ES2376337T3

ES2376337T3 - Anticuerpos monoclonales neutralizantes de la toxina del �?ntrax humanos y métodos para su uso.

Info

Publication number: ES2376337T3
Application number: ES05780195T
Authority: ES
Inventors: Herman Groen; Christine Cool-Kebbedies; Kunja S. Slopsema; Hans Westra
Original assignee: IQ Therapeutics BV
Current assignee: IQ Therapeutics BV
Priority date: 2004-03-03
Filing date: 2005-03-03
Publication date: 2012-03-13
Anticipated expiration: 2025-03-03
Also published as: WO2005120567A3; ATE530196T1; AU2005251535A1; US20110059098A1; CA2560759A1; EP1729806B1; EP2163257A1; US20060258842A1; WO2005120567A2; EP1729806A2; US7658925B2

Abstract

Un anticuerpo monoclonal totalmente humano aislado o un fragmento funcional de éste, que se une a un epitopo en una región del polipéptido del antígeno protector de Bacillus anthracis y neutraliza la toxina letal de Bacillus anthracis, en el que dicho anticuerpo o su fragmento funcional tiene una cadena pesada con tres CDR, comprendiendo las CDR KKPGA (SEQ ID NO:11), SNAIQWVRQAPGQRLEW (SEQ ID NO:12) y YMELSSLR (SEQ ID NO:13), respectivamente, y tiene una cadena ligera con tres CDR, comprendiendo las CDR LTQSPGTLSLS (SEQ ID NO:14), SYSSLAW (SEQ ID NO:15) y GPDFTLTIS (SEQ ID NO:16), respectivamente.

Description

Anticuerpos monoclonales neutralizantes de la toxina del ántrax humanos y métodos para su uso.

Campo de la invención

Esta invención se refiere, en general, a anticuerpos anti-ántrax, así como a métodos para su uso.

Antecedentes

Bacillus anthracis, la virulenta bacteria formadora de endoesporas, muy conocida por su uso reciente como arma de bioterrorismo, ha infestado a los seres humanos y al ganado desde la antigüedad (Friedlander, 2000). La bacteria se ha asociado con el descubrimiento de las ciencias de la bacteriología y la inmunología, destancándose la famosa demostración de Pasteur de la protección de ovejas con vacunas en Pouilly-le-Fort, Francia. Desde entonces, la atención que ha recibido Bacillus anthracis en gran medida ha girado entorno a sus propiedades, que hacen que sea perfectamente adecuada como arma biológica porque forma esporas termorresistentes que son fáciles de producir y de transportar, y pueden infectar a través de la vía de aerosol.

El documento US 2004/009178 A1 se refiere a algunos anticuerpos neutralizantes humanos descritos como útiles como antitoxinas o antiinfecciosos con respecto a agentes infecciosos, por ejemplo ántrax, botulismo, viruela, virus de la encefalitis equina venezolano (VEEV), virus del Nilo occidental (WNV) y similares.

Cirino, N.M. et al., Infection and Immunity, junio de 1999, vol. 67, nº 6, pp. 2957-2963 se refiere a la interrupción de la unión de la toxina del ántrax mediante el uso de inhibidores competitivos y anticuerpos humanos.

Balint, R.F. y Larrick, J.W., Gene, 137 (1993), pp. 109-118 se refiere a métodos para modificar anticuerpos para que tengan un contacto de mayor afinidad con antígenos de proteínas, denominados mutagénesis parsimoniosa.

El documento WO 2005/023177 se refiere a anticuerpos monoclonales humanos contra el antígeno protector de Bacillus anthracis.

El documento WO 03/037370 describe una composición antigénica que comprende un antígeno protector y un factor letal, en la que uno del antígeno protector y/o factor letal carece de un sitio de unión funcional. Se mencionan anticuerpos contra estos polipéptidos.

Little, M. et al., Immunology Today (2000), vol. 21, nº 8, pp. 364-370 se refiere a la producción de anticuerpos monoclonales humanos y fragmentos recombinantes.

Sumario de la invención

La invención se basa, en parte, en el descubrimiento de anticuerpos monoclonales neutralizantes de la toxina del ántrax totalmente humanos. El anticuerpo monoclonal (mAb) de la invención se une al polipéptido del antígeno protector (AP) de Bacillus anthracis y neutraliza la toxina letal (TxLe). Esta descripción también proporciona un mAb que se une al polipéptido del factor letal (FL) de Bacillus anthracis y neutraliza la toxina letal (TxLe). Los ejemplos de anticuerpos monoclonales incluyen IQNPA e IQNLF descritos en la presente.

La presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal totalmente humano aislado o un fragmento funcional de éste, que se une a un epitopo en una región del polipéptido del antígeno protector y neutraliza la toxina letal de Bacillus anthracis, en el que dicho anticuerpo o su fragmento funcional tiene una cadena pesada con tres CDR que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en KKPGA (SEQ ID NO:11), SNAIQWVRQAPGQRLEW (SEQ ID NO:12) y YMELSSLR (SEQ ID NO:13), y tiene una cadena ligera con tres CDR que comprenden una secuencia una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en LTQSPGTLSLS (SEQ ID NO:14), SYSSLAW (SEQ ID NO:15) y GPDFTLTIS (SEQ ID NO:16).

Un anticuerpo IQNPA contiene un polipéptido de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 o un fragmento de ésta, y la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:1 o un fragmento de ésta. Preferiblemente, el polipéptido de cadena pesada del anticuerpo IQNPA tiene la secuencia de aminoácidos de los restos aminoácidos 1-106 de SEQ ID NO:2, y más preferiblemente los restos aminoácidos 31-106 de SEQ ID NO:2. Un anticuerpo IQNPA contiene un polipéptido de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4 o un fragmento de ésta, y la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:3 o un fragmento de ésta. Preferiblemente, el polipéptido de cadena ligera del anticuerpo IQNPA tiene la secuencia de aminoácidos de los restos aminoácidos 1-97 de SEQ ID NO:2, y más preferiblemente los restos aminoácidos 24-97 de SEQ ID NO:2.

También se incluye en la invención un anticuerpo monoclonal totalmente humano aislado o un fragmento de éste, que tiene una cadena pesada con tres CDR que contienen la secuencia de aminoácidos KKPGA (SEQ ID NO:11); SNAIQWVRQAPGQRLEW (SEQ ID NO:12); YMELSSLR (SEQ ID NO:13), o una cadena ligera con tres CDR que contienen la secuencia de aminoácidos LTQSPGTLSLS (SEQ ID NO:14); SYSSLAW (SEQ ID NO:15); GPDFTLTIS (SEQ ID NO:16). El anticuerpo se une a un epitopo en una región del polipéptido del antígeno protector y neutraliza el polipéptido de la toxina letal de Bacillus anthracis.

Como alternativa, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo que se une al mismo epitopo que IQNPA. Por ejemplo, el anticuerpo compite con la unión del anticuerpo monoclonal IQNPA al dominio 4 de un polipéptido del antígeno protector.

La unión al antígeno protector significa que el anticuerpo monoclonal interacciona de modo específico con una porción del polipéptido del antígeno protector. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal se une al dominio 4 de un polipéptido del antígeno protector. Una interacción específica significa que el anticuerpo monoclonal tiene una afinidad de unión, siendo dicha afinidad de unión de aproximadamente 10-6 M a aproximadamente 10-14 M. Preferiblemente, la afinidad de unión es de aproximadamente 10-8 M a aproximadamente 10-12 M. Por ejemplo, la afinidad de unión es de aproximadamente 10-10 M. La afinidad de unión se mide mediante métodos conocidos en la técnica.

La neutralización de la toxina letal se define por un aumento en la supervivencia de las células después de una exposición a Bacillus anthracis. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal disminuye la formación de complejos entre el antígeno protector y el factor letal (FL) o el factor de edema (FE), disminuyendo con ello la translocación de FL y FE hacia el citosol celular.

Opcionalmente, el anticuerpo monoclonal inhibe la unión de (i) AP a las células diana, (ii) AP al receptor de la toxina del ántrax (RTA), o (iii) del factor letal al antígeno protector. Como alternativa, el mAb inhibe la unión de AP a AP, evitando con ello la heptamerización.

El anticuerpo monoclonal es 2, 4, 8, 10, 15, 20 , 25 o más veces eficaz para neutralizar el polipéptido de la toxina letal del Bacillus anthracis comparado con un antisuero de Bacillus anthracis natural. Un antisuero de Bacillus anthracis natural se deriva, por ejemplo, de sujetos inmunizados con una vacuna del ántrax, tal como AVA o AVP. Los ejemplos de antisueros de Bacillus anthracis incluyen AVR414.

La invención también incluye métodos para prevenir o reducir el riesgo de desarrollar una infección por Bacillus anthracis en un sujeto, identificando un sujeto en riesgo de desarrollar una infección por Bacillus anthracis y administrando al sujeto una composición que contiene un anticuerpo monoclonal humano de la invención, tal como IQNPA, o una combinación de IQNPA e IQNLF.

La invención también incluye métodos para aliviar un síntoma de una infección por Bacillus anthracis en un sujeto, identificando un sujeto que padece una infección por Bacillus anthracis y administrando al sujeto una composición que contiene un anticuerpo monoclonal humano de la invención, tal como IQNPA. Opcionalmente, también se administra al sujeto un antibiótico, tal como ciprofloxacina, doxiciclina, amoxicilina, o penicilina G procaína.

También se incluye en la invención un método para la inmunización pasiva de un sujeto contra Bacillus anthracis, mediante la administración a un sujeto de una composición que contiene el anticuerpo monoclonal de la invención, tal como mAb IQNPA.

El anticuerpo monoclonal se administra antes de la exposición a Bacillus anthracis. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal se administra al menos 1 año antes de la exposición a Bacillus anthracis. El anticuerpo monoclonal se administra 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses

o más antes de la exposición a Bacillus anthracis. Como alternativa, el anticuerpo monoclonal se administra después de la exposición a Bacillus anthracis. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal se administra al menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 8 horas o mas después de la exposición a Bacillus anthracis. El anticuerpo monoclonal se administra 1 día, 2 días, 3 días, 4 días o más después de la exposición a Bacillus anthracis.

El sujeto sufre o está en riesgo de desarrollar una infección por Bacillus anthracis. El sujeto es un mamífero, tal como un ser humano, un primate, un ratón, una rata, un perro, un gato, una vaca, un caballo, un cerdo.

Un sujeto que padece o que está en riesgo de desarrollar Bacillus anthracis se identifica mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, aislando a B. anthracis de la sangre, de lesiones dérmicas, o de secreciones respiratorias, o midiendo los anticuerpos específicos en la sangre. Los síntomas de una infección por B. anthracis incluyen fiebre (una temperatura mayor que 37,8 ºC), escalofríos o sudores nocturnos, síntomas similares a la gripe, tos, normalmente una tos no productiva, molestias en el pecho, falta de aliento, fatiga, dolores musculares, dolor de garganta, seguido de dificultades para tragar, aumento del tamaño de los nódulos linfáticos, dolor de cabeza, náuseas, pérdida del apetito, dolor abdominal, vómitos, o diarrea, o en el caso de contracción cutánea, una llaga, en especial en la cara, los brazos o las manos, que comienza como un bulto en relieve y se desarrolla en una úlcera indolora con un área negra en el centro.

La invención también proporciona un método para detectar la presencia de una bacteria de Bacillus anthracis en una muestra, poniendo en contacto una muestra de la cual se sabe o se sospecha que contiene una bacteria de Bacillus anthracis con el anticuerpo monoclonal según la invención, y detectando la presencia o la ausencia de un complejo de anticuerpo-bacteria. La presencia de un complejo de anticuerpo-bacteria indica que la muestra contiene una bacteria de Bacillus anthracis. En contraste, la ausencia de un complejo de anticuerpo-bacteria indica que la muestra no contiene una bacteria de Bacillus anthracis. La muestra es, por ejemplo, sangre, una lesión dérmica, secreciones respiratorias, fluido vesicular o fluido cerebroespinal. La muestra se pone en contacto con el anticuerpo monoclonal in vitro o in vivo. El anticuerpo monoclonal es, por ejemplo, IQNPA. Opcionalmente, el anticuerpo monoclonal está marcado.

También se proporciona una composición, y una composición de vacuna pasiva que contiene el anticuerpo monoclonal según la invención y un vehículo. La invención también incluye un kit que contiene, en uno o más recipientes, el anticuerpo monoclonal según la invención.

En otro aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que incluye la secuencia de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3, o un fragmento, homólogo, análogo o derivado de éstas. El ácido nucleico puede incluir, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido al menos 99% idéntico a un polipéptido que incluye las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4, o una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido al menos 95% idéntico a un polipéptido que incluye las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4. El ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un fragmento de ADN genómico, o una molécula de ADNc. Preferiblemente, el ácido nucleico aparece en la naturaleza. La invención también proporciona una secuencia de ácido nucleico que es complementaria con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3.

También se incluye en la invención un vector que contiene uno o más de los ácidos nucleicos descritos en la presente, y una célula que contiene los vectores o los ácidos nucleicos descritos en la presente.

En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido aislado que incluye la secuencia de SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4, o un fragmento, homólogo, análogo o derivado de éstas. El polipéptido puede incluir, por ejemplo, una secuencia de aminóacidos al menos 99% idéntica a un polipéptido de SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4, o un polipéptido al menos 95% idéntico a un polipéptido que incluye las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4.

La invención también se dirige a células hospedantes transformadas con un vector que comprende cualquiera de las moléculas de ácidos nucleicos descritas anteriormente.

