ES2391892T3 - Äcidos nucleicos titulados 273P4B7 y su uso en detección de cáncer - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de:(a) SEC ID Nº: 2, de los números de resto de nucleótido 95 a 3847;(b) SEC ID Nº: 4, de los números de resto de nucleótido 604 a 3987;(c) SEC ID Nº: 8, de los números de resto de nucleótido 688 a 1947;(d) SEC ID Nº: 2, de los números de resto de nucleótido 95 a 3847, en los que en el resto de nucleótido en 571es T;(e) SEC ID Nº: 2, de los números de resto de nucleótido 95 a 3847, en los que en el resto de nucleótido en 608es G;(f) SEC ID Nº: 2, de los números de resto de nucleótido 95 a 3847, en los que en el resto de nucleótido en 1185es G;(g) SEC ID Nº: 2, de los números de resto de nucleótido 95 a 3847, en los que en el resto de nucleótido en 2759es A;(h) SEC ID Nº: 2, de los números de resto de nucleótido 95 a 3847, en los que en el resto de nucleótido en 3658es C; o(i) SEC ID Nº: 2, de los números de resto de nucleótido 95 a 3847, en los que en el resto de nucleótido en 3850es A.

Description

Acidos nucleicos titulados 273P4B7 y su uso en deteccion de cancer

Campo de la invención

La invencion descrita en el presente documento se refiere a genes, denominados 273P4B7 y variantes de los 5 mismos, expresados en ciertos canceres, y a procedimientos de diagnostico y terapeuticos y composiciones utiles en el tratamiento de canceres que expresan 273P4B7.

Antecedentes de la invención

El cancer es la segunda causa principal de muerte de seres humanos junto a enfermedad coronaria. En todo el mundo, millones de personas mueren de cancer cada ano. Solamente en los Estados Unidos, como informo la

10 Sociedad Americana del Cancer, el cancer provoca la muerte de mas de medio millon de personas anualmente, diagnosticandose mas de 1,2 millones de casos nuevos cada ano. Aunque las muertes de enfermedad cardiaca se han reducido significativamente, las resultantes de cancer generalmente estan aumentando. A principios del proximo siglo, se predice que el cancer se convierta en la causa principal de muerte.

En todo el mundo, varios canceres destacan como las principales causas de muerte. En particular, carcinomas de

15 pulmon, prostata, mama, colon, pancreas y ovarios representan las principales causas de muerte por cancer. Estos y practicamente todos los demas carcinomas comparten una caracteristica letal comun. Con muy pocas excepciones, la enfermedad metastasica de un carcinoma es letal. Ademas, incluso para los pacientes con cancer que sobreviven inicialmente a esos canceres primarios, la experiencia habitual ha mostrado que sus vidas se alteran drasticamente. Muchos pacientes con cancer experimentan fuertes ansiedades impulsadas por la consciencia del potencial de

20 recurrencia o fallo del tratamiento. Muchos pacientes con cancer experimentan debilidades fisicas despues del tratamiento. Ademas, muchos pacientes con cancer experimentan una recurrencia.

En todo el mundo, el cancer de prostata es el cuarto cancer mas prevalente en hombres. En Norte America y el Norte de Europa, es con diferencia el cancer mas habitual en hombres y es la segunda causa principal de muerte por cancer en hombres. Solamente en los Estados Unidos, mas de 30.000 hombres mueren anualmente de esta

25 enfermedad, superada solamente por el cancer de pulmon. A pesar de la magnitud de estas cifras, aun no hay tratamiento eficaz para cancer de prostata metastasico. La protastectomia quirurgica, radioterapia, terapia de ablacion hormonal, castracion quirurgica y la quimioterapia continuan siendo las principales modalidades de tratamiento. Desafortunadamente, estos tratamientos son ineficaces para muchos y con frecuencia se asocian con consecuencias indeseables.

30 Con respecto al diagnostico, la falta de un marcador tumoral prostatico que pueda detectar de forma precisa tumores de etapa temprana, localizados sigue siendo una limitacion significativa en el diagnostico y tratamiento de esta enfermedad. Aunque el ensayo de antigeno especifico de prostata en suero (PSA) ha sido una herramienta muy util, sin embargo su especificidad y utilidad general se consideran en general insuficientes en varios aspectos importantes.

35 El progreso para identificar marcadores especificos adicionales para cancer de prostata se ha mejorado por la generacion de xenoinjertos de cancer de prostata que pueden recapitular diferentes etapas de la enfermedad en ratones. Los xenoinjertos de LAP (Cancer de Prostata de Los Angeles) son xenoinjertos de cancer de prostata que han sobrevivido al pase en varios ratones inmunodeficientes combinados graves (SCID) y han mostrado la capacidad para imitar la transicion de dependencia de androgenos a independencia de androgenos (Klein y col.,

40 1997, Nat. Med. 3: 402). Los marcadores de cancer de prostata identificados mas recientemente incluyen PCTA-1 (Su y col., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7252), antigeno de membrana especifica de prostata (PSM) (Pinto y col., Clin Cancer Res 2 sep 1996 (9): 1445-51), STEAP (Hubert, y col., Proc Natl Acad Sci USA. 17 Dic 1999; 96(25): 14523-8) y antigeno de celulas madre de prostata (PSCA) (Reiter y col., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1735).

Aunque los marcadores previamente identificados tales como PSA, PSM, PCTA y PSCA han facilitado intentos de

45 diagnosticar y tratar cancer de prostata, existe la necesidad de identificar marcadores adicionales y dianas terapeuticas para canceres de prostata y relacionados para mejorar adicionalmente el diagnostico y la terapia.

El carcinoma de celulas renales (RCC) representa aproximadamente el 3 por ciento de tumores malignos adultos. Una vez que los adenomas alcanzan un diametro de 2 a 3 cm, existe potencial de tumor maligno. En el adulto, los dos tumores renales malignos principales son adenocarcinoma de celulas renales y carcinoma de celulas 50 transicionales de la pelvis renal o ureter. La incidencia de adenocarcinoma de celulas renales se estima en mas de

29.000 casos en los Estados Unidos, y mas de 11.600 pacientes murieron de esta enfermedad en 1998. El carcinoma de celulas transicionales es menos frecuente, con una incidencia de aproximadamente 500 casos por ano en los Estados Unidos.

La cirugia ha sido la terapia principal para adenocarcinoma de celulas renales durante muchas decadas. Hasta hace 55 poco, la enfermedad metastasica ha sido refractaria a cualquier terapia sistemica. Con los desarrollos recientes en terapias sistemicas, particularmente inmunoterapias, el carcinoma de celulas renales metastasico puede enfocarse

de forma agresiva en pacientes apropiados con una posibilidad de respuestas duraderas. No obstante, sigue existiendo la necesidad de terapias eficaces para estos pacientes.

De todos los nuevos casos de cancer en los Estados Unidos, el cancer de vejiga representa aproximadamente 5 por ciento en los hombres (quinta neoplasia mas habitual) y 3 por ciento en mujeres (octava neoplasia mas habitual). La incidencia esta aumentando lentamente, simultaneamente con una poblacion crecientemente mas vieja. En 1998, hubo una estimacion de 54.500 casos, incluyendo 39.500 en hombres y 15.000 en mujeres. La incidencia ajustada por edad en los Estados Unidos es de 32 por 100.000 para hombres y 8 por 100.000 en mujeres. La relacion historica de hombre/mujer de 3:1 puede estar reduciendose en relacion con los patrones del tabaquismo en mujeres. Hubo una estimacion de 11.000 muertes de cancer de vejiga en 1998 (7.800 en hombres y 3.900 en mujeres). La incidencia y mortalidad de cancer de vejiga aumentan fuertemente con la edad y seran un problema creciente a medida que la poblacion se haga mas vieja.

La mayoria de los canceres de vejiga recurren en la vejiga. El cancer de vejiga se trata con una combinacion de reseccion transuretral de la vejiga (TUR) y quimioterapia o inmunoterapia intravesical. La naturaleza multifocal y recurrente del cancer de vejiga apunta a las limitaciones de TUR. La mayoria de los canceres invasivos de musculo no se curan por TUR solamente. La cistectomia radical y desviacion urinaria son los medios mas eficaces para eliminar el cancer pero conllevan un impacto innegable en la funcion urinaria y sexual. Continua habiendo una necesidad significativa de modalidades de tratamiento que sean beneficiosas para pacientes con cancer de vejiga.

Se produjo una estimacion de 130.200 casos de cancer colorrectal en 2000 en los Estados Unidos, incluyendo

93.800 casos de cancer de colon y 36.400 de cancer rectal. Los canceres colorrectales son los terceros canceres mas habituales en hombres y mujeres. Las tasas de incidencia se redujeron significativamente durante 1992-1996 (de 2,1% por ano). La investigacion sugiere que estas reducciones se han debido a aumento de exploracion y retirada de polipos, lo que evita la progresion de los polipos a canceres invasivos. Hubo una estimacion de 56.300 muertes (47.700 de cancer de colon, 8.600 de cancer rectal) en 2000, lo que representa aproximadamente el 11% de todas las muertes por cancer en Estados Unidos.

En la actualidad, la cirugia es la forma mas habitual de terapia para cancer colorrectal, y para canceres que no se han propagado es con frecuencia curativa. Se proporciona quimioterapia, o quimioterapia mas radiacion, antes o despues de cirugia a la mayoria de los pacientes cuyo cancer ha perforado en profundidad la pared intestinal o se ha propagado a los ganglios linfaticos. Se necesita ocasionalmente una colostomia permanente (creacion de una abertura abdominal para eliminacion de residuos corporales) para cancer de colon y con poca frecuencia se requiere para cancer rectal. Continua habiendo una necesidad de modalidades de diagnostico y tratamiento eficaces para cancer colorrectal.

Hubo una estimacion de 164.100 nuevos casos de cancer de pulmon y bronquial en 2000, que representan el 14% de todos los diagnosticos de cancer en Estados Unidos. La tasa de incidencia de cancer de pulmon y bronquial esta reduciendose significativamente en hombres, desde un maximo de 86,5 por 100.000 en 1984 a 70,0 en 1996. En los anos 90, la tasa de aumento entre mujeres comenzo a ralentizarse. En 1996, la tasa de incidencia en mujeres fue de 42,3 por 100.000.

El cancer de pulmon y bronquial provoco una estimacion de 156.900 muertes en 2000, que explican el 28% de todas las muertes por cancer. Durante 1992-1996, la mortalidad de cancer de pulmon se redujo significativamente entre hombres (-1,7% por ano) mientras que las tasas para mujeres aun estaban aumentando significativamente (0,9% por ano). Desde 1987, mas mujeres han muerto cada ano de cancer de pulmon que de cancer de mama, que, durante mas de 40 anos, fue la principal causa de muerte por cancer en mujeres. La reduccion de incidencia de cancer de pulmon y tasas de mortalidad resulto con mas probabilidad de las tasas de tabaquismo reducidas durante los 30 anos anteriores; sin embargo, los patrones de tabaquismo en reduccion entre mujeres quedan por detras de los de los hombres. Es preocupante que aunque las reducciones del uso del tabaco en adultos se han ralentizado, el uso del tabaco en los jovenes esta aumentando de nuevo.

Las opciones de tratamiento para cancer de pulmon y bronquial se determinan por el tipo y etapa del cancer e incluyen cirugia, radioterapia y quimioterapia. Para muchos canceres localizados, la cirugia es habitualmente el tratamiento de eleccion. Debido a que la enfermedad habitualmente ya se ha propagado en el momento en que se descubre, con frecuencia se necesitan radioterapia y quimioterapia en combinacion con cirugia. La quimioterapia por si sola o combinada con radiacion es el tratamiento de eleccion para cancer de pulmon de celulas pequenas; en este regimen, un gran porcentaje de pacientes experimentan remision, que en algunos casos es de larga duracion. Existe, sin embargo, una necesidad continua de enfoques de diagnostico y tratamiento eficaces para canceres de pulmon y bronquiales.

Se esperaba que se produjera una estimacion de 182.800 nuevos casos invasivos de cancer de mama entre mujeres en los Estados Unidos durante el 2000. Adicionalmente, se esperaba diagnosticar aproximadamente 1,400 nuevos casos de cancer de mama en hombres en 2000. Despues de aumentar aproximadamente 4% por ano en los anos 80, las tasas de incidencia de cancer de mama en mujeres se han nivelado en los anos 90 a aproximadamente 110,6 casos por 100.000.

Solamente en los Estados Unidos, hubo una estimacion de 41.200 muertes (40.800 mujeres, 400 hombres) en 2000 debido a cancer de mama. El cancer de mama se clasifica en segundo lugar entre las muertes por cancer en mujeres. De acuerdo con los datos mas recientes, las tasas de mortalidad se redujeron significativamente durante 1992-1996 con las mayores reducciones en mujeres jovenes, tanto blancas como negras. Estas reducciones fueron probablemente el resultado de deteccion mas temprana y tratamiento mejorado.

Teniendo en cuenta las circunstancias medicas y las referencias del paciente, el tratamiento de cancer de mama puede implicar lumpectomia (retirada local del tumor) y retirada de los ganglios linfaticos bajo el brazo; la mastectomia (retirada quirurgica de la mama) y retirada de los ganglios linfaticos bajo el brazo; radioterapia; quimioterapia; o terapia hormonal. Con frecuencia, se usan dos o mas procedimientos en combinacion. Numerosos estudios han mostrado que, para enfermedad de etapa temprana, las tasas de supervivencia a largo plazo despues de lumpectomia mas radioterapia son similares a tasas de supervivencia despues de mastectomia radical modificada. Avances significativos en tecnicas de reconstruccion proporcionan varias opciones para reconstruccion de la mama despues de mastectomia. Recientemente, dicha reconstruccion se ha realizado a la vez que la mastectomia.

La escision local de carcinoma ductal in situ (DCIS) con cantidades adecuadas de tejido de mama normal circundante puede evitar la recurrencia local del DCIS. La radiacion a la mama y/o tamoxifeno pueden reducir la probabilidad de que se produzca DCIS en el tejido mamario restante. Esto es importante debido a que DCIS, si se deja sin tratar, puede desarrollarse a cancer de mama invasivo. No obstante, hay graves efectos secundarios o secuelas para estos tratamientos. Existe, por lo tanto, una necesidad de tratamientos de cancer de mama eficaces.

Hubo una estimacion de 23.100 nuevos casos de cancer de ovario en los Estados Unidos en 2000. Representan el 4% de todos los canceres entre mujeres y se clasifican en segundo lugar entre canceres ginecologicos. Durante 1992-1996, las tasas de incidencia de cancer de ovario se redujeron significativamente. Como consecuencia de cancer de ovario, hubo una estimacion de 14.000 muertes en 2000. El cancer de ovario causa mas muertes que cualquier otro cancer del sistema reproductor femenino.

La cirugia, radioterapia y quimioterapia son opciones de tratamiento para cancer de ovario. La cirugia habitualmente incluye la retirada de uno o ambos ovarios, las trompas de falopio (salpingo-ooforectomia) y el utero (histerectomia). En algunos tumores muy tempranos, solo se retirara el ovario implicado, especialmente en mujeres jovenes que desean tener hijos. En enfermedad avanzada, se realiza un intento de retirar toda la enfermedad intraabdominal para potenciar el efecto de quimioterapia. Continua habiendo una importante necesidad de opciones de tratamiento eficaces para cancer de ovario.

Hubo una estimacion de 28.300 nuevos casos de cancer pancreatico en los Estados Unidos en 2000. Durante los ultimos 20 anos, las tasas de cancer pancreatico se han reducido en hombres. Las tasas entre mujeres han permanecido aproximadamente constantes pero pueden estar empezando a reducirse. El cancer pancreatico provoco una estimacion de 28.200 muertes en 2000 en los Estados Unidos. Durante los ultimos 20 anos, ha habido una reduccion ligera pero significativa de las tasas de mortalidad entre hombres (aproximadamente -0.9% por ano) mientras que las tasas han aumentado ligeramente entre mujeres.

La cirugia, radioterapia y quimioterapia son opciones de tratamiento para cancer pancreatico. Estas opciones de tratamiento pueden extender la supervivencia y/o aliviar sintomas en muchos pacientes pero no es probable que produzcan una cura para la mayoria. Existe una necesidad significativa de opciones terapeuticas y de diagnostico adicionales para cancer pancreatico.

Sumario de la invención

La presente invencion se refiere a un gen, designado 273P4B7, que se ha descubierto ahora que se sobreexpresa en el cancer o los canceres enumerados en la Tabla I. El analisis de expresion de transferencia de Northern de expresion del gen 273P4B7 en tejidos normales muestra un patron de expresion restringido en tejidos adultos. Se proporcionan las secuencias de nucleotidos (Figura 2) y aminoacidos (Figura 2 y Figura 3) de 273P4B7. El perfil relacionado con tejido de 273P4B7 en tejidos adultos normales, combinado con la sobreexpresion observada en los tejidos enumerados en la Tabla I, muestran que 273P4B7 se sobreexpresa de forma aberrante en al menos algunos canceres, y de este modo actua como una diana de diagnostico, profilactica, de pronostico y/o terapeutica util para canceres del tejido o los tejidos tales como los enumerados en la Tabla I.

La invencion proporciona polinucleotidos correspondientes o complementarios a todos o parte de los genes 273P4B7, ARNm y/o secuencias codificantes, preferentemente de forma aislada incluyendo polinucleotidos que codifican proteinas relacionadas con 273P4B7, asi como ADN, ARN, hibridos de ADN/ARN y moleculas relacionadas, y polinucleotidos u oligonucleotidos que hibridan con los genes 273P4B7, ARNm, o con polinucleotidos que codifican 273P4B7. Tambien se proporcionan medios para aislar ADNc y los genes que codifican 273P4B7. Tambien se proporcionan moleculas de ADN recombinante que contienen polinucleotidos 273P4B7, y celulas transformadas o transducidas con tales moleculas. En ciertas realizaciones, hay una condicion de que la secuencia de acido nucleico completa de la Figura 2 no se codifique y/o la secuencia de aminoacidos completa de la Figura 2 no se prepare. En ciertas realizaciones, se codifica la secuencia de acido nucleico completa de la Figura 2 y/o se

prepara la secuencia de aminoacidos completa de la Figura 2, estando cualquiera de las dos en formas de dosis unitarias humanas respectivas.

La invencion proporciona ademas procedimientos para detectar la presencia y estado de polinucleotidos y proteinas 273P4B7 en diversas muestras biologicas, asi como procedimientos para identificar celulas que expresan 273P4B7. Una realizacion tipica de la presente invencion proporciona procedimientos para supervisar productos genicos de 273P4B7 en una muestra de hematologia o tejido que tenga o se sospeche que tenga alguna forma de desregulacion del crecimiento tal como cancer.

Ademas, la invencion comprende secuencias de acido nucleico de 273P4B7. Las realizaciones de una secuencia de acido nucleico de la invencion comprenden una secuencia que codifica una secuencia de aminoacidos como se expone en el presente documento.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. La secuencia de SSH de 273P4B7 de 170 nucleótidos.

Figura 2.A) La secuencia de ADNc y aminoacidos de 273P4B7 variante 1 (tambien llamada "273P4B7 v.1" o "273P4B7 variante 1") se muestra en la Figura 2A. La metionina de partida esta subrayada. La fase abierta de lectura se extiende desde el acido nucleico 95-3847 incluyendo el codon de parada.

B) La secuencia de ADNc y aminoacidos de 273P4B7 variante 2 (tambien llamada "273P4B7 v.2") se muestra en la Figura 2B. El codon para la metionina de partida esta subrayado. La fase abierta de lectura se extiende desde el acido nucleico 604-3987 incluyendo el codon de parada.

C) 273P4B7 v.3 a v.8, variaciones de SNP 273P4B7 v.1. Las 273P4B7 v.3 a v.8 son variantes con diferencia de un unico nucleotido de 273P4B7 v.1. 273P4B7 v.3, v.7 y v.8 codifican la misma proteina que v.1. Las proteinas de 273P4B7 v.4, v. 5 y v.6 difieren de 273P4B7 v.1 por un aminoacido. Aunque estas variantes de SNP se muestran por separado, tambien pueden aparecer en cualquier combinacion y en cualquiera de las variantes de transcrito enumeradas anteriormente en las Figuras 2A y 2B.

D) La secuencia de ADNc y aminoacidos de 273P4B7 variante 9 (tambien llamada "273P4B7 v.9") se muestra en la Figura 2D. El codon para la metionina de partida esta subrayado. La fase abierta de lectura se extiende desde el acido nucleico 4-3324 incluyendo el codon de parada.

E) La secuencia de ADNc y aminoacidos de 273P4B7 variante 10 (tambien llamada "273P4B7 v.10") se muestra en la Figura 2E. El codon para la metionina de partida esta subrayado. La fase abierta de lectura se extiende desde el acido nucleico 688-1947 incluyendo el codon de parada.

F) La secuencia de ADNc y aminoacidos de 273P4B7 variante 11 (tambien llamada "273P4B7 v.11") se muestra en la Figura 2F. El codon para la metionina de partida esta subrayado. La fase abierta de lectura se extiende desde el acido nucleico 114-1373 incluyendo el codon de parada.

Figura 3.

A) La secuencia de aminoacidos de 273P4B7 v.1 se muestra en la Figura 3A; tiene 1250 aminoacidos. B) La secuencia de aminoacidos de 273P4B7 v.2 se muestra en la Figura 3B; tiene 1127 aminoacidos. C) La secuencia de aminoacidos de 273P4B7 v.4 se muestra en la Figura 3C; tiene 1250 aminoacidos. D) La secuencia de aminoacidos de 273P4B7 v.5 se muestra en la Figura 3D; tiene 1250 aminoacidos. E) La secuencia de aminoacidos de 273P4B7 v.6 se muestra en la Figura 3E; tiene 1250 aminoacidos. F) La secuencia de aminoacidos de 273P4B7 v.9 se muestra en la Figura 3F; tiene 1106 aminoacidos. G) La secuencia de aminoacidos de 273P4B7 v.10 se muestra en la Figura 3G; tiene 419 aminoacidos. H) La secuencia de aminoacidos de 273P4B7 v.11 se muestra en la Figura 3H; tiene 419 aminoacidos.

Como se usa en el presente documento, una referencia a 273P4B7 incluye todas las variantes del mismo, incluyendo las mostradas en las Figuras 2, 3, 10 y 11, a no ser que el contexto claramente indique otra cosa.

Figura 4. Alineamiento de 273P4B7 con homologos conocidos. Figura 4(A) Alineamiento de 273P4B7 con proteina humana no nombrada (giI22760345). Figura 4(B) Alineamiento de 273P4B7 con antigeno tumoral BJ-HCC-15 humano (giI22002580). Figura 4(C) Alineamiento de 273P4B7 con Proteina de Raton (giI27706852).

Figura 5. Perfil de hidrofilia de aminoacidos de 273P4B7 v.1 determinada por analisis de secuencia de algoritmo informatico usando el procedimiento de Hopp y Woods (Hopp T. P., Woods K. R., 1981. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

78: 3824-3828) al que se accede en el Sitio Web Protscale localizado en Internet en (expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) a traves del servidor de biologia molecular ExPasy.

Figura 6. Perfil hidropatico de aminoacidos de 273P4B7 v.1 determinado por analisis de secuencia de algoritmo informatico usando el procedimiento de Kyte y Doolittle (Kyte J., Doolittle R. F., 1982. J. Mol. Biol. 157: 105-132) al que se accede en el sitio web ProtScale localizado en Internet en (.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) a traves del servidor de biologia molecular ExPasy.

Figura 7. Perfil de porcentaje de restos de aminoacidos accesibles de 273P4B7 v.1 determinado por analisis de secuencia de algoritmo informatico usando el procedimiento de Janin (Janin J., 1979 Nature 277: 491-492) al que se accede en el sitio web ProtScale localizado en Internet en (.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) a traves del servidor de biologia molecular ExPasy.

Figura 8. Perfil de flexibilidad media de aminoacidos de 273P4B7 v.1 determinado por analisis de secuencia de algoritmo informatico usando el procedimiento de Bhaskaran y Ponnuswamy (Bhaskaran R., y Ponnuswamy P. K., 1988. Int. J. Pept. Protein Res. 32: 242-255) al que se accede en el sitio web ProtScale localizado en Internet en (.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) a traves del servidor de biologia molecular ExPasy.

Figura 9. Perfil de giro beta de aminoacidos de 273P4B7 v.1 determinado por analisis de secuencia de algoritmo informatico usando el procedimiento de Deleage y Roux (Deleage, G., Roux B. 1987 Protein Engineering 1:289-294) al que se accede en el sitio web ProtScale localizado en Internet en (.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) a traves del servidor de biologia molecular ExPasy.

Figura 10. Estructuras de variantes de transcrito de 273P4B07. La variante 273P4B07 v.2 se identifico como una variante de transcrito de 273P4B07 v.1. La variante 273P4B07 v.2 extendio el exon 1 en 22 pb en comparacion con

v.1 y anadio un exon entre los exones 1 y 2 de la variante v.1. Las variantes v.9, v.10 y v.11 fueron parte del ultimo exon de v.1 o v.2. No se muestran aqui colas de poli A y SNP. Los numeros entre "()" debajo de las cajas corresponden a los de 273P4B07 v.1. Las longitudes de intrones y exones no son proporcionales.

Figura 11. Alineamiento esquematico de variantes de proteina 273P4B7. Las variantes proteicas corresponden a variantes de nucleotidos. Las variantes de nucleotidos 273P4B07 v.3, v.7 y v.8 codificaron la misma proteina que

v.1. La variante v.2 codifico una proteina que era 123 aminoacidos mas corta que v.1. La variante de nucleotido 273P4B07 v.2 fue una variante de transcrito de v.1, como se muestra en la Figura 10. Las variantes v.9 y v.10 fueron mas cortas y tuvieron algun aminoacido diferente en comparacion con v.1 en las posiciones correspondientes mostradas en la Figura. La variante v.11 fue la misma que la parte C terminal de v.1 y diferente de v.10 en un aminoacido en la posicion 158. El SNP en v.1 tambien podia aparecer en v.2. Las diferencias de un aminoacido se indicaron encima de las cajas. Las cajas negras representan la misma secuencia que 273P4B07 v.1. Los numeros debajo de la caja corresponden a 273P4B07 v.1.

Figura 12. Alineamiento esquematico de variantes de SNP de 273P4B07. Las variantes 273P4B07 v.3 a v.8 fueron variantes con diferencias de un nucleotido en comparacion con la variante v.1 (ORF: 29-1858). Aunque estas variantes de SNP se mostraron por separado, tambien podian aparecer en cualquier combinacion y en cualquier variante de transcrito que contenia los pares de bases, tales como v.2 mostrada en la Figura 10. Los numeros corresponden a los de 273P4B07 v.1. La caja negra muestra la misma secuencia que 273P4B07 v.1. Los SNP se indican por encima de la caja.

Figura 13. Prediccion de estructura secundaria y dominios transmembrana para variante de proteina 273P4B7 1. Figura 13A: La estructura secundaria de la variante de proteina 273P4B7 1 (Figura 13A) (SEC ID N°: 134) se predijo usando el procedimiento de Red Neural Jerarquica -HNN (NPS@: Network Protein Sequence Analysis TIBS Marzo de 2000 Vol. 25, N° 3 [291]: 147-150 Combet C., Blanchet C., Geourjon C. y Deleage G., http://pbil.ibcp.ibcp-fr/cgibin/npsa auto-mat.pl?page=npsa nn.html), al que se accede desde el servidor de biologia molecular ExPasy localizado en Internet en (www.expasy.ch/tools/). Este procedimiento predice la presencia y localizacion de helices alfa, hebras extendidas y bucles aleatorios a partir de la secuencia proteica primaria. Tambien se enumera el porcentaje de la proteina en una estructura secundaria dada.

Figura 13B: Representacion esquematica de la probabilidad de existencia de regiones transmembrana de 273P4B7 variante 1 basandose en el algoritmo TMpred de Hofmann y Stoffel que utiliza TMBASE (K. Hofmann, W. Stoffel. TMBASE - A database of membrane spanning protein segments Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374: 166, 1993). Figura 13C: Representacion esquematica de la probabilidad de la existencia de regiones transmembrana de 273P4B7 variante 1, basandose en el algoritmo TMHMM de Sonnhammer, von Heijne, y Krogh (Erik L. L. Sonnhammer, Gunnar von Heijne, y Anders Krogh: A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences. In Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, p 175-182 Ed J. Glasgow, T. Littlejohn, F. Major, R. Lathrop, D. Sankoff, y C. Sensen Menlo Park, CA: AAAI Press, 1998). Se accede a los algoritmos TMpred y TMHMM desde el servidor de biologia molecular ExPasy localizado en Internet en (www.expasy.ch/tools/).

Figura 14. Expresion de 273P4B7 por RT-PCR. Se preparo ADNc de primera cadena a partir de tejidos normales (vejiga, cerebro, corazon, rinon, higado, pulmon, prostata, bazo, musculo esqueletico, testiculo, pancreas, colon y estomago) y de grupos de muestras de ensayo de cancer de paciente (grupo de cancer de prostata, grupo de cancer de vejiga, grupo de cancer de rinon, grupo de cancer de colon, grupo de cancer de pulmon, grupo de cancer de ovario, grupo de cancer de mama, grupo de metastasis de cancer, grupo de cancer de pancreas, grupo de xenoinjerto de cancer de prostata, metastasis de prostata a ganglio linfatico, grupo de cancer de hueso y melanoma, grupo de cancer cervical, grupo de cancer de linfoma, grupo de cancer de estomago, grupo de cancer de utero y grupo de multixenoinjerto). Se realizo normalizacion por PCR usando cebadores para actina. Se realizo PCR semicuantitativa usando cebadores para 273P4B7 a los 22, 26 y 30 ciclos de amplificacion. En la (Figura 14A) se

muestra una imagen del gel de agarosa de RT-PCR. En la (Figura 14B) se cuantificaron productos de PCR usando el software Alphalmager. Los resultados muestran expresion fuerte de 273P4B7 en grupo de cancer de prostata, grupo de cancer de vejiga, grupo de cancer de rinon, grupo de cancer de colon, grupo de cancer de pulmon, grupo de cancer de ovario, grupo de cancer de mama, grupo de metastasis de cancer, grupo de cancer de pancreas, grupo de xenoinjerto de cancer de prostata, metastasis de prostata a ganglio linfatico, grupo de cancer de hueso y melanoma, grupo de cancer cervical, grupo de cancer de linfoma, grupo de cancer de estomago, grupo de cancer de utero y grupo de multixenoinjerto (grupo de xenoinjerto de cancer de prostata, cancer de rinon y cancer de vejiga). En tejidos normales, 273P4B7 se expresa predominantemente en testiculo y no en ningun otro tejido normal ensayado.

Figura 15. Expresion de 273P4B7 en tejidos normales. Se exploraron dos transferencias de Northern de tejido multiple (Clontech) ambas con 2 μg de ARNm/carril con la secuencia de 273P4B7. Se indican patrones de tamano en kilobases (kb) en el lateral. Los resultados muestran expresion de un transcrito de 273P4B7 de aproximadamente 7 kb en testiculo normal pero no en los otros tejidos normales ensayados.

Figura 16. Expresion de 273P4B7 en muestras de ensayo del paciente con cancer de pancreas, ovario y testiculo. Se extrajo ARN de pancreas normal (NPa), ovario normal (NO), testiculo normal (NTe), muestra de ensayo de paciente con cancer de pancreas (P1), muestra de ensayo de paciente con cancer de ovario (P2, P3, P4) y muestra de ensayo de paciente con cancer de testiculo (P5, P6, P7). Se exploro transferencia de Northern con 10 μg de ARN total/carril con secuencia de SSH de 273P4B7. Se indican patrones de tamano en kilobases (kb) en el lateral. Se detecto transcrito de 273P4B7 en las muestras de ensayo del paciente, pero no en los tejidos normales.

