ES2376173T3 - Método de preparación de adn plasm�?dico de grado farmacéutico. - Google Patents

Abstract

Un dispositivo de lisis celular alcalina continua que comprende: - un primer mezclador o inyector capaz de inyectar una disolución de lisado en la dirección opuesta de una suspensión celular; - un primer tubo de pequeno diametro para generar un flujo turbulento dentro de la mezcla;- un segundo tubo de gran diametro para generar un flujo laminar dentro de la mezcla;- un segundo mezclador o inyector para inyectar la disolución neutralizante en un extremo y recoger en el otro extremo la mezcla.

Description

Metodo de preparaci6n de ADN plasmidico de grado farmaceutico

CAMPO DE LA INVENCION

Esta invenci6n se refiere a la preparaci6n de ADN plasmidico altamente purificado, y en particular a la producci6n y 5 aislamiento de ADN plasmidico de grado farmaceutico para uso en terapia basada en plasmido.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Los avances en la biologia molecular sugieren claramente que la terapia basada en plasmido, en particular en los campos de vacunas y terapia genica humana, pueden ser una forma eficaz para tratar enfermedades. Un obstaculo significativo de esta tecnologia, sin embargo, es encontrar formas eficientes para administrar el gen de interes a la 10 celula. Un metodo prometedor para administrar de manera segura y eficaz un gen normal a celulas humanas es mediante ADN plasmidico. El ADN plasmidico es una forma cerrada, circular de ADN bacteriano en el que puede insertarse una secuencia de ADN de interes. Una vez administrado a la celula humana, el ADNp empieza a replicarse y a producir copias de la secuencia de ADN insertada. Asi, los investigadores consideran el ADN plasmidico como un vehiculo prometedor para administrar genes normales a celulas humanas con el fin de tratar

15 una variedad de estados patol6gicos.

Se necesitan cantidades enormes de ADN plasmidico para el desarrollo de la investigaci6n para implementar esta nueva tecnologia y la terapia humana. Debido a que el ADN plasmidico utilizado en terapia genica y en otras aplicaciones clinicas es habitualmente producido por bacterias tales como Escherichia coli (E. coli), se necesitan metodos para separar de manera eficaz el ADN plasmidico del ADN gen6mico (ADNg) de la celula bacteriana, asi

20 como de endotoxinas y proteinas de la celula bacteriana. Por lo tanto, existe una necesidad creciente de procedimientos de purificaci6n sencillos, robustos y escalables que puedan utilizarse para aislar grandes cantidades de ADN plasmidico a partir de celulas bacterianas.

Una etapa importante en cualquier procedimiento de purificaci6n de plasmidos implica la lisis de las celulas bacterianas con el fin de liberar el contenido celular a partir del cual puede entonces aislarse el ADNp. De hecho, en 25 primer lugar es necesario conseguir tres etapas de suspensi6n celular, lisis celular y neutralizaci6n y precipitaci6n de los contaminantes del anfitri6n. La resuspensi6n celular utiliza normalmente agitaci6n manual o agitaci6n magnetica y un homogeneizador o mezclador impelente para resuspender las celulas en el tamp6n de resuspensi6n. La lisis celular puede realizarse mediante agitaci6n manual o agitaci6n magnetica con el fin de mezclar las celulas resuspendidas con la disoluci6n de lisis (que consiste en alcali diluido (base) y detergentes); despues mantener la 30 mezcla a temperatura ambiente (20-25 grados Celsius) o en hielo durante un periodo de tiempo, tal como 5 minutos, para completar la lisis. Como se ha indicado anteriormente, ni la agitaci6n manual ni la agitaci6n magnetica son escalables. La tercera etapa es la neutralizaci6n y precipitaci6n de los contaminantes del anfitri6n. El lisado de la segunda etapa se mezcla normalmente con una disoluci6n de neutralizaci6n fria mediante agitaci6n suave o agitaci6n magnetica para acidificar el lisado antes de ponerlo en hielo durante 10-30 minutos para facilitar la

35 desnaturalizaci6n y precipitaci6n del ADN cromos6mico de alto peso molecular, proteinas del anfitri6n y otras moleculas del anfitri6n. Ni la agitaci6n manual ni la agitaci6n magnetica son escalables.

Generalmente, la pared celular se digiere mediante tratamiento con lisozima durante poco tiempo o mediante tratamiento con acetato alcalino o de potasio (KOAc). Generalmente, tambien se anade ARNasa para degradar los ARN de la suspensi6n bacteriana. Estas etapas quimicas pueden resultar eficaces para lisar las celulas a pequena 40 escala. Sin embargo, el aumento de la viscosidad hace muy dificil el procesado a gran escala. Un metodo alternativo sencillo y rapido para preparar plasmidos comprende el tratamiento de las bacterias con lisozima, despues hervirlas a aproximadamente 100°C en un tamp6n adecuado durante de 20 a 40 segundos formando un grumo insoluble de ADN gen6mico, proteina y restos celulares permaneciendo el plasmido en disoluci6n con ARN como contaminante principal. Despues, se anade una disoluci6n mezclada de NaOH y dodecilsulfato s6dico (SDS) con el fin de disolver 45 la membrana citoplasmica. NaOH desnaturaliza parcialmente los ADN y degrada parcialmente los ARN y SDS actua para disolver la membrana y desnaturalizar las proteinas. Sucesivamente, el complejo SDS-proteina y los restos celulares se precipitan mediante la adici6n de acetato de potasio 5N (pH 4,8). En este momento, el pH es importante tanto para neutralizar el NaOH utilizado en dicha manipulaci6n como para renaturalizar el plasmido. Sin embargo, esta tecnica no es apropiada para aumentar la escala hasta fermentaciones bacterianas de gran volumen y se

50 pretende que sea para fermentaciones de menos de cinco litros. Posteriormente, se aplica una centrifugaci6n para eliminar los precipitados, obteniendose asi los plasmidos deseados en el sobrenadante. Esta serie de manipulaciones tambien requiere una mezcla lenta y firme, con el fin de evitar que el ADN cromos6mico bacteriano se rompa en fragmentos pequenos y agregue, produciendo la contaminaci6n del plasmido y dificultando la realizaci6n del procesamiento a gran escala.

55 Un metodo alternativo habitual para lisar las celulas, conocido como lisis alcalina, consiste en mezclar una suspensi6n de celulas bacterianas (disoluci6n 1) con una disoluci6n de lisis alcalina (disoluci6n 2). La disoluci6n 2 consiste en un detergente, por ejemplo, dodecil sulfato s6dico (SDS) para lisar las celulas bacterianas y liberar el material intracelular y un alcali, por ejemplo, hidr6xido s6dico para desnaturalizar las proteinas y acidos nucleicos de

las celulas (particularmente ADNg y ARN). Al lisarse las celulas y desnaturalizarse el ADN, la viscosidad de la disoluci6n aumenta en gran medida. Despues de la desnaturalizaci6n, se anade una disoluci6n acida, por ejemplo, acetato de potasio (disoluci6n 3), para neutralizar el hidr6xido s6dico induciendo la renaturalizaci6n de los acidos nucleicos. Los fragmentos largos de ADNg se vuelven a asociar al azar y forman redes que precipitan como fl6culos, atrapando proteinas, lipidos y otros acidos nucleicos. La sal de potasio del dodecilsulfato tambien precipita eliminando las proteinas a las que esta asociada. Las dos hebras de ADNp (ADN plasmidico), se entrelazan entre si, se reasocian normalmente para volver a formar el plasmido inicial que permanece en disoluci6n.

La tecnica anterior describe de forma general esta tecnica de lisis en modo discontinuo, es decir, en el que se mezclan diferentes disoluciones mediante la adici6n secuencial de las disoluciones a recipientes o tanques. Debido a que el lisado alcalino es un fluido viscoelastico que es muy dificil de manipular, una dificultad con este metodo se produce durante el mezclado de las diferentes disoluciones. Debido a que el esfuerzo de cizalla produce la fragmentaci6n del ADNg, lo que hace que sea muy dificil de separar del ADNp, se necesitan metodos para evitar la aplicaci6n de esfuerzos de cizalla al fluido. Ademas, el ADNp largo (es decir, mayor de aproximadamente 10 pares de kilo bases) tambien es susceptible al dano por cizalla durante el proceso de mezclado. Despues de que la disoluci6n que contiene la suspensi6n celular se ha mezclado con la disoluci6n de lisis, se mezcla el lisado alcalino viscoelastico con la disoluci6n de neutralizaci6n. De nuevo, este proceso de mezclado resulta problematico debido a las propiedades viscoelasticas de la disoluci6n.

Ademas, otra dificultad para aumentar la escala del proceso de lisis discontinuo implica la eficacia del mezclado de los diferentes fluidos cuando se intentan limitar los esfuerzos de cizalla para evitar la fragmentaci6n del ADNg. Como se ha indicado previamente, el comportamiento cromatografico del ADN gen6mico fragmentado es muy similar al del ADNp, de manera que se vuelve practicamente imposible deshacerse del ADNg mediante los procedimientos de purificaci6n estandar. Por lo tanto, resultan claras varias limitaciones relacionadas con la utilizaci6n de este procedimiento discontinuo para lisar celulas bacterianas, tales como aumento de escala, baja calidad del ADNp recuperado debido a la contaminaci6n con ADNg fragmentado y la cantidad relativamente baja del ADNp obtenido.

A diferencia del metodo discontinuo, se han propuesto varios metodos para mezclar de manera continua varias disoluciones de lisis celular utilizando una serie de mezcladores estaticos. Segun estos metodos, una disoluci6n de una suspensi6n celular y una disoluci6n de lisis celular se anaden simultaneamente a un mezclador estatico. La disoluci6n de celulas lisadas que sale del primer mezclador estatico y una disoluci6n de precipitaci6n se anaden simultaneamente a un segundo mezclador estatico. La disoluci6n que sale de este segundo mezclador contiene el lisado precipitado y plasmidos (WO 97.

Otros modos continuos de lisar celulas incluyen la utilizaci6n de un intercambiador de calor de flujo directo en el que las celulas suspendidas se calientan hasta 70-100°C. Despues de la lisis celular en el intercambiador de calor, la corriente de salida se somete a centrifugaci6n de flujo continuo o discontinuo durante la cual precipitan los restos celulares y el ADN gen6mico, dejando el ADN plasmidico en el sobrenadante.

El aislamiento y purificaci6n de ADN plasmidico a gran escala a partir de fermentaciones microbianas de gran volumen requieren, por lo tanto, el desarrollo de un procedimiento mejorado de preparaci6n de plasmidos.

A pesar de los numerosos metodos utilizados actualmente para lisar celulas bacterianas, ninguno de ellos se plantea los problemas causados por las propiedades viscoelasticas de los fluidos y las fuerzas de cizalla implicadas en las etapas de mezclado. La presente invenci6n se refiere, por lo tanto, a un metodo nuevo para la lisis alcalina continua de la suspensi6n de celulas bacterianas a gran escala y proporciona una ventaja importante limitando las fuerzas de cizalla.

Otra etapa importante en la preparaci6n de ADN plasmidico es el aislamiento o la separaci6n y purificaci6n del plasmido. Las tecnicas clasicas para aislar y purificar ADN plasmidico a partir de fermentaciones bacterianas son adecuadas para preparaciones de plasmidos a pequena escala o a escala de laboratorio. Despues de romper las celulas bacterianas anfitrionas que contienen el plasmido, seguido de neutralizaci6n con acetato que produce la precipitaci6n del ADN gen6mico y proteinas de la celula anfitriona, que se eliminan generalmente mediante, por ejemplo, centrifugaci6n. La fase liquida contiene el ADN plasmidico que se precipita con alcohol y se somete a centrifugaci6n isopicnica utilizando CsCl en presencia de bromuro de etidio para separar las diferentes formas de ADN plasmidico, es decir, superenrollado, circulo mellado, y linearizado. Se requiere una extracci6n adicional con butanol para eliminar el bromuro de etidio residual seguido de la precipitaci6n del ADN utilizando alcohol. Se utilizan etapas adicionales de purificaci6n para eliminar las proteinas de la celula anfitriona.

Estos metodos habituales para aislar ADN plasmidico tienen varias limitaciones. Por ejemplo, los metodos de purificaci6n que implican la utilizaci6n de grandes cantidades de disolventes organicos inflamables (por ejemplo, etanol e isopropanol) y compuestos quimicos t6xicos, por ejemplo, bromuro de etidio, fenol y cloroformo, no son deseables generalmente para el aislamiento y purificaci6n de ADN plasmidico a gran escala. Pueden utilizarse metodos alternativos a la centrifugaci6n con cloruro de cesio para la purificaci6n de ADN plasmidico, tales como cromatografia de exclusi6n por tamano, cromatografia en hidroxiapatita y varios metodos cromatograficos basados en fase reversa o intercambio ani6nico. Estas alternativas pueden ser adecuadas para producir cantidades

pequenas del material de investigaci6n a escala de laboratorio pero generalmente no son facilmente escalables y no son capaces de producir las cantidades de ADN plasmidico.

A traves de una serie de manipulaciones como se describen mas arriba, es posible obtener plasmido con pureza relativamente elevada (de ahora en adelante dicho metodo de separaci6n y purificaci6n de acido nucleico se refiere como un metodo quimico de separaci6n). Sin embargo, con el metodo quimico se separaci6n, el proceso de separaci6n y purificaci6n es complicado y debe utilizarse una gran cantidad de disolvente organico, por lo que plantea muchos problemas respecto al tratamiento de los disolventes desechados y otros.

Ademas del metodo quimico de separaci6n y purificaci6n, existe un metodo para separar plasmidos mediante electroforesis. El metodo electroforetico incluye electroforesis en papel y electroforesis en gel, y la electroforesis en gel es habitual actualmente. El metodo electroforetico tiene la ventaja de obtener plasmido con pureza elevada, aunque tiene muchos problemas de tiempo de separaci6n largo, recolecci6n dificil, carga baja de muestra, etc. Consecuentemente, una situaci6n actual es que la separaci6n electroforetica se usa solo cuando se desea que mejorar adicionalmente la pureza de la fracci6n de plasmido purificada por dicho metodo quimico de separaci6n y purificaci6n.

Los metodos disponibles actualmente para separar las dos formas de ADN plasmidico utilizan cromatografia de intercambio i6nico (Duarte et al., Journal of Chromatography A, 606 (1998), 31-45) o cromatografia de exclusi6n por tamano (Prazeres, D.M., Biotechnology Techniques Vol. 1, No. 6, Junio 1997, p 417-420), acopladas a la utilizaci6n de aditivos tales como polietilen glicol (PEG), detergentes, y otros componentes tales como cobalto de hexamina, espermidina, y polivinilpirrolidona (PVP). Sin embargo, los metodos que se conocen actualmente son incapaces de proporcionar una separaci6n eficaz y econ6mica de ADN superenrollado y mellado (o relajado). Ademas, muchos de los metodos conocidos presentan la desventaja de utilizar PEG u otros aditivos, que pueden no ser deseables en la fabricaci6n de ADN plasmidico, ya que requieren metodos de separaci6n, eliminaci6n y control de calidad adicionales que pueden ser dificiles, mas largos y mas caros. Las formas alternativas de los metodos conocidos para separar las formas superenrolladas y relajadas de ADN plasmidico utilizan resinas muy caras, patentadas, que tambien utilizan disolventes tales como acetonitrilo, etanol y otros componentes, como trietilamina y fosfato de tetrabutil amonio durante el procesamiento. Los metodos adicionales para separar ADN superenrollado y relajado se basan en cromatografia de exclusi6n por tamano, que implica la separaci6n de las dos formas de ADN plasmidico tomando como base la pequena diferencia de tamano. Estas columnas tienden a ser relativamente largas, lo que plantea problemas significativos en el aumento de escala, haciendo que no sea factible su aplicaci6n para una producci6n a gran escala. Ademas, los metodos de exclusi6n por tamano necesitan disoluciones de muestra concentradas que no se pueden obtener con disoluciones de ADN plasmidico, debido a la naturaleza altamente viscosa del ADN. Las preparaciones de ADN plasmidico, que se producen a partir de preparaciones bacterianas y que habitualmente contienen una mezcla de ADN plasmidico relajado y superenrollado, requieren frecuentemente la eliminaci6n de endotoxinas, como requiere la FDA, ya que se sabe que las endotoxinas producidas por muchos anfitriones bacterianos producen reacciones inflamatorias, tales como fiebre y sepsia, en el anfitri6n que recibe el ADN plasmidico. Estas endotoxinas son generalmente lipopolisacaridos, o fragmentos de estos, que son componentes de la membrana exterior de bacterias Gram-negativas y que estan presentes en la preparaci6n de ADN de las celulas anfitrionas y en las membranas o macromoleculas de las celulas anfitrionas. Por lo tanto, la eliminaci6n de endotoxinas es una etapa crucial y necesaria en la purificaci6n de ADN plasmidico para una utilizaci6n terapeutica o profilactica. La eliminaci6n de endotoxinas de las disoluciones de ADN plasmidico utilizaba principalmente la estructura cargada negativamente de las endotoxinas. Sin embargo, el ADN plasmidico tambien esta cargado negativamente y por lo tanto la separaci6n se consigue habitualmente con resinas de intercambio ani6nico que unen ambas moleculas y, en determinadas condiciones, eluyen preferentemente ADN plasmidico mientras unen endotoxinas. Dicha separaci6n resulta s6lo en una eliminaci6n parcial ya que cantidades significativas de endotoxinas eluyen con el ADN plasmidico y/o se consigue una baja recuperaci6n del ADN plasmidico.

El aislamiento y purificaci6n de ADN plasmidico a gran escala a partir de fermentaciones microbianas de gran volumen requieren, por lo tanto, el desarrollo de un procedimiento mejorado de preparaci6n de plasmidos. Tambien se requiere un procedimiento para separar y purificar una gran cantidad de ADN plasmidicos de una manera mas sencilla y en menos tiempo. Tambien es deseable para la investigaci6n y terapia basadas en plasmidos, que los acidos nucleicos puedan separarse y purificarse manteniendo la misma estructura de una manera reproducible, y con el fin de evitar efectos adversos de impurezas en el cuerpo del ser humano, se requiere que los acidos nucleicos hayan sido separados y purificados hasta una pureza alta.

Con dicho metodo convencional, sin embargo, existe el problema de que los acidos nucleicos con pureza suficientemente elevada, en particular, los ADN plasmidicos no puedan obtenerse en gran cantidad. Por lo tanto, la presente invenci6n pretende proporcionar un metodo de separaci6n que utiliza al menos dos etapas cromatograficas, que permite separar una gran cantidad de ADN plasmidicos en menos tiempo y con un grado de pureza mayor.

COMPENDIO DE LA INVENCION

La invenci6n se basa en el descubrimiento de un metodo para producir y aislar ADN plasmidico altamente purificado. El ADN plasmidico producido y aislado mediante el metodo de la invenci6n contiene unos niveles muy bajos de ADN

cromos6mico, ARN, proteina y endotoxinas contaminantes. El ADN plasmidico producido segun la invenci6n tiene la suficiente pureza para terapia basada en plasmidos.

Asi, la invenci6n abarca un dispositivo de lisis celular alcalina continua que comprende:

•

un primer mezclador o inyector capaz de inyectar una disoluci6n de lisado en la direcci6n opuesta de una suspensi6n celular;

•

un primer tubo de pequeno diametro para generar un flujo turbulento dentro de la mezcla;

•

un segundo tubo de gran diametro para generar un flujo laminar dentro de la mezcla;

•

un segundo mezclador o inyector para inyectar la disoluci6n neutralizante en un extremo y recoger en el otro extremo la mezcla.

En otra realizaci6n mas, el mecanismo puede utilizarse en un metodo para aislar ADN plasmidico a partir de celulas que comprende: (a) mezclar las celulas con una disoluci6n de lisis alcalina en el medio para flujo turbulento; y (b) neutralizar la disoluci6n de lisis alcalina mediante la adici6n de una disoluci6n acida.

La invenci6n engloba ademas un metodo para producir y aislar ADN plasmidico altamente purificado que esencialmente no contiene contaminantes y, por lo tanto, es ADN de grado farmaceutico.

Otro objeto de la presente invenci6n se refiere a un metodo para separar y purificar acidos nucleicos y ADN plasmidico. Mas detalladamente, se refiere a un metodo para separar acidos nucleicos y ADN plasmidico de grado farmaceutico que son utiles para la investigaci6n y la terapia basada en plasmidos. Una preparaci6n de ADN plasmidico aislada segun los metodos de la invenci6n puede someterse a etapas de purificaci6n incluyendo al menos cromatografia de triple helice y puede incluir ademas cromatografia de intercambio ani6nico y cromatografia de interacci6n hidrof6bica.

Estos metodos incluyen, por lo tanto, la etapa de lisis alcalina continua descrita en la presente memoria en combinaci6n con una posterior cromatografia de intercambio ani6nico y cromatografia de triple helice, y ademas cromatografia de interacci6n hidrof6bica.

Estos metodos tambien incluyen, por lo tanto, la etapa de lisis alcalina continua descrita en la presente memoria en combinaci6n con unas etapas posteriores de cromatografia de intercambio ani6nico y cromatografia de triple helice y cromatografia de interacci6n hidrof6bica en combinaci6n. La primera etapa cromatografica puede estar precedida de la filtraci6n del lisado u otra eliminaci6n del fl6culo.

Otro objeto de la invenci6n es maximizar el rendimiento de ADN plasmidico a partir de una combinaci6n celula anfitriona/ADN plasmidico.

Otro objeto de la invenci6n es proporcionar una preparaci6n de ADN plasmidico que no contiene sustancialmente ARN del anfitri6n bacteriano.

Otro objeto de la invenci6n es proporcionar una preparaci6n de ADN plasmidico que no contiene sustancialmente proteinas del anfitri6n bacteriano.

Otro objeto de la invenci6n es proporcionar una preparaci6n de ADN plasmidico que no contiene sustancialmente ADN cromos6mico del anfitri6n bacteriano.

Otro objeto de la invenci6n es proporcionar una preparaci6n de ADN plasmidico que no contiene sustancialmente endotoxinas del anfitri6n bacteriano.

Otro objeto de la presente invenci6n es proporcionar un metodo para preparar ADN plasmidico de grado farmaceutico que es muy puro para utilizarse en investigaci6n y en terapia basada en plasmidos y que es susceptible de incrementar su escala hasta la fabricaci6n a gran escala.

Finalmente, la presente invenci6n se refiere a un dispositivo continuo para la lisis celular alcalina que comprende un primer mezclador o inyector capaz de inyectar un fluido alcalino en la direcci6n opuesta a la suspensi6n celular, un primer tubo de pequeno diametro para generar un flujo turbulento en la mezcla, un segundo tubo de un diametro grande para generar un flujo laminar en la mezcla, un segundo mezclador o inyector para inyectar la disoluci6n neutralizante en un extremo y recoger la mezcla en el otro extremo.

