ES2376064T3 - La a-amilasa de trichoderma reesei fomenta la sacarificación de almidón de ma�?z. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido aislado que comprende o se compone de (i) los restos 21 a 463 de la SEQ ID NO:3 mostrada en la fig. 7B o (ii) una variante de la α-amilasa de Trichoderma reesei (TrAA), presentando la variante actividad α-amilasa y una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 90% con los restos 21 a 463 de la SEQ ID NO:3 mostrada en la fig. 7B.

Description

La a-amilasa de Trichoderma reesei fomenta la sacarificación de almidón de maíz

ANTECEDENTES

[0001] El jarabe de maíz con alto contenido en fructosa (HFCS) es una forma procesada del jarabe de maíz que presenta un alto contenido en fructosa y un dulzor comparable al del azúcar, lo que hace que el HFCS sea útil como sustituto de azúcar en refrescos y otros alimentos procesados. El HFCS supone actualmente una industria de mil millones de dólares. El proceso de producción de HFCS ha evolucionado a lo largo de los años desde la hidrólisis ácida hasta una secuencia de reacciones catalizadas por enzimas:

(1)

Licuefacción: Las a-amilasas (EC 3.2.1.1) se usan primero para degradar una suspensión de almidón que contiene entre 30 y 40% p/p de sólidos secos (ss) a maltodextranos. Las a-amilasas son endohidrolasas que catalizan la rotura aleatoria de enlaces a-1,4-D-glucosídicos internos. Puesto que la licuefacción se realiza típicamente a temperaturas elevadas, por ejemplo de 90 a 100°C, se prefieren para este paso a-amilasas termoestables, tales como una a-amilasa de Bacillus sp.

(2)

Sacarificación: Habitualmente se usan glucoamilasas y/o a-amilasas maltogénicas para catalizar la hidrólisis de los extremos no reductores de los maltodextranos formados después de la licuefacción, liberando D-glucosa, maltosa e isomaltosa. Se pueden usar enzimas desramificantes, tales como la pululanasa, para apoyar la sacarificación. La sacarificación transcurre típicamente en condiciones ácidas y a temperaturas elevadas, por ejemplo a 60°C y pH 4,3. Las glucoamilasas usadas en este proceso se obtienen típicamente de hongos, por ejemplo la glucoamilasa de Aspergillus niger (AnGA) usada en Optidex® LAOO o la glucoamilasa de Humicola grisea (HgGA). Las a-amilasas maltogénicas usadas actualmente para esta aplicación incluyen amilasas de plantas y la aamilasa de Aspergillus oryzae, el ingrediente activo de Clarase® L. La sacarificación se puede usar para producir jarabes o bien con alto contenido en maltosa o bien ricos en glucosa.

(3)

Isomerización: Un jarabe rico en glucosa se puede procesar posteriormente para producir fructosa si se desean productos más dulces. La isomerización de glucosa a fructosa es catalizada por la glucosa isomerasa y proporciona aproximadamente un 42% (p/v) de fructosa, entre 50 y 52% de glucosa y una mezcla de otros azúcares. Manipulaciones adicionales pueden proporcionar finalmente un HFCS de calidad comercial con un contenido en fructosa del 42%, 55% o 90%, por ejemplo.

[0002] Las a-amilasas y las glucoamilasas se añaden directamente a un lote de procesamiento del jarabe de maíz y no se reutilizan. Las glucosa isomerasa, por otra parte, se inmovilizan en columnas a través de las cuales se pasa la mezcla de azúcares. Las columnas con glucosa isomerasa se reutilizan hasta que las enzimas hayan perdido la mayor parte de su actividad.

[0003] El paso de sacarificación es el paso limitante de la velocidad de producción de HFCS. La sacarificación dura típicamente entre 48 y 72 horas, periodo durante el cual muchas glucoamilasas fúngicas han perdido actividad significativa. Además, aunque se pueden usar tanto las a-amilasas maltogénicas como las glucoamilasas para catalizar la sacarificación, las enzimas trabajan típicamente a diferentes pH y temperaturas óptimos. Por ejemplo, las a-amilasas maltogénicas presentan típicamente un pH óptimo de al menos pH 5,0 y una temperatura óptima inferior a 55°C, mientras que la AnGA presenta típicamente un pH óptimo de pH 4,0 a 4,5 y una temperatura óptima de aproximadamente 60°C. La diferencia en las condiciones de reacción entre las dos enzimas requiere ajustar el pH y la temperatura, lo que ralentiza el proceso global y puede dar lugar a la formación de agregados de amilosa insolubles. Cualquier a-amilasa bacteriana residual se inactivará si se baja el pH; sin embargo, la a-amilasa bacteriana se puede sustituir posteriormente por una a-amilasa estable a ácido.

[0004] De forma ideal, el paso de sacarificación proporciona un jarabe con una composición de aproximadamente 95 a 97% p/p de glucosa, 1 a 2% p/p de maltosa y 0,5 a 2% p/p de isomaltosa. Este jarabe rico en glucosa se puede usar en la reacción de isomerización (paso (3) anterior) o bien se puede usar para la producción de glucosa cristalina. Estas concentraciones tan elevadas de glucosa no son fáciles de conseguir. Por ejemplo, la glucoamilasa de Trichoderma reesei (TrGA) ofrece una actividad específica mejorada en relación con AnGA o HgGA; sin embargo, la TrGA proporciona un producto que presenta típicamente una concentración final de glucosa de aproximadamente 88% p/v. Además, las concentraciones elevadas de glucosa en el jarabe promueven la conversión de glucosa en maltosa y maltotriosa.

[0005] Por consiguiente, existe en la técnica la demanda de un procedimiento mejorado para preparar HFCS que incluya un paso de sacarificación que use una a-amilasa con un pH óptimo y una temperatura óptima compatibles con el uso de glucoamilasas fúngicas. Existe además la demanda de una a-amilasa que pueda catalizar

la sacarificación en menos tiempo. Asimismo existe la demanda de una a-amilasa que pueda lograr estos objetivos produciendo al mismo tiempo, después de la sacarificación, un jarabe que presente una concentración de glucosa de aproximadamente 96% p/p.

RESUMEN

[0006] Estas y otras demandas de la técnica se satisfacen mediante una a-amilasa maltogénica de Trichoderma reesei (TrAA). Se proporcionan la enzima, variantes de la enzima y ácidos nucleicos codificantes. Igualmente se proporcionan células huésped que expresan la TrAA.

[0007] La TrAA se usa ventajosamente en diversos procesos, en particular en la sacarificación de maltodextranos formados después de la licuefacción. En una realización, una TrAA se usa en un proceso de producción de maltosa, bien sola o bien en combinación con otras enzimas, tales como la pululanasa. La TrAA cataliza ventajosamente la producción de maltosa a un pH relativamente bajo y una temperatura elevada, lo que permite el uso de condiciones de reacción compatibles con las glucoamilasas fúngicas, por ejemplo la AnGA. Además, la facilidad con la que se produce la TrAA la hace más económica que las a-amilasas usadas actualmente para la producción de maltosa.

[0008] En otra realización, la TrAA se usa en un proceso de sacarificación que produce una concentración elevada de glucosa. La TrAA suprime ventajosamente la reacción inversa que forma maltooligosacáridos a partir de glucosa, lo que permite alcanzar concentraciones de glucosa en una mezcla de almidón de maíz procesada tan altas como aproximadamente 96% p/v. Además, esta concentración de glucosa se puede alcanzar en menos tiempo que catalizando la reacción con solo una glucoamilasa. En una realización, se añade una glucoamilasa con la TrAA. La glucoamilasa puede ser una glucoamilasa fúngica, tal como TrGA, o se puede añadir una mezcla de glucoamilasas, por ejemplo una combinación de TrGA, HgGA y AnGA.

[0009] Por consiguiente, un objetivo es proporcionar un polipéptido aislado que comprenda (i) los residuos 21 a 463 de la SEQ ID NO:3; o (ii) una variante de la a-amilasa de Trichoderma reesei (TrAA), presentando la variante actividad a-amilasa y al menos una identidad de secuencia de aminoácidos con los residuos 21 a 463 de la SEQ ID NO:3. Por ejemplo, la variante puede presentar entre 1 y 10 sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos en comparación con los residuos 21 a 463 de la SEQ ID NO:3. De forma alternativa, el polipéptido puede comprender la secuencia SEQ ID NO:3 o los residuos 21 a 463 de la SEQ ID NO:3, es decir, la secuencia polipeptídica madura sin la secuencia señal. El polipéptido puede comprender una secuencia señal de una especie distinta de Trichoderma reesei. En una realización, el polipéptido está glucosilado. El polipéptido aislado se puede purificar adicionalmente.

[0010] Otro objetivo es proporcionar un polinucleótido que codifique el polipéptido anterior. El polinucleótido puede comprender la SEQ ID NO:2, es decir, una secuencia de ADNc. También se proporciona un ARNm aislado, en el que los restos T de la SEQ ID NO:2 están sustituidos por restos U (uracilo).

[0011] Otro objetivo es proporcionar un vector que comprenda el polinucleótido anterior y una célula bacteriana que comprenda este vector. También se proporciona una célula huésped que expresa el polinucleótido, siendo la célula huésped en una realización un Trichoderma sp., en particular T. reesei. El huésped puede ser alternativamente un aislado RL-P37, una célula de hongo filamentoso, un Aspergillus sp., un Fusarium sp. o un Penicillium sp. La célula huésped de Aspergillus puede ser Aspergillus nidulans, A. awamori, A. oryzae, A. actileatits,

A. niger o A. japonicus. La célula huésped de Fusarium puede ser Fusarium oxysporum o F. solani. La célula huésped puede expresar adicionalmente un ácido nucleico que codifique una glucoamilasa heteróloga, es decir, una glucoamilasa que no es de la misma especie que la célula huésped. La glucoamilasa puede ser, por ejemplo, una glucoamilasa de Humicola grisea. De forma alternativa o adicional, la célula huésped puede no expresar una glucoamilasa endógena de la célula huésped.

[0012] Otro objetivo es proporcionar un procedimiento para la sacarificación de almidón, que comprende: añadir a una solución de almidón licuado un polipéptido expuesto anteriormente y sacarificar la solución de almidón licuado. El polipéptido se puede añadir a la solución de almidón licuado en una cantidad de aproximadamente 0,3 a 1 kg por tonelada métrica de sólidos secos. La solución de almidón licuado puede ser cualquier suspensión de almidón licuado con aproximadamente 20 a 35% p/p de sólidos secos.

[0013] El procedimiento comprende adicionalmente un paso de adición de una glucoamilasa a la solución de almidón licuado, en el que la sacarificación de la solución de almidón licuado produce un jarabe rico en glucosa. La concentración de glucosa en el jarabe rico en glucosa puede ascender a al menos aproximadamente 97% p/p ss. La concentración máxima de glucosa en el jarabe rico en glucosa se puede alcanzar en un plazo de 24 horas a partir de la adición del polipéptido a la solución de almidón licuado. La glucoamilasa puede provenir de plantas, hongos o bacterias. Por ejemplo, la glucoamilasa puede ser una glucoamilasa de Trichoderma reesei (TrGA), una

glucoamilasa de Aspergillus niger (AnGA) o una glucoamilasa de Humicola grisea (HgGA). La glucoamilasa puede provenir de un hongo que es Aspergillus sp., A. awamori, A. oryzae, Talaromyces sp., T. emersonii, T. leycettanus,

T. duponti, T. thermophilus, Clostridium sp., C. thermoamylolyticum o C. thermohydrosulfuricum. La glucoamilasa se puede añadir en una cantidad de aproximadamente 0,02 a 2,0 UG/g ss o de aproximadamente 0,1 a 1,0 UG/g ss. Adicionalmente se pueden añadir otras enzimas que incluyen, pero no se limitan a, una enzima desramificante, una isoamilasa, una pululanasa, una proteasa, una celulasa, una hemicelulasa, una lipasa, una cutinasa o una combinación de las mismas. El procedimiento de sacarificación de almidón puede comprender asimismo la fermentación de la solución de almidón sacarificado para producir etanol. La solución de almidón licuado puede encontrarse entre aproximadamente 40ºC y aproximadamente 60ºC. La solución de almidón licuado puede encontrarse entre aproximadamente pH 4,0 y aproximadamente pH 6,0, o entre aproximadamente pH 4,2 y aproximadamente pH 4,8.

[0014] Otro objetivo es proporcionar una composición para el procesamiento de almidón que comprenda el polipéptido anterior y, opcionalmente, una glucoamilasa, una pululanasa, una 1-amilasa, una a-amilasa fúngica distinta de TrAA, una proteasa, una celulasa, una hemicelulasa, una lipasa, una cutinasa, una isoamilasa o una combinación de las mismas.

[0015] Otro objetivo es proporcionar una composición de horneado que comprenda el polipéptido anterior en una solución o en un gel. El procedimiento de horneado comprende la adición de la composición de horneado de la reivindicación 46 a una sustancia que se ha de hornear y el horneado de la sustancia.

[0016] Aun otro objetivo es proporcionar una composición para desencolar productos textiles que comprenda el polipéptido en una solución acuosa con, opcionalmente, otra enzima. El procedimiento de desencolado de un producto textil comprende poner la composición de desencolado en contacto con un producto textil durante un tiempo suficiente para desencolar el producto textil.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0017] Los dibujos adjuntos se incorporan en y forman parte de esta memoria descriptiva e ilustran diferentes realizaciones. En los dibujos:

[0018] La fig. 1 representa la capacidad de la TrAA para catalizar, en presencia de una glucoamilasa, un proceso de sacarificación con una eficacia superior a la alcanzada con la glucoamilasa sola. El eje y muestra el porcentaje en peso de glucosa (DP1) producido en un proceso de sacarificación de 24 horas a pH 4,2, 60°C. La reacción fue catalizada por 1,0 kg/tm ss de glucoamilasa sola (GA) o de GA combinada con la cantidad indicada de TrAA en kg/tm de ss. Nótese que la adición de 1 mg de enzima a una solución de 50 ml que contiene un 32% de sólidos secos, por ejemplo, significa que la solución contiene 1 mg de enzima/16 g de ss, o 0,0625 kg/tm de ss.

[0019] La fig. 2 representa la capacidad de la TrAA para catalizar la producción de maltosa a un pH bajo. El eje y muestra el porcentaje en peso de maltosa (DP2) producido en un proceso de producción de maltosa de 24 horas catalizado por 0,5 kg/tm ss de TrAA a 55°C. El pH de la reacción se muestra en el eje x.

[0020] La fig. 3 representa la capacidad de la TrAA para catalizar la producción de maltosa con una eficacia comparable a Clarase® L. En el eje y se muestra el porcentaje en peso de maltosa (DP2) producido en un proceso de producción de maltosa de 48 horas. En el eje x se muestra la enzima usada para catalizar la reacción. “Clarase”: 10 SKBU/g ss de Clarase® L a pH 5,5, 55°C. “10 TrAA”: 10 SKBU/g ss de a-amilasa de Trichoderma reesei a pH 4,5, 60°C. “15 TrAA”: y “20 TrAA” representan TrAA a 15 SKBU/g ss y 20 SKBU/g ss, respectivamente, a pH 4,5, 60°C. “20 TrAA + PU” representa la adición de 0,25 kg/tm ss de pululanasa a 20 SKBU/g ss de TrAA a pH 4,5, 60°C.

[0021] La fig. 4 representa un proceso de producción de maltosa catalizado por TrAA con la cantidad óptima de pululanasa. El eje y muestra el porcentaje en peso de maltosa (DP2) producido al cabo de 24 horas a pH 4,6, 58°C en presencia de 0,5 kg/tm ss de TrAA. El eje x muestra la cantidad de pululanasa en kg/tm de ss añadida a la reacción. [0022] La fig. 5 muestra proteínas separadas mediante SDS-PAGE procedentes de una alícuota de células cultivadas que expresan TrAA (carril 1) o de TrAA purificada (carril 2). En el carril M se muestran los marcadores del peso molecular.

[0023] La fig. 6A muestra la actividad a-amilasa relativa (en unidades arbitrarias) de la TrAA purificada en función del pH, usando el reactivo Ceralpha (Megazyme International Ireland, Ltd., Wicklow, Irlanda; n° de catálogo K-CERA) como sustrato.

[0024] La fig. 6B muestra la actividad a-amilasa relativa (en unidades arbitrarias) de la TrAA purificada en función de la temperatura, usando el mismo sustrato artificial.

[0025] La fig. 7A y la fig. 7B son un listado de las SEQ ID NOS:1-7.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0026] Se proporciona una a-amilasa fúngica procedente de Trichoderma reesei. La TrAA ofrece varias ventajas frente a las a-amilasas usadas actualmente. En primer lugar, la TrAA es activa a un pH relativamente bajo y a una temperatura elevada, lo que permite usar la enzima en combinación con una glucoamilasa fúngica en las mismas condiciones de reacción. Esto obvia la necesidad de realizar la reacción de sacarificación en forma de un proceso discontinuo, en el que se han de reajustar el pH y la temperatura para el uso óptimo de la a-amilasa o la glucoamilasa. En segundo lugar, la TrAA, en combinación con una pululanasa, cataliza la generación de maltosa con la misma eficacia que las enzimas más caras usadas comúnmente, tales como Clarase® L.

1. Definiciones y abreviaturas

[0027] De acuerdo con esta descripción detallada, se aplican las siguientes abreviaturas y definiciones. Cabe señalar que, según se usa en la presente memoria, las formas en singular “un”, “una”, “el” y “la” incluyen los equivalentes en plural, salvo que el contexto dicte claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a “una enzima” incluye una pluralidad de tales enzimas, y la referencia a “la formulación” incluye la referencia a una o más formulaciones y equivalentes de las mismas conocidos para los expertos en la técnica, y así sucesivamente.

[0028] Salvo que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria poseen el significado que entiende habitualmente un experto normal en la técnica. A continuación se proporcionan los términos siguientes.