Figura 17. Expresion de 273P4B7 en muestras de ensayo de paciente con cancer cervical. Figura 17(A): Se extrajo ARN total de muestras de ensayo de paciente con cancer cervical (T1-T7) y linea celular HeLa. Se exploro transferencia de Northern con 10 μg de ARN total/carril con secuencia de SSH de 273P4B7. Se indican patrones de tamano en kilobases (kb) en el lateral. Se detecto transcrito de 273P4B7 en todas las muestras de ensayo de paciente ensayadas asi como en la linea celular Hela. Figura 17(B): Se preparo ADNc de primera cadena de un panel de muestras de ensayo de paciente con cancer cervical, cuello de utero normal y linea celular cervical HeLa. Se realizo normalizacion por PCR usando cebadores para actina. Se realizo PCR semicuantitativa, usando cebadores para 273P4B7, a 26 y 30 ciclos de amplificacion. Las muestras se procesaron en un gel de agarosa, y los productos de PCR se cuantificaron usando el software Alphalmager. Se registro la expresion, ausente, baja, media o alta. Los resultados muestran expresion de 273P4B7 en la mayoria de los tejidos de cancer cervical ensayados.

Figura 18. Expresion de 273P4B7 en muestras de ensayo de paciente con cancer de vejiga. Se preparo ADNc de primera cadena a partir de un panel de muestras de ensayo de paciente con cancer de vejiga, vejiga normal (N) y lineas celulares de cancer de vejiga (UM-UC-3, TCCSUP, J82). Se analizo normalizacion por PCR usando cebadores para actina. Se realizo PCR semicuantitativa, usando cebadores para 273P4B7, a 26 y 30 ciclos de amplificacion. Las muestras se procesaron en un gel de agarosa (Figura 18(A)) y se cuantificaron productos de PCR usando el software Alphalmager (Figura 18(B)). La expresion se registro como ausente, baja, media o alta. Los resultados muestran la expresion de 273P4B7 en la mayoria de los tejidos de cancer de vejiga ensayados, pero no en los tejidos de vejiga normal.

Figura 19. Expresion de 273P4B7 en muestras de ensayo de paciente de cancer de colon. Se preparo ADNc de primera cadena a partir de un panel de muestras de ensayo de paciente con cancer de colon, colon normal y lineas celulares de cancer de colon (LoVo, CaCo-2, SK-CO1, Colo205 y T284). Se realizo normalizacion por PCR usando cebadores para actina. Se realizo PCR semicuantitativa, usando cebadores para 273P4B7, a 26 y 30 ciclos de amplificacion. Las muestras se procesaron en un gel de agarosa y se cuantificaron productos de PCR usando el software Alphalmager. La expresion se registro como ausente, baja, media o alta. Los resultados muestran la expresion de 273P4B7 en la mayoria de los tejidos de cancer de colon ensayados, pero no en los tejidos de colon normal. Tambien se detecto expresion en las lineas celulares LoVo, CaCo-2, SK-CO1, Colo205, pero no en la linea celular T284.

Figura 20. Expresion de 273P4B7 en muestras de ensayo del paciente con cancer de ovario. Se preparo ADNc de primera cadena a partir de un panel de muestras de ensayo de paciente con cancer de ovario, ovario normal y lineas celulares de cancer de ovario (OV-1063, PA-1, SW626). Se realizo normalizacion por PCR usando cebadores para actina. Se realizo PCR semicuantitativa, usando cebadores para 273P4B7, a 26 y 30 ciclos de amplificacion. Las muestras se procesaron en un gel de agarosa y se procesaron en gel de agarosa, y se cuantificaron productos de PCR usando el software Alphalmager. La expresion se registro como ausente, baja, media o alta. Los resultados muestran expresion de 273P4B7 en la mayoria de tejidos de cancer de ovario ensayados asi como en las lineas celulares, pero no en ovario normal.

Descripción detallada de la invención

Esquema de las secciones

I.) Definiciones II.) Polinucleotidos de 273P4B7

II.A.) Usos de polinucleotidos de 273P4B7 II.A.1.) Supervision de Anomalias Geneticas II.A.2.) Realizaciones Antisentido II.A.3.) Cebadores y Pares de Cebadores

II.A.4.) Aislamiento de Moleculas de Acido Nucleico que Codifican 273P4B7

II.A.5.) Moleculas de Acido Nucleico Recombinantes y Sistemas de Huesped-Vector III.) Proteinas relacionadas con 273P4B7

III.A.) Expresion de Proteinas relacionadas con 273P4B7

IV.) Procedimientos para la Deteccion de 273P4B7 V.) Procedimientos para Supervisar el Estado de Genes relacionados con 273P4B7 y Sus Productos VI.) Realizaciones de Diagnostico y Pronostico de 273P4B7.

VII.) KITS/Articulos de Fabricacion

I.) Definiciones:

A no ser que se definan de otro modo, se pretende que todos los terminos de la tecnica, notaciones y otros terminos cientificos o terminologia usada en el presente documento tengan los significados habitualmente entendidos por los expertos en la materia a la que se refiere la presente invencion. En algunos casos, se definen terminos con significados habitualmente entendidos en el presente documento para clarificar y/o para una referencia rapida, y no deberia interpretarse necesariamente que la inclusion de tales definiciones en el presente documento represente una diferencia sustancial sobre la que se entiende generalmente en la tecnica. Muchas de las tecnicas y procedimientos descritos o referidos en el presente documento se entienden bien y se emplean habitualmente usando metodologia convencional por los expertos en la materia, tales como, por ejemplo, las metodologias de clonacion molecular ampliamente utilizadas descritas en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a edicion (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. Segun sea apropiado, los procedimientos que implican el uso de kits y reactivos disponibles en el mercado se llevan a cabo generalmente de acuerdo con protocolos y/o parametros definidos por el fabricante a no ser que se indique de otro modo.

Las expresiones "cancer de prostata avanzado", "cancer de prostata localmente avanzado", "enfermedad avanzada" y "enfermedad localmente avanzada" significan canceres de prostata que se han extendido a traves de la capsula prostatica, y pretenden incluir enfermedad de estadio C segun el sistema de la Asociacion Urologica Americana (AUA), enfermedad de estadio C1- C2 segun el sistema de Whitmore-Jewett y enfermedad de estadio T3 - T4 y N+ segun el sistema de TNM (tumor, nodulo, metastasis). En general, no se recomienda cirugia para pacientes con enfermedad localmente avanzada, y estos pacientes tienen resultados sustancialmente menos favorables en comparacion con pacientes que tienen cancer de prostata clinicamente localizado (confinado a organos). La enfermedad localmente avanzada se identifica clinicamente por pruebas palpables de induracion detras del borde lateral de la prostata, o asimetria o induracion por encima de la base de la prostata. El cancer de prostata localmente avanzado se diagnostica en la actualidad de forma patologica despues de prostatectomia radical si el tumor invade o penetra la capsula prostatica, se extiende al margen quirurgico, o invade las vesiculas seminales.

Se pretende que "alterar el patron de glicosilacion nativo" para los fines del presente documento signifique suprimir uno o mas restos de carbohidrato hallados en el 273P4B7 de secuencia nativa (retirando el sitio de glicosilacion subyacente o suprimiendo la glicosilacion por medios quimicos y/o enzimaticos) y/o anadir uno o mas sitios de glicosilacion que no estan presentes en el 273P4B7 de secuencia nativa. Ademas, la frase incluye cambios cualitativos en la glicosilacion de las proteinas nativas, lo que implica un cambio en la naturaleza y proporciones de los diversos restos de carbohidrato presentes.

El termino "analogo" se refiere a una molecula que es estructuralmente similar o comparte atributos similares o correspondientes con otra molecula (por ejemplo, una proteina relacionada con 273P4B7). Por ejemplo, un analogo de una proteina 273P4B7 puede unirse especificamente con un anticuerpo o linfocito T que se una especificamente a 273P4B7.

La expresion "secuencias de codones optimizados" se refieren a secuencias de nucleotidos que se han optimizado para una especie huesped particular reemplazando cualquier codon que tenga una frecuencia de uso de menos de aproximadamente 20%. Las secuencias de nucleotidos que se han optimizado para expresion en una especie huesped dada por eliminacion de secuencias de poliadenilacion espurias, eliminacion de senales de corte y empalme de exones/intrones, eliminacion de repeticiones de tipo transposon y/u optimizacion de contenido de GC ademas de optimizacion de codones se denominan en el presente documento "secuencias de expresion potenciada".

El "producto genico" se denomina en ocasiones en el presente documento una proteina o ARNm. Por ejemplo, un "producto genico de la invencion" se denomina en ocasiones en el presente documento una "secuencia de aminoacidos de cancer", "proteina de cancer", "proteina de un cancer enumerado en la Tabla I", un "ARNm de

cancer", "ARNm de un cancer enumerado en la Tabla I", etc. La proteina de cancer puede codificarse por un acido nucleico de la Figura 2. La proteina de cancer puede ser un fragmento o, como alternativa, ser la proteina de longitud completa para el fragmento codificado por los acidos nucleicos de la Figura 2. Puede usarse una secuencia de aminoacidos de cancer para determinar la identidad o similitud de secuencia. Las secuencias pueden ser variantes alelicas de origen natural de una proteina codificada por un acido nucleico de la Figura 2. Las secuencias pueden ser variantes de secuencia como se han descrito adicionalmente en el presente documento.

Se conocen bien por los expertos en la materia ensayos de "exploracion de alto rendimiento" con respecto a la presencia, ausencia, cuantificacion u otras propiedades de acidos nucleicos particulares. De forma similar, se conocen de forma similar ensayos de union y ensayos de genes indicadores. Por lo tanto, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5.559.410 desvela procedimientos de exploracion de alto rendimiento para proteinas; la Patente de Estados Unidos N° 5.585.639 desvela procedimientos de exploracion de alto rendimiento para union de acido nucleico (es decir, en matrices) mientras que las Patentes de Estados Unidos N° 5.576.220 y 5.541.061 desvelan procedimientos de alto rendimiento para explorar con respecto a union de ligando/anticuerpo.

Ademas, estan disponibles en el mercado sistemas de exploracion de alto rendimiento (vease, por ejemplo, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ; Zymark Corp., Hopkinton, MA; Air Technical Industries, Mentor, OH; Beckman Instruments, Inc. Full-erton, CA; Precision Systems, Inc., Natick, MA; etc.). Estos sistemas tipicamente automatizan procedimientos completos, incluyendo todo el pipeteo de muestras y reactivos, distribucion de liquidos, incubaciones temporalizadas y lecturas finales de la microplaca en detector o detectores apropiados para el ensayo. Estos sistemas configurables proporcionan alto rendimiento y rapido arranque asi como un alto grado de flexibilidad y personalizacion. Los fabricantes de tales sistemas proporcionan protocolos detallados para diversos sistemas de alto rendimiento. Por lo tanto, por ejemplo, Zymark Corp. proporciona boletines tecnicos que describen sistemas de exploracion para detectar la modulacion de la transcripcion genica, union de ligando, y similares.

El termino "homologo" se refiere a una molecula que muestra homologia con otra molecula, por ejemplo, teniendo secuencias de restos quimicos que son iguales o similares en posiciones correspondientes.

"Antigeno de Leucocitos Humanos" o "HLA" es una proteina del Complejo Mayor de Histocompatibilidad de clase II o clase II humano (MHC) (vease, por ejemplo, Stites, y col., IMMUNOLOGY, 8a ED., Lange Publishing, Los Altos, CA (1994)).

Los terminos "hibridar", "hibridando", "hibrida" y similares, usados en el contexto de polinucleotidos, pretenden referirse a condiciones de hibridacion convencionales, preferentemente tales como hibridacion en formamida 50%/SSC6X/SDS 0,1%/ADNbc 100 μg/ml, en las que las temperaturas para hibridacion estan por encima de 37 °C y las temperaturas para lavado en SSC 0,1X/SDS 0,1% estan por encima de 55 grados C.

Las frases "aislado" o "biologicamente puro" se refieren a material que esta sustancialmente o esencialmente sin componentes que normalmente acompanan al material como se encuentra en su estado nativo. Por lo tanto, los peptidos aislados de acuerdo con la invencion preferentemente no contienen materiales normalmente asociados con los peptidos en su ambiente in situ. Por ejemplo, se dice que un polinucleotido esta "aislado" cuando esta sustancialmente separado de polinucleotidos contaminantes que corresponden a o son complementarios de genes distintos de los genes de 273P4B7 o que codifican polipeptidos distintos del producto genico de 273P4B7 o fragmentos del mismo. Un experto en la materia puede emplear facilmente procedimientos de aislamiento de acido nucleico para obtener un polinucleotido de 273P4B7 aislado. Se dice que una proteina esta "aislada", por ejemplo, cuando se emplean procedimientos fisicos, mecanicos o quimicos para retirar las proteinas 273P4B7 de constituyentes celulares que normalmente estan asociados con la proteina. Un experto en la materia puede emplear facilmente procedimientos de purificacion convencionales para obtener una proteina 273P4B7 aislada. Como alternativa, puede prepararse una proteina aislada por medios quimicos.

El termino "mamifero" se refiere a cualquier organismo clasificado como un mamifero, incluyendo ratones, ratas, conejos, perros, gatos, vacas, caballos y seres humanos. En una realizacion de la invencion, el mamifero es un raton. En otra realizacion de la invencion, el mamifero es un ser humano.

Las expresiones "cancer de prostata metastasico" y "enfermedad metastasica" significan canceres de prostata que se han propagado a ganglios linfaticos regionales o a sitios distantes, y se pretende que incluyan enfermedad de estadio D en el sistema AUA y estadio TxNxM+ en el sistema TNM. Como sucede con cancer de prostata localmente avanzado, la cirugia generalmente no esta indicada para pacientes con enfermedad metastasica, y la terapia hormonal (ablacion androgenica) es una modalidad de tratamiento preferida. Los pacientes con cancer de prostata metastasico desarrollan con el tiempo un estado refractario para androgenos en un periodo de 12 a 18 meses de inicio del tratamiento. Aproximadamente la mitad de estos pacientes refractarios para androgenos mueren en un periodo de 6 meses despues de desarrollar ese estado. El sitio mas habitual para metastasis de cancer de prostata es el hueso. Las metastasis de hueso de cancer de prostata son con frecuencia osteoblasticas en lugar de osteoliticas (es decir, dan como resultado formacion neta de hueso). Las metastasis de hueso se encuentran mas frecuentemente en la medula espinal, seguido del femur, pelvis, caja toracica, craneo y humero. Otros sitios habituales para metastasis incluyen ganglios linfaticos, pulmon, higado y cerebro. El cancer de prostata metastasico se diagnostica tipicamente por linfadenectomia pelvica abierta o laparoscopica, exploraciones de radionuclidos de

cuerpo completo, radiografia esqueletica y/o biopsia de lesion de hueso.

Un "excipiente farmaceutico" comprende un material tal como un adyuvante, un vehiculo, agentes tamponantes y de ajuste de pH, agentes de ajuste de tonicidad, agentes humectantes, conservantes y similares.

"Farmaceuticamente aceptable" se refiere a una composicion no toxica, inerte y/o que es fisiologicamente compatible con seres humanos u otros mamiferos.

El termino "polinucleotido" se refiere a una forma polimerica de nucleotidos de al menos 10 bases o pares de bases de longitud, ribonucleotidos o desoxinucleotidos o una forma modificada de uno de los tipos de nucleotidos, y se pretende que incluya formas mono y bicatenarias de ADN y/o ARN. En la tecnica, este termino se usa con frecuencia de forma intercambiable con "oligonucleotido". Un polinucleotido puede comprender una secuencia de nucleotidos desvelada en el presente documento en la que timidina (T), como se muestra por ejemplo en la Figura 2, tambien puede ser uracilo (U); esta definicion se refiere a las diferencias entre las estructuras quimicas de ADN y ARN, en particular la observacion de que una de las cuatro bases principales en ARN es uracilo (U) en lugar de timidina (T).

El termino "polipeptido" significa un polimero de al menos aproximadamente 4, 5, 6, 7 u 8 aminoacidos. A lo largo de la memoria descriptiva, se usan designaciones para aminoacidos de tres letras o una letra convencionales. En la tecnica, ese termino se usa con frecuencia de forma intercambiable con "peptido" o "proteina".

Los "radioisotopos" incluyen, pero sin limitacion, los siguientes (tambien se exponen usos ejemplares no limitantes):

Ejemplos de Isotopos Medicos:

Isotopo

Descripcion de uso

Actinio-225 (AC-225)

Vease Torio-229 (Th-229)

Actinio-227 (AC-227)

Precursor de Radio-223 (Ra-223) que es un emisor alfa usado para tratar metastasis en el esqueleto resultante de cancer (es decir, canceres de mama y prostata) y radioinmunoterapia de cancer.

Bismuto-212 (Bi-212)

Vease Torio-228 (Th-228)

Bismuto-213 (Bi-213)

Vease Torio-229 (Th-229)

Cadmio-109 (Cd-109)

Deteccion de cancer

Cobalto-60 (Co-60)

Fuente de radiacion para radioterapia de cancer, para irradiadores de alimentos y para esterilizacion de suministros medicos.

Cobre-64 (Cu-64)

Un emisor de positrones usado para terapia de cancer y formacion de imagenes de SPECT

Cobre-67 (Cu-67)

Emisor de beta/gamma usado en radioinmunoterapia de cancer y estudios de diagnostico (es decir, canceres de mama y colon y linfoma)

Disprosio-166 (Dy-166)

Radioinmunoterapia de cancer

Erbio-169 (Er-169)

Tratamiento de artritis reumatoide, particularmente para las articulaciones pequenas asociadas con dedos de la mano y del pie

Europio-152 (Eu-152)

Fuente de radicacion para irradiacion de alimentos y para esterilizacion de suministros medicos

Europio-154 (Eu-154)

Fuente de radicacion para irradiacion de alimentos y para esterilizacion de suministros medicos

Gadolinio-153 (Gd-153)

Deteccion de osteoporosis y dispositivos de seguridad de calidad medica nuclear

Oro-198 (Au-198)

Implante y terapia intracavitaria de canceres de ovario, prostata y cerebro

Holmio-166 (Ho-166)

Tratamiento de mieloma multiple en terapia esqueletica dirigida, radioinmunoterapia de cancer, ablacion de medula osea y tratamiento de artritis reumatoide

Yodo-125 (I-125)

Deteccion de osteoporosis, formacion de imagenes de diagnostico, farmacos

indicadores, tratamiento de cancer de cerebro, radiomarcaje, formacion de imagenes

tumorales, mapeo de receptores en el cerebro, radioterapia intersticial, braquiterapia

para tratamiento de cancer de prostata, determinacion de la tasa de filtracion

glomerular (GFR), determinacion del volumen de plasma, deteccion de trombosis

venosa profunda de las piernas

Yodo-131 (I-131)

Evaluacion de la funcion tiroidea, deteccion de enfermedad tiroidea, tratamiento de

cancer de tiroides asi como otras enfermedades de tiroides no malignas (es decir,

enfermedad de Graves, bocio e hipertiroidismo), tratamiento de leucemia, linfoma y

otras formas de cancer (por ejemplo, cancer de mama) usando radioinmunoterapia

Iridio-192 (Ir-192)

Braquiterapia, tratamiento de tumor de cerebro y medula espinal, tratamiento de

arterias bloqueadas (es decir, arteriosclerosis y reestenosis) e implantes para tumores

de mama y prostata

Lutecio-177 (Lu-177)

Radioinmunoterapia de cancer y tratamiento de arterias bloqueadas (es decir,

arteriosclerosis y reestenosis)

Molibdeno-99 (Mo-99)

Precursor de Tecnecio-99m (Tc-99m) que se usa para formacion de imagenes del

cerebro, higado, pulmones, corazon y otros organos. En la actualidad, Tc-99m es el

radioisotopo mas ampliamente usado para formacion de imagenes de diagnostico de

diversos canceres y enfermedades que implican el cerebro, corazon, higado,

pulmones; tambien se usa en deteccion de trombosis venosa profunda de las piernas

Osmio-194 (Os-194)

Radioinmunoterapia de cancer

Paladio-103 (Pd-103)

Tratamiento de cancer de prostata

Platino-195m (Pt-195m)

Estudios sobre biodistribucion y metabolismo de cisplatino, un farmaco

quimioterapeutico

Fosforo-32 (P-32)

Tratamiento de policitemia rubra vera (enfermedad de celulas sanguineas) y leucemia,

diagnostico/tratamiento de cancer de hueso; tratamiento de cancer de colon,

pancreatico y de higado; radiomarcaje de acidos nucleicos para investigacion in vitro,

diagnostico de tumores superficiales, tratamiento de arterias bloqueadas (es decir,

arteriosclerosis y reestenosis) y terapia intracavitaria

Fosforo-33 (P-33)

Tratamiento de leucemia, diagnostico/tratamiento de enfermedad de hueso,

radiomarcaje y tratamiento de arterias bloqueadas (es decir, arteriosclerosis y

reestenosis)

Radio-223 (Ra-223)

Vease Actinio-227 (Ac-227)

Renio-186 (Re-186)

Alivio de dolor por cancer de hueso, tratamiento de artritis reumatoide y diagnostico y

tratamiento de linfoma y canceres de hueso, mama, colon e higado usando

radioinmunoterapia

Renio-188 (Re-188)

Diagnostico y tratamiento de cancer usando radioinmunoterapia, alivio de dolor de

cancer de hueso, tratamiento de artritis reumatoide y tratamiento de cancer de

prostata

Rodio-105 (Rh-105)

Radioinmunoterapia de cancer

Samario-145 (Sm-145)

Tratamiento de cancer ocular

Samario-153 (Sm-153)

Radioinmunoterapia de cancer y alivio del dolor por cancer de hueso

Escandio-47 (Sc-47)

Radioinmunoterapia de cancer y alivio de dolor de cancer de hueso

Selenio-75 (Se-75)

Radioindicador usado en estudios de cerebro, formacion de imagenes de corteza

adrenal por gammaescintigrafia, localizaciones laterales de tumores que secretan

esteroides, exploracion pancreatica, deteccion de glandulas paratiroideas hiperactivas,

medicion de tasa de perdida de acido biliar del grupo endogeno

Estroncio-85 (Sr-85) Deteccion de cancer de hueso y exploraciones cerebrales

Estroncio-89 (Sr-89) Alivio de dolor por cancer de hueso, tratamiento de mieloma multiple y terapia osteoblastica

Tecnecio-99m (Tc-99m) Vease Molibdeno-99 (Mo-99)

Torio-228 (Th-228) Precursor de Bismuto-212 (Bi-212) que es un emisor alfa usado en radioinmunoterapia de cancer

Torio-229 (Th-229) Precursor de Actinio-225 (Ac-225) y precursor anterior de Bismuto-213 (Bi-213) que son emisores alfa usados en radioinmunoterapia de cancer

Tulio-170 (Tm-170) Fuente de gamma para irradiadores de sangre, fuente de energia para dispositivos medicos implantados

(Sn-117m) (Sn-117m) Inmunoterapia de cancer y alivio de dolor por cancer de hueso

Wolframio-188 (W-188) Precursor de Renio-188 (Re-188) que se usa para diagnosticos/tratamiento de cancer,

alivio de dolor por cancer de hueso, tratamiento de artritis reumatoide y tratamiento de

arterias bloqueadas (es decir, arteriosclerosis y reestenosis)

Xenon-127 (Xe-127) Formacion de imagenes neuronales de trastornos cerebrales, estudios de SPECT alta resolucion, ensayos de funcion pulmonar y estudios de flujo sanguineo cerebral

Iterbio-175 (Yb-175) Radioinmunoterapia de cancer

Itrio-90 Microsemillas obtenidas de irradiar Itrio-89 (Y-89) para tratamiento de cancer de higado

Itrio-91 (Y-91) Marcador emisor de gamma para Itrio-90 (Y-90) que se usa para radioinmunoterapia

de cancer (es decir, linfoma, canceres de mama, colon, rinon, pulmon, ovario,

prostata, pancreas e inoperables de higado)

Una molecula de ADN o ARN "recombinante" es una molecula de ADN o ARN que se ha sometido a manipulacion molecular in vitro.

La "rigurosidad" de las reacciones de hibridacion se puede determinar facilmente por un experto habitual en la materia, y generalmente es un calculo empirico que depende de la longitud de la sonda, temperatura de lavado y concentracion salina. En general, sondas mas largas requieren temperaturas mas altas para hibridacion apropiada, mientras que sondas mas cortas necesitan temperaturas mas bajas. La hibridacion depende en general de la capacidad de las secuencias de acido nucleico desnaturalizadas para rehibridar cuando estan presentes cadenas complementarias en un ambiente por debajo de su temperatura de fusion. Cuanto mayor sea el grado de homologia deseada entre la sonda y la secuencia hibridable, mayor sera la temperatura relativa que puede usarse. Como resultado, se deduce que las temperaturas relativas mas altas tenderian a hacer las condiciones de reaccion mas rigurosas, mientras que las temperaturas mas bajas menos. Para detalles adicionales y explicacion de la rigurosidad de las reacciones de hibridacion, vease Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

Las "condiciones rigurosas" o "condiciones de alta rigurosidad", como se definen en el presente documento, se identifican, pero sin limitacion, por las que: (1) emplean fuerza ionica baja y temperatura alta para lavar, por ejemplo cloruro sodico 0,015 M/citrato sodico 0,0015 M/dodecil sulfato sodico 0,1% a 50 °C; (2) emplean durante la hibridacion un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, formamida 50% (v/v) con albumina de suero bovino 0,1%/Ficoll 0,1%/polivinilpirrolidona 0,1%/tampon de fosfato sodico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sodico 750 mM, citrato sodico 75 mM a 42 °C; o (3) emplean formamida 50%, SSC 5 x (NaCl 0,75 M, citrato sodico 0,075 M), fosfato sodico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sodico 0,1%, solucion de Denhardt 5 x, ADN de esperma de salmon sonicado (50 μg/ml), SDS 0,1% y dextran sulfato 10% a 42 °C, con lavados a 42 °C en SSC 0,2 x (cloruro sodico/citrato sodico) y formamida 50% a 55 °C, seguido de lavado de alta rigurosidad que consiste en SSC 0,1 x que contiene EDTA a 55 °C. Las "condiciones moderadamente rigurosas" se describen, pero sin limitacion, por las de Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e

incluyen el uso de solucion de lavado y condiciones de hibridacion (por ejemplo, temperatura, fuerza ionica y % de SDS) menos rigurosas que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas es incubacion durante una noche a 37 °C en una solucion que comprende: formamida 20%, SSC 5 x (NaCl 150 mM, citrato trisodico 15 mM), fosfato sodico 50 mM (pH 7,6), solucion de Denhardt 5 x, dextran sulfato 10%, y ADN de esperma de salmon cortado desnaturalizado 20 mg/ml, seguido de lavado de los filtros en SSC 1 x a aproximadamente 37-50 °C. El experto en la materia reconocera como ajustar la temperatura, fuerza ionica, etc. segun sea necesario para acomodar factores tales como longitud de sonda y similares.

Como se usa en el presente documento "tratar" o "terapeutico" y terminos relacionados gramaticalmente, se refieren a cualquier mejora de cualquier consecuencia de enfermedad, tal como supervivencia prolongada, menor morbilidad y/o una reduccion de los efectos secundarios que son los productos secundarios de una modalidad terapeutica alternativa; no se requiere erradicacion completa de la enfermedad.

El termino "variante" se refiere a una molecula que muestra una variacion de un tipo o norma descrito, tal como una proteina que tiene uno o mas restos de aminoacidos diferentes en la posicion o las posiciones correspondientes de una proteina especificamente descrita (por ejemplo, la proteina 273P4B7 mostrada en la Figura 2 o Figura 3). Un analogo es un ejemplo de una proteina variante. Las isoformas de corte y empalme y Polimorfismos de un unico nucleotido (SNP) son ejemplos adicionales de variantes.

Las "proteinas relacionadas con 273P4B7" incluyen las identificadas especificamente en el presente documento, asi como variantes alelicas, variantes de sustitucion conservativa, analogos y homologos que pueden aislarse/generarse y caracterizarse sin experimentacion indebida siguiendo los procedimientos perfilados en el presente documento o facilmente disponibles en la tecnica. Tambien se incluyen proteinas de fusion que combinan partes de diferentes proteinas 273P4B7 o fragmentos de las mismas, asi como proteinas de fusion de una proteina 273P4B7 y un polipeptido heterologo. Tales proteinas 273P4B7 se denominan colectivamente proteinas relacionadas con 273P4B7

o 273P4B7. La expresion "proteina relacionada con 273P4B7" se refiere a un fragmento polipeptidico o una secuencia de proteina 273P4B7 de 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, o mas de 25 aminoacidos; o al menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135,140, 145, 150, 155, 160,165, 170, 175, 180,185, 190,195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, o 576 o mas aminoacidos.

II.) Polinucleótidos de 273P4B7

Un aspecto de la invencion se refiere a polinucleotidos correspondientes a o complementarios de todo o parte de un gen de 273P4B7, ARNm y/o secuencia codificante, preferentemente en forma aislada, incluyendo polinucleotidos que codifican una proteina relacionada con 273P4B7 y fragmentos de la misma, ADN, ARN, hibrido ADN/ARN y moleculas relacionadas, polinucleotidos u oligonucleotidos complementarios de un gen de 273P4B7 o secuencia de ARNm o una parte de la misma, y polinucleotidos u oligonucleotidos que hibridan con un gen de 273P4B7, ARNm o con un polinucleotido que codifica 273P4B7 (colectivamente, "polinucleotidos de 273P4B7"). En todos los casos cuando se hace referencia a ellos en esta seccion, T tambien puede ser U en la Figura 2.

Los polinucleotidos de 273P4B7 incluyen: un polinucleotido de 273P4B7 que tiene la secuencia mostrada en la Figura 2, la secuencia de nucleotidos de 273P4B7 como se muestra en la Figura 2 en la que T es U; al menos 10 nucleotidos contiguos de un polinucleotido que tiene la secuencia como se muestra en la Figura 2; o al menos 10 nucleotidos contiguos de un polinucleotido que tiene la secuencia que se muestra en la Figura 2 en la que T es U.