Los objetos y ventajas adicionales de la invenci6n se mostraran en parte en la descripci6n que sigue y en parte seran obvias a partir de la descripci6n o pueden apreciarse mediante la practica de la invenci6n. Los objetos y ventajas de la invenci6n se llevaran a cabo y se conseguiran mediante los elementos y combinaciones indicadas particularmente en las reivindicaciones adjuntas.

Debe entenderse que tanto la descripci6n general anterior como la descripci6n detallada siguiente son s6lo a modo de ejemplo y explicaci6n y que no son restrictivas de la invenci6n, como se reivindica.

Los dibujos adjuntos, que se incorporan en y constituyen una parte de esta memoria descriptiva, ilustran una (varias) realizaci6n (realizaciones) de la invenci6n y junto con la descripci6n sirven para explicar los principios de la invenci6n.

DESCRIPCION BREVE DE LAS FIGURAS

La Figura 1 es un esquema del aparato que puede utilizarse para el modo continuo de lisis celular de la invenci6n.

La Figura 2 es un esquema del mezclador M1 en el aparato continuo de lisis celular.

La Figura 3 es una tabla que compara los rendimientos de la purificaci6n en terminos de ADNg, ARN, proteinas, endotoxinas contaminantes utilizando una unica etapa de cromatografia de intercambio ani6nico (AEC), o un metodo de dos etapas con una etapa de cromatografia de intercambio ani6nico en combinaci6n con cromatografia de afinidad de triple helice (THAC), y un metodo de tres etapas que comprende una etapa de cromatografia de intercambio ani6nico, una etapa de cromatografia de afinidad de triple helice y una etapa de cromatografia de interacci6n hidrof6bica (HIC) en combinaci6n ND significa no detectado: metodos analiticos de baja sensibilidad.

La Figura 4 es una tabla que compara varios metodos de separaci6n y purificaci6n de ADN plasmidico, tales como cromatografia de intercambio ani6nico (AEC), HAC, cromatografia en hidroxiapatita, cromatografia de interacci6n hidrof6bica (HIC), cromatografia en fase reversa (RPC), cromatografia de exclusi6n por tamano (SEC), cromatografia de afinidad de triple helice (THAC) solas o en combinaci6n y el metodo segun la presente invenci6n. En la presente memoria se proporcionan los resultados en terminos de calidad del ADN plasmidico purificado. ND, no detectado (metodos analiticos de baja sensibilidad).

Las Figuras 5A y 5B son graficos que muestran las velocidades de despurinaci6n y mella (formaci6n de la forma de plasmido circular abierta) del ADN plasmidico almacenado a +25°C y +5°C hasta 90 dias.

Definiciones

Acido significa que se refiere a o que contiene un acido; que tiene un pH de menos de 7.

Alcalino significa que se refiere a o que contiene un alcali o base; que tiene un pH mayor de 7.

Continuo significa no interrumpido, que no se interrumpe.

ADN gen6mico significa un ADN que se obtiene de o que existe en un cromosoma.

Flujo laminar significa el tipo de flujo en una corriente de disoluci6n acuosa en la que cada particula se mueve en una direcci6n paralela a todas las particulas.

Lisado significa el material producido mediante el proceso de lisis celular. El termino lisar se refiere a la acci6n de romper la pared celular y/o la membrana celular de una celula que esta en una disoluci6n tamponada (es decir, suspensi6n celular) mediante tratamiento quimico utilizando una disoluci6n que contiene un agente lisante. Los agentes lisantes incluyen, por ejemplo, alcali, detergentes, disolventes organicos y enzimas. En una realizaci6n preferida, la lisis de las celulas se realiza para liberar plasmidos intactos de las celulas anfitrionas.

Se neutraliza para hacer (una disoluci6n) neutra o para producir (un acido o base/alcali) la neutralizaci6n. Mediante este termino queremos decir que algo que neutraliza una disoluci6n lleva el pH de la disoluci6n a un pH entre 5 y 7, y preferiblemente aproximadamente 7 o mas preferiblemente mas cerca de 7 de lo que estaba anteriormente.

Fluido Newtoniano es un fluido en el que el esfuerzo de cizalla es proporcional al gradiente de velocidad y perpendicular al plano de cizalla. La constante de proporcionalidad se conoce como la viscosidad. Los ejemplos de fluidos Newtonianos incluyen liquidos y gases.

Fluido no Newtoniano es un fluido en el que el esfuerzo de cizalla no es proporcional s6lo al gradiente de velocidad y perpendicular al plano de cizalla. Los fluidos no Newtonianos pueden no tener una viscosidad bien definida. Los fluidos no Newtonianos incluyen s6lidos plasticos, fluidos segun la ley de la potencia, fluidos viscoelasticos (que tienen tanto propiedades viscosas como elasticas), y fluidos con viscosidad dependiente del tiempo.

ADN plasmidico significa una inclusi6n celular pequena que consiste en un anillo de ADN que no es un cromosoma, que puede tener la capacidad de tener insertado un fragmento de ADN no end6geno. Los procedimientos para la construcci6n de plasmidos incluyen los descritos en Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Para los fines de la presente invenci6n, el termino fluir se refiere a la acci6n de hacer pasar un liquido a una velocidad de flujo particular (por ejemplo, litros por minuto) a traves del mezclador, habitualmente mediante la acci6n

de una bomba. Debe indicarse que se cree que la velocidad de flujo a traves del mezclador afecta la eficacia de la lisis, precipitaci6n y mezclado.

ADN "mellado " o "relajado" significa ADN que no esta superenrollado. ADN "superenrollado" es un termino bien entendido en la tecnica.

Una "impureza contaminante" es cualquier sustancia de la que se desea separar o aislar el ADN. Las impurezas contaminantes incluyen, pero no se limitan a, proteinas de la celula anfitriona, endotoxina, ADN y/o ARN de la celula anfitriona. Se entiende que lo que se considera una impureza contaminante puede depender del contexto en el que se practican los metodos de la invenci6n. Una "impureza contaminante" puede proceder o no de la celula anfitriona, es decir, puede ser o no una impureza de la celula anfitriona.

"Aislar" o "purificar" un primer componente (tal como ADN) significa enriquecer el primer componente respecto a otros componentes con los que se encuentra inicialmente el primer componente. En la presente memoria se proporcionan los grados de purificaci6n deseados y/o que se pueden obtener.

Los terminos esencialmente sin y altamente purificado se definen como aproximadamente 95% y preferiblemente mas de 98,99% puro o sin contaminantes o que posee menos de 5%, y preferiblemente menos de 1-2% de contaminantes.

ADN de grado farmaceutico se define en la presente memoria como una preparaci6n de ADN que contiene no mas de aproximadamente 5%, y preferiblemente no mas de aproximadamente 1-2% de componentes celulares, tales como membranas celulares.

ADN de grado farmaceutico se define en la presente memoria como una preparaci6n de ADN que contiene partes por mill6n o ppm (< 0,0001%, es decir < 0,0001 mg por 100 mg de ADN plasmidico) de ADN, ARN gen6mico y proteinas contaminantes.

Tambien, o mas precisamente, "ADN plasmidico de grado farmaceutico" en la presente memoria significa una preparaci6n de ADN que contiene menos de aproximadamente 0,01%, o menos de 0,001%, y preferiblemente menos de 0,0001%, o preferiblemente menos de 0,00008% (< 0,00008%, es decir < 0,00008 mg por 100 mg de ADN plasmidico) de ADN cromos6mico o ADN gen6mico.

ADN plasmidico de grado farmaceutico significa en la presente memoria una preparaci6n de ADN que contiene menos de aproximadamente 0,01%, o menos de 0,001%, y preferiblemente menos de 0,0001%, o preferiblemente menos de 0,00002% (< 0,00002%, es decir < 0,00002 mg por 100 mg de ADN plasmidico) de contaminantes de ARN.

ADN plasmidico de grado farmaceutico significa en la presente memoria una preparaci6n de ADN que contiene menos de aproximadamente 0,0001%, y lo mas preferiblemente menos de 0,00005% (< 0,00005%, es decir < 0,00005 mg por 100 mg de ADN plasmidico) de proteinas contaminantes.

ADN de grado farmaceutico significa en la presente memoria una preparaci6n de ADN que contiene menos de 0,1 EU/mg de endotoxinas.

El ADN de grado farmaceutico significa en la presente memoria una preparaci6n de ADN que esta preferiblemente predominantemente en forma circular y mas precisamente que contiene mas del 80%, 85%, 90%, 95%, o mas del 99% de forma circular cerrada de ADN plasmidico.

Tubo T se refiere a una configuraci6n de tubo con forma de T, en la que una forma T se forma mediante una unica pieza de tubo creada en esa configuraci6n o mas de una pieza de tubo combinadas para crear esa configuraci6n. El tubo T tiene tres brazos y un area central en la que se unen los brazos. Un tubo T puede utilizarse para mezclar ingredientes ya que dos fluidos pueden fluir en cada uno de los brazos de la T, unirse en el area central y salir por el tercer brazo. El mezclado se produce al combinarse los fluidos.

Flujo turbulento significa movimiento irregular al azar de particulas de fluido en direcciones transversales a la direcci6n del flujo principal, en el que la velocidad en un punto determinado varia de manera erratica en magnitud y direcci6n.

Viscoelastico se refiere a fluidos que tienen propiedades tanto viscosas como elasticas.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

La invenci6n se basa en el descubrimiento de un metodo escalable para producir una alta producci6n de ADN plasmidico de grado farmaceutico. En particular, la invenci6n se basa en el descubrimiento de un metodo para producir y aislar ADN plasmidico altamente purificado utilizando una lisis alcalina continua de las celulas anfitrionas.

Como primera etapa las celulas anfitrionas se inoculan, es decir, se transforman con un ADN plasmidico en la fase exponencial de crecimiento y se siembran en placas que contienen medio LB que contiene un antibi6tico tal como

tetraciclina. Se inoculan colonias independientes de la placa cada una en 20 ml de medio LB suplementado con el antibi6tico apropiado tetraciclina en matraces Erlenmeyer de plastico esteriles independientes y se crecen durante 12-16 horas a 37 grados en un incubador con agitaci6n. Uno de estos cultivos se utiliz6 para inocular 200 ml de medio LB esteril suplementado en un matraz Erlenmeyer de 2 L. Este se creci6 a 37°C y 200 rpm en un incubador con agitaci6n y se utiliz6 para inocular dos matraces Erlenmeyer de 5 L y se crecieron a 30°C y 200 rpm en un incubador con agitaci6n y se utilizaron para inocular el recipiente de fermentaci6n cuando estaban en mitad de la fase exponencial, despues de 5 horas y a una DO600 nm de 2 unidades.

Los cultivos de las celulas anfitrionas y la inoculaci6n son muy conocidos en la tecnica. Generalmente, las celulas anfitrionas se crecen hasta que alcanzan una gran biomasa y las celulas estan en crecimiento exponencial con el fin de tener una gran cantidad de ADN plasmidico. Pueden utilizarse dos metodos distintos, es decir, fermentaci6n discontinua y de alimentaci6n discontinua.

La fermentaci6n discontinua permite controlar la velocidad de crecimiento mediante la manipulaci6n de la temperatura de crecimiento y de la fuente de carbono utilizada. Tal y como se utiliza en la presente memoria, el termino "fermentaci6n discontinua" es un proceso de cultivo celular mediante el que todos los nutrientes requeridos para el crecimiento celular y para la producci6n del plasmido contenido en las celulas cultivadas estan en el recipiente en exceso (por ejemplo, un exceso de 10 veces de las concentraciones de nutrientes respecto a la tecnica anterior) en el momento de la inoculaci6n, evitando asi la necesidad de realizar adiciones al recipiente esteril despues de las adiciones posteriores a la esterilizaci6n y la necesidad de modelos y estrategias de alimentaci6n complejos.

Otro tipo de fermentaci6n util segun la invenci6n es la fermentaci6n de alimentaci6n discontinua, en la que se controla la velocidad de crecimiento celular mediante la adici6n de nutrientes al cultivo durante el crecimiento celular. Tal y como se utiliza en la presente memoria, "fermentaci6n de alimentaci6n discontinua" se refiere a un proceso de cultivo celular en el que la velocidad de crecimiento se controla mediante adiciones evaluadas cuidadosamente de metabolitos al cultivo durante la fermentaci6n. La fermentaci6n de alimentaci6n discontinua segun la invenci6n permite que el cultivo celular alcance una biomasa mayor que la fermentaci6n discontinua.

Los ejemplos de procesos de fermentaci6n y velocidades ejemplares de adici6n de la alimentaci6n estan descritos mas adelante para una preparaci6n de 50 L. Sin embargo, tambien pueden procesarse otros volumenes, por ejemplo, 10 L, 50 L, o mas de 500 L, utilizando las velocidades de alimentaci6n ejemplares descritas mas adelante, dependiendo de la escala del equipo.

Las fermentaciones con medio discontinuo altamente enriquecido y con medio de alimentaci6n discontinua son apropiadas para la producci6n de cultivos con alta densidad celular para maximizar la producci6n especifica del plasmido y permitir la recogida con una gran biomasa todavia en crecimiento exponencial.

La fermentaci6n de alimentaci6n discontinua utiliza glucosa o glicerol como una fuente de carbono. La fermentaci6n se realiza en modo discontinuo hasta que se agota el sustrato carbonado inicial (glucosa). Este punto se nota por un incremento rapido de DO y se confirma mediante un analisis de glucosa en una muestra tomada inmediatamente despues de este evento. Entonces se pone en marcha la bomba del medio de alimentaci6n previamente cebada. La velocidad de la bomba se determina mediante un modelo obtenido de Curless et al. (Bioeng. 38:1082-1090, 1991), que se incorpora en su totalidad en la presente memoria por referencia. El modelo se disena para facilitar el control de la fase de alimentaci6n de un proceso de alimentaci6n discontinua. En el proceso discontinuo inicial, una concentraci6n no inhibidora de sustrato es consumida por las celulas que crecen a su velocidad de crecimiento especifica maxima, max, dando lugar a un incremento rapido de los niveles de biomasa despues de la inoculaci6n. El cultivo no puede crecer a esta velocidad indefinidamente debido a la acumulaci6n de metabolitos t6xicos (Fieschio et al., "Fermentation Technology Using Recombinant Microorganisms." En Biotechnology, eds. H. J. Rhem y G. Reed. Weinheim: VCH Verlagsgesellschaft mbH 7b: 117-140, 1989). Con el fin de permitir un crecimiento logaritmico continuado, el modelo calcula la velocidad de alimentaci6n basada en el tiempo del sustrato carbonado limitante del crecimiento, sin la necesidad de un retrocontrol, para dar lugar a una fase de crecimiento de alimentaci6n discontinua ajustada por el operador. Esto se elige a un nivel que no produce la acumulaci6n de catabolitos inhibidores y es suficiente para rendir una gran biomasa.

Generalmente, la fermentaci6n discontinua utiliza unos niveles altos (por ejemplo, 4 veces mayores que las concentraciones de la tecnica anterior) de precursores presentes en el medio discontinuo enriquecido. En particular, las cantidades de extracto de levadura en el medio discontinuo enriquecido son 5 g/l (como en el medio LB) hasta 20 g/litro proporcionando asi grandes cantidades de factores de crecimiento y de precursores de acidos nucleicos. El medio tambien esta suplementado con sulfato de amonio (5 g/l) que actua como una fuente de nitr6geno organico. Las adiciones de precursores (nitr6geno organico en la forma de sulfato de amonio) durante el proceso de alimentaci6n en la fermentaci6n de alimentaci6n discontinua se disenan para prevenir efectos perjudiciales en la calidad del plasmido.

Un aspecto importante del metodo segun la presente invenci6n es la lisis celular. Por lo tanto, la presente invenci6n engloba un procedimiento para producir y aislar ADN plasmidico altamente purificado que incluye la etapa de lisis celular en la que hay (a) un medio para flujo turbulento para mezclar rapidamente una suspensi6n celular (disoluci6n

1 en la Figura 1) con una disoluci6n que lisa las celulas (disoluci6n 2 en la Figura 1); y (b) un medio para flujo laminar para permitir la incubaci6n de una mezcla formada en (a) sin agitaci6n sustancial, en la que la mezcla formada en (a) fluye desde el medio para flujo turbulento hasta el medio para flujo laminar.

Segun una realizaci6n de la invenci6n, el mecanismo puede comprender ademas un medio para anadir una segunda disoluci6n que neutralice la disoluci6n de lisis (disoluci6n 3 en la Figura 1), en el que la mezcla incubada en (b) fluye desde el medio para flujo laminar hasta el medio para la adici6n de una segunda disoluci6n.

En otra realizaci6n mas, el mecanismo puede utilizarse en un metodo para aislar ADN plasmidico a partir de celulas que comprende: (a) mezclar las celulas con una disoluci6n de lisis alcalina en el medio para flujo turbulento; y (b) neutralizar la disoluci6n de lisis alcalina mediante la adici6n de una disoluci6n acida.

A pesar de los numerosos metodos utilizados actualmente para lisar celulas bacterianas, ninguno de ellos se plantea los problemas causados por las propiedades viscoelasticas de los fluidos y las fuerzas de cizalla implicadas en las etapas de mezclado. Un objeto de la presente invenci6n es un metodo para utilizar tubos T para mezclar la suspensi6n celular (disoluci6n 1) y la disoluci6n alcalina (disoluci6n 2) uniformemente y muy rapidamente antes de que aparezca el fluido viscoelastico. Por lo tanto, la lisis continua segun la presente invenci6n proporciona una ventaja importante limitando las fuerzas de cizalla. Los tubos T tienen generalmente un diametro de tubo pequeno, habitualmente un diametro inferior a 1 cm, preferiblemente de aproximadamente 2 y 8 mm, y mas preferiblemente de aproximadamente 6mm, con el fin de incrementar el tiempo de contacto de los fluidos mezclados, pero este metodo no utiliza la inducci6n del mezclado mediante el paso a traves del tubo. La Tabla 1 que aparece a continuaci6n en la presente memoria muestra la variaci6n de los parametros B1a, B1b, B2 del medio para flujo turbulento, flujo laminar, y flujo turbulento, respectivamente, y sus velocidades de flujo correspondientes S1, S2, y S3 como se muestra en la Figura 1.

Tabla 1

B1a (60L/h)

B1b (60L/h) B2 (90L/h) Velocidades de flujo

diametro

longitud diametro longitud diametro longitud S1, S2 y S3 Intervalo

5 a 7 mm

2-6m 12,5 a 19 mm 13 a 23 m 5 a 8 mm 2 a 4 m 60/60/90 L/h ± 20%

Otro objeto de la presente invenci6n es un mezclador o inyector con tubos en lugar de una T, que permite la dispersi6n de las celulas en la disoluci6n de lisis. De acuerdo con esto, el estres mecanico en los fluidos que pasan a traves de los tubos se reduce en gran medida si se compara con el de los fluidos que se agitan, por ejemplo, mediante palas en tanques. La eficacia inicial del mezclado resulta en una eficacia aun mayor en los segundos siguientes, ya que este fluido todavia no tiene las propiedades viscoelasticas y el mezclado realizado por el tubo de pequeno diametro es muy eficaz. Por el contrario, cuando un tubo T se utiliza para el mezclado, el mezclado inicial es s6lo moderado mientras el fluido se vuelve rapidamente viscoelastico, lo que resulta en problemas considerables mientras fluye en el tubo. Este mezclado parcial resulta en la lisis de s6lo una parte de las celulas y, por lo tanto, s6lo puede liberar una parte de los plasmidos antes de la neutralizaci6n.

Segun la presente invenci6n, hemos identificado dos fases durante la lisis, denominadas Fase I y Fase II. Estas dos fases corresponden a I) lisis de las celulas y II) desnaturalizaci6n de los acidos nucleicos, lo que produce un cambio importante en el comportamiento reol6gico que resulta en un fluido viscoelastico. El ajuste de los diametros de los tubos hace posible conseguir la finalidad de estas dos fases. En un tubo con un diametro pequeno (B1a), el mezclado se incrementa. Esta es la configuraci6n utilizada para la Fase I. En un tubo con un diametro grande (B1b), el mezclado (y por lo tanto el esfuerzo de cizalla) se reduce. Esta es la configuraci6n utilizada para la Fase II.

De acuerdo con esto, utilizamos un mezclador denominado M1 que se muestra en la Figura 2. Tambien puede utilizarse cualquier dispositivo con forma de T para proporcionar la dispersi6n de la suspensi6n celular segun la presente invenci6n. Con este mezclador, la disoluci6n 1 se inyecta en contracorriente en la disoluci6n de lisis alcalina a traves de uno o mas orificios con diametro pequeno con el fin de obtener una dispersi6n eficaz. Los diametros de estos orificios son de aproximadamente 0,5 mm a 2 mm, y preferiblemente aproximadamente 1 mm en la configuraci6n mostrada.

La mezcla sale del mezclador M1 para pasar a traves de un tubo con un diametro pequeno (Figura 1) durante un corto periodo de tiempo (de aproximadamente 2,5 s). La combinaci6n del diametro y del tiempo de flujo puede calcularse facilmente para mantener un flujo turbulento. Los ejemplos de variaciones de estos parametros se proporcionan en la Tabla 1. Todas las referencias al diametro del tubo proporcionan el diametro interno del tubo, no el diametro externo, que incluye el espesor de las paredes del tubo. Este tiempo breve de residencia en el tubo permite una homogeneizaci6n muy rapida de las disoluciones 1 y 2. Asumiendo que la disoluci6n 1 y la disoluci6n 2 todavia son fluidos Newtonianos durante la Fase I, el modo de flujo es turbulento durante la fase de homogeneizaci6n. A la salida de este tubo, las disoluciones 1 y 2 se homogeneizan y comienza la lisis de las celulas en suspensi6n.

La mezcla homogeneizada pasa entonces a traves de un segundo tubo (B1b) con un diametro mucho mayor (Figura 1), en el que se produce la lisis de las celulas y la formaci6n del fluido viscoelastico. Durante esta fase, el mezclado puede minimizarse y puede dejarse a la disoluci6n en "reposo" para limitar la turbulencia lo maximo posible con el fin de minimizar cualquier esfuerzo de cizalla que fragmentaria el ADNg. En una realizaci6n de la presente invenci6n, un tiempo de contacto de aproximadamente 1 a 3 min, aproximadamente 2 min, y preferiblemente de 1 min 20 s es suficiente para completar la lisis celular y para desnaturalizar los acidos nucleicos. Durante la fase de desnaturalizaci6n, el modo del flujo es laminar, lo que promueve la difusi6n lenta de SDS y de hidr6xido s6dico hacia los componentes celulares.

