ES2375351T3

ES2375351T3 - Ácido nucleico y proteína correspondiente denominada 238p1b2 útil en el tratamiento y la detección de cáncer.

Info

Publication number: ES2375351T3
Application number: ES02728645T
Authority: ES
Inventors: Arthur B. Raitano; Pia M. Challita-Eid; Mary Faris; Rene S. Hubert; Robert Kendall Morrison; Wangmao Ge; Aya Jakobovits
Original assignee: Agensys Inc
Current assignee: Agensys Inc
Priority date: 2002-04-01
Filing date: 2002-04-01
Publication date: 2012-02-29
Anticipated expiration: 2022-04-01
Also published as: WO2003085081A3; AU2002258688B2; WO2003085081A2; ATE533507T1; CA2479049A1; EP1553980A4; AU2008246215A1; EP1553980B1; DK1553980T3; PT1553980E; IL164325A0; AU2008246215B2; CY1112424T1; IL210928A; IL210928A0; IL164325A; AU2002258688A1; EP1553980A2

Abstract

Un procedimiento para detectar la presencia de cáncer de próstata en una muestra de ensayo, comprendiendo el procedimiento: poner en contacto la muestra con una sonda que se une específicamente a un polinucleótido de la Figura 2B; y detectar la unión del polinucleótido de la muestra con la misma.

Description

Acido nucleico y proteina correspondiente denominada 238P1B2 util en el tratamiento y la deteccion de cancer

Campo de la invención

La invencion descrita en el presente documento se refiere a un gen y su proteina codificada, denominada 238P1B2, 5 expresada en ciertos canceres, y a procedimientos de diagnostico y terapeuticos y composiciones utiles en el tratamiento de canceres que expresan 238P1B2.

Antecedentes de la invención

El cancer es la segunda causa principal de muerte de seres humanos junto a enfermedad coronaria. A nivel mundial, millones de personas mueren de cancer cada ano. Solamente en los Estados Unidos, como se indica por la

10 Sociedad Americana del Cancer, el cancer provoca la muerte de mas de medio millon de personas anualmente, con mas de 1,2 millones de casos nuevos diagnosticados por ano. Aunque las muertes de enfermedad coronaria han estado reduciendose significativamente, las resultantes de cancer generalmente estan aumentando. Se predice que en la primera parte del proximo siglo el cancer se convertira en la causa principal de muerte.

A nivel mundial, varios canceres destacan como los mas letales. En particular, los carcinomas de pulmon, prostata,

15 mama, colon, pancreas y ovario representan las causas principales de muerte por cancer. Estos y virtualmente todos los demas carcinomas comparten una caracteristica letal comun. Con muy pocas excepciones, la enfermedad metastasica de un carcinoma es letal. Ademas, incluso para los pacientes de cancer que inicialmente sobreviven sus canceres primarios, la experiencia habitual ha mostrado que sus vidas se alteran de forma dramatica. Muchos pacientes de cancer experimentan fuertes ansiedades provocadas por la consciencia del potencial de reaparicion o

20 fracaso del tratamiento. Muchos pacientes de cancer experimentan debilitamientos fisicos despues del tratamiento. Ademas, muchos pacientes de cancer experimentan una recidiva.

A nivel mundial, el cancer de prostata es el cuarto cancer mas prevalente en hombres. En Norte America y el Norte de Europa, es con diferencia el cancer mas habitual en hombres y es la segunda causa de muerte por cancer en hombres. Solamente en los Estados Unidos, mas de 30.000 hombres mueren anualmente de esta enfermedad,

25 superado solamente por el cancer de pulmon. A pesar de la magnitud de estos numeros, aun no existe tratamiento eficaz para cancer de prostata metastasico. La prostatectomia quirurgica, radioterapia, terapia de ablacion hormonal, castracion quirurgica y quimioterapia continuan siendo las principales modalidades de tratamiento. Desafortunadamente, estos tratamientos son ineficaces para muchos y con frecuencia estan asociados con consecuencias no deseables.

30 Con respecto al diagnostico, la falta de un marcador de tumor de prostata que pueda detectar de forma precisa tumores de etapa temprana localizados, sigue siendo una limitacion significativa en el diagnostico y tratamiento de esta enfermedad. Aunque el ensayo de antigeno especifico de prostata en suero (PSA) ha sido una herramienta muy util, sin embargo su especificidad y utilidad general con frecuencia se considera insuficiente en varios aspectos importantes.

35 El progreso en la identificacion de marcadores especificos adicionales para cancer de prostata ha mejorado por la generacion de xenotrasplantes de cancer de prostata que pueden recapitular diferentes etapas de la enfermedad en ratones. Los xenotrasplantes de LAPC (Cancer de Prostata Los Angeles) son xenotrasplantes de cancer de prostata que han sobrevivido el pase en ratones inmunodeficientes graves combinados (SCID) y han mostrado la capacidad de imitar la transicion de dependencia de androgenos a independencia de androgenos (Klein y col., 1997, Nat. Med.

40 3:402). Marcadores de cancer de prostata mas recientemente identificados incluyen PCTA-1 (Su y col., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7252), antigeno de membrana especifica de prostata (PSM) (Pinto y col., Clin Cancer Res 1996 Sep 2 (9): 1445-51), STEAP (Hubert, y col., Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Dec 7; 96(25): 14523-8) y antigeno de celula madre de prostata (PSCA) (Reiter y col., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1735).

Aunque marcadores previamente identificados tales como PSA, PSM, PCTA y PSCA han facilitado los esfuerzos

45 para diagnosticar y tratar cancer de prostata, existe la necesidad de identificacion de marcadores adicionales y dianas terapeuticas para canceres de prostata y relacionados para mejorar adicionalmente el diagnostico y la terapia.

El carcinoma de celulas renales (RCC) supone aproximadamente 3 % de los tumores malignos de adultos. Una vez que los adenomas alcanzan un diametro de 2 a 3 cm, existe potencial tumoral. En el adulto, los dos tumores renales

50 malignos principales son adenocarcinoma de celulas renales y carcinoma de celulas transicionales del ureter o pelvis renal. La incidencia de adenocarcinoma de celulas renales se estima en mas de 29.000 casos en los Estados Unidos y mas de 11.600 pacientes murieron de esta enfermedad en 1998. El carcinoma de celulas transicionales es menos frecuente, con una incidencia de aproximadamente 500 casos por ano en los Estados Unidos.

La cirugia ha sido la terapia principal para adenocarcinoma de celulas renales durante muchas decadas. Hasta hace 55 poco, la enfermedad metastasica ha sido refractaria para cualquier terapia sistemica. Con los desarrollos recientes en las terapias sistemicas, particularmente inmunoterapias, el carcinoma de celulas renales metastasicas puede

enfocarse de forma agresiva en pacientes apropiados con posibilidad de respuestas duraderas. Sin embargo, sigue existiendo una necesidad de terapias eficaces para estos pacientes.

De todos los nuevos casos de cancer en los Estados Unidos, el cancer de vejiga representa aproximadamente 5 % en hombres (quinto neoplasma mas habitual) y 3 % en mujeres (octavo neoplasma mas habitual). La incidencia esta aumentando lentamente, simultaneamente con una poblacion crecientemente mas vieja. En 1998, hubo una estimacion de 54.500 casos, incluyendo 39.500 en hombres y 15.000 en mujeres. La incidencia ajustada por edad en los Estados Unidos es 32 por 100.000 para hombres y 8 por 100.000 en mujeres. La relacion hombre/mujer historica de 3:1 se puede estar reduciendo en relacion con los patrones de tabaquismo en mujeres. Hubo una estimacion de 11.000 muertes de cancer de vejiga en 1998 (7.800 en hombres y 3.900 en mujeres). La incidencia del cancer de vejiga y la mortalidad aumentan fuertemente con la edad y seran un problema creciente a medida que la poblacion se hace mas vieja.

La mayoria de los canceres de vejiga recurren en la vejiga. El cancer de vejiga se trata con una combinacion de reseccion transuretral de la vejiga (TUR) y quimioterapia intravesical o inmunoterapia. La naturaleza multifocal y recurrente de cancer de vejiga apunta a las limitaciones de TUR. La mayoria de los canceres invasivos de musculo no se curan solamente por TUR. La cistectomia radical y la desviacion urinaria es el medio mas eficaz para eliminar el cancer pero conlleva un impacto innegable en la funcion urinaria y sexual. Continua habiendo una necesidad significativa de modalidades de tratamiento que sean beneficiosas para pacientes con cancer de vejiga.

Se estima que se produjeron 130.200 casos de cancer colorrectal en 2000 en los Estados Unidos, incluyendo 93.800 casos de cancer de colon y 36.400 de cancer rectal. Los canceres colorrectales son los terceros canceres mas habituales en hombres y mujeres. Las tasas de incidencia se redujeron significativamente durante 1992-1996 (-2,1 % por ano). La investigacion sugiere que estas reducciones se han debido a exploracion aumentada y retirada de polipos, evitando la progresion de polipos a canceres invasivos. Hubo una estimacion de 56.300 muertes (47.700 de cancer de colon, 8.600 de cancer rectal) en 2000, que suponen aproximadamente 11 % de todas las muertes por cancer en Estados Unidos.

En la actualidad, la cirugia es la forma mas habitual de terapia para cancer colorrectal y, para canceres que no se han propagado, es frecuentemente curativa. La quimioterapia, o quimioterapia mas radiacion, se proporciona antes o despues de cirugia a la mayoria de los pacientes cuyo cancer ha perforado en profundidad la pared del intestino o se ha propagado a los ganglios linfaticos. En ocasiones se necesita una colostomia permanente (creacion de una apertura abdominal para eliminacion de residuos corporales) para cancer de colon e infrecuentemente se requiere para cancer rectal. Continua habiendo una necesidad de modalidades de diagnostico y tratamiento eficaces para cancer colorrectal.

Se estima que se produjeron 164.100 nuevos casos de cancer de pulmon y bronquial en 2000, que suponen el 14 % de todos los diagnosticos de cancer de Estados Unidos. La tasa de incidencia de cancer de pulmon y bronquial esta reduciendose significativamente en hombres, de un maximo de 86,5 por 100.000 en 1984 a 70,0 en 1996. En los anos 90, la tasa de aumento entre mujeres comenzo a ralentizarse. En 1996, la tasa de incidencia en mujeres fue de 42,3 por 100.000.

El cancer de pulmon y bronquial provoco 156.900 muertes estimadas en 2000, lo que suponen el 28 % de todas las muertes por cancer. Durante 1992-1996, la mortalidad de cancer de pulmon se redujo significativamente entre hombres (-1,7 % por ano) mientras que las tasas para mujeres aun aumentaban significativamente (0,9 % por ano). Desde 1987, han muerto mas mujeres cada ano de cancer de pulmon que de cancer de mama, que, durante mas de 40 anos, fue la causa principal de muerte por cancer en mujeres. La reduccion de incidencia de cancer de pulmon y tasas de mortalidad resulto con mayor probabilidad de la reduccion de las tasas de tabaquismo durante los 30 anos anteriores; sin embargo, los patrones de tabaquismo en reduccion entre mujeres estan por detras de los de los hombres. Es preocupante que aunque las reducciones del uso de tabaco en adultos se han ralentizado, el uso de tabaco en jovenes esta aumentando de nuevo.

Las opciones de tratamiento para cancer de pulmon y bronquial se determinan por el tipo y etapa de cancer e incluyen cirugia, radioterapia y quimioterapia. Para muchos canceres localizados, la cirugia es habitualmente el tratamiento de eleccion. Debido a que la enfermedad habitualmente se ha propagado en el momento en que se descubre, con frecuencia se requieren radioterapia y quimioterapia en combinacion con cirugia. La quimioterapia sola o combinada con radiacion es el tratamiento de eleccion para cancer de pulmon de celulas pequenas; en este regimen, un gran porcentaje de pacientes experimentan remision, que en algunos casos es de larga duracion. Existe sin embargo, una necesidad continua de enfoques de tratamiento y diagnostico eficaces para canceres de pulmon y bronquiales.

Se estima que se produciran 182.800 nuevos casos invasivos de cancer de mama entre mujeres en los Estados Unidos durante 2000. Adicionalmente, se esperaba que se diagnosticaran aproximadamente 1.400 nuevos casos de cancer de mama en hombres en 2000. Despues de aumentar aproximadamente 4 % por ano en los anos 80, las tasas de incidencia de cancer de mama en mujeres se han nivelado en los anos 90 a aproximadamente 110,6 casos por 100.000.

Solamente en los Estados Unidos, se estima que se produjeron 41.200 muertes (40.800 mujeres, 400 hombres) en 2000 debido a cancer de mama. El cancer de mama se clasifica en segundo lugar entre las muertes por cancer en mujeres. De acuerdo con los datos mas recientes, las tasas de mortalidad se redujeron significativamente durante 1992-1996 con las reducciones mayores en mujeres jovenes, tanto blancas como negras. Estas reducciones fueron probablemente el resultado de deteccion mas temprana y tratamiento mejorado.

Teniendo en cuenta las circunstancias medicas y las preferencias del paciente, el tratamiento de cancer de mama puede implicar lumpectomia (retirada local del tumor) y retirada de los ganglios linfaticos bajo el brazo; mastectomia (retirada quirurgica de la mama) y retirada de los ganglios linfaticos bajo el brazo; radioterapia; quimioterapia; o terapia hormonal. Con frecuencia, se usan dos o mas procedimientos en combinacion. Numerosos estudios han mostrado que, para enfermedad de etapa temprana, las tasas de supervivencia a largo plazo despues de lumpectomia mas radioterapia son similares a las tasas de supervivencia despues de mastectomia radical modificada. Avances significativos en las tecnicas de reconstruccion proporcionan varias opciones para reconstruccion del pecho despues de mastectomia. Recientemente, dicha reconstruccion se ha realizado a la vez que la mastectomia.

La escision local de carcinoma ductal in situ (DCIS) con cantidades adecuadas de tejido mamario normal circundante pueden evitar la reaparicion local del DCIS. La radiacion en la mama y/o tamoxifeno pueden reducir las probabilidades de que aparezca DCIS en el tejido mamario restante. Esto es importante porque DCIS, si se deja sin tratar, puede desarrollarse a cancer de mama invasivo. Sin embargo, existen efectos secundarios o secuelas graves para estos tratamientos. Existe por lo tanto, la necesidad de tratamientos de cancer de mama eficaces.

Se estima que hubo 23.000 nuevos casos de cancer de ovario en los Estados Unidos en 2000. Supone el 4 % de todos los canceres entre mujeres y se clasifica el segundo entre canceres ginecologicos. Durante 1992-1996, las tasas de incidencia de cancer de ovario se redujeron significativamente. Como consecuencia de cancer de ovario, hubo una estimacion de 14.000 muertes en 2000. El cancer de ovario provoca mas muertes que cualquier otro cancer del sistema reproductor femenino.

La cirugia, la radioterapia y la quimioterapia son opciones de tratamiento para cancer de ovario. La cirugia habitualmente incluye la retirada de uno o ambos ovarios, las trompas de Falopio (salpingo-ooforectomia) y el utero (histerectomia). En algunos tumores muy tempranos, solo se retirara el ovario implicado, especialmente en mujeres jovenes que desean tener hijos. En enfermedad avanzada, se realiza un intento de retirar toda la enfermedad intraabdominal para potenciar el efecto de la quimioterapia. Continua existiendo una necesidad importante de opciones de tratamiento eficaces para cancer de ovario.

Se estima que hubo 28.300 nuevos casos de cancer pancreatico en los Estados Unidos en 2000. Durante los ultimos 20 anos, las tasas de cancer pancreatico se han reducido en hombres. Las tasas entre mujeres han permanecido aproximadamente constantes pero pueden estar empezando a reducirse. El cancer pancreatico provoco una estimacion de 28.200 muertes en 2000 en los Estados Unidos. Durante los ultimos 20 anos, hubo una ligera pero significativa reduccion en las tasas de mortalidad entre hombres (aproximadamente -0,9 % por ano) mientras que las tasas han aumentado ligeramente entre mujeres.

La cirugia, la radioterapia y la quimioterapia son opciones de tratamiento para cancer pancreatico. Estas opciones de tratamiento pueden prolongar la supervivencia y/o aliviar sintomas en muchos pacientes pero no es probable que produzcan una cura para la mayoria. Existe una necesidad significativa de opciones de diagnostico y terapeuticas adicionales para cancer pancreatico.

El documento W001/27158 desvela varios polipeptidos receptores olfatorios humanos y polinucleotidos que los codifican. Los documentos W002/16548 y EP-A-1270724, publicados el 2 de enero de 2003, desvelan proteinas receptoras acopladas a proteina G y polinucleotidos que las codifican. No se establece ninguna relacion entre ninguna de estas proteinas y su expresion en tejido tumoral.

Sumario de la invención

La presente invencion se refiere a un gen, designado 238P1B2, que se ha descubierto ahora que se sobre-expresa en el cancer o canceres enumerados en la Tabla I. El analisis de expresion por transferencia de Northern de la expresion del gen 238P1B2 en tejidos normales muestra un patron de expresion restringido en tejidos adultos. Se proporcionan las secuencias de nucleotidos (Figura 2) y aminoacidos (Figura 2 y Figura 3) de 238P1B2. El perfil relacionado con tejido de 238P1B2 en tejidos adultos normales, en combinacion con la sobre-expresion observada en los tumores enumerados en la Tabla I, muestra que 238P1B2 se sobre-expresa de forma aberrante en al menos algunos canceres y por lo tanto actua como una diana de diagnostico, profilactica, de pronostico y/o terapeutica util para canceres del tejido o tejidos tales como los enumerados en la Tabla I.

De acuerdo con la presente invencion, se proporciona un procedimiento para detectar la presencia de cancer de prostata en una muestra de ensayo, comprendiendo el procedimiento poner en contacto la muestra con una sonda que se une especificamente a un polinucleotido de la Figura 2B (SEC IN N° 8872); y detectar la union del polinucleotido en la muestra a la misma.

Los inventores describen polinucleotidos correspondientes o complementarios a todos o parte de los genes de 238P1B2, ARNm y/o secuencias codificantes, preferentemente en forma de aislada, incluyendo polinucleotidos que codifican proteinas relacionadas con 238P1B2 y fragmentos de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o mas de 25 aminoacidos contiguos; al menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 100 o mas de 100 aminoacidos contiguos de una proteina relacionada con 238P1B2, asi como los peptidos/proteinas en si mismos; ADN, ARN, hibridos de ADN/ARN y moleculas relacionadas, polinucleotidos u oligonucleotidos complementarios o que tienen al menos un 90 % de homologia con los genes 238P1B2 o secuencias de ARNm o partes de las mismas y polinucleotidos u oligonucleotidos que hibridan con los genes de 238P1B2, ARNm o con polinucleotidos que codifican 238P1B2. Los inventores tambien describen medios para aislar ADNc y los genes que codifican 238P1B2. Tambien se describen moleculas de ADN recombinante que contienen polinucleotidos de 238P1B2, celulas transformadas o transducidas con tales moleculas y sistemas de huespedvector para la expresion de productos genicos de 238P1B2. Puede existir una condicion de que la secuencia de acido nucleico completa de la Figura 2 no este codificada y/o la secuencia de aminoacidos completa de la Figura 2 no este preparada. La secuencia de acido nucleico completa de la Figura 2 puede prepararse y/o la secuencia de aminoacidos completa de la Figura 2 puede prepararse, estando cualquiera de las dos en formas de dosis unitaria humana respectivas.

La invencion proporciona procedimientos para detectar la presencia y el estado de polinucleotidos de 238P1B2 en diversas muestras biologicas, asi como procedimientos para identificar celulas que expresan 238P1B2. Una realizacion tipica de la presente invencion proporciona procedimientos para controlar los productos genicos de 238P1B2 en una muestra tisular o hematologica que tiene o se sospecha que tiene alguna forma de desregulacion del crecimiento tal como cancer.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. La secuencia SSH de 238P1B2 de 210 nucleotidos Figura 2. La secuencia de ADNc y aminoacidos de la variante 1A de 238P1B2 se muestra en la Figura 2A. La metionina de partida esta subrayada. El marco de lectura abierto se extiende desde los acidos nucleicos 2133 a 2897 incluyendo el codon de parada. La secuencia de acido nucleico y aminoacidos de 238P1B2 variante 1B se muestra en la Figura 2B, el codon para la metionina de inicio esta subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el acido nucleico 1947 a 2897 incluyendo el codon de parada. La secuencia de acido nucleico y aminoacidos de 238P1B2 variante 2 se muestra en la Figura 2C, el codon para la metionina de inicio esta subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el acido nucleico 2133 a 2897 incluyendo el codon de parada. La secuencia de acido nucleico y aminoacidos de 238P1B2 variante 3 se muestra en la Figura 2D, el codon para la metionina de inicio esta subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el acido nucleico 2133 a 2897 incluyendo el codon de parada. La secuencia de acido nucleico y aminoacidos de 238P1B2 variante 4 se muestra en la Figura 2E, el codon para la metionina de inicio esta subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el acido nucleico 2133 a 2897 incluyendo el codon de parada. La secuencia de acido nucleico y aminoacidos de 238P1B2 variante 5 se muestra en la Figura 2F, el codon para la metionina de inicio esta subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el acido nucleico 2133 a 2897 incluyendo el codon de parada. La secuencia de acido nucleico y aminoacidos de 238P1B2 variante 6 se muestra en la Figura 2G, el codon para la metionina de inicio esta subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el acido nucleico 2133 a 2897 incluyendo el codon de parada. Figura 3. La secuencia de aminoacidos de 238P1B2 variante 1A se muestra en la Figura 3A; tiene 254 aminoacidos. La secuencia de aminoacidos de 238P1B2 variante 1B se muestra en la Figura 3B; tiene 316 aminoacidos. La secuencia de aminoacidos de 238P1B2 variante 2 se muestra en la Figura 3C; tiene 254 aminoacidos. Figura 4. A. Alineamiento de secuencia de acido nucleico de 238P1B2 variante 1 con receptor olfatorio de raton M0R14-1. B. Alineamiento de secuencia de acido nucleico de 238P1B2 variante 1 con el receptor olfatorio de raton M0R14-10. C. Alineamiento de secuencia de aminoacidos de 238P1B2 v.1A con el receptor olfatorio de raton M0R14-1. D. Alineamiento de secuencia de aminoacidos de 238P1B2 v.1A con 0PCRPH0R-1 especifico de prostata. E. Alineamiento de secuencia de aminoacidos de 238P1B2 variante 1 con el receptor olfatorio humano 5112. F. Alineamiento de Clustal de secuencia de aminoacidos de las tres variantes de 238P1B2, que representa que 238P1B2 V1B contiene 62 aa adicionales en su extremo N-terminal en relacion con V1A y que 238P1B2 V2 porta una mutacion puntual I a T en el aa 225 en relacion con VIA. Figura 5. Perfil de hidrofilia de aminoacidos de A) 238P1B2 y B) 238P1B2 variante 1A determinado por analisis de secuencia de algoritmo informatico usando el procedimiento de Hopp y Woods (Hopp T.P., Woods K.R, 1981. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-3828) al que se accede en el sitio web Protscale (www.expasy.ch/cgibin/protscale.pl) a traves del servidor de biologia molecular ExPasy. Figura 6. Perfil hidropatico de aminoacidos de A) 238P1B2 y B) 238P1B2 variante 1A determinado por analisis de secuencia de algoritmo informatico usando el procedimiento de Kyte y Doolittle (Kyte J., Doolittle R.F., 1982. J. Mol. Biol. 157:105-132) al que se accede en el sitio web Protscale (www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) a traves del servidor de biologia molecular ExPasy. Figura 7. Perfil aminoacidico de porcentaje de restos accesibles de A) 238P1B2 y B) 238P1B2 variante 1A determinado por analisis de secuencia de algoritmo informatico usando el procedimiento de Janin (Janin J., 1979 Nature 277:491-492) al que se accede en el sitio web Protscale (www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) a traves del servidor de biologia molecular ExPasy.

Figura 8. Perfil de aminoacidos de flexibilidad media de A) 238P1B2 y B) 238P1B2 variante 1A determinado por analisis de secuencia de algoritmo informatico usando el procedimiento de Bhaskaran y Ponnuswamy (Bhaskaran R., y Ponnuswamy P.K., 1988. Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255) al que se accede en el sitio web Protscale (www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) a traves del servidor de biologia molecular ExPasy. Figura 9. Perfil de aminoacidos de giro beta de A) 238P1B2 y B) 238P1B2 variante 1A determinado por analisis de secuencia de algoritmo informatico usando el procedimiento de Deleage y Roux (Deleage, G., Roux B. 1987 Protein Engineering 1:289-294) al que se accede en el sitio web Protscale (www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) a traves del servidor de biologia molecular ExPasy. Figura 10. Presentacion esquematica de variantes de nucleotidos de 238P1B2. Las variantes 238P1B2 v.2 a 238P1B2 v.6 son variantes con variaciones de nucleotido sencillo. La caja negra muestra la misma secuencia que 238P1B2 v.1. Los numeros corresponden a los de 238P1B2 v.1. Los SNP se indican encima de la caja. Figura 11. Presentacion esquematica de variantes proteicas de 238P1B2. La variante de nucleotidos 238P1B2 v.1 en la Figura 10 codifica variantes de proteina 238P1B2 v.lA y v.1B. La variante de nucleotidos 238P1B2 v.2 en la Figura 10 codifica la variante proteica 238P1B2 v.2. La caja negra muestra la misma secuencia que 238P1B2 v.1 Los numeros en "()" debajo de la caja corresponden a los de 238P1B2 v.1A. Las diferencias de aminoacidos sencillos se indican encima de la caja. Figura 12. A, B. Prediccion de estructura secundaria para 238P1B2 variante 1a y variante 1b. Las estructuras secundarias de las proteinas 238P1B2 variante 1a (A) y de variante 1b (B) se predijeron usando el procedimiento de Red Neural Jerarquica HNN (Guermeur, 1997, en la Direccion Web pbil.ibcp.fr/cgibin/npsa automat.pl?page=npsa nn.html), a la que se accede desde el servidor de biologia molecular ExPasy (en la Direccion Web www.expasy.ch/tools/). Este procedimiento predice la presencia y localizacion de helices alfa, tramos extendidos y bucles aleatorios de la secuencia proteica primaria. El porcentaje de la proteina en una estructura secundaria dada tambien se enumera para cada variante. C, D, E, F. Prediccion transmembrana para 238P1B2 variante 1a y 1b. C, E. Representaciones esquematicas de la probabilidad de existencia de regiones transmembrana y orientacion de 238P1B2 variante 1a (C) y variante 1b (E) basadas en el algoritmo TMpred de Hofmann y Stoffel que usa TMBASE (K. Hofmann, W. Stoffel. TMBASE -A database of membrane spanning protein segments Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374:166, 1993). D, F. Representacion esquematica de la probabilidad de la existencia de regiones transmembrana y la orientacion extracelular e intracelular de 238P1B2 variante 1a (D) y variante 1b (F) basandose en el algoritmo TMHMM de Sonnhammer, von Heijne, y Krogh (Erik L.L. Sonnhammer, Gunnar von Heijne y Anders Krogh: A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences. en Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, p 175-182 Ed J. Glasgow, T. Littlejohn, F. Major, R. Lathrop, D. Sankoff, y C. Sensen Menlo Park, CA: AAAI Press, 1998). Se accede a los algoritmos TMpred y TMHMM desde el servidor de biologia molecular ExPasy (en la Direccion Web www.expasy.ch/tools/). Los resultados de los programas de prediccion de transmembrana presentados representan 238P1B2 variante 1a como mas probablemente con 6 dominios transmembrana y la variante 1 b 7 dominios transmembrana. Figura 13: Topologia probable y estructura de 238P1B2 variantes I y 1B. Figura 14. Expresion de 238P1B2 por RT-PCR. Se preparo ADNc de primera cadena de grupo vital 1 (higado, pulmon y rinon), grupo vital 2 (pancreas, colon y estomago) y grupo de cancer de prostata. Se realizo normalizacion por PCR usando cebadores para actina y GAPDH. Se realizo una PCR semi-cuantitativa, usando cebadores para 238P1B2 a 26 y 30 ciclos de amplificacion. Los resultados muestran expresion fuerte de 238P1B2 en el grupo de cancer de prostata pero no en el grupo vital 1 y grupo vital 2. Figura 15. Expresion de 238P1B2 en tejidos normales. Se exploraron dos transferencias de northern de tejido multiple (Clontech) ambas con 2 μg de ARNm/carril con el fragmento SSH de 238P1B2. Los patrones de tamano en kilobases (kb) se indican en el lateral. Los resultados muestran ausencia de expresion de 238P1B2 en los 16 tejidos normales ensayados. Figura 16. Expresion de 238P1B2 en Tejidos Normales Multiples. Se analizo una transferencia puntual de ARNm que contenia 76 muestras diferentes de tejidos humanos usando una sonda SSH de 238P1B2. La expresion solamente se detecto en placenta. Figura 17. Expresion de 238P1B2 en Muestras de Ensayo de Cancer de Paciente Humano y Tejidos Normales. Se extrajo ARN de un grupo de tres muestras de ensayo de paciente con cancer de prostata, asi como de prostata normal (PN), vejiga normal (VN), rinon normal (RN), colon normal (CN), pulmon normal (PuN), mama normal (MN), y ovario normal (0N). Se exploro transferencia de Northern con 10 μg de ARN total/carril con secuencia SSH de 238P1B2. Los patrones de tamano en kilobases (kb) estan indicados en el lateral. Los resultados muestran expresion de 238P1B2 en el grupo de cancer de prostata y ovario normal. Figura 18. Expresion de 238P1B2 en tejidos de pacientes con cancer de prostata. Se extrajo ARN de prostata normal (N), xenotransplantes de cancer de prostata (LAPC-4AD, LAPC-4AI, LAPC-9AD, LAPC-9A1), lineas celulares de cancer de prostata (LNCaP y PC3) y tumores de pacientes con cancer de prostata (T). Se exploraron transferencias de Northern con 10 μg de ARN total con el fragmento SSH de 238P1B2. Los patrones de tamano en kilobases estan en el lateral. Los resultados muestran expresion fuerte de 238P1B2 en tejidos de tumor de prostata. El panel inferior representa la tincion con bromuro de etidio del gel.

Descripción detallada de la invención

Descripcion de las secciones

I) Definiciones

II) Polinucleótidos de 238P1B2

II.A.) Usos de polinucleótidos de 238P1B2

II.A.1.) Control de anomalías genéticas

II.: A.2.) Antisentido

II.: A.3.) Cebadores y pares de cebadores

II.: A.4.) Aislamiento de moléculas de ácido nucleico que codifican 238P1B2

II.: A.5.) Moléculas de ácido nucleico recombinante y sistemas de huésped-vector

III.) Proteínas relacionadas con 238P1B2

III.A.) Proteínas que portan motivo

III.B.) Expresión de proteínas relacionadas con 238P1B2

III.C.) Modificaciones de proteínas relacionadas con 238P1B2

III.D.) Usos de proteínas relacionadas con 238P1B2

IV.) Procedimientos para la detección de 238P1B2

V.) Procedimientos para controlar el estado de genes relacionados con 238PIB2 y sus productos

VI.) Identificación de moléculas que interaccionan con 238P1B2

VII.) Procedimientos de diagnóstico y pronóstico.