La invencion proporciona un polinucleotido aislado que comprende la secuencia de: (a) SEC ID N°: 2, de los numeros de resto de nucleotido 95 a 3847; (b) SEC ID N°: 4, de los numeros de resto de nucleotido 604 a 3987; (c) SEC ID N°: 8, de los numeros de resto de nucleotido 688 a 1947; (d) SEC ID N°: 2, de los numeros de resto de nucleotido 95 a 3847, en los que el resto en 571 es T; (e) SEC ID N°: 2, de los numeros de resto de nucleotido 95 a 3847, en los que el resto de nucleotido en 608 es G; (f) SEC ID N°: 2, de los numeros de resto de nucleotido 95 a 3847, en los que el resto de nucleotido en 1185 es G; (g) SEC ID N°: 2, de los numeros de resto de nucleotido 95 a 3847, en los que el resto de nucleotido en 2759 es A; (h) SEC ID N°: 2, de los numeros de resto de nucleotido 95 a 3847, en los que el resto de nucleotido en 3658 es C; o (i) SEC ID N°: 2, de los numeros de resto de nucleotido 95 a 3847, en los que el resto de nucleotido en 3850 es A. Por ejemplo, los nucleotidos de 273P4B7 pueden comprender, sin limitacion:

(I)

un polinucleotido que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una secuencia como se muestra en la Figura 2, en la que T tambien puede ser U;

(II)

un polinucleotido que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2A, del numero de resto de nucleotido 95 al numero de resto de nucleotido 3847, incluyendo codon de parada, en el que T tambien puede ser U;

(III) un polinucleotido que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2B, del numero de resto de nucleotido 604 al numero de resto de nucleotido 3987, incluyendo codon de parada, en el que T tambien puede ser U;

(IV)

un polinucleotido que codifica una proteina relacionada con 273P4B7 que es al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% homologa de una secuencia de aminoacidos completa mostrada en la Figura 2A-F;

(V)

un polinucleotido que codifica una proteina relacionada con 273P4B7 que es al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% identica a una secuencia de aminoacidos completa mostrada en la Figura 2A-F;

(VII) un polinucleotido que codifica una region peptidica de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoacidos de un peptido de las Figuras 3A y 3C-3E en cualquier incremento de numero entero hasta 1250 que incluye al menos 1, 2 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoacidos que tienen un valor mayor de 0,5 en el perfil de hidrofilia de la Figura 5;

(VIII) un polinucleotido que codifica una region peptidica de al menos 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12,13, 14,15, 16,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoacidos de un peptido de la Figura 3A y 3C-3E en cualquier incremento de numero entero hasta 1250 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoacidos que tienen un valor menor de 0,5 en el perfil hidropatico de la Figura 6;

(IX)

un polinucleotido que codifica una region peptidica de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoacidos de un peptido de la Figura 3A y 3C-3E en cualquier incremento de numero entero hasta 1250 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoacidos que tienen un valor mayor de 0,5 en el perfil de Porcentaje de Restos Accesibles de la Figura 7;

(X)

un polinucleotido que codifica una region peptidica de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoacidos de un peptido de la Figura 3A y 3C-3E en cualquier incremento de numero entero hasta 1250 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoacidos que tienen un valor mayor de 0,5 en el Perfil de Flexibilidad media de la Figura 8;

(XI)

un polinucleotido que codifica una region peptidica de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoacidos de un peptido de la Figura 3A y 3C-3E en cualquier incremento de numero entero hasta 1250 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoacidos que tienen un valor mayor de 0,5 en el perfil de giro Beta de la Figura 9;

(XII) un polinucleotido que codifica una region peptidica de al menos 5, 6, 7, 8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoacidos de un peptido de la Figura 3B en cualquier incremento de numero entero hasta 1127 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoacidos que tienen un valor mayor de 0,5 en el perfil de Hidrofilia de la Figura 5;

(XIII) un polinucleotido que codifica una region peptidica de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoacidos de un peptido de la Figura 3B en cualquier incremento de numero entero hasta 1127 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoacidos que tienen un valor menor de 0,5 en el perfil Hidropatico de la Figura 6;

(XIV) un polinucleotido que codifica una region peptidica de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoacidos de un peptido de la Figura 3B en cualquier incremento de numero entero hasta 1127 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9. 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoacidos que tienen un valor mayor de 0,5 en el perfil de Porcentaje de Restos Accesibles de la Figura 7;

(XV) un polinucleotido que codifica una region peptidica de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoacidos de un peptido de la Figura 3B en cualquier incremento de numero entero hasta 1127 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoacidos que tienen un valor mayor de 0,5 en el perfil Flexibilidad Media de la Figura 8;

(XVI) un polinucleotido que codifica una region peptidica de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoacidos de un peptido de la Figura 3B en cualquier incremento de numero entero hasta 1127 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de

aminoacidos que tienen un valor mayor de 0,5 en el perfil de giro Beta de la Figura 9; ,

(XVII) un polinucleotido que es completamente complementario de un polinucleotido de una cualquiera de (I)-(XVI); y

(XVIII) un polinucleotido que es completamente complementario de un polinucleotido de una cualquiera de 5 (I)-(XVII).

Una composicion (XX) puede comprender un polinucleotido de cualquiera de (I)-(XVIII) junto con un excipiente farmaceutico y/o en una forma de dosis unitaria humana.

Un polinucleotido de cualquiera de (I)-(XVIII) o una composicion (XX) puede usarse en un procedimiento para modular una celula que expresa 273P4B7.

10 Un polinucleotido de cualquiera de (I)-(XVIII) o una composicion (XX) puede usarse en un procedimiento para diagnosticar, prevenir, pronosticar o tratar a un individuo que porta una celula que expresa 273P4B7.

Un polinucleotido de cualquiera de (I)-(XVIII) o una composicion (XX) puede usarse en un procedimiento para diagnosticar, prevenir, pronosticar o tratar a un individuo que porta una celula que expresa 273P4B7, siendo dicha celula de un cancer de un tejido enumerado en la Tabla I.

15 Un polinucleotido de cualquiera de (I)-(XXVIII) o una composicion (XX) puede usarse en un procedimiento para diagnosticar, prevenir, pronosticar o tratar un cancer.

Un polinucleotido de cualquiera de (I)-(XXVIII) o una composicion (XX) puede usarse en un procedimiento para diagnosticar, prevenir, pronosticar o tratar un cancer de un tejido enumerado en la Tabla I.

Un polinucleotido de cualquiera de (I)-(XXVIII) o una composicion (XX) puede usarse en un procedimiento para 20 identificar o caracterizar un modulador de una celula que expresa 273P4B7.

Como se usa en el presente documento, se entiende que un intervalo desvela especificamente todas las posiciones unitarias completas del mismo. Los polinucleotidos de 273P4B7 tipicos codifican partes especificas de secuencias de ARNm de 273P4B7 (y las que son complementarias de tales secuencias) tales como las que codifican las proteinas y/o fragmentos de las mismas, por ejemplo:

25 (a) 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1025, 1050, 1075, 1100, 1125, 1150, 1175, 1200, 1225, 1235, 1240, 1245, 1250 o mas aminoacidos contiguos de 273P4B7 variante 1; las

30 longitudes maximas relevantes para otras variantes son: variante 2, 1127 aminoacidos; variante 4, 1250 aminoacidos; variante 5, 1250 aminoacidos; variante 6, 1250 aminoacidos; variante 9, 1106 aminoacidos; variante 10, 419 aminoacidos; y variante 11, 419 aminoacidos.

Por ejemplo, los polinucleotidos representativos codifican de aproximadamente el aminoacido 1 a aproximadamente el aminoacido 10 de la proteina 273P4B7 mostrada en la Figura 2 o Figura 3, de aproximadamente el aminoacido 10 35 a aproximadamente el aminoacido 20 de la proteina 273P4B7 mostrada en la Figura 2 o Figura 3, de aproximadamente el aminoacido 20 a aproximadamente el aminoacido 30 de la proteina 273P4B7 mostrada en la Figura 2 o Figura 3, de aproximadamente el aminoacido 30 a aproximadamente el aminoacido 40 de la proteina 273P4B7 mostrada en la Figura 2 o Figura 3, de aproximadamente el aminoacido 40 a aproximadamente el aminoacido 50 de la proteina 273P4B7 mostrada en la Figura 2 o Figura 3, de aproximadamente el aminoacido 50 a 40 aproximadamente el aminoacido 60 de la proteina 273P4B7 mostrada en la Figura 2 o Figura 3, de aproximadamente el aminoacido 60 a aproximadamente el aminoacido 70 de la proteina 273P4B7 mostrada en la Figura 2 o Figura 3, de aproximadamente el aminoacido 70 a aproximadamente el aminoacido 80 de la proteina 273P4B7 mostrada en la Figura 2 o Figura 3, de aproximadamente el aminoacido 80 a aproximadamente el aminoacido 90 de la proteina 273P4B7 mostrada en la Figura 2 o Figura 3, de aproximadamente el aminoacido 90 a 45 aproximadamente el aminoacido 100 de la proteina 273P4B7 mostrada en la Figura 2 o Figura 3, en incrementos de aproximadamente 10 aminoacidos, que terminan en aminoacido carboxilo terminal expuesto en la Figura 2 o Figura

3. En consecuencia, los polinucleotidos pueden codificar partes de la secuencia de aminoacidos (de aproximadamente 10 aminoacidos), de aminoacidos, 100 al aminoacido carboxilo terminal de la proteina 273P4B7. En los que se entiende que cada posicion de aminoacido particular desvela esa posicion mas o menos cinco restos

50 de aminoacidos.

Los polinucleotidos pueden codificar partes relativamente largas de una proteina 273P4B7. Por ejemplo, pueden generarse polinucleotidos que codifican de aproximadamente el aminoacido 1 (o 20, 30 o 40 etc.) a aproximadamente el aminoacido 20 (o 30, 40 o 50, etc.) de la proteina 273P4B7 o "variante" mostrada en la Figura 2

o Figura 3 por una diversidad de tecnicas bien conocidas en la materia. Estos fragmentos polinucleotidicos pueden 55 incluir cualquier parte de la secuencia de 273P4B7 como se muestra en la Figura 2.

Los fragmentos polinucleotidicos de 273P4B7 pueden codificar uno o mas de los motivos biologicos contenidos dentro de una proteina 273P4B7 o secuencia "variante". Los fragmentos polinucleotidicos tipicos codifican una o mas de las regiones de la proteina 273P4B7 o variante que muestra homologia con una molecula conocida. Los fragmentos polinucleotidicos tipicos pueden codificar uno o mas de los sitios de N-glucosilacion variantes o de proteina 273P4B7, sitios de fosforilacion de proteina quinasa dependiente de AMPc y GMPc, sitios de fosforilacion de caseina quinasa II o sitio de N-miristoilacion y sitios de amidacion.

II.A.) Usos de polinucleótidos de 273P487

II.A.1.) Supervisión de anomalías genéticas

Los polinucleotidos de los parrafos anteriores tienen varios usos especificos diferentes. El gen de 273P4B7 humano se mapea en la localizacion cromosomica expuesta en el Ejemplo titulado "Mapeo Cromosomico de 273P4B7". Por ejemplo, debido a que el gen de 273P4B7 se mapea en este cromosoma, se usan polinucleotidos que codifican diferentes regiones de las proteinas 273P4B7 para caracterizar anomalias citogeneticas en esta localizacion cromosomica, tales como anomalias que se identifican como asociadas con diversos canceres. En ciertos genes, se ha identificado una diversidad de anomalias cromosomicas incluyendo reordenamientos como anomalias citogeneticas frecuentes en varios canceres diferentes (vease por ejemplo, Krajinovic y col., Mutat. Res. 382(3-4): 81-83 (1998); Johansson y col., Blood 86(10): 3905-3914 (1995) y Finger y col., P.N.A.S. 85(23): 9158-9162 (1988)). Por lo tanto, los polinucleotidos que codifican regiones especificas de las proteinas 273P487 proporcionan nuevas herramientas que pueden usarse para delinear, con mayor precision de lo que era previamente posible, anomalias citogeneticas en la region cromosomica que codifica 273P4B7 que pueden contribuir al fenotipo maligno. En este contexto, estos polinucleotidos satisfacen una necesidad en la tecnica para expandir la sensibilidad de exploracion cromosomica para identificar anomalias cromosomicas mas utiles y menos comunes (vease por ejemplo Evans y col., Am. J. Obstet. Gynecol 171 (4): 1055-1057 (1994)).

Ademas, como se mostro que 273P4B7 se expresaba en gran medida en prostata y otros canceres, se usaron polinucleotidos de 273P487 en procedimientos que evaluan el estado de productos genicos de 273P4B7 en tejidos normales frente a cancerosos. Tipicamente, se usan polinucleotidos que codifican regiones especificas de las proteinas 273P4B7 para evaluar la presencia de perturbaciones (tales como deleciones, inserciones, mutaciones puntuales o alteraciones que dan como resultado perdida de un antigeno, etc.) en regiones especificas del gen de 273P4B7, tales como regiones que contienen uno o mas motivos. Los ensayos ejemplares incluyen tanto ensayos de RT-PCR como analisis de polimorfismo de conformacion monocatenaria (SSCP) (vease, por ejemplo, Marrogi y col., J. Cutan. Pathol. 26(8): 369-378 (1999)), ambos de los cuales utilizan polinucleotidos que codifican regiones especificas de una proteina para examinar estas regiones dentro de la proteina.

II.A.2.) Realizaciones antisentido

Otras realizaciones de la invencion relacionadas con acido nucleico contempladas especificamente desveladas en el presente documento son ADN genomico, ADNc, ribozimas y moleculas antisentido, asi como moleculas de acido nucleico basadas en una cadena principal alternativa, o que incluye bases alternativas, bien derivadas de fuentes naturales o bien sintetizadas, e incluyen moleculas capaces de inhibir la expresion de ARN o proteica de 273P4B7. Por ejemplo, las moleculas antisentido pueden ser ARN u otras moleculas, incluyendo acidos peptido nucleicos (PNA) o moleculas no de acido nucleico tales como derivados de fosforotioato que se unen especificamente a ADN

o ARN de una manera dependiente de pares de bases. Un experto en la materia puede obtener facilmente estas clases de moleculas de acido nucleico usando los polinucleotidos de 273P4B7 y secuencias polinucleotidicas desveladas en el presente documento.

La tecnologia antisentido implica la administracion de oligonucleotidos exogenos que se unen a un polinucleotido diana localizado dentro de las celulas. El termino "antisentido" se refiere al hecho de que tales oligonucleotidos son complementarios de sus dianas intracelulares, por ejemplo, 273P4B7. Vease por ejemplo, Jack Cohen, Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, 1989; y Synthesis 1: 1-5 (1988). Los oligonucleotidos antisentido de 273P4B7 de la presente invencion incluyen derivados tales como S-oligonucleotidos (derivados de fosforotioato o S-oligos, vease, Jack Cohen, mencionado anteriormente), que muestran accion inhibidora de crecimiento celular de cancer potenciado. Los S-oligos (nucleosido fosforotioatos) son analogos isoelectronicos de un oligonucleotido (O-oligo) en los que un atomo de oxigeno no enlazante del grupo fosfato se reemplaza por un atomo de azufre. Los S-oligos de la presente invencion pueden prepararse por tratamiento de los O-oligos correspondientes con 3H-1,2-benzoditiol-3-ona-1,1-dioxido, que es un reactivo de transferencia de azufre. Vease, por ejemplo, lyer, R P. y col., J. Org. Chem. 55: 4693-4698 (1990); e lyer, R. P. y col., J. Am. Chem. Soc.

112: 1253-1254 (1990). Los oligonucleotidos antisentido de 273P4B7 adicionales de la presente invencion incluyen oligonucleotidos antisentido de morfolino conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Partridge y col., 1996, Antisense & Nucleic Acid Drug Development 6: 169-175).

Los oligonucleotidos antisentido de 273P4B7 de la presente invencion tipicamente pueden ser ARN o ADN que es complementario de e hibrida de forma estable con los primeros 100 codones 5' o ultimos 100 codones 3' de una secuencia genomica de 273P4B7 o el ARNm correspondiente. No se requiere complementariedad absoluta, aunque se prefieren altos grados de complementariedad. El uso de un oligonucleotido complementario de esta region

posibilita la hibridacion selectiva con ARNm de 273P4B7 y no con ARNm que especifique otras subunidades reguladoras de la proteina quinasa. En una realizacion, los oligonucleotidos antisentido de 273P4B7 de la presente invencion son fragmentos de 15 a 30 unidades de la molecula de ADN antisentido que tienen una secuencia que hibrida con ARNm de 273P4B7. Opcionalmente, el oligonucleotido antisentido de 273P4B7 es un oligonucleotido de 30 unidades que es complementario de una region en los primeros 10 codones 5' o ultimos 10 codones 3' de 273P4B7. Como alternativa, las moleculas antisentido se modifican para emplear ribozimas en la inhibicion de expresion de 273P4B7, vease, por ejemplo, L. A. Couture & D. T. Stinchcomb; Trends Genet 12: 510-515 (1996).

II.A.3.) Cebadores y pares de cebadores

Realizaciones especificas adicionales de estos nucleotidos incluyen cebadores y pares de cebadores que permiten la amplificacion especifica de polinucleotidos de la invencion o de cualquier parte especifica de los mismos, y sondas que hibridan selectivamente o especificamente con moleculas de acido nucleico de la invencion o con cualquier parte de las mismas. Las sondas pueden marcarse con un marcador detectable, tal como, por ejemplo, un radioisotopo, compuesto fluorescente, compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, quelante metalico o enzima. Tales sondas y cebadores se usan para detectar la presencia de un polinucleotido de 273P4B7 en una muestra y como un medio para detectar una celula que expresa una proteina de 273P4B7.

Los ejemplos de tales sondas incluyen polipeptidos que comprenden toda o parte de la secuencia de ADNc de 273P4B7 humana mostrada en la Figura 2. Tambien se describen ejemplos de pares de cebadores capaces de amplificar especificamente ARNm de 273P4B7 en los ejemplos. Como se entendera por el experto en la materia, pueden prepararse muchos cebadores y sondas diferentes basandose en las secuencias proporcionadas en el presente documento y usarse eficazmente para amplificar y/o detectar un ARNm de 273P4B7.

Los polinucleotidos de 273P4B7 de la invencion son utiles para una diversidad de fines, incluyendo pero sin limitacion su uso como sondas y cebadores para la amplificacion y/o deteccion del gen o los genes de 273P4B7, ARNm, o fragmentos de los mismos; como reactivos para el diagnostico y/o pronostico de cancer de prostata y otros canceres; como secuencias codificantes capaces de dirigir la expresion de polipeptidos de 273P4B7; como herramientas para modular o inhibir la expresion del gen o los genes de 273P4B7 y/o traduccion del transcrito o los transcritos de 273P4B7; y como agentes terapeuticos.

La presente invencion incluye el uso de cualquier sonda como se ha descrito en el presente documento para identificar y aislar un 273P4B7 o secuencia de acido nucleico relacionada con 273P4B7 de una fuente de origen natural, tal como seres humanos u otros mamiferos, asi como la secuencia de acido nucleico aislada en si misma, que comprenderia todas o la mayoria de las secuencias halladas en la sonda usada.

II.A.4.) Aislamiento de moléculas de ácido nucleico que codifican 273P4B7

Las secuencias de ADNc de 273P4B7 descritas en el presente documento permiten al aislamiento de otros polinucleotidos que codifican producto o productos genicos de 273P4B7, asi como el aislamiento de polinucleotidos que codifican homologos de productos genicos de 273P4B7, isoformas de corte y empalme alternativo, variantes alelicas y formas mutantes de un producto genico de 273P4B7 asi como polinucleotidos que codifican analogos de proteinas relacionadas con 273P4B7. Se conocen bien diversos procedimientos de clonacion molecular que pueden emplearse para aislar ADNc de longitud completa que codifican un gen de 273P4B7 (vease, por ejemplo, Sambrook,

J. y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edicion, Cold Spring Harbor Press, Nueva York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel y col., Eds., Wiley and Sons, 1995). Por ejemplo, las metodologias de clonacion de fago lambda pueden emplearse convenientemente, usando sistemas de clonacion disponibles en el mercado (por ejemplo, Lambda ZAP Express, Stratagene). Pueden identificarse clones de fagos que contienen ADNc de gen de 273P4B7 explorando con un ADNc de 273P4B7 marcado o un fragmento del mismo. Por ejemplo, en una realizacion, un ADNc de 273P4B7 (por ejemplo, Figura 2) o una parte del mismo puede sintetizarse y usarse como una sonda para recuperar ADNc solapantes y de longitud completa correspondientes a un gen de 273P4B7. Un gen de 273P4B7 en si mismo puede aislarse explorando bibliotecas de ADN genomico, bibliotecas de cromosomas artificiales bacterianos (BAC), bibliotecas de cromosomas artificiales de levadura (YAC) y similares, con sondas o cebadores de ADN de 273P4B7.

II.A.5.) Moléculas de ácido nucleico recombinante y sistemas de huésped-vector

La invencion tambien proporciona moleculas de ADN o ARN recombinante que contienen un polinucleotido de 273P4B7, incluyendo pero sin limitacion fagos, plasmidos, fagemidos, cosmidos, YAC, BAC, asi como diversos vectores virales y no virales bien conocidos en la tecnica, y celulas transformadas o transfectadas con tales moleculas de ADN o ARN recombinantes. Se conocen bien procedimientos para generar tales moleculas (vease, por ejemplo, Sambrook y col., 1989, mencionado anteriormente).

La invencion proporciona adicionalmente un sistema de huesped-vector que comprende una molecula de ADN recombinante que contiene un polinucleotido de 273P4B7, fragmento, analogo u homologo del mismo dentro de una celula huesped procariota o eucariota adecuada. Los ejemplos de celulas huesped eucariotas adecuadas incluyen una celula de levadura, una celula vegetal o una celula animal, tal como una celula de mamifero o una celula de insecto (por ejemplo, una celula infectable por baculovirus tal como una celula Sf9 o HighFive). Los ejemplos de

celulas de mamifero adecuadas incluyen diversas lineas celulares de cancer de prostata tales como DU145 y TsuPr1, otras lineas celulares de cancer de prostata transfectables o transducibles, celulas primarias (PrEC), asi como varias celulas de mamifero usadas habitualmente para la expresion de proteinas recombinantes (por ejemplo, celulas COS, CHO, 293, 293T). Mas particularmente, un polinucleotido que comprende la secuencia codificante de 273P4B7 o un fragmento, analogo u homologo de la misma puede usarse para generar proteinas de 273P4B7 o fragmentos de las mismas usando cualquier variedad de sistemas huesped-vector usados habitualmente y conocidos ampliamente en la tecnica.

Esta disponible una amplia serie de sistemas de huesped-vector adecuados para la expresion de proteinas 273P4B7

o fragmentos de las mismas, vease por ejemplo, Sambrook y col, 1989, mencionado anteriormente; Current Protocols in Molecular Biology, 1995, mencionado anteriormente). Los vectores preferidos para expresion en mamiferos incluyen pero sin limitacion pcDNA 3.1 marcador myc-His (Invitrogen) y el vector retroviral pSRatkneo (Muller y col, 1991, MCB 11: 1785). Usando estos vectores de expresion, 273P4B7 puede expresarse en varias lineas celulares de cancer de prostata y no de prostata, incluyendo por ejemplo 293, 293T, rat-1, NIH 3T3 y TsuPr1. Los sistemas de huesped-vector son utiles para la produccion de una proteina 273P4B7 o fragmento de la misma. Tales sistemas de huesped-vector pueden emplearse para estudiar las propiedades funcionales de 273P4B7 y mutaciones o analogos de 273P4B7.

Puede producirse proteina 273P4B7 humana recombinante o un analogo u homologo o fragmento de la misma por celulas de mamifero transfectadas con una construccion que codifica un nucleotido relacionado con 273P4B7. Por ejemplo, pueden transfectarse celulas 293T con un plasmido de expresion que codifica 273P4B7 o fragmento, analogo u homologo del mismo, una proteina relacionada con 273P4B7 se expresa en las celulas 293T y la proteina 273P4B7 recombinante se aisla usando procedimientos de purificacion convencionales (por ejemplo, purificacion de afinidad usando anticuerpos anti-273P4B7). Una secuencia codificante de 273P4B7 puede subclonarse en el vector retroviral pSRaMSVtkneo y usarse para infectar diversas lineas celulares de mamifero, tales como NIN 3T3, TsuPr1, 293 y rat-1 para establecer lineas celulares que expresan 273P4B7. Tambien pueden emplearse diversos otros sistemas de expresion bien conocidos en la tecnica. Pueden usarse construcciones de expresion que codifican un peptido lider unido en fase con una secuencia codificante de 273P4B7 para la generacion de una forma secretada de proteina 273P4B7 recombinante.

Como se analiza en el presente documento, la redundancia en el codigo genetico permite variacion en secuencias genicas de 273P4B7. En particular, se conoce en la tecnica que las especies huesped especificas con frecuencia tienen preferencias codonicas especificas, y por lo tanto se puede adaptar la secuencia desvelada segun se prefiera para un huesped deseado. Por ejemplo, las secuencias codonicas analogas preferidas tipicamente tienen codones poco habituales (es decir, codones que tienen una frecuencia de uso de menos de aproximadamente 20% en secuencias conocidas del huesped deseado) reemplazados con codones de mayor frecuencia. Las preferencias codonicas para una especie especifica se calculan, por ejemplo, utilizando tablas de uso codonico disponibles en INTERNET tal como en la direccion dna.affrc.go.jp/∼nakamura/codon.html.

Se sabe que modificaciones de secuencia adicionales potencian la expresion proteica en un huesped celular. Estas incluyen eliminacion de secuencias que codifican senales de poliadenilacion espurias, senales de sitios de corte y empalme de exon/intron, repeticiones de tipo transposon y/u otras secuencias bien caracterizadas tales que son deletereas para la expresion genica. El contenido de GC de la secuencia se ajusta a niveles medios para un huesped celular dado, como se calcula por referencia a genes conocidos expresados en la celula huesped. Cuando sea posible, la secuencia se modifica para evitar estructuras de ARNm secundarias en horquilla predichas. Otras modificaciones utiles incluyen la adicion de una secuencia consenso de inicio de la traduccion al inicio de la fase abierta de lectura, como se describe en Kozak, Mol. Cell Biol., 9: 5073-5080 (1989). Los expertos en la materia entienden que la regla general de que los ribosomas eucariotas inician la traduccion exclusivamente en el codon AUG 5' proximal se anula solamente en condiciones poco habituales (vease, por ejemplo, Kozak PNAS 92 (7): 26622666, (1995) y Kozak NAR 15 (20): 8125-8148 (1987)).

III.) Proteínas relacionadas con 273P4B7

Un polinucleotido de 273P4B7 puede codificar un polipeptido de 273P4B7. Las proteinas 273P4B7 especificas comprenden un polipeptido que tiene toda o parte de la secuencia de aminoacidos de 273P4B7 humana como se muestra en la Figura 2 o Figura 3. Como alternativa, las proteinas 273P4B7 pueden comprender polipeptidos variantes, homologos o analogos que tienen alteraciones en la secuencia de aminoacidos de 273P4B7 mostrada en la Figura 2 o Figura 3.

Un polipeptido de 273P4B7 puede incluir: un polipeptido de 273P4B7 que tiene una secuencia mostrada en la Figura 2, una secuencia peptidica de 273P4B7 como se muestra en la Figura 2 en la que T es U; al menos 10 nucleotidos contiguos de un polipeptido que tiene la secuencia como se muestra en la Figura 2; o al menos 10 peptidos contiguos de un polipeptido que tiene la secuencia como se muestra en la Figura 2 en la que T es U. Por ejemplo, los peptidos de 273P4B7 pueden comprender, sin limitacion:

(I) una proteina que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una secuencia de aminoacidos como se muestra en la Figura 2A-F o Figura 3A-H;

(II) una proteina relacionada con 273P4B7 que es al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% homologa de una secuencia de aminoacidos completa mostrada en la Figura 2A-F o 3A-H;

(III) una proteina relacionada con 273P4B7 que es al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% identica a una secuencia de aminoacidos completa mostrada en la Figura 2A-F o 3A-H;

(IX)

un polipeptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9,10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoacidos de una proteina de la Figura 3A, 3C-3E en cualquier incremento de numero entero hasta 1250 respectivamente que incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoacidos que tienen un valor mayor de 0,5 en el perfil de Hidrofilia de la Figura 5;

(X)

un polipeptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoacidos de una proteina de la Figura 3A, 3C-3E, en cualquier incremento de numero entero hasta 1250 respectivamente que incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoacidos que tienen un valor menor de 0,5 en el perfil Hidropatico de la Figura 6;

(XI)

un polipeptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoacidos de una proteina de la Figura 3A, 3C-3E, en cualquier incremento de numero entero hasta 1250 respectivamente que incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoacidos que tienen un valor mayor de 0,5 en el perfil de Porcentaje de Restos Accesibles de la Figura 7;

(XII) un polipeptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoacidos de una proteina de la Figura 3A, 3C-3E, en cualquier incremento de numero entero hasta 1250 respectivamente que incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoacidos que tienen un valor mayor de 0,5 en el perfil de Flexibilidad Media de la Figura 8;

(XIII) un polipeptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, aminoacidos de una proteina de la Figura 3A, 3C-3E en cualquier incremento de numero entero hasta 1250 respectivamente que incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoacidos que tienen un valor mayor de 0,5 en el perfil de giro Beta de la Figura 9;

(XIV) un polipeptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoacidos de una proteina de la Figura 3B, en cualquier incremento de numero entero hasta 1127 respectivamente que incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoacidos que tienen un valor mayor de 0,5 en el perfil de Hidrofilia de la Figura 5;

(XV) un polipeptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoacidos de una proteina de la Figura 3B, en cualquier incremento de numero entero hasta 1127 respectivamente que incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoacidos que tienen un valor mayor de 0,5 en el perfil Hidropatico de la Figura 6;

(XVI) un polipeptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoacidos de una proteina de la Figura 3B, en cualquier incremento de numero entero hasta 1127 respectivamente que incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoacidos que tienen un valor mayor de 0,5 en el perfil de Porcentaje de Restos Accesibles de la Figura 7;

(XVII) un polipeptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoacidos de una proteina de la Figura 3B, en cualquier incremento de numero entero hasta 1127 respectivamente que incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoacidos que tienen un valor mayor de 0,5 en el perfil de Flexibilidad Media de la Figura 8;

(XVIII) un polipeptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, aminoacidos de una proteina de la Figura 3B en cualquier incremento de numero entero hasta 1127 respectivamente que incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoacidos que tienen un valor mayor de 0,5 en el perfil de giro Beta de la Figura 9;

(XXVII) un peptido que comprende una, dos, tres, cuatro o cinco de las siguientes caracteristicas, o un oligonucleotido que codifica dicho peptido:

i) una region de al menos 5 aminoacidos de un peptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de numero entero hasta la longitud completa de esa proteina en la Figura 3, que incluye una posicion de

5 aminoacido que tiene un valor igual a o mayor de 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, o que tiene un valor igual a 0,1, en el perfil de Hidrofilia de la Figura 5; ii) una region de al menos 5 aminoacidos de un peptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de numero entero hasta la longitud completa de esa proteina en la Figura 3, que incluye una posicion de aminoacido que tiene un valor igual a o menor de 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1, o que tiene un valor igual a 0,0,

10 en el perfil Hidropatico de la Figura 6; iii) una region de al menos 5 aminoacidos de un peptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de numero entero hasta la longitud completa de esa proteina en la Figura 3, que incluye una posicion de aminoacido que tiene un valor igual a o mayor de 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, o que tiene un valor igual a 1,0, en el perfil de Porcentaje de Restos Accesibles de la Figura 7;

15 iv) una region de al menos 5 aminoacidos de un peptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de numero entero hasta la longitud completa de esa proteina en la Figura 3, que incluye una posicion de aminoacido que tiene un valor igual a o mayor de 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, o que tiene un valor igual a 1,0, en el perfil de Flexibilidad Media de la Figura 8; o, v) una region de al menos 5 aminoacidos de un peptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento

20 de numero entero hasta la longitud completa de esa proteina en la Figura 3, que incluye una posicion de aminoacido que tiene un valor igual a o mayor de 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, o que tiene un valor igual a 1,0, en el perfil de giro Beta de la Figura 9;

En general, las variantes alelicas de origen natural de 273P4B7 humana comparten un alto grado de identidad estructural y homologia (por ejemplo, 90% o mas homologia). Tipicamente, las variantes alelicas de una proteina

25 273P4B7 contienen sustituciones de aminoacidos conservativas dentro de las secuencias de 273P4B7 descritas en el presente documento o contienen una sustitucion de un aminoacido de una posicion correspondiente en un homologo de 273P4B7. Una clase de variantes alelicas de 273P4B7 son proteinas que comparten un alto grado de homologia con al menos una region pequena de una secuencia de aminoacidos de 273P4B7 particular, pero contienen adicionalmente una diferencia radical con respecto a la secuencia, tal como una sustitucion no

30 conservativa, truncamiento, insercion o desplazamiento de fase. En comparaciones de secuencias proteicas, los terminos, similitud, identidad y homologia tienen cada uno un significado distinto como se aprecia en el campo de la genetica. Ademas, la ortologia y paralogia pueden ser conceptos importantes que describen la relacion de miembros de una familia de proteinas dada en un organismo para los miembros de la misma familia en otros organismos.