El lisado obtenido de esta manera y la disoluci6n de neutralizaci6n 3 se mezclan entonces con un mezclador Y denominado M2. En una realizaci6n de la presente invenci6n, el diametro interno del mezclador Y es de aproximadamente 4 a 15 mm, o de aproximadamente 6 a 10 mm, y puede ser de aproximadamente 6mm o de aproximadamente 10 mm. El tubo con un diametro pequeno (por ejemplo, un tubo de aproximadamente 6 mm) se pone en la salida del mezclador Y para permitir el mezclado rapido (< 1 s) y eficaz del lisado con la disoluci6n 3. La disoluci6n neutralizada se recoge en un tanque de recogida. Durante la neutralizaci6n, la disminuci6n rapida del pH induce la floculaci6n (es decir, la formaci6n de grumos o masas). Por otra parte, el plasmido parcialmente desnaturalizado se renaturaliza muy rapidamente y permanece en disoluci6n. Los fl6culos sedimentan gradualmente en el tanque de recogida, arrastrando a la mayor parte de los contaminantes.

El dibujo esquematico de la Figura 1 muestra una realizaci6n del sistema continuo de lisis (CL). La lisis continua puede utilizarse sola o con procesos adicionales.

El metodo de la presente invenci6n puede utilizarse para lisar cualquier tipo de celula (es decir, procariota o eucariota) para cualquier prop6sito relacionado con la lisis, tal como la liberaci6n de ADN plasmidico deseado de las celulas diana para ser posteriormente purificado. En una realizaci6n preferida, el metodo de la presente invenci6n se utiliza para lisar celulas anfitrionas que contienen plasmidos para liberar los plasmidos.

El proceso de lisis alcalina continua segun la presente invenci6n puede realizarse en celulas recogidas de una fermentaci6n que se ha crecido hasta una biomasa de celulas que no ha alcanzado la fase estacionaria y que por lo tanto estan en la fase de crecimiento exponencial (2-10 g peso seco/litro). La etapa de lisis alcalina continua tambien puede realizarse en celulas recogidas de una fermentaci6n que se ha crecido hasta una gran biomasa de celulas y que no estan en crecimiento exponencial sino que han alcanzado la fase estacionaria, con una concentraci6n celular de aproximadamente 10-200 g de peso seco por litro, y preferiblemente 12-60 g de peso seco por litro.

La invenci6n engloba ademas un metodo para producir y aislar ADN plasmidico altamente purificado que esencialmente no contiene contaminantes y, por lo tanto, es ADN de grado farmaceutico. El ADN plasmidico producido y aislado mediante el metodo de la invenci6n contiene unos niveles muy bajos, es decir, partes por mill6n (ppm) de ADN cromos6mico, ARN, proteina y endotoxinas contaminantes y contiene mayoritariamente la forma circular cerrada de ADN plasmidico. El ADN plasmidico producido segun la invenci6n tiene la suficiente pureza como para utilizarse en investigaci6n y en terapia basada en plasmidos.

El metodo de la invenci6n comprende etapas de purificaci6n que incluyen cromatografia de afinidad de triple helice con una etapa adicional de cromatografia de intercambio i6nico y puede incluir ademas cromatografia de interacci6n hidrof6bica o cromatografia de permeaci6n en gel. La etapa de cromatografia de intercambio i6nico puede ser cromatografia de intercambio i6nico en lechos fluidizados y cromatografia de intercambio ani6nico axial y/o radial de alta resoluci6n.

El metodo incluye, por lo tanto, la etapa de lisis alcalina descrita en la presente memoria en combinaci6n con unas etapas posteriores de cromatografia de intercambio i6nico, cromatografia afinidad de triple helice y cromatografia de interacci6n hidrof6bica, en ese orden. La primera etapa cromatografica puede estar precedida de la filtraci6n del lisado u otra eliminaci6n del fl6culo. Los metodos de la invenci6n descritos en la presente memoria para purificar ADN plasmidico son escalables y por lo tanto se puede aumentar su escala hasta la fabricaci6n a gran escala.

En algunas realizaciones de la invenci6n, la lisis continua puede combinarse con etapas de purificaci6n adicionales para proporcionar un producto con gran pureza que contiene ADNp. Puede combinarse, por ejemplo, con al menos una de eliminaci6n del fl6culo (tal como filtraci6n del lisado, sedimentaci6n o centrifugaci6n), cromatografia de intercambio i6nico (tal como intercambio cati6nico o ani6nico), cromatografia de afinidad de triple helice y cromatografia de interacci6n hidrof6bica. En una realizaci6n, la lisis continua esta seguida de cromatografia de intercambio ani6nico, cromatografia de afinidad de triiple helice y cromatografia de interacci6n hidrof6bica, en ese orden. En otra realizaci6n, la lisis continua esta seguida de filtraci6n del lisado, cromatografia de intercambio ani6nico, cromatografia de afinidad de triiple helice y cromatografia de interacci6n hidrof6bica, en ese orden. Estas etapas permiten un proceso de fabricaci6n de plasmidos verdaderamente escalable que puede producir grandes cantidades de ADNp con una pureza sin precedentes. El ADN y ARN asi como las proteinas del anfitri6n estan en el intervalo de sub-ppm.

El metodo de la presente invenci6n puede usar tambien etapas adicionales de SEC, cromatografia de fase inversa, cromatografia sobre hidroxiapatita, etc... en combinaci6n con las etapas descritas en la presente memoria de acuerdo con la presente solicitud.

Puede utilizarse una eliminaci6n del fl6culo para proporcionar una mayor pureza al producto ADNp resultante. Esta etapa puede utilizarse para eliminar la mayor parte del material precipitado (fl6culo). Un mecanismo para realizar la eliminaci6n del fl6culo es mediante una etapa de filtraci6n del lisado, tal como a traves de un filtro con una rejilla de 1 a 5 mm, y preferiblemente 3,5 mm, seguido de una filtraci6n de profundidad como una etapa de filtraci6n fina. Otros metodos para conseguir la eliminaci6n del fl6culo son mediante centrifugaci6n o sedimentaci6n.

Puede utilizarse la cromatografia de intercambio i6nico para proporcionar una mayor pureza al producto ADNp resultante. El intercambio ani6nico puede seleccionarse dependiendo de las propiedades de los contaminantes y del pH de la disoluci6n.

Puede utilizarse la cromatografia de intercambio ani6nico para proporcionar una mayor pureza al producto ADNp resultante. La cromatografia de intercambio ani6nico funciona uniendo moleculas cargadas negativamente (o acidas) a un soporte que esta cargado positivamente. La utilizaci6n de la cromatografia de intercambio i6nico permite separar moleculas en base a su carga. Mediante esta tecnica pueden separarse facilmente familias de moleculas (acidas, basicas y neutras). Pueden utilizarse esquemas de eluci6n por etapas, eluyendo muchos contaminantes en las primeras fracciones y eluyendo el ADNp en las ultimas fracciones. El intercambio ani6nico es muy eficaz para eliminar proteinas y endotoxinas de la preparaci6n de ADNp.

En el caso de la cromatografia de intercambio i6nico, son muy conocidos en la tecnica el material de empaquetamiento y el metodo para preparar dicho material asi como el proceso para preparar, polimerizar y funcionalizar la cromatografia de intercambio ani6nico y para eluir y separar el ADN plasmidico presente en esta.

El compuesto que se va a utilizar para la sintesis de los materiales base que se utilizan para el material de empaquetamiento de la cromatografia de intercambio ani6nico puede ser cualquier compuesto, si pueden introducirse varios grupos funcionales que presentan hidrofobicidad o varios grupos de intercambio i6nico mediante una reacci6n posterior a la sintesis de los materiales base. Los ejemplos de mon6meros monofuncionales incluyen estireno, o-halometilestireno, m-halometilestireno, p-halometilestireno, o-haloalquilestireno, m-haloalquilestireno, phaloalquilestireno, a-metilestireno, a-metil-o-halometilestireno, a-metil-m-halometilestireno, a-metil-phalometilestireno, a-metil-o-haloalquilestireno, a-metil-m-haloalquilestireno, a-metil-p-haloalquilestireno, ohidroximetilestireno, m-hidroximetilestireno, p-hidroximetilestireno, o-hidroxialquilestireno, m-hidroxialquilestireno, phidroxialquilestireno, , a-metil-o-hidroximetilestireno, a-metil-m-hidroximetilestireno, a-metil-p-hidroximetilestireno, ametil-o-hidroxialquilestireno, a-metil-m-hidroxialquilestireno, a-metil-p-hidroxialquilestireno, glicidil metacrilato, glicidil acrilato, hidroxietil acrilato, hidroximetacrilato, y acetato de vinilo . Los compuestos mas preferidos son grupos haloalquilo sustituidos en el anillo aromatico, hal6genos tales como Cl, Br, I y F e hidrocarburos saturados de cadena lineal y/o ramificada con 2 a 15 atomos de carbono. Los ejemplos de mon6meros polifuncionales incluyen divinilbenceno, trivinilbenceno, diviniltolueno, triviniltolueno, divinilnaftaleno, trivinilnaftaleno, dimetacrilato de etilenglicol, diacrilato de etilenglicol, dimetacrilato de dietilenglicol, diacrilato de dietilenglicol, metilenbismetacrilamida, y metilenbisacrilamida.

Puede introducirse varios grupos de intercambio i6nico mediante la reacci6n posterior. La preparaci6n del material base incluye una primera etapa en la que se pesan el mon6mero monofuncional y el mon6mero polifuncional en una proporci6n apropiada y se anaden el diluyente o disolvente pesados de manera precisa que se utilizan para el fin de ajustar los poros de las particulas formadas y el iniciador de la polimerizaci6n pesado similarmente de manera precisa, seguido de una buena agitaci6n. La mezcla se somete entonces a una suspensi6n de polimerizaci6n de tipo aceite-en-agua en la que se anade la mezcla en una disoluci6n acuosa de suspensi6n disuelta del estabilizador pesada de manera precisa con anterioridad y se forman gotitas de aceite del tamano deseado mezclando con agitaci6n y la polimerizaci6n se realiza calentando gradualmente la disoluci6n de la mezcla. La proporci6n del mon6mero monofuncional respecto al mon6mero polifuncional es generalmente aproximadamente 1 mol de mon6mero monofuncional y aproximadamente 0,01 a 0,2 moles del mon6mero polifuncional para obtener particulas blandas del material base. Un iniciador de la polimerizaci6n no esta restringido particularmente y se utilizan de tipo azobis y/o de tipo per6xido utilizados comunmente.

Tambien pueden utilizarse estabilizadores de la suspensi6n tales como tensioactivos i6nicos, tensioactivos no i6nicos y polimeros con propiedades anfipaticas o mezclas de estos para prevenir la agregaci6n de las gotitas de aceite entre si.

El material de empaquetamiento que se va a utilizar para la cromatografia de intercambio i6nico para purificar ADN plasmidicos tiene preferiblemente un diametro de poro relativamente grande, particularmente en el intervalo de

1.500 a 4.000 angstrom. La modificaci6n de la superficie para introducir grupos de intercambio i6nico a los materiales base es muy conocida en la tecnica.

Pueden utilizarse dos tipos de eluyentes para la cromatografia de intercambio i6nico. Puede utilizarse un primer eluyente que contiene una baja concentraci6n de sal y un segundo eluyente que contiene una alta concentraci6n de

sal. El metodo de eluci6n consiste en cambiar por etapas del primer eluyente al segundo eluyente y en cambiar continuamente la composici6n del gradiente de eluci6n del primer eluyente al segundo eluyente. Pueden utilizarse los tampones y sales que se utilizan generalmente en estos eluyentes para la cromatografia de intercambio i6nico. Para el primer eluyente que contiene una baja concentraci6n de sal es particularmente preferible una disoluci6n acuosa con una concentraci6n de tamp6n de 10 a 50 mM y un valor de pH de 6 a 9. Para el segundo eluyente que contiene una alta concentraci6n de sal, es particularmente preferible una disoluci6n acuosa con 0,1 a 2M de sal de sodio anadida al eluyente C. Para las sales de sodio pueden utilizarse cloruro de sodio y sulfato de sodio.

Ademas, puede utilizarse un agente quelante de iones metalicos bivalentes tal como, por ejemplo, acido etilendiamino-tetraacetico, para inhibir la degradaci6n de los plasmidos debida a las enzimas que degradan ADN en el lisado de Escherichia coli. La concentraci6n del agente quelante para iones metalicos bivalentes es preferiblemente 0,1 a 100 mM.

Una amplia variedad de matrices de intercambio ani6nico disponibles comercialmente son adecuadas para utilizarse en la presente invenci6n, incluyendo, pero sin limitarse a, las disponibles a partir de POROS Anion Exchange Resins, Qiagen, Toso Haas, Sterogene, Spherodex, Nucleopac, y Pharmacia. Por ejemplo, la columna (Poros II PI/M, 4,5 mm x 100) se equilibra inicialmente con 20 mM Bis/TRIS Propano a pH 7,5 y 0,7 M NaCl. La muestra se carga y se lava con el mismo tamp6n inicial. Se aplica un gradiente de eluci6n de 0,5 M a 0,85 M NaCl en aproximadamente 25 volumenes de columna y se recogen las fracciones. La cromatografia de intercambio ani6nico preferida incluye Fractogel TMAE HiCap.

Segun una realizaci6n preferida del procedimiento para separar y purificar ADN plasmidico, la presente invenci6n se refiere a un metodo para separar y purificar acidos nucleicos y/o ADN plasmidico mediante cromatografia de intercambio i6nico y cromatografia de triple helice en combinaci6n para obtener eficazmente acidos nucleicos con una gran pureza y en grandes cantidades.

La cromatografia de afinidad de triple helice se describe entre otros en las patentes de EEUU 6.319.672, 6.287.762 asi como en la solicitud de patente internacional publicada en WO02/77274 del Solicitante.

La cromatografia de afinidad de triple helice se basa en la hibridaci6n especifica de oligonucle6tidos y una secuencia diana en el ADN de doble hebra. Estos oligonucle6tidos pueden contener las bases siguientes:

•

timidina (T), que puede formar tripletes con dobletes A.T de ADN bicatenario (Rajagopal et al., Biochem 28 (1989) 7859);

•

adenina (A), que puede formar tripletes con dobletes A.T de ADN bicatenario;

•

guanina (G), que puede formar tripletes con dobletes G.C de ADN bicatenario;

•

citosina protonada (C+), que puede formar tripletes con dobletes G.C de ADN bicatenario (Rajagopal et al., loc. cit.);

•

uracilo (U), que puede formar tripletes con pares de bases A.U o A.T.

Preferiblemente, el oligonucle6tido utilizado comprende una secuencia de homopirimidina rica en citosinas y la secuencia especifica presente en el ADN es una secuencia homopurina-homopirimidina. La presencia de citosinas permite tener una triple helice que es estable a pH acido en el que las citosinas estan protonadas y se desestabiliza a pH alcalino en el que las citosinas se neutralizan.

El oligonucle6tido y la secuencia especifica presente en el ADN son preferiblemente complementarias para permitir la formaci6n de una triple helice. Los mejores rendimientos y la mejor selectividad pueden obtenerse utilizando un oligonucle6tido y una secuencia especifica que son totalmente complementarios. Por ejemplo, un oligonucle6tido poli(CTT) y una secuencia especifica poli(GAA). Los oligonucle6tidos preferidos tienen una secuencia 5,-GAGGCTTCTTCTTCTT CTTCTTCTT-3, (GAGG(CTT)7 (SEQ ID NO: 1), en la que las bases GAGG no forman una triple helice pero permiten al oligonucle6tido estar separado del brazo de acoplamiento; la secuencia (CTT)7. Estos oligonucle6tidos son capaces de formar una triple helice con una secuencia especifica que contiene unidades complementarias (GAA). La secuencia en cuesti6n puede ser, en particular, una regi6n que contiene 7, 14 6 17 unidades GAA, como se describe en los ejemplos.

Otra secuencia de interes especifico es la secuencia 5,-AAGGGAGGGAGGA GAGGAA-3, (SEQ ID NO: 2). Esta secuencia forma una triple helice con los oligonucle6tidos 5,-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3, (SEQ ID NO: 3) 6 5,-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3, (SEQ ID NO: 4). En este caso, el oligonucle6tido se une en una orientaci6n antiparalela a la cadena de polipurina. Estas triples helices son estables s6lo en presencia de Mg2+ (Vasquez et al., Biochemistry, 1995, 34, 7243-7251; Beal y Dervan, Science, 1991, 251, 1360--1363).

Como se ha indicado anteriormente, la secuencia especifica puede ser una secuencia presente naturalmente en el ADN de doble hebra o una secuencia sintetica introducida artificialmente en este ultimo. Es especialmente ventajoso

utilizar un oligonucle6tido capaz de formar una triple helice con una secuencia que esta presente naturalmente en el ADN bicatenario, por ejemplo, en el origen de replicaci6n de un plasmido o en un gen marcador. A este respecto, se sabe mediante analisis de secuencia que algunas regiones de estos ADN, en particular en el origen de replicaci6n, podrian tener regiones homopurina-homopirimidina. La sintesis de oligonucle6tidos capaces de formar triples helices con estas regiones naturales homopurina-homopirimidina permite ventajosamente aplicar el metodo de la invenci6n a plasmidos sin modificar, en particular, a plasmidos comerciales del tipo pUC, pBR322, pSV, y semejantes. Entre las secuencias homopurina-homopirimidina presentes de manera natural en un ADN bicatenario, puede mencionarse una secuencia que comprende toda o parte de la secuencia 5,-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3, (SEQ ID NO: 5) presente en el origen de replicaci6n del plasmido de E. coli ColE1. En este caso, el oligonucle6tido que forma la triple helice tiene la secuencia: 5,-GAAGGGCTTCCCTCTTTCC-3, (SEQ ID NO: 6), y se une alternativamente a las dos hebras de la doble helice, como describen Beal y Dervan (J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4976-4982) y Jayasena y Johnston (Nucleic Acids Res. 1992, 20, 5279-5288). Tambien puede mencionarse la secuencia 5,-GAAAAAGGAAGAG-3, (SEQ ID NO: 7) del gen de la �-lactamasa del plasmido pBR322 (Duval-Valentin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 1992, 89, 504-508).

Las secuencias diana apropiadas que pueden formar estructuras triplex con oligonucle6tidos particulares se han identificado en origenes de replicaci6n de plasmidos CoIE1 asi como los plasmidos pCOR. Los plasmidos pCOR son plasmidos con un origen de replicaci6n condicional y se describen entre otros en EEUU 2004/142452 y EEUU 2003/161844. Los plasmidos derivados de ColE1 contienen una secuencia de homopurina de 12-mer (5,-AGAAAAAAAGGA-3,) (SEQ ID NO: 8) mapeada en posici6n 5, respecto al transcrito de ARN-II implicado en la replicaci6n del plasmido (Lacatena et al., 1981, Nature, 294, 623). Esta secuencia forma una estructura triplex estable con el oligonucle6tido complementario de 12-mer 5,-TCTTTTTTTCCT-3, (SEQ ID NO: 9). La parte central de pCOR contiene una cadena de homopurina de 14 bases no repetidas (5,-AAGAAAAAAAAGAA-3,) (SEQ ID NO: 10) localizada en el segmento rico en A+T del origen de replicaci6n y de pCOR (Levchenko et al., 1996, Nucleic Acids Res., 24, 1936). Esta secuencia forma una estructura triplex estable con el oligonucle6tido complementario de 14mer 5,-TTCTTTTTTTTCTT-3, (SEQ ID NO: 11). Los oligonucle6tidos correspondientes 5,-TCTTTTTTTCCT-3, (SEQ ID NO: 8) y 5,-TTCTTTTTTTTCTT-3, (SEQ ID NO: 11) localizan de manera eficaz y especifica sus secuencias complementarias respectivas localizadas en el origen de replicaci6n bien de ColE1 ori o pCOR (oriy). De hecho, una triada unica no-can6nica (T*GC o C*AT) puede resultar en la completa desestabilizaci6n de la estructura triplex.

La utilizaci6n de un oligonucle6tido capaz de formar una triple helice con una secuencia presente en un origen de replicaci6n o en un gen marcador es especialmente ventajosa, ya que hace posible, con el mismo oligonucle6tido, la purificaci6n de cualquier ADN que contiene dicho origen de replicaci6n o dicho gen marcador. Por lo tanto, no es necesario modificar el plasmido o el ADN bicatenario hebra con el fin de incorporar en este una secuencia artificial especifica.

Aunque se prefieren secuencias totalmente complementarias, se entiende, sin embargo, que pueden tolerarse algunos emparejamientos err6neos entre la secuencia del oligonucle6tido y la secuencia presente en el ADN, siempre que no den lugar a una gran perdida de afinidad. Puede mencionarse la secuencia 5,-AAAAAAGGGAATAAGGG-3, (SEQ ID NO: 12) presente en el gen de �-lactamasa de E. coli. En este caso, la timina que interrumpe la secuencia de polipurina puede reconocerse mediante una guanina de la tercera cadena, formando asi un triplete G*TA que es estable cundo esta flanqueado por dos tripletes T*AT (Kiessling et al., Biochemistry, 1992, 31, 2829-2834).

Segun una realizaci6n particular, los oligonucle6tidos de la invenci6n comprenden la secuencia (CCT)n, la secuencia (CT)n o la secuencia (CTT)n, en las que n es un numero entero entre 1 y 15 inclusive. Es especialmente ventajosa la utilizaci6n de secuencias del tipo (CT)n o (CTT)n. El Solicitante ha mostrado, en efecto, que la cantidad de C en el oligonucle6tido influye en el rendimiento de la purificaci6n. En particular, como se muestra en el Ejemplo 7, el rendimiento de la purificaci6n aumenta cuando el oligonucle6tido contiene menos citosinas. Se entiende que los oligonucle6tidos de la invenci6n tambien pueden combinar unidades (CCT), (CT) o (CTT).

El oligonucle6tido utilizado puede ser natural (compuesto por bases naturales sin modificar) o puede estar modificado quimicamente. En particular, el oligonucle6tido puede tener ventajosamente determinadas modificaciones quimicas que permiten incrementar su resistencia a o su protecci6n frente a nucleasas o su afinidad por la secuencia especifica. Tambien se entiende que oligonucle6tido significa cualquier sucesi6n de nucle6sidos unidos que han sufrido una modificaci6n del esqueleto con el fin de hacerlo mas resistente a nucleasas. Entre las modificaciones posibles, pueden mencionarse los fosforotioatos de oligonucle6tido, que son capaces de formar triples helices con ADN (Xodo et al., Nucleic Acids Res., 1994, 22, 3322-3330), asi como los oligonucle6tidos que tienen esqueletos de formacetal o metilfosfonato (Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc, 1991, 113, 7767-7768). Tambien es posible utilizar oligonucle6tidos sintetizados con an6meros a de nucle6tidos, que tambien forman triples helices con ADN (Le Doan et al., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 7749-7760). Otra modificaci6n del esqueleto es la uni6n fosforamidato. Por ejemplo, puede mencionarse la uni6n internucleotidica fosforamidato N3,-p5, descrita por Gryaznov y Chen, que da oligonucle6tidos que forman triples helices con ADN especialmente estables (J. Am. Chem. Soc, 1994, 116, 3143-3144). Entre otras modificaciones del esqueleto, tambien puede mencionarse la utilizaci6n de ribonucle6tidos, de 2,-O-metilribosa, fosfodiester, etc. (Sun y Helene, Curr. Opinion Struct. Biol., 116, 3143-3144). Por ultimo, el esqueleto basado en f6sforo puede reemplazarse por un esqueleto de poliamida como en

PNA (acidos nucleicos peptidicos), que tambien pueden formar triples helices (Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500; Kim et al., J. Am. Chem. Soc, 1993, 115, 6477-6481), o por un esqueleto basado en guanidina, como en DNG (guanidina desoxiribonucleica, Proc Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 6097-6101), o por analogos policati6nicos del ADN, que tambien forman triples helices.