VIII.) KITS

I.) Definiciones:

A no ser que se defina de otro modo, todos los terminos de la tecnica, notaciones y otros terminos cientificos o terminologia usada en el presente documento pretenden tener los significados habitualmente entendidos por los expertos en la materia a la que pertenece la presente invencion. En algunos casos, los terminos con significados habitualmente entendidos se definen en el presente documento para mayor claridad y/o para referencia sencilla y no deberia interpretarse necesariamente que la inclusion de tales definiciones en el presente documento representa una diferencia sustancial frente a lo que se entiende generalmente en la tecnica. Muchas de las tecnicas y procedimientos descritos o referidos en el presente documento se entienden bien y se emplean habitualmente usando metodologia convencional por los expertos en la materia, tal como, por ejemplo, las metodologias de clonacion molecular usadas ampliamente descritas en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a edicion (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N... Segun sea apropiado, los procedimientos que implican el uso de kits y reactivos disponibles en el mercado se llevan a cabo generalmente de acuerdo con los protocolos y/o parametros definidos por el fabricante a no ser que se indique de otro modo.

Las expresiones "cancer de prostata avanzado", "cancer de prostata avanzado localmente", "enfermedad avanzada" y "enfermedad avanzada localmente" significa canceres de prostata que se han extendido a traves de la capsula prostatica y se pretende que incluyan enfermedad de etapa C segun el sistema de la Asociacion Urologica Americana (AUA), enfermedad de etapa C1-C2 segun el sistema Whitmore-Jewett y enfermedad de etapa T3-T4 y N+ segun el sistema TNM (tumor, nodulo, metastasis). En general, no se recomienda cirugia para pacientes con enfermedad localmente avanzada y estos pacientes tienen resultados sustancialmente menos favorables en comparacion con pacientes que tienen cancer de prostata localizado clinicamente (restringido a organo). La enfermedad localmente avanzada se identifica clinicamente por pruebas palpables de induracion mas alla del limite lateral de la prostata o asimetria o induracion por encima de la base de la prostata.

El cancer de prostata localmente avanzado se diagnostica en la actualidad patologicamente despues de prostatectomia radical si el tumor invade o penetra en la capsula prostatica, se extiende al margen quirurgico o invade las vesiculas seminales.

"Alterar el patron de glucosilacion nativo" pretende significar para los fines del presente documento suprimir uno o mas restos de carbohidrato hallados en la secuencia nativa 238P1B2 (retirando el sitio de glucosilacion subyacente

o suprimiendo la glucosilacion por medios quimicos y/o enzimaticos) y/o anadir uno o mas sitios de glucosilacion que no estan presentes en la secuencia nativa de 238P1B2. Ademas, la frase incluye cambios cualitativos en la glucosilacion de las proteinas nativas, que implican un cambio en la naturaleza y proporciones de los diversos restos

de carbohidrato presentes.

El termino "analogo" se refiere a una molecula que es estructuralmente similar o comparte atributos similares o correspondientes con otra molecula (por ejemplo, una proteina relacionada con 238P1B2). Por ejemplo un analogo de una proteina de 238P1B2 puede unirse especificamente con un anticuerpo o linfocito T que se une especificamente a 238P1B2.

El termino "anticuerpo" se usa en el sentido mas amplio. Por lo tanto un "anticuerpo" puede ser de origen natural o artificial tal como anticuerpos monoclonales producidos por tecnologia de hibridoma convencional. Los anticuerpos anti-238P1B2 comprenden anticuerpos monoclonales y policlonales asi como fragmentos que contienen el dominio de union a antigeno y/o una o mas regiones determinantes de complementariedad de estos anticuerpos.

Un "fragmento de anticuerpo" se define como al menos una parte de la region variable de la molecula de inmunoglobulina que se une a su diana, es decir, la region de union al antigeno. Puede abarcar especificamente anticuerpos anti-238P1B2 sencillos y clones de los mismos (incluyendo anticuerpos agonistas, antagonistas y neutralizadores) y composiciones de anticuerpo anti-238P1B2 con especificidad de poliepitopica.

La expresion "secuencias con codones optimizados" se refiere a secuencias de nucleotidos que se han optimizado para una especie huesped particular reemplazando cualquier codon que tenga una frecuencia de uso de menos de aproximadamente 20 %. Las secuencias de nucleotidos que se han optimizado para expresion en una especie de huesped dada por eliminacion de secuencias de poliadenilacion espurias, eliminacion de senales de corte y empalme de exones/intrones, eliminacion de repeticiones de tipo transposon y/u optimizacion de contenido de GC ademas de optimizacion de codones se denominan en el presente documento "secuencias de expresion potenciada".

La expresion "agente citotoxico" se refiere a una sustancia que inhibe o evita la actividad de expresion de celulas, funcion de celulas y/o provoca destruccion de celulas. Se pretende que el termino incluya agentes quimioterapeuticos de isotopos radiactivos y toxinas tales como toxinas de moleculas pequenas o toxinas enzimaticamente activas de origen bacteriano, fungico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas. Los ejemplos de agentes citotoxicos incluyen, pero sin limitacion maitansinoides, itrio, bismuto, ricina, cadena de ricina A, doxorrubicina, daunorrubicina, taxol, bromuro de etidio, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, dihidroxi antracin diona, actinomicina, toxina de la difteria, exotoxina de pseudomonas (PE) A, PE40, abrina, cadena de abrina A, cadena de modeccina A, alfa-sarcina, gelonina, mitogelina, retstrictocina, fenomicina, enomicina, curicina, crotina, caliqueamicina, inhibidor de Saponaria officinalis y glucocorticoides y otros agentes quimioterapeuticos, asi como radioisotopos tales como At211, I131, I125, . 90, Re186 , R188, S153, Bi212, P32 e isotopos radiactivos de Lu. Los anticuerpos tambien pueden conjugarse con una enzima activadora de profarmaco antineoplasico capaz de convertir el profarmaco a su forma activa.

El termino "homologo" se refiere a una molecula que muestra homologia con otra molecula, por ejemplo, que tiene secuencias de restos quimicos que son el mismo o similares en posiciones correspondientes.

El "antigeno de leucocitos humanos" o "HLA" es una proteina del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I o clase II (vease, por ejemplo, Stites, y col, INMUN0L0GiA, 8a ED., Lange Publishing, Los Altos, CA (1994).

Los terminos "hibridar", "hibridando", "hibrida" y similares, usados en el contexto de polinucleotidos, pretenden referirse a condiciones de hibridacion convencionales, preferentemente tales como hibridacion en formamida 50 %/6XSSC/SDS 0,1 %/ADNmc 100 μg/ml, en la que las temperaturas para hibridacion estan por encima de 37 grados C y la temperatura para lavado en 0,1 XSSC/SDS 0,1 % estan por encima de 55 grados C.

Las frases "aislado" o "biologicamente puro" se refieren a material que esta sustancialmente o esencialmente sin componentes que normalmente acompanan al material como se encuentra en su estado nativo. Por lo tanto, los peptidos aislados descritos en el presente documento preferentemente no contienen materiales normalmente asociados con los peptidos en su ambiente in situ. Por ejemplo, se dice que un polinucleotido esta "aislado" cuando esta sustancialmente separado de polinucleotidos contaminantes que corresponden o son complementarios a genes distintos de los genes de 238P1B2 o que codifican polipeptidos distintos del producto genico de 238P1B2 o fragmentos de los mismos. Un experto en la materia puede emplear facilmente procedimientos de aislamiento de acidos nucleicos para obtenerun polinucleotido de 238P1B2 aislado.

Se dice que una proteina esta "aislada" por ejemplo, cuando se emplean procedimientos fisicos, mecanicos o quimicos para retirar las proteinas de 238P1B2 de constituyentes celulares que normalmente estan asociados con la proteina. Un experto en la materia puede emplear facilmente procedimientos de purificacion convencionales para obtener una proteina 238P1B2 aislada. Como alternativa, puede prepararse una proteina aislada por medios quimicos.

El termino "mamifero" se refiere a cualquier organismo clasificado como un mamifero, incluyendo ratones, ratas, conejos, perros, gatos, vacas, caballos y seres humanos. El mamifero puede ser un raton. El mamifero puede ser un ser humano.

Las expresiones "cancer de prostata metastasico" y "enfermedad metastasica" significan canceres de prostata que se han propagado a ganglios linfaticos regionales o a sitios distantes y pretenden incluir enfermedad de etapa D segun el sistema AUA y etapa TxNxM + segun el sistema TNM. Como es el caso con cancer de prostata localmente avanzado, la cirugia generalmente no esta indicada para pacientes con enfermedad metastasica y la terapia hormonal (ablacion de androgenos) es una modalidad de tratamiento preferida. Los pacientes con cancer de prostata metastasico con el tiempo desarrollan un estado refractario para androgenos en un periodo de 12 a 18 meses de inicio del tratamiento. Aproximadamente la mitad de estos pacientes refractarios para androgenos mueren en un periodo de 6 meses despues de desarrollar ese estado. El sitio mas habitual para metastasis de cancer de prostata es el hueso. Las metastasis de hueso de cancer de prostata son con frecuencia osteoblasticas en lugar de osteoliticas (es decir, dan como resultado formacion de hueso neta). Las metastasis de hueso se encuentran mas frecuentemente en la columna, seguido del femur, pelvis, caja toracica, craneo y humero. 0tros sitios habituales para metastasis incluyen ganglios linfaticos, pulmon, higado y cerebro. El cancer de prostata metastasico se diagnostica normalmente por linfadenectomia de pelvis laparoscopica o abierta, exploraciones de radionuclidos del cuerpo completo, radiografia del esqueleto y/o biopsia de lesion de hueso.

La expresion "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo obtenido de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogenea, es decir, los anticuerpos que comprenden la poblacion son identicos excepto por posibles mutaciones de origen natural que estan presentes en cantidades menores.

Un "motivo", como en el motivo biologico de una proteina relacionada con 238P 1B2, se refiere a cualquier patron de aminoacidos que forman parte de la secuencia primaria de una proteina, que se asocia con una funcion particular (por ejemplo, interaccion proteina-proteina, interaccion proteina-ADN, etc.) o modificacion (por ejemplo, que esta fosforilada, glucosilada o amidada), o localizacion (por ejemplo secuencia secretora, secuencia de localizacion nuclear, etc.) o una secuencia que se correlaciona con inmunogenicidad, de forma humoral o celular. Un motivo puede ser contiguo o capaz de alinearse con ciertas posiciones que generalmente se correlacionan con una cierta funcion o propiedad. En el contexto de motivos de HLA, "motivo" se refiere a un patron de restos en un peptido de longitud definida, habitualmente un peptido de aproximadamente 8 a aproximadamente 13 aminoacidos para un motivo de HLA de clase I y de aproximadamente 6 a aproximadamente 25 aminoacidos para un motivo de HLA de clase II, que se reconoce por una molecula de HLA particular. Los motivos peptidicos para union de HLA son normalmente diferentes para cada proteina codificada por cada alelo de HLA humano y difieren en el patron de los restos de anclaje primarios y secundarios.

Un "excipiente farmaceutico" comprende un material tal como un adyuvante, un vehiculo, agentes de ajuste de pH y tamponamiento, agentes de ajuste de tonicidad, agentes humectantes, conservante y similares.

"Farmaceuticamente aceptable" se refiere a una composicion no toxica, inerte y/o que es fisiologicamente compatible con seres humanos u otros mamiferos.

El termino "polinucleotido" significa una forma polimerica de nucleotidos de al menos 10 bases o pares de bases de longitud, ribonucleotidos o desoxinucleotidos o una forma modificada de uno de los tipos de nucleotidos, y pretende incluir formas mono y bicatenarias de ADN y/o ARN. En la tecnica, este termino se usa con frecuencia de forma intercambiable con "oligonucleotido". Un polinucleotido puede comprender una secuencia de nucleotidos desvelada en el presente documento en la que timina (T), como se muestra por ejemplo en la Figura 2, tambien puede ser uracilo (U); esta definicion concierne a las diferencias entre las estructuras quimicas de ADN y ARN, en particular la observacion de que una de las cuatro bases principales de ARN es uracilo (U) en lugar de timina (T).

El termino "polipeptido" significa un polimero de al menos aproximadamente 4, 5, 6, 7 u 8 aminoacidos. A lo largo de la memoria descriptiva, se usan designaciones convencionales de tres letras o una letra para los aminoacidos. En la tecnica, este termino se usa con frecuencia de forma intercambiable con "peptido" o "proteina".

Un "resto de anclaje principal" de HLA es un aminoacido en una posicion especifica a lo largo de una secuencia peptidica que se entiende que proporciona un punto de contacto entre el peptido inmunogenico y la molecula de HLA. De uno a tres, habitualmente dos, restos de anclaje principales dentro de un peptido de longitud definida generalmente definen un "motivo" para un peptido inmunogenico. Se entiende que estos restos se ajustan en contacto cercano con el surco de union a peptido de una molecula de HLA, con sus cadenas laterales internadas en bolsillos especificos del surco de union. Por ejemplo, los restos de anclaje principales para un molecula de HLA de clase I pueden localizarse en la posicion 2 (desde la posicion amino terminal) y en la posicion carboxilo terminal de un epitopo peptidico de 8, 9, 10, 11 o 12 restos descrito en el presente documento. Los restos de anclaje principales de un peptido que se uniran a una molecula de HLA de clase II pueden espaciarse entre si, en lugar de con los extremos de un peptido, cuando el peptido es generalmente de al menos 9 aminoacidos de longitud.

Una molecula de ADN o ARN "recombinante" es una molecula de ADN o ARN que se ha sometido a manipulacion molecular in vitro.

Los ejemplos no limitantes de moleculas pequenas incluyen compuestos que se unen o interaccionan con 238P1B2, ligandos que incluyen hormonas, neuropeptidos, quimiocinas, odorantes, fosfolipidos y equivalentes funcionales de los mismos que se unen y preferentemente inhiben la funcion proteica de 238P1B2. Tales moleculas pequenas no

limitantes preferentemente tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 10 kDa, mas preferentemente por debajo de aproximadamente 9, aproximadamente 8, aproximadamente 7, aproximadamente 6, aproximadamente 5 o aproximadamente 4 kDa. Las moleculas pequenas pueden asociarse fisicamente con, o unirse a, proteinas 238P1B2; no se encuentran en rutas metabolicas de origen natural; y/o son mas solubles en soluciones acuosas que no acuosas.

La "rigurosidad" de las reacciones de hibridacion la puede determinar facilmente un experto en la materia y generalmente es un calculo empirico dependiente de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado y la concentracion salina. En general, sondas mas largas requieren temperaturas mayores para hibridacion apropiada, mientras que sondas mas cortas necesitan temperaturas mas bajas. La hibridacion depende en general de la capacidad de las secuencias de acido nucleico desnaturalizadas para rehibridar cuando estan presentes hebras complementarias en un ambiente por debajo de su temperatura de fusion. Cuanto mayor sea el grado de homologia deseada entre la sonda y la secuencia hibridable, mayor es la temperatura relativa que puede usarse. Como resultado, se entiende que temperaturas relativas mayores tenderian a hacer las condiciones de reaccion mas rigurosas, mientras que las temperaturas mas bajas las harian menos. Para detalles adicionales y explicacion de la rigurosidad de reacciones de hibridacion, vease Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

"Condiciones rigurosas" o "condiciones de alta rigurosidad", como se define en el presente documento, se identifican por, pero sin limitacion, las que: (1) emplean fuerza ionica baja y alta temperatura para lavar, por ejemplo cloruro sodico 0,015 M/citrato sodico 0,0015 M/dodecilsulfato sodico 0,1 % a 50 °C; (2) emplean durante la hibridacion un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, formamida 50 % (v/v) con albumina de suero bovino 0,1 %/Ficoll 0,1 %/polivinilpirrolidona 0,1 %/tampon de fosfato sodico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sodico 750 mM, citrato sodico 75 mM a 42 'C; o (3) emplean formamida 50 %, SSC 5 x (NaCl 0,75 M, citrato sodico 0,075 M), fosfato sodico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sodico 0,1 %, solucion de Denhardt 5 x, ADN de esperma de salmon sonicado (50 μg/ml), SDS 0,1 % y dextran sulfato 10 % a 42 'C, con lavados a 42 'C en SSC 0,2 x (cloruro sodico/citrato sodico) y formamida al 50 % a 55 'C, seguido de un lavado de alta rigurosidad que consiste en SSC 0,1 x que contiene EDTA a 55 'C. Las "condiciones moderadamente rigurosas" se describen por, pero sin limitacion, las de Sambrook y col, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva .ork: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de solucion de lavado y condiciones de hibridacion (por ejemplo, temperatura, fuerza ionica y % de SDS) menos rigurosas que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas es la incubacion durante una nochea37 'Cen una solucionquecomprende: formamida20 %,SSC5x(NaCl150 mM, citrato trisodico 15 mM), fosfato sodico 50 mM (pH 7,6), solucion de Denhardt 5 x, dextran sulfato 10 % y ADN de esperma de salmon roto desnaturalizado 20 mg/ml, seguido de lavado de los filtros en SSC 1 x a aproximadamente 37-50 'C. El experto en la materia reconocera como ajustar la temperatura, fuerza ionica, etc. segun sea necesario para adaptar factores tales como longitud de la sonda y similares.

Un "supermotivo" de HLA es una especificidad de union a peptido compartida por las moleculas de HLA codificadas por dos o mas alelos de HLA.

Como se usa en el presente documento "tratar" o "terapeutico" y terminos relacionados gramaticalmente, se refieren a cualquier mejora de cualquier consecuencia de enfermedad, tal como supervivencia prolongada, menor morbidez y/o una reduccion de los efectos secundarios que son los productos secundarios de una modalidad terapeutica alternativa; no se requiere erradicacion completa de la enfermedad.

Un "animal transgenico" (por ejemplo, un raton o rata) es un animal que tiene celulas que contienen un transgen, introduciendose dicho transgen en el animal o un ancestro del animal en una etapa prenatal, por ejemplo, embrionaria. Un "transgen" es un ADN que esta integrado en el genoma de una celula de la que se desarrolla un animal transgenico.

Como se usa en el presente documento, una "vacuna" de respuesta inmune celular o HLA es una composicion que contiene o codifica uno o mas peptidos descritos en el presente documento. Existen numerosas vacunas tales, tales como un coctel de uno o mas peptidos individuales; uno o mas peptidos descritos en el presente documento comprendidos por un peptido poliepitopico; o acidos nucleicos que codifican tales peptidos o polipeptidos individuales, por ejemplo, un minigen que codifica un peptido poliepitopico. El "uno o mas peptidos" pueden incluir cualquier numero entero de unidad completa de 1 a 150 o mas, por ejemplo, al menos, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 4344, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 o 150 o mas peptidos descritos en el presente documento. Los peptidos o polipeptidos pueden opcionalmente modificarse, tal como por lipidacion, adicion de secuencias de direccion u otras. Los peptidos de HLA de clase I descritos en el presente documento pueden mezclarse con, o ligarse a, peptidos de HLA de clase II, para facilitar la activacion de tanto linfocitos T citotoxicos como linfocitos T auxiliares. Las vacunas de HLA tambien pueden comprender celulas presentadoras de antigenos pulsadas por peptidos, por ejemplo, celulas dendriticas.

El termino "variante" se refiere a una molecula que muestra una variacion de un tipo o norma descrito, tal como una proteina que tiene uno o mas restos aminoacidicos diferentes en la posicion o posiciones correspondientes de una proteina especificamente descrita (por ejemplo, la proteina 238P1B2 mostrada en la Figura 2 o Figura 3). Un

analogo es un ejemplo de una proteina variante. Las isoformas de corte y empalme y polimorfismos de nucleotidos sencillos (SNP) son ejemplos adicionales de variantes.

"Las variantes relacionadas con 238P1B2" incluyen las especificamente identificadas en el presente documento, asi como variantes alelicas, variantes de sustitucion conservativas, analogos y homologos que pueden aislarse/generarse y caracterizarse sin experimentacion indebida siguiendo los procedimientos descritos en el presente documento o facilmente disponibles en la tecnica. Las proteinas de fusion que combinan partes de diferentes proteinas de 238P1B2 o fragmentos de las mismas, asi como proteinas de fusion de una proteina 238P1B2 y un polipeptido heterologo tambien estan incluidas. Tales proteinas de 238P1B2 se denominan de forma colectiva proteinas relacionadas con 238P1B2, las proteinas descritas en el presente documento o 238P1B2. La expresion "proteina relacionada con 238P1B2" se refiere a un fragmento polipeptidico o una secuencia de proteina 238P1B2 de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o mas de 25 aminoacidos; o, al menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 100 o mas de 100 aminoacidos.

II) Polinucleótidos de 238P1B2

Los inventores describen polinucleotidos correspondientes o complementarios a todo o parte de un gen, ARNm y/o secuencia codificante de 238P1B2, preferentemente en forma aislada, incluyendo polinucleotidos que codifican una proteina relacionada con 238P1B2 y fragmentos de la misma, ADN, ARN, hibrido ADN/ARN y moleculas relacionadas, polinucleotidos u oligonucleotidos complementarios a un gen 238P1B2 o secuencia de ARNm o una parte de los mismos y polinucleotidos u oligonucleotidos que hibridan con un gen 238P1B2, ARNm o con un polinucleotido que codifica 238P1B2 (colectivamente, "polinucleotidos de 238P1B2"). En todos los casos cuando se haga referencia en esta seccion, T tambien puede ser U en la Figura 2.

Los polinucleotidos de 238P1B2 incluyen: un polinucleotido de 238P1B2 que tiene la secuencia mostrada en la Figura 2, la secuencia de nucleotidos de 238P1B2 como se muestra en la Figura 2 en la que T es U; al menos 10 nucleotidos contiguos de un polinucleotido que tiene la secuencia como se muestra en la Figura 2; o, al menos 10 nucleotidos contiguos de un polinucleotido que tiene la secuencia como se muestra en la Figura 2 en la que T es U. Por ejemplo, los nucleotidos de 238P1B2 comprenden, sin limitacion:

(I): un polinucleotido que comprende, que consiste esencialmente en, o consiste en una secuencia como se muestra en la Figura 2, en la que T tambien puede ser U;

(II): un polinucleotido que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2A, del numero de resto nucleotidico 2133 hasta el numero de resto nucleotidico 2894, seguido de un codon de parada, en la que T tambien puede ser U;

(III) un polinucleotido que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2B, del numero de resto nucleotidico 1947 hasta el numero de resto nucleotidico 2894, seguido de un codon de parada, en la que T tambien puede ser U;

(IV): un polinucleotido que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2C, del numero de resto nucleotidico 2133 hasta el numero de resto nucleotidico 2894, seguido de un codon de parada, en la que T tambien puede ser U;

(V): un polinucleotido que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2D, del numero de resto nucleotidico 2133 hasta el numero de resto nucleotidico 2894, seguido de un codon de parada, en la que T tambien puede ser U;

(VI): un polinucleotido que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2E, del numero de resto nucleotidico 2133 hasta el numero de resto nucleotidico 2894, seguido de un codon de parada, en la que T tambien puede ser U;

(VII) un polinucleotido que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2F, del numero de resto nucleotidico 2133 hasta el numero de resto nucleotidico 2894, seguido de un codon de parada, en la que T tambien puede ser U;

(VIII) un polinucleotido que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2G, del numero de resto nucleotidico 2133 hasta el numero de resto nucleotidico 2894, seguido de un codon de parada, en la que T tambien puede ser U;

(IX): un polinucleotido que codifica una proteina relacionada con 238P1B2 que es al menos 90 % homologa con una secuencia de aminoacidos completa mostrada en la Figura 2A-G;

(X): un polinucleotido que codifica una proteina relacionada con 238P1B2 que es al menos 90 % identica a una secuencia de aminoacidos completa mostrada en la Figura 2A-G;

(XI): un polinucleotido que codifica al menos un peptido expuesto en las Tablas V-XVIII o Tabla XIX;

(XII) un polinucleotido que codifica una region peptidica de al menos 5 aminoacidos de un peptido de la Figura 3A en cualquier incremento de numero entero hasta 254 que incluye una posicion de aminoacido que tiene un valor mayor de 0,5 en el perfil de Hidrofilia de la Figura 5A o de la Figura 3B en cualquier incremento de numero completo hasta 316 que incluye una posicion de aminoacido que tiene un valor mayor de 0,5 en el perfil de Hidrofilia de la Figura 5B;

(XIII) un polinucleotido que codifica una region peptidica de al menos 5 aminoacidos de un peptido de la Figura 3A en cualquier incremento de numero entero hasta 254 que incluye una posicion de aminoacido que tiene un valor mayor de 0,5 en el perfil hidropatico de la Figura 6A o de la Figura 3B en cualquier incremento de numero entero hasta 316, que incluye una posicion de aminoacido que tiene un valor menor de 0,5 en el perfil hidropatico de la Figura 6B;

(XIV) un polinucleotido que codifica una region peptidica de al menos 5 aminoacidos de un peptido de la Figura 3A en cualquier aumento de numero entero hasta 254 que incluye una posicion de aminoacido que tiene un valor mayor de 0,5 en el perfil de porcentaje de restos accesibles de la Figura 7A o de la Figura 3B en cualquier incremento de numero entero hasta 316, que incluye una posicion de aminoacido que tiene un valor mayor de 0,5 en el perfil de porcentaje de restos accesibles de la Figura 7B;

(XV) un polinucleotido que codifica una region peptidica de al menos 5 aminoacidos de un peptido de la Figura 3A en cualquier incremento de numero entero hasta 254 que incluye una posicion de aminoacido que tiene un valor mayor de 0,5 en el perfil de Flexibilidad Media en la Figura 8A o de la Figura 3B en cualquier incremento de numero entero hasta 316, que incluye una posicion de aminoacido que tiene un valor mayor de 0,5 en el perfil de Flexibilidad Media en la Figura 8B;

(XVI) un polinucleotido que codifica una region peptidica de al menos 5 aminoacidos de un peptido de la Figura 3A en cualquier incremento de numero entero hasta 254 que incluye una posicion de aminoacido que tiene un valor mayor de 0,5 en el perfil de giro Beta de la Figura 9A o de la Figura 3B en cualquier aumento de numero entero hasta 316, que incluye una posicion de aminoacido que tiene un valor mayor de 0,5 en el perfil de giro Beta de la Figura 9B;

(XVII) un polinucleotido que codifica una proteina relacionada con 238P1B2 cuya secuencia esta codificada por los ADNc contenidos en el plasmido depositado en la Coleccion Americana de Cultivos Tipo como N° de Acceso PTA-4124 el 7 de marzo de 2002;

(XVIII) un polinucleotido que es completamente complementario con un polinucleotido de uno cualquiera de (I)(XVII);

(XIX) un polinucleotido que hibrida selectivamente en condiciones rigurosas con un polinucleotido de (I)-(XVIII);

(XX) un peptido que esta codificado por cualquiera de (I)-(XIX); y

(XXI) un polinucleotido de cualquiera de (I)-(XIX) o peptido de (XX) junto con un excipiente farmaceutico y/o en una forma de dosis unitaria humana.

Como se usa en el presente documento, se entiende que un intervalo desvela especificamente todas las posiciones de unidades enteras del mismo. Los polinucleotidos de 238P1B2 tipicos codifican partes especificas de las secuencias de ARNm de 238P1B2 (y las que son complementarias para tales secuencias) tales como las que codifican las proteinas y/o fragmentos de las mismas, por ejemplo:

(a): 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250 o 254 aminoacidos contiguos de 238P1B2;

(b): 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250 o 254 aminoacidos contiguos de la variante 1A;

(c): 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315 o 316 aminoacidos contiguos de la variante 1B; o

(d): 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190,195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250 o 254 aminoacidos contiguos de la variante 2.

Por ejemplo, se describen en el presente documento polinucleotidos y sus peptidos codificados, los polinucleotidos representativos pueden codificar de aproximadamente aminoacido 1 a aproximadamente aminoacido 10 de la proteina 238P1B2 o variantes mostradas en la Figura 2 o Figura 3, polinucleotidos que codifican de aproximadamente aminoacido 10 a aproximadamente aminoacido 20 de la proteina 238P1B2 o variantes mostradas

en la Figura 2 o Figura 3, polinucleotidos que codifican de aproximadamente aminoacido 20 a aproximadamente aminoacido 30 de la proteina 238P1B2 o variantes mostradas en la Figura 2 o Figura 3, polinucleotidos que codifican de aproximadamente aminoacido 30 a aproximadamente aminoacido 40 de la proteina 238P1B2 o variantes mostradas en la Figura 2 o Figura 3, polinucleotidos que codifican de aproximadamente aminoacido 40 a aproximadamente aminoacido 50 de la proteina 238P1B2 o variantes mostradas en la Figura 2 o Figura 3, polinucleotidos que codifican de aproximadamente aminoacido 50 a aproximadamente aminoacido 60 de la proteina 238P1B2 o variantes mostradas en la Figura 2 o Figura 3, polinucleotidos que codifican de aproximadamente aminoacido 60 a aproximadamente aminoacido 70 de la proteina 238P1B2 o variantes mostradas en la Figura 2 o Figura 3, polinucleotidos que codifican de aproximadamente aminoacido 70 a aproximadamente aminoacido 80 de la proteina 238P1B2 o variantes mostradas en la Figura 2 o Figura 3, polinucleotidos que codifican de aproximadamente aminoacido 80 a aproximadamente aminoacido 90 de la proteina 238P1B2 o variantes mostradas en la Figura 2 o Figura 3, polinucleotidos que codifican de aproximadamente aminoacido 90 a aproximadamente aminoacido 100 de la proteina 238P1B2 o variantes mostradas en la Figura 2 o Figura 3 o regiones codificantes de aproximadamente aminoacido 100 a aminoacidos posteriores en la secuencia, en aumentos de aproximadamente 10 aminoacidos, terminando en el aminoacido carboxilo terminal expuesto en la Figura 2 o Figura 3. En consecuencia los polinucleotidos que codifican partes de la secuencia de aminoacidos (de aproximadamente 10 aminoacidos), de los aminoacidos 100 hasta el aminoacido carboxilo terminal de la proteina 238P1B2 se describen en el presente documento en el que se entiende que cada posicion de aminoacido particular desvela esa posicion mas o menos cinco restos aminoacidicos.

