ES2376345T3 - Procedimiento de preparación (2r,3s)-1,2-epoxi-3-(protegido)amino-4-butano sustituido e intermedios del mismo. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento que comprende preparar (2R,3S)-1-halo-2-hidroxi-3-(protegido)amino-4-butano sustituido de la fórmula: **Fórmula** en la que X es a halógeno, R se selecciona entre alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, y arilo sustituido, y R1 representa un grupo protector de amino, poniendo en contacto un Rhodococcus erythropolis mutagenizado que tiene Nº de depósito de ATCC PTA-6648 con de 2,5 a aproximadamente 6% p/v, basado en sustrato, de sustrato de (3S)-1-halo-2-oxo-3-(protegido)amino-4-butano sustituido de la fórmula: **Fórmula** en la que X, R, y R1 son como se han definido anteriormente.

Description

Procedimiento de preparacion (2R,3S)-1,2-epoxi-3-(protegido)amino-4-butano sustituido e intermedios del mismo

Referencia cruzada a solicitud relacionada

La presente solicitud reivindica los beneficios de la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° 5 60/684.300, presentada el 25 de mayo de 2005.

Campo de la invención

La presente invencion se refiere a un procedimiento para preparar (2R,3S)-1,2-epoxi-3-(protegido)amino-4-butano sustituido e intermedios del mismo. Mas especificamente, la invencion se refiere al uso de una cepa de Rhodococcus erythropolis mutagenizada que tiene numero de deposito ATCC PTA-6648 para reducir

10 microbiologicamente (3S)-1-hato-2-oxi-3-(protegido)amino-4-butano sustituido a (2R,3S)-1-halo-2-hidroxi-3(protegido)amino-4-butano sustituido. La presente invencion tambien se refiere a la conversion de (2R,3S)-1-halo-2hidroxi-3-(protegido)amino-4-butano sustituido en (2R,3S)-1,2-epoxi-3-(protegido)amino-4-butano sustituido y al aislamiento de cristales de (2R,3S)-1,2-epoxi-3-(protegido)amino-4-butano sustituido.

Antecedentes de la invención

15 Los 1-halo-2-hidroxi-3-(protegido)amino-4-butanos sustituidos representados por la siguiente formula general:

en la que X es un halogeno, R se selecciona entre alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, y arilo sustituido, y R1 representa un grupo protector de amino, son utiles en la produccion de derivados de butano 1,2-epoxi-3-(protegido)amino-4-sustituido representados por la siguiente formula general:

en la que R y R1 son como se han definido anteriormente. Los butanos 1-halo-2-hidroxi-3-(protegido)amino-4sustituido de formula 1 pueden prepararse reduciendo microbiologicamente un sustrato de (3S)-1-halo-2-oxo-3(protegido)amino-4-sustituido sustituido que tiene la siguiente formula general:

25 en la que X, R y R1 son como se han definido anteriormente.

Los derivados de 1,2-epoxi-3-(protegido)amino-4-butano sustituido de formula (2) pueden usarse para producir diversos inhibidores de proteasa de VIH, ACE y renina. Los diversos inhibidores de proteasa de VIH que pueden producirse con el intermedio de la formula (2) incluyen, pero sin limitacion, por ejemplo, los inhibidores de proteasa de VIH desvelados en la Patente de Estados Unidos N° 5.849.911 de la columna 2, linea 13 a la columna 12, linea

30 59. El inhibidor de proteasa de VIH tipico que puede producirse mediante el intermedio de la formula (2) incluye pero sin limitacion, por ejemplo, el compuesto de ester dimetilico del acido [3S-(3R*,8R*,9R*,12R*)]-3,12-bis(1,1dimetiletil)-8-hidroxi-4,11-dioxo-9-(fenilmetil)-6{[4-(2-piridinil)fenil]metil}-2,3,6,10,13-pentaazaretetradecanodioico desvelado en la Patente de Estados Unidos N° 5.849.911.

Los derivados de 1,2-epoxi-3-(protegido)amino-4-butano sustituido de la formula (2) pueden sintetizarse de acuerdo 35 con, por ejemplo, el siguiente esquema de reaccion (1):

en el que X, R y R1 de cada una de las Formulas 4-8 son como se han definido anteriormente. De acuerdo con el esquema de reaccion (1), la reduccion microbiana del sustrato de formula 3 en el diastereomero de (2R,3S)-1-halo2-hidroxi-3-(protegido)amino-4-butano sustituido de formula 4 tambien puede dar como resultado la produccion de 5 un subproducto de diastereomero de (2S,3S)-1-halo-2-hidroxi-3-(protegido)amino-4-butano sustituido no deseado de formula 5 y una impureza des-halo alcohol de (3S)-2-hidroxi-3-(protegido)amino-4-butano sustituido indeseada de formula 8. El diastereomero de (2R,3S)-1-halo-2-hidroxi-3-(protegido)amino-4-butano sustituido deseado de formula 4 se trato posteriormente con una base y se epoxido para dar el (2R,3S)-1,2-epoxi-3-(protegido)amino-4-butano sustituido deseado de formula 6. El subproducto de diasteromero de (2S,3S)-1-halo-2-hidroxi-3-(protegido)amino-4

10 butano sustituido no deseado de formula 5, sin embargo, debe tratarse con una base epoxidada para dar el (2S,3S)1,2-epoxi-3-(protegido)amino-4-butano sustituido de formula 7.

Sumario de la invención

La presente invencion se refiere a un procedimiento que comprende preparar (2R,3S)-1-halo-2-hidroxi-3(protegido)amino-4-butano sustituido de la formula:

en la que X es a halogeno, R se selecciona entre alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, y arilo sustituido, y R1 representa un grupo protector de amino, poniendo en contacto un Rhodococcus erythropolis mutagenizado que tiene deposito ATCC N° PTA-6648 con de 2,5 a aproximadamente 6% p/v, basado en sustrato, de sustrato de (3S)-1-halo-2-oxo-3-(protegido)amino-4-sustituido sustituido de la formula:

en la que X, R, y R1 son como se han definido anteriormente. La presente invencion tambien se refiere a i) producir un exceso diastereomerico del compuesto de formula (4) de al

menos aproximadamente el 95,1%; ii) biotransformar al menos aproximadamente el 99,6% del sustrato de famula (3) para dar el compuesto de formula (4); iii) obtener el compuesto de formula (4) a una pureza diastereomerica de al menos aproximadamente el 96%; y/o iv) producir menos de aproximadamente el 0,6 de porcentaje de area de la impureza des-halo alcohol de formula (8) poniendo en contacto Rhodococcus erythropolis mutagenizado que tiene un deposito ATCC N° PTA-6648 con el sustrato de formula (3) en presencia de aproximadamente 2 a aproximadamente 6% (p/v) de glicerol.

La presente invencion tambien se refiere a un procedimiento que comprende la utilizacion de la centrifugacion para separara el (2R,3S)-1-halo-2-hidroxi-3-(protegido)amino-4-butano sustituido de formula (4) de al menos una impureza.

La presente invencion se refiere aun mas a un procedimiento que comprende mezclar el (2R,3S)-1-halo-2-hidroxi-3(protegido)amino-4-butano sustituido de formula (4) con al menos una base en presencia de al menos un disolvente seleccionado entre un disolvente organico polar y un disolvente organico polar y agua para producir una mezcla de reaccion que comprende (2R,3S)-1,2-epoxi-3-(protegido)amino-4-butano sustituido de la formula

en la que R se selecciona entre alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo y arilo sustituido, y R1 representa un grupo protector de amino.

La presente invencion tambien se refiere a un procedimiento que comprende retirar por cristalizacion el compuesto de formula (6) de la mezcla de reaccion, mezclando el (2R,3S)-1-halo-2-hidroxi-3-(protegido)amino-4-butano sustituido de formula (4) con al menos una base en presencia de al menos un disolvente seleccionado entre un disolvente organico polar y un disolvente organico polar y agua, anadiendo conjuntamente agua y la mezcla de reaccion.

La presente invencion tambien se refiere a una Rhodococcus erythropolis mutagenizado que tiene el deposito ATCC N° PTA-6648.

Descripción detallada de la invención

Las caracteristicas y ventajas de la presente invencion pueden comprenderse mas facilmente por los expertos en la materia despues de leer la siguiente descripcion detallada. Debe apreciarse que ciertas caracteristicas de la invencion que se describen, por razones de claridad, anteriormente y mas adelante en el contexto de una sola realizacion, tambien pueden combinarse para formar una sola realizacion. Por el contrario, diversas caracteristicas de la invencion que se describen, por razones de brevedad, en el contexto de una sola realizacion, tambien pueden combinarse de manera que formen sub-combinaciones de las mismas.

A menos que se indique especificamente lo contrario en el presente documento, las referencias hechas en singular tambien incluyen el plural. Por ejemplo, "un" y "uno" pueden referirse tanto a uno como a uno o mas.

Todos los numeros que expresan cantidades de ingredientes, propiedades, tales como peso molecular, condiciones de reaccion y asi sucesivamente, que estan precedidos por la palabra "aproximadamente" deben interpretarse unicamente como aproximaciones de manera que pueden usarse ligeras variaciones en el numero indicado anteriormente y mas adelante para conseguir sustancialmente los mismos resultados que con el numero indicado. Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, los parametros numericos precedidos por la palabra "aproximadamente" son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que pretendan obtenerse mediante la presente invencion. Al menos, y no como un intento de limitar la aplicacion de la doctrina de equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parametro numerico debe interpretarse al menos a la luz del numero de digitos significativos indicados y aplicando tecnicas de redondeo ordinarias.

Debe apreciarse que cada uno de los diversos intervalos indicados pretende ser continuo, de manera que incluyen cada parametro numerico entre el valor maximo y minimo indicada de cada intervalo. Debe entenderse tambien que, aunque sin pretender limitar la aplicabilidad de la doctrina de equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parametro numerico debe interpretarse al menos de una manera coherente con el numero indicado de digitos significativos para cada parametro numerico y aplicando tecnicas de redondeo ordinarias. Ademas, tambien debe entenderse que, aunque sin pretender limitar la doctrina de equivalentes al alcance de las reivindicaciones, aun cuando un numero puede estar contenido dentro de un intervalo numerico, en el que al menos uno de los numeros maximos y minimos del intervalo esta o no precedido por la palabra "aproximadamente", cada valor numerico contenido dentro del intervalo puede estar precedido o no por la palabra "aproximadamente". Por ejemplo, un intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 incluye aproximadamente 1, aproximadamente 2, 2, aproximadamente 3, 3, aproximadamente 4, 4, aproximadamente 5, 5, aproximadamente 6, 6, aproximadamente 7,

7, aproximadamente 8, 8, aproximadamente 9, 9 y aproximadamente 10; un intervalo de aproximadamente 1,1 a aproximadamente 3,2 incluye aproximadamente 1,1, aproximadamente 1,2, 1,2, aproximadamente 1,3, 1,3, aproximadamente 1,4, 1,4, aproximadamente 1,5, 1,5, aproximadamente 1,6, 1,6, aproximadamente 1,7, 1,7, aproximadamente 1,8, 1,8, aproximadamente 1,9, 1,9, aproximadamente 2,0, 2,0, aproximadamente 2,1, 2,1, aproximadamente 2,2, 2,2, aproximadamente 2,3, 2,3, aproximadamente 2,4, 2,4, aproximadamente 2,5, 2,5, aproximadamente 2,6, 2,6, aproximadamente 2,7, 2,7, aproximadamente 2,8, 2,8, aproximadamente 2,9, 2,9, aproximadamente 3,0, 3,0, aproximadamente 3,1, 3,1 y aproximadamente 3,2; y un intervalo de aproximadamente 1 a 4 incluye aproximadamente 1, 2, aproximadamente 2, 3, aproximadamente 3 y 4.

