ES2374854T3

ES2374854T3 - Hidrolizado proteico de lactosuero.

Info

Publication number: ES2374854T3
Application number: ES08736283T
Authority: ES
Inventors: Gitte Budolfsen Lynglev; Per Munk Nielsen
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2007-04-16
Filing date: 2008-04-16
Publication date: 2012-02-22
Anticipated expiration: 2028-04-16
Also published as: ATE527896T1; NZ579708A; PL2146589T3; US8222372B2; CN101801209B; AU2008237912B2; EP2146589A2; US20080254505A1; BRPI0810149A2; CN101801209A; DK2146589T3; WO2008125685A2; EP2146589B1; AU2008237912A1; WO2008125685A3

Abstract

Método para la producción de un hidrolizado proteico de lactosuero comprendiendo: a) provisión de una composición acuosa de proteína de lactosuero comprendiendo beta-lactoglobulina y alfalactoalbúmina; b) sometimiento de dicha composición a la acción de una endopeptidasa microbiana que específicamente divide en el lado carboxi-terminal de arginina o lisina; e c) inactivación de la endopeptidasa.

Description

Hidrolizado proteico de lactosuero

5 Campo técnico

[0001] La presente invención se refiere a un método para la producción de un hidrolizado proteico de lactosuero usando una endopeptidasa microbiana.

10 Antecedentes de la invención

[0002] Suplementos de proteína, como polvo de proteína de lactosuero, se utilizan comúnmente por culturistas y otros atletas para acelerar el desarrollo muscular y la ayuda en la recuperación. Asimismo, estos suplementos de proteína son útiles para nutrición clínica.

15 En general, predigeridas, las proteínas de lactosuero parcialmente hidrolizadas se absorben más fácilmente que las proteínas no hidrolizadas, porque los hidrolizados de proteínas se considera que tienen beneficios nutritivos. Pero mientras que la proteína de lactosuero no hidrolizada tiene un sabor a leche de moderado a ligero, la proteína de lactosuero hidrolizada tiende a saber bastante diferente, normalmente de manera que muchos la encuentran indeseable. Por lo tanto, cuando estos hidrolizados se usan en, por ejemplo, bebidas, el sabor tiene que ser enmascarado, por

20 ejemplo, por adición de sabor artificial.

[0003] Hidrólisis de proteína usando endopeptidasas específicas se conoce en la técnica, ver, por ejemplo, WO97/43910

o US 5 866 357. La hidrólisis de beta-lactoglobulina, que es una de las proteínas presentes en proteína de lactosuero, se ha estudiado en

25 Madsen et al. (1997), Int. Dairy Journal, 7, pp. 399-409. Hidrólisis de epítopos de beta-lactoglobulina con proteasas diferentes se describe también en Food Proteins and Their Applications; Ed. S. Damodaran & A. Paraf; Marcel Dekker, New York, 1997; pp. 443-472.

Resumen de la invención

30 [0004] Los presentes inventores han encontrado sorprendentemente un método para la producción de un hidrolizado proteico de lactosuero, donde la proteína de lactosuero está sujeta a tratamiento con una endopeptidasa microbiana con especificidad para arginina y lisina, seguido de inactivación de la endopeptidasa, que da lugar a un hidrolizado con un sabor agradable.

35 El hidrolizado puede incluso tener un sabor mejor que la proteína de lactosuero no hidrolizada. Además, el hidrolizado proteico de lactosuero obtenido por el método de la invención es estable y tiene una tendencia reducida a gel sobre tratamiento térmico en comparación con hidrolizados obtenidos con otras endopeptidasas.

[0005] La presente invención, por lo tanto, se refiere a un método para la producción de un hidrolizado proteico de 40 lactosuero comprendiendo:

a) provisión de una composición acuosa de proteína de lactosuero comprendiendo beta-lactoglobulina y alfalactoalbúmina; b) sometimiento de dicha composición a la acción de una endopeptidasa microbiana que específicamente

45 divide en el lado carboxi-terminal de arginina o lisina; y c) inactivación de la endopeptidasa.

[0006] La presente invención también se refiere al uso de un hidrolizado proteico de lactosuero obtenido por el método de arriba en la nutrición clínica o en una bebida energética o una bebida deportiva. 50 Descripción detallada de la invención

[0007] Como se ha mencionado anteriormente, la presente invención se refiere a un método para la producción de un hidrolizado proteico de lactosuero comprendiendo:

55 a) provisión de una composición acuosa de proteína de lactosuero comprendiendo beta-lactoglobulina y alfalactoalbúmina; b) sometimiento de dicha composición a la acción de una endopeptidasa microbiana que específicamente divide en el lado carboxi-terminal de arginina o lisina; y

60 c) inactivación de la endopeptidasa.

[0008] La proteína de lactosuero para usarse en el método de la invención debe entenderse como proteínas que pueden obtenerse de lactosuero, como proteínas aisladas del lactosuero. El lactosuero puede definirse como la parte líquida que se separa cuando la leche coagula por ácido y/o cuajo.