Tambien se describen en el presente documento polinucleotidos que codifican partes relativamente largas de una proteina 238P1B2. Por ejemplo, pueden generarse polinucleotidos que codifican de aproximadamente aminoacido 1 (o 20, 30 o 40 etc.) a aproximadamente aminoacido 20 (o 30, 40 o 50 etc.) de la proteina 238P1B2 o variantes mostradas en la Figura 2 o Figura 3 por diversas tecnicas bien conocidas en la materia. Estos fragmentos polinucleotidicos pueden incluir cualquier parte de la secuencia de 238P1B2 o variantes como se muestra en la Figura 2.

Los polinucleotidos ilustrativos adicionales incluyen fragmentos polinucleotidicos de 238P1B2 que codifican uno o mas de los motivos biologicos contenidos dentro de una secuencia de proteina 238P1B2 o secuencia variante.

Los inventores describen epitopos de anticuerpo que comprenden una region peptidica o un oligonucleotido que codifica la region peptidica, que tienen dos, tres, cuatro o cinco de las siguientes caracteristicas:

i) una region peptidica de al menos 5 aminoacidos de un peptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de numero entero hasta la longitud completa de esa proteina en la Figura 3, que incluye una posicion de aminoacido que tiene un valor igual a o mayor de 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o que tiene un valor igual a 1,0, en el perfil de Hidrofilia de la Figura 5; ii) una region peptidica de al menos 5 aminoacidos de un peptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de numero entero hasta la longitud completa de esa proteina en la Figura 3, que incluye una posicion de aminoacido que tiene un valor igual o menor de 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1 o que tiene un valor igual a 0,0 en el perfil hidropatico de la Figura 6; iii) una region peptidica de al menos 5 aminoacidos de un peptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de numero entero hasta la longitud completa de esa proteina en la Figura 3, que incluye una posicion de aminoacido que tiene un valor igual o mayor de 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o que tiene un valor igual a 1,0, en el perfil de Porcentaje de Restos Accesibles de la Figura 7; iv) una region peptidica de al menos 5 aminoacidos de un peptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de numero entero hasta la longitud completa de esa proteina en la Figura 3, que incluye una posicion de aminoacido que tiene un valor igual o mayor de 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o que tiene un valor igual a 1,0, en el perfil de Flexibilidad Media de la Figura 8; o v) una region peptidica de al menos 5 aminoacidos de un peptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de numero entero hasta la longitud completa de esa proteina en la Figura 3, que incluye una posicion de aminoacido que tiene un valor igual o menor de 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o que tiene un valor igual a 1,0, en el perfil de giro Beta de la Figura 9.

Los fragmentos polinucleotidicos tipicos codifican una o mas regiones de la proteina 238P1B2 o variante que muestra homologia con una molecula conocida. Los fragmentos polinucleotidicos tipicos pueden codificar uno o mas de los sitios de N-glucosilacion de la proteina 238P1B2 o variante, sitios de fosforilacion de proteina quinasa dependiente de AMPc y GMPc, sitios de fosforilacion de caseina quinasa II o sitio de N-miristilacion y sitios de amidacion.

II.A.) Usos de polinucleótidos de 238P1B2

II.A.1.) Control de anomalías genéticas

Los polinucleotidos de los parrafos precedentes tienen varios usos especificos diferentes. El gen de 238P1B2 humano se mapea en la localizacion cromosomica expuesta en el Ejemplo 3. Por ejemplo, debido a que el gen 238P1B2 se mapea en este cromosoma, los polinucleotidos que codifican regiones diferentes de las proteinas

238P1B2 se usan para caracterizar anomalias citogeneticas de esta localizacion cromosomica, tales como anomalias que se identifican como asociadas con diversos canceres. En ciertos genes, se han identificado diversas anomalias cromosomicas incluyendo reordenamientos como anomalias citogeneticas frecuentes en varios canceres diferentes (vease por ejemplo Krajinovic y col, Mutat. Res 382(3-4): 81-83 (1998); Johansson y col., Blood 86(10): 3905-3914 (1995) y Finger y col, P.N.A.S.: 85(23) 9158-9162 (1988)). Por lo tanto, los polinucleotidos que codifican regiones especificas de las proteinas 238P1B2 proporcionan nuevas herramientas que pueden usarse para delinear, con mayor precision de lo que era posible previamente, anomalias citogeneticas en la region cromosomica que codifica 238P1B2 que pueden contribuir al fenotipo maligno. En este contexto, estos polinucleotidos satisfacen una necesidad en la tecnica de expandir la sensibilidad de exploracion cromosomica para identificar anomalias cromosomicas mas sutiles y menos habituales (vease por ejemplo, Evans y col, Am J. 0bstet. Gynecol 171(4): 10551057 (1994)).

Ademas, como se demostro que 238P1B2 tenia alta expresion en vejiga y otros canceres, se usaron polinucleotidos de 238P1B2 en procedimientos que evaluan el estado de los productos genicos de 238P1B2 en tejidos normales frente a cancerosos. Normalmente, los polinucleotidos que codifican regiones especificas de las proteinas 238P1B2 se usan para evaluar la presencia de perturbaciones (tales como deleciones, inserciones, mutaciones puntuales o alteraciones que dan como resultado una perdida de un antigeno, etc.) en regiones especificas del gen de 238P1B2, tales como regiones que contienen uno o mas motivos. Los ensayos ejemplares incluyen tanto ensayos de RT-PCR como analisis de polimorfismo de conformacion monocatenaria (SSCP) (vease, por ejemplo, Marrogi y col., J. Cutan. Pathol. 26(8): 369-378 (1999)), ambos de los cuales usan polinucleotidos que codifican regiones especificas de una proteina para examinar esas regiones dentro de la proteina.

II.A.2.) Antisentido

Los inventores describen ADN genomicos, ADNc, ribozimas y moleculas antisentido, asi como moleculas de acido nucleico basadas en una cadena principal alternativa, o que incluyen bases alternativas, derivadas de fuentes naturales o sintetizadas, e incluyen moleculas capaces de inhibir el ARN o la expresion proteica de 238P1B2. Por ejemplo, las moleculas antisentido pueden ser ARN u otras moleculas, incluyendo acidos peptido nucleicos (PNA) o moleculas no de acido nucleico tales como derivados de fosforotioato, que se unen especificamente a ADN o ARN de una manera dependiente de pares de bases. Un experto en la materia puede obtener facilmente estas clases de moleculas de acido nucleico usando los polinucleotidos de 238P1B2 y las secuencias polinucleotidicas desveladas en el presente documento.

La tecnologia antisentido implica la administracion de oligonucleotidos exogenos que se unen a un polinucleotido diana localizado dentro de las celulas. El termino "antisentido" se refiere al hecho de que tales oligonucleotidos son complementarios para sus dianas intracelulares, por ejemplo, 238P1B2. Vease, por ejemplo, Jack Cohen, 0ligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, 1989; y Synthesis 1:1-5 (1988). Los oligonucleotidos antisentido de 238P1B2 descritos en el presente documento incluyen derivados tales como Soligonucleotidos (derivados de fosforotioato o S-oligos, vease, Jack Cohen, mencionado anteriormente), que muestran accion inhibidora de crecimiento celular canceroso potenciada. Los S-oligos (nucleosido fosforotioatos) son analogos isoelectronicos de un oligonucleotido (0-oligo) en el que un atomo de oxigeno no de union del grupo de fosfato se reemplaza por un atomo de azufre. Los S-oligos descritos en el presente documento pueden prepararse por tratamiento de los 0-oligos correspondientes con 3H-1,2-benzoditiol-3-ona-1,1-dioxido, que es un reactivo de transferencia de azufre. Vease, por ejemplo, Iyer, R. P. y col, J. 0rg. Chem. 55:4693-4698 (1990); e Iyer,

R. P. y col, J. Am. Chem Soc. 112:1253-1254 (1990). Los oligonucleotidos antisentido de 238P1B2 adicionales incluyen oligonucleotidos antisentido morfolinos conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Partridge y col, 1996, Antisense & Nucleic Acid Drug Development 6:169-175).

Los oligonucleotidos antisentido de 238P1B2 descritos en el presente documento normalmente pueden ser ARN o ADN que es complementario e hibrida de forma estable con los primeros 100 codones 5' o los ultimos 100 codones 3' de una secuencia genomica de 238P1B2 o el ARNm correspondiente. No se requiere complementariedad absoluta, aunque se prefieren altos grados de complementariedad. El uso de un oligonucleotido complementario a esta region permite la hibridacion selectiva con ARNm de 238P1B2 y no con ARNm que especifica otras subunidades reguladoras de proteina quinasa. Los oligonucleotidos antisentido de 238P1B2 pueden ser fragmentos de 15 a 30 mer de la molecula de ADN antisentido que tienen una secuencia que hibrida con ARNm de 238P1B2. 0pcionalmente, el oligonucleotido antisentido de 238P1B2 es un oligonucleotido de 30-mer que es complementario a una region en los primeros 10 codones 5' o los ultimos 10 codones 3' de 238P1B2. Como alternativa, las moleculas antisentido se modifican para emplear ribozimas en la inhibicion de la expresion de 238P1B2, vease, por ejemplo, L.

A. Couture & D. T. Stinchcomb; Trends Genet 12:510-515 (1996).

II.A.3.) Cebadores y pares de cebadores

Los inventores describen cebadores y pares de cebadores, que permiten la amplificacion especifica de polinucleotidos descritos en el presente documento o de cualquier parte especifica de los mismos y sondas que hibridan selectiva o especificamente con moleculas de acido nucleico descritas en el presente documento o con cualquier parte de las mismas. Las sondas pueden marcarse con un marcador detectable, tal como, por ejemplo, un radioisotopo, compuesto fluorescente, compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, quelante

metalico o enzima. Tales sondas y cebadores se usan para detectar la presencia de un polinucleotido de 238P1B2 en una muestra y como un medio para detectar una celula que exprese una proteina 238P1B2.

Ejemplos de tales sondas incluyen polipeptidos que comprenden toda o parte de la secuencia de ADNc de 238P1B2 humana mostrada en la Figura 2. Ejemplos de pares de cebadores capaces de amplificar especificamente ARNm de 238P1B2 tambien se describen en los ejemplos. Como se entendera por el experto en la materia, puede prepararse una gran cantidad de cebadores y sondas diferentes basandose en las secuencias proporcionadas en el presente documento y usarse eficazmente para amplificar y/o detectar un ARNm de 238P1B2.

Los polinucleotidos de 238P1B2 descritos en el presente documento son utiles para diversos fines, incluyendo pero sin limitacion su uso como sondas y cebadores para la amplificacion y/o deteccion del gen o genes de 238P1B2, ARNm o fragmentos de los mismos; como reactivos para el diagnostico y/o pronostico de cancer de prostata y otros canceres; como secuencias codificantes capaces de dirigir la expresion de polipeptidos de 238P1B2; como herramientas para modular o inhibir la expresion del gen o genes de 238P1B2 y/o traduccion del transcrito o transcritos de 238P1B2; y como agentes terapeuticos.

Cualquier sonda como se describe en el presente documento puede usarse para identificar y aislar una 238P1B2 o una secuencia de acido nucleico relacionada con 238P1B2 de una fuente de origen natural, tal como seres humanos u otros mamiferos, asi como la secuencia de acido nucleico aislada por si misma, que comprenderia todas o la mayoria de las secuencias halladas en la sonda usada.

A. II.4) Aislamiento de moléculas de ácido nucleico que codifican 238P1B2

Las secuencias de ADNc de 238P1B2 descritas en el presente documento permiten el aislamiento de otros polinucleotidos que codifican producto o productos genicos de 238P1B2, asi como el aislamiento de polinucleotidos que codifican homologos de producto genico de 238P1B2, isoformas de corte y empalme alternativo, variantes alelicas y formas mutantes de un producto genico de 238P1B2 asi como polinucleotidos que codifican analogos de proteinas relacionadas con 238P1B2. Se conocen bien diversos procedimientos de clonacion molecular que pueden emplearse para aislar ADNc de longitud completa que codifican un gen de 238P1B2 (vease, por ejemplo, Sambrook,

J. y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edicion, Cold Spring Harbor Press, Nueva .ork, 1989; Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel y col., Eds., Wiley y Sons, 1995). Por ejemplo, pueden emplearse convenientemente metodologias de clonacion de fago lambda, usando sistemas de clonacion disponibles en el mercado (por ejemplo, Lambda �AP Express, Stratagene). Los clones de fago que contienen ADNc del gen de 238P1B2 pueden identificarse explorando con un ADNc de 238P1B2 marcado o un fragmento del mismo. Por ejemplo, puede sintetizarse un ADNc de 238P1B2 (por ejemplo, Figura 2) o una parte del mismo y usarse como una sonda para recuperar ADNc solapantes y de longitud completa correspondientes a un gen de 238P1B2. Un gen de 238P1B2 en si mismo puede aislarse por exploracion de genotecas de ADN genomico, bibliotecas de cromosomas artificiales de bacteria (BAC), bibliotecas de cromosomas artificiales de levadura (.AC), y similares, con sondas o cebadores de ADN de 238P1B2.

II.A.5.) Moléculas de ácido nucleico recombinante y sistemas de huésped-vector

Las moleculas de ADN o ARN recombinantes pueden contener polinucleotido de 238P1B2, un fragmento, analogo u homologo del mismo, incluyendo pero sin limitacion fagos, plasmidos, fagemidos, cosmidos, .AC, BAC, asi como diversos vectores viricos y no viricos bien conocidos en la tecnica, y celulas transformadas o transfectadas con tales moleculas de ADN o ARN recombinantes. Se conocen bien procedimientos para generar tales moleculas (vease, por ejemplo, Sambrook y col, 1989, mencionado anteriormente).

Un sistema de huesped-vector puede comprender una molecula de ADN recombinante que contiene un polinucleotido de 238P1B2, fragmento, analogo u homologo del mismo dentro de una celula huesped procariota o eucariota adecuada. Los ejemplos de celulas huesped eucariotas adecuadas incluyen una celula de levadura, una celula vegetal o una celula animal, tales como una celula de mamifero o una celula de insecto (por ejemplo, una celula infectable por baculovirus tal como una celula Sf9 o HighFive). Los ejemplos de celulas de mamifero adecuadas incluyen diversas lineas celulares de cancer de prostata tales como DU145 y TsuPr1, otras lineas celulares de cancer de prostata transfectables o transducibles, celulas primarias (PrEC), asi como varias celulas de mamifero usadas habitualmente para la expresion de proteinas recombinantes (por ejemplo, celulas C0S, CH0, 293, 293T). Mas particularmente, un polinucleotido que comprende la secuencia codificante de 238P1B2 o un fragmento, analogo u homologo de la misma puede usarse para generar proteinas 238P1B2 o fragmentos de las mismas usando cualquier variedad de sistemas de huesped- vector usadas habitualmente y conocidos ampliamente en la tecnica.

Esta disponible una amplia serie de sistemas de huesped-vector adecuados para la expresion de proteinas 238P1B2

o fragmentos de las mismas, vease, por ejemplo, Sambrook y col., 1989, mencionado anteriormente; Current Protocolos in Molecular Biology, de 1995, mencionado anteriormente). Los vectores preferidos para expresion de mamiferos incluyen pero sin limitacion pcDNA 3.1 marcador de His-myc (Invitrogen) y el vector retroviral pSRatkneo (Muller y col, 1991, MCB 11:1785). Usando estos vectores de expresion, 238P1B2 puede expresarse en varias lineas celulares de cancer de prostata y no de prostata, incluyendo por ejemplo, 293, 293T, rat-1, NIH 3T3 y TsuPrl.

Estos sistemas de huesped-vector son utiles para la produccion de una proteina de 238P1B2 o fragmento de la misma. Tales sistemas de huesped-vector pueden emplearse para estudiar las propiedades funcionales de 238P1B2 y mutaciones o analogos de 238P1B2.

Proteina 238P1B2 humana recombinante o un analogo u homologo o fragmento de la misma pueden producirla celulas de mamifero transfectadas con una construccion que codifica un nucleotido relacionado con 238P1B2. Por ejemplo, las celulas 293T pueden transfectarse con un plasmido de expresion que codifica 238P1B2 o fragmento, analogo u homologo de la misma, una proteina relacionada con 238P1B2 se expresa en las celulas 293T y la proteina 238P1B2 recombinante se aisla usando procedimientos de purificacion convencionales (por ejemplo, purificacion de afinidad usando anticuerpos anti-238P1B2). Puede subclonarse una secuencia codificante de 238P1B2 en el vector retroviral pSRaMSVtkneo y usarse para infectar diversas lineas celulares de mamifero, tales como NIH 3T3, TsuPr1, 293 y rat-1 para establecer lineas celulares que expresen 238P1B2. Tambien pueden emplearse diversos otros sistemas de expresion bien conocidos en la tecnica. Pueden usarse construcciones de expresion que codifican un peptido lider unido en fase con una secuencia codificante de 238P1B2 para la generacion de una forma secretada de proteina 238P1B2 recombinante.

Como se analiza en el presente documento, la redundancia en el codigo genetico permite variacion en las secuencias genicas de 238P1B2. En particular, se sabe en la tecnica que especies de huesped especificas con frecuencia tienen preferencias codonicas especificas y por lo tanto se puede adaptar la secuencia desvelada segun se prefiera para un huesped deseado. Por ejemplo, las secuencias codonicas analogas preferidas normalmente tienen codones poco habituales (es decir, codones que tienen una frecuencia de uso de menos de aproximadamente 20 % en secuencias conocidas del huesped deseado) reemplazados con codones de mayor frecuencia. Las preferencias codonicas para una especie especifica se calculan, por ejemplo, usando tablas de uso de codones disponibles en INTERNET tales como en la direccion www.dna.affrc.gojp/-nakamura/codon.html.

Se sabe que modificaciones de secuencia adicionales potencian la expresion proteica en un huesped celular. Estas incluyen eliminacion de secuencias que codifican senales de poliadenilacion espurias, senales de sitio de corte y empalme de exones/intrones, repeticiones de tipo transposon y/u otras secuencias bien caracterizadas tales que son deletereas para la expresion genica. El contenido de GC de la secuencia se ajusta a niveles medios para un huesped celular dado, segun se calcula por referencia a genes conocidos expresados en la celula huesped. Cuando sea posible, la secuencia se modifica para evitar estructuras de ARNm secundarias en horquilla predichas. 0tras modificaciones utiles incluyen la adicion de una secuencia consenso de inicio de la traduccion al comienzo del marco de lectura abierto, como se describe en Kozak, Mol Cell Biol., 9:5073-5080 (1989). Los expertos en la materia entienden que la regla general de que los ribosomas eucariotas inician la traduccion exclusivamente en el codon AUG 5' proximal se anula solamente en condiciones poco habituales (vease, por ejemplo, Kozak PNAS: 92(7) 26622666, (1995) y Kozak NAR 15(20): 8125-8148 (1987)).

III.) Proteínas relacionadas con 238PIB2

Los inventores describen proteinas relacionadas con 238P1B2. Las proteinas 238P1B2 especificas comprenden un polipeptido que tiene toda o parte de la secuencia de aminoacidos de 238P1B2 humana como se muestra en la Figura 2 o Figura 3. Como alternativa, las proteinas 238P1B2 comprenden polipeptidos variantes, homologos o analogos que tienen alteraciones en la secuencia de aminoacidos de 238P1B2 mostrada en la Figura 2 o Figura 3.

En general, las variantes alelicas de origen natural de 238P1B2 humana comparten un alto grado de identidad estructural y homologia (por ejemplo, 90 % o mas homologia). Normalmente, las variantes alelicas de una proteina 238P1B2 contienen sustituciones de aminoacidos conservativas dentro de las secuencias de 238P1B2 descritas en el presente documento o contienen una sustitucion de un aminoacido de una posicion correspondiente en un homologo de 238P1B2. Una clase de variantes alelicas de 238P1B2 son proteinas que comparten un alto grado de homologia con al menos una region pequena de una secuencia de aminoacidos de 238P1B2 particular, pero contienen adicionalmente una diferencia radical de la secuencia, tal como una sustitucion no conservativa, truncacion, insercion o desplazamiento de fase. En comparaciones de secuencias proteicas, los terminos, similitud, identidad y homologia tienen cada uno un significado distinto como se aprecia en el campo de la genetica. Ademas, la ortologia y paralogia pueden ser conceptos importantes que describen la relacion de miembros de una familia proteica dada en un organismo con los miembros de la misma familia en otros organismos.

Se proporcionan abreviaturas de aminoacidos en la Tabla II. Pueden realizarse frecuentemente sustituciones de aminoacidos conservativas en una proteina sin alterar la conformacion o la funcion de la proteina. Las proteinas descritas en el presente documento pueden comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 sustituciones conservativas. Tales cambios incluyen sustituir con cualquiera de isoleucina (I), valina (V) y leucina (L) cualquier otro de estos aminoacidos hidrofobos; acido aspartico (D) a acido glutamico (E) y viceversa; glutamina (�) a asparagina

(N) y viceversa; y serina (S), a treonina (T) y viceversa. 0tras sustituciones tambien pueden considerarse conservativas, dependiendo del ambiente del aminoacido particular y su papel en la estructura tridimensional de la proteina. Por ejemplo, glicina (G) y alanina (A) pueden ser con frecuencia intercambiables, al igual que alanina (A) y valina (V). La metionina (M), que es relativamente hidrofoba, puede con frecuencia intercambiarse con leucina e isoleucina y en ocasiones con valina. Lisina (K) y arginina (R) son con frecuencia intercambiables en localizaciones en las que la caracteristica significativa del resto aminoacidico es su carga y las pK diferentes de estos dos restos

aminoacidicos no son significativas. 0tros cambios mas pueden considerarse "conservativos" en ambientes particulares (vease, por ejemplo, Tabla III en el presente documento; paginas 13-15 "Biochemistry" 2a ED. Lubert Stryer ed (Stanford University); Henikoffet y col, PNAS 1992 Vol 89 10915-10919; Lei y col, J Biol Chem 19 mayo 1995; 270 (20): 11882-6).

Los inventores describen una amplia diversidad de variantes o analogos aceptados en la tecnica de proteinas 238P1B2 tales como polipeptidos que tienen inserciones, deleciones y sustituciones de aminoacidos. Pueden realizarse variantes de 238P1B2 usando procedimientos conocidos en la tecnica tales como mutagenesis dirigida, exploracion de alanina y mutagenesis por PCR. Puede realizarse mutagenesis dirigida (Carter y col, Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); �oller y col., Nucl. Acids Res, 10:6487 (1987)), mutagenesis de casete (Wells y col, Gene,

34:315 (1985)), mutagenesis de seleccion de restriccion (Wells y col., Philos. Trans. R. Soc London SerA, 317:415 (1986)) u otras tecnicas conocidas en el ADN clonado para producir el ADN variante de 238P1B2.

Tambien puede emplearse analisis de exploracion de aminoacidos para identificar uno o mas aminoacidos junto con una secuencia contigua que esta implicada en una actividad biologica especifica tal como una interaccion proteinaproteina. Entre los aminoacidos de exploracion preferidos hay aminoacidos neutros relativamente pequenos. Tales aminoacidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteina. La alanina es normalmente un aminoacido de exploracion preferido entre este grupo porque elimina la cadena lateral detras del carbono beta y es menos probable que altere la conformacion de la cadena principal de la variante. La alanina tambien se prefiere normalmente porque es el aminoacido mas habitual. Ademas, se encuentra con frecuencia en posiciones tanto expuestas como internadas (Creighton, The Proteins, (W. H. Freeman & Co., N...); Chothia, J. Mol Biol., 150:1 (1976)). Si la sustitucion de alanina no produce cantidades adecuadas de variante, puede usarse un aminoacido isosterico.

Como se define en el presente documento, las variantes, analogos u homologos de 238P1B2, tienen el atributo distintivo de tener al menos un epitopo que "reacciona de forma cruzada" con una proteina 238P1B2 que tiene una secuencia de aminoacidos de la Figura 3. Como se usa en esta frase, "reacciona de forma cruzada" significa que un anticuerpo o linfocito T que se une especificamente a una variante de 238P1B2 tambien se une especificamente a una proteina de 238P1B2 que tiene una secuencia de aminoacidos expuesta en la Figura 3. Un polipeptido deja de ser una variante de una proteina mostrada en la Figura 3, cuando ya no contiene ningun epitopo que pueda reconocerse por un anticuerpo o linfocito T que se une especificamente a la proteina 238P1B2 de partida. Los expertos en la materia entienden que los anticuerpos que reconocen proteinas se unen a epitopos de diverso tamano y un agrupamiento del orden de aproximadamente cuatro o cinco aminoacidos, contiguos o no, se considera un numero tipico de aminoacidos en un epitopo minimo. Vease, por ejemplo, Nair y col., J. Immunol 2000 165 (12): 6949-6955; Hebbes y col., Mol Immunol (1989) 26(9): 865:-73; Schwartz y col, J Immunol (1985) 135 (4): 2598-608.

0tras clases de variantes de proteina relacionadas con 238P1B2 comparten el 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 % o mas similitud con una secuencia de aminoacidos de la Figura 3, o un fragmento de la misma. 0tra clase especifica de variantes o analogos de proteina 238P1B2 comprende uno o mas de los motivos biologicos de 238P1B2 descritos en el presente documento o actualmente conocidos en la tecnica. Por lo tanto, los analogos de fragmentos de 238P1B2 (nucleicos o aminoacidicos) pueden tener propiedades funcionales alteradas (por ejemplo, inmunogenicas) en relacion con el fragmento de partida. Tambien debe apreciarse que los motivos que son ahora o se convierten en parte de la tecnica deben aplicarse a las secuencias de acidos nucleicos o aminoacidos de la Figura 2 o Figura 3.

Como se ha analizado en el presente documento, los polipeptidos pueden contener menos de la secuencia de aminoacidos completa de una proteina 238P1B2 mostrada en la Figura 2 o Figura 3. Por ejemplo, los peptidos/ proteinas representativos pueden tener cualquiera de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o mas aminoacidos contiguos de una proteina 238P1B2 mostrada en la Figura 2 o Figura 3.

Ademas, los polipeptidos representativos pueden consistir en aproximadamente aminoacido 1 a aproximadamente a aproximadamente aminoacido 10 de una proteina 238P1B2 mostrada en la Figura 2 o Figura 3, polipeptidos que consisten en aproximadamente aminoacido 10 a aproximadamente aminoacido 20 de una proteina 238P1B2 mostrada en la Figura 2 o Figura 3, polipeptidos que consisten en aproximadamente aminoacido 20 a aproximadamente aminoacido 30 de una proteina 238P1B2 mostrada en la Figura 2 o Figura 3, polipeptidos que consisten en aproximadamente aminoacido 30 a aproximadamente aminoacido 40 de una proteina 238P1B2 mostrada en la Figura 2 o Figura 3, polipeptidos que consisten en aproximadamente aminoacido 40 a aproximadamente aminoacido 50 de una proteina 238P1B2 mostrada en la Figura 2 o Figura 3, polipeptidos que consisten en aproximadamente aminoacido 50 a aproximadamente aminoacido 60 de una proteina 238P1B2 mostrada en la Figura 2 o Figura 3, polipeptidos que consisten en aproximadamente aminoacido 60 a aproximadamente aminoacido 70 de una proteina 238P1B2 mostrada en la Figura 2 o Figura 3, polipeptidos que consisten en aproximadamente aminoacido 70 a aproximadamente aminoacido 80 de una proteina 238P1B2 mostrada en la Figura 2 o Figura 3, polipeptidos que consisten en aproximadamente aminoacido 80 a aproximadamente aminoacido 90 de una proteina 238P1B2 mostrada en la Figura 2 o Figura 3, polipeptidos que consisten en aproximadamente aminoacido 90 a aproximadamente aminoacido a 100 de una proteina 238P1B2 mostrada en la Figura 2 o Figura 3, etc. a lo largo de la totalidad de una secuencia de aminoacidos de 238P1B2. Ademas, los polipeptidos que consisten en aproximadamente aminoacido 1 (o 20, 30 o 40 etc.) a aproximadamente aminoacido 20 (o 130, 140 o 150 etc.) de una proteina 238P1B2 mostrada en la Figura 2 o Figura 3. Debe

apreciarse que las posiciones de partida y parada en este parrafo se refieren a la posicion especificada asi como esa posicion mas o menos 5 restos.

Se generan proteinas relacionadas con 238P1B2 usando tecnologia de sintesis peptidica convencional o usando procedimientos de escision quimica bien conocidos en la tecnica. Como alternativa, pueden usarse procedimientos recombinantes para generar moleculas de acido nucleico que codifiquen una proteina relacionada con 238P1B2. Las moleculas de acido nucleico pueden proporcionar un medio para generar fragmentos definidos de una proteina 238P1B2 (o variantes, homologos o analogos de la misma).

III.A.) Proteínas que portan motivo

Los polipeptidos de 238P1B2 adicionales comprenden los restos aminoacidicos de uno o mas de los motivos biologicos contenidos dentro de una secuencia polipeptidica de 238P1B2 expuesta en la Figura 2 o Figura 3. Se conocen en la tecnica diversos motivos y puede evaluarse una proteina con respecto a la presencia de tales motivos por varios sitios de internet disponibles publicamente (vease, por ejemplo, las direcciones Web: pfam.wustl.edu/; searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-search/struc-predict.html;psort.ims.u-tokyo.ac.jp/; www.cbs.dtu.dk/; www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html; www.expasy.ch/tools/scnpsiti.html; Epimatrix™ y Epimer™, Brown University, www.brown.edu/Research/TB-HIVLab/epimatrix-/epimatrix.html; y BIMAS, bimas.dcrt.nih.gov/.).

Diversas referencias reflejan la tecnica con respecto a la identificacion y generacion de epitopos en una proteina de interes asi como analogos de la misma. Vease, por ejemplo, documento W0 9733602 de Chesnut y col; Sette, Immunogenetics 1999 50 (3-4): 201-212; Sette y col., J. Immunol. 2001 166 (2): 1389-1397; Sidney y col., Hum. Immunol. 1997 58(1): 12-20; Kondo y col., Immunogenetics 1997 45(4): 249-258; Sidney y col., J. Immunol. 1996 157(8): 3480-90; y Falk y col., Nature 351: 290-6 (1991); Hunt y col., Science 255: 1261-3 (1992); Parker y col, J. Immunol. 149: 3580-7 (1992); Parker y col., J. Immunol. 152: 163-75 (1994)); Kast y col., 1994 152 (8): 3904-12; Borras-Cuesta y col., Hum. Immunol. 2000 61(3): 266-278; Alexander y col., J. Immunol. 2000 164(3); 164 (3): 16251633; Alexander y col., PMID: 7895164, UI: 95202582; 0'Sullivan y col., J. Immunol. 1991 147(8): 2663-2669; Alexander y col., Immunity 1994 1(9): 751-761 y Alexander y col., Immunol. Res. 1998 18(2): 79-92.

