ES2376167T3

ES2376167T3 - Inmunoensayos para la determinación espec�?fica de isoformas de scca.

Info

Publication number: ES2376167T3
Application number: ES03795518T
Authority: ES
Inventors: Eva RÖJER; Nilsson Olle
Original assignee: Canag Diagnostics AB; Fujirebio Diagnostics AB
Current assignee: Canag Diagnostics AB; Fujirebio Diagnostics AB
Priority date: 2002-09-10
Filing date: 2003-08-27
Publication date: 2012-03-09
Anticipated expiration: 2023-08-27
Also published as: CA2498524C; AU2003256194B2; AU2003256194A1; CA2498524A1; WO2004024767A1; CN1684981A; EP1539817A1; HK1080091A1; BR0314207A; EP1539817B1; JP2006516114A; AU2003256194B9; RU2005110410A; ATE532796T1; SE0202702D0; DK1539817T3; SE0202702L; KR20050071493A

Abstract

Un anticuerpo monoclonal caracterizado porque se une selectivamente sólo a moléculas del antígeno 2 de carcinoma de células escamosas (SCCA2), excluyendo las moléculas de SCCA2 en complejo, con una reactividad cruzada de <5% para SCCA2 en complejo o moléculas del antígeno 1 de carcinoma de células escamosas (SCCA1), para uso en la detección de carcinoma de células escamosas o enfermedad recurrente de carcinoma de células escamosas.

Description

Inmunoensayos para la determinacion especifica de isoformas de SCCA

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invencion se refiere a la determinacion especifica de diferentes isoformas de SCCA y al uso de la 5 concentracion serologica de las diferentes isoformas y proporcion entre ellas como un medio de diagnostico del cancer.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

El antigeno de carcinoma de celulas escamosas (SCCA) es un marcador serologico para los carcinomas de celulas escamosas (SCC) del utero, cuello del utero, pulmon, cabeza y cuello, vulva y esofago (1, 2). Lo purificaron originalmente al final de la decada de los 70 Kato y colaboradores a partir del complejo TA del carcinoma de celulas

10 escamosas del cuello del utero humano con un peso molecular de 42448 kDa (1, 3). La electroforesis del complejo TA revelo mas de 10 fracciones y el isoelectroenfoque del antigeno sugirio dos subfracciones, una isoforma acida (pI<6,25) y una neutra (pI≥6,25) (4).

La clonacion del ADNc de SCCA muestra que pertenece a la familia de los inhibidores de serina proteasas (serpinas) (6). La clonacion adicional de la region genomica del cromosoma 18q21.3 revelo dos genes dispuestos en tandem (7). El

15 mas telomerico, el SCCA original, se designo SCCA1, mientras que el mas centromerico se designo SCCA2 (Figura 1). Ambos contienen ocho exones y los limites intron4exon, sitios de corte y empalme, codones de inicio y codones terminales potenciales son identicos. Son identicos en un 98% a nivel de nucleotidos e identicos en un 92% a nivel de aminoacidos. Los valores de pI deducidos de los productos genicos SCCA1 y SCCA2 muestran que la isoforma neutra esta codificada por SCCA1 y la isoforma acida por SCCA2.

20 En los seres humanos las serpinas se localizan en uno de dos grupos cromosomicos. PI6, PI9 y ELNAH2 se localizan en 6p25, mientras que PIB, Bomapina, PAI2, SCCA1, SCCA2, Headpin y Maspina se localizan en 18q21.3 (Figura 1) (7412). Se supone que estos grupos han surgido a traves de dos duplicaciones intercromosomicas independientes y varios ciclos de duplicaciones intracromosomicas (9). Se ha publicado frecuentemente que la region cromosomica 18q es una region con una frecuencia alta de reorganizaciones (9, 13416). Las dianas y funciones de las serpinas no se entienden

25 completamente. Para la mayor parte, las funciones principales son la regulacion de eventos proteoliticos asociados con la coagulacion, fibrinolisis, apoptosis e inflamacion, aunque se han publicado funciones alternativas tales como regulacion del transporte de hormonas y de la presion sanguinea (17424).

Aunque SCCA1 y SCCA2 son casi identicas, se diferencian en sus bucles de sitio reactivo (Figura 2 y 3). SCCA1 inhibe las cisteina proteinasas semejantes a papaina catepsina S, K y L (25. 26) mientras que SCCA2 inhibe las serina

30 proteinasas semejantes a quimiotripsina catepsina G y quimasa de mastocitos (27). Los estudios sobre el bucle del sitio reactivo (RSL) de SCCA1 muestran que RSL es esencial para la inhibicion de cisteina proteinasa (28). La parte variable de RSL dicta la especificidad de las proteinasas diana mostrado por mutantes de intercambio de RSL de SCCA1 y SCCA2 y mutantes unicos (28, 29). Es probable que las serpinas utilicen un mecanismo dependiente de RSL comun para inhibir tanto las serina como las cisteina proteinasas.

35 El papel biologico de SCCA1 y SCCA2 no se entiende completamente. Se considera que son serpinas inhibidoras. Los datos sugieren que SCCA estan implicadas en la apoptosis y la expresion hace que las celulas cancerosas sean resistentes a varios mecanismos de muerte por inhibicion de la apoptosis (30).

