ES2374729T3 - Inhibición de la diferenciación de células madre, aumento de la proliferación e inducción selectiva de la apoptosis por factores wnt. - Google Patents

Abstract

Método in vitro para inhibir la diferenciación de una célula madre de pulmón, que comprende disponer dicha célula madre con Wnt3a o con una variante de Wnt3a biológicamente activa que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a.

Description

Inhibición de la diferenciación de células madre, aumento de la proliferación e inducción selectiva de la apoptosis por factores Wnt

La presente invención se refiere al sector de la medicina, más en particular al sector de la medicina de pulmón. La presente invención se refiere a la diferenciación de células madre, en particular a la regeneración y recuperación de tejido orgánico y al transplante. La presente invención se refiere más en particular a la inhibición de la diferenciación de células madre mediante la manipulación de una vía de Wnt. Más en particular, la presente invención se refiere al aumento de la proliferación y al control de la diferenciación de células de pulmón mediante la manipulación de una vía de Wnt.

Órganos vitales, tales como el pulmón, el riñón, el hígado, el páncreas y la piel se caracterizan por la presencia de células epiteliales diferenciadas específicas para cada órgano basadas en células (mesenquimales) de una matriz de tejido conectivo específicas para cada órgano. La combinación de dichas células diferenciadas con la matriz de tejido conectivo está relacionada con la función específica de cada uno de dichos órganos. Dichas funciones específicas pueden ser tan variadas como, por ejemplo, el intercambio de gases en el pulmón, la filtración en el riñón, la desintoxicación y conjugación en el hígado, producción de insulina en las células de islotes pancreáticos o protección por la piel contra un medio peligroso. Una enfermedad o degeneración de dicho órgano es a menudo mortal, ya que una estructura del órgano degenerada o perdida es a menudo escasamente sustituida y porque las células especializadas de un órgano no pueden sustituir la función de otro órgano.

Por todo el mundo se han buscado soluciones para el tratamiento de enfermedades degenerativas de órganos y la piel y sus apéndices. Para la piel, como estructura orgánica relativamente simple, se han realizado algunos avances mediante la aplicación de transplantes autólogos o heterólogos de piel. Se tratan trozos de piel (en forma de mallas) a efectos de que se estiren más allá del tamaño inicial y que cubran los defectos de la piel de un paciente con piel en forma de malla. Dichos transplantes ofrecen una base para que las células proliferen y cierren las lesiones de la piel.

Para los órganos especializados en el cuerpo, las células regenerantes en el órgano in situ serían lo más óptimo ya que el transplante es a menudo más difícil y menos satisfactorio. El transplante conduce a menudo a efectos adversos del huésped frente al injerto o incluso del injerto frente al huésped. Sería también un gran logro si los órganos o una parte de los mismos, se pudieran mantener fuera del cuerpo (sinónimo de ex vivo) durante un periodo de tiempo, para darles la oportunidad de recuperarse mediante la regulación hacia arriba de la proliferación y la diferenciación de las células específicas de cada órgano. Aunque el órgano sea ex vivo, el paciente es, por ejemplo, dependiente de las máquinas para que asuman la función del órgano. En una etapa posterior, dicho órgano se coloca de nuevo en el paciente. Este método también es muy adecuado para células de la médula ósea que se extraen del paciente antes del tratamiento de la leucemia, y se sustituyen después del tratamiento. Dichas células de médula ósea se separan a menudo en diversas subpoblaciones y se analiza la ausencia de células leucémicas para evitar que las células leucémicas vuelvan a entrar al huésped. Muchas células no sobreviven a esta manipulación ex vivo; con el resultado de que un reimplante de la médula ósea es menos satisfactorio.

En especial, dichas células altamente diferenciadas, tales como, por ejemplo, las células de riñón, las células productoras de insulina en los islotes de Langerhans del páncreas, y células glandulares y/o de folículos pilosos de la dermis, son muy difíciles de recuperar, en caso de que sea posible, y muy difíciles de mantener, una vez extraídas de su contexto en el cuerpo.

Muchos investigadores intentan hallar modos de aumentar el tiempo de vida de dichas células especializadas en el cultivo y las posibilidades de que las células proliferen manteniendo su estado diferenciado. En la práctica, parece difícil conseguir este objetivo.

En la presente invención, este objetivo se consigue mediante la mejora de la vía de señalización de Wnt en células madre/células progenitoras de dicho órgano que comprende células diferenciadas. En una realización, se da a conocer un tiempo de vida y proliferación y diferenciación mayores y una riqueza selectiva de células madre del pulmón.

Una de las aplicaciones potenciales principales de las células madre es su utilización en los estudios de transplante en que estas células reconstituyen las células en el órgano enfermo. El transplante se realiza preferentemente con células madre que se pueden diferenciar in vivo en el tipo de célula deseado o con células madre diferenciadas previamente in vitro. Dicha diferenciación previa de células madre in vitro en un tipo de células deseado es un proceso que era difícil de controlar antes de la presente invención.

Un aspecto de la presente memoria da a conocer un método para dirigir la diferenciación de células madre a un tipo de célula deseado in vitro para utilizar las células diferenciadas con el objetivo del transplante (véase, por ejemplo, el ejemplo 1). El control de dicha diferenciación se consigue limitando el aumento de la vía de señalización de Wnt hasta cierta ventana en estas células madre. El control de la vía de señalización de Wnt se consigue mediante la adición, como mínimo, de Wnt3a o una variante de Wnt3a que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a. Sin seguir ninguna teoría, se cree que la fluctuación de la concentración de beta catenina intracelular se mantiene en un intervalo estrecho, induciendo así la diferenciación de un conjunto limitado de tipos de células.

La familia de genes de Wnt codifica factores secretados importantes para el desarrollo, implicados en el crecimiento celular, diferenciación y organogénesis (Wodartz y Nusse, 1998). Los genes de Wnt codifican una familia de glicoproteínas secretadas que modulan el destino celular y el comportamiento en embriones a través de la activación de vías de señalización mediadas por receptor. Los sucesos de señalización de Wnt son iniciados por la activación del receptor que implica la unión al dominio rico en cisteínas (CRD) de la proteína receptora transmembrana 7 frizzled (Fz) (Bhanot y otros, 1996). Una señal clásica de Wnt suprime la actividad de la glicógeno sintasa quinasa 3 (GSK-3), conduciendo a cambios en la fosforilación y una estabilidad incrementada de la proteína 1-catenina en el citoplasma (Hinck y otros, 1994). La 1-catenina es esencial para la activación de genes diana en respuesta a la señalización de Wnt (Miller y Moon, 1996; Willert y Nusse, 1998), ya que se compleja con los factores de transcripción de la caja HMG de la familia TCF/LEF (Behrens y otros, 1996; Molenaar y otros, 1996; Huber y otros, 1996). Las secuencias, patrones de expresión y actividades de Wnt se conservan de manera elevada en la evolución, de manera que ha sido posible comprender de manera profunda las funciones, y mecanismos de acción, de los genes Wnt a través de la síntesis de estrategias genéticas y biológicas celulares en diferentes organismos. Estos estudios sugieren que existen proteínas WNT funcionalmente distintas analizadas mediante la capacidad de transformar células y mediante las diferencias en respuestas embrionarias a las señales ectópicas de WNT. Además, los estudios de de ganancia de función y pérdida de función apoyan ambos la implicación de proteínas Wnt en la modulación del destino celular y el comportamiento celular durante el desarrollo de vertebrados, a menudo a través de interacciones combinatorias con otras vías de señalización para regular la expresión génica (Moon RT, Brown JD, Torres M. Trends Genet 1997 Apr; 13(4):157-62). Esto está apoyado por los datos sobre la capacidad y sensibilidad de células embrionarias de ratones de diferenciarse en tres capas germinales, las cuales eran inhibidas por mutaciones específicas en el gen de pólipo adenomatoso coli. (Kielman y otros, 2002)

Se ha encontrado que los componentes de la vía de señalización de Wnt están presentes durante la organogénesis en el ratón (Roelink y Nusse, 1991; Buhler y otros, 1993; Parr y otros, 1993; Christiansen y otros, 1995; Wang y Shackleford, 1996; Cho y Dressler, 1998; Korinek y otros, 1998; Leimester y otros, 1998). Además, la pérdida de función de genes de Wnt y genes relacionados con Wnt conduce al desarrollo anormal en el ratón (McMahon y Bradley, 1990; Monkley y otros, 1993; Takada y otros, 1994; Stark y otros, 1994; Galceran y otros, 1999; Liu y otros, 1999; Yamaguchi y otros, 1999; Brisken y otros, 2000; Lee y otros, 2000). La señalización de Wnt es inhibida por la presencia de proteínas Dickkopf. Dichas proteínas Dickkopf (Dkk) se unen al coreceptor de LRP para Wnt. La modulación de la vía de Wnt en el cultivo celular se puede realizar, por ejemplo, mediante modificación genética (Kielman y otros, 2002) o mediante la administración de factores solubles que influyen en la vía de Wnt. Este último método se ha utilizado para monocapas de células en cultivos celulares en los que las células no presentaban conexión de tejido entre sí, tales como, por ejemplo, células madre hemopoyéticas (Matthews y otros, 2000). En el cultivo de órganos, los efectos de los factores solubles no se predicen o entienden fácilmente debido a la estructura tridimensional del órgano y porque el microambiente de las células es más complejo por la presencia de otras células, tales como tejido conectivo y vasos sanguíneos.

La presente invención da a conocer el control de la vía canónica de señalización de Wnt y da a conocer Wnt3a que actúa como proteína de la vía canónica de Wnt. En un aspecto de la presente invención, se demuestra que Wnt3a es capaz de inhibir la rotura proteolítica de beta-catenina intracelular, inhibiendo y/o modulando de este modo la diferenciación y replicación de células madre pluripotentes en el pulmón y de células madre omnipotentes.

Al describir la presente invención, se utilizarán los siguientes términos y se definen tal como se indica a continuación.