1.1 Definiciones

[0029] “Amilasa” se refiere a una enzima que, entre otras cosas, es capaz de catalizar la degradación de almidón. Generalmente, las a-amilasas (EC 3.2.1.1; a-D-(1-4)-glucano glucanohidrolasa) se definen como enzimas endoactivas que rompen los enlaces a-D-(1-4) O-glucosídicos en el interior de la molécula de almidón de una manera aleatoria. Por el contrario, las enzimas amilolíticas exoactivas, tales como las a-amilasas maltogénicas (EC 3.2.1.133); las 1-amilasas (EC 3.2.1.2; y la a-D-(1-4)-glucano maltohidrolasa) rompen la molécula de almidón desde el extremo no reductor del sustrato. Las 1-amilasas, las a-glucosidasas (EC 3.2.1.1.20; a-D-glucósido glucohidrolasa), la glucoamilasa (EC 3.2.1.3; a-D-(1-4)-glucano glucohidrolasa) y las amilasas específicas de producto pueden producir maltooligosacáridos de una longitud específica a partir del almidón. Las glucoamilasas liberan restos glucosilo de los extremos no reductores de las moléculas de amilosa y amilopectina. Las glucoamilasas también catalizan la hidrólisis de los enlaces a-1,6 y a-1,3, aunque a una velocidad mucho menor que los enlaces a-1,4.

[0030] “Variante de la a-amilasa”, “polipéptido variante de la a-amilasa” y “enzima variante” se refieren a una proteína a-amilasa que presenta una secuencia de aminoácidos que ha sido modificada a partir de la secuencia de aminoácidos de una a-amilasa natural. Como se usa en la presente memoria, “enzimas parentales”, “secuencia parental”, “polipéptido parental”, "proteína a-amilasa natural” y “polipéptidos parentales” se refieren a enzimas y polipéptidos en los que se basan los polipéptidos variantes de la a-amilasa, por ejemplo una a-amilasa de Trichoderma reesei. Por “ácido nucleico parental” se entiende una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido parental. Una a-amilasa natural existe en la naturaleza. Las “variantes de la a-amilasa” difieren de una aamilasa natural en los restos de aminoácidos de la proteína madura, es decir, sin una secuencia señal. La variante de la a-amilasa puede ser una proteína de fusión que contiene un polipéptido a-amilasa heterólogo. Por ejemplo, la proteína a-amilasa puede comprender una proteína a-amilasa madura unida al péptido señal de otra a-amilasa.

[0031] “Variantes” se refieren a polipéptidos y ácidos nucleicos. El término “variante” y el término “mutante” se pueden usar indistintamente. Las variantes incluyen inserciones, sustituciones, transversiones, truncamientos y/o inversiones en uno o más puntos de la secuencia de aminoácidos o de nucleótidos, respectivamente. Los ácidos nucleicos variantes pueden incluir secuencias que son complementarias a secuencias que son capaces de hibridar con las secuencias de nucleótidos presentadas en la presente memoria. Por ejemplo, una secuencia variante es complementaria a secuencias capaces de hibridar en condiciones estrictas, por ejemplo 50°C y 0,2x SSC (1x SSC = NaCl 0,15 M, citrato sódico 0,015 M, pH 7,0), con las secuencias de nucleótidos presentadas en la presente memoria. Más concretamente, el término variante abarca secuencias que son complementarias a secuencias que son capaces de hibridar en condiciones muy estrictas, por ejemplo 65°C y 0,1x SSC, con las secuencias de nucleótidos presentadas en la presente memoria.

[0032] Como se usa en la presente memoria, el término “expresión” se refiere al proceso por medio del cual se produce un polipéptido a partir de la secuencia de ácido nucleico de un gen. El proceso incluye tanto la transcripción como la traducción.

[0033] “Aislado” significa que la secuencia está al menos sustancialmente exenta de al menos otro componente al que la secuencia está asociada de forma natural y se encuentra en la naturaleza.

[0034] “Purificado” significa que el material se encuentra en un estado relativamente puro, por ejemplo de una pureza de al menos aproximadamente 90%, una pureza de al menos aproximadamente 95% o una pureza de al menos aproximadamente 98%.

[0035] “Termoestable” significa que la enzima retiene su actividad tras la exposición a temperaturas elevadas. La termoestabilidad de una enzima, tal como una a-amilasa, se mide mediante su semivida (t1/2), en la que la mitad de la actividad enzimática se pierde por la semivida. El valor de la semivida se calcula en condiciones definidas midiendo la actividad amilasa residual.

[0036] “Intervalo de pH” se refiere a la capacidad de la enzima para mostrar actividad catalítica en condiciones desde ácidas hasta básicas, abarcando 5 o más unidades de pH.

[0037] Como se usa en la presente memoria, “estable al pH” se refiere a la capacidad de la enzima para retener su actividad en un amplio intervalo de pH.

[0038] Como se usa en la presente memoria, “secuencia de aminoácidos” es sinónimo del término “polipéptido” y/o del término “proteína”. En algunos casos, la expresión “secuencia de aminoácidos” es sinónimo del término “péptido”; en algunos casos, la expresión “secuencia de aminoácidos” es sinónimo del término “enzima”.

[0039] Como se usa en la presente memoria, “secuencia de nucleótidos” o “secuencia de ácido nucleico” se refiere a una secuencia de oligonucleótidos o una secuencia de polinucleótidos y a variantes, homólogos, fragmentos y derivados de la misma. La secuencia de nucleótidos puede ser de origen genómico, sintético o recombinante y puede ser de cadena doble o de cadena sencilla, tanto si representa la cadena sentido como la antisentido. Como se usa en la presente memoria, la expresión “secuencia de nucleótidos” incluye ADN genómico, ADNc, ADN sintético y ARN.

[0040] "Homólogo" se refiere a una entidad que presenta un cierto grado de identidad u "homología" con las presentes secuencias de aminoácidos y las presentes secuencias de nucleótidos. Una "secuencia homóloga" incluye un polinucleótido o un polipéptido que presenta un cierto porcentaje, por ejemplo 80%, 85%, 90%, 95% o 99%, de identidad de secuencia con otra secuencia. Porcentaje de identidad significa que, cuando están alineados, ese porcentaje de bases o restos de aminoácidos es el mismo cuando se comparan las dos secuencias. Las secuencias de aminoácidos no son idénticas cuando un aminoácido está sustituido, delecionado o añadido en comparación con la presente secuencia. El porcentaje de identidad de secuencia típicamente se mide con respecto a la secuencia madura de la presente proteína, es decir, después de la modificación postraduccional para eliminar, por ejemplo, una secuencia señal. Típicamente, los homólogos comprenderán los mismos residuos en los sitios activos que la presente secuencia de aminoácidos. Los homólogos igualmente retienen la actividad a-amilasa maltogénica, aunque el homólogo pueda presentar propiedades enzimáticas diferentes que la presente proteína.

[0041] Como se usa en la presente memoria, "hibridación" incluye el proceso por medio del cual se junta una cadena de ácido nucleico con una cadena complementaria a través de un apareamiento de bases, así como el proceso de amplificación realizado en las tecnologías de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El ácido nucleico variante de la a-amilasa puede existir en forma de ADN o ARN de cadena sencilla o doble, un heterodúplex de ARN/ADN o un copolímero de ARN/ADN. Como se usa en la presente memoria, "copolímero" se refiere a una cadena sencilla de ácido nucleico que comprende tanto ribonucleótidos como desoxirribonucleótidos. El ácido nucleico variante de la a-amilasa puede presentar codones optimizados para incrementar adicionalmente la expresión.

[0042] Como se usa en la presente memoria, un compuesto "sintético" se produce mediante síntesis química

o enzimática in vitro. Incluye, pero no se limita a, ácidos nucleicos variantes de la a-amilasa preparados con el uso de codones óptimos para los organismos huésped, tales como las levaduras metilotróficas Pichia, Hansenula, Streptomyces y Trichoderma, por ejemplo T. reesei, u otros huéspedes de expresión a elegir.

[0043] Como se usa en la presente memoria, "célula transformada" incluye células, tanto células bacterianas como fúngicas, que han sido transformadas mediante el uso de técnicas de ADN recombinante. La transformación se produce típicamente por inserción de una o más secuencias de nucleótidos en una célula. La secuencia de nucleótidos insertada puede ser una secuencia de nucleótidos heteróloga, es decir, una secuencia que no es natural de la célula que se ha de transformar, tal como una proteína de fusión.

[0044] Como se usa en la presente memoria, "unido funcionalmente" significa que los componentes descritos se encuentran en una relación que les permite funcionar de la manera deseada. Por ejemplo, una secuencia reguladora unida funcionalmente a una secuencia codificante está ligada de tal manera que se logra la expresión de la secuencia codificante en condiciones compatibles con las secuencias control.

[0045] Como se usa en la presente memoria, "biológicamente activo" se refiere a una secuencia que presenta una función estructural, reguladora o bioquímica similar a la de la secuencia presente en la naturaleza, aunque no necesariamente en la misma medida.

[0046] La expresión "hongos filamentosos" se refiere a todas las forma filamentosas de la subdivisión Eumycotina. Véase Alexopoulos, INTRODUCTORY MYCOLOGY, Wiley, Nueva York (1962). Estos hongos se caracterizan por un micelio vegetativo con una pared celular compuesta por quitina, celulosa y otros polisacáridos complejos. Los hongos filamentosos son morfológica, fisiológica y genéticamente distintos de las levaduras. El crecimiento vegetativo de los hongos filamentosos se produce por elongación de las hifas y el catabolismo del carbono es obligatoriamente aerobio. Una célula parental de hongo filamentoso puede ser una célula de Trichoderma sp., por ejemplo T. reesei (clasificado previamente como T. longibrachiatum y conocido actualmente también como Hypocrea jecorina), T. viricle, T, koningii, T. harzianum; Penicillium sp.; Humicola sp., por ejemplo H. insolens y H. grisea; Chrysosporium sp., por ejemplo C. lucknowense; Gliocladium sp.; Aspergillus sp., por ejemplo

A. oryzae, A. niger y A. awamori; Fusarium sp.; Neurospora sp.; Hypocrea sp.; y Emericella sp. Véase también Innis y col., Science 228: 21-26 (1985).

[0047] Como se usa en la presente memoria, el término "almidón" se refiere a cualquier material compuesto por los carbohidratos polisacáridos complejos de plantas compuestos por amilosa y amilopectina con la fórmula (C6H10O5)x, en la que X puede ser cualquier número. La expresión "almidón granular" se refiere al almidón crudo, es decir, sin cocer, por ejemplo al almidón que no ha sido sometido a una gelificación.

[0048] Como se usa en la presente memoria, el término "sacarificación" se refiere a la conversión enzimática de almidón en glucosa.

[0049] El término "licuefacción" se refiere al estado de conversión del almidón en el que el almidón gelificado se hidroliza para dar dextrinas solubles de bajo peso molecular. La expresión "grado de polimerización" (DP) se refiere al número (n) de unidades de anhidroglucopiranosa en un sacárido dado. Ejemplos de DP1 son los monosacáridos glucosa y fructosa. Ejemplos de DP2 son los disacáridos maltosa y sacarosa.

[0050] Como se usa en la presente memoria, la expresión "contenido en sólidos secos" (ss) se refiere a los sólidos totales de una suspensión expresados en porcentaje en peso seco. El término "suspensión" se refiere a una mezcla acuosa que contiene sólidos insolubles.

[0051] El término "ED" o "equivalente de dextrosa" se define como el porcentaje de azúcar reductor, es decir, D-glucosa, como fracción de los carbohidratos totales en un jarabe. [0052] La expresión "sacarificación y fermentación simultáneas (SFS)" se refiere a un proceso de la producción de productos bioquímicos en el que están presentes, durante el mismo paso del proceso, un organismo microbiano, tal como un microorganismo productor de etanol, y al menos una enzima, tal como TrAA o una variante de la misma. SFS se refiere a la hidrólisis contemporánea de sustratos de almidón granular para dar sacáridos, que incluyen glucosa, y la fermentación de los sacáridos para dar, por ejemplo, alcohol en el mismo recipiente de reacción.

[0053] Como se usa en la presente memoria, "microorganismo productor de etanol" se refiere a un microorganismo con la capacidad para convertir un azúcar o un oligosacárido en etanol.

1.2. Abreviaturas

[0054] Salvo que se indique lo contrario, se aplican las abreviaturas siguientes:

ADA azodicarbonamida AnGA glucoamilasa de Aspergillus niger ATCC Colección Americana de Cultivos Tipo BBA 1-amilasa Spezyme® BBA 1500L ADNc ADN complementario ED equivalente de dextrosa DEAE dietilaminoetanol ADN ácido desoxirribonucleico DNS ácido 3,5-dinitrosalicílico DPn grado de polimerización con n subunidades ss sólido seco EC comisión de enzimas para la clasificación de las enzimas EDTA ácido etilendiaminotetraacético FGSC Centro de Cepas Genéticas de Hongos G173A el resto glicina (G) en posición 173 está reemplazado por un resto alanina (A), designándose los

aminoácidos con las abreviaturas de una sola letra bien conocidas en la técnica GA glucoamilasa UG unidad de actividad glucoamilasa HFCS jarabe de maíz con alto contenido en fructosa HFSS jarabe basado en almidón con alto contenido en fructosa HPLC cromatografía líquida de alta resolución HgGA glucoamilasa de Humicola grisea AS azúcares superiores (DPn, donde n > 3) kb kilobase LAT a-amilasa de B. licheniformis LB caldo de Luria Bertani UL unidades lipasa, una medida de la actividad fosfolipasa por unidad de masa de enzima MOPS ácido 3-(n-morfolino)propanosulfónico ARNm ácido ribonucleico mensajero tm tonelada métrica (1.000 kg) PCR reacción en cadena de la polimerasa PEG polietilenglicol ppm partes por millón PU, UP pululanasa o unidades pululanasa RT-PCR reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa SD caldo dextrosa Sabouraud SDS-PAGE electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico SKBU/g ss unidad a-amilasa por gramo de sólidos secos. Una unidad a-amilasa dextriniza 1,0 g de sustrato

dextrina límite por hora en las condiciones del ensayo. 1x SSC NaCl 0,15 M, citrato sódico 0,015 M, pH 7,0 SFS sacarificación y fermentación simultáneas TE Tris 10 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM TrAA a-amilasa de Trichoderma reesei TrGA glucoamilasa de Trichoderma reesei p/v peso/volumen p/p peso/peso YM caldo extracto de levadura y malta µl microlitro

2. -Amilasa de Trichoderma reesei (TrAA) y variantes de la misma

[0055] Se proporciona un polipéptido aislado y/o purificado que comprende la SEQ ID NO:3. Se trata de una a-amilasa natural de Trichoderma reesei (TrAA) que comprende una secuencia líder de 20 aminoácidos. En una realización, la TrAA es una forma madura del polipéptido en la que se ha disociado la secuencia líder de 20 aminoácidos, de manera que el extremo N-terminal del polipéptido comienza con el resto ácido aspártico (D) en la posición 21 de la SEQ ID NO:3. También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican el polipéptido que comprende la SEQ ID NO:3 o los restos de aminoácido 21 a 463 de la SEQ ID NO:3. En una realización, un ácido nucleico que codifica la TrAA es un ADN genómico que comprende la SEQ ID NO:1; en otra realización, el ácido nucleico es un ADNc que comprende la SEQ ID NO:2. Un experto en la técnica entenderá que el código genético está degenerado, lo que significa que, en algunos casos, múltiples codones pueden codificar el mismo aminoácido. Los ácidos nucleicos incluyen ADN genómico, ARNm y ADNc que codifican una TrAA o una variante de la misma.

[0056] Además de la a-amilasa natural de Trichoderma reesei (TrAA), se proporcionan variantes de la misma que difieren de la secuencia de la TrAA natural mostrada en la SEQ ID NO:3 en la sustitución, inserción o deleción de uno o más aminoácidos. Por ejemplo, una a-amilasa variante puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35 ó 40 modificaciones de aminoácidos, por ejemplo 1 a 10 sustituciones de aminoácidos, al mismo tiempo que retiene la actividad a-amilasa maltogénica. La TrAA variante puede retener una actividad específica mayor o menor que la TrAA natural. Las variantes son sinónimos de "homólogos". Se proporcionan ácidos nucleicos variantes que codifican los polipéptidos variantes. Los ácidos nucleicos variantes incluyen todos los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos variantes.

2.1. Caracterización de las variantes de la TrAA

[0057] Las variantes de la enzima se pueden caracterizar por sus secuencias de ácido nucleico y polipeptídica primaria, por modelado estructural tridimensional y/o por su actividad específica. Otras características de la variante de la TrAA incluyen, por ejemplo, estabilidad, intervalo de pH, estabilidad a la oxidación y termoestabilidad. En un aspecto, las variantes de la TrAA se expresan a niveles más altos que la TrAA natural al mismo tiempo que retienen las características de rendimiento de la TrAA natural. Los niveles de expresión y la actividad enzimática se pueden valorar usando ensayos convencionales conocidos para el experto en este campo. En otro aspecto, las variantes demuestran unas características de rendimiento mejoradas en relación con la enzima natural, tal como una estabilidad mejorada a altas temperaturas (es decir, 70 a 120ºC) y/o a pH extremos (es decir, pH 4,0 a 6,0, o pH 8,0 a 11,0).

[0058] Una característica de expresión se refiere a un nivel de expresión alterado de la variante cuando la variante se produce en una célula huésped concreta. La expresión generalmente se refiere a la cantidad de variante activa que se puede recuperar de un caldo de fermentación a lo largo de un periodo de tiempo dado usando técnicas convencionales conocidas en la técnica. La expresión también se puede referir a la cantidad o la tasa de variante producida en la célula huésped o secretada por la célula huésped. La expresión también se puede referir a la tasa de traducción del ARNm que codifica la enzima variante.

[0059] Las variantes de la TrAA también pueden presentar una estabilidad alterada a la oxidación en comparación la a-amilasa parental. Por ejemplo, una estabilidad reducida a la oxidación puede resultar ventajosa en composiciones para la licuefacción de almidón.

