ES2374971T3 - Uso de polipéptidos de neublastina para el tratamiento del dolor neuropático. - Google Patents

Uso de polipéptidos de neublastina para el tratamiento del dolor neuropático. Download PDF

Info

Publication number
ES2374971T3
ES2374971T3 ES02719102T ES02719102T ES2374971T3 ES 2374971 T3 ES2374971 T3 ES 2374971T3 ES 02719102 T ES02719102 T ES 02719102T ES 02719102 T ES02719102 T ES 02719102T ES 2374971 T3 ES2374971 T3 ES 2374971T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
seq
neublastin
polypeptide
pain
neuropathic pain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES02719102T
Other languages
English (en)
Inventor
Dinah W. Y. Sah
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biogen Inc
Biogen MA Inc
Original Assignee
Biogen Idec Inc
Biogen Idec MA Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=29552973&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2374971(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biogen Idec Inc, Biogen Idec MA Inc filed Critical Biogen Idec Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2374971T3 publication Critical patent/ES2374971T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/185—Nerve growth factor [NGF]; Brain derived neurotrophic factor [BDNF]; Ciliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins, e.g. NT-3
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Addiction (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

Uso de un polipéptido de neublastina para la preparación de una composición farmacéutica para tratar, prevenir o retrasar el dolor neuropático, en el que el dolor neuropático es alodinia, dolor hiperalgésico o dolor fantasma.