El tejido de pulmón en la presente invención comprende, como mínimo, dos o más de los siguientes compartimentos: el compartimento alveolar, el compartimento bronquiolar, el compartimento bronquial y el compartimento traqueal. Una célula de pulmón se define en la presente invención como una célula epitelial, como mínimo, de uno de estos cuatro compartimentos. Una población de células de pulmón comprende, como mínimo, dos células de pulmón. En la presente invención, en una realización preferente, una población de células de pulmón juntas es capaz de actuar en el intercambio de gases entre el compartimento de sangre del organismo y la atmósfera. En el pulmón, están presentes las células epiteliales y el tejido de soporte. El tejido de soporte comprende tejido conectivo, nervios y vasos linfáticos y sanguíneos. En esta solicitud, el tejido conectivo se describe mediante el término mesénquima.

Las células madre omnipotentes son células que poseen la capacidad de proliferar indefinidamente y poseen la capacidad de diferenciarse en cualquier tipo de células posible que esté presente en el organismo totalmente desarrollado.

Las células madre pluripotentes son células que poseen la capacidad de proliferar indefinidamente y poseen la capacidad de diferenciarse en un amplio, aunque limitado, número de tipos de células que, en general, pertenecen a un cierto tejido, tal como el pulmón o un cierto linaje celular, tal como endodermo, ectodermo o mesodermo.

Las células madre de la presente invención están modificadas genéticamente o no y/o se obtienen o no mediante transferencia nuclear.

La vía de señalización canónica de Wnt es una cascada de señalización en que un conjunto de proteínas controla la rotura proteolítica de beta-catenina. Algunas proteínas en esta vía son modificadas químicamente por otras proteínas y/o son capaces de inducir otras moléculas, tales como, por ejemplo, azúcares y lípidos que a menudo tienen influencia sobre la rotura proteolítica de beta-catenina.

La proteína Wnt3a es parte de una gran familia de proteínas que presentan un gran parecido entre sí en estructura y en función. Las proteínas Wnt se conservan fuertemente durante la evolución en la estructura y la función y son intercambiables entre especies. Por lo tanto, la presente invención comprende todas las proteínas Wnt o una parte funcional, derivado o análogo de las mismas que, como Wnt3a, son capaces de inducir la vía canónica de Wnt. Otros componentes de la vía de señalización de Wnt o fragmentos de estos componentes, o compuestos que mimetizan la función de estos componentes, que en último término reducen la rotura proteolítica de beta-catenina, tendrán el mismo efecto que Wnt3a en el tipo, no necesariamente en la cantidad, y están también dentro del alcance de la presente memoria.

Los términos “Wnt” o “polipéptido Wnt”, cuando se utilizan en la presente invención, comprenden polipéptidos Wnt de secuencia nativa, variantes de polipéptido Wnt, y polipéptidos Wnt quiméricos. De manera opcional, el polipéptido Wnt no está asociado con glicosilación o palmitoilación nativa. La “glicosilación nativa” se refiere a los grupos carbohidrato que están unidos covalentemente al polipéptido Wnt cuando se produce en la célula metazoana de la que deriva en la naturaleza. La palmitoilación nativa, a su vez, se refiere a la unión covalente de derivados lipídicos en un polipéptido Wnt cuando se produce en la célula metazoana de la que deriva en la naturaleza (Willert y otros, 2003). Por consiguiente, un polipéptido Wnt humano producido en una célula no metazoana es un ejemplo de un Wnt que “no está asociado con glicosilación o palmitoilación nativa”. Algunas veces, el polipéptido Wnt no está glicosilado o no está palmitoilado (por ejemplo, como resultado de una producción recombinante en una procariota).

Un polipéptido de "secuencia nativa" es un polipéptido que tiene la misma secuencia primaria de aminoácidos que un polipéptido (por ejemplo, polipéptido Wnt) derivado de la naturaleza. Dicho polipéptido de secuencia nativa se aísla, por ejemplo, de la naturaleza o se produce mediante medios recombinantes o sintéticos. Un polipéptido de secuencia nativa tiene la secuencia de aminoácidos de un polipéptido humano natural, polipéptido murino o polipéptido de cualquier otra especie de mamífero.

El término “polipéptido Wnt de secuencia nativa” incluye polipéptido Wnt de cualquier especie animal (por ejemplo, humano, murino, conejo, gato, vaca, oveja, pollo, porcino, equino, etc.) natural. El término “proteína Wnt de secuencia nativa” incluye las proteínas nativas con o sin la metionina (Met) N-terminal de iniciación, y con o sin la secuencia señal nativa. Los polipéptidos Wnt de secuencia nativa humanos y murinos conocidos en la técnica tienen de aproximadamente 348 a aproximadamente 389 aminoácidos de largo en sus formas no procesadas que reflejan variabilidad (particularmente, en el extremo amino terminal escasamente conservado y varios sitios internos), contienen 21 cisteínas conservadas, y presentan las características de una proteína secretada (véase, por ejemplo, los polipéptidos Wnt como en Gavin y otros, supra; Lee y otros, supra; Christiansen y otros, supra; documento PCT/US94/14708 [WO 95/17416]). El peso molecular de un polipéptido Wnt es de aproximadamente 38-42 KD en una forma monomérica. Una variante de Wnt biológicamente activa tiene una secuencia de aminoácidos que tiene, como mínimo, aproximadamente el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con un polipéptido Wnt de secuencia nativa, preferentemente, como mínimo, aproximadamente el 95%, más preferentemente, como mínimo, aproximadamente el 99%. Las funciones efectoras de los polipéptidos Wnt de secuencia nativa incluyen preferentemente la inhibición de la diferenciación y/o el aumento de la proliferación y/o inducción de apoptosis.

Un polipéptido Wnt "aislado" se ha purificado de una fuente de Wnt o, por ejemplo, se ha preparado mediante métodos recombinantes o sintéticos y está suficientemente libre de otros péptidos o proteínas (1) para mostrar homología para, como mínimo, 16 residuos de aminoácidos y, preferentemente, 20 residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o de la secuencia de aminoácidos interna del polipéptido Wnt, o (2) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción con plata.

El término “anticuerpo” se utiliza para moléculas de unión en el sentido más amplio y, entre otras cosas, cubre anticuerpos monoclonales, composiciones de anticuerpos con especificidad poliepitópica, anticuerpos biespecíficos, diacuerpos, y moléculas de cadena única, así como fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab, F(ab’)2 y Fv), siempre que muestren la actividad biológica deseada.

El término “anticuerpo monoclonal”, tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que constituyen la población son idénticos a excepción de posibles mutaciones naturales que se pueden presentar en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un único sitio antigénico. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que habitualmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante en el antígeno. Además de su especificidad, la utilización de anticuerpos monoclonales sintetizados mediante un cultivo de hibridoma es ventajosa en que no están contaminados por otras inmunoglobulinas. El modificador “monoclonal” indica el carácter del anticuerpo por obtenerse de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos y no debe interpretarse que se requiere la producción del anticuerpo mediante ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizar, según la presente invención, se fabrican, en una realización, mediante el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler y otros, Nature 256:495 [1975], y, en otra realización, se fabrican mediante métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, patente de Estados Unidos No. 4.816.567 (Cabilly y otros)). En aún otra realización, los “anticuerpos monoclonales”se aíslan de bibliotecas de anticuerpos en fagos utilizando las técnicas descritas, por ejemplo, en Clackson y otros, Nature 352:624-628 [1991] y Marks y otros, J. Mol. Biol. 222:581-597 [1991].

Los anticuerpos monoclonales dados a conocer en la presente invención también comprenden anticuerpos (inmunoglobulinas) “quiméricos” en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que muestren la actividad biológica deseada (Cabilly y otros, supra; Morrison y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 [1984]).

La frase “aumento de la proliferación de una célula” comprende la etapa de incrementar el grado de crecimiento y/o reproducción de la célula, en relación con una célula no tratada in vitro o in vivo. Un incremento en la proliferación celular en un cultivo celular se detecta, por ejemplo, mediante el recuento del número de células antes y después de la exposición a una molécula de interés. El grado de proliferación se cuantifica alternativamente a través de un examen microscópico del grado de confluencia. La proliferación celular también se cuantifica utilizando un ensayo de incorporación de timidina o BrdU.

Por "control de la diferenciación de una célula” se entiende el acto de incrementar el grado de adquisición o posesión de una o más características o funciones que difieren de las de la célula original (es decir, especialización celular). Esto se detecta, por ejemplo, mediante el cribado de un cambio en el fenotipo de la célula (por ejemplo, identificando cambios morfológicos en la célula y/o marcadores de superficie en la célula).

Una "célula madre de pulmón o una célula progenitora de pulmón” o “célula primitiva de pulmón” es una célula que es capaz de diferenciarse para una formar un tipo de célula de pulmón más comprometida o madura.

"Mamífero" se refiere a un mamífero humano o no humano, incluyendo un animal doméstico y de granja, y un animal de zoológico, un animal para competiciones deportivas, o un animal de mascota, tal como un perro, un caballo, un gato, una vaca, etc. Preferentemente, el mamífero es humano.

En una realización, la presente invención da a conocer la utilización de un Wnt3a o una variante de Wnt3a que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con un Wnt3a que aumenta la vía de señalización canónica de Wnt hasta niveles que evitan o inhiben o modulan o, como mínimo, retardan la diferenciación de las células madre de pulmón y/o de células madre omnipotentes y aumentan su proliferación.

La concentración de Wnt3a o una variante de Wnt3a que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a necesaria para aumentar la vía de señalización de Wnt a efectos de inhibir la diferenciación y/o aumentar la proliferación, depende del tipo de célula madre y el factor pertinente. Como ejemplo, la concentración eficaz necesaria para la proliferación de células madre se da a conocer en los ejemplos, pero con el método de la presente invención, se enseña a un experto cómo hallar la concentración eficaz para otros tipos de células y tipos de órganos. Para Wnt3a humana recombinante producida por R&D Systems (número de catálogo 1323-WN), la concentración eficaz para las células madre de pulmón está entre 1 y 2000 ng/ml. Por lo tanto, la presente invención da a conocer un método para inhibir, como mínimo, en parte, la diferenciación de células madre Wng en una población de células de mamífero que comprende disponer dicha célula madre in vitro con un Wnt3a o una variante de Wnt3a que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a. Preferentemente, dicha regulación hacia arriba de la vía de señalización de Wnt se consigue poniendo en contacto dichas células con un factor soluble de Wnt3a.