65 El lactosuero puede así ser un subproducto de producción de queso o de producción de caseína.

Leche en el contexto de la presente invención puede derivarse de cualquier mamífero, como vacas, cabras, oveja, burros, camellos, camélidos, yacs, o búfalos. En un aspecto preferido, la leche es leche de vaca.

[0009] Proteína de lactosuero para ser usada en el método de la invención comprende beta-lactoglobulina y alfalactoalbúmina. Puede también comprender otras proteínas obtenibles de lactosuero, como albúmina de suero. La composición acuosa del paso a) puede también comprender otras proteínas que no son obtenibles de lactosuero.

[0010] En un aspecto preferido, la composición acuosa del paso a) comprende al menos 15%, tal como al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55% o al menos 60% de beta-lactoglobulina de materia seca total. En otro aspecto preferido, la composición acuosa del paso a) comprende al menos 5%, tal como al menos 10%, al menos 15% o al menos 20% de alfa-lactoalbúmina de materia seca total. En otro aspecto, la composición acuosa del paso a) comprende al menos 1%, tal como al menos 2%, al menos 3%, al menos 4% o al menos 5% de albúmina de suero de materia seca total.

[0011] En otro aspecto preferido, la composición acuosa del paso a) comprende al menos 15% (p/p), tal como al menos 20% (p/p), al menos 25% (p/p), al menos 30% (p/p), al menos 35% (p/p), al menos 40% (p/p), al menos 45% (p/p), al menos 50% (p/p), al menos 55% (p/p) o al menos 60% (p/p) de beta-lactoglobulina de proteína total. En otro aspecto preferido, la composición acuosa de paso a) comprende al menos 5% (p/p), tal como al menos 10% (p/p), al menos 15% (p/p) o al menos 20% (p/p) de alfa-lactoalbúmina de proteína total. En otro aspecto, la composición acuosa de paso a) comprende al menos 1% (p/p), tal como al menos 2% (p/p), al menos 3% (p/p), al menos 4% (p/p) o al menos 5% (p/p) de albúmina de suero de proteína total.

[0012] Preferiblemente, la proteína de lactosuero ha sido aislada del lactosuero y la proporción entre beta-lactoglobulina y alfa-lactoalbúmina es en esencia la misma que en el lactosuero donde esta fue aislada.

[0013] En una forma de realización preferida, la proteína de lactosuero usada en el método puede ser un concentrado de proteína de lactosuero, que tiene un contenido de proteína de aproximadamente 29% a menos de sobre 90% en una base sin humedad. Concentrados de proteína de lactosuero contienen un bajo nivel de grasa y colesterol, pero generalmente tienen niveles más altos de carbohidratos en forma de lactosa.

[0014] En otra forma de realización, la proteína de lactosuero puede ser un aislado de proteína de lactosuero. En general, aislados de proteína de lactosuero tienen un contenido de proteína de al menos sobre 90% de proteína de lactosuero en una base sin humedad. Estos aislados han sido procesados en general para eliminar la grasa y la lactosa.

[0015] La proteína de lactosuero para ser usada en el método de la invención puede ser una mezcla de concentrado de proteína de lactosuero y aislado de proteína de lactosuero.

[0016] La proteína de lactosuero puede comprender proteínas de lactosuero intactas o esta puede comprender proteínas de lactosuero parcialmente hidrolizadas.

[0017] En el método de la invención, el material de proteína de lactosuero se mezcla o se dispersa típicamente en el agua para formar un compuesto acuoso comprendiendo sobre 1% a sobre 20% de proteína en peso. En una forma de realización, el compuesto acuoso puede comprender sobre 1% a sobre 5% de proteína en peso. En otra forma de realización, el compuesto acuoso puede comprender sobre 6% a sobre 10% de proteína en peso. En otra forma de realización, el compuesto acuoso puede comprender sobre 11% a sobre 15% de proteína en peso. En todavía otra forma de realización, el compuesto acuoso puede comprender sobre 16% a sobre 20% de proteína en peso.

[0018] Después de que el material de proteína se dispersa en agua, el pH y la temperatura del compuesto acuoso de proteína se puede ajustar para optimizar la reacción de hidrólisis, y, en particular, para asegurar que la endopeptidasa usada en la reacción de hidrólisis funciona cerca de su nivel de actividad óptimo. El pH del compuesto acuoso de proteína se puede ajustar y controlar según métodos generalmente conocidos en la técnica. El pH del compuesto acuoso de proteína se puede ajustar y mantener a de sobre 5,0 a sobre 10,0. En una forma de realización, el pH del compuesto acuoso de proteína se puede ajustar y mantener a de sobre 6,5 a sobre 8,0. En una forma de realización preferida, el pH del compuesto acuoso de proteína se puede ajustar y mantener a sobre 7,5. La temperatura del compuesto acuoso de proteína se ajusta y se mantiene preferiblemente a de sobre 40°C a sobre 70°C durante la reacción de hidrólisis conforme a métodos conocidos en la técnica. En una forma de realización preferida, la temperatura del compuesto acuoso de proteína se puede ajustar y mantener a de sobre 40°C a sobre 60°C durante la reacción de hidrólisis.

