ES2375650T3 - Bacteria productora de l-amino�?cidos y procedimiento para producir l-amino�?cidos. - Google Patents

Abstract

Una bacteria corineforme que tiene la capacidad de producir L-aminoácidos, en la que dicha bacteria corineforme está modificada para que la actividad de acetil-CoA hidrolasa disminuya en comparación con una cepa de tipo natural o no modificada como resultado de una mutación en la región codificante o una región reguladora de la expresión de un gen cromosómico de acetil-CoA hidrolasa, o como resultado de la alteración del gen cromosómico de acetil-CoA hidrolasa, y en la que dicho L-aminoácido es uno o más L-aminoácidos generados por ruta biosintética usando ácido pirúvico como intermedio, en la que dicho gen de acetil-CoA se selecciona entre el grupo que consiste en: (A) un gen que comprende los nucleótidos 1037 a 2542 de la SEQ ID NO: 23; y (B) un ADN que puede hibridar en condiciones rigurosas con un polinucleótido que comprende los nucleótidos 1037 a 2542 de la SEQ ID NO: 23, y que codifica una proteína que tiene actividad de acetil-CoA hidrolasa.

Description

Bacteria productora de l-aminoácidos y procedimiento para producir l-aminoácidos

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a un procedimiento para producir L-aminoácidos generados por ruta biosintética usando ácido pirúvico como intermedio durante la fermentación de bacterias corineformes, particularmentelos L-aminoácidos L-ácido glutámico, L-arginina, L-glutamina, L-prolina, L-valina, L-alanina y L-lisina.

ANTECEDENTES DE LA TËCNICA

Un L-aminoácido, tal como el ácido glutámico, se genera por ruta biosintética usando ácido pirúvico comointermedio, y convencionalmente se ha producido a escala industrial mediante procedimientos de fermentación utilizando bacterias corineformes, incluyendo Brevibacterium y Corynebacterium, que tienen la capacidad de producir Laminoácidos. Para mejorar la productividad L-aminoácidos de bacterias corineformes, se han usado cepas aisladas demutantes naturales o artificiales de las mismas (documentos JP07-121228B, JP07-121228B, JP06-237779A, Adv.Biochem. Eng. Biotechnol. 2003; 79: 59-112. J. Biotechnol. 4 de sep. de 2003; 104(1-3): 155-72 y WO95/34672).

Cuando se cultivan bacterias aeróbicas, especialmente bacterias corineformes, en condiciones limitadas deoxígeno, se acumulan ácidos orgánicos distintos de la sustancia diana, tales como ácido láctico y ácido acético, encantidades en exceso en forma de subproductos. Dicha acumulación inhibe el crecimiento de las bacterias y reduce engran medida su productividad durante la fermentación. Además, son necesarias cantidades en exceso de contraionesque neutralicen dichos ácidos orgánicos, lo que aumenta el coste de producción. Por consiguiente, se ha deseado la creación de cepas que produzcan menos ácido acético durante el cultivo, tales como cepas en las que se reduce o elimina la actividad de una enzima que cataliza la producción de ácido acético.

Los ejemplos de un procedimiento de fermentación que usa una cepa en la que se reduce o elimina la actividadde una enzima que cataliza la producción de ácido acético incluyen la producción de L-aminoácidos usando Escherichia coli que es deficiente en actividades de fosfoacetiltransferasa (pta) y lactato deshidrogenasa (Idh) (documento WO99/06532), la producción de L-aminoácidos usando la familia Enterobacteriaceae que es deficiente en actividad de piruvato oxidasa (poxB), y la producción de D-ácido pantoteico usando Enterobacteriaceae que es deficiente en la actividad de piruvato oxidasa (poxB) (documento WO02/36797).

Se han reseñado acetato cinasa (ack) y fosfotransacetilasa (pta) como enzimas que están implicadas en laasimilación del ácido acético en bacterias corineformes (Microbiology, feb. de 1999; 145(Pt2): 503-13). Además, se hareseñado una bacteria corineforme en la que está alterada la enzima productora de acetato piruvato oxidasa (poxB)(documento EP1096013A).

La acetil-CoA hidrolasa es una enzima (3.1.2.1) que produce ácido acético a partir de acetil-CoA y H2O, y se ha dado a conocer la secuencia nucleotídica predicha que codifica acetil-coA hidrolasa de Corynebacterium glutamicum(documento EP1108790A). Sin embargo, no se ha reseñado el análisis de clonación y expresión real del gen; y por lotanto la función real del gen no se ha confirmado todavía.

DIVULGACIÓN DE LA INVENCIÓN

Es un objeto de la presente invención proporcionar una bacteria corineforme que tenga una capacidadmejorada para producir L-aminoácidos que se generan por ruta biosintética usando ácido pirúvico como intermedio, y proporcionar un procedimiento para producir de forma eficaz los L-aminoácidos que se han mencionado anteriormenteusando una bacteria de este tipo.

Los inventores de la presente invención han estudiado extensamente para conseguir los objetos que se han mencionado anteriormente. Como resultado, descubrieron que disminuyendo la actividad de acetil-CoA hidrolasa en unabacteria corineforme, aumenta la capacidad para producir L-aminoácidos, particularmente L-ácido glutámico, L-valina y L-alanina, y realizaron de esta manera la presente invención.

Es un objeto de la presente invención proporcionar una bacteria corineforme que tenga capacidad de producirL-aminoácidos, en la que dicha bacteria corineforme se modifica para que la actividad de acetil-CoA hidrolasa disminuya en comparación de una cepa de tipo natural o no modificada como resultado de una mutación en la región codificante o una región reguladora de la expresión de un gen cromosómico de acetil-CoA hidrolasa, o como resultado de la alteración del gen cromosómico de acetil-CoA hidrolasa, y en la que dicho L-aminoácido es uno o más L-aminoácidosgenerados por una ruta biosintética usando ácido pirúvico como intermedio, en la que dicho gen de acetil-CoA hidrolasase selecciona entre el grupo que consiste en:

(A)

un gen que comprende los nucleótidos 1037 a 2542 de la SEQ ID NO: 23; y

(B)

un ADN que puede hibridar en condiciones rigurosas con polinucleótido que comprende los nucleótidos 1037 a 2542de la SEQ ID NO: 23, y que codifica una proteína que tiene actividad de acetil-CoA hidrolasa.

Es un objeto más de la presente invención proporcionar la bacteria corineforme como se ha descrito anteriormente, en la que dicha acetil-CoA hidrolasa se selecciona entre el grupo que consiste en:

(A)

Una proteína que comprende una secuencia aminoacídica mostrada en la SEQ ID NO: 24; y

(B)

Una proteína que comprende una secuencia aminoacídica mostrada en la SEQ ID NO: 24, con lo que uno o variosaminoácidos en dicha proteína se sustituyen, eliminan, insertan o añaden, y en la que dicha proteína tiene actividad deacetil-CoA hidrolasa.

Es un objeto más de la presente invención proporcionar la bacteria corineforme como se ha descrito anteriormente, en la que dicha bacteria corineforme se modifica adicionalmente para aumentar la actividad de glutamatodeshidrogenasa mediante transformación con un plásmido que contiene un gen que codifica glutamato deshidrogenasa; integrando dicho gen en un cromosoma por recombinación homóloga, conjugación o transposición, o introduciendo unamutación en una región promotora de dicho gen o sustituyendo por un promotor fuerte.

Es un objeto más de la presente invención proporcionar la bacteria corineforme como se ha descrito anteriormente, en la que dicho L-aminoácido es uno o más L-aminoácidos seleccionados entre el grupo que consiste enL-ácido glutámico, L-arginina, L-glutamina, L-prolina, L-alanina, L-valina y L-lisina.

Es un objeto más de la presente invención proporcionar un procedimiento para producir un L-aminoácido que comprende: cultivar la bacteria corineforme como se ha descrito anteriormente en un medio, y recoger el L-aminoácido del medio, y en el que dicho L-aminoácido es uno o más L-aminoácidos generados a través de ácido pirúvico comointermedio.

Es un objeto más de la presente invención proporcionar el procedimiento que se ha descrito anteriormente, enel que dichos L-aminoácidos son uno o más aminoácidos seleccionados entre el grupo que consiste en L-ácido glutámico, L-arginina, L-glutamina, L-prolina, L-alanina, L-valina y L-lisina.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Fig. 1 es un esquema que muestra el procedimiento de la construcción del plásmido pBS3. La Fig. 2 es un esquema que muestra el procedimiento de la construcción del plásmido pBS4. La Fig. 3 es un esquema que muestra el procedimiento de la construcción del plásmido pBS5T. La Fig. 4 es un esquema que muestra el procedimiento de la construcción del plásmido pLldh56-1. La Fig. 5 es un esquema que muestra el procedimiento de construir el plásmido pBS4S::Lach.

DESCRIPCIÓN DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS

En lo sucesivo en este documento, se describirán en detalle realizaciones de la presente invención.

<1> Bacteria corineforme que tiene la capacidad de producir L-aminoácidos generados por ruta sintética usando ácido pirúvico como intermedio

En la presente invención, los ejemplos de bacteria corineforme incluyen una bacteria corineforme convencional,y también incluyen bacterias que se habían clasificado en el género Brevibacterium, pero que actualmente se clasifican en el género Corynebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1991)), así como bacterias Brevibacterium que están muy cercanas a las bacterias Corynebacterium. Los ejemplos de dicha bacteria corineforme incluyen los siguientes:

Corynebacterium acetoacidophilum Cornynebacterium acetoglutamicum Corynebacterium alkanolyticum Corynebacterium callunae Corynebacterium glutamicum Corynebacterium lilium Corynebacterium melassecola Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficients) Corynebacterium herculis Brevibacterium divaricatum Brevibacterium flavum Brevibacterium immariophilum Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) Brevibacterium roseum Brevibacterium saccharolyticum Brevibacterium thiogenitalis Brevibacterium ammoniagenes Brevibacterium album Brevibacterium cerinum Microbacterium ammoniaphilum

Son ejemplos específicos de bacteria corineforme los que se indican a continuación.