[0060] La TrAA variante puede ser más termoestable que la a-amilasa natural. Tales variantes de la TrAA son ventajosas para el uso en el horneado o en otros procesos que requieran altas temperaturas. Por ejemplo, una variante termoestable de la TrAA puede degradar almidón a temperaturas de aproximadamente 55ºC a aproximadamente 80ºC o más. Una variante termoestable de la TrAA puede retener su actividad tras una exposición a temperaturas de hasta aproximadamente 95ºC.

[0061] Los polipéptidos variantes de la a-amilasa descritos en la presente memoria también pueden presentar mutaciones que prolonguen la semivida en relación con la enzima parental en un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% o más, especialmente a temperaturas elevadas de aproximadamente 55ºC a aproximadamente 95ºC o más, en particular a aproximadamente 80ºC. En una realización, la variante de la TrAA se puede calentar durante aproximadamente 1 a 10 minutos a 80ºC o más.

[0062] Los polipéptidos variantes de la TrAA pueden incluir adicionalmente mutaciones en la secuencia señal del polipéptido parental o en cualquier otra parte del polipéptido parental de la TrAA. Por ejemplo, la variante de la TrAA puede encontrarse en forma de una proteína de fusión que comprende un polipéptido heterólogo, tal como el péptido señal de B. licheniformis (LAT), fusionado con la TrAA para promover la secreción de la proteína expresada desde una célula huésped bacteriana. Otros polipéptidos heterólogos que se pueden fusionar con la TrAA variante incluyen secuencias para, por ejemplo, facilitar la purificación de la proteína expresada. En una realización, una secuencia heteróloga incluye un sitio sensible a proteasas que permite cortar la secuencia heteróloga de la TrAA variante expresada.

[0063] En un aspecto, el polipéptido variante de la TrAA codificado por el ácido nucleico posee la misma estabilidad al pH que la secuencia parental. En otro aspecto, la variante de la TrAA comprende una mutación que confiere un mayor intervalo de estabilidad al pH o que desplaza el intervalo de pH a una zona deseada para la finalidad comercial última de la enzima. Por ejemplo, en una realización, la variante de la TrAA puede degradar almidón entre aproximadamente pH 4,5 y aproximadamente pH 10,5. El polipéptido variante de la TrAA puede presentar, en condiciones idénticas, una semivida más larga o una actividad mayor (dependiendo del ensayo) en comparación con el polipéptido parental, o la variante de la TrAA puede presentar la misma actividad que el polipéptido parental. El polipéptido variante de la a-amilasa también puede presentar, en condiciones idénticas de pH, una semivida aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% más larga o mayor que su polipéptido parental. Alternativa o adicionalmente, la variante de la TrAA puede presentar una actividad específica mayor que el polipéptido parental en condiciones idénticas de pH.

[0064] En otro aspecto, se proporciona un ácido nucleico complementario a un ácido nucleico que codifica cualquiera de las variantes de la TrAA expuestas en la presente memoria. Asimismo se proporciona un ácido nucleico capaz de hibridar con el complemento. En otra realización, la secuencia para el uso en los procedimientos y composiciones descritos en la presente memoria es una secuencia sintética. Incluye, pero no se limita a, secuencias preparadas con el uso de codones óptimos para la expresión en organismos huésped, como en las levaduras metilotróficas Trichoderma, Pichia y Hansenula.

3. Producción de TrAA y de las variantes de la misma

[0065] En una realización, la TrAA natural se expresa en una cepa de T. reesei y, opcionalmente, se aísla antes del uso. En otra realización, la TrAA natural se purifica después de la expresión. Usando técnicas bien conocidas para el experto, se seleccionan cepas de T. reesei especialmente útiles que expresan altos niveles de la TrAA natural. Un alto nivel de expresión puede ser aproximadamente 12 a 20 g de TrAA o de una variante de la misma por litro de medio de cultivo, aproximadamente 14 a 18 g/l o aproximadamente 16 a 19 g/l. En otras realizaciones, la TrAA natural o una variante de la misma se expresa por recombinación en una célula huésped. El gen de la TrAA se puede clonar y expresar como se describe, por ejemplo, en las solicitudes publicadas de EE.UU. nº 2007/0004018 y nº 2006/0094080.

Expresión recombinante de enzimas

[0066] En algunas realizaciones, los microorganismos se manipulan genéticamente para expresar la TrAA o sus variantes. Las células huésped adecuadas incluyen células de hongos filamentosos, que pueden ser, por ejemplo, una cepa de Aspergillus sp., Trichoderma sp., Fusarium sp. o Penicillium sp. Las células huésped fúngicas especialmente adecuadas incluyen Aspergillus nidulans, A. awamori, A. oryzae, A. aculeatus, A. niger, A. japonicus, Trichoderma reesei, T. viride, Fusarium oxysporum y F. solani. En Ward y col., Appl. Microbiol. Biotechnol. 39: 738743 (1993) y Goedegebuur y col., Curro Gene. 41: 89-98 (2002), se describen cepas de Aspergillus. En una realización especialmente adecuada, el huésped es una cepa de Trichoderma reesei que produce niveles relativamente altos de TrAA, por ejemplo de 15 a 20 g/l. Se conocen T. reesei adecuados, y ejemplos no limitantes incluyen ATCC nº 13631, ATCC nº 26921, ATCC nº 56764, ATCC nº 56765, ATCC nº 56767 y NRRL 15709. En algunas realizaciones, la cepa huésped es un derivado de RL-P37, que se describe en Sheir-Neiss y col., Appl. Microbiol. Biotechnology 20: 46-53 (1984). Cuando la TrAA o sus variantes se expresan en una célula huésped eucariota, la TrAA expresada presenta, en una realización especialmente adecuada, el mismo patrón de glicosilación que el que se encuentra en la TrAA natural. Las células huésped especialmente adecuadas incluyen células huésped de Trichoderma reesei manipuladas de acuerdo con los procedimientos expuestos en la patente de EE.UU. nº 5,874,276 y el documento WO 05/001036 (Genencor International, Inc.).

[0067] En otras realizaciones, la célula huésped es una célula huésped manipulada genéticamente con genes nativos desactivados, por ejemplo genes delecionados. Por ejemplo, la inactivación de uno o más genes en una célula huésped fúngica se puede realizar mediante procedimientos conocidos, como los que se describen en la patente de EE.UU. nº 5,246,853, la patente de EE.UU. nº 5,475,101 y el documento WO 92/06209. La inactivación génica se puede efectuar mediante deleción completa o parcial, inactivación insercional o mediante cualquier otro medio que convierta a un gen en no funcional respecto a su finalidad deseada, impidiendo de este modo que el gen exprese una proteína funcional. Los genes inactivados pueden incluir, por ejemplo, genes que codifican enzimas celulolíticas, tales como endoglucanasas y exocelobiohidrolasas, por ejemplo cbh1, cbh2, egl1, egl2 y egl3. En una realización, cuando la célula huésped es una célula de Trichoderma, en particular una célula huésped de Trichoderma reesei, se inactivarán y, en particular, se delecionarán los genes cbh1, cbh2, egl1 y egl2. En la patente de EE.UU. nº 5,874,276 y el documento WO 05/001036 se exponen y describen células huésped de T. reesei especialmente adecuadas que presentan cuatro proteínas delecionadas. En otra realización, la patente de EE.UU. nº 5,650,322 describe cepas derivadas de RL-P37 que presentan deleciones en el gen cbh1 y el gen cbh 2, por ejemplo.

[0068] En otra realización, las células huésped adecuadas incluyen una bacteria gram-positiva seleccionada del grupo formado por Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. lemus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. thuringiensis, Streptomyces lividans o S. murinus; o una bacteria gram-negativa, siendo dicha bacteria gram-negativa Escherichia coli o una especie de Pseudomonas.

[0069] En algunas realizaciones, se manipula genéticamente una célula huésped para expresar una variante de la TrAA con una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la TrAA natural. En algunas realizaciones, el polinucleótido que codifica una TrAA o una variante de la misma presentará una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:2 o una secuencia de ácido nucleico que presenta una identidad de secuencia de al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la SEQ ID NO:2. En otras realizaciones, la cepa huésped que expresa una TrAA o una variante de la misma también se manipula genéticamente para expresar una GA heteróloga.

3.2. Vectores

[0070] En algunas realizaciones, se prepara una construcción de ADN que comprende un ácido nucleico que codifica una TrAA o una variante de la misma para que se exprese en una célula huésped. Los ácidos nucleicos representativos que codifican una TrAA incluyen las SEQ ID NO:1 y 2. En una realización, la construcción de ADN se transfiere a una célula huésped mediante un vector de expresión que comprende secuencias reguladoras unidas funcionalmente a una secuencia que codifica la TrAA.

[0071] El vector puede ser cualquier vector que se pueda integrar en el genoma de una célula huésped fúngica y replicar cuando se introduce en la célula huésped. El Catálogo de Cepas del FGSC enumera vectores adecuados. Véase FGSC, Catálogo de Cepas, Universidad de Missouri, en www.fgsc.net (última actualización 17 de enero de 2007). En Sambrook y col., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (2001); Bennett y col., MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press, San Diego (1991), págs. 369-428; y la patente de EE.UU. nº 5,874,276 se proporcionan ejemplos adicionales de vectores de expresión y/o de integración adecuados. Los vectores especialmente útiles incluyen pFB6, pBR322, PUC18, pUC100 y pENTR/D, pDONTM201, pDONRTM221, pENTRTM, pGEM®3Z y pGEM®4Z. Los plásmidos adecuados para el uso en células bacterianas incluyen pBR322 y pUC19, que permiten la replicación en E. coli, y pE194, por ejemplo, que permite la replicación en Bacillus.

[0072] En algunas realizaciones, un ácido nucleico que codifica una TrAA o una variante de la misma se une funcionalmente a un promotor adecuado que permita la transcripción en la célula huésped. El promotor puede proceder de genes que codifican proteínas homólogas o heterólogas con respecto a la célula huésped. Preferentemente, el promotor es útil en un huésped de Trichoderma. Ejemplos adecuados no limitantes de promotores incluyen los promotores de cbh1, cbh2, egl1 y egl2. En una realización, el promotor es uno que es nativo de la célula huésped. Por ejemplo, cuando el huésped es T. reesei, el promotor es un promotor nativo de T. reesei. En una realización, el promotor es cbh1 de T. reesei, que es un promotor inducible depositado en GenBank bajo el número de acceso D86235. Un "promotor inducible" es un promotor que es activo bajo regulación ambiental o del desarrollo. En otra realización, el promotor es uno que es heterólogo con respecto a la célula huésped. Otros ejemplos de promotores útiles incluyen los promotores de los genes de la glucoamilasa de Aspergillus awamori y A. niger. Véanse Nunberg y col., Mol. Cell. Biol. 4: 2306-2315 (1984) y Boel y col., EMBO J. 3: 1581-1585 (1984).

[0073] En algunas realizaciones, la secuencia codificante está unida funcionalmente a una secuencia señal. El ADN que codifica la secuencia señal puede ser la secuencia de ADN asociada de forma natural al gen de la TrAA que se ha de expresar. Por ejemplo, el ADN codificante puede comprender la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:4, que codifica la secuencia señal de la TrAA de SEQ ID NO:5. En otras realizaciones, el ADN codificante no comprende la SEQ ID NO:4, que está sustituida por una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia señal de una especie distinta de Trichoderma reesei. En esta realización, el polinucleótido que codifica la secuencia señal se encuentra inmediatamente en la dirección 5' y en el marco del polinucleótido que codifica el polipéptido. En realizaciones adicionales, una secuencia señal y una secuencia promotora que componen una construcción de ADN

o un vector que se ha de introducir en una célula huésped fúngica provienen de la misma fuente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la secuencia señal es la secuencia señal de cbh1 que se une funcionalmente a un promotor de cbh1.

[0074] En algunas realizaciones, el vector de expresión también incluye una secuencia de terminación. En una realización, la secuencia de terminación y la secuencia promotora provienen de la misma fuente. En otra realización, la secuencia de terminación es homóloga con respecto a la célula huésped. Una secuencia de terminación especialmente adecuada es cbh1 procedente de una cepa de Trichoderma y, en particular, de T. reesei. Otros trerminadores fúngicos útiles incluyen el terminador del gen de la glucoamilasa de Aspergillus niger o A. awamori. Véanse Nunberg y col. (1984), antes citado, y Boel y col (1984), antes citado.

[0075] En algunas realizaciones, el vector de expresión incluye un marcador seleccionable. Ejemplos de marcadores seleccionables adecuados incluyen aquellos que confieren resistencia a agentes antimicrobianos, por ejemplo higromicina o fleomicina. También son adecuados los marcadores selectivos nutricionales que incluyen amdS, argB y pyr4. Los marcadores útiles en los sistemas de vectores para la transformación de Trichoderma son conocidos en general. Véanse, por ejemplo, BIOTECHNOLOGY OF FILAMENTOUS FUNGI, Finkelstein y col., eds., Butterworth-Heinemann, Boston, Mass. (1992); cap. 6; y Kingdom y col., APPLIED MOLECULAR GENETICS OF FILAMENTOUS FUNGI, Blackie Academic and Professional, Chapman and Hall, Londres (1992). En una realización, el marcador selectivo es el gen amdS, que codifica la enzima acetamidasa; permite el crecimiento de las células transformadas en acetamida como fuente de nitrógeno. El uso de un gen amdS de A. nidulans como marcador selectivo se describe en Kelley y col., EMBO J. 4: 475-479 (1985) y Penttila y col., Gene 61: 155-164 (1987).

[0076] Un vector de expresión adecuado que comprende una construcción de ADN con un polinucleótido que codifica una TrAA o una variante de la misma puede ser cualquier vector que sea capaz de replicarse de forma autónoma en un organismo huésped dado o de integrarse en el ADN del huésped. En algunas realizaciones, el vector de expresión es un plásmido. En algunas realizaciones, se contemplan dos tipos de vectores de expresión para obtener la expresión de genes. El primer vector de expresión comprende secuencias de ADN en las que el promotor, la región codificante de la TrAA y el terminador provienen todos del gen que se ha de expresar. En algunas realizaciones, se obtiene un truncamiento génico por deleción de secuencias de ADN no deseadas, por ejemplo ADN que codifica dominios no deseados, para dejar el dominio que se ha de expresar bajo el control de sus propias secuencias reguladoras de transcripción y traducción. El segundo tipo de vector de expresión está preensamblado y contiene secuencias necesarias para obtener altos niveles de transcripción y un marcador seleccionable. En algunas realizaciones, la región codificante de un gen de TrAA o parte de la misma se inserta en este vector de expresión de utilidad general de manera que se encuentre bajo el control transcripcional de las secuencias promotora y terminadora de la construcción de expresión. En algunas realizaciones, los genes o partes de ellos se insertan en la dirección 3' del fuerte promotor de cbh1.

[0077] Los procedimientos usados para ligar una construcción de ADN que comprende un polinucleótido que codifica una TrAA o una variante de la misma, un promotor, un terminador y otras secuencias y los procedimientos para insertar la construcción en un vector adecuado son conocidos en la técnica. La unión se efectúa generalmente por ligación en sitios de restricción convenientes. Si no existen tales sitios, se usan los conectores oligonucleotídicos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional. Véanse, por ejemplo, Sambrook (2001), antes citado, y Bennett y col. (1991), antes citado. Adicionalmente, los vectores se pueden construir usando técnicas de recombinación conocidas en la técnica.

[0078] Se pueden usar procedimientos conocidos para obtener una célula huésped fúngica con uno o más genes inactivados, como se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 5,246,853; la patente de EE.UU. nº 5,475,101; y el documento WO 92/06209. La inactivación génica se puede efectuar mediante deleción completa o parcial, por inactivación insercional o mediante cualquier otro medio que convierta a un gen en no funcional respecto a su finalidad deseada, impidiendo de este modo que el gen exprese una proteína funcional. Se puede delecionar cualquier gen de Trichoderma sp. o de otros huéspedes fúngicos filamentosos que haya sido clonado, por ejemplo los genes cbh1, cbh2, egl1 y egl2. En algunas realizaciones, la deleción génica se puede efectuar insertando una forma del gen deseado que se ha de inactivar en un plásmido mediante procedimientos conocidos en la técnica. El plásmido de deleción se corta después en un sitio(s) apropiado de restricción para enzimas dentro de la región codificante del gen deseado y la secuencia codificante del gen o una parte de ella es sustituida por un marcador seleccionable. A ambos lados del gen marcador permanecen secuencias de ADN flanqueantes del locus del gen que se ha de delecionar, por ejemplo entre aproximadamente 0,5 y 0,2 kb. Un plásmido de deleción apropiado generalmente presentará sitios de restricción para enzimas únicos, presentes para poder retirar el fragmento que contiene el gen delecionado, incluidas las secuencias de ADN flanqueantes y el gen marcador seleccionable, en una sola pieza lineal.

Transformación, expresión y cultivo de las células huésped

[0079] La introducción de una construcción de ADN o de un vector en una célula huésped incluye técnicas tales como transformación; electroporación; microinyección nuclear; transducción; transfección, por ejemplo, mediada por lipofección y mediada por DEAE-dextrano; incubación con precipitado de ADN por fosfato cálcico; bombardeo de alta velocidad con microproyectiles recubiertos con ADN; y fusión de protoplastos. Las técnicas de transformación generales son conocidas en la técnica. Véanse, por ejemplo, Ausubel y col. (1987), antes citado, capítulo 9; Sambrook y col. (2001), antes citado; y Campbell y col., Curr. Genet. 16: 53-56 (1989). La expresión de proteínas heterólogas en Trichoderma se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 6,022,725; la patente de EE.UU. nº 6,268,328; Harkki y col., Enzyme Microb. Technol. 13: 227-233 (1991); Harkki y col., BioTechnol. 7: 596603 (1989); documento EP 244234; documento EP 215594; y Nevalainen y col., "The molecular biology of Trichoderma and its application to the expression of both homologous and heterologous genes", en MOLECULAR INDUSTRIAL MYCOLOGY, Leong y Berka, eds., Marcel Dekker Inc., Nueva York (1992), págs. 129-148. También se hace referencia a Cao y col., Science 9: 991-1001 (2000) para la transformación de cepas de Aspergillus. En una realización, se construyen transformantes genéticamente estables con sistemas de vectores por medio de los cuales el ácido nucleico que codifica una TrAA o una variante de la misma se integra de forma estable en el cromosoma de una célula huésped. Los transformantes se purifican después mediante técnicas conocidas.