Actualmente, es posible mediante técnicas de adhesión diferencial y centrifugación con gradiente de percoll aislar una población de células madre de tejido de pulmón y de las vías respiratorias. El cultivo a largo plazo (por ejemplo, durante más de 4 ó 5 días) de estas células madre sin perder las propiedades de célula madre no era posible antes de la presente invención.

Una realización de la presente invención da a conocer un método para expandir el número total de células madre somáticas presentes en una población de células, tales como, por ejemplo, de tejido de pulmón y de las vías respiratorias (incluyendo el compartimento traqueal, el compartimento bronquial, el compartimento bronquiolar y el compartimento alveolar) y de células madre omnipotentes (tales como células madre embrionarias) in vitro, mientras, como mínimo, en parte, se mantienen sus propiedades originales de célula madre. La presente invención da a conocer un método para incrementar el número de células madre en una población de células de mamífero en comparación con una población de referencia, que comprende la regulación hacia arriba de una vía de señalización de Wnt en dicha población de células hasta un nivel de inhibición de la diferenciación, en el que dicha población de referencia no se dispone con dicha regulación hacia arriba de una vía de señalización de Wnt.

En una realización de la presente invención, se aíslan células madre de tejido de pulmón sano y se expanden in vitro y se utiliza como fuente de células madre que son transplantadas directamente en un paciente a efectos de generar nuevo tejido de pulmón o de las vías respiratorias.

La presente invención ahora también permite que un experto en la materia aísle células madre de pulmón o de las vías respiratorias a partir de una muestra de pulmón del tejido de pulmón o de las vías respiratorias del paciente y expanda estas células madre derivadas del paciente en un número suficiente in vitro a efectos de devolver estas células madre al paciente. Por lo tanto, la presente invención da a conocer un método para la diferenciación selectiva de una célula madre, que comprende controlar el nivel de activación de la vía de Wnt.

En otro ejemplo, la memoria da a conocer la modificación genética de las células de una persona con un defecto genético en las células del pulmón, y da a conocer un método para aislar, cultivar y expandir las propias células madre de un paciente in vitro y modificarlas genéticamente a efectos de corregir el efecto de este defecto genético presente en la línea germinal del paciente y devolver estas células madre modificadas genéticamente al paciente.

En otra realización, dado que con la presente invención las células madre se cultivan durante un periodo de tiempo más largo, las células madre cultivadas de tejido de pulmón y de las vías respiratorias se utilizan como fuente para generar in vitro un tejido de pulmón y de las vías respiratorias diferenciado a efectos de transplantarlos en un paciente con una deficiencia en los pulmones o las vías respiratorias. Por lo tanto, en otra realización, la presente solicitud describe un método para repoblar células en un mamífero que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de una célula madre o una célula madre de pulmón de la presente invención. Este método es particularmente útil para el tratamiento de personas que padecen de insuficiencia pulmonar o son susceptibles a la misma, estando dicha insuficiencia pulmonar causada, por ejemplo, por deficiencia del surfactante pulmonar, enfisema, distrés respiratorio crónico y/o cáncer. En un ejemplo, las células se extraen del cuerpo para ser tratadas según la presente invención, o se elige tratar las células en el cuerpo. Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método para inhibir, como mínimo, en parte, la diferenciación de células madre y/o incrementar la cantidad de células madre y/o aumentar la apoptosis de células mesenquimales y/o diferenciar las células madre en el cuerpo del mamífero, preferentemente en un cuerpo humano, que comprende manipular la vía de Wnt. En otra realización, la presente invención da a conocer un método para evitar o retrasar la diferenciación de células madre omnipotentes. Dichas células madre omnipotentes presentan la capacidad de diferenciarse en todos los posibles tipos de células y linajes celulares que están presentes en el organismo totalmente desarrollado. Las células madre ominipotentes se aíslan preferentemente de la masa celular interna de los embriones tempranos en la etapa de blastocistos. La presente invención también es válida para células madre omnipotentes que se pueden aislar de embriones tempranos en etapas de desarrollo diferentes de la etapa de blastocistos. La presente invención también es adecuada para células madre omnipotentes que se aíslan de la cresta genital, las denominadas células germinales primordiales (PGC), de embriones tempranos que ya experimentaron la formación de las tres capas germinales: ectodermo, endodermo y mesodermo durante la gastrulación. La presente invención también es adecuada para células madre omnipotentes que se obtienen mediante la transferencia de núcleos de células somáticas diferenciadas (preferentemente de un paciente) a una de las células madre omnipotentes descritas en la presente patente.

Una de las aplicaciones en que se utilizan células madre omnipotentes es la generación de animales transgénicos mediante la transfección de una célula omnipotente con una construcción de ADN de manera que cambia el contenido original de ADN de esa célula. Dicha construcción de ADN se mantiene en la célula mediante una integración intercromosómica (nuclear o mitocondrial) o como una molécula de ADN episomal (extranuclear). El mantenimiento de las células omnipotentes se facilita mediante la adición de factor inhibidor de leucocitos u otros factores de crecimiento, preferentemente añadidos en forma purificada o producidos por una línea celular. La presente invención da a conocer una alternativa a estos factores de crecimiento, como adición de un factor elevador de la vía de Wnt a una concentración eficaz ayuda a mantener las características omnipotentes de las células madre.

Otro ejemplo de la presente memoria da a conocer un método para la generación y aislamiento de células madre omnipotentes a partir de embriones. Las células madre omnipotentes se aíslan de los embriones en diferentes etapas del desarrollo. La dificultad en este proceso es la pérdida de las propiedades omnipotentes de las células madre debido a la diferenciación en varios tipos de células. La presente memoria, como mínimo, evita o retrasa la diferenciación de estas células madre omnipotentes, facilitando de este modo el aislamiento de líneas de células madre omnipotentes a partir de embriones, manteniendo a la vez sus propiedades omnipotentes. El aislamiento de células madre omnipotentes a partir de embriones tempranos era muy difícil antes de la presente invención, si es que era posible, en muchas especies, incluyendo los seres humanos. La presente memoria permite ahora el aislamiento de células madre omnipotentes de varias especies de mamífero, incluyendo seres humanos, con una frecuencia y eficiencia mucho más elevada de lo que era posible anteriormente.

En otra realización, la presente invención da a conocer el conocimiento de que la inducción de la apoptosis mediante la activación de la vía de Wnt es posible en cada tipo de célula presente en el pulmón, es decir, células terminalmente diferenciadas, así como células madre. La concentración de una Wnt3a o una variante de Wnt3a que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a necesaria para inducir la apoptosis en un tipo de célula específica depende del propio factor y del tipo de célula. Esta concentración es para los tipos de células presentes en el pulmón descritos en el ejemplo 1, figuras 2 y 3. El nivel del polipéptido Wnt3a necesario para la apoptosis de células mesenquimales es cercano al nivel necesario para la inhibición de la diferenciación y el aumento de la proliferación de células madre. Por lo tanto, la presente solicitud da a conocer un método para inducir la apoptosis en células mesenquimales en una población de células de mamífero que comprende disponer dicha célula mesenquimal in vitro con Wnt3a o una variante de Wnt3a que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a. Preferentemente, dicha población también comprende una célula madre.

La apoptosis de células mesenquimales evita el sobrecrecimiento de las células madre somáticas durante su cultivo in vitro, facilitando de este modo la purificación y el cultivo selectivo in vitro de células madre de pulmón.

La diferenciación de células madre omnipotentes y pluripotentes depende de la fuerza de la vía de señalización de Wnt en estas células. Las células madre en que se activa la vía de señalización de Wnt están limitadas en su capacidad de diferenciación mediante la acción de la señal de Wnt. Una célula madre en que la posible capacidad de diferenciación o amplitud de la vía de señalización de Wnt es máxima se puede diferenciar de todos sus derivados. Una célula madre en que la amplitud de la vía de señalización de Wnt está limitada a una cierta ventana está limitada en su capacidad de diferenciación y está limitada a diferenciarse en ciertos tipos de células.

La presente invención da a conocer un método para dirigir la diferenciación de células madre omnipotentes y pluripotentes a un número limitado de tipos de células deseados, tales como, por ejemplo, células epiteliales bronquiales o células epiteliales traqueales o células epiteliales alveolares de tipo I o II, mediante la restricción de la fuerza de la señal de Wnt a una cierta ventana. Tal como se ha descrito anteriormente, la presente memoria divulga cómo dirigir la diferenciación en un órgano o cultivo de órgano in vitro. Por lo tanto, la presente memoria da a conocer un método en el que dicha población de células está dispuesta en una estructura tridimensional. La presente memoria da a conocer además un compuesto soluble capaz de influir en la propagación o la diferenciación seleccionada de una célula madre. Dicho compuesto soluble comprende, por ejemplo, un factor soluble capaz de regular hacia arriba la vía de señalización de Wnt en dichas células, tal como, por ejemplo, un factor de Wnt aislado

o un anticuerpo o un anticuerpo monoclonal capaz de unirse específicamente y actuar como un factor de Wnt.

Por lo tanto, la presente invención da a conocer un método de la invención en el que dicha Wnt3a comprende un factor soluble capaz de regular hacia arriba una vía de señalización de Wnt en dichas células, y/o un factor de Wnt3a aislado. Por lo tanto, la presente invención también da a conocer un método de la invención, en el que dicho factor comprende Wnt-3a o una variante de Wnt3a que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a.

La presente invención da a conocer un intervalo de concentraciones en las que una Wnt 3a o una variante de Wnt3a que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a, es eficaz en la inhibición, como mínimo, parcial, de la diferenciación de células madre en una población. Por lo tanto, la presente invención da a conocer un método para inhibir la diferenciación de una célula madre de pulmón, que comprende disponer dicha célula madre in vitro con una Wnt3a o una variante de Wnt3a que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a.