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870

Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806

Corynebacterium alkanolyticum ATCC21511

Corynebacterium callunae ATCC15991

Corynebacterium glutamicum ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060, ATCC13869

Corynebacterium lilium ATCC15990

Corynebacterium melassecola ATCC17965

Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539)

Corynebacterium herculis ATCC13868

Brevibacterium divaricatum ATCC 14020

Brevibacterium flavum ATCC13826, ATCC14067, AJ12418 (FERM BP-2205) Brevibacterium immariophilum ATCC14068

Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) ATCC13869

Brevibacterium roseum ATCC13825

Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066

Brevibacterium thiogenitalis ATCC19240

Brevibacterium ammoniagenes ATCC6871, ATCC6872

Brevibacterium album ATCC15111

Brevibacterium cerinum ATCC 15112

Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354

Estas cepas están disponibles en la Colección de cultivos tipo estadounidense “American Type Culture Collection” (ATCC, dirección: código postal 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos de América). Es decir, a cada cepa se le da en un número de registro único que se enumera en el catalogo de la ATCC. Las cepas pueden ordenarse usando este número de registro. La cepa AJ12340 se depositó en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial, Ministerio de Comercio e Industria Internacional “National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Internacional Trade andIndustry” (actualmente Depositario del Organismo Internacional de Patentes, Instituto Nacional de Ciencia y TecnologíaAvanzada “International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology” en Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-5466, Japón) el 27 de octubre de 1989según las disposiciones del tratado de Budapest y se le dio el número de acceso FERM BP-1539. La cepa AJ12418 sedepositó en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial, Ministerio de Comercio e Industria Internacional “National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Internacional Trade and Industry” el 5 de enero de 1989 según lasdisposiciones del tratado de Budapest y se le dio el número de acceso FERM BP-2205.

“L-Aminoácidos generados por ruta biosintética usando ácido pirúvico como intermedio” significapreferiblemente aquellos que tienen estructuras de carbono derivadas de ácido pirúvico. Los ejemplos de dichos Laminoácidos incluyen L-ácido glutámico, L-arginina, L-glutamina, L-prolina, L-alanina, L-valina y L-lisina. Como se usa en este documento, "la capacidad para producir L-aminoácidos por ruta biosintética usando ácido pirúvico comointermedio" se refiere a la capacidad de las bacterias corineformes de la presente invención de causar la acumulación de uno o más de los L-aminoácidos que se han mencionado anteriormente en un medio cuando se cultivan en el medio.

La capacidad para producir L-aminoácidos puede ser una capacidad original de una cepa de tipo natural debacteria corineforme o una capacidad que se ha conferido mediante crianza. Además, la capacidad para producir Laminoácidos puede conferirse mediante una modificación que da como resultado un descenso en la actividad de acetil-CoA hidrolasa, como se describe posteriormente.

Para conferir la capacidad de producir L-aminoácidos, pueden usarse procedimientos convencionales que sehan usado en la crianza de bacterias corineformes, tal como la creación de cepas mutantes de regulación metabólica, o la creación de cepas recombinantes que tienen actividad potenciada de enzimas biosintéticas de sustancias diana ("Amino Acid Fermentation", Center for Academic Publications Japan Co., Ltd., 1ª ed. publicada el 30 de mayo de 1986,pág. 77 a 100). En estos procedimientos, la introducción de una mutación de regulación metabólica, y la potenciación delas enzimas biosintéticas de sustancia diana pueden usarse en solitario o en combinación. Además, pueden introducirse dos o más mutaciones, y pueden potenciarse dos o más actividades enzimáticas.

5 Un ejemplo de un procedimiento para conferir capacidad de producir L-ácido glutámico es potenciar la expresión de un gen que codifica una enzima biosintética de L-ácido glutámico. Los ejemplos de las enzimas que estánimplicadas en la biosíntesis de L-ácido glutámico incluyen glutamato deshidrogenasa, glutamina sintetasa, glutamatosintetasa, isocitrato deshidrogenasa, aconitato hidratasa, citrato sintasa, fosfoenolpiruvato carboxilasa, piruvato carboxilasa, piruvato deshidrogenasa, piruvato cinasa, fosfoenolpiruvato sintasa, enolasa, fosfogliceromutasa,fosfoglicerato cinasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, fructosa biofosfato aldolasa, fosfofructo cinasa y glucosa fosfato isomerasa.

Puede conseguirse potenciar la expresión de estos genes insertando un fragmento de ADN que contiene ungen de este tipo en un plásmido apropiado que pueda replicarse de forma autónoma en la bacteria corineforme, y transformando las células bacterianas con el plásmido resultante; integrando un gen de este tipo en un cromosoma

15 mediante recombinación homóloga, conjugación, transposición (documentos EP0756007B, EP0332488A, EP0771879A), etc.; o introduciendo una mutación en una región promotora de un gen de este tipo (documento WO/0018935) o sustituyendo por un promotor fuerte.

Cuando los genes que se han mencionado anteriormente se introducen mediante un plásmido o se integran enun cromosoma, puede ser un promotor para la expresión de los genes cualquier promotor, siempre que pueda funcionaren la bacteria corineforme. Los ejemplos de dichos promotores incluyen promotor lac, promotor trp, promotor trc,promotor PS2 y promotor pL. También puede usarse un promotor nativo para cada gen.

Los ejemplos de microorganismos modificados para que se potencie la expresión del gen citrato sintetasa, elgen fosfoenolpiruvato carboxilasa y/o el gen glutamato deshidrogenasa incluyen los microorganismos dados a conoceren los documentos JP2001-333769A (EP1078989A), JP2000-106869A (EP955368A), JP2000-189169A (EP952221A) y

25 JP2001-333769A (EP1078989A).

La modificación para conferir la capacidad de producir L-ácido glutámico incluye también disminuir o eliminar una actividad de una enzima que cataliza la síntesis de un compuesto distinto de L-ácido glutámico, y la ramificación apartir de una ruta de biosíntesis de L-ácido glutámico. Los ejemplos de dichas enzimas incluyen isocitrato liasa, acetoglutarato deshidrogenasa, fosfotransacetilasa, acetato cinasa, acetohidroxiácido sintasa, acetolactato sintasa, formiato acetiltransferasa, lactato deshidrogenasa y glutamato descarboxilasa.

Para disminuir o eliminar la actividad de las enzimas que se han descrito anteriormente, puede introducirse unamutación o deleción que cause un descenso o pérdida de la actividad de las enzimas en los genes de las enzimas en elcromosoma. Esto puede conseguirse, por ejemplo, alterando un gen que codifica la enzima en el cromosoma, o modificando una secuencia de control de la expresión, tal como un promotor y/o una secuencia Shine Dargarno (SD) del

35 gen. Además, las actividades de dichas enzimas pueden disminuirse o eliminarse introduciendo una mutación de aminoácido que cause una sustitución de aminoácidos, una mutación finalizadora que genere un codón de terminación o una mutación con desplazamiento de marco que añada o elimine uno o más nucleótidos en la región codificante, o eliminando una porción del gen (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)). Además, las actividades de dichas enzimas pueden disminuirse o eliminarse construyendo un gen que codifique una enzima mutante que tenga suregión codificante eliminada y un gen cromosómico reemplazado por el gen resultante mediante recombinación homóloga. Los ejemplos de bacteria corineforme en los que la actividad de a-cetoglutarato deshidrogenasa disminuyeincluyen las cepas dadas a conocer en los documentos JP7-834672A y JP06-237779.

Además, un ejemplo de un procedimiento para conferir la capacidad de producir L-ácido glutámico incluye unprocedimiento para modificar una cepa para potenciar la expresión de un gen que codifica el gen yggB o para introducir 45 la mutación en el gen yggB (NCgl 1221; NP_600492. Reports small-conductance... [gi: 19552490]) (Solicitud de Patente

de Estados Unidos Nº 60/715131).

La capacidad de producir L-ácido glutámico también puede conferirse cribando una cepa resistente a análogos de ácidos orgánicos, inhibidores respiratorios o generadores de superóxido, o cribando una cepa sensible a inhibidores de la síntesis de la pared celular. Los ejemplos de dichos procedimientos incluyen conferir resistencia a benzopirona onaftoquinona (documento JP56-1889A), conferir resistencia a ácido monofluoracético (JP 50-113209A), conferirresistencia a adenina o timina (JP57-065198) conferir resistencia a HOQNO (JP56-140895A), conferir resistencia a acetomalónico (JP57-2689A), conferir resistencia a guanidina (JP56-35981 A), conferir resistencia a daunomicina (JP58158192A) y conferir sensibilidad a la penicilina (JP04-88994A).

Los ejemplos específicos de dicha bacteria incluyen las siguientes cepas.

55 Brevibacterium flavum AJ3949 (FERM BP-2632: documento JP 50-113209A)

Corynebacterium glutamicum AJ11628 (FERM P-5736; documento JP 57-065198A)

Brevibacterium flavum AJ11355 (FERM P-5007; documento JP56-1889A)

Corynebacterium glutamicum AJ11355 (FERM P-5020; documento JP56-1889A)

Brevibacterium flavum AJ11217 (FERM P-4318; documento JP57-2689A)

Corynebacterium glutamicum AJ11218 (FERM P-4319; documento JP57-2689A) Brevibacterium flavum AJ11564 (FERM P-5472; documento JP56-140895A)

Brevibacterium flavum AJ11439 (FERM P-5136; documento JP56-35981A)

Corynebacterium glutamicum H7684 (FERM BP-3004; documento JP04-88994A)

Brevibacterium lactofermentum AJ11426 (FERM P5123; documento JP56-048890A)

Corynebacterium glutamicum AJ11440 (FERM P5137; documento JP56-048890A)

Brevibacterium lactofermentum AJ11796 (FERM P6402; documento JP58-158192A)

Un ejemplo de un procedimiento para conferir la capacidad de producir L-valina incluye un procedimiento demodificación de una cepa para potenciar la expresión de un gen que codifica una enzima biosintética de L-valina. Losejemplos de una enzima biosintética de L-valina incluyen enzimas codificadas por un gen del operón ilvBNC, es decir, acetohidroxiácido sintetasa codificada por ilvBN e isómeroreductasa codificada por ilvC (documento WO00/50624). El operón ilvBNC se somete a represión transcripcional mediante cualquier combinación de L-valina, L-isoleucina y Lleucina, de modo que es deseable liberar la atenuación para evitar la represión transcripcional por L-valina comoproducto.