Ademas, cuando una cantidad, concentracion u otro valor o parametro se da como una lista de valores superiores y valores inferiores, dichos listados pretenden incluir todos los intervalos formados emparejando cualquiera de los valores superiores con cualquiera de los valores inferiores, independientemente de si los intervalos se describen por separado.

La abreviatura "e.d." como se usa en el presente documento significa "exceso diastereomerico".

El termino "alquilo" se refiere a un grupo hidrocarburo de cadena lineal o de cadena ramificada que tiene de 1 a 7 atomos de carbono. Los grupos "alquilo" ejemplares incluyen, pero sin limitacion, por ejemplo, metilo; etilo; propilo; isopropilo; n-butilo; t-butilo; pentilo; hexilo; isohexilo; heptilo y 4,4-dimetilpentilo.

La expresion "alquilo inferior" se refiere a un grupo alquilo que tiene de 1 a 4 atomos de carbono. Es de importancia indicar que aunque la expresion "alquilo inferior" esta incluida dentro de la definicion de "alquilo", el uso de la expresion "alquilo inferior" no pretende limitar la definicion del termino "alquilo" tanto implicita como explicitamente a un grupo hidrocarburo de cadena lineal o de cadena ramificada que tiene de 5 a 7 atomos de carbono. Los grupos alquilo inferior ejemplares incluyen, pero sin limitacion, por ejemplo, metilo; etilo; propilo; isopropilo; n-butilo; t-butilo; e isobutilo.

La expresion "alquilo sustituido" se refiere a un grupo alquilo sustituido en cualquier posicion sustituible y disponible con uno a cuatro sustituyentes seleccionados entre, por ejemplo, H; halogeno; trifluorometilo (-CF3); triftuorometoxi (0CF3); hidroxilo (-0H); alcoxi; cicloalcoxi; heterociclooxi; oxo (=0); alcanoilo; alquilo; arilo; arilo sustituido; ariloxi; aralquilo; alcanoiloxi; amino (NH2); alquilamino; arilamino; aralquilamino; cicloalquilamino; heterocicloamino; y/o amino disustituido.

El termino "halogeno" o "halo" se refiere a cloro, bromo, fluor y yodo.

El termino "arilo" se refiere a anillos hidrocarburo aromaticos monociclicos o biciclicos que tienen de 6 a 12 atomos de carbono en la porcion de anillo. Los grupos arilo ejemplares incluyen, pero sin limitacion, por ejemplo, grupos fenilo; naftilo; bifenilo; y difenilo.

La expresion "arilo sustituido" se refiere a un grupo arilo sustituido con al menos un sustituyente, preferentemente de 1 a 4 sustituyentes, en cualquier posicion del anillo sustituible o disponible, o donde la valencia lo permita en cualquiera de los anillos condensados o unidos al mismo. Al menos uno de los sustituyentes, por ejemplo, puede seleccionarse entre H; alquilo; alquilo sustituido; halo; trifluorometilo (-CF3); trifluorometoxi(-0CF3); hidroxilo (-0H); alcoxi; cicloalcoxi; heterociclooxi; alcanoilo; alcanoiloxi; amino (NH2); alquilamino; dialquilamino; arilo; aralquilamino; cicloalquilamino; heterocicloamino; alcanoilamino; tiol (-SH); alquiltio; cicloalquiltio; heterociclotio; ureido; nitro (-N02); ciano (-C≡N); carboxi (-C02H); carboxialquilo; carbamilo (-C(=0)NH2); alcoxicarbonilo; alquiltiono; ariltiono; alquilsulfonilo; sulfonamido (-S02NH2); y/o ariloxi. Cualquier sustituyente elegido puede estar adicionalmente sustituido con al menos un sustituyente seleccionado entre H; halo; hidroxil (-0H); alquilo; alcoxi, arilo; alquilo sustituido; y aralquilo. Cuando un arilo esta sustituido, cada anillo del arilo puede estar sustituido.

El termino "cicloalquilo" se refiere a un sistema de anillos hidrocarburo ciclicos no aromaticos saturados o parcialmente insaturados. Por ejemplo, un grupo cicloalquilo puede contener 1 a 3 anillos con 3 a 7 carbonos por anillo, que puede estar opcionalmente condensado con un anillo carbociclico insaturado que contiene de 3 a 7 carbonos. Los grupos "cicloalquilo" ejemplares incluyen, pero sin limitacion, por ejemplo, ciclopropilo; ciclobutilo; ciclopentilo; ciclohexilo; cicloheptilo; ciclobutenilo, ciclopentenilo y ciclohexenilo.

La expresion "cicloalquilo sustituido" se refiere a un cicloalquilo sustituido con al menos un sustituyente, preferentemente de 1 a 4 sustituyentes, mas preferentemente de 1 a 2 sustituyentes, en cualquier punto de union disponible tanto en el anillo cicloalquilo como, donde la valencia lo permita, en cualquiera de los anillos condensados

o unidos al mismo. Los sustituyentes ejemplares incluyen, pero sin limitacion, por ejemplo, alquilo sustituido; y/o al menos un sustituyente descrito anteriormente como un sustituyente alquilo ejemplar en la definicion de la expresion "alquilo sustituido".

Los terminos "heterociclilo", "heterociclo" y "heterociclico" se refieren a un a un grupo ciclico aromatico o no aromatico, totalmente saturado o insaturado es decir, por ejemplo, un sistema de anillos monociclico de 4 a 7 miembros, biciclico de 7 a 11 miembros o triciclico de 10 a 15 miembros que tiene al menos un heteroatomo en al menos un anillo que contiene atomo de carbono. Cada anillo que contiene heteroatomo del heterociclo, heterociclico

o heterociclo puede contener 1, 2 o 3 heteroatomos seleccionados entre N, 0 y/o S, en el que N y/o S pueden estar

opcionalmente oxidados y/o el N opcionalmente cuaternizado. El heterociclo, heterociclico o heterociclilo puede estar unido al resto de la molecula mediante cualquier heteroatomo o atomo de carbono disponible.

Los grupos monociclicos ejemplares incluyen, pero sin limitacion, por ejemplo, pirrolidinilo, pirrolilo, indolilo, pirazolilo, oxetanilo, pirazolinilo, imidazolilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, oxazolilo, oxazolidinilo, isoxazolinilo, isoxazolilo, tiazolilo, tiadiazolilo, tiazolidinilo, isotiazolilo, isotiazolidinilo, furilo, tetrahidrofurilo, tienilo, oxadiazolilo, piperidinilo, piperazinilo, 2-oxopiperazinilo, 2-oxopiperidinilo, 2-oxopirrolidinilo, 2-oxazepinilo, azepinilo, 4piperidonilo, piridilo, N-oxo-piridilo, pirazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, tetrahidropiranilo, morfolinilo, tiamorfolinilo, tiamorfolinil sulfoxido, tiamorfolinil sulfona, 1,3-dioxolano y tetrahidro-1,1-dioxotienilo, dioxanilo, isotiazolidinilo, tietanilo, tiiranilo, triazinilo y triazolilo.

Los grupos heterociclicos biciclicos ejemplares incluyen, pero sin limitacion, por ejemplo, 2,3-dihidro-2-oxo-1Hindolilo; benzotiazolilo, benzoxazolilo, benzotienilo, quinuclidinilo, quinolinilo, quinolinil-N-oxido, tetrahidroisoquinolinilo, isoquinolinilo, benzoimidazolilo, benzopiranilo, indolizinilo, benzofurilo, cromonilo, coumarinilo, cinnolinilo, quinoxalinilo, indazolilo, pirrolopiridilo, furopiridinilo (tal como furo[2,3-c]piridinilo, furo[3,1b]piridinil] o furo[2,3-b]piridinilo), dihidroisoindolilo, dihidroquinazolinilo (tal como 3,4-dihidro-4-oxo-quinazolinilo), benzoisotiazolilo, benzoisoxazolilo, benzodiazinilo, benzofurazanilo, benzotiopiranilo, benzotriazolilo, benzopirazolilo, dihidrobenzofurilo, dihidrobenzotienilo, dihidrobenzotiopiranilo, dihidrobenzotiopiranil sulfona, dihidrobenzopiranilo, indolinilo, isocromanilo, isoindolinilo, naftiridinilo, ftalazinilo, piperonilo, purinilo, piridopiridilo, quinazolinilo, tetrahidroquinolinilo, tienofurilo, tienopiridilo y tienotienilo.

Los heterociclos mas pequenos incluyen, pero sin limitacion, por ejemplo, epoxidos y aziridinas.

Las expresiones "heterociclo sustituido", "heterociclico sustituido" y "heterociclilo sustituido" se refieren a un heterociclo, heterociclico y heterociclilo, respectivamente, sustituido en cualquier punto de union disponible, o donde la valencia lo permita en cualquiera de los anillos condensados o unidos al mismo, con alquilo sustituido y/o al menos un sustituyente descrito anteriormente como un sustituyente alquilo ejemplar en la definicion de la expresion "alquilo sustituido".

Las definiciones para los otros diversos grupos recitados en el presente documento son como se indican a continuacion: alcoxi es -0Ra; cicloalcoxi es -0Rb; heterociclooxi es -0Rc; alcanoil es -C(=0)Ra; ariloxi es -0Ar; alcanoiloxi es -0C(=0)Ra; alquilamino es -NHRa; arilamino es -NHAr; aralquilo es -RaAr; aralquilamino es -NHRaAr; amino disustituido es -NRdRe; dialquilamino es -NRaRa; cicloalquilamino -NHRb; heterocicloamino -NHRc; alcanoilamino es -NHC(=0)Ra; alquiltio es -SRa; cicloalquiltio es -SRb; heterociclotio es -SRc; ureido es H

; carboxialquilo es -RaC02H; alcoxicarbonilo es -C(=0)0Ra; aralquiloxicarbonilo es -C(=0)0RaAr; alquiltiono es S(=0)Ra; ariltiono es -S(=0)Ar; y alquilsulfonil es -S0(q)Ra, en los que Ra es alquilo o alquilo sustituido; Rb es cicloalquilo o cicloalquilo sustituido;. Rc es heterociclo o heterociclo sustituido; Rd y Re se seleccionan entre alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido y aralquilo; Ar es un arilo o arilo sustituido; y q es 2 o 3.

A menos que se indique otra cosa, cuando se usa el termino "insaturado" en el presente documento para referirse a un anillo o grupo, el anillo o grupo puede estar totalmente insaturado o parcialmente insaturado.

El termino "carbociclico" significa un anillo monociclico o biciclico, saturado o insaturado, en el que todos los atomos de todos los anillos son carbono. Por lo tanto, el termino incluye anillos cicloalquilo y arilo. El anillo carbociclico puede estar sustituido, en cuyo caso los sustituyentes se seleccionan entre los indicados anteriormente para grupos arilo.

La expresion "grupo protector de amino" se refiere a restos reconocidos en la tecnica capaces de unirse a un grupo amino de manera que previenen que el grupo amino actue en reacciones que suceden en cualquier otra parte de la molecula a las que el grupo amino esta unido. Los grupos protectores de amino aceptables incluyen, pero sin limitacion, por ejemplo, grupos protectores de amino descritos en "Protective Groups in 0rganic Synthesis", 2a edicion, John Wiley & Sons, 1991. El grupo protector de amino puede, por ejemplo, ser un grupo protector de tipo uretano (que tambien se denomina un grupo protector carbamato) tal como, por ejemplo, grupos aralquiloxicarbonilo y grupos alcoxicarbonilo. Un grupo protector de amino puede seleccionarse, por ejemplo, entre benciloxicarbonilo; metoxicarbonilo; y terc-butoxicarbonilo. Tipicamente, el grupo protector de amino es terc-butoxicarbonilo.