Se proporcionan abreviaturas de aminoacidos en la Tabla II. Pueden realizarse con frecuencia sustituciones de

35 aminoacidos conservativas en una proteina sin alterar la conformacion o la funcion de la proteina. Las proteinas de la invencion pueden comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 sustituciones conservativas. Tales cambios incluyen sustituir con cualquier de isoleucina (I), valina (V) y leucina (L) cualquier otro de estos aminoacidos hidrofobos; acido glutamico (A) por acido aspartico (D) y viceversa; asparagina (N) por glutamina (0) y viceversa; y treonina (T) por serina (S) y viceversa. Otras sustituciones tambien pueden considerarse conservativas,

40 dependiendo del ambiente del aminoacido particular y su papel en la estructura tridimensional de la proteina. Por ejemplo, glicina (G) y alanina (A) pueden ser con frecuencia intercambiables, al igual que alanina (A) y valina (V). La metionina (M), que es relativamente hidrofoba, puede intercambiarse frecuentemente con leucina e isoleucina, y en ocasiones con valina. Lisina (K) y arginina (R) son con frecuencia intercambiables en localizaciones en las que la caracteristica significativa del resto de aminoacido es su carga y las pK diferentes de estos dos restos de

45 aminoacidos no son significativas. Otros cambios mas pueden considerarse "conservativos" en ambiente particulares (vease por ejemplo Tabla III en el presente documento; paginas 13-15 "Biochemistry" 2a ED. Lubert Stryer ed (Stanford University); Henikoff y col., PNAS 1992 Vol 89 10915-10919; Lei y col., J Biol Chem 19 May 1995; 270(20): 11882-6).

Una amplia diversidad de variantes o analogos aceptados en la tecnica de proteinas 273P4B7 tales como

50 polipeptidos que tienen inserciones, deleciones y sustituciones de aminoacidos. Pueden realizarse variantes de 273P4B7 usando procedimientos conocidos en la tecnica tales como mutagenesis dirigida, exploracion de alanina y mutagenesis por PCR. Puede realizarse mutagenesis dirigida (Carter y col., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller y col., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)), mutagenesis de casete (Wells y col., Gene, 34:315 (1985)), mutagenesis de seleccion de restriccion (Wells y col., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)) u otras tecnicas

55 conocidas en el ADN clonado para producir el ADN variante de 273P4B7.

Se generan proteinas relacionadas con 273P4B7 usando tecnologia de sintesis de peptidos convencional o usando procedimientos de escision quimica bien conocidos en la tecnica. Como alternativa, pueden usarse procedimientos recombinantes para generar moleculas de acido nucleico que codifican una proteina relacionada con 273P4B7. Las moleculas de acido nucleico pueden proporcionar un medio para generar fragmentos definidos de una proteina

60 273P4B7 (o variantes, homologos o analogos de la misma).

La invencion comprende secuencias de acido nucleico de 273P4B7. Un fragmento proteico puede ser: una subsecuencia de al menos 158, 262 o 420 aminoacidos contiguos de una proteina de 273P4B7 v.1; una subsecuencia de aminoacidos de una proteina de 273P4B7 v. 1 con la condicion de que la proteina 273P4B7 v. 1 sea tal que no incluya una valina (V) o metionina (M) en la posicion 145; arginina (R) o glicina (G) en la posicion 172; isoleucina (I) o valina (V) en la posicion 889; o lisina (K) o arginina (R) en la posicion 989. Una secuencia de aminoacidos puede ser un fragmento de una proteina de 273P4B7 v.1 con la condicion de que no sea una proteina de 273P4B7 v. 9, v.10 o v.11. Un fragmento de aminoacidos puede ser 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150,155, 56, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 270, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 422, 434, 435, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 650, 675, 700, 705, 710, 715, 716, 717, 718, 719, 720, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1025, 1050, 1075, 1100, 1125, 1127, 1150, 1175, 1200, 1025, o 1250 aminoacidos contiguos de una proteina de la Figura 2; el fragmento/subsecuencia puede comprender un motivo funcional o estructural, por ejemplo, como se expone en el presente documento, o comprende un epitopo de sistema inmune (anticuerpo o linfocito T). Una secuencia de acido nucleico de la invencion puede comprender una secuencia que codifica una secuencia de aminoacidos como se expone en el presente documento.

III.A.) Expresión de proteínas relacionadas con 273P4B7

En los ejemplos a continuacion, 273P4B7 puede expresarse convenientemente en celulas (tales como celulas 293T) transfectadas con un vector de expresion disponible en el mercado tal como un vector de expresion conducido por CMV que codifica 273P4B7 con un marcador His 6X y MYC C terminal (pcDNA3.1/mycHIS, Invitrogen o Tag5, GenHunter Corporation, Nashville TN). El vector Tag5 proporciona una senal de secrecion de IgGK que puede usarse para facilitar la produccion de una proteina 273P4B7 secretada en celulas transfectadas. La 273P4B7 marcada con HIS secretada en el medio de cultivo puede purificarse, por ejemplo, usando una columna de niquel usando tecnicas convencionales.

IV) Procedimientos para la detección de 273P4B7

Otro aspecto de la presente invencion se refiere a procedimientos para detectar polinucleotidos de 273P4B7, asi como procedimientos para identificar una celula que expresa 273P4B7. El perfil de expresion de 273P4B7 lo hace un marcador de diagnostico para enfermedad metastatizada. En consecuencia, el estado de productos genicos de 273P4B7 proporciona informacion util para predecir una diversidad de factores incluyendo susceptibilidad a enfermedad de etapa avanzada, tasa de progresion y/o agresividad del tumor. Como se analiza en detalle en el presente documento, el estado de los productos genicos de 273P4B7 en muestras de pacientes puede analizarse por una diversidad de protocolos que se conocen bien en la tecnica incluyendo analisis inmunohistoquimico, la diversidad de tecnicas de transferencia de Northern incluyendo hibridacion in situ, analisis de RT-PCR (por ejemplo en muestras microdiseccionadas de captura de laser), analisis de transferencia de Western y analisis de matrices tisulares.

Mas particularmente, la invencion proporciona ensayos para la deteccion de polinucleotidos de 273P4B7 en una muestra biologica, tal como suero, hueso, prostata, y otros tejidos, orina, semen, preparaciones celulares y similares. Los polinucleotidos de 273P4B7 detectables incluyen, por ejemplo, un gen de 273P4B7 o fragmento del mismo, ARNm de 273P4B7, ARNm de 273P4B7 variante de corte y empalme alternativo y moleculas de ADN o ARN recombinantes que contienen un polinucleotido de 273P4B7. Se conocen bien en la tecnica varios procedimientos para amplificar y/o detectar la presencia de polinucleotido de 273P4B7 y pueden emplearse en la practica de este aspecto de la invencion.

En una realizacion, un procedimiento para detectar un ARNm de 273P4B7 en una muestra biologica comprende producir ADNc de la muestra por transcripcion inversa usando al menos un cebador, amplificar el ADNc producido de este modo usando un polinucleotido de 273P4B7 como cebadores sentido y antisentido para amplificar ADNc de 273P4B7 en el mismo; y detectar la presencia del ADNc de 273P4B7 amplificado. Opcionalmente, puede determinarse la secuencia del ADNc de 273P4B7 amplificado.

En otra realizacion, un procedimiento para detectar un gen de 273P4B7 en una muestra biologica comprende aislar en primer lugar ADN genomico de la muestra; amplificar el ADN genomico aislado usando polinucleotidos de 273P4B7 como cebadores sentido y antisentido; y detectar la presencia del gen de 273P4B7 amplificado. Puede disenarse cualquier variedad de combinaciones de sonda sentido y antisentido apropiadas a partir de una secuencia de nucleotidos de 273P4B7 (vease, por ejemplo Figura 2) y usarse para este fin.

Los procedimientos para identificar una celula que exprese 273P4B7 tambien estan dentro del alcance de la invencion. En una realizacion, un ensayo para identificar una celula que exprese un gen de 273P4B7 comprende detectar la presencia de ARNm de 273P4B7 en la celula. Se conocen bien procedimientos para la deteccion de ARNm particulares en celulas e incluyen, por ejemplo, ensayos de hibridacion usando sondas de ADN complementarias (tales como hibridacion in situ usando ribosondas de 273P4B7 marcadas, transferencia de Northern y tecnicas relacionadas) y diversos ensayos de amplificacion de acidos nucleicos (tales como RT-PCR

usando cebadores complementarios especificos para 273P4B7, y otros procedimientos de deteccion de tipo amplificacion, tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y similares).

El analisis de expresion de 273P4B7 tambien es util como una herramienta para identificar y evaluar agentes que modulan la expresion de genes de 273P4B7. Por ejemplo, la expresion de 273P4B7 se regula positivamente de forma significativa en cancer de prostata, y se expresa en canceres de los tejidos enumerados en la Tabla I. La identificacion de una molecula o agente biologico que inhibe la expresion o sobreexpresion de 273P4B7 en celulas cancerosas es de valor terapeutico. Por ejemplo, un agente tal puede identificarse usando una exploracion que cuantifica la expresion de 273P4B7 por RT-PCR, hibridacion de acidos nucleicos o union de anticuerpos.

V) Procedimientos para controlar el estado de genes relacionados con 273P4B7 y sus productos

Se sabe que la oncogenesis es un proceso multietapa en el que el crecimiento celular se desregula progresivamente y las celulas progresan de un estado fisiologico normal a estados precancerosos y despues cancerosos (vease, por ejemplo, Alers y col., Lab Invest. 77(5): 437-438 (1997) e Isaacs y col., Cancer Surv. 23: 19-32 (1995)). En este contexto, el examen de una muestra biologica con respecto a pruebas de crecimiento celular desregulado (tal como expresion de 273P4B7 aberrante en canceres) permite la deteccion temprana de dicha fisiologia aberrante, antes de que un estado patologico tal como cancer haya progresado a un estadio en la que las opciones terapeuticas son mas limitadas y/o el pronostico es peor. En tales examenes, el estado de 273P4B7 en una muestra biologico de interes puede compararse, por ejemplo, con el estado de 273P4B7 en una muestra normal correspondiente (por ejemplo una muestra de ese individuo o como alternativa otro individuo que no esta afectado por una patologia). Una alteracion del estado de 273P4B7 en la muestra biologica (en comparacion con la muestra normal) proporciona pruebas de crecimiento celular desregulado. Ademas de usar una muestra biologica que no esta afectada por una patologia como una muestra normal, se puede usarse tambien un valor normativo predeterminado tal como un nivel normal predeterminado de expresion de ARNm (vease, por ejemplo, Grever y col., J. Comp. Neurol. 9 Dic 1996; 376(2): 306-14 y Patente de Estados Unidos N° 5.837.501) para comparar el estado de 273P4B7 en una muestra.

El termino "estado" en este contexto se usa de acuerdo con su significado aceptado en la tecnica y se refiere a la condicion o estado de un gen y sus productos. Tipicamente, los expertos en la materia usan varios parametros para evaluar la condicion o estado de un gen y sus productos. Estos incluyen, pero sin limitacion la localizacion de productos genicos expresados (incluyendo localizacion de celulas que expresan 273P4B7) asi como el nivel y la actividad biologica de productos genicos expresados (tales como ARNm, polinucleotidos y polipeptidos de 273P4B7). Tipicamente, una alteracion del estado de 273P4B7 comprende un cambio de la localizacion de 273P4B7 y/o celulas que expresan 273P4B7 y/o un aumento de ARNm de 273P4B7 y/o expresion proteica.

El estado de 273P4B7 en una muestra puede analizarse por varios medios bien conocidos en la tecnica, incluyendo sin limitacion, analisis inmunohistoquimico, hibridacion in situ, analisis de RT-PCR en muestras microdiseccionadas con captura de laser, analisis de transferencia de Western y analisis de matrices tisulares. Se encuentran protocolos tipicos para evaluar el estado de un gen y productos genicos de 273P4B7, por ejemplo en Ausubel y col. eds., 1995, Current Protocols in Molecular Biology, Unidades 2 (Transferencia de Northern), 4 (Transferencia de Southern), 15 (Inmunotransferencia) y 18 (Analisis de PCR). Por lo tanto, el estado de 273P4B7 en una muestra biologica se evalua por diversos procedimientos utilizados por expertos en la materia incluyendo, pero sin limitacion, analisis de Southern genomico (para examinar, por ejemplo, perturbaciones en un gen de 273P4B7), analisis de Northern y/o analisis de PCR de ARNm de 273P4B7 (para examinar, por ejemplo, alteraciones de las secuencias polinucleotidicas o niveles de expresion de ARNm de 273P4B7) y analisis de Western y/o inmunohistoquimicos (para examinar, por ejemplo alteraciones en secuencias polipeptidicas, alteraciones en localizacion de polipeptidos dentro de una muestra, alteraciones en niveles de expresion de proteinas 273P4B7 y/o asociaciones de proteinas 273P4B7 con companeros de union polipeptidicos). Los polinucleotidos de 273P4B7 detectables incluyen, por ejemplo, un gen de 273P4B7 o fragmento del mismo, ARNm 273P4B7, variantes de corte y empalme alternativo, ARNm de 273P4B7, y moleculas de ADN o ARN recombinante que contienen un polinucleotido de 273P4B7.

El perfil de expresion de 273P4B7 lo hace un marcador de diagnostico para enfermedad local y/o metastatizada, y proporciona informacion sobre el crecimiento o potencial oncogenico de una muestra biologica. En particular, el estado de 273P4B7 proporciona informacion util para predecir la susceptibilidad a estadios de enfermedad particulares, progresion y/o agresividad del tumor. La invencion proporciona procedimientos y ensayos para determinar estado de 273P4B7 y diagnosticar canceres que expresan 273P4B7, tales como canceres de los tejidos enumerados en la Tabla I. Por ejemplo, debido a que el ARNm de 273P4B7 se expresa de forma tan alta en prostata y otros canceres en relacion con tejido prostatico normal, pueden usarse ensayos que evaluan los niveles de transcritos de ARNm de 273P4B7 en una muestra biologica para diagnosticar una enfermedad asociada con desregulacion de 273P4B7, y pueden proporcionar informacion de pronostico util para definir opciones terapeuticas apropiadas.

El estado de expresion de 273P4B7 proporciona informacion incluyendo la presencia, etapa y localizacion de celulas displasicas, precancerosas y cancerosas, prediciendo la susceptibilidad a diversos estadios de enfermedad y/o para evaluar la agresividad el tumor. Ademas, el perfil de expresion lo hace util como un reactivo de formacion de imagenes para enfermedad metastatizada. En consecuencia, un aspecto de la invencion se refiere a los diversos procedimientos de pronostico y diagnostico moleculares para examinar el estado de 273P4B7 en muestras

biologicas tales como las de individuos que padecen, o se sospecha que padecen, una patologia caracterizada por crecimiento celular desregulado, tal como cancer.

Como se ha descrito anteriormente, el estado de 273P4B7 en una muestra biologica puede examinarse por varios procedimientos bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, el estado de 273P4B7 en una muestra biologica tomada de una localizacion especifica en el cuerpo puede examinarse evaluando la muestra con respecto a la presencia o ausencia de celulas que expresan 273P4B7 (por ejemplo las que expresan ARNm de 273P4B7). Este examen puede proporciona pruebas de crecimiento celular desregulado, por ejemplo, cuando se encuentran celulas que expresan 273P4B7 en una muestra biologica que normalmente no contiene tales celulas (tales como un ganglio linfatico), debido a que tales alteraciones en el estado de 273P4B7 en una muestra biologica se asocian con frecuencia con crecimiento celular desregulado. Especificamente, un indicador de crecimiento celular desregulado son las metastasis de celulas cancerosas de un organo de origen (tal como la prostata) a un area diferente del cuerpo (tal como un ganglio linfatico). En este contexto, las pruebas de crecimiento celular desregulado son importantes por ejemplo debido a que pueden detectarse metastasis de ganglios linfaticos ocultas en una proporcion sustancial de pacientes con cancer de prostata, y tales metastasis se asocian con predictores conocidos de progresion de enfermedad (vease, por ejemplo, Murphy y col., Prostate 42(4): 315-317 (2000); Su y col., Semin. Surg. Oncol. 18(1): 17-28 (2000) y Freeman y col., J Urol Ago 1995 154(2 Pt 1): 474-8).

En un aspecto, la invencion proporciona procedimientos para supervisar los productos genicos de 273P4B7 determinando el estado de productos genicos de 273P4B7 expresados por celulas de un individuo sospechoso de tener una enfermedad asociada con crecimiento celular desregulado (tal como hiperplasia o cancer) y comparando despues el estado determinado de este modo con el estado de productos genicos de 273P4B7 en una muestra normal correspondiente. La presencia de productos genicos de 273P4B7 aberrantes en la muestra de ensayo en relacion con la muestra normal proporciona un indicio de la presencia de crecimiento celular desregulado dentro de las celulas del individuo.

En otro aspecto, la invencion proporciona ensayos utiles para determinar la presencia de cancer en un individuo, que comprenden detectar un aumento significativo de la expresion de ARNm de 273P4B7 en una muestra celular o tisular de ensayo en relacion con los niveles de expresion en la celula o tejido normal correspondiente. La presencia de ARNm de 273P4B7 puede, por ejemplo, evaluarse en tejidos incluyendo pero sin limitacion los enumerados en la Tabla I. La presencia de expresion de 273P4B7 significativa en cualquiera de estos tejidos es util para indicar la aparicion, presencia y/o gravedad de un cancer, puesto que los tejidos normales correspondientes no expresan ARNm de 273P4B7 o lo expresan a niveles menores.

En una realizacion adicional, se puede evaluar el estado de secuencias de nucleotidos y aminoacidos de 273P4B7 en una muestra biologica para identificar perturbaciones en la estructura de estas moleculas. Estas perturbaciones pueden incluir inserciones, deleciones, sustituciones y similares. Tales evaluaciones son utiles debido a que se observan perturbaciones en las secuencias de nucleotidos y aminoacidos en un gran numero de proteinas asociadas con un fenotipo de crecimiento desregulado (vease, por ejemplo, Marrogi y col., 1999, J. Cutan. Pathol. 26(8): 369378). Por ejemplo, una mutacion en la secuencia de 273P4B7 puede ser indicativa de la presencia o promocion de un tumor. Tales ensayos tienen por lo tanto valor diagnostico y predictivo cuando una mutacion en 273P4B7 indica una perdida potencial de funcion o aumento de crecimiento tumoral.

Se conoce bien en la tecnica una amplia diversidad de ensayos para observar perturbaciones en secuencias de nucleotidos y aminoacidos. Por ejemplo, el tamano y estructura de secuencias de acidos nucleicos o aminoacidos de productos genicos de 273P4B7 se observan por Northern, Southern, Western, protocolos de secuenciacion de ADN y PCR analizados en el presente documento. Ademas, se conocen bien en la tecnica otros procedimientos para observar perturbaciones en secuencias de aminoacidos y nucleotidos tales como analisis de polimorfismos de conformacion monocatenaria (vease, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 5.382.510 expedida el 7 de Septiembre de 1999, y 5.952.170 expedida el 17 de Enero de 1995).

Adicionalmente, se puede examinar el estado de metilacion de un gen de 273P4B7 en una muestra biologica. Con frecuencia se produce desmetilacion aberrante y/o hipermetilacion de islas de CpG en regiones reguladoras 5' del gen en celulas inmortalizadas y transformadas, y pueden dar como resultado expresion alterada de diversos genes. Por ejemplo, la hipermetilacion de promotor de la glutation S-transferasa de clase pi (una proteina expresada en prostata normal pero no expresada en �90% de carcinomas de prostata) parece silenciar permanentemente la transcripcion de este gen y es la alteracion genomica mas frecuentemente detectada en carcinomas de prostata (De Marzo y col., Am. J. Pathol. 155(6): 1985-1992 (1999)). Ademas, esta alteracion esta presente en al menos 70% de los casos de neoplasia intraepitelial prostatica de alto grado (PIN) (Brooks y col., Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 1998, 7: 531-536). En otro ejemplo, la expresion del gen especifico de tumor LAGE-I (que no se expresa en prostata normal pero se expresa en 25-50% de canceres de prostata) se induce por desoxi-azacitidina en celulas linfoblastoides, lo que sugiere que la expresion tumoral se debe a desmetilacion (Lethe y col., Int. J. Cancer 76(6): 903-908 (1998)). Se conoce bien en la tecnica una diversidad de ensayos para examinar el estado de metilacion de un gen. Por ejemplo, se puede utilizar, en enfoques de hibridacion de Southern, enzimas de restriccion sensibles a metilacion que no pueden escindir secuencias que contengan sitios de CpG metilados para evaluar el estado de metilacion de islas de CpG. Ademas, MSP (PCR especifica de metilacion) puede perfilar rapidamente el estado de metilacion de todos los sitios de CpG presentes en una isla de CpG de un gen dado. Este procedimiento implica

modificacion inicial de ADN por bisulfito sodico (que convertira todas las citosinas no metiladas en uracilo) seguido de amplificacion usando cebadores especificos para ADN no metilado frente a metilado. Tambien pueden encontrarse protocolos que implican interferencia de metilacion por ejemplo en Current Protocols In Molecular Biology, Unidad 12, Frederick M. Ausubel y col. eds., 1995.

La amplificacion genica es un procedimiento adicional para evaluar el estado de 273P4B7. La amplificacion genica se mide en una muestra directamente, por ejemplo, por transferencia de Southern convencional o transferencia de Northern para cuantificar la transcripcion de ARNm (Thomas, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205), transferencia puntual (analisis de ADN), o hibridacion in situ, usando una sonda marcada de forma apropiada, basandose en las secuencias proporcionadas en el presente documento. Como alternativa, se emplean anticuerpos que reconocen dobles cadenas especificas, incluyendo dobles cadenas de ADN, dobles cadenas de ARN y dobles cadenas hibridas de ADN-ARN o dobles cadenas de ADN-proteina. Los anticuerpos a su vez se marcan y el ensayo se lleva a cabo cuando la doble cadena se une a una superficie, de modo que tras la formacion de doble cadena en la superficie, puede detectarse la presencia de anticuerpo unido a la doble cadena.

Puede ensayarse convenientemente tejido biopsiado o sangre periferica con respecto a la presencia de celulas cancerosas usando por ejemplo, analisis de Northern, transferencia puntual o RT-PCR para detectar expresion de 273P4B7. La presencia de ARNm de 273P4B7 amplificable por RT-PCR proporciona un indicio de la presencia de cancer. Se conocen bien en la tecnica ensayos de RT-PCR. Se estan evaluando en la actualidad ensayos de deteccion de RT-PCR para celulas tumorales en sangre periferica para su uso en el diagnostico y tratamiento de varios tumores solidos humanos. En el campo del cancer de prostata, estos incluyen ensayos de RT-PCR para la deteccion de celulas que expresan PSA y PSM (Verkaik y col., 1997, Urol. Res. 25: 373-384; Ghossein y col., 1995,

J. Clin. Oncol. 13: 1195-2000; Heston y col., 1995, Clin. Chem. 41: 1687-1688).

Un aspecto adicional es una evaluacion de la susceptibilidad que tiene un individuo para desarrollar cancer. Un procedimiento para predecir la susceptibilidad al cancer puede comprender detectar ARNm de 273P4B7 en una muestra tisular, indicando su presencia susceptibilidad al cancer, en el que el grado de expresion de ARNm de 273P4B7 se correlaciona con el grado de susceptibilidad. La presencia de 273P4B7 en prostata u otro tejido puede examinarse, proporcionando la presencia de 273P4B7 en la muestra un indicio de susceptibilidad a cancer de prostata (o la aparicion o existencia de un tumor de prostata). De forma similar, se puede evaluar la integridad de secuencias de nucleotidos y aminoacidos de 273P4B7 en una muestra biologica, para identificar perturbaciones en la estructura de estas moleculas tales como inserciones, deleciones, sustituciones y similares. La presencia de una o mas perturbaciones en productos genicos de 273P4B7 en la muestra es un indicio de susceptibilidad a cancer (o la aparicion o existencia de un tumor).

Pueden usarse procedimientos para evaluar la agresividad del tumor. Un procedimiento para evaluar la agresividad de un tumor puede comprender determinar el nivel de ARNm de 273P4B7 expresado por celulas tumorales, comparando el nivel determinado de este modo con el nivel de ARNm de 273P4B7 expresado en un tejido normal correspondiente tomado del mismo individuo o una muestra de referencia de tejido normal, en el que el grado de expresion de ARNm de 273P4B7 en la muestra de tumor en relacion con la muestra normal indica el grado de agresividad. La agresividad de un tumor puede evaluarse determinando el grado en que 273P4B7 se expresa en las celulas tumorales, indicando los niveles de expresion mayores tumores mas agresivos. Otra realizacion es la evaluacion de la integridad de secuencias de nucleotidos y aminoacidos de 273P4B7 en una muestra biologica, para identificar perturbaciones en la estructura de estas moleculas tales como inserciones, deleciones, sustituciones y similares. La presencia de una o mas perturbaciones indica tumores mas agresivos.

Pueden usarse procedimientos para observar la progresion de un tumor maligno en un individuo a lo largo del tiempo. Los procedimientos para observar la progresion de un tumor maligno en un individuo a lo largo del tiempo pueden comprender determinar el nivel de ARNm de 273P4B7 expresado por celulas en una muestra del tumor, comparar el nivel determinado de este modo con el nivel de ARNm de 273P4B7 expresado en una muestra tisular equivalente tomada del mismo individuo en un momento diferente, en los que el grado de expresion de ARNm de 273P4B7 en la muestra de tumor a lo largo del tiempo proporciona informacion sobre la progresion del cancer. La progresion de un cancer puede evaluarse determinando la expresion de 273P4B7 en las celulas tumorales a lo largo del tiempo, cuando la expresion aumentada a lo largo del tiempo indica una progresion del cancer. Ademas, se puede evaluar la integridad de las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de 273P4B7 en una muestra biologica para identificar perturbaciones en la estructura de estas moleculas tales como inserciones, deleciones, sustituciones y similares, en las que la presencia de una o mas perturbaciones indica una progresion del cancer.

Los enfoques de diagnostico anteriores pueden combinarse con uno cualquiera de una amplia diversidad de protocolos de pronostico y diagnostico conocidos en la tecnica. Por ejemplo, pueden usarse procedimientos para observar una coincidencia entre la expresion de gen de 273P4B7 y productos genicos de 273P4B7 (o perturbaciones en el gen de 273P4B7 y productos genicos de 273P4B7) y un factor que se asocie con tumores malignos, como un medio para diagnosticar y pronosticar el estado de una muestra tisular. Puede utilizarse una amplia diversidad de factores asociados con tumores malignos, tales como la expresion de genes asociados con tumores malignos (por ejemplo, expresion de PSA, PSCA y PSM para cancer de prostata, etc.) asi como observaciones citologicas globales (vease, por ejemplo, Bocking y col., 1984, Anal. 0uant. Cytol. 6(2): 74-88; Epstein, 1995, Hum. Pathol. 26(2):223-9; Thorson y col., 1998, Mod. Pathol. 11(6): 543-51; Baisden y col., 1999, Am. J. Surg. Palhol. 23(8): 918-24). Los

procedimientos para observar una coincidencia entre la expresion de gen de 273P4B7 y productos genicos de 273P4B7 (o perturbaciones en gen de 273P4B7 y productos genicos de 273P4B7) y otro factor que se asocia con tumores malignos son utiles, por ejemplo, debido a que la presencia de un conjunto de factores especificos que coinciden con enfermedad proporciona informacion crucial para diagnosticar y pronosticar el estado de una muestra tisular.

Los procedimientos para observar una coincidencia entre la expresion de gen de 273P4B7 y productos genicos de 273P4B7 (o perturbaciones en gen de 273P4B7 y productos genicos de 273P4B7) y otro factor asociado con tumores malignos implican detectar la sobreexpresion de ARNm de 273P4B7 en una muestra tisular, detectar la sobreexpresion de ARNm o proteina de PSA en una muestra tisular (o expresion de PSCA o PSM) y observar una coincidencia de sobreexpresion de ARNm de 273P4B7 y ARNm o proteina de PSA (o expresion de PSCA o PSM). Puede examinarse la expresion de ARNm de 273P4B7 y PSA en tejido de prostata, en la que la coincidencia de sobreexpresion de ARNm de 273P4B7 y PSA en la muestra indica la existencia de cancer de prostata, susceptibilidad a cancer de prostata o la aparicion o estado de un tumor de prostata.

Se describen en el presente documento procedimientos para detectar y cuantificar la expresion de ARNm de 273P4B7 y se conocen bien en la tecnica tecnologias de deteccion y cuantificacion de acidos nucleicos convencionales. Los procedimientos convencionales para la deteccion y cuantificacion de ARNm de 273P4B7 incluyen hibridacion in situ usando ribosondas de 273P4B7 marcadas, transferencia de Northern y tecnicas relacionadas que utilizan sondas polinucleotidicas de 273P4B7, analisis de RT-PCR usando cebadores especificos para 273P4B7 y otros procedimientos de deteccion de tipo amplificacion, tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y similares. En una realizacion especifica, se usa RT-PCR semicuantitativa para detectar y cuantificar expresion de ARNm de 273P4B7. Puede usarse cualquier variedad de cebadores capaces de amplificar 273P4B7 para este fin, incluyendo pero sin limitacion los diversos conjuntos de cebadores descritos especificamente en el presente documento.

VI.) Realizaciones de diagnóstico y pronóstico de 273P4B7.

Como se desvela en el presente documento, se usan polinucleotidos de 273P4B7 en ensayos de diagnostico, pronostico y terapeuticos bien conocidos que examinan afecciones asociadas con crecimiento celular desregulado tales como cancer, en particular los canceres enumerados en la Tabla I (vease, por ejemplo, tanto su patron especifico de expresion tisular como su sobreexpresion en ciertos canceres como se describe por ejemplo en el ejemplo titulado "Analisis de expresion de 273P4B7 en tejidos normales y muestras de ensayo de pacientes").

Puede hacerse una analogia entre 273P4B7 y un antigeno asociado a prostata PSA, el marcador arquetipico que se ha usado por los facultativos medicos durante anos para identificar y supervisar la presencia de cancer de prostata (vease, por ejemplo, Merrill y col., J. Urol. 163(2): 503-5120 (2000); Polascik y col., J. Urol. Aug; 162(2): 293-306 (1999) y Fortier y col., J. Nat. Cancer lnst. 91 (19): 1635-1640(1999)). Tambien se usa una diversidad de otros marcadores de diagnostico en contextos similares incluyendo p53 y K-ras (vease, por ejemplo, Tulchinsky y col., Int J Mol Med Jul 1999 4(1): 99-102 y Minimoto y col., Cancer Detect Prev 2000; 24(1): 1-12). Por lo tanto, la presente divulgacion de polinucleotidos de 273P4B7 (asi como sondas polinucleotidicas de 273P4B7 usadas para identificar la presencia de estas moleculas) y sus propiedades permite a los expertos en la materia utilizar estas moleculas en procedimientos que son analogos a los usados, por ejemplo, en una diversidad de ensayos de diagnostico dirigidos a examinar afecciones asociadas con cancer.

Las realizaciones tipicas de procedimientos de diagnostico que utilizan los polinucleotidos de 273P4B7, son analogas de los procedimientos de ensayo de diagnostico bien establecidos que emplean, por ejemplo, polinucleotidos de PSA, polipeptidos, linfocitos T reactivos y anticuerpos. Por ejemplo, al igual que se usan polinucleotidos de PSA como sondas (por ejemplo en analisis de Northern, vease, por ejemplo, Sharief y col., Biochem. Mol. Biol. Int. 33(3): 567-74(1994)) y cebadores (por ejemplo en analisis de PCR, vease, por ejemplo, Okegawa y col., J. Urol. 163(4): 1189-1190 (2000)) para observar la presencia y/o el nivel de ARNm de PSA en procedimientos de supervision de sobreexpresion de PSA o la metastasis de canceres de prostata, los polinucleotidos de 273P4B7 descritos en el presente documento pueden utilizarse de la misma manera para detectar sobreexpresion de 273P4B7 o la metastasis de prostata y otros canceres que expresan este gen.