En general, temperaturas superiores a este intervalo pueden inactivar la endopeptidasa, mientras temperaturas inferiores o superiores a este intervalo tienden a ralentizar la actividad de la endopeptidasa.

[0019] La reacción de hidrólisis se inicia generalmente añadiendo una endopeptidasa al compuesto acuoso de material de proteína.

[0020] Endopeptidasas para ser usadas en el método de la invención dividen específicamente en el lado del carboxiterminal de o bien un residuo de arginina o un residuo de lisina. Por "dividir específicamente" se entiende que la endopeptidasa tiene una especificidad más alta para la división en el lado carboxi-terminal de o bien arginina o lisina que para la división en el lado carboxi-terminal de cualquier otro aminoácido. En una forma de realización, la endopeptidasa específicamente divide en el lado carboxi-terminal de arginina, significando que la endopeptidasa tiene una especificidad más alta para la división en el lado carboxi-terminal de arginina que para la división en el lado carboxi-terminal de cualquier otro aminoácido.

[0021] Típicamente, la endopeptidasa tiene actividad proteolítica óptima a un pH de sobre 6,0 a sobre 11,0, preferiblemente a un pH de sobre 8 a sobre 10, y a una temperatura de sobre 40°C a sobre 70°C, preferiblemente a una temperatura de sobre 45°C a sobre 60°C o de sobre 45°C a sobre 55°C.

[0022] Una endopeptidasa para ser usada en el método de la invención es de origen microbiano. El uso de enzimas microbianas, mejor que enzimas animales o vegetales, es ventajoso en que las enzimas microbianas muestran un amplio espectro de características (pH óptimo, temperatura, etc.) y puede obtenerse consistentemente en cantidades relativamente grandes.

[0023] La endopeptidasa es preferiblemente una endopeptidasa de tipo tripsina de origen microbiano. En el contexto de la presente invención, una endopeptidasa de tipo tripsina es una endopeptidasa con una especificidad similar al de la tripsina, por ejemplo, una endopeptidasa con una proporción de tripsina superior a 100, donde la proporción de tripsina se determina como la actividad de la enzima cuando la división después de Arg o Lys (el que sea el más grande) dividida por la actividad de la enzima cuando división después de cualquier otro aminoácido. Estas mediciones de actividad para determinar la proporción de tripsina deberían realizarse a un valor de pH en el que la actividad de la endopeptidasa es al menos la mitad de la actividad de la endopeptidasa en su pH óptimo. La proporción de tripsina se puede determinar como se describe en el ejemplo 3 de la presente solicitud.

[0024] En una forma de realización, la endopeptidasa es una endopeptidasa bacteriana.

[0025] En otra forma de realización, la endopeptidasa es una endopeptidasa fúngica. En una forma de realización preferida, la endopeptidasa es de una cepa de Fusarium, preferiblemente Fusarium oxysporum, por ejemplo, con la secuencia de aminoácidos mostrada como en SEC ID nº: 2 de la presente solicitud (SWISSPROT n°. P35049). Una endopeptidasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum con la secuencia de aminoácidos mostrada como aminoácidos 25-248 de SEC ID nº: 2 se ha descrito previamente (US5,288,627; US5,693,520).

[0026] En una forma de realización, la endopeptidasa es una endopeptidasa de tipo tripsina de Achromobacter lyticus, por ejemplo, con la secuencia de aminoácidos mostrada como en SEC ID nº: 4 de la presente solicitud (UNIPROT:P15636). En otra forma de realización, la endopeptidasa es una endopeptidasa de tipo tripsina de Fusarium solani, por ejemplo, AP977S con la secuencia de aminoácidos mostrada como en la SEC ID nº: 6 de la presente solicitud (GENESEQP: ADZ80577). En otra forma de realización, la endopeptidasa es una endopeptidasa de tipo tripsina de Fusarium cf. solani, por ejemplo, AP971 con la secuencia de aminoácidos mostrada como en la SEC ID nº: 8 de la presente solicitud.

[0027] En una forma de realización de la invención, la endopeptidasa se selecciona del grupo consistente en:

i) un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que es al menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98% idéntico a (A) cualquiera de SEC ID Nº: 2, 4, 6 o 8, o (B) un fragmento de cualquiera de estas secuencias con actividad de proteasa; ii) un polipéptido que se codifica por un polinucleótido que es al menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98% idéntico a cualquiera de SEC ID Nº: 1, 3, 5 o 7; iii) un polipéptido que se codifica por un polinucleótido cuyo complemento hibridiza bajo al menos condiciones de astringencia bajas, preferiblemente al menos astringencia media, al menos astringencia alta o al menos condiciones de astringencia muy altas, con cualquiera de SEC ID Nº: 1, 3, 5 o 7; y

iv) un polipéptido con una secuencia de aminoácidos modificado por sustitución, deleción y/o inserción de uno o diferentes aminoácidos en (A) cualquiera de SEC ID Nº: 2, 4, 6 o 8, o (B) un fragmento de cualquiera de estas secuencias con actividad de proteasa.