[0080] En un ejemplo no limitante, los transformantes estables que incluyen un marcador amdS se distinguen de los transformantes inestables por su tasa de crecimiento más rápida y la formación de colonias circulares con un contorno liso en lugar de mellado sobre medio de cultivo sólido que contiene acetamida. En algunos casos se realiza adicionalmente un ensayo de estabilidad adicional en el que se hacen crecer los transformantes sobre medio sólido no selectivo, por ejemplo un medio exento de acetamida, se recogen las esporas de este medio de cultivo y se determina el porcentaje de estas esporas que seguidamente germinan y crecen sobre medio que contiene acetamida. Se pueden usar otros procedimientos conocidos en la técnica para seleccionar los transformantes.

[0081] En una realización específica, la preparación de Trichoderma sp. para la transformación implica la preparación de protoplastos a partir de micelios fúngicos. Véase Campbell y col., Curr. Genet. 16: 53-56 (1989). En algunas realizaciones, los micelios se obtienen a partir de esporas vegetativas germinadas. Los micelios se tratan con una enzima que digiere la pared celular, dando como resultado protoplastos. Los protoplastos se protegen mediante la presencia de un estabilizador osmótico en el medio de suspensión. Estos estabilizadores incluyen sorbitol, manitol, cloruro potásico, sulfato de magnesio y similares. La concentración de estos estabilizadores varía habitualmente entre 0,8 M y 1,2 M, pudiéndose usar, por ejemplo, una solución de sorbitol 1,2 M en el medio de suspensión.

[0082] La captación de ADN por parte de la cepa huésped de Trichoderma sp. depende de la concentración de ion calcio. En una solución de captación generalmente se usa CaCl2 de aproximadamente 10 a 50 M. Otros compuestos adecuados adicionales incluyen un sistema tamponante, tal como tampón TE (Tris 10 mM, pH 7,4; EDTA 1 mM) o MOPS 10 mM, pH 6,0, y polietilenglicol. Se cree que el polietilenglicol fusiona las membranas celulares, permitiendo de este modo que el contenido del medio sea liberado al citoplasma de la cepa de Trichoderma sp. Esta fusión con frecuencia deja múltiples copias del ADN plasmídico integradas en el cromosoma del huésped.

[0083] En la transformación de Trichoderma sp. habitualmente se usan protoplastos o células que han sido sometidos a un tratamiento de permeabilidad, típicamente a una densidad de 105 a 107/ml, en particular de 2x106/ml. Un volumen de 100 µl de estos protoplastos o células en una solución apropiada (por ejemplo sorbitol 1,2 M y CaCl2 50 mM) se mezcla con el ADN deseado. Generalmente se añade una concentración elevada de PEG a la solución de captación. Se puede añadir entre 0,1 y 1 volumen de PEG 4000 al 25% a la suspensión de protoplastos; sin embargo, resulta útil añadir aproximadamente 0,25 volúmenes a la suspensión de protoplastos. Asimismo se pueden añadir a la solución de captación aditivos, tales como dimetilsulfóxido, heparina, espermidina, cloruro potásico y similares, para facilitar la transformación. Se dispone de procedimientos similares para otras células huésped fúngicas. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 6,022,725 y 6,268,328.

[0084] Generalmente, la mezcla se incuba después a aproximadamente 0ºC durante un periodo de tiempo de 10 a 30 minutos. Después se añade PEG adicional a la mezcla para fomentar la captación del gen o de la secuencia de ADN deseados. El PEG 4000 al 25% generalmente se añade en volúmenes de 5 a 15 veces el volumen de la mezcla de transformación; sin embargo, pueden ser adecuados volúmenes mayores y menores. El PEG 4000 al 25% asciende típicamente a aproximadamente 10 veces el volumen de la mezcla de transformación. Una vez añadido el PEG, la mezcla de transformación se incuba bien a temperatura ambiente o bien sobre hielo antes de añadir una solución de sorbitol y CaCl2. La suspensión de protoplastos se añade después a alícuotas fundidas de un medio de crecimiento. Este medio de crecimiento permite solo el crecimiento de los transformantes.

[0085] En general, las células se cultivan en un medio convencional que contiene sales fisiológicas y nutrientes. Véanse, por ejemplo, Pourquie y col., BIOCHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSE DEGRADATION, Aubert y col., eds., Academic Press (1988), págs. 71-86; e Ilmen y col., Appl. Environ. Microbiol.

63: 1298-1306 (1997). También son adecuados los medios comunes preparados comercialmente, por ejemplo caldo extracto de levadura y malta (YM), caldo de Luria Bertani (LB) o caldo dextrosa Sabouraud (SD).

[0086] Son adecuadas las condiciones de cultivo convencionales; por ejemplo, los cultivos se incuban a aproximadamente 28ºC en un medio apropiado en cultivos en agitación o fermentadores hasta alcanzar el nivel deseado de expresión de una TrAA o de una variante de la misma. Las condiciones de cultivo preferidas para un hongo filamentoso dado son conocidas en la técnica y están disponibles, por ejemplo, en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) y el Centro de Cepas Genéticas de Hongos (FGSC). Una vez establecido el crecimiento del hongo, las células se exponen a condiciones efectivas para causar o permitir la expresión de una TrAA o de una variante de la misma.

3.4. Identificación de la actividad de la TrAA

[0087] Para evaluar la expresión de una TrAA o de una variante de la misma en una célula huésped se pueden medir la proteína expresada, el ARNm correspondiente o la actividad a-amilasa maltogénica en ensayos. Los ensayos adecuados incluyen, por ejemplo, transferencias Northern y Southern, RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa) e hibridación in situ, usando una sonda de hibridación marcada de forma apropiada. Los ensayos adecuados también incluyen la medición de la actividad de la TrAA en una muestra, por ejemplo mediante ensayos que miden directamente los azúcares reductores, tales como glucosa, en los medios de cultivo. La concentración de glucosa se puede determinar, por ejemplo, usando el kit de reactivos para glucosa nº 15-UV (Sigma Chemical Co.) o un instrumento, tal como el autoanalizador Technicon. La actividad glucoamilasa se puede ensayar mediante el procedimiento del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS). Véase Goto y col., Biosci. Biotechnol. Biochem. 58: 49-54 (1994).

[0088] Generalmente, la TrAA expresada en un huésped Trichoderma o Aspergillus presentará una concentración en el medio de cultivo superior a 1 gramo de proteína por litro (g/l), superior a 2 g/l, superior a 5 g/l, superior a 10 g/l, superior a 20 g/l o superior a 25 g/l. En una realización, la TrAA o la variante de la misma expresada en un huésped Trichoderma o Aspergillus estará glucosilada, es decir, la TrAA o la variante de la misma comprenderá un resto glucosilo. En una realización especialmente adecuada, el patrón de glucosilación será el mismo que el que está presente en la TrAA natural.

3.5. Procedimientos para la purificación de la TrAA

[0089] En general, una TrAA o una variante de la misma producida en un cultivo celular es secretada al medio y se puede purificar o aislar, por ejemplo, eliminando los componentes no deseados del medio de cultivo celular. En algunos casos, una TrAA o una variante de la misma se puede recuperar de un lisado celular. En tales casos, la enzima se purifica a partir de las células en las que se ha producido usando técnicas utilizadas de forma rutinaria por los expertos en la técnica. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, cromatografía de afinidad, procedimientos cromatográficos de intercambio iónico que incluyen intercambio iónico de alta resolución, cromatografía de interacción hidrófoba, reparto entre dos fases, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice o en una resina de intercambio catiónico, tal como DEAE, cromatoenfoque, SDS-PAGE, precipitación con sulfato de amonio y filtración en gel usando Sephadex G-75, por ejemplo.

Fermentación

[0090] En algunas realizaciones, las células fúngicas que expresan una TrAA o una variante de la misma se cultivan en condiciones de fermentación continua o discontinua. Una fermentación discontinua clásica consiste en un sistema cerrado en el que la composición del medio se fija al principio de la fermentación y no se altera durante la fermentación. Al comienzo de la fermentación el medio se inocula con el (los) microorganismo(s) deseado(s). En este procedimiento, la fermentación se deja que transcurra sin la adición de ningún componente al sistema. Típicamente, una fermentación discontinua se califica de "discontinua" con respecto a la adición de la fuente de carbono, y con frecuencia se intentan controlar factores tales como el pH y la concentración de oxígeno. Las composiciones del metabolito y de la biomasa del sistema discontinuo cambian constantemente hasta el momento en que se detiene la fermentación. En los cultivos discontinuos, las células progresan desde una fase de adaptación (lag) estática a una fase logarítmica de alto crecimiento y, finalmente, hasta una fase estacionaria, en la que la tasa de crecimiento disminuye o se detiene. Si no se tratan, las células en la fase estacionaria finalmente mueren. En general, las células en fase logarítmica son las responsables de la mayor parte de la producción de producto.

[0091] Una variación útil del sistema discontinuo convencional es el sistema de "fermentación discontinua alimentada". En esta variación de un sistema discontinuo típico el sustrato se añade en incrementos a medida que la fermentación progresa. Los sistemas discontinuos alimentados son útiles cuando es probable que la represión catabólica inhiba el metabolismo de las células y cuando resulta deseable tener cantidades limitadas de sustrato en el medio. La medición de la concentración real de sustrato en los sistemas discontinuos alimentados es difícil y, por lo tanto, se estima en base a los cambios observados en factores medibles, tales como pH, oxígeno disuelto y la presión parcial de los gases de desecho, tales como CO2. Las fermentaciones discontinua y discontinua alimentada son habituales y conocidas en la técnica.

[0092] La fermentación continua es un sistema abierto en el que se añade de forma continua un medio de fermentación definido a un biorreactor y se retira simultáneamente la misma cantidad de medio acondicionado para el procesamiento. La fermentación continua generalmente mantiene los cultivos a una densidad elevada constante, encontrándose las células principalmente en la fase de crecimiento logarítmico. La fermentación continua permite modular uno o más factores que afecten al crecimiento celular y/o a la concentración de producto. Por ejemplo, en una realización, un nutriente limitante, tal como la fuente de carbono o la fuente de nitrógeno, se mantiene a una tasa fija y todos los demás parámetros se pueden modular. En otros sistemas, se pueden alterar numerosos factores que afecten al crecimiento mientras se mantiene constante la concentración de células, medida a partir de la turbidez del medio. Los sistemas continuos procuran mantener las condiciones de crecimiento del estado estacionario. Así, la pérdida de células debida a la retirada del medio se deberá compensar con la tasa de crecimiento celular en la fermentación. En la técnica de la microbiología industrial se conocen procedimientos para modular nutrientes y factores de crecimiento para los procesos de fermentación continua, así como técnicas para maximizar la tasa de formación de producto.

4. Composiciones y usos de la TrAA y de sus variantes

[0093] La TrAA y sus variantes producidas y purificadas mediante los procedimientos antes descritos son útiles para una diversidad de aplicaciones industriales. En una realización, la TrAA y sus variantes son útiles en un proceso de conversión de almidón, en particular en un proceso de sacarificación de un almidón que ha sido sometido a licuefacción. El producto final deseado puede ser cualquier producto que se pueda producir por conversión enzimática del sustrato de almidón. Por ejemplo, el producto deseado puede ser un jarabe rico en maltosa, que se puede usar en otros procesos, tales como la preparación de HFCS. De forma alternativa, el producto puede ser un jarabe rico en glucosa, que se puede usar directamente, por ejemplo, como fuente de glucosa cristalina o que se puede convertir en una serie de otros productos útiles, tales como productos intermedios del ácido ascórbico (por ejemplo, gluconato; ácido 2-ceto-L-gulónico; 5-ceto-gluconato; y 2,5-dicetogluconato); 1,3propanodiol; aminoácidos aromáticos (por ejemplo, tirosina, fenilalanina y triptófano); ácidos orgánicos (por ejemplo, lactato, piruvato, succinato, isocitrato y oxaloacetato); aminoácidos (por ejemplo, serina y glicina); antibióticos; enzimas; vitaminas y hormonas.

[0094] En aun otra realización, el proceso de conversión de almidón puede constituir un precursor para o, simultáneamente, un proceso de fermentación diseñado para producir alcohol como combustible o para beber (es decir, alcohol potable). Un experto en la técnica está al corriente de las diversas condiciones de fermentación que se pueden usar en la producción de estos productos finales. La TrAA y sus variantes también son útiles en las composiciones y los procedimientos de preparación de alimentos. A continuación se describirán con más detalle estos usos diversos de la TrAA y sus variantes.

Preparación de sustratos de almidón

[0095] Los expertos normales en la técnica estarán al corriente de los procedimientos disponibles que se pueden usar para preparar sustratos de almidón para el uso en los procesos descritos en la presente memoria. Por ejemplo, se puede obtener un sustrato de almidón útil a partir de tubérculos, raíces, tallos, legumbres, cereales o grano entero. Más específicamente, el almidón granular se puede obtener a partir de maíz, zuro, trigo, cebada, centeno, milo, sagú, yuca, tapioca, sorgo, arroz, guisantes, judías, plátanos o patatas. El maíz contiene entre aproximadamente 60 y 68% de almidón; la cebada contiene entre aproximadamente 55 y 65% de almidón; el mijo contiene entre aproximadamente 75 y 80% de almidón; el trigo contiene entre aproximadamente 60 y 65% de almidón; y el arroz pulido contiene entre 70 y 72% de almidón. Los sustratos de almidón que se consideran específicamente son almidón de maíz y almidón de trigo. El almidón procedente de un grano puede estar molido o entero e incluye sólidos de maíz, tales como semillas, salvado y/o zuro. El almidón puede ser almidón bruto altamente refinado o materia prima de los procesos de refinería de almidón. También existen diferentes almidones disponibles en el mercado. Por ejemplo, el almidón de maíz está disponible en Cerestar, Sigma, y Katayama Chemical Industry Co. (Japón); el almidón de trigo está disponible en Sigma; el almidón de batata está disponible en Wako Pure Chemical Industry Co. (Japón); y el almidón de patata está disponible en Nakaari Chemical Pharmaceutical Co. (Japón).

[0096] El sustrato de almidón puede ser un almidón crudo procedente de granos enteros molidos que contiene fracciones sin almidón, por ejemplo residuos de germen y fibras. La molienda puede comprender bien la molienda en húmedo o bien la molienda en seco. En la molienda en húmedo, el grano entero se pone en remojo en agua o ácido diluido para separar el grano en sus partes constituyentes, por ejemplo almidón, proteína, germen, aceite, fibras de semilla. La molienda en húmedo separa eficazmente el germen y la harina (es decir, gránulos de almidón y proteína) y es especialmente adecuada para la producción de jarabes. En la molienda en seco, las semillas enteras se muelen para dar un polvo fino y se procesan sin fraccionar el grano en sus partes constituyentes. El grano molido en seco comprenderá así, además del almidón, cantidades significativas de compuestos carbohidratados distintos del almidón. La mayor parte del etanol proviene de la molienda en seco. De forma alternativa, el almidón que se ha de procesar puede ser un almidón altamente refinado, por ejemplo con una pureza de al menos 90%, al menos 95%, al menos 97% o al menos 99,5%.

Gelificación y licuefacción del almidón

[0097] Como se usa en la presente memoria, el término "licuefacción" o "licuar" se refiere a un proceso por medio del cual el almidón se convierte en dextrinas menos viscosas y de cadena más corta. En general, este proceso implica la gelificación del almidón simultáneamente con o seguida de la adición de una a-amilasa, aunque se pueden añadir opcionalmente enzimas adicionales que induzcan licuefacción. En algunas realizaciones, el sustrato de almidón preparado como se ha descrito anteriormente se suspende en agua. La suspensión de almidón puede contener, en porcentaje en peso de sólidos secos, entre aproximadamente 10 y 55%, entre aproximadamente 20 y 45%, entre aproximadamente 30 y 45%, entre aproximadamente 30 y 40% o entre aproximadamente 30 y 35% de almidón. La a-amilasa (EC 3.2.1.1) se puede añadir a la suspensión con, por ejemplo, una bomba dosificadora. La a-amilasa usada típicamente para esta aplicación es una a-amilasa bacteriana termoestable, tal como una aamilasa de B. licheniformis. Habitualmente, la a-amilasa se suministra, por ejemplo, a aproximadamente 1.500 unidades por kg de materia seca de almidón. Para optimizar la estabilidad y actividad de la a-amilasa, el pH de la suspensión se ajusta a entre aproximadamente pH 5,5 y 6,5, y típicamente se añade calcio aproximadamente 1 mM (aproximadamente 40 ppm de iones calcio libres). Otras a-amilasas puede requerir condiciones diferentes. La aamilasa bacteriana que permanece en la suspensión después de la licuefacción se puede desactivar bajando el pH en un paso de reacción subsiguiente o eliminando el calcio de la suspensión.

[0098] La suspensión de almidón más la a-amilasa se puede bombear de forma continua a través de un aparato de cocción a presión que se calienta a vapor a 105ºC. La gelificación ocurre muy rápidamente en estas condiciones, y la actividad enzimática, combinada con las significativas fuerzas de corte, inicia la hidrólisis del sustrato de almidón. El tiempo de permanencia en el aparato de cocción a presión es muy breve. El almidón parcialmente gelificado se puede transferir a una serie de tubos de retención mantenidos entre 100 y 105ºC y retener durante 5 min para completar el proceso de gelificación. La hidrólisis se completa hasta alcanzar el ED requerido en depósitos de retención entre 90 y 100ºC, o a temperaturas superiores, durante aproximadamente 1 a 2 horas. Estos depósitos pueden contener separadores para impedir el retromezclado.