La abreviatura "ATCC" se refiere a la Asociacion Americana de Cultivos Tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 y/o el numero de acceso asignado por la ATCC al depositario del microorganismo en particular indicado junto con la abreviatura ATCC.

Fermentacion y Biotransformacion

La presente invencion se refiere a un procedimiento que comprende preparar (2R,3S)-1-halo-2-hidroxi-3(protegido)amino-4-butano sustituido de la formula:

en la que X es a halogeno, R se selecciona entre alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo y arilo sustituido, y R1 representa un grupo protector de amino, poniendo en contacto una cepa de Rhodococcus erythropolis mutagenizada que tiene un deposito de la ATCC N° PTA-6648 con de 2,5 a aproximadamente 6% p/v, basado en sustrato, de sustrato (3S)-1-halo-2-oxo-3-(protegido)amino-4-sustituido sustituido de la formula:

en la que X, R y R1 son como se han definido anteriormente.

10 El sustrato de formula 3 puede producirse de acuerdo con procedimientos facilmente conocidos por un experto en la materia. Por ejemplo, el sustrato de formula (3) puede sintetizarse de acuerdo con el siguiente esquema de reaccion

2:

De acuerdo con el esquema de reaccion 2, el acido N-amino protegido de la formula:

en la que R y R1 son como se han definido anteriormente, se trata con un formiato de alquilo, tal como, por ejemplo, cloroformiato de isuburilo, y una amina terciaria, tal como, por ejemplo, N-metil morfolina, seguido de la adicion de una solucion de diazometano/eter dietilico para dar un diazocetona de acido N-amino protegido de la formula:

20 en la que R y R1 son como se han definido anteriormente. Despues, el compuesto de formula (10) puede tratarse con un acido mineral, tal como, por ejemplo, acido clorhidrico (HCl) o acido bromhidrico (HBr) para producir el sustrato deseado de formula (3).

El sustrato de formula (3) tambien puede sintetizarse, por ejemplo, haciendo reaccionar un compuesto de la formula:

en la que R y R1 son como se han definido anteriormente y R2 se selecciona entre alquilo, alquilo sustituido y bencilo, con al menos 2 equivalentes molares de un compuesto de la formula:

en la que X1 y X2 se seleccionan independientemente entre cloro, bromo, yodo y fluor, con la condicion de que al menos uno de X1 o X2 sea bromo o yodo.

Ademas, si X de formula (3) es cloro y R y R1 son como se han definido anteriormente, el sustrato de (3S)-1-cloro-2oxo-3-(protegido)amino-4-butano sustituido puede sintetizarse, por ejemplo, tratando un compuesto de la formula:

en la que R y R1 son como se han definido anteriormente y R3, que puede estar sustituido en el anillo fenilo tanto en la posicion orto como en la para, se selecciona entre hidrogeno y nitrogeno con iluro de azufre que contiene el compuesto de la formula:

15 en la que R4 y R5 se seleccionan independientemente entre alquilo, alquilo sustituido, arilo y arilo sustituido para producir un compuesto ceto iluro intermedio de la formula:

en la que R, R1, R4,y R5 son como se han definido anteriormente. Despues, el compuesto de formula (15) puede hacerse reaccionar con una fuente de cloruro que puede incluir, pero sin limitacion, por ejemplo, una fuente basica

20 de cloruro, tal como, por ejemplo, cloruro de litio; y un acido organico, tal como, por ejemplo, acido metanosulfonico.

En una realizacion, el sustrato de formula (3) es (S)-1-cloro-2-oxo-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano. El sustrato de (S)-1-cloro-2-oxo-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano puede producirse de acuerdo con procedimientos facilmente conocidos por un experto en la materia, incluyendo pero sin limitacion, por ejemplo los procedimientos generales ya expuestos anteriormente en el presente documento para la preparacion del sustrato de

25 formula (3).

En una realizacion, el compuesto de formula (4) producido es (2R,3S)-1-cloro-2-hidroxi-3-N-(tercbutoxicarbonil)amino-4-fenilbutano.

El compuesto de formula (4) puede producirse poniendo en contacto el sustrato de formula (3) con una cepa de Rhodococcus erythropolis mutagenizada que tiene el N° deposito de ATCC PTA-6648. La cepa de Rhodococcus

30 erythropolis mutagenizada que tiene el N° deposito de ATCC PTA-6648 puede producir una enzima cetorreductasa capaz de biotransformar o de reducir enzimaticamente el sustrato de formula (3) al compuesto de formula (4).

En una realizacion, las celulas PTA-6648 de la ATCC se ponen en contacto con sustrato de formula (3) desde el 2,5

hasta aproximadamente el 6% p/v, en base al sustrato.

En otra realizacion, las celulas PTA-6648 de la ATCC se ponen en contacto con sustrato de formula (3) desde aproximadamente el 4,5 hasta aproximadamente el 6% p/v, en base al sustrato.

En otra realizacion mas, las celulas PTA-6648 de la ATCC se ponen en contacto con sustrato de formula (3) a aproximadamente el 6% p/v, en base al sustrato.

Las celulas PTA-6648 de la ATCC se pueden suministrar, por ejemplo, como celulas humedas o secas intactas, tales como, por ejemplo, celulas liofilizadas, secadas por pulverizacion o secadas por calentamiento o como material celular tratado, tal como, por ejemplo, celulas rotas o extracto celular. Las celulas PTA-6648 de la ATCC se pueden cultivar a una densidad celular elevada de acuerdo con cualquier procedimiento de fermentacion conocido facilmente por un experto en la materia incluyendo pero sin limitacion, por ejemplo, un procedimiento de fermentacion semicontinuo. Las celulas PTA-6648 de la ATCC se pueden cultivar en un recipiente, tal como, por ejemplo, un matraz de agitacion o un tanque fermentador.

El sustrato de formula (3) se puede biotransformar en el compuesto de la formula (4) poniendose en contacto con celulas PTA-6648 de la ATCC en un procedimiento de etapa unica o in situ o un procedimiento de dos etapas.

El procedimiento de etapa unica o in situ implica biotransformar de forma simultanea el sustrato de formula (3) en el compuesto de formula (4) mientras al menos algunas de las celulas PTA-6648 de la ATCC estan aun en fermentacion. Es decir, el sustrato de formula (3) se puede poner en contacto con las celulas PTA-6648 de la ATCC antes de que todas las celulas hayan terminado de fermentar. Por ejemplo, las celulas PTA-6648 de la ATCC se pueden cultivar en medio hasta que se realiza cultivo celular suficiente. Tras la realizacion suficiente del cultivo de celulas PTA-6648 de la ATCC, el sustrato de formula (3) se puede anadir directamente al medio que contiene celulas PTA-6648 de la ATCC para formar una pasta de mezcla de reaccion que comprende celulas PTA-6648 de la ATCC y sustrato de formula (3). El sustrato de formula (3) despues se puede permitir que se biotransforme en el compuesto de formula (4) durante una cantidad de tiempo eficaz para posibilitar sustancialmente que todo el sustrato de formula (3) se biotransforme en el compuesto de formula (4).

El procedimiento de dos etapas implica en primer lugar fermentar por separado las celulas PTA-6648 de la ATCC y despues tras la finalizacion de la fermentacion, poner en contacto el sustrato de formula (3) con las celulas PTA6648 de la ATCC fermentadas. Es decir, el procedimiento de dos etapas implica en primer lugar fermentar por separado las celulas y despues usar las celulas fermentadas por separado para biotransformar el sustrato de formula (3) en el compuesto de formula (4). Mas especificamente, en el procedimiento de dos etapas las celulas PTA-6648 de la ATCC se pueden cultivar en medio hasta que se muestra un nivel de actividad enzimatica de cetorreductasa predeterminado. Cuando el nivel deseado de actividad enzimatica se obtiene, las celulas cultivadas se pueden separar del medio y mezclarse con, por ejemplo, tampon de fosfato de sodio 0,1 M para producir una pasta de celulas PTA-6648 de la ATCC que tiene un pH de 7,4. El sustrato de formula (3) despues se puede anadir a la pasta de celulas PTA-6648 de la ATCC para formar una pasta de mezcla de reaccion que comprende celulas PTA-6648 de la ATCC y sustrato de formula (3). El sustrato de formula (3) despues se puede permitir que biotransforme en el compuesto de formula (4) durante una cantidad de tiempo eficaz para posibilitar sustancialmente que todo el sustrato de formula (3) se biotransforme en el compuesto de formula (4).

El sustrato de formula (3) se puede anadir como un polvo o como una pasta en glicerol y agua. Tipicamente, sin embargo, el sustrato de formula (3) se anade como una pasta en glicerol y agua.

En una realizacion, el sustrato de formula (3) se pone en contacto con las celulas PTA-6648 de la ATCC en presencia de glicerol a aproximadamente el 2 a aproximadamente el 6% (p/v).

En otra realizacion, se anaden fuentes de glucosa y carbono de glicerol a la pasta de mezcla de reaccion a traves de toda la biotransformacion para mantener una concentracion de aproximadamente el 2,2% (p/v) de glucosa y una concentracion de aproximadamente el 6% (p/v) de glicerol.

Las celulas PTA-6648 de la ATCC se pueden cultivar en medio de acuerdo con cualquier procedimiento de fermentacion aceptable conocido por un experto en la materia incluyendo pero sin limitacion, por ejemplo, un procedimiento de fermentacion semicontinuo.

Un experto en la materia esta familiarizado con medios aceptables para cultivar celulas PTA-6648 de la ATCC incluyendo pero sin limitacion, por ejemplo, medios que comprenden caldo; una fuente de carbono; una fuente de nitrogeno; un elemento trazas y un agente antiespumante. El medio seleccionado puede tener un pH, por ejemplo, de desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 8 y tipicamente de aproximadamente 7,0. Tipicamente, el medio utilizado es acuoso.

El caldo contenido en el medio incluye pero no esta limitado a, por ejemplo, caldo triptico de soja (triptona al 1,7%, soytona al 0,3%, cloruro de sodio al 0,5%, glucosa al 0,25%, fosfato dipotasico al 0,25% y pH 7,0) y medio F7 (glucosa al 2,2%, extracto de levadura al 1%, extracto de malta al 1%, peptona al 0,1% y pH 7,0).

La fuente de carbono contenida tipicamente en el medio incluye pero sin limitacion, por ejemplo, azucar, tal como, por ejemplo, maltosa, lactosa, glucosa, fructosa, glicerol, sorbitol, sacarosa, almidon y manitol y acidos organicos y sus sales, tales como, por ejemplo, acetato de sodio y citrato de sodio.

La fuente de nitrogeno tipicamente contenida en el medio incluye pero sin limitacion, por ejemplo, N-Z amina A; licor de maiz fermentado; harina de soja; extractos de levadura; melazas; levadura del pan; triptona; nutrisoja; peptona; yeastamin; nitrato de sodio y sulfato de amonio.

Los elementos trazas contenidos tipicamente en el medio incluyen pero sin limitacion, por ejemplo, fosfato y una sal de magnesio, manganeso, calcio, cobalto, niquel, hierro, sodio y/o potasio.