Especificamente, debido a que las metastasis implican el movimiento de celulas cancerosas de un organo de origen (tal como el pulmon o la glandula prostatica, etc.) a un area diferente del cuerpo (tal como un ganglio linfatico), pueden usarse ensayos que examinan una muestra biologica con respecto a la presencia de celulas que expresan polinucleotidos de 273P4B7 para proporcionar pruebas de metastasis. Por ejemplo, cuando se descubre que una muestra biologica de tejido que normalmente no contiene celulas que expresen 273P4B7 (ganglio linfatico) contiene celulas que expresan 273P4B7 tales como la expresion de 273P4B7 vista en LAPC4 y LAPC9, xenoinjertos aislados de ganglio linfatico y metastasis de hueso, respectivamente, este hallazgo es indicativo de metastasis.

Como alternativa pueden usarse polinucleotidos de 273P4B7 para proporcionar pruebas de cancer, por ejemplo, cuando se descubre que celulas de una muestra biologica que normalmente no expresan 273P4B7 o expresan 273P4B7 a un nivel diferente expresan 273P4B7 o tiene una expresion aumentada de 273P4B7 (vease, por ejemplo, la expresion de 273P4B7 en los canceres enumerados en la Tabla I y en muestras de pacientes etc. mostrada en las

Figuras adjuntas). En tales ensayos, los expertos en la materia pueden desear adicionalmente generar pruebas complementarias de metastasis ensayando la muestra biologica con respecto a la presencia de un segundo marcador restringido por tejido (ademas de 273P4B7) tal como PSA, PSCA etc. (vease, por ejemplo, Alanen y col., Pathol. Res. Pract. 192(3): 233-237 (1996)).

Al igual que los fragmentos polinucleotidicos de PSA y variantes polinucleotidicas se emplean por expertos en la materia para su uso en procedimientos para supervisar PSA, se usan fragmentos polinucleotidicos de 273P4B7 y variantes polinucleotidicas de una manera analoga. En particular, los polinucleotidos de PSA tipicos usados en procedimientos para supervisar PSA son sondas o cebadores que consisten en fragmentos de la secuencia de ADNc de PSA. Ilustrando esto, los cebadores usados para amplificar por PCR un polinucleotido de PSA deben incluir menos de la secuencia de PSA completa para actuar en la reaccion en cadena de la polimerasa. En el contexto de tales reacciones de PCR, los expertos en la materia generalmente crean una diversidad de diferentes fragmentos polinucleotidicos que pueden usarse como cebadores para amplificar diferentes partes de un polinucleotido de interes o para optimizar reacciones de amplificacion (vease, por ejemplo, Caetano-Anolles, G. Biotechniques 25(3): 472-476, 478-480 (1998); Robertson y col., Methods Mol. Biol. 98: 121-154 (1998)). Se proporciona una ilustracion adicional del uso de tales fragmentos en el Ejemplo titulado "Analisis de expresion de 273P4B7 en tejidos normales y muestras de ensayo de pacientes", en el que se usa un fragmento polinucleotidico de 273P4B7 como una sonda para mostrar la expresion de ARN de 273P4B7 en celulas cancerosas. Ademas, se usan tipicamente secuencias polinucleotidicas variantes como cebadores y sondas para los ARNm correspondientes en analisis de PCR y Northern (vease, por ejemplo, Sawai y col., Fetal Diagn. Ther. Nov-Dic 1996 11 (6): 407-13 y Current Protocols In Molecular Biology, Volumen 2, Unidad 2, Frederick M. Ausubel y col. eds., 1995)). Los fragmentos polinucleotidicos y variantes son utiles en este contexto en el que son capaces de unirse con una secuencia polinucleotidica diana (por ejemplo, un polinucleotido de 273P4B7 mostrado en la Figura 2 o variante del mismo) en condiciones de alta rigurosidad.

Como se muestra en el presente documento, los polinucleotidos de 273P4B7 (asi como las sondas polinucleotidicas de 273P4B7 usadas para identificar la presencia de estas moleculas) muestran propiedades especificas que las haces utiles en el diagnostico de canceres tales como los enumerados en la Tabla I. Se usan ensayos de diagnostico que miden la presencia de productos genicos de 273P4B7, para evaluar la presencia o aparicion de una condicion de enfermedad descrita en el presente documento, tal como cancer de prostata, para identificar pacientes para medidas preventivas o supervision adicional, como se ha realizado de forma exitosa con PSA. Ademas, estos materiales satisfacen una necesidad en la tecnica de moleculas que tengan caracteristicas similares o complementarias a PSA en situaciones en las que, por ejemplo, no puede realizarse un diagnostico definitivo de metastasis de origen prostatico basandose en un ensayo para PSA solamente (vease, por ejemplo, Alanen y col., Pathol. Res. Pract. 192(3): 233-237 (1996)), y en consecuencia, necesitan emplearse materiales tales como polinucleotidos y polipeptidos de 273P4B7 (asi como las sondas polinucleotidicas de 273P4B7 y anticuerpos anti273P4B7 usados para identificar la presencia de estas moleculas) para confirmar una metastasis de origen prostatico.

Finalmente, ademas de su uso en ensayo de diagnostico, los polinucleotidos de 273P4B7 desvelados en el presente documento tienen varias otras utilidades tales como su uso en la identificacion de anomalias cromosomicas asociadas con oncogenia en la region cromosomica en la que se mapea el gen de 273P4B7 (vease el Ejemplo titulado "Mapeo Cromosomico de 273P4B7" posteriormente). Ademas, aparte de su uso en ensayos de diagnostico, las proteinas y polinucleotidos relacionados con 273P4B7 desvelados en el presente documento tienen otras utilidades tales como su uso en el analisis forense de tejidos de origen desconocido (vease, por ejemplo, Takahama K Forensic Sci Int 28 Jun 1996; 80(1-2): 63-9).

VII.) Kits/Artículos de fabricación

Para su uso en las aplicaciones de laboratorio, pronostico y diagnostico descritas en el presente documento, se describen kits. Tales kits pueden comprender un vehiculo, envase o recipiente que esta compartimentalizado para recibir uno o mas recipientes tales como frascos, tubos y similares, comprendiendo cada uno de los recipientes uno de los elementos separados para usarse en el procedimiento, junto con un marcador o prospecto que comprende instrucciones para su uso, tal como un uso descrito en el presente documento. Por ejemplo, el recipiente o los recipientes pueden comprender una sonda que esta o puede estar marcada de forma detectable. Dicha sonda puede ser un polinucleotido especifico para un gen o un mensaje de la invencion. Cuando el procedimiento utiliza hibridacion de acidos nucleicos para detectar el acido nucleico diana, el kit tambien puede tener recipientes que contienen nucleotido o nucleotidos para amplificacion de la secuencia de acido nucleico diana. Los kits pueden comprender un recipiente que comprende un indicador, tal como una proteina de union a biotina, tal como avidina o estreptavidina, unida con una molecula indicadora, tal como un marcador enzimatico, fluorescente o radioisotopo; un indicador tal puede usarse con, por ejemplo, un acido nucleico. El kit puede incluir todas o parte de las secuencias de aminoacidos en la Figura 2 o en la Figura 3 o analogos de las mismas, o una molecula de acido nucleico que codifica tales secuencias de aminoacidos.

El kit tipicamente comprendera el recipiente descrito anteriormente y uno o mas recipientes adicionales asociados con el mismo que comprenden materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas; etiquetas de vehiculo, envase, recipiente, frasco y/o tubo que

enumeran contenidos y/o instrucciones de uso, y prospectos con instrucciones de uso.

Puede estar presente un marcador en o con el recipiente para indicar que la composicion se usa para una aplicacion no terapeutica especifica, tal como una aplicacion de pronostico, diagnostico o laboratorio, y tambien puede indicar instrucciones para uso in vivo o in vitro, tal como los descritos en el presente documento. Tambien pueden incluirse instrucciones y/o u otra informacion en un prospecto o prospectos o etiqueta o etiquetas que se incluyen con o en el kit. La etiqueta puede estar en o asociada con el recipiente. Una etiqueta puede estar en un recipiente cuando las letras, numeros u otros caracteres que forman la etiqueta se moldean o se graban en el recipiente en si mismo; una etiqueta puede estar asociada con un recipiente cuando esta presente dentro de un receptaculo o vehiculo que tambien contiene el recipiente, por ejemplo, como un prospecto. La etiqueta puede indicar que la composicion se usa para diagnostico, pronostico de una afeccion, tal como una neoplasia de un tejido expuesto en la Tabla I.

Las expresiones "kits" y "articulo de fabricacion" pueden usarse como sinonimos.

Un articulo o articulos de fabricacion pueden contener composiciones, tales como secuencia o secuencias de acidos nucleicos, por ejemplo, se proporcionan materiales utiles para el diagnostico o pronostico de neoplasias de tejidos tales como los expuestos en la Tabla I. El articulo de fabricacion tipicamente comprende al menos un recipiente y al menos una etiqueta. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, frascos, jeringas y tubos de ensayo. Los recipientes pueden formarse de una diversidad de materiales tales como vidrio, metal o plastico. El recipiente puede contener secuencia o secuencias de acido nucleico y/o celula o poblacion o poblaciones. El recipiente puede contener un polinucleotido para su uso en el examen del perfil de expresion de ARNm de una celula, junto con reactivos usados para este fin.

El recipiente puede contener como alternativa una composicion que es eficaz para diagnostico o pronostico de una afeccion y puede tener un orificio de acceso esteril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solucion intravenosa o un frasco que tenga un tapon perforable por una aguja de inyeccion hipodermica).

El articulo de fabricacion puede comprender ademas un segundo recipiente que comprenda un tampon farmaceuticamente aceptable, tal como solucion salina tamponada con fosfato, solucion de Ringer y/o solucion de dextrosa. Puede incluir adicionalmente otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agitadores, agujas, jeringas y/o prospectos con indicaciones y/o instrucciones de uso.

Ejemplos:

Se describen e ilustran adicionalmente diversos aspectos de la invencion mediante los varios ejemplos a continuacion, ninguno de los cuales se pretende que limite el alcance de la invencion.

Ejemplo 1: Aislamiento generado por SSH de fragmento de ADNc del gen de 273P4B7

Para aislar genes que se sobreexpresan en cancer de pulmon se uso el procedimiento de Hibridacion Sustractiva de Supresion (SSH) usando ADNc derivado de tejidos de cancer de pulmon. La secuencia de ADNc de SSH de 273P4B7 derivo de ADNc negativos para tumor de pulmon derivados de pulmon normal. El ADNc de 273P4B7 se identifico como altamente expresado en cancer.

Materiales y procedimientos

Tejidos humanos:

Los tejidos de paciente de cancer y normales se obtuvieron de diferentes fuentes tales como el NDRI (Filadelfia, PA). Se obtuvo ARNm de algunos tejidos normales de Clontech, Palo Alto, CA.

Aislamiento de ARN:

Los tejidos se homogeneizaron en reactivo de Trizol (Life Technologies, Gibco BRL) usando 10 ml/g de aislado tisular de ARN total. En ARN poli A se purifico a partir de ARN total usando kits de ARNm Oligotex de 0iagen Mini y Midi. El ARNm y total se cuantificaron por analisis espectrofotometrico (D.O. 260/280 nm) y se analizaron por electroforesis en gel.

Oligonucleotidos:

Se usaron los siguientes oligonucleotidos purificados por HPLC.

DPNCDN (cebador de sintesis de ADNc):

5'TTTTGATCAAGCTT303' (SEC lD N°: 30)

Adaptador 1:

50 5'CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAG3' (SEC ID N°: 31)

3'GGCCCGTCCTAG5' (SEC ID N°: 32)

Adaptador 2:

5'GTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAG3' (SEC ID N°: 33)

3'CGGCTCCTAG5' (SEC ID N°: 34)

Cebador de PCR 1:

5'CTAATACGACTCACTATAGGGC3' (SEC ID N°: 35)

Cebador anidado (NP)1:

5'TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGA3' (SEC ID N°: 36)

Cebador anidado (NP)2:

5'AGCGTGGTCGCGGCCGAGGA3' (SEC ID N°: 37)

Hibridacion sustractiva de supresion:

Se uso Hibridacion Sustractiva de Supresion (SSH) para identificar ADNc correspondientes a genes que pueden expresarse de forma diferencial en cancer. La reaccion de SSH utilizo ADNc de tejidos de cancer de pulmon y normales.

La secuencia genica de 273P4B7 derivo de sustraccion de ADNc de pulmon normal negativo para cancer de pulmon y una mezcla de 9 tejidos normales. Se identifico la secuencia de ADN de SSH (Figura 1).

El ADNc derivado de pulmon normal mezclado con un grupo de 9 tejidos normales se uso como la fuente del ADNc "conductor" mientras que el ADNc de cancer de pulmon se uso como la fuente del ADNc "de ensayo". Se sintetizaron ADNc bicatenarios correspondientes a ADNc de ensayo y conductores a partir de 2 μg de ARN poli(A)+ aislado del tejido relevante, como se ha descrito anteriormente, usando kit de Sustraccion de ADNc PCR-Select de CLONTECH y 1 ng de oligonucleotido DPNCDN como cebador. Se llevo a cabo sintesis de primera y segunda cadena como se describe en el protocolo del manual de usuario del Kit (CLONTECH Protocolo N° PT1117-1, N° de Catalogo K18041). El ADNc resultante se digirio con Dpn II durante 3 horas a 37 °C. Se extrajo ADNc digerido con fenol/cloroformo

(1:1) y se precipito con etanol.

Se genero ADNc conductor combinando en una relacion 1:1 ADNc digerido con Dpn II de pulmon normal con una mezcla de ADNc digerido derivado de los nueve tejidos normales: estomago, musculo esqueletico, pulmon, cerebro, higado, rinon, pancreas, intestino delgado y corazon.

Se genero ADNc de ensayo diluyendo 1 μl de ADNc digerido con Dpn II de la fuente tisular relevante (vease anteriormente) (400 ng) en 5 μl de agua. El ADNc diluido (2 μl, 160 ng) se ligo despues a μl de Adaptador 1 y Adaptador 2 (10 μM), en reacciones de ligacion separadas, en un volumen total de 10 μl a 16 °C durante una noche, usando 400 u de ADN ligasa T4 (CLONTECH). La ligacion se termino con 1 μl de EDTA 0,2 M y calentamiento a 72 °C durante 5 minutos.

La primera hibridacion se realizo anadiendo 1,5 μl (600 ng) de ADNc conductor a cada uno de dos tubos que contenian 1,5 μl (20 ng) de ADNc de ensayo ligado a Adaptador 1 y Adaptador 2. En un volumen final de 4 μl, las muestras se superpusieron con aceite mineral, se desnaturalizaron en un termociclador MJ Research a 98 °C durante 1,5 minutos, y despues se permitio que hibridaran durante 8 horas a 68 °C. Las dos hibridaciones se mezclaron despues junto con 1 μl adicional de ADNc conductor desnaturalizado nuevo y se permitio que hibridaran durante una noche a 68 °C. La segunda hibridacion se diluyo despues en 200 μl de Hepes 20 mM, pH 8,3, NaCl 50 mM, EDTA 0,2 mM, se calento a 70 °C durante 7 minutos y se almaceno a -20 °C.

Amplificacion por PCR, clonacion y secuenciacion de fragmentos genicos generados a partir de SSH:

Para amplificar fragmentos genicos resultantes de reacciones de SSH, se realizaron dos amplificaciones por PCR. En la reaccion de PCR primaria se anadio 1 μl de la mezcla de hibridacion final diluida a 1 μl de cebador de PCR 1 (10 μM), 0,5 μl de mezcla de dNTP (10 μM), 2,5 μl de tampon de reaccion 10 x (CLONTECH) y 0,5 μl de mezcla de ADNc polimerasa Advantage 50 x (CLONTECH) en un volumen final de 25 μl. Se realizo PCR 1 usando las siguientes condiciones: 75 °C durante 5 minutos, 94 °C durante 25 segundos, despues 27 ciclos de 94 °C durante 10 segundos, 66 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 1,5 minutos. Se realizaron cinco reacciones de PCR primarias separadas para cada experimento. Los productos se agruparon y se diluyeron 1:10 con agua. Para la reaccion de PCR secundaria, se anadio 1 μl de la reaccion de PCR primaria agrupada y diluida a la misma mezcla de reaccion que se usa para PCR 1, excepto que se usaron los cebadores NP1 y NP2 (10 μM) en lugar del cebador de PCR 1. Se realizo PCR 2 usando 10-12 ciclos de 94 °C durante 10 segundos, 68 °C durante 30 segundos y 72 °C durante

1,5 minutos. Los productos de PCR se analizaron usando electroforesis en gel de agarosa 2%.

Los productos de PCR se insertaron en pCR2.1 usando el kit de clonacion de vector T/A (Invitrogen). Se sometieron

E. coli transformadas a seleccion de ampicilina y azul/blanco. Se seleccionaron colonias blancas y se dispusieron en placas de 96 pocillos y se dejaron crecer en cultivo liquido durante una noche. Para identificar insertos, se realizo amplificacion por PCR en 1 μl de cultivo bacteriano usando las condiciones de PCR1 y NP1 y NP2 como cebadores. Los productos de PCR se analizaron usando electroforesis en gel de agarosa 2%.

Se almacenaron clones bacterianos en glicerol 20% en un formato de 96 pocillos. Se preparo ADN plasmidico, se secuencio y se sometio a busquedas de homologia de acido nucleico de las bases de datos GenBank, dBest, y NCI-CGAP.

Analisis de expresion de RT-PCR

Pueden generarse ADNc de primera cadena de 1 μg de ARNm con estimulacion de oligo (dT) 12-18 usando el sistema de Preamplificacion Gibco-BRL Superscript. Se uso el protocolo del fabricante que incluia una incubacion durante 50 minutos a 42 °C con transcriptasa inversa seguido de tratamiento con RNAsa H a 37 °C durante 20 minutos. Despues de completar la reaccion, el volumen puede aumentarse a 200 μl con agua antes de normalizacion. Pueden obtenerse ADNc de primera cadena de 16 tejidos humanos normales diferentes de Clontech.

Se realizo normalizacion de los ADNc de primera cadena de multiples tejidos usando los cebadores 5'atatcgccgcgctcgtcgtcgacaa3' (SEC ID N°: 38) y 5'agccacacgcagctcattgtagaagg 3' (SEC ID N°: 39) para amplificar β-actina. Se amplifico ADNc de primera cadena (5 μl) en un volumen total de 50 μl que contenia cebadores 0,4 μM, dNTP 0,2 μM cada uno, tampon de PCR 1X (Clontech, Tris-HCl 10 mM, MgCl2 1,5 mM, KCI 50 mM, pH 8,3) y ADN polimerasa Klentaq 1X (Clontech). Pueden retirarse cinco μl de la reaccion de PCR a 18, 20 y 22 ciclos y usarse para electroforesis en gel de agarosa. Se realizo PCR usando un termociclador MJ Research en las siguientes condiciones: la desnaturalizacion inicial puede ser a 94 °C durante 15 segundos, seguido de 18, 20 y 22 ciclos de 94 °C durante 15 segundos, 65 °C durante 2 minutos, 72 °C durante 5 segundos. Se llevo a cabo una extension final a 72 °C durante 2 minutos. Despues de electroforesis en gel de agarosa, las intensidades de bandas en las bandas de β-actina de 283 pb de multiples tejidos se compararon por inspeccion visual. Se calculo que los factores de dilucion para los ADNc de primera cadena daban como resultado intensidades de banda de β-actina iguales en todos los tejidos despues de 22 ciclos de PCR. Pueden requerirse tres ciclos de normalizacion para conseguir intensidades de banda iguales en todos los tejidos despues de 22 ciclos de PCR.

Para determinar niveles de expresion del gen de 273P4B7, se analizaron 5 μl de ADNc de primera cadena normalizado por PCR usando 26 y 30 ciclos de amplificacion. Puede conseguirse analisis de expresion semicuantitativa comparando los productos de PCR en numeros de ciclos que proporcionan intensidades de banda ligeras. Los cebadores usados para RT-PCR se enumeran a continuacion:

273P4B7.1

5'- GCTAGTGCTCAGAATACCAGACTATGG - 3' (SEC ID N°: 40)

273P4B7.2

5'- CGCTTGACATAAAAAGTGCAGATCC - 3' (SEC ID N°: 41)

Se muestra un analisis de expresion de RT-PCR tipico en la Figura 14(A) y 14(B). Se preparo ADNc de primera cadena a partir del grupo vital 1 (higado, pulmon y rinon), grupo vital 2 (pancreas, colon y estomago), pancreas normal, grupo de cancer de ovario y grupo de cancer de pancreas. Se realizo normalizacion por PCR usando cebadores para actina y GAPDH. Se realizo PCR semicuantitativa, usando cebadores para 273P4B7, a 26 y 30 ciclos de amplificacion. Se detecto expresion de 273P4B7 en grupo de cancer de ovario, grupo de cancer de pancreas, grupo vital 1, pero no en grupo vital 2 ni en pancreas normal.

Ejemplo 2: Clonación de longitud completa de 273P4B7

La secuencia de ADNc de SSH de 273P4B7 derivo de una sustraccion consistente en tejidos normales negativos para cancer de pulmon. La secuencia de ADNc de SSH de 170 pb (Figura 1) se designo 273P4B7.

Se clono 273P4B7 v.1 de4194 pb de cancer de pulmon, revelando una ORF de 1250 aminoacidos (Figura 2 y Figura 3). Tambien se identificaron otras variantes de 273P4B7 y estas se enumeran en la Figura 2 y Figura 3.

273P4B7 v.1, v.3, v.7 y v.8 codifican proteinas identicas de 1250 aminoacidos de longitud. 273P4B7 v.4, v.5 y v.6 difieren de 273P4B7 v.1 en un aminoacido como se muestra en la Figura 2. 273P4B7 v.2 es una variante de corte y empalme de 273P4B7 v.1 y codifica una proteina de 1127 aminoacidos.

273P4B7 v.1 muestra el 99% sobre solamente 1106 aminoacidos con la proteina no nombrada AK074719. La secuencia de acido nucleico de 273P4B7 v.1 se alinea con 99% de identidad con la posicion de nucleotidos 1594194, para ADNc FLJ31932 fis, clon NT2RP7006296, debilmente similar a PROTEiNA DE REPARACION DEESCISION ERCC-6.

273P4B7 v.1 muestra 72% de identidad con la proteina de raton BC004701 que se ha mostrado que es un miembro de la familia de superfamilia de helicasa de tipo DEAD. Los miembros de esta familia incluyen las helicasas de caja DEAD y DEAH. Las helicasas estan implicadas en el desenrollamiento de acidos nucleicos. Las helicasas de caja DEAD estan implicadas en diversos aspectos del metabolismo de ARN, incluyendo transcripcion nuclear, corte y empalme de pre ARNm, biogenesis de ribosomas, transporte nucleocitoplasmico, traduccion, degradacion de ARN y expresion de genes organulares.

Ejemplo 3: Mapeo cromosómico de 273P4B7

La localizacion cromosomica puede implicar genes en patogenesis de enfermedad. Estan disponibles varios enfoques de mapeo de cromosomas incluyendo hibridacion fluorescente in situ (FISH), paneles de hibrido de radiacion (RH) ser humano/hamster (Walter y col., 1994; Nature Genetics 7: 22; Research Genetics, Huntsville Al), paneles de hibridos de celulas somaticas ser humano-roedor tales como los que estan disponibles del Instituto Coriell (Camden, Nueva Jersey) y visores genomicos que utilizan homologias de BLAST para clones genomicos secuenciados y mapeados (NCBI, Bethesda, Maryland).

273P4B7 se mapea en el cromosoma Xq13.1 usando secuencia de 273P4B7 y la herramienta BLAST de NCBI localizada en Internet en (ncbi.nim.nih.govlgenome/seq/page.cgi!?F=HsBlasthtml&&ORG=Hs).

Ejemplo 4: Análisis de expresión de 273P4B7 en tejidos normales y muestras de ensayo de pacientes

El analisis de expresion por RT-PCR demostro que 273P4B7 se expresa fuertemente en muestras de ensayo de cancer de pacientes (Figura 14). Se preparo ADNc de primera cadena a partir de tejidos normales (vejiga, cerebro, corazon, rinon, higado, pulmon, prostata, bazo, musculo esqueletico, testiculo, pancreas, colon y estomago) y de grupos de muestras de ensayo de cancer de pacientes (grupo de cancer de pancreas, grupo de cancer de vejiga, grupo de cancer de rinon, grupo de cancer de colon, grupo de cancer de pulmon, grupo de cancer de ovario, grupo de cancer de mama, grupo de metastasis de cancer, grupo de cancer de pancreas, grupo de xenoinjerto de cancer de prostata, metastasis de prostata a ganglio linfatico, grupo de cancer de hueso y melanoma, grupo de cancer cervical, grupo de cancer de linfoma, grupo de cancer de estomago, grupo de cancer de utero y grupo multixenoinjerto). Se realizo normalizacion por PCR para actina. Se realizo PCR semicuantitativa, usando cebadores para 273P4B7 a 22, 26 y 30 ciclos de amplificacion. En la Figura 14(A) se muestra una imagen del gel de agarosa de RT-PCR. En la Figura 14(A) se cuantificaron productos de PCR usando el software Alphalmager. Los resultados muestran fuerza de expresion de 273P4B7 en grupo de cancer de prostata, grupo de cancer de vejiga, grupo de cancer de rinon, grupo de cancer de colon, grupo de cancer de pulmon, grupo de cancer de ovario, grupo de cancer de mama, grupo de metastasis de cancer, grupo de cancer de pancreas, grupo de xenoinjerto de cancer de prostata, metastasis de prostata a ganglio linfatico, grupo de cancer de hueso y melanoma, grupo de cancer cervical, grupo de cancer de linfoma, grupo de cancer de estomago, grupo de cancer de utero y grupo de multixenoinjerto (grupo de xenoinjerto de cancer de prostata, cancer de rinon y cancer de vejiga). En tejidos normales, 273P4B7 se expresa predominantemente en testiculo y no en ningun otro tejido normal ensayado.

Se muestra expresion extensiva de 273P4B7 en tejidos normales en la Figura 15. Se exploraron dos transferencias de Northern de tejidos multiples (Clontech) ambas con 2 μg de ARNm/carril con la secuencia de 273P4B7. Se indican los patrones de tamano en kilobases (kb) en el lateral. Los resultados muestran la expresion de un transcrito de 273P4B7 de aproximadamente 7 kb en testiculo normal pero no en los otros tejidos normales ensayados.

Se muestra expresion de 273P4B7 en muestras de ensayo de paciente con cancer de pancreas, ovario y testiculo en la Figura 16. Se extrajo ARN de pancreas normal (NPa), ovario normal (NO), testiculo normal (NTe), muestra de ensayo de paciente con cancer de pancreas (P1), muestra de ensayo de paciente con cancer de ovario (P2,P3,P4) y muestra de ensayo de paciente con cancer de testiculo (P5,P6,P7). Se exploro transferencia de Northern con 10 μg de ARN total/carril con secuencia de SSH de 273P4B7. Se indican los patrones de tamano en kilobases (kb) en el lateral. Se detecto transcrito de 273P4B7 en las muestras de ensayo de paciente, pero no en los tejidos normales.

La Figura 17 muestra expresion de 273P4B7 en muestras de ensayo de paciente con cancer cervical. En la Figura 17(A), se extrajo ARN total de muestras de ensayo de paciente con cancer cervical (T1-T7) y linea celular HeLa. Se exploro transferencia de Northern con 10 μg de ARN total/carril con secuencia de SSH de 273P4B7. Se indican los patrones de tamano en kilobases (kb) en el lateral. Se detecto transcrito de 273P4B7 en todas las muestras de ensayo de paciente ensayadas asi como en la linea celular HeLa. En la Figura 17(B) se preparo ADNc de primera cadena a partir de un panel de muestras de ensayo de paciente con cancer cervical, cuello uterino normal y linea celular cervical HeLa. Se realizo normalizacion por PCR usando cebadores para actina. Se realizo PCR semicuantitativa, usando cebadores para 273P4B7 a 26 y 30 ciclos de amplificacion. Las muestras se procesaron en un gel de agarosa, y los productos de PCR se cuantificaron usando el software Alphalmager. La expresion se registro como ausente, baja, media o fuerte. Los resultados muestran la expresion de 273P4B7 en la mayoria de los tejidos de cancer cervical ensayados.

Se muestra expresion de 273P4B7 en muestras de ensayo de paciente con cancer de vejiga en la figura 18. Se preparo ADNc de primera cadena a partir de un panel de muestras de ensayo de paciente con cancer de vejiga, vejiga normal (N) y lineas celulares de cancer de vejiga (UM-UC-3, TCCSUP, J82). Se realizo normalizacion por

PCR usando cebadores para actina. Se analizo PCR semicuantitativa usando cebadores para 273P4B7, a 26 y 30 ciclos de amplificacion. Las muestras se procesaron en un gel de agarosa (Figura 18(A)) y los productos de PCR se cuantificaron usando el software Alphalmager (Figura 18(B)). Se registro expresion como ausente, baja, media o alta. Los resultados muestran expresion de 273P4B7 en la mayoria de los tejidos de cancer de vejiga ensayados, pero no en los tejidos de vejiga normal.

Se muestra expresion de 273P4B7 en muestras de ensayo de paciente con cancer de colon en la figura 19. Se preparo ADNc de primera cadena a partir de un panel de muestras de ensayo de paciente con cancer de colon, colon normal y lineas celulares de cancer de colon (LoVo, CaCo-2, SK-CO1, Colo205 y T284). Se realizo normalizacion por PCR usando cebadores para actina. Se realizo PCR semicuantitativa, usando cebadores para 273P4B7, a 26 y 30 ciclos de amplificacion. Se procesaron muestras en un gel de agarosa y se cuantificaron productos de PCR usando el software Alphalmager. Se registro la expresion como ausente, baja, media o alta. Los resultados muestran expresion de 273P4B7 en la mayoria de los tejidos de cancer de colon ensayados, pero no en los tejidos de colon normal. Tambien se detecto expresion en las lineas celulares LoVo, CaCo-2, SK-CO1 Colo205, pero no en la linea celular T284.

La Figura 20 muestra expresion de 273P4B7 en muestras de ensayo de paciente con cancer de ovario. Se preparo ADNc de primera cadena a partir de un panel de muestras de ensayo de paciente con cancer de ovario, ovario normal y lineas celulares de cancer de ovario (OV-1063, PA-1, SW626). Se realizo normalizacion por PCR usando cebadores para actina. Se realizo PCR semicuantitativa, usando cebadores para 273P4B7, a 26 y 30 ciclos de amplificacion. Se procesaron muestras en un gel de agarosa y se cuantificaron productos de PCR usando el software Alphalmager. La expresion se registro como ausente, baja, media o alta. Los resultados muestran expresion de 273P4B7 en la mayoria de tejidos de cancer de ovario ensayados, asi como en las lineas celulares, pero no en ovario normal.

La expresion restringida de 273P4B7 en tejidos normales y la expresion detectada en muestras de ensayo de paciente con cancer sugiere que 273P4B7 es una diana terapeutica y un marcador de diagnostico para canceres humanos.