Las proteinas relacionadas con 238P1B2 pueden estar en muchas formas, preferentemente en forma aislada. Una molecula proteica de 238P1B2 purificada estara sustancialmente sin otras proteinas o moleculas que perjudican la union de 238P1B2 con anticuerpo, linfocito T u otro ligando. La naturaleza y grado de aislamiento y purificacion dependera del uso pretendido. Las proteinas relacionadas con 238P1B2 incluyen proteinas relacionadas con 238P1B2 purificadas y proteinas relacionadas con 238P1B2 solubles funcionales. Una proteina de 238P1B2 soluble funcional o fragmento de la misma puede conservar la capacidad de unirse a anticuerpo, linfocito T u otro ligando.

Las proteinas 238P1B2 pueden comprender fragmentos biologicamente activos de una secuencia de aminoacidos de 238P1B2 mostrada en la Figura 2 o Figura 3. Tales proteinas muestran propiedades de la proteina 238P1B2 de partida, tales como la capacidad para inducir la generacion de anticuerpos que se unen especificamente a un epitopo asociado con la proteina 238P1B2 de partida; de unirse a tales anticuerpos; de inducir la activacion de HTL

o CTL; y/o de reconocerse por HTL o CTL que tambien se unen especificamente a la proteina de partida.

Los polipeptidos relacionados con 238P1B2 que contienen estructuras particularmente interesantes pueden predecirse y/o identificarse usando diversas tecnicas analiticas bien conocidas en la materia, incluyendo, por ejemplo, los procedimientos de analisis de Chou - Fasman, Garnier-Robson, Kyte Doolittle, Eisenberg, Karplus Schultz o Jameson-Wolf o basandose en inmunogenicidad. Los fragmentos que contienen tales estructuras son particularmente utiles en la generacion de anticuerpos anti-238P1B2 especificos de subunidad o linfocitos T o en la identificacion de factores celulares que se unen a 238P1B2. Por ejemplo, pueden generarse perfiles de hidrofilia e identificarse fragmentos peptidicos inmunogenicos, usando el procedimiento de Hopp, T. P. y Woods, K. R., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-3828. Pueden generarse perfiles hidropaticos e identificarse fragmentos peptidicos inmunogenicos, usando el procedimiento de Kyte, J y Doolittle, R. F. 1982, J. Mol Biol. 157:105-132. Pueden generarse perfiles de porcentaje (%) de restos accesibles e identificarse fragmentos peptidicos inmunogenicos, usando el procedimiento de Janin J., 1979, Nature 277: 491-492. Pueden generarse perfiles de flexibilidad media e identificarse fragmentos peptidicos inmunogenicos, usando el procedimiento de Bhaskaran R., Ponnuswamy P. K., 1988, Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255. Pueden generarse perfiles de giro beta e identificarse fragmentos peptidicos inmunogenicos, usando el procedimiento de Deleage, G., Roux B., 1987, Protein Engineering 1: 289-294.

Pueden determinarse epitopos de CTL usando algoritmos especificos para identificar peptidos dentro de una proteina 238P1B2 que sean capaces de unirse optimamente a alelos de HLA especificos (por ejemplo, usando el sitio S.FPEITHI en la direccion Web syfpeithi.bmi-heidelberg.com/; Epimatrix™ y Eimer™, Brown University, URL (www.brown.edu/Research/TB-HIV Lab/epimatrix/epimatrix.htrnl); y BIMAS, URL bimas.dcrt.nih.gov/).

El algoritmo de busqueda de motivo peptidico de HLA lo desarrollo el Dr. Ken Parker basandose en la union de secuencias peptidicas especificas en el surco de las moleculas de HLA de clase I, en particular HLA-A2 (vease, por ejemplo, Falk y col., Nature 351: 290-6(1991); Hunt y col., Science 255:1261-3 (1992); Parker y col., J. Immunol. 149:3580-7 (1992); Parker y col., J. Immunol. 152:163-75 (1994)). Este algoritmo permite la localizacion y la

clasificacion de peptidos 8-mer, 9-mer y 10-mer a partir de una secuencia proteica completa para union predicha a HLA-A2 asi como numerosas otras moleculas de HLA de clase I. Muchos peptidos de union a HLA de clase I son 8, 9, 10 u 11-mer. Por ejemplo, para HLA-A2 de clase I, los epitopos preferentemente contienen una leucina (L) o metionina (M) en la posicion 2 y una valina (V) o leucina (L) en el extremo C terminal (vease, por ejemplo, Parker y col., J. Immunol. 149:3580-7 (1992)).

La puntuacion de union corresponde a la mitad de tiempo estimado de disociacion de complejos que contienen el peptido a 37 'C a pH 6,5. Se predice que los peptidos con la mayor puntuacion de union seran los unidos de forma mas estrecha a HLA de clase I en la superficie celular durante el periodo de tiempo mayor y de este modo representan las mejores dianas inmunogenicas para reconocimiento de linfocitos T.

La union real de peptidos a un alelo de HLA puede evaluarse por estabilizacion de la expresion de HLA en la linea celular defectuosa para procesamiento de antigenos T2 (vease, por ejemplo, Xue y col., Prostate 30: 73-8 (1997) y Peshwa y col., Prostate 36: 129-38 (1998)). La inmunogenicidad de peptidos especificos puede evaluarse in vitro por estimulacion de linfocitos T citotoxicos CD8+ (CTL) en presencia de celulas presentadoras de antigenos tales como celulas dendriticas.

Debe apreciarse que cada epitopo predicho por el sitio BIMAS, sitios Epimer™ y Epimatrix™ o especificado por los motivos de HLA de clase I o clase II disponibles en la tecnica o que forman parte de la tecnica tales como los que se exponen en la Tabla IV (o determinados usando el sitio web syfpeithi.bmi-heidelberg.com/ o BIMAS, bimas.dcrt.nih.gov/) deben "aplicarse" a una proteina 238P1B2 descrita en el presente documento. Como se usa en el presente contexto "aplicarse" significa que se evalua una proteina 238P1B2, por ejemplo, visualmente o por procedimientos de hallazgo de patrones basados en ordenador, como se aprecia por los expertos en la materia relevante. Cada subsecuencia de una proteina 238P1B2 de 8, 9, 10 u 11 restos aminoacidicos que porta un motivo de HLA de clase I o una subsecuencia de 9 o mas restos aminoacidicos que portan un motivo de HLA de clase II se describen en el presente documento.

III. B.) Expresión de proteínas relacionadas con 238P1B2

Como se describe en los ejemplos a continuacion, 238P1B2 puede expresarse de forma conveniente en celulas (tales como celulas 293T) transfectadas con un vector de expresion disponible en el mercado tal como un vector de expresion dirigido por CMV que codifica 238P1B2 con un marcador M.C y 6Xhis C terminal (pcDNA3.1/mycHIS, Invitrogen o Tag5, GenHunter Corporation, Nashville TN). El vector Tag5 proporciona una senal de secrecion de IgGK que puede usarse para facilitar la produccion de una proteina 238P1B2 secretada en celulas transfectadas. La 238P1B2 marcada con HIS secretada en el medio de cultivo puede purificarse, por ejemplo, usando una columna de niquel usando tecnicas convencionales.

III.C.) Modificaciones de proteínas relacionadas con 238P1B2

Se describen en el presente documento modificaciones de proteinas relacionadas con 238P1B2 tales como modificaciones covalentes. Un tipo de modificacion covalente incluye hacer reaccionar restos aminoacidicos diana de un polipeptido 238P1B2 con un agente de derivatizacion organico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionada o los restos N o C terminal de una proteina 238P1B2. 0tro tipo de modificacion covalente de un polipeptido de 238P1B2 descrito en el presente documento comprende alterar el patron de glucosilacion nativo de una proteina descrita en el presente documento. 0tro tipo de modificacion covalente de 238P1B2 comprende ligar un polipeptido de 238P1B2 con uno o diversos polimeros no proteinicos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera expuesta en las Patentes de Estados Unidos N° 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337.

Las proteinas relacionadas con 238P1B2 descritas en el presente documento tambien pueden modificarse para formar una molecula quimerica que comprende 238P1B2 fusionada con otra secuencia polipeptidica o de aminoacidos heterologa. Una molecula quimerica tal puede sintetizarse quimicamente o de forma recombinante. Una molecula quimerica puede tener una proteina descrita en el presente documento fusionada con otro antigeno asociado a tumor o fragmento del mismo. Como alternativa, una proteina descrita en el presente documento puede comprender una fusion de fragmentos de una secuencia de 238P1B2 (de aminoacidos o acidos nucleicos) de modo que se crea una molecula que no es, en toda su extension, directamente homologa a las secuencias de aminoacidos

o acidos nucleicos mostradas en la Figura 2 o la Figura 3. Una molecula quimerica tal puede comprender multiples de la misma subsecuencia de 238P1B2. Una molecula quimerica puede comprender una fusion de una proteina relacionada con 238P1B2 con un marcador epitopico de polihistidina, que proporciona un epitopo con el que puede unirse de forma selectiva el niquel inmovilizado, con citocinas o con factores de crecimiento. El marcador epitopico se coloca generalmente en el extremo carboxilo o amino terminal de una proteina 238P1B2. Como alternativa, la molecula quimerica puede comprender una fusion de una proteina relacionada con 238P1B2 con una inmunoglobulina o una region particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molecula quimerica (tambien denominada "inmunoadhesina"), una fusion tal podia ser con la region Fc de una molecula de IgG. Las fusiones de Ig preferentemente incluyen la sustitucion de una forma soluble (dominio transmembrana delecionado o inactivado) de un polipeptido de 238P1B2 en lugar de al menos una region variable dentro de una molecula de Ig. La fusion de inmunoglobulina puede incluir las regiones bisagra, CH2 y CH3 o la bisagra, CH1, CH2 y CH3 de una

molecula de IgGI. Para la produccion de fusiones de inmunoglobulina vease, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 5.428.130 presentada el 27 de junio de 1995.

IILD.) Usos de proteínas relacionadas con 238P1B2

Las proteinas descritas en el presente documento tienen varios usos especificos diferentes. Como 238P1B2 esta altamente expresada en canceres de prostata y otros, se usan proteinas relacionadas con 238P1B2 en procedimientos que evaluan el estado de productos genicos de 238P1B2 en tejidos cancerosos frente a normales, elucidando de este modo el fenotipo maligno. Normalmente, se usan polipeptidos de las regiones especificas de una proteina 238P1B2 para evaluar la presencia de perturbaciones (tales como deleciones, inserciones, mutaciones puntuales, etc.) en esas regiones (tales como regiones que contienen uno o mas motivos). Los ensayos ejemplares usan anticuerpos o linfocitos T que se dirigen a proteinas relacionadas con 238P1B2 que comprenden los restos aminoacidicos de uno o mas de los motivos biologicos contenidos dentro de una secuencia polipeptidica de 238P1B2 para evaluar las caracteristicas de esta region en tejidos normales frente a cancerosos o para inducir una respuesta inmune al epitopo. Como alternativa, se usan proteinas relacionadas con 238P1B2 que contienen los restos aminoacidicos de uno o mas de los motivos biologicos en una proteina 238P1B2 para explorar con respecto a factores que interaccionen con esa region de 238P1B2.

Los fragmentos proteicos/subsecuencias de 238P1B2 son particularmente utiles en la generacion y caracterizacion de anticuerpos especificos de dominio (por ejemplo, anticuerpos que reconocen un epitopo extracelular o intracelular de una proteina 238P1B2), para identificar agentes o factores celulares que se unen a 238P1B2 o un dominio estructural particular de los mismos y en diversos contextos terapeuticos y de diagnostico, incluyendo pero sin limitacion ensayos de diagnostico, vacunas de cancer y procedimientos para preparar tales vacunas.

Las proteinas codificadas por los genes de 238P1B2, o por analogos, homologos o fragmentos de los mismos, tienen diversos usos, incluyendo pero sin limitacion generar anticuerpos y en procedimientos para identificar ligandos y otros agentes y constituyentes celulares que se unen a un producto genico de 238P1B2. Los anticuerpos inducidos contra una proteina 238P1B2 o fragmento de la misma son utiles en ensayos de diagnostico y pronostico, y metodologias de formacion de imagenes en el tratamiento de canceres humanos caracterizados por la expresion de proteina 238P1B2, tales como los enumerados en la Tabla I. Tales anticuerpos pueden expresarse de forma intracelular y usarse en procedimientos para tratar pacientes con tales canceres. Tambien se usan acidos nucleicos

o proteinas relacionadas con 238P1B2 en la generacion de respuestas de HTL o CTL.

Se usan diversos ensayos inmunologicos utiles para la deteccion de proteinas 238P1B2, incluyendo pero sin limitacion diversos tipos de radioinmunoensayos, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA), ensayos inmunofluorescentes ligados a enzima (ELISA), procedimientos inmunocitoquimicos y similares. Los anticuerpos pueden marcarse y usarse como reactivos de formacion de imagenes inmunologicos capaces de detectar celulas que expresan 238P1B2 (por ejemplo, en procedimientos de formacion de imagenes radioescintigraficos). Las proteinas 238P1B2 tambien son particularmente utiles en la generacion de vacunas de cancer, como se describe adicionalmente en el presente documento.

IV.) Procedimientos para la detección de 238P1B2

Los inventores describen procedimientos para detectar polinucleotidos de 238P1B2 y proteinas relacionadas con 238P1B2, asi como procedimientos para identificar una celula que expresa 238P1B2. El perfil de expresion de 238P1B2 lo hace un marcador de diagnostico para enfermedad metastasizada. En consecuencia, el estado de los productos genicos de 238P1B2 proporciona informacion util para predecir diversos factores incluyendo susceptibilidad a enfermedad de etapa avanzada, tasa de progresion y/o agresividad del tumor. Como se analiza en detalle en el presente documento, el estado de los productos genicos de 238P1B2 en muestras de pacientes puede analizarse mediante diversos protocolos que se conocen bien en la tecnica incluyendo analisis inmunohistoquimico, la diversidad de tecnicas de transferencia de Northern incluyendo hibridacion in situ, analisis por RT-PCR (por ejemplo en muestras microdisecadas por captura de laser) analisis de transferencia de Western y analisis de serie tisular.

De forma mas particular, los inventores describen ensayos para la deteccion de polinucleotidos de 238P1B2 en una muestra biologica, tales como suero, hueso, prostata y otros tejidos, orina, semen, preparaciones celulares y similares. Los polinucleotidos de 238P1B2 detectables incluyen, por ejemplo, un gen de 238P1B2 o fragmento del mismo, ARNm de 238P1B2, ARNm de 238P1B2 de variante de corte y empalme alternativo y moleculas de ADN o ARN recombinantes que contienen un polinucleotido de 238P1B2. Se conocen bien en la tecnica varios procedimientos para amplificar y/o detectar la presencia de polinucleotidos de 238P1B2 y pueden emplearse en la practica de estos ensayos.

Un procedimiento para detectar un ARNm de 238P1B2 en una muestra biologica puede comprender producir ADNc de la muestra por transcripcion inversa usando al menos un cebador; amplificar el ADNc producido de este modo usando polinucleotidos de 238P1B2 como cebadores sentido y antisentido para amplificar ADNc de 238P1B2 en el mismo; y detectar la presencia del ADNc de 238P1B2 amplificado. 0pcionalmente, puede determinarse la secuencia del ADNc de 238P1B2 amplificado.

Un procedimiento para detectar un gen de 238P1B2 en una muestra biologica puede comprender primero aislar ADN genomico de la muestra; amplificar el ADN genomico aislado usando polinucleotidos de 238P1B2 como cebadores sentido y antisentido; y detectar la presencia del gen de 238P1B2 amplificado. Puede designarse cualquier variedad de combinaciones de sonda sentido y antisentido apropiadas a partir de una secuencia de nucleotidos de 238P1B2 (vease, por ejemplo, Figura 2) y usarse para este fin.

Los inventores tambien describen ensayos para detectar la presencia de una proteina 238P1B2 en un tejido u otra muestra biologica tal como suero, semen, hueso, prostata, orina, preparaciones celulares y similares. Los procedimientos para detectar una proteina relacionada con 238P1B2 tambien se conocen bien e incluyen, por ejemplo, inmunoprecipitacion, analisis inmunohistoquimico, analisis de transferencia de Western, ensayos de union molecular, ELISA, ELIFA y similares. Por ejemplo, un procedimiento para detectar la presencia de una proteina relacionada con 238P1B2 en una muestra biologica comprende primero poner en contacto con la muestra con un anticuerpo de 238P1B2, un fragmento sensible a 2381PB2 del mismo o una proteina recombinante que contiene una region de union a antigeno de un anticuerpo de 238P1B2; y despues detectar la union de la proteina relacionada con 238P1B2 en la muestra.

Tambien se describen procedimientos para identificar una celula que expresa 238P1B2. Un ensayo para identificar una celula que exprese un gen de 238P1B2 puede comprender detectar la presencia de ARNm de 238P1B2 en la celula. Se conocen bien procedimientos para la deteccion de ARNm particulares en celulas e incluyen, por ejemplo, ensayos de hibridacion usando sondas de ADN complementario (tales como hibridacion in situ usando ribosondas de 238P1B2 marcadas, transferencia de Northern y tecnicas relacionadas) y diversos ensayos de amplificacion de acido nucleico (tales como RT-PCR usando cebadores complementarios especificos para 238P1B2 y otros procedimientos de deteccion de tipo amplificacion, tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y similares). Como alternativa, un ensayo para identificar una celula que expresa un gen de 238P1B2 comprende detectar la presencia de proteinas relacionadas con 238P1B2 en la celula o secretada por la celula. Se conocen bien en la tecnica diversos procedimientos para la deteccion de proteinas y se emplean para la deteccion de proteinas relacionadas con 238P1B2 y celulas que expresan proteinas relacionadas con 238P1B2.

El analisis de expresion de 238P1B2 tambien es util como una herramienta para identificar y evaluar agentes que modulan la expresion genica de 238P1B2. Por ejemplo, la expresion de 238P1B2 se regula positivamente de forma significativa en cancer de prostata y se expresa en canceres de los tejidos enumerados en la Tabla 1. La identificacion de una molecula o agente biologico que inhibe expresion de 238P1B2 o sobreexpresion en celulas cancerosas es de valor terapeutico. Por ejemplo, un agente tal puede identificarse usando una exploracion que cuantifica la expresion de 238P1B2 por RT-PCR, hibridacion de acido nucleico o union de anticuerpo.

V.) Procedimientos para controlar el estado de genes relacionados con 238P1B2 y sus productos

Se sabe que la oncogenesis es un proceso multietapa en el que el crecimiento celular se desregula progresivamente y las celulas progresan de un estado fisiologico normal a estados precancerosos y despues cancerosos (vease, por ejemplo, Alers y col., Lab Invest. 77(5):437-438 (1997) e Isaacs y col., Cancer Surv. 23:19-32 (1995)). En este contexto, la examinacion de una muestra biologica con respecto a pruebas de crecimiento celular desregulado (tal como expresion de 238P1B2 aberrante en canceres) permite la deteccion temprana de dicha fisiologia aberrante, antes de que un estado patologico tal como cancer haya progresado a una etapa en la que las opciones terapeuticas son mas limitadas y/o el pronostico es peor. En tales examinaciones, el estado de 238P1B2 en una muestra biologica de interes puede compararse, por ejemplo, con el estado de 238P1B2 en una muestra normal correspondiente (por ejemplo una muestra de ese individuo o como alternativa otro individuo que no esta afectado por una patologia). Una alteracion en el estado de 238P1B2 en la muestra biologica (en comparacion con la muestra normal) proporciona pruebas de crecimiento celular desregulado. Ademas de usar una muestra biologica que no esta afectada por una patologia como una muestra normal, puede usarse tambien un valor normativo predeterminado tal como un nivel normal predeterminado de expresion de ARNm (vease, por ejemplo, Grever y col.,

J. Comp. Neurol. 9 de diciembre de 1996; 376(2):306-14 y Patente de Estados Unidos N° 5.837.501) para comparar el estado de 238P1B2 en una muestra.

El termino "estado" en este contexto se usa de acuerdo con su significado aceptado en la tecnica y se refiere a la condicion o el estado de un gen y sus productos. Normalmente, los expertos en la materia usan varios parametros para evaluar la condicion o estado de un gen y sus productos. Estos incluyen, pero sin limitacion la localizacion de productos genicos expresados (incluyendo la localizacion de celulas que expresan 238P1B2) asi como el nivel y actividad biologica de productos genicos expresados (tales como ARNm de 238P1B2, polinucleotidos y polipeptidos). Normalmente, una alteracion en el estado de 238P1B2 comprende un cambio en la localizacion de 238P1B2 y/o celulas que expresan 238PIB2 y/o un aumento en la expresion de ARNm y/o proteina de 238P1B2.

El estado de 238P1B2 en una muestra puede analizarse por varios medios bien conocidos en la tecnica, incluyendo sin limitacion, analisis inmunohistoquimico, hibridacion in situ, analisis por RT-PCR en muestras microdisecadas de captura de laser, analisis de transferencia de Western y analisis de serie tisular. Los protocolos tipicos para evaluar el estado de un gen de 238P1B2 y productos genicos se encuentran, por ejemplo en Ausubel y col., eds. 1995, Current Protocols In Molecular Biology, unidades 2 (transferencia de Northern), 4 (transferencia de Southern), 15 (inmunotransferencia) y 18 (analisis de PCR). Por lo tanto, el estado de 238PIB2 en una muestra biologica se evalua

por diversos procedimientos usados por los expertos en la materia incluyendo, pero sin limitacion analisis de Southern genomico (para examinar, por ejemplo perturbaciones en un gen de 238P1B2), analisis de Northern y/o analisis por PCR de ARNm de 238P1B2 (para examinar, por ejemplo alteraciones en las secuencias polinucleotidicas o niveles de expresion de ARNm de 238P1B2) y, analisis de Western y/o inmunohistoquimicos (para examinar, por ejemplo alteraciones de secuencias polipeptidicas, alteraciones de la localizacion polipeptidica dentro de una muestra, alteraciones en los niveles de expresion de proteinas 238P1B2 y/o asociaciones de proteinas 238P1B2 con companeros de union polipeptidicos). Los polinucleotidos de 238P1B2 detectables incluyen, por ejemplo, un gen de 238P1B2 o fragmento del mismo, ARNm de 238P1B2, variantes de corte y empalme alternativo, ARNm de 238P1B2 y moleculas de ADN o ARN recombinantes que contienen un polinucleotido de 238P1B2.

El perfil de expresion de 238P1B2 le hace un marcador de diagnostico para enfermedad local y/o metastasizada y proporciona informacion sobre el crecimiento o potencial oncogenico de una muestra biologica. En particular, el estado de 238P1B2 proporciona informacion util para predecir la susceptibilidad a etapas de enfermedad particulares, progresion y/o agresividad del tumor. Los inventores describen procedimientos y ensayos para determinar el estado de 238P1B2 y diagnosticar canceres que expresan 238P1B2, tales como canceres de los tejidos enumerados en la Tabla I. Por ejemplo, debido a que el ARNm de 238P1B2 esta tan altamente expresado en canceres de prostata y otros en relacion con tejido prostatico normal, los ensayos que evaluan los niveles de transcritos de ARNm de 238P1B2 o proteinas en una muestra biologica pueden usarse para diagnosticar una enfermedad asociada con desregulacion de 238P1B2 y pueden proporcionar informacion de pronostico util en la definicion de opciones terapeuticas apropiadas.

El estado de expresion de 238P1B2 proporciona informacion incluyendo la presencia, la etapa y la localizacion de celulas precancerosas y cancerosas displasicas, prediciendo la susceptibilidad a diversas etapas de enfermedad y/o para estimar la agresividad del tumor. Ademas, el perfil de expresion lo hace util como un reactivo de formacion de imagenes para enfermedad metastasizada. En consecuencia, los inventores describen diversos procedimientos de pronostico y diagnostico moleculares para examinar el estado de 238PIB2 en muestras biologicas tales como las de individuos que padecen, o se sospecha que padecen una patologia caracterizada por crecimiento celular desregulado, tal como cancer.

Como se ha descrito anteriormente, el estado de 238P1B2 en una muestra biologica puede examinarse por varios procedimientos bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, el estado de 238P1B2 en una muestra biologica tomada de una localizacion especifica en el cuerpo puede examinarse evaluando la muestra con respecto a la presencia o ausencia de celulas que expresan 238P1B2 (por ejemplo, las que expresan ARNm o proteinas de 238P1B2). Esta examinacion puede proporcionar pruebas de crecimiento celular desregulado, por ejemplo, cuando se encuentran celulas que expresan 238P1B2 en una muestra biologica que no contiene normalmente tales celulas (tal como un ganglio linfatico), debido a que tales alteraciones en el estado de 238P1B2 en una muestra biologica se asocian con frecuencia con crecimiento celular desregulado. Especificamente, un indicador del crecimiento celular desregulado es las metastasis de celulas cancerosas de un organo de origen (tal como la prostata) a un area diferente del cuerpo (tal como un ganglio linfatico). En este contexto, las pruebas de crecimiento celular desregulado son importantes por ejemplo debido a que pueden detectarse metastasis de ganglios linfaticos ocultas en una proporcion sustancial de pacientes con cancer de prostata y tales metastasis se asocian con predictores conocidos de progresion de enfermedad (vease, por ejemplo, Murphy y col., Prostate 42 (4): 315-317 (2000); Su y col., Semin. Surg. 0ncol 18(1):17-28 (2000) y Freeman y col., J Urol Ago 1995 154 (2 Pt 1): 474-8).

Los inventores describen procedimientos para controlar los productos genicos de 238P1B2 determinando el estado de los productos genicos de 238P1B2 expresados por celulas de un individuo sospechoso de tener una enfermedad asociada con crecimiento celular desregulado (tal como hiperplasia o cancer) y comparando despues el estado determinado de este modo con el estado de los productos genicos de 238P1B2 en una muestra normal correspondiente. La presencia de productos genicos de 238P1B2 aberrantes en la muestra de ensayo en relacion con la muestra normal proporciona un indicio de la presencia de crecimiento celular desregulado dentro de las celulas del individuo.

Los inventores describen ensayos utiles en la determinacion de la presencia de cancer en un individuo, que comprenden detectar un aumento significativo de expresion de ARNm o proteinas de 238P1B2 en una muestra celular o tisular de ensayo en relacion con niveles de expresion en el tejido o celula normal correspondiente. La presencia de ARNm de 238P1B2 puede, por ejemplo, evaluarse en muestras tisulares incluyendo pero sin limitacion las enumeradas en la Tabla I. La presencia de expresion de 238P1B2 significativa en cualquiera de estos tejidos es util para indicar la aparicion, presencia y/o gravedad de un cancer, puesto que los tejidos normales correspondientes no expresan ARNm de 238P1B2 o lo expresan a niveles mas bajos.

El estado de 238P1B2 puede determinarse en el nivel proteico en lugar de en el nivel de acido nucleico. Por ejemplo, un procedimiento tal comprende determinar el nivel de proteina de 238P1B2 expresada por celulas en una muestra tisular de ensayo y comparar el nivel determinado de este modo con el nivel de 238P1B2 expresado en una muestra normal correspondiente. La presencia de proteina 238P1B2 puede evaluarse, por ejemplo, usando procedimientos inmunohistoquimicos. Los anticuerpos de 238P1B2 o companeros de union capaces de detectar expresion de proteina 238P1B2 se usan en diversos formatos de ensayo bien conocidos en la tecnica para este fin.

Puede evaluarse el estado de las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de 238P1B2 en una muestra biologica para identificar perturbaciones en la estructura de estas moleculas. Estas perturbaciones pueden incluir inserciones, deleciones, sustituciones y similares. Tales evaluaciones son utiles porque las perturbaciones en las secuencias de nucleotidos y aminoacidos se observan en un gran numero de proteinas asociadas con un fenotipo desregulado del crecimiento (vease, por ejemplo, Marrogi y col., 1999, J. Cutan. Pathol. 26 (8): 369-378). Por ejemplo, una mutacion en la secuencia de 238P1B2 puede ser indicativa de la presencia o promocion de un tumor. Tales ensayos por lo tanto tienen valor diagnostico y predictivo en el que una mutacion de 238P1B2 indica una potencial perdida de funcion o aumento de crecimiento tumoral.

Se conoce bien en la tecnica una amplia diversidad de ensayos para observar perturbaciones en secuencias de nucleotidos y aminoacidos. Por ejemplo, el tamano y estructura de las secuencias de acido nucleicos o aminoacidos de los productos genicos de 238P1B2 se observan por los protocolos de Northern, Southern, Western, PCR y secuenciacion de ADN analizados en el presente documento. Ademas, se conocen bien en la tecnica otros procedimientos para observar perturbaciones en secuencias de nucleotidos y aminoacidos tales como analisis de polimorfismo de conformacion de cadena sencilla (vease, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 5.382.510 presentada el 7 de septiembre de 1999 y 5.952.170 presentada el 17 de enero de 1995).

Adicionalmente, se puede examinar el estado de metilacion de un gen de 238P1B2 en una muestra biologica. Con frecuencia se produce desmetilacion aberrante y/o hipermetilacion de islas de CpG en regiones reguladoras 5' del gen en celulas inmortalizadas y transformadas y puede dar como resultado expresion alterada de diversos genes. Por ejemplo, la hipermetilacion del promotor de la glutation S-transferasa de clase pi (una proteina expresada en prostata normal pero no expresada en > del 90 % de carcinomas de prostata) parece silenciar permanentemente la transcripcion de este gen y es la alteracion genomica mas frecuentemente detectada en carcinomas de prostata (De Marzo y col., Am. J. Pathol. 155 (6): 1985-1992 (1999)). Ademas, esta alteracion esta presente en al menos el 70 % de los casos de neoplasia intraepitelial prostatica de alto grado (PIN) (Brooks y col., Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 1998, 7:531-536). En otro ejemplo, la expresion del gen especifico de tumor LAGE-I (que no se expresa en prostata normal pero se expresa en 25-50 % de los canceres de prostata) se induce por desoxi-azacitidina en celulas linfoblastoides, lo que sugiere que la expresion tumoral se debe a desmetilacion (Lethe y col., Int J. Cancer 76 (6): 903-908 (1998)). Se conocen bien en la tecnica diversos ensayos para examinar el estado de metilacion de un gen. Por ejemplo, puede usarse, en enfoques de hibridacion de Southern, enzimas de restriccion sensibles a metilacion que no pueden escindir secuencias que contienen sitios de CpG metilados para evaluar el estado de metilacion de las islas de CpG. Ademas, MSP (PCR especifica de metilacion) puede perfilar rapidamente el estado de metilacion de todos los sitios de CpG presentes en una isla de CpG de un gen dado. Este procedimiento implica modificacion inicial de ADN por bisulfito sodico (que convertira todas las citosinas no metiladas a uracilo) seguido de amplificacion usando cebadores especificos para ADN metilado frente a no metilado. Tambien pueden hallarse protocolos que implican interferencia de metilacion por ejemplo en Current Protocols in Molecular Biology, unidad 12, Frederick M. Ausubel y col eds., 1995.