Sumario de un aspecto de esta descripción

Esta descripción también se referie a un anticuerpo IQNLF que contiene un polipéptido de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6 o un fragmento de ésta, y la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:5 o un fragmento de ésta. Preferiblemente, el polipéptido de cadena pesada del anticuerpo IQNLF tiene la secuencia de aminoácidos de los restos aminoácidos 1-106 de SEQ ID NO:6, y más preferiblemente los restos aminoácidos 31-106 de SEQ ID NO:6. Un anticuerpo IQNLF contiene un polipéptido de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8 o un fragmento de ésta, y la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:7 o un fragmento de ésta. Preferiblemente, el polipéptido de cadena ligera del anticuerpo IQNLF tiene la secuencia de aminoácidos de los restos aminoácidos 1-97 de SEQ ID NO:2, y más preferiblemente los restos aminoácidos 24-97 de SEQ ID NO:2.

Además, esta descripción proporciona un anticuerpo monoclonal totalmente humano aislado o un fragmento de éste, que tiene una cadena pesada con tres CDR que contienen la secuencia de aminoácidos VQPGG (SEQ ID NO:17); SYAMSWVRQAPGKGLEW (SEQ ID NO:18); YMQMNSL (SEQ ID NO:19), o una cadena ligera con tres CDR que contienen la secuencia de aminoácidos TQSPDFQSVSP (SEQ ID NO:20); SSLHWYQ (SEQ ID NO:21); DFTLTINSL (SEQ ID NO:22). El anticuerpo se une a un epitopo en una región del polipéptido del factor letal y neutraliza la toxina letal de Bacillus anthracis.

Como alternativa, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo que se une al mismo epitopo que IQNLF. Por ejemplo, el anticuerpo compite con la unión del anticuerpo monoclonal IQNLF a un polipéptido del FL.

La unión al FL significa que el mAb interacciona de modo específico con una porción del polipéptido de FL. Una interacción específica significa que el anticuerpo monoclonal tiene una afinidad de unión, siendo dicha afinidad de unión de aproximadamente 10-6 M a aproximadamente 10-14 M. Preferiblemente, la afinidad de unión es de aproximadamente 10-8 M a aproximadamente 10-12 M. Por ejemplo, la afinidad de unión es de aproximadamente 1010 M. La afinidad de unión se mide mediante métodos conocidos en la técnica.

La invención también incluye métodos para prevenir o reducir el riesgo de desarrollar una infección por Bacillus anthracis en un sujeto, identificando un sujeto en riesgo de desarrollar una infección por Bacillus anthracis y administrando al sujeto una composición que contiene un anticuerpo monoclonal humano de la invención, tal como IQNLF, o una combinación de IQNLF e IQNPA.

La invención también incluye métodos para aliviar un síntoma de una infección por Bacillus anthracis en un sujeto, identificando un sujeto que padece una infección por Bacillus anthracis y administrando al sujeto una composición que contiene un anticuerpo monoclonal humano de la invención, tal como un anticuerpo IQNLF. Opcionalmente, también se administra al sujeto un antibiótico, tal como ciprofloxacina, doxiciclina, amoxicilina, o penicilina G procaína.

También se incluye en la invención un método para la inmunización pasiva de un sujeto contra Bacillus anthracis, mediante la administración a un sujeto de una composición que contiene el anticuerpo monoclonal de la invención, tal como mAb IQNLF.

La invención también proporciona un método para detectar la presencia de una bacteria de Bacillus anthracis en una muestra, poniendo en contacto una muestra de la cual se sabe o se sospecha que contiene una bacteria de Bacillus anthracis con el anticuerpo monoclonal según la invención, y detectando la presencia o la ausencia de un complejo de anticuerpo-bacteria. La presencia de un complejo de anticuerpo-bacteria indica que la muestra contiene una bacteria de Bacillus anthracis. En contraste, la ausencia de un complejo de anticuerpo-bacteria indica que la muestra no contiene una bacteria de Bacillus anthracis. La muestra es, por ejemplo, sangre, una lesión dérmica, secreciones respiratorias, fluido vesicular o fluido cerebroespinal. La muestra se pone en contacto con el anticuerpo monoclonal in vitro o in vivo. El anticuerpo monoclonal es, por ejemplo, IQNLF. Opcionalmente, el anticuerpo monoclonal está marcado.

En otro aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que incluye la secuencia de SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:7, o un fragmento, homólogo, análogo o derivado de éstas. El ácido nucleico puede incluir, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido al menos 99% idéntico a un polipéptido que incluye las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:8, o una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido al menos 95% idéntico a un polipéptido que incluye las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:8. El ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un fragmento de ADN genómico, o una molécula de ADNc. Preferiblemente, el ácido nucleico aparece en la naturaleza. La invención también proporciona una secuencia de ácido nucleico que es complementaria con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:7.

En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido aislado que incluye la secuencia de SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:8, o un fragmento, homólogo, análogo o derivado de éstas. El polipéptido puede incluir, por ejemplo, una secuencia de aminóacidos al menos 99% idéntica a un polipéptido de SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:8, o un polipéptido al menos 95% idéntico a un polipéptido que incluye las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:8.

A menos que se indique lo contrario, todos los términos y las expresiones técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que el que entienden habitualmente los expertos en la técnica a la cual pertenece esta invención. Aunque pueden utilizarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente en la práctica o el ensayo de la presente invención, los métodos y materiales adecuados se describen a continuación. En caso de conflicto, dominará la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, los métodos y los ejemplos son sólo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un diagrama de barras que muestra los resultados de un ensayo de neutralización de la toxina del ántrax (primer experimento) que demuestra que IQNPA-1 e IQNPA-2 son eficaces para neutralizar la toxina in vitro.

La figura 2 es un diagrama de barras que muestra los resultados de un ensayo de neutralización de la toxina del ántrax (segundo experimento) que demuestra que IQNPA-1 e IQNPA-2 son eficaces para neutralizar la toxina in vitro.

La figura 3 es un diagrama de barras que muestra los resultados de un ensayo de neutralización de la toxina del ántrax que demuestra que IQNPA-1 e IQNPA-2 son eficaces para neutralizar la toxina in vitro después de dejar que el AP se una a las células diana durante 2 horas.

La figura 4 es un diagrama de barras que muestra los resultados de un ensayo de neutralización de la toxina del ántrax que demuestra que IQNPA-1 e IQNPA-2 son eficaces para neutralizar la toxina in vitro después de dejar que el AP se una a las células diana durante 3 horas.

La figura 5 es un diagrama de barras que muestra los resultados de un ensayo de neutralización de la toxina del ántrax in vitro que demuestra que IQNLF-1 e IQNLF-2 son eficaces para neutralizar la toxina in vitro.

La figura 6 es un diagrama de barras que muestra los resultados de un ensayo de neutralización de la toxina del ántrax in vivo medidos después de la preincubación de las células diana y el antígeno protector, que demuestra que IQNPA-1 e IQNPA-2 son eficaces para neutralizar la toxina in vivo.

La figura 7 es una gráfica lineal que muestra el efecto de la dilución de IQNPA-1 sobre la supervivencia de ratones inmunizados de forma pasiva 2,5 horas antes de una exposición a 30 x DLM de esporas de ántrax.

La figura 8 es una gráfica lineal que muestra el efecto de la dilución de IQNPA-2 sobre la supervivencia de ratones inmunizados de forma pasiva 2,5 horas antes de una exposición a 30 x DLM de esporas de ántrax.

La figura 9 es una gráfica lineal que muestra el efecto de la dilución de un suero de ántrax control sobre la supervivencia de ratones inmunizados de forma pasiva 2,5 horas antes de una exposición a 30 x DLM de esporas de ántrax.

La figura 10 es una gráfica lineal que muestra el efecto de la dosis sobre la supervivencia de ratones inmunizados de forma pasiva medido hasta 10 días después de la exposición.

La figura 11 es una gráfica probit para los huMab 10 días después de la exposición.

La figura 12 es una gráfica que muestra el efecto de la supervivencia de ratones tratados una vez con IQNPA-1, IQNPA-2, o suero de ántrax control en diferentes momentos después de la exposición.

La figura 13 es una gráfica que muestra el efecto de la supervivencia de ratones tratados una vez con IQNPA-1, o suero de ántrax control en diferentes momentos después de la exposición.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de anticuerpos monoclonales totalmente humanos, IQNPA-1 e IQNPA-2, que son específicos para el antígeno protector (AP) de B. anthracis, e IQNLF-1 e IQNLF-2, que son específicos para el factor letal (FL) de B. anthracis. El análisis de la secuencia de IQNPA-1 e IQNPA-2 reveló que los dos anticuerpos tienen idéntica secuencia de ácidos nucleicos y por tanto se derivan del mismo clon primario. Se obtuvieron resultados similares para IQNLF-1 e IQNLF-2. Por consiguiente, los términos IQNPA-1 e IQNPA-2, e IQNLF-1 e IQNLF-2 se utilizan de modo intercambiable, y los anticuerpos se denominan en la presente, respectivamente, anticuerpos IQNPA e IQNLF. Las líneas celulares de hibridoma que producen los anticuerpos monoclonales humanos IQNPA-1 e IQNPA-2, e IQNLF-1 e IQNLF-2 se denominan hibridomas IQNPA-1 e IQNPA-2, e IQNLF-1 e IQNLF-2, respectivamente. Los anticuerpos IQNPA e IQNLF se denominan colectivamente en la presente anticuerpos IQN o huMab.

Los anticuerpos IQNPA neutralizan la toxina letal de Bacillus anthracis in vivo e in vitro.

De manera similar, los anticuerpos IQNLF neutralizan la toxina letal de Bacillus anthracis in vitro. Además, los anticuerpos IQNPA se unen al sitio de unión del receptor de la toxina del ántrax (RTA) del polipéptido del AP. En ratones expuestos a los anticuerpos IQNPA antes de la exposición a B. anthracis se descubrió que el tratamiento con los anticuerpos protegió al 50% de los animales expuestos a unas dosificaciones tan bajas como 2,7 y 4,8 !g/ml, que se correlacionan aproximadamente con 0,125 y 0,25 mg/kg, respectivamente. Además, los anticuerpos IQNPA proporcionan 100% de protección cuando se administran hasta 36 horas después de la exposición a 25-40 x DLM de esporas de Bacillus anthracis. En contraste, en ratones no tratados, la media del tiempo hasta la muerte después de la exposición a estas esporas es de aproximadamente 55 hr (2,3 días). Estos resultados demuestran que los anticuerpos IQNPA son útiles para un tratamiento tras la exposición y profiláctico de la infección por ántrax.

B. anthracis es una bacteria Gram-positiva aerobia, formadora de esporas, baciliforme. B. anthracis tiene dos factores de virulencia principales, una toxina tripartita y una cápsula antifagocítica. Las tres proteínas de la exotoxina son el factor de edema (FE), el factor letal (FL), y el antígeno protector (AP). El FE y el FL modifican enzimáticamente sustratos del citosol de células de mamífero; el FE es una adenilato ciclasa que provoca la pérdida de fluidos de los tejidos afectados y la inhibición de la fagocitosis, y el FL es una proteasa dependiente de cinc que rompe la proteína quinasa quinasa activada por mitógenos y provoca la lisis de macrófagos. El AP deriva su nombre del hecho de que es el inmunógeno protector clave en las actuales vacunas humanas. El AP se une al receptor de la toxina del ántrax (RTA), tras lo cual se escinde un fragmento de 20 kDa, dejando que los restantes 63 kDa de la parte carboxi-terminal formen un heptámero insertado en la membrana que se une de una a tres de las enzimas tóxicas, FL, para formar la toxina letal (TxLe), o EF, para formar la toxina de edema (TE), y transloca las enzimas tóxicas hacia el citosol. La TxLe es el principal contribuyente a la virulencia en animales infectados, y parece ser el principal efector del choque y la muerte del ántrax sistémico.

El ser humano en general adquire la enfermedad directamente, por contacto con ganado infectado, o indirectamente en empleos industriales que se dedican al procesamiento de productos animales. Existen tres formas de la enfermedad que están reconocidas en seres humanos: la infección cutánea, por inhalación y gastrointestinal. La forma por inhalación es la más preocupante en el contexto de un ataque biológico. Tras la inhalación, las esporas son fagocitadas por macrófagos alveolares y transportadas a los nódulos linfáticos de drenaje, en donde las esporas germinan y se produce la multiplicación de los bacilos vegetativos. Como resultado se produce una bacteremia y una toxemia fatales, con una tasa de mortalidad en individuos no tratados > 80%. Un tratamiento temprano es esencial, puesto que estudios en animales sugieren que la enfermedad alcanza un punto en el que los antibióticos ya no son eficaces debido a la acumulación de un nivel letal de toxina, aunque el organismo sea sensible al agente.

En la actualidad, la vacuna humana autorizada en EEUU (AVA) estimula anticuerpos que neutralizan la actividad de la toxina del ántrax (Ivins et al., 1998). Sin embargo, se ha demostrado que pueden ser necesarias vias semanas para organizar una respuesta de anticuerpos neutralizantes significativa. Por tanto, no es probable que la inmunización activa sea eficaz dentro del marco de tiempo de una infección. Una estrategia alternativa sería administrar anticuerpos neutralizantes de la toxina letal preformados. Se ha demostrado en una serie de estudios en animales que los anticuerpos preformados procedentes de animales (por ejemplo, caballos) inmunizados con la vacuna del ántrax o AP puede proteger de forma pasiva a los receptores, incluyendo los seres humanos. Sin embargo, existen desventajas a la utilización de suero derivado de animales. El acceso depende de la disponibilidad continua de animales inmunizados, mantenidos y controlados correctamente. La concentración, la eficacia y la seguridad del material es variable e incontrolable. Además, los sueros derivados de animales sólo pueden utilizarse de modo eficaz durante un periodo de tiempo limitado, puesto que se organizará una respuesta de anticuerpos neutralizantes contra los anticuerpos animales después de una utilización prolongada o repetida. De manera más grave, existe el hecho de que los receptores humanos puedan reaccionar de manera adversa al suero, que varía de la enfermedad del suero al choque anafiláctico, o puedan contraer uno de una serie de patógenos animales letales para los seres humanos.