Conferir la capacidad de producir L-valina a las bacterias corineformes puede realizarse disminuyendo oeliminando la actividad de al menos una enzima que cataliza una reacción que disminuye la producción de L-valina. Porejemplo, la capacidad de producir L-valina puede conferirse disminuyendo la actividad de treonina deshidratasa, quecataliza la síntesis de L-leucina, o disminuyendo la actividad de una enzima que cataliza la síntesis de D-pantotenato(documento WO00/50624).

La capacidad de producir L-valina también puede conferirse impartiendo resistencia a los análogos deaminoácidos o similares a una bacteria corineforme.

Por ejemplo, pueden usarse cepas mutantes productoras de L-valina auxotróficas de L-isoleucina y Lmetionina, y resistentes a D-ribosa, ribonucleósidos de purina o ribonucleósidos de pirimidina (FERM P-1841, FERM P29, JP-B-53-025034), cepas mutantes productoras de L-valina resistentes a policetidas (FERM P-1763, FERM P-1764; JP-B006-065314), cepas mutantes productoras de L-valina resistentes a L-valina y sensibles a los análogos de ácidopirúvico, tales como, ácido 1-fluoropirúvico (FERM BP-3006, BP-3007, Patente 3006929).

Los ejemplos de bacterias corineformes que tienen la capacidad de producir L-alanina incluyen bacteriascorineformes deficientes en la actividad H+-ATPasa (Appl. Microbiol. Biotechnol. nov. de 2001; 57(4): 534-40), ybacterias corineformes amplificadas con un gen estructural que codifica ácido aspártico 1-descarboxilasa (documento JP-A-7-163383).

La capacidad de producir L-arginina puede conferirse modificando la bacteria corineforme para potenciar laexpresión de un gen que codifica la enzima biosintética de L-arginina. Los ejemplos de enzima biosintética de L-argininaincluyen N-acetilglutamilfosfato reductasa (argC), ornitina acetiltransferasa (argJ), N-acetilglutamato cinasa (argB), acetilornitina transaminasa (argD), ornitina carbamoiltransferasa (argF), ácido argininosuccínico sintetasa (argG), ácidoargininosuccínico liasa (argH) y carbamoilfosfato sintetasa. Estos genes biosintéticos de arginina existen en el operónArg (argCJBDFRGH), y se regulan mediante un represor de arginina codificado por argR. (J Bacteriol. dic. de 2002; 184(23): 6602-14.) Por lo tanto, la alteración del represor de arginina da como resultado un aumento en la expresión deloperón Arg, potenciando de esta manera las actividades de las enzimas productoras de L-arginina (documento US20020045223).

Otro procedimiento para conferir la capacidad de producir L-arginina es, por ejemplo, conferir resistencia a losanálogos de aminoácidos. Los ejemplos de bacterias corineformes incluyen bacterias corineformes resistentes a 2tiazolealanina y auxotróficas de L-histidina, L-prolina, L-treonina, L-isoleucina, L-metionina o L-triptófano (documento JPA-54-044096); bacterias corineformes resistentes a ácido cetomalónico, ácido fluoromalónico o ácido monofluoroacético(documento JP-A-57-18989); una bacteria corineforme resistente a argininol (documento JP-B-62-024075); y una bacteria corineforme resistente a x-guanidina (x es un ácido graso o un derivado de cadena alifática) (documento JP-A2-186995); y una bacteria corineforme resistente a arginina hidroxamato y 6-azauracilo (documento JP-A-57-150381).

Es un ejemplo de un procedimiento para conferir la capacidad de producir L-glutamina modificar una bacteriacorineforme para potenciar la expresión de un gen que codifica una enzima biosintética de L-glutamina. Los ejemplos deL-glutamina biosintética incluyen glutamina sintetasa y glutamato deshidrogenasa (documento US2003-0003550).

La capacidad de producir L-glutamina también puede conferirse disminuyendo o eliminando la actividad de unaenzima que cataliza una reacción que se ramifica a partir de la ruta biosintética de L-glutamina y que produce otros compuestos. Por ejemplo, la capacidad de producir L-glutamina puede conferirse disminuyendo la actividad de glutaminasa (documento US2004-0152175).

La capacidad de producir L-glutamina puede conferirse también confiriendo resistencia a análogos de Laminoácidos. Los ejemplos de dichos procedimientos incluyen un procedimiento de conferir resistencia a 6-diazo-5oxonorleucina (documento JP-A-3-232497), un procedimiento para conferir resistencia a análogos de purina y/osulfóxido de metionina (documento JP-A-61 -202694), un procedimiento para conferir resistencia a a-ácido cetomalonico (documento JP-A-56-151495), y un procedimiento para conferir resistencia a un péptido que contiene ácido glutámico(documento JP-2-186994).

Los ejemplos específicos de bacterias corineformes que producen L-glutamina incluyen las siguientes cepas.

Brevibacterium flavum AJ11573 (FERM P-5492, documento JP56-161495A) Brevibacterium flavum AJ11576 (FERM BP-10381, documento JP56-161495A)

Brevibacterium flavum AJ12212 (FERM P-8123, documento JP61-202694A)

Brevibacterium flavum AJ12418 (FERM BP-2205, documento JP02-186994A)

Brevibacterium flavum DH18 (FERM P-11116, documento JP03-232497A)

Corynebacterium melassecola DH344 (FERM P-11117, documento JP3-232497A)

Corynebacterium glutamicum AJ11574 (FERM P-5493, documento JP56-151495A)

Un ejemplo de un procedimiento para conferir la capacidad de producir L-prolina incluye un procedimiento demodificación de una bacteria corineforme para potenciar la expresión de un gen que codifica una enzima biosintética deL-prolina. Los ejemplos de enzima biosintética de L-prolina incluyen glutamato cinasa, y-glutamil fosfato reductasa y pirolina-5-carboxilato reductasa. (J. Bacteriol. agosto de 1996; 178(15): 4412-9).

La capacidad de producir L-prolina puede conferirse también disminuyendo o eliminando la actividad de una enzima que cataliza una reacción que se ramifica a partir de la ruta biosintética de L-prolina y que produce otroscompuestos. Por ejemplo, la capacidad de producir L-prolina puede conferirse disminuyendo la actividad de ornitinaaminotransferasa. (J. Bacteriol. agosto de 1996; 178(15): 4412-9).

Mientras tanto, L-arginina, L-glutamina y L-prolina contienen L-ácido glutámico como una estructura de carbono, de forma que la capacidad de producir estos aminoácidos puede conferirse amplificando un gen que codifica una enzima que cataliza una reacción que da como resultado la producción de cada L-aminoácido a partir de L-ácidoglutámico en la bacteria productora de L-ácido glutámico que se ha mencionado anteriormente.

Además, ya que la L-alanina se sintetiza por 1-descarboxilación de L-ácido aspártico, la bacteria productora deL-alanina puede obtenerse modificando la bacteria productora de L-ácido aspártico para que disminuya la actividad deacetil-CoA hidrolasa.

La crianza para conferir o potenciar la productividad de L-lisina puede realizarse introduciendo una o másmutaciones como se indica a continuación. Dichas mutaciones artificiales son como se indican a continuación:

Mutantes resistentes a S-(2-aminoetil)cisteína (en lo sucesivo en este documento denominado "AEC"); mutantes que requieren aminoácidos tales como L-homoserina para su crecimiento (véanse las publicaciones de patentes japonesas Nº 4828078 y 566499); mutantes resistentes a AEC y que requieran aminoácidos tales como, Lleucina, L-homoserina, L-prolina, L-serina, L-arginina, L-alanina, L-valina, etc. (véanse las patentes de Estados Unidos

3.708.395 y 3.825472); mutantes de producción de L-lisina resistentes a DL-aminocaprolactama, aminolauril-lactama, análogos de ácido aspártico, sulfamidas, quinoides y N-lauroil-leucina, y mutantes productores de L-lisina resistentes aoxaloacetato descarboxilasa o inhibidores de enzimas del sistema respiratorio (véanse las patentes japonesas abiertas a consulta por el público Nº 5053588, 5031093, 52102498, 539394, 5386089, 559783, 559759, 5632995, 5639778,publicaciones de patentes japonesas Nº 5343591, 531833); mutantes productores de L-lisina que requieren inositol o ácido acético (véanse las patentes japonesas abiertas a consulta por el público Nº 559784, 568692); mutantesproductores de L-lisina sensibles a ácido fluoropirúvico o a temperaturas de 34 ºC o más (véase la patente japonesaabierta a consulta por el público Nº 5386090); mutantes productores de L-lisina de Brevibacterium o Corynebacterium resistentes a etilenglicol (véase la patente de Estados Unidos 4.411.997).

Es un ejemplo de un procedimiento para conferir la capacidad de producir L-lisina potenciar la expresión de ungen que codifica una enzima biosintética de L-lisina. Los ejemplos de las enzimas implicadas en la biosíntesis de L-lisina incluyen, pero sin limitación, enzimas de la ruta de diaminopimelato, tales como el gen de dihidrodipicolinato sintasa (dapA), el gen de aspartato cinasa (lysC), el gen de dihidrodipicolinato reductasa (dapB), el gen de diaminopimelatodecarboxilasa (lysA), el gen de diaminopimelato deshidrogenasa (ddh) (todos los anteriores; publicación internacional nº96/40934), el gen de fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc) (solicitud de patente japonesa abierta a consulta por el públicoNº 60-87788), el gen de aspartato aminotransferasa (aspC) (publicación de patente japonesa Nº 6-102028), el gen dediaminopimelato epimerasa (dapF) (solicitud de patente japonesa abierta a consulta por el público Nº 2003-135066), y elgen de aspartato semialdehído deshidrogenasa (asd) (publicación internacional nº 00/61723), y las enzimas de la rutadel aminoadipato, tales como el gen de homoaconitato hidratasa (solicitud de patente japonesa abierta a consulta por el público nº 2000-157276).