La presente invención también da a conocer la percepción de que las células madre se estimulan para proliferar mediante la presencia de dicho factor de Wnt soluble. Por lo tanto, la presente invención también divulga un método para inducir una célula madre, preferentemente una célula madre de pulmón, para proliferar mediante la inhibición de la diferenciación de dicha célula madre, que comprende disponer dicha célula madre in vitro con una sustancia reguladora hacia arriba de la vía de Wnt. En una realización, la presente invención da a conocer un método de la invención, en el que dicha sustancia reguladora hacia arriba de la vía de Wnt comprende un factor Vnt3a soluble o una parte funcional, derivado o análogo del mismo. La presente invención da a conocer además, en los ejemplos, que Wnt3a o una variante de Wnt3a que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a ya regulan hacia arriba una vía de Wnt a partir de 1 ng/ml de fluido de cultivo de tejido y aún regulan hacia arriba a 2000 ng/ml. Por lo tanto, la presente invención da a conocer un método de la invención, en el que dicha célula madre se dispone con Wnt3a o una variante de Wnt3a que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a, en una cantidad, como mínimo, de 1 ng y, como máximo, de 2000 ng por ml de fluido de cultivo de tejido. En los ejemplos se encuentra que los efectos de Wnt3a en la vía de Wnt varían con las concentración de Wnt3a. Por lo tanto, en otra realización preferente, la presente invención divulga dicho método descrito anteriormente en el que la cantidad de Wnt3a o variante de Wnt3a que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a es de, como mínimo, 10 hasta, como máximo, 1500 ng por ml de fluido de cultivo de tejido. Dicha cantidad de Wnt3a es más preferente, como mínimo, de 20 a, como máximo, 1000 ng por ml de fluido de cultivo de tejido, lo más preferente, como mínimo, de 30 a, como máximo, 600 ng por ml de fluido de cultivo de tejido.

En otra realización, la presente invención da a conocer la percepción de que a un cierto nivel de regulación hacia arriba de Wnt, tiene lugar la apoptosis en células mesenquimales, mientras que las células epiteliales no se ven afectadas. Esta característica de la regulación hacia arriba de Wnt se utiliza para eliminar de manera selectiva células de una población de células mediante la elección del nivel de regulación hacia arriba de Wnt, de manera que se induce la apoptosis en células mesenquimales, mientras que las células epiteliales no se ven afectadas. Por lo tanto, la presente invención da a conocer un método para enriquecer una población de células madre de pulmón en una población de células mesenquimales que comprenden dichas células madre de pulmón, mediante la inducción de la apoptosis en células mesenquimales mediante la disposición de células mesenquimales con una Wnt3a o una variante de Wnt3a que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a.

Dado que el nivel de regulación hacia arriba de la vía de Wnt depende de la cantidad de Wnt3a administrada a las células, la presente invención también da a conocer un método de la invención, en el que dicha célula madre mesenquimal se dispone con Wnt3a o una variante Wnt3a que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a en una cantidad, como mínimo, de 60 ng y, como máximo, de 1500 ng por ml de fluido de cultivo de tejido, de manera que las células mesenquimales se vuelven apoptóticas.

Los ejemplos dan a conocer que el nivel de apoptosis cambia modificando el nivel de regulación hacia arriba de la vía de Wnt, por lo tanto, en una realización más preferente de la presente invención, se da a conocer un método de la invención, en el que dicha célula madre mesenquimal se dispone con Wnt3a o una variante de Wnt3a que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a, en una cantidad, como mínimo, de 100 ng y, como máximo, de 1000 ng por ml de fluido de cultivo de tejido.

En otra realización de la presente invención, la presente invención también da a conocer la diferenciación selectiva de células madre de pulmón que depende de la regulación hacia arriba de la vía de Wnt. Por lo tanto, la presente invención también da a conocer un método para disponer de un conjunto de células madre de pulmón de una población de células mesenquimales y células madre, que comprende disponer dichas células mesenquimales con una cantidad inductora de la apoptosis de una Wnt3a o una variante de Wnt3a que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a.

Naturalmente, el método descrito anteriormente es muy adecuado para células madre de pulmón, por tanto, una realización preferente de la presente invención da a conocer un método de la invención, en el que dichas células madre son células madre de pulmón.

La presente invención da a conocer el conocimiento de que Wnt3a es muy adecuada para regular hacia arriba la vía de Wnt.

Es preferente una cantidad de Wnt3a entre 50 ng y 1600 ng a efectos de conseguir resultados óptimos. Por lo tanto, la presente invención da a conocer un método de la invención, en el que se dispone dicha Wnt3a o variante de Wnt3a solubles que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a, en una cantidad, como mínimo, de 50 ng y, como máximo, de 1600 ng por ml de fluido de cultivo de tejido.

En una realización más preferente, la presente invención da a conocer un método de la invención, en el que la diferenciación de un tipo de célula de pulmón distal es inhibida, como mínimo, parcialmente, mediante la administración de 10-250 ng de Wnt3a o una variante de Wnt3a que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a por ml de fluido de cultivo de tejido.

Dicho tipo de célula de pulmón distal es preferentemente una célula de tipo alveolar, más preferentemente una célula de tipo alveolar de tipo I o tipo II. Por lo tanto, la presente invención da a conocer un método de la invención, en el que dicho tipo de célula de pulmón distal es una célula alveolar de tipo I o tipo II.

Las células madre son capaces de diferenciarse en varios tipos de células que se originan de una célula madre presente en una población de células madre de pulmón. La regulación hacia arriba de la vía de Wnt influye en la diferenciación tal como se describe en los ejemplos. Por lo tanto, la presente invención también da a conocer un método de la invención en el que se aumenta de forma selectiva la proliferación y la diferenciación de un tipo de célula de las vías respiratorias superiores mediante la administración de 10-750 ng de Wnt3a o una variante de Wnt3a que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a por ml de fluido de cultivo de tejido. En una realización preferente, dicho tipo de células de las vías respiratorias superiores es una célula epitelial traqueal o bronquial. Por lo tanto, la presente invención también da a conocer un método de la invención, en el que dicho tipo de células de las vías respiratorias superiores es una célula epitelial traqueal y/o bronquial.

Wnt3a es un compuesto soluble que regula hacia arriba la vía de Wnt en las células. Dicho compuesto se incluye preferentemente en un medio de cultivo celular.

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Generación de tejido de pulmón nuevo ex vivo

Conservación y crecimiento potencial de tejido alveolar en un pulmón murino mediante el tratamiento en cultivo con polipéptido Wnt3a recombinante.

Para aportar pruebas, se utiliza un cultivo de explante de pulmón in vitro (obtenido de un ratón). La generación de tejido alveolar nuevo en pacientes se estimula mediante la activación o reactivación de la formación de brotes alveolares. El crecimiento y la ramificación de brotes alveolares, seguido de la transformación en conductos, sacos y bolsas alveolares, da lugar al establecimiento del acino pulmonar.

Éste es un principio de diferenciación general tanto en feto como en mamífero adulto.

Como prueba, por tanto, se demuestra que un tratamiento con moléculas seleccionadas, implicadas en la vía de Wnt, inhibe el proceso de diferenciación de la diferenciación alveolar. La inhibición de este proceso de diferenciación se consigue aplicando un polipéptido Wnt3a purificado a un cultivo de explantes de pulmón in vitro de embriones de ratón con 13 días de vida (E13).

Material y métodos

Cultivos de explantes de pulmón in vitro

El cultivo de explantes de pulmón murino (fetal) se generó según nuestro protocolo estándar. De manera resumida, se aislaron pulmones completos o lóbulos pulmonares diseccionados de forma individual de ratones fetales y se cultivaron durante 1 a 5 días en un sistema de cultivo de gota colgante. El polipéptido Wnt3a se administró al medio de cultivo en diferentes concentraciones que variaban entre 0 y 4000 ng/ml. El efecto de este tratamiento se controló mediante estereomicroscopía. Los cultivos de los explantes de pulmón se fijaron posteriormente durante 30 minutos en paraformaldehído (PFA) al 10%, 30 minutos en PFA al 2% y 30 minutes en PFA al 4%. Después de la fijación, los explantes de pulmón se deshidrataron a través de una serie creciente de 2-isopropanol y posteriormente se bañaron en parafina. Para el análisis histológico, se cortaron secciones de 4 !m de grosor y se tiñeron con hematoxilina y eosina utilizando técnicas estándar.

Para el análisis inmunohistoquímico, se utilizaron secciones comparables y se trataron con anticuerpo monoclonal anti-PCNA seguido de un conjugado de peroxidasa de rábano antiratón de cabra. La detección de los epítopos de PCNA se llevó a cabo mediante el tratamiento de las secciones con diaminobenzidina (DAB) durante 15 minutos. Sistema de informadores TopFlash/FopFlash:

Se cultivaron en placas de 96 pocillos fibroblastos de ratón primario aislados de explantes de pulmón E12.5, células de la línea celular A549 de carcinoma de pulmón epitelial humano (ATCC CCL-185), células de la línea celular Calu3 de adenocarcinoma de pulmón epitelial humano (ATCC_HTB-55) y las células de la línea celular HFL-1 de fibroblasto de pulmón fetal humano normal (ATCC_153) y se transfectaron con las construcciones de informadores TopFlash y FopFlash utilizando lipofectamina 2000 según las instrucciones del fabricante. Como control interno para la eficacia de la transfección, se transfectó simultáneamente un informador constitutivo de luciferasa de renila (promega). Las células se transfectaron con las construcciones de informadores mencionadas anteriormente y se trataron simultáneamente con diferentes concentraciones de Wnt3A durante 20 horas, después de lo cual se lisaron las células y se midió la expresión de luciferasa utilizando un luminómetro de Berthold durante 2 segundos (Korinek, V., y otros, Mol. Cell. Biol. 18: 1248-1256, 1998). El reactivo de transfección Lipofectamina 2000 se adquirió en Invitrogen life technologies. El plásmido informador de beta-catenina/TCF de tipo salvaje (TOPFLASH) y el plásmido informador mutado (FOPFLASH) se obtuvieron de Upstate biotechnology (NY, Estados Unidos).