SCCA1 y SCCA2 se detectan en el citoplasma de celulas epiteliales escamosas normales (31, 33). El antigeno, que aparece en el suero de pacientes, puede ser una funcion de la superproduccion de SCCA por las celulas tumorales y su

40 velocidad de recambio normal (34). Se ha publicado que el SCCA detectado en el suero usando un ensayo de radioinmunologia con anticuerpo o PCR en tiempo real, RT4PCR, es principalmente SCCA2 (1, 35, 36) pero otros estudios usando PCR indican que ambos antigenos pueden amplificarse y detectarse en muestras de pacientes (37).

Las concentraciones sericas en pacientes con SCC se correlacionan con el estadio clinico y con el grado de diferenciacion histologica del tumor (1). Para el cancer del cuello del utero, varios estudios muestran una correlacion 45 entre los valores de pretratamiento y el resultado clinico (1, 38443). Los estudios tambien muestran una correlacion entre niveles altos de SCCA y volumen tumoral. La recurrencia o enfermedad progresiva pudieron detectarse varios meses antes de la evidencia clinica (39). Se observan resultados similares para carcinomas de celulas escamosas de pulmon, vulva, cabeza y cuello y esofago (1, 2, 44, 45). En todos estos estudios, han medido el nivel total de SCCA. Por ejemplo, Cataltepe et al. (33) describen el desarrollo de anticuerpos monoclonales especificos y un ensayo discriminatorio 50 sensible para los marcadores tumorales circulantes SCCA1 y SCCA2. Sin embargo, los anticuerpos segun Cataltepe et al. (33) solo pueden usarse para la determinacion de SCCA1 o SCCA2 "total". Solo son utiles para la determinacion de

niveles altamente elevados de estas moleculas y por lo tanto no son adecuados para distinguir entre sujetos con cancer y sanos ni para la monitorizacion de la respuesta a terapia y deteccion de enfermedad recurrente.

Las SCCA pertenecen a la familia de las serpinas y es probable que diferentes formas de las serpinas puedan detectarse en tejidos y en la circulacion. La funcion general de las serpinas es regular la actividad de diferentes enzimas proteoliticas y puede especularse que SCCA1 y SCCA2 en tejidos y suero tambien pueden aparecer como la serpina "libre" y como un complejo con sus proteasas diana. Esto seria similar a la serina proteasa PSA que en el suero se encuentra principalmente como un complejo con la serpina alfa14antiquimotripsina. La determinacion especifica de SCCA1 y SCCA2 asi como la forma respectiva "libre" y en complejo de la serpina respectiva tambien puede proporcionar informacion clinica adicional comparada con SCCA "total".

RESUMEN DE LA INVENCION

La presente invencion describe el establecimiento de anticuerpos monoclonales capaces de distinguir entre SCCA1 y SCCA2 asi como entre la cantidad "libre" y "total" de la serpina respectiva. Ademas, la invencion describe el uso de los anticuerpos discriminatorios establecidos para el diseno de inmunoensayos para la determinacion de la forma total y "libre" de las serpinas SCCA1 y SCCA2, asi como el uso de los inmunoensayos para el diagnostico del cancer y la deteccion de enfermedad recurrente.

DESCRIPCION DE REALIZACIONES ESPECiFICAS

El establecimiento de anticuerpos monoclonales frente a epitopos de SCCA1 y SCCA2, asi como SCCA varios expuestos y escondidos en el complejo serina proteasa de las SCCA, respectivamente, hace posible disenar inmunoensayos especificos para la determinacion de la forma respectiva de SCCA. Ademas, en la presente invencion se describen metodos para el diagnostico del cancer usando los inmunoensayos especificos.

EJEMPLO 1

Produccion de SCCA recombinante

1.1 Clonacion de SCCA

Se prepararon ARNm de las lineas celulares Caski (cuello uterino), C44I (cuello uterino), A549 (pulmon) y RPMI2650 (faringe) usando el kit de Purificacion de ARNm Micro QuickPrep (Pharmacia) y se preparo el ADNc usando el kit de Sintesis de Primera Cadena de ADNc (Pharmacia). Un fragmento de ADN de 1218 pb que engloba la secuencia codificadora de SCCA se amplifico por PCR en una reaccion de 100 μl que contiene 10 mM Tris4HCl pH 8,85, 25 mM KCl, 5 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4(Boehringer), 0,2 mM dNTP (Pharmacia), 10 μM SCCA 147F (las secuencias de ADN de todos los cebadores se muestran en la Tabla 1), 10 μM SCCA 3914397B, 2 μl de ADNc y 2,5 U de polimerasa Pow (Boehringer). Despues de desnaturalizar las muestras durante 5 min a 960C, se realizo un total de 30 ciclos, consistiendo cada uno en desnaturalizacion durante 15 segundos a 960C, hibridacion durante 15 segundos a 600C y extension durante 30 segundos a 720C. La reaccion de PCR se completo con una extension final durante 10 min a 720C.