[0028] Un fragmento de secuencias de un aminoácido con actividad de proteasa puede ser la secuencia de aminoácidos de la enzima activa, por ejemplo, después de tratamiento, como después de cualquier péptido señal y/o propéptido ha sido dividido. Fragmentos preferidos son aminoácidos 25-248 de SEC ID nº: 2, aminoácidos 21-653 de SEC ID nº: 4, aminoácidos 26251 de SEC ID nº: 6, o aminoácidos 18-250 de SEC ID nº: 8.

[0029] En una forma de realización preferida de la invención, la endopeptidasa tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98% idéntico a aminoácidos 25-248 de SEC ID nº: 2.

[0030] Condiciones de astringencia de muy bajas a muy altas se definen como prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, 0,3% de SDS, 200 microg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y cortado, y bien 25% formamida para astringencias bajas y muy bajas, 35% formamida para astringencias medias y medias-altas, o 50% formamida para astringencias altas y muy altas, seguido de procedimientos de transferencia de Southern estándar durante 12 a 24 horas óptimamente. El material portador es finalmente lavado tres veces cada una durante 15 minutos usando 2X SSC, 0,2% de SDS preferiblemente al menos a 45°C (astringencia muy baja), más preferiblemente al menos a 50°C (astringencia baja), más preferiblemente al menos a 55°C (astringencia media), más preferiblemente al menos a 60°C (astringencia media alta), incluso más preferiblemente al menos a 65°C (astringencia alta), y de forma más preferida al menos a 70°C (astringencia muy alta). En una forma de realización particular, el lavado se lleva a cabo usando 0.2X SSC, 0,2% de SDS preferiblemente al menos a 45°C (astringencia muy baja), más preferiblemente al menos a 50°C (astringencia baja), más preferiblemente al menos a 55°C (astringencia media), más preferiblemente al menos a 60°C (astringencia media alta), incluso más preferiblemente al menos a 65°C (astringencia alta), y de forma más preferida al menos a 70°C (astringencia muy alta). En otra forma de realización particular, el lavado se lleva a cabo usando 0,1X SSC, 0,2% de SDS preferiblemente al menos a 45°C (astringencia muy baja), más preferiblemente al menos a 50°C (astringencia baja), más preferiblemente al menos a 55°C (astringencia media), más preferiblemente al menos a 60°C (astringencia media alta), incluso más preferiblemente al menos a 65°C (astringencia alta), y de forma más preferida al menos a 70°C (astringencia muy alta).

[0031] Para fines de la presente invención, el alineamiento de dos secuencias de aminoácidos puede ser determinado usando el programa Needle del paquete EMBOSS (Rice, P., Longden, I. and Bleasby, A. (2000)) MBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite. Trends in Genetics 16, (6) pp276-277 ; http://emboss.org) versión

2.8.0. El programa Needle implementa el algoritmo de alineamiento global descrito en Needleman, S. B. and Wunsch, C.

D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453. La matriz de sustitución usada es BLOSUM62, la penalización de abertura del espacio es de 10 y la penalización de extensión del espacio es de 0,5.

[0032] El grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se calcula como el número de correspondencias exactas en un alineamiento de las dos secuencias, divididos por la longitud de la más corta de las dos secuencias. El resultado se expresa en un porcentaje de identidad. Una correspondencia exacta ocurre cuando las dos secuencias tienen residuos de aminoácidos idénticos en las mismas posiciones del solapamiento. La longitud de una secuencia es el número de residuos de aminoácidos en la secuencia (p. ej. la longitud de SEC ID nº: 2 es de 248 aminoácidos).

[0033] El grado de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina por el método Wilbur-Lipman (Wilbur and Lipman, 1983, Proceedings of the National Academy of Science USA 80: 726-730) usando el software de LASERGENE™ MEGALIGN™ (DNASTAR, Inc., Madison, WI) con una tabla de identidad y los siguientes parámetros de alineamiento múltiples: penalización del espacio de 10 y penalización de longitud del espacio de 10. Parámetros de alineamiento de pareja son Ktuple=3, penalización espacio=3, y windows=20.

[0034] El grado de identidad entre secuencias de nucleótidos se calcula como el número de correspondencias exactas en un alineamiento de las dos secuencias, divididos por la longitud de la más corta de las dos secuencias. El resultado se expresa en porcentaje de identidad. Una correspondencia exacta ocurre cuando las dos secuencias tienen nucleótidos idénticos en las mismas posiciones del solapamiento. La longitud de una secuencia es el número de nucleótidos en la secuencia (p. ej. la longitud de SEC ID nº: 1 es de 744 nucleótidos).