Cuantificación de la proliferación celular utilizando inmunohistoquímica de fosfo-histona H3. Se midió la cantidad de células que experimentaban mitosis utilizando la detección inmunohistoquímica de la histona H3 fosforilada que está presente únicamente en cromosomas condensados durante la mitosis. Por condición, se trataron, como mínimo, cuatro explantes de pulmón diferentes y dos investigadores diferentes contaron un total de 20 secciones por condición para células positivas en histona H3 fosforilada. El anticuerpo primario contra la fosfo histona H3 (ser10, clon 6G3) se adquirió en Cell Signaling technology y se utilizó según las recomendaciones del proveedor:

La inducción de la apoptosis se detectó utilizando el Kit de Detección de Muerte Celular In Situ de Roche (Número de catálogo 11 684 817 001) según las instrucciones del fabricante. Como fuente para Wnt3a se utilizó Wnt-3a de ratón recombinante de R&D systems (Número de catálogo: 1324-WN, R&D systems, Inc. Minneapolis, Estados Unidos). Como medio de cultivo se utilizó DMEM/F12 de HAM (1:1) de Biochrom AG, número de catálogo FG 4815.

El anticuerpo contra PCNA se adquirió en Zymed Laboratories Inc., (número de catálogo 18-0110). El anticuerpo secundario utilizado era de Jackson Laboratories, Inc (número de catálogo 115-056-062). Los anticuerpos primarios utilizados para la detección inmunohistoquímica fueron para beta-catenina; mAb IgG anti beta-catenina, clon 14 de BD-Transduction Laboratories, para tubulina-beta, mAb, clon TBN05 (Tub2.1) de Neomarkers, para BrdU; mAb anti-Bromodesoxiuridina (BrdU), clon ZBU30 de Zymed laboratories inc.

El efecto de Wnt3A de 500 ng/ml a 4000 ng/ml en el crecimiento de explantes de pulmón fetal.

Resultados:

El tratamiento de los cultivos de pulmón de explantes de pulmón embrionario del día 13 (E13) con polipéptido Wnt3a 1000 ng/ml dio lugar al bloqueo total de la diferenciación pulmonar después de 16 horas (figura 1E). Incluso después de un cultivo de cinco días bajo estas condiciones, no se pudo observar mediante estereomicroscopía una diferenciación y desarrollo alveolar significativos (figura 1F).

El análisis histológico de estos cultivos de cinco días de vida reveló que la diferenciación del epitelio pulmonar primordial se detuvo en una etapa comparable con la del inicio del cultivo (E13). Además, la mayoría de las células mesenquimales que rodean el epitelio mostraron núcleos picnóticos, lo cual indica que estas células han experimentado apoptosis. Esto contrastaba claro con el epitelio que no contenía células apoptóticas (figura 1H).

Para analizar la viabilidad del epitelio y el mesénquima circundante, se tiñeron las secciones para el marcador de proliferación “Antígeno Nuclear de Células Proliferantes” ("Proliferating Cell Nuclear Antigen"), (PCNA, figura 1I-J). Esta tinción inmunohistoquímica mostró que el epitelio aún era proliferante, mientras que la mayoría de células mesenquimales eran inactivas o estaban muertas (figuras 1K+L). Esto contrastaba con los cultivos de explantes de pulmón no tratados donde tanto el epitelio como el mesénquima eran fuertemente proliferantes (figuras 1I+J).

Los resultados anteriores indican que el polipéptido Wnt3a presenta un fuerte efecto inhibidor en el desarrollo y la diferenciación del pulmón fetal.

A efectos de determinar el intervalo de concentraciones en que el polipéptido Wnt3a es efectivo, se cultivaron explantes de pulmón totales en presencia de Wnt3a en un intervalo de 0 ng/ml, 500 ng/ml, 750 ng/ml, 1000 ng/ml, 2000, ng/ml y 4000 ng/ml, figuras 2A-R).

El análisis estereomicroscópico ya mostró después de un día un efecto perjudicial en el desarrollo del pulmón con las concentraciones de Wnt3a, 2000 ng/ml y 4000 ng/ml (figuras 2M+P).

Después de 2 días de cultivo, estos explantes de pulmón se fijaron y bañaron en parafina para el análisis inmunohistológico.

El análisis histológico de secciones teñidas con H/E mostró que la población de células mesenquimales experimenta una rápida inducción de apoptosis en el intervalo de Wnt3a de 1000-4000 ng/ml. La apoptosis también se induce en el epitelio a una concentración de 2000-4000 ng/ml, pero no es detectable a una concentración de 1000 ng/ml. Sin embargo, el mesénquima se vuelve claramente apoptótico a una concentración superior a 750 ng/ml, lo que indica que el umbral de inducción para la apoptosis es diferente para el epitelio y el mesénquima. A la concentración de 750 ng/ml, la apoptosis en el mesénquima es claramente detectable, pero aún no es abundante, mientras que el epitelio no mostró signos de apoptosis en absoluto, figuras 2H+I).

La tinción inmunohistoquímica de PCNA mostró además una proliferación dependiente de Wnt3a en los cultivos de explantes de pulmón. Sin la adición de Wnt3a, la periferia del pulmón que contenía los brotes de pulmón en crecimiento muestra una tinción más intensa para PCNA que el epitelio bronquial situado más en el centro, lo que indica que la periferia del pulmón es más fuertemente proliferante que la parte central (figuras 2S+T). Sin embargo, la adición al medio de Wnt3a 500 ng/ml muestra un incremento global destacado en la intensidad y la frecuencia de tinción de PCNA en el epitelio bronquial situado en el centro, lo que indica que la proliferación es aumentada por Wnt3a en una dosis de Wnt3a 500 ng/ml (figuras 2U+V). Un incremento adicional de la concentración de Wnt3a hasta 750 ng/ml (figuras 2W+X) no conduce a un incremento adicional de la intensidad y la frecuencia de la tinción del PCNA, sino que, en cambio, es comparable con la situación de control (figuras 2S+T). La adición de Wnt3a 1000 ng/ml reduce la tinción de PCNA por debajo de la situación de control (figuras 2Y+Z), mientras que con Wnt3a 2000 y 4000 ng/ml (figuras 2AA +AD), la tinción de PCNA era completamente negativa, lo que indica que la proliferación se bloqueaba completamente, probablemente debido a la apoptosis inducida en el mesénquima y el epitelio (figura 2).

Para determinar adicionalmente el efecto a corto plazo de diferentes concentraciones de Wnt3A sobre la inducción de la proliferación, se cultivaron los explantes de pulmón (E12.5) durante 1 día con Wnt3a 0, 30, 125 y 500 ng/ml.

Se procesaron los explantes de pulmón para el análisis inmunohistoquímico y se tiñeron para la fosforilación de la Histona H3, que se puede utilizar como un marcador cuantificable de la proliferación celular, ya que está presente en una cantidad fija en cromosomas condensados sólo durante la división celular activa (material y métodos). Los resultados de esta cuantificación muestran que Wnt3A presenta un efecto estimulador significativo en la proliferación. Se observó un incremento de la proliferación global de más del 20% en las muestras de Wnt3A de 30, 125 y 500 ng/ml tratadas. Sin embargo, la mayor parte del incremento en la proliferación se pudo atribuir al mesénquima en el que se observó un incremento del 40 al 60% de células que experimentan apoptosis. Se encontró poca diferencia entre las diferentes concentraciones de Wnt3A, lo que indica que el efecto estimulador máximo de Wnt3A ya se alcanzó con Wnt3a 30 ng/ml (figura 3).

El efecto de Wnt3A de 4 ng/ml a 500 ng/ml en el crecimiento de pulmón fetal durante cuatro días.

Para determinar de manera más exacta la concentración de Wnt3a que es eficaz en el desarrollo, diferenciación y apoptosis pulmonar, se cultivaron explantes de pulmón fetal durante un periodo más largo (4 días) en presencia de concentraciones más bajas de Wnt3a, es decir: 0 ng/ml, 4 ng/ml, 20 ng/ml, 100 ng/ml y 500 ng/ml (figuras 4A-O).

Ninguna de estas concentraciones fue eficaz en el bloqueo completo de la diferenciación del desarrollo de pulmón fetal, aunque la diferenciación a una concentración de 500 ng/ml (figuras 4N+O) se retrasó tal como se mostraba mediante la morfología primordial del epitelio en comparación con la situación de control (figuras 4B+C). Entre 100 y 500 ng/ml, el mesénquima mostró un nivel de apoptosis creciente, mientras que el en epitelio no se pudieron detectar signos de apoptosis (figuras 4K+L y 4N+O).

Entre 4 y 20 ng/ml, no se observaron efectos claros a nivel de apoptosis y diferenciación en comparación con la situación de control (figuras 4B+C, 4E+F y 4H+I).

Análisis de la apoptosis mediante el ensayo TUNEL y de la proliferación activa mediante la incorporación de BrdU en explantes de pulmón tratados con Wnt3A de 4 ng/ml a 1000 ng/ml durante 4 días.

Los experimentos descritos anteriormente muestran que el efecto biológico visible de Wnt3A en la proliferación, apoptosis y diferenciación se encuentra en un intervalo de concentraciones entre 1 y 2000 ng/ml. Una concentración de 2000 ng/ml no es preferente ya que afecta a la viabilidad de todas las células y, de este modo, carece de especificidad. Una concentración por debajo de 1 ng/ml no muestra cambios morfológicos claros aunque una concentración de 30 ng/ml aumenta la proliferación de manera destacada después de 1 día. Se observaron efectos drásticos a nivel de apoptosis, proliferación y diferenciación. Para analizar adicionalmente el efecto de Wnt3a en la apoptosis y la proliferación, se cultivaron explantes de pulmón durante 4 días en presencia de 0, 4, 20, 100, 250, 500, 750 y 1000 ng/ml. A efectos de identificar si después del tratamiento con Wnt3A las células son viables y activas, se añadió BrdU proliferante al medio de cultivo que se incorpora en el ADN recién sintetizado de células proliferantes activas, dos horas antes de la fijación de los explantes de pulmón. El examen histológico en el día 4 mostró, al igual que antes, que el proceso de diferenciación se retrasaba fuertemente y reveló muchas células picnóticas a concentraciones de Wnt3a por encima de 100 ng/ml. Para investigar mejor este efecto, se analizaron secciones histológicas con el ensayo TUNEL, el cual detecta ADN fragmentado presente en células apoptóticas (material y métodos). Se detectó una señal de fondo baja de células positivas en TUNEL en los explantes tratados con placebo, aunque, sin embargo, se observó un incremento brusco en células positivas en TUNEL a concentraciones por encima de 100 ng/ml de Wnt3a que es proporciona al número de células picnóticas halladas en estas muestras (figura 5). A 1000 ng/ml, casi el 100% de las células mesenquimales eran picnóticas y también eran positivas en TUNEL, lo que indica que habían experimentado apoptosis (figura 4H). En cambio, casi ninguna de las células epiteliales era positiva en TUNEL, o contenía núcleos picnóticos, lo que indica que estas células son mucho menos sensibles para la apoptosis en comparación con las células mesenquimales (figura 5).