Deteccion de SCCA1 y SCCA2

La presencia de SCCA1 en los productos de PCR se detecto por escision con la enzima de restriccion SacII, lo que resulto en dos fragmentos, 245 y 973 pb, respectivamente, o por PCR especifica de SCCA1 usando los cebadores SCCA147Fy SCCA13234329B en una reaccion de PCR estandar (75 mM Tris4HCl pH 8,8, 20 mM (NH4)2SO4, 0,01% Tween 20, 2 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, 10 μM de cada cebador, molde, y 0,025 U/μl de reaccion de Polimerasa Taq; despues de desnaturalizar las muestras durante 5 min a 960C, se realizo un total de 30 ciclos, consistiendo cada uno en desnaturalizacion durante 15 segundos a 960C, hibridacion durante 15 segundos a la temperatura optima de hibridacion y extension durante 30 segundos a 720C. La reaccion de PCR se completo con una extension final durante 10 min a 720C), Ta=500C, lo que resulto en un fragmento de 997 pb. La presencia de SCCA2 se detecto por PCR estandar usando SCCA 147F y un cebador especifico de SCCA2, SCCa2 3574363B, Ta=600C, lo que proporciona un fragmento de

1.090 pb.

Clonacion

Los productos de PCR se clonaron usando el kit de clonacion PCR4Script Amp (Stratagene). Los cribados de colonias se realizaron por PCR como se describe en 1.2. Los ADN plasmidicos se prepararon a partir de los clones seleccionados que contienen SCCA1 o SCCA2 usando elSistema de Purificacion de ADN Wizard Plus Minipreps(Promega).

Secuenciacion del ADN

Los clones se secuenciaron usando ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing (PE Biosystems). Las muestras se corrieron en un ABI Prism 310.

Reclonacion

Los clones seleccionados se reclonaron en el vector de expresion pGEX46P43 (Pharmacia). Los fragmentos se escindieron del vector PCR4Script Amp usando BamHI y XhoI y se ligaron en el vector de expresion en una reaccion de 10 μl que contiene 1xOPA, 1 mM ATP, 50 ng del vector escindido, inserto de SCCA correspondiente a una proporcion moles de extremos vector:inserto de 1:541:8, y 7,5410 U de ADN ligasa T4 (todos de Pharmacia). Los tubos de reaccion se incubaron a 100C toda la noche y se inactivaron durante 10 min a 650C. Se transformaron 244 μl de la reaccion en E. coli JM109 (46). Los ADN plasmidicos de los clones seleccionados se transformaron en E. coli BL21 para la expresion de proteinas.

Mantenimiento del gen clonado

El ADN plasmidico (pGEX46P43 que contiene el gen de fusion SCCA1/A2) en una disolucion de tampon 10 mM Tris4HCl (pH 8,0) se almacena a 4800C. Para iniciar la expresion de proteinas, el ADN plasmidico se transforma en E. coli BL21 competentes segun Sambrook et al. (p 1.8241.84 en ref. 46). Para la preparacion de mas ADN plasmidico, se prefiere la transformacion en E. coli JM109.

1.1.2 Expresion y purificacion de proteinas

Expresion de Proteinas

Las condiciones de expresion se determinaron por preparaciones a pequena escala. Para la expresion a gran escala, se inocularon cultivos de 500 ml de 2xYT y 100 μg de ampicilina/ml con 5 ml de cultivo de toda la noche y se crecieron a 370C. La expresion de proteinas se indujo a DO600=0,541,3 mediante la adicion de IPTG a una concentracion final de 0,1 mM.

Purificacion de Proteinas

Las celulas se recogieron por centrifugacion durante 10 min a 2.000 g, se lavaron con 50 ml de TE pH 8,0, y se disolvieron en 3 ml de TE/g de sedimento bacteriano. Se anadio lisozima a una concentracion final de 800 μg/g de sedimento y las mezclas se incubaron en hielo durante 30460 min y se congelaron toda la noche a 4700C. Se anadieron cloruro de magnesio y ADNasa a una concentracion final de 12 mM y 20 μg/g de sedimento, respectivamente. Despues de incubar en hielo durante 30 min, las muestras se centrifugaron durante 30 min a 40.000 g. A cada sobrenadante se anadieron 0,5 ml de 50% Sefarosa de Glutation (Pharmacia) y se incubo durante 30 min42 h a temperatura ambiente con agitacion suave. La suspension de solidos se lavo 547 veces usando 1xPBS. Se eluyo la proteina de fusion GST4SCCA usando 0,541 ml de Glutation Reducido (Pharmacia) y se incubo durante 30460 min a temperatura ambiente o toda la noche a 40C, todo con agitacion suave. La proteina SCCA se eluyo por escision entre GST y SCCA. Se anadieron 0,48 ml de tampon de escision (50 mM Tris4HCl pH 7,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) y 20 μl de proteasa PreScission y las muestras se incubaron a 40C con agitacion suave durante 4 h o toda la noche. Las proteinas se analizaron en SDS4PAGE por Phast4system (Pharmacia).

EJEMPLO 2

Establecimiento de hibridomas yanticuerposmonoclonales

2.1 Inmunizacion y seleccion primaria de hibridomas Anti SCCA

Se obtuvieron antisueros policlonales reactivos con antigeno SCC por inmunizacion subcutanea de conejos con antigeno SCC recombinante y recogida de los sueros inmunes segun los procedimientos estandar. La titulacion de los antisueros policlonales se ensayo por determinacion de la reactividad de los antisueros con SCCA2 y SCCA1 biotinilados inmovilizados en placas de estreptavidina (Labsystems Oy, Helsinki, Finlandia). Los SCCA2 y SCCA1 recombinantes se biotinilaron con ester caproato de Biotina4N4succinimida segun los procedimientos estandar.