Ejemplo 5: Variantes de transcrito de 273P4B7

Como se usa en el presente documento, el termino variante comprende variantes de transcrito y Polimorfismos de un unico nucleotido (SNP). Las variantes de transcrito son variantes de ARNm maduro del mismo gen que surgen por transcripcion alternativa o corte y empalme alternativo. Los transcritos alternativos son transcritos del mismo gen pero inician la transcripcion en diferentes puntos. Las variantes de corte y empalme son variantes de ARNm cortadas y empalmadas de forma diferente a partir del mismo transcrito. En eucariotas, cuando se transcribe un gen de multiples exones a partir de ADN genomico, el ARN inicial se corta y empalma para producir ARNm funcional, que tiene solamente exones y se usa para traduccion a una secuencia de aminoacidos. En consecuencia, un gen dado puede tener de cero a muchos transcritos alternativos y cada transcrito puede tener de cero a muchas variantes de corte y empalme. Cada variante de transcrito tiene una composicion exonica unica y puede tener diferentes partes codificantes y/o no codificantes (extremos 5' o 3'), del transcrito original. Las variantes de transcrito pueden codificar las mismas, similares o diferentes proteinas con la misma funcion o una similar o pueden codificar proteinas con diferentes funciones, y pueden expresarse en el mismo tejido a la vez, en diferentes tejidos a la vez, en el mismo tejido en diferentes momentos o en diferentes tejidos en diferentes momentos. Las proteinas codificadas por variantes de transcrito pueden tener localizaciones subcelulares o extracelulares similares o diferentes, por ejemplo, secretada frente a intracelular.

Se identifican variantes de transcrito por una diversidad de procedimientos aceptados en la tecnica. Por ejemplo, se identifican transcritos alternativos y variantes de corte y empalme por experimentos de clonacion de longitud completa o mediante el uso de transcrito de longitud completa y secuencias EST. En primer lugar, todas las EST humanas se agruparon en grupos que muestran identidad directa o indirecta entre si. En segundo lugar, las EST en el mismo grupo se agruparon adicionalmente en subgrupos y se ensamblaron en una secuencia consenso. La secuencia genica original se compara con la secuencia o las secuencias consenso u otras secuencias de longitud completa. Cada secuencia consenso es una variante de corte y empalme potencial para ese gen. Incluso cuando se identifica una variante que aun no es un clon de longitud completa, esa parte de la variante es muy util como una herramienta de investigacion, por ejemplo, para generacion de antigenos y para clonacion adicional de variante de corte y empalme de longitud completa, usando tecnicas conocidas por los expertos en la materia.

Ademas, estan disponibles programas informaticos para los expertos en la materia que identifican variantes de transcrito basandose en secuencias genomicas. Los programas de identificacion de variantes de transcrito basada en genoma incluyen FgenesH (A. Salamov y V. Solovyev, "Ab initio gene finding in Drosophila genomic DNA," Genome Research. Abril de 2000; 10(4): 516-22); Grail (URL compbio.oml.gov/Grail-bin/EmptyGrailForm) y GenScan (URL genes.mit.edu/GENSCAN.htmt). Para un analisis general de protocolos de identificacion de variantes de corte y empalme vease, por ejemplo, Southan, C., A genomic perspective on human proteases, FEBS Lett. 8 Jun 2001; 498(2-3): 214-8; de Souza, S. J., y col., Identification of human chromosome 22 transcribed sequences with ORF expressed sequence tags, Proc. Natl. Acad. Sci USA. 7 Nov 2000; 97(23): 12690-3.

Para confirmar adicionalmente los parametros de una variante de transcrito, estan disponibles una diversidad de tecnicas en la materia, tales como clonacion de longitud completa, validacion proteomica, validacion basada en PCR y validacion de RACE 5', etc. (vease, por ejemplo, Validacion Proteomica: Brennan, S. O., y col., Albumin banks peninsula: a new termination variant characterized by electrospray mass spectrometry, Biochem Biophys Acta. 17 Ago 1999; 1433(1-2): 321-6; Ferranti P, y col., Differential splicing of pre-messenger RNA produces multiple forms of mature caprine alpha(s1)-casein, Eur J Biochem. 1 Oct 1997; 249(1): 1-7. Para validacion basada en PCR: Wellmann S, y col., Specific reverse transcripfion-PCR quantification of vascular endothelial growth factor (VEGF) splice variants by LightCycter technology, Clin Chem. Abr 2001; 47(4): 654-60; Jia, H. P., y col., Discovery of new human beta-defensins using a genomics-based approach, Gene. 24 Ene 2001; 263(1-2): 211-8. Para variacion basada en PCR y de RACE 5': Brigle, K. E., y col., Organization of the murine reduced folate carrier gene and identification of variant splice forms, Biochem Biophys Acta. 7 Ago 1997; 1353(2): 191-8).

Se conoce en la tecnica que las regiones genomicas se modulan en canceres. Cuando la region genomica en la que se mapea un gen se modula en un cancer particular, los transcritos alternativos o variantes de corte y empalme del gen tambien se modulan. Se desvela en el presente documento que 273P4B7 tiene un perfil de expresion particular relacionado con cancer (vease, por ejemplo, Tabla 1). Tambien estan implicados transcritos alternativos y variantes de corte y empalme de 273P4B7 en canceres en el mismo o diferentes tejidos, actuando de este modo como marcadores/antigenos asociados con tumor.

Usando el gen de longitud completa y secuencias EST, se identificaron cuatro variantes de transcrito adicionales, designadas 273P4B7 v.2, v.9 y v.10. Los limites de los exones en el transcrito original, 273P4B7 v.1, se muestran en la Tabla LI. Las estructuras de las variantes de transcrito se muestran en la Figura 10. La variante 273P4B7 v.2 anadio 22 bases al extremo 5' del exon 1 y un exon adicional en el primer intron de la variante v.1. Las variantes v.9 y v.10 fueron mas cortas y coincidieron con parte del ultimo exon de v.1, con algunos pares de bases diferentes.

Las Tablas LII(a)-(d) a LV(a)-(c) se exponen variante por variante. Las tablas LII(a)-(d) muestran secuencias de nucleotidos de las variantes de transcrito. Las tablas LIII(a)-(d) muestran el alineamiento de la variante de transcrito con secuencia de acido nucleico de 273P4B7 v.1. La Tabla LIV(a)-(d) expone la traduccion de aminoacidos de la variante de transcrito para la orientacion de fase de lectura identificada. La Tabla LV(a)-(d) presenta alineamientos de la secuencia de aminoacidos codificada por la variante de corte y empalme con la de 273P4B7 v.1.

Ejemplo 6: Polimorfismos de un único nucleótido de 273P4B7

Un Polimorfismo de un unico nucleotido (SNP) es una variacion de un par de bases en una secuencia de nucleotidos en una localizacion especifica. En cualquier punto dado del genoma, hay cuatro pares de bases de nucleotidos posibles: A/T, C/G, G/C y T/A. El genotipo se refiere a la secuencia de pares de bases especifica de una o mas localizaciones en el genoma de un individuo. Haplotipo se refiere a la secuencia de pares de bases de mas de una localizacion en la misma molecula de ADN (o en el mismo cromosoma en organismos superiores), con frecuencia en el contexto de un gen o en el contexto de varios genes unidos estrechamente. El SNP que se produce en un ADNc se denomina SNPc. Este SNPc puede cambiar aminoacidos de la proteina codificada por el gen y de este modo cambiar las funciones de la proteina. Algunos SNP provocan enfermedades hereditarias; otros contribuyen a variaciones cuantitativas en el fenotipo y reacciones a factores ambientales incluyendo dieta y farmacos entre individuos. Por lo tanto, SNP y/o combinaciones de alelos (llamados haplotipos) tienen muchas aplicaciones, incluyendo diagnostico de enfermedades hereditarias, determinacion de reacciones farmacologicas y dosificacion, identificacion de genes responsables de enfermedades y analisis de la relacion genetica entre individuos (P. Nowotny, J. M. Kwon y A. M. Goate, "SNP analysis to dissect human traits," Curr. Opin. Neurobiol. Oct 2001; 11 (5): 637-641; M. Pirmohamed y B. K. Park, "Genetic susceptibility to adverse drug reactions," Trends Pharmacol. Sci. Jun 2001; 22(6): 298-305; J. H. Riley, C. J. Allan, E. Lai y A. Roses, "The use of single nucleotide polymorphisms in the isolation of common disease genes," Pharmacogenomics. Feb 2000; 1(1): 39-47; R. Judson, J. C. Stephens y A. Windemuth, "The predictive power of haplotypes in clinical response," Pharmacogenomics, Feb 2000; 1(1): 15-26).

Los SNP se identifican por una diversidad de procedimientos aceptados en la tecnica (P. Bean, "The promising voyage of SNP target discovery," Am Clin. Lab. Oct-Nov 2001; 20(9): 18-20; K. M. Weiss, "In search of human variation," Genome Res. Jul 1998; 8(7): 691-697; M. M. She, "Enabling large-scale pharmacogenetic studies by highthroughput mutation detection and genotyping technologies," Clin. Chem. Feb 2001; 47(2): 164-172). Por ejemplo, pueden identificarse SNP por secuenciacion de fragmentos de ADN que muestran polimorfismo por procedimientos basados en gel tales como polimorfismo de longitud de fragmento de restriccion (RFLP) y electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE). Tambien pueden descubrirse por secuenciacion directa de muestras de ADN agrupadas de diferentes individuos o por comparacion de secuencias de diferentes muestras de ADN. Con la rapida acumulacion de datos de secuencias en bases de datos publicas y privadas, se pueden descubrir SNP comparando secuencias usando programas informaticos (Z. Gu, L. Hillier y P. Y. Kwok, "Single nucleotide polymorphism hunting in cyberspace," Hum Mutat 1998; 12(4): 221-225). Los SNP pueden verificarse y puede determinarse el genotipo o haplotipo de un individuo por una diversidad de procedimientos incluyendo secuenciacion directa y micromatrices de alto rendimiento (P. Y. Kwok, "Methods for genotyping single nucleotide polymorphisms," Annul. Rev. Genomics Hum. Genet. 2001; 2: 235-258; M. Kokoris, K. Dix, K. Moynihan, J. Mathis, B. Erwin, P. Grass, B. Hines y A. Duesterhoeft, "High-throughput SNP genotyping with the Masscode system," Mol. Diagn. Dic 2000; 5(4): 329-340).

Usando los procedimientos descritos anteriormente, se identificaron seis SNP en el transcrito, 273P4B7 v.1, como se muestra en la Tabla LVI. Los transcritos o proteinas con alelo alternativo se designaron variante 273P4B7 v.3 a v.8, como se muestra en la Tabla LVI y Figura 12. Estos alelos del SNP, aunque se muestran aqui por separado, pueden aparecer en diferentes combinaciones (haplotipos) y en una cualquiera de las variantes de transcrito (tales como 273P4B7 v.2, como se enumera en la tabla LVI) que contenga el sitio de SNP, como se expone en las Figuras 11 y

12.

Ejemplo 7: Producción de 273P4B7 recombinante en sistemas procariotas

Para expresar 273P4B7 recombinante y variantes de 273P4B7 en celulas procariotas, se clona la 273P4B7 de longitud completa o parcial y secuencias de ADNc de variantes de 273P4B7 en uno cualquiera de una diversidad de vectores de expresion conocidos en la tecnica. Se expresa una o mas de las siguientes regiones de variantes de 273P4B7: la secuencia de longitud completa presentada en las Figuras 2 y 3, o cualesquiera 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o mas aminoacidos contiguos de 273P4B7, variantes o analogos de la misma.

A. Construcciones de transcripcion y traduccion in vitro

pCRII: Para generar sondas de ARN sentido y antisentido de 273P4B7 para investigaciones in situ de ARN, se generan construcciones de pCRII (Invitrogen, Carlsbad CA) que codifican todo o fragmentos del ADNc de 273P4B7. El vector pCRII tiene promotores Sp6 y T7 que flanquean el inserto para conducir la transcripcion de ARN de 273P4B7 para su uso como sondas en experimentos de hibridacion in situ de ARN. Estas sondas se usan para analizar la expresion en celulas y tejidos de 273P4B7 al nivel de ARN. El ARN de 273P4B7 transcrito que representa la region codificante de aminoacidos de ADNc del gen de 273P4B7 se usa en sistemas de traduccion in vitro tales como el Sistema de Reticulolisado Acoplado a TnT� (Promega, Corp., Madison, WI) para sintetizar proteina 273P4B7.

B. Construcciones bacterianas:

Construcciones de pGEX: Para generar proteinas 273P4B7 recombinantes en bacterias que se fusionan con la proteina de Glutation S-transferasa (GST), toda o partes de la secuencia codificante de proteina de ADNc de 273P4B7 se clonan en la familia pGEX de vectores de fusion de GST (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Estas construcciones permiten la expresion controlada de secuencias de proteina 273P4B7 recombinante con GST fusionada en el extremo amino terminal y un epitopo de seis histidinas (His 6X) en el extremo carboxilo terminal. Los marcadores de GST y His 6X permiten purificacion de la proteina de fusion recombinante a partir de bacterias inducidas con la matriz de afinidad apropiada y permiten el reconocimiento de la proteina de fusion con anticuerpos anti-GST y anti-His. El marcado de His 6X se genera anadiendo 6 codones de histidina al cebador de clonacion en el extremo 3', por ejemplo, de la fase abierta de lectura (ORF). Puede emplearse un sitio de escision proteolitica, tal como el sitio de reconocimiento de PreScission� en pGEX-6P-1, de modo que permita escision del marcador de GST de la proteina relacionada con 273P4B7. El gen de resistencia a ampicilina y origen de pBR322 permiten seleccion y mantenimiento de los plasmidos pGEX en E. coli.

Construcciones de pMAL: Para generar, en bacterias, proteinas 273P4B7 recombinantes que se fusionan con proteina de union a maltosa (MBP), toda o partes de la secuencia codificante de proteina de ADNc de 273P4B7 se fusionan con el gen de MBP por clonacion en vectores pMAL-c2X y pMAL-p2X (New England Biolabs, Beverly, MA). Estas construcciones permiten la expresion controlada de secuencias de proteina 273P4B7 recombinante con MBP fusionada en el extremo amino terminal y un marcador epitopico de His 6X en el extremo carboxilo terminal. Los marcadores de MBP y His 6X permiten purificacion de la proteina recombinante a partir de bacterias inducidas con la matriz de afinidad apropiada y permiten el reconocimiento de la proteina de fusion con anticuerpos anti-MBP y anti-His. El marcado epitopico de His 6X se genera anadiendo 6 codones de histidina al cebador de clonacion 3'. Un sitio de reconocimiento de factor Xa permite escision del marcador pMAL de 273P4B7. Los vectores pMAL-c2X y pMALp2X se optimizan para expresar la proteina recombinante en el citoplasma o periplasma respectivamente. La expresion en el periplasma potencia el plegamiento de proteinas con enlaces disulfuro.

Construcciones de pET: Para expresar 273P4B7 en celulas bacterianas, toda o partes de la secuencia codificante de proteina de ADNc de 273P4B7 se clonan en la familia pET de vectores (Novagen, Madison, WI). Estos vectores permiten expresion estrechamente controlada de proteina 273P4B7 recombinante en bacterias con y sin fusion con proteinas que potencian la solubilidad, tales como NusA y tiorredoxina (Trx) y marcadores epitopicos, tales como His 6X y S-Tag� que ayudan a la purificacion y deteccion de la proteina recombinante. Por ejemplo, se realizan construcciones utilizando sistema de fusion de pET NusA 43.1 de modo que las regiones de la proteina 273P4B7 se expresen como fusiones amino terminales con NusA.

C. Construcciones de levadura:

Construcciones de pESC: Para expresar 273P4B7 en la especie de levadura Saccharomyces cerevisiae para generacion de proteina recombinante y estudios funcionales, toda o partes de la secuencia codificante de proteina de ADNc de 273P4B7 se clonan en la familia pESC de vectores cada uno de los cuales contiene 1 de 4 marcadores seleccionables, HIS3, TRP1, LEU2 y URA3 (Stratagene, La Jolla, CA). Estos vectores permiten la expresion

controlada a partir del mismo plasmido de hasta dos genes diferentes o secuencias clonadas que contienen marcadores epitopicos Flag� o Myc en la misma celula de levadura. Este sistema es util para confirmar interacciones proteina-proteina de 273P4B7. Ademas, la expresion en levadura produce modificaciones postraduccionales similares, tales como glicosilaciones y fosforilaciones que se encuentran cuando se expresan en celulas eucariotas.

Construcciones de pESP: Para expresar 273P4B7 en la especie de levadura Saccharomyces pombe, toda o partes de la secuencia codificante de proteina de ADNc de 273P4B7 se clonan en la familia pESP de vectores. Estos vectores permiten alto nivel controlado de expresion de una secuencia de proteina 273P4B7 que se fusiona en el extremo aminoterminal o en el extremo carboxilo terminal de GST que ayuda a la purificacion de la proteina recombinante. Un marcador epitopico Flag� permite la deteccion de la proteina recombinante con anticuerpo antiFlag�.

Ejemplo 8: Producción de 273P4B7 recombinante en sistemas eucariotas superiores

A. Construcciones de mamífero:

Para expresar 273P4B7 recombinante en celulas eucariotas, la secuencia de ADNc de 273P4B7 de longitud completa o parcial se clonaron en uno cualquiera de una diversidad de vectores de expresion conocidos en la tecnica. Una o mas de las siguientes regiones de 273P4B7 se expreso en estas construcciones, aminoacidos 1 a 1250 o cualesquiera 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o mas aminoacidos contiguos de 273P4B7 v.1, v.4, v.5 y v.6; aminoacidos 1 a 1127 de v.2 o cualesquiera 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o mas aminoacidos contiguos de variantes de 273P4B7, o analogos de las mismas.

Las construcciones pueden usarse para transfectar una cualquiera de una amplia diversidad de celulas de mamiferos tales como celulas 293T. Los lisados de celulas 293T transfectadas pueden explorarse con el suero policlonal anti-273P4B7, descrito en el presente documento.

Construcciones de pcDNA4/HisMax: Para expresar 273P4B7 en celulas de mamifero, se clona una ORF de 273P4B7, o partes de la misma, de 273P4B7 en pcDNA4/HisMax Version A (Invitrogen, Carlsbad, CA). La expresion proteica se conduce desde el promotor de citomegalovirus (CMV) y el potenciador de traduccion SP16. La proteina recombinante tiene epitopos Xpress� y seis histidinas (His 6X) fusionados con el extremo amino terminal. El vector pcDNA4/HisMax tambien contiene la senal de poliadenilacion de hormona del crecimiento bovina (BGH) y secuencia de terminacion de la transcripcion para potenciar la estabilidad de ARNm junto con el origen de SV40 para replicacion episomal y rescate de vector sencillo en lineas celulares que expresan el antigeno T grande. El gen de resistencia a Zeocina posibilita la seleccion de celulas de mamifero que expresan la proteina y el gen de resistencia a ampicilina y el origen de ColE1 permite seleccion y mantenimiento del plasmido en E. coli.

Construcciones de pcDNA3.1/MycHis: Para expresar 273P4B7 en celulas de mamifero, se clono ORF 273P4B7, o partes de la misma, de 273P4B7 con un sitio de inicio de la traduccion Kozak consenso en pcDNA3.1/MycHis Version A (Invitrogen, Carlsbad, CA). La expresion proteica se conduce desde el promotor de citomegalovirus (CMV). Las proteinas recombinantes tienen el epitopo myc y epitopo His 6X fusionados con el extremo carboxilo terminal. El vector pcDNA3.1/MycHis tambien contiene la senal de poliadenilacion de hormona del crecimiento bovina (BGH) y secuencia de terminacion de la transcripcion para potenciar la estabilidad del ARNm, junto con el origen de SV40 para replicacion episomal y rescate de vector sencillo en lineas celulares que expresan el antigeno T grande. Puede usarse el gen de resistencia a Neomicina, porque posibilita la seleccion de celulas de mamifero que expresan la proteina y el gen de resistencia a ampicilina y el origen de ColE1 permite la seleccion y el mantenimiento del plasmido en E. coli.

Construcción pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO: Para expresar 273P4B7 en celulas de mamifero, y permitir la deteccion de las proteinas recombinantes usando fluorescencia, se clona una ORF de 273P4B7, o partes de la misma, con un sitio de inicio de la traduccion de Kozak consenso en pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO (Invitrogen, CA). La expresion proteica se conduce desde el promotor de citomegalovirus (CMV). Las proteinas recombinantes tienen la proteina verde fluorescente (GFP) fusionada con el extremo carboxilo terminal que facilita la deteccion no invasiva, in vivo y estudios de biologia celular. El vector pcDNA3.1 CT GFP-TOPO tambien contiene la senal de poliadenilacion de hormona del crecimiento bovina (BGH) y secuencia de terminacion de la transcripcion para potenciar la estabilidad del ARNm junto con el origen de SV40 para replicacion episomal y rescate de vector sencillo en lineas celulares que expresan el antigeno T grande. El gen de resistencia a Neomicina posibilita la seleccion de celulas de mamifero que expresan la proteina, y el gen de resistencia a ampicilina y origen de ColE1 permite la seleccion y el mantenimiento del plasmido en E. coli. Se realizan construcciones adicionales con una fusion de GFP amino terminal en pcDNA3.1/NT-GFP-TOPO que abarca la longitud completa de una proteina 273P4B7.

PAPtag: Una ORF de 273P4B7, o partes de la misma, se clona en pAPtag-5 (GenHunter Corp. Nashville, TN). Esta construccion genera una fusion de fosfatasa alcalina en el extremo carboxilo terminal de una proteina 273P4B7 fusionando a la vez la secuencia senal de IgGκ con el extremo amino terminal. Tambien se generan construcciones en las que se fusiona fosfatasa alcalina con una secuencia senal de IgGκ amino terminal con el extremo amino

terminal de una proteina 273P4B7. Las proteinas 273P4B7 recombinantes resultantes se optimizan para secrecion al medio de celulas de mamifero transfectadas y pueden usarse para identificar proteinas tales como ligandos o receptores que interaccionan con proteinas 273P4B7. La expresion proteica se conduce desde el promotor de CMV y las proteinas recombinantes tambien contienen epitopos myc y His 6X fusionados en el extremo carboxilo terminal que facilitan la deteccion y purificacion. El gen de resistencia a Zeocina presente en el vector posibilita seleccion de celulas de mamifero que expresan la proteina recombinante y el gen de resistencia a ampicilina permite la seleccion del plasmido en E. coli.

pTag5: Una ORF de 273P4B7, o partes de la misma, se clona en pTag-5. Este vector es similar a pAPtag pero sin la fusion con fosfatasa alcalina. Esta construccion genera proteina 273P4B7 con una secuencia senal de IgGκ amino terminal y marcadores epitopicos myc y His 6X en el extremo carboxilo terminal que facilitan la deteccion y purificacion de afinidad. La proteina 273P4B7 recombinante resultante se optimiza para secrecion al medio de celulas de mamifero transfectadas y se usa como inmunogeno o ligando para identificar proteinas tales como ligandos o receptores que interaccionan con las proteinas 273P4B7. La expresion proteica se conduce desde el promotor de CMV. El gen de resistencia a Zeocina presente en el vector posibilita la seleccion de celulas de mamifero que expresan la proteina, y el gen de resistencia a ampicilina permite la seleccion del plasmido en E. coli.

PsecFc: Una ORF de 273P4B7, o partes de la misma, tambien se clona en psecFc. El vector psecFc se ensamblo clonando el Fc de inmunoglobulina G1 humana (IgG) (regiones bisagra, CH2, CH3) en pSecTag2 (Invitrogen, California). Esta construccion genera una fusion de Fc de IgG1 en el extremo carboxilo terminal de las proteinas 273P4B7, fusionando a la vez la secuencia senal de IgGκ con el extremo N terminal. Tambien se usan fusiones de 273P4B7 que utilizan la region Fc de IgG1 murina. Las proteinas 273P4B7 recombinantes resultantes se optimizan para secrecion al medio de celulas de mamifero transfectadas, y pueden usarse como inmunogenos o para identificar proteinas tales como ligandos o receptores que interaccionan con proteinas 273P4B7. La expresion proteica se conduce desde el promotor de CMV. El gen de resistencia a higromicina presente en el vector posibilita la seleccion de celulas de mamifero que expresan la proteina recombinante, y el gen de resistencia a ampicilina permite la seleccion del plasmido en E. coli.

Construcciones de pSR : Para generar lineas celulares de mamifero que expresen 273P4B7 de forma constitutiva, se clono ORF de 273P4B7, o partes de la misma, de 273P4B7 en construcciones de pSRα. Se generaron retrovirus anfotropicos y ecotropicos por transfeccion de construcciones de pSRα en la linea de empaquetamiento 293T-10A1 o cotransfeccion de pSRα y un plasmido auxiliar (que contiene secuencias de empaquetamiento suprimidas) en las celulas 293, respectivamente. El retrovirus se usa para infectar una diversidad de lineas celulares de mamifero, dando como resultado la integracion del gen clonado, 273P4B7, en las lineas celulares huesped. La expresion proteica se conduce desde una repeticion terminal larga (LTR). El gen de resistencia a Neomicina presente en el vector posibilita la seleccion de celulas de mamifero que expresan la proteina, y el gen de resistencia a ampicilina y origen de ColE1 permiten la seleccion y el mantenimiento del plasmido en E. coli. Los vectores retrovirales pueden usarse a continuacion para infeccion y generacion de diversas lineas celulares usando, por ejemplo, celulas PC3, NIH 3T3, TsuPr1, 293 o rat-1.

Se realizaron construcciones de pSRα adicionales que fusionan un marcador epitopico tal como el marcador FLAG� con el extremo carboxilo terminal de secuencias de 273P4B7 para permitir la deteccion usando anticuerpos anti-Flag. Por ejemplo, la secuencia de FLAG� 5' gat tac aag gat gac gac gat aag 3' (SEC ID N°: 42) se anade a cebador de clonacion en el extremo 3' de la ORF. Se realizan construcciones de pSRα adicionales para producir proteinas de fusion de myc/His 6X y GFP tanto amino terminal como carboxilo terminal de las proteinas 273P4B7 de longitud completa.

Vectores virales adicionales: Se realizan construcciones adicionales para suministro y expresion de 273P4B7 mediado por virus. Se consigue alto titulo de virus que conduce a alto nivel de expresion de 273P4B7 en sistemas de suministro viral tales como vectores adenovirales y vectores de amplicon de herpes. Se amplifican secuencias codificantes de 273P4B7 o fragmentos de las mismas por PCR y se subclonan en el vector lanzadera AdEasy (Stratagene). Se realiza recombinacion y empaquetamiento de virus de acuerdo con las instrucciones del fabricante para generar vectores adenovirales. Como alternativa, se clonan secuencias codificantes de 273P4B7 o fragmentos de las mismas en el vector de VHS-1 (Imgenex) para generar vectores virales de herpes. Los vectores virales se usan a continuacion para infeccion de diversas lineas celulares tales como celulas PC3, NIH 3T3, 293 o rat-1.

Sistemas de expresión regulada: Para controlar la expresion de 273P4B7 en celulas de mamifero, se clonan secuencias codificantes de 273P4B7, o partes de las mismas, en sistemas de expresion de mamifero regulados tales como el Sistema T-Rex (Invitrogen), el Sistema GeneSwitch (Invitrogen) y el Sistema de Ecdisona estrechamente regulado (Stratagene). Estos sistemas permiten el estudio de los efectos dependientes de concentracion y tiempo de 273P4B7 recombinante. Estos vectores se usan a continuacion para controlar la expresion de 273P4B7 en diversas lineas celulares tales como celulas PC3, NIH 3T3, 293 o rat-1.

B. Sistemas de expresión de baculovirus

Para generar proteinas 273P4B7 recombinantes en un sistema de expresion de baculovirus, se clona ORF de 273P4B7, o partes de la misma, en el vector de transferencia de baculovirus pBlueBac 4.5 (Invitrogen), que

proporciona un marcador His en el extremo N terminal. Especificamente, pBlueBac-273P4B7 se cotransfecta con plasmido auxiliar pBac-N-Blue (Invitrogen) en celulas de insecto SF9 (Spodoptera frugiperda) para generar baculovirus recombinante (vease manual de instrucciones de Invitrogen para detalles). Despues se recoge el baculovirus del sobrenadante celular y se purifica por ensayo en placas.

Se genera despues proteina 273P4B7 recombinante por infeccion de celulas de insecto HighFive (Invitrogen) con baculovirus purificado. Puede detectarse proteina 273P4B7 recombinante usando anticuerpos anti-273P4B7 o anti marcador His. Puede purificarse proteina 273P4B7 y usarse en diversos ensayos basados en celulas o como inmunogeno para generar anticuerpos policlonales y monoclonales especificos para 273P4B7.

Ejemplo 9: Perfiles de antigenicidad y estructura secundaria

La Figura 5, Figura 6, Figura 7, Figura 8 y Figura 9 representan graficamente cinco perfiles de aminoacidos de 273P4B7 variante 1, estando disponible cada evaluacion accediendo al sitio web de ProtScale localizado en Internet en (www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) en el servidor de biologia molecular ExPasy.

Estos perfiles: Figura 5, Hidrofilia (Hopp T. P., Woods K. R., 1981. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 3824-3828); Figura 6, Hidropatico, (Kyte J., Doolittle R. F., 1982. J. Mol. Biol. 157: 105-132); Figura 7, Porcentaje de Restos Accesibles (Janin J., 1979 Nature 277: 491-492); Figura 8, Flexibilidad Media (Bhaskaran R., y Ponnuswamy P. K., 1988. Int. J. Pept. Protein Res. 32: 242-255); Figura 9, giro Beta (Deleage, G., Roux B. 1987 Protein Engineering 1: 289-294); y opcionalmente otros disponibles en la tecnica, tales como en el sitio web de ProtScale, se usaron para identificar regiones antigenicas de cada una de las proteinas variantes de 273P4B7. Cada uno de los perfiles de aminoacidos anteriores de variantes de 273P4B7 se generaron usando los siguientes parametros ProtScale para analisis: 1) Un tamano de ventana de 9; 2) 100% de peso de los bordes de la ventana en comparacion con el centro de la ventana; y 3) valores de perfil de aminoacidos normalizados para quedar entre 0 y 1.

Se usaron los perfiles de Hidrofilia (Figura 5), Hidropatico (Figura 6) y Porcentaje de Restos Accesibles (Figura 7) para determinar tramos de aminoacidos hidrofilos (es decir, valores mayores de 0,5 en el perfil de Hidrofilia y Porcentaje de Restos Accesibles y valores menores de 0,5 en el perfil Hidropatico). Tales regiones probablemente se exponen al amiente acuoso, estan presentes en la superficie de la proteina, y por lo tanto disponibles para reconocimiento inmune, tal como por anticuerpos.

Los perfiles de Flexibilidad Media (Figura 8) y giro Beta (Figura 9) determinan tramos de aminoacidos (es decir, valores mayores de 0,5 en el perfil de giro Beta y el perfil de Flexibilidad Media) que no estan restringidos en estructuras secundarias tales como laminas beta y helices alfa. Tales regiones tambien estan mas probablemente expuestas en la proteina y por lo tanto accesibles a reconocimiento inmune, tal como por anticuerpos.

Se usan secuencias antigenicas de las proteinas variantes de 273P4B7 indicadas, por ejemplo, por los perfiles expuestos en la Figura 5, Figura 6, Figura 7, Figura 8 y/o Figura 9 para preparar inmunogenos, peptidos o acidos nucleicos que los codifican, para generar anticuerpos terapeuticos y de diagnostico anti-273P4B7. El inmunogeno puede ser cualesquiera 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16,17,18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o mas de 50 aminoacidos contiguos, o los acidos nucleicos correspondientes que los codifican, de las variantes de proteina 273P4B7 enumeradas en las Figuras 2 y 3. En particular, los inmunogenos peptidicos de la invencion pueden comprender una region peptidica de al menos 5 aminoacidos de las Figuras 2 y 3 en cualquier incremento de numero entero que incluye una posicion de aminoacido que tiene un valor mayor de 0,5 en los perfiles de Hidrofilia de la Figura 5; una region peptidica de al menos 5 aminoacidos de las Figuras 2 y 3 en cualquier incremento de numero entero que incluye una posicion de aminoacido que tiene un valor menor de 0,5 en el perfil Hidropatico de la Figura 6; una region peptidica de al menos 5 aminoacidos de las Figuras 2 y 3 en cualquier incremento de numero entero que incluye una posicion de aminoacido que tenga un valor mayor de 0,5 en los perfiles de Porcentaje de Restos Accesibles de la Figura 7; una region peptidica de al menos 5 aminoacidos de las Figuras 2 y 3 en cualquier incremento de numero entero que incluye la posicion de aminoacido que tiene un valor mayor de 0,5 en los perfiles de Flexibilidad Media en la Figura 8; y una region peptidica de al menos 5 aminoacidos de las Figuras 2 y 3 en cualquier incremento de numero entero que incluye una posicion de aminoacido que tiene un valor mayor de 0,5 en el perfil de giro Beta de la Figura 9. Los inmunogenos peptidicos de la invencion tambien pueden comprender acidos nucleicos que codifican cualquiera de los anteriores.