Una mejora sería el uso de anticuerpos policlonales recogidos de seres humanos que hayan sido inmunizados con la vacuna del ántrax humana autorizada (AVA). La ventaja de utilizar sueros derivados de seres humanos es que los sueros humanos son menos inmunogénicos que los sueros animales, por tanto se produciría una menor respuesta de anticuerpos neutralizantes, lo cual permite una utilización prolongada y repetida, y una probable reducción en las respuestas adversas. Además, la IgG humana tiene una semivida sérica de 20 días y, en teoría, una infusión de anticuerpos humanos podría proteger a un individuo expuesto durante varias semanas. Sin embargo, las principales desventajas de esta estrategia son el riesgo de transmisión de enfermedades, las variaciones entre los lotes en la concentración de los ingredientes activos y, por tanto, en la eficacia del material y la incapacidad de generar cantidades suficientes de sueros protectores (con unas titulaciones suficientemente altas) para proteger a todas las personas expuestas en el caso de un ataque con armas biológicas o bioterrorista.

Como alternativa, la mejor estrategia sería desarrollar anticuerpos monoclonales neutralizantes de la toxina del ántrax humanos que pudiesen utilizarse para tratar a individuos infectados y/o para proporcionar una “cobertura a corto plazo” a individuos no protegidos que están o estarán desplegados en entornos de alto riesgo. Otras ventajas serían la menor necesidad de tomar antibióticos profilácticos, cuya utilización a largo plazo puede provocar considerables disfunciones gastrointestinales, así como que los anticuerpos sean eficaces contra cepas de ántrax resistentes a los antibióticos. Por consiguiente, los anticuerpos monoclonales humanos tienen todas las ventajas de los anticuerpos policlonales humanos pero ninguna de las desventajas mencionadas anteriormente y, como tales, podrían constituir antitoxinas óptimas.

Por consiguiente, la invención proporciona anticuerpos monoclonales humanos que neutralizan la toxina letal de Bacillus anthracis que son útiles para reducir el riesgo de infección por B. anthracis y para tratar a un sujeto infectado por B. anthracis. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales IQNPA-1 e IQNPA-2 se han identificado como anticuerpos capaces de neutralizar la toxina letal de Bacillus anthracis in vivo e in vitro.

El anticuerpo IQNPA incluye una región de cadena pesada (SEQ ID NO:2) codificada por la secuencia de ácido nucleico que aparece a continuación en SEQ ID NO:1, y una cadena ligera (SEQ ID NO:4) codificada por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en SEQ ID NO:3. Los codones de inicio y de fin, que definen la región codificadora, están subrayados en SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3.

>Secuencia de nucleótidos de la Hy de IQNPA: (SEQ ID NO:1)

>Secuencia de nucleótidos de la Hy de IQNPA: (SEQ ID NO:2)

>Secuencia de nucleótidos de la LK de IQNPA: (SEQ ID NO:3)

>Secuencia de nucleótidos de la LK de IQNPA: (SEQ ID NO:4)

El anticuerpo IQNLF incluye una región de cadena pesada (SEQ ID NO:6) codificada por la secuencia de ácido nucleico que aparece a continuación en SEQ ID NO:5, y una cadena ligera (SEQ ID NO:8) codificada por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en SEQ ID NO:7. Los codones de inicio y de fin, que definen la región codificadora, están subrayados en SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:7.

>Secuencia de nucleótidos de la Hy de IQNLF: (SEQ ID NO:5)

>Secuencia de nucleótidos de la Hy de IQNLF: (SEQ ID NO:6)

>Secuencia de nucleótidos de la LK de IQNLF: (SEQ ID NO:7)

>Secuencia de nucleótidos de la LK de IQNLF: (SEQ ID NO:8)

Tal como se emplea en la presente, el término “anticuerpo” se refiere a moléculas de inmunoglobulina y a porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulinas (Ig), es decir, moléculas que contienen un sitio de unión al antígeno que se une de modo específico (inmunorreacciona) a un antígeno. “Se une de modo específico” o “inmunorreacciona” significa que el anticuerpo reacciona con uno o más determinantes antigénicos del antígeno deseado y no reacciona (es decir, se une) con otros polipéptidos o se une con una afinidad mucho menor (Kd > 10-6) a otros polipéptidos.

La expresión “anticuerpo monoclonal” (MAb) o “composición de anticuerpos monoclonales”, tal como se emplea en la presente, se refiere a una población de moléculas de anticuerpos que contiene sólo una especie molecular de una molécula de anticuerpo que consiste en un producto génico de cadena ligera exclusivo y un producto génico de cadena pesada exclusivo. En particular, las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del anticuerpo monoclonal son idénticas en todas las moléculas de la población. Los MAb contienen un sitio de unión al antígeno capaz de inmunorreaccionar con un epitopo concreto del antígeno que se caracteriza por una afinidad de unión exclusiva por él.

En general, las moléculas de anticuerpos obtenidas de seres humanos están relacionadas con cualquiera de las clases de IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, que se diferencian entre sí por la naturaleza de la cadena pesada presente en la molécula. Ciertas clases también tienen subclases, tales como IgG1, IgG2, y otras. Además, en los seres humanos, la cadena ligera puede ser una cadena kappa o una cadena lambda.

La expresión “sitio de unión al antígeno” o “porción de unión” se refiere a la parte de la molécula de inmunoglobulina que participa en la unión al antígeno. El sitio de unión al antígeno está formado por restos aminoácidos de las regiones variables (“V”) N-terminales de las cadenas pesada (“H”) y ligera (“L”). Tres tramos muy divergentes dentro de las regiones V de las cadenas pesada y ligera, denominados “regiones hipervariables”, están interpuestos entre tramos flanqueantes más conservados conocidos como “regiones de marco” o “FR”. Por tanto, el término “FR” se refiere a secuencias de aminoácidos que en la naturaleza se encuentran entre regiones hipervariables y adyacentes a éstas en inmunoglobulinas. En una molécula de anticuerpo, las tres regiones hipervariables de una cadena ligera y las tres regiones hipervariables de una cadena pesada están dispuestas con relación entre sí en el espacio tridimensional para formar una superficie de unión al antígeno. La superficie de unión al antígeno es complementaria con la superficie tridimensional de un antígeno unido, y las tres regiones hipervariables de cada una de las cadenas pesada y ligera se denominan “regiones determinantes de la complementariedad” o “CDR”.

Tal como se emplea en la presente, el término “epitopo” incluye cualquier determinante de proteína capaz de unirse de modo específico a una inmunoglobulina, un scFv, o un receptor de células T. Los determinantes epitópicos habitualmente consisten en agrupaciones de moléculas de la superficie químicamente activas, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcares, y habitualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Pueden generarse anticuerpos contra los péptidos Nterminales o C-terminales de un polipéptido. Por ejemplo, el anticuerpo se genera contra el factor letal, el factor de edema o el antígeno protector. De manera óptima, el anticuerpo se genera contra el dominio 4 de un péptido del antígeno protector. Por ejemplo, el anticuerpo se une a los restos aminoácidos 608-735 de un péptido del antígeno protector. El anticuerpo se une a la secuencia de aminoácidos: NNIAVGADES WKEAHREVI NSSTEGLLLN IDKDIRKILS GYIVEIEDTE GLKEVINDRYDMLNISSLRQ DGKTFIDFKK YNDKLPLYIS NPNYKVNVYA VTKENTIINP SENGDTSTNG IKKILIFSKK GYEIG (SEQ ID NO:9), o TNIYTVLDKI KLNAKMNILI RDKRFHYDRN NIAVGADESV VKEAHREVIN SSTEGLLLNI DKDIRKILSG YIVEIEDTEG LKEVINDRYD MLNISSLRQD GKTFIDFKKY NDKLPLYISNPNYKVNVYAV TKENTIINPS ENGDTSTNGI KKILIFSKKG YEIG (SEQ ID NO:10).

Tal como se emplean en la presente, las expresiones “unión inmunológica” y “propiedades de unión inmunológica” se refieren a las interacciones no covalentes del tipo que se producen entre una molécula de inmunoglobulina y un antígeno para el cual la inmunoglobulina es específica. La fuerza o afinidad de las interacciones de unión inmunológica puede expresarse en términos de la constante de disociación (Kd) de la interacción, en la que una Kd más pequeña representa una mayor afinidad. Las propiedades de unión inmunológica de polipéptidos seleccionados se cuantifican utilizando métodos conocidos en la técnica. Uno de estos métodos supone medir las velocidades de formación y disociación del antígeno-sitio de unión/complejo antigénico, dependiendo dichas velocidades de las concentraciones de los asociados del complejo, de la afinidad de la interacción, y de los parámetros geométricos que influyen por igual en la constante en ambas direcciones. Por tanto, la “constante de afinidad” (Kon) y la “constante de disociación (Koff) pueden determinarse mediante el cálculo de las concentraciones y las velocidades reales de asociación y disociación (véase Nature, 361:186-87 (1993)). La proporción de Koff/Kon permite la cancelación de todos los parámetros no relacionados con la afinidad, y es igual a la constante de disociación Kd (véase, en general, Davies et al. (1990), Annual Rev. Biochem., 59:439-473). Se dice que un anticuerpo de la presente invención se une de modo específico a un epitopo del ántrax cuando la constante de unión en equilibrio (Kd) es : 1 !M, preferiblemente : 100 nM, más preferiblemente : 10 nM, y lo más preferiblemente de 100 pM a aproximadamente 1 pM, según se mide mediante ensayos, tales como los ensayos de unión con radioligandos o ensayos similares conocidos por los expertos en la técnica.

Tal como se emplea en la presente, el término “fragmento”, cuando se emplea haciendo referencia a un ácido nucleico que codifica IQNLF o IQNPA, pretende indicar un ácido nucleico que tiene sustancialmente la misma secuencia que una porción de un ácido nucleico que codifica IQNLP o IQNPA. El fragmento del ácido nucleico tiene una longitud y una secuencia suficientes para hibridarse de modo selectivo con un ácido nucleico que codifica un anticuerpo IQNLP o IQNPA, o una secuencia de nucleótidos que es complementaria con un ácido nucleico que codifica un anticuerpo IQNLP o IQNPA. Por tanto, se pretende que el fragmento incluya cebadores para la secuenciación y la reacción en cadena de polimerasa (PCR), así como sondas para una transferencia o una hibridación en disolución de ácidos nucleicos. El significado del término también pretende incluir regiones de secuencias de nucleótidos que no codifican directamente polipéptidos de IQNLP o IQNPA, tales como los intrones, y las secuencias de regiones no traducidas del gen que codifica IQNLP o IQNPA.

Los expertos en la técnica reconocerán que es posible determinar, sin experimentación indebida, si un anticuerpo monoclonal humano tiene la misma especificidad que un anticuerpo monoclonal humano de la invención (por ejemplo, el anticuerpo monoclonal IQNLP y IQNPA) determinando si el primero evita que el segundo se una a un polipéptido del antígeno protector del ántrax, a un polipéptido del factor letal, o a un receptor de la toxina del ántrax. Si el anticuerpo monoclonal humano que se está ensayando compite con el anticuerpo monoclonal humano IQNLP o IQNPA, tal como se demuestra por una disminución en la unión del anticuerpo monoclonal humano IQNLP o IQNPA, entonces los dos anticuerpos monoclonales se unen al mismo epitopo o a un epitopo muy relacionado. Otra manera para determinar si un anticuerpo monoclonal humano tiene la especificidad de un anticuerpo monoclonal humano de IQNLP o IQNPA es preincubar el anticuerpo monoclonal humano de la invención con un polipéptido del antígeno protector, con el que normalmente sería reactivo, y después añadir el anticuerpo monoclonal humano que se está ensayando para determinar si el anticuerpo monoclonal humano que se está ensayando ve inhibida su capacidad para unirse al polipéptido del antígeno protector. Si el anticuerpo monoclonal humano que se está ensayando es inhibido, entonces con toda probabilidad tiene la misma especificidad epitópica, o una especificidad epitópica funcionalmente equivalente que el anticuerpo monoclonal de la invención. La selección de anticuerpos monoclonales humanos de la invención también se realiza utilizando B. anthracis y determinando si el anticuerpo monoclonal de ensayo es capaz de neutralizar a B. anthracis.

Se emplean diversos procedimientos conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra una proteína del ántrax, o contra derivados, fragmentos, análogos, homólogos u ortólogos de éstos (véase, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E. y Lane D., 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, incorporado en la presente como referencia). Los anticuerpos totalmente humanos son moléculas de anticuerpos en las que la secuencia completa de la cadena ligera y de la cadena pesada, incluyendo las CDR, surgen de genes humanos. Estos anticuerpos se denominan “anticuerpos humanos” o “anticuerpos totalmente humanos” en la presente. Los anticuerpos monoclonales humanos pueden prepararse utilizando la técnica del trioma; la técnica del hibridoma de células B humanas (véase, Kozbor, et al., 1983, Immunol. Today, 4:72); y la técnica del hibridoma de EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (véase, Cole, et al., 1985, en: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Los anticuerpos monoclonales humanos pueden utilizarse y pueden producirse utilizando hibridomas humanos (véase, Cote, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:2026-2030), o transformando células B humanas con el virus de Epstein Barr in vitro (véase, Cole, et al., 1985, en: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96).