Además, la bacteria de la presente invención puede tener una actividad disminuida de una enzima que cataliza una reacción para generar un compuesto distinto de L-lisina mediante la ramificación de la ruta biosintética de L-lisina, opuede ser deficiente en una enzima de este tipo. Las enzimas que catalizan una reacción para generar un compuesto distinto de L-lisina mediante la ramificación de la ruta biosintética de L-lisina incluyen homoserina deshidrogenasa y lisina descarboxilasa. Se describen cepas que tienen actividades reducidas de las enzimas en los documentos WO95/23864 y WO 96/178930.

<2> Modificación para disminuir la actividad de acetil-CoA hidrolasa

La bacteria corineforme de la presente invención tiene la capacidad para producir un L-aminoácido generadopor una ruta biosintética usando ácido pirúvico como intermedio como se ha mencionado anteriormente y se modificapara que la actividad de acetil-CoA hidrolasa (EC 3.1.2.1) disminuya.

La bacteria corineforme de la presente invención puede obtenerse modificando la bacteria corineforme que seha mencionado anteriormente que tiene la capacidad de producir L-aminoácidos generados por ruta biosintética usandoácido pirúvico como intermedio para que se reduzca la actividad de acetil-CoA hidrolasa. La crianza de la bacteria corineforme de la presente invención, conferir la capacidad de producir L-aminoácido a la bacteria, o modificar la bacteria para que se reduzca la actividad de acetil-CoA hidrolasa pueden realizarse en cualquier orden.

"Actividad de acetil-CoA hidrolasa (ACH) " se refiere a la actividad para catalizar la producción de ácido acéticoa partir de acetil-CoA y H2O. "Modificado para que la actividad de acetil-CoA hidrolasa disminuya" significa que la5 actividad de acetil-CoA hidrolasa es inferior que en las cepas no modificadas, incluyendo una bacteria corineforme de tipo natural. La actividad de ACH se reduce preferiblemente al 50% o menos, más preferiblemente al 30% o menos,todavía más preferiblemente al 10% o menos por peso celular unitario en comparación con una cepa no modificada. Eneste documento, una bacteria corineforme de tipo natural que sirve como control incluye, por ejemplo, la cepa Brevibacterium lactofermentum 2256 (ATCC 13869) o Corynebacterium glutamicum ATCC13032, y una cepa no modificada incluye la cepa Brevibacterium lactofermentum Lldh. La actividad de acetil-CoA hidrolasa puede medirse deacuerdo con el procedimiento de Gergely, J., y col., (Gergely, J., Hele, P. & Ramkrishnan, C.V. (1952) J. Biol. Chem.198 pág. 323-334). "Disminuir" incluye cuando la actividad ha desaparecido completamente. Se prefiere que la bacteria corineforme de la presente invención tenga una actividad de acetil-CoA hidrolasa que sea inferior a la de una cepa detipo natural o no modificada y que cause una acumulación de L-aminoácidos mayor que una cepa de tipo natural o no

15 modificada.

Los ejemplos de ACH incluyen una proteína que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en la SEQ IDNO: 24, y una proteína que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 24, en la que uno o másaminoácidos se remplazan, eliminan, insertan o añaden en una o más posiciones, pero se mantiene la actividad deACH. Aunque el número de "varios" restos aminoácidos al que se hace referencia en este documento puede diferirdependiendo de las posiciones en la estructura tridimensional o de los tipos de restos aminoacídicos de la proteína, puede ser preferiblemente de 2 a 20, más preferiblemente de 2 a 10, con particular preferencia de 2 a 5. El gen de ACHpreferiblemente codifica una proteína que tiene una homología de no menos del 80%, más preferiblemente no menosdel 90%, incluso más preferiblemente no menos del 95%, con particular preferencia no menos del 97% con respecto a lasecuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 24, mientras que se mantiene la actividad de ACH. La

25 sustitución de aminoácidos en estos homólogos de ACH es preferiblemente una sustitución conservativa, incluyendo sustitución de ser o thr por ala, sustitución de gln, his o lys por arg, sustitución de glu, gln, lys, his o asp por asn, sustitución de asn, glu o gln por asp, sustitución de ser o ala por cys, sustitución de asn, glu, lys, his, asp o arg por gln, sustitución de gly, asn, gln, lys o asp por glu, sustitución de pro por gly, sustitución de asn, lys, gln, arg o tyr por his,sustitución de leu, met, val o phe por ile, sustitución de ile, met, val o phe por leu, sustitución de asn, glu, gln, his o argpor lys, sustitución de ile, leu, val o phe por met, sustitución de trp, tyr, met, ile o leu por phe, sustitución de thr o ala porser, sustitución de ser o ala por thr, sustitución de phe o tyr por trp, sustitución de his, phe o trp por tyr y la sustitución de met, ile o leu por val.

"Modificado para que la actividad de acetil-CoA hidrolasa disminuya" incluye el caso en el que el número demoléculas de acetil-CoA hidrolasa por célula disminuye, y el caso en el que la actividad de CoA hidrolasa por molécula35 disminuye. Específicamente, estas modificaciones pueden conseguirse, por ejemplo, alterando un gen que codifica acetil-CoA hidrolasa en un cromosoma, o modificando una secuencia reguladora de la expresión, tal como un promotory/o una secuencia Shine-Dalgarno (SD). El gen de acetil-CoA hidrolasa en un cromosoma incluye, por ejemplo, un ADNque comprende los nucleótidos 1037 a 2542 de la SEQ ID NO: 23. Además, el gen de acetil-CoA hidrolasa incluye, porejemplo, un ADN que puede obtenerse usando el cebador de SEQ ID 7 y 8 en el procedimiento de PCR. Además, elgen de acetil-CoA hidrolasa en un cromosoma puede ser un ADN que es capaz de hibridar con los nucleótidos 1037 a2542 de la SEQ ID No. 23 o una sonda que pueda preparase a partir de los nucleótidos en condiciones rigurosassiempre que codifique una proteína que tenga actividad de acetil-CoA hidrolasa. "Condiciones rigurosas" se refiere acondiciones en las que se forman los denominados híbridos específicos y no se forman híbridos no específicos. Aunquees difícil expresar claramente estas condiciones mediante valores numéricos, los ejemplos de dichas condiciones

45 incluyen cuando se realizan los lavados una sola vez, preferiblemente dos a tres veces a 60ºC y a una concentración salina que corresponde a 1 x SSC, 0,1% de SDS, preferiblemente 0,1 x SSC, 0,1% de SDS.

El gen de acetil-CoA hidrolasa (en lo sucesivo en este documento denominado como "gen ach") puedeclonarse sintetizando oligonucleótidos sintéticos basándose en una secuencia oligonucleotídica de Corynebacterium glutamicum (por ejemplo, la SEQ ID No. 23, NCgl2480 con nº de acceso a GenBank NC_003450 (una hebra complementaria de 2729376 a 2730884 de NC_003450)), y realizando un análisis por PCR usando un ADN cromosómico de Corynebacterium glutamicum como molde. Además, también está disponible otra secuencia nucleotídica derivada de una bacteria corineforme tal como Brevibacterium lactofermentum. El ADN cromosómico puede prepararse a partir de una bacteria corineforme en forma de un donante de ADN mediante, por ejemplo, el procedimiento de Saito y Miura (H. Saito y K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), "Biotechnology

55 Experiments Handbook", ed. por The Society for Biotechnology Japan, pág. 97 a 98, Baifukan, 1992).

El gen ach preparado de esta manera o una parte del mismo puede usarse para alterar el gen cromosómicoach. Además, el gen ach usado para alterar el gen cromosómico de ach también puede ser un gen que tiene homologíasuficiente para causar la recombinación homóloga con el gen ach en el cromosoma de una bacteria corineforme diana(por ejemplo, un gen que tiene los nucleótidos 1037 a 2542 de la SEQ ID NO: 23). En este documento, la homologíasuficiente para causar la recombinación homóloga es preferiblemente del 80% o más, más preferiblemente del 90% o más, todavía más preferiblemente del 95% o más, con particular preferencia del 97% o más. Además, también puedeusarse un ADN que puede hibridar en condiciones rigurosas con el gen que se ha mencionado anteriormente para alteración génica.

Por ejemplo, el gen ach puede alterarse preparando un "gen ach de tipo deleción" en el que se elimina una

65 secuencia parcial del gen ach para que no se produzca acetil-CoA hidrolasa de funcionamiento normal, transformando una bacteria corineforme con un ADN que contiene el gen ach de tipo deleción para causar una recombinación entre el gen ach de tipo deleción y el gen ach en un cromosoma. Dicha alteración génica mediante sustitución génica utilizandola recombinación homóloga ya está establecida e incluye un procedimiento que emplea un ADN lineal o un procedimiento que emplea un plásmido que contiene un origen de replicación sensible a la temperatura (patente de Estados Unidos 6.303.383 o JP-A-05-007491). La alteración génica mediante sustitución génica utilizando recombinación homóloga también puede realizarse usando un plásmido que no puede replicarse en bacterias corineformes. Se usa preferiblemente un plásmido que no puede replicarse en bacterias corineformes pero puede replicarse en la bacteria Escherichia. Los ejemplos de un plásmido de este tipo incluyen pHSG299 (Takara Bio) y pHSG399 (Takara Bio).

Un gen cromosómico ach puede reemplazarse con un gen ach de tipo deleción, por ejemplo, medianterecombinación homóloga usando sacB (Schafer, A. y col., Gene 145 (1994) 69-73). El gen sacB codifica una levanosacarasa y se usa para seleccionar de forma eficaz cepas en las que un gen cromosómico diana se reemplaza por ungen mutante y una porción de vector se extrae a partir de un cromosoma.

En primer lugar, se prepara un plásmido recombinante insertando un gen ach (mutante) de tipo deleción, ungen sacB, y un marcador de selección, tal como un gen resistente a cloranfenicol en un plásmido que contiene un origende replicación sensible a la temperatura. El plásmido obtenido se introduce en una cepa hospedadora de la bacteria corineforme. Cuando se expresa levano sacarasa en células de la bacteria corineforme, el levano generado por la conversión de sacarosa se vuelve letal para la bacteria y, por consiguiente, la bacteria no puede crecer en un medio que contenga sacarosa. Por lo tanto, mediante el cultivo en una placa que contiene sacarosa, pueden seleccionarse cepasen las que tenga lugar la sustitución entre el gen ach mutante en el plásmido y un gen ach cromosómico y a partir de las cuales se extraen otras porciones del plásmido desde la célula.