El agente antiespumante tipicamente contenido en el medio incluye, pero sin limitacion, por ejemplo, propilenglicol.

Los medios disponibles en el mercado aceptables para cultivar celulas PTA-6648 de la ATCC, incluyen, pero sin limitacion, por ejemplo, caldo triptico de soja alternativo (disponible en Becton Dickinson Company, Sparks, MD), que contiene proteina de soja al 1,8%; extracto de levadura al 0,2%; cloruro de sodio al 0,5%; glucosa al 0,25% y fosfato dipotasico al 0,25%.

El medio puede, antes de inocularse con celulas PTA-6648 de la ATCC, esterilizarse mediante, por ejemplo, calentamiento hasta una temperatura de aproximadamente 121 °C durante aproximadamente 30 minutos. Despues el pH del medio se puede ajustar, por ejemplo, hasta un pH de desde aproximadamente 6,5 hasta aproximadamente 7,5 y tipicamente hasta un pH de aproximadamente 7,0. El pH se puede ajustar con, por ejemplo, una base, tal como, por ejemplo, hidroxido de amonio o un acido, tal como, por ejemplo, acido fosforico. El pH del medio, sin embargo, se puede ajustar de acuerdo con cualquier procedimiento conocido por un experto en la materia.

Un experto en la materia puede usar cualquier procedimiento capaz de detectar el punto en el que sustancialmente todo el sustrato de formula (3) se ha biotransformado en el compuesto de formula (4), incluyendo pero sin limitacion, por ejemplo, analisis de HPLC. Sin embargo, tipicamente sustancialmente todo el sustrato de formula (3) se biotransforma en el compuesto de formula (4) en aproximadamente 4 hasta aproximadamente 96 horas despues de que el sustrato de formula (3) se pone en contacto con las celulas PTA-6648 de la ATCC y aun mas tipicamente en aproximadamente 4 a aproximadamente 48 horas.

La cantidad total de sustrato de formula (3) que se tiene que anadir a las celulas PTA-6648 de la ATCC se puede dividir en cuatro partes iguales, en las que la parte uno se anade a aproximadamente 0 horas, la parte dos a aproximadamente 4 horas, la parte tres a aproximadamente 8 horas y la parte cuatro a aproximadamente 23 horas. Por ejemplo, si se tiene que anadir un total de aproximadamente el 6% p/v de sustrato de formula (3) a las celulas, el aproximadamente 6% p/v de sustrato de formula (3) se divide en cuatro partes iguales de aproximadamente el 1,5% p/v cada una, en la que la primera parte de aproximadamente el 1,5% p/v se anade aproximadamente 0 horas, la segunda parte a aproximadamente 4 horas, la tercera parte a aproximadamente 8 horas y la cuarta parte a aproximadamente 23 horas.

Como alternativa, el sustrato de formula (3) se puede anadir de forma continua a las celulas PTA-6648 de la ATCC a lo largo de un periodo de tiempo que varia desde aproximadamente 0 hasta aproximadamente 24 horas. Por ejemplo, si el sustrato de formula (3) se anade en forma solida, el sustrato de formula (3) se puede anadir a las celulas PTA-6648 de la ATCC a traves de, por ejemplo, un alimentador sin fin solido que esta ajustado a un indice de suministro constante de forma de posibilitar que la cantidad total de sustrato que se esta anadiendo a las celulas PTA-6648 de la ATCC se anada dentro del lapso de tiempo deseado. Un experto en la materia esta familiarizado con procedimientos similares que se pueden usar para anadir una pasta de sustrato de formula (3) en, por ejemplo, glicerol/agua a las celulas PTA-6648 de la ATCC.

De acuerdo con los procedimientos de etapa unica o in situ, un experto en la materia esta familiarizado en general con procedimientos disponibles para determinar el punto en el cual se ha realizado un cultivo de celulas PTA-6648 de la ATCC suficiente. Por ejemplo, las celulas PTA-6648 de la ATCC generalmente se han cultivado suficientemente cuando la densidad optica a 600 nm del cultivo es mayor de 0,5.

De acuerdo con el procedimiento de dos etapas, el nivel predeterminado de actividad enzimatica de cetorreductasa es el punto en el cual se ha acumulado una cantidad optima de enzima cetorreductasa en la fermentacion. Una cantidad optima de enzima cetorreductasa se pude obtener tipicamente despues de, por ejemplo, aproximadamente 60 a aproximadamente 96 horas de fermentacion.

En el procedimiento de dos etapas, las celulas PTA-6648 de la ATCC se pueden separar el medio con tecnicas de separacion convencionales conocidas facilmente por un experto en la materia. Tales tecnicas de separacion convencionales incluyen, pero sin limitacion, por ejemplo, filtracion de membrana y centrifugacion.

La pasta de mezcla de reaccion que contiene las celulas PTA-6648 de la ATCC y el sustrato de formula (3) tambien puede contener un agente de tamponamiento. Los agentes de tamponamiento tipicos incluyen, pero sin limitacion, por ejemplo, tampon fosfato; tampon de tris-clorhidrato; tampon de bicina [N,N-bis(2-hidroxietil)glicina]; tampon de tricina [N-tris(hidroximetil)metilglicina] y tampon de acetato de sodio.

En una realizacion, el sustrato de formula (3) se biotransforma en el compuesto de formula (4) mientras que la pasta de mezcla de reaccion se esta aireando y agitando. La pasta de mezcla de reaccion se puede airear con, por ejemplo, desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 10 volumenes de aire por volumen de medio por minuto (vvm) o, por ejemplo, con aproximadamente 5 vvm. La pasta de mezcla de reaccion se puede agitar, por ejemplo, a aproximadamente 100 a aproximadamente 2000 RPM, o, por ejemplo, a aproximadamente 500 a aproximadamente 1200 RPM.

En una realizacion, la pasta de mezcla de reaccion contiene desde aproximadamente el 1 hasta aproximadamente el 40% p, en base al peso de celulas humedo, celulas PTA-6648 de la ATCC.

En otra realizacion, la pasta de mezcla de reaccion contiene desde aproximadamente el 20 hasta aproximadamente el 35% p, en base al peso humedo de celulas, celulas PTA-6648 de la ATCC.

En otra realizacion, la pasta de mezcla de reaccion contiene aproximadamente el 30% p, en base al peso humedo de celulas, celulas PTA-6648 de la ATCC.

A traves de todo el procedimiento de fermentacion y biotransformacion el pH se puede mantener, por ejemplo, a aproximadamente 5,0 hasta aproximadamente 9,0, o, por ejemplo, a aproximadamente 6,0 hasta aproximadamente 8,0; la temperatura se puede mantener, por ejemplo, a aproximadamente 15 °C hasta aproximadamente 38 °C o, por ejemplo, a aproximadamente 25 ° hasta aproximadamente 32 °C y la presion se pude mantener, por ejemplo, a aproximadamente presion atmosferica.

En una realizacion, el sustrato de formula (3) se pone en contacto con celulas PTA-6648 de la ATCC en presencia de aproximadamente el 2 hasta aproximadamente el 6% (p/v) de glicerol para obtener compuesto de formula (4) en un exceso diastereomerico de al menos aproximadamente el 95,1%.

En otra realizacion, el sustrato de formula (3) se pone en contacto con celulas PTA-6648 de la ATCC en presencia de aproximadamente el 2 hasta aproximadamente el 6% (p/v) de glicerol para obtener compuesto de formula (4) en un exceso diastereomerico de al menos aproximadamente el 95,6%.

En aun otra realizacion, el sustrato de formula (3) se pone en contacto con celulas PTA-6648 de la ATCC en presencia de glicerol a aproximadamente el 2 hasta aproximadamente el 6% (p/v) para obtener compuesto de formula (4) en un exceso diastereomerico de al menos aproximadamente el 96%.

En incluso una realizacion adicional, el sustrato de formula (3) se pone en contacto con celulas PTA-6648 de la ATCC en presencia de glicerol a aproximadamente el 2 hasta aproximadamente el 6% (p/v) para obtener compuesto de formula (4) en un exceso diastereomerico de al menos aproximadamente el 97%.

En una realizacion, el sustrato de formula (3) se pone en contacto con celulas PTA-6648 de la ATCC en presencia de glicerol a aproximadamente el 2 hasta aproximadamente el 6% (p/v) para biotransformar al menos aproximadamente el 99,6% de sustrato de formula (3) en compuesto de formula (4).

En otra realizacion, el sustrato de formula (3) se pone en contacto con celulas PTA-6648 de la ATCC en presencia de glicerol a aproximadamente el 2 hasta aproximadamente el 6% (p/v) para biotransformar al menos aproximadamente el 99,8% de sustrato de formula (3) en compuesto de formula (4).

En otra realizacion, el sustrato de formula (3) se pone en contacto con celulas PTA-6648 de la ATCC en presencia de glicerol a aproximadamente el 2 hasta aproximadamente el 6% (p/v) para biotransformar al menos aproximadamente el 100% del sustrato de formula (3) en compuesto de formula (4).

En una realizacion, el sustrato de formula (3) se pone en contacto con celulas PTA-6648 de la ATCC en presencia de glicerol a aproximadamente el 2 hasta aproximadamente el 6% (p/v) para obtener compuesto de formula (4) a una pureza diastereomerica de al menos aproximadamente el 96%.

En otra realizacion, el sustrato de formula (3) se pone en contacto con celulas PTA-6648 de la ATCC en presencia de glicerol a aproximadamente el 2 hasta aproximadamente el 6% (p/v) para obtener compuesto de formula (4) a una pureza diastereomerica de al menos aproximadamente el 97,5%.

En otra realizacion, el sustrato de formula (3) se pone en contacto con celulas PTA-6648 de la ATCC en presencia de glicerol a aproximadamente el 2 hasta aproximadamente el 6% (p/v) para obtener compuesto de formula (4) a una pureza diastereomerica de al menos el 97,9%.

En una realizacion adicional, el sustrato de formula (3) se pone en contacto con celulas PTA-6648 de la ATCC en presencia de glicerol a aproximadamente el 2 hasta aproximadamente el 6% (p/v) para obtener compuesto de formula (4) a una pureza diastereomerica de al menos aproximadamente el 98,0%.

En una realizacion adicional mas, el sustrato de formula (3) se pone en contacto con celulas PTA-6648 de la ATCC en presencia de glicerol a aproximadamente el 2 hasta aproximadamente el 6% (p/v) para obtener compuesto de formula (4) a una pureza diastereomerica de al menos aproximadamente el 98,5%.

En una realizacion, un porcentaje de area de menos de aproximadamente 0,6 de impureza des-halo alcohol (3S)-2hidroxi-3-(protegido)amino-4-butano sustituido de la formula:

en la que R y R1 son como se ha descrito anteriormente, se produce cuando el sustrato de formula (3) se pone en contacto con celulas PTA-6648 de la ATCC en presencia de glicerol a aproximadamente el 2 hasta aproximadamente el 6% (p/v).

En otra realizacion, menos de aproximadamente el 0,5 de porcentaje de area de la impureza de formula 8 se produce cuando el sustrato de formula (3) se pone en contacto con celulas PTA-6648 de la ATCC en presencia de aproximadamente el 2 hasta aproximadamente el 6% (p/v).

En otra realizacion, menos de aproximadamente el 0,4 porcentaje de area de la impureza de formula 8 se produce cuando el sustrato de formula (3) se pone en contacto con celulas PTA-6648 de la ATCC en presencia de aproximadamente el 2 hasta aproximadamente el 6% (p/v).