[0099] Como se usa en la presente memoria, la expresión "licuefacción secundaria" se refiere al paso de licuefacción posterior a la licuefacción primaria (calentamiento a 90-100ºC), cuando la suspensión se deja enfriar a temperatura ambiente. Este paso de enfriamiento puede durar de 30 minutos a 180 minutos, por ejemplo de 90 minutos a 120 minutos. Como se usa en la presente memoria, la expresión "minutos de licuefacción secundaria" se refiere al tiempo transcurrido desde el inicio de la licuefacción secundaria hasta el momento en que se mide el equivalente de dextrosa (ED).

[0100] El almidón licuado resultante del proceso anterior típicamente contiene aproximadamente 98% de oligosacáridos y aproximadamente 2% de maltosa y 0,3% de D-glucosa. El almidón licuado típicamente se encuentra en forma de una suspensión que presenta aproximadamente 10 a 50% de ss; aproximadamente 10 a 45%; aproximadamente 15 a 40%; aproximadamente 20 a 40%; aproximadamente 25 a 40%; o aproximadamente 25 a 35% de ss.

Sacarificación: Creación de jarabes de glucosa o de maltosa

[0101] El almidón licuado se puede sacarificar para dar o bien un jarabe de glucosa o bien un jarabe de maltosa, usando la TrAA y las variantes de la misma, opcionalmente en presencia de otra(s) enzima(s). La composición exacta de los productos de la sacarificación depende de la combinación de enzimas usada, así como del tipo de almidón granular procesado. Ventajosamente, el jarabe de glucosa que se puede obtener usando la TrAA proporcionada y las variantes de la misma puede contener aproximadamente un 96% p/p de D-glucosa. La cantidad máxima de glucosa que se puede obtener actualmente con cualquier ajuste de las condiciones de sacarificación se encuentra entre aproximadamente 95 y 97%. El jarabe de glucosa se puede usar directamente tras la concentración para la producción de jarabes con alto contenido en fructosa o para la producción de glucosa cristalina. De forma igualmente ventajosa, el jarabe de maltosa que se puede obtener usando la TrAA proporcionada y las variantes de la misma puede contener más del 60% p/p de maltosa.

[0102] En general, la TrAA o una variante de la misma se añade a una suspensión de un sustrato de almidón granular en una cantidad de aproximadamente 0,01 a 1 kg de enzima por tonelada métrica de sólidos secos. En algunas realizaciones, la TrAA o una variante de la misma se añade en una cantidad de 0,1 a 5 kg/tm de ss o de 0,3 a 1 kg/tm de ss, o a aproximadamente 0,5 kg/tm de ss. La actividad específica de la TrAA o de la variante de la misma puede ascender a entre aproximadamente 10.000 y 80.000 SKBU/g de enzima o a entre aproximadamente

15.000 y 60.000 SKBU/g o a entre aproximadamente 15.000 y 30.000 SKBU/g.

[0103] La TrAA o una variante de la misma se puede añadir a la suspensión en forma de enzima purificada. De forma alternativa, la TrAA o una variante de la misma se puede añadir en forma de una solución de enzima aislada. En una realización, la TrAA o una variante de la misma se añade en forma de un extracto celular producido a partir de un cultivo de células que expresan la TrAA o la variante de la misma. En otra realización, la TrAA o una variante se añade en forma de una célula huésped que expresa y secreta la TrAA o la variante al medio de reacción, de manera que la enzima es proporcionada de forma continua a la reacción. En esta realización, la célula huésped que expresa la TrAA o una variante de la misma también puede expresar otra enzima que se use además de la TrAA o su variante para catalizar la sacarificación. Por ejemplo, una célula huésped, por ejemplo Trichoderma reesei

o Aspergillus niger, se pueden manipular para que coexpresen la TrAA o una variante de la misma y una glucoamilasa, por ejemplo TrGA o HgGA. En una realización, la célula huésped se modifica genéticamente de manera que no exprese su glucoamilasa endógena.

Jarabes de glucosa

[0104] En un aspecto, la TrAA y sus variantes se usan en un proceso de sacarificación para producir un jarabe rico en glucosa. Para producir un jarabe de glucosa, la TrAA o las variantes de la misma se añaden típicamente con una glucoamilasa (EC 3.2.1.3), por ejemplo la glucoamilasa AMGTM. Como se muestra en la tabla 1 y en la fig. 1 y se comenta en los ejemplos más adelante, el proceso de sacarificación catalizado por la TrAA o una variante de la misma en presencia de una glucoamilasa puede proporcionar concentraciones de glucosa próximas o superiores al 97%. Ventajosamente, se puede alcanzar una concentración máxima de glucosa en menos tiempo que catalizando la reacción con glucoamilasa sola. En una realización, las concentraciones máximas de glucosa se alcanzan al cabo de 12 horas, 24 horas o 36 horas. Véanse la tabla 2 y el texto asociado en los ejemplos. De forma especialmente ventajosa, la TrAA y sus variantes suprimen la reacción inversa de glucosa a maltooligosacáridos, de manera que la concentración máxima de glucosa se mantiene durante más tiempo que en un proceso de sacarificación convencional. Véase la tabla 2. En algunas realizaciones, la concentración máxima de glucosa se mantiene durante aproximadamente 12 horas o aproximadamente 24 horas una vez alcanzada la concentración máxima.

[0105] Un ejemplo de una glucoamilasa es la glucoamilasa de Trichoderma reesei (TrGA) y variantes de la misma que poseen una actividad específica y termoestabilidad superiores. Véanse las solicitudes publicadas de EE.UU. nº 2006/0094080, 2007/0004018 y 2007/0015266 (Genencor International, Inc.). Las variantes adecuadas de la TrGA incluyen aquellas que presentan actividad glucoamilasa y una identidad de secuencia con la TrGA natural de al menos 80%, al menos 90% o al menos 95%. La TrAA y sus variantes incrementan ventajosamente el rendimiento de glucosa producida en un proceso de sacarificación catalizado por la TrGA. Sin la adición de TrAA o sus variantes, la TrGA produce típicamente una solución con aproximadamente 88% de glucosa a pH 4,3; sin embargo, cuando se añaden a la reacción la TrAA o sus variantes, la mezcla de TrAA y TrGA produce significativamente una solución con una concentración mayor de glucosa, por ejemplo del 94%.

[0106] De forma alternativa, la glucoamilasa puede ser otra glucoamilasa procedente de plantas, hongos o bacterias. Por ejemplo, las glucoamilasas pueden ser la glucoamilasa G1 o G2 de Aspergillus niger o sus variantes (por ejemplo, Boel y col., EMBO J. 3: 1097-1102 (1984), documentos WO 92/00381 y WO 00/04136 (Novo Nordisk A/S)); y la glucoamilasa de A. awamori (por ejemplo, documento WO 84/02921 (Cetus Corp.)). Otras glucoamilasas de Aspergillus que se consideran incluyen variantes con una mayor termoestabilidad, por ejemplo G137A y G139A (Chen y col., Prot. Eng. 9: 499-505 (1996)); D257E y D293E/Q (Chen y col., Prot. Eng. 8: 575-582 (1995)); N182 (Chen y col., Biochem. J. 301: 275-281 (1994)); A246C (Fierobe y col., Biochemistry, 35: 8698-8704 (1996)); y variantes con restos Pro en las posiciones A435 y S436 (Li y col., Protein Eng. 10: 1199-1204 (1997)). Otras glucoamilasas que se consideran incluyen las glucoamilasas de Talaromyces, en particular las procedentes de T. emersonii (por ejemplo, documento WO 99/28448 (Novo Nordisk A/S), T. leycettanus (por ejemplo, patente de EE.UU. nº RE 32,153 (CPC International, Inc.)), T. duponti o T. thermophilus (por ejemplo, patente de EE.UU. nº 4,587,215). Las glucoamilasas bacterianas que se consideran incluyen las glucoamilasas del género Clostridium, en particular C. thermoamylolyticum (por ejemplo, documento EP 135,138 (CPC International, Inc.)) y C. thermohydrosulfuricum (por ejemplo, documento WO 86/01831 (Michigan Biotechnology Institute)). Las glucoamilasas adecuadas incluyen las glucoamilasas procedentes de Aspergillus oryzae, como una glucoamilasa que presenta una homología del 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% o incluso del 90% con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:2 en el documento WO 00/04136 (Novo Nordisk A/S). Asimismo son adecuadas las glucoamilasas comerciales, tales como AMG 200L; AMG 300L; SANTM SUPER y AMGTM E (de Novozymes): OPTIDEX® 300 (de Genencor International, Inc.); AMIGASETM y AMIGASETM PLUS (de DSM); GZYME® G900 (de Enzyme BioSystems); y G-ZYME® G990 ZR (una glucoamilasa de A. niger con un bajo contenido en proteasas). Las glucoamilasas se añaden típicamente en una cantidad de 0,02 a 2,0 UG/g de ss o de 0,1 a 1,0 UG/g de ss, por ejemplo 0,2 UG/g de ss.

[0107] Otras enzimas adecuadas que se pueden usar con la TrAA o sus variantes incluyen una enzima desramificante, tal como una isoamilasa (EC 3.2.1.68). Las enzimas desramificantes se pueden añadir en las cantidades eficaces conocidas para el experto en la técnica. También resulta adecuada una pululanasa (EC 3.2.1.41), por ejemplo Promozyme®. La pululanasa se añade típicamente a 100 U/kg de ss. Otras enzimas adecuadas incluyen proteasas, tales como proteasas fúngicas y bacterianas. Las proteasas fúngicas incluyen las obtenidas de Aspergillus, como A. niger, A. awamori, A. oryzae; Mucor (por ejemplo, M. miehei); y Rhizopus. Otras enzimas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, celulasas, hemicelulasas, lipasas y cutinasas.

[0108] Mientras que la licuefacción generalmente funciona en forma de un proceso continuo, la sacarificación se efectúa con frecuencia en forma de un proceso discontinuo. La sacarificación típicamente es más eficaz a temperaturas de aproximadamente 60ºC y a un pH de aproximadamente 4,0 a 4,5, por ejemplo a pH 4,3, requiriendo enfriamiento y ajuste del pH del almidón licuado. La sacarificación se puede realizar, por ejemplo, a una temperatura comprendida entre aproximadamente 40ºC, aproximadamente 50ºC o aproximadamente 55ºC y aproximadamente 60ºC. La sacarificación se efectúa normalmente en tanques agitados, que pueden tardar varias horas en llenarse o vaciarse. Las enzimas se añaden típicamente o bien a una razón fija a los sólidos secos mientras se llenan los tanques o bien se añaden en forma de una sola dosis al comienzo de la etapa de llenado. Una reacción de sacarificación para preparar un jarabe de glucosa transcurre típicamente durante aproximadamente 24 a 72 horas o 24 a 28 horas o, en particular, 24 o menos horas, por ejemplo 20 a 21 horas. Una vez alcanzado un ED máximo, la reacción se detiene, por ejemplo, calentándola a 85ºC durante 5 min. Una incubación adicional dará lugar a un ED más bajo, llegando finalmente a aproximadamente 90 ED, puesto que la glucosa acumulada se vuelve a polimerizar para dar isomaltosa con la aproximación del equilibrio termodinámico. El rendimiento final de glucosa, en porcentaje de los sólidos secos totales solubilizados, puede ascender a al menos aproximadamente 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% o 98%. En una realización, la glucosa se produce en un proceso continuo, y sustancialmente toda la glucosa se usa para producir un producto de fermentación, tal como etanol.

4.3.2. Jarabes de maltosa

[0109] En otro aspecto, la TrAA o una variante de la misma se usa en un proceso de producción de un jarabe con un alto contenido en maltosa. Entre las ventajas que ofrece la TrAA y sus variantes se encuentra la posibilidad de usar la TrAA y sus variantes a pH relativamente bajos. En la fig. 2 se representa una dependencia de pH representativa de la TrAA para la producción de maltosa (DP2). Puesto que la sacarificación típicamente transcurre en condiciones ácidas y a temperaturas elevadas, por ejemplo a 60ºC y pH 4,3, la alta actividad de la TrAA o de sus variantes en estas condiciones permite ventajosamente el uso de la TrAA o de sus variantes en condiciones que son óptimas para otras enzimas, por ejemplo las glucoamilasas, usadas en la sacarificación.

[0110] Los jarabes con un alto contenido en maltosa producidos con una TrAA o sus variantes presentan propiedades ventajosas. La concentración de maltosa alcanzada usando la TrAA o sus variantes es comparable o superior a la que se alcanza con las enzimas maltogénicas convencionales, tales como BBA o la a-amilasa fúngica Clarase® L. Véanse las tablas 3 y 4 y la fig. 2. En una realización, la concentración de maltosa alcanza un porcentaje de sólidos secos de aproximadamente 50% a aproximadamente 62%. En otra realización, la concentración de maltosa llega de aproximadamente 55%, aproximadamente 60% o aproximadamente 61% a aproximadamente 62%. Además, el jarabe con un alto contenido en maltosa obtenido usando la TrAA puede contener glucosa en una concentración de aproximadamente 8 a 9%, mientras que un jarabe convencional con un alto contenido en maltosa producido en condiciones comparables, por ejemplo usando Clarase® L, presenta típicamente una concentración de glucosa de aproximadamente 4 a 5%. Véase la tabla 3. El rendimiento relativamente alto de glucosa hace que el jarabe con un alto contenido en maltosa preparado usando la TrAA o sus variantes sea más dulce que los jarabes con un alto contenido en maltosa producidos usando enzimas convencionales.

[0111] La TrAA o una variante de la misma puede catalizar la producción de un jarabe con un alto contenido en maltosa por sí misma o en presencia de al menos otra enzima más. Una enzima especialmente adecuada para el uso con la TrAA o una variante de la misma es la pululanasa. La adición de una pululanasa aumenta significativamente el rendimiento de maltosa, como se muestra en la tabla 5 y en la fig. 3. La cantidad de pululanasa añadida puede ascender a aproximadamente 0,1 kg/tm de ss, a aproximadamente 0,25 kg/tm de ss o a aproximadamente 0,5 kg/tm de ss. En una realización, la cantidad de pululanasa añadida para proporcionar un incremento máximo de maltosa producida en la reacción. Los datos en la tabla 5 indican que el efecto de la pululanasa en la formación de maltosa es máximo cuando la concentración de pululanasa asciende a aproximadamente 0,25 kg/tm de ss en las condiciones concretas usadas para producir maltosa, indicadas en el texto que acompaña la tabla 5 en los ejemplos más adelante.

[0112] Otras enzimas adecuadas para el uso con la TrAA o variantes de la misma incluyen 1-amilasas bacterianas, por ejemplo BBA, otras a-amilasas fúngicas, por ejemplo Clarase® L, o la glucoamilasa. Otras enzimas adecuadas adicionales incluyen proteasas, tales como proteasas fúngicas y bacterianas. Las proteasas fúngicas incluyen las obtenidas de Aspergillus, como A. niger, A. awamori, A. oryzae; Mucor, por ejemplo M. miehei; y Rhizopus. Otras enzimas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, celulasas, hemicelulasas, lipasas, isoamilasas y cutinasas.

[0113] Las 1-amilasas (EC 3.2.1.2) son amilasas maltogénicas exoactivas que catalizan la hidrólisis de los enlaces a-1,4-glucosídicos para dar amilopectina y polímeros de glucosa relacionados, liberando de este modo maltosa. Las 1-amilasas se han aislado de diversas plantas y microorganismos. Véase Fogarty y col., en PROGRESS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, vol. 15, págs. 112-115 (1979). Estas 1-amilasas presentan temperaturas óptimas comprendidas en el intervalo de 40ºC a 65ºC y pH óptimos comprendidos en el intervalo de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,0. Las 1-amilasas que se consideran incluyen, pero no se limitan a, las 1-amilasas de cebada Spezyme® BBA 1500, Spezyme® DBA, OptimaltTM ME, OptimaltTM BBA (Genencor International, Inc.) y NovozymTM WBA (Novozymes A/S).

Producción de HFCS y fermentación

[0114] En una realización, el hidrolizado de almidón soluble producido mediante el tratamiento con TrAA, variantes de la misma o mezclas de enzimas que comprenden TrAA o sus variantes se convierte en un jarabe basado en almidón con alto contenido en fructosa (HFSS), tal como un jarabe de maíz con alto contenido en fructosa (HFCS). Esta conversión se puede lograr usando una glucosa isomerasa, en particular una glucosa isomerasa inmovilizada sobre un soporte sólido. El pH se aumenta a entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 8,0, por ejemplo a pH 7,5, y el Ca2+ se elimina mediante intercambio iónico. Las isomerasas adecuadas incluyen Sweetzyme® IT (Novozymes A/S); G-zyme® IMGI y G-zyme® G993, Ketomax®, G-zyme® G993, G-zyme® G993 líquido y GenSweet® IGI. Después de la isomerización la mezcla contiene típicamente entre aproximadamente 40 y 45% de fructosa, por ejemplo 42% de fructosa.

[0115] En otra realización, el hidrolizado de almidón soluble, en particular un jarabe rico en glucosa, se fermenta poniendo el hidrolizado en contacto con un organismo fermentador, típicamente a una temperatura de aproximadamente 32ºC, por ejemplo entre 30ºC y 35ºC. Los productos de fermentación incluyen etanol, ácido cítrico, glutamato monosódico, ácido glucónico, gluconato sódico, gluconato cálcico, gluconato potásico, glucono deltalactona y eritorbato sódico. Los procesos de sacarificación y fermentación se pueden llevar a cabo en forma de un proceso de sacarificación y fermentación simultáneo (SFS). La fermentación puede comprender opcionalmente una purificación y recuperación siguientes de etanol. Durante la fermentación, el contenido de etanol en el caldo o la "cerveza" puede alcanzar al menos aproximadamente 8%, al menos aproximadamente 12% o aproximadamente 16% de etanol. El caldo se puede destilar para producir soluciones de etanol enriquecidas, por ejemplo con una pureza del 96%. Además, el CO2 generado por fermentación se puede recoger con un lavador de CO2, comprimir y comercializar para otros usos, por ejemplo para la producción de bebidas gaseosas o de hielo seco. Los desechos sólidos del proceso de fermentación se pueden usar como productos ricos en proteínas, por ejemplo como alimento para ganado.