También se incluye en la invención los fragmentos funcionales de los anticuerpos IQNLP e IQNPA. Un fragmento funcional significa una molécula de anticuerpo o un fragmento funcional de ésta, que tiene sustancialmente las mismas secuencias de aminoácidos de las CDR de la cadena pesada y ligera, tal como aparecen en IQNLF o IQNPA. El fragmento funcional aún conserva parte o toda la actividad de unión a FL o AP. Estos fragmentos funcionales pueden incluir, por ejemplo, fragmentos funcionales de anticuerpos, tales como Fab, F(ab)2, Fv, Fv monocatenarios (scFv). Otros fragmentos funcionales pueden incluir, por ejemplo, polipéptidos de la cadena pesada

o ligera, polipéptidos de la región variable, o polipéptidos de CDR o porciones de éstos, con la condición de que dichos fragmentos funcionales conserven la actividad de unión, la especificidad, la actividad de unión a FL o AP, o la actividad neutralizante. La expresión también pretende incluir polipéptidos que incluyen, por ejemplo, formas modificadas de aminoácidos naturales, tales como D-estereoisómeros, aminoácidos no naturales, análogos y miméticos de aminoácidos, con la condición de que dichos polipéptidos conserven la actividad funcional según se definió anteriormente. Cuando se emplean haciendo referencia a un fragmento funcional, no es necesario que todas las CDR de IQNLF o IQNPA estén representadas. En lugar de esto, sólo están presentes las CDR que normalmente estarían presentes en la porción de anticuerpo que se corresponde con el fragmento funcional. De manera similar, la expresión “fragmento funcional” cuando se emplea haciendo referencia a un ácido nucleico codificador pretende referirse a un ácido nucleico que codifica un anticuerpo o un fragmento funcional que no tiene sustituciones en los aminoácidos de IQNLF o IQNPA fuera de las CDR, y que tiene sustancialmente la misma secuencia de nucleótidos

que las secuencias de nucleótidos de las CDR de la cadena pesada y ligera, y que codifica sustancialmente las mismas secuencias de aminoácidos de las CDR que se encuentran en IQNLF o IQNPA. El significado de fragmento funcional pretende incluir variaciones y modificaciones menos importantes del anticuerpo, con la condición de que su función no se vea comprometida. Estos fragmentos funcionales son muy conocidos por los expertos en la técnica. Estos términos y expresiones se describen, por ejemplo, en Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (1989); Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers, R.A. (ed.), Nueva York: VCH Publisher, Inc.); Huston et al., Cell Biophysics, 22:189-224 (1993); Pluckthun y Skerra, Meth. Enzymol., 178:497-515 (1989); y en Day, E.D., Advanced Immunochemistry, 2ª ed., Wiley-Liss, Inc., Nueva York, N.Y. (1990).

En el caso en que existen dos o más definiciones de un término o expresión que se utilicen y/o se acepten en la técnica, la definición del término o expresión tal como se emplea en la presente pretende incluir todos estos significados, a menos que se indique explícitamente lo contrario. Un ejemplo específico es el uso del término “CDR” para describir los sitios de combinación con el antígeno no contiguos que se encuentran dentro de la región variable de ambos polipéptidos de cadena pesada y ligera. Esta región concreta ha sido descrita por Kabat et al., supra, y por Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987), y por MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996), en los que las definiciones incluyen solapamientos o subconjuntos de restos aminoácidos cuando se comparan entre sí. No obstante, la aplicación de cualquiera de las definiciones para una CDR de IQNLF o IQNPA, o sus variantes, pretende estar dentro del alcance del término o expresión según se define y se emplea en la presente. Los restos aminoácidos que incluyen las CDR, según se definen en cada una de las referencias citadas anteriormente, se indican a continuación en la tabla A como comparación.

TABLA A

Definiciones de CDR

Kabat1: Chothia2 MacCallum3

VH: CDR1 31-35 26-32 30-35

VH: CDR2 50-65 53-55 47-58

VH: CDR3 95-102 96-101 93-101

VL: CDR1 24-34 26-32 30-36

VL: CDR2 50-56 50-52 46-55

VL: CDR3 89-97 91-96 89-96

1 La numeración de los restos sigue la nomenclatura de Kabat et al., supra. 2 La numeración de los restos sigue la nomenclatura de Chothia et al., supra. 3 La numeración de los restos sigue la nomenclatura de MacCallum et al., supra.

Las secuencias que se corresponden con las CDR de IQNPA incluyen, por ejemplo, las regiones definidas por Kabat et al., supra y/o las regiones definidas por Chothia et al., supra, así como las definidas por MacCallum et al., supra. Los fragmentos de las CDR de IQNPA para cada una de las anteriores definiciones se correspondencon los nucleótidos indicados a continuación en la tabla B cuando se numeran según SEQ ID NO:1 y 3. La numeración de la secuencia de nucleótidos se extrae de la secuencia primaria que se muestra en SEQ ID NO:1 y 3, y se ajusta a las definiciones previamente indicadas en la tabla A.

TABLA B

Restos nucleótidos de las CDR de IQNPA

Kabat: Chothia MacCallum

VH: CDR1 104-118 89-109 101-118

VH: CDR2 161-211 170-181 152-190

VH: CDR3 308-331 311-328 302-328

VL: CDR1 83-115 89-109 101-121

VL: CDR2 161-181 161-169 149-178

VL: CDR3 278-304 284-301 278-301

De manera similar, los fragmentos de la CDR de IQNPA para cada una de las anteriores definiciones se corresponden con los restos aminoácidos indicados a continuación en la tabla C, cuando se numeran según SEQ ID NO:2 y 4. El número del resto aminoácido se extrae de la secuencia primaria que se muestra en SEQ ID NO:2 y 4, y se ajusta a las definiciones previamente indicadas en la tabla A.

TABLA C

Restos aminoácidos de las CDR de IQNPA

Kabat: Chothia MacCallum

VH: CDR1 Lys31-Ala35 Ser26-Lys32 Val30-Ala35

VH: CDR2 Ser50-Trp66 Ile53-Val56 Thr47-Ala59

VH: CDR3 Tyr99-Arg106 Met100-Leu105 Thr97-Leu105

VL: CDR1 Leu24-Ser34 Gln26-Ser32 Thr30-Gly36

VL: CDR2 Ser50-Trp56 Ser50-Ser52 Ser46-Ala55

VL: CDR3 Gly89-Ser97 Asp91-Ile96 Gly89-Ile96

Por tanto, la invención también proporciona fragmentos de ácidos nucleicos que codifican sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que una CDR de un polipéptido de la cadena pesada o ligera de IQNLF.

5 Las secuencias que se corresponden con las CDR de IQNLF incluyen, por ejemplo, las regiones definidas por Kabat et al., supra y/o las regiones definidas por Chothia et al., supra, así como las definidas por MacCallum et al., supra. Los fragmentos de las CDR de IQNLF para cada una de las anteriores definiciones se corresponden con los nucleótidos indicados a continuación en la tabla D cuando se numeran según SEQ ID NO:5 y 7. La numeración de la secuencia de nucleótidos se extrae de la secuencia primaria que se muestra en SEQ ID NO:5 y 7, y se ajusta a las

10 definiciones previamente indicadas en la tabla A.

TABLA D

Restos nucleótidos de las CDR de IQNLF

Kabat: Chothia MacCallum

VH: CDR1 Lys31-Ala35 Ser26-Lys32 Val30-Ala35

VH: CDR2 Ser50-Trp66 Ile53-Val56 Thr47-Ala59

VH: CDR3 Tyr99-Arg106 Met100-Leu105 Thr97-Leu105

VL: CDR1 Leu24-Ser34 Gln26-Ser32 Thr30-Gly36

VL: CDR2 Ser50-Trp56 Ser50-Ser52 Ser46-Ala55

VL: CDR3 Gly89-Ser97 Asp91-Ile96 Gly89-Ile96

De manera similar, los fragmentos de las CDR de IQNLF para cada una de las anteriores definiciones se corresponden con restos aminoácidos nucleótidos indicados a continuación en la tabla D cuando se numeran según 15 SEQ ID NO:6 y 8. La numeración de los restos aminoácidos se extrae de la secuencia primaria que se muestra en SEQ ID NO:6 y 8, y se ajusta a las definiciones previamente indicadas en la tabla A.

TABLA E

Restos aminoácidos de las CDR de IQNPA

Kabat: Chothia MacCallum

VH: CDR1 Val31-Gly35 Ser26-Gln32 Leu30-Gly35

VH: CDR2 Ser50-Trp65 Met53-Val56 Met47-Ala59

VH: CDR3 Tyr99-Arg106 Met100-Leu105 Thr97-Leu105

VL: CDR1 Thr24-Pro34 Ser26-Val32 Gln30-Glu36

VL: CDR2 Ser50-Gln56 Ser50-Leu52 Gln46-Tyr55

VL: CDR3 Asp89-Thr97 Thr91-Ser96 Asp89-Ser96

Por tanto, la invención también proporciona fragmentos de ácidos nucleicos que codifican sustancialmente la misma 20 secuencia de aminoácidos que una CDR de un polipéptido de cadena pesada o ligera de IQNPA.

Tal como se emplea en la presente, el término “sustancialmente” o la expresión “sustancialmente la misma” cuando

se emplea haciendo referencia a una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos pretende significar que la

secuencia de nucleótidos o de aminoácidos muestra un grado o una cantidad considerable de coincidencia de

secuencia cuando se compara con una secuencia de referencia. Este grado o cantidad considerable de coincidencia 25 de secuencia también se considera significativo y, por tanto, muestra características que son decididamente

reconocibles o conocidas. Por tanto, una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente la misma secuencia de

nucleótidos que una cadena pesada o ligera de IQNLF o IQNPA y sus fragmentos se refiere a una secuencia que

muestra características que son decididamente conocidas o reconocibles por codificar o por ser la secuencia de

aminoácidos de IQNLF o IQNPA. Sus modificaciones de menor importancia también se incluyen, con la condición de 30 que sean reconocibles como una secuencia del anticuerpo IQNLF o IQNPA. De manera similar, una secuencia de

aminoácidos que es sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la cadena pesada o ligera de IQNLF o

IQNPA o sus fragmentos funcionales se refiere a una secuencia que muestra características que son decididamente conocidas o reconocibles por representar la secuencia de aminoácidos de IQNLF o IQNPA y sus modificaciones de menor importancia.

Además de las sustituciones conservadoras de aminoácidos, las modificaciones de menor importancia de las secuencias de nucleótidos que codifican IQNLF o IQNPA que permiten la sustitución funcional de aminoácidos también pretenden incluirse dentro de la definición del término. La sustitución de aminoácidos funcionalmente equivalentes codificados por las secuencias de nucleótidos e IQNLF o IQNPA tiene carácter rutinario y puede realizarse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Brevemente, la sustitución de aminoácidos funcionalmente equivalentes puede realizarse identificando los aminoácidos que se desean cambiar, incorporando los cambios en el ácido nucleico codificador, y después determinando la función del polipéptido o polipéptidos de IQNLF o IQNPA modificados y expresados de modo recombinante. En la técnica se conocen métodos rápidos para fabricar y seleccionar múltiples cambios simultáneos, y pueden utilizarse para producir un banco de ácidos nucleicos codificadores que contenga todos los cambios posibles o todos los cambios deseados, y después expresar y seleccionar el banco para los polipéptidos de IQNLF o IQNPA que conserven la función. Estos métodos incluyen, por ejemplo, la mutagénesis basada en codones, la síntesis de oligonucleótidos aleatoria, y la síntesis de oligonucleótidos parcialmente degenerados.

La identificación de los aminoácidos que se van a cambiar puede ser realizarse por los expertos en la técnica utilizando la información actual disponible con respecto a la estructura y la función de los anticuerpos, así como la información actual y disponible que incluye métodos para procedimientos de injerto de CDR. Por ejemplo, las CDR pueden identificarse dentro del anticuerpo del donante mediante cualquiera de los criterios especificados en Kabat et al., supra, Chothia et al., supra y/o MacCallum et al., supra, y cualquiera o todos los restos aminoácidos no idénticos que están fuera de estas secuencias de CDR pueden cambiarse a aminoácidos funcionalmente equivalentes. Utilizando los anteriores métodos descritos conocidos en la técnica, cualquiera o todos los aminoácidos no idénticos pueden cambiarse de modo individual o en combinación con aminoácidos en diferentes posiciones para incorporar el número deseado de sustituciones de aminoácidos en cada una de las posiciones deseadas. Entonces se producen los polipéptidos de IQNLF o IQNPA que contienen los aminoácidos sustituidos deseados, y se seleccionan para la conservación o el aumento de la función, comparado con polipéptidos de IQNLF o IQNPA no sustituidos. La producción de polipéptidos de IQNLF o IQNPA sustituidos puede realizarse, por ejemplo, mediante expresión recombinante utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica. Se considera que los polipéptidos de IQNLF o IQNPA que muestren una conservación o un aumento de la función, comparado con IQNLF o IQNPA no sustituidos, contienen modificaciones de menor importancia de la secuencia de nucleótidos codificadora, que dan como resultado la sustitución funcional de uno o más aminoácidos.

La sustitución funcional de los aminoácidos resulta beneficiosa, puesto que permite la rápida identificación de restos aminoácidos equivalentes sin que sea necesaria una información estructural ni procedimientos laboriosos que son necesarios para evaluar e identificar a los restos aminoácidos que deben considerarse para la sustitución para transferir de manera satisfactoria la función de unión del donante. Además, se eliminan los procedimientos discontinuos existentes para cambiar y ensayar los aminoácidos identificados para la sustitución. Fundamentalmente, utilizando la estrategia de sustitución funcional descrita anteriormente, pueden identificarse todos los restos aminoácidos no idénticos entre el donante y el marco humano, y sustituirse con cualquiera o todos de otros posibles restos aminoácidos en cada posición no idéntica para producir una población de polipéptidos sustituidos que contienen todas las permutaciones y combinaciones posibles o todas las permutaciones y combinaciones deseadas. La población de polipéptidos sustituidos entonces puede seleccionarse para detectar los polipéptidos sustituidos que conservan la función. Utilizando los procedimientos de mutagénesis basada en codones descritos anteriormente, se ha utilizado la generación de un banco de restos aminoácidos sustituidos y la selección de los restos funcionalmente sustituidos para la producción rápida de anticuerpos terapéuticos injertados, así como para la alteración rápida de la afinidad de anticuerpos. Los ejemplos de estos procedimientos aparecen, por ejemplo, en Rosok et al., J. Biol. Chem., 271:22611-22618 (1996), y en Glaser et al., J. Immunol., 149:3903-3913 (1992), respectivamente.