Description

Uso de polipéptidos de neublastina para el tratamiento del dolor neuropático
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0001] La invención se refiere a usos de un polipéptido de neublastina para su uso en tratamientos para el dolor neuropático, en los que el dolor neuropático es alodinia, dolor hiperalgésico o dolor fantasma.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0002] El dolor neuropático es una categoría de dolor que incluye varias formas de dolor crónico y que se produce como resultado de la disfunción de tejido nervioso más que somático. El dolor neuropático, que es el dolor que procede de la disfunción del sistema nervioso central o periférico, también puede ser una consecuencia de daños a nervios periféricos o a regiones del sistema nervioso central, puede ser el resultado de una enfermedad, o puede ser idiopático. Los síntomas de dolor neuropático incluyen sensaciones de ardor, hormigueo, electricidad, parestesia, rigidez, entumecimiento en las extremidades, sensaciones de distorsión corporal, alodinia (dolor provocado por una estimulación de la piel que normalmente es inocua), hiperalgesia (sensibilidad anormal al dolor) e hiperpatía (una respuesta dolorosa exagerada que persiste mucho después de que haya cesado el estímulo).
[0003] Son varias causas comunes de dolor neuropático la diabetes, la quimioterapia del cáncer, la infección por herpes zóster, la compresión de raíces cervicales o lumbares debida a una enfermedad degenerativa de la columna, lesiones malignas de plexos o raíces nerviosas, degeneración nerviosa, tal como por amputación, infección por VIH y lesiones de las vías centrales del dolor, incluyendo el tracto espinotalámico, tálamo o radiaciones talámicas. Las causas adicionales de dolor neuropático incluyen neuropatías inducidas por fármacos o inducidas por toxinas. Por ejemplo, antivirales tales como ddI, ddC y d4T causan comúnmente neuropatías periféricas, como lo hacen la fenitoína (una medicación para convulsiones), isoniazid (una medicación para la tuberculosis), vincristina, vinblastina, taxol, taxotere y cisplatino (agentes quimioterápicos del cáncer), vitaminas a alta dosis y antagonistas del ácido fólico.
[0004] Las terapias actuales para el manejo del dolor neuropático son de un beneficio limitado para muchos pacientes, e implican efectos secundarios indeseables o toxicidades limitantes de dosis. Además, las terapias actuales son sintomáticas, no modificadoras de la enfermedad. Continúa existiendo la necesidad de terapias mejoradas para el manejo y tratamiento del dolor neuropático, especialmente las que se dirijan a la patología subyacente.
DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN
[0005] Esta invención proporciona usos mejorados de un polipéptido de neublastina para su uso en el tratamiento, prevención o retraso del dolor neuropático, en el que el dolor neuropático es alodinia, dolor hiperalgésico o dolor fantasma. Los presentes usos aplican polipéptidos de neublastina ("NBN"), incluyendo polipéptidos de neublastina de longitud completa o polipéptidos de neublastina truncados bioactivos, incluyendo, por ejemplo, al menos las SEC ID Nº: 2, 4, 5 y 11-27. Además, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que contienen un polipéptido de neublastina de longitud completa o un polipéptido de neublastina truncado suspendido, disuelto o dispersado en un vehículo farmacéuticamente aceptable para su uso en el tratamiento, prevención o retraso del dolor neuropático, en el que el dolor neuropático es alodinia, dolor hiperalgésico o dolor fantasma.
[0006] En una realización específica, el polipéptido de neublastina puede ser cualquier polipéptido de AA-80-AA140 de SEC ID Nº: 2, AA41-AA140 de SEC ID Nº: 2, AA1-AA140 de SEC ID Nº: 2, AA25-AA140 de SEC ID Nº: 2, AA28-AA140 de SEC ID Nº: 2, AA-80-AA144 de SEC ID Nº: 4, AA1-AA144 de SEC ID Nº: 4, AA1-AA224 de SEC ID Nº: 5 o AA81-AA224 de SEC ID Nº: 5; al menos un polipéptido que comprende la secuencia C-terminal expuesta en AA107-AA140 de SEC ID Nº: 2 o AA76-AA140 de SEC ID Nº: 2, y que conserva los siete restos de Cys característicos de la familia de GDNF y de la superfamilia de TGF-beta; al menos un polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 22, SEC ID Nº: 23, SEC ID Nº: 24, SEC ID Nº: 25, SEC ID Nº: 26 o SEC ID Nº: 27; o al menos una secuencia polipeptídica que tiene una homología de aminoácidos superior al 70% con una secuencia enumerada anteriormente.
[0007] El polipéptido de neublastina puede modificarse por un resto derivado para tener un tiempo de permanencia prolongado y/o una concentración aumentada en el cuerpo. Los polipéptidos de neublastina pueden ser polipéptidos de neublastina N-glicosilados. Además, el polipéptido de neublastina puede derivatizarse con uno o más restos incluyendo, pero sin limitación, restos de polietilenglicol, ésteres alifáticos, amidas, derivados de N-acilo o derivados de O-acilo.
[0008] En una realización, la invención presenta un uso de un polipéptido de neublastina incluyendo, por ejemplo, cualquiera de las SEC ID Nº: 2, 4, 5 y 11-27, para su uso en el tratamiento, la prevención o el retraso del dolor neuropático, en el que el dolor neuropático es alodinia, dolor hiperalgésico o dolor fantasma en un sujeto, en solitario
o en combinación con un compuesto inductor de analgesia seleccionado del grupo que consiste en opioides, antiarrítmicos, analgésicos tópicos, anestésicos locales, anticonvulsivantes, antidepresivos, corticosteroides y fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE). En una realización preferida, el compuesto inductor de analgesia es un anticonvulsivante. En otra realización preferida, el compuesto inductor de analgesia es gabapentina (ácido (1aminometil)ciclohexano acético) o pregabalina (ácido S-(+)-4-amino-3-(2-metilpropil)butanoico).
[0009] En otra realización, la invención presenta un uso de un polipéptido de neublastina, incluyendo, por ejemplo, al menos una de las SEC ID Nº: 2, 4, 5 y 11-27, para tratar la alodinia táctil en un sujeto, en solitario o en combinación con un compuesto inductor de analgesia seleccionado del grupo que consiste en opioides, antiarrítmicos, analgésicos tópicos, anestésicos locales, anticonvulsivantes, antidepresivos, corticosteroides y AINE. En una realización preferida, el compuesto inductor de analgesia es un anticonvulsivante. En otra realización preferida, el compuesto inductor de analgesia es gabapentina (ácido (1-aminometil)ciclohexano acético) o pregabalina (ácido S(+)-4-amino-3-(2-metilpropil)butanoico).
[0010] El polipéptido de neublastina puede administrarse junto con un agente terapéutico, incluyendo, pero sin limitación, un agente anticanceroso o un agente antiviral. Los agentes anticancerosos incluyen, pero sin limitación, taxol, taxotere, cisplatino, nocodazol, vincristina, vindesina y vinblastina. Los agentes antivirales incluyen, pero sin limitación, ddI, DDC, d4T, foscarnet, dapsona, metronidazol e isoniazid.
[0011] La invención incluye un uso de un polipéptido de neublastina para su uso en el tratamiento, prevención o retraso del dolor neuropático en un sujeto, en el que el dolor neuropático es alodinia, dolor hiperalgésico o dolor fantasma. En una realización específica, el dolor neuropático está asociado con neuropatía diabética. En otra realización, el dolor neuropático está asociado con una infección de un sujeto por un virus, incluyendo, pero sin limitación, un herpesvirus, un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y un papilomavirus. El dolor neuropático puede estar asociado con una infección por un virus herpes zóster, o especialmente con una neuralgia postherpética. En una realización adicional, el dolor neuropático está asociado con ciática. También se describe un uso para modular la pérdida de sensibilidad dolorosa en un sujeto aquejado de una neuropatía, tal como neuropatía diabética. La pérdida de sensibilidad dolorosa puede ser una pérdida en la sensibilidad dolorosa térmica.
[0012] En realizaciones adicionales, el dolor neuropático es dolor hiperalgésico dolor hiperalgésico, dolor fantasma o hiperalgesia térmica. Además, el dolor neuropático también puede estar asociado con neuropatía hereditaria (incluyendo, pero sin limitación, ataxia de Friedreich, polineuropatía amiloide familiar, enfermedad de Tangier, enfermedad de Fabry), trastornos metabólicos (incluyendo, pero sin limitación, insuficiencia renal e hipotiroidismo), deficiencias vitamínicas (incluyendo, pero sin limitación, deficiencia de vitamina B12, deficiencia de vitamina B6 y deficiencia de vitamina E), neuropatías tóxicas y yatrogénicas (incluyendo, pero sin limitación, alcoholismo, intoxicación por vitamina B6, intoxicación por hexacarbono, amiodarona, cloranfenicol, disulfiram, isoniazida, oro, litio, metronidazol, misonidazol, nitrofurantoína), neuropatías infecciosas (incluyendo, pero sin limitación, lepra, enfermedad de Lyme), neuropatías autoinmunes (incluyendo, pero sin limitación, síndrome de Guillain-Barre, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, gammapatía monoclonal de importancia indeterminada y polineuropatía), neuralgia trigeminal, síndromes de atrapamiento (incluyendo, pero sin limitación, túnel carpiano), neuralgia postraumática, dolor de miembro fantasma, dolor por esclerosis múltiple, síndromes de dolor regional complejos (incluyendo, pero sin limitación, distrofia simpática refleja, causalgia), neoplasia, neuropatía vasculítica/angiopática y neuropatía idiopática.
[0013] Los usos anteriores contemplan administrar al sujeto, preferentemente por vía sistémica, una formulación que comprende un polipéptido de neublastina a una dosificación de entre 1 Ig/kg y 30.000 Ig/kg de peso corporal del sujeto, por dosis. En realizaciones alternativas, la dosificación está entre 10 Ig/kg y 30.000 Ig/kg de peso corporal del sujeto, por dosis; entre 10 Ig/kg y 10.000 Ig/kg de peso corporal del sujeto, por dosis; entre 25 Ig/kg y 10.000 Ig/kg de peso corporal del sujeto, por dosis; entre 25 Ig/kg y 3.000 Ig/kg de peso corporal del sujeto, por dosis; y entre 50 Ig/kg y 3.000 Ig/kg de peso corporal del sujeto, por dosis.
[0014] El polipéptido de neublastina aplicado en los usos anteriores puede administrarse por cualquier sistema de administración adecuado, y preferentemente, del grupo que consiste en administración intravenosa, administración intramuscular, administración intrapulmonar, administración subcutánea y administración intraperitoneal, más preferentemente por administración intramuscular o administración subcutánea. El polipéptido de neublastina aplicado en los usos anteriores también puede administrarse por administración intratecal.
[0015] La formulación que contiene polipéptido de NBN de la invención puede administrarse en una composición de liberación prolongada.
[0016] A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la materia a la que pertenece esta invención. Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria en la práctica o ensayo de la invención, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, dominará la presente memoria descriptiva,
[0017] incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
[0018] Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción detallada y reivindicaciones siguientes.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0019]
La FIG. 1 es una representación de línea quebrada que ilustra una prevención casi completa de la alodinia táctil por neublastina (NBN) subcutánea en ratas con ligación de nervios espinales (SNL) L5/L6;
la FIG. 2 es una representación de línea quebrada que ilustra una prevención casi completa de la hiperalgesia térmica por neublastina (NBN) subcutánea en ratas con ligación de nervios espinales (SNL) L5/L6.
La FIG. 3 es una representación de línea quebrada que ilustra la reversión casi completa de una alodinia táctil completamente establecida por neublastina (NBN) subcutánea en ratas con ligación de nervios espinales (SNL) L5/L6;
la FIG. 4 es una representación de línea quebrada que ilustra la reversión casi completa de una hiperalgesia térmica completamente establecida por neublastina (NBN) subcutánea en ratas con ligación de nervios espinales (SNL) L5/L6.
La FIG. 5 es una gráfica de barras que ilustra la normalización casi completa de la hipoalgesia térmica por neublastina subcutánea en ratas con neuropatía inducida por STZ (estreptozotocina).
La FIG. 6A y la FIG. 6B son representaciones gráficas que ilustran la prevención de la hiperalgesia térmica (FIG. 6A), la prevención de la hipoalgesia térmica (FIG. 6B) y la reversión de la hiperalgesia térmica (FIG. 6B) por neublastina subcutánea en ratas con neuropatía inducida por STZ (estreptozotocina) a las 4 semanas (FIG. 6A) y 8 semanas (FIG. 6B) postratamiento con STZ.
La FIG. 7 es una representación de línea quebrada que ilustra la reversión por neublastina (NBN) dependiente de la dosis de una alodinia táctil completamente establecida por neublastina subcutánea en ratas con ligación de nervios espinales (SNL) L5/L6.
La FIG. 8 es una representación de línea quebrada que ilustra la reversión por neublastina (NBN) dependiente de la dosis de una hiperalgesia térmica completamente establecida por neublastina subcutánea en ratas con ligación de nervios espinales (SNL) L5/L6.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
[0020] Esta invención se refiere a usos de un polipéptido de neublastina y a composiciones que lo comprenden para tratar, prevenir o retrasar el dolor neuropático, en los que el dolor neuropático es alodinia, dolor hiperalgésico o dolor fantasma, en un sujeto en riesgo de, o aquejado de, dicho dolor neuropático.
[0021] Los polipéptidos de neublastina son proteínas que promueven la supervivencia, mantienen la diferenciación fenotípica, previenen la degeneración, promueven la regeneración y restauran la actividad de células y tejidos neuronales. Como alternativa, se ha hecho referencia a la neublastina (inicialmente descrita, por ejemplo, en el documento WO 00/01815) como "artemina" (véase, por ejemplo, el documento WO 00/18799) y "enovina" (véase, por ejemplo, el documento WO 00/04050). La neublastina se ha clasificado como un miembro distante de la superfamilia de TGF-� (Massague, et al,. 1994, Trends in Cell Biology, 4: 172-178) y es un miembro de la familia del ligando del factor neurotrófico derivado de una línea celular glial ("GDNF"; documento WO 93/06116), en la familia que incluye GDNF, persefina ("PSP"; Milbrandt et al., 1998, Neuron 20: 245- 253) y neurturina ("NTN"; documento WO 97/08196). Los ligandos de la subfamilia de GDNF tienen en común su capacidad para inducir la señalización a través de la tirosina quinasa receptora RET. Estos tres ligandos de la subfamilia de GDNF difieren en sus afinidades relativas por una familia de factores neurotróficos, los receptores GFRa. La neublastina actúa preferentemente a través del complejo de GFRa3-RET. Baudet et al, Development, 127, págs. 4335-44 (2000); Baloh et al., Neuron, 21, págs. 1291-1302 (1998); Airaksinen et al., Mol. Cell. Neuroscience, 13, págs. 313-325 (1999).
[0022] En la Tabla 1 se muestra una comparación de la secuencia de aminoácidos de Neublastina (SEC ID Nº: 2) con los miembros de la subfamilia de GDNF Neurturina (SEC ID Nº: 6), Persefina (SEC ID Nº: 7) y GDNF (SEC ID Nº: 8). Los polipéptidos de neublastina útiles en esta invención mantienen preferentemente la huella molecular de la subfamilia de GDNF, es decir, los restos aminoacídicos subrayados en la Tabla 1.
Tabla 1: Comparación de secuencia de aminoácidos de Neublastina (SEC ID Nº: 2) con Neurturina (SEC ID Nº: 6), Persefina (SEC ID Nº: 7) y GDNF (SEC ID Nº: 8)
* indica posiciones que tienen un solo resto totalmente conservado. : indica que uno de los siguientes grupos "fuertes" está totalmente conservado: -STA, NEQK, NHQK, NEDQ, QHRK, MILV, MILF, HY, FYW. . indica que uno de los siguientes grupos "mas débiles" está totalmente conservado: -CSA, ATV, SAG, STNK, STPA, SGND, SNDEQK, NDEQHK, NEQHRK, HFY.
[0023] A partir del alineamiento de secuencias de aminoácidos mostrado en la Tabla 1, puede observarse que la neublastina tiene siete restos de cisteína en localizaciones que están conservadas dentro de la superfamilia de TGF�. Basándose en este alineamiento de secuencias, se demostró que la neublastina es un miembro de la subfamilia 5 de GDNF de factores neurotróficos (LGLG - FR(Y/F)CSGSC - QxCCRP - SAxxCGC, la huella molecular de la
subfamilia de GDNF, subrayada en la Tabla 1).
[0024] Los polipéptidos de neublastina útiles en la presente memoria pueden proporcionarse en cualquier forma bioactiva, incluyendo la forma de pre-pro-proteínas, pro-proteínas, proteínas maduras, proteínas glicosiladas, proteínas fosforiladas, formas truncadas o cualquier otra proteína modificada postraduccionalmente. Se asume que 10 una neublastina bioactiva está en la forma dimerizada para cada variante de NBN, ya que la formación del dímero es necesaria para la actividad. Se observa escasa o ninguna actividad en un polipéptido de NBN monomérico. Un polipéptido de neublastina bioactivo incluye un polipéptido dimerizado que, en presencia de un cofactor (tal como GFRa3 o RET), se une a GFRa3 o a un complejo de GFRa3 y RET, induce la dimerización de RET y la autofosforilación de RET. Por consiguiente, un "polipéptido de neublastina," como se usa en la presente memoria, es