Los anticuerpos monoclonales reactivos con SCCA1 y SCCA2 se obtuvieron por inmunizacion de ratones Balb/c intraperitonealmente con 10450 μg de SCCA recombinante en adyuvante Ribi. Despues de la inmunizacion y de 244 dosis de refuerzo durante 60490 dias se fusionaron celulas de bazo de los ratones inmunizados con celulas se mieloma P3 x 63Ag 8 como se describe.

Los hibridomas que producen anticuerpos que reaccionan con SCCA1 y/o SCCA2 se seleccionaron por cribado con ELISA de los sobrenadantes de hibridomas en pocillos de microtitulacion recubiertos con antisuero policlonal purificado por afinidad frente a IgG + M de raton, (Jackson Immuno Res Lab, EEUU). Los pocillos se incubaron con antigeno SCCA y, despues de lavar, el antigeno unido se detecto por incubacion con Anti SCC de Conejo policlonal e Ig Anti Conejo de

5 Cerdo marcada con HRP (Dako AS, Copenhague, Dinamarca).

2.2 Reactividad de los hibridomas seleccionados con antigenos SCC

La reactividad de los hibridomas establecidos se ensayo en un ELISA similar al procedimiento de cribado. Brevemente, los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas se inmovilizaron en placas de microtitulacion recubiertas con antisuero policlonal frente a IgG+M de raton (Jackson Immuno ResLab,EEUU). Lospocillos se incubaron con 50 μL

10 de los diferentes antigenos SCC recombinantes (SCCA1, SCCA2, proteina de fusion SCCA1/A2 y SCCA2/A1) en PBS 1% BSA durante 1 h, despues de lavar las placas se incubaron con 100 μL de anti4SCC de conejo diluido 1/5.000 en PBS41% BSA y se incubaron durante 1 h adicional. El Anti4SCC de conejo unido se detecto por incubacion con Ig anti Conejo de Cerdo4HRP y se visualizo con sustrato OPD y determinacion de DO a 450 nm.

En la figura 4 se muestra la reactividad de los hibridomas seleccionados. Tambien son evidentes a partir de la Tabla 1 15 siguiente.

Tabla 1

2.3 Seleccion de los anticuerpos monoclonales que discriminan entre SCCA libre y unido en complejo

Los Mab que reaccionan con epitopos expuestos en los complejos SCCA4proteasa asi como los Mab que reaccionan 20 con epitopos "escondidos" en el complejo serpina4proteasa se seleccionaron por determinacion de la union a complejo SCCA4proteasa y a SCCA "libre".

2.3.1 Establecimiento de complejos SCCA4proteasa

La union de complejo de SCCA a proteasas diana se realizo mezclando 2 μg de SCCA4proteina con 0,5 μg de Catepsina G (Biodesign Int.) o 0,5 μg de 0,9 μg Catepsina L (Calbiochem) en tampon 1xPBS en un volumen total de 4,5 μl. Las muestras se incubaron a 370C durante 30 minutos. A cada muestra, se anadieron 0,5 μl de 10xComplejo4tampon (20%

5 SDS, 140 mM Mercaptoetanol, azul de bromofenol). Las muestras se incubaron durante 3 minutos a 950C y se analizaron en un gel de SDS4PAGE al 12,5%.

La reactividad de la union al complejo es evidente a partir de la Tabla 2 siguiente y de la Figura 5.

2.3.2 Reactividad con complejos SCCA4proteasa

Los Mab que reconocen epitopos que no interferian con la formacion de complejos entre SCCA1 y Catepsina L y SCCA2

10 y Catepsina G, respectivamente, se detectaron por preincubacion de los anticuerpos que reconocian epitopos localizados en el Exon 247 de SCCA1 y SCCA2 respectivamente y determinacion de la formacion de complejos en ensayos ELISA como se describe.

Tomando como base la capacidad de inhibir la formacion de complejos entre SCCA1 y Catepsina L y SCCA2 y Catepsina G, respectivamente, se dedujo que varios anticuerpos reconocian epitopos que no estaban influidos por la

15 formacion de complejos entre las serpinas y las proteasas diana. En la figura 5, asi como en la Tabla 2 siguiente, se muestra la reactividad de los anticuerpos con serpina4proteasas.

Tabla 2

Los anticuerpos descritos en 2.3.1., que reaccionaban con epitopos localizados en el Exon 8 inhibieron la formacion de 20 complejos entre la serpina respectiva y su proteasa. Puede deducirse que estos anticuerpos reconocian epitopos "escondidos".

Los complejos con SCCA "libre" se muestran en la Tabla 3 siguiente, asi como en la Figura 6.

Tabla 3

2.3.3 Resumen de la reactividad de Mab establecidos

La reactividad de los anticuerpos monoclonales establecidos frente a las diferentes formas de SCCA se resume en la Tabla 4.

Tabla 4

Los grupos A1b y A3b reaccionan preferentemente con SCC "Libre"; los Grupos C1a y C2a reconocen "SCCA2 Total", mientras que los Grupos C1b y C2b reconocen solo "SCCA2 Libre".