A efectos de identificar si las células epiteliales aún eran activamente proliferantes después de cuatro días de tratamiento con Wnt3a, se inmunotiñeron las secciones histológicas para BrdU incorporada (figura 6). A concentraciones de 500 ng/ml e inferiores, tanto el mesénquima como el epitelio contenían muchas células positivas en BrdU, y de este modo, proliferantes activas. A 1000 ng/ml, casi todas las células positivas en BrdU estaban presentes en el epitelio y sólo unas pocas estaban presentes en el mesénquima, lo que indica que a pesar de la inducción masiva de apoptosis en el mesénquima, el epitelio es viable y proliferante. Con Wnt3a 750 ng/ml, se observó un efecto intermedio en los explantes de pulmón tratados con Wnt3A entre 500 ng/ml y 1000 ng/ml (figura 6).

El tratamiento a largo plazo de cultivos de explantes de pulmón fetal con Wnt3a induce un desplazamiento dependiente de la dosis de la diferenciación de pulmón distal (alveolar) a la diferenciación de pulmón proximal (bronquial/traqueal).

Para determinar adicionalmente el efecto de Wnt3A en el desarrollo y la diferenciación del pulmón con el tiempo, se cultivaron explantes de pulmón fetal aislados en embriones aislados a E12.5 con Wnt3A a 0, 10, 50, 250, y 500 ng/ml durante 8 días. Dos horas antes de la fijación de los explantes de pulmón, se añadió BrdU al medio de cultivo que se incorpora en el ADN recién sintetizado de células proliferantes activas. Después de los diferentes puntos de tiempo, se procesaron los explantes de pulmón para el análisis histológico y la inmunotinción de genes marcadores.

Cultivo de ocho días sin Wnt3A:

El análisis histológico mostró que el desarrollo del pulmón a largo plazo en el sistema de cultivo de gota colgante sin adición de Wnt3A al medio, es comparable con el desarrollo del pulmón in vivo. Los explantes de pulmón sin Wnt3A se podían cultivar durante ocho días sin la señal de necrosis o apoptosis. La contracción del epitelio bronquial es visible después de uno a dos días de cultivo, lo que indica que las células de músculo liso se desarrollan a lo largo de las vías respiratorias. Esto se confirmó con la tinción inmunohistoquímica para actina de músculo liso (datos no mostrados). Después de ocho días se podían distinguir claramente varios tipos de células diferenciadas, tales como células cúbicas de tipo II, células claras secretoras, células de cartílago y las células alveolares de tipo I (figura 7A). Esto no está muy retrasado con respecto a la situación in vivo donde las células alveolares de tipo I se diferencian entre E17.5 y E19.5, que corresponden de este modo al día 5 y al día 7 del cultivo in vitro.

Cultivo de ocho días con Wnt3A de 10 a 250 ng/ml.

El tratamiento de los explantes de pulmón del día E12.5 mostró un cambio claro en la morfología, que se volvió más y más evidente con el tiempo, lo que indica que una concentración de Wnt3A tan pequeña como 10 ng/ml presenta efectos profundos en el desarrollo del pulmón. El análisis histológico de estos explantes después de ocho días mostró un alveolarización decreciente del epitelio distal. El aplanamiento del epitelio primordial en la célula de tipo I que tiene lugar durante la diferenciación del pulmón distal normal se inhibe con una concentración creciente de Wnt3A y a 250 ng/ml está casi completamente suprimido (figuras 7B-7E). De este modo, el desarrollo de pulmón distal es inhibido mediante el tratamiento con Wnt3A en un intervalo de concentración de Wnt3A, como mínimo, de 10 ng/ml hasta 250 ng/ml.

Cultivo de ocho días con Wnt3A 500 ng/ml.

La adición de Wnt3A presenta un efecto sorprendente en la diferenciación final de explantes de pulmón de E12.5. Los cultivos previos ya habían mostrado el efecto inhibidor a corto plazo en la ramificación de Wnt3A 500 ng/ml después de 1 día. Después de un tratamiento de ocho días con Wnt3A 500 ng/ml, la ramificación aún era suprimida de manera severa y se parecía en la morfología a los explantes de pulmón E12.5 aislados originales. Sin embargo, el análisis histológico y la inmunotinción con un anticuerpo antitubulina IV que marca el epitelio ciliado, mostraron que estos explantes consisten completamente en estructuras proximales que comprenden: epitelio bronquial compuesto de células ciliadas y células secretoras; cartílago y mesénquima. No se pudieron observar células de tipo I o de tipo II, lo que indica que la diferenciación del epitelio distal que comprende los compartimentos alveolar y bronquiolar era completamente inhibida mediante el tratamiento con Wnt3A 500 ng/ml (figura 7F). La administración de Wnt3A a concentraciones superiores a 250 ng/ml limita, de este modo, la diferenciación pulmonar a tipos de células halladas en las vías respiratorias superiores y, de este modo, es adecuada para el crecimiento selectivo de tipos de células de pulmón proximales a partir de tejido de pulmón primordial, una aplicación que es muy útil para generar tejido para tratar enfermedades o lesiones de las vías respiratorias superiores.

Wnt3a induce la acumulación de beta-catenina nuclear en células mesenquimales de pulmón.

A efectos de determinar si Wnt3A en realidad eleva la vía de señalización de Wnt en estos explantes, se tiñeron secciones histológicas para beta-catenina, el factor intracelular que junto con los miembros del grupo de movilidad elevada (HMG) de los factores de transcripción, tales como TCF1 y LEF, transducen la señal de Wnt al núcleo.

Los resultados mostraron que existe un incremento dependiente de la dosis de Wnt3A en la beta-catenina nuclear en los primeros dos días, que era especialmente prominente en las células mesenquimales que rodean los brotes de pulmón en crecimiento y ramificación en el compartimento distal del pulmón. Este efecto era máximo en los pulmones tratados con Wnt3A a 250 ng/ml y 500 ng/ml (figuras 8D + 8E) y había desaparecido en los cultivos de cuatro y ocho días (datos no mostrados).

Wnt3a induce una activación dependiente de la dosis de la expresión informadora de Wnt en tejido de pulmón fetal

Los resultados anteriores indican que el tejido de pulmón fetal es capaz de transducir la señal de Wnt mediante la adición de Wnt3A al cultivo. Para demostrar adicionalmente que Wnt3A es capaz de inducir la vía de señalización de Wnt en el tejido de pulmón, los presentes inventores realizaron el ensayo de informadores TopFlash/FopFlash en explantes de pulmón disociados aislados de embriones en E12.5. Los pulmones disociados se transfectaron simultáneamente con la construcción informadora TopFlash que es activada por los complejos de transcripción de beta-catenina nuclear. Esto se comparó con la activación de una construcción informadora FopFlash que está mutada en los sitios de unión de beta-catenina/TCF y mide sólo la expresión de base del promotor mínimo (Korinek, V., y otros, Mol. Cell. Biol. 18: 1248-1256, 1998). La proporción de la expresión de TopFlash con respecto a la expresión de FopFlash es una medida para la inducción de la vía de señalización de Wnt por Wnt3A. Las células transfectadas se trataron con diferentes concentraciones de Wnt3A que variaban entre 0,4 y 500 ng/ml de Wnt. Se observó una respuesta clara dependiente de la dosis de Wnt3A, lo que indica que las células de pulmón fetal presentan todos los componentes necesarios para recibir y translucir la vía de transducción de señal de Wnt (figura 9A)

A efectos de analizar si Wnt3A es capaz de activar la vía de transducción de la señal de Wnt en humanos, se estimularon tres líneas celulares diferentes de origen humano con Wnt3A y se midió la respuesta con el ensayo de informadores TopFlash/FopFlash. Las tres líneas celulares derivadas de pulmón humano fueron: la línea celular A549 de carcinoma epitelial de pulmón (figura 9B), la línea de fibroblastos de pulmón normal HFL-1 (figura 9C) y la línea celular calu-3 de adenocarcinoma epitelial (figura 9D). Los resultados revelaron que las tres líneas celulares respondían a Wnt3A de una manera dependiente de la dosis, lo que indica que las células de pulmón humano y de ratón son capaces de recibir y translucir la señal de Wnt tras la estimulación con Wnt3A.

El perfil de expresión demuestra que Wnt3A inhibe la diferenciación de explantes de pulmón fetal.

Para investigar adicionalmente el efecto de la inhibición de Wnt3A en la diferenciación pulmonar, se analizaron los perfiles de expresión de explantes de pulmón tratados con Wnt3A con análisis “microarray” utilizando el juego de chips de Affymetrix MOE430AB, que contiene el transcriptoma completo de ratón. Los explantes de pulmón, por condición 10 pulmones fetales completos aislados de embriones en E12.5, se trataron durante 4 horas con Wnt3A de 0 y 250 ng/ml (Wnt 0/4h y Wnt 250/4h, respectivamente), y durante 24 horas para Wnt3A de 0, 10, 50 y 250 ng/ml (Wnt 0/24h, Wnt 10/24h, Wnt 50/24h, Wnt 250/24h, respectivamente). Se aislaron juntos los 60 explantes de pulmón de 6 ratones suizos preñados y se distribuyeron al azar sobre 6 condiciones diferentes. Después del periodo de tiempo indicado, se aisló el ARN total, el cual se procesó para la síntesis de una sonda para la hibridación sobre los juegos de chips MOE-430AB. Los resultados muestran un fuerte efecto de Wnt3A en la expresión génica en los explantes de pulmón. Se observó una respuesta rápida cuando los pulmones se trataron durante 4 horas con Wnt3A 250 ng/ml. Un gran número de genes se expresaron de manera diferencial en más de dos veces entre el grupo Wnt250/4h y el grupo Wnt0/4h, es decir, 446 genes en regulados hacia arriba y 1165 genes regulados hacia abajo. Según las expectativas, se encontraron muchos genes conocidos sensibles a Wnt en el grupo de genes regulados hacia arriba, mostrando de nuevo que la vía de Wnt se activaba en estos explantes de pulmón.