La amplificacion genica es un procedimiento adicional para evaluar el estado de 238P1B2. La amplificacion genica se mide en una muestra directamente, por ejemplo, por transferencia de Southern o transferencia de Northern convencional para cuantificar la transcripcion de ARNm (Thomas, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205), transferencia puntual (analisis de ADN), o hibridacion in situ, usando una sonda marcada de forma apropiada, basandose en las secuencias proporcionadas en el presente documento. Como alternativa, se emplean anticuerpos que reconocen dobles cadenas especificas, incluyendo dobles cadenas de ADN, dobles cadenas de ARN, y dobles cadenas hibridas de ADN-ARN o dobles cadenas de ADN-proteina. Los anticuerpos a su vez se marcan y el ensayo se lleva a cabo cuando la doble cadena esta unida a una superficie, de modo que tras la formacion de doble cadena de superficie, la presencia del anticuerpo unido a la doble cadena pueda detectarse.

Puede analizarse convenientemente tejido biopsiado o sangre periferica con respecto a la presencia de celulas cancerosas usando por ejemplo, analisis de Northern, de transferencia puntal o RT-PCR para detectar la expresion de 238P1B2. La presencia de ARNm de 238P1B2 amplificable por RT-PCR proporciona un indicio de la presencia de cancer. Se conocen bien en la tecnica ensayos de RT-PCR. En la actualidad se estan evaluando los ensayos de deteccion por RT-PCR para celulas tumorales en sangre periferica para su uso en el diagnostico y tratamiento de varios tumores solidos humanos. En el campo del cancer de prostata, estos incluyen ensayos de RT-PCR para la deteccion de celulas que expresan PSA y PSM (Verkaik y col., 1997, Urol. Res. 25:373-384; Ghossein y col., 1995,

J. Clin. 0ncol. 13:1195-2000; Heston y col., 1995, Clin. Chem. 41:1687-1688).

Los inventores describen una evaluacion de la susceptibilidad que un individuo tiene para desarrollar cancer. Los inventores describen un procedimiento para predecir la susceptibilidad a cancer que comprende detectar ARNm de 238P1B2 o proteina 238P1B2 en una muestra tisular, indicando su presencia susceptibilidad a cancer, en el que el grado de expresion de ARNm de 238P1B2 se correlaciona con el grado de susceptibilidad. La presencia de 238P1B2 en prostata u otro tejido puede examinarse, proporcionando la presencia de 238P1B2 en la muestra un indicio de susceptibilidad a cancer de prostata (o la aparicion o existencia de un tumor de prostata). De forma similar, se puede evaluar la integridad de las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de 238P1B2 en una muestra biologica para identificar perturbaciones en la estructura de estas moleculas tales como inserciones, deleciones, sustituciones y similares. La presencia de una o mas perturbaciones de los productos genicos de 238P1B2 en la muestra es un indicio de susceptibilidad a cancer (o la aparicion o existencia de un tumor).

Los inventores describen procedimientos para estimar la agresividad del tumor. Un procedimiento para estimar la agresividad de un tumor puede comprender determinar el nivel de ARNm de 238P1B2 o proteina 238P1B2 expresada por celulas tumorales, comparando el nivel determinado de este modo con el nivel de ARNm de 238P1B2

o proteina 238P1B2 expresado en un tejido normal correspondiente tomado del mismo individuo o una muestra de referencia de tejido normal, en el que el grado de expresion de ARNm de 238P1B2 o proteina 238P1B2 en la muestra de tumor en relacion con la muestra normal indica el grado de agresividad. La agresividad de un tumor puede evaluarse determinando el grado en que 238P1B2 se expresa en las celulas tumorales, indicando mayores niveles de expresion tumores mas agresivos. Los inventores describen la evaluacion de la integridad de secuencias de nucleotidos y aminoacidos de 238P1B2 en una muestra biologica, para identificar perturbaciones en la estructura de estas moleculas tales como inserciones, deleciones, sustituciones y similares. La presencia de una o mas perturbaciones indica tumores mas agresivos.

Los inventores describen procedimientos para observar la progresion de un tumor maligno en un individuo a lo largo del tiempo. Los procedimientos para observar la progresion de un tumor maligno en un individuo a lo largo del tiempo pueden comprender determinar el nivel de ARNm de 238P1B2 o proteina 238P1B2 expresado por celulas en una muestra del tumor, comparando el nivel determinado de este modo con el nivel de ARNm de 238P1B2 o proteina 238P1B2 expresado en una muestra tisular equivalente tomada del mismo individuo en un momento diferente, en el que el grado de expresion de ARNm de 238P1B2 o proteina 238P1B2 en la muestra de tumor a lo largo del tiempo proporciona informacion sobre la progresion del cancer. La progresion de un cancer puede evaluarse determinando la expresion de 238P1B2 en las celulas tumorales a lo largo del tiempo, indicando un aumento de la expresion a lo largo del tiempo una progresion del cancer. Tambien, se puede evaluar la integridad de las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de 238P1B2 en una muestra biologica para identificar perturbaciones en la estructura de estas moleculas tales como inserciones, deleciones, sustituciones y similares, indicando la presencia de una o mas perturbaciones una progresion del cancer.

Los enfoques de diagnostico anteriores pueden combinarse con uno cualquiera de una amplia diversidad de protocolos de pronostico y diagnostico conocidos en la tecnica. Por ejemplo, los inventores describen procedimientos para observar una coincidencia entre la expresion del gen de 238P1B2 y los productos genicos de 238P1B2 (o perturbaciones en el gen de 238P1B2 y los productos genicos de 238P1B2) y un factor que esta asociado con tumor maligno, como un medio para diagnosticar y pronosticar el estado de una muestra tisular. Puede usarse una amplia diversidad de factores asociados con tumor maligno, tales como la expresion de genes asociados con tumor maligno (por ejemplo, expresion de PSA, PSCA y PSM para cancer de prostata etc.), asi como observaciones citologicas globales (vease, por ejemplo, Bocking y col., 1984, Anal. �uant. Cytol. (6)2:74-88; Epstein, 1995, Hum. Pathol. (26)2:223-9; Thorson y col., 1998, Mod. Pathol. (11)6:543-51; Baisden y col., 1999, Am

J. Surg. Pathol. 23(8):918-24). Los procedimientos para observar una coincidencia entre la expresion de gen de 238P1B2 y productos genicos de 238P1B2 (o perturbaciones en el gen de 238P1B2 y productos genicos de 238P1B2) y otro factor que se asocia con tumor maligno son utiles, por ejemplo, porque la presencia de un conjunto de factores especificos que coinciden con la enfermedad proporciona informacion crucial para diagnosticar y pronosticar el estado de una muestra tisular.

Los procedimientos para observar una coincidencia entre la expresion del gen de 238P1B2 y los productos genicos de 238P1B2 (o perturbaciones en el gen de 238P1B2 y productos genicos de 238P1B2) y otro factor asociado con tumor maligno pueden implicar detectar la sobreexpresion de ARNm o proteina de 238P1B2 en una muestra tisular, detectar la sobreexpresion de ARNm o proteina de PSA en una muestra tisular (o expresion de PSCA o PSM), y observar una coincidencia de sobreexpresion de ARNm o proteina de 238P1B2 y ARNm o proteina de PSA (o expresion de PSCA o PSM). La expresion de ARNm de 238P1B2 y PSA en tejido de prostata puede examinarse, indicando la coincidencia de sobreexpresion de ARNm de 238P1B2 y PSA en la muestra la existencia de cancer de prostata, susceptibilidad a cancer de prostata o la aparicion o estado de un tumor de prostata.

Se describen en el presente documento procedimientos para detectar y cuantificar la expresion de ARNm o proteina de 238P1B2 y se conocen bien en la tecnica tecnologias de deteccion y cuantificacion de proteina y acido nucleico convencionales. Los procedimientos convencionales para la deteccion y cuantificacion de ARNm de 238P1B2 incluyen hibridacion in situ usando ribosondas de 238P1B2 marcadas, transferencia de Northern y tecnicas relacionadas usando sondas polinucleotidicas de 238P1B2, analisis por RT-PCR usando cebadores especificos para 238P1B2 y otros procedimientos de deteccion de tipo amplificacion, tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y similares. Puede usarse RT-PCR semicuantitativa para detectar y cuantificar la expresion de ARNm de 238P1B2. Puede usarse cualquier variedad de cebadores capaces de amplificar 238P1B2 para este fin, incluyendo pero sin limitacion los diversos conjuntos de cebadores especificamente descritos en el presente documento. Pueden usarse anticuerpos policlonales o monoclonales que pueden ser especificamente reactivos con la proteina 238P1B2 de tipo silvestre en un ensayo inmunohistoquimico de tejido biopsiado.

VI.) Identificación de moléculas que interaccionan con 238P1B2

Las secuencias proteica y de acido nucleico de 238P1B2 desveladas en el presente documento permiten que un experto en la materia identifique proteinas, moleculas pequenas y otros agentes que interaccionan con 238P1B2, asi como rutas activadas por 238P1B2 mediante uno cualquiera de los diversos protocolos aceptados en la tecnica. Por ejemplo, se puede usar uno de los llamados sistemas de trampa de interaccion (tambien denominado "ensayo de

dos hibridos"). En tales sistemas, las moleculas interaccionan y reconstituyen un factor de transcripcion que dirige la expresion de un gen indicador, tras lo cual se ensaya la expresion del gen indicador. 0tros sistemas identifican interacciones proteina-proteina in vivo a traves de reconstitucion de un activador transcripcional eucariota, vease, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 5.955.280 presentada el 21 de septiembre de 1999, 5.925.523 presentada el 20 de julio de 1999, 5.846.722 presentada el 8 de diciembre de 1998 y 6.004.746 presentada el 21 de diciembre de 1999. Tambien estan disponibles en la tecnica algoritmos para predicciones basadas en genoma de la funcion proteica (vease, por ejemplo, Marcotte, y col., Nature 402:4 noviembre de 1999, 83-86).

Como alternativa se pueden explorar bibliotecas peptidicas para identificar moleculas que interaccionan con secuencias proteicas de 238P1B2. En tales procedimientos, los peptidos que se unen a 238P1B2 se identifican explorando bibliotecas que codifican una coleccion controlada o aleatoria de aminoacidos. Los peptidos codificados por las bibliotecas se expresan como proteinas de fusion de proteinas de revestimiento bacteriofago, las particulas de bacteriofago se exploran despues frente a la proteina o proteinas 238P1B2.

En consecuencia, se identifican de este modo peptidos que tienen una amplia diversidad de usos, tales como reactivos terapeuticos, de pronostico o de diagnostico, sin ninguna informacion anterior sobre la estructura del ligando o molecula receptora esperados. Se desvelan bibliotecas peptidicas y procedimientos de exploracion tipicos que pueden usarse para identificar moleculas que interaccionan con secuencias proteicas de 238P1B2 por ejemplo en las Patentes de Estados Unidos N° 5.723.286 presentada el 3 de marzo de 1998 y 5.733.731 presentada el 31 de marzo de 1998.

Como alternativa, se usan lineas celulares que expresan 238P1B2 para identificar interacciones proteina-proteina mediadas por 238P1B2. Tales interacciones pueden examinarse usando tecnicas de inmunoprecipitacion (vease, por ejemplo, Hamilton B.J., y col. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999, 261: 646-51). La proteina 238P1B2 puede inmunoprecipitarse de lineas celulares que expresan 238P1B2 usando anticuerpos anti-238P1B2. Como alternativa, pueden usarse anticuerpos contra marcador His en una linea celular modificada por ingenieria genetica para que exprese fusiones de 238P1B2 y un marcador His (vectores mencionados anteriormente). El complejo inmunoprecipitado puede examinarse con respecto a asociacion proteica por procedimientos tales como transferencia de Western, marcaje con 35S-metionina de proteinas, microsecuenciacion de proteinas, tincion con plata y electroforesis en gel de dos dimensiones.

Pueden identificarse moleculas pequenas y ligandos que interaccionan con 238P1B2 a traves de ensayos de exploracion relacionados. Por ejemplo, pueden identificarse moleculas pequenas que interfieren con la funcion proteica, incluyendo moleculas que interfieren con la capacidad de 238P1B2 para mediar en la fosforilacion y desfosforilacion, interaccion con moleculas de ADN o ARN como un indicio de regulacion de ciclos celulares, senalizacion de segundo mensajero o tumorogenesis. De forma similar, se identifican moleculas pequenas que modulan el canal de iones relacionado con 238P1B2, bomba proteica o funciones de comunicacion celular y se usan para tratar pacientes que tengan un cancer que exprese 238P1B2 (vease, por ejemplo, Hille, B., Ionic Channels of Excitable Membranes 2a Ed., Sinauer Assoc., Sunderland, MA, 1992). Ademas, pueden identificarse ligandos que regulan la funcion de 238P1B2 basandose en su capacidad para unirse a 238P1B2 y activar una construccion indicadora. Se analizan procedimientos tipicos por ejemplo en la Patente de Estados Unidos N° 5.928.868 presentada el 27 de julio de 1999 e incluyen procedimientos para formar ligandos hibridos en los que al menos un ligando es una molecula pequena. En un procedimiento ilustrativo, las celulas modificadas por ingenieria genetica para expresar un proteina de fusion de 238P1B2 y una proteina de union a ADN se usan para co-expresar una proteina de fusion de un ligando hibrido/molecula pequena y una proteina activadora de la transcripcion de biblioteca de ADNc. Las celulas contienen adicionalmente un gen indicador, la expresion del cual esta condicionada por la proximidad de la primera y segunda proteinas de fusion entre si, un acontecimiento que se produce solamente si el ligando hibrido se une a sitios diana en ambas proteinas hibridas. Las celulas que expresan el gen indicador se seleccionan y se identifica la molecula pequena desconocida o el ligando desconocido. Este procedimiento proporciona un medio para identificar moduladores que activan o inhiben 238P1B2.

Los inventores describen un procedimiento para explorar con respecto a una molecula que interacciona con una secuencia de aminoacidos de 238P1B2 mostrada en la Figura 2 o Figura 3, que comprende las etapas de poner en contacto una poblacion de moleculas con una secuencia de aminoacidos de 238P1B2, permitir que la poblacion de moleculas y la secuencia de aminoacidos de 238P1B2 interaccionen en condiciones que facilitan una interaccion, determinar la presencia de una molecula que interacciona con la secuencia de aminoacidos de 238P1B2 y despues separar las moleculas que no interaccionan con la secuencia de aminoacidos de 238P1B2 de las moleculas que si. El procedimiento puede comprender adicionalmente purificar, caracterizar e identificar una molecula que interacciona con la secuencia de aminoacidos de 238P1B2. La molecula identificada puede usarse para modular una funcion realizada por 238P1B2. La secuencia de aminoacidos de 238P1B2 puede ponerse en contacto con una biblioteca de peptidos.

VII.) Procedimientos de diagnóstico y pronóstico

Como se desvela en el presente documento, pueden usarse polinucleotidos, polipeptidos de 238P1B2, linfocitos T citotoxicos reactivos (CTL), linfocitos T auxiliares reactivos (HTL) y anticuerpos anti-polipeptido en ensayos de diagnostico, pronostico y terapeuticos bien conocidos que examinan las afecciones asociadas con crecimiento

celular desregulado tales como cancer, en particular los canceres enumerados en la Tabla I (vease, por ejemplo, tanto su patron especifico de expresion tisular como su sobreexpresion en ciertos canceres como se describe por ejemplo en el Ejemplo 4).

Puede hacerse una analogia de 238P1B2 con un antigeno asociado a prostata PSA, el marcador arquetipico que se ha usado por los facultativos medicos durante anos para identificar y controlar la presencia de cancer de prostata (vease, por ejemplo, Merrill y col., J. Urol. 163(2): 503-5120 (2000); Polascik y col., J. Urol. Aug; 162(2): 293-306 (1999) y Fortier y col., J. Nat. Cancer Inst. 91(19): 1635-1640(1999)). Tambien se usan diversos otros marcadores de diagnostico en contextos similares incluyendo p53 y K-ras (vease, por ejemplo, Tulchinsky y col., Int J Mol Med 1999 Jul 4(1): 99-102 y Minimoto y col., Cancer Detect Prev 2000; 24(1): 1-12). Por lo tanto, la presente divulgacion de polinucleotidos y polipeptidos de 238P1B2 (asi como sondas polinucleotidicas de 238P1B2 y anticuerpos anti238P1B2 usados para identificar la presencia de estas moleculas) y sus propiedades permite que los expertos en la materia utilicen estas moleculas en procedimientos que son analogos a los usados, por ejemplo, en diversos ensayos de diagnostico dirigidos a examinar las condiciones asociadas con cancer.

Los procedimientos de diagnostico tipicos que usan los polinucleotidos, polipeptidos linfocitos T sensibles a y anticuerpos de 238P1B2, son analogos a los procedimientos de ensayos de diagnostico bien establecidos que emplean, por ejemplo, polinucleotidos, polipeptidos, linfocitos T sensibles a y anticuerpos de PSA. Por ejemplo, igual que los polinucleotidos de PSA se usan como sondas (por ejemplo en analisis de Northern, vease, por ejemplo, Sharief y col., Biochem. Mol. Biol. Int. 33(3): 567-74(1994)) y cebadores (por ejemplo en analisis de PCR, vease, por ejemplo, 0kegawa y col., J. Urol. 163(4): 1189-1190 (2000)) para observar la presencia y/o el nivel de ARNm de PSA en procedimientos de control de la sobreexpresion de PSA o la metastasis de canceres de prostata, los polinucleotidos de 238P1B2 descritos en el presente documento pueden usarse de la misma manera para detectar sobreexpresion de 238P1B2 o la metastasis de prostata y otros canceres que expresan este gen. Como alternativa, igual que los polipeptidos de PSA se usan para generar anticuerpos especificos para PSA que pueden despues usarse para observar la presencia y/o el nivel de proteinas de PSA en procedimientos para controlar la sobreexpresion de proteina de PSA (vease, por ejemplo, Stephan y col., Urology 55(4):560-3 (2000)) o la metastasis de celulas de prostata (vease, por ejemplo, Alanen y col., Pathol. Res. Pract. 192(3):233-7 (1996)), los polipeptidos de 238P1B2 descritos en el presente documento pueden usarse para generar anticuerpos para su uso en la deteccion de sobreexpresion de 238P1B2 o la metastasis de celulas de prostata y celulas de otros canceres que expresan este gen.

Especificamente, debido a que las metastasis implican el movimiento de celulas de cancer de un organo de origen (tal como el pulmon o la glandula prostatica etc.) a un area diferente del cuerpo (tal como un ganglio linfatico), pueden usarse ensayos que examinan una muestra biologica con respecto a la presencia de celulas que expresan polinucleotidos y/o polipeptidos de 238P1B2 para proporcionar pruebas de metastasis. Por ejemplo, cuando se descubre que una muestra biologica de tejido que normalmente no contiene celulas que expresan 238P1B2 (ganglio linfatico) contiene celulas que expresan 238P1B2 tal como la expresion de 238P1B2 vista en LAPC4 y LAPC9, xenotrasplantes aislados de ganglio linfatico y metastasis de hueso, respectivamente, este hallazgo es indicativo de metastasis.

Como alternativa pueden usarse polinucleotidos y/o polipeptidos de 238P1B2 para proporcionar pruebas de cancer, por ejemplo, cuando se descubre que celulas en una muestra biologica que normalmente no expresan 238P1B2 o expresan 238P1B2 a un nivel diferente expresan 238P1B2 o tienen una expresion aumentada de 238P1B2 (vease, por ejemplo, la expresion de 238P1B2 en los canceres enumerados en la Tabla I y en muestras de pacientes etc. mostrados en las Figuras adjuntas). En tales ensayos, los expertos en la materia pueden desear adicionalmente generar pruebas complementarias de metastasis ensayando la muestra biologica con respecto a la presencia de un segundo marcador restringido a tejido (ademas de 238P1B2) tal como PSA, PSCA etc. (vease, por ejemplo, Alanen y col., Pathol. Res. Pract. 192(3): 233-237 (1996)).

Igual que los fragmentos polinucleotidicos y variantes polinucleotidicas de PSA los emplean los expertos en la materia para su uso en procedimientos para controlar PSA, los fragmentos polinucleotidicos y variantes polinucleotidicas de 238P1B2 se usan de una manera analoga. En particular, los polinucleotidos de PSA tipicos usados en procedimientos de control de PSA son sondas o cebadores que consisten en fragmentos de la secuencia de ADNc de PSA. Ilustrando esto, los cebadores usados para amplificar por PCR un polinucleotido de PSA deben incluir menos de la secuencia de PSA completa para actuar en la reaccion en cadena de la polimerasa. En el contexto de tales reacciones de PCR, los expertos en la materia generalmente crean diversos diferentes fragmentos polinucleotidicos que pueden usarse como cebadores para amplificar diferentes partes de un polinucleotido de interes o para optimizar reacciones de amplificacion (vease, por ejemplo, Caetano-Anolles, G. Biotechniques 25(3): 472-476, 478-480 (1998); Robertson y col., Methods Mol. Biol. 98: 121-154 (1998)). Se proporciona una ilustracion adicional del uso de tales fragmentos en el Ejemplo 4, en el que se usa un fragmento polinucleotidico de 238P1B2 como una sonda para mostrar la expresion de ARN de 238P1B2 en celulas cancerosas. Ademas, se usan normalmente secuencias polinucleotidicas variantes como sondas y cebadores para los ARNm correspondientes en analisis de PCR y Northern (vease, por ejemplo, Sawai y col., Fetal Diagn. Ther. 1996 Nov-Dic 11(6): 407-13 y Current Protocols In Molecular Biology, Volumen 2, Unidad 2, Frederick M. Ausubel y col. eds., 1995)). Los fragmentos y variantes polinucleotidicos son utiles en este contexto cuando son capaces de unirse a una secuencia polinucleotidica diana (por ejemplo, un polinucleotido de 238P1B2 mostrado en la Figura 2 o variante del mismo) en

condiciones de alta rigurosidad.

Ademas, los polipeptidos de PSA que contienen un epitopo que puede reconocerse por un anticuerpo o linfocito T que se une especificamente a ese epitopo se usan en procedimientos de control de PSA. Tambien pueden usarse fragmentos polipeptidicos de 238P1B2 y analogos o variantes polipeptidicas de una manera analoga. Esta practica de usar fragmentos polipeptidicos o variantes polipeptidicas para generar anticuerpos (tales como anticuerpos o linfocitos T anti PSA) es tipica en la tecnica usandose una amplia diversidad de sistemas tales como proteinas de fusion por los facultativos (vease, por ejemplo, Current Protocols In Molecular Biology, Volumen 2, Unidad 16, Frederick M. Ausubel y col. eds., 1995). En este contexto, cada epitopo o epitopos actuan para proporcionar la arquitectura con la que un anticuerpo o linfocito T es reactivo. Normalmente, los expertos en la materia crean diversos diferentes fragmentos polipeptidicos que pueden usarse para generar respuestas inmunes especificas para diferentes partes de un polipeptido de interes (vease, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 5.840.501 y Patente de Estados Unidos N° 5.939.533). Por ejemplo puede ser preferible usar un polipeptido que comprende uno de los motivos biologicos de 238P1B2 analizados en el presente documento o una subsecuencia que porta motivo que se identifica facilmente por un experto en la materia basandose en motivos disponibles en la tecnica. Los fragmentos polipeptidicos, variantes o analogos son normalmente utiles en este contexto siempre que comprendan un epitopo capaz de generar un anticuerpo o linfocito T especifico para una secuencia polipeptidica diana (por ejemplo un polipeptido de 238P1B2 mostrado en la Figura 3).

Como se muestra en el presente documento, los polinucleotidos y polipeptidos de 238P1B2 (asi como las sondas polinucleotidicas de 238P1B2 y anticuerpos o linfocitos T anti-238P1B2 usados para identificar la presencia de estas moleculas) muestran propiedades especificas que los hacen utiles en el diagnostico de canceres tales como los enumerados en la Tabla I. Se usan ensayos de diagnostico que miden la presencia de productos genicos de 238P1B2, para evaluar la presencia o aparicion de una enfermedad descrita en el presente documento, tal como cancer de prostata, para identificar pacientes para medidas preventivas o control adicional, como se ha hecho tan exitosamente con PSA. Ademas, estos materiales satisfacen una necesidad de la tecnica de moleculas que tengan caracteristicas similares o complementarias a PSA en situaciones en las que, por ejemplo, no puede realizarse un diagnostico definitivo de metastasis de origen prostatico basandose en un ensayo de PSA solamente (vease, por ejemplo, Alanen y col., Pathol. Res. Pract. 192(3): 233-237 (1996)), y en consecuencia, es necesario emplear materiales tales como polinucleotidos y polipeptidos de 238P1B2 (asi como las sondas polinucleotidicas de 238P1B2 y anticuerpos anti-238P1B2 usados para identificar la presencia de estas moleculas) para confirmar una metastasis de origen prostatico.

Finalmente, ademas de su uso en ensayos de diagnostico, los polinucleotidos de 238P1B2 desvelados en el presente documento tienen varias otras utilidades tales como su uso en la identificacion de anomalias cromosomicas asociadas a oncogenes en la region cromosomica en la que se mapea el gen de 238P1B2 (vease Ejemplo 3 posteriormente). Por otra parte, ademas de su uso en ensayos de diagnostico, las proteinas y polinucleotidos relacionados con 238P1B2 desvelados en el presente documento tiene otras utilidades tales como su uso en analisis forense de tejidos de origen desconocido (vease, por ejemplo, Takahama K Forensic Sci Int 28 de junio de 1996; 80 (1-2): 63-9).

Adicionalmente, pueden usarse proteinas o polinucleotidos relacionados con 238P1B2 descritos en el presente documento para tratar una afeccion patologica caracterizada por la sobreexpresion de 238P1B2. Por ejemplo, la secuencia de aminoacidos o acido nucleico de la Figura 2 o Figura 3, o fragmentos de una de ellas, puede usarse para generar una respuesta inmune a un antigeno de 238P1B2. Pueden usarse anticuerpos u otras moleculas que reaccionan con 238P1B2 para modular la funcion de esta molecula y de este modo proporcionar un beneficio terapeutico.

VIII.) Kits

Para su uso en las aplicaciones de diagnostico y terapeuticas descritas en el presente documento, tambien se describen kits en el presente documento. Tales kits pueden comprender un vehiculo, envase o recipiente que se compartimentaliza para recibir uno o mas recipientes tales como frascos, tubos y similares, comprendiendo cada uno de los recipientes uno de los elementos separados a usar en el procedimiento. Por ejemplo, el recipiente o recipientes pueden comprender una sonda que esta o puede estar marcada de forma detectable. Dicha sonda puede ser un anticuerpo o polinucleotido especifico para una proteina relacionada con 238P1B2 o un gen o mensaje de 238P1B2, respectivamente. Cuando el procedimiento usa hibridacion de acido nucleico para detectar el acido nucleico diana, el kit tambien puede tener recipientes que contienen nucleotido o nucleotidos para amplificacion de la secuencia de acido nucleico diana y/o un recipiente que comprende un medio indicador, tal como una proteina de union a biotina, tal como avidina o estreptavidina, unida a una molecula indicadora, tal como un marcador enzimatico, fluorescencia o radioisotopo. El kit puede incluir toda o parte de la secuencia de aminoacidos de la Figura 2 o Figura 3 o analogos de la misma, o una molecula de acido nucleico que codifique tales secuencias de aminoacidos.

El kit normalmente comprendera el recipiente descrito anteriormente y uno o mas otros recipientes que comprenden materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones para su uso.

Puede estar presente una etiqueta en el recipiente para indicar que la composicion se usa para una terapia o aplicacion no terapeutica especifica y tambien puede indicar instrucciones para uso in vivo o in vitro, tal como los descritos anteriormente. Tambien pueden incluirse instrucciones y/u otra informacion en un prospecto que se incluye con el kit.

Ejemplos:

Diversos aspectos de la invencion se describen adicionalmente y se ilustran por medio de los varios ejemplos que siguen, ninguno de los cuales se pretende que limite el alcance de la invencion.

Ejemplo 1: Aislamiento generado por SSH de un fragmento de ADNc del gen de 238P1B2

El procedimiento de Hibridacion Sustractiva de Supresion (SSH) que usa ADNc derivado de tejidos de cancer de pacientes se usa para aislar genes que se sobreexpresan en cancer. La secuencia de ADNc de SSH de 238P1B2 se derivo de un grupo de cancer de colon sin sustraccion de ADNc de tejido normal. Se incluyeron en el conductor ADNc derivados de 10 tejidos normales. El ADNc de 238P1B2 se identifico como altamente expresado en el grupo de tejido de cancer de prostata, con expresion restringida detectada en tejidos normales.

La secuencia de ADN de SSH de 210 pb (Figura 1) es nueva pero muestra homologia con ARNm del receptor olfatorio de raton M0R14-10. Se aislo un ADNc de 238P1B2, clon de 238P1B2 A, de 3754 pb de biblioteca de ADNc de prostata, revelando una 0RF de 254 aminoacidos (Figura 2, Figura 3 y Figura 4A).

Materiales y procedimientos Tejidos humanos: Los tejidos canceroso y normal del paciente se obtuvieron de distintas fuentes tales como el NDRI (Philadelphia,

PA). Se obtuvo ARNm para algunos tejidos normales de Clontech, Palo Alto, CA. Aislamiento de ARN: Se homogeneizaron tejidos en reactivo de Trizol (Life Technologies, Gibco BRL) usando ARN total aislado de tejido

10 ml/g. Se purifico ARN poli A de ARN total usando kits mini y midi de ARNm 0ligotex de �iagen's. Se cuantificaron el ARNm y total por analisis espectrofotometrico (D.0. 260/280 nm) y se analizaron por electroforesis en gel. 0ligonucleotidos: Se usaron los siguientes oligonucleotidos purificados por HPLC. DPNCDN (cebador de sintesis de ADNc): 5'TTTTGATCAAGCTT303' Adaptador 1: 5'CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAG3' (SEC ID N° 708) 3'GGCCCGTCCTAG5' Adaptador 2:

5’GTAATAGCATCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAG3’ 3’CGGCTCCTAG5’

Cebador de PCR 1: 5'CTAATACGACTCACTATAGGGC3' Cebador anidado (PN) 1: 5'TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGA3' Cebador anidado (PN) 2: 5'AGCGTGGTCGCGGCCGAGGA3' Hibridacion sustractiva de supresion Se uso Hibridacion Sustractiva de Supresion (SSH) para identificar ADNc correspondientes a genes que se

expresan de forma diferencial en cancer. La reaccion de SSH uso ADNc de cancer de colon y tejidos normales.