5 2.4 Produccion de anticuerpos monoclonales discriminatorios

Los anticuerpos monoclonales se produjeron por cultivo in vitro de los clones de hibridoma por inoculacion de10 4 celulas/mL en DMEM, 5% Suero Fetal de Ternera en botellas giratorias y se dejo que crecieran durante 10414 dias. Los anticuerpos monoclonales se purificaron a partir del medio de cultivo por cromatografia de afinidad con Proteina A (Bioprocessing Ltd, Durham, Reino Unido) segun la recomendacion del fabricante.

10 EJEMPLO 3

Establecimiento de inmunoensayos

Usando los anticuerpos monoclonales establecidos y proteinas recombinantes fue posible desarrollar inmunoensayos para la determinacion especifica de SCCA total y SCCA "libre" total y ensayos especificos para SCCA1 total y SCCA1 "libre" asi como ensayos para la determinacion especifica de SCCA2 total y SCCA2 "libre", respectivamente.

15 3.1. Inmunoensayos para la determinacion de SCCA total

3.1.1 Inmunoensayos para la determinacion de "SCCA total"

Los ensayos especificos para SCCA, es decir el total de SCCA1 "libre", SCCA2 "libre", SCCA1 en complejo y SCCA2 en complejo se disenaron usando anticuerpos entre A1a (Tabla 1) en combinacion con anticuerpos de los Grupos A2 o A3a.

En la configuracion preferida, el anticuerpo SCC113 se uso como anticuerpo de captura y SCC107 como anticuerpo de deteccion.

El Mab SCC113 se biotinilo con ester caproato de BiotinaNHRS, Sigma Chemical Co, EEUU, usando procedimientos estandar y se uso como anticuerpo de captura. El Mab SCC107 se conjugo con HRP segun una modificacion del procedimiento de Nakone.

El Mab SCC113 biotinilado y el Mab SCC107 conjugado con HRP se usaron en un EIA de una etapa segun el protocolo siguiente.

Procedimiento del ensayo:

1.: Anadir 25 μL de antigeno SCCA recombinante (0450 μg/L en PBS, 60 g/L BSA, pH 7,2) + 100 μL de Mab SCC113 Biotina, 1 μg/mL y HRPSCC107, 1 μg/mL en Tampon de Ensayo a placas de microtitulacion recubiertas con Estreptavidina, Labsystems Oy, Helsinki, Finlandia.

2.: Incubar durante 1 h ± 10 min con agitacion

3.: Lavar 6 veces con tampon 5 mM Tris, 0,05% Tween 40, pH 7,75.

4.: Anadir 100 μL TMB, ELISA Technology, EEUU.

5.: Incubar 30 min ± 5min

6.: Determinar DO 620 nm en lector ELISA.

Las curvas dosis4respuesta de los antigenos SCCA1 y SCCA2 libres y en complejo revelaron que el ensayo reconocia todas las formas de SCCA.

3.2. Ensayos para la determinacion especifica de SCCA1

3.2.1 Ensayos para SCCA1 total

Los ensayos especificos para SCCA1 total, es decir, SCCA1 Libre y en Complejo, sin reactividad significativa con SCCA2 se disenaron usando anticuerpos del Grupo B1 en combinacion con anticuerpos del Grupo A1a, A2 o A3a. En la configuracion preferida, se uso el Mab SCC110 como anticuerpo se captura y SCC107 se uso como anticuerpo de deteccion.

El Mab SCC111 se biotinilo con ester caproato BiotinaNHRS (Sigma Chemical Co, EEUU) usando procedimientos estandar y se uso como anticuerpo de captura. El Mab SCC107 se conjugo con HRP, Tipo V (Sigma Chemical Co, EEUU), segun una modificacion del procedimiento de Nakone.

El Mab SCC111 biotinilado y el Mab SCC107 conjugado con HRP se usaron en EIA de dos sitios segun el protocolo siguiente.

Procedimiento del ensayo:

1.: Anadir 50 μL de antigeno SCCA recombinante (04100 μg/L en PBS, 60 g/L BSA, pH 7,2) + 100 μL de Mab SCC111 Biotina, 2 μg/mL, en Tampon de Ensayo a placas de microtitulacion recubiertas con Estreptavidina, Labsystems Oy, Helsinki, Finlandia).

2.: Incubar durante 1 h ± 10 min con agitacion

3.: Lavar 3 veces con tampon 5 mM Tris, 0,05% Tween 40, pH 7,75.

4.: Anadir 100 μL Mab SCC107 HRP 2 μg/mL, en Tampon de Ensayo.

5.: Incubar durante 1 h ± 10 min con agitacion.

6.: Lavar 6 veces con tampon 5 mM Tris, 0,05% Tween 40, pH 7,75.

7.: Anadir 100 μL TMB, ELISA Technology, EEUU.

8.: Incubar 30 min ± 5min

9. Determinar DO 620 nm en lector ELISA. Tomando como base las curvas dosis4respuesta para SCCA1 y SCCA2 se concluyo que el ensayo segun el ejemplo

3.2.1 reconocia todas las formas de SCCA1 con una reaccion cruzadade <5% para SCCA2.