15 un polipéptido que posee actividad neurotrófica (por ejemplo, como se describe en el documento WO 00/01815) de la forma siguiente:
1. Neublastina de tipo silvestre
[0025] Las secuencias de aminoácidos ("aa" o "AA") de neublastina de "tipo silvestre" siguientes son ejemplares de las que se aplican en los usos de las composiciones de esta invención:
20 -- AA-80-AA140 de SEC ID Nº: 2 (prepro humana de "tipo silvestre",
-- AA-41-AA140 de SEC ID Nº: 2 (pro humana),
--
AA1-AA140 de SEC ID Nº: 2 (140AA madura (SEC ID Nº: 11); en lo sucesivo "140NBN"),
--
AA25-AA140 de SEC ID Nº: 2 (116AA madura (SEC ID Nº: 12); en lo sucesivo "116NBN"),
--
AA28-AA140 de SEC ID Nº: 2 (113AA madura (SEC ID Nº: 13); en lo sucesivo "113NBN"),
25 -- AA-80-AA144 de SEC ID Nº: 4 (prepro murina),
--
AA1-AA144 de SEC ID Nº: 4 (madura murina -- 144 AA),
--
AA1-AA224 de SEC ID Nº: 5 (prepro de rata),
--
AA81-AA224 de SEC ID Nº: 5 (madura de rata -- 144 AA),
--
Péptidos con una secuencia C-terminal expuesta en los AA107-AA140 de la SEC ID Nº: 2, más preferentemente AA76-AA140 de la SEC ID Nº: 2, y que conservan los 7 restos de Cys característicos de la familia de GDNF y de la superfamilia de TGF-�.
[0026] En una realización, el polipéptido de neublastina preferido contiene (siete) cisteínas conservadas como en la SEC ID Nº: 2 en las posiciones 43, 70, 74, 107, 108, 136 y 138. Se sabe que estos siete restos de cisteína conservados dentro de la superfamilia de TGF-� forman tres enlaces disulfuro intramonoméricos (contemplados, por ejemplo, en la SEC ID Nº: 2 entre los restos de cisteína 43-108, 70-136 y 74-138) y un enlace disulfuro intermonomérico (contemplado, por ejemplo, en la SEC ID Nº: 2 entre los restos de cisteína 107-107), que junto con la región de cadena beta extendida constituyen el motivo estructural conservado para la superfamilia de TGF-�. Véase, por ejemplo, Daopin et al., Proteins 1993, 17: 176-192.
2. Neublastinas truncadas ("NBN")
[0027] Los polipéptidos de neublastina útiles en la presente invención también incluyen formas truncadas de la molécula de neublastina de longitud completa. En dichas moléculas truncadas, se han delecionado uno o más aminoácidos del extremo N-terminal o del extremo C-terminal, preferentemente del extremo N-terminal. El polipéptido de neublastina truncado puede obtenerse proporcionando un polipéptido de neublastina maduro y poniendo el polipéptido de neublastina maduro en contacto con al menos una proteasa en condiciones suficientes para producir el polipéptido de neublastina truncado. Preferentemente, al menos una proteasa es una exoproteasa, y la puesta en contacto del polipéptido de neublastina maduro da como resultado la formación de un producto de digestión de polipéptido de neublastina con exopeptidasa que puede digerirse adicionalmente con una dipeptidil peptidasa.
[0028] Los polipéptidos de neublastina truncados descritos en la presente memoria incluyen preferentemente una secuencia polipeptídica que incluye los siete restos de cisteína conservados en la secuencia de neublastina madura. En ciertas realizaciones preferidas, el polipéptido de neublastina truncado incluye al menos los 85 aminoácidos carboxi-terminales del polipéptido de neublastina maduro 113NBN.
[0029] Otras variantes de Neublastina incluyen formas de NBN truncadas. Los ejemplos de éstas incluyen:
(i)
la secuencia polipeptídica de 112AA denominada en la presente memoria NBN112, que posee los 112 aminoácidos carboxi-terminales de un polipéptido de neublastina maduro, por ejemplo, los aminoácidos 29-140 de la SEC ID Nº: 2 (SEC ID Nº: 14).
(ii)
la secuencia polipeptídica de 111AA denominada en la presente memoria NBN111, que posee los 111 aminoácidos carboxi-terminales de un polipéptido de neublastina maduro, por ejemplo, los aminoácidos 30-140 de la SEC ID Nº: 2 (SEC ID Nº: 15).
(iii) la secuencia polipeptídica de 110AA denominada en la presente memoria NBN110, que posee los 110 aminoácidos carboxi-terminales de un polipéptido de neublastina maduro, por ejemplo, los aminoácidos 31-140 de la SEC ID Nº: 2 (SEC ID Nº: 16).
(iv)
la secuencia polipeptídica de 109AA denominada en la presente memoria NBN109, que posee los 109 aminoácidos carboxi-terminales de un polipéptido de neublastina maduro, por ejemplo, los aminoácidos 32-140 de la SEC ID Nº: 2 (SEC ID Nº: 17).
(v)
la secuencia polipeptídica de 108AA denominada en la presente memoria NBN108, que posee los 108 aminoácidos carboxi-terminales de un polipéptido de neublastina maduro, por ejemplo, los aminoácidos 33-140 de la SEC ID Nº: 2 (SEC ID Nº: 18).
(vi)
la secuencia polipeptídica de 107AA denominada en la presente memoria NBN107, que posee los 107 aminoácidos carboxi-terminales de un polipéptido de neublastina maduro, por ejemplo, los aminoácidos 34-140 de la SEC ID Nº: 2 (SEC ID Nº: 19).
(vii) la secuencia polipeptídica de 106AA denominada en la presente memoria NBN106, que posee los 106 aminoácidos carboxi-terminales de un polipéptido de neublastina maduro, por ejemplo, los aminoácidos 35-140 de la SEC ID Nº: 2 (SEQ ID N0:20).
(viii) la secuencia polipeptídica de 105AA denominada en la presente memoria NBN105, que posee los 105 aminoácidos carboxi-terminales de un polipéptido de neublastina maduro, por ejemplo, los aminoácidos 36-140 de la SEC ID Nº: 2 (SEC ID Nº: 21).
(ix)
la secuencia polipeptídica de 104AA denominada en la presente memoria NBN104, que posee los 104 aminoácidos carboxi-terminales de un polipéptido de neublastina maduro, por ejemplo, los
aminoácidos 37-140 de la SEC ID Nº: 2 (SEC ID Nº: 22).
(x)
la secuencia polipeptídica de 103AA denominada en la presente memoria NBN103, que posee los 103 aminoácidos carboxi-terminales de un polipéptido de neublastina maduro, por ejemplo, los aminoácidos 38-140 de la SEC ID Nº: 2 (SEC ID Nº: 23).
(xi)
la secuencia polipeptídica de 102AA denominada en la presente memoria NBN102, que posee los 102 aminoácidos carboxi-terminales de un polipéptido de neublastina maduro, por ejemplo, los aminoácidos 39-140 de la SEC ID Nº: 2 (SEC ID Nº: 24).
(xii) la secuencia polipeptídica de 101AA denominada en la presente memoria NBN101, que posee los 101 aminoácidos carboxi-terminales de un polipéptido de neublastina maduro, por ejemplo, los aminoácidos 40-140 de la SEC ID Nº: 2 (SEC ID Nº: 25).
(xiii) la secuencia polipeptídica de 100AA denominada en la presente memoria NBN100, que posee los 100 aminoácidos carboxi-terminales de un polipéptido de neublastina maduro, por ejemplo, los aminoácidos 41-140 de la SEC ID Nº: 2 (SEC ID Nº: 26).
(xiv) la secuencia polipeptídica de 99AA denominada en la presente memoria NBN99, que posee los 99 aminoácidos carboxi-terminales de un polipéptido de neublastina maduro, por ejemplo, los aminoácidos 42-140 de la SEC ID Nº: 2 (SEC ID Nº: 27).
[0030] Se entiende que las formas truncadas de Neublastina descritas en la presente memoria (por ejemplo, las formas de 112AA a 99AA) tienen actividad neurotrófica.
[0031] En realizaciones más preferidas, el polipéptido de neublastina truncado son los 99 aa, 100 aa, 101 aa, 102 aa, 103 aa, 104 aa, 105 aa, 106 aa, 107 aa, 108 aa, 109 aa, 110 aa, 111 aa o 112 aa aminoácidos carboxiterminales del polipéptido de neublastina maduro de 113 AA (es decir, NBN99, NBN100, NBN101, NBN102, NBN103, NBN104, NBN105, NBN106, NBN107, NBN108, NBN109, NBN110, NBN111 o NBN112, respectivamente). Las secuencias también pueden encontrarse en los polipéptidos de neublastina murina y de rata como los 99 aa, 100 aa, 101 aa, 102 aa, 103 aa, 104 aa, 105 aa, 106 aa, 107 aa, 108 aa, 109 aa, 110 aa, 111 aa o 112 aa carboxiterminales, respectivamente, en las SEC ID Nº: 4 y 5. Estos ejemplos más preferidos de formas de NBN truncadas son bioactivos (denominados "polipéptidos de neublastina truncados bioactivos") ya que se ha demostrado en la presente memoria que tienen actividad neurotrófica. Como se ha indicado anteriormente, es necesaria la dimerización de NBN para la bioactividad, ya que se observa de escasa a ninguna actividad con el polipéptido monomérico de NBN.
3. Neublastinas variantes ("NBN") con una similitud o identidad sustancial
[0032] Las NBN útiles en esta invención también incluyen los polipéptidos de NBN que tienen una secuencia de aminoácidos con una similitud o identidad sustancial con los diversos polipéptidos de "neublastina" prepro, pro, maduros y truncados expuestos anteriormente. Preferentemente, el polipéptido de neublastina usado tiene una identidad o similitud de al menos el 70%, más preferentemente del 85%, aún más preferentemente del 90%, o aún más preferentemente del 95% con los polipéptidos de neublastina en las SEC ID Nº: 2, 4, 5 u 11-27. Más preferentemente, el polipéptido de neublastina usado tiene una similitud o identidad de al menos el 99% con los polipéptidos de neublastina en las SEC ID Nº: 2, 4, 5 u 11-27.
[0033] El grado con el que un polipéptido candidato comparte homología con un polipéptido de neublastina de la invención se determina como el grado de similitud o identidad entre dos secuencias de aminoácidos.
[0034] Un alto nivel de identidad de secuencia indica una probabilidad de que la primera secuencia proceda de la segunda secuencia. La identidad de secuencia de aminoácidos requiere secuencias de aminoácidos idénticas entre dos secuencias alineadas. Por lo tanto, una secuencia candidata que comparta una identidad de aminoácidos del 70% con una secuencia de referencia requiere que, después del alineamiento, el 70% de los aminoácidos en la secuencia candidata sean idénticos a los aminoácidos correspondientes en la secuencia de referencia. La identidad se determina mediante análisis informático, tal como, sin limitaciones, el programa de alineamiento informático ClustalX (Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F y Higgins DG: 'The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools"; Nucleic Acids Res. 1997, 25 (24): 4876-82), y los parámetros por defecto sugeridos en el mismo. Usando este programa, la parte madura de un polipéptido codificado por una secuencia de ADN análoga de la invención presenta un grado de identidad de al menos el 70%, más preferentemente del 85%, aún más preferentemente del 90%, o aún más preferentemente del 95%, más preferentemente de al menos el 99% con las secuencias de aminoácidos presentadas en la presente memoria como SEC ID Nº: 2 (NBN humana), SEC ID Nº: 4 y 5 (NBN de roedor) o SEC ID Nº: 11-27 (NBN maduras y truncadas).
[0035] Se conocen otras herramientas de alineamiento, tales como el algoritmo de programación dinámico descrito en Needleman et al., J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), y el Programa Align, un paquete informático comercial producido por DNAstar, Inc. Una vez que se realiza y se refina el alineamiento entre las secuencias candidata y de referencia, se calcula una puntuación de porcentaje de homología. Los aminoácidos individuales de cada secuencia se comparan secuencialmente de acuerdo con su similitud entre sí.
[0036] Los factores de similitud incluyen tamaño, forma y carga eléctrica similares. Un método particularmente preferido de determinación de similitudes de aminoácidos es la matriz PAM250 descrita en Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure 345-352 (1978 y Supl.). Una puntuación de similitud se calcula primero como la suma de las puntuaciones de similitud de aminoácidos por parejas alineados. Las inserciones y deleciones se ignoran para los fines del porcentaje de homología e identidad. Por consiguiente, no se usan penalizaciones por huecos en este cálculo. La puntuación bruta se normaliza después dividiéndola por la media geométrica de las puntuaciones del compuesto candidato y del esqueleto de siete cisteínas de los polipéptidos de neublastina. La media geométrica es la raíz cuadrada del producto de estas puntuaciones. La puntuación bruta normalizada es el porcentaje de homología.
[0037] Como se ha señalado anteriormente, los polipéptidos de neublastina de la invención incluyen polipéptidos variantes. En el contexto de esta invención, la expresión "polipéptido variante" incluye un polipéptido (o proteína) que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de las secuencias presentadas como SEC ID Nº: 2 (NBN humana),
o SEC ID Nº: 4 y 5 (NBN de roedor), o SEC ID Nº: 11-27 (NBN maduras y truncadas), en una o más posiciones de aminoácidos. Dichos polipéptidos variantes incluyen los polipéptidos modificados descritos anteriormente, así como sustituciones conservativas, variantes de corte y empalme, isoformas, homólogos de otras especies y polimorfismos.
[0038] Como se define en la presente memoria, la expresión "sustituciones conservativas" denota la sustitución de un resto aminoacídico por otro resto biológicamente similar. Típicamente, la similitud biológica, como se ha mencionado anteriormente, refleja sustituciones en la secuencia de tipo silvestre con aminoácidos conservados. Por ejemplo, se esperaría que las sustituciones de aminoácidos conservativas tuvieran escaso o ningún efecto sobre la actividad biológica, particularmente si están presentes en menos del 10% del número total de restos en el polipéptido
o proteína. Preferentemente, las sustituciones de aminoácidos conservativas representan cambios en menos del 5% del polipéptido o proteína, más preferentemente menos del 2% del polipéptido o proteína. Por ejemplo, cuando se calcula de acuerdo con, por ejemplo, la 113NBN humana, la mayoría de las sustituciones conservativas preferidas representarían menos de tres sustituciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos madura de tipo silvestre. En una realización particularmente preferida, hay una sola sustitución de aminoácido en la secuencia madura, en la que ni el aminoácido sustituido ni el de reemplazo son cíclicos.
[0039] Otros ejemplos de sustituciones particularmente conservativas incluyen la sustitución de un resto hidrófobo por otro, tal como isoleucina, valina, leucina o metionina, o la sustitución de un resto polar por otro, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por aspártico, o glutamina por asparagina y similares.
[0040] La expresión sustitución conservativa también incluye el uso de un resto aminoacídico sustituido en lugar de un resto aminoacídico precursor no sustituido con tal de que los anticuerpos generados contra el polipéptido sustituido también inmunorreaccionen con el polipéptido no sustituido.
[0041] Las modificaciones de esta secuencia de aminoácidos primaria pueden dar como resultado proteínas que tengan una actividad sustancialmente equivalente en comparación con el polipéptido homólogo no modificado y, por lo tanto, pueden considerarse análogos funcionales de las proteínas precursoras. Dichas modificaciones pueden ser deliberadas, por ejemplo, como por mutagénesis dirigida, o pueden aparecer espontáneamente, e incluyen variantes de corte y empalme, isoformas, homólogos de otras especies y polimorfismos. Dichos análogos funcionales también están contemplados de acuerdo con la invención.
[0042] Además, las modificaciones de la secuencia de aminoácidos primaria pueden dar como resultado proteínas que no conserven la actividad biológica de la proteína precursora, incluyendo formas negativas dominantes, etc. Una proteína negativa dominante puede interferir con la proteína de tipo silvestre por unión a, o secuestro de otro modo de agentes reguladores, tales como componentes aguas arriba o aguas abajo, que normalmente interaccionan funcionalmente con el polipéptido. Dichas formas negativas dominantes también están contempladas de acuerdo con la invención.
4. NBN derivadas o modificadas
[0043] Los polipéptidos de la presente invención también incluyen polipéptidos quiméricos o polipéptidos de fusión escindibles en los que se fusiona otro polipéptido en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal del polipéptido
o fragmento del mismo. Un polipéptido quimérico puede producirse por fusión de una secuencia de ácido nucleico (o una porción de la misma) que codifica otro polipéptido con una secuencia de ácido nucleico (o una porción de la misma) de la presente invención. Las técnicas para producir polipéptidos quiméricos son técnicas convencionales. Dichas técnicas requieren habitualmente unir las secuencias de modo que estén en la misma fase de lectura abierta, y la expresión del polipéptido fusionado bajo el control del mismo promotor o promotores y del mismo terminador.
[0044] Los polipéptidos de neublastina pueden ser polipéptidos N-glicosilados. En una realización, el resto de Asn en la posición 122 de la SEC ID Nº: 2 está glicosilado.
[0045] Esta invención también contempla proteínas de fusión de neublastina, tales como fusiones con Ig, como se describe, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos 5.434.131; 5.565.335; 5.541.087; y 5.726.044, o preferentemente fusiones con albúmina sérica.
[0046] Los polipéptidos de neublastina útiles aquí incluyen composiciones de liberación prolongada y polipéptidos de
5 neublastina modificados con un resto derivado (preferentemente un resto de polietilenglicol) para tener un tiempo de permanencia prolongado y/o una concentración aumentada en fluidos corporales. Además, el polipéptido de neublastina puede derivatizarse con un resto seleccionado del grupo que consiste en ésteres alifáticos, amidas, derivados de N-acilo o derivados de O-acilo.