Los anticuerpos se purifican mediante técnicas muy conocidas, tales como una cromatografía de afinidad utilizando la proteína A o la proteína G, que proporciona principalmente la fracción de IgG del suero inmunológico. Después, o como alternativa, el antígeno específico que es la diana de la inmunoglobulina buscada, o un epitopo de éste, puede inmovilizarse sobre una columna para purificar el anticuerpo específico inmunológico mediante una cromatografía de inmunoafinidad. La purificación de inmunoglobulinas se analiza, por ejemplo, en D. Wilkinson (The Scientist, publicado por The Scientist, Inc., Filadelfia PA, vol. 14, nº 8 (17 de abril, 2000), pp. 25-28).

Resulta deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora para potenciar, por ejemplo, la eficacia del anticuerpo para tratar a B. anthracis. Por ejemplo, puede introducirse un resto o restos cisteína en la región Fc, permitiendo con ello la formación de enlaces disulfuro intercatenarios en esta región. El anticuerpo homodimérico generado de esta manera puede tener una mejor capacidad de internalización y/o producir una mayor muerte celular mediada por el complemento y una mayor citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (véase, Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992), y Shopes, J. Immunol., 148:2918-2922 (1992)). Como alternativa, un anticuerpo puede modificarse para que tenga regiones Fc duales y, con ello, puede tener una mayor lisis mediada por el complemento y mayores capacidades de ADCC (véase, Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989)).

La invención también se refiere a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico, tal como una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o sus fragmentos), o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado).

Las toxinas enzimáticamente activas y sus fragmentos que pueden utilizarse incluyen la cadena A de la difteria, los fragmentos activos que no se unen de la toxina de la difteria, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de la ricina, la cadena A de la abrina, la cadena A de la modecina, alfa-sarcina, las proteínas de Aleurites fordii, las proteínas de diantina, las proteínas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), el inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, el inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenos. Está disponible una diversidad de radionúclidos para la producción de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y, y 186Re.

Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se fabrican utilizando una diversidad de agentes acoplantes de proteínas bifuncionales, tales como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como HCl de adipimidato de dimetilo), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis-(pazidobenzoil)hexandiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolieno), y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4dinitrobenceno). Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina de ricina según se describe en Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminapentaacético marcado con carbono14 (MX-DTPA) es un ejemplo de agente quelante para la conjugación del radionúclido al anticuerpo (véase el documento WO 94/11026).

Los expertos en la técnica reconocerán que puede acoplarse una gran variedad de posibles restos a los anticuerpos resultantes o a otras moléculas de la invención (véase, por ejemplo, "Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J.M. Cruse y R.E. Lewis, Jr. (eds.), Carger Press, Nueva York, (1989), cuyo contenido total se incorpora en la presente como referencia).

El acoplamiento se logra mediante cualquier reacción química que una a las dos moléculas, con la condición de que el anticuerpo y el otro resto conserven sus respectivas actividades. Este enlace puede incluir muchos mecanismos químicos, por ejemplo enlace covalente, unión de afinidad, intercalación, enlace coordinado y formación de complejos. Sin embargo, el enlace preferido es el enlace covalente. El enlace covalente se logra mediante condensación directa de cadenas laterales existentes, o mediante la incorporación de moléculas puente externas. Muchos agentes conectores bivalentes o polivalentes son útiles para acoplar moléculas de proteínas, tales como los anticuerpos de la presente invención, a otras moléculas. Por ejemplo, los agentes de acoplamiento representativos pueden incluir compuestos orgánicos, tales como tioésteres, carbodiimidas, ésteres de succinimida, diisocianatos, glutaraldehído, diazobencenos, y hexametilendiaminas. Este listado no pretende ser exhaustivo de las diversas clases de agentes de acoplamiento conocidos en la técnica, sino que son ejemplos de los agentes de acoplamiento más habituales (véase, Killen y Lindstrom, Jour. Immun., 133:1335-2549 (1984); Jansen et al., Immunological Reviews, 62:185-216 (1982); y Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987). Los conectores preferidos se describen en la bibliografía (véase, por ejemplo, Ramakrishnan, S. et al., Cancer Res., 44:201-208 (1984), que describe el uso del MBS (éster de M-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida)). Véase también la patente de EEUU nº 5.030.719, que describe el uso de un derivado de acetilhidrazida halogenada acoplado a un anticuerpos a través de un conector oligopeptídico. Los conectores particularmente preferidos incluyen: (i) EDC (clorhidrato de 1-etil-3-(3dimetilaminopropil)carbodiimida; (ii) SMPT (4-succinimidiloxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridilditio)tolueno, Pierce Chem. Co., nº de cat. 21558G); (iii) SPDP (succinimidil-6-[3-(2-piridilditio)propionamido]hexanoato, Pierce Chem. Co., nº de cat. 21651G); (iv) Sulfo-LC-SPDP (hexanoato de sulfosuccinimidil-6-[3-(2-piridilditio)propianamida], Pierce Chem. Co. nº de cat. 2165-G); y (v) sulfo-NHS (N-hidroxisulfosuccinimida, Pierce Chem. Co., nº de cat. 24510) conjugada a EDC.

Los conectores descritos anteriormente contienen componentes que tienen diferentes atributos, conduciendo con ello a conjugados con diferentes propiedades fisicoquímicas. Por ejemplo, los sulfo-NHS ésteres de carboxilatos de alquilo son más estables que los sulfo-NHS ésteres de carboxilatos aromáticos. Los conectores que contienen NHSéster son menos solubles que los sulfo-NHS ésteres. Además, el conector SMPT contiene un enlace disulfuro estéricamente impedido, y puede formar conjugados con mayor estabilidad. Los enlaces disulfuro en general son menos estables que otros enlaces, porque el enlace disulfuro se rompe in vitro, dando como resultado que haya menos conjugado disponible. El sulfo-NHS, en particular, puede potenciar la estabilidad de los acoplamientos de carbodiimida. Los acoplamientos de carbodiimida (tales como EDC), cuando se usan junto con sulfo-NHS, forman ésteres que son más resistentes a la hidrólisis que la reacción de acoplamiento de carbodiimida por sí sola.

Métodos de tratamiento

La invención proporciona métodos profilácticos, profilácticos después de la exposición, y terapéuticos para tratar a un sujeto que está en riesgo (o es susceptible) de contraer una infección por B. anthracis. La inmunización pasiva ha demostrado ser una estrategia eficaz y segura para la prevención y el tratamiento de enfermedades infecciosas. La inmunización pasiva utilizando un anticuerpo monoclonal humano neutralizante proporciona una estrategia de tratamiento inmediata para una profilaxis y un tratamiento de emergencia de una infección por Bacillus anthracis. Además, la inmunización pasiva en un sujeto expuesto al ántrax utilizando un anticuerpo monoclonal humano neutralizante permite al sujeto organizar una respuesta protectora endógena contra el agente infeccioso, haciendo que, con ello, sea innecesaria una inmunización activa con una vacuna del ántrax para la protección futura. El agente infeccioso, en todos sus componentes inmunogénicos y no inmunogénicos, será procesado y presentado al sistema inmunológico concreto, produciendo una inmunidad protectora a largo plazo.

Mediante la unión a Bacillus anthracis, los anticuerpos IQNPA e IQNLF modulan el reconocimiento del antígeno por el sistema inmunológico de un sujeto, induciendo con ello la inmunidad natural del sujeto.

Se evita una infección por Bacillus anthracis, o se reduce el riesgo de desarrollar una infección por Bacillus anthracis en un sujeto, mediante la administración al sujeto de un anticuerpo IQNPA o IQNLF. Un sujeto que está en riesgo de contraer una infección por Bacillus anthracis incluye individuos que se han puesto en contacto, o sospechosos de haberse puesto en contacto, o que pueden ponerse en contacto (es decir, expuestos) con las esporas o con las células vegetativas de una cepa de Bacillus anthracis de cualquier manera. Por ejemplo, ésta puede ser exponiéndose a una nube de esporas del ántrax diseminadas de forma deliberada o no deliberada, tocando suelo, animales o productos animales infectados, o trabajando con esporas o células vegetativas en un laboratorio. La administración de un agente profiláctico se produce antes de la manifestación de los síntomas característicos del Bacillus anthracis, de forma que se previene una enfermedad o un trastorno o, como alternativa, se retrasa su avance o gravedad.

Como alternativa, los anticuerpos IQNPA o IQNLF se administran de modo terapéutico. Por ejemplo, los anticuerpos IQN se administran a un sujeto después de la manifestacón de un síntoma de una infección por Bacillus anthracis. Opcionalmente, los anticuerpos IQN se administran con un régimen de tratamiento con antibióticos. El tratamiento reduce la gravedad o alivia un síntoma de una infección por Bacillus anthracis. La eficacia del tratamiento se determina junto con cualquier método conocido para diagnosticar o tratar una infección por Bacillus anthracis. El alivio de uno o más síntomas de la infección por Bacillus anthracis indica que el compuesto confiere un beneficio clínico.

Los síntomas del Bacillus anthracis varían dependiendo de cómo se contrajo la enfermedad (por ejemplo, cutánea, por inhalación o intestinal), pero los síntomas habitualmente aparecen en 7 días. La mayoría (aproximadamente 95%) de las infecciones de ántrax aparecen cuando la bacteria entra en un corte o una abrasión de la piel, tal como cuando se manipula lana, pieles, cuero o productos capilares contaminados (en especial pelo de cabra) de animales infectados. La infección cutánea comienza con un bulto en relieve que produce picor que parece la picadura de un insecto, pero que en 1-2 días se desarrolla en una vesícula y después en una úlcera indolora, habitualmente con un diámetro de 1-3 cm, con una característica área necrótica negra (muerta) en el centro. Las glándulas linfáticas en el área adyacente pueden hincharse. Aproximadamente 20% de los casos no tratados de ántrax cutáneo acaban en muerte. El síntoma inicial de la inhalación de ántrax puede parecerse a un resfriado común. Después de varios días, los síntomas pueden avanzar a graves problemas respiratorios y choque. El ántrax por inhalación habitualmente es fatal. La forma de enfermedad intestinal del ántrax puede producirse después del consumo de carne contaminada y se caracteriza por una inflamación aguda del tracto intestinal. A los signos iniciales de náuseas, pérdida del apetito, vómitos, y fiebre les sigue el dolor abdominal, vómitos de sangre, y diarrea grave. El ántrax intestinal produce la muerte en 25% al 60% de los casos.

La infección por Bacillus anthracis se diagnostica aislando a B. anthracis de la sangre, lesiones de la piel, o secreciones respiratorias, o midiendo los anticuerpos específicos en la sangre de personas con casos sospechosos.

Los anticuerpos IQNPA o IQNLF se administran antes de la exposición a Bacillus anthracis. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal se administra al menos 1 año antes de la exposición a Bacillus anthracis. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal se administra de 1-7 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses o más antes de la exposición a Bacillus anthracis. Como alternativa, el anticuerpo monoclonal se administra después de la exposición a Bacillus anthracis. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal se administra al menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 8 horas o mas después de la exposición a Bacillus anthracis. El anticuerpo monoclonal se administra 1 día, 2 días, 3 días, 4 días o más después de la exposición a Bacillus anthracis. Los anticuerpos IQNPA

o IQNLF se administran como una dosis individual. Como alternativa, los anticuerpos IQNPA o IQNLF se administran en dosis múltiples. Por ejemplo, los anticuerpos IQNPA o IQNLF se administran en dos, tres, cuatro o cinco dosis. Las dosis se administran con un intervalo, por ejemplo, de 1, 2, 3, 4 o más días.

Opcionalmente, los anticuerpos IQNPA o IQNLF se coadministran con un antibiótico. Como alternativa, los anticuerpos IQNPA o IQNLF se administran antes o después de la administración de un antibiótico. Los antibióticos incluyen, por ejemplo ciprofloxacina, doxiciclina, amoxicilina, y penicilina G procaína.

Una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de la invención se refiere en general a la cantidad necesaria para lograr un objetivo terapéutico. Tal como se indicó anteriormente, éste puede ser una interacción de unión entre el anticuerpo y su antígeno diana que, en ciertos casos, interfiere con el funcionamiento de la diana. La cantidad requerida para ser administrada además dependerá de la afinidad de unión del anticuerpo por su antígeno específico, y también dependerá de la velocidad a la cual un anticuerpo administrado se destruye del volumen libre de otro sujeto al cual se administra. Los intervalos habituales para una dosificación terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o de un fragmento de anticuerpo de la invención pueden ser, como ejemplo no limitante, de aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal. Las frecuencias de dosificación habituales pueden variar, por ejemplo, de dos veces diarias a una vez semanal.

Composiciones de fármacos

En la presente se proporcionan composiciones terapéuticas o profilácticas, que en general comprenden mezclas de uno o más anticuerpos monoclonales IQNPA o IQNLF y sus combinaciones. Las composiciones profilácticas se emplean para evitar una infección por Bacillus anthracis, y las composiciones terapéuticas se emplean para tratar individuos tras una infección por Bacillus anthracis. Los usos profilácticos incluyen el suministro de un título mayor de anticuerpos a Bacillus anthracis en un sujeto tratado. De esta manera, se proporciona a los sujetos con un alto riesgo de contraer Bacillus anthracis una inmunidad pasiva contra Bacillus anthracis.