3.2.2 Ensayos para SCCA1 "libre"

Los ensayos especificos para SCCA1 "libre", es decir, especificos para SCCA1 sin formar complejo sin reactividad significativa con SCCA1 en complejo o SCCA2 se disenaron usando anticuerpos del Grupo B2 en combinacion con anticuerpos del Grupo A1a. En la configuracion preferida, el Mab SCCK134 se uso como anticuerpo de captura y el SCC107 se uso como anticuerpo de deteccion.

El Mab SCCK134 se biotinilo con ester caproato BiotinaNHRS (Sigma Chemical Co, EEUU) usando procedimientos estandar y se uso como anticuerpo de captura. El Mab SCC107 se conjugo con HRP, Tipo V (Sigma Chemical Co, EEUU), segun una modificacion del procedimiento de Nakone.

El Mab SCCK134 biotinilado y el Mab SCC107 conjugado con HRP se usaron en EIA de dos sitios segun el protocolo siguiente.

Procedimiento del ensayo:

1.: Anadir 50 μL de antigeno SCC recombinante (04100 μg/L en PBS, 60 g/L BSA, pH 7,2) + 100 μL de Mab SCCK134 Biotina, 2 μg/mL, en Tampon de Ensayo a placas de microtitulacion recubiertas con Estreptavidina (Labsystems Oy, Helsinki, Finlandia).

2.: Incubar durante 1 h ± 10 min con agitacion

3.: Lavar 3 veces con tampon 5 mM Tris, 0,05% Tween 40, pH 7,75.

4.: Anadir 100 μL Mab SCC107 HRP 2 μg/mL, en Tampon de Ensayo.

5.: Incubar durante 1 h ± 10 min con agitacion.

6.: Lavar 6 veces con tampon 5 mM Tris, 0,05% Tween 40, pH 7,75.

7.: Anadir 100 μL TMB, ELISA Technology, EEUU.

8.: Incubar 30 min ± 5min

9.: Determinar DO 620 nm en lector ELISA. Tomando como base las curvas dosis4respuesta para SCCA1 y SCCA2 se concluyo que el ensayo segun el ejemplo

3.2.2 reconocia solo SCCA1 "LIBRE" con una reaccion cruzada de <5% para SCCA1 en complejo o SCCA2.

3.3 Ensayos para la determinacion especifica de SCCA2

3.3.1 Ensayos para la determinacion de SCCA2 Total

Los ensayos especificos para SCCA2 total, es decir, SCCA2 libre y en complejo, sin reactividad significativa con SCCA1 se disenaron usando anticuerpos de los Grupos C1a o C2a en combinacion con anticuerpos del Grupo A1a. En la configuracion preferida, se uso Mab SCC103 como anticuerpo de captura y SCC107 se uso como anticuerpo de deteccion.

El Mab SCC103 se biotinilo con ester caproato BiotinaNHRS (Sigma Chemical Co, EEUU) usando procedimientos estandar y se uso como anticuerpo de captura. El Mab SCC107 se conjugo con HRP, Tipo V (Sigma Chemical Co, EEUU), segun una modificacion del procedimiento de Nakone.

El Mab SCC103 biotinilado y el Mab SCC107 conjugado con HRP se usaron en EIA de dos sitios segun el protocolo siguiente.

Procedimiento del ensayo:

1. Anadir 50 μL de antigeno SCC recombinante (04100 μg/L en PBS, 60 g/L BSA, pH 7,2) + 100 μL de Mab SCC103 Biotina, 2 μg/mL, en Tampon de Ensayo a placas de microtitulacion recubiertas con Estreptavidina (Labsystems Oy, Helsinki, Finlandia).

2.: Incubar durante 1 h ± 10 min con agitacion

3.: Lavar 3 veces con tampon 5 mM Tris, 0,05% Tween 40, pH 7,75.

4.: Anadir 100 μL Mab SCC107 HRP 2 μg/mL, en Tampon de Ensayo.

5.: Incubar durante 1 h ± 10 min con agitacion.

6.: Lavar 6 veces con tampon 5 mM Tris, 0,05% Tween 40, pH 7,75.

7.: Anadir 100 μL TMB, ELISA Technology, EEUU.

8.: Incubar 30 min ± 5min

3.3.1 reconocia todas las formas de SCCA2 con una reaccion cruzada de <5% para SCCA2.

3.3.2 Ensayos para SCCA2 "libre"

Los ensayos especificos para SCCA2 "libre", es decir, SCCA2 sin formar complejo, sin reactividad significativa con complejo SCCA24proteasa o SCCA1 se disenaron usando anticuerpos del Grupo C2b en combinacion con anticuerpos del Grupo A1a. En la configuracion preferida, el Mab SCC104 se uso como anticuerpo de captura y el SCC107 se uso como anticuerpo de deteccion.

El Mab SCC104 se biotinilo con ester caproato BiotinaNHRS (Sigma Chemical Co, EEUU) usando procedimientos estandar y se uso como anticuerpo de captura. El Mab SCC107 se conjugo con HRP, Tipo V (Sigma Chemical Co, EEUU), segun una modificacion del procedimiento de Nakone.

El Mab SCC104 biotinilado y el Mab SCC107 conjugado con HRP se usaron en EIA de dos sitios segun el protocolo siguiente.