[0047] La Tabla 2 a continuación muestra una comparación de ClustalW entre prepro-neublastina humana (SEC ID
10 Nº: 2), de ratón (SEC ID Nº: 4) y rata (SEC ID Nº: 5). Los polipéptidos de NBN maduros NBN140, NBN116, NBN113 y NBN99 están indicados mediante "*". Los extremos N-terminales de NBN112 a NBN100 están indicados mediante símbolos ":" consecutivos. La Tabla 3 a continuación muestra la comparación de distancia entre los polipéptidos de neublastina humano, de ratón y rata de tipo silvestre (SEC ID Nº: 2, 4 y 5).
Métodos de producción del polipéptido de neublastina [0048] El polipéptido de neublastina usado en la presente memoria puede aislarse de células de mamífero, preferentemente de una célula humana o de una célula de origen murino. En una realización más preferida, el polipéptido de neublastina puede aislarse de tejido cardiaco humano, de músculo esquelético humano, de páncreas humano o de tejido cerebral humano, en particular de núcleo caudado o de tálamo, o puede obtenerse a partir de ADN de origen de mamífero, como se analiza en más detalle a continuación.
[0049] Como alternativa, los polipéptidos de neublastina pueden obtenerse por expresión de polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos de neublastina. Dichos polinucleótidos incluyen secuencias de ADN, ADNc y ARN y están disponibles en la técnica. Véanse, por ejemplo, los documentos WO 00/01815, WO 00/04050 y WO 00/18799. Los polinucleótidos particularmente útiles tienen la secuencia de ADN presentada como SEC ID Nº: 1 (ADNc de NBN humana), y la secuencia de ADN presentada como SEC ID Nº: 3 (ADNc de NBN de ratón). Además, puede usarse la secuencia genómica para la NBN humana (véase el Nº de Acceso de GenBank AC 005038).
[0050] Más específicamente, los polipéptidos de neublastina útiles en la presente memoria pueden obtenerse por cultivo de una célula que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de neublastina en condiciones que permitan la producción del polipéptido de neublastina, seguido de la recuperación del polipéptido de neublastina del medio de cultivo. La secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de neublastina puede ser una secuencia de ácido nucleico que normalmente sea endógena a la célula o una secuencia de ácido nucleico obtenida exógenamente que se introduce en una célula de "producción". Cuando las células se van a modificar genéticamente con el fin de producir un polipéptido de neublastina, las células pueden modificarse por métodos convencionales o por activación génica.
[0051] De acuerdo con métodos convencionales, una molécula de ADN que contiene una secuencia de ADNc o ADN genómico de neublastina puede estar contenida dentro de una construcción de expresión y transfectarse en células por métodos convencionales incluyendo, pero sin limitación, transfección mediada por liposomas, polibreno o DEAE dextrano, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, microinyección o microproyectiles impulsados por velocidad ("biolística"). Como alternativa, se podría usar un sistema que administre ADN mediante un vector viral. Los virus que se sabe que son útiles para la transferencia de genes incluyen adenovirus, virus adenoasociados, lentivirus, herpesvirus, virus de las paperas, poliovirus, retrovirus, virus Sindbis y virus vaccinia tales como el virus de la viruela del canario, así como la infección por Baculovirus de células de insecto, en particular células de insecto Sf9.
[0052] Como alternativa, las células pueden modificarse para producir un polipéptido de neublastina usando una estrategia de activación génica ("GA"), tal como se describe en las patentes de Estados Unidos 5.733.761 y
5.750.376.
[0053] Por consiguiente, la expresión "genéticamente modificada," como se usa en la presente memoria en referencia a células, pretende incluir células que expresan un producto génico particular después de la introducción de una molécula de ácido nucleico que codifica el producto génico y/o elementos reguladores que controlan la expresión de una secuencia codificante endógena para el producto génico. La molécula de ácido nucleico puede introducirse por direccionamiento génico, que permite la incorporación de la molécula de ácido nucleico en un sitio genómico particular.
[0054] En una realización, el polipéptido de neublastina se produce en una célula bacteriana, preferentemente E. coli. En una realización diferente, el polipéptido de neublastina se produce en una célula derivada de insecto, particularmente Sf9.
[0055] En otra realización, el polipéptido de neublastina se produce, por ejemplo, en una célula de mamífero, por ejemplo, una célula humana, un ovocito o una célula de levadura. La célula de la invención puede ser, sin limitación, una célula de riñón embrionario humano ("HEK"), por ejemplo, una célula HEK 293, una célula BHK21, una célula de ovario de hámster chino ("CHO"), una célula de ovocito de Xenopus laevis ("XLO") o Pichia pastoris (levadura). En una realización, la célula de la invención es una célula fúngica, por ejemplo, una célula fúngica filamentosa. En otra realización más, la célula es una célula de insecto, más preferentemente la célula Sf9. Son células de mamífero adicionales de la invención las líneas celulares PC12, HiB5, RN33b, células progenitoras neuronales humanas, y otras células derivadas de células humanas, especialmente células neuronales.
[0056] Los ejemplos de células primarias o secundarias incluyen fibroblastos, células epiteliales incluyendo células epiteliales mamarias e intestinales, células endoteliales, elementos formados de la sangre, incluyendo linfocitos y células de médula ósea, células gliales, hepatocitos, queratinocitos, células musculares, células neuronales o los precursores de estos tipos celulares. Los ejemplos de líneas celulares humanas inmortalizadas útiles en los presentes métodos incluyen, pero sin limitación, células de melanoma de Bowes (Nº de Acceso ATCC CRL 9607), células de Daudi (Nº de Acceso ATCC CCL 213), células HeLa y derivados de células HeLa (Nº de Acceso ATCC CCL 2, CCL 2.1 y CCL 2.2), células HL-60 (Nº de Acceso ATCC CCL 240), células HT-1080 (Nº de Acceso ATCC CCL 121), células de Jurkat (Nº de Acceso ATCC TIB 152), células de carcinoma KB (Nº de Acceso ATCC CCL 17), células de leucemia K-562 (Nº de Acceso ATCC CCL 243), células de cáncer de mama MCF-7 (Nº de Acceso ATCC BTH 22), células MOLT-4 (Nº de Acceso ATCC 1582), células Namalwa (Nº de Acceso ATCC CRL 1432), células Raji (Nº de Acceso ATCC CCL 86), células RPMI 8226 (Nº de Acceso ATCC CCL 155), células U-937 (Nº de Acceso ATCC CRL 1593), células WI-38VA13 sublínea 2R4 (Nº de Acceso ATCC CLL 75.1) y células de carcinoma de ovario 2780AD (Van der Blick et al., Cancer Res. 48: 5927-5932, 1988), así como células de heterohibridoma producidas por fusión de células humanas y células de otras especies. También pueden usarse cepas de fibroblastos humanos secundarios, tales como WI-38 (Nº de Acceso ATCC CCL 75) y MRC-5 (Nº de Acceso ATCC CCL 171).
[0057] Cuando la célula es una célula eucariota, la incorporación del polinucleótido heterólogo de la invención puede llevarse a cabo en particular por infección (empleando un vector viral), por transfección (empleando un vector plasmídico), usando precipitación con fosfato de calcio, microinyección, electroporación, lipofección u otros métodos físico-químicos conocidos en la técnica.
[0058] Los polipéptidos de NBN se aíslan de cultivos de células de producción, o de medio de cultivo acondicionado por células de producción, usando técnicas de purificación de proteínas convencionales incluyendo el replegamiento si es aplicable. A continuación se describen técnicas adecuadas en los Ejemplos.
Sujetos para tratamiento
[0059] Esta invención puede usarse para el tratamiento, profilaxis o retraso del dolor neuropático, en el que el dolor neuropático es alodinia, dolor hiperalgésico o dolor fantasma, en un sujeto mamífero aquejado del mismo, o en riesgo del mismo, por aplicación de un polipéptido de neublastina. Los sujetos en riesgo de desarrollar una neuropatía incluyen sujetos con diabetes, sujetos que están recibiendo quimioterapia, sujetos que han experimentado ciertos traumatismos, sujetos que han ingerido diversas toxinas o fármacos, sujetos que experimenten ciertas deficiencias vitamínicas, sujetos infectados con ciertos patógenos víricos, sujetos aquejados de diversos trastornos autoinmunes y trastornos metabólicos, y sujetos que han experimentado ciertos daños nerviosos
o neurodegeneración. Los sujetos mamíferos incluyen ovejas, caballos, perros, gatos, cerdos, conejos, cobayas, ratas, hámsteres, jerbos y ratones, pero más preferentemente son seres humanos.
[0060] Típicamente, en sujetos humanos, el paciente es resistente a otras terapias del dolor tradicionales o el sujeto responde insuficientemente a otras de dichas terapias del dolor para proporcionar un control del dolor satisfactorio.
[0061] En general, esta invención presenta protocolos tanto de tratamiento profiláctico como de tratamiento terapéutico. En el tratamiento profiláctico, se prepara un polipéptido de neublastina que se administrará a un sujeto en riesgo de dolor neuropático, en el que el dolor neuropático es alodinia, dolor hiperalgésico o dolor fantasma; se esperaría que dichos sujetos fueran sujetos con una neuropatía en fase temprana. El tratamiento con neublastina en tales circunstancias serviría para tratar de forma preventiva a pacientes en riesgo.
[0062] En el tratamiento terapéutico, se prepara un polipéptido de neublastina que se administrará a un sujeto que ha experimentado dolor neuropático, en el que el dolor neuropático es alodinia, dolor hiperalgésico o dolor fantasma; se esperaría que dichos sujetos fueran sujetos con una neuropatía en fase tardía. El tratamiento con neublastina en tales circunstancias serviría para aliviar dicho dolor neuropático. Dichos pacientes en fase tardía pueden haber recibido varias terapias, comenzando con la automedicación (tal como fármacos antiinflamatorios no esteroideos, por ejemplo, ibuprofeno). Dichos tratamientos pueden aumentarse a escala a antidepresivos (por ejemplo, antidepresivos tricíclicos, venlafaxina e inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina —las medicaciones específicas incluyen amitriptilina, desipramina, imipramina y nortriptilina) o anticonvulsivantes (por ejemplo, gabapentina, carbamazepina, lamotrigina, topiramato y fenitoína). Otra medicación incluye analgésicos tópicos (por ejemplo, capsaicina y lidoderm), antiarrítmicos y opioides. Puede realizarse una cirugía en casos de neuropatía grave. Los estudios indican que menos del 50% de los pacientes responden a analgésicos tópicos, antiarrítmicos, opioides o cirugía.
Métodos y composiciones farmacéuticas
[0063] Esta invención proporciona usos de un polipéptido de neublastina para tratar, prevenir o retrasar el dolor neuropático, en los que el dolor neuropático es alodinia, dolor hiperalgésico o dolor fantasma. Los presentes usos aplican polipéptidos de neublastina, incluyendo polipéptidos de neublastina de longitud completa o polipéptidos de neublastina truncados bioactivos. Además, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que contienen un polipéptido de neublastina de longitud completa o un polipéptido de neublastina truncado suspendido, disuelto o dispersado en un vehículo farmacéuticamente aceptable para tratar, prevenir o retrasar el dolor neuropático, en las que el dolor neuropático es alodinia, dolor hiperalgésico o dolor fantasma.
1. Tratamiento del dolor neuropático
[0064] En una realización, la invención presenta un uso de un polipéptido de neublastina para tratar, prevenir o retrasar el dolor neuropático, en el que el dolor neuropático es alodinia, dolor hiperalgésico o dolor fantasma. El polipéptido de neublastina puede administrarse en solitario (monoterapia) o como parte de un régimen de terapia de combinación. Las terapias de combinación preferidas incluyen un compuesto inductor de analgesia seleccionado del grupo que consiste en opioides, antiarrítmicos, analgésicos tópicos, anestésicos locales, anticonvulsivantes, antidepresivos, corticosteroides y fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE).
[0065] La invención también proporciona tratamientos de neuropatías inducidas por quimioterapia (tales como las causadas por administración de agentes quimioterápicos, por ejemplo, taxol o cisplatino); neuropatías inducidas por toxinas, neuropatías inducidas por fármacos, neuropatías inducidas por patógenos (por ejemplo, inducidas por virus), neuropatías inducidas por deficiencias vitamínicas; neuropatías idiopáticas; y neuropatías diabéticas, por aplicación de un polipéptido de neublastina. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 5.496.804 y 5.916.555. La invención puede usarse todavía además para el tratamiento de mononeuropatías, mononeuropatías múltiples y polineuropatías, incluyendo neuropatías axonales y desmielinizantes, usando los nucleótidos y polipéptidos de neublastina de esta invención.
[0066] El dolor neuropático puede estar asociado con varias neuropatías periféricas, incluyendo:
(a) neuropatías inducidas por quimioterapia,
(b)
neuropatías inducidas por toxinas (incluyendo, pero sin limitación, neuropatías inducidas por alcoholismo, intoxicación por vitamina B6, intoxicación por hexacarbono, amiodarona, cloranfenicol, disulfiram, isoniazida, oro, litio, metronidazol, misonidazol, nitrofurantoína),
(c)
neuropatías inducidas por fármacos, incluyendo dolor neuropático inducido por fármacos terapéuticos (tal como el causado por agentes anticancerosos, particularmente agentes anticancerosos seleccionados del grupo que consiste en taxol, taxotere, cisplatino, nocodazol, vincristina, vindesina y vinblastina; y tal como el causado por agentes antivirales, particularmente agentes antivirales seleccionados del grupo que consiste en ddl, DDC, d4T, foscarnet, dapsona, metronidazol e isoniazid).
(d)
neuropatías inducidas por deficiencias vitamínicas (incluyendo, pero sin limitación, deficiencia de vitamina B12, deficiencia de vitamina B6 y deficiencia de vitamina E),
(e)
neuropatías idiopáticas,
(f)
neuropatías diabéticas,
(g)
daños nerviosos inducidos por patógenos,
(h)
daños nerviosos inducidos por inflamación,
(i)
neurodegeneración,
(j)
neuropatía hereditaria (incluyendo, pero sin limitación, ataxia de Friedreich , polineuropatía amiloide familiar, enfermedad de Tangier, enfermedad de Fabry),
(k) trastornos metabólicos (incluyendo, pero sin limitación, insuficiencia renal e hipotiroidismo),
(l)
neuropatías infecciosas y virales (incluyendo, pero sin limitación, dolor neuropático asociado con lepra, enfermedad de Lyme, dolor neuropático asociado con infección por un virus, particularmente un virus seleccionado del grupo que consiste en un herpesvirus (por ejemplo, herpes zóster que puede conducir a neuralgia postherpética), un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y un papilomavirus),
(m)
neuropatías autoinmunes (incluyendo, pero sin limitación, síndrome de Guillain-Barre, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, gammapatía monoclonal de importancia indeterminada y polineuropatía),
(n) neuralgia trigeminal y síndromes de atrapamiento (incluyendo, pero sin limitación, túnel carpiano),
(o)
otros síndromes de dolor neuropático incluyendo neuralgia postraumática, dolor de miembro fantasma, dolor por esclerosis múltiple, síndromes de dolor regional complejos (incluyendo, pero sin limitación, distrofia simpática refleja, causalgia), dolor asociado a neoplasia, neuropatía vasculítica/angiopática y ciática.
[0067] El dolor neuropático puede manifestarse como alodinia, dolor hiperalgésico, hiperalgesia térmica o dolor fantasma.
2. Tratamiento de la alodinia táctil
[0068] La expresión "alodinia táctil" se refiere típicamente a la afección en un sujeto en la que se provoca dolor por una estimulación de la piel (por ejemplo, tacto) que normalmente es inocua. Esta invención presenta un uso de un polipéptido de neublastina para su uso en el tratamiento de la alodinia táctil en un sujeto. En una realización, la alodinia táctil se trata mediante un polipéptido de neublastina solamente.
[0069] En una segunda realización, la alodinia táctil se trata por administración al sujeto de una cantidad eficaz de un polipéptido de neublastina en combinación con una cantidad eficaz de un compuesto inductor de analgesia seleccionado del grupo que consiste en opioides, antiarrítmicos, analgésicos tópicos, anestésicos locales, anticonvulsivantes, antidepresivos, corticosteroides y AINE. En una realización preferida, el compuesto inductor de analgesia es un anticonvulsivante. En otra realización preferida, el compuesto inductor de analgesia es gabapentina (ácido (1-aminometil)ciclohexano acético) o pregabalina (ácido S-(+)-4-amino-3-(2-metilpropil)butanoico).
3. Tratamiento para la reducción de la pérdida de la sensibilidad dolorosa
[0070] También se describe un uso para reducir la pérdida de la sensibilidad dolorosa en un sujeto aquejado de una neuropatía. En una realización preferida, la neuropatía es neuropatía diabética. En una realización preferida, la pérdida de sensibilidad dolorosa es una pérdida de sensibilidad dolorosa térmica. Esta invención contempla un tratamiento tanto profiláctico como terapéutico.