Opcionalmente, la composición se administra junto con agentes inmunorreguladores auxiliares, por ejemplo citoquinas, linfoquinas, y quimioquinas que incluyen, pero no se limitan a IL-2, IL-2 modificada (Cys125 -Ser125), GM-CSF, IL-12, y-interferón, IP-10, MIP11, y RANTES.

Los anticuerpos o agentes de la invención (también denominados en la presente “compuestos activos”), y sus derivados, fragmentos, análogos y homólogos, se incorporan en composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración. Dichas composiciones generalmente comprenden el anticuerpo o agente, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tal como se emplea en la presente, la expresión “vehículo farmacéuticamente aceptable” pretende incluir cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y que retrasan la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. Los vehículos adecuados se describen en la edición más reciente de Remington’s Pharmaceutical Sciences, un texto de referencia convencional en el campo, que se incorpora en la presente como referencia. Los ejemplos preferidos de dichos vehículos o diluyentes incluyen, pero no se limitan a agua, disolución salina, disoluciones de Ringer, disolución de dextrosa, y albúmina de suero humana al 5%.

Una composición farmacéutica de la invención se formula para que sea compatible con su vía de administración prevista. Los ejemplos de vías de administración incluyen la administración parenteral, por ejemplo intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (es decir, tópica), transmucósica, y rectal. Las disoluciones o suspensiones utilizadas para la aplicación parenteral, intradérmica, o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril, tal como agua para inyección, disolución salina, aceites no volátiles, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos, tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes, tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes, tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA); tampones, tales como acetatos, citratos o fosfatos; y agentes para ajustar la tonicidad, tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringas desechables, o viales de dosis múltiples fabricados de vidrio o plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para un uso inyectable incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles (cuando sean hidrosolubles), y polvos estériles para la preparación improvisada de disoluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen disolución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ), o disolución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida hasta el grado en que pueda inyectarse con facilidad. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y conservación, y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y sus mezclas adecuadas. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión, y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol, y cloruro de sodio en la composición.

Puede lograrse una absorción prolongada de las composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo monoestearato de aluminio y gelatina.

Pueden prepararse disoluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o con una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de una esterilización mediante filtración. En general, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contenga un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos de preparación son un secado al vacío y una liofilización que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier otro ingrediente deseado procedente de una disolución del mismo previamente esterilizada mediante filtración.

Para la administración mediante inhalación, los compuestos se administran en forma de un pulverizado en aerosol desde un recipiente o dispensador presurizado que contiene un propelente adecuado, por ejemplo, un gas, tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.

La administración sistémica también puede ser por medios transmucósicos o transdérmicos. Para la administración transmucósica o transdérmica se emplean en la formulación penetrantes apropiados para la barrera que va a ser permeada. Estos penetrantes son conocidos en general en la técnica e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucósica, detergentes, sales biliares, y derivados del ácido fusídico. La administración transmucósica puede lograrse mediante el uso de pulverizados nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en ungüentos, bálsamos, geles o cremas, según se conoce en general en la técnica.

En una realización, los compuestos activos se preparan con vehículos que protegerán al compuesto frente a la rápida eliminación del cuerpo, tales como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulados. Pueden utilizarse polímeros biodegradables biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, poli(ácido glicólico), colágeno, poliortoésteres, y poli(ácido láctico). Los métodos para la preparación de dichas formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales también se pueden obtener en el mercado de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. También pueden utilizarse suspensiones liposómicas (que incluyen liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerposmonoclonales contra los antígenos víricos) como vehículos farmacéuticamente aceptables. Éstos pueden prepararse según métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, tal como se describe en la patente de EEUU nº 4.522.811.

Resulta especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en una forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y para que la dosificación sea más uniforme. Una forma de dosificación unitaria, tal como se utiliza en la presente, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto que se va a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas de dosificación unitarias de la invención viene dictada y depende directamente de las características exclusivas del compuesto activo y del efecto terapéutico concreto que se va a lograr y las limitaciones inherentes en la técnica de componer este tipo de compuesto activo para el tratamiento de individuos.

Las composiciones farmacéuticas pueden incluirse en un recipiente, un envase, un kit, o un dispensador junto con instrucciones para la administración.

Selección de bacterias de Bacillus anthracis

Los anticuerpos dirigidos contra Bacillus anthracis son útiles en métodos conocidos en la técnica relacionados con la localización y/o la cuantificación de una bacteria de Bacillus anthracis en una muestra. Una bacteria de Bacillus anthracis se detecta en una muestra poniendo en contacto la muestra de la cual se sabe o se sospecha que contiene la bacteria con un anticuerpo IQPN, y detectar la presencia o la ausencia de un complejo de anticuerpobacteria. La presencia de un complejo indica que la muestra contiene Bacillus anthracis. A la inversa, la ausencia de un complejo indica que la muestra no contiene Bacillus anthracis. La muestra se pone en contacto con el anticuerpo IQN in vitro. Como alternativa, la muestra se pone en contacto con el anticuerpo IQN in vivo.

Un anticuerpo IQN se emplea para aislar, es decir detectar, una bacteria de Bacillus anthracis en una muestra mediante técnicas convencionales, tales como inmunoafinidad, cromatografía o inmunoprecipitación. Un anticuerpo IQN también se emplea de modo diagnóstico para controlar los niveles de proteínas en un tejido como parte de un procedimiento de ensayo clínico, por ejemplo para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento concreto. La detección puede verse facilitada por el acoplamiento (es decir, la unión física) del anticuerpo a un marcador detectable. El término “marcado” con respecto a la sonda o al anticuerpo pretende incluir el marcaje directo de la sonda o del anticuerpo mediante acoplamiento (es decir, la unión física) de una sustancia detectable a la sonda o al anticuerpo, así como el marcaje indirecto de la sonda o del anticuerpo por su reactividad con otro reactivo que esté directamente marcado. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, 1-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina, y aequorina; y los ejemplos de materiales radiactivos adecuados incluyen 125I, 131I, 35S o 3H. El marcaje indirecto incluye la detección de un anticuerpo primario utilizando un anticuerpo secundario marcado de modo fluorescente y el marcaje terminal de una sonda de ADN con biotina de forma que pueda detectarse con estreptavidina marcada de modo fluorescente.

La expresión “muestra biológica” pretende incluir tejidos, células y fluidos biológicos aislados a partir de un sujeto, así como tejidos, células y fluidos presentes dentro de un sujeto. Por tanto, se incluye dentro del uso de la expresión “muestra biológica” la sangre y una fracción o un componente de la sangre que incluye el suero sanguíneo, el plasma sanguíneo, o la linfa, lesiones dérmicas, secreciones respiratorias, fluido vesicular o fluido cerebroespinal.

También se incluye en la invención un kit para detectar la presencia de una bacteria de Bacillus anthracis en una muestra. Por ejemplo, el kit puede comprender: un compuesto o agente marcado capaz de detectar a Bacillus anthracis (por ejemplo, IQNPA-1, IQNPA-2, IQNLF-1 o IQNLF-2) en una muestra; un medio para determinar la cantidad de Bacillus anthracis en la muestra; y un medio para comparar la cantidad de Bacillus anthracis en la muestra con un patrón. El compuesto o agente se envasa en un recipiente adecuado. El kit comprende además instrucciones para utilizar el kit para detectar una bacteria de Bacillus anthracis en una muestra.

La invención se ilustrará más a fondo en los siguientes ejemplos no limitantes:

Ejemplo 1: Preparación de anticuerpos monoclonales humanos contra el ántrax

Se emplearon los siguientes métodos generales para preparar anticuerpos monoclonales humanos de la invención.

Reactivos

Se prepara el medio de cultivo DMEM/F12 de HAM (Cambrex Biosciences 12-719F) con bicarbonato de sodio 1300 mg/l (Merck), piruvato de sodio 55 mg/l (Fluka), mercaptoetanol 2,3 mg/l (Merck), gentamicina 60 mg/l (Sigma), y suero bovino fetal al 8% (Wisent). En experimentos de fusión, el medio también se suplementa con hipoxantina 13,61 mg/l (Fluka) y timidina 3,83 mg/l (Fluka). Este medio se denomina DMEM/F12 de HAM/HT.

La selección de los hibridomas se realiza con DMEM/F12 de HAM/HT suplementado con 1% de sobrenadante que contiene IL-6 de la línea celular de carcinoma de vejiga humano T24 (T24CM) y aminopterina 0,4 M (Sigma). Medio de fusión: tampón hipo-osmótico listo para usar (Eppendorf).

Cultivos celulares

Células de timoma EL-4 mutantes, EL4/B5, se cultivaron de modo rutinario en DMEM/F12 de HAM suplementado con FCS al 8% a unas concentraciones de células entre 1 x 104 y 1 x 106 c/ml. Si las células crecen más que 1 x 106 c/ml pueden perder su actividad estimulante de células B. Se emplean células de mieloma murino NS-1, o xenohíbridos K6HKB5 y PAI-1 como compañeros de fusión para células B murinas y humanas, respectivamente. Las células se cultivaron de modo rutinario en DMEM/F12 de HAM/HT suplementado con FCS al 10% a unas concentraciones entre 5 x 104 y 15 x 105 células por ml. Un día antes de la fusión, los cultivos se dividieron 1:3 para crear un cultivo en fase logarítmica el día de la fusión.

Preparación de un sobrenadante de células T/macrófagos humanos (TSN)

Células mononucleares recién aisladas se centrifugaron durante 10 min a 2000 N/kg. Posteriormente, las células B y T se separaron según una modificación del método descrito por Gutiérrez et al. (1979). El sedimento se resuspendió en 5 ml de SIP al 100%. Después se colocó una capa de 10 ml de SIP al 70%, seguido de una capa de 25 ml de SIP al 50%, sobre SIP al 100%. El gradiente se centrifugó durante 10 min a 25.000 N/kg. La fracción enriquecida en células T que permanece en la interfase entre SIP al 70% y al 50% se recoge y se lava dos veces con DMEM/F12 de HAM suplementado con FCS al 10%. Las células lavadas se estimulan durante 40-45 h en DMEM/F12 de HAM suplementado con FCS al 10%, PHA 5 g/ml (Wellcome), y PMA 10 ng/ml (Sigma). Por último, el sobrenadante se recoge, se filtra a través de un filtro de membrana de 0,2 m y se conserva en partes alícuotas a -70 ºC.

Cultivos de células B/EL-4

Se preparan cultivos de células B/EL-4 según se describe en Zubler et al. Brevemente, células B brutas o purificadas se mezclan con TSN y se irradian (2500 RAD) 50.000 células B5/EL-4 en un volumen final de 2001 DMEM/F12 de HAM suplementado con FCS al 10% en placas de cultivo de tejidos de fondo plano de 96 pocillos. Se establece la cantidad óptima de TNS para cada lote mediante titulación. Normalmente TSN al 10% es suficiente para una estimulación óptima de las células B humanas, mientras que normalmente se requiere TSN al 20% para células B murinas. Los cultivos se incuban a 37 ºC con CO2 al 5% y humedad al 100%. Entre el día 8 y el día 12 se ensayan los sobrenadantes para la producción de inmunoglobulinas.

Aislamiento de células mononucleares

Se extrae sangre de una vacuna del ántrax, 5-10 días después de la última inyección de refuerzo. La sangre se diluye 50/50 en v/v con PBS estéril y se centrifuga en Isopaque Ficoll (45 min, 400 g). Las células mononucleares resultantes de este procedimiento se utilizan frescas, o se congelan en N2 líquido.

Enriquecimiento de células B humanas

Las células mononucleares aisladas (frescas o descongeladas) se enriquecieron para los linfocitos B con el protocolo de “células B intactas” de un aparato AutoMACS (Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA). Esta suspensión enriquecida de células B se empleó fresca, o se descongeló de N2 líquido.

Expansión con CD40 de linfocitos

Los linfocitos B enriquecidos se expandieron utilizando el sistema de expansión 3T6CD40L. Brevemente, se recogieron células 3TCD40L a una confluencia de aproximadamente 80%. El medio de cultivo se rechazó y se añadió tampón EDTA (6 ml en T75 o 3 ml en T25). Las células se resuspendieron y se irradiaron con 100 Gy con una fuente de Cs137. Las células se lavaron en medio de linóleo y se contaron. La concentración requerida en 24 pocillos: 8 x 10e4 ml; en 96 pocillos: 2 x 10e5/ml. Se añadió una cantidad y un volumen similares de células B a las células 3T6CD40L irradiadas (es decir, 1:1). Se añadió rhIL-4 10 ng/ml al cultivo.

El medio de cultivo se refrescó, -mitad del volumen +IL-4 cada 3 días. Cada 7 días se añadieron células 3T6CD40L recién irradiadas (2 x 105 en 24 pocillos; 5 x 10e3 en 96 pocillos), o las células B se recolectaron y se trasladaron a una nueva placa con 3T6CD40L recién irradiadas (la misma concentración que el cultivo inicial). Después de aproximadamente 5 a 7 días fueron visibles en el cultivo las características agrupaciones de células B. Las células B cultivadas se recolectaron entre los días 5 y 11 resuspendiendo con cuidado las células con una pipeta Pasteur.