Procedimiento del ensayo:

1.: Anadir 50 μL de antigeno SCC recombinante (04100 μg/L en PBS, 60 g/L BSA, pH 7,2) + 100 μL de Mab SCC104 Biotina, 2 μg/mL, en Tampon de Ensayo a placas de microtitulacion recubiertas con Estreptavidina (Labsystems Oy, Helsinki, Finlandia).

2.: Incubar durante 1 h ± 10 min con agitacion

3.: Lavar 3 veces con tampon 5 mM Tris, 0,05% Tween 40, pH 7,75.

4.: Anadir 100 μL Mab SCC107 HRP 2 μg/mL, en Tampon de Ensayo.

5.: Incubar durante 1 h ± 10 min con agitacion.

6.: Lavar 6 veces con tampon 5 mM Tris, 0,05% Tween 40, pH 7,75.

7.: Anadir 100 μL TMB, ELISA Technology, EEUU.

8.: Incubar 30 min ± 5min

9.: DO 620 nm en lector ELISA. Tomando como base las curvas dosis4respuesta para SCCA1 y SCCA2 puede concluirse que el inmunoensayo segun

3.3.2 reconocia solo SCCA2 "libre" con una reaccion cruzada de <5% para SCCA2 en complejo o SCCA1. EJEMPLO 4 Diagnostico de cancer usando inmunoensayos discriminatorios para SCCA "libre". Los inmunoensayos segun el Ejemplo 3 se usaron para determinar diferentes formas de SCCA en individuos sanos y en

pacientes con carcinoma de celulas escamosas.

Todos los ensayos mostraron discriminacion entre los individuos sanos y los pacientes con cancer como se esperaba. Sin embargo, la proporcion discriminatoria entre los sujetos sanos y con cancer fue mayor para los ensayos que determinan SCCA2, lo que se mejoro mas por determinacion de la proporcion entre SCCA2 libre y en complejo y entre SCCA2 y SCCA1.

Las isoformas de SCCA se determinaron en 50 donantes de sangre y en 50 sujetos sanos con edades entre 50 y 65 anos con el fin de determinar el nivel normal superior. Las isoformas de SCCA tambien se determinaron en los ensayos segun el Ejemplo 3 en 94 muestras de mujeres diagnosticadas con cancer del cuello del utero y en 20 individuos con cancer de celulas escamosas de pulmon.

Ejemplo 4.1.

Los resultados para cancer de celulas escamosas de pulmon se muestran en la Figura 2. SCCA1 estaba por encima del nivel normal superior en 14 pacientes mientras que SCCA2 estaba elevado en 18 pacientes. El nivel de SCCA2 tambien era relativamente mayor comparado con SCCA1 y asi se mejora la discriminacion entre sujetos sanos e individuos con enfermedad maligna.

Ejemplo 4.2. SCCA en cancer del cuello del utero.

Los niveles de SCCA1 y SCCA2 en muestras preterapia de mujeres con cancer del cuello del utero se muestran en las Figuras 7410. SCCA2 estaba relativamente mas elevado en la mayor parte de los casos comparado con SCCA1. Incrementando asi la discriminacion entre sujetos sanos e individuos con cancer del cuello del utero.

Ejemplo 4.3 SCCA1 y SCCA2 en la monitorizacion de terapia de cancer del cuello del utero.

SCCA1 y SCCA2 se determinaron usando los ensayos segun el Ejemplo 3 en 6 pacientes durante la monitorizacion de la terapia. Tanto SCCA1 como SCCA2 siguieron el curso clinico de la enfermedad y detectaron enfermedad recurrente antes de la manifestacion clinica de la enfermedad en 4/4 pacientes. Sin embargo, en los pacientes los incrementos relativos de SCCA2 fueron mayores comparados con SCCA1 proporcionando asi una senal temprana de enfermedad recurrente. En el paciente con NED tanto SCCA1 como SCCA2 se normalizaron despues de la terapia.

La enfermedad recurrente se detecto en el paciente 53 18 meses despues de la terapia. La recurrencia se indico por SCCA1 y SCCA2 elevados, pero SCCA2 respondio antes y mostro un nivel mayor como indicacion de la recurrencia comparado con SCCA1.

En el paciente 29 la recurrencia se detecto clinicamente 16 meses despues de la terapia, lo que se indico por SCCA2 elevado desde los 8 meses despues de la terapia, que fue 243 meses antes que SCCA1.

El paciente 83 mostro enfermedad progresiva 7 meses despues de la terapia inicial. SCCA2 no se normalizo nunca, mientras que SCCA1 se normalizo 3 meses despues de la terapia inicial y permanecio elevado marginalmente en el momento del diagnostico clinico de enfermedad progresiva.

La enfermedad recurrente se diagnostico clinicamente en el paciente 70 despues de 13 meses. SCCA2 empezo a incrementarse entre 546 meses despues de la terapia. SCCA1 tambien estaba ligeramente elevado 9 meses despues de la terapia y despues siguio el curso clinico. Sin embargo, SCCA2 indico mas claramente la enfermedad recurrente 547 meses antes del diagnostico clinico.

Los niveles de SCCA2 nunca se normalizaron en el paciente 48 lo que sugiere la recurrencia y enfermedad progresiva ya 2 meses despues de la terapia. SCCA1 estaba en el nivel normal superior hasta 5 meses despues de la terapia antes de incrementarse.