En incluso una realizacion adicional, menos de aproximadamente el 0,2 de porcentaje de area de la impureza de formula 8 se produce cuando el sustrato de formula (3) se pone en contacto con celulas PTA-6648 de la ATCC en presencia de aproximadamente el 2 hasta aproximadamente el 6% (p/v).

En una realizacion, la impureza de des-halo alcohol (3S)-2-hidroxi-3-(protegido)amino-4-butano sustituido de formula 8 es ((1S)-1-bencil-2-hidroxipropil)carbamato de terc-butilo.

Centrifugacion

Despues de que sustancialmente todo el sustrato de formula (3) se ha biotransformado en compuesto de formula (4), el compuesto de formula (4) se puede separar de la pasta de mezcla de reaccion.

El compuesto de formula (4) se puede separar a traves de un procedimiento de centrifugacion que implica en primer lugar centrifugar la pasta de mezcla de reaccion para producir a) una capa pesada que contiene compuesto de formula (4) y b) sobrenadante que contiene al menos una impureza y en segundo lugar extraer el compuesto de formula (4) en un disolvente organico.

En una realizacion, aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 35% de compuesto de formula (4) esta contenido en la capa pesada.

En otra realizacion, aproximadamente el 10% hasta aproximadamente el 35% de compuesto de formula (4) esta contenido en la capa pesada.

En otra realizacion, aproximadamente el 25% hasta aproximadamente el 35% de compuesto de formula (4) esta contenido en la capa pesada.

La al menos una impureza que puede estar contenida en el sobrenadante incluye, pero sin limitacion, por ejemplo, el subproducto de diastomero de (2S, 3S)-1-halo-2-hidroxi-3-(protegido)amino-4-butano sustituido de formula 5; al menos aproximadamente el 70% de celulas PTA-6648 de la ATCC; propilenglicol y sales.

Los tipos de centrifugas que se pueden usar de acuerdo con el presente procedimiento incluyen, pero sin limitacion, por ejemplo, una centrifuga Beckman Coulter Allegra® 64R High-Speed Refrigerated Bench top Centrifuge (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA) y un Westfalia Concurrent Extractor-Decanter (Westfalia Separator AG, 0elde, Germany).

En general, aunque la velocidad a la que la pasta de mezcla de reaccion se centrifuga dependera del tipo de centrifuga seleccionado, la velocidad de centrifugacion esta tipicamente optimizada. Por ejemplo, si se usa una centrifuga Beckman Coulter Allegra® 64R High-Speed Refrigerated Bench top Centrifuge, la pasta de mezcla de reaccion se puede centrifugar a una velocidad optimizada de aproximadamente 3700 RPM durante al menos aproximadamente 5 minutos.

La velocidad de centrifugacion optimizada de la Beckman Coulter Allegra® 64R High-Speed Refrigerated Bench top Centrifuge, sin embargo, se puede usar para calcular la velocidad de centrifugacion optima de otras centrifugas que se pueden usar para centrifugar la pasta de mezcla de reaccion de la presente invencion. Por ejemplo, la velocidad optimizada de la Beckman Coulter Allegra® 64R High-Speed Refrigerated Bench top Centrifuge de 3700 RPM se

puede convertir a fuerza g, que es la fuerza de gravedad generada por la centrifuga, a traves de la siguiente ecuacion:

r = radio del rotor, es decir radio en metros desde el husillo hasta el fondo de la muestra; rpm = revoluciones por minuto y g es la aceleracion debido a la gravedad (9,81 m/s2).

Ya que el radio del rotor de la centrifuga Beckman Coulter Allegra® 64R High-Speed Refrigerated Bench top Centrifuge es 0,204 m y la velocidad optimizada de centrifugacion es 3700 RPM, la fuerza g de la centrifuga se calcula que es aproximadamente 3119 x g. Esta fuerza g calculada despues se puede usar junto con el radio conocido de otra centrifuga para calcular las RPM aproximadas necesarias para satisfacer la fuerza g calculada de la Beckman Coulter Allegra® 64R High-Speed Refrigerated Bench top Centrifuge.

En una realizacion. La pasta de mezcla de reaccion se puede enfriar, sin congelarse, hasta una temperatura desde aproximadamente 0 hasta aproximadamente 25 °C antes de centrifugarse.

En otra realizacion, la pasta de mezcla de reaccion se puede enfriar, sin congelarse, hasta una temperatura de desde aproximadamente 0 hasta aproximadamente 12 °C antes de centrifugarse.

En aun otra realizacion, la pasta de mezcla de reaccion puede enfriarse, sin congelarse, hasta una temperatura de desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 5 °C antes de centrifugarse.

En centrifugaciones discontinuas, el tamano de la botella de centrifuga, el volumen de pasta de mezcla de reaccion, la temperatura de la pasta de mezcla de reaccion, las rpm de la centrifuga y la longitud de tiempo que la pasta de mezcla de reaccion se centrifuga pueden todas afectar la parte de capa pesada recogida y la cantidad de impureza eliminada a traves del sobrenadante. Sin embargo, un experto en la materia generalmente conoce como cada uno de estos parametros se pueden ajustar de forma de optimizar la cantidad de cristales de formula (4) contenida en la capa pesada mientras que tambien optimiza la cantidad de impurezas eliminadas a traves del sobrenadante.

En centrifugaciones discontinuas, la capa pesada recogida se puede deshidratar sometiendola a una segunda etapa de centrifugacion que posibilita que una capa pesada mas seca se separe del sobrenadante adicional. La capa pesada mas seca despues se puede recoger y el sobrenadante descartarse. Las centrifugas que se pueden usar para deshidratar la capa pesada recogida incluyen, pero sin limitacion, por ejemplo, las centrifugas que ya se han descrito en el presente documento anteriormente.

La capa pesada mas seca contiene a) una capa superior de color oscuro que comprende celulas PTA-6648 de la ATCC y < 1% en peso, en base a la capa superior de color oscuro, de cristales de formula (4) y b) una capa inferior de color claro que comprende aproximadamente el 20 a aproximadamente el 35%, en base a la capa inferior de color claro, de cristales de formula (4), aproximadamente el 50 a aproximadamente el 60%, en base a la capa inferior de color claro, de agua y aproximadamente el 5 a aproximadamente el 30%, en base a la capa inferior de color claro, de celulas PTA-6648 de la ATCC residuales. La capa superior de color oscuro se puede separar tipicamente de la capa inferior de color claro mediante, por ejemplo, eliminacion manual con, por ejemplo, una espatula.

Sin embargo, un experto en la materia puede ser consciente de que estan disponibles centrifugas a escala de planta que pueden eliminar las etapas de deshidratacion y separacion manual de centrifugaciones discontinuas. Por ejemplo, una centrifuga Westfalia Concurrent Extractor-Decanter (Westfalia Separator AG, 0elde, Alemania) puede producir directamente una capa pesada satisfactoriamente seca a partir de la pasta de mezcla de reaccion. Adicionalmente, la eleccion del anillo estanco apropiado y la optimizacion de velocidad diferencial entre el desplazamiento y el cuenco de la centrifuga Westfalia Extractor-Decanter puede posibilitar que los cristales de formula (4) se separen directamente de la masa de las celulas PTA-6648 de la ATCC.

Despues de separarse a traves de centrifugacion, el compuesto de formula (4) se puede extraer en un disolvente organico mezclando la capa pesada o la capa inferior de color claro que contiene los cristales de formula (4) con al menos un disolvente organico para formar una primera pasta. La primera pasta se puede formar, por ejemplo, mezclando la capa pesada o la capa inferior de color claro con al menos uno de los disolventes organicos durante al menos aproximadamente 5 minutos.

Los disolventes organicos ejemplares en los que puede extraerse el compuesto de formula (4) incluyen, pero sin limitacion, por ejemplo, un disolvente aprotico polar, tal como, por ejemplo, acetona, metil etil cetona, tetrahidrofurano, 1,4-dioxano, 1,3-dioxolano, 1,2-dimetoxietano, dimetil eter de dietilenglicol, trietilenglicol dimetil eter, dimetil eter de tetra-etilenglicol, dimetil eter de polietilenglicol, 1,2-dietoxietano, eter dietilico de dietilenglicol, eter dietilico de trietilenglicol, eter dietilico de tetraetilenglicol, eter dietilico de polietilenglicol, acetonitrilo,

dimetilformamida y dimetilsulfoxido; un disolvente organico protico polar, tal como, por ejemplo, alcoholes, tal como, por ejemplo, metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, sec-butanol, isobutanol y terc-butanol; y combinaciones de los mismos.

En una realizacion, al menos uno de los disolventes organicos es un disolvente organico protico polar.

En otra realizacion, el disolvente organico protico polar es alcohol isopropilico [IPA].

Para facilitar la epoxidacion y cristalizacion posteriores, es de importancia indicar que el uso de un disolvente inmiscible en agua, tal como, por ejemplo, acetato de etilo, MTBE y/o heptano para extraer el compuesto de formula

(4) puede implicar 1) retirar por destilacion el disolvente inmiscible en agua, y 2) reemplazar el disolvente inmiscible en agua que se ha retirado por filtracion con un disolvente mas miscible en agua, tal como, por ejemplo, acetona y/o IPA.

La fase pesada o fase inferior de color claro puede mezclarse con de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 volumenes de al menos un disolvente organico, y tipicamente con de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 volumenes.

La primera suspension puede prepararse una temperatura que varia de aproximadamente 0 a aproximadamente 98 °C, y tipicamente a una temperatura que varia de aproximadamente 25 a aproximadamente 30 °C.

Despues, la primera suspension puede centrifugarse para separar la suspension en 1) una fase inferior que contiene celulas ATCC PTA-6648 residuales y compuesto residual de formula (4) y 2) una fase ligera de disolvente organico acuoso enriquecido que contiene el compuesto de formula (4). Las centrifugas que pueden utilizarse incluyen, pero sin limitacion, por ejemplo, las centrifugas ya descritas anteriormente en el presente documento.

0pcionalmente, la fase inferior que contiene las celulas ATCC PTA-6648 residuales y el compuesto residual de formula (4) pueden extraerse adicionalmente con mas cantidad de disolvente organico y despues separarse mediante centrifugacion. Las centrifugas que puede utilizarse incluyen, pero sin limitacion, por ejemplo, las centrifugas ya descritas anteriormente en el presente documento.

Para retirar un color de proceso no deseado, la primera suspension puede, antes de que se centrifugue, mezclarse opcionalmente con una segunda suspension que comprende al menos al menos un disolvente organico y carbono para producir una tercera suspension. La segunda suspension puede prepararse tanto mezclando el carbono con al menos un disolvente organico o, si se usa un disolvente organico miscible en agua, tal como, por ejemplo, IPA en la preparacion de la primera suspension, el tratamiento de carbono puede realizarse simultaneamente con la extraccion.

En una realizacion, el carbono se mezcla con de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1 volumen de al menos un disolvente organico.

En otra realizacion, el carbono se mezcla con de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 0,4 volumenes de al menos un disolvente organico.

En una realizacion, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20% p/v, basado en la fase pesada o la fase inferior de color claro, de carbono se mezcla con al menos un disolvente organico.

En otra realizacion, de aproximadamente 3 a aproximadamente 6% p/v, basado en la fase pesada o la fase inferior de color claro, de carbono se mezclan con al menos un disolvente organico.

El carbono que puede utilizarse en la preparacion de la segunda suspension incluye, pero sin limitacion, por ejemplo, carbono Darco KB.