[0035] Preferiblemente, la cantidad de endopeptidasa microbiana usada en el método de la invención es de sobre 0,01 a sobre 500 AU (como definido debajo) por kg de proteína de lactosuero, preferiblemente de sobre 0,1 a sobre 100 AU por kg de proteína de lactosuero, más preferiblemente de sobre 0,5 a sobre 50 AU por kg de proteína de lactosuero.

[0036] Una unidad de Anson (AU) se define como la cantidad de enzima que bajo condiciones estándar (es decir, 25°C, pH 7,5 y 10 min. de tiempo de reacción) digiere la hemoglobina a un nivel inicial de manera que haya liberada por minuto una cantidad de producto soluble ATC que da el mismo color con reactivo de fenol como un miliequivalente de tirosina.

[0037] La cantidad de endopeptidasa añadida al material de proteína puede y variará dependiendo de la fuente del material de proteína, el grado deseado de hidrólisis y la duración de la reacción de hidrólisis. La cantidad de endopeptidasa puede variar de sobre 1 mg de proteína enzimática a sobre 5000 mg de proteína enzimática por kilogramo de material de proteína. En otra forma de realización, la cantidad puede variar de 10 mg de proteína enzimática a sobre 2000 mg de proteína enzimática por kilogramo de material de proteína. En otra forma de realización, la cantidad puede variar de sobre 50 mg de proteína enzimática a sobre 1000 mg de proteína enzimática por kilogramo de material de proteína.

[0038] Como se apreciará por un experto en la materia, la duración de la reacción de hidrólisis puede y variará. En términos generales, la duración de la reacción de hidrólisis puede variar de unos minutos a muchas horas, tal como, de sobre 30 minutos a sobre 48 horas.

[0039] Preferiblemente, el tratamiento con endopeptidasa microbiana produce un hidrolizado proteico de lactosuero con un grado de hidrólisis (DH) de sobre 0,1% a sobre 20%, más preferiblemente de sobre 0,5% a sobre 10% o de sobre 0,5% a sobre 8%, incluso más preferiblemente de sobre 1% a sobre 5%.

[0040] El grado de hidrólisis (DH) expresa la extensión de la hidrólisis de proteína obtenida por el método. En el contexto de la invención, el grado de hidrólisis (DH) se define de la siguiente manera:

El experto en la materia sabrá medir el DH.

[0041] En el paso c) del método de la invención, la endopeptidasa es inactivada. Esta inactivación se puede realizar por cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, calentando por lo menos a 70°C, tal como por lo menos a 75°C o al menos a 80°C.

[0042] Un hidrolizado proteico de lactosuero obtenido por el método de la invención se puede utilizar en un producto alimenticio, por ejemplo, en una bebida. Ejemplos no limitativos de estos productos alimenticios incluyen bebidas deportivas o bebidas energéticas. Un hidrolizado proteico de lactosuero obtenido por el método de la invención puede también usarse en nutrición clínica, por ejemplo, en hospitales.

Ejemplo 1

[0043] Cinco enzimas proteolíticas diferentes se usaron para hidrolizar concentrado de proteína de lactosuero (Lacprodan 80) de Arla Foods, Dinamarca (comprendiendo sobre un 80% de proteína de materia seca total). Las enzimas y dosis fueron:

Proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum, dosis de 500 mg enzimático proteína/kg materia prima. PTN 6,0 (Novozymes A/S), dosis de 0,5% de materia prima. Alcalase 2,4L (Novozymes A/S), dosis de 0,2% de materia prima. Neutrasa 0,8L (Novozymes A/S), dosis de 1% de materia prima. Protamex 1,5MG (Novozymes A/S), dosis de 0,5% de materia prima.

[0044] Concentrado de proteína de lactosuero se mezcló con agua (1:9) antes de la adición de enzima.

[0045] La hidrólisis se produjo a 50°C en un vaso de precipitado montado con adición de base (0,1 N de NaOH) sistema de dosificación para mantener un pH constante a pH 7,5 hasta grado de hidrólisis (DH) = 4%.

[0046] Las muestras se calentaron a 85°C para inactivar las enzimas y se evaluaron en el panel sensorial.

[0047] Pruebas de triángulo se usaron para comparar el hidrolizado obtenido con la proteasa microbiana de tipo tripsina con cada uno de los hidrolizados obtenidos con las otras cuatro enzimas. De seis panelistas cada uno recibió tres muestras codificadas. Se les dijo que dos de las muestras eran iguales y que una era diferente. Se les pidió a los panelistas que identificaran la muestra diferente.

El número de "respuestas correctas" en la tabla de debajo indica el número de panelistas que fue capaz de identificar la muestra diferente. También se les pidió a los panelistas que seleccionaran la menos amarga de las muestras en cada prueba de triángulo.