[0071] En el tratamiento profiláctico, se administra un polipéptido de neublastina a un sujeto en riesgo de desarrollar una pérdida de sensibilidad dolorosa; se esperaría que dichos sujetos fueran sujetos con una neuropatía en fase temprana. El tratamiento con neublastina en tales circunstancias serviría para tratar de forma preventiva a pacientes en riesgo.
[0072] En el tratamiento terapéutico, también se describe que se administra un polipéptido de neublastina a un sujeto que ha experimentado una pérdida de sensibilidad dolorosa como resultado de su afección por una neuropatía; se esperaría que dichos sujetos fueran sujetos con una neuropatía en fase tardía. El tratamiento con neublastina en tales circunstancias serviría para rescatar la sensibilidad dolorosa apropiada en el sujeto.
4. Tratamiento de infecciones víricas y neuropatías asociadas a virus
[0073] Se contempla el tratamiento profiláctico de neuropatías infecciosas y víricas. El tratamiento profiláctico está indicado después de la determinación de una infección vírica y antes de la aparición del dolor neuropático. Durante el tratamiento, el polipéptido de NBN se administra para prevenir la aparición del dolor neuropático asociado con lepra, enfermedad de Lyme, dolor neuropático asociado con una infección por un virus, particularmente un virus seleccionado del grupo que consiste en un herpesvirus (y más particularmente por un virus herpes zóster, que puede conducir a una neuralgia postherpética), un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y un papilomavirus). En una realización alternativa, se usa un polipéptido de NBN para reducir la gravedad del dolor neuropático, si apareciese.
[0074] Los síntomas de una infección vírica aguda incluyen con frecuencia la aparición de una erupción. Otros síntomas incluyen, por ejemplo, el desarrollo de dolor persistente en el área del cuerpo afectada, que es una complicación común de una infección por herpes zóster (zóster). La neuralgia postherpética puede durar un mes o más, y puede aparecer varios meses después de que haya desaparecido cualquier síntoma de tipo erupción. La neuralgia postherpética puede ser muy grave y prolongada, y puede ser muy resistente al tratamiento.
5. Tratamiento de neuropatías diabéticas
[0075] Se contempla el tratamiento profiláctico de neuropatías asociadas a diabetes. El tratamiento profiláctico de las neuropatías diabéticas comenzaría después de la determinación del diagnóstico inicial de diabetes o de síntomas asociados con diabetes y antes de la aparición del dolor neuropático. El tratamiento profiláctico de las neuropatías diabéticas también puede comenzar tras la determinación de que un sujeto está en riesgo de desarrollar diabetes o síntomas asociados con diabetes. Durante el tratamiento, se usa un polipéptido de NBN para prevenir la aparición del dolor neuropático o reducir la gravedad del dolor neuropático, si apareciese.
[0076] Los resultados de la FIG. 6A y FIG. 6B son relativos al tratamiento de la neuropatía diabética en pacientes humanos que necesitan dicho tratamiento. Se contempla la prevención de la hipoalgesia térmica y la prevención y reversión de la hiperalgesia térmica, como se describe en el Ejemplo 6.
6. Dosificación
[0077] Los usos anteriores contemplan, preferentemente como administración sistémica, una formulación que comprende un polipéptido de neublastina a una dosificación de entre 1 Ig/kg y 30.000 Ig/kg de peso corporal del sujeto, por dosis; preferentemente la dosificación está entre 10 Ig/kg y 10.000 Ig/kg de peso corporal del sujeto, por dosis; más preferentemente la dosificación está entre 25 Ig/kg y 3.000 Ig/kg de peso corporal del sujeto, por dosis.
[0078] Se contemplan diversos regímenes de dosificación para el tratamiento o la prevención de la alodinia táctil. En una realización, se aplica una formulación que comprende un polipéptido de neublastina en los usos de administración a un sujeto de una dosificación de entre 1 Ig/kg y 30.000 Ig/kg de peso corporal del sujeto, por dosis. En otra realización, la dosificación está entre 10 Ig/kg y 30.000 Ig/kg de peso corporal del sujeto, por dosis. En una realización adicional, la dosificación está entre 10 Ig/kg y 10.000 Ig/kg de peso corporal del sujeto, por dosis. En una realización diferente, la dosificación está entre 25 Ig/kg y 10.000 Ig/kg de peso corporal del sujeto, por dosis. En otra realización más, la dosificación está entre 25 Ig/kg y 3.000 Ig/kg de peso corporal del sujeto, por dosis. En una realización más preferible, la dosificación está entre 50 Ig/kg y 3.000 Ig/kg de peso corporal del sujeto, por dosis.
[0079] Asimismo, se describen diversos programas de dosificación para un tratamiento para modular la pérdida de sensibilidad dolorosa. La administración a un sujeto de una formulación que comprende un polipéptido de neublastina incluye administrar NBN a una dosificación de entre 1 Ig/kg y 30.000 Ig/kg de peso corporal del sujeto, por dosis; preferentemente la dosificación está entre 10 Ig/kg y 10,000 Ig/kg de peso corporal del sujeto, por dosis; más preferentemente la dosificación está entre 25 Ig/kg y 3.000 Ig/kg de peso corporal del sujeto, por dosis.
7. Administración
[0080] El polipéptido de neublastina aplicado en los usos anteriores puede administrarse mediante cualquier sistema de administración adecuado, y preferentemente del grupo que consiste en administración intravenosa, administración intramuscular, administración intrapulmonar, administración subcutánea y administración intraperitoneal, más preferentemente por administración intramuscular, administración intravenosa o administración subcutánea. El polipéptido de neublastina aplicado en los usos anteriores también puede administrarse mediante administración intratecal.
8. Formulación
[0081] Esta invención también describe nuevas composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de polipéptidos de neublastina suspendidos, disueltos o dispersados en un vehículo farmacéuticamente aceptable para tratar, prevenir o retrasar el dolor neuropático, en las que el dolor neuropático es alodinia, dolor hiperalgésico o dolor fantasma.
[0082] Para su uso en terapia el polipéptido de la invención puede administrarse en cualquier forma conveniente. En una realización preferida, el polipéptido de la invención se incorpora en una composición farmacéutica junto con uno
o más adyuvantes, excipientes, vehículos y/o diluyentes, y la composición farmacéutica se prepara por el experto en la materia usando métodos convencionales conocidos en la técnica. Pueden encontrarse detalles adicionales sobre técnicas para la formulación y administración en la última edición de Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, PA). Típicamente, los diluyentes, vehículos y excipientes aceptables no afectan perjudicialmente a la homeostasia del destinatario, particularmente al equilibrio electrolítico. Los vehículos aceptables pueden incluir sales biocompatibles, inertes o bioabsorbibles, agentes tamponantes, oligo- o polisacáridos, polímeros, agentes de mejora de la viscosidad, conservantes y similares. Un vehículo ejemplar comprende solución salina fisiológica normal (NaCl 0,15 M, pH 7,0 a 7,4). Otro vehículo ejemplar comprende fosfatos sódico 50 mM, cloruro sódico 100 mM.
9. Regímenes
[0083] La frecuencia de dosificación para los polipéptidos de neublastina de esta invención está dentro de las habilidades y del juicio clínico de los médicos. Típicamente, el régimen de administración se establece por ensayos clínicos que pueden establecer los parámetros de administración óptimos. Sin embargo, el experto puede variar dichos regímenes de administración de acuerdo con la edad, salud, peso, sexo y estado médico del sujeto. La frecuencia de dosificación también puede variar entre tratamientos agudos y crónicos para la neuropatía. Además, la frecuencia de dosificación puede variarse dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1: Expresión de polipéptido de neublastina
A. Expresión en E. coli
[0084] Para la expresión y purificación en bacterias, un plásmido que codifica neublastina de rata se expresó en E. coli como una proteína de fusión marcada con His con un sitio de escisión por enteroquinasa inmediatamente adyacente al inicio de la secuencia de NBN madura de 113 aminoácidos. Las células de E. coli se cultivaron en un fermentador de 500 l y se proporcionó una pasta celular congelada. Las células de E. coli se lisaron en una prensa Manton Gaulin y la NBN de rata se recuperó a partir de la fracción de sedimento lavado insoluble.
[0085] La NBN se extrajo a partir del sedimento con clorhidrato de guanidina, se replegó, y la etiqueta de His se eliminó con enteroquinasa. Para una purificación adicional, el producto se sometió después a cromatografía en Ni NTA agarosa (Qiagen) y a cromatografía en una resina de intercambio catiónico Bakerbond WP CBX.
[0086] El producto resultante se sometió a una caracterización exhaustiva, incluyendo el análisis por SDS-PAGE, cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), HPLC de fase inversa, desorción/ionización láser asistida por matriz/espectrometría de masas (MALDI/MS), mapeo de péptidos, evaluación de actividad en el ELISA KIRA y determinación del contenido de endotoxina. La pureza del producto de NBN según se midió por SDS-PAGE y SEC era superior al 95%. El producto de NBN migraba en condiciones no reductoras como un dímero, lo que concuerda con su estructura esperada. El contenido de endotoxina del material es de forma rutinaria inferior a 1 UE/mg. La actividad específica de la NBN en el ELISA KIRA es de aproximadamente 10 nM. El producto se formuló a 1 mg/ml en PBS pH 6,5. El material puede suministrarse como un líquido congelado, que se almacena a -70ºC.
[0087] También se han construido sistemas de expresión similares para la NBN humana. A partir de estas construcciones, la NBN humana se ha expresado en E. coli.
B. Expresión en células de mamífero
[0088] Construcción del plásmido pJC070.14. Para expresar el ADNc de neublastina en células de ovario de hámster chino, se insertó un fragmento de ADNc que codifica la forma prepro de neublastina humana en el vector de expresión de mamífero pEAG347 para generar el plásmido pJC070.14. El pEAG347 contiene los promotores temprano de SV40 y tardío principal de adenovirus en tándem (derivados del plásmido pAD2beta; Norton y Coffin, Mol. Cell. Biol. 5: 281 (1985)), un sitio de clonación NotI único, seguido de señales de terminación de la transcripción tardía de SV40 y poliA (derivadas del plásmido pCMVbeta; MacGregor y Caskey, Nucl. Acids. Res. 17: 2365 (1989)). Además, el pEAG347 contiene una cadena principal plasmídica derivada de pUC19 y un dhfr derivado del pSV2dhfr para la selección y amplificación con MTX en células CHO transfectadas.
[0089] El plásmido pJC070.14 se generó en dos etapas. En primer lugar, se aisló un fragmento que codifica la forma prepro de neublastina humana del plásmido pUbi1Z-NBN usando la reacción en cadena de la polimerasa con los oligonucleótidos KD2-824 5'AAGGAAAAAA GCGGCCGCCA TGGAACTTGG ACTTGGAGG3' (SEC ID Nº: 9), KD2825 5'TTTTTTCCTT GGCGGCCGCT CAGCCCAGGC AGCCGCAGG3' (SEQ ID Nº: 10) y polimerasa PFU. El fragmento se clonó en el sitio Srf-1 del pPCR-Script Amp SK(+) para generar el plásmido pJC069. En la segunda etapa, se realizó una digestión parcial con Not-1 en el plásmido pJC069 para generar un fragmento de 685 pb (que contiene el gen de neublastina) que se clonó en el sitio Not-1 del plásmido pEAG347 para generar el plásmido pJC070.14. La transcripción del gen de neublastina en el plásmido pJC070.14 está controlada por el promotor tardío principal de adenovirus.
[0090] Generación de líneas celulares CHO que expresan neublastina. 200 Ig de pJC070.14 se linealizaron por digestión con la endonucleasa de restricción Mlu-1. El ADN se extrajo con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico
(25:24:1) y se precipitó con etanol. El ADN linealizado se resuspendió en Hepes 20 mM pH 7,05, NaCl 137 mM, KCl 5 mM, Na2HPO4 0,7 mM, dextrosa 6 mM (HEBS) y se introdujo en ~4E7 células CHO dukx B1 (dhfr-) (p23) por electroporación (280 V y 960 IF). Después de la electroporación, las células se devolvieron a cultivo en medio de Eagle modificado a+ (MEM) complementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) durante dos días. Después, las células se trataron con tripsina y se volvieron a sembrar en placas de 100 mm (100.000 células/placa) en a-MEM (que carece de ribo- y desoxirribonucleósidos), complementado con FBS dializado al 10%, durante cinco días. Las células se dividieron posteriormente a una densidad de 100.000 células/placa de 100 mm, y se seleccionaron en metotrexato 200 nM. Se escogieron las colonias resistentes y se aumentaron a escala a placas de 6 pocillos; los medios acondicionados de cada clon se exploraron usando un ensayo específico para neublastina descrito a continuación. Los doce clones que expresaban el mayor nivel de neublastina se aumentaron a escala a matraces T162 y posteriormente se volvieron a ensayar. Estas líneas celulares CHO producían neublastina en el intervalo de 25 a 50 ng/ml/día.
[0091] Ensayo de complejo ternario para neublastina. La presencia de neublastina se evaluó en los medios de sobrenadantes de la línea celular CHO usando una forma modificada de un ensayo de complejo ternario descrito por Sanicola et al. (Proc Natl Acad Sci USA 94: 6238 (1997).
[0092] Se han generado construcciones de expresión de mamífero similares y se han realizado estudios similares tanto para NBN humana como para NBN de rata. Se ha realizado un ensayo in vivo de la actividad de NBN en ratas. Los estudios en rata se realizaron casi exclusivamente con NBN de rata.
EJEMPLO 2: Eficacia de neublastina de longitud completa en un modelo animal de ligación de nervios de dolor neuropático – Prevención del dolor neuropático
[0093] El efecto preventivo de la neublastina sobre la alodinia táctil y la hiperalgesia térmica se estudió en el modelo de ligación de nervios espinales ("SNL") L5/L6 de Chung (Kim y Chung (1992), Pain 50: 355-363. Se dividieron ratas macho Sprague-Dawley (250-300 g) en cuatro grupos. Un grupo de ratas (n = 7) recibió una operación simulada, y se les administró vehículo por inyección subcutánea. Un segundo grupo de ratas (n = 7) recibió una operación simulada y se les administró Neublastina de rata (1 mg/kg) por inyección subcutánea. Un tercer grupo de ratas (n = 7) recibió la ligación de nervios espinales, y se les administró vehículo por inyección subcutánea. Un cuarto grupo de ratas (n = 7) recibió la ligación de nervios espinales, y se les administró neublastina de rata (1 mg/kg) por inyección subcutánea. El vehículo consistía en fosfato 5 mM y cloruro sódico 150 mM a pH 6,5. Se inyectó neublastina o vehículo 30 minutos antes de la ligación de nervios espinales o de la operación simulada, y después los días 2, 4, 7, 9, 11 y 14 después de la ligación o de la operación (post-SNL). Se usaron los ensayos de comportamiento de Von Frey (Chaplan et al. (1994), J. Neurosci. Meth. 53: 55-63) y Hargreaves (Hargreaves et al. (1988), Pain 32: 77-88) para controlar las respuestas táctil y térmica, respectivamente. Estas respuestas dolorosas se controlaron antes de la ligación de nervios espinales o de la operación simulada para establecer las respuestas basales, y después diariamente durante dos semanas después de la operación.
[0094] Los resultados se representan en las FIGS. 1 y 2 como promedios ± errores típicos de la media. La administración subcutánea de neublastina (como se indica por flechas hacia abajo en las FIGS. 1 y 2) condujo a una normalización casi completa de ambos tipos de dolor neuropático (táctil, FIG. 1 y térmico, FIG. 2) en ratas con ligación de nervios espinales. En ratas con operación simulada, la administración subcutánea de neublastina no alteró significativamente la sensibilidad táctil (FIG. 1) o térmica (FIG. 2). En ratas con ligación de nervios espinales, el efecto de la neublastina sobre la sensibilidad térmica se hizo evidente por primera vez 3 días después del inicio de la administración de neublastina, mientras que el efecto sobre la alodinia táctil se hizo evidente por primera vez ligeramente después, a los 4-5 días después del inicio de la administración de neublastina. El efecto de la neublastina sobre la sensibilidad térmica alcanzó una meseta aproximadamente 7-8 días después del inicio de la administración de neublastina, mientras que el efecto sobre la alodinia táctil alcanzó una meseta aproximadamente 10-11 días después del inicio de la administración de neublastina. Los efectos de la neublastina no disminuyeron durante el intervalo de 2-3 días entre administraciones. De hecho, hubo una normalización sustancial de ambos comportamientos dolorosos entre las administraciones de neublastina los días 4 y 7, según se midió los días 5 y 6. Después de la administración de neublastina el día 11, la normalización máxima existente de ambos comportamientos dolorosos se mantuvo constante, sugiriendo que el efecto de normalización de la neublastina sobre el dolor neuropático se mantiene durante al menos 3 días.
EJEMPLO 3: Tratamiento de neuropatía con un polipéptido de neublastina truncado