Los ejemplos del gen sacB incluyen los que se indican a continuación.

Bacillus subillus: sacB, número de acceso a GenBank X02730 (SEQ ID NO: 19)

Bacillus amyloliqufaciens: sacB, número de acceso a GenBank X52988

Zymomonas mobilis: sacB, número de acceso a GenBank L33402.

Bacillus stearothermophilus: surB, número de acceso a GenBank U34874

Lactobacillus sanfranciscensis: frfA, número de acceso a GenBank AJ508391

Acetobacterxylinus: IsxA, número de acceso a GenBank AB034152

Gluconacetobacter diazotrophicus: IsdA, número de acceso a GenBank L41732.

La transformación puede realizarse mediante procedimientos convencionales. Por ejemplo, puede emplearseun procedimiento de tratamiento de células receptoras con cloruro de calcio para aumentar la permeabilidad del ADN,que se ha reseñado para Escherichia coli (Mandel, M. y Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), y un procedimiento deluso de células competentes preparadas a partir de células en crecimiento para introducir un ADN, que se ha reseñado para Bacillus subtilis (Duncan, C.H., Wilson, G.A. y Young, F.E., Gene, 1, 153 (1977)). Además de estos procedimientos, puede realizarse la introducción de un ADN recombinante en células receptoras similares a protoplastos

o esferoplastos, que se ha reseñado que puede aplicarse a Bacillus subtilis, actinomicetos y levaduras (Chang, S. y Choen, S.N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M.J., Ward, J.M. y Hopwood, O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J.B. y Fink, G.R., Proc. Natl. Sci. USA, 75, 1929 (1978)). Además, la transformación de la bacteria Coryneform también puede realizarse mediante el procedimiento del impulso eléctrico (Sugimoto y col., documento JP2207791A).

Los ejemplos de plásmidos sensibles a la temperatura para las bacterias corineformes incluyen p48K y pSFKT2(documento EP1038966), pHSC4 (publicación de patente francesa abierta a consulta por el público nº 2667875, 1992 y JP5-7491A), pBS5T, y así sucesivamente. En las bacterias corineformes, estos plásmidos pueden replicarse de forma autónoma al menos a una temperatura de 25 ºC, pero no pueden replicarse de forma autónoma a una temperatura de 37 ºC. La cepa AJ12571 que alberga pHSC4 se depositó en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial, Ministerio de Comercio e Industria Internacional “National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Internacional Trade and Industry” (actualmente Depositario del Organismo Internacional de Patentes, Instituto Nacional de Ciencia y TecnologíaIndustrial Avanzada “International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology” en Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-5466, Japón) el 26 de agosto de 1991 según las estipulaciones del Tratado de Budapest y se le dio un número de acceso FERM BP-3524.

La cepa transformante se cultiva a una temperatura a la que el origen de replicación sensible a la temperaturano funciona (por ejemplo, 25 ºC) para obtener una cepa en la que se ha introducido el plásmido. Después, el transformante se cultiva a alta temperatura para extraer el plásmido sensible a la temperatura, y se siembra en un mediode placas que contiene un fármaco antibiótico tal como kanamicina. Aunque las cepas a partir de las cuales se extrae el plásmido no pueden crecer en una placa que contenga un fármaco antibiótico de este tipo, pueden crecer unas pocascepas en las que el gen ach cromosomal se reemplaza por el gen ach mutante y aparecer como colonias.

En una cepa en la que se integra el ADN recombinante que contiene el gen ach mutante en el ADN cromosómico, el ADN recombinante provoca la recombinación con el gen ach que existía originalmente en el cromosoma, y se insertan los genes de fusión del gen ach cromosómico y el gen ach mutante en el cromosoma paraque las otras porciones del ADN recombinante (segmento del vector, origen de replicación sensible a la temperatura y marcador de resistencia a fármacos) estén presentes entre los genes de fusión. Después, con el objeto de dejarúnicamente el gen ach mutante en el ADN cromosómico, se elimina una copia del gen ach junto con el segmento delvector (incluyendo el origen de replicación sensible a la temperatura y el marcador de resistencia a fármacos) del ADN cromosómico. En este caso, el gen ach normal se deja en el ADN cromosómico y el gen ach mutante se extirpa del ADNcromosómico, o al contrario, el gen ach mutante se deja en el ADN cromosómico y el gen ach normal se extirpa del ADNcromosómico. Después, puede seleccionarse una cepa en la que el únicamente permanece el gen ach mutante en el cromosoma usando PCR, hibridación Southern, o similares.

El descenso en la actividad de acetil-CoA hidrolasa también puede conseguirse modificando una secuencia reguladora de la expresión, tal como un promotor, una secuencia Shine-Dalgarno (SD), operadora, terminadora yatenuadora. Puede identificarse una secuencia reguladora de la expresión en un cromosoma mediante un software de

5 análisis de genes tal como Genetix, mediante vectores para el análisis de expresión, tal como un vector de búsqueda de promotor y mediante información conocida, tal como a partir de la base de datos de Genbank. Por ejemplo, los ejemplos de mutaciones que disminuyen la actividad de acetil-CoA hidrolasa incluyen una mutación que modifica una región promotora del gen de acetil-CoA hidrolasa para que sea menos potente y una mutación que altera una secuenciaconsenso en una región promotora de acetil-CoA hidrolasa. Dichas mutaciones pueden introducirse usando plásmidossensibles a la temperatura o vectores suicidas que no pueden replicarse en una célula hospedadora.

El descenso de la actividad de acetil-CoA hidrolasa también puede conseguirse introduciendo sustitucionesaminoacídicas (mutación finalizadora) en una región codificante del gen de acetil-CoA hidrolasa en un cromosoma, introduciendo un codón de terminación (mutación de aminoácido), introduciendo una mutación con desplazamiento demarco mediante el cual se añaden o eliminan uno o dos nucleótidos, o eliminando una parte del gen (Journal of

15 Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)).

Los ejemplos de un procedimiento para disminuir la actividad de acetil-CoA hidrolasa incluyen también unprocedimiento de tratamiento de bacterias corineformes con radiación ultravioleta o con un mutágeno usado en untratamiento de mutación ordinario, tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) y ácido nitroso, para seleccionar las cepas que tienen actividad de acetil-CoA hidrolasa disminuida ("Amino Acid Fementation", Center for Academic Publications Japan Co., Ltd., 1ª ed. publicada el 30 de mayo de 1986, págs. 77 a 100).

Mientras tanto, se usan preferiblemente en la presente invención cepas modificadas adicionalmente parapotenciar la actividad de glutamato deshidrogenasa (en lo sucesivo en este documento, denominada como "GDH").

Para amplificar la actividad de GDH en una bacteria corineforme que tiene la capacidad de producir Laminoácidos y que se ha modificado para disminuir la actividad de ACH, se liga un fragmento génico que codifica GDH

25 con un vector que funciona en las bacterias corineformes, preferiblemente con un vector del tipo copia múltiple para preparar un ADN recombinante, y se transforma la bacteria corineforme con el ADN resultante. Como resultado de unaumento en el número de copias de un gen que codifica GDH en las células de los transformantes, se amplifica laactividad de GDH.

El gen que codifica GDH puede derivar de bacterias corineformes o puede derivar de otros organismos tales como Escherichia coli.

La secuencia nucleotídica del gen que codifica GDH de bacterias corineformes (gen gdh) ya se ha identificado (por ejemplo, SEQ ID NO: 25: Molecular Microbiology (1992) 6(3), 317-326 1999, una hebra complementaria de 2194739..2196082 de NC_003450), de modo que el gen gdh puede obtenerse por PCR usando cebadores diseñados basándose en la secuencia nucleotídica y el ADN cromosómico de bacterias corineformes como molde (PCR: reacción

35 en cadena de la polimerasa; White, T.J. y col.; Trends Genet. 5, 185 (1989)). Los genes que codifican GDH de otros microorganismos también pueden obtenerse de la misma manera.

<3> Producción de L-aminoácidos usando bacterias corineformes de la presente invención

Pueden producirse de forma eficaz L-aminoácidos generados usando ácido pirúvico como intermedio cultivando las bacterias corineformes obtenidas como se ha descrito anteriormente en un medio para producir y causar la acumulación de dichos L-aminoácidos, y recogiendo dichos L-aminoácidos del medio.

Para producir dichos L-aminoácidos usando las bacterias corineformes de la presente invención, puederealizarse un cultivo mediante un procedimiento convencional con un medio ordinario que contenga una fuente decarbono, una fuente de nitrógeno, sales inorgánicas y una cantidad traza de nutrientes orgánicos, tales comoaminoácidos y vitaminas, si se requieren. Puede usarse un medio sintético o natural. Las fuentes de carbono y nitrógeno

45 usadas en el medio de cultivo pueden ser de cualquier tipo siempre que puedan utilizarse por la cepa de la presente invención.

Los ejemplos de fuentes de carbono incluyen azúcares, tales como glucosa, glicerol, fructosa, sacarosa, maltosa, manosa, galactosa, hidrolizados de almidón y melazas. Además, pueden usarse ácidos orgánicos, tales comoácido cítrico y malato, y alcoholes, tales como etanol, solos o en combinación con otras fuentes de carbono.

Los ejemplos de fuentes de nitrógeno incluyen amonio, sales de amonio, tales como sulfato de amonio,carbonato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio y acetato de amonio, y nitratos.

Los ejemplos de nutrientes orgánicos que pueden estar presentes en cantidades traza incluyen aminoácidos, vitaminas, ácidos grasos y ácidos nucleicos, y también pueden utilizarse peptona, casaminoácidos, extractos de levadura, e hidrolizado de proteína de semilla de soja que contienen estos nutrientes. En el caso de que se usen cepas

55 mutantes autotróficas de nutrientes que requieran aminoácidos y similares para el crecimiento, es preferible suplementar los nutrientes requeridos.