La timina de la tercera cadena tambien puede reemplazarse por un 5-bromouracilo, que aumenta la afinidad del oligonucle6tido por el ADN (Povsic y Dervan, J. Am. Chem. Soc, 1989, 111, 3059-3061). La tercera cadena tambien puede contener bases no naturales, entre las cuales pueden mencionarse 7-deaza-2,-desoxixantosina (Milligan et al., Nucleic Acids Res., 1993, 21, 327-333), 1-(2-desoxi--D-ribofuranosil)-3-metil-5-amino-1H-pirazolo[4,3d]pirimidin-7-ona (Koh y Dervan, J. Am. Chem. Soc, 1992, 114, 1470-1478), 8-oxoadenina, 2-aminopurina, 2,-O-metilseudoisocitidina, o cualquier otra modificaci6n conocida por el experto en la tecnica (para una revisi6n vease Sun y Helene, Curr. Opinion Struct. Biol., 1993, 3, 345-356).

Otro tipo de modificaci6n del oligonucle6tido tiene la finalidad, mas especialmente, de mejorar la interacci6n y/o afinidad entre el oligonucle6tido y la secuencia especifica. En particular, una modificaci6n mas ventajosa segun la invenci6n consiste en metilar las citosinas del oligonucle6tido. El oligonucle6tido asi metilado presenta la propiedad destacada de formar una triple helice estable con la secuencia especifica en intervalos de pH cercanos a la neutralidad (;5). Por lo tanto, esto hace posible trabajar a valores de pH mayores que los oligonucle6tidos de las tecnicas anteriores, es decir, a valores de pH en los que son mucho menores los riesgos de degradaci6n del ADN plasmidico.

La longitud del oligonucle6tido utilizado en el metodo de la invenci6n es entre 5 y 30. Se utiliza ventajosamente un oligonucle6tido con una longitud mayor de 10 bases. La longitud puede adaptarse por un experto en la tecnica para cada caso individual para obtener la selectividad y estabilidad deseadas de la interacci6n.

Los oligonucle6tidos segun la invenci6n pueden sintetizarse mediante cualquier tecnica conocida. En particular, pueden prepararse mediante sintetizadores de acidos nucleicos. Obviamente puede utilizarse cualquier otro metodo conocido por el experto en la tecnica.

Con el fin de permitir su acoplamiento covalente al soporte, generalmente el oligonucle6tido se funcionaliza. Asi, puede modificarse mediante un tiol, amina o grupo carboxilo terminal en la posici6n 5, 6 3,. En particular, la adici6n de un tiol, amina o grupo carboxilo permite, por ejemplo, acoplar el oligonucle6tido a un soporte que tiene funciones disulfuro, maleimida, amina, carboxilo, ester, ep6xido, bromuro de cian6geno o aldehido. Estos acoplamientos se forman mediante la formaci6n de uniones disulfuro, tioeter, ester, amida o amina entre el oligonucle6tido y el soporte. Puede utilizarse cualquier otro metodo conocido por el experto en la tecnica, tal como reactivos de acoplamiento bifuncionales, por ejemplo.

Mas aun, para mejorar la hibridaci6n con el oligonucle6tido acoplado, puede ser ventajoso que el oligonucle6tido contenga una secuencia de bases "brazo" y "espaciador". La utilizaci6n de un brazo permite, de hecho, unir el oligonucle6tido a una distancia elegida del soporte, permitiendo mejorar sus condiciones de interacci6n con el ADN. El brazo consiste ventajosamente en una cadena carbonada lineal que comprende 1 a 18 y preferiblemente 6 6 12 grupos (CH2), y una amina que permite la uni6n a la columna. El brazo esta unido a un fosfato del oligonucle6tido o de un "espaciador" compuesto por bases que no interfieren con la hibridaci6n. Asi, el "espaciador" puede comprender bases de purina. Como ejemplo, el "espaciador" puede comprender la secuencia GAGG. El brazo esta compuesto ventajosamente por una cadena carbonada lineal que comprende 6 6 12 atomos de carbono.

La cromatografia de afinidad de triplex es muy eficaz para eliminar ARN y ADN gen6mico. Estos pueden ser soportes cromatograficos funcionalizados, en gran cantidad o preempaquetados en una columna, superficies plasticas funcionalizadas o lechos de latex, magneticos funcionalizados u otros. Preferiblemente se utilizan soportes cromatograficos. Como ejemplo, los soportes cromatograficos que pueden utilizarse son agarosa, acrilamida o dextrano asi como sus derivados (tales como Sefadex, Sefarosa, Superosa, etc.), polimeros tales como poli(estireno/divinilbenceno), o silice injertada o no injertada, por ejemplo. Las columnas de cromatografia pueden operar en el modo de difusi6n o perfusi6n.

Para obtener mejores rendimientos en la purificaci6n, es especialmente ventajoso utilizar, en el plasmido, una secuencia que contiene varias posiciones de hibridaci6n con el oligonucle6tido. La presencia de varias posiciones de hibridaci6n promueve, en efecto, las interacciones entre dicha secuencia y el oligonucle6tido, que dan lugar a una mejora en los rendimientos de la purificaci6n. Por lo tanto, para un oligonucle6tido que contiene n repeticiones de restos (CCT), (CT) o (CTT), es preferible utilizar una secuencia de ADN que contiene al menos n restos complementarios y preferiblemente n+1 restos complementarios. Una secuencia que tiene n+1 restos complementarios proporciona dos posiciones de hibridaci6n con el oligonucle6tido. Ventajosamente, la secuencia de ADN contiene hasta 11 posiciones de hibridaci6n, es decir, n+10 motivos complementarios.

El metodo segun la presente invenci6n puede utilizarse para purificar cualquier tipo de ADN de doble hebra. Un ejemplo de este ultimo es ADN circular, tal como un plasmido, que generalmente tiene uno o mas genes con importancia terapeutica. Este plasmido tambien puede llevar un origen de replicaci6n, un gen marcador y semejantes. El metodo de la invenci6n puede aplicarse directamente a un lisado celular. En esta realizaci6n, el

plasmido, amplificado por transformaci6n seguida de cultivo celular, se purifica directamente despues de la lisis de las celulas. El metodo de la invenci6n tambien puede aplicarse a un lisado aclarado, es decir al sobrenadante obtenido despues de la neutralizaci6n y centrifugaci6n del lisado celular. Obviamente tambien puede aplicarse a una disoluci6n prepurificada mediante metodos conocidos. Este metodo tambien permite purificar ADN lineal o circular que tiene una secuencia importante a partir de una mezcla que comprende ADN de diferentes secuencias. El metodo segun la invenci6n tambien puede utilizarse para purificar ADN de doble hebra.

El lisado celular puede ser un lisado de celulas procariotas o eucariotas.

Respecto a las celulas procariotas, pueden mencionarse como ejemplos las bacterias E. coli, B. subtilis, S. typhimurium o Streptomyces. Respecto a las celulas eucariotas pueden mencionarse las celulas animales, de levaduras, fungicas y semejantes y mas especificamente las levaduras Kluyveromyces o Saccharomyces o las celulas COS, CHO, C127, NIH3T3, y semejantes.

El metodo de la presente invenci6n que incluye al menos una etapa de cromatografia de afinidad de triplex puede utilizarse para proporcionar una mayor pureza al producto ADNp resultante. En la cromatografia de afinidad de triplex, se une un oligonucle6tido a un soporte, tal como una resina de cromatografia u otra matriz. La muestra que se esta purificando se mezcla con el oligonucle6tido unido, por ejemplo aplicando la muestra a una columna de cromatografia que contiene el oligonucle6tido unido a una resina de cromatografia. El plasmido deseado en la muestra se unira al oligonucle6tido formando un triplex. Los enlaces entre el oligonucle6tido y el plasmido pueden ser enlaces Hoogsteen. Esta etapa puede producirse a un pH :5, a una concentraci6n alta de sal durante un tiempo de contacto de 20 minutos o mas. Puede utilizarse una etapa de lavado. Finalmente, la desprotonaci6n de citosina se produce en un tamp6n neutro, eluyendo el plasmido de la resina a la que esta unida el oligonucle6tido.

Segun la realizaci6n mas preferida, el procedimiento de separaci6n y purificaci6n de los acidos nucleicos y/o de los ADN plasmidicos comprende las etapas de cromatografia de intercambio i6nico, cromatografia de afinidad de triple helice y cromatografia de interacci6n hidrof6bica en combinaci6n.

La cromatografia de interacci6n hidrof6bica utiliza restos hidrof6bicos en un sustrato para atraer regiones hidrof6bicas de las moleculas en la muestra para purificaci6n. Debe indicarse que estos soportes de HIC funcionan mediante un efecto de "agrupamiento"; se forman o se comparten enlaces no covalentes o i6nicos cuando estas moleculas se asocian. La cromatografia de interacci6n hidrof6bica es beneficiosa ya que elimina muy eficazmente formas circulares abiertas de plasmidos y otros contaminantes, tales como ADNg, ARN y endotoxinas.

La sintesis de los materiales base para la cromatografia de interacci6n hidrof6bica, asi como los procesos para preparar, polimerizar y funcionalizar la cromatografia de interacci6n hidrof6bica y eluir y separar ADN plasmidico mediante esta son muy conocidos en la tecnica y se describen entre otros en la patente de EEUU No: 6.441.160 que se incorpora en la presente memoria por referencia.

El compuesto que se va a utilizar para la sintesis de los materiales base que se utilizan para el material de empaquetamiento de la cromatografia de interacci6n hidrof6bica puede ser cualquier compuesto, si pueden introducirse varios grupos funcionales que presentan hidrofobicidad o varios grupos de intercambio i6nico mediante una reacci6n posterior a la sintesis de los materiales base. Los ejemplos de mon6meros monofuncionales incluyen estireno, o-halometilestireno, m-halometilestireno, p-halometilestireno, o-haloalquilestireno, m-haloalquilestireno, phaloalquilestireno, a-metilestireno, a-metil-o-halometilestireno, a-metil-m-halometilestireno, a-metil-phalometilestireno, a-metil-o-haloalquilestireno, a-metil-m-haloalquilestireno, a-metil-p-haloalquilestireno, ohidroximetilestireno, m-hidroximetilestireno, p-hidroximetilestireno, o-hidroxialquilestireno, m-hidroxialquilestireno, phidroxialquilestireno, , a-metil-o-hidroximetilestireno, a-metil-m-hidroximetilestireno, a-metil-p-hidroximetilestireno, ametil-o-hidroxialquilestireno, a-metil-m-hidroxialquilestireno, a-metil-p-hidroxialquilestireno, glicidil metacrilato, glicidil acrilato, hidroxietil acrilato, hidroximetacrilato, y acetato de vinilo. Los compuestos mas preferidos son grupos haloalquilo sustituidos en el anillo aromatico, hal6genos tales como Cl, Br, I y F e hidrocarburos saturados de cadena lineal y/o ramificada con 2 a 15 atomos de carbono.

Los ejemplos de mon6meros polifuncionales incluyen divinilbenceno, trivinilbenceno, diviniltolueno, triviniltolueno, divinilnaftaleno, trivinilnaftaleno, etilen glicol dimetacrilato, etilen glicol diacrilato, dietilen glicol dimetacrilato, dietilen glicol diacrilato, metilenbismetacrilamida, y metilenbisacrilamida.

Pueden introducirse varios grupos hidrof6bicos funcionales o varios grupos de intercambio i6nico mediante la reacci6n posterior. Con el fin de minimizar la influencia en los productos deseados que se desea separar debida a la hidrofobicidad que presenta el material base en si mismo, o al aumento o disminuci6n del volumen del material base por si mismo debido al cambio en la concentraci6n de sal y al cambio del valor del pH, el material base se prepara preferiblemente utilizando mon6meros relativamente hidrofilicos, tales como glicidil metacrilato, glicidil acrilato, hidroxietil acrilato, hidroximetacrilato y acetato de vinilo. La preparaci6n del material base incluye una primera etapa en la que se pesan el mon6mero monofuncional y el mon6mero polifuncional en una proporci6n apropiada y se anaden el diluyente o disolvente pesados de manera precisa que se utilizan para el fin de ajustar los poros de las particulas formadas y el iniciador de la polimerizaci6n pesado similarmente de manera precisa, seguido de una buena agitaci6n. La mezcla se somete entonces a una suspensi6n de polimerizaci6n de tipo aceite-en-agua en la

que se anade la mezcla en una disoluci6n acuosa de suspensi6n disuelta del estabilizador pesada de manera precisa con anterioridad y se forman gotitas de aceite del tamano deseado mezclando con agitaci6n y la polimerizaci6n se realiza calentando gradualmente la disoluci6n de la mezcla.

La proporci6n del mon6mero monofuncional respecto al mon6mero polifuncional es generalmente aproximadamente 1 mol de mon6mero monofuncional y aproximadamente 0,01 a 0,2 moles del mon6mero polifuncional para obtener particulas blandas del material base. La proporci6n del mon6mero polifuncional puede incrementarse hasta aproximadamente 0,2 a 0,5 moles para obtener particulas duras de materiales base. El mon6mero polifuncional puede utilizarse solo para obtener particulas todavia mas duras.

Un iniciador de la polimerizaci6n no esta restringido particularmente y se utilizan de tipo azobis y/o de tipo per6xido utilizados comunmente.

Tambien pueden utilizarse estabilizadores de la suspensi6n tales como tensioactivos i6nicos, tensioactivos no i6nicos y polimeros con propiedades anfipaticas o mezclas de estos para prevenir la agregaci6n de las gotitas de aceite entre si.

El diametro de las particulas formadas es generalmente de aproximadamente 2 a 500 Im. El diametro preferido de las particulas esta comprendido entre 2 y 30 Im, y mas preferiblemente aproximadamente 2 a 10 Im. Cuando se pretende la purificaci6n a gran escala de acidos nucleicos con gran pureza, es aproximadamente 10 a 100 Im y cuando se separa el producto deseado de la disoluci6n madre cruda puede ser 100 a 500 Im, mas preferiblemente aproximadamente 200 a 400 Im. Para ajustar el diametro de las particulas, puede ajustarse la velocidad rotacional del agitador durante la polimerizaci6n. Cuando se necesitan particulas con un diametro pequeno, puede incrementarse el numero de revoluciones y, cuando se desean particulas grandes, puede disminuirse el numero de revoluciones. Por lo tanto, como el diluyente que se va a utilizar se utiliza para ajustar los poros de las particulas formadas, la selecci6n del diluyente es particularmente importante. Como concepto fundamental, para el disolvente que se va a utilizar para la polimerizaci6n, el ajuste se realiza combinando de manera variada un disolvente que es un mal disolvente para el mon6mero con un disolvente que es un buen disolvente para el mon6mero. El tamano del diametro del poro puede seleccionarse apropiadamente dependiendo del tamano molecular de los acidos nucleicos que se van a separar, aunque se prefiere que este en un intervalo de 500 a 4.000 angstrom para el material de empaquetamiento para la cromatografia de interacci6n hidrof6bica y en un intervalo de 1.500 a 4.000 angstrom para el material de empaquetamiento para la cromatografia de intercambio i6nico.

En la cromatografia de interacci6n hidrof6bica, para separar acidos nucleicos con diferente hidrofobicidad preferible utilizando materiales de empaquetamiento con diferente hidrofobicidad, respectivamente, es importante la modificaci6n de la superficie del material base.

Los grupos hidrof6bicos pueden seleccionarse entre los de cadena larga o ramificada incluyendo grupos hidrocarbonados saturados o grupos hidrocarbonados insaturados con 2 a 20 atomos de carbono. El anillo aromatico tambien puede estar contenido en el grupo hidrocarbonado.

Los grupos hidrof6bicos tambien pueden seleccionarse entre compuestos que tienen la f6rmula siguiente:

en la que n=0 a aproximadamente 20 y el grupo metileno puede tener cadena lineal o ramificada, m=0 a aproximadamente 3 y el grupo hidrocarbonado puede tener cadena lineal o ramificada, y A es un grupo C=O o un grupo eter, aunque el grupo metileno puede estar unido directamente al material base sin A.

Los grupos hidrof6bicos pueden incluir ademas un grupo eter de alquilenglicol con 2 a 20 atomos de carbono que consiste en unidades repetidas de 0 a 1 0, en el que el extremo opuesto del grupo funcional que reacciona con el material base puede ser un grupo OH tal cual o puede estar cubierto con un grupo alquilo con 1 a 4 atomos de carbono.

Los grupos hidrof6bicos descritos anteriormente pueden utilizarse solos o en mezcla para modificar la superficie.

Se prefieren las cadenas de los grupos alquilo con 6 a 20 atomos de carbono para una baja hidrofobicidad como los plasmidos. Cadenas largas de grupos alquilo que tienen 2 a 15 atomos de carbono para separar compuestos con una alta hidrofobicidad tales como ARN procedente de Escherichia coli y ARN en las celulas de seres humanos y animales. Grupos alquilo de 4 a 18 atomos de carbono para separar compuestos con una hidrofobicidad relativamente baja tales como ADN procedentes de Escherichia coli y ADN en las celulas de seres humanos y animales.

Despues de separar estos compuestos, los compuestos pueden seleccionarse apropiadamente para modificar la superficie sin estar confinados a dicha ejemplificaci6n. En efecto, el grado de hidrofobicidad del material de empaquetamiento varia dependiendo de la concentraci6n de sal en el medio o de la concentraci6n de sal en el

eluyente para la adsorci6n. Ademas, el grado de hidrofobicidad del material de empaquetamiento difiere dependiendo de la cantidad del grupo introducida en el material base.

El diametro del poro del material base para la cromatografia de interacci6n hidrof6bica es particularmente preferible que sea de 500 a 4.000 angstrom, pero puede seleccionarse apropiadamente de dicho intervalo dependiendo del tamano molecular de los acidos nucleicos que se desea separar. En general, debido a que la retenci6n de los acidos nucleicos en el material de empaquetamiento y la capacidad de adsorci6n (definido por la muestra) difieren dependiendo del diametro del poro, es preferible utilizar un material base con un diametro de poro grande para acidos nucleicos con un tamano molecular grande y un material base con un diametro de poro pequeno para acidos nucleicos con un tamano molecular pequeno.

Por ejemplo, puede hacerse reaccionar material base de estireno con grupo hidrof6bico que comprende grupos alquilo de cadena larga, utilizando un compuesto que contiene hal6genos y/o haluro de carbonilo y un catalizador tal como FeCl3, SnCl2 o AlCl3, y utilizando una reacci6n de Friedel-Craft, es posible anadirlo directamente al anillo aromatico en el material base como un compuesto deshalogenado y/o compuesto acilado. En el caso de que el material base sean particulas que contienen un grupo hal6geno, por ejemplo, utilizando compuestos con OH contenido en el grupo funcional que se va a anadir, como butanol, y utilizando la reacci6n de Williamson con un catalizador alcalino tal como NaOH o KOH, es posible introducir el grupo funcional mediante un enlace eter. En el caso de que el grupo funcional deseado que se va a anadir sea un compuesto que contiene un grupo amino, como hexilamina, es posible la adici6n utilizando un catalizador alcalino tal como NaOH o KOH y utilizando una reacci6n acida deshalogenica. En el caso de que el material base contenga un grupo OH, por el contrario, si se introduce un grupo epoxi, grupo hal6geno o grupo haluro de carbonilo previamente en el grupo funcional que se desea anadir, es posible introducir el grupo funcional mediante un enlace eter o ester. En el caso en el que el material base contenga un grupo epoxi, si reacciona con un compuesto con un grupo OH o grupo amino contenido en el grupo funcional que se desea anadir, es posible introducir el grupo funcional mediante un enlace eter o amino. Mas aun, en el caso en el que el grupo funcional que se desea anadir contenga un grupo hal6geno, es posible anadir el grupo funcional mediante un enlace eter utilizando un catalizador acido. Debido a que la proporci6n del grupo funcional que se va a introducir en el material base esta influida por la hidrofobicidad del producto que se quiere separar, no puede restringirse, pero, en general, es adecuado el material de empaquetamiento con aproximadamente 0,05 a 4,0 mmoles de grupo funcional anadido por 1 g de material base seco.

Respecto a la modificaci6n de la superficie, un metodo para anadir el grupo funcional mediante una reacci6n posterior a la formaci6n del material base o las particulas es como se describe. La modificaci6n de la superficie se realiza segun el mismo metodo, en el que el material base se forma despues de la polimerizaci6n utilizando mon6meros anadiendose dichos grupos funcionales antes de la polimerizaci6n.

El material base tambien puede ser gel de silice poroso. Un metodo para fabricar gel de silice, comprende acoplamiento con silano utilizando un compuesto tal como alquiltrimetoxisilano directamente en las particulas fabricadas segun el metodo descrito en "Latest High-Speed Liquid Chromatography", pagina 289 y siguientes. (escrito por Toshio Nambara y Nobuo Ikegawa, publicado por Tokyo Hirokawa Bookstore en 1988). Antes o despues del acoplamiento del silano utilizando un agente de acoplamiento de silano que contiene un grupo epoxi, puede anadirse un grupo funcional segun el metodo mencionado anteriormente. Es adecuada una proporci6n del grupo funcional que se introduce de aproximadamente 0,05 a 4,0 mmoles de grupo funcional anadido por 1 g de material base seco.

Se utilizan eluyentes en la etapa de separaci6n o purificaci6n de la cromatografia de interacci6n hidrof6bica. Generalmente, se utilizan dos tipos de eluyentes. Un eluyente contiene una alta concentraci6n de sal, mientras que el segundo eluyente contiene una baja concentraci6n de sal. El metodo de eluci6n comprende cambiar por etapas de un eluyente que tiene una alta concentraci6n de sal a un eluyente que tiene una baja concentraci6n de sal y puede utilizarse el metodo de gradiente de eluci6n que cambia continuamente la composici6n de un eluyente al otro. Pueden utilizarse los tampones y sales generalmente utilizados en la cromatografia de interacci6n hidrof6bica. Para el eluyente que contiene una alta concentraci6n de sal, es particularmente preferible una disoluci6n acuosa con una concentraci6n de sal de 1,0 a 4,5M y un valor de pH de 6 a 8. Para el eluyente que contiene una baja concentraci6n de sal, es particularmente preferible una disoluci6n acuosa con una concentraci6n de sal de 0,01 a 0,5M y un valor de pH de 6 a 8. Generalmente, pueden utilizarse como sales el sulfato de amonio y el sulfato de sodio.