Al menos uno de los disolventes organicos que puede utilizarse en la preparacion de la segunda suspension incluye, pero sin limitacion, por ejemplo, los disolventes organicos ya descritos anteriormente en el presente documento.

La tercera suspension puede centrifugarse adicionalmente para separar la suspension en una fase inferior que contiene 1) al menos una impureza que incluye, pero sin limitacion, por ejemplo, carbono, celulas ATCC PTA-6648 residuales y compuesto de formula (4) residual; y 2) una fase ligera de disolvente organico acuoso enriquecido que contiene el compuesto de formula (4). Las centrifugas que puede utilizarse incluyen, pero sin limitacion, por ejemplo, las centrifugas ya descritas anteriormente en el presente documento.

0pcionalmente, la fase inferior que contiene al menos una impureza puede extraerse adicionalmente con mas cantidad de disolvente organico y despues separarse por centrifugacion. Las centrifugas que puede utilizarse incluyen, pero sin limitacion, por ejemplo, las centrifugas ya descritas anteriormente en el presente documento. El disolvente organico que puede utilizarse incluye, pero sin limitacion, por ejemplo, los disolventes organicos ya descritos anteriormente en el presente documento.

De acuerdo con los procedimientos de centrifugacion, el e.d del compuesto de formula (4) presente en la fase ligera

de disolvente organico acuoso enriquecido es mayor de el e.d del compuesto de formula (4) presente en la suspension de la mezcla de reaccion post-biotransformacion.

En una realizacion, el e.d del compuesto de formula (4) presente en la fase ligera del disolvente organico acuoso enriquecido se incrementa sobre la cantidad presente en la suspension de mezcla de reaccion postbiotransformacion de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 3,5%.

En otra realizacion, el e.d del compuesto de formula (4) presente en la fase ligera del disolvente organico acuoso enriquecido se incrementa sobre la cantidad presente en la suspension de mezcla de reaccion postbiotransformacion en aproximadamente 1,0 a aproximadamente 3,5%.

En otra realizacion mas, el e.d del compuesto de formula (4) presente en la fase ligera del disolvente organico acuoso enriquecido se incrementa sobre la cantidad presente en la suspension de mezcla de reaccion postbiotransformacion en aproximadamente 1,5 a aproximadamente 3,5%.

Epoxidacion y Cristalizacion

El compuesto de formula (4) puede epoxidarse para dar (2R,3S)-1,2-epoxi-3-(protegido)amino-4-butano sustituido de formula (6) mezclando el compuesto de formula (4) con al menos una base, en presencia de al menos un disolvente seleccionado entre un disolvente organico polar y un disolvente organico polar y agua para producir una mezcla de reaccion que comprende el compuesto de formula (6). El compuesto de formula (4) puede epoxidarse para dar el compuesto de formula (6) tanto directamente despues de que se biotransforme a partir del sustrato de formula (3) como despues de que se separe de la suspension de mezcla de reaccion. El compuesto de formula (6) puede retirarse por cristalizacion de la mezcla de reaccion, anadiendo conjuntamente la mezcla de reaccion y el agua.

En una realizacion, el compuesto de formula (6) es (2R,3S)-1,2-epoxi-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano.

Las bases ejemplares que pueden utilizarse en la epoxidacion del compuesto de formula (4) incluyen, pero sin limitacion, por ejemplo, hidroxidos de metales alcalinos, tales como, por ejemplo, hidroxido de litio, hidroxido sodico e hidroxido potasico; carbonatos de metales alcalinos; hidroxidos de metales alcalinoterreos; carbonatos de metales alcalinos; y combinaciones de los mismos.

En una realizacion, al menos una de las bases es un hidroxido de metal alcalino.

En otra realizacion, al menos una de las bases es un hidroxido de metal alcalinoterreo.

En otra realizacion mas, al menos una de las bases es un hidroxido de metal alcalino.

En una realizacion adicional mas, al menos una de las bases es hidroxido potasico.

Al menos una de las bases puede ser un solido, una solucion acuosa o una suspension. Tipicamente, sin embargo, al menos una de las bases es una solucion acuosa. Una base que es una solucion acuosa puede contener, por ejemplo, de aproximadamente 40% a aproximadamente 50% p/p de hidroxido de metal alcalino. En general, se utiliza al menos una cantidad estequiometrica de base.

En una realizacion, se usan de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 equivalentes de al menos una de las bases en la realizacion de la epoxidacion.

En otra realizacion, se usan de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 equivalentes de al menos una de las bases en la realizacion de la epoxidacion.

En otra realizacion mas, se usan de aproximadamente 1,1 a aproximadamente 1,5 equivalentes de al menos una de las bases en la realizacion de la epoxidacion.

Los disolventes organicos polares ejemplares que pueden utilizarse en la epoxidacion del compuesto de formula (4) incluyen, pero sin limitacion, por ejemplo, un disolvente aprotico polar, tal como, por ejemplo, acetona, metil etil cetona, tetrahidrofurano, 1,4-dioxano, 1,3-dioxolano, 1,2-dimetoxietano, dimetil eter de dietilenglicol, dimetil eter de trietilenglicol, dimetil eter de tetraetilenglicol, dimetil eter de polietilenglicol, 1,2-dietoxietano, eter dietilico de dietilenglicol, eter dietilico de trietilenglicol, eter dietilico de tetra etilenglicol, eter dietilico de polietilenglicol, acetonitrilo, dimetilformamida y dimetilsulfoxido; un disolvente organico protico polar, tal como, por ejemplo, un alcohol, tal como, por ejemplo, metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, sec-butanol, isobutanol y tercbutanol; y combinaciones de los mismos.

En una realizacion, el disolvente organico es un disolvente aprotico polar.

En otra realizacion, el disolvente organico protico polar es alcohol isopropilico.

En una realizacion, al menos uno de los disolventes es un disolvente organico polar y agua, y el disolvente organico polar tiene una afinidad relativamente alta por el agua.

En otra realizacion, al menos uno de los disolventes es un disolvente organico polar y agua, y el disolvente organico polar tiene una alta afinidad por el agua.

En otra realizacion mas, al menos uno de los disolventes es un disolvente organico polar y agua, y el disolvente organico polar es totalmente miscible con el agua. Un disolvente organico es, por ejemplo, totalmente miscible con agua cuando la mezcla de disolvente y agua formada despues de mezclar el disolvente con el agua es en apariencia homogenea.

Una proporcion de al menos uno de los disolventes organicos con agua cuando se usa una mezcla de un disolvente organico polar y agua puede variar dependiendo de factores tales como, por ejemplo, el disolvente organico polar empleado en particular, la potencia de al menos una de las bases y la temperatura de reaccion. Un experto en la materia, sin embargo, esta familiarizado generalmente con experimentos cotidianos para determinar facil y rapidamente la proporcion optima de disolvente organico polar y agua.

En una realizacion, la proporcion de al menos un disolvente organico polar a agua es inferior a aproximadamente 10 en volumen.

En otra realizacion, la proporcion de al menos uno de los disolventes organicos polares a agua es inferior a aproximadamente 5 en volumen.

En otra realizacion mas, la proporcion de al menos un disolvente organico polar a agua es inferior a aproximadamente 2 en volumen.

En una realizacion en la que el compuesto de formula (4) se mezcla con al menos una de las bases despues de que se extraiga en la fase ligera del disolvente organico acuoso enriquecido, el KF de la fase ligera del disolvente organico acuoso enriquecido puede ajustarse antes de que se mezcle con al menos una de las bases. El ajuste del

KF puede, por ejemplo, mantener sales y producto en solucion durante la reaccion de epoxidacion.

En una realizacion, el KF se ajusta a un intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 35% p/v, basado en la fase ligera del disolvente organico acuoso enriquecido.

En otra realizacion, el KF se ajusta a un intervalo de aproximadamente 24% a aproximadamente 26%, basado en la fase ligera del disolvente organico acuoso enriquecido.

En una realizacion, el KF se ajusta anadiendo agua.

El compuesto de formula (4) puede mezclarse con al menos una de las bases de acuerdo con u proceso discontinuo, semi-continuo o continuo. En una realizacion, el compuesto de formula (4) y al menos una de las bases se mezclan entre si en un proceso continuo, en el que se anade una corriente constante del compuesto de formula

(4) a una corriente constante de al menos una de las bases a una velocidad controlada de manera que aproximadamente 1 a aproximadamente 10, tipicamente aproximadamente 1 a aproximadamente 3 y mas tipicamente aproximadamente 1,1 a aproximadamente 1,5 equivalentes de al menos una de las bases se anaden por mol del compuesto de formula (4).

La temperatura a la que el compuesto de formula (4) puede ponerse en contacto con al menos una de las bases no esta particularmente restringida, pero en general la temperatura deberia ser tal, que la mezcla de reaccion no se solidifique. Por ejemplo, la temperatura es tipicamente aproximadamente 50 °C o inferior, y mas tipicamente de aproximadamente 30 °C o inferior.

En la retirada por cristalizacion del compuesto de formula (6) de la mezcla de reaccion, la mezcla de reaccion y el agua se anaden conjuntamente.

La mezcla de reaccion y el agua pueden anadirse conjuntamente de acuerdo con un proceso discontinuo, semicontinuo o continuo.

0pcionalmente, la mezcla de reaccion y el agua pueden anadirse conjuntamente a una mezcla de cristal de siembra que contiene al menos un cristal de siembra de (2R,3S)-1,2-epoxi-3-(protegido)amino-4-butano sustituido, agua y alcohol isopropilico. En una realizacion, la mezcla de cristal de siembra contiene aproximadamente una proporcion

3:1 de agua:alcohol isopropilico. En otra realizacion, al menos uno de los cristales de siembra tiene la misma formula quimica que el compuesto de formula (6) que se esta retirando por cristalizacion de la mezcla de reaccion.

La cantidad de al menos uno de los cristales de siembra utilizada depende generalmente de una diversidad de factores, que incluyen, por ejemplo, la velocidad a la que la mezcla de reaccion y el agua se anaden conjuntamente. Tipicamente, sin embargo, la cantidad de al menos uno de los cristales de siembra usada es al menos aproximadamente 1% en peso en relacion al compuesto de formula (6) que se esta retirando por cristalizacion de la mezcla de reaccion.

Tipicamente, la mezcla de reaccion y el agua se anaden conjuntamente a una temperatura que permite que se realice la cristalizacion.

En una realizacion, la mezcla de reaccion y el agua se anaden conjuntamente a una temperatura de aproximadamente 40 °C o inferior.

En otra realizacion, la mezcla de reaccion y el agua se anaden conjuntamente a una temperatura de aproximadamente 20 °C o inferior.

En otra realizacion mas, la mezcla de reaccion y el agua se anaden conjuntamente a una temperatura de aproximadamente 10 °C o inferior.

La temperatura del agua varia tipicamente de aproximadamente 0 a aproximadamente 5 °C.

0pcionalmente, puede usarse un intercambiados de calor en linea para enfriar la mezcla de reaccion antes de anadir conjuntamente la mezcla de reaccion y el agua.

La mezcla de reaccion y el agua pueden anadirse conjuntamente a un cristalizador mantenido opcionalmente a una temperatura de aproximadamente 0 a aproximadamente 20 °C, y tipicamente a una temperatura de aproximadamente 0 a aproximadamente 10 °C.

Segun se anaden conjuntamente la mezcla de reaccion y el agua, se forma una suspension que comprende al menos un cristal de formula (6). 0pcionalmente, la suspension resultante que comprende al menos uno de los cristales de formula (6) puede agitarse moderadamente o agitarse para producir el cristal o cristales de formula (6) propiedades satisfactorias y un tamano de particula uniforme. 0pcionalmente, la suspension resultante puede calentarse y/o enfriarse para mejorar el rendimiento, calidad y caracteristicas del cristal o cristales de la formula (6).