Los ejemplos de sales inorgánicas incluyen fosfatos, sales de magnesio, sales de calcio, sales de hierro y salesde manganeso.

El cultivo se realizó en condiciones aeróbicas a una temperatura de fermentación de 20 a 45 ºC, ajustando elpH a entre 5 y 9. Si el pH disminuye durante el cultivo, pueden añadirse carbonato de calcio o una base tal como gasamoniaco al medio para su neutralización. El cultivo de aproximadamente 10 a 120 horas da como resultado la

acumulación de cantidades considerables de L-aminoácidos.

Los L-aminoácidos se recogen del medio después de que se complete el cultivo mediante un procedimiento derecuperación conocido. Por ejemplo, después de la retirada de las células de la disolución del cultivo, los L-aminoácidosse recogen mediante concentración y cristalización.

EJEMPLOS

En lo sucesivo en este documento, la presente invención se explica más específicamente por medio de lossiguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1

<1> Construcción del vector de alteración que porta el gen sacB

(A)

Construcción de pBS3

Se obtuvo un gen sacB (SEQ ID NO: 19) mediante PCR usando un ADN cromosómico de Bacillus subtilis como molde y oligonucleótidos de las SEQ ID NO: 1 y 2 como cebadores. La PCR se realizó usando LA taq (fabricadapor TaKaRa) como se indica a continuación: un ciclo de retención térmica a 94 ºC durante 5 minutos; y 25 ciclos dedesnaturalización a 94 ºC durante 30 segundos, asociación a 49 ºC durante 30 segundos, y elongación a 72 ºC durante2 minutos. El producto de PCR obtenido se purificó mediante un procedimiento convencional, después se digirió conBglll y BamHI dando extremos romos. El fragmento se insertó en pHSG299, que se había digerido con AvaII dandoextremos romos. El ADN obtenido se usó para transformar células competentes de Escherichia coli JM109 (fabricadaspor TAKARA BIO INC.). Después, las células bacterianas transformadas se sembraron en un medio de LB agar quecontenía 25 !g/ml de kanamicina (en lo sucesivo en este documento, abreviada como "Km") y se incubó durante una noche. Después de esto, se aislaron colonias individuales como transformantes. Los plásmidos se extrajeron de lostransformantes obtenidos y el plásmido que tenía un inserto del producto de PCR objetivo se denominó pBS3. La Fig. 1 muestra el procedimiento de construcción de pBS3.

(B)

Construcción de pBS4S

El sitio de reconocimiento SmaI en el gen resistente a kanamicina en pBS3 se modificó por sustituciónnucleotídica usando PCR de cruzamiento sin provocar la sustitución aminoacídica, para que el pBS3 no se corte por laendonucleasa SmaI. En primer lugar, se realizó el análisis por PCR usando pBS3 como molde y ADN sintético de las SEQ ID NO: 3 y 4 como cebador, para obtener de esta manera un fragmento N-terminal del gen resistente akanamicina. Por otro lado, para obtener un fragmento C-terminal del gen resistente a kanamicina, se realizó una PCRusando pBS3 como molde y ADN sintético de las SEQ ID NO: 5 y 6 como cebador. Se realizó la PCR usando ADNpolimerasa Pyrobest (fabricada por TAKARA BIO Inc.) como se indica a continuación: un ciclo de retención térmica a 98ºC durante 5 minutos; y 25 ciclos de desnaturalización a 98 ºC durante 10 segundos, asociación a 57 ºC durante 30 segundos, y elongación a 72 ºC durante 1 minuto, para obtener el producto de PCR objetivo. Las SEQ ID NO: 4 y 5 son complementarias parcialmente entre sí y no contienen el sitio de reconocimiento SmaI. Después, para obtener un fragmento completo del gen mutante resistente a kanamicina sin el sitio de reconocimiento SmaI, se mezclaron los productos génicos N-terminal y C-terminal que se han mencionado anteriormente en cantidades sustancialmente equimolares. Se realizó la PCR usando los productos génicos como matriz y ADN sintético de las SEQ ID NOS: 3 y 6como cebador para obtener un fragmento del gen resistente a kanamicina de sitio SmaI modificado. Se realizó la PCRusando ADN polimerasa Pyrobest (fabricada por TAKARA BIO Inc.) como se indica a continuación: un ciclo de retencióntérmica a 98 ºC durante 5 minutos; y 25 ciclos de desnaturalización a 98 ºC durante 10 segundos, asociación a 57 ºC durante 30 segundos, y elongación a 72 ºC durante 1,5 minutos, para obtener de esta manera el producto de PCRobjetivo.

El producto de PCR se purificó mediante un procedimiento convencional, después se digirió con BamII ydespués se insertó en el sitio de reconocimiento BamII que se ha descrito anteriormente de pBS3. El plásmido resultante se usó para transformar células competentes de Escherichia coli JM109 (disponibles en Takara Bio). Es decir,las células bacterianas transformadas se sembraron en un medio de LB agar que contenía 25 !g/ml de kanamicina y seincubaron durante una noche. Después de esto, se seleccionaron colonias que aparecieron como transformantes. Los plásmidos se aislaron a partir de los transformantes obtenidos y el plásmido que tenía un inserto del producto de PCR objetivo se nombró pBS4S. La Fig. 2 muestra el procedimiento para construir pBS4S.

(C) Construcción de pBS5T

Se eliminó un origen de replicación sensible a la temperatura en la bacteria corineforme de pHSC4 (documento JP-A-5-7491) digiriéndolo con BamHI y SmaI y dando extremos romos, y se insertó en el sitio NdeI de extremo romo de pBS4S. Usando el ADN resultante, se transformaron células competentes de Escherichia coli JM109 (fabricadas por TAKARA, BIO INC.) y se sembraron en un medio de LB agar que contenía 25 !g/ml de Km, seguido de cultivo durante una noche. Después, se aislaron colonias individuales como transformantes. Los plásmidos se extrajeron de lostransformantes obtenidos y un plásmido que tenía un inserto del producto de PCR objetivo se nombró pBS5T. La Fig. 3 muestra un procedimiento de construcción de pBS5T.

Ejemplo 2

<Construcción de la cepa con Idh alterado>

(A) Clonación de un fragmento para alterar el gen de lactato deshidrogenasa

Se obtuvo un fragmento génico que contenía lactato deshidrogenasa (en lo sucesivo en este documento, abreviado como "gen Idh") obtenido a partir de la cepa Brevibacterium lactofermentum 2256 que tenía el ORF eliminadopor PCR de cruzamiento usando ADN sintéticos diseñados basándose en la secuencia nucleotídica del gen ldh de la cepa Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (SEQ ID NO: 21: nº de acceso a la base de datos de GenBankNC_003450), como cebador. Específicamente, la PCR se realizó mediante un procedimiento convencional usando un

5 ADN cromosómico de la cepa Brevibacterium lactofermentum 2256 como molde y el ADN sintético de las SEQ ID NOS: 7 y 8 como cebador, obteniéndose el fragmento N-terminal del gen ldh. Por otro lado, para obtener un fragmento Cterminal del gen Idh, se realizó una PCR mediante un procedimiento convencional usando el ADN cromosómico de la cepa Brevibacterium lactofermentum 2256 como molde y ADN sintético de las SEQ ID NOS: 9 y 10 como cebador. Las SEQ ID NOS: 8 y 9 eran complementarias entre sí y se diseñaron para dar como resultado la deleción de toda lasecuencia del ORF del gen ldh.

Después, para obtener un fragmento del gen Idh que tenga una secuencia interna eliminada, se mezclaron los productos génicos N-terminal y C-terminal de Idh en cantidades sustancialmente equimolares y se realizó la PCRmediante un procedimiento convencional usando la mezcla como molde y el ADN sintético de las SEQ ID NO: 11 y 12como cebador. Después de la purificación del producto de PCR de una manera convencional, se digirieron los productos

15 de PCR con SaII. Después de esto, se insertó el producto de PCR en el sitio SaII del pBS4S que se ha mencionado anteriormente. Con el ADN obtenido, se transformaron las células competentes de Escherichia coli (fabricadas por TAKARA BIO INC.) y se sembraron sobre un medio de LB agar que contenía IPTG 100 !M, 40 !g/ml de X-GaI y 25 !g/ml de Km, seguido de cultivo durante una noche. Después de esto, se aislaron colonias individuales como transformantes. Los plásmidos se extrajeron de los transformantes obtenidos, y un plásmido que tenía el inserto delproducto de PCR objetivo se nombró pLldh56-1. La Fig. 4 muestra un procedimiento de construcción del plásmido.

(B) Preparación de la cepa con Idh alterado

Ya que el pLldh56-1 preparado en la sección (A) que se ha descrito anteriormente no contiene una región quepermite la replicación autónoma en las bacterias corineformes, cuando las bacterias corineformes se transforman con elplásmido, las cepas transformantes que tienen el plásmido incorporado al cromosoma por recombinación homóloga

25 aparecen con una frecuencia extremadamente baja. Por lo tanto, la cepa Brevibacterium lactofermentum 2256 se transformó usando una disolución que contenía una alta concentración del plásmido pLldh56-1 mediante el procedimiento de impulso eléctrico, después se sembró en un medio de CM-Dex agar que contenía 25 !g/ml de kanamicina (5 g/l de glucosa, 10 g/l de polipeptona, 10 g/l de extracto de levadura, 1 g/l de KH2PO4, 0,4 g/l deMgSO4·7H2O, 0,01 g/l de FeSO4-7H2O, 0,01 g/l de MnSO4·7H2O, 3 g/l de urea, 1,2 g/l de hidrolizados de semilla de sojay a pH 7,5 (KOH)), y se cultivó a 31,5 ºC durante aproximadamente 30 horas. Las colonias que aparecieron en este medio eran cepas en las que se había producido la recombinación homóloga entre el fragmento del gen Idh delplásmido y el gen Idh en el cromosoma de la cepa Brevibacterium lactofermentum 2256, y se insertaron en el cromosoma el gen resistente a kanamicina y el gen SacB obtenido a partir del plásmido.