5 [0048] Las muestras hechas con Alcalase, Neutrasa y Protamex todos tuvieron una tendencia clara a gel durante la pasteurización. Las muestras hechas con PTN y proteasa microbiana de tipo tripsina permanecieron homogéneas.

[0049] Las muestras se diluyeron en contenido de proteína 3% antes de la evaluación de sabor.

10 [0050] Los resultados de las evaluaciones de sabor de triángulo se muestran debajo. MTP es la proteasa microbiana experimental de tipo tripsina de Fusarium oxysporum. Seis panelistas se incluyeron en la evaluación. Si al menos 5 respuestas correctas fueron dadas (columna 2), la diferencia entre las muestras fue considerada

15 significativa. Las columnas tercera y cuarta son el número de panelistas (con respuestas correctas en la segunda columna) que encontraron que cualquiera de las muestras tienen un sabor menos amargo:

Respuestas correctas: Menos amargo

Ensayo 1, PTN: 5 PTN MTP

2: 3

Ensayo 2, Alcalase: 4 Alcalase MTP

2

Ensayo 3, Neutrase: 2 Neutrase MTP

1

Ensayo 4, Protamex: 3 Protamex MTP

2: 1

20 [0051] Los resultados muestran que hay una diferencia significativa entre las muestras producidas MTP y PTN donde las muestras producidas MTP se seleccionan como que eran menos amargas que las muestras producidas PTN. Ninguna diferencia significativa se mostró entre las muestras producidas MTP y cualquiera de las muestras producidas con las enzimas que no tenían especificidad Lys y Arg (Alcalase, Neutrasa, Protamex).

Ejemplo 2

[0052] Cinco enzimas proteolíticas diferentes se usaron para hidrolizar concentrado de proteína de lactosuero de Leprino Foods, EEUU (comprendiendo sobre 80% de proteína de materia seca total). 30 Las enzimas y dosis fueron: Proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum, dosis de 500 mg de enzima proteína/kg materia prima. PTN 6,0 (Novozymes A/S), dosis de 0,5% de materia prima. 35 Alcalase 2,4L (Novozymes A/S), dosis de 0,2% de materia prima. Neutrasa 0,8L (Novozymes A/S), dosis de 1% de materia prima. 40 Protamex 1,5MG (Novozymes A/S), dosis de 0,5% de materia prima. [0053] Concentrado de proteína de lactosuero se mezcló con agua (1:9) antes de adición de enzima. [0054] Hidrólisis se produjo a 50°C en un vaso de precipitado montado con adición de base (0,1N de NaOH) sistema de 45 dosificación para mantener un pH constante a pH 7,5 hasta grado de hidrólisis (DH) = 4%. [0055] Las muestras se calentaron a 85°C para inactivar las enzimas y se evaluaron en el panel sensorial.

[0056] Pruebas de triángulo se usaron para comparar el hidrolizado obtenido con la proteasa microbiana de tipo tripsina con cada uno de los hidrolizados obtenidos con las otras cuatro enzimas. De siete panelistas cada uno recibió tres muestras codificadas. Se les dijo que dos de las muestras eran iguales y que una era diferente.

5 Se le pidió a los panelistas que identificaran la muestra diferente. El número de "respuestas correctas" en la tabla de debajo indica el número de panelistas que fue capaz de identificar la muestra diferente. También se le pidió a los panelistas que seleccionaran la menos amarga de las muestras en cada prueba de triángulo.

10 [0057] Todas las muestras permanecieron homogéneas durante/después de la pasteurización.

[0058] Las muestras se diluyeron a contenido de proteína 3% antes de la evaluación de sabor.

[0059] Resultados de las evaluaciones de sabor de triángulo se muestran debajo.

15 MTP es la proteasa experimental microbiana de tipo tripsina de Fusarium oxysporum. Siete panelistas se incluyeron en la evaluación. Si al menos 5 respuestas correctas fueron dadas (columna 2), la diferencia entre las muestras se consideró significativa. Las columnas tercera y cuarta son el número de panelistas (con respuestas correctas en la segunda columna) que encontraron que cualquiera de las muestras tienen un sabor menos amargo:

Respuestas correctas: Menos amargo

Ensayo 1, PTN: 5 PTN MTP

4

Ensayo 2, Alcalase: 6 Alcalase MTP

4

Ensayo 3, Neutrase: 2 Neutrase MTP

2

Ensayo 4, Protamex: 3 Protamex MTP

3

[0060] Los resultados muestran que hay una diferencia significativa entre las muestras producidas con MTP y las muestras producidas con cualquiera de Alcalase o PTN donde las muestras producidas MTP se seleccionaron como 25 que eran menos amargas que ambas muestras producidas de Alcalase y PTN.