La etapa de purificaci6n del ADN plasmidico con cromatografia de interacci6n hidrof6bica puede realizarse combinando un material de empaquetamiento en el que se ha introducido el grupo funcional con una baja hidrofobicidad con un material de empaquetamiento en el que se ha introducido el grupo funcional con alta hidrofobicidad. En efecto, el medio de Escherichia coli cultivada contiene en gran cantidad varios componentes diferentes en hidrofobicidad tales como polisacaridos, ADN gen6mico, ARN, plasmido y proteinas de Escherichia coli. Tambien se sabe que existen diferencias en hidrofobicidad incluso entre los acidos nucleicos. Las proteinas que son consideradas impurezas tienen una mayor hidrofobicidad que los plasmidos.

Muchas resinas de cromatografia de interacci6n hidrof6bica estan disponibles comercialmente, tales como Fractogel propil, Toyopearl, Source isopropil, y cualquier otra resina que tiene grupos hidrof6bicos. Las resinas mas preferidas son medio polimerico Toyopearl. Toyopearl es un polimero metacrilico que incorpora una alta estabilidad mecanica y

quimica. Las resinas estan disponibles como serie de resinas no funcionalizadas "HW" y pueden derivatizarse con quimicas de superficie para cromatografia de intercambio i6nico o interacciones hidrof6bicas. Pueden utilizarse cuatro tipos de resinas Toyopearl HIC que presentan diferente quimica de superficie y niveles de hidrofobicidad. La hidrofobicidad de las resinas Toyopearl HIC se incrementa en las series: Eter, Fenil, Butil y Hexil. Las estructuras de las resinas Toyopearl HIC preferidas, es decir, Toyopearl HW-65 con un diametro de poro de 1.000 angstrom se muestran a continuaci6n:

Toyopearl Ether-650

Toyopearl Phenyl-650

Toyopearl Butyl-650

Toyopearl Hexyl-650

Las resinas Toyopearl descritas anteriormente pueden tener varios grados de tamano de particula. Toyopearl 650C tiene un tamano de particula de aproximadamente 50 a 150 Im, preferiblemente aproximadamente 100Im, mientras que Toyopearl 650M tiene un tamano de particula de aproximadamente 40 a 90Im, preferiblemente aproximadamente 65Im y Toyopearl 650S tiene un tamano de particula de aproximadamente 20 a 50 Im, preferiblemente aproximadamente 35Im. Es muy conocido que el tamano de las particulas influye en la resoluci6n, es decir, la resoluci6n mejora con un grado de tamano de particula de C a M a S, y por lo tanto se incrementa con tamanos de particula mas pequenos. La resina Toyopearl mas preferida utilizada en la etapa de cromatografia HIC en el proceso de separaci6n y purificaci6n del ADN plasmidico segun la presente invenci6n es Toyopearl butil-650S que esta comercializada por Tosoh Bioscience.

Segun una realizaci6n preferida, se realiza una etapa adicional de diafiltraci6n. Los materiales de diafiltraci6n estandar disponibles comercialmente son adecuados para utilizarse en este proceso, segun las tecnicas estandar conocidas en la tecnica. Un metodo de diafiltraci6n preferido es diafiltraci6n utilizando una membrana de ultrafiltraci6n con un punto de corte de peso molecular en el intervalo de 30.000 a 500.000, dependiendo del tamano del plasmido. Esta etapa de diafiltraci6n permite el intercambio de tamp6n y se realiza una concentraci6n. El eluato de la etapa 12 se concentra 3 a 4 veces mediante filtraci6n en flujo tangencial (punto de corte de la membrana, 30 kDa) hasta una concentraci6n diana de aproximadamente 2,5 a 3,0 mg/mL y se intercambia el tamp6n del concentrado por diafiltraci6n a un volumen constante con 10 volumenes de disoluci6n salina y se ajusta a la concentraci6n de plasmido diana con disoluci6n salina. La concentraci6n de NV1FGF se calcula a partir de la absorbancia a 260 nm de muestras del concentrado. La disoluci6n de NV1FGF se filtra a traves de un filtro de capsula de 0,2 Im y se divide en varias alicuotas, que se almacenan en recipientes en una habitaci6n fria a 2-8°C hasta el procesamiento adicional. Esto rinde un concentrado purificado con una concentraci6n de ADN plasmidico de plasmido superenrollado de aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, y preferiblemente 99%. La recuperaci6n global de plasmido con este proceso es al menos 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, y 80%, con una recuperaci6n media del 60 %.

Segun esta realizaci6n, la etapa de diafiltraci6n se realiza segun las condiciones siguientes: se utilizan tamp6n para la etapa a) y para la etapa b):

i) una primera diafiltraci6n (etapa a) frente a 12,5 a 13,0 volumenes de 50 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7,4 (denominado tamp6n I), y

ii) Realizar una segunda diafiltraci6n del retenido de la etapa a) anterior (etapa b) frente a 3,0 a 3,5 volumenes de excipiente salino (150 mM NaCl). Esta etapa de diafiltraci6n preferida segun la presente invenci6n elimina de manera eficaz y extensa el sulfato de amonio y el EDTA. Tambien, posteriormente a estas etapas de diafiltraci6n, se obtiene una concentraci6n fisiol6gica apropiada de NaCl (aproximadamente 150mM) y una concentraci6n final de Tris por debajo de 1 mM (entre 200 IM y 1 mM).

La formulaci6n de ADN plasmidico obtenida de esta manera utilizando esta etapa de diafiltraci6n comprende NaCl como excipiente salino y una concentraci6n apropiada de tamp6n Tris con el fin de mantener o controlar el valor de pH entre 7 y 7,5. Las formulaciones de ADN plasmidico segun la presente solicitud son particularmente utiles ya que su ADN plasmidico puede almacenarse de manera sorprendente en una forma estable no degradable en estas condiciones durante un periodo de tiempo prolongado a 5°C y hasta 25°C, es decir, a temperatura ambiente.

Como se ha descrito, segun el metodo inventivo de separaci6n se puede obtener ADN plasmidico con gran pureza en gran cantidad mediante una manipulaci6n mas sencilla que la del metodo convencional.

El proceso para purificar plasmidos puede utilizarse posteriormente al metodo de lisis continua como se ha descrito anteriormente, o a cualquier metodo alternativo de lisis muy conocido en la tecnica. Por ejemplo, puede utilizarse lisis por calor con flujo directo de las celulas microbianas que contienen el plasmido. Este proceso se describe entre otros en la publicaci6n Internacional WO 96/02658. El intercambiador de calor particular consisti6 en un tubo de acero inoxidable de 305 cm x 0,64 cm O.D. con forma de serpentin. El serpentin esta completamente sumergido en un bano de agua con una temperatura alta constante. El volumen de retenci6n del serpentin es aproximadamente 50 mL. Se utilizaron termopares y un term6metro para determinar las temperaturas de entrada y de salida y la temperatura del bano de agua, respectivamente. La corriente del producto se bombea en el serpentin de calefacci6n utilizando una bomba peristaltica Masterflex con tubos de silicona. El lisado celular sali6 del serpentin y se centrifug6 en una centrifuga discontinua Beckman J-21 para aclararlo. Despues de la centrifugaci6n, el ADN plasmidico puede purificarse utilizando el metodo de purificaci6n segun la presente invenci6n.

Alternativamente, para la lisis celular se pueden utilizar mezcladores estaticos en serie. En efecto, como se describe en WO97/23601 (incorporado en la presente memoria por referencia), puede utilizarse un primer mezclador estatico para lisar las celulas a traves de un primer mezclador estatico y para precipitar el lisado celular un segundo mezclador estatico como un metodo alternativo para lisar las celulas antes del metodo para purificar el ADN plasmidico segun la presente invenci6n. Se puede lisar en linea un gran volumen de celulas cuidadosamente y de manera continua utilizando el mezclador estatico y los otros mezcladores estaticos se ponen en linea para conseguir otras funciones tales como diluci6n y precipitaci6n. Los mezcladores estaticos adecuados utiles en el metodo de la presente invenci6n incluyen cualquier dispositivo de flujo directo referido en la tecnica como un mezclador estatico o sin movimiento con una longitud suficiente como para permitir los procesos de la presente invenci6n. Por ejemplo, para el fin de lisar las celulas, el mezclador estatico tendra que tener una longitud que proporcione un tiempo de contacto suficiente entre la disoluci6n de lisis y las celulas para producir la lisis de las celulas en cuesti6n durante su paso a traves del mezclador. En una realizaci6n preferida, los mezcladores estaticos adecuados contienen una estructura helicoidal interna que hace que los dos liquidos entren en contacto entre si en un flujo rotacional opuesto haciendo que los liquidos se mezclen entre si en un flujo turbulento.

El metodo para separar y purificar ADN plasmidico segun la presente invenci6n puede utilizarse para separar y purificar cualquier tipo de vector de cualquier tamano. El intervalo del tamano del ADN plasmidico que puede separarse mediante el metodo segun la presente invenci6n es de aproximadamente 5 kb a aproximadamente 50 kb, preferiblemente 15 kb a 50 kb, ADN que incluye un nucleo de vector de aproximadamente 3 kb, un gen terapeutico y secuencias reguladoras asociadas. Asi, un nucleo de vector util en la invenci6n sera capaz de llevar insertos de aproximadamente 10-50 kb o mayores. El inserto puede incluir ADN de cualquier organismo, pero preferiblemente sera de origen mamifero y puede incluir, ademas de un gen que codifica una proteina terapeutica, secuencias reguladoras tales como promotores, secuencias de poli adenilaci6n, amplificadores, regiones de control de locus, etc. El gen que codifica una proteina terapeutica puede tener un origen gen6mico y por lo tanto contener exones e intrones como se refleja en su organizaci6n gen6mica o puede proceder de ADN complementario. Dichos vectores pueden incluir, por ejemplo, un nucleo de vector replicable con una replicaci6n de alto numero de copias, que tiene un policonector para la inserci6n de un gen terapeutico, un gen que codifica un marcador que se puede seleccionar, por ejemplo SupPhe ARNt, el gen de resistencia a la tetraciclina y es fisicamente pequeno y estable. El nucleo de vector del plasmido permite ventajosamente insertos de fragmentos de ADN de mamiferos, otros eucariotas, procariota o viral y el plasmido resultante puede purificarse y utilizarse en terapia basada en plasmidos in vivo o ex vivo. Los vectores con un numero de copias relativamente alto, es decir, en el intervalo de 20-40 copias/celula hasta 1.000-2.000 copias/celula pueden separarse y purificarse mediante el metodo segun la presente invenci6n. Por ejemplo, se prefiere un vector que incluye el origen de replicaci6n de pUC segun el metodo de la invenci6n. El origen de replicaci6n de pUC permite una replicaci6n mas eficaz del ADN plasmidico y resulta en un incremento de diez veces del numero de copias de plasmido/celula respecto, por ejemplo, a un origen de pBR322. Preferiblemente, puede separarse ADN plasmidico con un origen de replicaci6n condicional o pCOR como se describe en EEUU 2003/1618445, mediante el proceso segun la presente invenci6n. El numero de copias alto resultante incrementa en gran medida la proporci6n de ADN plasmidico respecto a ADN cromos6mico, ARN, proteinas celulares y co-factores, mejora la producci6n del plasmido y facilita la purificaci6n aguas abajo. De acuerdo con esto, puede

utilizarse cualquier vector (ADN plasmidico) segun la invenci6n. Los vectores representativos incluyen pero no estan limitados a plasmido NV1FGF. NV1FGF, un plasmido que codifica un Factor de Crecimiento de Fibroblastos acido o Factor de Crecimiento de Fibroblastos tipo 1 (FGF-1), util para tratar pacientes con enfermedad oclusiva arterial periferica terminal (PAOD) o con enfermedad arterial periferica (PAD), cumple los requisitos de seguridad. Camerota et al. (J Vasc. Surg., 2002, 35, 5:930-936) describe que a 51 pacientes con PAD terminal no reconstruible, con dolor en reposo o necrosis tisular, se les inyect6 intramuscularmente dosis crecientes unicas o repetidas de NV1FGF en muslo o pantorrila isquemicos. Se evaluaron posteriormente varios parametros tales como presi6n de oxigeno transcutaneo, indices braquiales en tobillos y dedos de los pies, evaluaci6n del dolor y cicatrizaci6n de ulceras. Se observ6 un incremento significativo de los indices braquiales, reducci6n del dolor, resoluci6n del tamano de las ulceras y una perfusi6n mejorada despues de la administraci6n de NV1FGF.

Las celulas anfitrionas utiles segun la invenci6n pueden ser cualquier cepa bacteriana, es decir, tanto cepas Gram positivas como Gram negativas, tales como E. coli y Salmonella Typhimurium o Bacillus que es capaz de mantener un numero de copias alto de los plasmidos descritos anteriormente; por ejemplo 20-200 copias. Pueden utilizarse cepas anfitrionas de E. coli segun la invenci6n e incluyen HB101, DH1, y DH5aF, XAC-1 y XAC-1pir 116, TEX2, y TEX2pir42 (WO04/033664). Las cepas que contienen el plasmido F o derivados del plasmido F (por ejemplo, JM 109) no se prefieren generalmente debido a que el plasmido F puede co-purificarse con el producto plasmidico terapeutico.

Segun otro aspecto, la presente invenci6n tambien se refiere a una composici6n que comprende ADN plasmidico altamente purificado que esencialmente no contiene contaminantes o contaminantes en el intervalo de sub-ppm y que, por lo tanto, es ADN de grado farmaceutico. La composici6n de ADN plasmidico de grado farmaceutico segun la presente invenci6n contiene, por lo tanto, sub-ppm (< 0,0001%, es decir < 0,0001 mg por 100 mg de ADN plasmidico) de ADNg, ARN, y proteinas contaminantes

La composici6n de ADN plasmidico de grado farmaceutico contiene, por lo tanto, menos de aproximadamente 0,01%, o menos de 0,001%, y preferiblemente menos de 0,0001%, o preferiblemente menos de 0,00008% (< 0,0008%, es decir, < 0,0008 mg por 100 mg de ADN plasmidico) de ADN cromos6mico o ADN gen6mico.

La composici6n de ADN plasmidico de grado farmaceutico contiene, por lo tanto, menos de aproximadamente 0,01%, o menos de 0,001%, y preferiblemente menos de 0,0001%, o preferiblemente menos de 0,00002% (< 0,0002%, es decir, < 0,0002 mg por 100 mg de ADN plasmidico) de ARN contaminantes.

La composici6n de ADN plasmidico de grado farmaceutico contiene, por lo tanto, menos de aproximadamente 0,0001%, y lo mas preferiblemente menos de 0,00005% de proteinas contaminantes.

La composici6n de ADN plasmidico de grado farmaceutico contiene, por lo tanto, menos de 0,1 EU/mg de endotoxinas.

La composici6n de ADN plasmidico de grado farmaceutico contiene por lo tanto de forma predominante la forma circular y mas precisamente contiene mas de 80%, 85%, 90%, 95%, 6 99% de la forma circular cerrada del ADN plasmidico.

La presente invenci6n tambien se refiere a formulaciones liquidas de ADN plasmidico que son estables y permanecen sin degradarse a temperatura ambiente durante largos periodos de tiempo, y son, por lo tanto, utiles para el almacenamiento de ADN plasmidicos que son utilizados en investigaci6n y en terapia humana relacionada.

La presente invenci6n se refiere, por lo tanto, a una formulaci6n estable de ADN plasmidico que comprende ADN plasmidico, una disoluci6n de tamp6n muy diluida, y un excipiente salino, en la que la disoluci6n de tamp6n esta presente a una concentraci6n para mantener el pH de dicha formulaci6n o composici6n entre 7 y 7,5.

Las disoluciones tamp6n que son capaces de mantener el pH de la composici6n entre 7 y 7,5 consisten en un sistema acido/base que comprende Tris [tris(hidroximetil)-aminometano], o lisina y un acido elegido entre un acido fuerte (acido clorhidrico, por ejemplo) y un acido debil (acido maleico, acido malico o acido acetico, por ejemplo), o un sistema acido/base que comprende Hepes acido [2-(4-(2-hidroxietilpiperacin)-1-il)etanosulf6nico] y una base fuerte (hidr6xido s6dico, por ejemplo). La disoluci6n tamp6n tambien puede comprender Tris/HCl, lisina/HCl, Tris/acido maleico, Tris/acido malico, Tris/acido acetico, o Hepes/hidr6xido s6dico.

Preferiblemente, el pH se mantiene entre 7 y 7,5 y aun mas particularmente a aproximadamente 7,2.

El excipiente salino que puede utilizarse en la formulaci6n de la presente invenci6n es preferiblemente NaCl a una concentraci6n entre 100 y 200 mM, y preferiblemente a una concentraci6n de aproximadamente 150mM. Otro excipiente salino puede comprender aniones y cationes seleccionados del grupo que consiste en acetato, fosfato, carbonato, SO2-4 , Cl-, Br-, NO3-, Mg2+, Li+, Na+, K+, y NH4+.

La concentraci6n molar de la disoluci6n tamp6n se determina para que ejerza el efecto tamponador dentro de un limite y en un volumen en el que el valor del pH se estabilice entre 7 y 7,5. La composici6n de almacenamiento estable de ADN plasmidico segun la presente invenci6n comprende, por lo tanto, ADN plasmidico, un excipiente

salino y una disoluci6n tamp6n en la que la disoluci6n tamp6n esta presente en una concentraci6n de hasta 1mM, y preferiblemente entre 250IM y 1mM, o preferiblemente entre 400IM y 1mM para mantener el pH de dicha formulaci6n o composici6n entre 7 y 7,5. Entre los sistemas tamp6n segun la invenci6n, la disoluci6n tamp6n Tris a una concentraci6n de 400IM proporciona unos resultados particularmente satisfactorios y es, por lo tanto, la preferida en la formulaci6n de plasmido de la presente invenci6n.

Como se muestra en los Ejemplos mas adelante, las formulaciones de ADN plasmidico segun la presente invenci6n presentan una estabilidad excelente tanto a 4°C como a temperatura ambiente (RT), por ejemplo, 20 6 25°C. Particularmente, la formulaci6n de ADN plasmidico es util durante un periodo de tiempo prolongado de 1 mes, 2 meses, 3 meses, a 6 meses y hasta 12 meses a 4°C y a 25°C, por ejemplo, TA.

La presente invenci6n se refiere, por lo tanto, a una composici6n que comprende ADN plasmidico, una disoluci6n tamp6n y un excipiente salino, en la que la disoluci6n tamp6n esta presente a una concentraci6n suficiente para preservar el ADN plasmidico en una forma estable a 4°C a 25°C.

La presente invenci6n tambien se refiere a una composici6n que comprende ADN plasmidico, una disoluci6n tamp6n y un excipiente salino, en la que la disoluci6n tamp6n esta presente a una concentraci6n suficiente para preservar el ADN plasmidico en una forma estable a 4°C a 25°C durante un periodo de tiempo prolongado de 1 mes, 2 meses, 3 meses, a 6 meses, y hasta 12 meses.

En efecto, los ADN plasmidicos que se almacenan a 5°C o a temperatura ambiente durante un periodo largo de tiempo presentan velocidades bajas de despurinaci6n y de circularizaci6n abierta, inferiores a 20%, 15%, 10%, 5%,

o : 1 % por mes.

La composici6n segun la presente invenci6n puede comprender ademas un adyuvante, tal como por ejemplo un polimero seleccionado entre polietilen glicol, un plur6nico o un azucar polisorbato o alcohol.

Segun otro aspecto, la presente invenci6n se refiere a un metodo para preservar ADN plasmidico en una composici6n que comprende a) preparar una muestra purificada de ADN plasmidico y b) combinar dicha muestra purificada de ADN plasmidico con un excipiente salino y una disoluci6n tamp6n que mantiene el pH de la composici6n resultante entre 7 y 7,5.

La presente invenci6n tambien se refiere a un metodo para preservar ADN plasmidico en una composici6n a una temperatura de hasta aproximadamente 20°C, que comprende a) preparar una muestra purificada de ADN plasmidico, b) combinar la muestra purificada de ADN plasmidico con un excipiente salino y una disoluci6n tamp6n en la que la disoluci6n tamp6n esta presente a una concentraci6n de menos de 1mM, o entre 250IM y 1mM, y preferiblemente 400IM; y c) almacenar la composici6n de ADN plasmidico a una temperatura de aproximadamente 4°C hasta aproximadamente 20°C.

Ejemplos

Tecnicas generales de clonaci6n y de biologia molecular

Los metodos tradicionales de biologia molecular, tales como digesti6n con enzimas de restricci6n, electroforesis en gel, transformaci6n en E. coli, precipitaci6n de acidos nucleicos y similares, estan descritos en la bibliografia (Maniatis et al., T., E.F. Fritsch, y J. Sambrook, 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, segunda edici6n. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York; Ausubel F.M., R. Brent, R.E. Kinston,

D.D. Moore, J.A. Smith, J.G. Seidman y K. Struhl. 1987. Current protocols in molecular biology 1987-1988. John Willey and Sons, Nueva York.). Las secuencias de nucle6tidos se determinaron mediante el metodo de terminaci6n de la cadena segun el protocolo publicado previamente (Ausubel et al., 1987).

Las enzimas de restricci6n se obtuvieron de New England Biolabs, Beverly, MA (Biolabs).

Para llevar a cabo las ligaciones, los fragmentos de ADN se incuban en un tamp6n que comprende 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP en presencia de la ADN ligasa del fago T4 (Biolabs).

Los oligonucle6tidos se sintetizaron utilizando quimica de fosforamidita con las fosforamiditas protegidas en la posici6n mediante un grupo cianoetilo (Sinha, N.D., J. Biernat, J. McManus y H. Koster, 1984. Polymer support oligonucleotide synthesis, XVIII: Use of -cyanoethyl-N,N-dialkylamino-/N-morpholino phosphoramidite of deoxynucleosides for the synthesis of ADN fragments simplifying deprotection and isolation of the final product. Nucl. Acids Res., 12, 4539-4557: Giles, J. W. 1985. Advances in automated ADN synthesis. Am. Biotechnol., Nov./Dic.) con un sintetizador automatico de ADN Biosearch 8600 utilizando las recomendaciones del fabricante.

Los ADN ligados o los ADN que se van a ensayar para determinar su eficacia de transformaci6n se utilizan para transformar la cepa siguiente que se ha hecho competente:

E. coli DH5a[F/endA1, hsdR17, supE44, thi-1, recA1, gyrA96, relA1, L(lacZYA-arqF)U169, deoR, <80dlac (lacZLM15)] (para cualquier plasmido Col E1); o E. coli XAC-pir (para cualquier plasmido derivado de pCor).

Las minipreparaciones de ADN plasmidico se realizan segun el protocolo de Klein et al., 1980.

El medio de cultivo LB se utiliza para crecer las cepas de E. coli (Maniatis et al., 1982). Las cepas se incuban a 37°C. Las bacterias se plaquean en placas de medio LB suplementado con antibi6ticos adecuados.