Después, estos primeros recombinantes se cultivaron en un medio líquido CM-Dex que no contenía kanamicina

35 a 31,5 ºC durante una noche. Después de la dilución apropiada, los recombinantes se sembraron en un medio de Dex-S10 agar que contenía 10% de sacarosa (10 g/l de sacarosa, 10 g/l de polipeptona, 10 g/l de extracto de levadura, 1 g/lde KH2PO4, 0,4 g/l de MgSO4·7H2O, 0,01 g/l de FeSO4·7H2O, 0,01 g/l de MnSO4·4H2O, 3 g/l de urea, 1,2 g/l de hidrolizados de semilla de soja, 10 !g/l de biotina y a pH 7,5 (KOH)) y se cultivaron a 31,5 ºC durante aproximadamente 30 horas. Como resultado, se obtuvieron aproximadamente 50 cepas a partir de las cuales se extrajo el gen sacB mediante una segunda recombinación y que tenían insensibilidad a la sacarosa.

Las cepas obtenidas de esta manera incluyen cepas en las que el gen cromosómico ldh se reemplaza por untipo mutante derivado de pLldh56-1, y cepas en las que permaneció el gen cromosómico ldh de tipo natural. Secomprobó fácilmente si el gen ldh era de tipo mutante o de tipo natural sometiendo las células obtenidas a cultivo enmedio Dex-S10 agar para PCR directa. Usando cebadores (SEQ ID NO: 7 y 10) para la amplificación por PCR para

45 analizar el gen Idh, se seleccionó como una cepa con Idh alterado una cepa cuyo producto de PCR es menor que el del gen ldh de tipo natural que se había amplificado usando el ADN cromosómico de la cepa 2256 de tipo natural comomolde, y se nombro cepa 2256L(ldh). Esta cepa se usó como cepa de partida para preparar la siguiente cepa de gen ach alterado.

Cuando se realiza la fermentación en condiciones anaeróbicas, se acumula una cantidad considerable de ácido láctico como subproducto, por lo que es preferible que la actividad de lactato deshidrogenasa sea deficiente (documentos JP11-206385; J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2004; 7(4): 182-96). Sin embargo, el L-ácido glutámico se produce normalmente en condiciones aeróbicas en las que la lactato deshidrogenasa no funciona, y no es necesario alterar el gen ldh en las cepas de gen de acetil-CoA hidrolasa alterado para la producción de L-ácido glutámico.

Ejemplo 3

55 <Construcción de una cepa de gen de acetil-CoA hidrolasa alterado>

(A) Clonación de un fragmento para alterar el gen de acetil-CoA hidrolasa

Se obtuvo un fragmento génico que contenía el gen de acetil-CoA hidrolasa (en lo sucesivo en este documento,el gen se denomina "ach") derivado de la cepa Brevibacterium lactofermentum 2256 que tenía el ORF eliminadomediante PCR de cruzamiento usando ADN sintético diseñado basándose en la secuencia nucleotídica del gen deCorynebacterium glutamicum ATCC13032 (SEQ ID NO: 23: nº de acceso a la base de datos GenBank NC-003450). Específicamente, la PCR se realizó mediante un procedimiento convencional usando el ADN cromosómico de la cepaBrevibacterium lactofermentum 2256 como molde y el ADN sintético de las SEQ ID NO: 13 y 14 como cebador paraobtener el fragmento C-terminal del gen ach. Por otro lado, para obtener un fragmento N-terminal, se realizó el análisis por PCR mediante un procedimiento convencional usando el ADN cromosómico de la cepa Brevibacterium65 lactofermentum 2256 como molde y ADN sintético de las SEQ ID NO: 15 y 16 como cebador. Las SEQ ID NO: 14 y 15 eran parcialmente complementarias entre sí. Se realizó una reacción por PCR usando KOD-plus (fabricado por

TOYOBO Co., LTD.). Después de realizar 1 ciclo de retención a 94 ºC durante 2 minutos, se repitió lo siguiente durante30 ciclos: un ciclo de desnaturalización a 94 ºC durante 10 segundos, asociación a 55 ºC durante 30 segundos, yelongación a 68 ºC durante 50 segundos. Después, para obtener un fragmento del gen ach que tenía una secuencia interna eliminada, se mezclaron el fragmento N-terminal y el fragmento C-terminal del gen ach en cantidades sustancialmente equimolares. El análisis por PCR se realizó mediante un procedimiento convencional usando la mezcla como de molde y el ADN sintético de las SEQ ID NO: 17 y 18 como cebador. Se realizó una reacción por PCR usandoKOD-plus (fabricado por TOYOBO Co., LTD.). Después de realizar 1 ciclo de retención a 94 ºC durante 2 minutos, elsiguiente ciclo se repitió durante 30 ciclos: desnaturalización a 94 ºC durante 10 segundos, asociación a 55 ºC durante30 segundos y elongación a 68 ºC durante 90 segundos. Después de la purificación del producto amplificado por PCR de una manera convencional, se digirieron los productos de PCR con XbaI y se insertaron en el sitio XbaI de pBS4S construido en el ejemplo 1 (B) anterior. Con el ADN resultante, las células competentes de Escherichia coli JM109 (fabricado por TAKARA BIO INC.) se transformaron y se sembraron en un medio de LB agar que contenía IPTG 100!M, 40 !g/ml de X-GaI y 25 !g/ml de Km, seguido de cultivo durante una noche. Después de esto, se aislaron coloniasblancas individuales como transformantes. Los plásmidos se extrajeron de los transformantes y uno que tenía un inserto del producto de PCR objetivo se nombró pBS4S::Lach. La Fig. 5 muestra un procedimiento para construir pBS4S::Lach.

(B) Preparación de la cepa con ach alterado

Ya que el pBS4S::Lach que se ha preparado en la sección (A) anterior no contiene una región que permita lareplicación autónoma en células de bacterias corineformes, cuando las bacterias corineformes se transforman con elplásmido, las cepas con el plásmido incorporado a su cromosoma por recombinación homóloga aparecen como transformantes en una frecuencia extremadamente baja. Por lo tanto, se transformó la cepa Brevibacterium lactofermentum 2256 L(ldh) usando una disolución que contenía una alta concentración del plásmido pBS4S::Lach mediante el procedimiento de impulso eléctrico, se sembró en un medio CM-Dex agar que contenía 25 !g/ml dekanamicina y se cultivó a 31,5 ºC durante aproximadamente 30 horas. Las cepas que aparecieron en este medio erancepas en las que aparecía recombinación homóloga entre el fragmento del gen ach de tipo deleción del plásmido y el gen ach en el cromosoma de la cepa Brevibacterium lactofermentum 2256 L(ldh), y en las que se insertaron en el cromosoma el gen resistente a kanamicina y el gen SacB derivado del plásmido.

Después, estos primeros recombinantes se cultivaron en un medio líquido CM-Dex que no contenía kanamicinaa 31,5 ºC durante una noche. Después de la dilución apropiada, los recombinantes se sembraron sobre un medio Dex-S10 agar que contenía sacarosa al 10% y se cultivaron a 31,5 ºC durante aproximadamente 30 horas. Como resultado,se obtuvieron aproximadamente 50 cepas a partir de las cuales se extrajo el gen SacB del cromosoma mediante unasegunda recombinación y que se habían vuelto insensibles a la sacarosa.

Las cepas obtenidas de esta manera incluyen las cepas en las que el gen ach cromosómico se reemplaza porun tipo de mutante derivado de pBS4S::Lach y aquellas cepas en las que permanece el gen ach cromosómico de tiponatural. Se confirmó fácilmente si el gen ach era de tipo mutante o de tipo natural sometiendo las células obtenidas mediante cultivo en un medio Dex-S10 agar PCR directa. Tras el análisis del gen ach usando cebadores (SEQ ID NO: 13 y 16), se amplificaron un fragmento de ADN de 2,9 kb para un gen ach de tipo natural y un fragmento de ADN de 1,4kb para un gen ach de tipo mutante. Como resultado del análisis de las cepas insensibles a sacarosa mediante elprocedimiento que se ha mencionado anteriormente, se seleccionaron las cepas que contenían únicamente un gen achde tipo mutante, y la cepa con ach alterado derivada de la cepa 2256 L(ldh) se denominó cepa 2256 L(ldh, ach).

Ejemplo 4

<Producción de L-ácido glutámico mediante la cepa con ach alterado>

(1) Evaluación de la capacidad productora de L-ácido glutámico de la cepa con ach alterado

Se cultivaron la cepa Brevibacterium lactofermentum 2256 L(ldh) y la cepa 2256 L(ldh, ach) para la producciónde L-ácido glutámico en un matraz de tipo S como se indica a continuación. Se inoculó un asa de cada cepa 2256 L(ldh) y 2256 L(ldh, ach), que se habían cultivado en una placa de CMDex agar, en 300 ml de medio de siembra (60 g de glucosa, 1,54 g de H3PO4, 1,45 g de KOH, 0,9 g de MgSO4·7H2O, 0,01 g de FeSO4·7H2O, 670 !g de VB1·HCI, 40 !gdebiotina, 1,54 g de hidrolizados de semilla de soja, 0,28 g de DL-metionina, 0,1 ml de AZ-20R por 1 litro de agua purificada (ajustada a pH 7,2 con amoniaco-agua)), y se cultivó con aireación a 1/1 vvm hasta que el azúcar residual sehabía consumido completamente mientras se controlaba el pH a 7,2 (NH3), la temperatura a 31,5 ºC y PL>0.

Se inocularon 30 ml del caldo de cultivo en 270 ml del medio de cultivo principal (80 g de glucosa, 3,46 g de KH2PO4, 1 g de MgSO4·7H2O, 0,01 g de FeSO4·7H2O, 0,01 g de MnSO4·4-5H2O, 230 !g de VB1·HCI, 0,35 g de hidrolizados de semilla de soja, y 0,2 ml de AZ-20R por 1 litro de agua purificada (ajustada a pH 7,3 con amoniaco)) y secultivó con aireación a 1/1 vvm mientras se controlaba la temperatura a 31,5 ºC, el pH a 7,3 y PL>0. Antes de que elazúcar residual se consumiera por completo, se añadieron de 70 a 80 ml de una solución de alimentación compuesta de500 g de glucosa y 0,2 ml de AZ-20R por 1 l de agua purificada, y se continuó el cultivo hasta que el azúcar residual se había consumido por completo.