El paciente 45 respondio al tratamiento y no se observo ninguna evidencia de enfermedad despues de la terapia. Esto se indico tanto por SCCA1 como SCCA2 ya que los niveles se normalizaron y permanecieron en el intervalo normal.

Tanto SCCA1 como SCCA2 siguieron el curso clinico de la enfermedad. Sin embargo, SCCA2 proporciono una respuesta mas temprana y mas definida de enfermedad recurrente comparado con SCCA1.

Leyendas�de�las�Figuras

FIG.1 En los seres humanos las serpinas se localizan en uno de dos grupos cromosomicos. PI6, PI9 y ELNAH2 se localizan en 6p25, mientras que PIB, Bomapina, PAI2, SCCA1, SCCA2, Headpin y Maspina se localizan en 18q21.3 FIG. 243 muestran los bucles de sitio reactivo de SCCA1 y SCCA2 5 FIG.4 muestra la reactividad relativa de los Mab de SCC FIG. 5 muestra la reactividad relativa de los Mab de SCC unidos en complejo FIG. 6 muestra la reactividad relativa de los Mab de SCC "libres" FIG. 7 muestra SCCA1 y SCCA2 en 20 muestras de cancer de Celulas Escamosas de Pulmon, enfermedad limitada. Las barras indican el nivel de referencia superior de SCCA1 y SCCA2 respectivamente. 10 FIG. 8. SCCA1 y SCCA2 en cancer del cuello del utero de Estadio I. Las barras indican el nivel de referencia superior de SCCA1 y SCCA2 respectivamente. FIG. 9. SCCA1 y SCCA2 en cancer del cuello del utero de Estadio II. Las barras indican el nivel de referencia superior de SCCA1 y SCCA2 respectivamente. FIG. 10. SCCA1 y SCCA2 en cancer del cuello del utero de Estadio III4IV. 15 Las barras indican los niveles normales superiores.

REFERENCIAS

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un anticuerpo monoclonal caracterizado porque se une selectivamente solo a moleculas del antigeno 2 de carcinoma de celulas escamosas (SCCA2), excluyendo las moleculas de SCCA2 en complejo, con una reactividad cruzada de <5% para SCCA2 en complejo o moleculas del antigeno 1 de carcinoma de celulas escamosas (SCCA1), para uso en la deteccion de carcinoma de celulas escamosas o enfermedad recurrente de carcinoma de celulas escamosas.
2.

Un anticuerpo monoclonal segun la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo se ha producido por celulas de hibridoma, obteniendose dichas celulas de hibridoma de celulas del bazo de un mamifero que se han fusionado con celulas de mieloma.
3.

Un metodo in vitro para detectar moleculas de SCCA2 en una muestra, caracterizado�porque

4 anticuerpos monoclonales segun las reivindicaciones 1 y/o 2 que se unen selectivamente solo a moleculas de SCCA2 libres se ponen en contacto en una muestra; y

4 se compara el nivel de union de dichos anticuerpos monoclonales en dicha muestra con el nivel de union de los mismos anticuerpos monoclonales en una muestra normal; y

4 un nivel incrementado de union de los anticuerpos monoclonales en la muestra comparado con el nivel de union de los mismos anticuerpos monoclonales en la muestra normal indica una presencia de cancer de celulas escamosas o cancer recurrente de celulas escamosas en la muestra.
4.

Un metodo segun la reivindicacion 3, en el que el cancer de celulas escamosas es cancer de celulas escamosas del cuello del utero.
5.

Un metodo segun la reivindicacion 3, en el que el cancer de celulas escamosas es cancer de celulas escamosas de pulmon.
6.

Un metodo segun la reivindicacion 3, en el que el cancer de celulas escamosas es cancer de celulas escamosas del utero.
7.

Un metodo segun la reivindicacion 3, en el que el cancer de celulas escamosas es cancer de celulas escamosas del esofago.
8.

Un metodo segun la reivindicacion 3, en el que el cancer de celulas escamosas es cancer de celulas escamosas de cabeza y cuello.
9.

Un metodo segun la reivindicacion 3, en el que el cancer de celulas escamosas es cancer de celulas escamosas de la vulva.
10.

Uso del anticuerpo monoclonal segun las reivindicaciones 1 y/o 2 para la deteccion in vitro de moleculas de SCCA2 en una muestra.
11.

Uso segun la reivindicacion 10, en el que la muestra es cancer de celulas escamosas del cuello del utero.
12.

Uso segun la reivindicacion 10, en el que la muestra es cancer de celulas escamosas de pulmon.
13.

Uso segun la reivindicacion 10, en el que la muestra es cancer de celulas escamosas del utero.
14.

Uso segun la reivindicacion 10, en el que la muestra es cancer de celulas escamosas del esofago.
15.

Uso segun la reivindicacion 10, en el que la muestra es cancer de celulas escamosas de cabeza y cuello.
16.

Uso segun la reivindicacion 10, en el que la muestra es cancer de celulas escamosas de la vulva.
17.

Uso del anticuerpo monoclonal segun las reivindicaciones 142 para la preparacion de un agente de diagnostico para la deteccion in vitro de moleculas de SCCA2 en una muestra.