Ejemplo 1

El ajuste de los diametros a las velocidades de flujo utilizadas se hace segun el calculo de los numeros de Reynolds en serpentines del sistema de lisis continuo. Debido a que el analisis siguiente asume que el comportamiento de los fluidos es Newtoniano, las figuras mostradas mas adelante son s6lo completamente validas en B1a y en parte en B2.

El valor del numero de Reynolds permite al experto en la tecnica especificar el tipo de comportamiento que se produce. Aqui, s6lo nos ocuparemos del flujo de fluido en un tubo (ingenieria hidraulica).

1) Fluido No Newtoniano

Los dos tipos de fluidos no Newtonianos que aparecen mas comunmente en la industria son Bingham y Ostwald de Waele. En este caso, el numero de Reynolds (Re) se calcula como sigue: ReN es el numero de Reynolds generalizado

D: diametro interno de la secci6n transversal (m)

P: masa volumetrica del fluido (kg/m3)

w: velocidad espacial del fluido (m/s)

n: indice del comportamiento del fluido (sin dimensi6n)

m: coeficiente de la consistencia del fluido (dyn . sn / cm2 ) Y n y m se determinan empiricamente (estudio del comportamiento reol6gico).

2) Fluido Newtoniano

Como en la primera secci6n, en la Ecuaci6n (1) tenemos: Re = f(diametro interno, I, p, y u) porque n y m son funciones de I.

p: Masa volumetrica del fluido (kg/m3)

I: Viscosidad del fluido (Pa.s, y 1 mPa.s = 1 cP)

D: diametro interno de la secci6n transversal (m)

u: velocidad espacial media del fluido (m/s) La Ecuaci6n (1), para n=1, se reduce a la Ecuaci6n (2). Con Q = velocidad de flujo (m3/h) y S = area superficial de la secci6n transversal (m2) y si I se da en cP, entonces:

En un conducto circular, el flujo es laminar para un numero de Reynolds por debajo de 2.500, y es flujo turbulento suave hidraulicamente para un numero de Reynolds entre 2.000 y 500.000. El limite es deliberadamente vago entre

2.000 y 2.500, cuando se utilizan ambos tipos de comportamiento para determinar que puede ocurrir y la elecci6n se realiza a posteriori.

3) Calculos

Como n y m generalmente no se conocen, se han utilizado las aproximaciones siguientes para estimar las tendencias:

Fluido Newtoniano (en todas las secciones transversales) p = 1.000 kg/m3 (para todos los fluidos) I = 5 cP en B1a y 40 cP en B1b (nuestros datos) 2,5 cP en B2 (nuestros datos)

5 Los calculos siguientes se realizaron utilizando la Ecuaci6n (3) para dos configuraciones de tubos estandar ensayadas denominadas configuraci6n 1 y configuraci6n 2 (sin tubo B1b):

Tabla 2

Serpentin

Configuraci6n 1 Configuraci6n 2

B1a

B2 B1a B2

Viscosidad * (cP)

5 2,5 5 2,5

Diametro (mm)

12,7 9,5 6 6

Velocidad de flujo (L/h)

60 105 12 21

Numero de Reynolds Procedimiento

334 1564 141 495

laminar

laminar

laminar

laminar

En estas dos configuraciones, los flujos son laminares en todas las etapas y las disoluciones no se mezclan 10 adecuadamente entre si.

Para otras configuraciones de tubos (sin tubo B1b), tenemos:

Tabla 3

Serpentin

Alta velocidad/diametro estd Alta velocidad/16 mm ID Alta velocidad/6 mm ID

B1a

B2 B1a B2 B1a B2

Viscosidad * (cP)

5 2,5 5 2,5 5 2,5

Diametro (mm)

12 10 16 16 6 6

Velocidad de flujo (L/h)

120 210 120 210 120 210

Numero de Reynolds

707 2971 531 1857 1415 4951

Proceso

laminar turbulento laminar laminar laminar turbulento

Se realizaron calculos similares utilizando la Ecuaci6n (3) para varias configuraciones de tubos estando presentes 15 los tubos B1a y B1b:

Tabla 4

Serpentin

Alta velocidad Alta velocidad/agitaci6n max

B1a

B1b B2

B1a

B1a

B1a

Viscosidad * (cP)

5 5 2,5 5 5 5

Diametro (mm)

6 16 6 3 2 3

Velocidad de flujo (L/h)

120 120 210 120 120 160

Numero de Reynolds

1415 531 4951 2829 4244 3773

Proceso

laminar laminar turbulento turbulento turbulento turbulento

Claramente, se pueden obtener valores de Reynolds predefinidos ajustando los diametros de los tubos y las velocidades de flujo.

Un experto en la tecnica puede prever muchas combinaciones de diametros y longitudes para B2 o para las dos secciones de B1 (B1a y B1b). Por ejemplo, la primera secci6n de B1 puede reducirse de 6 mm a 3 mm con el fin de reducir la longitud y de incrementar la agitaci6n. Adicionalmente, n y m pueden determinarse a partir del estudio del comportamiento reol6gico de los fluidos y utilizarse para determinar las caracteristicas correctas de los tubos.

Ademas de la eficacia de la agitaci6n, tambien se puede considerar la duraci6n de la agitaci6n, que en algunas realizaciones de la presente invenci6n se obtiene ajustando la longitud de los serpentines.

El diametro de los tubos o la velocidad del fluido no parecen dominar en la Ecuaci6n (1) para un fluido no Newtoniano (datos no mostrados). En otras palabras, no parece ser mas eficaz alterar el diametro que alterar la velocidad de flujo si se utiliza la ecuaci6n (1) para los calculos en B1b y en B2. Cuando se desean velocidades de flujo altas, el diametro puede variarse junto con la velocidad de flujo.

Estos principios pueden utilizarse como base para limitar la agitaci6n tanto como sea posible en B1b y B2 con el fin de evitar la fragmentaci6n del ADNg.

Durante la lisis, la agitaci6n puede ser bastante vigorosa siempre que el ADNg no se desnaturalice. La reducci6n del diametro al comienzo de B1 hace posible el incremento de la agitaci6n (Re incrementado) con el fin de mezclar suficientemente la disoluci6n 2 con las celulas. Por otra parte, cuando las celulas se lisan, pueden reducirse la agitaci6n y las fuerzas de fricci6n contra la pared para evitar la fragmentaci6n de los acidos nucleicos. El incremento del diametro hace posible la reducci6n de la agitaci6n (Re disminuido) y de la fricci6n (velocidad menor).

M1: mezclado de los fluidos.

B1a: sintonizaci6n precisa del mezclado al comienzo de la lisis: fen6meno de convecci6n (macromezclado).

B1b: dejar que se produzca la desnaturalizaci6n mas fen6meno de difusi6n (micromezclado).

Se asume que el numero de Reynolds generalizado tiene el mismo significado para un fluido no Newtoniano que el numero de Reynolds clasico tiene para un fluido Newtoniano. En particular, se asume que el limite para el regimen laminar en un conducto con secci6n transversal circular es ReN < 2.300.

La neutralizaci6n se realiza en B2. Las velocidades altas de flujo tienden a incrementar la fragmentaci6n del ADN gen6mico mediante la producci6n de una agitaci6n demasiado vigorosa y mediante fuerzas de fricci6n en la pared (estres mecanicos). La utilizaci6n de un tubo con un diametro grande hace posible reducir la agitaci6n (Re) y las fuerzas de fricci6n (velocidad). Pusimos aqui un tubo con un diametro pequeno (6 mm) para evitar una agitaci6n insuficiente. Nuestras observaciones mostraban que era mejor tener s6lo un tubo con diametro pequeno para B2, con el fin de agitar "violentamente y rapidamente" el lisado neutralizado.

Ejemplo 2

Se puede dividir el sistema CL en 5 etapas. En una realizaci6n particular, la configuraci6n era como sigue:

1) Mezclado: celulas (en la disoluci6n 1) + disoluci6n 2 (M1 + 3 m de tubo de 6 mm). Comienzo de la lisis de las celulas con SDS, no existe riesgo de fragmentaci6n del ADN siempre que no se desnaturalice. 2) Final de la lisis y desnaturalizaci6n del ADNg (13 m de tubo de 16 mm). 3) Mezclado: Lisado + disoluci6n 3 (M2 +3 m de tubo de 6 mm). 4) Recogida del lisado neutralizado a 4°C 5) Sedimentaci6n de fl6culos y grandes fragmentos de ADNg toda la noche a 4°C.

Las condiciones siguientes pueden utilizarse para llevar a cabo la lisis continua:

•

Disoluci6n 1 : EDTA 10 mM, glucosa (Glc) 9 g/l y Tris HCl 25 mM, pH 7,2.

•

Disoluci6n 2: SDS 1 % y NaOH 0,2 N.

•

Disoluci6n 3: Acido acetico 2 M y acetato de potasio 3M.

•

Velocidad de flujo 60 l/h: Disoluci6n 1 y disoluci6n 2

•

Velocidad de flujo 90 l/h: Disoluci6n 3.

•

Celulas ajustadas a 38,5 g/l con la disoluci6n 1.

Las celulas en la disoluci6n 1 pasan a traves de 3 toberas que las dispersan en la disoluci6n 2, que llega desde la direcci6n opuesta.

•

El mezclador M1 tiene una geometria que hace posible optimizar el mezclado de los dos fluidos (vease la Figura 2, dibujo esquematico del mezclador).

•

La primera secci6n del tubo despues del mezclador M1 es B1a y la siguiente secci6n es B1b. B1a: 3 m de longitud, 6 mm de diametro, 2,5 s de tiempo de residencia B1b: 13 m de longitud, 16 mm de diametro, 77 s de tiempo de residencia

El proceso de la presente invenci6n proporciona una ventaja en terminos de eficacia, resumidos como: dispersi6n,

mezclado breve violento, y mezclado suave por difusi6n. Utilizando el proceso de la presente invenci6n, se incrementa el numero de celulas lisadas y por lo tanto se incrementa la cantidad de ADNp recuperada.

La idea de la difusi6n es especialmente importante por la dificultad de mezclar estos fluidos debido a sus

propiedades, en particular la viscoelasticidad. El proceso de la presente invenci6n hace posible limitar el esfuerzo de cizalla y por lo tanto limitar la fragmentaci6n del ADNg, lo que facilita su eliminaci6n durante la purificaci6n cromatografica posterior.

El problema es el mezclado con la disoluci6n 3, que puede enfriarse hasta 4°C. En una realizaci6n, el proceso de la invenci6n utiliza:

•

Mezclador M2, que es una Y con un diametro interno de aproximadamente 10 mm

•

La secci6n del tubo B2 situado despues del mezclador M2. B2: 2 m de tubo de 6 mm; tiempo de residencia: 1 s

La Tabla 5 siguiente proporciona los resultados obtenidos en ensayos comparativos para mostrar las ventajas de nuestro proceso de lisis continua comparado con la lisis discontinua.

Tabla 5

Proporci6n ADNg/ADNp en el lisado

Cantidad de plasmido extraida por g de celula (mg/g)

Lisis discontinua

16,9 1,4

Lisis continua con sistema CL descrito en el ejemplo 1

1,6 1,9

Ejemplo 3

La columna utilizada es una columna HiTrap de 1 ml activada con NHS (N-hidroxisuccinimida, Pharmacia) conectada a una bomba peristaltica (salida < 1 ml/min. El oligonucle6tido especifico utilizado tiene un grupo NH2 en el extremo 5, y su secuencia es como sigue: 5,-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3, (SEQ ID NO: 1)

Los tampones utilizados en este ejemplo son los siguientes:

Tamp6n de acoplamiento: 0,2 M NaHCO3, 0,5 M NaCl, pH 8,3.

Tamp6n A: 0,5 M etanolamina, 0,5 M NaCl, pH 8,3.

Tamp6n B: 0,1 M acetato, 0,5 M NaCl, pH 4.

La columna se lava con 6 ml de 1 mM HCl, y el oligonucle6tido diluido en el tamp6n de acoplamiento (50 nmoles en 1 ml) se aplica a la columna y se deja durante 30 minutos a temperatura ambiente. La columna se lava tres veces sucesivamente con 6 ml de tamp6n A y despues con 6 ml de tamp6n B. El oligonucle6tido se une asi covalentemente a la columna mediante una conexi6n CONH. La columna se almacena a 4°C en PBS, 0,1 % NaN3, y puede utilizarse al menos cuatro veces.

Se sintetizaron los dos oligonucle6tidos siguientes: oligonucle6tido 4817: 5,-GATCCGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAG AA GAAGAAGG-3, (SEQ ID NO: 13) y oligonucle6tido 4818 5,-AATTCCTTCTT CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCG-3, (SEQ ID NO: 14)

Estos oligonucle6tidos cuando se hibridan y clonan en un plasmido, introducen una secuencia homopurinahomopirimidina (GAA)17 (SEQ ID NO: 15) en el plasmido correspondiente, como se ha descrito anteriormente.

La secuencia correspondiente a estos dos oligonucle6tidos hibridados se clon6 en el sitio de clonaci6n multiple del plasmido pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA), que porta un gen de resistencia a ampicilina. Para este fin, los oligonucle6tidos se hibridaron de la manera siguiente: un Ig de estos dos oligonucle6tidos se colocaron juntos en 40 ml de un tamp6n final que comprende Tris-HCl 50 mM pH 7,4, MgCl2 10 mM. Esta mezcla se calent6 a 95°C y despues se coloc6 a temperatura ambiente de forma que la temperatura bajase despacio. Diez ng de la mezcla de oligonucle6tidos hibridados se ligaron con 200 ng de plasmido pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA) digerido con BamHI y EcoRI en 30 Il finales. Despues de la ligaci6n, se transform6 una alicuota en DH5a. Las mezclas de transformaci6n se plaquearon en medio L suplementado con ampicilina (50 mg/l) y X-gal (20 mg/l). Los clones recombinantes deberian mostrar una ausencia de coloraci6n azul en este medio, al contrario que el plasmido parental (pBKS+) que permite la complementaci6n a del fragmento w de B-galactosidasa de E. coli. Despues de la minipreparaci6n del ADN plasmidico a partir de 6 clones, todos mostraron la desaparici6n del sitio Pstl localizado entre los sitios EcoRI y BamHI de pBKS+, y un incremento del peso molecular de la banda de Pvull de 448-pb que contiene el sitio de clonaci6n multiple. Se seleccion6 un clon y el plasmido correspondiente se denomin6 pXL2563. La secuencia clonada se verific6 secuenciando utilizando el cebador -20 (5,-TGACCGGCAGCAAAATG-3,(SEQ ID NO: 16)) (Viera J. y J. Messing. 1982. The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene, 19, 259-268) para el plasmido pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA). El plasmido pXL2563 se purific6 segun el kit Wizard Megaprep (Promega Corp. Madison, WI) segun las recomendaciones del proveedor. Esta preparaci6n de ADN plasmidico se utiliz6 a partir de entonces en los ejemplos descritos mas adelante.

El plasmido pXL2563 se purific6 en la columna HiTrap acoplada al oligonucle6tido, descrito en 1.1., a partir de una disoluci6n que tambien contiene el plasmido pBKS+.

Los tampones utilizados en esta purificaci6n son los siguientes:

Tamp6n F: 2 M NaCl, 0,2 M acetato, pH 4,5 a 5.

Tamp6n E: 1 M Tris-HCl, pH 9, 0,5 mM EDTA.

La columna se lava con 6 ml de tamp6n F, y los plasmidos (20 Ig de pXL2563 y 20 Ig de pBKS+ en 400 Il de tamp6n F) se aplican a la columna y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente. La columna se lava con 10 ml de tamp6n F y la eluci6n se realiza con el tamp6n E. Los plasmidos se detectan despues de electroforesis en gel de agarosa al 1 % y tinci6n con bromuro de etidio. La proporci6n de los plasmidos en la disoluci6n se estima midiendo su actividad transformante en E. coli.

Comenzando con una mezcla que contiene 30 % de pXL2563 y 70 % de pBKS+, se recupera una disoluci6n que contiene 100 % de pXL2563 a la salida de la columna. La pureza, estimada por la proporci6n de DO a 260 y 280 nm se incrementa de 1,9 a 2,5, lo que indica que mediante este metodo se han eliminado las proteinas contaminantes.

Ejemplo 4

El acoplamiento del oligonucle6tido (5,-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3, (SEQ ID NO: 1)) a la columna se realiza como se describe en el Ejemplo 3. Para el acoplamiento, el oligonucle6tido se modifica en el extremo 5, con un grupo amino unido al fosfato del espaciador por un brazo que contiene 6 atomos de carbono (Modified oligonucleotide Eurogentec SA, Belgica). El plasmido pXL2563 se purific6 utilizando el kit Wizard Megaprep (Promega Corp. Madison, WI) segun las recomendaciones del proveedor. Los tampones utilizados en este ejemplo son los siguientes:

Tamp6n F: 0-2 M NaCl, 0,2 M acetato, pH 4,5 a 5.

Tamp6n E: 1 M Tris-HCl pH 9, 0,5 mM EDTA.

La columna se lava con 6 ml del tamp6n F, y 100 Ig del plasmido pXL2563 diluidos en 400 Il de tamp6n F se aplican a la columna y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente. La columna se lava con 10 ml de tamp6n F y la eluci6n se realiza con el tamp6n E. El plasmido se cuantifica determinando la densidad 6ptica a 260 nm.

En este ejemplo, la uni6n se realiza en un tamp6n cuya molaridad respecto a NaCl varia de 0 a 2 M (tamp6n F). El rendimiento de la purificaci6n disminuye al disminuir la molaridad de NaCl. El pH del tamp6n de uni6n puede variar de 4,5 a 5, siendo el rendimiento de la purificaci6n mayor a 4,5. Tambien es posible utilizar otro tamp6n de eluci6n de pH basico: la eluci6n se realiza asi con un tamp6n que comprende borato 50 mM, pH 9, EDTA 0,5 mM. El acoplamiento del oligonucle6tido (5,-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3, (SEQ ID NO: 1) a la columna se realiza como se describe en el Ejemplo 3. El plasmido pXL2563 se purific6 utilizando el kit Wizard Megaprep (Promega Corp. Madison, WI) segun las recomendaciones del proveedor. Los tampones utilizados en este ejemplo son los siguientes:

Tamp6n F: 0,1 M NaCl, 0,2 M acetato, pH 5.

Tamp6n E: 1 M Tris-HCl pH 9, 0,5 mM EDTA.

La columna se lava con 6 ml del tamp6n F, y 100 Ig del plasmido pXL2563 diluidos en 400 Il de tamp6n F se aplican a la columna y se incuba durante una hora a temperatura ambiente. La columna se lava con 10 ml de tamp6n F y la eluci6n se realiza con el tamp6n E. Se determina el contenido de ADN gen6mico o cromos6mico de E. coli presente en las muestras de plasmido antes y despues de pasar a traves de la columna con el oligonucle6tido. Este ADN gen6mico se cuantifica mediante PCR utilizando cebadores en el gen galK de E. coli. Segun el protocolo siguiente: La secuencia de estos cebadores se describe por Debouck et al. (Nucleic Acids Res. 19 85, 13, 18411853):

5,-CCG AAT TCT GGG GAC CAA AGC AGT TTC-3, (SEQ ID NO: 17)

y 5,-CCA AGC TTC ACT GTT CAC GAC GGG TGT-3, (SEQ ID NO: 18).

El medio de reacci6n comprende, en 25 Il de tamp6n de PCR (Promega France, Charbonnieres): MgCl2 1,5 mM; dXTP 0,2 mM (Pharmacia, Orsay); cebador 0,5 IM; 20 U/ml de polimerasa Taq (Promega). La reacci6n se realiza segun la secuencia:

•

5 min a 95°C

•

30 ciclos de 10 s a 95°C

30 s a 60°C

1 min a 78°C

• 10 min a 78°C.

El fragmento de ADN amplificado de 124 pares de bases de longitud se separa mediante electroforesis en gel de agarosa al 3 % en presencia de SybrGreen I (Molecular Probes, Eugene, EEUU), y se cuantifica por referencia con una serie de ADN gen6mico Ultrapur de la cepa B de E. coli (Sigma, ref D4889).

Ejemplo 5

Este ejemplo describe la purificaci6n de ADN plasmidico a partir de un lisado aclarado de un cultivo bacteriano, en la denominada escala "miniprep": se centrifugan 1,5 ml de un cultivo de toda la noche de cepas DH5a que contienen el plasmido pXL2563 y el sedimento se resuspende en 100 Il de 50 mM glucosa, 25 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM EDTA. Se anaden 200 Il de NaOH 0,2 M, SDS al 1 %, se invierten los tubos para mezclar, a continuaci6n se anaden 150 Il de acetato de potasio 3 M pH 5 y los tubos se invierten para mezclar. Despues de centrifugar, se recupera el sobrenadante y se carga en la columna del oligonucle6tido obtenida como se describe en el Ejemplo 1. La uni6n, lavados y eluci6n son identicos a los descritos en el Ejemplo 3. Se recupera aproximadamente 1 Ig de plasmido a partir de 1,5 ml de cultivo. El plasmido obtenido, analizado mediante electroforesis en gel de agarosa y tinci6n con bromuro de etidio, forma una unica banda de ADN circular "superenrollado". No se detecta ninguna traza de ADN o ARN de alto peso molecular (cromos6mico) en el plasmido purificado mediante este metodo.

Ejemplo 6

Este ejemplo describe un experimento de purificaci6n de ADN plasmidico realizado en las mismas condiciones que en el Ejemplo 5, comenzando a partir de 20 ml de cultivo bacteriano de cepas DH5a que contienen el plasmido pXL2563. El sedimento celular se resuspende en 1,5 ml de 50 mM glucosa, 25 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM EDTA. La lisis se realiza con 2 ml de 0,2 M NaOH, 1 % SDS, y la neutralizaci6n con 1,5 ml de 3 M acetato de potasio, pH 5. El ADN se precipita con 3 ml de 2-propanol, y el sedimento se resuspende en 0,5 ml de 0,2 M de acetato de sodio, pH 5, 0,1 M NaCl y se carga en la columna de oligonucle6tido obtenida como se describe en el Ejemplo anterior. La uni6n, lavado de la columna y eluci6n se llevan a cabo como se describe en el Ejemplo anterior, excepto el tamp6n de lavado cuya molaridad respecto a NaCl es 0,1 M. El plasmido obtenido, analizado mediante electroforesis en gel de agarosa y tinci6n con bromuro de etidio, forma una unica banda de ADN circular "superenrollado". No se detecta ninguna traza de ADN o ARN de alto peso molecular (cromos6mico) en el plasmido purificado. La digesti6n del plasmido con una enzima de restricci6n proporciona una unica banda en el peso molecular esperado de 3 kilobases. El plasmido utilizado contiene un casete que contiene el promotor de citomegalovirus, el gen que codifica la luciferasa y la secuencia homopurina-homopirimidina (GAA)17 (SEQ ID NO: 15) que se origina a partir del plasmido pXL2563. La cepa DH1 (Maniatis et al., 1989) que contiene este plasmido se cultiva en un fermentador de 7 litros. Se prepara un lisado aclarado a partir de 200 gramos de celulas: el sedimento celular se resuspende en 2 litros de 25 mM Tris, pH 6,8, 50 mM glucosa, 10 mM EDTA, a los que se anaden 2 litros de 0,2 M NaOH, 1 % SDS. El lisado se neutraliza mediante la adici6n de un litro de 3M acetato de potasio. Despues de la diafiltraci6n, se aplican 4 ml de este lisado a una columna HiTrap-NHS de 5 ml acoplada al oligonucle6tido de secuencia 5,-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3, (SEQ ID NO: 1), segun el metodo descrito en el Ejemplo 3. El lavado y la eluci6n se realizan como se describe en el Ejemplo anterior.