Procedimiento de inmunoadsorción

Placas de cultivo de 6 pocillos se incubaron durante la noche con 4 ml por pocillo de una disolución que contenía de 1 a 10 ug de antígeno en tampón de carbonato de sodio 0,05 M, pH = 9,6. Después, los pocillos se lavaron con PBS y se utilizaron directamente para los experimentos de inmunoadsorción o se conservaron a 20 ºC. La inmunoadsorción se realizó incubando las células B enriquecidas en pocillos revestidos con el antígeno durante 1 a 2 horas a 37 ºC, CO2 al 5% y humedad al 100%. Después de esta incubación, las células no unidas se retiraron con suavidad mediante tres lavados sucesivos con PBS. Después las células B específicas unidas al antígeno se recuperaron incubando cada pocillo con 250 ul de PBS que contenía EDTA-Na2 1,1 mM y tripsina al 0,05% (Flow, nº de cat. 16-893-49), pH = 7,5, durante 2 minutos. El tratamiento con tripsina se detuvo mediante la adición de 5 ml de DMEM/F12 de HAM suplementado con FCS al 10%. Por último, toda la superficie de los pocillos se enjuagó con el medio utilizando una pipeta Pasteur para eliminar las células B unidas residuales de un modo mecánico.

Electrofusión

La electrofusión de los linfocitos a células de mieloma K6H6B5 se realiza en una proporción que varía de 1:0,5 a

1:10 en 60 !l de medio de fusión en una microcámara. Los cultivos de células B se mezclaron con células de mieloma en tubos de centrífuga de 2 ml. Se eliminó el suero de las células lavando una vez con medio de fusión. Después la suspensión celular se centrifugó y el sedimento se resuspendió en 60 !l de medio de fusión a temperatura ambiente. La suspensión celular completa se pipeteó hacia el espacio interno de una cámara de fusión. La cámara consiste en dos electrodos con forma de disco de acero inoxidable introducidos en una caja de Perspex. Los electrodos están separados por un espaciador de Teflón con diámetro variable y un espesor de 0,50 mm. El alineamiento se produce mediante un campo eléctrico alterno de 1 MHz y 150 V/cm durante 30 sg, seguido inmediatamente por un pico de pulso de 1500 V/cm durante 15 !s. Después se aplicó inmediatamente un pulso cuadrado de alto campo de 3 kV/cm y una duración de 10 s que provoca la rotura de la membrana celular. De nuevo se aplica el campo alterno durante 30 s para permitir el entremezclado de las células y para volver a sellar las membranas. Los contenidos de la cámara de fusión se trasladaron a 20 ml de un medio de selección (HAT) y se

cultivaron en placas de microcultivo de 96 pocillos. En el día 9, los cultivos se estudiaron para observar el crecimiento del hibridoma, y los sobrenadantes se ensayaron para la producción de inmunoglobulinas.

Fusión de PEG

La fusión de PEG con las células de mieloma (K6H6/B5) se produce en una proporción 1:1 en 1-1,5 ml de una disolución de PEG 4000 (al 50%) durante 3 minutos. Después de dos etapas de lavado (la etapa uno con DMEM/F12, y la etapa dos con medio-HT), estos productos de fusión se sembraron en placas de microvaloración y se cultivaron en medio de selección (HAT) durante 9 días.

Los anticuerpos monoclonales específicos para B. anthracis se seleccionaron mediante métodos conocidos en la técnica.

Ejemplo 2: Evaluación in vitro de la actividad de neutralización de anticuerpos monoclonales humanos contra el ántrax

Se determinó la capacidad de los hMab IQNPA-1 e IQNPA-2 para neutralizar la toxina del ántrax in vitro. Las células diana se expusieron al antígeno protector de B. anthracis (AP) que se había preincubado con los hMab IQNPA-1 e IQNPA-2 (preexposición). Como alternativa, las células diana se incubaron con AP antes de una exposición a los hMab IQNPA-1 e IQNPA-2 (postexposición).

Preexposición

Brevemente, 50.000 células RAW/pocillo se cultivaron (células diana). AP y hMab se preincubaron durante 1 hr y después se añadieron al cultivo de células RAW. Se añadió el factor letal (FL) y el cultivo se incubó durante 12 a 15 hr a 37 ºC. Se añadió WST-1 y se midió la DO450 a 1 y 2 horas. Este experimento se repitió dos veces. Los resultados se muestran en las figuras 1 y 2.

Postexposición

Las células RAW264.7 (células diana) se incubaron con PA durante 2 horas o durante 3 horas antes de la adición de los hMab IQNPA-1 e IQNPA-2. Se añadió el FL y IQNPA-1 e IQNPA-2, y el cultivo se incubó de 12 a 15 horas a 37 ºC. Se añadió WST-1 y se midió la DO450 a 1 y 2 horas. Este experimento se repitió dos veces. Tal como se muestra en las figuras 3-4, los hMab IQNPA-1 e IQNPA-2 fueron capaces de neutralizar totalmente la toxina letal después de que el antígeno protector se hubiera unido a las células diana.

En otros experimentos, las células diana se expusieron a AP. Después de una hora, se añadieron al cultivo los hMab IQNLF-1 e IQNLF-2 que reconocían al FL y se incubaron durante 15 horas a 37 ºC. Se añadió WST-1 y se midió la DO450 a 1 hora. Los resultados se muestran en la figura 5.

Ejemplo 3: Comparación in vitro de la actividad de neutralización de anticuerpos monoclonales humanos contra el ántrax con el suero AVR414

Se comparó la actividad de neutralización de la toxina de los hMab IQNPA-1 e IQNPA-2 con la actividad de sueros procedentes de individuos inmunizados con la vacuna del ántrax humana (AVA). Este suero se denomina AVA414. El ensayo se realizó en el Center for Disease Control (Atlanta, Georgia). Tal como se muestra en la figura 7, ambos hMab IQNPA-1 e IQNPA-2 fueron 25 x más eficaces para neutralizar la toxina del ántrax en el ensayo de protección del 99%.

Ejemplo 4: Determinación de la afinidad de anticuerpos monoclonales humanos contra el ántrax

Se analizó la cinética y la afinidad de unión de los hMab neutralizantes IQNPA-1 e IQNPA-2 por el antígeno protector de B. anthracis purificado mediante resonancia de plasmón de superficie (BIAcore 3000, Suecia). El antígeno protector de B. anthracis se inmovilizó covalentemente sobre un chip detector CM5 a través de un grupo amina utilizando el kit de acoplamiento de amina (BIAcore). Se midieron los parámetros cinéticos de la unión con anticuerpos a diferentes concentraciones molares, y se evaluaron con el programa informático de evaluación BIA. Los resultados se muestran en la tabla 1.

Tabla 1. Velocidades cinéticas y afinidad de unión de los huMab IQNPA-1 e IQNPA-2

ka (1/Ms): kd (1/s) Rmax (RU) KA (1/M) KD (M) Chi2

IQNPA-1: 1,6e5 1,93e-5 939 8,31e9 1,2e-10 89,5

IQNPA-2: 1,78e5 1,81e-5 1090 9,86e9 1,01e-10 211

Ejemplo 5: Identificación del epitopo reconocido por los anticuerpos monoclonales contra el ántrax

Para determinar los epitopos reconocidos por los huMab, IQNPA-1 e IQNPA-2 se seleccionaron contra los dominios del antígeno protector recombinante. Se seleccionaron los siguientes dominios de AP: GST-1; GST1-2; GST1-2-3; GST1-2-3-4; GST3-4; y GST-4. La concentración inicial de los huMab fue: IQNPA-1, 0,77 mg/ml, y IQNPA-2, 0,65

5 mg/ml.

Brevemente, una placa de microtitulación se revistió para cada dominio o combinación de dominios. La concentración de revestimiento se determinó para la concentración molar de cada dominio. Cada Mab se analizó por duplicado a dos diluciones iniciales de 1:1000 y 1:10.000. El ensayo se realizó como sigue:

1. Las placas se revisten con los dominios (50 !l por pocillo) y se incuban durante la noche a 4 ºC.

: 10 2. Se lava y se bloquea con Blotto al 5% durante 2 horas a 37 ºC.

3.: Se lava y se añaden los mAb diluidos 1:1000 (2 !l en 1,998 ml) y 1:10.000 (200 !l de 1:1000 en 1,8 ml) en Blotto al 1%. Se añaden 100 !l en los primeros dos pocillos y se diluye en serie a través de la placa en 50 !l. Se incuba durante la noche a 4 ºC.

4.: Se lava. Se añade anti-IgG humana de cabra-HRP diluido 1:6000. Se incuba durante 1 hora a 37 ºC.

: 15 5. Se lava. Se añade ABTS y se realiza una lectura a intervalos de 10, 20 y 30 minutos.

Concentraciones de revestimiento de la placa

El revestimiento de la placa con rAP de longitud completa fue con 5 !g/ml. Como es una proteína de 83 kDa, esto es igual a 6,02 x 10-11 moles por ml. Por tanto, se han calculado los revestimientos de la placa equimolares a partir de su peso molecular (suponiendo una unión insignificante del marcador de GST).

20 Tabla 2

Dominio: PM en Daltons Conc. de revestim. (!g/ml) para 6,02 x 10-11 moles/ml Conc. de la disolución madre de proteínas de dominio (mg/ml) vol. de la disolución madre requerido para revestir una placa

GST 1: 57400 3,45 4,4 3,9 !l en 4,9961 ml

GST 1 a 2: 82600 4,97 1,6 15,5 !l en 4,9845 ml

GST 1 a 3: 94500 5,69 0,9 31,6 !l en 4,9684 ml

GST 1 a 4: 109000 6,56 1,3 25,2 !l en 4,9748 ml

GST 3 a 4: 53300 3,21 4,4 3,6 !l en 4,9964 ml

GST 4: 41400 2,49 4,6 2,7 !l en 4,9973 ml

Tal como se muestra en la tabla 3, ambos huMab sólo reconocieron las proteínas de dominio de AP que contenían el dominio 4. Los ensayos contra GST-1, 1 a 2, y 1 a 3 se repitieron con proteínas de revestimiento de la placa que previamente no se habían utilizado, a una dilución inicial de la muestra de 1:100 y con una muestra de control

25 positivo para determinar que no había problema con el ensayo. Puesto que los títulos de punto final de las tres proteínas de dominio que contenían el dominio 4 son aproximadamente iguales, esto sugiere que los huMab se unen de modo específico sólo a la porción del dominio 4 de las proteínas del antígeno protector.

Tabla 3

Dominio: Título de punto final

IQNPA-1: IQNPA-2

GST 1: <1:100* <1:100*

GST 1 a 2: <1:100* <1:100*

GST 1 a 3: <1:100* <1:100*

GST 1 a 4: 1:256000 1:128000

GST 3 a 4: 1:256000 1:256000

GST 4: 1:256000 1:128000

* Estos ensayos se repitieron con mAb a una dilución inicial de 1:100.

Ejemplo 6: Evaluación in vivo de la eficacia protectora preexposición de anticuerpos monoclonales humanos contra el ántrax

Los huMab IQNPA-1 e IQNPA-2 reconocen al antígeno protector de Bacillus anthracis. Los huMab han demostrado neutralizar la citotoxicidad inducida por la toxina letal en una línea celular eucariota in vitro. El objetivo de este 5 estudio fue determinar si la inhibición de la citotoxicidad que se observa in vitro se correlaciona con la eficacia protectora in vivo.

Se administró cada uno de los huMab a grupos de 5 ratones A/J (Harlan, Reino Unido) por vía intraperitoneal a una dosis estándar de 200 !g en 0,1 ml de PBS (igual a 10 mg/kg de peso corporal, suponiendo 20 g por ratón). Se administró un suero de referencia que comprende partes alícuotas reunidas de antisuero de macaco rhesus

10 (referencias de los animales 221 y 224) contra rAP a grupos de 5 ratones a unos niveles de dosis de 200 !g y 500 !g, cada uno en 0,1 ml de PBS. La exposición se administró 2,5 horas después de la inmunización pasiva mediante la vía de inyección intraperitoneal. La exposición consistía en la cepa STI de B. anthracis, administrada a una dosis de 4,18 x104 esporas/0,1 ml.

La observación inicial después de la inmunización demuestra que los ratones no reaccionan de forma adversa a la

15 IgG extraña administrada. Cada uno de los huMab administrados a un nivel de dosis de 200 !g protegía totalmente a los ratones frente a la exposición de ántrax inyectado (tabla 4). El suero de referencia de macaco confiere una protección del 40% a cualquiera de los niveles de dosis de 200 !g o 500 !g.

Tabla 4. Número de ratones A/J que sobreviven 10 días después de la exposición

Ratón receptor: Elemento Concentración de IgG en los grupos de tratamiento (!g/ratón) Supervivientes/nº expuesto (%) en el día 10

1: IQNPA-1 200 5/5 (100)

2: IQNPA-2 200 5/5 (100)

3: Elemento de referencia 200 2/5 (40)

4: Elemento de referencia 500 2/5 (40)

5: Sin estimular - 0/5 (0)

20 Ejemplo 7: Determinación de la DE50 in vivo de los anticuerpos monoclonales humanos contra el ántrax

El objetivo de este estudio es determinar la relación entre la dosis de huMab admistrada y la protección conferida por la transferencia pasiva en el modelo de ratón, e identificar una dosis eficaz al 50% (DE50).

El estudio se realizó en ratones A/J hembra de la misma edad (Harlan, Reino Unido). Cada huMab se tituló en una curva de dosis-respuesta para determinar la DE50. Cada huMab se diluyó según se describe en la tabla 5, para 25 lograr los niveles de dosis requeridos. Se administraron unos niveles de dosis de cada huMab en el intervalo de 100 !g a 2,5 !g por vía intraperitoneal (i.p.) a grupos de 5 ratones, a las 2,5 horas antes de la exposición a 4,64 x 104 esporas/0,1 ml (aproximadamente 30 DLM) de la cepa STI de B. anthracis. Se administró un suero de referencia que comprende partes alícuotas reunidas de antisuero de macaco rhesus contra rAP (referencias de los animales 221 y 224) a grupos de 5 ratones A/J en el mismo intervalo de dosis. Se determinó la supervivencia de los ratones a los 10

30 días después de la exposición.