[0116] Los microorganismos productores de etanol incluyen levaduras, tales como Saccharomyces cerevisiae, y bacterias, por ejemplo Zymomonas mobilis, que expresan la alcohol deshidrogenasa y la piruvato descarboxilasa. En algunas realizaciones, el microorganismo productor de etanol expresa la xilosa reductasa y la xilitol deshidrogenasa, enzimas que convierten xilosa en xilulosa. Las fuentes comerciales de levadura incluyen RED STAR (Red Star); FERMIOL® (DSM Specialties) y SUPERSTART® (Alltech).

[0117] En una realización, las células fúngicas que expresan una glucoamilasa heteróloga y/o la TrAA o sus variantes se cultivan en condiciones de fermentación discontinua o continua. Una fermentación discontinua clásica consiste en un sistema cerrado en el que la composición del medio se fija al principio de la fermentación. Es decir, la fermentación se deja que transcurra sin la adición de ningún componente al sistema. En los cultivos discontinuos, las células progresan desde una fase de adaptación (lag) estática a una fase logarítmica de alto crecimiento y, finalmente, hasta una fase estacionaria, en la que la tasa de crecimiento disminuye o se detiene. En general, las células en fase logarítmica son las responsables de la mayor parte de la producción de glucoamilasa heteróloga y/o de TrAA o sus variantes.

[0118] Una variación de este proceso es el sistema de "fermentación discontinua alimentada", en el que el sustrato se añade en incrementos a medida que la fermentación progresa. Los sistemas discontinuos alimentados son útiles cuando la represión catabólica puede inhibir el metabolismo de las células y cuando resulta deseable tener cantidades limitadas de sustrato en el medio. La concentración real de sustrato en los sistemas discontinuos alimentados se estima en base a los cambios observados en factores medibles, tales como pH, oxígeno disuelto y la presión parcial de los gases de desecho, tales como CO2. Las fermentaciones discontinua y discontinua alimentada son habituales y conocidas en la técnica.

[0119] La fermentación continua es un sistema abierto en el que se añade de forma continua un medio de fermentación definido a un biorreactor y se retira simultáneamente la misma cantidad de medio acondicionado para el procesamiento. La fermentación continua generalmente mantiene los cultivos a una densidad elevada constante, encontrándose las células principalmente en la fase de crecimiento logarítmico. La fermentación continua permite modular el crecimiento celular y/o la concentración de producto. Por ejemplo, en una realización, un nutriente limitante, tal como la fuente de carbono o la fuente de nitrógeno, se mantiene a una tasa fija y todos los demás parámetros se pueden modular. Puesto que el crecimiento se mantiene en estado estacionario, la pérdida de células debida a la retirada del medio se deberá compensar con la tasa de crecimiento celular en la fermentación. En la técnica de la microbiología industrial se conocen procedimientos para optimizar los procesos de fermentación continua y maximizar la tasa de formación de producto.

Composiciones y procedimientos para hornear y preparar alimentos

[0120] Para el uso comercial y casero de harina para hornear y producir alimentos es importante mantener un nivel apropiado de actividad a-amilasa en la harina. Un nivel de actividad demasiado alto puede dar como resultado un producto que es pegajoso y/o pastoso y, por lo tanto, no comercializable. Una harina con una actividad a-amilasa insuficiente puede no contener suficiente azúcar para que la levadura funcione adecuadamente, dando como resultado pan o productos horneados secos y quebradizos. Por consiguiente, se puede añadir a la harina una TrAA

o una variante de la misma, sola o en combinación con otra(s) a-amilasa(s), para aumentar el nivel de la actividad aamilasa endógena en la harina. En esta realización, la TrAA o variante de la misma puede presentar una temperatura óptima en presencia de almidón comprendida en los intervalos de 30 a 90ºC, 40 a 80ºC, 40 a 50ºC, 45 a 65ºC o 50 a 60ºC, por ejemplo. El pH óptimo en una solución de almidón soluble al 1% puede encontrarse, por ejemplo, entre pH 4,5 y 6.

[0121] Para la producción de cerveza, tanto en la industria como en la producción de cerveza casera, también se usan granos, tales como cebada, avena, trigo, así como componentes vegetales, tales como maíz, lúpulo y arroz. Los componentes usados en la producción de cerveza pueden estar sin maltear o malteados, es decir, parcialmente germinados, lo que da como resultado un aumento de los niveles de enzimas, incluida la a-amilasa. Para una producción eficaz de cerveza se requieren unos niveles adecuados de la actividad enzimática a-amilasa, con el fin de asegurar los niveles apropiados de azúcares para la fermentación. Por consiguiente, se puede añadir una TrAA o variante de la misma, sola o en combinación con otra(s) a-amilasa(s), a los componentes usados para la producción de cerveza.

[0122] Como se usa en la presente memoria, el término "harina" se refiere a granos de cereales molidos o triturados. El término "harina" también puede referirse a sagú o productos de tubérculos que hayan sido triturados o picados. En algunas realizaciones, la harina también puede contener componentes adicionales al cereal o material vegetal molido o picado. Un ejemplo de un componente adicional es, sin pretender que sea limitante, un agente leudante. Los granos de cereales incluyen trigo, avena, centeno y cebada. Los productos de tubérculos incluyen harina de tapioca, harina de yuca y polvo de anón. El término "harina" también incluye harina de maíz triturada, maíz harinoso, harina de arroz, harina integral, harina autofermentante, harina de tapioca, harina de yuca, arroz triturado, harina enriquecida y polvo de anón.

[0123] Como se usa en la presente memoria, el término "materia prima" se refiere a granos y componentes vegetales que se machacan o rompen. Por ejemplo, la cebada que se usa en la producción de cerveza es un grano que se ha triturado o machado toscamente para obtener una consistencia apropiada para producir una masa para fermentación. Como se usa en la presente memoria, el término "materia prima" incluye cualquiera de los tipos de plantas y granos antes mencionados en las formas machacada o triturada toscamente. Los procedimientos descritos en la presente memoria se pueden usar para determinar los niveles de la actividad a-amilasa tanto en las harinas como en la materia prima.

[0124] También se puede añadir una TrAA o una variante de la misma, sola o en combinación con otras amilasas, para prevenir o retrasar el enranciamiento, es decir, el endurecimiento de la miga de los productos horneados. La cantidad de amilasa anti-enranciamiento se encontrará típicamente en el intervalo de 0,01 a 10 mg de proteína enzimática por kg de harina, por ejemplo en 0,5 mg/kg de ss. Otras amilasas anti-enranciamiento adicionales que se pueden usar en combinación con una TrAA o una variante de la misma incluyen una endoamilasa, por ejemplo una endo-amilasa bacteriana de Bacillus. La amilasa adicional puede ser otra a-amilasa maltogénica (EC 3.2.1.133), por ejemplo de Bacillus. Novamyl® es un ejemplo de una a-amilasa maltogénica de la cepa NCIB 11837 de B. stearothermophilus y se describe en Christophersen y col., Starch 50: 39-45 (1997). Otros ejemplos de endo-amilasas anti-enranciamiento incluyen a-amilasas bacterianas procedentes de Bacillus, tales como B. licheniformis o B. amyloliquefaciens. La amilasa anti-enranciamiento puede ser una exo-amilasa, tal como una 1-amilasa, procedente, por ejemplo, de fuentes vegetales, tales como haba de soja, o de fuentes microbianas, tales como Bacillus.

[0125] La composición para hornear que comprende una TrAA o una variante de la misma puede comprender adicionalmente una fosfolipasa. La fosfolipasa puede presentar actividad A1 o A2 para eliminar el ácido graso de los fosfolípidos, formando un lisofosfolípido. Puede o no poseer actividad lipasa, es decir, actividad sobre sustratos triglicerídicos. La fosfolipasa típicamente presenta una temperatura óptima comprendida en el intervalo de 30 a 90ºC, por ejemplo de 30 a 70ºC. Las fosfolipasas añadidas pueden ser de origen animal, por ejemplo de páncreas, por ejemplo de páncreas bovino o porcino, veneno de serpiente o veneno de abeja. De forma alternativa, la fosfolipasa puede ser de origen microbiano, por ejemplo de hongos filamentosos, levaduras o bacterias, tales como del género o especie Aspergillus, A. niger; Dictyostelium, D. discoideum; Mucor, M. javanicus, M. mucedo, M. subtilissimus; Neurospora, N. crassa; Rhizomucor, R. pusillus; Rhizopus, R. arrhizus, R. japonicus, R. stolonifer; Sclerotinia, S. libertiana; Trichophyton, T. rubrum; Whetzelinia, W. sclerotiorum; Bacillus, B. megaterium, B. subtilis; Citrobacter, C. freundii; Enterobacter, E. aerogenes, E. cloacae; Edwardsiella, E. tarda; Etwinia, E. herbicola; Escherichia, E. coli; Klebsiella, K. pneumoniae; Proteus, P. vulgaris; Providencia, P. stuartii; Salmonella, S. thyphimurium; Serratia, S. liquefasciens, S. marcescens; Shogella, S. flexneri; Streptomyces, S. violeceoruber; Yersinia, Y. enterococolitica; Fusarium, F. oxysporum (cepa DSM 2672), por ejemplo.

[0126] La fosfolipasa se añade en una cantidad tal que mejore la ternura del pan durante el periodo inicial después del horneado, en particular durante las primeras 24 horas. La cantidad de fosfolipasa se encontrará típicamente en el intervalo de 0,01 a 10 mg de proteína enzimática por kg de harina, por ejemplo de 0,1 a 5 mg/kg. Esto es, la actividad fosfolipasa se encontrará generalmente en el intervalo de 20 a 1.000 unidades lipasa (UL)/kg de harina, definiéndose una unidad lipasa como la cantidad de enzima necesaria para liberar 1 µmol de ácido butírico por minuto a 30ºC, pH 7, con goma arábiga como emulsionante y tributirina como sustrato.

[0127] Las composiciones de la masa generalmente comprenden sémola de trigo o harina de trigo y/u otros tipos de sémola, harina o almidón, tal como harina de maíz, almidón de maíz, sémola de centeno, harina de centeno, harina de avena, sémola de avena, harina de soja, sémola de sorgo, harina de sorgo, sémola de patata, harina de patata o almidón de patata. La masa puede ser fresca, congelada o parcialmente horneada. La masa puede ser una masa leudada o una masa que se ha de someter a una leudación. La masa se puede leudar de varias maneras, como por adición de agentes leudantes químicos, por ejemplo bicarbonato sódico, o por adición de un leudado, es decir, una masa de fermentación. La masa también se puede leudar por adición de un cultivo de levadura adecuado, tal como un cultivo de Saccharomyces cerevisiae (levadura de panadero), por ejemplo una cepa de S. cerevisiae disponible en el mercado.

[0128] La masa también puede comprender otros ingredientes de masa convencionales, por ejemplo proteínas, tales como leche en polvo, gluten y soja; huevos (por ejemplo huevos enteros, yemas de huevo o claras de huevo); un oxidante, tal como ácido ascórbico, bromato potásico, yodato potásico, azodicarbonamida (ADA) o persulfato amónico; un aminoácido, tal como L-cisteína; un azúcar; o una sal, tal como cloruro sódico, acetato cálcico, sulfato sódico o sulfato cálcico. La masa puede comprender además grasa, por ejemplo triglicéridos, tales como grasa granulada o manteca. La masa puede comprender adicionalmente un emulsionante, tal como mono-o diglicéridos, ésteres de ácido diacetiltartárico y mono-o diglicéridos, ésteres de azúcares y ácidos grasos, ésteres de poliglicerol y ácidos grasos, ésteres de ácido láctico y monoglicéridos, ésteres de ácido acético y monoglicéridos, estearatos de polioxietileno o lisolecitina. En particular, la masa se puede preparar sin la adición de emulsionantes.

[0129] Opcionalmente, se puede usar una enzima adicional junto con la amilasa anti-enranciamiento y la fosfolipasa. La enzima adicional puede ser una segunda amilasa, tal como una amiloglucosidasa, una 1-amilasa, una ciclodextrina glucanotransferasa, o la enzima adicional puede ser una peptidasa, en particular una exopeptidasa, una transglutaminasa, una lipasa, una celulasa, una hemicelulasa, en particular una pentosanasa tal como xilanasa, una proteasa, una proteína disulfuro isomerasa, por ejemplo una proteína disulfuro isomerasa como se describe, por ejemplo, en el documento WO 95/00636, una glucosiltransferasa, una enzima ramificante (enzima ramificante de a-1,4-glucano), una a-4-glucanotransferasa (dextrina glucosiltransferasa) o una oxidorreductasa, por ejemplo una peroxidasa, una lacasa, una glucosa oxidasa, una piranosa oxidasa, una lipooxigenasa, una L-aminoácido oxidasa o una carbohidrato oxidasa. La(s) enzima(s) adicional(es) pueden ser de cualquier origen, incluyendo mamíferos y plantas, y en particular de origen microbiano (bacteriano, de levadura o fúngico) y se pueden obtener mediante técnicas usadas convencionalmente en la técnica.

[0130] La xilanasa es típicamente de origen microbiano, procedente, por ejemplo, de una bacteria o de un hongo, tal como de una cepa de Aspergillus, en particular de A. aculeatus, A. niger (documento WO 91/19782), A. awamori (por ejemplo, documento WO 91/18977) o A. tubingensis (por ejemplo, documento WO 92/01793); de una cepa de Trichoderma, por ejemplo T. reesei, o de una cepa de Humicola, por ejemplo H. insolens (por ejemplo, documento WO 92/17573). Pentopan® y Novozym 384® son preparaciones de xilanasa disponibles en el mercado producidas a partir de Trichoderma reesei. La amiloglucosidasa puede ser una amiloglucosidasa de A. niger (tal como AMG®). Otros productos de amilasa útiles incluyen Grindamyl® A 1000 o A 5000 (disponible en Grindsted Products, Dinamarca) y Amylase® H o Amylase® P (disponibles en Gist-Brocades, Países Bajos). La glucosa oxidasa puede ser una glucosa oxidasa fúngica, en particular una glucosa oxidasa de Aspergillus niger (tal como Gluzyme®). Un ejemplo de una proteasa es Neutrase®. Un ejemplo de una lipasa puede proceder de cepas de Thermomyces (Humicola), Rhizomucor, Candida, Aspergillus, Rhizopus o Pseudomonas, en particular de Thermomyces lanuginosus (Humicola lanuginosa), Rhizomucor miehei, Candida antarctica, Aspergillus niger, Rhizopus delemar o Rhizopus arrhizus, o Pseudomonas cepacia. En realizaciones específicas, la lipasa puede ser la lipasa A o la lipasa B procedente de Candida antarctica, como se describe, por ejemplo, en el documento WO 88/02775, o la lipasa puede proceder de Rhizomucor miehei, como se describe, por ejemplo, en el documento EP 238023, o de Humicola lanuginosa, descrita, por ejemplo, en el documento EP 305216, o de Pseudomonas cepacia, como se describe, por ejemplo, en los documentos EP 214761 y WO 89/01032.

[0131] El procedimiento se puede usar para cualquier tipo de producto horneado preparado a partir de una masa, ya sea de carácter tierno o crujiente o de tipo blanco, ligero o negro. Ejemplos son pan, en particular pan blanco, integral o de centeno, típicamente en forma de barras u hogazas, tales como, pero sin limitarse a, pan francés de tipo baguette, pan pita, tortillas, tortas, tortitas, bizcochos, galletas, masa para pasteles, pan crujiente, pan al vapor, pizza y similares.

[0132] En otra realización, una TrAA o una variante de la misma se puede usar en una mezcla previa que comprende harina junto con una amilasa anti-enranciamiento, una fosfolipasa y un fosfolípido. La mezcla previa puede contener otros aditivos que mejoren la masa y/o que mejoren el pan, por ejemplo cualquiera de los aditivos mencionados anteriormente, incluidas las enzimas. En un aspecto, la TrAA o la variante de la misma es un componente de una preparación enzimática que comprende una amilasa anti-enranciamiento y una fosfolipasa para uso como aditivo de horneado.

[0133] La preparación enzimática se encuentra opcionalmente en forma de granulado o polvo aglomerado. La preparación puede presentar una distribución estrecha del tamaño de partículas, estando más del 95% (en peso) de las partículas comprendidas en el intervalo de 25 a 500 µm. Los granulados y polvos aglomerados se pueden preparar mediante procedimientos convencionales, por ejemplo pulverizando la TrAA o la variante de la misma sobre un portador en un granulador de lecho fluidizado. El portador puede componerse de núcleos particulados que presentan un tamaño de partícula adecuado. El portador puede ser soluble o insoluble, por ejemplo una sal (tal como NaCl o sulfato sódico), un azúcar (tal como sacarosa o lactosa), un alcohol de azúcar (tal como sorbitol), almidón, arroz, copos de maíz o soja.

[0134] Otro aspecto contempla el envolvimiento de partículas que comprenden una TrAA o una variante de la misma, es decir, partículas de a-amilasa. Para preparar las partículas de a-amilasa envueltas la enzima se pone en

contacto con un lípido de calidad alimentaria en una cantidad suficiente para suspender todas las partículas de aamilasa. Como se usa en la presente memoria, los lípidos de calidad alimentaria pueden ser cualquier compuesto orgánico natural insoluble en agua pero soluble en disolventes orgánicos no polares, tales como hidrocarburos o éter dietílico. Los lípidos de calidad alimentaria adecuados incluyen, pero no se limitan a, triglicéridos, tanto en forma de grasas como de aceites, que están saturados o insaturados. Ejemplos de ácidos grasos y combinaciones de los mismos que componen los triglicéridos saturados incluyen, pero no se limitan a, los ácidos butírico (procedente de la grasa de la leche), palmítico (procedente de grasa animal y vegetal) y/o esteárico (procedente de grasa animal y vegetal). Ejemplos de ácidos grasos y combinaciones de los mismos que componen los triglicéridos insaturados incluyen, pero no se limitan a, los ácidos palmitoleico (procedente de grasa animal y vegetal), oleico (procedente de grasa animal y vegetal), linoleico (procedente de aceites vegetales) y/o linolénico (procedente de aceite de linaza). Otros lípidos de calidad alimentaria adecuados incluyen, pero no se limitan a, monoglicéridos y diglicéridos derivados de los triglicéridos comentados anteriormente, fosfolípidos y glucolípidos.