[0095] El efecto preventivo de un polipéptido que contiene los 102 aminoácidos carboxi-terminales de la neublastina de rata madura en el tratamiento de la alodinia táctil y la hiperalgesia térmica, dos afecciones neuropáticas periféricas, se demuestra en un modelo de ligación de nervios espinales ("SNL") L5/L6 de Chung.
[0096] Se dividieron ratas macho Sprague-Daley (aproximadamente 250-300 gramos) en cuatro grupos. Un grupo de ratas (n = 6) recibe una operación simulada y se les administra vehículo por inyección subcutánea. Un segundo grupo de ratas (n = 6) recibe una operación simulada y se les administra neublastina truncada (1 mg/kg) por inyección subcutánea. Un tercer grupo de ratas (n = 6) recibe una ligación de nervios espinales y se les administra vehículo por ligación subcutánea. Un cuarto grupo (n = 6) recibe la ligación de nervios espinales, y se les administra neublastina truncada (1 mg/kg) por inyección subcutánea. El vehículo incluye fosfato 5 mM y cloruro sódico 150 mM a pH 6,5. Se administra neublastina truncada o vehículo los días 0, 2, 4, 7, 9, 11 y 14. El día 0, se administra neublastina truncada 30 minutos antes de la ligación de nervios espinales o de la operación simulada. Las respuestas dolorosas se determinan usando ensayos de comportamiento como se describen en Chaplan et al. (1994), J. Neurosci. Meth. 53: 55-63 y Hargreaves et al. (1988), Pain 32: 77-88. Estos ensayos controlan las respuestas táctil y térmica, respectivamente. Las respuestas dolorosas se controlan antes de la ligación de nervios espinales o de la operación simulada para establecer las respuestas basales. Después, las respuestas dolorosas se controlan diariamente durante dos semanas después de la operación.
[0097] Se espera que la administración subcutánea de neublastina truncada conduzca a la normalización de ambos tipos de dolor neuropático en ratas con ligación de nervios espinales. En ratas con operación simulada, no se espera que la administración subcutánea de neublastina truncada altere significativamente la sensibilidad táctil o térmica. Se espera que el efecto de la neublastina sobre la sensibilidad térmica se haga evidente aproximadamente 3 días después de la administración de neublastina, mientras que se espera que el efecto sobre la alodinia táctil se haga evidente por primera vez ligeramente después.
EJEMPLO 4: Eficacia de la neublastina en un modelo animal de ligación de nervios de dolor neuropático – Reversión del dolor neuropático
[0098] El efecto de reversión de la neublastina sobre la alodinia táctil y la hiperalgesia térmica se estudió en el modelo de ligación de nervios espinales ("SNL") L5/L6 de Chung. Se dividieron ratas macho Sprague-Dawley (270275 g) en cuatro grupos. Un grupo de ratas (n = 8) recibió una operación simulada, y se les administró vehículo por inyección subcutánea. Un segundo grupo de ratas (n = 8) recibió una operación simulada y se les administró neublastina de rata (1 mg/kg) por inyección subcutánea. Un tercer grupo de ratas (n = 8) recibió la ligación de nervios espinales, y se les administró vehículo por inyección subcutánea. Un cuarto grupo de ratas (n = 8) recibió la ligación de nervios espinales, y se les administró neublastina de rata (1 mg/kg) por inyección subcutánea. El vehículo consistía en fosfato 5 mM y cloruro sódico 150 mM a pH 6,5. Se usaron los ensayos de comportamiento de Von Frey (Chaplan et al. (1994), J. Neurosci. Meth. 53: 55-63) y Hargreaves (Hargreaves et al. (1988), Pain 32: 77-88) para controlar las respuestas táctil y térmica, respectivamente. Estas respuestas dolorosas se controlaron antes de la ligación de nervios espinales o de la operación simulada para establecer las respuestas basales, y después diariamente durante 2 semanas después de la operación. Se inyectó neublastina o vehículo 60 minutos antes del ensayo de comportamiento los días 3, 5, 7, 10, 12 y 14 después de la ligación o de la operación (post-SNL).
[0099] Los resultados se representan en las FIGS. 3 y 4 como promedios ± errores típicos de la media. Ambos tipos de comportamiento de dolor neuropático (alodinia táctil mostrada en la FIG. 3, e hiperalgesia térmica mostrada en la FIG. 4) se habían desarrollado completamente el día 3, como se esperaba. La administración subcutánea de neublastina (como se indica por flechas hacia abajo en las FIGS. 3 y 4) condujo a una reversión casi completa de ambos tipos de dolor neuropático (táctil en la FIG. 3 y térmico en la FIG. 4) en ratas con ligación de nervios espinales, de modo que se normalizaron las respuestas táctil y térmica. En ratas con operación simulada, la administración subcutánea de neublastina no alteró significativamente la sensibilidad táctil (FIG. 3) o térmica (FIG. 4). En ratas con ligación de nervios espinales, el efecto de la neublastina sobre la sensibilidad térmica y la alodinia táctil se hizo evidente por primera vez de 2 a 3 días después del inicio de la administración de neublastina. El efecto de la neublastina sobre la sensibilidad térmica y la alodinia táctil alcanzó una meseta aproximadamente 7-8 días después del inicio de la administración de neublastina. Los efectos de la neublastina no disminuyeron durante el intervalo de 2 a 3 días entre administraciones. De hecho, hubo una normalización sustancial de ambos comportamientos dolorosos entre las administraciones de neublastina los días 3, 5, 7 y 10.
EJEMPLO 5: Eficacia de la neublastina en un modelo animal de estreptozotocina de dolor neuropático – Prevención de la pérdida de sensibilidad dolorosa (Ejemplo ilustrativo)
[0100] El efecto preventivo de la neublastina sobre la pérdida de sensibilidad térmica (hipoalgesia térmica) se estudió en el modelo de estreptozotocina ("STZ") de neuropatía diabética. Se dividieron ratas hembra Sprague-Dawley (250-275 g) en 4 grupos, comprendiendo cada uno 10 animales. Un grupo de ratas no recibió STZ; estas ratas recibieron vehículo por inyección subcutánea. Tres grupos de ratas recibieron 1 inyección de STZ (50 mg/kg en solución salina estéril) y posteriormente se confirmó que estaban hiperglucémicas por ensayo espectrofotométrico de muestras de sangre. De los 3 grupos de ratas hiperglucémicas, 1 grupo recibió vehículo por inyección subcutánea, a un segundo grupo se le administró neublastina de rata (0,1 mg/kg) por inyección subcutánea, y a un tercer grupo de ratas se le administró neublastina de rata (1 mg/kg) por inyección subcutánea. El vehículo consistía en fosfato 5 mM y cloruro sódico 150 mM a pH 6,5. Se administró neublastina o vehículo 3 veces por semana (programa de lunes, miércoles y viernes) durante 8 semanas, y se inició en el momento de la inducción de hiperglucemia con STZ. Las latencias de respuesta térmica se evaluaron después de 8 semanas como se describe en Calcutt et al. (2000), Anesthesiology 93: 1271-1278. En resumen, se aplicó una fuente de calor radiante a la superficie plantar de la pata de modo que la temperatura superficial aumentaba de 30ºC a 38,5ºC en 20 segundos, y se midió el tiempo de latencia entre el inicio del calentamiento y la retirada de la pata para evaluar la latencia de la respuesta térmica. Un aumento en la latencia de la retirada de la pata indica una pérdida de sensibilidad térmica (hipoalgesia térmica).
[0101] Los resultados se representan en la FIG. 5 como promedios ± errores típicos de la media. Como se esperaba a las 8 semanas post-STZ, la latencia de la retirada de la pata aumentó en las ratas con STZ tratadas con vehículo (STZ vehículo) en comparación con ratas normales, indicando que se había inducido hipoalgesia térmica mediante la inyección de STZ. La administración de neublastina prevenía el aumento en la latencia de la respuesta térmica en ratas hiperglucémicas (STZ). Ambas dosis de neublastina (1 mg/kg y 0,1 mg/kg) normalizaban casi completamente la sensibilidad térmica después de 8 semanas de administración a 3 veces por semana. Estos resultados demuestran que la neublastina previene la hipoalgesia térmica, la pérdida de sensibilidad térmica que se produce en el modelo de rata con STZ de neuropatía diabética.
EJEMPLO 6: Prevención de la hipoalgesia térmica, y prevención y reversión de la hiperalgesia térmica por neublastina in ratas con estreptozotocina.
[0102] Se preparó NBN113 de rata en E. coli como se describe en el Ejemplo 1. El efecto preventivo de la neublastina sobre la pérdida de sensibilidad térmica (hipoalgesia térmica), y la prevención y reversión por neublastina de la sensibilidad térmica aumentada (hiperalgesia térmica) se estudió en el modelo de rata con estreptozotocina ("STZ") de neuropatía diabética, como se describe en el Ejemplo 5. Los estudios de dosificación descritos en el Ejemplo 5 se confirmaron y se ampliaron. Los resultados se muestran en la FIG. 6A y la FIG. 6B.
[0103] Los resultados en la FIG. 6A y la FIG. 6B se representan como promedios ± errores típicos de la media. Como se esperaba a las 4 semanas post-STZ, la latencia de la retirada de la pata disminuyó en las ratas con STZ tratadas con vehículo, en comparación con las ratas normales, indicando que se había inducido hiperalgesia térmica mediante la inyección de STZ. Todas las dosis de neublastina subcutánea (0,03 mg/kg y 0,1 mg/kg) prevenían la hiperalgesia térmica en ratas con STZ después de 4 semanas de administración a 3 veces por semana, como se muestra en la FIG. 6A. Todas las dosis de neublastina subcutánea (0,03 mg/kg y 0,1 mg/kg) prevenían la hipoalgesia térmica en ratas con STZ después de 8 semanas de administración a 3 veces por semana, como se muestra en la FIG. 6B. Además, como se muestra en la FIG. 6B, la neublastina subcutánea (0,1 mg/kg) administrada durante las segundas 4 semanas del estudio de tratamiento de 8 semanas (veh; NBN 0,1 mg/kg) no sólo revertía la hiperalgesia térmica que era evidente a las 4 semanas postratamiento con STZ, sino que también prevenía el desarrollo de hipoalgesia térmica a las 8 semanas en ratas con STZ. Estos resultados demuestran que la neublastina previene y revierte la hiperalgesia térmica en el modelo de rata con STZ de neuropatía diabética, y que la neublastina previene la pérdida de sensibilidad térmica (hipoalgesia térmica) que se produce en el modelo de rata con STZ de neuropatía diabética.
EJEMPLO 7: Eficacia de la neublastina en un modelo animal de ligación de nervios de dolor neuropático – La reversión del dolor neuropático es dependiente de la dosis.
[0104] Se preparó NBN113 de rata en E. coli como se describe en el Ejemplo 1. Se realizó un análisis de la reversión dependiente de la dosis por NBN113 de la alodinia táctil y de la hiperalgesia térmica en ratas usando el modelo animal de ligación de nervios espinales ("SNL") L5/L6 de Chung, como se describe en el Ejemplo 4, con dosis de NBN de 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,6 mg/kg y 2 mg/kg. Los resultados experimentales mostrados en las FIGS 3 y 4 se confirmaron y se ampliaron. Los resultados se muestran en la FIG. 7 y la FIG. 8.
[0105] Los resultados de las FIGS. 7 y 8 se representan como promedios ± errores típicos de la media. BL indica las respuestas basales. Ambos tipos de comportamiento de dolor neuropático (alodinia táctil mostrada en la FIG. 7, e hiperalgesia térmica mostrada en la FIG. 8) se habían desarrollado completamente el día 2, como se esperaba. La administración subcutánea de neublastina (NBN) 2 mg/kg 3 veces por semana (como se indica por las flechas) condujo a una reversión casi completa de ambos tipos de dolor neuropático (táctil en la FIG. 7 y térmico en la FIG. 8) en ratas con ligación de nervios espinales, de modo que se normalizaron las respuestas táctil y térmica. Como se muestra en la FIG. 7, la reversión por neublastina de la alodinia táctil inducida por ligación de nervios espinales era dependiente de la dosis. La dosificación de neublastina (NBN) a 0,1 mg/kg s.c. o 0,6 mg/kg s.c. revertía parcialmente la alodinia táctil después de 9 (así como 11) días de dosificación tres veces por semana, mientras que la NBN a 2 mg/kg s.c. revertía significativamente la alodinia táctil después de 7 (así como 9 y 11) días de dosificación tres veces por semana, con reversión casi completa de la alodinia táctil después de 9 y 11 días de dosificación tres veces por semana. Además, la reversión media de la alodinia táctil inducida por ligación de nervios espinales el día 14 post-SNL era superior con dosis subcutáneas crecientes de neublastina de 0,1 mg/kg a 0,6 mg/kg a 2 mg/kg. La neublastina (NBN) a 0,03 mg/kg s.c. no revertía significativamente la alodinia táctil inducida por ligación de nervios espinales durante 11 días de dosificación a tres veces por semana.
[0106] Como se representa en la FIG. 8, la reversión por neublastina (NBN) de la hiperalgesia térmica inducida por ligación de nervios espinales (SNL) también era dependiente de la dosis. La dosificación de NBN a 0,1 mg/kg revertía significativamente la hiperalgesia térmica después de 9 (así como 11) días de dosificación tres veces por semana, la NBN a 0,6 mg/kg revertía significativamente la hiperalgesia térmica después de 7 (así como 9 y 11) días de dosificación tres veces por semana, y la NBN a 2 mg/kg revertía significativamente la hiperalgesia térmica después de 4 (así como 7, 9 y 11) días de dosificación tres veces por semana. Además, la reversión media de la hiperalgesia térmica inducida por ligación de nervios espinales el día 14 post-SNL era superior con dosis subcutáneas crecientes de neublastina de 0,1 mg/kg a 0,6 mg/kg a 2 mg/kg. La NBN a 0,03 mg/kg s.c. no revertía significativamente la hiperalgesia térmica inducida por ligación de nervios espinales durante 11 días de dosificación a tres veces por semana.
LISTADO DE SECUENCIAS
[0107]
<110> Biogen, Inc. Sah, Dinah Wen-Yee
<120> Tratamiento usando polipéptidos de neublastina
<130> 00689-507 (A118) utilidad
<140> Presentada con la misma
<141>
<150> USSN 06/287.554
<151>
<160> 27
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 861
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (58)..(717)
<220>
<221> 5'UTR
<222> (1)..(57)
<220>
<221> 3'UTR
<222 > (718)..(861)
<220>
<221> sig_peptide
<222> (58)..(174)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (298)..(717)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (370)..(717)
<220>
<221> mat_peptide
<222 > (379)..(717)
<220>
<221> misc_structure
<222> (661)..(663)
<223> CARBOHID: asparagina glicosilada en Asn122
<220>
<221> misc_structure
<222 > (424)..(621)
<223> DISULFUR: puente disulfuro Gly43-Gly108
<220>
<221> misc_structure
<222> (505)..(705) 5 <223> DISULFUR: puente disulfuro Gly70-Gly136
<220>
<221> misc_structure
<222> (517)..(711)
<223> DISULFUR: puente disulfuro Gly74-Gly138 10 <220>
<221> misc_structure
<222> (616)..(618)
<223> DISULFUR: puente disulfuro intercatenario Gly107-Gly107
<400> 1
<210> 2
<211> 220
<212> PRT
<213> Homo sapiens
5 <400> 2
<210> 3
<211> 2136
<212> ADN
<213> Murinae gen. sp. 10 <220>
<221> CDS
<222> (975)..(1646)
<220>
<221> 5'UTR 15 <222> (1)..(974)
<220>
<221> 3'UTR <222> (1647)..(2136)
<220>
<221> sig_peptide
<222> (975)..(1091) 5 <220>
<221> mat_peptide
<222> (1215)..(1646)
<220>
<221> mat_peptide 10 <222> (1290)..(1646)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (1299)..(1646)
<400> 3
<210> 4
<211> 224
<212> PRT 5 <213> Murinae gen. sp.
<400> 4 <210> 5
<211> 224
<212> PRT
<213> Rattus sp.
<220>
<221> SEÑAL
<222> (1)..(39)
<220>
<221> PROPEP
<222> (40)..(80)
<220>
<221> PÉPTIDO
<222> (81)..(224)
<220>
<221> PÉPTIDO
<222> (109)..(224)
<220>
<221> PÉPTIDO
<222> (112)..(224)
<220>
<221> CARBOHID
<222> (206)
<220>
<221> DISULFUR
<222> (127)..(192)
<220>
<221> DISULFUR
<222> (154)..(220)
<220>
<221> DISULFUR
<222> (158)..(222)
<220>
<221> DISULFUR
<222> (191)
<223> Enlace disulfuro intercatenario
<400> 5 <210> 6
<211>
197 5 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
<210> 7
<211>
156 5 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7 <210> 8
<211> 211
<212> PRT 5 <213> Homo sapiens
<400> 8
<210> 9
<211> 39
<212> ADN
5 <213> Homo sapiens
<400> 9
aaggaaaaaa gcggccgcca tggaacttgg acttggagg
39
<210> 10
<211> 39
10 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 10
ttttttcctt ggcggccgct cagcccaggc agccgcagg
39
<210> 11
15 <211> 140
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CARBOHID
20 <222> (122)
<223> asparagina glicosilada
<400> 11
<210> 12
<211> 116 5 <212> PRT
<213 > Homo sapiens
<220>
<221> CARBOHID
<222> (98) 10 <223> asparagina glicosilada
<400> 12 <210> 13
<211> 113
<212> PRT
<213>
Homo sapiens 5 <220>
<221> CARBOHID
<222> (95)
<223> asparagina glicosilada
<400> 13
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213>
Homo sapiens 15 <400> 14
<210> 15
<211> 111
<212> PRT
<213>
Homo sapiens 5 <400> 15
<210> 16
<211> 110
<212> PRT 10 <213> Homo sapiens
<400> 16
<210> 17
<211> 109 15 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17 <210> 18
<211> 108
<212> PRT 5 <213> Homo sapiens
<400> 18
<210> 19
<211> 107 10 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19 <210> 20
<211> 106
<212> PRT 5 <213> Homo sapiens
<400> 20
<210>21 <211>105 10 <212>PRT
<213>Homo sapiens <400>21
<210> 22
<211> 104
<212> PRT 5 <213> Homo sapiens
<400> 22
<210> 23
<211> 103 10 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
<210> 24 15 <211> 102
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
5 <210> 25
<211> 101
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400>25
<210>26 <211>100
<212>PRT
<213>Homo sapiens 15 <400>26
<210> 27
<211> 99
<212> PRT 5 <213> Homo sapiens
<400> 27