Tabla 5. Preparación de diluciones en serie de los elementos de ensayo y de referencia para lograr las diluciones de trabajo

Elemento: Concentraciones Elemento (ml) PBS (ml) Dosis

0,77 mg/ml: 1,00 0,54 100 !g/0,2 ml

IQNPA-1: 100 !g/0,2 ml 0,50 0,50 25 !g/0,1 ml

100 !g/0,2 ml: 0,20 0,80 10 !g/0,1 ml

25 !g/0,1 ml: 0,10 0,90 2,5 !g/0,1 ml

0,65 mg/ml: 1,00 0,30 100 !g/0,2 ml

IQNPA-2: 100 !g/0,2 ml 0,50 0,50 25 !g/0,1 ml

100 !g/0,2 ml: 0,20 0,80 100 !g/0,1 ml

25 !g/0,1 ml: 0,10 0,90 2,5 !g/0,1 ml

Referencia -221: 5,92 mg/ml 0,10 0,49 100 !g/0,1 ml

Referencia -224: 6,09 mg/ml 0,10 0,51 100 !g/0,1 ml

Elemento de: 100 !g/0,1 ml 0,20 0,60 25 !g/0,1 ml

referencia reunido: 100 !g/0,1 ml 0,10 0,90 10 !g/0,1 ml

(221 + 224): 25 !g/0,1 ml 0,10 0,90 2,5 !g/0,1 ml

La observación inicial después de la inmunización demuestra que los ratones no reaccionaron de forma adversa a los huMab, aunque se produjo una reacción adversa transitoria contra el suero de referencia de macaco (atribuido al contenido en urea). Todos los ratones se recuperaron antes de la exposición. Ambos huMab ofrecieron protección 5 en el ensayo de 10 días de una manera relacionada con la dosis. La protección ofrecida fue mayor que la del suero de referencia, que protegión 60% de los animales al nivel de dosis mayor (tabla 6). El efecto de la dilución de los huMab y del suero de referencia sobre la supervivencia a lo largo de diez días se muestra en las figuras 7-9. Los huMab se comportaron de forma muy similar, proporcionando los niveles de dosis de 100 !g y 25 !g una protección del 80%, y proporcionando el nivel de dosis de 2,5 !g una protección del 60%. De manera sorprendente, el nivel de

10 dosis de 10 !g de cada huMab proporcionó la protección mínima, aunque el tamaño de los grupos era demasiado pequeño para esto pueda identificarse como un resultado significativo diferente del nivel de dosis de 2,5 !g. Se muestra una curva de dosis-respuesta de la tasa de supervivencia para los huMab y el antisuero de referencia (figura 10).

Tabla 6. Número de ratones A/J que sobreviven 10 días después de la exposición

1: IQNPA-1 100 4/5 (80)

2: 25 4/5 (80)

3: 10 1/5 (20)

4: 2,5 3/5 (60)

5: IQNPA-2 100 4/5 (80)

6: 25 4/5 (80)

7: 10 2/5 (40)

8: 2,5 3/5 (60)

9: Elemento de referencia 100 3/5 (60)

10: 25 0/5 (0)

11: 10 0/5 (0)

12: 2,5 0/5 (0)

15 Hubo poca diferencia en el tiempo hasta la muerte para cada uno de los huMab. Al nivel de dosis de 25 !g, el huMab IQNPA-1 muestra un tiempo hasta la muerte retrasado comparado con el huMab IQNPA-2, pero se produjo un resultado inverso al nivel de dosis de 100 !g.

El diseño de ensayo utilizado en este estudio es un ensayo de líneas paralelas en el que la eficacia del huMab se

20 compara con la eficacia del antisuero de referencia. Puesto que el antisuero de referencia sólo protege a los ratones al nivel de dosis mayor, los datos no pudieron incluirse en los análisis estadísticos. Cuando los datos de los huMab se compararon para la linealidad, las pendientes generadas mediante la titulación de cada huMab no se diferenciaban significativamente (p > 0,05) (tabla 7). Se realizó un análisis probit sobre las pendientes para cada huMab (figura 11). Los valores de DE50 se derivaron para cada huMab y se calculó su potencia relativa (tabla 8). A

25 partir de este cálculo puede observarse que el huMab IQNAP-1 es la mitad de potente que el huMab IQNPA-2.

Tabla 7. Resumen de los análisis estadísticos de las pendientes de dilución de las vacunas con los valores de P

Ensayo estadístico: Valor de P*

Constante: 0,476

Dilución: 0,144

1 comparado con 2: 0,741

Pendientes iguales: 0,932

* valor de P < 0,05 significativamente diferente

Tabla 8. Cálculo de los valores de DE50 y potencia relativa de los huMab

Elemento: DE50 (!g/ml) Potencia relativa de IQNPA-1 frente a IQNPA-2

IQNPA-1: 4,8511 0,5503

IQNPA-2: 2,6696

En resumen, el resultado de este estudio demuestra que ambos huMab proporcionan protección frente a una exposición con ántrax en el modelo de ratón. El análisis probit indica que IQNPA-2 es el doble de potente que IQNPA-1 (figura 11).

Ejemplo 8: Evaluación in vivo de la eficacia protectora después de la exposición de anticuerpos monoclonales humanos contra el ántrax

El objetivo de este estudio es determinar si los huMab pueden ser eficaces cuando se administran mediante una terapia postexposición y, si es así, determinar la ventana terapéutica de la postexposición.

Se administró a ratones A/J 200 !g de huMab por vía intraperitoneal a las 4 horas, 8 horas, 12 horas y 24 horas después de la exposición a la cepa STI de B. anthracis, administrada a una dosis de 5,6 x 104 esporas/0,1 ml, equivalente a aproximadamente 40 dosis letales medias (DLM). Tal como se muestra en la tabla 9 y en la figura 12, ambos huMab proporcionaron protección frente a la infección. El ligero avance que se observó en los días 10 y 20 en los grupos dosificados con IQNPA-2 e IQNPA-1, respectivamente, a las 8 h después de la exposición no fue significativo (1 animal de 5).

Los anticuerpos huMab IQNPA ensayados no se diferenciaban significativamente entre sí en la protección que confieren a los ratones receptores mediante transferencia pasiva. Ambos IQNPA-1 e IQNPA-2 son protectores en el modelo de ratón cuando se administran hasta 24 horas después de la exposición a la cepa STI de B. anthracis, y la protección se mantiene a lo largo de 20 días después de la exposición, cuando se esperaría que los títulos de los anticuerpos transferidos de forma pasiva estuviesen disminuyendo. El elemento de referencia ofrece menos protección a los ratones a lo largo del tiempo.

En resumen, estos estudios demuestran que los anticuerpos monoclonales totalmente humanos IQNPA-1 y 2 son fármacos útiles para el tratamiento profiláctico y postexposición del ántrax.

Tabla 9. Número de ratones A/J supervivientes 20 días después de la exposición

nº de jaula del ratón receptor (n = 5): Grupos de tratamiento Tiempo de tratamiento postexposición Supervivientes/número expuesto (%) en el día 10 Supervivientes/número expuesto (%) en el día 20

1: IQNPA-1 200 !g/ratón +4 h 5/5 5/5

2: +8 h 5/5 4/5

3: +12 h 5/5 5/5

4: +24 h 5/5 5/5

5: IQNPA-2 200 !g/ratón +4 h 5/5 5/5

6: +8 h 4/5 4/5

7: +12 h 5/5 5/5

8: +24 h 5/5 5/5

9: Elemento de referencia (muestras reunidas 221 + 224) +4 h 4/5 4/5

10: +8 h 4/5 3/5

11: +12 h 3/5 2/5

12: +24 h 1/5 0/5

En un segundo estudio se administró a ratones A/J 180 !g de huMab por vía intraperitoneal a las 24 horas, 36 horas, y 48 horas, o 1000 !g de huMab por vía intraperitoneal a las 4 horas, 8 horas, 12 horas y 24 horas después de la exposición a la cepa STI de B. anthracis, administrada a una dosis de 3,4 x 104 esporas/0,1 ml, equivalente a aproximadamente 25 dosis letales medias (DLM). Tal como se muestra en la tabla 10 y en la figura 13, IQNPA-2 ofreció protección frente a la infección a lo largo de 10 días después de la exposición. Se observó una protección total en ratones dosificados con 100 !g del elemento de ensayo a las 24 horas después de la exposición. La protección total se extendió a las 36 horas después de la exposición cuando los ratones fueron dosificados con 180 !g del elemento de ensayo (tabla 10). La figura 13 muestra el efecto sobre la supervivencia de los ratones cuando se vacunan en diferentes momentos después de la exposición. El elemento de referencia ofrece menos protección a los ratones a lo largo del tiempo.

Tabla 10. Número de ratones A/J que sobreviven 10 días después de la exposición

nº de jaula del ratón receptor (n = 5): Grupos de tratamiento Tiempo de tratamiento después de la exposición Supervivientes/nº expuesto (%) en el día 10

1: IQNPA-1 180 !g/ratón +24 h 5/5

2: +36 h 5/5

3: +48 h 3/5

4: IQNPA-2 100 !g/ratón +4 h 4/5

5: +8 h 5/5

6: +12 h 5/5

7: +24 h 5/5

8: +36 h 2/5

9: +48 h 3/5

10: Elemento de referencia (muestras reunidas 221+224) +8 h 3/5

11: +12 h 2/5

12: +24 h 1/5

Otras realizaciones

Aunque en la presente se han descrito con detalle realizaciones concretas, esto se ha hecho como ejemplo sólo con

5 un objetivo ilustrativo y no pretende ser limitante con respecto al alcance de las reivindicaciones adjuntas, que aparecen a continuación. En particular, los inventores contemplan que pueden realizarse diversas sustituciones, alteraciones y modificaciones en la invención sin apartarse del espíritu y del alcance de la invención según se define mediante la reivindicaciones. Se considera que otros aspectos, ventajas y modificaciones están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones. Las reivindicaciones presentadas son representativas de las invenciones

10 descritas en la presente.

Claims

REIVINDICACIONES

1.-Un anticuerpo monoclonal totalmente humano aislado o un fragmento funcional de éste, que se une a un epitopo en una región del polipéptido del antígeno protector de Bacillus anthracis y neutraliza la toxina letal de Bacillus anthracis, en el que dicho anticuerpo o su fragmento funcional tiene una cadena pesada con tres CDR, comprendiendo las CDR KKPGA (SEQ ID NO:11), SNAIQWVRQAPGQRLEW (SEQ ID NO:12) y YMELSSLR (SEQ ID NO:13), respectivamente, y tiene una cadena ligera con tres CDR, comprendiendo las CDR LTQSPGTLSLS (SEQ ID NO:14), SYSSLAW (SEQ ID NO:15) y GPDFTLTIS (SEQ ID NO:16), respectivamente.
2.-El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1, en el que la región del polipéptido del antígeno protector es el dominio 4.
3.-El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo monoclonal comprende un polipéptido de cadena pesada codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:1.
4.-El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo monoclonal comprende un polipéptido de cadena ligera codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:3.
5.-El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1, que comprende al menos un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, y al menos un polipéptido de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, en el que dicho anticuerpo o fragmento funcional se une a un epitopo en una región del polipéptido del antígeno protector de Bacillus anthracis y neutraliza el polipéptido de la toxina letal de Bacillus anthracis.
6.-Un anticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su uso en un método para disminuir el riesgo de desarrollar una infección por Bacillus anthracis en un sujeto.
7.-El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 6, en el que el anticuerpo monoclonal se administra antes de la exposición a Bacillus anthracis.
8.-El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 6, en el que el anticuerpo monoclonal se administra después de la exposición a Bacillus anthracis.
9.-El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 6, en el que el sujeto es asintomático para una infección por Bacillus anthracis.
10.-Un anticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para su uso en un método para aliviar un síntoma de una infección por Bacillus anthracis.
11.-El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 10, en el que el alivio de un síntoma comprende además administrar un antibiótico.
12.-Un anticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para su uso en un método para inducir una protección inmunológica a largo plazo endógena frente al Bacillus anthracis en un sujeto expuesto a Bacillus anthracis.
13.-El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 12, en el que el sujeto no ha sido vacunado contra Bacillus anthracis.
14.-Una composición para su uso en un método de vacunación de un sujeto, que comprende el anticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y el polipéptido del antígeno protector de Bacillus anthracis.
15.-Un anticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para su uso en un método para modular una respuesta inmunológica contra Bacillus anthracis en un sujeto expuesto a un antígeno de Bacillus anthracis.
16.-Un método para detectar la presencia de una bacteria de Bacillus anthracis en una muestra ex vivo, que comprende:

a) poner en contacto dicha muestra con el anticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones 1-5; y

b) detectar la presencia o la ausencia de un complejo de anticuerpo-bacteria, detectando con ello la presencia de dicha bacteria de Bacillus anthracis en dicha muestra.
17.-El método de la reivindicación 16, en el que dicho anticuerpo monoclonal comprende además un marcador.
18.-El método de la reivindicación 16, en el que dicha muestra se obtiene de la sangre, de una lesión dérmica, de secreciones respiratorias, de fluido vesicular o de fluido cerebroespinal. 19.-Una composición que comprende el anticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y un

5 vehículo. 20.-Una vacuna pasiva contra Bacillus anthracis, que comprende la composición de la reivindicación 19. 21.-Un kit que comprende, en uno o más recipientes, el anticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones

1-5.
22.-Una célula que produce el anticuerpo monoclonal o un fragmento de éste de cualquiera de las reivindicaciones 10 1-5.