Ejemplo 7

Este ejemplo describe la utilizaci6n de un oligonucle6tido que presenta citosinas metiladas. La secuencia del oligonucle6tido utilizado es como sigue: 5, -GAGGMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCCTMeCTTMeCTT-3, (SEQ ID NO: 19)

Este oligonucle6tido tiene un grupo NH2 en el extremo 5, terminal. MeC=5-metilcitosina. Este oligonucle6tido permite purificar el plasmido pXL2563 en las condiciones del Ejemplo 1 con un tamp6n de uni6n de pH 5 (de esta manera se disminuye el riesgo de degradaci6n del plasmido).

Ejemplo 8

En los ejemplos anteriores, el oligonucle6tido utilizado esta modificado en el extremo 5, terminal con un grupo amino unido al fosfato mediante un brazo que contiene 6 atomos de carbono: NH2-(CH2)6-. En este ejemplo, el grupo amino esta unido al fosfato del extremo 5, terminal mediante un brazo que contiene 12 atomos de carbono: NH2-(CH2)12. El acoplamiento del oligonucle6tido y el paso a traves de la columna se realizan como se describe en el Ejemplo 3 con un tamp6n F: NaCl 2 M, acetato 0,2 M, pH 4,5. Este oligonucle6tido permite obtener rendimientos de purificaci6n mejores: se obtiene un rendimiento del 53 % mientras con el oligonucle6tido que contiene 6 atomos de carbono, este rendimiento es del orden del 45 % en las mismas condiciones.

Ejemplo 9

Siguiendo la estrategia de clonaci6n descrita en el Ejemplo 3, se construyeron otros dos plasmidos que portan secuencias homopurina-homopirimidina: el plasmido pXL2725 que contiene la secuencia (GGA)16 , (SEQ ID NO: 20) y el plasmido pXL2726 que contiene la secuencia (GA)25 (SEQ ID NO: 21).

Los plasmidos pXL2725 y pXL2726, analogos al plasmido pXL2563, se construyeron segun la estrategia de clonaci6n descrita en el Ejemplo 3, utilizando los pares de oligonucle6tidos siguientes:

5986: 5,-GATCC(GA)25GGG-3, (SEQ ID NO: 22)

5987: 5,-AATTCCC(TC)25G-3, (SEQ ID NO: 23)

5981: 5,-GATCC(GGA)17GG-3, (SEQ ID NO: 24)

5982: 5,-AATT(CCT)17CCG-3, (SEQ ID NO: 25)

La pareja de oligonucle6tidos 5986 y 5987 se utiliz6 para construir el plasmido pXL2726 clonando los oligonucle6tidos en los sitios BamHI y EcoRI del pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA), mientras que los oligonucle6tidos 5981 y 5982 se utilizaron para la construcci6n del plasmido pXL2725. Se utilizaron las mismas condiciones experimentales que para la construcci6n del plasmido pXL2563, y s6lo se cambiaron las parejas de oligonucle6tidos. De manera similar, se verificaron las secuencias clonadas mediante secuenciaci6n en los plasmidos. Esto permite observar que el plasmido pXL2725 tiene una modificaci6n respecto a la secuencia esperada: en lugar de la secuencia GGA repetida 17 veces, esta GGAGA(GGA)15 (SEQ ID NO: 26).

Ejemplo 10

Los oligonucle6tidos que forman helices triples con estas secuencias de homopurina se acoplaron a las columnas HiTrap segun la tecnica descrita en el Ejemplo 1.1. El oligonucle6tido de secuencia 5,-AATGCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT-3, (SEQ ID NO: 27) se utiliz6 para la purificaci6n del plasmido pXL2725, y el oligonucle6tido de secuencia 5,-AGTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3, (SEQ ID NO: 28) se utiliz6 para la purificaci6n del plasmido pXL2726.

Las dos columnas obtenidas de esta manera permiten purificar los plasmidos correspondientes segun la tecnica descrita en el Ejemplo 2, con los tampones siguientes:

Tamp6n F: NaCl 2 M, acetato 0,2 M, pH 4,5.

Tamp6n E: 1 M Tris-HCl, pH 9, 0,5 mM EDTA.

Los rendimientos obtenidos son 23 % y 31 % para pXL2725 y pXL2726, respectivamente.

Ejemplo 11

Este ejemplo ilustra la influencia de la longitud de la secuencia especifica presente en el plasmido en los rendimientos de la purificaci6n.

El gen informador utilizado en estos experimentos para demostrar la actividad de las composiciones de la invenci6n es el gen que codifica la luciferasa (Luc).

El plasmido pXL2621 contiene un casete que contiene el promotor citomegalovirus (CMV) de 661-pb, extraido a partir de pcDNA3 (Invitrogen Corp., San Diego, CA) por escisi6n con las enzimas de restricci6n MluI y HindIII, clonado antes del extremo 5, del gen que codifica la luciferasa, en los sitios MluI y HindIII, dentro del vector Vector basico pGL (Promega Corp., Madison, WI). Este plasmido se construy6 utilizando tecnicas estandar de biologia molecular.

Los plasmidos pXL2727-1 y pXL272--2 se construyeron de la manera siguiente:

Dos microgramos del plasmido pXL2621 se linearizaron con BamHI; la enzima se inactiv6 mediante tratamiento durante 10 min a 65°C; simultaneamente, los oligonucle6tidos 6006 y 6008 se hibridaron como se describe para la construcci6n del plasmido pXL2563.

6006: 5,-GATCT(GAA)17CTGCAGATCT-3, (SEQ ID NO: 29)

6008: 5,-GATCAGATCTGCAG(TTC)17A-3, (SEQ ID NO: 30).

Esta mezcla de hibridaci6n se clon6 en los extremos BamHI del plasmido pXL2621 y, despues de la transformaci6n en DH5a, se identificaron los clones recombinantes mediante analisis de restricci6n enzimatica con PstI, ya que los oligonucle6tidos introducen un sitio PstI. Se seleccionaron dos clones, y la secuencia de nucle6tidos del fragmento clonado se verific6 utilizando el cebador (6282, 5,-ACAGTCATAAGTGCGGCGACG-3, (SEQ ID NO: 31)) como cebador de la reacci6n de secuenciaci6n (Viera J. y J. Messing, 1982. The pUC plasmids an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene 19:259-268).

El primer clon (pXL2727-1) contiene la secuencia GAA repetida 10 veces. El segundo (pXL2727-2) contiene la secuencia 5,-GAAGAAGAG(GAA)7GGAAGAGAA-3, (SEQ ID NO: 32).

Se utiliza una columna tal como la descrita en el Ejemplo 3, y que esta acoplada al oligonucle6tido 5,-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3, (SEQ ID NO: 1).

El plasmido pXL2727-1 tiene 14 repeticiones de la secuencia GAA. El oligonucle6tido descrito anteriormente, que contiene s6lo 7 repeticiones de la secuencia de hibridaci6n correspondiente CTT, puede hibridar asi con el plasmido en 8 posiciones diferentes. El plasmido pXL2727-2, por el contrario, tiene una secuencia de hibridaci6n (GAA)7 (SEQ ID NO: 36) de la misma longitud que la del oligonucle6tido unido a la columna. Este oligonucle6tido puede hibridar asi s6lo en una posici6n en pXL2727-2.

El experimento es identico al descrito en el Ejemplo 4, con los tampones siguientes:

Tamp6n F: NaCl 2 M, acetato 0,2 M, pH 4,5.

Tamp6n E: 1 M Tris-HCl, pH 9, 0,5 mM EDTA.

El rendimiento de la purificaci6n es 29 % con el plasmido pXL2727-1 y 19 % con pXL2727-2.

Las celulas utilizadas son celulas NIH 3T3, inoculadas el dia anterior al experimento en placas de cultivo de 24 pocillos con 50.000 celulas/pocillo. El plasmido se diluye en 150 mM NaCl y se mezcla con el lipofectante RPR115335. Se utiliza una proporci6n de cargas positivas de lipofectante/cargas negativas de ADN igual a 6. La mezcla se agita en un vortex, se deja durante 10 minutos a temperatura ambiente, se diluye en medio sin suero fetal de ternera y a continuaci6n se anade a las celulas en la proporci6n de 1 Ig de ADN por pocillo de cultivo. Despues de dos horas a 37°C, se anade 10 % volumen/volumen de suero fetal de ternera y las celulas se incuban durante 48 horas a 37°C en presencia de 5 % de CO2. Las celulas se lavan dos veces con PBS y se determina la actividad luciferasa segun el protocolo descrito (kit de Promega, Promega Corp. Madison, WI) en un lumin6metro Lumat LB9501 (EG y G Berthold, Evry). El plasmido pXL2727-1, purificado como se describe en el Ejemplo 8.2, proporciona unos rendimientos en la transfecci6n dos veces mayores que los obtenidos con el mismo plasmido purificado utilizando el kit Wizard Megaprep (Promega Corp. Madison, WI).

Ejemplo 12

El ejemplo siguiente demuestra la purificaci6n de plasmidos derivados de pCOR utilizando cromatografia de afinidad de triple helice. Se ha mostrado que esta tecnologia elimina acidos nucleicos contaminantes (particularmente ADN gen6mico y ARN de la celula anfitriona) hasta niveles que no se han conseguido alcanzar con metodos cromatograficos convencionales.

Se sintetiz6 un gel de afinidad de triplex con Sephacryl S-1000 SF (Amersham-Pharmacia Biotech) como matriz cromatografica. Sephacryl S-1000 se activ6 en primer lugar con m-peryodato de sodio (3 mM, temperatura ambiente, 1 h) en acetato de sodio 0,2 M (pH 4,7). Despues, el oligonucle6tido se acopl6 mediante su resto 5,-NH2 terminal a grupos aldehido de la matriz activada mediante aminaci6n reductora en presencia de acido asc6rbico (5 mM) como se ha descrito previamente para el acoplamiento de proteinas (Hornsey et al., J. Immunol. Methods, 1986, 93, 8388). El oligonucle6tido homopirimidina utilizado en estos experimentos (de Eurogentec, purificado mediante HPLC) tenia una secuencia que era complementaria a una secuencia de homopurina corta de 14-mer (5,-AAGAAAAAAAAGAA-3,) (SEQ ID NO: 10) presente En el origen de replicaci6n (oriy) del plasmido pCOR (Soubrier et al., Gene Therapy, 1999, 6, 1482-1488)-Como se ha discutido anteriormente, la secuencia del oligonucle6tido homopirimidina es 5,-TTCTTTTTTTTCTT-3, (SEQ ID NO: 11).

Se cromatografiaron los plasmidos siguientes: pXL3296 (pCOR sin transgen, 2,0 kpb), pXL3179 (pCOR-FGF, 2,4 kpb), pXL3579 (pCOR-VEGFB, 2,5 kpb), pXL3678 (pCOR-AFP, 3,7 kpb), pXL3227 (pCOR-lacZ 5,4 kpb) y pXL3397 (pCOR-Bdeleted FVIII, 6,6 kpb). Todos estos plasmidos se purificaron mediante dos etapas de cromatografia de intercambio ani6nico a partir de lisados aclarados obtenidos como se describe en el Ejemplo 4. Tambien se estudi6 el plasmido pBKS+ (pBluescript II KS + de Stratagene), un plasmido derivado de ColE1, purificado mediante ultracentrifugaci6n en CsCl. Todos los plasmidos utilizados estaban en su estado topol6gico o forma superenrollada (> 95 %).

En cada experimento de purificaci6n de ADN plasmidico, se cargaron 300 Ig de ADN plasmidico en 6 ml de NaCl 2 M, acetato de potasio 0,2 M (pH 5,0) a una velocidad de flujo de 30 cm/h en una columna de afinidad que contenia el oligonucle6tido mencionado anteriormente 5,-TTCTTTTTTTTCTT-3, (SEQ ID NO: 11). Despues de lavar la columna con 5 volumenes del mismo tamp6n, el plasmido unido se eluy6 con Tris/HCl 1 M, EDTA 0,5 mM (pH 9,0) y se cuantific6 mediante UV (260 nm) y cromatografia de intercambio i6nico con una columna Millipore Gen-Pak (Marquet et al., BioPharm, 1995, 8, 26-37). Las recuperaciones de los plasmidos en la fracci6n recogida fueron 207 Ig para pXL3296, 196 Ig para pXL3179, 192 Ig para pXL3579, 139 Ig para pXL3678, 97 Ig para pXL 3227, y 79 Ig para pXL 3397.

No se pudo detectar ninguna uni6n de plasmido (< 3 Ig) cuando se cromatografi6 pBKS en esta columna. Esto indica que el oligonucle6tido 5,-TTCTTTTTTTTCTT-3, (SEQ ID NO: 11) forma estructuras triplex estables con la secuencia complementaria de 14-mer 5,- AAGAAAAAAAAGAA-3, (SEQ ID NO: 10) presente en pCOR (oriy), pero no con la secuencia muy relacionada 5,-AGAAAAAAAGGA-3, (SEQ ID NO: 8) presente en pBKS. Esto indica que la introducci6n de una triada no can6nica unica (T*GC en este caso) resulta en una desestabilizaci6n completa de la estructura triplex.

Como control, no se observ6 ninguna uni6n de plasmido (< 1 Ig) cuando se cromatografi6 pXL3179 en una columna blanco sintetizada en condiciones estrictamente similares pero sin oligonucle6tido.

Realizando esta columna de purificaci6n de afinidad en las condiciones indicadas en la presente memoria, el nivel de contaminaci6n por el ADN gen6mico del anfitri6n se redujo del 2,6 % hasta el 0,07 % para una preparaci6n de pXL3296. De manera similar, el nivel de contaminaci6n por el ADN del anfitri6n se redujo del 0,5 % hasta el 0,008 % para una preparaci6n de pXL3179 cuando la muestra se cromatografi6 mediante la misma columna de afinidad.

Ejemplo 13

El ejemplo siguiente demuestra la purificaci6n de plasmidos derivados de ColE1 utilizando cromatografia de afinidad de triple helice. Se ha mostrado que esta tecnologia elimina acidos nucleicos contaminantes (particularmente ADN gen6mico y ARN de la celula anfitriona) hasta niveles que no se han conseguido alcanzar con metodos cromatograficos convencionales.

Se sintetiz6 un gel de afinidad de triplex acoplando un oligonucle6tido que tiene la secuencia 5,-TCTTTTTTTCCT-3, (SEQ ID NO: 9) en Sephacryl S-1000 SF oxidado con peryodato como se describe en el Ejemplo anterior.

Los plasmidos pXL3296 (pCOR sin transgen) y pBKS, un plasmido derivado de ColE1, se cromatografiaron en una columna de 1 ml que contenia el oligonucle6tido 5,-TCTTTTTTTCCT-3, (SEQ ID NO: 9) en las condiciones descritas en el Ejemplo 9. Las recuperaciones de los plasmidos en la fracci6n recogida fueron 175 Ig para pBKS y <1 Ig para pXL3296. Esto indica que el oligonucle6tido 5,-TCTTTTTTTCCT-3, (SEQ ID NO: 9) forma estructuras triplex estables con la secuencia complementaria de 12-mer (5,-AGAAAAAAAGGA-3,) (SEQ ID NO: 8) presente en pBKS, pero no con la secuencia muy relacionada de 12-mer (5,-AGAAAAAAAAGA-3,) (SEQ ID NO: 34) presente en pCOR. Esto indica que la introducci6n de una triada no can6nica unica (C*AT en este caso) puede resultar en una desestabilizaci6n completa de la estructura triplex.

Ejemplo 14

Un cultivo de siembra se produjo en un matraz Erlenmeyer sin deflectores mediante el metodo siguiente. El banco de trabajo de celulas se inocula en un matraz Erlenmeyer que contiene medio M9modG5, en una proporci6n de siembra de 0,2%v/v. La cepa se cultiva a 220 rpm en un agitador rotatorio a 37° ± 1°C durante aproximadamente 18 ± 2 horas hasta la desaparici6n de la glucosa. Esto resulta en un cultivo de siembra de 200 ml. Se espera que la densidad 6ptica del cultivo sea A600 aproximadamente 2-3.

Se crea un pre-cultivo en un primer fermentador. El cultivo de siembra se transfiere asepticamente a un prefermentador que contiene medio M9modG5 para asegurar una proporci6n de siembra de 0,2% (v/v) y se cultiva con aireaci6n y agitaci6n. La pO2 se mantiene por encima del 40% de saturaci6n. El cultivo se recoge cuando la glucosa se consume despues de 16 horas. Esto resulta en aproximadamente 30 litros de pre-cultivo. Se espera que la densidad 6ptica del cultivo sea A600 aproximadamente 2-3.

Se crea un cultivo principal en un segundo fermentador. Se transfieren asepticamente 30 litros de precultivo a un fermentador con 270 litros de medio FmodG2 esterilizado para asegurar una proporci6n de siembra de aproximadamente el 10% (v/v). El cultivo se comienza en modo discontinuo para formar biomasa. La alimentaci6n con glucosa se inicia una vez que se ha consumido el azucar inicial despues de aproximadamente 4 horas. La aireaci6n, agitaci6n, pO2 (40%), pH (6,9 ± 0,1), temperatura (37±1°C) y la alimentaci6n de glucosa se controlan con el fin de mantener una velocidad de crecimiento especifica cercana a 0,09h-1. El cultivo se termina despues de aproximadamente 35 horas de alimentaci6n. Esto resulta en aproximadamente 400 litros de cultivo. Se espera que la densidad 6ptica del cultivo sea A600 aproximadamente 100.

Se realiza una primera etapa de separaci6n, que se denomina recogida celular. La biomasa se recoge con una centrifuga de discos. El medio se concentra 3 a 4 veces para eliminar el medio de cultivo restante y se resuspende continuamente en 400 litros de tamp6n S1 esteril. Esto resulta en aproximadamente 500 litros de biomasa precondicionada. DCW = 25 ± 5 g/L.

Se realiza una segunda etapa de separaci6n, que se denomina etapa de concentraci6n. Despues de la resuspensi6n/homogeneizaci6n en tamp6n S1, las celulas se procesan de nuevo con el separador para rendir una suspensi6n de s6lidos concentrada. Esto resulta en aproximadamente 60-80 litros de suspensi6n de s6lidos lavada y concentrada. DCW = 150 ± 30 g/L ; pADN = 300 ± 60 mg/L.

Despues, se realiza una etapa de congelaci6n. La suspensi6n de s6lidos se distribuye asepticamente en bolsas FlexboyT de 20 L (llenas hasta el 50% de su capacidad) y posteriormente se congelan a -20° ± 5°C antes del procesamiento adicional. Esto resulta en una biomasa congelada. ADNp = 300 ± 60 mg/L ; forma superenrollada > 95 % .

Entonces se realiza una etapa de descongelaci6n celular. Las bolsas congeladas se calientan hasta 20°C y la suspensi6n celular se diluye hasta 40 g/L, pH 8,0 con 100 mM Tris hidrocloruro, 10 mM EDTA, 20 mM glucosa y la

suspensi6n se deja a 20 ± 2 °C durante 1 h con agitaci6n antes de la lisis celular. Esto resulta en una suspensi6n de s6lidos de biomasa descongelada. pH=8,0 ± 0,2.

Pueden utilizarse temperaturas de aproximadamente 20°C durante esta etapa.

Despues, se realiza una etapa de lisis alcalina. La etapa de lisis celular esta comprendida del bombeo de la suspensi6n celular diluida a traves de un mezclador en linea con una disoluci6n 0,2 N de NaOH-35 mM SDS (disoluci6n S2), seguido de una etapa de contacto continuo en un tubo en serpentin. La etapa de contacto continuo es para asegurar la lisis celular completa y la desnaturalizaci6n del ADN gen6mico y de las proteinas. La disoluci6n de las celulas lisadas se mezcla en linea con la disoluci6n 3 (S3) helada de 3 M acetato de potasio-2 N acido acetico, antes de recogerla en un recipiente helado agitado. La adici6n de la disoluci6n S3 resulta en la precipitaci6n de un ADN gen6mico, ARN, proteinas y KDS.

A continuaci6n, se realiza una filtraci6n del lisado. El lisado neutralizado se incuba a 5 ± 3°C durante 2 a 24 horas sin agitaci6n y se filtra a traves de un filtro de rejilla de 3,5 mm para eliminar la mayor parte del material precipitado (fase de fl6culo) seguido de una filtraci6n de profundidad como etapa de filtraci6n fina. Esto resulta en un lisado aclarado, con una concentraci6n de plasmido superenrollado de mas del 90%.

Despues, se realiza cromatografia de intercambio ani6nico. La disoluci6n del lisado aclarado se diluye con agua purificada hasta un valor de conductividad diana de 50 mS/cm, se filtra a traves de un filtro con doble capa (3 Im-0,8 Im) y se carga en una columna de cromatografia de intercambio ani6nico. Se utiliza una columna de 300 mm empaquetada con 11,0 L de resina Fractogel® TMAE HiCap (M) (Merck; #1.10316.5000). El lisado aclarado se carga en la columna y la eluci6n se realiza utilizando una etapa de gradiente de NaCl. La mayor parte de los contaminantes unidos a la columna se eluyen con una disoluci6n de NaCl a aproximadamente 61 mS/cm, y el ADN plasmidico se eluye con una disoluci6n de NaCl a aproximadamente 72 mS/cm. Esto resulta en un eluato de cromatografia de intercambio i6nico que tiene una alta concentraci6n de ADN plasmidico.

Despues, se realiza una cromatografia de afinidad de triplex. El eluato de la columna de cromatografia de intercambio ani6nico se diluye con aproximadamente 0,5 volumenes de una disoluci6n 500 mM de acetato de sodio (pH 4,2) que contiene 4,8 M de NaCl y se bombea a traves de una columna de cromatografia de afinidad de triplex equilibrada con 50 mM acetato de sodio (pH 4,5) que contiene 2 M NaCl. La columna tiene un diametro de 300 mm y contiene 10,0 L de gel THAC SephacrylT S-1000 (Amersham Biosciences; Piscataway, NJ). La columna se lava con una disoluci6n 50 mM acetato de sodio (pH 4,5) que contiene 1 M NaCl y NV1FGF se eluye con 100 mM Tris (pH 9,0) que contiene 0,5 mM EDTA. Esto resulta en un eluato de cromatografia de afinidad de triplex que tiene una alta concentraci6n de plasmido.