Claims (27)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Uso de un polipéptido de neublastina para la preparación de una composición farmacéutica para tratar, prevenir o retrasar el dolor neuropático, en el que el dolor neuropático es alodinia, dolor hiperalgésico o dolor fantasma.
  2. 2.
    Un polipéptido de neublastina para su uso en el tratamiento, prevención o retraso del dolor neuropático, en el que el dolor neuropático es alodinia, dolor hiperalgésico o dolor fantasma.
  3. 3.
    El uso de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la composición farmacéutica o el polipéptido de neublastina se prepara para su administración por liberación sistémica.
  4. 4.
    El uso de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la composición farmacéutica o el polipéptido de neublastina se prepara para su administración por liberación intravenosa.
  5. 5.
    El uso de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la composición farmacéutica o el polipéptido de neublastina se prepara para su administración por liberación subcutánea.
  6. 6.
    El uso de las reivindicaciones 1 y 2, en el que el dolor neuropático es alodinia.
  7. 7.
    El uso de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la alodinia es alodinia táctil.
  8. 8.
    El uso de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el dolor neuropático es dolor hiperalgésico.
  9. 9.
    El uso de la reivindicación 8, en el que el dolor hiperalgésico es dolor hiperalgésico térmico.
  10. 10.
    El uso de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el dolor neuropático está asociado con neuralgia postherpética, neuropatía diabética o ciática.
  11. 11.
    El uso de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicho dolor neuropático está asociado con la infección por un virus.
  12. 12.
    El uso de la reivindicación 11, en el que dicho virus se selecciona del grupo que consiste en un herpesvirus, un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y un papilomavirus.
  13. 13.
    El uso de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicho dolor neuropático es un dolor neuropático asociado con la administración de un agente terapéutico.
  14. 14.
    El uso de la reivindicación 13, en el que dicho agente terapéutico es un agente anticanceroso.
  15. 15.
    El uso de la reivindicación 14, en el que dicho agente anticanceroso se selecciona del grupo que consiste en taxol, taxótero, cisplatino, nocodazol, vincristina, vindesina y vinblastina.
  16. 16.
    El uso de la reivindicación 13, en el que dicho agente terapéutico es un agente antiviral.
  17. 17.
    El uso de la reivindicación 16, en el que dicho agente antiviral se selecciona del grupo que consiste en ddI, DDC, d4T, foscarnet, dapsona, metronidazol e isoniazid.
  18. 18.
    El uso de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el dolor neuropático está asociado con una neuropatía hereditaria (incluyendo, pero no limitándose a, ataxia de Friedreich , polineuropatía amiloide familiar, enfermedad de Tangier, enfermedad de Fabry), trastornos metabólicos (incluyendo, pero no limitándose a, insuficiencia renal e hipotiroidismo), deficiencias vitamínicas (incluyendo, pero no limitándose a, deficiencia de vitamina B12, deficiencia de vitamina B6 y deficiencia de vitamina E), neuropatías tóxicas y yatrogénicas (incluyendo, pero no limitándose a, alcoholismo, intoxicación por vitamina B6, intoxicación por hexacarbono, amiodarona, cloranfenicol, disulfiram, isoniazida, oro, litio, metronidazol, misonidazol, nitrofurantoína), neuropatías infecciosas (incluyendo, pero no limitándose a, lepra y enfermedad de Lyme), neuropatías autoinmunes (incluyendo, pero no limitándose a, síndrome de Guillain-Barre, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, gammapatía monoclonal de importancia indeterminada y polineuropatía), neuralgia trigeminal, síndromes de atrapamiento (incluyendo, pero no limitándose a, túnel carpiano), neuralgia postraumática, dolor de miembro fantasma, dolor por esclerosis múltiple, síndromes de dolor regional complejos (incluyendo, pero no limitándose a, distrofia simpática refleja y causalgia), neoplasia, neuropatía vasculítica/angiopática, y neuropatía idiopática.
  19. 19.
    El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido de neublastina se modifica con una porción derivada para tener un tiempo de permanencia prolongado o una concentración aumentada en fluidos corporales.
  20. 20.
    El uso de la reivindicación 19, en el que dicha porción derivada se selecciona del grupo que consiste en una porción de polietilenglicol, ésteres alifáticos, amidas, derivados de N-acilo y derivados de O-acilo.
  21. 21.
    El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la secuencia de aminoácidos
    de dicho polipéptido de neublastina comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:
    a.
    al menos un polipéptido que comprende los AA-80-AA140 de la SEC ID Nº: 2, los AA41-AA140 de la SEC ID Nº: 2, los AA1-AA140 de la SEC ID Nº: 2, los AA25-AA140 de la SEC ID Nº: 2, los AA28-AA140 de la SEC ID Nº: 2, los AA-80-AA144 de la SEC ID Nº: 4, los AA1-AA144 de la SEC ID Nº: 4, los AA1-AA224 de la SEC ID Nº: 5 o los AA81-AA224 de la SEC ID Nº: 5;
    b.
    al menos un polipéptido que comprende la secuencia C-terminal expuesta en AA107-AA140 de la SEC ID Nº: 2 o AA76-AA140 de la SEC ID Nº: 2, y que conserva los siete residuos de Cys característicos de la familia de GDNF y de la superfamilia de TGF-;
    c.
    al menos un polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 22, SEC ID Nº: 23, SEC ID Nº: 24, SEC ID Nº: 25, SEC ID Nº: 26 o SEC ID Nº: 27; y
    d.
    al menos una secuencia polipeptídica que tiene una homología de aminoácidos superior al 70%, más preferentemente del 85%, aún más preferentemente del 90%, y aún más preferentemente del 95% con cualquiera de las secuencias de (a)-(c) anteriores.
  22. 22.
    El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido de neublastina comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en al menos un polipéptido que comprende los AA42-AA140 de la SEC ID Nº: 2 o los AA37-AA140 de la SEC ID Nº: 2.
  23. 23.
    El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la composición farmacéutica comprende además un compuesto inductor de analgesia seleccionado del grupo que consiste en opioides, antiarrítmicos, analgésicos tópicos, anestésicos locales, anticonvulsivos, antidepresivos, corticosteroides y AINE.
  24. 24.
    El uso de la reivindicación 23, en el que el compuesto inductor de analgesia es un anticonvulsivoe.
  25. 25.
    El uso de la reivindicación 23, en el que el compuesto inductor de analgesia es gabapentina (ácido 1(aminometil)ciclohexano acético) o pregabalina (ácido S-(+)-4-amino-3-(2-metilpropil)butanoico).
  26. 26.
    El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la dosificación del polipéptido de neublastina está entre 1 Ig/kg y 30.000 Ig/kg de peso corporal del sujeto, por dosis, entre 10 Ig/kg y 10.000 Ig/kg de peso corporal del sujeto, por dosis, o entre 25 Ig/kg y 3.000 Ig/kg de peso corporal del sujeto, por dosis.
  27. 27.
    El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la composición farmacéutica es una composición de liberación prolongada.
    REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN
    Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden 5 excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.
    10 Literatura diferente de patentes citada en la descripción
ES02719102T 2001-03-28 2002-02-28 Uso de polipéptidos de neublastina para el tratamiento del dolor neuropático. Expired - Lifetime ES2374971T3 (es)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US28755401P 2001-03-28 2001-03-28
US82042101A 2001-03-28 2001-03-28
US820421 2001-03-28
US287554P 2001-03-28
PCT/US2002/006388 WO2002078730A2 (en) 2001-03-28 2002-02-28 Use of neublastin polypeptides for treating neuropathic pain