Todos los inmunogenos de la invencion, peptido o acido nucleico, pueden realizarse en forma de dosis unitaria humana, o estar comprendidos por una composicion que incluye un excipiente farmaceutico compatible con la fisiologia humana.

La estructura secundaria de la variante 1 de proteina 273P4B7, concretamente la localizacion y presencia predicha de helices alfa, hebras extendidas y bucles aleatorios, se predice a partir de la secuencia de aminoacidos primaria usando el Procedimiento de Red Neural Jerarquica-HNN (NPS@: Network Protein Sequence Analysis TIBS Marzo de 2000 Vol. 25, N° 3 [291]: 147-150 Combet C, Blanchet C, Geourjon C. y Deleage G., http://pbil.ibcp.fr/cgibin/npsa automat.pl?page=npsa nn.html), al que se accede desde el servidor de biologia molecular ExPasy localizado en Internet en (www.expasy.ch/tools/). El analisis indica que la variante 1 de 273P4B7 esta compuesta de 41,60% de helice alfa, 11,12% de hebra extendida y 47,28% de hebra aleatoria (Figura 13A).

El analisis de la presencia potencial de dominios transmembrana en la proteina variante 1 de 273P4B7 se llevo a cabo usando una diversidad de algoritmos de prediccion de transmembrana a los que se accede desde el servidor de biologia molecular ExPasy localizado en Internet en (www.expasy.ch/tools/). Se muestran graficamente en la Figura 13B y Figura 13C los resultados de analisis de variante 1 usando el programa TMpred (Figura 13B) y programa TMHMM (Figura 13C). El programa TMpred predice la presencia de 2 dominios transmembrana, mientras que el programa TMHMM no predice dominios transmembrana. Tomados junto con analisis que emplea otros programas resumidos en la Tabla VI y Tabla L, los datos sugieren que 273P4B7 es mas probablemente una proteina soluble.

Ejemplo 10: Identificación de epítopos candidatos de CTL que portan motivo y supermotivo de HLA

Este ejemplo ilustra la identificacion y confirmacion de epitopos que portan supermotivo y motivo. El calculo de cobertura de poblacion se realiza usando la estrategia descrita posteriormente.

Busquedas informaticas y algoritmos para identificacion de epitopos que portan motivo y/o supermotivo

Se realizan busquedas informaticas con respecto a epitopos que porta supermotivos o motivos de HLA de Clase I o Clase II como sigue. Todas las secuencias proteicas de 273P4B7 traducidas se analizan usando un programa de software de busqueda de cadena de texto para identificar secuencias peptidicas potenciales que contienen motivos de union a HLA apropiados; tales programas se producen facilmente de acuerdo con informacion en la tecnica a la vista de divulgaciones de motivo/supermotivo conocidas. Ademas, tales calculos pueden realizarse mentalmente.

Las secuencias de supermotivo de A2-, A3-, y DR identificadas se puntuan usando algoritmos polinomiales para predecir su capacidad para unirse a moleculas de HLA de Clase I o Clase II especificas. Estos algoritmos polinomiales explican el impacto de diferentes aminoacidos en diferentes posiciones y se basan esencialmente en la premisa de que la afinidad global (o ΔG) de interacciones de molecula de HLA-peptido pueden aproximarse como una funcion polinomial lineal del tipo:

en la que aji es un coeficiente que representa el efecto de la presencia de un aminoacido dado (j) en una posicion dada (i) junto con la secuencia de un peptido de n aminoacidos. La suposicion crucial de este procedimiento es que los efectos en cada posicion son esencialmente independientes entre si (es decir, union independiente de cadenas laterales individuales). Cuando el resto j aparece en la posicion i en el peptido, se asume que contribuye con una cantidad constante ji a la energia libre de union del peptido independientemente de la secuencia del resto del peptido.

El procedimiento de derivacion de coeficientes de algoritmo especificos se ha descrito en Gulukota y col., J. Mol. Biol. 267: 1258-126,1997; (vease tambien Sidney y col., Human Immunol. 45: 79-93,1996; y Southwood y col., J. Immunol. 160: 3363-3373, 1998). Brevemente, para todas las posiciones i, de tipo anclaje y no anclaje, la media geometrica de la union relativa promedio (ARB) de todos los peptidos que portan j se calcula en relacion con el resto del grupo y se usa como la estimacion de ji. Para peptidos de Clase II, si son posibles multiples alineamientos, solo se utiliza el alineamiento de mayor puntuacion, siguiendo un procedimiento por etapas. Para calcular una puntuacion de algoritmo de un peptido dado en un conjunto de ensayo, se multiplican los valores de ARB correspondientes a la secuencia del peptido. Si este producto excede un umbral seleccionado, se predice que el peptido se une. Se seleccionan umbrales apropiados en funcion del grado de rigurosidad de la prediccion deseada.

Seleccion de peptidos con reaccion cruzada con supertipo de HLA-A2

Se exploran secuencias proteicas de 273P4B7 utilizando software de identificacion de motivos, para identificar secuencias de 8, 9, 10 y 11 unidades que contienen la especificidad de anclaje principal de supermotivo de HLA-A2. Tipicamente, estas secuencias se puntuan despues usando el protocolo descrito anteriormente y los peptidos correspondientes a las secuencias de puntuacion positiva se sintetizan y se ensayan con respecto a su capacidad para unirse a moleculas de HLA-A*0201 purificadas in vitro (HLA-A*0201 se considera una molecula se supertipo A2 prototipo).

Estos peptidos se ensayan despues con respecto a la capacidad para unirse a moleculas de supertipo A2 adicionales (A*0202, A*0203, A*0206 y A*6802). Los peptidos que se unen al menos a tres de los cinco alelos de supertipo A2 ensayados tipicamente se consideran agentes de union con reaccion cruzada con supertipo A2. Los peptidos preferidos se unen con una afinidad igual a o menor de 500 nM a tres o mas moleculas de supertipo HLA-A2.

Seleccion de epitopos que portan supermotivo HLA-A3

La secuencia o las secuencias de proteina 273P4B7 exploradas anteriormente tambien se examinan con respecto a la presencia de peptidos con los anclajes primarios de supermotivo HLA-A3. Se sintetizan despues peptidos correspondientes a las secuencias que portan supermotivo HLA A3 y se ensayan con respecto a union con moleculas de HLA-A*0301 y HLA-A*1101, las moleculas codificadas por los dos alelos de supertipo A3 mas

prevalentes. Los peptidos que se unen al menos a dos de los alelos con afinidades de union de ≤500 nM, con frecuencia ≤200 nM, se ensayan despues con respecto a reactividad cruzada de union con los otros alelos de supertipo A3 comunes (por ejemplo, A*3101, A*3301 y A*6801) para identificar los que pueden unirse al menos a tres de las cinco moleculas de supertipo HLA-A3 ensayadas.

Seleccion de epitopos que portan supermotivo HLA-B7

La proteina o las proteinas 273P4B7 exploradas anteriormente tambien se analizan con respecto a la presencia de peptidos de 8-, 9- 10- u 11 unidades con el supermotivo de HLA-B7. Se sintetizan peptidos correspondientes y se ensayan con respecto a union con HLA-B*0702, la molecula codificada por el alelo de supertipo B7 mas comun (es decir, el alelo de supertipo B7 prototipo). Se identifican peptidos que se unen a B*0702 con CI50 de ≤500 nM usando procedimientos convencionales. Estos peptidos se ensayan despues con respecto a union con otras moleculas de supertipo B7 comunes (por ejemplo, B*3501, B*5101, B*5301 y B*5401). Se identifican por lo tanto peptidos capaces de unirse a tres o mas de los cinco alelos de supertipo B7 ensayados.

Seleccion de epitopos que aportan motivo A1 y A24

Para aumentar adicionalmente la cobertura de la poblacion, tambien pueden incorporarse los epitopos HLA-A1 y A24 en composiciones de vacuna. Tambien puede realizarse un analisis de la proteina 273P4B7 para identificar secuencias que contienen motivo HLA-A1 y A24.

Se identifican epitopos de union con alta afinidad y/o reaccion cruzada que portan otro motivo y/o supermotivos usando metodologia analoga.

Ejemplo 11: Polinucleótidos complementarios

Se usan secuencias complementarias de las secuencias codificantes de 273P4B7, o cualquier parte de las mismas, para detectar, reducir, o inhibir la expresion de 273P4B7 de origen natural. Aunque se describe el uso de oligonucleotidos que comprenden de aproximadamente 15 a 30 pares de bases, se usa esencialmente el mismo procedimiento con fragmentos de secuencia mayores o menores. Se disenan oligonucleotidos apropiados usando, por ejemplo software OLIGO 4.06 (National Biosciences) y la secuencia codificante de 273P4B7. Para inhibir la transcripcion, se disena un oligonucleotido complementario de la secuencia 5' mas excepcional y se usa para evitar la union del promotor con la secuencia codificante. Para inhibir la traduccion, se disena un oligonucleotido complementario para evitar la union ribosomica con un transcrito que codifique 273P4B7.

Ejemplo 12 Comparación de homología de 273P4B7 con secuencias conocidas:

La proteina 273P4B7 de la Figura 3 tiene 1250 aminoacidos con un peso molecular calculado de 141,1 kDa y pI de 5,19. Se predice que 273P4B7 es una proteina nuclear (65% por PSORT) con posibilidad de ser una proteina citoplasmica (50% PSORT). Aunque algunos programas de prediccion indican que 273P4B7 puede tener un dominio transmembrana, es igualmente probable que la proteina 273P4B7 sea una proteina intracelular soluble.

Mediante el uso del sitio web PubMed del N.C.B.I. disponible en Internet en (.ncbi.nlm.nih.gov/entrez), se descubrio al nivel proteico que 273P4B7 muestra mejor homologia con una proteina no nombrada (giI22760345) de funcion desconocida, con 99% de identidad y 99% de homologia sobre la longitud completa de la proteina (Figura 4A). La proteina 273P4B7 demuestra similitud con una proteina humana hipotetica llamada antigeno tumoral BJ-HCC-15 (giI22002580) con 99% de identidad y 100% de homologia sobre los ultimos 419 aa de la proteina 273P4B7 (Figura 4B). Se ha identificado el ortologo de raton de 273P4B7 que muestra 72% de identidad y 81% de homologia con 273P4B7 (Figura 4C). El analisis bioinformatico revelo la presencia de un motivo de SNF2 en los aminoacidos 99417 y un motivo helicasa en los aminoacidos 490-574 de la proteina 273P4B7. Estos motivos tambien se encuentran en la proteina de la familia SNF2/RAD54 de raton (giI27414501) que porta 72% de identidad con 273P4B7.

El dominio SNF2 se encuentra con frecuencia en proteinas implicada en la regulacion de la transcripcion, reparacion de ADN, recombinacion de ADN y desenrollamiento de cromatina (Alexeev A, Mazin A, Kowalczykowski SC. Nat Struct Biol. 2003, 10: 182; Solinger JA, Kiianitsa K, Heyer WD. Mol Cell. 2002, 10: 1175; Martens JA, Winston F.: Genes Dev. 2002, 16: 2231). Remodelando los complejos de ADN, SNF2 hace al ADN nucleosomal accesible a factores reguladores, regulando de este modo la expresion genica (Fan HY y col, Mol Cell. 2003,11: 1311). Las pruebas en Saccharomyces cerevisiae indican que SNF2 regula la transcripcion en estos organismos. Se ha mostrado que los complejos de SNF con SWI y SWI/SNF se reclutan al promotor de genes especificos induciendo su activacion transcripcional (Kingston, R. E. y Narlikar, G. J. Genes & Dev.1999, 13: 2339-2352). Se ha identificado un complejo de remodelacion de cromatina similar en celulas de mamifero, conocidas como Brm/ Brg1. Se descubrio que este complejo regulaba la expresion genica asi como el ciclo celular (Muchardt C y Yaniv M, Oncogene 2001,

20: 3067). Finalmente un "gen de tipo SNF2 asociado con proliferacion" que contiene motivos de SNF2 se ha asociado con AML (Lee D y col, Cancer Res. 2000, 60: 3612).

Los hallazgos de los inventores de que 273P4B7 se expresa de forma elevada en varios canceres mostrando a la vez un patron de expresion restringido en tejidos normales sugieren que el gen de 273P4B7 puede desempenar un papel importante en diversos canceres, incluyendo los canceres expuestos en la Tabla I. Se proporciona por la

presente invencion que 273P4B7 controle el crecimiento y progresion del tumor regulando la proliferacion, el ciclo celular, la expresion genica asi como la supervivencia celular. En consecuencia, cuando 273P4B7 actua como un regulador de proliferacion, ciclo celular, expresion genica y supervivencia celular, 273P4B7 se usa para fines terapeuticos, de diagnostico, de pronostico o preventivos.

Ejemplo 13: Identificación y confirmación de rutas de transducción de señales

Se ha indicado que muchas proteinas de mamiferos interaccionan con moleculas de senalizacion y participan en la regulacion de rutas de senalizacion (J Neurochem. 2001; 76: 217-223). En particular, se ha mostrado que los factores de transcripcion regulan rutas mitogenicas y de supervivencia (Neeley K, Biochim Biophys Acta. 2002, 1603: 19). Usando tecnicas de inmunoprecipitacion y transferencia de Western, se identifican proteinas que se asocian con 273P4B7 y median en acontecimientos de senalizacion. Pueden regularse varias rutas que se sabe que desempenan un papel en biologia del cancer por 273P4B7, incluyendo rutas de fosfolipidos tales como P13K, AKT, etc., rutas de adhesion y migracion, incluyendo FAK, Rho, Rac-1, etc., asi como cascadas mitogenicas/de supervivencia tales como ERK, p38, etc. (Cell Growth Differ. 2000,11: 279; J Biol Chem. 1999, 274: 801; Oncogene. 2000, 19: 3003, J. Cell Biol. 1997, 138: 913.). El analisis bioinformatico revelo que 273P4B7 puede fosforilarse por serina/treonina asi como tirosina quinasas. Por lo tanto, la fosforilacion de 273P4B7 se proporciona por la presente invencion para conducir a activacion de las rutas enumeradas anteriormente.

Usando, por ejemplo, tecnicas de transferencia de Western, se confirma la capacidad de 273P4B7 para regular estas rutas. Las celulas que expresan o carecen de 273P4B7 se dejan sin tratar o se estimulan con citocinas, hormonas y anticuerpos anti-integrina. Se analizan lisados celulares usando anticuerpos anti fosfo especificos (Cell Signaling, Santa Cruz-Biotechnology) para detectar fosforilacion y regulacion de ERK, p38, AKT, P13K, PLC y otras moleculas de senalizacion.

Para confirmar que 273P4B7 activa de forma directa o indirecta las rutas de transduccion de senal conocidas en celulas, se llevan a cabo ensayos indicadores transcripcionales basados en luciferasa (luc) en celulas que expresan genes individuales. Estos indicadores transcripcionales contienen sitios de union a consenso para factores de transcripcion conocidos que quedan corriente abajo de rutas de transduccion de senal bien caracterizadas. Los indicadores y ejemplos de estos factores de transcripcion asociados, rutas de transduccion de senal y estimulos de activacion se enumeran a continuacion.

1.

NFkB-luc, NFkB/Rel; lk-quinasa/SAPK; crecimiento/apoptosis/tension

2.

SRE-luc, SRF/TCF/ELK1; MAPK/SAPK; crecimiento/diferenciacion

3.

AP-1-luc, FOS/JUN; MAPK/SAPK/PKC; crecimiento/apoptosis/tension

4.

ARE-luc, receptor de androgenos; esteroides/MAPK; crecimiento/diferenciacion/apoptosis

5.

p53-luc, p53; SAPK; crecimiento/diferenciacion/apoptosis

6.

CRE-luc, CREB/ATF2; PKA/p38; crecimiento/apoptosis/tension

Los efectos mediados por genes pueden ensayarse en celulas que muestran expresion de ARNm. Pueden introducirse plasmidos indicadores de luciferasa mediante transfeccion mediada por lipidos (TFX-50, Promega). La actividad luciferasa, un indicador de actividad transcripcional relativa, se mide por incubacion de extractos celulares con sustrato de luciferina y la luminiscencia de la reaccion se supervisa en un luminometro.

Se mapean rutas de senalizacion activadas por 273P4B7 y se usan para identificacion y validacion de dianas terapeuticas. Cuando 273P4B7 desempena un papel en la regulacion de rutas de senalizacion, rutas mitogenicas y de supervivencia, rutas de fosfolipidos y rutas de adhesion y migracion bien individualmente o bien de forma comunal, esta se usa como una diana para fines de diagnostico, pronostico, preventivos y terapeuticos. Adicionalmente, cuando 273P4B7 esta implicada en senalizacion celular, esta se usa como diana para fines de diagnostico, pronostico, preventivos y terapeuticos.

Ejemplo 14: Implicación en progresión tumoral

El gen de 273P4B7 puede contribuir al crecimiento de celulas cancerosas. El papel de 273P4B7 en el crecimiento tumoral se confirma en una diversidad de lineas celulares primarias y transfectadas incluyendo lineas celulares de pancreas, cuello uterino, vejiga, pulmon, prostata, rinon, colon, ovario, mama, hueso, piel, ganglio linfatico, estomago y utero asi como celulas NIH 3T3 modificadas por ingenieria genetica para expresar de forma estable 273P4B7. Se evaluan celulas parentales que carecen de los sitios 273P4B7 y celulas que expresan 273P4B7 con respecto a crecimiento celular usando un ensayo de proliferacion bien documentado (Fraser SP, Grimes JA, Djamgoz MB. Prostate. 2000; 44: 61, Johnson DE, Ochieng J, Evans SL. Anticancer Drugs. 1996, 7:288).

Para confirmar el papel de 273P4B7 en el proceso de transformacion, se investiga su efecto en los ensayos de formacion de colonias. Las celulas NIH3T3 parentales que carecen de 273P4B7 se comparan con celulas NHI-3T3 que expresan 273P4B7, usando un ensayo de agar blando en condiciones rigurosas y mas permisivas (Song Z. y col. Cancer Res. 2000, 60: 6730).

Para confirmar el papel de 273P4B7 en invasion y metastasis de celulas cancerosas, se usa un ensayo bien establecido, por ejemplo, un ensayo del Sistema de Inserto Transwell (Becton Dickinson) (Cancer Res. 1999, 59:

6010). Las celulas de control, incluyendo, pero sin limitacion lineas celulares de prostata, colon, vejiga y rinon que carecen de 273P4B7 se comparan con celulas que expresan 273P4B7. Las celulas se cargan con el colorante fluorescente, calceina, y se siembran en el pocillo superior del inserto de Transwell revestido con un analogo de membrana basal. La invasion se determina por fluorescencia de las celulas en la camara inferior en relacion con la fluorescencia de la poblacion de celulas completa.

273P4B7 tambien puede desempenar un papel en el ciclo celular y apoptosis. Las celulas parentales y celulas que expresan 273P4B7 se comparan con respecto a diferencias en la regulacion del ciclo celular usando un ensayo de BrdU bien establecido (Abdel-Malek ZA. J Cell Physiol. 1988, 136: 247). En resumen, las celulas se cultivan en condiciones tanto optimas (suero completo) como limitantes (suero bajo), se marcan con BrdU y se tinen con Ab anti-BrdU y yoduro de propidio. Las celulas se analizan con respecto a entrada en las fases G1, S y G2M del ciclo celular. Como alternativa, se evalua el efecto de la tension en apoptosis en celulas parentales de control y celulas que expresan 273P4B7. Las celulas modificadas por ingenieria genetica y parentales se tratan con diversos agentes quimioterapeuticos, tales como paclitaxel, gemcitabina, etc. e inhibidores de sintesis de proteinas, tales como cicloheximida. Las celulas se tinen con anexina V-FITC y la muerte celular se mide por analisis de FACS. La modulacion de muerte celular por 273P4B7 puede desempenar un papel critico en la regulacion de la progresion tumoral y carga tumoral.

Cuando 273P4B7 desempena un papel en el crecimiento celular, transformacion, invasion y metastasis, y el ciclo celular y apoptosis, esta se usa como una diana para fines de diagnostico, de pronostico, preventivos y terapeuticos.

Ejemplo 15: Implicación en angiogénesis

La angiogenesis o formacion de nuevos vasos sanguineos es necesaria para el crecimiento tumoral (Hanahan D, Folkman J. Cell. 1996, 86: 353; Folkman J. Endocrinology. 1998 139: 441). Se han desarrollado varios ensayos para medir angiogenesis in vitro e in vivo, tales como los ensayos de cultivo tisular, formacion de tubos celulares endoteliales y proliferacion de celulas endoteliales. Usando estos ensayos asi como neovascularizacion in vitro, se confirma el efecto de 273P4B7 en angiogenesis.

Por ejemplo, se evaluan celulas endoteliales modificadas por ingenieria genetica para expresar 273P4B7 usando ensayos de formacion y proliferacion de tubos. El efecto de 273P4B7 tambien se confirma en modelos animales in vivo. Por ejemplo, se implantan celulas que expresan o carecen de 273P4B7 por via subcutanea en ratones inmunocomprometidos. Se evaluan la migracion de celulas endoteliales y angiogenesis 5-15 dias despues usando tecnicas de inmunohistoquimica.

Cuando 273P4B7 afecta a la angiogenesis, esta se usa como una diana para fines de diagnostico, pronostico, preventivos y terapeuticos.

Ejemplo 16: Regulación de la transcripción

La localizacion de 273P4B7 en el nucleo y su similitud con proteinas que contienen SNF2 que se sabe que regulan la expresion genica y estructura de cromatina, apoya el uso de la presente invencion de 273P4B7 basado en su papel en la regulacion transcripcional de genes eucariotas. La regulacion de la expresion genica se confirma, por ejemplo, estudiando la expresion genica en celulas que expresan o carecen de 273P4B7. Para este fin, se realizan dos tipos de experimentos.

En el primer conjunto de experimentos, se extrae ARN de celulas parentales y que expresan 273P4B7 y se hibrida con matrices genicas disponibles en el mercado (Clontech) (Smid-Koopman E y col. Br J Cancer. 2000. 83: 246). Se comparan las celulas en reposo asi como celulas tratadas con FBS o androgeno. Se identifican genes expresados de forma diferencial de acuerdo con procedimientos conocidos en la tecnica. Los genes expresados de forma diferencial se mapean despues en rutas biologicas (Chen K y col., Thyroid. 2001.11: 41.).

En el segundo conjunto de experimentos, la activacion de la ruta transcripcional especifica se evalua usando construcciones indicadoras de luciferasa disponibles en el mercado (Stratagene) incluyendo: NFkB-luc, SRE-luc, ELK1-luc, ARE-luc, p53-luc y CRE-luc. Estos indicadores transcripcionales contienen sitios de union de consenso para factores de transcripcion conocidos que quedan corriente abajo de rutas de transduccion de senal bien caracterizadas, y representan una buena herramienta para determinar la activacion de la ruta y explorar con respecto a moduladores positivos y negativos de la activacion de la ruta.

Por lo tanto, cuando 273P4B7 desempena un papel en la regulacion genica, esta se usa como una diana para fines de diagnostico, pronostico, preventivos y terapeuticos.

A lo largo de la presente solicitud, se hace referencia a diversos contenidos de datos de sitios web, publicaciones, solicitudes de patente y patentes (se hace referencia a los sitios web por sus direcciones de Localizador de Recursos Uniforme, o URL, en la web). Diversas modificaciones de los modelos y procedimientos de la invencion, ademas de los descritos en el presente documento, resultaran evidentes para los expertos en la materia a partir de la descripcion y las ensenanzas anteriores.

TABLAS: TABLA I: Tejidos que Expresan 273P4B7: Tejidos Malignos

a.

Prostata

b.

Vejiga

c.

Rinon

d.

Colon

e.

Pulmon

f.

Ovario

g.

Mama

h.

Pancreas

i.

Hueso

j.

Piel

k.

Cuello uterino

I.

Ganglio linfatico

m.

Estomago

n.

Utero

TABLA II: Abreviaturas de Aminoácidos

UNA LETRA

TRES LETRAS NOMBRE COMPLETO

F

Phe fenilalanina

L

Leu leucina

S

Ser serina

Y

Tyr tirosina

C

Cys cisteina

W

Trp triptofano

P

Pro prolina

H

His histidina

0

Gln glutamina

R

Arg arginina

I

Ile isoleucina

M

Met metionina

T

Thr treonina

N

Asn asparagina

K

Lys lisina

V

Val valina

A

Ala alanina

D

Asp acido aspartico

E

Glu acido glutamico

G

Gly glicina

TABLA III: Matriz de sustitucion de aminoacidos

Adaptada de la matriz de sustitucion de aminoacidos BLOSUM62 del Software GCG 9.0 (matriz de sustitucion en bloque). Cuanto mayor sea el valor, mas probable sera que se encuentre una sustitucion en proteinas naturales relacionadas. (Vease la direccion web ikp.unibe.ch/manual/blosum62.html)

TABLA IV: Motivos/Supermotivos de HLA de Clase I/II TABLA IV (A): Supermotivos/Motivos de HLA de Clase I

SUPERMOTIVO

POSICION POSICION POSICION

2 (Anclaje Primario)

3 (Anclaje Primario) Extremo C (Anclaje Primario)

A1

T ILVM S FWY

A2

LIVMATQ IVMATL

A3

VSMATLI RK

A24

YFWIVLMT FIYWLM

87

P VILFMWYA

B27

RHK FYLWMIVA

B44

ED FWYLIMVA

B58

ATS FWYLIVMA

B62

0LIVMP FWYMIVLA

MOTIVOS

A1

TSM Y

A1

DEAS Y

A2.1

LMVQIAT VLIMAT

A3

LMVISATF CGD KYRHFA

A11

VTMLISAGNCDF KRYH

A24

YFWM FLIW

A*3101

MVTALIS RK

A*3301

MVALFIST RK

(continuacion)

MOTIVOS

A*6801

AVTMSLI RK

B*0702

P LMFWYAIV

B*3501

P LMFWYIVA

B51

P LIVFWYAM

B*5301

P IMFWYALV

B*5401

P ATIVLMFWY

Se prefieren los restos en negrita, los restos en cursiva se prefieren menos: Se considera que un peptido porta motivo si tiene anclajes primaros en cada posicion de anclaje primario para un motivo o supermotivo como se ha especificado en la tabla anterior.

TABLA IV (B): Supermotivo de HLA de Clase II

1

6 9

W, F, Y, V, I, L

A, V, I, L, P, C, S, T A, V, I, L, C, S, T, M, Y

TABLA IV (C): Motivos de HLA de Clase II

MOTIVOS DR4 DR1 DR7 DR3 Motivo a preferido Motivo b preferido Supermotivo DR

deletereo preferido deletereo preferido deletereo preferido MOTIVOS anclaje primario 1 FMYLIVW MFLIVWY MFLIVWY anclaje primario LIVMFY LIVMFAY MFLIVWY 2 3 4 M T W C C H PAM0 FD M C W A G 2 3 anclaje primario 4 D DN0EST 5 anclaje primario 6 7 8 9 I VSTCPALIM MH R MH WDE CWD VMATSPLIC M GDE D AVM IVMSACTPL M GRD N IV G 5 anclaje primario 6 KRH VMSTACPLI

10 Los restos en cursiva indican restos menos preferidos o "tolerados".

TABLA IV (D): Supermotivos de HLA de Clase I

SUPER-MOTIVOS POSICION: 1 2 3 4 5 6 7 8 Extremo C

A1 Anclaje primario Anclaje primario FWY

TILVMS

A2 Anclaje primario Anclaje primario LIVMAT0 LIVMAT

A3 DeletereoDE (3/5); P(5/5) Anclaje primario YFW (4/5) YFW (3/5) YFW (4/5) P (4/5) Anclaje primario RK preferido VSMATLI DE (4/5)

A24 Anclaje primario Anclaje primario YFWIVLMT FIYWLM

B7 DeletereoFWY (5/5) LIVMAnclaje primario P FWY (4/5) DE (3/5) G (4/5) 0N (4/5) FWY (3/5) Anclaje primario

preferido (3/5) DE(3/5); DE (4/5) VILFMWYA P(5/5); G(4/5); A(3/5); 0N(3/5)

B27 Anclaje primario Anclaje primario RHK FYLWMIVA

B44 Anclaje primario ED Anclaje primario FWYLIMVA

B58 Anclaje primario Anclaje primario ATS FWYLIVMA

862 Anclaje primario Anclaje primario

QLIVMP FWYMIVLA

Los restos en negrita indican restos menos preferidos o "tolerados".