En los explantes tratados durante 24 horas, se observó un efecto menos pronunciado. En el grupo tratado con Wnt3a 10 ng/ml, 209 genes se regularon hacia arriba y 223 genes se regularon hacia abajo en más de 2 veces. En el grupo tratado con 50 ng/ml, 95 y 92 genes se regularon hacia arriba y hacia abajo, respectivamente. En el grupo tratado con 250 ng/ml, 195 y 152 genes se regularon hacia arriba y hacia abajo en más de dos veces, respectivamente. Sin embargo, debe indicarse que una concentración mínima de Wnt3A de 10 ng/ml es capaz de inducir cambios significativos en la expresión génica. Existe una fuerte correlación en el comportamiento de los genes en los grupos tratados con Wnt3A durante 24 horas. Los genes regulados hacia arriba (o hacia abajo) en uno de estos grupos también se regularon hacia arriba (o hacia abajo) en los otros dos grupos. De manera destacada, existe una correlación opuesta entre los genes regulados hacia arriba o hacia abajo en el grupo tratado durante 4 horas en comparación con los genes en el grupo tratado durante 24 horas. En otras palabras, los genes regulados hacia arriba en el grupo tratado durante 4 horas se regularon hacia abajo en el grupo tratado durante 24 horas y viceversa.

El análisis por grupos de los perfiles de expresión de genes significativamente diferentes en uno de los 6 grupos (4500 genes), en el que se agrupan los genes con un nivel de expresión comparable, muestra claramente que los tres grupos tratados con Wnt3A 10, 50 y 250 ng/ml durante 24 horas, responden de manera similar (figura 10). De manera destacada, el análisis por grupos de 4500 genes cambiados significativamente (p< 0,000001) muestra que los perfiles de expresión de estos tres pulmones tratados con Wnt3A durante 24 horas están fuertemente relacionados con los pulmones no tratados durante 4 horas, y estas 4 condiciones se parecen entre sí más que los pulmones no tratados durante 24 horas. Esto demuestra que el transcriptoma de pulmones cultivados durante 24 horas permanece más joven que cuando se cultivan en presencia de Wnt3A. En otras palabras, la Wnt3A inhibe, como mínimo, parcialmente, la diferenciación de tejido de pulmón fetal.

El análisis por grupos también muestra que el grupo tratado con Wnt3A durante 4 horas presenta el perfil de expresión más diferente de los 6 grupos. Además, muestra que este perfil es para la mayoría de genes (aproximadamente el 75%) opuesto a los perfiles de los grupos tratados con Wnt3A durante 24 horas. Aparentemente, tiene lugar un mecanismo de fuerte retroalimentación en la estimulación con Wnt3A después de 24 horas. Un mecanismo que finalmente da lugar a la inhibición de la diferenciación y el desarrollo del pulmón.

Conclusiones

En este ejemplo, se ha mostrado que la adición de Wnt3A induce la acumulación nuclear de beta-catenina en tejido de pulmón primordial; la clave de la transducción de la señal de Wnt. Además, se ha mostrado que la administración de Wnt3A induce la expresión de una construcción de wnt-informador transfectada en tejido de pulmón fetal con, como mínimo, entre 10 y 1000 ng/ml de Wnt3A. De este modo, el pulmón primordial tiene todos los componentes necesarios de la vía de transducción de señal de wnt para reconocer el polipéptido Wnt3a y para transducir su señal intracelular.

La adición de Wnt3a tiene un efecto profundo en el desarrollo de pulmón fetal. La diferenciación, la proliferación celular y la apoptosis se alteran ampliamente tras la adición de Wnt3a al medio de cultivo. La concentración eficaz depende del tipo de célula y de la función celular.

Utilizando criterios morfológicos, el análisis de genes marcadores y el análisis por “microarray” los presentes inventores demostraron que la diferenciación del epitelio pulmonar primordial es inhibida de manera eficaz con Wnt3A en una concentración entre 10 y 2000 ng/ml con un valor óptimo entre 50 y 500 ng/ml.

La proliferación del epitelio bronquial y alveolar aumenta de manera destacada con Wnt3a entre 30 y 500 ng/ml de medio de cultivo, mientras que a concentraciones superiores a 2000 ng/ml se inhibe la proliferación.

La apoptosis en el mesénquima se induce a concentraciones superiores a 100 ng/ml, mientras que la apoptosis en el epitelio se induce a concentraciones superiores a 1000 ng/ml. De este modo, el mesénquima es mucho más sensible para la apoptosis inducida por Wnt3A que en el epitelio.

Los efectos de Wnt3a en la diferenciación, proliferación y apoptosis dependen fuertemente del tipo de célula y la dosis. Los presentes resultados muestran que a ciertas concentraciones de Wnt3a, se puede, a la vez, inhibir la diferenciación alveolar, aumentar la proliferación epitelial e inducir la apoptosis en células mesenquimales. El intervalo en que tiene lugar estos tres sucesos en el sistema de cultivo de gota colgante es entre 100 y 1000 ng de Wnt3a por ml de medio de cultivo. Por lo tanto, la adición de Wnt3a es adecuada para cultivar selectivamente y expandir el número total de la población de células madre no diferenciadas del pulmón y para inducir selectivamente la apoptosis en una población de células mesenquimales.

Además, los presentes inventores han demostrado que Wnt3A no sólo inhibe la diferenciación, también limita la diferenciación a lo largo del eje proximal-distal del pulmón. El efecto biológico también depende de la dosis con la concentración de Wnt3A. Como regla general, cuanto mayor es la concentración de Wnt3A, más limitada es la diferenciación a los tipos de tejidos presentes en la parte proximal del pulmón, es decir, el epitelio traqueal con mesénquima y cartílago circundante. El intervalo de concentraciones en el que este efecto biológico tuvo lugar está en el intervalo de 10-1000 ng/ml. A una concentración de Wnt3A entre 10 y 250 ng/ml, se suprimió la diferenciación de epitelio distal, mientras que a una concentración de Wnt3a entre 250 y 1000 ng/ml, la diferenciación se limitó principalmente al tejido pulmonar proximal, tal como el epitelio bronquial, el epitelio traqueal y el cartílago. La adición de una cierta concentración de polipéptido Wnt3A es por tanto útil para la diferenciación selectiva de células de pulmón primordiales en tejido pulmonar proximal. Este tejido es entonces, a su vez, adecuado para el tratamiento de enfermedades o lesiones de las vías respiratorias superiores.

Leyendas para las figuras

Figuras 1A-1H: Cultivo de explantes de pulmón y posterior análisis inmunohistológico después de cinco días, sin la adición (figuras 1A-D y 1I+J) y con la adición de Wnt3a (1000 ng/ml, figuras 1 E-H y 1 K+L). Cabe destacar la detención de la diferenciación alveolar, el carácter primordial del epitelio y la inducción masiva de apoptosis en el mesénquima en presencia de Wnt3a cinco días después del inicio del cultivo.

Figuras 1I-1L: Análisis inmunohistoquímico de la utilización de PCNA como marcador para la proliferación. Figuras 1I+J; tinción con PCNA cinco días después del inicio del cultivo sin la adición de Wnt3a. Figuras 1K+L; tinción con PCNA después de cinco cías de cultivo en presencia de Wnt3a (1000 ng/ml). Cabe destacar la fuerte reducción en la proliferación del mesénquima frente al epitelio en presencia Wnt3a.

Figuras 2A-2R: Cultivo de explantes de pulmón y posterior análisis histológico 2 días después del inicio del cultivo en presencia de Wnt3a a una concentración de 0 ng/ml (2A-C); 500 ng/ml (2D-F); 750 ng/ml (2G-I); 1000 ng/ml (2J-L); 2000 ng/ml (2M-O) y 4000 ng/ml (2P-R).

Cabe destacar el número creciente de célula apoptóticas en el mesénquima con una concentración de Wnt3a por encima de 500 ng/ml y la inducción de la apoptosis en el epitelio con una concentración de Wnt3a por encima de 2000 ng/ml.

Figuras 2S-2AD: Análisis inmunohistoquímico de la utilización de PCNA como marcador para la proliferación 2 días después del inicio del cultivo en presencia de Wnt3a a una concentración de 0 ng/ml (2S+T); 500 ng/ml (2U+V); 750 ng/ml (2W+X); 1000 ng/ml (2Y+Z); 2000 ng/ml (2AA+AB) y 4000 ng/ml (2AC+AD).

Cabe destacar la elevada tinción con PCNA, en comparación con el control, en el epitelio bronquial en presencia de Wnt3a 500 y 750 ng/ml y la ausencia de proliferación a concentraciones por encima de 2000 ng/ml.

Figura 3: Proliferación en explantes de pulmón fetal cultivados durante 1 día con la adición de 0 ng/ml, 30 ng/ml, 125 ng/ml y 250 ng/ml de Wnt3A. Se contó el número total de células y de células mesenquimales después de la tinción inmunohistoquímica contra fosfo histona H3 (ser10).

Figuras 4 A-O: Cultivo de explantes de pulmón y posterior análisis histológico 4 días después del inicio del cultivo en presencia de Wnt3a a una concentración de 0 ng/ml (4A-C); 4 ng/ml (4D-F); 20 ng/ml (4G-I); 100 ng/ml (4J-L); y 500 ng/ml (4M-O). Cabe destacar el número creciente de células apoptóticas en el mesénquima a una concentración de Wnt3a por encima de 100 ng/ml y el carácter no diferenciado del epitelio cuatro días después del cultivo en presencia de Wnt3a 500 ng/ml (4M-O).