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2374971T3 true ES2374971T3 (es) 2012-02-23

Family

ID=29552973

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES02719102T Expired - Lifetime ES2374971T3 (es) 2001-03-28 2002-02-28 Uso de polipéptidos de neublastina para el tratamiento del dolor neuropático.

Country Status (11)

Country Link
EP (1) EP1395279B1 (es)
JP (3) JP4499362B2 (es)
CN (1) CN1525866B (es)
AR (1) AR033031A1 (es)
AT (1) ATE526982T1 (es)
AU (1) AU2002250203B2 (es)
CA (1) CA2442159C (es)
ES (1) ES2374971T3 (es)
MY (1) MY143470A (es)
NZ (1) NZ529126A (es)
WO (1) WO2002078730A2 (es)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7442370B2 (en) 2001-02-01 2008-10-28 Biogen Idec Ma Inc. Polymer conjugates of mutated neublastin
US7276580B2 (en) 2001-03-12 2007-10-02 Biogen Idec Ma Inc. Neurotrophic factors
NZ581460A (en) * 2003-01-31 2010-02-26 Biogen Idec Inc Polymer conjugates of mutated neublastin
CA2864810A1 (en) 2003-04-18 2004-11-04 Biogen Idec Ma, Inc. Polymer-conjugated glycosylated neublastin
RU2005138368A (ru) 2003-06-10 2006-07-27 ЭнЭсДЖЕНЕ А/С (DK) Улучшенная секреция нейбластина
US7598059B2 (en) 2003-10-02 2009-10-06 Biogen Idec Ma Inc. Neublastin expression constructs
PL1745069T3 (pl) 2004-03-30 2009-10-30 Nsgene As Zastosowanie terapeutyczne czynnika wzrostu NSG33
NZ553420A (en) 2004-08-19 2010-02-26 Biogen Idec Inc Refolding transforming growth factor beta family proteins
BRPI0514534A (pt) * 2004-08-19 2008-06-17 Biogen Idec Inc variantes de neublastina
TWI501774B (zh) * 2006-02-27 2015-10-01 Biogen Idec Inc 神經性病症之治療
JP5583005B2 (ja) 2007-05-01 2014-09-03 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 血管新生を増大させるための組成物および方法
JP6149226B2 (ja) 2010-10-01 2017-06-21 ホーバ セラピューティクス アンパルトセルスカブ アロディニア、痛覚過敏、自発痛及び幻肢痛の処置
CN107596346A (zh) 2011-09-05 2018-01-19 霍巴治疗公司 异常性疼痛、痛觉过敏、自发性疼痛、和幻痛的治疗
US8652527B1 (en) 2013-03-13 2014-02-18 Upsher-Smith Laboratories, Inc Extended-release topiramate capsules
US9101545B2 (en) 2013-03-15 2015-08-11 Upsher-Smith Laboratories, Inc. Extended-release topiramate capsules
WO2015042580A1 (en) * 2013-09-23 2015-03-26 Biogen Idec Ma Inc. Compositions and methods for treatment of neuropathic pain
EP3804747A1 (en) * 2015-01-18 2021-04-14 Gloriana Therapeutics, Inc. Therapeutic protein formulations
SG11202006669RA (en) * 2018-01-15 2020-08-28 Lateral IP Pty Ltd Peptides and uses thereof
KR20240006581A (ko) 2021-05-06 2024-01-15 호바 세라퓨틱스 에이피에스 화학요법-유도된 신경병성 통증의 예방 및 치료
CA3239550A1 (en) 2021-12-10 2023-06-15 Kenneth Petersen Treatment of nociceptive pain
DE102024118582A1 (de) 2024-07-01 2026-01-08 KILLWATT GmbH Verfahren zum Betrieb eines ein- oder mehrspurigen Fahrzeugs, insbesondere Pedelecs, sowie ein- oder mehrspuriges Fahrzeug, insbesondere Pedelec

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5336603A (en) 1987-10-02 1994-08-09 Genentech, Inc. CD4 adheson variants
DE69226871T3 (de) 1991-06-27 2009-09-24 Bristol-Myers Squibb Co. CTL4A-Rezeptor, ihn enthaltenden Fusionsproteine und deren Verwendung
US5750376A (en) 1991-07-08 1998-05-12 Neurospheres Holdings Ltd. In vitro growth and proliferation of genetically modified multipotent neural stem cells and their progeny
MX9205293A (es) 1991-09-20 1993-05-01 Syntex Sinergen Neuroscience J Factores neurotrofico derivado del glial
US5733761A (en) 1991-11-05 1998-03-31 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
CA2092271C (en) 1993-03-09 2009-10-13 Eddie Reed Use of g-csf for treating taxol side-effects
US5541087A (en) 1994-09-14 1996-07-30 Fuji Immunopharmaceuticals Corporation Expression and export technology of proteins as immunofusins
US5739307A (en) 1995-08-28 1998-04-14 Washington University Polynucleotide encoding neurturin neurotrophic factor
KR100195886B1 (ko) 1996-11-01 1999-06-15 김상조 당뇨병 치료용 의약조성물
US20020055467A1 (en) * 1998-07-06 2002-05-09 Johansen Teit E. Novel neurotrophic factors
US6593133B1 (en) * 1998-07-06 2003-07-15 Nsgene A/S Neurotrophic factors
WO2000004050A2 (en) * 1998-07-14 2000-01-27 Janssen Pharmaceutica N.V. Neurotrophic growth factor
US20020002269A1 (en) 1998-09-29 2002-01-03 Jeffrey D. Milbrandt Artemin, a neurotrophic factor
AU2354600A (en) * 1998-12-09 2000-06-26 Amgen, Inc. Grnf4 a neurotrophic factor
BR0116749A (pt) * 2000-12-22 2006-11-28 Genentech Inc usos de artemina ou seu agonista e artigo manufaturado
UA82983C2 (ru) * 2001-02-01 2008-06-10 Байоджен Айдек Ма Інк. Полимерные коньюгаты найбластина и способы их использования

Also Published As

Publication number Publication date
WO2002078730A3 (en) 2003-11-27
CN1525866A (zh) 2004-09-01
NZ529126A (en) 2010-07-30
AR033031A1 (es) 2003-12-03
AU2002250203B2 (en) 2006-08-10
CA2442159C (en) 2011-08-23
EP1395279B1 (en) 2011-10-05
CN1525866B (zh) 2013-05-29
JP2012167119A (ja) 2012-09-06
JP2005508842A (ja) 2005-04-07
JP4499362B2 (ja) 2010-07-07
HK1062805A1 (en) 2004-11-26
EP1395279A2 (en) 2004-03-10
WO2002078730A2 (en) 2002-10-10
JP2009161515A (ja) 2009-07-23
ATE526982T1 (de) 2011-10-15
MY143470A (en) 2011-05-31
CA2442159A1 (en) 2002-10-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2374971T3 (es) Uso de polipéptidos de neublastina para el tratamiento del dolor neuropático.
US20090258831A1 (en) Treatment using neublastin polypeptides
ES2349043T3 (es) Variantes de neublastina.
AU2002250203A1 (en) Use of neublastin polypeptides for treating neuropathic pain
ES2450065T3 (es) Composiciones y métodos para la administración de proteínas de la familia de ligandos del GDNF
JP2011155987A (ja) ニューブラスチン（Ｎｅｕｂｌａｓｔｉｎ）変異体
ES2479942T3 (es) Neublastina glucosilada conjugada con polímero
ME00277B (me) Polimerni konjugati mutiranog neublastina
EP2753347B1 (en) Treatment of allodynia, hyperalgsia, spontaneous pain, and phantom pain
JP2011078434A (ja) 変異ニューブラスチンのポリマー結合体
HK1062805B (en) Use of neublastin polypeptides for treating neuropathic pain
ITMI971247A1 (it) Composizioni farmaceutiche contenenti la proteina stimolante i macrofagi per il trattamento di patologie del sistema nervoso
HK1199395B (en) Treatment of allodynia, hyperalgsia, spontaneous pain, and phantom pain