A continuaci6n, se realiza una etapa de cromatografia de interacci6n hidrof6bica. El eluato de la columna de cromatografia de afinidad se diluye con 3,6 volumenes de una disoluci6n 3,8 M sulfato de amonio en Tris (pH 8,0). Despues de filtrar a traves de un filtro de 0,45 Im, el filtrado se carga a 60 cm/h en una columna de interacci6n hidrof6bica (diametro 300 mm) empaquetada con 9,0 L de resina Toyopearl® Butil-650S (TosoH corp., Grove City, OH). La columna se lava con una disoluci6n de sulfato de amonio a aproximadamente 240 mS/cm y NV1FGF se eluye con sulfato de amonio a 220 mS/cm. Esto resulta en un eluato de HIC sin formas relajadas.

Segun una realizaci6n preferida, se realiza una etapa adicional de diafiltraci6n. Los materiales de diafiltraci6n estandar disponibles comercialmente son adecuados para utilizarse en este proceso, segun las tecnicas estandar conocidas en la tecnica. Un metodo de diafiltraci6n preferido es diafiltraci6n utilizando una membrana de ultrafiltraci6n con un punto de corte de peso molecular en el intervalo de 30.000 a 500.000, dependiendo del tamano del plasmido. Esta etapa de diafiltraci6n permite el intercambio de tamp6n y se realiza una concentraci6n. El eluato de la etapa 12 se concentra 3 a 4 veces mediante filtraci6n en flujo tangencial (punto de corte de la membrana, 30 kDa) hasta una concentraci6n diana de aproximadamente 2,5 a 3,0 mg/mL y se intercambia el tamp6n del concentrado por diafiltraci6n a un volumen constante con 10 volumenes de disoluci6n salina y se ajusta a la concentraci6n de plasmido diana con disoluci6n salina. La concentraci6n de NV1FGF se calcula a partir de la absorbancia a 260 nm de muestras del concentrado. La disoluci6n de NV1FGF se filtra a traves de un filtro de capsula de 0,2 Im y se almacena en recipientes en una habitaci6n fria a 2-80C hasta un procesamiento posterior. Esto rinde un concentrado purificado con una concentraci6n de ADN plasmidico de plasmido superenrollado de aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, y preferiblemente 99%. La recuperaci6n global de plasmido con este proceso es al menos 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, y 80%, con una recuperaci6n media del 60 %.

Ejemplo 15

El metodo del Ejemplo anterior que comprende una etapa de cromatografia de intercambio i6nico, una etapa de cromatografia de afinidad de triple helice, y una etapa de cromatografia hidrof6bica resulta en una preparaci6n de ADN plasmidico mas purificada comparada con los metodos conocidos previamente. Este nuevo metodo se ha comparado con metodos conocidos previamente y ha resultado en preparaciones de ADNp que tienen unas cantidades mucho menores de ADN gen6mico, ARN, proteinas y endotoxinas. Esto se refleja en la Figura 6. Estos experimentos muestran que AEC, THAC y HIC proporcionan un rendimiento de la purificaci6n sorprendentemente

alto comparado con algunas combinaciones de 2 etapas para la eliminaci6n eficaz de todos los contaminantes. La combinaci6n de estas etapas proporciona una sinergia clara en terminos de eficacia en la separaci6n del ADN plasmidico de otros materiales biol6gicos y contaminantes, tales como proteinas y endotoxinas, ARN y ADN gen6mico, asi como plasmido circular abierto. Ademas, la combinaci6n sinergica de las etapas, es decir, AEC/THAC/HIC segun la presente invenci6n permite no s6lo la obtenci6n de ADN plasmidico altamente purificado de grado farmaceutico sino tambien de composiciones de ADN plasmidico altamente puras y totalmente superenrolladas de mas del 80%, 85%, 90%, 95% y mas del 99%.

Ejemplo 16

El metodo del Ejemplo anterior que comprende una etapa de cromatografia de intercambio i6nico, una etapa de cromatografia de afinidad de triple helice, y una etapa de cromatografia hidrof6bica para la preparaci6n de una preparaci6n de ADN plasmidico altamente purificado se compara con los metodos conocidos previamente. Como se muestra en la Figura 3, el metodo segun la presente invenci6n resulta sorprendentemente en preparaciones de ADNp que tienen unas cantidades mucho menores de ADN gen6mico, ARN, proteinas y endotoxinas en el intervalo de sub-ppm. Ademas, como se muestra en la Figura 4, el proceso de la presente invenci6n muestra una calidad del producto obtenido a hasta 10g.

Ejemplo 17

La etapa de diafiltraci6n como se describe en el Ejemplo 14 se realiza segun las condiciones siguientes: los tampones para la etapa a y para la etapa b se utilizaron para determinar las mejores condiciones para:

iii) una primera diafiltraci6n (etapa a) frente a 12,5 a 13,0 volumenes de 50 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7,4 (denominado tamp6n I), y

iv) Realizar una segunda diafiltraci6n del retenido de la etapa a) anterior (etapa b) frente a 3,0 a 3,5 volumenes de excipiente salino (150 mM NaCl).

Esta etapa de diafiltraci6n alternativa segun la presente invenci6n elimina de manera eficaz y extensa el sulfato de amonio y el EDTA. Tambien, posteriormente a estas etapas de diafiltraci6n, se obtiene una concentraci6n diana apropiada de NaCl de aproximadamente 150mM y una concentraci6n final de Tris entre 400 IM y 1 mM. Los ejemplos de composiciones de formulaciones de ADN plasmidico se proporcionan en la Tabla 6 siguiente, y

Tabla 6

Especies

Concentraci6n final

1a diafiltraci6n

2a diafiltraci6n Ingrediente Farmaceutico Activo

Sulfato de amonio

10 IM < 1 IM < 1 IM

AEDT

4 IM < 1 IM < 1 IM

Tris

50 mM 1.48 IM 740 IM

NaCl

154 mM 154 mM 154 mM

Ejemplo 18

Se fabric6 un lote tecnico de ADN plasmidico NV1FGF API (ingredientes farmaceuticos activos) denominado LS06 segun el Ejemplo 13 con la etapa del proceso de diafiltraci6n descrito en el Ejemplo 17. El eluato se diafiltra en primer lugar a aproximadamente 2 mg de API /mL frente a aproximadamente 13 volumenes de tamp6n I y el retenido resultante se diafiltr6 frente a aproximadamente 3 volumenes de excipiente salino. El retenido final se filtr6 entonces a traves de un filtro de 0,2 Im y se ajust6 a 1 mg/mL. El API final (pH 7,24) se almacen6 en una botella de vidrio Duran a 5°C hasta la fabricaci6n de DP.

Se realiz6 un estudio de estabilidad en muestras de LS06 almacenadas en botellas de vidrio Duran (API) asi como en viales de 8 mL utilizados para la fabricaci6n del Producto Farmaceutico. Despues de 90 dias a +5°C el grado tanto de despurinaci6n como de circularizaci6n abierta en todas las muestras fue dificilmente detectable (: 0,3 %). Despues de 90 dias a +25°C las velocidades de despurinaci6n y de circularizaci6n abierta de las muestras de LS06 tambien fueron bastante bajas . Las velocidades de despurinaci6n y circularizaci6n abierta calculadas de este estudio fueron de :1% por mes,

Este estudio demuestra que el perfil de estabilidad del ADN plasmidico NV1FGF es muy estable en la formulaci6n de la presente invenci6n en la que los valores de pH se mantienen a aproximadamente 7 a 7,5. Mientras que la velocidad de despurinaci6n y las velocidades de mella del plasmido generalmente se aceleran mucho a +25°C, el Solicitante ha mostrado que el ADN plasmidico permanece estable en una forma no degradada durante un periodo de tiempo largo incluso a RT.

La especificaci6n debe entenderse a la luz de las indicaciones de las referencias citadas en la especificaci6n. Las realizaciones en la especificaci6n proporcionan una ilustraci6n de las realizaciones de la invenci6n y no debe interpretarse que limitan el alcance de la invenci6n. El experto en la tecnica reconoce facilmente que la invenci6n engloba muchas otras realizaciones. Todas las publicaciones y patentes citadas en esta descripci6n se incorporan por referencia en su totalidad. Cuando el material incorporado por referencia contradiga o sea inconsistente con esta especificaci6n, la especificaci6n se impondra a dicho material. La cita de cualquier referencia en la presente memoria no supone una admisi6n de que dichas referencias sean tecnicas anteriores a la presente invenci6n.

A no ser que se indique otra cosa, todos los numeros que expresan cantidades de ingredientes, condiciones de reacci6n, y asi sucesivamente, utilizados en la especificaci6n, incluyendo las reivindicaciones, deben entenderse en todos los casos que estan modificados por el termino "aproximadamente." De acuerdo con esto, a no ser que otra cosa indique lo contrario, los parametros numericos son aproximaciones y pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas pretendidas que se quieren obtener por la presente invenci6n. Por ultimo, y sin intenci6n de limitar la aplicaci6n de la doctrina de equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parametro numerico debe interpretarse a la luz de las aproximaciones del numero de digitos significativos y de redondeo ordinario.

A no ser que se indique otra cosa, el termino "al menos" que precede una serie de elementos debe entenderse que se refiere a cada elemento de la serie. Los expertos en la tecnica reconoceran, o seran capaces de descubrir utilizando s6lo la experimentaci6n rutinaria, muchos equivalentes de las realizaciones especificas de la invenci6n descritas en la presente memoria. Se pretende que dichos equivalentes esten englobados por las reivindicaciones siguientes.

REFERENCIAS

Patentes:

WO 98/00815 (utilizaci6n de T [Tee], Pasteur Merieux Serums et Vaccins [Sueros y Vacunas])

WO 96/02658, A.L. Lee et al., A Method for Large Scale Plasmid Purification (1996).

WO 97/23601, N.C. Wan et al., Method for Lysing Cells (1997).

WO 99/29832, D.S. McNeilly, Method for purifying plasmid ADN and plasmid ADN substantially free of genomic ADN (1999).

Patente de EEUU No. 6.214.568, D.S. McNeilly Method for purifying plasmid ADN and plasmid ADN substantially free of genomic ADN (2001).

Publicaciones:

H.C.

Birnboim y J. Doly, A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid ADN Nucleic Acid Research 7(6):1513-1523 (1979).

D.

Stephenson, F. Norman y R.H. Cumming, Shear thickening of ADN in SDS lysates Bioseparation 3:285-289 (1993).

M.S. Levy, L.A.S. Ciccolini, S.S.S. Yim, J.T. Tsai, N. Titchener-Hooker, P. Ayazi Shamlou y P. Dunnill, The effects of material properties and fluid flow intensity on plasmid ADN recovery during cell lysis Chemical Engineering Science 54:3171-3178 (1999).

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Gencell SAS

<120> Metodo de Preparaci6n de ADN Plasmidico de Grado Farmaceutico

<130> GC03001-PCT

5 <150> US 60/503.464

<151>

<150> US 60/563.008

<151>

<160> 34

10 <170> Versi6n PatentIn 3.2

<210> 1

<211> 25

<212> ADN

<213> Artificial

15 <220>

<223> Oligonucle6tido Sintetico

<400> 1 gaggcttctt cttcttcttc ttctt 25

<210> 2 20 <211> 19

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucle6tido Sintetico

25 <400> 2 aagggaggga ggagaggaa 19

<210> 3

<211> 19

<212> ADN 30 <213> Artificial

<220>

<223> Oligonucle6tido Sintetico

<400> 3 aaggagagga gggagggaa 19

35 <210> 4

<211> 19

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 40 <223> Oligonucle6tido Sintetico

<400> 4 ttggtgtggt gggtgggtt 19

<210> 5

<211> 19 45 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucle6tido Sintetico

<400> 5 cttcccgaag ggagaaagg 19

<210> 6

<211> 19 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucle6tido Sintetico

<400> 6 10 gaagggcttc cctctttcc 19

<210> 7

<211> 13

<212> ADN

<213> Artificial

15 <220>

<223> Oligonucle6tido Sintetico

<400> 7 gaaaaaggaa gag 13

<210> 8 20 <211> 12

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucle6tido Sintetico

25 <400> 8 agaaaaaaag ga 12

<210> 9

<211> 12

<212> ADN 30 <213> Artificial

<220>

<223> Oligonucle6tido Sintetico

<400> 9 tctttttttc ct 12

35 <210> 10

<211> 14

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 40 <223> Oligonucle6tido Sintetico

<400> 10 aagaaaaaaa agaa 14

<210> 11

<211> 14 45 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Nucle6tido Sintetico

<400> 11 50 ttcttttttt tctt 14

<210> 12 <211> 17 <212> ADN <213> Artificial

5

<220> <223> Oligonucle6tido Sintetico

<400> 12 aaaaaaggga ataaggg

17

10

<210> 13 <211> 58 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Oligonucle6tido Sintetico

15

<400> 13 gatccgaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa gaagaagg 58

20

<210> 14 <211> 58 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Oligonucle6tido Sintetico

<400> 14 aattccttct tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct tcttcttctt cttcttcg

58

25

<210> 15 <211> 51 <212> ADN <213> Artificial

30

<220> <223> Oligonucle6tido Sintetico

<400> 15 gaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga a

51

35

<210> 16 <211> 17 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Oligonucle6tido Sintetico

40

<400> 16 tgaccggcag caaaatg 17

<210> 17 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial

45

<220> <223> Oligonucle6tido Sintetico

<400> 17 ccgaattctg gggaccaaag cagtttc

27

50

<210> 18 <211> 27

<212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Oligonucle6tido Sintetico

5

<400> 18 ccaagcttca ctgttcacga cgggtgt 27

10

<210> 19 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> 5-metilcitosina

<400> 19 gaggcttctt cttcttcttc ttctt

25

15

<210> 20 <211> 48 <212> ADN <213> Artificial

20

<220> <223> Oligonucle6tido Sintetico

<400> 20 ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga ggaggaggag gaggagga

48

25

<210> 21 <211> 50 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Oligonucle6tido Sintetico

30

<400> 21 gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga 50

<210> 22 <211> 58 <212> ADN <213> Artificial

35

<220> <223> Oligonucle6tido Sintetico

<400> 22 gatccgagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagaggg

58

40

<210> 23 <211> 58 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Oligonucle6tido Sintetico

45

<400> 23 aattccctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctcg 58

50

<210> 24 <211> 58 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Oligonucle6tido Sintetico

<400> 24 gatccggagg aggaggagga ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga ggaggagg

58

5

<210> 25 <211> 58 <212> ADN <213> Artificial

10

<220> <223> Oligonucle6tido Sintetico

<400> 25 aattcctcct cctcctcctc ctcctcctcc tcctcctcct cctcctcctc ctcctccg

58

15

<210> 26 <211> 50 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Oligonucle6tido Sintetico

20

<400> 26 ggagaggagg aggaggagga ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga 50

<210> 27 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial

25

<220> <223> Oligonucle6tido Sintetico

<400> 27 aatgcctcct cctcctcctc ctcct

25

30

<210> 28 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Oligonucle6tido Sintetico

35

<400> 28 agtgctctct ctctctctct ctctct 26

40

<210> 29 <211> 66 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Oligonucle6tido Sintetico

<400> 29

45 <210> 30

<211> 66

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucle6tido Sintetico

<400> 30

5

<210> 31 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial

10

<220> <223> Oligonucle6tido Sintetico

<400> 31 acagtcataa gtgcggcgac g

21

15

<210> 32 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Oligonucle6tido Sintetico

20

<400> 32 gaagaagagg aagaagaaga agaagaagaa ggaagagaa 39

<210> 33 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial

25

<220> <223> Oligonucle6tido Sintetico

<400> 33 gaagaagaag aagaagaaga a

21

30

<210> 34 <211> 12 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Oligonucle6tido Sintetico

35

<400> 34 agaaaaaaaa ga 12

Claims (28)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un dispositivo de lisis celular alcalina continua que comprende:

   -

   un primer mezclador o inyector capaz de inyectar una disoluci6n de lisado en la direcci6n opuesta de una suspensi6n celular;

   -

   un primer tubo de pequeno diametro para generar un flujo turbulento dentro de la mezcla;

   -

   un segundo tubo de gran diametro para generar un flujo laminar dentro de la mezcla;

   -

   un segundo mezclador o inyector para inyectar la disoluci6n neutralizante en un extremo y recoger en el otro extremo la mezcla.

2. 2.

   El dispositivo de la reivindicaci6n 1, en donde se selecciona el diametro de los tubos e inyectores para controlar los caudales de las mezclas dentro de flujos turbulentos y laminares.

3. 3.

   El dispositivo de lisis celular alcalina continua de la reivindicaci6n 1 o 2, que ademas comprende una bomba para inyectar o bombear la suspensi6n celular para ponerla en contacto en la direcci6n contraria con la disoluci6n celular.

4. 4.

   El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en donde el primer mezclador o inyector es un mezclador o inyector en linea.

5. 5.

   El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en donde el primer mezclador es un tubo en T.

6. 6.

   El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en donde la mezcla de la suspensi6n celular y la disoluci6n de lisado fluyen a traves del primer tubo bajo un flujo turbulento durante corto tiempo.

7. 7.

   El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en donde el primer tubo tiene un diametro inferior a 1cm, preferiblemente entre 2 y 8 mm, y mas preferiblemente alrededor de 6 mm, y una longitud de 1 a 10 m, y preferiblemente de 2 a 6m.

8. 8.

   El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en donde la mezcla se somete al flujo turbulento durante 1 a 10 s, y preferiblemente de 2 a 5 s, y mas preferiblemente 2,5 s.

9. 9.

   El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el segundo tubo es un tubo en serpentin capaz de generar un flujo laminar para permitir el contacto continuo de la disoluci6n alcalina y la suspensi6n celular y para asegurar la lisis celular completa.

10. 10.

    El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el periodo de contacto continuo es de entre 30 s a 2 min, preferiblemente entre 1 min a 1 min 30 s, y preferiblemente de 1min 20s.

11. 11.

    El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en donde el segundo tubo tiene un diametro inferior a 1cm, preferiblemente entre 10 y 20mm, o entre 12,5 y 19 mm, y mas preferiblemente igual a 16mm, y una longitud de 5 a 30 m, y preferiblemente de 13 a 23 m.

12. 12.

    El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en donde el tercer tubo tiene un diametro inferior a 1cm, preferiblemente entre 2 a 10 mm, mas preferiblemente entre 5 a 8 mm, y una longitud entre 1 a 10 m y mas preferiblemente entre 2 a 4 m.

13. 13.

    El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en donde el segundo mezclador o inyector tiene forma de Y y en linea con las celulas lisadas para inyectar una disoluci6n resultante en la precipitaci6n de un ADN, ARN gen6mico, y proteinas.

14. 14.

    El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 que se conecta de forma operable a un tanque para fermentaci6n.

15. 15.

    Un metodo de lisado de celulas que comprende hacer fluir las celulas a traves de un dispositivo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

16. 16.

    El metodo de la reivindicaci6n 15, en el que la disoluci6n de lisis es una disoluci6n que contiene un agente de lisis seleccionado del grupo que consiste en un alcali, un detergente, un disolvente organico y una enzima o una mezcla de estos.

17. 17.

    El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 15 y 16 que ademas comprende al menos dos etapas cromatograficas seleccionada de cromatografia de intercambio i6nico, cromatografia de afinidad de triple helice y cromatografia de interacci6n hidrof6bica.

18. 18.

    El metodo de la reivindicaci6n 17 en donde la cromatografia de intercambio i6nico, la cromatografia de afinidad de triple helice y la cromatografia de interacci6n hidrof6bica ocurren en ese orden.

19. 19.

    El metodo de la reivindicaci6n 17, en el que la primera cromatografia realizada esta precedida de una filtraci6n del lisado.

20. 20.

    El metodo de la reivindicaci6n 17, en el que la primera cromatografia realizada esta precedida de la eliminaci6n del fl6culo.

21. 21.

    El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, que es susceptible de incrementar su escala hasta la fabricaci6n a gran escala.

22. 22.

    Un metodo a gran escala de fabricaci6n de ADN plasmidico de elevada pureza, en el que las celulas hospedantes que contienen plasmido se hacen fluir a traves de un medio para flujo turbulento para mezclar rapidamente una suspensi6n celular con una disoluci6n que lisa las celulas; (b) a continuaci6n las celulas se hacen fluir a traves de un pedio para flujo laminar para permitir incubar una mezcla formada en (a) sin agitaci6n sustancial, en donde la mezcla de celulas formada en (a) a continuaci6n se hace fluir desde el medio para flujo turbulento hacia el medio para flujo laminar y (c) se pone en contacto a traves de un medio para anadir una segunda disoluci6n que neutraliza la disoluci6n de lisado, en donde la mezcla de celulas incubadas en (b) fluye des desde le medio para flujo laminar hacia el medio para anadir una segunda disoluci6n, y los plasmidos tal como se liberan de las celulas se separan por cromatografia de intercambio i6nico, cromatografia de afinidad de triple helice y cromatografia de interacci6n hidrof6bica que se producen en ese orden.

23. 23.

    El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22, que comprende ademas una etapa anterior de eliminaci6n del fl6culo haciendo pasar la disoluci6n a traves de un filtro de rejilla y mediante una filtraci6n de profundidad.

24. 24.

    El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 23, que comprende ademas una etapa de diafiltraci6n despues de la ultima etapa cromatografica.

25. 25.

    El metodo de la reivindicaci6n 24, en donde la etapa de diafiltraci6n es para obtener la sal, tamp6n y valores de pH apropiados.

26. 26.

    El metodo de la reivindicaci6n 24 o 25, en donde la etapa de diafiltraci6n comprende las etapas siguientes:

    recoger la disoluci6n de la ultima etapa cromatografica;

    realizar una primera etapa de diafiltraci6n frente a tamp6n Tris/NaCl;

    realizar una segunda etapa de diafiltraci6n frente a disoluci6n salina en condiciones adecuadas para controlar la concentraci6n final del tamp6n y para estabilizar el pH de la formulaci6n final de ADN plasmidico.

27. 27.

    El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 26, en el que las etapas cromatograficas se realizan en soporte s6lido que es cualquier material organico, inorganico o compuesto, poroso, superporoso o no poroso, adecuado para separaciones cromatograficas, que esta derivatizado con poli(alquenglicoles), alcanos, alquenos, alquinos, arenos u otras moleculas que confieren un caracter hidrof6bico al soporte.

28. 28.

    El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 15 a 26, en el que la cromatografia de interacci6n hidrof6bica se realiza en un lecho fijo o en un lecho expandido.

    FIGURA 1

    FIGURA 2

    VISTA GENERAL DEL MEZCLADOR M1

    CLDÜw! 3

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