Figuras 5 A-H: Inducción de apoptosis por Wnt3A.

El ensayo de TUNEL se realizó sobre secciones histológicas de explantes de pulmón fetal, cultivados durante 4 días en presencia de Wnt3a a una concentración de 0 ng/ml (5A); 0,4 ng/ml (5B); 2 ng/ml (5C); 10 ng/ml (5D); 50 ng/ml (5E); 250 ng/ml (5F); 500 ng/ml (5G) y 1000 ng/ml (5H). Cabe destacar el incremento general en células apoptóticas (marrón) en el mesénquima con una concentración de Wnt3A por encima de 100 ng/ml y la inducción masiva de apoptosis en el mesénquima a diferencia del epitelio no afectado a 1000 ng/ml, ilustrando la diferencia en sensibilidad por la apoptosis inducida por Wnt3A entre el mesénquima y el epitelio.

Figuras 6 A-H: Efecto de Wnt3A en la proliferación en el mesénquima y el epitelio.

La incorporación de BrdU en ADN recién sintetizado se analizó mediante inmunotinción de secciones histológicas de explantes de pulmón fetal cultivados durante 4 días en presencia de Wnt3a a una concentración de 0 ng/ml (6A); 0,4 ng/ml (6B); 2 ng/ml (6C); 10 ng/ml (6D); 50 ng/ml (6E); 250 ng/ml (6F); 500 ng/ml (6G) y 1000 ng/ml (6H).

Figura 7: El efecto de Wnt3A en la diferenciación final de pulmón.

Los explantes de pulmón se cultivaron durante ocho días en presencia de Wnt3A con concentraciones de 0 ng/ml (7A + B), 10 ng/m (7C), 50 ng/ml (7D), 250 ng/ml (7E) y 500 ng/ml (7F). Después de bañar las secciones histológicas, éstas se tiñeron con un anticuerpo tubulina-IV para marcar el epitelio bronquial ciliado. Además, las secciones se contratiñeron con Hematoxilina y Azul alciano que tiñeron la mucosidad secretada del epitelio bronquial y el cartílago asociado con el epitelio traqueal. Cabe destacar la abundancia de epitelio traqueal, mucosidad y cartílago en la muestra tratada con Wnt3A 500 ng/ml (7F). Además, cabe destacar la pérdida de epitelio aplanado (células alveolares tipo I) con una dosis creciente de Wnt3A.

Figura 8: Translocación nuclear de beta-catenina por Wnt3A en explantes de pulmón fetal.

La translocación de beta-catenina se determinó utilizando análisis inmunohistólogico de secciones histológicas de explantes de pulmón fetal (E12.5), cultivados durante 2 días en presencia de Wnt3a a una concentración de 0 ng/ml (8A); 10 ng/ml (8B); 50 ng/ml (8C); 250 ng/ml (8D); 500 ng/ml (8E) y 1000 ng/ml (8F). Cabe destacar la fuerte inducción de beta-catenina nuclear en el mesénquima que flanquea el epitelio de los brotes de pulmón en crecimiento a concentraciones de Wnt3A de 250 ng/ml (8D) y 500 ng/ml (8E).

Figuras 9 A-D: Inducción de la vía de señalización de Wnt por Wnt3A en células de pulmón humanas y de ratón.

La inducción de la vía de señalización de Wnt se midió realizando un ensayo de informadores Top Flah/Fop Flash sobre fibroblastos de pulmón primarios aislados de pulmón fetal en E12.5 (9A), la línea celular epitelial humana adulta A549 (9B), la línea celular de fibroblastos humanos fetales HFL-1 (9C), y la línea celular epitelial humana adulta calu-3 (9D).

Cabe destacar la fuerte inducción de la vía de señalización de Wnt en las tres líneas celulares humanas, lo que indica que Wnt3A, como en ratón, es capaz de inducir la vía de Wnt en humanos.

Leyenda para la figura 10:

El análisis por grupos y la relación de los perfiles de expresión de 4500 genes cambió significativamente (p<10-6) en la expresión en uno de los seis cultivos de explantes de pulmón fetal sometidos a Wnt3A 0 ng/ml durante 4 horas (0 Wnt/4h); Wnt3A 250 ng/ml durante 4 horas (250 Wnt/4h); Wnt3A 0 ng/ml durante 24 horas (0 Wnt/24h); Wnt3A 10 ng/ml durante 24 horas (10 Wnt/24h); 50 ng de Wnt3A durante 24 horas (50 Wnt/24h); 250 ng de Wnt3A durante 24 horas (250 Wnt/24h). Los niveles de expresión de los 4500 genes se colocaron en seis filas en las que el nivel de expresión de cada gen en relación con su nivel de expresión promedio observado en las seis condiciones se representa mediante una barra coloreada. Una barra verde corresponde al gen expresado por debajo de su nivel de expresión promedio y una barra roja corresponde a genes expresados por encima de su nivel de expresión promedio.

Cabe destacar los perfiles de expresión comunes de los cultivos de pulmón fetal tratados durante 24 horas con Wnt3A a las concentraciones de 10 ng/ml, 50 ng/ml y 250 ng/ml y su similitud más próxima con el perfil de expresión de cultivos de pulmón no tratados más jóvenes (0 Wnt/4h) que con el perfil de expresión de cultivos de pulmón no tratados de la misma edad (0 Wnt/24h), lo que indica que el tratamiento con Wnt3A inhibe la diferenciación y el desarrollo pulmonar.

Referencias

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10 Willert K, Brown JD, Danenberg E, Duncan AW, Weissman IL, Reya T, Yates JR 3º, Nusse R. Wnt proteins are lipidmodified and can act as stem cell growth factors (“Las proteínas Wnt son modificadas por lípidos y pueden actuar como factores de crecimiento de células madre”). Nature. 22 de mayo del 2003; 423(6938): 448-52.

15 Wodarz A y Nusse R. 1998. Mechanisms of Wnt signaling in development (“Mecanismos de señalización de Wnt en el desarrollo”). Annu Rev Cell Dev Biol, 14:59-88.

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Método in vitro para inhibir la diferenciación de una célula madre de pulmón, que comprende disponer dicha célula madre con Wnt3a o con una variante de Wnt3a biológicamente activa que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a.

2. 2.

   Método in vitro para inducir la proliferación de una célula madre de pulmón mediante la inhibición de la diferenciación de dicha célula madre, que comprende disponer dicha célula madre con Wnt3a o con una variante de Wnt3a biológicamente activa que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a.

3. 3.

   Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicha célula madre se dispone con Wnt3a o con una variante de Wnt3a biológicamente activa que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a, en una cantidad, como mínimo, de 1 ng y, como máximo, de 2000 ng por ml de fluido de cultivo de tejido.

4. 4.

   Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la cantidad de Wnt3a o de una variante de Wnt3a biológicamente activa que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a, es, como mínimo, de 10 a, como máximo, 1500 ng por ml de fluido de cultivo de tejido.

5. 5.

   Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la cantidad de Wnt3a o de una variante de Wnt3a biológicamente activa que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a, es, como mínimo, de 20 a, como máximo, 1000 ng por ml de fluido de cultivo de tejido.

6. 6.

   Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la cantidad de Wnt3a o de una variante de Wnt3a biológicamente activa que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a, es, como mínimo, de 30 a, como máximo, 500 ng por ml de fluido de cultivo de tejido.

7. 7.

   Método in vitro para enriquecer una población de células madre de pulmón en una población de células mesenquimales que comprende dichas células madre de pulmón, mediante la inducción de la apoptosis en las células mesenquimales mediante la disposición de dichas células mesenquimales con Wnt3a o con una variante de Wnt3a biológicamente activa que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a.

8. 8.

   Método, según la reivindicación 7, en el que dicha célula madre mesenquimal se dispone con Wnt3a o con una variante de Wnt3a biológicamente activa que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a, en una cantidad, como mínimo, de 50 ng y, como máximo, de 1500 ng por ml de fluido de cultivo de tejido.

9. 9.

   Método, según la reivindicación 7 u 8, en el que dicha célula madre mesenquimal se dispone con Wnt3a o con una variante de Wnt3a biológicamente activa que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a, en una cantidad, como mínimo, de 100 ng y, como máximo, de 1000 ng por ml de fluido de cultivo de tejido.

10. 10.

    Método in vitro para proporcionar un conjunto de células madre de pulmón a partir de una población de células mesenquimales y de células madre de pulmón, que comprende disponer dichas células mesenquimales con una cantidad inductora de la apoptosis de Wnt3a o de una variante de Wnt3a biológicamente activa que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a, y disponer dichas células madre de pulmón con una cantidad inhibidora de la diferenciación de Wnt3a o de una variante de Wnt3a biológicamente activa que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a.

11. 11.

    Método, según la reivindicación 10, en el que dicha Wnt3a o variante de Wnt3a biológicamente activa que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a se dispone en una cantidad, como mínimo, de 50 ng y, como máximo, de 1500 ng por ml de fluido de cultivo de tejido.

12. 12.

    Método, según la reivindicación 10 u 11, en el que la diferenciación de un tipo de célula de pulmón distal es inhibida, como mínimo, parcialmente, mediante la administración de 10-250 ng de Wnt3a o de una variante de Wnt3a biológicamente activa que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a por ml de fluido de cultivo de tejido.

13. 13.

    Método, según la reivindicación 12, en el que dicho tipo de célula de pulmón distal es una célula alveolar de tipo I

    o tipo II.

14. 14.

    Método, según la reivindicación 10 u 11, en el que se incrementa selectivamente la proliferación y la diferenciación de un tipo de célula de las vías respiratorias superiores mediante la administración de 10-750 ng de Wnt3a o de una variante de Wnt3a biológicamente activa que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la

    secuencia de aminoácidos con Wnt3a por ml de fluido de cultivo de tejido.

15. 15.

    Método, según la reivindicación 14, en el que dicho tipo de célula de las vías respiratorias superiores es una

    célula epitelial traqueal y/o bronquial. 5
16. 16. Utilización de Wnt3a o de una variante de Wnt3a biológicamente activa que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la insuficiencia pulmonar, deficiencia del surfactante pulmonar, enfisema, distrés respiratorio crónico y/o cáncer de pulmón.