[0135] El lípido de calidad alimentaria, en particular en forma líquida, se pone en contacto con una forma pulverizada de las partículas de a-amilasa de tal manera que el material lipídico cubra al menos una parte de la superficie de al menos la mayoría, por ejemplo el 100%, de las partículas de a-amilasa. Así, cada partícula de aamilasa está envuelta individualmente en un lípido. Por ejemplo, todas o sustancialmente todas las partículas de aamilasa están provistas de una película envolvente fina y continua de lípido. Esto se puede lograr vertiendo en primer lugar una cantidad de lípido en un recipiente y suspendiendo después las partículas de a-amilasa de manera que el lípido humedezca totalmente la superficie de cada partícula de a-amilasa. Después de un breve periodo de agitación se recuperan las partículas de a-amilasa envueltas, que llevan una cantidad sustancial de los lípidos en su superficie. El grosor del recubrimiento así aplicado sobre las partículas de a-amilasa se puede controlar seleccionando el tipo de lípido usado y, si se desea, repitiendo la operación con el fin de generar una película más gruesa.

[0136] El almacenamiento, la manipulación y la incorporación del vehículo portador cargado se pueden realizar por medio de una mezcla envasada. La mezcla envasada puede comprender la a-amilasa envuelta. No obstante, la mezcla envasada puede contener además ingredientes adicionales según lo requiera el fabricante o el panadero. Una vez incorporada la a-amilasa envuelta en la masa, el panadero continúa con el proceso de producción normal para ese producto.

[0137] Las ventajas de envolver las partículas de a-amilasa son dos. En primer lugar, el lípido de calidad alimentaria protege la enzima de la desnaturalización térmica durante el proceso de horneado para aquellas enzimas que son termolábiles. Por consiguiente, mientras la a-amilasa está estabilizada y protegida durante las etapas de crecimiento de la masa y horneado, se separa del recubrimiento protector en el producto acabado final horneado, en el que hidroliza los enlaces glucosídicos para dar poliglucanos. El vehículo portador cargado también proporciona una liberación sostenida de la enzima activa en el producto acabado horneado. Es decir, después del proceso de horneado, la a-amilasa activa es liberada continuamente del recubrimiento protector a una velocidad que contrarresta y, por tanto, reduce la velocidad de los mecanismos de enranciamiento.

[0138] En general, la cantidad de lípido aplicada sobre las partículas de a-amilasa puede variar desde un bajo porcentaje del peso total de la a-amilasa hasta muchas veces ese peso, dependiendo de la naturaleza del lípido, la manera en que éste se ha aplicado sobre las partículas de a-amilasa, la composición de la mezcla de masa que se ha de tratar y el rigor con el que se realiza la operación de mezclado de la masa implicada.

[0139] El vehículo portador cargado, es decir, la enzima envuelta en lípido, se añade a los ingredientes usados para preparar un producto acabado horneado en una cantidad eficaz para prolongar la vida del producto acabado horneado en almacenamiento. El panadero calcula la cantidad de a-amilasa envuelta, preparada como se ha descrito anteriormente, que se requerirá para lograr el efecto anti-enranciamiento deseado. La cantidad de aamilasa envuelta requerida se calcula en base a la concentración de enzima envuelta y la proporción de a-amilasa para la harina especificada. Ha resultado ser eficaz un amplio intervalo de concentraciones, si bien, como se ha comentado, las mejoras observables en el anti-enranciamiento no se corresponden linealmente con la concentración de a-amilasa, pero por encima de ciertos niveles mínimos, unos grandes incrementos de la concentración de aamilasa producen escasas mejoras adicionales. La concentración de a-amilasa usada realmente en una producción panadera concreta puede ser mucho mayor que la mínima necesaria con el fin de proporcionar al panadero cierta seguridad contra errores de medición por defecto involuntarios por parte del panadero. El límite inferior de la concentración de enzima se determina mediante el efecto anti-enranciamiento mínimo que desee alcanzar el panadero.

[0140] Un procedimiento de preparación de un producto acabado horneado puede comprender: a) preparar partículas de a-amilasa recubiertas de lípido, quedando recubiertas sustancialmente todas las partículas de aamilasa; b) mezclar una masa que contiene harina; c) añadir la a-amilasa recubierta de lípido a la masa antes de completar el mezclado y terminar el mezclado antes de que el recubrimiento lipídico se desprenda de la a-amilasa; d) hacer crecer la masa; y e) hornear la masa para proporcionar el producto acabado horneado, en el que la aamilasa es inactiva durante las etapas de mezclado, crecimiento de la masa y horneado y es activa en el producto acabado horneado.

[0141] La a-amilasa envuelta se puede añadir a la masa durante el ciclo de mezclado, por ejemplo hacia el final del ciclo de mezclado. La a-amilasa envuelta se añade en un punto de la etapa de mezclado que permita una distribución suficiente de la a-amilasa envuelta en la masa; sin embargo, la etapa de mezclado se termina antes de que el recubrimiento protector se desprenda de la(s) partícula(s) de a-amilasa. Dependiendo del tipo y volumen de la masa y de la acción y velocidad del mezclador, se puede requerir entre uno y seis minutos o más para mezclar la aamilasa envuelta con la masa, pero dos a cuatro minutos es la media. Por lo tanto, varias variables pueden determinar el procedimiento preciso. En primer lugar, la cantidad de a-amilasa envuelta debe tener un volumen total suficiente para permitir la dispersión de la a-amilasa envuelta en la mezcla de masa. Si la preparación de a-amilasa envuelta está altamente concentrada, puede ser necesario añadir aceite adicional a la mezcla previa antes de añadir la a-amilasa envuelta a la masa. Las recetas y los procesos de producción pueden requerir modificaciones específicas; no obstante, generalmente se pueden obtener buenos resultados cuando un 25% del aceite especificado en una fórmula de masa panadera se reserva fuera de la masa y se usa como vehículo para una aamilasa envuelta concentrada cuando se añade hacia el final del ciclo de mezclado. En el pan u otros productos horneados, especialmente en aquellos que presentan un bajo contenido en grasa, por ejemplo los panes de estilo francés, una mezcla de a-amilasa envuelta que constituye aproximadamente un 1% del peso de la harina seca es suficiente para mezclar apropiadamente la a-amilasa envuelta con la masa. El intervalo de porcentajes adecuados es amplio y depende de la fórmula, el producto acabado y los requisitos de la metodología de producción del panadero individual. En segundo lugar, la suspensión de a-amilasa envuelta se debe añadir a la mezcla con suficiente tiempo para que se mezcle por completo con la masa, pero no durante tanto tiempo como para que una acción mecánica excesiva desprenda el recubrimiento lipídico protector de las partículas de a-amilasas envueltas.

7. Composiciones para desencolar productos textiles y uso

[0142] También se consideran composiciones y procedimientos para el tratamiento de tejidos (por ejemplo, para desencolar un producto textil) usando una TrAA o una variante de la misma. Los procedimientos de tratamiento de tejidos son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 6,077,316). Por ejemplo, en un aspecto, el tacto y el aspecto de un tejido se mejora mediante un procedimiento que comprende poner el tejido en contacto con una TrAA o una variante de la misma en una solución. En un aspecto, el tejido se trata con la solución a presión.

[0143] En un aspecto, se aplica una TrAA o una variante de la misma durante o después de tejer un producto textil o durante la etapa de desencolado o en uno o más pasos adicionales de procesamiento del tejido. Durante la tejedura de los productos textiles, las hebras se exponen a una tensión mecánica considerable. Antes de tejer en telares mecánicos, los hilos de urdimbre con frecuencia se recubren con almidón o derivados de almidón encolantes para aumentar su resistencia a la tracción y prevenir la rotura. Se puede aplicar una TrAA o una variante de la misma durante o después de la tejedura para eliminar este almidón o derivados de almidón encolantes. Después de la tejedura se puede usar una TrAA o una variante para eliminar el recubrimiento encolante antes de procesar adicionalmente el tejido para asegurar un resultado homogéneo y resistente al lavado.

[0144] Una TrAA o una variante de la misma se puede usar sola o con otros reactivos químicos desencolantes y/o enzimas desencolantes para desencolar tejidos, incluidos los tejidos que contienen algodón, como aditivos de detergentes, por ejemplo en composiciones acuosas. Una TrAA o una variante de la misma también se puede usar en composiciones y procedimientos para producir un aspecto de lavado a la piedra en tejidos y prendas de mezclilla teñidos con índigo. Para la fabricación de ropa, el tejido se puede cortar y coser para producir ropa o prendas que posteriormente se acaban. En particular, para la fabricación de vaqueros de mezclilla se han desarrollado diferentes procedimientos de acabado enzimáticos. El acabado de una prenda de mezclilla normalmente se inicia con un paso de desencolado enzimático, durante el cual las prendas se someten a la acción de enzimas amilolíticas para conferir suavidad al tejido y hacer el algodón más accesible a los pasos de acabado enzimático siguientes. Se puede usar una TrAA o una variante de la misma en los procedimientos de acabado de prendas de mezclilla (por ejemplo, en un "proceso de prelavado biológico"), de desencolado enzimático y para conferir suavidad a los tejidos y/o en procesos de acabado.

EJEMPLOS

Ejemplo 1

1.1 Clonación del gen de la TrAA

[0145] Se aisló ADN cromosómico de T. reesei QM6a a partir de una masa micelial de un cultivo líquido en caldo de dextrosa de patata (DifcoTM, nº de cat. 254920) usando el sistema BIO101 Fast Prep® de acuerdo con el procedimiento descrito por el proveedor (Qbiogene, Inc., Irvine, CA). El ADN se purificó usando una columna Quick Spin (Qiagen, Inc., Valencia, CA; nº de cat. 28106). El gen de la TrAA se aisló usando cebadores con secuencias específicas de la TrAA, un cebador directo NSP331 (SEQ ID NO:6: ATGAAGCTCCGGTACGCTCTCC) y un cebador inverso NSP332 (SEQ ID NO:7: TCACGAAGACAGCAAGACAATGGGC) diseñados de acuerdo con la secuencia de nucleótidos predicha en la base de datos del genoma de Trichoderma reesei del Instituto de Genómica Adjunto del Departamento de Energía de Estados Unidos. Los cebadores estaban flanqueados en el extremo 5' por secuencias Gateway® AttB (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). El ADN cromosómico de T. reesei QM6a se usó como molde.

[0146] La mezcla de PCR contenía los componentes siguientes: 4 µl del cebador directo (10 µM); 4 µl del cebador inverso (10 µM); 1 µl de ADN molde (500 ng/µl); 2 µl de mezcla de dNTP (10 mM); 10 µl de tampón Cx 10x; y 0,5 µl de ADN polimerasa PfuTurbo® Cx Hotstart (Stratagene, La Jolla, CA; nº de cat. 600410). Se añadió agua desionizada hasta un volumen total de 100 µl. El protocolo para la PCR fue el siguiente: desnaturalización inicial durante 30 s a 98ºC, desnaturalización, alineamiento y extensión en 30 ciclos de 10 s a 98ºC; 30 s a 68ºC; 45 s a 72ºC, respectivamente, y un paso de extensión final de 10 min a 72ºC.

[0147] Los fragmentos de la PCR se analizaron mediante electroforesis en agarosa al 1%. Los fragmentos del tamaño esperado se aislaron usando el kit de purificación y extracción del gel (Qiagen nº de cat. 28706). Los fragmentos de la PCR se clonaron en el vector pDONR201 Gateway® Entry, y con él se transformaron células de E. coli DH5a Max Efficiency (Invitrogen nº de cat. 18258012). Se determinó la secuencia de nucleótidos del ADN insertado, y a partir de ella se dedujo la secuencia de ADN genómico del gen de la TrAA (SEQ ID NO:1).

1.2 Transformación de T. reesei y fermentación/expresión de TrAA

[0148] El ADN vectorial que contenía el gen de la TrAA se recombinó en el vector de expresión pTrex3g para

T. reesei, que se describe en detalle en el documento WO 2006/060062. Con el vector de expresión resultante se transformó una cepa huésped de T. reesei derivada de RL-P37 que presentaba diversas deleciones génicas (Lcbh1, Lcbh2, Legl1, Legl2, es decir, "cuatro deleciones"; véanse los documentos WO 92/06184 y WO 05/001036), usando bombardeo de partículas con el sistema PDS-1000/Helium (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA; nº de cat. 16502257). El protocolo se expone más adelante y se hace referencia a los ejemplos 6 y 11 del documento WO 05/001036.

[0149] Se preparó una suspensión de esporas (aproximadamente 5 x 108 esporas/ml) de una cepa de T. reesei con cuatro deleciones. Se esparció una suspensión de esporas de 100 a 200 µl sobre el centro de placas con medio mínimo (MM) con acetamida. El medio MM con acetamida se compone de 0,6 g/l de acetamida; 1,68 g/l de CsCl; 20 g/l de glucosa; 20 g/l de KH2PO4; 0,6 g/l de CaCl2·2H2O; solución de oligoelementos; 20 g/l de agar Noble; pH 5,5. Una solución concentrada de oligoelementos 1000x contenía 5,0 g/l de FeSO4·7H2O; 1,6 g/l de MnSO4·H2O; 1,4 g/l de ZnSO4·7H2O; y 1,0 g/l de CoCl2·6H2O. La suspensión de esporas se dejó secar en la superficie del medio MM con acetamida.

[0150] Para la transformación se siguieron las instrucciones del fabricante. Brevemente, se colocaron 60 mg de partículas de tungsteno M10 en un tubo de microcentrífuga. Se añadió 1 ml de etanol y la solución se dejó reposar durante 15 s. Las partículas se centrifugaron a 15.000 rpm durante 15 s. El etanol se eliminó y las partículas se lavaron tres veces con dH2O estéril antes de añadir 250 µl de glicerol al 50% (v/v) estéril. Se colocaron 25 µl de la suspensión de partículas de tungsteno en un tubo de microcentrífuga. Después se añadieron las soluciones siguientes bajo continua agitación en vórtex: 5 µl (100 a 200 ng/µl) de ADN plasmídico, 25 µl de CaCl2 2,5 M y 10 µl de espermidina 0,1 M. Las partículas se centrifugaron durante 3 s. El sobrenadante se retiró y las partículas se lavaron con 200 µl de etanol al 100% y se centrifugaron durante 3 s. Se retiró el sobrenadante, se añadieron 24 µl de etanol al 100% y se mezclaron mediante una pipeta, después se retiraron alícuotas de partículas de 8 µl y se colocaron en el centro de discos macroportadores en un desecador. Una vez seca la solución de tungsteno/ADN, los discos macroportadores se colocaron en una cámara de bombardeo junto con la placa de MM de acetamida con esporas y el proceso de bombardeo se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tras bombardear las esporas de la placa con las partículas de tungsteno/ADN, las placas se incubaron a 30ºC. Las colonias transformadas se transfirieron a placas nuevas con medio MM con acetamida y se incubaron a 30ºC.

1.3 Demostración de la actividad -amilasa de la TrAA expresada

[0151] Tras crecer durante 5 días en placas con medio MM con acetamida, los transformantes que mostraban una morfología estable se inocularon en frascos de agitación de 250 ml que contenían 30 ml de medio Proflo. El medio Proflo contenía 30 g/l de a-lactosa; 6,5 g/l de (NH4)sSO4; 2 g/l de KH2PO4; 0,3 g/l de MgSO4·7H2O; 0,2 g/l de CaCl2; solución de oligoelementos; 2 ml/l de Tween 80 al 10%; 22,5 g/l de harina de algodón ProFlo (Traders Protein, Memphis, TN); y 0,72 g/l de CaCO3. Tras dos días de crecimiento a 28ºC con agitación a 140 rpm se transfirió un 10% del cultivo Proflo a un frasco de agitación de 250 ml que contenía 30 ml de medio definido de lactosa. La composición del medio definido de lactosa es 5 g/l de (NH4)2SO4; 33 g/l de tampón PIPPS; 9 g/l de casaminoácidos; 4,5 g/l de KH2SO4; 1,0 g/l de MgSO4·7H2O; 5 ml/l de antiespumante Mazu DF60-P (Mazur Chemicals, IL); solución de oligoelementos; pH 5,5. Después de la esterilización se añadieron al medio 40 ml/l de una solución de lactosa al 40% (p/v). Los frascos de agitación con medio definido de lactosa se incubaron a 28ºC, 140 rpm, durante 4 a 5 días.

[0152] Los micelios se eliminaron por centrifugación y el sobrenadante se analizó en cuanto a proteínas totales (kit de ensayo de proteína BCA, Pierce CA; nº de cat. 23225). La actividad a-amilasa se ensayó usando el reactivo Ceralpha (p-nitrofenil maltoheptaósido bloqueado con bencilideno) como sustrato (Megazyme International Ireland, Ltd., Wicklow, Irlanda; nº de cat. K-CERA).