En una realizacion, la suspension que contiene al menos uno de los cristales de la formula (6) contiene aproximadamente una proporcion 3:1 de agua con al menos uno de los disolventes.

En otra realizacion, la mezcla de reaccion y el agua se anaden juntos en un proceso continuo, en el que se anade conjuntamente una corriente constante de mezcla de reaccion a una corriente constante de agua a una velocidad controlada para producir la suspension que comprende al menos uno de los cristales de formula (6) y aproximadamente una proporcion 3:1 de agua con al menos uno de los disolventes.

Al menos uno de los cristales de formula (6) puede separarse de la suspension mediante cualquier tecnica de separacion solido-liquido habitual, tal como, por ejemplo, filtracion por presion; filtracion a presion reducida; y centrifugacion.

Despues de que se separen, al menos uno de los cristales de formula (6) puede lavarse con agua y, si fuera necesario, secarse posteriormente, por ejemplo, a presion atmosferica, en, por ejemplo, un lecho fluidificado o vacio.

Ejemplos

La presente invencion se define adicionalmente en los siguientes Ejemplos. La presente invencion no se limita por los ejemplos ilustrativos expuestos a continuacion en el presente documento, sino que se define por las reivindicaciones posteriores del presente documento.

Ejemplo 1

Producción de cepa PTA-6648 de la ATCC de Rhodococcus Erythropolis mutagenizada

La cepa PTA-6648 de la ATCC de R. erythropolis mutagenizada se produjo sometiendo celulas electrocompetentes 4277 de R. erythropolis de la ATCC a un Kit de EZ::Tn™<R6Kγori/KAN-2>Tnp Transposome™ adquirido en Epicentre® Biotechnologies (Madison, WI).

Las celulas electrocompetentes 4277 de R. erythropolis de la ATCC se produjeron de acuerdo con una version modificada del protocolo expuesto por R. van der Geize y col. in Appl. Environ. Microbiol. 66: 2029-2036 (2000). En primer lugar, 200 ml de caldo triptico de soja alternativo (ATSB) que contiene proteina de soja al 1,8%, extracto de levadura al 0,2%, cloruro de sodio al 0,5%, glucosa al 0,25% y fosfato dipotasico al 0,25% se complemento con glicina al 3,0%. Despues el caldo se inoculo con 4,0 ml de 4277 de R. erythropolis de la ATCC en cultivo durante una noche y se agito a 250 RPM a 30 °C hasta una fase exponencial tardia (densidad optica a 600 nm = 2-3). Despues las celulas 4277 de R. erythropolis de la ATCC se sedimentaron centrifugandose durante 10 minutos a 4000 x gravedad a 4 °C y se lavaron dos veces con agua destilada fria. Despues de la centrifugacion, el sedimento celular recogido se resuspendio en 2-3 ml de una solucion de glicerol al 15%. Alicuotas de 100 μl de las celulas electrocompetentes 4277 de R. erythropolis de la ATCC se colocaron en tubos Eppendorf de 1,5 ml y se congelaron a -80 °C hasta su uso.

Tras el uso, las celulas 4277 de la ATCC de R. erythropolis electrocompetentes congeladas se descongelaron en hielo. Una vez descongeladas, un μl de kit EZ::TN™<R6Kγori/KAN-2>Tnp Transposome™ se anadio al tubo Eppendorf de 1,5 ml y se mezclo con las celulas. La mezcla resultante se transfirio a una cubeta con huecos de 2 mm y se sometio a electroporacion. La electroporacion se llevo a cabo en un Electro Cell Manipulator, modelo ECM

630 (BTX Molecular Delivery Systems, Harvard Apparatus Inc., San Diego, CA). La fuerza y resistencia de campo se ajustaron a 1,8 kV/cm y 400 Ω (25 μF), respectivamente. Se anadio un ml de caldo TSB a la cubeta inmediatamente a continuacion de la electroporacion y la suspension celular resultante se transfirio a un tubo de 14 ml de Polipropileno de Fondo Redondo (Becton Dickinson Labware, Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ). El tubo se agito a 250 RPM a 30 °C durante 4 horas. Alicuotas de 100μl de celulas 4277 de la ATCC de R. erythropolis mutagenizadas despues se sembraron en placas de agar TSB que contenian 250 μg/ml de kanamicina. Las placas se incubaron a 30 °C durante 3-4 dias para permitir que se formaran las colonias de las celulas 4277 de la ATCC de R. erythropolis mutagenizadas.

Las colonias de celulas 4277 de la ATCC de R. erythropolis mutagenizadas se recogieron mediante mondadientes esteriles y se colocaron en cada pocillo de 2 ml de una placa de 96 pocillos, en la que cada pocillo de 2 ml contenia 400 μl de TSB y 250 μg/ml de kanamicina. Despues la placa se incubo en una incubadora Microtitertron 0rbital Shaking (Appropriate Technical Resources, Inc., Laurel, MD) durante 48 horas a 700 RPM y 30 °C con humedad relativa del 45%. Despues se extrajeron cultivos celulares de 40 μl de cada pocillo y se inocularon en cada pocillo de 2 ml de una placa de 96 pocillos nueva, en la que cada pocillo de 2 ml contenia 400 μl de TSB y 250 μg/ml de kanamicina. La placa inoculada recientemente se incubo en una incubadora Microtitertron 0rbital Shaking (Appropriate Technical Resources, Inc., Laurel, MD) durante 24 horas a 700 RPM y 30 °C con humedad relativa del 45% y despues se centrifugo en una centrifuga Eppendorf, modelo 5810R (Brinkmann Instruments, Inc., Westbury, NY) a 4000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se vacio invirtiendo las placas de 96 pocillos cabeza abajo durante 30 segundos. Despues las celulas se resuspendieron en 400 μl de una solucion de reduccion enzimatica (pH 7,5) que contenia el 0,15% p/v de sustrato de (S)-1-cloro-2-oxo-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano; el 1,0% p/v de glucosa y tampon de tricina 0,1 M. La placa de 96 pocillos se incubo nuevamente en una incubadora Microtitertron 0rbital Shaking (Appropriate Technical Resources, Inc., Laurel, MD) durante 24 horas a 700 RPM y 30 °C con humedad relativa del 45% para posibilitar que ocurriera reduccion de cetona enzimatica del sustrato (3S)-1cloro-2-oxo-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano a 1-cloro-2-hidroxi-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4fenilbutano en cada pocillo de 2 ml. El contenido de cada pocillo de 2 ml se extrajo posteriormente en volumenes iguales de una mezcla 3:1 de n-butanol:metanol y se analizo mediante HPLC para determinar bioconversion y pureza diaestereoisomerica. De esta manera se seleccionaron 2500 colonias aisladas.

Cuando el contenido de cada pocillo de 2 ml que contenia cultivos de R. erythropolis mutagenizado se analizo, aproximadamente el 90% de los 2500 aislados bioconvirtieron aproximadamente el 100% del sustrato de (3S)-1cloro-2-oxo-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano en 1-cloro-2-hidroxi-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4fenilbutano, pero produjeron unicamente una e.d., de compuesto (2R,3S)-1-cloro-2-hidroxi-3-N-(tercbutoxicarbonil)amino-4-fenilbutano deseado de <92%. Se observo que unicamente un aislado tenia un e.d. a favor de compuesto (2R,3S)-1-cloro-2-hidroxi-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano de >98% y este aislado se deposito en la ATCC y se le asigno el n° de ATCC PTA-6648.

Ejemplos 2 a 14

Preparación de células PTA 6648 de la ATCC

El cultivo de PTA 6648 de la ATCC del Ejemplo 1 se cultivo hasta una densidad celular elevada con un procedimiento de fermentacion semicontinuo usando un cultivo de base de una fase para inocular un recipiente fermentador que contiene un medio discontinuo complejo. En primer lugar, 100 ml de medio de base (pH 7,2) que contiene cerelosa al 0,2% y extracto de levadura al 1% se inoculo con 0,2 ml de reserva de PTA-6648 de la ATCC o cultivo durante una noche. En segundo lugar, el medio de base inoculado se incubo y se agito en un incubadora Microtitertron 0rbital Shaking (Appropriate Technical Resources, Inc., Laurel, MD) durante 22-26 horas a 250 RPM y 28 °C. En tercer lugar, un fermentador B. Braun BioStat B de 5 litros (Sartorius BBI Systems, Inc. Bethlehem, PA) con 1,5 litros de un medio discontinuo complejo (pH 7,0-7,1) que contiene extracto de levadura al 0,3%, glicerol al 0,35%, fosfato dipotasico al 1,2%, acido citrico al 0,17%, cloruro de sodio al 0,13%, sulfato de magnesio al 0,18%, sulfato de amonio al 0,046% y propilenglicol al 0,01% se inoculo con 75 ml del medio de base inoculado. Durante la fermentacion, se empleo un medio de alimentacion concentrado que contenia glicerol al 38%, extracto de levadura 10% y propilenglicol al 0,003% para conseguir densidad celular elevada mientras que se permite la expresion intracelular nativa de la enzima cetorreductasa. A aproximadamente 70-72 horas, que es el punto en el cual se habia acumulado una cantidad optima de enzima cetorreductasa, se recogieron aproximadamente 440 g/l de celulas. Las celulas recogidas se lavaron y se diafiltraron con volumen en exceso de cuatro veces de agua a traves de una membrana de filtracion que tiene un tamano de poro de 0,2 μm. El volumen de la mezcla que contiene las celulas PTA-6648 de la ATCC recogidas se redujo posteriormente para producir una concentracion de celulas en la mezcla de aproximadamente el 40% (p/v).

Reacción de biotransformación

Se preparo un sistema acuoso tamponado (pH 7,4) que contenia el 28-32% (p/v) de celulas PTA-6648 de la ATCC anadiendo tampon de fosfato de sodio 0,1 M, glucosa al 2,2% (p/v), glicerol al 6% (p/v) y la mezcla que contenia aproximadamente el 40% (p/v) de celulas PTA-6648 de la ATCC preparada anteriormente a un fermentador de 5 litros B. Braun BioStat B. La agitacion, temperatura, pH y flujo de aire del fermentador se supervisaron y controlaron

a 1200 RPM, 26 °C, pH 7,4-7,6 y 1 vvm, respectivamente. La produccion de espuma se limito usando antiespuma PPG. Las cantidades de oxigeno disuelto y C02 presentes en el sistema acuoso tamponado tambien se supervisaron y mantuvieron a p02≥30.

Las fuentes de glucosa y carbono de glicerol se consumieron por las celulas PTA-6648 de la ATCC durante la

5 biotransformacion y como resultado se reabastecieron segun era necesario para mantener una concentracion de glucosa del 2,2% (p/v) y una concentracion de glicerol del 6% (p/v). La glucosa y el glicerol se anadieron para proporcionar energia a las celulas PTA-6648 de la ATCC.

Se anadio un total del 6,0% (p/v) de sustrato (S)-1-cloro-2-oxo-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano como una pasta de glicerol y agua al sistema acuoso tamponado (pH 7,4) que contenia aproximadamente del 28-32% (p/v)

10 de celulas PTA-6648 de la ATCC como cuatro adiciones separadas del 1,5% (p/v) de (S)-1-cloro-2-oxo-3-N-(tercbutoxicarbonil)amino-4-fenilbutano. La primera adicion se realizo a aproximadamente 0 horas, la segunda a aproximadamente a 4 horas, la tercera a aproximadamente 8 horas y la ultima a aproximadamente 23 horas. La reaccion de biotransformacion se termino en los tiempos expuestos en la Tabla 1 mas adelante en el presente documento.