Ejemplo 3

Definición, medición y cálculo de la proporción de tripsina

30 Principio

[0061] Para hacer un ensayo que se pueda medir para la determinación de la actividad de endopeptidasa de tipo tripsina, hemos usado 10 sustratos cromogénicos diferentes con la fórmula general Suc-AAPX-pNA - donde X es la

35 primera letra de abreviatura para uno de los veinte residuos naturales de aminoácidos. La endopeptidasa se dividirá en el lado del carboxi-terminal de X y liberará un color amarillo (para-nitroanilina), que puede medirse. Hemos usado estos 10 sustratos Suc-AAPX-pNA diferentes disponibles de Bachem (X = A, R, D, E, I, L, K, M, F y V) para hacer la medición y el cálculo de lo que llamamos la proporción de tripsina.

Una endopeptidasa de tipo tripsina en el contexto de la presente invención puede definirse como una endopeptidasa con una proporción de tripsina superior a 100.

[0062] La proporción de tripsina se calcula como la actividad máxima en o bien Suc-AAPR-pNA o Suc-AAPK-pNA 45 dividida por la actividad máxima en cualquiera de los otros ocho sustratos Suc-AAPX-pNA: [0063] Las mediciones de actividad deberían realizarse a un valor de pH en el que la actividad es al menos la mitad de la actividad a pH óptimo.

Materiales y métodos 5 Ensayo Suc-AAPX-pNA:

[0064]

10 Sustratos: Suc-AAPA-pNA (Bachem L-1775) Suc-AAPR-pNA (Bachem L-1720) Suc-AAPD-pNA (Bachem L-1835) Suc-AAPE-pNA (Bachem L-1710) Suc-AAPI-pNA (Bachem L-1790)

15 Suc-AAPL-pNA (Bachem L-1390) Suc-AAPK-pNA (Bachem L-1725) Suc-AAPM-pNA (Bachem L-1395) Suc-AAPF-pNA (Bachem L-1400) Suc-AAPV-pNA (Bachem L-1770)

20 Temperatura: temperatura ambiente (25°C) Tampón de ensayo: 100mM de ácido succínico, 100mM de HEPES, 100mM de CHES, 100mM de CABS, 1 mM de CaCl2, 150mM de KCl, 0,01% de Tritón X-100, pH 9,0. Ensayo: 20 ul (microlitro) de dilución de peptidasa (diluida en 0,01% de Tritón X-100) se colocó en un pocillo en una placa de microtitulación.

25 El ensayo se comenzó añadiendo 200 ul de sustrato de pNA (50 mg disuelto en 1,0 ml de DMSO y además diluido 90x con el tampón de ensayo). El aumento inicial en OD405 se controló como una medida de la actividad de peptidasa. Si un gráfico lineal (o cerca de lineal) no se consiguió en los 4 minutos de tiempo de medición, la peptidasa se diluyó además y el ensayo se repitió.

30 Peptidasas: Alcalase (Novozymes A/S, Dinamarca) Achromobacter lyticus lisil-endopeptidasa (SEC ID nº: 4) Proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum Tripsina porcina (Novozymes A/S, Dinamarca) Todas las enzimas fueron purificadas por cromatografía a una alta pureza.

35 Sólo una banda se vio para cada peptidasa en los geles de SDS-PAGE coomassie manchados. Características para peptidasas: Alcalase: pHopt = pH 9 en Suc-AAPF-pNA. Proteasa de Achromobacter lyticus: pHopt = pH 10 en Suc-AAPK-pNA. Proteasa de tipo tripsina de Fusarium: pHopt = pH 10 en Boc-VLGR-pNA.

40 Tripsina porcina: pHopt = pH 10 en Boc-VLGR-pNA.

Resultados

[0065] Especificidad de peptidasas en sustratos Suc-AAPX-pNA a pH 9 y cálculo de la proporción de tripsina:

45 [0066] El experimento de especificidad se realizó a pH 9. Como se puede observar en el párrafo de materiales y métodos, tres de las peptidasas evaluadas tienen pHopt > pH 9. No obstante, para estas tres peptidasas la actividad a pH 9 es más de la mitad de la actividad a pHopt. Los resultados se muestran en la tabla de debajo:

50 [0067] Los datos de actividad proporcionados para cada endopeptidasa en la tabla es relativa a la actividad con el mejor sustrato Suc-AAPX-pNA.