Después de que el cultivo se completara, se analizó la cantidad de L-ácido glutámico (Glu) que se habíaacumulado en el caldo de cultivo en un Biotech Analyzer AS210 (fabricado por Asahi Kasei Corporation.) después de ladilución apropiada del caldo de cultivo. La Tabla 1 muestra los resultados.

Tabla 1. Producción de L-ácido glutámico mediante una cepa deficiente en ach DO620 nm Cepa Azúcar consumido (g) Glu (g/l) Rendimiento de Glu (%) a-KG (g/l)(x 101) 2256 L (ldh) 0,720 60,1 87,8 51,8 2,66 2256 L (ldh, ach) 0,629 63,6 93,6 53,9 8,45

La cepa 2256 L(ldh, ach) mostró aproximadamente una mejora del 2% en el rendimiento en comparación con la cepa 2256 L(ldh) (la cepa de partida). Además, la cantidad de a-cetoglutarato (a-KG), que es un precursor de L-ácido 5 glutámico, que se había acumulado mejoró aproximadamente tres veces. Los resultados mostraron que la eliminación o

disminución de la actividad de ACH es eficaz en la producción de L-ácido glutámico.

Ejemplo 5

<Producción de L-alanina y L-valina mediante una cepa deficiente en ach >

(1) Evaluación del cultivo de la cepa deficiente en ach

10 Se cultivaron la cepa Brevibacterium lactofermentum 2256 L(ldh) y la cepa 2256 L(ldh, ach) para la producción de L-alanina y L-valina en un matraz de tipo S como se indica a continuación. Se inoculó un asa de cada cepa 2256 L(ldh) y 2256 L(ldh, ach), que se habían cultivado en una placa de CMDex agar, en 300 ml de un medio de cultivo (60 g de glucosa, 1,54 g de H3PO4, 1,45 g de KOH, 0,9 g de MgSO4·7H2O, 0,01 g de FeSO4·7H2O, 670 !g de VB1-HCI, 40 !gde biotina, 1,54 g de hidrolizados de semilla de soja, 0,28 g de DL-metionina, 0,1 ml de AZ-20R por 1 litro de agua

15 purificada (ajustada a pH 7,2 con amoniaco-agua)), y se cultivó con aireación a 1/1 vvm hasta que el azúcar residual se había consumido completamente, mientras que se mantuvo el pH a 7,2 con amoniaco, la temperatura a 31,5 ºC y PL>0.

Se inocularon 30 ml del caldo de cultivo en 270 ml del medio de cultivo principal (80 g de glucosa, 3,46 g de KH2PO4, 1 g de MgSO4·7H2O, 0,01 g de FeSO4·7H2O, 0,01 g de MnSO4·4-5H2O, 230 !g de VB1-HCI, 0.35 g de hidrolizados de semilla de soja y 0,2 ml de AZ-20R por 1 litro de agua purificada (ajustada a pH 7,3 con amoniaco)) y se

20 cultivó con aireación a 1/1 vvm mientras se controlaba la temperatura a 31,5 ºC, el pH a 7,3 y PL>0. Antes de que el azúcar residual se consumiera por completo, se añadieron de 70 a 80 ml de una solución de alimentación compuesta de500 g de glucosa y 0,2 ml de AZ-20R por 1 l de agua purificada y se continuó el cultivo hasta que el azúcar residual sehabía consumido por completo.

Después de que el cultivo se completara, se analizó la cantidad de L-alanina (Ala) y L-valina (Val) que se había25 acumulado en el caldo de cultivo con un Amino Acid Analyzer L8500 (fabricado por Hitachi, Ltd.) después de la dilución apropiada del caldo de cultivo. La Tabla 2 muestra los resultados.

Tabla 2. Producción de Ala y Val por una cepa deficiente en ach

DO620 nm Cepa Ala (g/l) Val (g/l) (x 101)

2256 Lldh 0,72 1,149 0,052

2256 LldhLach 0,629 2,533 0,214

La 2256 L(ldh, ach) mostró una mejora de aproximadamente 2,2 veces de la cantidad de L-alanina acumulada,30 y aproximadamente una mejora de cuatro veces de la cantidad de L-valina acumulada. Los resultados mostraron que la eliminación o descenso de la actividad de ACH es eficaz en la producción de L-valina y L-alanina.

APLICABILIDAD INDUSTRIAL

De acuerdo con la presente invención, se mejora el rendimiento de la fermentación de los L-aminoácidosgenerados por ruta biosintética usando ácido pirúvico como intermedio.

35 LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Ajinomoto Co., Inc.

<120> BACTERIA PRODUCTORA DE L-AMINO�?CIDOS Y PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR L-AMINO�?CIDOS

<130> C537-C5225

<150> documento JP2004-340187 40 <151>

<160> 26

<170> PatentIn versión 3.1

<210> 1

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 1

cgggatcctt tttaacccat caca

24

<210> 2

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 2

gaagatcttc aaaaggttag gaatacggt

29

<210> 3

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 3

ccttttgaag atcgaccagt tgg

23

<210> 4

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 4

tacctggaat gctgttttcc cagggatcgc agtggtgagt aacc

44

<210> 5 <213> Secuencia Artificial <400> 13

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 5

cctgggaaaa cagcattcca ggtattag

28

<210> 6

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 6

tgcaggtcga ctctagagga tcc

23

<210> 7

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 7

cactgcacgg ccctgcgaac

20

<210> 8

<211> 42

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 8

cgccaactag gcgccaaaaa ttcctgattt ccctaaccgg ac

42

<210> 9

<211> 42

<212> ADN

<220>

<223> cebadores

<400> 9

gtccggttag ggaaatcagg aatttttggc gcctagttgg cg

42

<210> 10

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 10

tgtgggcctt cggcgaggac

20

<210> 11

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 11

gagtcgaccg caccccattt ttcata

26

<210> 12

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 12

tggtcgacgt gaatgctcgg cgggatcc

28

<210> 13

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

gcttctgcgc aaagcaagcc tccg

24

<210> 14

<211> 50

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 14

gtccgattac ctgaggaggt attcccatga aggcataagt tttttcttgg

50

<210> 15

<211> 50

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 15

ccaagaaaaa acttatgcct tcatgggaat acctcctcag gtaatcggac

50

<210> 16

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 16

ggtcatgtgc atggttttct cattgc

26

<210> 17

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 17

ggcctctaga cctgcaccga tcaggatgag tgg

33

<210> 18

<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

5 <220>

<223> cebador

<400> 18 gcgctctaga ctcaacaaga gcacgcgcag tcacc 35

10 <210> 19

<211> 2014

<212> ADN

<213> Bacillus subtilis

<220>

15 <221> CDS

<222> (464).. (1882)

<223>

<400> 19

<210> 20

<211> 473

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 20

<210> 21

<211> 2820

<212> ADN 5 <213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> CDS

<222> (898).. (1851)

<223>

10 <400> 21

<210> 22

<211> 318

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 22 <210> 23

<211> 3600

<212> ADN 5 <213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> CDS

<222> (1037) .. (2542)

<223>

10 <400> 23

<210> 24

<211> 502

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 24 <210> 25

<211> 2037

<212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> CDS

<222> (573) .. (1913)

5 <223>

<400> 25

<210> 26

<211> 447

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 26

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una bacteria corineforme que tiene la capacidad de producir L-aminoácidos, en la que dicha bacteriacorineforme está modificada para que la actividad de acetil-CoA hidrolasa disminuya en comparación con una cepa detipo natural o no modificada como resultado de una mutación en la región codificante o una región reguladora de laexpresión de un gen cromosómico de acetil-CoA hidrolasa, o como resultado de la alteración del gen cromosómico deacetil-CoA hidrolasa, y en la que dicho L-aminoácido es uno o más L-aminoácidos generados por ruta biosintéticausando ácido pirúvico como intermedio, en la que dicho gen de acetil-CoA se selecciona entre el grupo que consiste en:

   (A)

   un gen que comprende los nucleótidos 1037 a 2542 de la SEQ ID NO: 23; y

   (B)

   un ADN que puede hibridar en condiciones rigurosas con un polinucleótido que comprende los nucleótidos 1037 a 2542 de la SEQ ID NO: 23, y que codifica una proteína que tiene actividad de acetil-CoA hidrolasa.

2. 2. La bacteria corineforme de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha acetil-CoA hidrolasa se seleccionaentre el grupo que consiste en:

   (A)

   una proteína que comprende una secuencia aminoacídica mostrada en la SEQ ID NO: 24; y

   (B)

   una proteína que comprende una secuencia aminoacídica mostrada en la SEQ ID NO: 24, con lo que uno o variosaminoácidos en dicha proteína están sustituidos, eliminados, insertados o añadidos, y en la que dicha proteína tieneactividad de acetil-CoA hidrolasa.

3. 3.

   La bacteria corineforme de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en la que dicha bacteriacorineforme está modificada adicionalmente para aumentar la actividad de glutamato deshidrogenasa mediante sutransformación con un plásmido que contiene un gen que codifica glutamato deshidrogenasa; integrando dicho gen enun cromosoma por recombinación homóloga, conjugación o transposición; o introduciendo una mutación en una regiónpromotora de dicho gen o sustituyendo por un promotor fuerte.

4. 4.

   La bacteria corineforme de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho Laminoácido es uno o más L-aminoácidos seleccionados entre el grupo que consiste en L-ácido glutámico, L-arginina, Lglutamina, L-prolina, L-alanina, L-valina y L-lisina.

5. 5.

   Un procedimiento para producir un L-aminoácido que comprende: cultivar la bacteria corineforme de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 es un medio y recoger el L-aminoácido del medio, y en el que dicho Laminoácido es uno o más L-aminoácidos generados mediante ácido pirúvico como intermedio.

6. 6.

   El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dichos L-aminoácidos son uno o más aminoácidos seleccionados entre el grupo que consiste en L-ácido glutámico, L-arginina, L-glutamina, L-prolina, Lalanina, L-valina y L-lisina.