TABLA IV (E): Motivos de HLA de Clase I

POSICION1 2 3 4 5 6 7 8 9 Extremo C

o extremo C

A1 9-unidades deletereo GFYW Anclaje primario STM DEA YFW P DE0N YFW Anclaje primario Y preferido DE RHKLIVMP A G A

A1 9-unidades deletereo GRHK ASTCLIVM Anclaje primario GSTC ASTC LIVM DE Anclaje primario Y DEAS

preferido A RHKDEPYFW DE P0N RHK PG GP

A1 10-deletereo YFW Anclaje primario STM DEA0N A YFW0N PASTC GDE P Anclaje primario unidades Y

preferido GP RHKGLIVM DE RHK 0NA RHKYFWA RHK

A1 10-deletereo YFW STCLIVM Anclaje primario A YFW PG G YFW Anclaje primariounidades DEAS Y

preferido RHK RHKDEPYFW P G PRHK 0N

A2.1 9-deletereo YFW Anclaje primario LM/ YFW STC YFW A P Anclaje primario unidades V0AT VUMAT

preferido DEP DERKH RKH DERKH

POSICION1 2 3 4 5 6 7 8 9 Extremo C

A2.1 10-deletereo AYFW Anclaje primario LM/ LVIM G G FYWL VIM Anclaje primariounidades V0AT VL/MAT

preferido DEP DE RKHA P RKH DERKHRKH

A3 deletereo RHK Anclaje primario YFW PRHKYF W A YFW P Anclaje primario LMVISATFCGD KYRHFA

preferido DEP DE

(continuacion) POSICION1 2 3 4 5 6 7 8 9 Extremo C

A11 deletereo A Anclaje primario YFW YFW A YFW YFW P Anclaje VTLMISAGNCD F primario KRYH

preferido DEP AG

A24 9-deletereo YFWRHK Anclaje primario STC YFW YFW Anclaje unidades YFWM primario FLIW

preferido DEG DE G 0NP DERHKG A0N

A24 10-Deletereo Anclaje primario P YFW P Anclaje unidades YFWM primario FLIW

Preferido GDE 0N RHK DE A 0N DEA

A3101 Deletereo RHK Anclaje primario YFW P YFW YFW AP Anclaje MVT/ ALIS primario RK

Preferido DEP DE ADE DE DE DE

A3301 Deletereo Anclaje primario YFW AYFW Anclaje MVALF/ST primario RK

Preferido GP DE

A6801 Deletereo YFWSTC Anclaje primario YFWLIV M YFW P Anclaje AVTMSU primario RK

preferido GP DEG RHK A

B0702 Deletereo RHKFWY Anclaje primario P RHK RHK RHK RHK PA Anclaje primario LMFWYAI V

preferido DE0NP DEP DE DE GDE 0N DE

(continuacion)

POSICION 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Extremo C

B3501 Preferido FWYLIVM Anclaje primario P FWY FWY Anclaje primario LMFWYIV A

o extremo C

A1 9-Preferido GFYW Anclaje primario DEA YFW P DE0N YFW Anclaje unidades STM primario Y

preferido DE RHKLIVMP G A A

A1 9-deletereo GRHK ASTCLIVM Anclaje GSTC ASTC LIVM DE Anclaje primario Y unidades primario

DEAS

preferido A RHKDEPYFW DE P0N RHK PG GP

deletereo AGP G G

B51 Deletereo LIVMFWYP FWY STC FWY G FWY Anclaje primario LIVFWYA Anclaje M primario

preferido AGPDER DE G DE0N GDE HKSTC

B5301 deletereo LIVMFWY Anclaje primario P FWY STC FWY LIVMFWY FWY Anclaje primario IMFWYAL V

preferido G RHK0N DE AGP0N

B5401 deletereo FWY Anclaje primario P FWYLIVM LIVM ALIVM FWYA P Anclaje primario ATIVLMF WY

preferido GP0NDE GDESTC RHKDE DE 0NDGE DE

TABLA IV (F):

Sumario de supertipos de HLA

Frecuencias fenotipicas globales de supertipos de HLA en diferentes poblaciones etnicas

Especificidad Frecuencia fenotipica

Supertipo

Posicion 2 Extremo C Caucasico Negro Norteamericano Japones Chino Hispano Media

B7

p AILMVFWY 43,2 55,1 57,1 43,0 49,3 49,5

A3

AILMVST RK 37,5 42,1 45,8 52,7 43,1 44,2

A2

AILMVT AILMVT 45,8 39,0 42,4 45,9 43,0 2,2

A24

YF (WIVLMT) (YWLM) 23,9 38,9 58,6 40,1 38,3 40,0

B44

E (D) FWYLIMVA 43,0 21,2 42,9 39,1 39,0 37,0

41

TI (LVMS) FWY 47,1 16,1 21,8 14,7 26,3 25,2

B27

RHK FYL (WMI) 28,4 26,1 13,3 13,9 35,3 23,4

B62

0L (IVMP) FWY (MIV) 12,6 4,8 36,5 25,4 11,1 18,1

B58

ATS FWY (LIV) 10,0 25,1 1,6 9,0 5,9 10,3

TABLA IV (G):

Cobertura de poblacion calculada proporcionada por diferentes combinaciones de supertipos de HLA

Supertipos de HLA Frecuencia fenotipica

A2, A3 y B7 A2, A3, B7, A24, B44 y A1 A2, A3, B7, A24, B44, A1, B27, B62 y B 58

Caucasico Negro Norteamericano Japones Chino Hispano Media

83,0

86,1 87,5 88,4 86,3 86,2

99,5

98,1 100,0 99,5 99,4 99,3

99,9

99,6 100,0 99,8 99,9 99,8

Los motivos indican los restos que definen las especificidades de supertipo. Los motivos incorporan restos que se ha determinado basandose en datos publicados que se reconocen por multiples alelos dentro de supertipo. Los restos entre parentesis son restos adicionales que tambien se ha predicho que se toleran por multiples alelos dentro del supertipo.

Tabla V: Motivos de aparición frecuente

Nombre

% de identidad media Descripcion Funcion potencial

zf-C2H2

34% Dedo de cinc, tipo C2H2 La proteina de union a acido nucleico actua como factor de transcripcion, localizacion nuclear probable

citocromo b N

68% Citocromo b(N-terminal)/b6/petB Oxidasa unida a membrana, genera superoxido

lg

19% Dominio de inmunoglobulina Los dominios son de cien aminoacidos de longitud e incluyen un enlace disulfuro intradominio conservado.

WD40

18% Dominio WD, repeticion de Gbeta Repeticiones en tandem de aproximadamente 40 restos, conteniendo cada una un motivo Trp-Asp. Actuan en la transduccion de senal e interaccion proteica

PDZ

23% Dominio PDZ Puede actuar en la direccion de moleculas de senalizacion a sitios submembranosos

LRR

28% Repeticion Rica en Leucina Motivos de secuencia corta implicados en interacciones proteina-proteina

Pquinasa

23% Dominio de proteina quinasa Nucleo catalitico conservado comun para tanto proteina serina/treonina como proteina tirosina quinasas que contienen un sitio de union a ATP y un sitio catalitico

PH

16% Dominio de PH Homologia de pleckstrina implicada en senalizacion intracelular o como constituyentes de citoesqueleto

EGF

34% Dominio de tipo EGF 30-40 aminoacidos de longitud hallado en el dominio extracelular de proteinas unidas a membrana o en proteinas secretadas

Rvt

49% Transcriptasa inversa (ADN polimerasa dependiente de ARN)

Ank

25% Repeticion de Ank Proteina citoplasmica, asocia proteinas integrales de membrana con el citoesqueleto

Oxidored q1

32% NADH-Ubiquinona/plastoquinona (complejo I), diversas cadenas Asociado con membrana. Implicado en translocacion de protones a traves de la membrana

Mano Ef

24% Mano EF Dominio de union a calcio, consiste en un bucle de 12 restos flanqueado en ambos lados por un dominio alfa helicoidal de 12 restos

Rvp

79% Aspartil proteasa retroviral Aspartil proteasas o proteasas acidas, centradas en un resto de aspartilo catalitico

Colageno

42% Repeticion de triple helice de colageno (20 copias) Proteinas estructurales extracelulares implicadas en la formacion de tejido conectivo. La secuencia consiste en la G-X-Y y las cadenas polipeptidicas forman una triple helice.

Fn3

20% Dominio de fibronectina de tipo III Localizado en la region de union a ligando extracelular de receptores y es de aproximadamente 200 restos de aminoacidos de longitud con dos pares de cisteinas implicadas en enlaces disulfuro

7tm 1

19% Receptor de 7 transmembranas (familia de rodopsina) Siete regiones transmembrana hidrofobas, con el extremo N terminal localizado de forma extracelular mientras que el extremo C terminal es citoplasmico. Senal a traves de proteinas G

Tabla VI: Modificaciones postraduccionales de 273P4B7

Sitio de N-glucosilacion

795 - 798 NVTT (SEC ID N°: 43) 827 - 830 NSSL (SEC ID N°: 44)

903- 906 NES0 (SEC ID N°: 45)

911- 914 NVSI (SEC ID N°: 46)

966 - 969 NFSS (SEC ID N°: 47)

1047-1050 NTSL (SEC ID N°: 48)

1084 -1087 NKSM (SEC ID N°: 49)

1155 -1158 NKSS (SEC ID N° 50) Sitio de sulfatacion de tirosina

1119-1133 EAKGPEDYPEEGVEE (SEC ID N°: 51)

1134 -1148 SSGEASKYTEEDPSG (SEC ID N°: 52)

1193 -1207 AAEATNDYETLVKRG (SEC ID N°: 53) Sitio de fosforilacion de proteina quinasa dependiente de AMPc y GMPc

335 - 338 KKKS (SEC ID N°: 54)

336 - 339 KKSS (SEC ID N°: 55) Sitio de fosforilacion de proteina quinasa C

4 - 6 SRR

214 - 216 SFR

237 - 239 STK

250 - 252 SNR

282 - 284 TLK

285 - 287 TFK

362 - 364 SRK

418-420 SAR

459 - 461 SGK

503 - 505 TLR

683 - 685 SVK

739 - 741 STK

740 - 742 TKK

769 - 771 SSK

791 - 793 SIK

872 - 874 STK

1004 - 1006 SEK

1036 - 1038 SFK

1055 - 1057 SVK

1063 - 1065 TPK

1089 - 1091 SRR

1095 - 1097 SRR

1162 - 1164 TSK Sitio de fosforilacion de caseina quinasa II

180 - 183 SKDE (SEC ID N°: 56)

269 - 272 SLFD (SEC ID N°: 57)

303 - 306 TPGE (SEC ID N°: 58)

329 - 332 TKED (SEC ID N°: 59)

339-342 SNPE (SEC ID N°: 60)

431 - 434 SA0D (SEC ID N°: 61)

454 - 457 TLME (SEC ID N°: 62)

589 - 592 TVEE (SEC ID N°: 63)

608 - 611 TTGE (SEC ID N°: 64)

620 - 623 SK0E (SEC ID N°: 65)

629 - 632 TIED (SEC ID N°: 66)

672 - 675 SDHD (SEC ID N°: 67)

683-686 SVKE (SEC ID N°: 68)

724 - 727 TRNE (SEC ID N°: 69)

763 - 766 T0EE (SEC ID N°: 70)

798 - 801 TL0D (SEC ID N°: 71)

820 - 823 SVEE (SEC ID N°: 72)

(continuacion) 838-841 TKNE (SEC ID N°: 73) 847 - 850 TL0E (SEC ID N°: 74) 873 - 876 TKAD (SEC ID N°: 75) 913 - 916 SIIE (SEC ID N°: 76) 1004 - 1007 SEKD (SEC ID N°: 77) 1028 - 1031 SDGE (SEC ID N°: 78) 1036 - 1039 SFKD (SEC ID N°: 79) 1134 -1137 SSGE (SEC ID N°: 80) 1142-1145 TEED (SEC ID N°: 81) 1188 -1191 SP0D (SEC ID N°: 82)

Sitio de fosforilacion de tirosina quinasa 655 - 662 KLDEHIAY (SEC ID N°: 83)

Sitio de N-miristoilacion 117 - 122 GGILAD (SEC ID N°: 84) 125 - 130 GLGKTV (SEC ID N°: 85) 138 - 143 GMFDAS (SEC ID N°: 86) 196 - 201 GVIITT (SEC ID N°: 87) 277 - 282 GSLLGT (SEC ID N°: 88) 281-286 GTLKTF (SEC ID N°: 89) 428 - 433 GTFSA0 (SEC ID N°: 90) 540 - 545 GVGLTL (SEC ID N°: 91) 542 - 547 GLTLTA (SEC ID N°: 92) 574 - 579 G0KENV (SEC ID N°: 93) 804 - 809 GTGSAD (SEC ID N°: 94) 806 - 811 GSADSI (SEC ID N°: 95) 831 - 836 GMEKSF (SEC ID N°: 96) 983 - 988 GSAPNS (SEC ID N°: 97) 1130 - 1135 GVEESS (SEC ID N°: 98)

Amidacion 113 - 116 DGRK (SEC ID N°: 99)

Tabla VII: Peptidos de Busqueda

273P4B7 variante 1

para 9 unidades, 10 unidades y 15 unidades (SEC ID N°: 100)

Programa Bioinformatico Direccion Resultado

ORF ORF finder 95-3847

Longitud de 1250 aa proteina

Region TM Pred http://www.ch.embnet.org/ 2TM, aa132

transmembrana 157, aa532554

HMMTop http://www.enzim.hu/ hmmtop/ 2TM, aa132151, aa 538558

Sosui http://www.genome.ad.tp/ SOSui/ proteina soluble

TMHMM http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM sin TM

Peptido Senal Senal P http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/ no

pl herramienta pl/MW http://www.expasy.ch/tools/ 5,1 pl

Peso molecular herramienta pl/MW http://www.expasy.ch/tools/ 141,1 kDa

Localizacion PSORT http://psort.nibb.ac.jp/ 50%cytop)asmic,30% mitocondrial

PSORT II http://psort.nibb.ac.jp/ 65%nuclear,21%cytoplasmic

Motivos Pfam http://www.sanger.ac.uk/ Dominio Nterminal de SNF2,

Pfam/ Helicasa-Cterminal

Prints http: //www.biochem.ucl.ac.uk/ ninguno hallado

Blocks http://www.blocks.fhcrc.org/ dominio relacionado con SNF2

Tabla LI: Límites de los exones del transcrito 273P4B7 v.1

Numero Exon

de Inicio Final longitud

1

1

162 162

2

163 4194 4032

Tabla Lll(a). Secuencia de nucleótidos de variante de transcrito 273P4B7 v.2 (SEC ID Nº: 110)

Tabla LIII(a). Alineamiento de secuencias de nucleótidos de 273P4B7v.2 (SEC ID Nº: 111) y 273P4B7v.1 (SEC ID Nº: 112)

Tabla LIV(a). Secuencias peptídicas de proteína codificada por 273P4B7 v.2 (SEC ID Nº: 113)

Tabla LV(a). Alineamiento de secuencias de aminoácidos de 273P4B7 v.2 (SEC ID Nº: 114) y 273P4B7 v.1 (SEC ID Nº: 115)

Tabla Lll (b). Secuencia de nucleótidos de variante de transcrito 273P4B7 v.9 (SEC ID Nº: 116)

Tabla LllI (b). Alineamiento de secuencias de nucleótidos de 273P4B7 v.9 (SEC ID Nº: 117) y 273P4B7 v.1 (SEC ID Nº: 118)

Tabla LIV (b). Secuencias peptídicas de proteína codificada por 273P4B7 v.9 (SEC ID Nº: 119)

Tabla LV (b). Alineamiento de secuencias de aminoácidos de 273P4B7 v.9 (SEC ID Nº: 120) y 273P4B7 v.1 (SEC ID Nº: 121)

Tabla Lll(c). Secuencia de nucleótidos de variante de transcrito 273P4B7 v.10 (SEC ID Nº: 122)

Tabla Llll (c). Alineamiento de secuencias de nucleótidos de 273P4B7 v.10 (SEC ID Nº: 123) y 273P4B7 v.1 (SEC ID Nº: 124)

Tabla LIV(c). Secuencias peptídicas de proteína codificada por 273P4B7 v.10 (SEC ID Nº: 125)

Tabla LV(c). Alineamiento de secuencias de aminoácidos de 273P4B7 v.10 (SEC ID Nº: 126) y 273P4B7 v.1 (SEC ID Nº: 127)

Tabla Lll (d). Secuencia de nucleótidos de variante de transcrito 273P4B7 v.11 (SEC ID Nº: 128)

Tabla Llll (d). Alineamiento de secuencias de nucleótidos de 273P4B7 v.11 (SEC ID Nº: 129) y 273P4B7 v.1 (SEC ID Nº: 130)

Tabla LIV (d). Secuencias peptídicas de proteína codificada por 273P4B7 v.11 (SEC ID Nº: 131)

Tabla LV (d). Alineamiento de secuencias de aminoácidos de 273P4B7v.11 (SEC ID Nº: 132) y 273P4B7 v.1 (SEC ID Nº: 133)

Tabla LVI: SNP y cambios codónicos en 273P4B7 v.1 y v.2. . *AA: aminoácido; **-: deleción de la base correspondiente.

SNP

SNP en v.1 SNP en v.2

SNP N°

Alelos Variante de SNP Posicion Cambio de AA* Posicion de AA Posicion Cambio de AA Posicion de AA

1

a/t v.3 571 159 711 36

2

a/g v.4 608 R/G 172 748 R/G 49

3

a/g v.5 1185 K/R 364 1325 K/R 241

4

a/g v.6 2759 I/V 889 2899 I/V 766

5

t/c v.7 3658 1188 3798 1065

6

a/g v.8 3850 3990

LISTADO DE SECUENCIAS 5 �110� Agensys, Inc.

�120� ACIDOS NUCLEICOS Y PROTEiNAS CORRESPONDIENTES TITULADAS 273P4B7 UTILES EN EL TRATAMIENTO DE DETECCION DE CANCER 10 �130� N.93904 SER

�140� EP 03788558.9 �141�

15 �150� PCT/US2003/025665 �151�

�150� US 60/404.306 20 �151�

�150� US 60/423.290 �151�

25 �160� 134

�170� FastSE0 para Windows Version 4.0

�210� 1 �211� 170 �212� ADN �213� Homo Sapiens

5 �220� �221� misc feature �222� 151, 161 �223� n = A,T, C o G

10 �400� 1

�210� 2 15 �211� 4194

�212� ADN

�213� Homo Sapiens

�400� 2 20

�210� 3 �211� 1250 �212� PRT

�213� Homo Sapiens

�400� 3

�210� 4 �211� 4334 �212� ADN �213� Homo Sapiens

�400� 4

�210� 5 �211� 1127 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 5

�210� 6 �211� 3671 �212� ADN �213� Homo Sapiens

�400� 6

�210� 7 �211� 1106 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 7

�210� 8 �211� 2312 �212� ADN �213� Homo Sapiens

�400� 8

�210� 9 �211� 419 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 9

�210� 10

�211� 1720 �212� ADN �213� Homo Sapiens

�400� 10

10 �210� 11

�211� 419

�212� PRT

�213� Homo Sapiens

15 �400� 11 108

�400� 12

�210� 13 �211� 1127 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 13

�400� 14

�400� 15

�210� 16 �211� 1250 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 16

�400� 17

�400� 18 131

�400� 19

�212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 20

�400� 21

�210� 22 �211� 419 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 22 140

�400� 23

�213� Homo Sapiens

�400� 24

�400� 25

�400� 26

�210� 27 �211� 21 �212� PRT

15 �213� Plasmodium falciparum

�400� 27 �210� 28 �211� 16 �212� PRT �213� Streptococcus aureus

�400� 28

�210� 29 �211� 12 �212� PRT �213� Secuencia artificial

�220� �221� VARIANTE �222� 3 �223� Xaa es cIclohexilalanina, fenilalanina o tirosina

�221� VARIANTE �222� 1, 13

�223� Xaa es D-alanina o L-alanina �223� Peptido sintetizado de forma artificial

�400� 29

�210� 30 �211� 14 �212� ADN

�213� Homo Sapiens

�400� 30 ttttgatcaa gctt

14

�210� 31 �211� 42 �212� ADN �213� Homo Sapiens

�400� 31 ctaatacgac tcactatagg gctcgagcgg ccgcccgggc ag

42

�210� 32 �211� 12 �212� ADN �213� Homo Sapiens

�400� 32 gatcctgccc gg

12

�210� 33 �211� 40 �212� ADN �213� Homo Sapiens

�400� 33 gtaatacgac tcactatagg gcagcgtggt cgcggccgag

40

�210� 34 �211� 10 �212� ADN �213� Homo Sapiens

�400� 34 gatcctcggc

10

�210� 35

�211� 22 �212� ADN �213� Homo Sapiens

�400� 35 ctaatacgac tcactatagg gc 22

�210� 36 �211� 22 �212� ADN �213� Homo Sapiens

�400� 36 tcgagcggcc gcccgggcag ga 22

�210� 37 �211� 20 �212� ADN �213� Homo Sapiens

�400� 37 agcgtggtcg cggccgagga 20

�210� 38 �211� 25 �212� ADN �213� Homo Sapiens

�400� 38 atatcgccgc gctcgtcgtc gacaa 25

�210� 39 �211� 26 �212� ADN �213� Homo Sapiens

�400� 39

agccacacgc agctcattgt agaagg

26

�210� 40 �211� 27 �212� ADN �213� Homo Sapiens

�400� 40 gctagtgctc agaataccag actatgg

27

�210� 41 �211� 25 �212� ADN �213� Homo Sapiens

�400� 41 cgcttgacat aaaaagtgca gatcc

25

�210� 42 �211� 24 �212� ADN �213� Homo Sapiens

�400� 42 gattacaagg atgacgacga taag

24

�210� 43 �211� 4 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 43

�210� 44

�211� 4 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 44

�210� 45 �211� 4 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 45

�210� 46 �211� 4 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 46

�210� 47 �211� 4 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 47 �210� 48 �211� 4 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 48

�210� 49 �211� 4 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 49

�210� 50 �211� 4 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 50

�210� 51 �211� 15 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 51 �210� 52 �211� 15 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 52

�210� 53 �211� 19 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 53

�210� 54 �211� 4 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 54

�210� 55 �211� 4 �212� PRT �213� Homo Sapiens �400� 55

�210� 56 �211� 4 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 56

�210� 57 �211� 4 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 57

�210� 58 �211� 4 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 58

�210� 59 �211� 4 �212� PRT �213� Homo Sapiens �400� 59

�210� 60 �211� 4 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 60

�210� 61 �211� 4 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 61

�210� 62 �211� 4 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 62

�210� 63 �211� 4 �212� PRT

�213� Homo Sapiens

�400� 63

�210� 64 �211� 4 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 64

�210� 65 �211� 4 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 65

�210� 66 �211� 4 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 66

�210� 67 �211� 4

�212� PRT

�213� Homo Sapiens

�400� 67

�210� 68 �211� 4 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 68

�210� 69 �211� 4 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 69

�210� 70 �211� 4 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 70

�210� 71 �211� 4

�212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 71

�210� 72 �211� 4 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 72

�210� 73 �211� 4 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 73

�210� 74 �211� 4 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 74 �210� 75 �211� 4 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 75

�210� 76 �211� 4 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 76

�210� 77 �211� 4 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 77

�210� 78 �211� 4 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 78 �210� 79 �211� 4 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 79

�210� 80 �211� 4 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 80

�210� 81 �211� 4 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 81

�210� 82 �211� 4 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 82 �210� 83 �211� 8 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 83

�210� 84 �211� 6 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 84

�210� 85 �211� 6 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 85

�210� 86 �211� 6 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 86 �210� 87 �211� 6 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 87

�210� 88 �211� 6 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 88

�210� 89 �211� 6 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 89

�210� 90 �211� 6 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 90 �210� 91 �211� 6 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 91

�210� 92 �211� 6 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 92

�210� 93 �211� 6 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 93

�210� 94 �211� 6 �212� PRT �213� Homo Sapiens �400� 94

�210� 95 �211� 6 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 95

�210� 96 �211� 6 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 96

�210� 97 �211� 6 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 97

�210� 98 �211� 6 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 98

5

�210� 99

�211� 4

�212� PRT

�213� Homo Sapiens

10

�400� 99

15 �210� 100

�211� 1250

�212� PRT

�213� Homo Sapiens

20 �400� 100

�400� 101

�210� 102 �211� 19 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 102

�210� 103 �211� 29 �212� PRT �213� Homo Sapiens �400� 103

�210� 104 �211� 17 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 104

�210� 105 �211� 19 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 105

�210� 106 �211� 29 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 106 �210� 107 �211� 17 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 107

�210� 108 �211� 19 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 108

�210� 109 �211� 29 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 109

�210� 110 �211� 4334 �212� ADN �213� Homo Sapiens

�400� 110

�400� 111

�400� 112

�212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 113

�400� 114

�400� 115

�400� 116

�400� 117 �400� 118

�210� 119 �211� 1106 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 119

�400� 120

�400� 121

�400� 122 �400� 123

10

�210� 124

�211� 2294

�212� ADN

�213� Homo Sapiens

15

�400� 124

5

�210� 125

�211� 419

�212� PRT

�213� Homo Sapiens

10

�400� 125

�400� 126

�210� 127 �211� 419 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 127 �400� 128

�210� 129

5 �211� 1744

�212� ADN

�213� Homo Sapiens

�400� 129 10

�400� 130 �400� 131 214

�213� Homo Sapiens

�400� 132 216 �212� PRT �213� Homo Sapiens

�400� 133 �400� 134

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un polinucleotido aislado que comprende la secuencia de:

   (a)

   SEC ID N°: 2, de los numeros de resto de nucleotido 95 a 3847;

   (b)

   SEC ID N°: 4, de los numeros de resto de nucleotido 604 a 3987;

   (c)

   SEC ID N°: 8, de los numeros de resto de nucleotido 688 a 1947;

   (d)

   SEC ID N°: 2, de los numeros de resto de nucleotido 95 a 3847, en los que en el resto de nucleotido en 571 es T;

   (e)

   SEC ID N°: 2, de los numeros de resto de nucleotido 95 a 3847, en los que en el resto de nucleotido en 608 es G;

   (f)

   SEC ID N°: 2, de los numeros de resto de nucleotido 95 a 3847, en los que en el resto de nucleotido en 1185 es G;

   (g)

   SEC ID N°: 2, de los numeros de resto de nucleotido 95 a 3847, en los que en el resto de nucleotido en 2759 es A;

   (h)

   SEC ID N°: 2, de los numeros de resto de nucleotido 95 a 3847, en los que en el resto de nucleotido en 3658 es C; o

   (i)

   SEC ID N°: 2, de los numeros de resto de nucleotido 95 a 3847, en los que en el resto de nucleotido en 3850 es A.

2. 2.

   Un vector recombinante que comprende el polinucleotido de acuerdo con la reivindicacion 1.

3. 3.

   Una celula huesped recombinante que contiene el vector de la reivindicacion 2.

4. 4.

   Un procedimiento in vitro para detectar la presencia de un polinucleotido de acuerdo con la reivindicacion 1 en una muestra de ensayo que comprende:

   poner en contacto la muestra con un polinucleotido que se une especificamente al polinucleotido de acuerdo con la reivindicacion 1; y detectar la union del polinucleotido en la muestra con el mismo.

5. 5.

   El procedimiento de la reivindicacion 4, en el que el polinucleotido es un ARNm.

6. 6.

   El procedimiento de la reivindicacion 4, en el que el polinucleotido es un ADNc producido a partir de la muestra por transcripcion inversa.

7. 7.

   El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que la etapa de determinacion comprende comparar una cantidad de union del polinucleotido que se une especificamente al polinucleotido de la reivindicacion 1 con la presencia del polinucleotido de la reivindicacion 1 en una muestra normal correspondiente.

8. 8.

   El procedimiento de la reivindicacion 7, en el que la presencia de polinucleotido elevado en la muestra de ensayo en relacion con la muestra de tejido normal proporciona un indicio de la presencia de cancer.

9. 9.

   El procedimiento de la reivindicacion 8, en el que el cancer se selecciona del grupo que consiste en leucemia y cancer de la prostata, vejiga, rinon, hueso, piel, cuello uterino, ovario, mama, ganglio linfatico, estomago, utero, pancreas, colon y pulmon, y las muestras tisulares de ensayo y normales se seleccionan del grupo que consiste en suero, sangre u orina y tejidos de la prostata, vejiga, rinon, hueso, piel, cuello uterino, ovario, mama, ganglio linfatico, estomago, utero, pancreas, colon y pulmon.

   Figura 1: Secuencia de SSH de 273P4B7 de 170 nucleotidos (SEC ID N°: 1).

   Figura 2:

   Figura 2A. El ADNc (SEC ID Nº: 2) y secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 3) de 273P4B7 v.1. La secuencia de inicio de Kozak se muestra en negrita y la metionina de partida está subrayada. La fase abierta de lectura se extiende desde el ácido nucleico 95-3847 incluyendo el codón de parada.

   Figura 2B. El ADNc (SEC ID Nº: 4) y secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 5) de 273P4B7v.2. La secuencia de inicio de Kozak se muestra en negrita y la metionina de partida está subrayada. La fase abierta de lectura se extiende desde el ácido nucleico 604-3987 incluyendo el codón de parada.

   Figura 2C. 273P4B7 v.3 a v.8. Variantes de SNP de 273P4B7 v.1. Las 273P4B7 v.3 a v.8 son variantes con diferencia de nucleótido sencillo de 273P4B7 v.1. 273P4B7 v.3, v.7 y v.8 codifican la misma proteína que v.1. Las proteínas 273P4B7 v.4, v.5. y v.6 se diferencian de 273P4B7 v.1 en un aminoácido. Aunque estas variantes de SNP se muestran por separado, también pueden aparecer en cualquier combinación y en cualquiera de las variantes de transcrito numeradas anteriormente en las Figuras 2A y 2B.

   VARIANTE

   POSICION DE ACIDO NUCLEICO VARIACION DE ACIDO NUCLEICO POSICIÓN DE AMINOÁCIDO VARIACION DE AMINOACIDO

   273P4B7V.3

   571 A/T Variante silenciosa

   273P4B7V.4

   608 A/G 172 R=�G

   273P4B7V.5

   1185 A/G 364 K=�R

   273P4B7V.6

   2759 A/G 889 l=�V

   273P4B7V.7

   3658 T/C Variante silenciosa

   273P4B7V.8

   3850 A/G Variante silenciosa

   Figura 2D. El ADNc (SEC ID Nº: 6) y secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 7) de 273P4B7 v.9. La metionina de partida está subrayada. La fase abierta de lectura se extiende desde el ácido nucleico 43324 incluyendo el codón de parada.

   Figura 2E El ADNc (SEC ID Nº: 8) y secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 9) de 273P4B7v.10. La metionina de partida está subrayada. La fase abierta de lectura se extiende desde el ácido nucleico 688-1947 incluyendo el codón de parada.

   Figura 2F. El ADNc (SEC ID Nº: 10) y secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 11) de 273P4B7v.11. La metionina de partida está subrayada. La fase abierta de lectura se extiende desde el ácido nucleico 114-1373 incluyendo el codón de parada.

   Figura 3:

   Figura 3A. Secuencia de aminoácidos de 273P4B7 v.1 (SEC ID Nº: 12). La proteína 273P4B7 v.1 tienes 1250 aminoácidos.

   Figura 3B. Secuencia de aminoácidos de 273P4B7 v2 (SEC ID Nº: 13). La proteína 273P4B7v.2 tiene 1127 aminoácidos

   Figura 3C. Secuencia de aminoácidos de 273P4B7 v.4 (SEC ID Nº: 14). La proteína 273P4B7 v.4 tiene 1250 aminoácidos

   Figura 3D. Secuencia de aminoácidos de 273P4B7 v.5 (SEC ID Nº: 15). La proteína 273P4B7 v.5 tiene 1250 aminoácidos

   Figura 3E. Secuencia de aminoácidos de 273P4B7 v.6 (SEC ID Nº: 16). La proteína 273P4B7 v.6 tiene 1250 aminoácidos

   Figura 3F. Secuencia de aminoácidos de 273P4B7 v.9 (SEC ID Nº: 17). La proteína 273P4B7 v.9 tiene 1106 aminoácidos.

   Figura 3G. Secuencia de aminoácidos de 273P4B7 v.10 (SEC ID Nº: 18). La proteína 273P4B7 v.10 tiene 419 aminoácidos.

   Figura 3H. Secuencia de aminoácidos de 273P4B7 v.11 (SEC ID Nº: 19). La proteína 273P4B7v.11 tiene 419 aminoácidos

   Figura 4: Alineamiento de 273P4B7 con homólogos conocidos

   Figura 4A) Alineamiento de 273P4B7(SEC ID Nº: 20) con proteína humana no nombrada (gi|22760345) (SEC ID Nº: 21) Identidades = 1103/1106 (99%), Positivos = 1105/1106(99%)

   Figura 4B) Alineamiento de 273P4B7(SEC ID N°:22) con antígeno tumoral BJ-HCC-15 humano (gi|22002580) (SEC ID Nº:23)Identidades = 418/419 (99%), Positivos = 419/419 (100%)

   Figura 4C) Alineamiento de 273P4B7 (SEC ID Nº: 24) con proteína de ratón (gi|27706852) (SEC ID Nº: 25) Identidades = 912/1256 (72%). Positivos = 1026/1256 (81%), Huecos = 35/1256 (2%) /

   Figura 5: 273P4B7 variante 1 Perfil de hidrofilia (Hopp TP., Woods K.R., 1981.

   Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 3824-3828)

   Figura 6: 273P4B7 variante 1 Perfil hidropático

   (Kyte J., Doolittle R.F., 1982. J. Mol. Biol. 157: 105-132)

   Figura 7: 273P4B7 variante 1 Perfil de % de restos accesibles (Janin J., 1979. Nature 277: 491-492)

   Figura 8: 273P4B7 variante 1 Perfil de flexibilidad media

   (Bhaskaran R., Ponnuswamy P.K., 1988. Int. J. Pept. Protein Res. 32: 242-255)

   Figura 9: 273P4B7 variante 1 Perfil de giro beta

   (Deleage, G., Roux B. 1987. Protein Engineering 1: 289-294)

   Figura 14B Expresión de 273P4B7 por RT-PCR

   Figura 16 Expresión de 273P4B7 en muestras de ensayo de paciente con cáncer de páncreas, ovario y testículo

   Figura 18 Expresión de 273P4B7 en muestras de ensayo de paciente con cáncer de vejiga