La secuencia genica de 238P1B2 se derivo de un grupo de cancer de colon sin sustraccion de ADNc de tejido normal. Se identifico la secuencia de ADN de SSH (Figura 1).

El ADNc derivado de un grupo de tejidos normales se uso como la fuente del ADNc "conductor", mientras que el ADNc de un grupo de tejidos de cancer de paciente se uso como la fuente del ADNc "de ensayo". Se sintetizaron ADNc bicatenarios correspondientes a ADNc de ensayo y conductor a partir de 2 μg de ARN poli(A)+ aislado del tejido de xenotrasplante relevante, como se ha descrito anteriormente, usando Kit de Sustraccion de ADNc PCR-Select de CL0NTECH y 1 ng de oligonucleotido DPNCDN como cebador. Se llevo a cabo sintesis de primera y segunda cadena como se describe en el protocolo del manual de usuario del Kit (Protocolo de CL0NTECH N° PT1117-1, N° de Catalogo K1804-1). El ADNc resultante se digirio con Dpn II durante 3 horas a 37 °C. El ADNc digerido se extrajo con fenol/cloroformo (1:1) y se precipito con etanol.

El ADNc conductor se genero combinando en una relacion 1:1 ADNc digerido con Dpn II de la fuente tisular relevante (vease anteriormente) con una mezcla de ADNc digeridos derivados de los nueve tejidos normales: estomago, musculo esqueletico, pulmon, cerebro, higado, rinon, pancreas, intestino delgado y corazon.

Se genero ADNc de ensayo diluyendo 1 μl de ADNc digerido con Dpn II de la fuente tisular relevante (vease anteriormente) (400 ng) en 5 μl de agua. El ADNc diluido (2 μl, 160 ng) se ligo despues con 2 μl de adaptador 1 y adaptador 2 (10 μM), en reacciones de ligacion separadas, en un volumen total de 10 μl a 16 'C durante una noche, usando 400 u de ADN ligasa T4 (CL0NTECH). La ligacion se termino con 1 μl de EDTA 0,2 M y calentamiento a 72 'C durante 5 minutos.

La primera hibridacion se realizo anadiendo 1,5 μl (600 ng) de ADNc conductor a cada uno de dos tubos que contenian 1,5 μl (20 ng) de ADNc de ensayo ligado con adaptador 1 y adaptador 2. En un volumen final de 4 μl, las muestras se superpusieron con aceite mineral, desnaturalizado en un termociclador MJ Research a 98 'C durante 1,5 minutos, y despues se permitio que hibridaran durante 8 horas a 68 °C. Las dos hibridaciones se mezclaron despues juntas con un 1 μl adicional de ADNc conductor desnaturalizado fresco y se permitio que hibridaran durante una noche a 68 °C. La segunda hibridacion se diluyo despues en 200 μl de Hepes 20 mM, pH 8,3, NaCl 50 mM, EDTA 0,2 mM, se calento a 70 °C durante 7 minutos y se almaceno a -20 °C.

Amplificacion por PCR, clonacion y secuenciacion de fragmentos genicos generados de SSH:

Para amplificar fragmentos genicos resultantes de reacciones de SSH, se realizaron dos ampliaciones por PCR. En la reaccion de PCR primaria se anadio 1 μl de la mezcla de hibridacion final diluida a 1 μl de cebador de PCR 1 (10 μM), 0,5 μl de mezcla de dNTP (10 μM), 2,5 μl de tampon de reaccion 10 x (CL0NTECH) y 0,5 μl de mezcla de ADNc polimerasa Advantage 50 x (CL0NTECH) en un volumen final de 25 μl. La PCR 1 se realizo usando las siguientes condiciones: 75 'C durante 5 minutos, 94 'C durante 25 segundos, despues 27 ciclos de 94 'C durante 10 segundos, 66 'C durante 30 segundos, 72 'C durante 1,5 minutos. Se realizaron cinco reacciones de PCR primaria separadas para cada experimento. Los productos se agruparon y diluyeron 1:10 con agua. Para la reaccion de PCR secundaria, se anadio 1 μl de la reaccion de PCR primaria diluida y agrupada a la misma mezcla de reaccion que se uso para PCR 1, excepto que se usaron cebadores NP1 y NP2 (10 μM) en lugar de cebador de PCR 1. La PCR 2 se realizo usando 10-12 ciclos de 94 'C durante 10 segundos, 68 'C durante 30 segundos y 72 'C durante 1, 5 minutos. Los productos PCR se analizaron usando electroforesis en gel de agarosa 2 %.

Los productos de PCR se insertaron en pCR2.1 usando el kit de clonacion de vector T/A (Invitrogen). Las E. coli transformadas se sometieron a seleccion de ampicilina y azul/blanco. Se seleccionaron colonias blancas y se dispusieron en placas de 96 pocillos y se dejaron crecer en cultivo liquido durante una noche. Para identificar insertos, se realizo amplificacion por PCR en 1 ml de cultivo bacteriano usando las condiciones de PCR1 y NP1 y NP2 como cebadores. Los productos de PCR se analizaron usando electroforesis en gel de agarosa 2 %.

Se almacenaron clones bacterianos en glicerol 20 % en un formato de 96 pocillos. Se preparo ADN plasmidico, se secuencio y se sometio a busquedas de homologia de acidos nucleicos de las bases de datos GenBank, dBest y NCI-CGAP.

Analisis de expresion de RT-PCR:

Puede generarse ADNc de primera cadena de 1 μg de ARNm con cebador oligo (dT) 12-18 usando el sistema de preamplificacion Gibco-BRL Superscript. Se uso el protocolo del fabricante que incluia una incubacion durante 50 minutos a 42 'C con transcriptasa inversa seguido de tratamiento con ARNasa H a 37 'C durante 20 minutos. Despues de completar la reaccion, el volumen puede aumentarse a 200 μl con agua antes de normalizacion. Puede obtenerse ADNc de primera cadena de 16 tejidos humanos normales diferentes de Clontech.

Se realizo la normalizacion de los ADNc de primera cadena de multiples tejidos usando los cebadores 5'atatcgccgcgctcgtcgtcgacaa3' y 5'agccacacgcagctcattgtagaagg 3' para amplificar β-actina. Se amplificaron ADNc de primera cadena (5 μl) en un volumen total de 50 μl que contenia cebadores 0,4 μM, dNTP cada uno 0,2 μM, tampon de PCR 1X (Clontech, Tris-HCL 10 mM, MgCl2 1,5 mM, KCl 50 mM, pH 8.3) y ADN polimerasa Klentaq 1X (Clontech). Pueden retirarse 5 μl de la reaccion de PCR a los 18, 20 y 22 ciclos y usarse para electroforesis en gel

de agarosa. Se realizo PCR usando un termociclador MJ Research en las siguientes condiciones: la desnaturalizacion inicial puede ser a 94 'C durante 15 segundos, seguido de 18, 20 y 22 ciclos de 94 'C durante 15, 65 'C durante 2 minutos, 72 'C durante 5 segundos. Se llevo a cabo una extension final a 72 'C durante 2 minutos. Despues de electroforesis en gel de agarosa, las intensidades de banda de las bandas de β-actina de 283 p.b. de multiples tejidos se compararon por inspeccion visual. Se calcularon los factores de dilucion para los ADNc de primera cadena para dar como resultado intensidades de banda de β-actina iguales en todos los tejidos despues de 22 ciclos de PCR. Pueden requerirse tres rondas de normalizacion para conseguir intensidades de banda iguales en todos los tejidos despues de 22 ciclos de PCR.

Para determinar los niveles de expresion del gen 238P1B2, se analizaron 5 μl de ADNc de primera cadena normalizado por PCR usando 26 y 30 ciclos de amplificacion. Puede conseguirse analisis de expresion semicuantitativa comparando los productos de PCR en los numeros de ciclos que dan intensidades de banda claras. Los cebadores usados para RT-PCR se disenaron usando la secuencia de SSH de 238P1B2 y se enumeran a continuacion:

238P1B2.1

5'-TTGCAGAATATCACCTCCACTTCC -3'

238P1B2.2

5'-GATCAGGCTGTTTCCCAAGAGAG -3'

Se muestra un analisis de expresion de RT-PCR tipico en la Figura 14. Se realizo analisis de expresion de RT-PCR en ADNc de primera cadena generados usando grupos de tejidos de multiples muestras. Se mostro que los ADNc se normalizaban usando PCR de beta-actina. Los resultados muestran expresion fuerte de 238P1B2 en grupo de cancer de prostata pero no en grupo vital 1 y grupo vital 2.

Ejemplo 2: Clonación de longitud completa de 238P1B2

La secuencia de ADNc de SSH de 238P1B2 derivo de un grupo de cancer de colon sin sustraccion de ADNc de tejido normal. La secuencia de ADNc de SSH (Figura 1) se designo 238P1B2.

La secuencia de ADN de SSH de 210 pb (Figura 1) es nueva y muestra 91 % de identidad con ARNm del receptor olfatorio de raton M0R14-10.

Se aislo un ADNc de longitud completa (clon de 238P1B2 A) de 3754 pb de biblioteca de prostata, revelando una 0RF de 254 aminoacidos (Figuras 2 y 3). El ADNc muestra mayor homologia con los receptores olfatorios M0R-141 y M0R14-10 de raton, con identidades de 85 % sobre 912 nucleotidos y 83 % sobre 906 nucleotidos respectivamente (Figura 4).

La secuencia proteica revela 7 dominios transmembrana y tiene homologia con receptores acoplados a proteina G (GPCR) implicados en la olfaccion (Raming y col., 1993, Nature 361:353; Malnic y col., 1999, Cell 96:713). Las proteinas que son miembros de esta familia de receptores muestran un extremo amino terminal extracelular, tres bucles extracelulares adicionales, tres bucles intracelulares y un extremo carboxilo terminal intracelular.

La secuencia mas homologa con 238P1B2 es la proteina M0R14-1 de raton. Las dos proteinas comparten 83 % de identidad sobre una region de 253 aminoacidos. El alineamiento de las dos proteinas se muestra en la Figura 4.

238P1B2 tambien muestra homologia significativa con el GPCR especifico de prostata, PH0R-1. Las dos proteinas comparten 48 % de identidad sobre una region de 250 aminoacidos (Figura 4).

El ADNc de 238P1B2 de longitud completa (clon de 238P1B2 A) se deposito en la Coleccion Americana de Cultivos Tipo el 7 de marzo de 2002 y se le asigno el numero de acceso PTA-4124.

La secuencia proteica de 238P1B2 v.1A codifica una proteina de seis transmembranas. La extension de la proteina en el extremo amino terminal anade otros 62 aminoacidos a 238P1B2 v.1A que conducen a 238P1B2 v.1B. Este extremo de 62 aminoacidos de 238P1B2 v.1B codifica una region transmembrana adicional y de este modo hace a 238P1B2 v.1B una proteina de siete transmembranas. Ademas, este extremo amino terminal muestra 84 % de identidad con el receptor de proteina acoplado a G M0R14-10 de raton, lo que indica que esta parte amino terminal esta codificada en la naturaleza.

La expresion natural de 238P1B2 v.1B puede producirse si el sitio de parada cadena arriba de la extension de 62 aminoacidos se modifica por sustitucion de acido nucleico sencilla que conduce a conversion del codon de parada a un aminoacido codificante. Pueden existir polimorfismos dentro de diferentes tejidos o entre diferentes individuos que mutan el codon de parada y permitiendo de este modo la traduccion apropiada de la region amino terminal de 62 aminoacidos de 238P1B2 v.1B. Una variacion tal puede anadir una metionina de partida directamente o extender la region codificante de 238P1B2 v.1B 16 aminoacidos adicionales hasta alcanzar una metionina de partida en la posicion de acido nucleico 1896.

Ejemplo 3: Mapeo cromosómico del gen de 238P1B2

La localizacion cromosomica puede implicar genes en patogenesis de enfermedad. Estan disponibles varios enfoques de mapeo de cromosomas incluyendo hibridacion fluorescente in situ (FISH), paneles de hibrido de radiacion humano/hamster (RH) (Walter y col., 1994; Nature Genetics 7:22; Research Genetics, Huntsville Al), paneles de hibrido celular somatico de humano-roedor tales como estan disponible del Instituto Coriell (Camden, New Jersey), y visores genomicos que usan homologias de BLAST para clones genomicos secuenciados y mapeados (NCBI, Bethesda, Maryland).

Usando la secuencia de 238P1B2 y la herramienta BLAST de NCBI: (vease la direccion Web www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/page.cgi?F=HsBlast.html&&0RG=Hs), se situo el 238P1B2 en el cromosoma 11p15.5, una region rica en GPCR.

Debido a que el gen de 238P1B2 humano se mapea en el cromosoma 11p15.5, pueden usarse polinucleotidos que codifican diferentes regiones de la proteina 238P1B2 para caracterizar anomalias citogeneticas en el cromosoma 11, banda p15.5 que se han identificado como asociadas con diversos canceres. En particular, se han identificado diversas anomalias cromosomicas en 11p15.5 como anomalias citogeneticas frecuentes en varios canceres diferentes (vease, por ejemplo, Lai y col., 2000, Clin. Cancer Res. 6(8):3172-6; 0ya y Schulz, 2000, Br. J. Cancer 83(5):626-31; Svaren y col., Sept. 12, 2000, J. Biol. Chem). En consecuencia, los polinucleotidos que codifican regiones especificas de la proteina 238P1B2 proporcionan nuevas herramientas que pueden usarse para delinear, con mayor precision de lo que era posible previamente, la naturaleza especifica de las anomalias citogeneticas en esta region del cromosoma 11 que contribuye al fenotipo maligno. En este contexto, estos polinucleotidos satisfacen una necesidad en la tecnica para expandir la sensibilidad de exploracion cromosomica para identificar anomalias cromosomicas mas sutiles y menos habituales (vease, por ejemplo, Evans y col., 1994, Am J. 0bstet. Gynecol. 171 (4): 1055-1057).

Ejemplo 4: Análisis de expresión de 238P1B2 en tejidos normales y muestras de ensayo de pacientes

El analisis de expresion por RT-PCR demostro que 238P1B2 se expresa fuertemente en muestras de ensayo de pacientes con cancer de prostata (Figura 14). Se preparo ADNc de primera cadena del grupo vital 1 (higado, pulmon y rinon), grupo vital 2 (pancreas, colon y estomago) y grupo de cancer de prostata. Se realizo normalizacion por PCR usando cebadores para actina y GAPDH. Se realizo PCR semicuantitativa, usando cebadores para 238P1B2 a 26 y 30 ciclos de amplificacion. Los resultados muestran fuerte expresion de 238P1B2 en grupo de cancer de prostata pero no en grupo vital 1 y grupo vital 2.

Se muestra analisis de transferencia de Northern de 238P1B2 en 16 tejidos normales humanos en la Figura 15. Los resultados muestran la ausencia de expresion de 238P1B2 en los 16 tejidos normales ensayados. El analisis exhaustivo de la expresion de 238P1B2 en 76 tejidos humanos muestra expresion restringida de 238P1B2 en placenta (Figura 16).

La expresion de 238P1B2 en muestras de ensayo de cancer de paciente y tejidos normales humanos se muestra en la Figura 17. Se extrajo ARN de un grupo de tres canceres de prostata, asi como de prostata normal (PN), vejiga normal (VN), rinon normal (RN), colon normal (CN), pulmonar normal (PuN), mama normal (MN) y ovario normal (0N). La transferencia de Northern con 10 μg de ARN total/carril se exploro con secuencia de 238P1B2. Los resultados muestran expresion de un transcrito de 238P1B2 de aproximadamente 4,5 kb en el grupo de cancer de prostata y ovario pero no en los otros tejidos normales ensayados. El analisis de muestras de ensayo de pacientes individuales muestra expresion fuerte de 238P1B2 en tejidos de cancer de prostata (Figura 18). La expresion para 238P1B2 detectada en tumores de puntuacion de Gleason 7 es significativamente mas fuerte que la expresion detectada en tumores de puntuacion de Gleason 5. Este resultado indica que 238P1B2 puede usarse como un marcador de pronostico para cancer de prostata.

La expresion restringida de 238P1B2 en tejidos normales y la expresion detectada en cancer de prostata sugiere que 238P1B2 es una diana terapeutica potencial y un marcador de diagnostico para canceres humanos.

Ejemplo 5: Variantes de transcrito de 238P1B2

Las variantes de transcrito son variantes de ARNm maduro del mismo gen por transcripcion alternativa o corte y empalme alternativo. Los transcritos alternativos son transcritos del mismo gen que comienza la transcripcion en puntos diferentes. Las variantes de corte y empalme son variantes de ARNm con corte y empalme diferente del mismo transcrito en eucariotas, cuando se transcribe un gen multiexonico de ADN genomico, el ARN inicial se corta y empalma para producir ARNm funcional, que solamente tiene exones y se usa para traduccion en una secuencia de aminoacidos. En consecuencia, un gen dado puede tener de cero a muchos transcritos alternativos y cada transcrito puede tener de cero a muchas variantes de corte y empalme. Cada variante de transcrito tiene una composicion exonica unica y puede tener diferentes partes codificantes y/o no codificantes (extremo 5' o 3'), del transcrito original. Las variantes de transcrito pueden codificar proteinas similares o diferentes con la misma o similar funcion o pueden codificar proteinas con diferentes funciones y pueden expresarse en el mismo tejido al mismo tiempo o en diferentes tejidos al mismo tiempo o en el mismo tejido a diferentes tiempos o en diferentes tejidos a diferentes tiempos. Las proteinas codificadas por variantes de transcrito pueden tener localizaciones celulares o

extracelulares similares o diferentes, por ejemplo, secretadas frente a intracelulares.

Se identifican variantes de transcrito por diversos procedimientos aceptados en la tecnica. Por ejemplo, se identifican transcritos alternativos y variantes de corte y empalme por experimentos de clonacion de longitud completa o mediante el uso de secuencias de EST y transcrito de longitud completa. En primer lugar, todas las EST humanas se agruparon en grupos que muestran identidad directa o indirecta entre si. En segundo lugar, las EST en el mismo grupo se agruparon adicionalmente en subgrupos y se ordenaron en una secuencia consenso. La secuencia del gen original se compara con la secuencia o secuencias consenso u otras secuencias de longitud completa. Cada secuencia consenso es una variante de corte y empalme potencial para ese gen (vease, por ejemplo, la direccion Web www.doubletwist.com/products/c11 agents0verview.jhtml). Incluso cuando se identifica una variante que no es un clon de longitud completa, esa parte de la variante es muy util para generacion de antigenos y para clonacion adicional de la variante de corte y empalme de longitud completa, usando tecnicas conocidas en la materia.

Ademas, estan disponibles programas informaticos en la tecnica para identificar variantes de transcrito basandose en secuencias genomicas. Los programas de identificacion de variantes de transcrito basados en genoma incluyen FgenesH (A. Salamov y V. Solovyev, "Ab initio gene finding in Drosophila genomic DNA", Genome Research. Abril de 2000; 10(4):516-22); Grail (direccion Web compbio.ornl.gov/Grail-binlEmptyGrailForm) y GenScan (direccionWeb genes.mit.edu/GENSCAN.html). Para un analisis general de protocolos de identificacion de variantes de corte y empalme vease, por ejemplo, Southan, C., A genomic perspective on human proteases, FEBS Lett. 8 de junio de 2001; 498(2-3):214-8; de Souza, S.J., y col., Identification of human chromosome 22 transcribed sequences with 0RF expressed sequence tags, Proc. Natl Acad Sci U S A. 7 de noviembre de 2000; 97(23):12690-3.

Para confirmar adicionalmente los parametros de una variante de transcrito, estan disponibles diversas tecnicas en la materia, tales como clonacion de longitud completa, validacion proteomica, validacion basada en PCR y validacion de RACE 5', etc. (vease por ejemplo, Validacion Proteomica: Brennan, S.0., y col., Albumin banks peninsula: a new termination variant characterized by electrospray mass spectrometry, Biochem Biophys Acta. 17 de agosto de 1999;1433(1-2):321-6; Ferranti P, y col., Differential splicing of premessenger RNA produces multiple forms of mature caprine alpha(s1)-casein, Eur J Biochem. 1 de octubre de 1997;249(1):1-7. Para validacion basada en PCR: Wellmann S, y col, Specific reverse transcription-PCR quantification of vascular endothelial growth factor (VEGF) splice variants by LightCycler technology, Clin Chem. Abril de 2001;47(4):654-60; Jia, H.P., y col, Discovery of new human beta-defensins using a genomics-based approach, Gene. 24 de enero de 2001; 263(1-2):211-8. Para validacion de RACE 5' y basada en PCR: Brigle, K.E., y col, 0rganization of the murine reduced folate carrier gene and identification of variant splice forms, Biochem Biophys Acta. 7 de agosto de 1997; 1353(2): 191-8).

Se sabe en la tecnica que las regiones genomicas estan moduladas en los canceres. Cuando la region genomica en la que se mapea un gen esta modulada en un cancer particular, las variantes de corte y empalme o transcritos alternativos del gen se modulan tambien. Se desvela en el presente documento que 238P1B2 tiene un perfil de expresion particular. Las variantes de transcritos y corte y empalme alternativos de 238P1B2 pueden compartir este patron de expresion, sirviendo de este modo como marcadores/antigenos asociados a tumor.

La composicion exonica de transcrito original, designado 238P1B2 v.1, se muestra en la tabla XXIII. No se ha identificado variante de transcrito por los procedimientos anteriores.

Ejemplo 6: Polimorfismos de nucleótido sencillo de 238P1B2

Un polimorfismo de nucleotido sencillo (SNP) es una variacion de par de bases sencillo en una secuencia de nucleotidos en una localizacion especifica. En cualquier punto dado del genoma, existen cuatro posibles pares de bases de nucleotidos: A/T, C/G, G/C y T/A. El genotipo se refiere a la secuencia de pares de bases especifica de una o mas localizaciones en el genoma de un individuo. El haplotipo se refiere a la secuencia de pares de bases de mas de una localizacion en la misma molecula de ADN (o el mismo cromosoma en organismos superiores), con frecuencia en el contexto de un gen o en el contexto de varios genes ligados de forma estrecha. Los SNP que se producen en un ADNc se denominan cSNP. Estos cSNP pueden cambiar aminoacidos de la proteina codificada por el gen y cambiar de este modo las funciones de la proteina. Algunos SNP provocan enfermedades heredadas; otros contribuyen a variaciones cuantitativas en el fenotipo y reacciones a factores ambientales incluyendo dieta y farmacos entre los individuos. Por lo tanto, los SNP y/o combinaciones de alelos (denominados haplotipos) tienen muchas aplicaciones, incluyendo diagnostico de enfermedades heredadas, determinacion de reacciones a farmacos y dosificacion, identificacion de genes responsables de enfermedades y analisis de la relacion genetica entre los individuos (P. Nowotny, J. M. Kwon y A. M. Goate, " SNP analysis to dissect human traits," Curr. 0pin. Neurobiol. 0ctubre de 2001; 11(5):637-641; M. Pirmohamed y B. K. Park, "Genetic susceptibility to adverse drug reactions," Trends Pharmacol. Sci. Junio de 2001; 22(6):298-305; J. H. Riley, C. J. Allan, E. Lai y A. Roses, " The use of single nucleotide polymorphisms in the isolation of common disease genes," Pharmacogenomics. Febrero de 2000; 1(1):3947; R. Judson, J. C. Stephens y A. Windemuth, "The predictive power of haplotypes in clinical response," Pharmacogenomics. Febrero de 2000; 1(1):15-26).

Los SNP se identifican mediante diversos procedimientos aceptados en la tecnica (P. Bean, "The promising voyage of SNP target discovery," Am. Clin. Lab. 0ctubre-noviembre de 2001; 20(9):18-20; K. M. Weiss, "In search of human

variation," Genome Res. Julio de 1998; 8(7):691-697; M. M. She, "Enabling large-scale pharmacogenetic studies by high-throughput mutation detection and genotyping technologies," Clin. Chem. Febrero de 2001; 47(2):164-172). Por ejemplo, se identifican SNP secuenciando fragmentos de ADN que muestran polimorfismo por procedimientos basados en gel tales como polimorfismo de longitud de fragmento de restriccion (RFLP) y electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE). Tambien pueden descubrirse por secuenciacion directa de muestras de ADN agrupadas de diferentes individuos o comparando secuencias de diferentes muestras de ADN. Con la rapida acumulacion de datos de secuencias en las bases de datos publicas y privadas, pueden descubrirse SNP comparando secuencias usando programas informaticos (�. Gu, L. Hillier y P. .. Kwok, "Single nucleotide polymorphism hunting in cyberspace" Hum. Mutat 1998; 12(4):221-225). Los SNP puede verificarse y puede determinarse el genotipo o haplotipo de un individuo por diversos procedimientos incluyendo secuenciacion directa y microseries de alto rendimiento (P. .. Kwok, "Methods for genotyping single nucleotide polymorphisms," Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2001; 2:235-258; M. Kokoris, K. Dix, K. Moynihan, J. Mathis, B. Erwin, P. Grass, B. Hines y

A. Duesterhoeft, "High-throughput SNP genotyping with the Masscode system," Mol. Diagn. Diciembre de 2000; 5(4):329-340).

Se identifican SNP de 238P1B2 por secuenciacion directa de los clones de ADNc y por comparacion de esas secuencias con secuencias publicas y patentadas. Comparando las secuencias con secuencias publicas o patentadas de alta calidad (por ejemplo, NCBI/GenBank, accesibles en la direccion Web www.ncbi.n1m.nih.gov), se identificaron cinco SNP de 238P1B2 en las posiciones de nucleotidos 274 (T/C), 1268 (T/G), 1299 (T/G), 2806 (T/C) y 3025 (T/C). Los transcritos o proteinas con alelos alternativos se designaron como variantes de 238P1B2 v.2, v.3, v.4, v.5 y v.6. La Figura 10 muestra el alineamiento esquematico de las variantes de nucleotidos. La Figura 11 muestra el alineamiento esquematico de variantes de proteina, correspondientes a variantes de nucleotidos. Las variantes de nucleotidos que codifican la misma secuencia de aminoacidos como variante 1 no se muestran en la Figura 11. Estos alelos de los SNP, aunque se muestran aqui de forma separada, pueden aparecer en diferentes combinaciones (haplotipos).

Ejemplo 7: Producción de 238P1B2 recombinante en sistemas procariotas

Para expresar 238P1B2 recombinante en celulas procariotas, se clonan las secuencias de ADNc de longitud parcial

: o completa de 238P1B2 variante 1a, variante 1b y variante 2 en uno cualquiera de diversos vectores de expresion conocidos en la tecnica. Una o mas de las siguientes regiones de variantes de 238P1B2 se expresan en estas construcciones: aminoacidos 1 a 254 de la variante 1a; aminoacidos 1 a 316 de la variante 1b y aminoacidos 1-254 de la variante 2 o cualesquiera 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 o mas aminoacidos contiguos de 238P1B2, variantes o analogos de la misma.

A.: Construcciones de transcripcion y traduccion in vitro:

pCRII: para generar sondas de ARN sentido y antisentido de 238P1B2 para investigaciones de ARN in situ, se generan construcciones de pCRII (Invitrogen, Carlsbad CA) codificando todo o fragmentos del ADNc de 238P1B2. El vector pCRII tiene los promotores Sp6 y T7 flanqueando el inserto para conducir la transcripcion de ARN de 238P1B2 para su uso como sondas en experimentos de hibridacion de ARN in situ. Estas sondas se usan para analizar la expresion celular y tisular de 238P1B2 al nivel de ARN. Se usa ARN de 238P1B2 transcrito que representa la region codificante de aminoacidos de ADN del gen de 238P1B2 en sistemas de traduccion in vitro tales como el sistema de reticulolisado acoplado TnT™ (Promega, Corp., Madison, WI) para sintetizar proteina 238P1B2.

B. Construcciones Bacterianas:

Construcciones de pGEX: para generar proteinas 238P1B2 recombinantes en bacterias que se fusionan con la proteina glutation proteina glutation S-transferasa (GST); se fusiona toda o partes de la secuencia codificante de proteina de ADNc de 238P1B2 con el gen de GST clonando en pGEX-6P-1 o cualquier otro vector de fusion de GST de la familia pGEX (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Estas construcciones permiten la expresion controlada de secuencias proteicas de 238P1B2 recombinantes con GST fusionada en el extremo amino terminal y un epitopo de seis histidinas (6X His) en el extremo carboxilo terminal. Los marcadores de GST y 6X His permiten la purificacion de la proteina de fusion recombinante de bacterias inducidas con la matriz de afinidad apropiada y permiten el reconocimiento de la proteina de fusion con anticuerpos anti-GST y anti-His. El marcador de 6X His se genera anadiendo 6 codones de histidina al cebador de clonacion en el extremo 3', por ejemplo, del marco de lectura abierto (0RF). Puede emplearse un sitio de escision proteolitica, tal como el sitio de reconocimiento de PreScission™ en pGEX-6P-1, para permitir la escision del marcador de GST de proteina relacionada con 238P1B2. El gen de resistencia a ampicilina y origen de pBR322 permite la seleccion y mantenimiento de los plasmidos pGEX en E. coli.

Construcciones de pMAL: para generar, en bacterias, proteinas 238P1B2 recombinantes que se fusionan con proteina de union a maltosa (MBP), toda o partes de la secuencia codificante de proteina de ADNc de 238P1B2 se fusiona con el gen de MBP clonando en los vectores pMAL-c2X y pMAL-p2X (New England Biolabs, Beverly, MA). Estas construcciones permiten la expresion controlada de secuencias proteicas de 238P1B2 recombinantes con MBP fusionada en el extremo amino terminal y un marcador epitopico de 6X His en el extremo carboxilo terminal.

Los marcadores MBP y 6X His permiten la purificacion de la proteina recombinante de bacterias inducidas con la matriz de afinidad apropiada y permiten el reconocimiento de la proteina de fusion con anticuerpos anti-BMP y anti-His. El marcador epitopico de 6X His se genera anadiendo 6 codones de histidina al cebador de clonacion 3'. Un sitio de reconocimiento de factor Xa permite la escision del marcador de pMAL de 238P1B2. Los vectores pMAL-c2X y pMAL-p2X se optimizan para expresar la proteina recombinante en el citoplasma o periplasma respectivamente. La expresion del periplasma potencia el plegamiento de proteinas con enlaces disulfuro.

Construcciones de pET: para expresar 238P1B2 en celulas bacterianas, toda o partes de la secuencia codificante de proteinas de ADNc de 238P1B2 se clona en la familia de pET de vectores (Novagen, Madison, WI). Estos vectores permiten expresion estrechamente controlada de proteina 238P1B2 recombinante en bacterias con y sin fusion con proteinas que potencian la solubilidad, tales como NusA y tiorredoxina (Trx), y marcadores epitopicos, tales como 6X His y S-Tag™ que ayudan a la purificacion y deteccion de la proteina recombinante. Por ejemplo, se realizan construcciones usando el sistema de fusion de pET NusA 43.1 de modo que se expresen regiones de la proteina 238P1B2 como fusiones amino terminales con NusA. Se expreso una proteina de fusion ANusA que abarcaba los aminoacidos 412-254 de 238P1B2 con un marcador 6x His C-terminal en E. coli, se purifico por cromatografia de afinidad de quelado metalico y se uso como un inmunogeno para generacion de anticuerpos.