[0153] Se mezclaron muestras del sobrenadante del cultivo con un volumen apropiado de tampón de carga de muestras 2x con agente reductor, y las proteínas se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) usando el gel Bis-Tris al 10% NUPAGE® Novex con tampón de corrida MES SDS. Las proteínas se tiñeron con SimplyBlueTM SafeStain (Invitrogen, Carlsbad, CA). En la fig. 5, carril 1, se muestra el patrón de tinción de las proteínas de una muestra bruta del sobrenadante del cultivo. Es obvio que las células huésped expresan cantidades relativamente elevadas de una proteína con un peso molecular aparente de aproximadamente 47 kDa, como se determina por comparación con los marcadores del peso molecular en el carril

M. Se estima que esta TrAA presenta una pureza de aproximadamente 89%.

1.4 Caracterización bioquímica del producto génico de TrAA

[0154] Los transformantes que expresaban la TrAA se crecieron en un cultivo de 3 l. La célula huésped secretó TrAA al cultivo en una concentración de aproximadamente 15 a 20 g/l. El filtrado del cultivo se concentró usando una unidad de ultrafiltración con un límite para el peso molecular de 10.000 Da (Pall Corp., OmegaTM Membrane, nº de cat. OS010c10). La preparación enzimática bruta se purificó usando un sistema de FPLC ÄKTA explorer 100 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Se equilibró una columna HiPrep 16/10 FF Q-Sepharose (Amersham Biosciences, nº de cat. 17-5190-01) con Tris 25 mM, pH 6,0, y la proteína se eluyó de la columna con NaCl 100 mM, Tris 25 mM, pH 6,0. Se efectuó un segundo paso de cromatografía de afinidad usando la resina Cbind 200 (Novagen nº de cat. 701212-3) y Tris 50 mM, pH 7,0, que contenía NaCl 500 mM como tampón de elución. Después de esta purificación por afinidad, la TrAA se puede concentrar de nuevo por ultrafiltración como se ha descrito anteriormente. La TrAA purificada se analizó mediante SDS-PAGE, y los resultados se muestran en la fig. 5, carril 2. Se estimó que la TrAA presentaba una pureza de aproximadamente 98%.

[0155] Los perfiles de pH y temperatura de la actividad a-amilasa del producto génico se determinaron usando el reactivo Ceralpha (Megazyme International Ireland, Ltd., Wicklow, Irlanda; nº de cat. K-CERA) como sustrato. Como se muestra en la fig. 6A, la TrAA demostró tener un pH óptimo de aproximadamente pH 5 a 6 y, como se muestra en la fig. 6B, la TrAA demostró presentar una temperatura óptima de aproximadamente 42ºC en las condiciones de ensayo.

Ejemplo 2

[0156] La TrAA es útil para aumentar el rendimiento de glucosa en una reacción de sacarificación catalizada por una glucoamilasa a pH bajo. La TrAA (lote nº GCI2004017/018-UF) se purificó como se ha descrito en la sección

1.3 del ejemplo 1. La glucoamilasa era de GA-L, lote nº 901-04290-001 (Genencor International, Inc.), que presentaba una actividad de 385 UG/g. El sustrato consistía en un sustrato de almidón licuado preparado de la siguiente manera: Se diluyeron 745 g de almidón de maíz crudo con agua para crear una suspensión del 32% p/p de ss. Se añadió la a-amilasa bacteriana termoestable Spezyme® Ethyl (Genencor International, Inc.), lote nº 10704107-001, en una concentración de 0,3 kg/tm de ss y la solución se licuó a 92ºC durante 25 min. Se realizó un ensayo de yodo para medir la concentración residual de almidón usando procedimientos conocidos en la técnica.

[0157] El almidón licuado se enfrió a 60ºC y el pH se ajustó a 4,2 con ácido sulfúrico al 20% v/v. Se añadieron TrAA y Optimax® 4060 en las concentraciones indicadas más adelante y la reacción transcurrió durante 30 horas a 60ºC. Al final de la reacción se determinaron los DPn producidos en la reacción mediante HPLC después de diluir la muestra 1:40 con agua de calidad HPLC y filtrar las muestras a través de un filtro de 0,45 micrómetros. Para el análisis por HPLC se inyectaron muestras de 20 µl en una columna Phenomenex Rezex ROA-Organic Acid (H+) y se separaron en un ciclo de 16 min en una fase móvil de agua de calidad HPLC a 60ºC. Los productos (DPn) en el eluato se midieron registrando el cambio en el índice de refracción.

5 [0158] La tabla 1 muestra los DPn obtenidos en una reacción representativa; la fig. 1 representa la producción de DP1 en función de las concentraciones de enzima usadas en este experimento. Como se puede apreciar, la TrAA produce, en presencia de una glucoamilasa, un jarabe rico en glucosa que presenta una concentración de glucosa mayor que la que produce una glucoamilasa por sí sola.

10 TABLA 1

GA

TrAA Tiempo (h) DP1 DP2 DP3 DP4+

0,6 kg/tm de ss

Nada 30 95,7 1,7 0,2 2,5

0,6 kg/tm de ss

0,06 kg/tm de ss 30 96,7 1,7 0,1 1,5

0,6 kg/tm de ss

0,12 kg/tm de ss 30 96,7 1,8 0,2 1,3

0,6 kg/tm de ss

0,18 kg/tm de ss 30 97,0 1,8 0,2 1,1

0,6 kg/tm de ss

0,3 kg/tm de ss 30 97,2 1,8 0,2 0,8

Ejemplo 3

[0159] Una reacción de sacarificación catalizada por la TrAA y una glucoamilasa alcanza un mayor nivel de

15 glucosa en menos tiempo que una reacción catalizada solo por una glucoamilasa. Se preparó almidón de maíz crudo licuado como se ha descrito en el ejemplo 2 en forma de una suspensión de 32% de ss. El almidón licuado se enfrió a 60ºC y el pH se ajustó a 4,2 antes de añadir las enzimas en las concentraciones indicadas en la tabla 2. La TrAA (lote nº GCI12004017/018-UF) se preparó como se ha descrito en la sección 1.3 del ejemplo 1. La glucoamilasa se proporcionó en forma de GA-L (lote nº 901-04290-001) a 385 UG/g. Los DPn se midieron al final de la reacción como

20 se ha indicado en el ejemplo 2 anterior.

TABLA 2

GA

TrAA Tiempo (h) DP1 DP2 DP3 DP4+

1 kg/tm de ss

Nada 21 24 29 48 93,9 94,6 95,0 95,2 2,5 2,6 2,8 3,8 0,3 0,3 0,3 0,4 3,3 2,4 1,9 0,7

1 kg/tm de ss

0,1 kg/tm de ss 21 24 29 48 94,6 95,1 95,4 95,3 2,5 2,6 2,9 3,7 0,3 0,3 0,3 0,4 2,4 2,0 1,4 0,7

1 kg/tm de ss

0,2 kg/tm de ss 21 24 29 48 95,1 95,3 95,5 95,4 2,5 2,6 2,9 3,7 0,3 0,3 0,4 0,4 2,0 1,7 1,2 0,5

1 kg/tm de ss

0,3 kg/tm de ss 21 24 29 48 95,6 95,7 95,7 95,3 2,5 2,6 2,9 3,6 0,3 0,3 0,3 0,3 1,7 1,4 1,1 0,7

1 kg/tm de ss

0,5 kg/tm de ss 21 24 29 48 95,6 95,9 95,9 95,2 2,6 2,6 2,9 3,8 0,3 0,3 0,3 0,4 1,4 1,2 0,9 0,7

0,5 kg/tm de ss

0,5 kg/tm de ss

21 24 29 48 94,2 94,5 95,3 95,9 2,0 2,5 2,1 2,5 0,4 0,4 0,4 0,3 3,4 3,0 2,3 1,3

[0160] La adición de la TrAA a la reacción de sacarificación provocó un aumento de DP1, es decir, de

25 glucosa, en la reacción. Las condiciones óptimas para la producción de DP1 se obtuvieron a una concentración de glucoamilasa de 1 kg/tm de ss y a una concentración de TrAA de 0,5 kg/tm de ss. En estas condiciones, DP1 ascendió al 95,9% p/p de ss, lo que superaba el nivel máximo de DP1 obtenido sin TrAA (95,2% p/p de ss). El nivel máximo de DP1 se alcanzó a las 24 horas en presencia de TrAA, pero se alcanzó solo después de 24 horas con glucoamilasa sola. En presencia de 0,5 kg/tm de ss y TrAA, la reversión de DP1 a oligosacáridos superiores no

30 comenzó hasta 48 horas después de iniciarse la reacción.

Ejemplo 4

[0161] La TrAA también es útil para aumentar el rendimiento de maltosa en una reacción de sacarificación. La TrAA muestra actividad maltogénica a un pH relativamente bajo, como se determina en el experimento siguiente. 5 El sustrato consistió en un sustrato de almidón licuado preparado como se ha descrito en el ejemplo 2, excepto que el maíz crudo se diluyó con agua para crear una suspensión del 30% p/p de ss, a la que se añadieron 0,25 kg/tm ss de Spezyme® Ethyl (Genencor International, Inc., lote nº 107-04107-001). Después de la licuefacción a 92ºC durante 25 min, el almidón licuado se enfrió a 55ºC y el pH se ajustó usando ácido sulfúrico al 20% v/v. Los DPn se midieron como se ha descrito en el ejemplo 2 anterior. La fig. 2 representa la dependencia de pH de la producción de DP2

10 después de una reacción de 48 horas catalizada por 0,5 kg/tm ss de TrAA (lote nº GCI12004017/018-UF). Como se muestra en la fig. 2, la TrAA mostró una actividad óptima entre pH 5,0 y 5,5; sin embargo, la TrAA también mostró una actividad casi óptima en el intervalo de pH de 4,5 a 6,0. Este experimento indica que la TrAA es altamente activa al pH relativamente bajo de 4,5.

15 Ejemplo 5

[0162] La TrAA puede catalizar la producción de DP2 proporcionando niveles comparables a los obtenidos con la a-amilasa maltogénica fúngica Clarase® L (Genencor International, Inc.). La TrAA se produjo en T. reesei y se purificó de acuerdo con los procedimientos descritos en el ejemplo 1 anterior. La TrAA (lote nº 150906) usada para 20 este experimento demostró una actividad específica de aproximadamente 18.000 SKBU/g. La TrAA también se ensayó en combinación con una pululanasa en forma de Optimax® L-1000 (Genencor International, Inc., lote nº 10704224-001), que presentaba una actividad específica de aproximadamente 1.040 unidades PU/g. La actividad específica de Clarase® L (lote nº 107-04330-001) en este experimento ascendió a aproximadamente 41.000 SKBU/g.

25 [0163] Se preparó almidón licuado como se ha descrito en el ejemplo 2 y se ajustó a 55ºC, pH 5,5, o 60ºC, pH 4,5. Las enzimas se añadieron en las concentraciones indicadas más adelante y la reacción transcurrió durante 48 horas a la temperatura indicada. Los DPn producidos durante la reacción se midieron 24 horas y 48 horas después de iniciarse la reacción, usando los procedimientos descritos en el ejemplo 2. La tabla 3 muestra los DPn obtenidos en una reacción representativa. La fig. 3 representa la concentración de DP2 obtenida en la reacción de

30 sacarificación a las 48 horas en función de la concentración de enzima en unidades SKBU/g.

TABLA 3

Enzima 1 (dosis)

Enzima 2 (dosis) T (ºC) pH Tiempo (h) % DP1 % DP2 % DP3 % AS

Clarase® L (10 SKBU/g)

NA 55 5,5 24 3,0 53,9 21,3 21,7

48

4,4 58,2 17,1 20,3

TrAA (10 SKBU/g)

NA 60 4,5 24 4,5 37,8 23,7 34,0

48

6,4 46,2 21,7 25,7

TrAA (15 SKBU/g)

NA 60 4,5 24 6,7 47,4 21,3 24,6

48

8,9 52,8 17,3 21,1

TrAA (20 SKBU/g)

NA 60 4,5 24 8,7 52,6 17,6 21,1

48

10,5 55,1 14,5 19,9

TrAA (20 SKBU/g)

PU (0,25 kg/tm) 60 4,5 24 8,9 54,5 19,4 17,2

48

11,3 58,9 16,5 13,4

[0164] A las 48 horas, la concentración de DP2 había aumentado a aproximadamente 58% p/p ss en

35 presencia de 10 SKBU/g de Clarase® L a 55ºC, pH 5,5. En comparación, las reacciones catalizadas por 20 SKBU/g de TrAA a 60ºC, pH 4,5, produjeron aproximadamente 55% de DP2 en 48 horas. En presencia de 20 SKBU/g de TrAA y 0,25 kg/tm de pululanasa, sin embargo, DP2 subió a aproximadamente 59% p/p ss en 48 horas, excediendo la concentración obtenida con Clarase® L. Además, la TrAA produjo, sola o en combinación con una pululanasa, un jarabe rico en maltosa con una concentración mayor de DP1 que la obtenida con Clarase® L: aproximadamente 11%

40 p/p ss frente a aproximadamente 4% p/p ss. Este experimento muestra, por consiguiente, que la TrAA se puede usar para producir un jarabe con alto contenido en maltosa a un pH bajo, conteniendo el jarabe niveles de maltosa comparables así como niveles de glucosa mayores que los obtenidos con Clarase® L.

Ejemplo 6

45 [0165] Cuando se usa a pH bajo, la TrAA supera significativamente a otras amilasas maltogénicas convencionales, como se muestra en el experimento siguiente. Las condiciones experimentales usadas fueron las mismas que en el ejemplo 5, excepto por que la reacción se realizó a 58ºC, pH 4,6, y la producción de DPn fue catalizada por 0,2 kg/tm ss de BBA (una 1-amilasa; lote nº 05189-001), 0,2 kg/tm ss de Clarase® L (lote nº

50 9016231002) o 0,5 kg/tm ss de TrAA (lote nº GCI2004017/018-UF). Como se indica en la tabla 4, se obtuvieron concentraciones significativamente mayores de DP2 en presencia de TrAA que con BBA o Clarase® L.

TABLA 4

Enzima (dosis)

T (ºC) pH Tiempo (h) % DP1 % DP2 % DP3 % AS ED

BBA (0,2 kg/tm ss)

58 4,6 24 0,6 12,5 3,2 83,6 25

48

0,3 12,2 3,1 84,4 24

Clarase® L (0,2 kg/tm ss)

58 4,6 24 0,6 9,9 17,9 71,6 28

48

10,0 18,0 14,2 71,3 28

TrAA (0,5 kg/tm ss)

58 4,6 24 6,0 44,4 20,8 28,7 46

48

8,1 51,2 17,8 22,9 49

Ejemplo 7

5 [0166] La producción de DP2 por medio de la TrAA aumentó significativamente con la adición de una pululanasa. En el experimento siguiente, las condiciones experimentales fueron las mismas que las descritas en el ejemplo 5, excepto por que la reacción se realizó a 58ºC, pH 4,6. La pululanasa se añadió en forma de Optimax® L1000 (Genencor International, Inc.; lote nº 9016167004 a 1.165 UP/g) en las concentraciones indicadas en la tabla 5. La reacción transcurrió a 58ºC, pH 4,6, durante los tiempos indicados. Como se muestra en la tabla 5, 0,1 a 0,25

10 kg/tm ss de pululanasa aumentaron significativamente la producción de DP2 catalizada por TrAA en 48 horas. La fig. 4 representa la formación de DP2 a las 48 horas en las diferentes condiciones descritas en este ejemplo.

TABLA 5 REIVINDICACIONES

TrAA

PU T (ºC) pH Tiempo (h) % DP1 % DP2 % DP3 % AS ED

0,5 kg/tm ss

Nada 58 4,6 24 7,2 44,8 20,1 27,9 47

48

9,2 51,6 16,8 22,3 50

0,5 kg/tm ss

0,1 kg/tm ss 58 4,6 24 6,7 44,9 21,5 26,9 47

48

1.0.4 61,8 22,4 5,3 57

0,5 kg/tm ss

0,25 kg/tm ss 58 4,6 24 7,8 49,4 23,6 19,2 50

48

10,8 61,7 22,0 5,5 57

0,5 kg/tm ss

0,5 kg/tm ss

58 4,6 24 7,5 50,3 25,0 17,2 51

48

10,3 60,9 22,9 5,9 56

1.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   Un polipéptido aislado que comprende o se compone de (i) los restos 21 a 463 de la SEQ ID NO:3 mostrada en la fig. 7B o (ii) una variante de la a-amilasa de Trichoderma reesei (TrAA), presentando la variante actividad a-amilasa y una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 90% con los restos 21 a 463 de la SEQ ID NO:3 mostrada en la fig. 7B.

2. 2.

   El polipéptido aislado de la reivindicación 1, en el que dicha variante presenta una identidad de secuencia de al menos 95% con los restos 21 a 463 de la SEQ ID NO:3 mostrada en la fig. 7B.

3. 3.

   El polipéptido aislado de la reivindicación 1, en el que la variante presenta entre 1 y 10 sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos en comparación con los restos 21 a 463 de la SEQ ID NO:3 mostrada en la fig. 7B.

4. 4.

   El polipéptido aislado de la reivindicación 1 que comprende la SEQ ID NO:3 mostrada en la fig. 7B.

5. 5.

   Un polinucleótido que codifica un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. 6.

   El polinucleótido de la reivindicación 5 que comprende la SEQ ID NO:2 mostrada en la fig. 7A.

7. 7.

   Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 5 o la reivindicación 6.

8. 8.

   Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 7 o expresa el polinucleótido de la reivindicación 5 o la reivindicación 6 y, opcionalmente, expresa además un ácido nucleico que codifica una glucoamilasa heteróloga.

9. 9.

   La célula huésped de la reivindicación 8, en la que la célula huésped es una célula bacteriana, un Trichoderma sp., un aislado de RL-P37, una célula de hongo filamentoso, un Aspergillus sp., un Fusarium sp. o un Penicillium sp.

10. 10.

    Un procedimiento para la sacarificación de almidón licuado para producir un jarabe rico en glucosa, que comprende: añadir un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 a una solución de almidón licuado, añadir una glucoamilasa a la solución de almidón licuado y sacarificar la solución de almidón licuado, en el que dicha sacarificación de la solución de almidón licuado produce un jarabe rico en glucosa.

11. 11.

    El procedimiento de la reivindicación 10, en el que dicho polipéptido se añade a la solución de almidón licuado en una cantidad de aproximadamente 0,3 a 1 kg por tonelada métrica de sólidos secos.

12. 12.

    El procedimiento de la reivindicación 10, en el que la solución de almidón licuado es una suspensión de almidón licuado de aproximadamente 20 a 35% p/p de sólidos secos.

13. 13.

    Una composición para el procesamiento de almidón que comprende el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

14. 14.

    Un procedimiento de horneado que comprende la adición del polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 a una sustancia que se ha de hornear y el horneado de la sustancia.

15. 15.

    Un procedimiento para desencolar productos textiles, que comprende poner el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en contacto con un producto textil durante un tiempo suficiente para desencolar el producto textil.