Suc-AAPX-pNA: Alcalase Proteasa de Achromobacter lyticus Tripsina de Fusarium Tripsina porcina

Suc-AAPA-pNA: 0,02497 - 0,00001 0,00000 0,00001

Suc-AAPR-pNA: 0,01182 0,00001 1,00000 1,00000

Suc-AAPD-pNA: 0,00053 0,00000 0,00000 0,00000

Suc-AAPI-pNA: 0,00026 0,00000 0,00000 0,00000

Suc-AAPM-pNA: 0,37582 0,00023 0,00002 0,00031

Suc-AAPV-pNA: 0,00033 0,00000 0,00000 0,00000

Suc-AAPL-pNA: 0,86502 0,00001 0,00000 0,00002

Suc-AAPE-pNA: 0,00289 0,00000 0,00000 0,00000

Suc-AAPK-pNA: 0,01900 1,00000 0,53071 0,51396

Suc-AAPF-pNA: 1,00000 0,00001 0,00003 0,00057

Máx de Suc-AAP(R/K)-pNA: 0,01900 1,00000 1,00000 1,00000

Máx de Suc-AAP(nonR/K)pNA: 1,00000 0,00023 0,00003 0,00057

Proporción tripsina: 0,019 4300 33000 1750

5 [0068] Se puede observar que según nuestra definición, la proteasa de Achromobacter lyticus, la proteasa de tipo tripsina de Fusarium y tripsina porcina son endopeptidasas de tipo tripsina. Mientras que Alcalase no es una endopeptidasa de tipo tripsina.

Listado de secuencias 10 [0069]

<110> Novozymes A/S 15 <120> hidrolizado proteico de lactosuero

<130> 11267

<160> 8 20

<170> Versión de patentIn 3.5

<210> 1

<211>: 744 25 <212> ADN

<213> Fusarium oxysporum

<400> 1

<210> 2

<211> 248

<212> PRT

<213> Fusarium oxysporum

<400> 2

<210> 3

<211> 1959

<212> ADN

<213> Achromobacter lyticus

<400> 3

<210> 4

<211> 653

<212> PRT

<213> Achromobacter lyticus

<400> 4

<210> 5

<211> 753

<212> ADN

<213> Fusarium solani

<400> 5

<210> 6

<211> 251

<212> PRT

<213> Fusarium solani

<400> 6

<210> 7

<211> 750

<212> ADN

<213> Fusarium cf. solani

<400> 7

<210> 8

<211>: 250 5 <212> PRT

<213> Fusarium cf. solani

<400> 8

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para la producción de un hidrolizado proteico de lactosuero comprendiendo:

5 a) provisión de una composición acuosa de proteína de lactosuero comprendiendo beta-lactoglobulina y alfalactoalbúmina;

b) sometimiento de dicha composición a la acción de una endopeptidasa microbiana que específicamente divide en el lado carboxi-terminal de arginina o lisina; e 10 c) inactivación de la endopeptidasa.
2. Método según la reivindicación 1, donde la endopeptidasa microbiana es una endopeptidasa fúngica.

15 3. Método según la reivindicación 2, donde la endopeptidasa fúngica se deriva de una cepa de Fusarium.
4. Método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la endopeptidasa tiene actividad proteolítica óptima a un pH de sobre 8 a sobre 10.

20 5. Método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la endopeptidasa tiene actividad proteolítica óptima a una temperatura de sobre 45°C a sobre 60°C.
6. Método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la endopeptidasa se selecciona del grupo consistente en:

25 i) un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que es al menos 60% idéntico a (A) cualquiera de SEC ID Nº: 2, 4, 6 o 8, o (B) un fragmento de cualquiera de estas secuencias con actividad de proteasa;

ii) un polipéptido que se codifica por un polinucleótido que es al menos 60% idéntico a cualquiera de SEC ID Nº: 1, 3, 5 30 o 7;

iii) un polipéptido que se codifica por un polinucleótido cuyo complemento hibridiza bajo condiciones de astringencia bajas con cualquiera de SEC ID Nº: 1, 3, 5 o 7 y

35 iv) un polipéptido con una secuencia de aminoácidos modificada por sustitución, deleción y/o inserción de uno o varios aminoácidos en (A) cualquiera de SEC ID Nº: 2, 4, 6 o 8, o (B) un fragmento de cualquiera de estas secuencias con actividad de proteasa.
7. Método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la endopeptidasa tiene una secuencia de 40 aminoácidos que es al menos 60% idéntica a aminoácidos 25-248 de SEC ID nº: 2.
8. Método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la proteína de lactosuero es concentrado de proteína de lactosuero o aislado de proteína de lactosuero.

45 9. Método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la solución acuosa de proteína de lactosuero comprende al menos 5% de alfa-lactoalbúmina de materia seca total.
10. Método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el hidrolizado proteico de lactosuero tiene un

grado de hidrólisis de sobre 0,1 % a sobre 20%. 50
11. Método según la reivindicación 10, donde el hidrolizado proteico de lactosuero tiene un grado de hidrólisis de sobre 0,5% a sobre 8%.
12. Método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el paso c) comprende calentamiento por lo menos 55 a 70°C.
13. Método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la endopeptidasa se añade a una concentración de 0,01-10 g de proteína enzimática por kg de proteína de lactosuero.

60 14. Hidrolizado proteico de lactosuero obtenido por el método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes para el uso en nutrición clínica.
15. Uso de un hidrolizado proteico de lactosuero obtenido por el método de cualquiera de reivindicaciones 1-13 en una bebida deportiva.