C. Construcciones de levadura:

Construcciones de pESC: para expresar 238P1B2 en la especie de levadura Saccharomyces cerevisiae para generacion de proteina recombinante y estudios funcionales, toda o partes de la secuencia codificante de proteina de ADNc de 238P1B2 se clona en la familia pESC de vectores cada uno de los cuales contiene 1 de 4 marcadores seleccionables, HIS3, TRP1, LEU2 y URA3 (Stratagene, La Jolla, CA). Estos vectores permiten la expresion controlada del mismo plasmido de hasta 2 genes diferentes o secuencias clonadas que contienen marcadores epitopicos Flag™ o Myc en la misma celula de levadura. Este sistema es util para confirmar interacciones proteinaproteina de 238P1B2. Ademas, la expresion en levadura produce modificaciones post-traduccionales similares, tales como glucosilaciones y fosforilaciones, que se encuentran cuando se expresan en celulas eucariotas.

Construcciones de pESP: para expresar 238P1B2 en la especie de levaduras Saccharomyces pombe, toda o partes de la secuencia codificante de proteina de ADNc de 238P1B2 se clona en la familia pESP de vectores. Estos vectores permiten alto nivel de expresion controlada de una secuencia proteica de 238P1B2 que se fusiona en el extremo amino terminal o en el extremo carboxilo terminal con GST que ayuda a la purificacion de la proteina recombinante. Un marcador epitopico Flag™ permite la deteccion de la proteina recombinante con un anticuerpo anti-Flag™.

Ejemplo 8: Producción de 238P1B2 recombinante en sistemas eucariotas

A. Construcciones de mamíferos

Para expresar 238P1B2 recombinante en celulas eucariotas, las secuencias de longitud completa o parcial de ADNc de 238P1B2 pueden clonarse en uno cualquiera de diversos vectores de expresion conocidos en la tecnica. Se expresa una o mas de las siguientes regiones de 238P1B2 en estas construcciones: aminoacidos 1 a 254 de variante 1A o variante 2, aminoacidos 1 a 316 de variante 1B, o cualesquiera 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 o mas aminoacidos contiguos de 238P1B2, variantes, o analogos de la misma. Se expresa una region de una variante especifica de 238P1B2 que codifica un aminoacido en posicion especifica que difiere del aminoacido de cualquier otra variante hallado en esa posicion. Como alternativa, se expresa una region de una variante de 238P1B2 que queda parcial o completamente dentro de una secuencia que es unica de esa variante.

Las construcciones pueden transfectarse en una cualquiera de diversas celulas de mamifero tales como celulas 293T. Los lisados de celulas 293T transfectadas pueden explorarse con el suero policlonal anti-238P1B2, descrito en el presente documento.

Construcciones pcDNA4/HisMax: para expresar 238P1B2 en celulas de mamifero, se clona una 0RF de 238P1B2, o partes de la misma, de 238P1B2 en pcDNA4/HisMax Version A (Invitrogen, Carlsbad, CA). La expresion proteica se conduce desde el promotor de citomegalovirus (CMV) y el potenciador traduccional SP16. La proteina recombinante tiene epitopos Xpress™ y seis histidinas (6X His) fusionados con el extremo amino terminal. El vector pcDNA4/HisMax tambien contiene la senal de poliadenilacion y secuencia de terminacion de la transcripcion de la hormona del crecimiento bovina (BGH) para potenciar la estabilidad de ARNm junto con el origen de SV40 para replicacion episomal y rescate de vector sencillo en lineas celulares que expresan el antigeno T grande. El gen de resistencia a zeocina permite la seleccion de celulas de mamifero que expresan la proteina y el gen de resistencia a ampicilina y el origen ColE1 permite la seleccion y mantenimiento del plasmido en E. coli.

Construcciones pcDNA3.1/MycHis: para expresar 238P1B2 en celulas de mamifero, se clona una 0RF de 238P1B2, o partes de la misma, de 238P1B2 con un sitio de inicio de la traduccion de Kozak consenso en pcDNA3.1/MycHis Version A (Invitrogen, Carlsbad, CA). La expresion proteica se conduce desde el promotor de citomegalovirus (CMV). Las proteinas recombinantes tienen el epitopo myc y el epitopo 6X His fusionados en el

extremo carboxilo terminal. El vector pcDNA3.1/MycHis tambien contiene la senal de poliadenilacion y secuencia de terminacion de la transcripcion de la hormona de crecimiento bovina (BGH) para potenciar la estabilidad de ARNm, junto con el origen de SV40 para replicacion episomal y rescate de vector sencillo en lineas celulares que expresan el antigeno T grande. El gen de resistencia a neomicina puede usarse, puesto que permite la seleccion de celulas de mamifero que expresan la proteina y el gen de resistencia a ampicilina y el origen ColE1 permite la seleccion y mantenimiento del plasmido en E. coli.

Construcción pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO: para expresar 238P1B2 en celulas de mamifero y permitir la deteccion de las proteinas recombinantes usando fluorescencia, una 0RF 238P1B2, o partes de la misma, con un sitio de inicio de la traduccion de Kozak consenso se clonan en pcDNA3.1/CT-GFP-T0P0 (Invitrogen, CA). La expresion proteica se conduce desde el promotor de citomegalovirus (CMV). Las proteinas recombinantes tienen la proteina verde fluorescente (GFP) fusionada con el extremo carboxilo terminal que facilita la deteccion no invasiva in vivo y estudios de biologia celular. El vector pcDNA3.1CT-GFP-T0P0 tambien contiene la senal de poliadenilacion y secuencia de terminacion de la transcripcion de la hormona de crecimiento bovina (BGH) para potenciar la estabilidad de ARNm junto con el origen de SV40 para replicacion episomal y rescate de vector sencillo en lineas celulares que expresan el antigeno T grande. El gen de resistencia a neomicina permite la seleccion de celulas de mamifero que expresan la proteina y el gen de resistencia a ampicilina y origen ColE1 permiten la seleccion y mantenimiento del plasmido en

E. coli. Se realizan construcciones adicionales con una fusion de GFP amino terminal en pcDNA3.1/NT-GFP-T0P0 que abarca la longitud completa de una proteina 238P1B2.

PAPtag: una 0RF de 238P1B2, o partes de la misma, se clona en pAPtag-5 (GenHunter Cop. Nashville, TN). Esta construccion genera una fusion de fosfatasa alcalina en el extremo carboxilo terminal de la proteina 238P1B2 fusionando a la vez la secuencia senal de IgGk con el extremo amino terminal. Tambien se generan construcciones en las que se fusiona fosfatasa alcalina con una secuencia senal de IgGκ amino terminal con el extremo amino terminal de una proteina 238P1B2. Las proteinas 238P1B2 recombinantes resultantes se optimizan para secrecion al medio de celulas de mamifero transfectadas y pueden usarse para identificar proteinas tales como ligandos o receptores que interaccionan con proteinas 238P1B2. La expresion de proteinas se conduce desde el promotor de CMV y las proteinas recombinantes tambien contienen epitopos myc y 6X His fusionados en el extremo carboxilo terminal que facilitan la deteccion y purificacion. El gen de resistencia a zeocina presente en el vector permite la seleccion de celulas de mamifero que expresan la proteina recombinante y el gen de resistencia a ampicilina permite la seleccion del plasmido en E. coli.

ptag5: Una 0RF de 238P1B2, o partes de la misma, se clona en pTag-5. Este vector es similar a pAPtag pero sin la fusion de fosfatasa alcalina. Esta construccion genera proteina 238P1B2 con una secuencia senal de IgGκ amino terminal y marcadores epitopicos myc y 6X His en el extremo carboxilo terminal que facilitan la deteccion y purificacion de afinidad. La proteina 238P1B2 recombinante resultante se optimiza para secrecion al medio de celulas de mamifero transfectadas y se usa como inmunogeno o ligando para identificar proteinas tales como ligandos o receptores que interaccionan con las proteinas 238P1B2. La expresion proteica se conduce desde el promotor de CMV. El gen de resistencia a zeocina presente en el vector permite la seleccion de celulas de mamifero que expresan la proteina y el gen de resistencia a ampicilina permite la seleccion del plasmido en E. coli.

PsecFc: Una 0RF de 238P1B2, o partes de la misma, tambien se clona en psecFc. El vector psecFc se ensamblo clonando el Fc de inmunoglobulina G1 (IgG) humana (regiones bisagra, CH2, CH3) en pSecTag2 (Invitrogen, California). Esta construccion genera una fusion de Fc de IgG1 en el extremo carboxilo terminal de las proteinas 238P1B2, fusionando a la vez la secuencia senal de IgGK en el extremo N-terminal. Tambien se usan fusiones de 238P1B2 que usan la region Fc de IgG1 murina. Las proteinas 238P1B2 recombinantes resultantes se optimizan para secrecion al medio de celulas de mamifero transfectadas y pueden usarse como inmunogenos o para identificar proteinas tales como ligandos o receptores que interaccionan con proteina 238P1B2. La expresion proteica se conduce desde el promotor de CMV. El gen de resistencia a higromicina presente en el vector permite la seleccion de celulas de mamifero que expresan la proteina recombinante y el gen de resistencia a ampicilina permite la seleccion del plasmido en E. coli.

Construcciones de pSR : para generar lineas celulares de mamifero que expresen 238P1B2 de forma constitutiva, se clonaron 0RF de 238P1B2, o partes de la misma, de 238P1B2 en construcciones pSRa. Se generan retrovirus anfotropicos y ecotropicos por transfeccion de construcciones pSRα en la linea de empaquetamiento 293T-10A1 o co-transfeccion de pSRa y un plasmido auxiliar (que contiene secuencias de empaquetamiento suprimidas) en las celulas 293, respectivamente. El retrovirus se usa para infectar diversas lineas celulares de mamifero, dando como resultado la integracion del gen clonado, 238P1B2, en las lineas celulares huesped. La expresion proteica se conduce desde una repeticion terminal larga (LTR). El gen de resistencia a neomicina presente en el vector permite la seleccion de celulas de mamifero que expresan la proteina y el gen de resistencia a ampicilina y origen ColE1 permiten la seleccion y mantenimiento del plasmido en E. coli. Los vectores retrovirales pueden usarse a continuacion para infeccion y generacion de diversas lineas celulares usando, por ejemplo, celulas PC3, NIH 3T3, TsuPr1, 293 o rat-1.

Se realizan construcciones pSRα adicionales que fusionan un marcador epitopico tal como el marcador FLAG™ con el extremo carboxilo terminal de secuencias de 238P1B2 para permitir la deteccion usando anticuerpo anti-Flag. Por ejemplo, se anade la secuencia de FLAG™ 5' gat tac aaggat gac gac gat aag 3' al cebador de clonacion en el

extremo 3' de la 0RF. Se realizan construcciones pSRα adicionales para producir proteinas de fusion con GFP y myc/6X His tanto amino terminales como carboxilo terminales de las proteinas de longitud completa 238P1B2.

Vectores víricos adicionales: Se realizan construcciones adicionales para suministro mediado por virus y expresion de 238P1B2. Se consigue alta titulacion viral que conduce a alto nivel de expresion de 238P1B2 en sistemas de suministro viricos tales como vectores adenoviricos y vectores de amplicon de herpes. Una secuencia codificante de 238P1B2 o fragmentos de la misma se amplifica por PCR y se subclona en el vector lanzadera AdEasy (Stratagene). Se realizan recombinacion y empaquetamiento de virus de acuerdo con las instrucciones del fabricante para generar vectores adenoviricos. Como alternativa, las secuencias codificantes de 238P1B2 o fragmentos de las mismas se clonan en el vector HSV-1 (Imgenex) para generar vectores viricos de herpes. Los vectores viricos se usan a continuacion para infeccion de diversas lineas celulares tales como celulas PC3, NIH 3T3, 293 o rat-1.

Sistemas de expresión regulados: para controlar la expresion de 238P1B2 en celulas de mamifero, se clonan secuencias codificantes de 238P1B2, o partes de las mismas, en sistemas de expresion de mamiferos regulados tales como el sistema T-Rex (Invitrogen), el sistema GeneSwitch (Invitrogen) y el sistema estrechamente regulado Ecdysone (Stratagene). Estos sistemas permiten el estudio de los efectos dependientes de concentracion y temporales de 238P1B2 recombinante. Estos vectores se usan a continuacion para controlar la expresion de 238P1B2 en diversas lineas celulares tales como celulas PC3, NIH 3T3, 293 o rat-1.

B. Sistemas de expresión de baculovirus

Para generar proteinas 238P1B2 recombinantes en un sistema de expresion de baculovirus, se clonan 0RF de 238P1B2 0F, o partes de la misma, en el vector de transferencia de baculovirus pBlueBac 4.5 (Invitrogen), que proporciona un marcador His en el extremo N-terminal. Especificamente, pBlueBac-238P1B2 se co-transfecta con el plasmido auxiliar pBac-N-Blue (Invitrogen) en celulas de insecto SF9 (Spodoptera frugiperda) para generar baculovirus recombinante (vease el manual de instrucciones de Invitrogen para detalles). Se recoge despues baculovirus del sobrenadante celular y se purifica por ensayo en placa.

Se genera despues proteina 238P1B2 recombinante por infeccion de celulas de insecto HighFive (Invitrogen) con baculovirus purificado. Puede detectarse proteina 238P1B2 recombinante usando anticuerpo anti-238P1B2 o anti marcador His. La proteina 238P1B2 puede purificarse y usarse en diversos ensayos basados en celulas o como inmunogeno para generar anticuerpo policlonales y monoclonales especificos para 238P1B2.

Ejemplo 9 perfiles de antigenicidad y estructura secundaria

Figura 5A,B, Figura 6 A,B, Figura 7 A,B, Figura 8 A,B, y Figura 9 A,B representan graficamente cinco perfiles de aminoacidos de la secuencia de aminoacidos de 238P1B2 variante 1a (SA-9a) y variante 1b (5B-9B), cada evaluacion disponible accediendo al sitio web de ProtScale (URL www.expasy.ch/cgi-ben/protscale.pl) en el servidor de biologia molecular ExPasy.

Estos perfiles: Figura 5, hidrofilia (Hopp T.P., Woods K.R., 1981. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 3824-3828); Figura 6, hidropatico, (Kyte J., Doolittle R.F., 1982. J. Mol. Biol. 157:105-132); Figura 7, porcentaje de restos accesibles (Janen J., 1979 Nature 277:491-492); Figura 8, flexibilidad media (Bhaskaran R., y Ponnuswamy P.K., 1988. Ent. J. Pept. Proteen Res. 32:242-255); Figura 9, giro beta (Deleage, G., Roux B. 1987 Proteen Engeneereng 1:289-294); y opcionalmente otros disponibles en la tecnica, tales como en el sitio web de ProtScale, se usaron para identificar regiones antigenicas de la proteina 238P1B2. Cada uno de los perfiles aminoacidicos anteriores de 238P1B2 se generaron usando los siguientes parametros de ProtScale para analisis: 1) un tamano de ventana de 9; 2) 100 % de peso de los bordes de ventana en comparacion con el centro de ventana; y 3) valores del perfil de aminoacidos normalizados para quedar entre 0 y 1.

Se usaron perfiles de hidrofilia (Figura 5), hidropatico (Figura 6) y porcentaje de restos accesibles (Figura 7) para determinar tramos de aminoacidos hidrofilos (es decir, valores mayores de 0,5 en el perfil de hidrofilia y porcentaje de restos accesibles y valores menores de 0,5 en el perfil hidropatico). Tales regiones probablemente se exponen al ambiente acuoso, estan presentes en la superficie de la proteina y por lo tanto estan disponibles para reconocimiento inmune, tal como por anticuerpos.

Los perfiles de flexibilidad media (Figura 8) y giro beta (Figura 9) determinan tramos de aminoacidos (es decir valores mayores de 0,5 en el perfil de giro beta y el perfil de flexibilidad media) que no se restringen en estructuras secundarias tales como laminas beta y helices alfa. Tales regiones tambien se exponen mas probablemente en la proteina y son por lo tanto accesibles para reconocimiento inmune, tal como por anticuerpos.

Se usan secuencias antigenicas de la proteina 238P1B2 variante 1a y variante 1b indicadas, por ejemplo, por los perfiles expuestos en la Figura 5 A,B, Figura 6 A,B, Figura 7 A,B, Figura 8 A,B, y/o Figura 9 A,B para preparar inmunogenos, peptidos o acidos nucleicos que los codifican, para generar anticuerpos anti-238P1B2 terapeuticos y de diagnostico. El inmunogeno puede ser cualquiera de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o mas de 50 aminoacidos contiguos o los acidos nucleicos correspondientes que los codifican, de las proteinas variantes de 238P1B2. En particular, los inmunogenos peptidicos para 238P1B2 variante

1a pueden comprender una region peptidica de al menos 5 aminoacidos de la Figura 2 en cualquier incremento de numero entero hasta 254 que incluya una posicion de aminoacido que tenga un valor mayor de 0,5 en el perfil de hidrofilia en la Figura 5A; una region peptidica de al menos 5 aminoacidos de la Figura 2 en cualquier aumento de numero entero hasta 254 que incluye una posicion de aminoacido que tenga un valor menor de 0,5 en el perfil hidropatico de la Figura 6A; una region peptidica de al menos 5 aminoacidos de la Figura 2 en cualquier incremento del numero entero hasta 254 que incluya una posicion de aminoacido que tenga un valor mayor de 0,5 en el perfil de porcentaje de restos accesibles de la Figura 7A, una region peptidica de al menos 5 aminoacidos de la Figura 2 en cualquier incremento de numero entero hasta 254 que incluya una posicion de aminoacido que tenga un valor mayor de 0,5 en el perfil de flexibilidad media en la Figura 8A; y, una region peptidica de al menos 5 aminoacidos de la Figura 2 en cualquier incremento de numero entero hasta 254 que incluya una posicion de aminoacido que tenga un valor mayor de 0,5 en el perfil de giro beta de la Figura 9A.

Ademas, los inmunogenos peptidicos para 238P1B2 variante 1b pueden comprender una region peptidica de al menos 5 aminoacidos de la Figura 2 en cualquier incremento de numero entero hasta 316 que incluya una posicion de aminoacido que tenga un valor mayor de 0,5 en el perfil de hidrofilia de la Figura 5B; una region peptidica de al menos 5 aminoacidos de la Figura 2 en cualquier incremento de numero entero hasta 316 que incluya una posicion de aminoacido que tenga un valor menor de 0,5 en el perfil hidropatico de la Figura 6B; una region peptidica de al menos 5 aminoacidos de la Figura 2 en cualquier incremento del numero entero hasta 316 que incluya una posicion de aminoacido que tenga un valor mayor de 0,5 en el perfil de porcentaje de restos accesibles de la Figura 7B; una region peptidica de al menos 5 aminoacidos de la Figura 2 en cualquier incremento de numero entero hasta 316 que incluya una posicion de aminoacido que tenga un valor mayor de 0,5 en el perfil de flexibilidad media en la Figura 8B; y una region peptidica de al menos 5 aminoacidos de la Figura 2 en cualquier incremento en el numero entero hasta 316 que incluya una posicion de aminoacido que tenga un valor mayor de 0,5 en el perfil de giro beta de la Figura 9B. Los inmunogenos tambien pueden comprender acidos nucleicos que codifiquen cualquiera de los peptidos anteriores.

Todos los inmunogenos descritos en el presente documento, sean peptidos o acidos nucleicos, pueden incorporarse en una forma de dosis unitaria humana, o estar comprendidos por una composicion que incluya un excipiente farmaceutico compatible con la fisiologia humana.

La estructura secundaria de 238P1B2, concretamente la presencia y localizacion predichas de helices alfa, hebras extendidas y bucles aleatorios, se predice a partir de la secuencia de aminoacidos primaria usando el procedimiento de red neural jerarquica - HNN (Guermeur, 1997, direccion web pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa automat.p1?page npsa nn.html), a la que se accede desde el servidor de biologia molecular ExPasy (direccion web www.expasy.ch/tools/). El analisis indica que 238P1B2 variante 1a esta compuesta de helice alfa 66,54 %, cadena extendida 6,69 % y bucle aleatorio 26,77 % (Figura 12A). El analisis indica que 238P1B2 variante 1b esta compuesta de helice alfa 61,71 %, cadena extendida 8,86 % y bucle aleatorio 29,43 % (Figura 12B).

Se llevo a cabo analisis con respecto a la presencia potencial de dominios transmembrana en 238P1B2 usando diversos algoritmos de prediccion transmembrana a los que se accede desde el servidor de biologia molecular ExPasy (direccion web www.expasy.ch/tools/). Los programas predicen la presencia de multiples dominios transmembrana en 238P1B2 variante 1a y variante 1b. La mayor probabilidad de topologia para la variante 1a es la de una proteina de superficie celular con 6 dominios transmembrana. La mayor probabilidad de topologia para la variante 1b es la de una proteina de superficie celular con 7 dominios transmembrana, que es coherente con la de un receptor acoplado a proteina G. Se muestran graficamente en la Figura 12C y Figura 12D los resultados del analisis de 238P1B2 variante 1a usando los programas de prediccion TMpred (Figura 12C) y TMHMM (Figura 12D) que presentan la localizacion y topologia de los 6 dominios transmembrana. Se muestran en la Figura 12E y Figura 12F los resultados de los programas de prediccion para 238P1B2 variante 1b que muestran la localizacion y topologia de los 7 dominios transmembrana. Los resultados de cada programa, concretamente los aminoacidos que codifican el dominio transmembrana, se resumen en la Tabla XXII.

Ejemplo 10: comparación de homología de 238P1B2 con secuencias conocidas

El gen de 238P1B2 es homologo de un gen clonado y secuenciado, concretamente el receptor olfatorio de raton M0R14-1 (gi 18479244) (�hang X, Firestein S. Nat Neurosci. 2002, 5:124), que muestra 83 % de identidad y 90 % de homologia con ese producto genico (Figura 4A; Figura 4C). La proteina 238P1B2 muestra el 78 % de identidad y el 87 % de homologia con otro receptor olfatorio de raton, concretamente M0R14-10 (gi 18480766). El homologo humano mas cercano a 238P1B2 es el receptor olfatorio humano 5BETA12 (51I2, gi 17456801), con 61 % de identidad y 79 % de homologia (Figura 4E). La comparacion de 238P1B2 con otro miembro de la familia del receptor olfatorio humano, concretamente 101P3A11 (patente de referencia AGS), la proteina 238P1B2 muestra 48 % de identidad y 70 % de homologia con 101P3A11, alineandose el primer aminoacido de 238P1B2 con el aminoacido 62 de 101P3A11. La proteina 238P1B2 variante 1A consiste en 254 aminoacidos, con un peso molecular calculado de 28,5kDa y pI de 9,2. 238P1B2 es una proteina de superficie celular con algo de localizacion en la mitocondria y reticulo endoplasmico. Se han identificado tres formas de la proteina 238P1B2, conteniendo la variante 238P1B2 V2 una mutacion puntual de isoleucina a treonina en el aminoacido 225 y conteniendo la variante 238P1B2 V1B 62 aminoacidos adicionales en su extremo amino terminal. (Figura 4F). Aunque se ha proyectado que 238P1B2 V1A tiene 6 dominios transmembrana, 238P1B2 V1B contiene 7 dominios transmembrana, con el extremo N-terminal

orientado extracelularmente y siendo el extremo C-terminal intracelular (Tabla XXII, Figura 13).

El analisis de motivos revelo la presencia de varios motivos conocidos, incluyendo un motivo GPCR de receptor olfatorio de siete transmembranas y una repeticion de tipo III de fibronectina. Las proteinas que son miembros de la familia del receptor acoplado a proteina G muestran un extremo amino terminal extracelular, tres bucles extracelulares, tres bucles intracelulares y un extremo carboxilo terminal intracelular. Los receptores acoplados a proteina G son receptores de siete transmembranas que se estimulan por hormonas polipeptidicas, neurotransmisores, quimiocinas y fosfolipidos (Civelli 0 y col, Trends Neurosci. 2001, 24:230; Vrecl M y col., Mol Endocrinol. 1998, 12:1818). La union de ligandos se produce tradicionalmente entre el primer y segundo bucles extracelulares del GPCR. Tras la union de ligando los GPCR transducen senales a traves de la membrana de superficie celular asociandose con proteinas G trimericas. Sus senales se transmiten mediante proteinas de union a nucleotido de guanina trimericas (proteinas G) a receptor de superficie celular, enzimas efectoras o canales ionicos (Simon y col., 1991, Science 252: 802). La transduccion de senal y salida biologica mediada por GPCR puede modularse a traves de diversos mecanismos incluyendo mimeticos peptidicos, moleculas pequenas inhibidoras y quinasas de GPCR o GRK (Pitcher JA y col, J Biol Chem. 1999, 3; 274:34531; Fawzi AB, y col. 2001, Mol. Pharmacol., 59:30).

Recientemente, tambien se ha mostrado que los GPCR se unen a rutas de senalizacion mitogenicas de tirosina quinasas (Luttrell y col., 1999, Science 283: 655; Luttrell y col., 1999 Curr 0pin Cell Biol 11: 177). Los GPCR se regulan por fosforilacion mediada por GPCR quinasas (GRK), que a su vez se activan indirectamente por los GPCR (Pitcher y col., 1998, Ann. Rev. Biochem. 67: 653). Los GPCR olfatorios transmiten sus senales activando la ruta de AMPc mediante adenilato ciclasa dando como resultado la senalizacion corriente abajo de proteina quinasa A y activando la ruta de fosfolipasa C generando inositol 1,4,5-trisfosfato (IP3) y diacil-glicerol (DAG) (Breer, 1993, Ciba Found Symp 179: 97; Bruch, 1996, Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 113:451). IP3 da como resultado un aumento del calcio intracelular, mientras que DAG activa la proteina quinasa C.

Recientes estudios han asociado los GPCR con la transformacion celular. En particular, se descubrio que el receptor acoplado a proteina G KSHV transforma celulas NIH 3T3 in vitro e induce lesiones de tipo KS multifocales en ratones transgenicos KSHV-GPCR (Schwarz M, Murphy PM. J Immunol 2001, 167:505). KSHV-GPCR fue capaz de producir su efecto en celulas endoteliales y fibroblastos activando rutas de senalizacion definidas, incluyendo la ruta de supervivencia AKT (Montaner S y col, Cancer Res 2001, 61:2641). Ademas, KSHV-GPCR indujo la activacion de rutas mitogenicas tales como AP-1 y NFkB, dando como resultado la expresion de genes proinflamatorios (Schwarz M, Murphy PM. J Immunol 2001, 167:505). 0tros GPCR asociados con formacion de tumores incluyen G2A y PAR-1, que se ha descubierto que inducen la transformacion de celulas NIH 3T3 (Whitehead IP y col, 0ncogene 2001, 20:1547).

Las regiones de repeticiones de fibronectina son motivos que median la union a diversas sustancias tales como receptores de fibronectina, heparina, colageno y fibrina en superficies celulares. Debido a su capacidad de union las fibronectinas estan implicadas en adhesion celular, diferenciacion celular, proliferacion, migracion y metastasis tumoral (Nykvist P y col, J Biol Chem 2001, 276:38673; Danen EH, .amada KM. J Cell Physiol 2001, 189:1; Nabeshima K y col, Histol Histopathol 1999, 14:1183). Ademas, la fibronectina potencia la angiogenesis y formacion de vasos sanguineos de novo regulando la migracion de celulas endoteliales, que constituyen componentes esenciales de los vasos sanguineos (Urbich C y col, Arterioscler Thromb Vasc Biol 2002, 22:69), potenciando de este modo el crecimiento y supervivencia tumoral.

Esta informacion indica que 238P1B2 desempena un papel en la transformacion de celulas de mamifero, induce respuestas mitogenicas incluyendo la activacion de diversas rutas de senalizacion y regula la transcripcion genica transmitiendo senales de superficie celular al nucleo. En consecuencia, cuando 238P1B2 actua como un regulador de la transformacion celular, formacion de tumores o como un modulador de la transcripcion implicado en la activacion de genes asociados con inflamacion, tumorogenesis o proliferacion, 238P1B2 se usa para fines terapeuticos, de diagnostico, de pronostico y/o preventivos. Ademas, cuando una molecula, tal como una variante o polimorfismo de 238P1B2 se expresa en tejidos cancerosos, se usa para fines terapeuticos, de diagnostico, de pronostico y/o preventivos.

Ejemplo 11: Identificación y confirmación de rutas de transducción de señales potenciales

Se ha indicado que muchas proteinas de mamifero interaccionan con moleculas de senalizacion y participan en la regulacion de rutas de senalizacion (J Neurochem 2001; 76:217-223). En particular, se ha indicado que los GPCR activan cascadas de MAK asi como proteinas G y se han asociado con la ruta EGFR en celulas epiteliales (Naor, �., y col, Trends Endocrinol Metab. 2000, 11:91; Vacca F y col, Cancer Res. 2000, 60:5310; Della Rocca GJ y col, J Biol Chem. 1999, 274:13978). Usando tecnicas de inmunoprecipitacion y transferencia de Western, se identifican proteinas que se asocian con 238P1B2 y median en acontecimientos de senalizacion. Pueden regularse varias rutas que se sabe que desempenan un papel en la biologia del cancer por 238P1B2, incluyendo rutas de fosfolipidos tales como PI3K, AKT, etc.; rutas de adhesion y migracion, incluyendo FAK, Rho, Rac-1, etc.; y cascadas de supervivencia/mitogenicas tales como ERK, p38, etc. (Cell Growth Differ. 2000,11:279; J BiolChem 1999, 274:801; 0ncogene. 2000, 19:3003, J. Cell Biol. 1997, 138:913).

Se ha mostrado que varios GPCR transactivan tirosina quinasas receptoras asociadas con la membrana celular, tales como el receptor de EGF (EGFR) (Pierce KL y col, J Biol Chem. 2001, 276:23155; Nath D y col, J Cell Sci. 2001, 114: 1213). Para determinar si la senalizacion de 238P1B2 da como resultado la activacion de EGFR, se dejan crecer celulas en medio solamente o en presencia del inhibidor de EGFR AG1517. La fosforilacion de EGFR se compara en celulas tratadas y de control. De forma similar, se investiga la comunicacion entre las rutas de 238P1B2 y EGFR.

Para confirmar que 238P1B2 activa directa o indirectamente rutas de transduccion de senal conocidas en las celulas, se llevan a cabo ensayos indicadores transcripcionales basados en luciferasa (luc) en celulas que expresan genes individuales. Estos indicadores transcripcionales contienen sitios de union a consenso para factores de transcripcion conocidos que quedan corriente abajo de rutas de transduccion de senal bien caracterizadas. Los indicadores y ejemplos de estos factores de transcripcion asociados, rutas de transduccion de senal y estimulos de activacion se enumeran a continuacion

1.: NFkB-luc, NFkB/Rel; Ik-quinasa/SAPK; crecimiento/apoptosis/tension

2.: SRE-luc, SRF/TCF/ELK1; MAPK/SAPK; crecimiento/diferenciacion

3.: AP-1-luc, F0S/JUN; MAPK/SAPK/PKC; crecimiento/apoptosis/tension

4.: ARE-luc, receptor de androgenos, esteroides/MAPK; crecimiento/diferenciacion/apoptosis

5.: p53-luc, p53; SAPK; crecimiento/diferenciacion/apoptosis

6.: CRE-luc, CREB/ATF2; PKA/p38; crecimiento/apoptosis/tension

Los efectos mediados por gen pueden ensayarse en celulas que muestran expresion de ARNm. Pueden introducirse plasmidos indicadores de luciferasa por transfeccion mediada por lipidos (TFX-50, Promega). La actividad luciferasa, un indicador de actividad transcripcional relativa, se mide por incubacion de extractos celulares con sustrato de luciferina y la luminiscencia de la reaccion se controla en un luminometro.

Las rutas de senalizacion activadas por 238P1B2 se mapean y se usan para la identificacion y validacion de dianas terapeuticas. Cuando 238P1B2 esta implicada en la senalizacion celular, se usa como diana para fines de diagnostico, de pronostico, preventivos y/o terapeuticos.

Ejemplo 12: 238P1B2 actúa como un GPCR

El analisis de secuencia y homologia de 238P1B2 indica que la proteina 238P1B2 es un miembro de la familia de los receptores olfatorios de GPCR. Se sabe que los receptores olfatorios regulan respuestas biologicas activando adenilato ciclasa. Para confirmar que 238P1B2 actua como GPCR y media en la activacion de adenilato ciclasa, se comprueba la acumulacion de AMPc en celulas PC3 y PC3-238P1B2 en celulas cultivadas en presencia o ausencia de suero bovino fetal (FBS). Las celulas se lisan y la concentracion intracelular de AMPc se mide usando un inmunoensayo enzimatico (EIA) disponible en el mercado. Los calculos de concentraciones de AMPc se basaron en D0450 de la curva patron. De forma similar, el mismo ensayo puede usarse para determinar si la induccion de acumulacion de AMPc por 238P1B2 se inhibe por inhibidores de GPCR tal como toxina pertussis.

Los GPCR trasmiten su senal activando proteinas G trimericas. Una vez que los GPCR se activan, la subunidad Ga asociada se une a GTP, se disocia del receptor y participa en acontecimientos de senalizacion corriente abajo (Schild D y Restrepo D. Physiol Rev. 1998, 78:429-66). Para determinar que la inhibicion de las subunidades Ga tiene un efecto en el crecimiento celular mediado por 238P1B2, se investiga el efecto de los inhibidores de Ga en la proliferacion de celulas 3T3-238P1B2 y PC3-238P1B2. Las celulas de control y que expresan 238P1B2 se dejan crecer en presencia o ausencia de suramina o su derivado NF 449 (Sigma). Las celulas se analizan con respecto a proliferacion usando un ensayo de tipo MTT.

Cuando 238P1B2 actua como un GPCR, se usa como diana para fines de diagnostico, pronostico, preventivos y/o terapeuticos.

Ejemplo 13: Implicación en la progresión tumoral

El gen 238P1B2 puede contribuir al crecimiento de celulas cancerosas. El papel de 238P1B2 en el crecimiento tumoral se confirma en diversas lineas celulares primarias y transfectadas incluyendo prostata asi como celulas NIH 3T3 modificadas por ingenieria genetica para expresar de forma estable 238P1B2. Se evaluan celulas parentales sin 238P1B2 y celulas que expresan 238P1B2 con respecto a crecimiento celular usando un ensayo de proliferacion bien documentado (Fraser SP, Grimes JA, Djamgoz MB. Prostate. 2000; 44:61, Johnson DE, 0chieng J, Evans SL. Anticancer Drugs. 1996, 7:288). Para confirmar que 238P1B2 media en la proliferacion potenciada por medio de su actividad GPCR, se dejan crecer celulas de control y celulas que expresan 238P1B2 en presencia o ausencia de toxina pertussis y se evaluan con respecto a su capacidad proliferativa usando el mismo ensayo descrito anteriormente.

Para confirmar el papel de 238P1B2 en el proceso de transformacion, se investiga su efecto en los ensayos de formacion de colonias. Se comparan celulas NIH-3T3 parentales sin 238P1B2 con celulas NIH-3T3 que expresan 238P1B2, usando un ensayo de agar blando en condiciones rigurosas y mas permisivas (Song �. y col., Cancer Res. (2000) 60:6730.

Para confirmar el papel de 238P1B2 en la invasion y metastasis de celulas cancerosas, se usa un ensayo bien establecido, por ejemplo, un ensayo de sistema de inserto Transwell (Becton Dickinson) (Cancer Res. 1999; 59:6010). Se comparan celulas de control, incluyendo lineas celulares de prostata y fibroblastos sin 238P1B2 con celulas que expresan 238P1B2. Las celulas se cargan con el colorante fluorescente, calceina, y se siembran en placas en el pocillo superior del inserto Transwell revestido con un analogo de membrana basal. La invasion se determina por fluorescencia de celulas en la camara inferior en relacion con la fluorescencia de la poblacion celular completa.

238P1B2 tambien puede desempenar un papel en el ciclo celular y apoptosis. Las celulas parentales y celulas que expresan 238P1B2 se comparan con respecto a diferencias en la regulacion del ciclo celular usando un ensayo BrdU bien establecido (Abdel-Malek �A. J Cell Physiol. 1988, 136:247). En resumen, las celulas cultivadas en condiciones tanto optimas (suero completo) como limitantes (suero bajo) se marcan con BrdU y se tinen con Ab anti-BrdU y yoduro de propidio. Las celulas se analizan con respecto a entrada en las fases G1, S y G2M del ciclo celular. Como alternativa, el efecto de tension en la apoptosis se evalua en celulas parentales de control y celulas que expresan 238P1B2, incluyendo celulas de prostata normales y tumorales. Las celulas modificadas por ingenieria genetica y las parentales se tratan con diversos agentes quimioterapeuticos, tales como etoposido, flutamida, etc., e inhibidores de sintesis proteica tales como cicloheximida. Las celulas se tinen con anexina V-FITC y la muerte celular se mide por analisis de FACS. La modulacion de muerte celular por 238P1B2 puede desempenar un papel critico en la regulacion de progresion tumoral y carga tumoral.

Cuando 238P1B2 desempena un papel en el crecimiento celular, transformacion, invasion o apoptosis, se usa como una diana para fines de diagnostico, pronostico, preventivos y/o terapeuticos.

Ejemplo 14: Implicación en angiogénesis

La angiogenesis o formacion de nuevos vasos sanguineos capilares es necesaria para el crecimiento tumoral (Hanahan D, Folkman J. Cell. 1996, 86:353; Folkman J. Endocrinology. 1998 139:441). Basandose en el efecto de los inhibidores de fosfodiesterasa en celulas endoteliales, 238P1B2 desempena un papel en la angiogenesis (DeFouw L y col, Microvasc Res 2001, 62:263). Se han desarrollado varios ensayos para medir angiogenesis in vitro e in vivo, tales como los ensayos de cultivo tisular de formacion de tubo celular endotelial y proliferacion de celulas endoteliales. Usando estos ensayos asi como neovascularizacion in vitro, se confirma el papel de 238P1B2 en angiogenesis, potenciacion o inhibicion.

Por ejemplo, las celulas endoteliales modificadas por ingenieria genetica para expresar 238P1B2 se evaluan usando ensayos de formacion de tubos y proliferacion. El efecto de 238P1B2 tambien se confirma en modelos animales in vivo. Por ejemplo, se implantan celulas que expresan o carecen de 238P1B2 de forma subcutanea en ratones inmunocomprometidos. La migracion celular endotelial y angiogenesis se evalua 5-15 dias despues usando tecnicas de inmunohistoquimica: 238P1B2 afecta a la angiogenesis y se usa como una diana para fines de diagnostico, pronostico, preventivos y/o terapeuticos.

Ejemplo 15: Regulación de la transcripción

La localizacion de superficie celular de 238P1B2 y su similitud con GPCR indica que 238P1B2 se usa eficazmente como un modulador de la regulacion transcripcional de genes eucariotas. La regulacion de la expresion genica se confirma, por ejemplo, estudiando expresion genica en celulas que expresan o carecen de 238P1B2. Para este fin, se realizan dos tipos de experimentos.

En el primer conjunto de experimentos, se extrae ARN de celulas parentales y que expresan 238P1B2 y se hibrida con series genicas disponibles en el mercado (Clontech) (Smid-Koopman E y col. Br J Cancer. 2000. 83:246). Se comparan celulas en reposo asi como celulas tratadas con FBS o androgeno. Se identifican genes expresados diferencialmente de acuerdo con procedimientos conocidos en la tecnica. Los genes expresados diferencialmente se mapean despues en rutas biologicas (Chen K y col. Thyroid. 2001. 11:41.).

En el segundo conjunto de experimentos, se evalua la activacion de ruta transcripcional especifica usando construcciones indicadoras de luciferasa disponibles en el mercado (Stratagene) incluyendo: NTkB-luc, SRE-luc, ELK1-luc, ARE-luc, p53-luc y CRE-luc. Estos indicadores transcripcionales contienen sitios de union consenso para factores de transcripcion conocidos que quedan corriente abajo de las rutas de transduccion de senal bien caracterizadas y representan una buena herramienta para determinar la activacion de la ruta y explorar con respecto a moduladores positivos y negativos de la activacion de la ruta.

Por lo tanto, 238P1B2 desempena un papel en la regulacion genica y se usa como una diana para fines de diagnostico, pronostico, preventivos y/o terapeuticos.

Ejemplo 16. Implicación en adhesión celular.

La adhesion celular desempena un papel critico en la colonizacion tisular y metastasis. Basandose en la presencia de una repeticion de fibronectina en su extremo C-terminal, 238P1B2 puede participar en la organizacion celular y como consecuencia afecta a la adhesion y motilidad celular. Para confirmar que 238P1B2 regula la adhesion celular,

se comparan celulas control sin 238P1B2 con celulas que expresan 238P1B2, usando tecnicas previamente descritas (vease, por ejemplo, Haier y col, Br. J. Cancer. 1999, 80:1867; Lehr y Pienta, J. Natl. Cancer Inst. 1998, 90:118). Brevemente, se incuban celulas marcadas con un indicador fluorescente, tales como calceina, en pocillos de cultivo tisular revestidos con medio solamente o con proteinas de la matriz. Las celulas adherentes se detectan por analisis fluorometrico y se calcula el porcentaje de adhesion. Como alternativa, se analizan celulas que carecen de o que expresan 238P1B2 con respecto a su capacidad para mediar en la adhesion celula-celula usando tecnicas experimentales similares como se ha descrito anteriormente. Ambos de estos sistemas experimentales se usan para identificar proteinas, anticuerpos y/o moleculas pequenas que modulan la adhesion celular a matriz extracelular e interaccion celula-celula. La adhesion celular desempena un papel critico en el crecimiento, progresion y colonizacion tumoral y 238P1B2 esta implicada en estos procesos. Por lo tanto, actua como una modalidad de diagnostico, pronostico, preventiva y/o terapeutica.

Ejemplo 17: Asociación proteína-proteína

Se ha mostrado que varios GPCR interaccionan con otras proteinas, regulando de este modo la transduccion de senales, transcripcion genica, transformacion y adhesion celular (Sexton PM y col, Cell Signal. 2001, 13:73; Turner CE, J Cell Sci. 2000, 23:4139). Usando tecnicas de inmunoprecipitacion asi como dos sistemas de hibrido de levadura, se identifican proteinas que se asocian con 238P1B2. Se comparan inmunoprecipitados de celulas que expresan 238P1B2 y celulas sin 238P1B2 con respecto a asociaciones proteina-proteina especificas.

Se realizan estudios para confirmar el alcance de la asociacion de 238P1B2 con moleculas efectoras, tales como proteinas nucleares, factores de transcripcion, quinasas, fosfatos, etc. Los estudios que comparan celulas positivas para 238P1B2 y negativas para 238P1B2 asi como estudios que comparan celulas no estimuladas/en reposo y celulas tratadas con activadores de celulas epiteliales, tales como citocinas, factores de crecimiento, androgeno y Ab anti-integrina revelan interacciones unicas.

Ademas, se confirman las interacciones proteina-proteina usando metodologia de dos hibridos de levadura (Curr 0pin Chem Biol. 1999, 3:64). Se introduce un vector que porta una biblioteca de proteinas fusionadas con el dominio de activacion de un factor de transcripcion en levadura que expresa una proteina de fusion de dominio de union ADN-238P1B2 y una construccion indicadora. La interaccion proteina-proteina se detecta por actividad indicadora colorimetrica. La asociacion especifica con moleculas efectoras y factores de transcripcion dirige a un experto en la material al modo de accion de 238P1B2 e identifica de este modo dianas terapeuticas, de pronostico, preventivas y/o de diagnostico para cancer. Este y otros ensayos similares tambien se usan para identificar y explorar con respecto a moleculas pequenas que interaccionan con 238P1B2.

Por lo tanto se descubre que 238P1B2 se asocia con proteina y moleculas pequenas. En consecuencia, 238P1B2 y estas proteinas y moleculas pequenas se usan para fines de diagnostico, pronostico, preventivos y/o terapeuticos.

TABLAS

Prostata

TABLA II: ABREVIATURAS DE AMIN0ACID0S

TABLA I: Tejidos que expresan 238P1B2 cuando son tumorales

UNA LETRA: TRES LETRAS NOMBRE COMPLETO

F: Phe fenilalanina

L: Leu leucina

s: Ser serina

.: Tyr tirosina

C: Cys cisteina

w: Trp triptofano

P: Pro prolina

H: His histidina

�: Gln glutamina

R: Arg arginina

I: Ile isoleucina

M: Met metionina

T: Thr treonina

(continuacion)

UNA LETRA: TRES LETRAS NOMBRE COMPLETO

N: Asn asparagina

K: Lys lisina

V: Val valina

A: Ala alanina

D: Asp acido aspartico

E: Glu acido glutamico

G: Gly glicina

TABLA III: MATRIZ DE SUSTITUCIÓN DE AMINOÁCIDOS Adaptada de la matriz de sustitucion de aminoacidos de GCG Software 9.0 BL0SUM62 (matriz de sustitucion en bloque). Cuanto mayor sea el valor, mas probable es que se encuentre una sustitucion en proteinas relacionadas naturales. (Vease la direccion web www.ikp.unibe.ch/manual/blosum62.html)

A: C D E F G H I K L M N P � R S T V W . .

4: 0 - - -2 0 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 -1 -1 1 0 0 -3 -2 A

2: 1

9: - - -2 -3 -3 -1 -3 -1 -1 -3 -3 -3 -3 -1 -1 -1 -2 -2 C

3: 4

6: 2 -3 -1 -1 -3 -1 -4 -3 1 -1 0 -2 0 -1 -3 -4 -3 D

5: -3 -2 0 -3 1 -3 -2 0 -1 2 0 0 -1 -2 -3 -2 E

6: -3 -1 0 -3 0 0 -3 -4 -3 -3 -2 -2 -1 1 3 F

6: -2 -4 -2 -4 -3 0 -2 -2 -2 0 -2 -3 -2 -3 G

8: -3 -1 -3 -2 1 -2 0 0 -1 -2 -3 -2 2 H

4: -3 2 1 -3 -3 -3 -3 -2 -1 3 -3 -1 I

5: -2 -1 0 -1 1 2 0 -1 -2 -3 -2 K

4: 2 -3 -3 -2 -2 -2 -1 1 -2 -1 L

5: -2 -2 0 -1 -1 -1 1 -1 -1 M

6: -2 0 0 1 -3 -4 -2 N

7: -1 -2 -1 -1 -2 -4 -3 P

5: 1 0 -1 -2 -2 -1 �

5: -1 -1 -3 -3 -2 R

4: 1 -2 -3 -2 S

5: 0 -2 -2 T

4: -3 -1 V

11: 2 W

7: .

Tabla XXI: Motivos y Modificaciones Post-traduccionales de 238P1B2

Sitio de fosforilacion de proteina quinasa dependiente de AMPc y GMPc. 10 176 - 179 RKeT Sitio de fosforilacion de proteina quinasa C. 235 - 237 SvK Sitio de fosforilacion de caseina quinasa II.

9 - 12 SatD 15 50 - 53 TvmE 130 - 133 SctD 172 - 175 SpeC

Sitio de N-miristilacion. 14 - 19 GLsiST 20 Identificacion de familia de receptores acoplados a proteina G 1. 52 - 68 MESsvLlaMAFDRFvaV Familia de receptores acoplados a proteina G 1.

1-234

TABLA XXII: Características Físicas de 238P1B2

238P1B2 Variante 1A: Programa Bioinformatico URL Resultado

0RF: 0RF finder 3758 pb

Longitud de la proteina: 254 aa

Region transmembrana: TM Pred Direccion web www.ch.embnet.org/ Extremo N terminal intracelular, 6 TM helices TM en 3-29, 4462, 86-110, 144-161, 182-203, 217-236aa

HMMTop: Direccion web www.enzim.hu/hmmtop/ Extremo N terminal intracelular, 6TM helices TM en 6-28, 43-62, 86-105, 136-158, 180-203, 216235aa

Sosui: Direccion web www.genome.ad.jp/S0Sui/ Proteina de membrana, 6TM helices TM en 6-28, 42-64, 87109, 144-166, 187-209, 217237aa

TMHMM: Direccion web www.cbs.dtu.dk/ services/TMH MM Extremo N terminal intracelular, 6TM helices TM en 7-29, 44-66, 86-108, 142-164, 185-207, 212234aa

Peptido senal: Signal P Direccion web www.cbs.dtu.dk/services/ Signal P/ Sitio de escision entre 169170aa

pI: pI/MW tool Direccion web www.expasy.ch/tools/ pI 9,24

Peso molecular: pI/MW tool Direccion web www.expasy.ch/tools/ 28,59 kDa

Localizacion: PS0RT Direccion web psort.nibb.ac.jp/ 60 % membrana plasmatica, 42,9 % membrana interna mitocondrial, 40 % Golgi, 30 % membrana de reticulo endoplasmico

PS0RT II: Direccion web psort.nibb.ac.jp/ 44,4 % reticulo endoplasmico, 22,2 % membrana plasmatica

Motivos: Pfam Direccion web www.sanger.ac.uk/Pfam/ Receptor 7TM (familia de rodopsina)

Prints: Direccion web www.biochemucl.ac.uk/ Identificacion de receptor olfatorio, proteina R de membrana interna del sistema de secrecion de Tipo III, identificacion de repeticion de tipo III de fibronectina

Blocks: Direccion web www.blocks.thcrc.org/ Sin motivo significativo

(continuacion)

238P1B2 Variante 1A: Programa Bioinformatico URL Resultado

238P1B2 Variante 1B: Programa Bioinformatico URL Resultado

0RF: 0RF finder 3758 pb

Longitud de la proteina: 316 aa

Region transmembrana: TM Pred Direccion web www.ch.embnet.org/ Extremo N terminal extracelular, 8TM helices TM en 9-27,33-51, 75-91, 98-125, 145-171, 206226, 249-265, 276-296aa

HMMTop: Direccion web www.enzim.hu/hmmtop/ Extremo N terminal extracelular, 7TM helices TM en 29-53, 6690, 105-124, 148-171, 202-226, 241-265, 278-297aa

Sosui: Direccion web www.genome.ad.jp/S0Sui/ Proteina de membrana, 8TM helices TM en 2-24, 33-55, 6789, 104-126, 149-171, 206228,245-267,279-299aa

TMHMM: Direccion web www.cbs.dtu.dk/ services/TMH MM Extremo N terminal intracelular, 7TM helices TM en 30-52, 6587, 102-124,145-167,204-226, 247-269, 274-296aa

Peptido senal: Signal P Direccion web www.cbs.dtu.dk/services/ Signal P/ Sitio de escision entre aa 26 y 27

pI: pI/MW tool Direccion web www.expasy.ch/tools/ pI 9,03

Peso molecular: pI/MW tool Direccion web www.expasy.ch/tools/ 35,34 kDa

Localizacion: PS0RT Direccion web psort.nibb.ac.jp/ 64 % de membrana plasmatica, 46 % Golgi, 37 % membrana del reticulo endoplasmico

PS0RT II: Direccion web psort.nibb.ac.jp/ 44,4 % reticulo endoplasmico, 33,3 % membrana plasmatica

Motivos: Pfam Direccion web www.sanger.ac.uk/Pfam/ Receptor de 7TM (familia de rodopsina), proteina de biosintesis de polisacaridos

Prints: Direccion web www.biochem.ucl.ac.uk/ Identificacion de receptor olfatorio, proteina R de membrana interna del sistema de secrecion de tipo III, identificacion de repeticion de tipo III de fibronectina

Blocks: Direccion web www.blocks.fhcrc.org/ Sin motivo significativo

Tabla XXIII. Composiciones Exónicas de 238P1B2 v.1

Numero de exones: Comienzo Fin

Exon 1: 1 3758

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para detectar la presencia de cancer de prostata en una muestra de ensayo, comprendiendo el procedimiento:

poner en contacto la muestra con una sonda que se une especificamente a un polinucleotido de la Figura 2B; y detectar la union del polinucleotido de la muestra con la misma.

Figura 1 Secuencia SSH de 238P1B2 de 210 nucleótidos

Figura 2A. La secuencia de ADNc y de aminoácidos de 238P1B2 v.1 A clon A. La metionina de partida esta subrayada. El marco de lectura abierto se extiende desde el acido nucleico 2133-2897 incluyendo el codon de parada.

Figura 2B. La secuencia de ADNc y de aminoácidos de 238P1B2 v.1B clon A. El marco de lectura abierto se extiende desde el acido nucleico 1947-2897 incluyendo el codon de parada.

Figura 2C. La secuencia de ADNc y de aminoácidos de 238P1B2 v.2. La metionina de partida esta subrayada. El marco de lectura abierto se extiende desde el acido nucleico 2133- 2897 incluyendo el codon de parada.

Figura 2D. La secuencia de ADNc y de aminoácidos de 238P1B2 v.3. La metionina de partida esta subrayada. El marco de lectura abierto se extiende desde el acido nucleico 2133-2897 incluyendo el codon de parada.

Figura 2E. La secuencia de ADNc y de aminoácidos de 238P1B2 v.4. La metionina de partida esta subrayada. El marco de lectura abierto se extiende desde el acido nucleico 2133-2897 incluyendo el codon de parada.

Figura 2F. La secuencia de ADNc y de aminoácidos de 238P1B2 v.5. La metionina de partida esta subrayada. El marco de lectura abierto se extiende desde el acido nucleico 2133-2897 incluyendo el codon de parada.

Figura 2G. La secuencia de ADNc y de aminoácidos de 238P1B2 v.6. La metionina de partida esta subrayada. El marco de lectura abierto se extiende desde el acido nucleico 2133-2897 incluyendo el codon de parada.

Figura 3A. Secuencia de aminoácidos de 238P1B2 v.1A clon A. La proteína 238PlB2 v.1 tiene 254 aminoácidos.

Figura 3B. Secuencia de aminoácidos de 238P1B2 v.1B. La proteína 238P1B2 v.1B tiene 316 aminoácidos.

Figura 3C. Secuencia de aminoácidos de 238P1B2 v.2. La proteína 238P1B2 v.2 tiene 254 aminoácidos.

Figura 4A Alineamiento de secuencias de ácido nucleico de 238P1B2 v.1 con receptor olfatorio de ratón MOR14-1.

>giI18479243IgbIA.072973.1I Gen del receptor olfatorio M0R14-1 de Mus musculus, cds completa Longitud =945

Puntuacion = 793 bits (400), Expectativa =0,0 Identidades = 784/912 (85 %). Cadena = Mas / Mas

Figura 4B Alineamiento de secuencias de acido nucleico de 238P1B2 v.1 con receptor olfatorio de raton M0R14-10.

>giI18480765IgbIA.073734.1I gen del receptor olfatorio M0R14-10 de Mus musculus, cds completa Longitud = 993

Puntuacion = 607 bits (306), Expectativa = e-170 Identidades = 756/906 (83 %) Cadena = Mas / Mas

Figura 4C Alineamiento de secuencias de aminoácidos de 238P1B2 v.1A con receptor olfatorio de ratón MOR14-1.

>giI18479244IgbIAAL60636.1I (A.072973) receptor olfatorio M0R14-1 �Mus musculus� Longitud =314 Puntuacion = 342 bits (878), Expectativa = 2e-93

Identidades = 210/253 (83 %), Positivos = 230/253 (90 %)

Figura 4D Alineamiento de secuencias de aminoácidos de 238P1B2 v.1A con GPCR PHOR-1 específico de próstata.

Puntuacion = 254 bits (650), Expectativa = 4e-67 Identidades = 120/250 (48 %), Positivos = 177/250 (70 %), Huecos = 1/250 (0 %)

Figura 4E Alineamiento de 238P1B2 variante 1 con receptor olfatorio humano 51I2.

Identidades = 154/252 (61 %), Positivos = 201/252 (79 %)

Figura 4F Alineamiento generado por Clustal de las tres variantes de 238P1B2, que representa que 238P1B2 V1B contiene 62 aa adicionales en su extremo N-terminal en relación con V1A, y que 238P1B2 V2 porta una mutación puntual I a T en el aa 225 en relación con V1A.

Figura 5A Perfil de hidrofilia de 238P1B2 variante 1a

(Hopp T.P., Woods K.R., 1981. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-3828)

Figura 5B Perfil de hidrofilia de 238P1B2 variante 1b

(Hopp T.P., Woods K.R., 1981. Proc. Nati. Acad. Sci. U.SA 78: 3824-3828)

Figura 6A Perfil hidropático de 238P1B2 variante 1a

(Kyte J., Doolittle R.F., 1982. J. Mol. Biol. 157: 105-132)

Figura 6B Perfil hidropático de 238P1B2 variante 1b

(Kyte J., Doolittle R.F., 1982. J. Mol. Biol. 157: 105-132)

Figura 7A Perfil de % de restos accesibles de 238P1B2 variante 1a

(Janin J., 1979. Nature 277: 491-492)

Figura 7B Perfil de % de restos accesibles de 238P1B2 variante 1b

(Janin J., 1979. Nature 277: 491-492)

Figura 8A Perfil de flexibilidad media de 238P1B2 variante 1a

(Bhaskaran R., Ponnuswamy P.K., 1988. Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255)

Figura 8B Perfil de flexibilidad media de 238P1B2 variante 1b

(Bhaskaran R., Ponnuswamy P.K., 1988. Int. J. Pept. Protein Res. 32: 242-255)

Figura 9A Perfil de giro beta de 238P1B2 variante 1a

(Deleage, G., Roux B. 1987. Protein Engineering 1:289-294)

Figura 9B Perfil de giro beta de 238P1B2 variante 1b

(Deleage, G., Roux B. 1987. Protein Engineering 1: 289-294)

Figura 10 Figura 11

Figura 12A Predicción de estructura secundaria de 238P1B2 variante 1a

Helice alfa (h): 66,54 % Hebra extendida (e): 6,69 %Bucle aleatorio (c): 26,77 %

Figura 12B Predicción de estructura secundaria de 238P1B2 variante 1b

Helice alfa (h): 61,71 % Hebra extendida (e): 8,86 %Bucle aleatorio (c): 29,43 %

92 93

Los numeros se refieren a los aminoacidos al comienzo de cada dominio transmembrana

M = Marcador

Grupo vital 11.

Grupo vital 22.

Grupo de cancer de prostata 3.

Corazon

1.

Cerebro2.

Placenta3.4 Pulmon

Higado5.

Musculo esqueletico6.7 Rinon

Pancreas 8.

Bazo

1.

Timo2.

Prostata3.

Testiculo4.

�tero5.

Intestino delgado6.

Colon7.

Leucocitos 8.

A1 encéfalo completoA2 cerebelo, izquierdoA3 sustancia negraA4 corazón A5 esófagoA6 colon, transversoA7 riñón A8 pulmón A9 hígado A10 HL60, leucemiaA11 encéfalo fetal H1 puente troncoencefálicoH2 putamenH3 - H4 punta del corazónH5 colon, ascendenteH6 - H7 tráqueaH8 - H9 - H10 A549, cáncer de pulmónH11 - H12 ADN genómico B1 córtex cerebralB2 cerebelo, derechoB3 núcleo accumbensB4 aortaB5 estómagoB6 colon, descendenteB7 músculo esqueléticoB8 placentaB9 páncreasB10 HeLa, S3B11 corazón fetal C1 lóbulo frontalC2 cuerpo callosoC3 tálamoC4 aurícula, izquierdaC5 duodenoC6 rectoC7 bazoC8 vejigaC9 glándula adrenalC10 K562, leucemiaC11 riñón fetal D1 lóbulo parietalD2 amígdalaD3 hipófisisD4. aurícula, derechaD5 yeyunoD6 - D7 timoD8 úteroD9 glándula tiroidesD10 MOLT-4D11 hígado fetal E1 lóbulo occipitalE2 núcleo caudadoE3 médula espinalE4 ventrículo, izquierdoE5 íleoE6 -E7 leucocitosE8 próstataE9 glándula salivalE10 RAJI, linfomaE11 bazo fetal F1 lóbulo temporalF2 hipocampoF3 -F4 ventrículo, derechoF5 ciegoF6 -F7 ganglio linfáticoF8 testículoF9 glándula mamariaF10 DAUDI, linfomaF11 timo fetalF12 ADN genómico G1 giro paracentralG2 bulbo raquídeoG3 - G4 tabique intraventricularG5 apéndiceG6 - G7 médula óseaG8 ovario G9 - G10 SW480, cáncer de colonG11 pulmón fetalG12 ADN genómico

Grupo de Ca de prostata = 10 μg de ARN total/por carril de un grupo de 3 tumores gleason 6,8,9

PN = prostata normalVN = vejiga normalRN = rinon normalCN = colon normalPUN = pulmon normalMN = mama normal0N = ovario normal

N = Prostata NormalT1 = Tumor de próstata, puntuación de gleason desconocidaT2 = Tumor de próstata, puntuación de gleason 5T3 = Tumor de próstata, puntuación de gleason 5T4 = Tumor de próstata, puntuación de gleason 7T5 = Tumor de próstata, puntuación de gleason 7