15 De acuerdo con el procedimiento de biotransformacion, se biotransformo un total del 6% p/v del sustrato (S)-1-cloro2-oxo-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano en menos de 72 horas en (2R,3S)-1-cloro-2-hidroxi-3-N(tercbutoxicarbonil) con un % de conversion >99,5%, un e.d. >95,5% y una impureza des-cloro de Porcentaje de Area ≤0,5.

Los resultados del procedimiento descrito anteriormente se resumen en la Tabla 1 expuesta en el presente 20 documento mas adelante.

TABLA 1

Reduccion Microbiana Usando PTA-6648 de la ATCC

Condiciones de Fermentacion

Condiciones de Biotransformacion

N° de Ej.

Tiempo (h) Tiempo (h) Carga de Sustrato (% p/v) Celulas (% p/v) e.d. (2R, 3S) (%) % Biotransformado1 PurezaDiaestereomerica 2R, 3S (%) Impureza Des-Cloro (% de Area)

2

84 24 4 30 95,9 99,7 98,0 N/A 2

3

84 24 4 30 96,6 99,8 98,3 N/A

4

72 29 4 30 97,2 >99,8 98,6 0,4

5

72 29 6 30 97,1 >99,8 98,6 0,5

6

83 47 6 30 95,0 99,6 97,5 N/A

7

72 47 6 27 96,1 99,7 98,1 0,5

8

70 47 6 30 95,8 99,8 97,9 0,3

9

70 47 6 30 96,0 99,8 98,0 0,4

10

70 47 6 30 96,1 99,8 98,1 0,2

11

70 47 6 30 95,8 99,6 97,9 0,2

12

70 47 6 30 96,0 99,6 98,0 0,4

13

70 55 6 30 96,8 100 98,4 0,5

14

70 54 6 30 (a20% extra anadido) 95,7 99,8 97,9 0,3

1. % Biotransformado=cloroalcoholes totales [(2R, 3S)-1-cloro-2-hidroxi-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano a (2S, 3S)-1-cloro-2-hidroxi-3-N-(tercbutoxicarbonil)amino-4-fenilbutano)] ÷ cloroalcoholes totales mas (S)-1-cloro-2-oxo-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano restante.2. "N/A" significa �no aplicable� y se usa para indicar que el parametro particular no se midio.

Ejemplos comparativos 15 a 22

Preparacion de celulas 4277 de la ATCC de Rhodoccocus erythropolis

Las celulas 4277 de la ATCC se prepararon de acuerdo con el procedimiento usado en el Ejemplo 2 para preparar celulas de PTA-6648 de la ATCC.

5 Reaccion de biotransformacion

Se preparo un sistema acuoso tamponado (pH 8,3) que contenia aproximadamente el 28-32% (p/v) de celulas 4277 de la ATCC de R. erythropolis anadiendo tampon de fosfato de sodio 0,1 M, glucosa al 2,2% (p/v), glicerol al 6% (p/v) y la mezcla que contenia aproximadamente el 40% (p/v) de celulas 4277 de la ATCC de R. erythropolis preparada anteriormente a un fermentador de 5 litros B. Braun BioStat B. La agitacion, temperatura, pH y flujo de

10 aire del fermentador se supervisaron y controlaron a 1200 RPM, 26 °C, pH 8,2-8,4 y 1 vvm, respectivamente. La produccion de espuma se limito usando antiespuma PPG. Las cantidades de oxigeno disuelto presente en el sistema acuoso tamponado tambien se supervisaron.

Las fuentes de glucosa y carbono de glicerol se consumieron por las celulas 4277 de la ATCC de R. erythropolis durante la biotransformacion y como un resultado se reabastecieron segun era necesario para mantener una

15 concentracion de glucosa del 2,2% (p/v) y una concentracion de glicerol del 6% (p/v). La glucosa y el glicerol se anadieron para proporcionar energia a las celulas de Rhodococcus.

El sustrato de (S)-1-cloro-2-oxo-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano se anadio como una pasta de glicerolagua en dos partes iguales a aproximadamente 0 y aproximadamente 4 horas. Por ejemplo, si se usa una carga de sustrato total del 2% (p/v), se anade el 1% (p/v) del sustrato a aproximadamente 0 horas y el 1% (p/v) del sustrato se

20 anade a aproximadamente 4 horas.

Los resultados del procedimiento descrito anteriormente se resumen en la Tabla 2 expuesta en presente documento mas adelante.

TABLA 2

Reduccion Microbiana Usando 4277 de la ATCC de R. erythropolis

Condiciones de Fermentacion

Condiciones de Biotransformacion

N° de Ej.

Tiempo (h) Tiempo (h) Carga de sustrato (% p/v) Celulas (%w/v) e.d. (%) % Biotransformado1 PurezaDiaestereomerica 2R, 3S (%) Impureza Des-Cloro (%de Area)

15

72 44 4 30 90,6 44,8 95,3 N/A 2

16

72 44 3 30 93,2 66,0 96,6 N/A

17

72 24 2 30 92,4 96,7 96,2 N/A

18

94 22 2 30 95,6 99,8 97,8 N/A

19

94 22 2,5 30 95,5 99,8 97,8 N/A

20

94 22 3 30 94,6 99,7 97,3 N/A

21

96 22 2 30 96,1 99,5 98,1 2,2

22

96 22 2 30 96,4 99,7 98,2 2,1

1. % Biotransformado=cloroalcoholes totales [(2R, 3S)-1-cloro-2-hidroxi-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano a (2S, 3S)-1-cloro-2-hidroxi-3-N-(tercbutoxicarbonil)amino-4-fenilbutano)] ÷ cloroalcoholes totales mas (S)-1-cloro-2-oxo-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano restante.2. "N/A" significa �no aplicable� y se usa para indicar que el parametro particular no se midio.

Ejemplo 23

Cada pasta resultante post-biotransformacion de los ejemplos 2, 3, 5, 6, 10, 11 y 14 se centrifugo posteriormente para producir 1) una capa pesada que contenia en su mayoria cristales de (2R, 3S)-1-cloro-2-hidroxi-3-N-(tercbutoxicarbonil)amino-4-fenilbutano y 2) un sobrenadante que contenia en su mayoria impurezas indeseadas, tales como, por ejemplo, propilenglicol; sales; (2S, 3S)-1-cloro-2-hidroxi-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano y >70% de las celulas PTA-6648 de la ATCC.

Para producir la capa pesada, la pasta post-biotransformacion de cada uno de los ejemplos 2, 3, 5, 6, 10, 11 y 14 se enfrio en primer lugar hasta 1-5'C (teniendo cuidad o de no congelar la pasta) y despues se agito durante 10 minutos. Cada pasta enfriada se separo posteriormente en dos partes iguales y cada parte se anadio a una botella de centrifuga de 750 ml separada. Despues ambas partes se centrifugaron en una centrifuga Beckman Coulter Allegra® 64R High-Speed Refrigerated Benchtop (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA) a 3700 rpm durante 5 minutos. La capa pesada de cada parte se recogio y el sobrenadante que contenia todas las diversas impurezas se descarto.

En centrifugaciones discontinuas, el tamano de la botella de centrifuga, el volumen de la pasta, la temperatura de la pasta, las rpm de la centrifuga y la longitud de tiempo centrifugada pueden todas afectar las partes de celulas indeseadas contenidas en la capa pesada y por lo tanto, la cantidad de impurezas eliminadas a traves del sobrenadante. La parte de celulas indeseadas contenidas en la capa pesada tambien puede influir en el contenido de agua del alcohol isopropilico (IPA KF), lo cual puede conducir a una reduccion adicional en la cantidad de impurezas eliminadas a traves del sobrenadante.

Cada capa pesada recogida se deshidrato centrifugandose en una centrifuga Beckman Coulter Allegra® 64R High-Speed. Refrigerated Benchtop Centrifugue (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA) a 3700 rpm durante 25 minutos. El sobrenadante acuoso resultante ( ∼20 ml) se decanto y cada una de las capas pesadas mas secas se examino.

Tras examinarse, se observo que cada una de las capas pesadas mas secas contenia una capa superior de color oscuro y una capa inferior de color claro. La capa superior de color oscuro contenia tipicamente en su mayoria celulas PTA-6648 de la ATCC y <1% en peso, en base a la capa pesada mas seca, de (2R, 3S)-1-cloro-2-hidroxi-3N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano. La capa inferior de color claro tipicamente contenia en su mayoria (2R, 3S)-1-cloro-2-hidroxi-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano; agua y cantidades residuales de celulas PTA6648 de la ATCC. Las capas superiores de color oscuro se eliminaron manualmente de las capas pesadas mas secas con una espatula. Las capas superiores de color oscuro se combinaron y ensayaron para (2R, 3S)-1-cloro-2hidroxi-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano, cuyos resultados se exponen mas adelante en el presente documento en la Tabla 3 en la columna titulada � % e.d. de Capa Superior de Color 0scuro (2R,3S)�.

La capa inferior de color claro de cada una de las capas pesadas se anadio junto con 420 ml de alcohol isopropilico (IPA) a un vaso de precipitados unico. El contenido del vaso de precipitados se agito a 25 °C durante 15 minutos para producir una pasta de capa inferior/IPA.

Despues 50 ml de IPA se mezclaron con 7,2 g de carbono Darco® KB (American Norit Co., Inc., Atlanta, GA) en un vaso de precipitados para producir una pasta de carbono/IPA. La pasta de carbono/IPA despues se anadio a la pasta de capa inferior/IPA. La pasta de capa inferior/carbono/IPA resultante se enjuago con 10 ml de IPA.

La pasta de capa inferior/carbono/IPA enjuagada se agito durante al menos 30 minutos a 25 °C y despues se centrifugo en una centrifuga Beckman Coulter Allegra® 64R High-Speed Refrigerated Benchtop (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA) a 3700 rpm durante 15 minutos. La pasta posterior se decanto para separar una primera fase pesada que contenia en su mayoria carbono y celulas PTA-6648 de la ATCC a partir de una primera fase ligera de IPA acuosa rica que contenia en su mayoria (2R, 3S)-1-cloro-2-hidroxi-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano; agua y cantidades residuales de celulas PTA-6648 de la ATCC. El contenido de agua de la primera fase ligera de IPA acuosa rica (IPA KF) fue del 15-20%.

La primera fase pesada se anadio junto con 120 ml de IPA a un vaso de precipitados. El contenido del vaso de precipitados se agito durante al menos 30 minutos a 25 °C para producir una pasta. La pasta se centrifugo en una centrifuga Beckman Coulter Allegra® 64R High-Speed Refrigerated Benchtop Centrifugue (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA) a 3700 rpm durante 15 minutos. La pasta centrifugada se decanto para separar una segunda fase pesada que contenia en su mayoria carbono y celulas PTA-6648 de la ATCC a partir de una segunda fase ligera de IPA acuosa rica que contenia en su mayoria (2R, 3S)-1-cloro-2-hidroxi-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano; agua y cantidades residuales de celulas PTA-6648 de la ATCC. El IPA KF de la segunda fase ligera de IPA acuosa rica fue de aproximadamente el 5-9%.

Las dos fases ligeras de IPA acuosas ricas se combinaron en una corriente de fase ligera de IPA acuosa rica unica y se sometio a filtracion de abrillantado a traves de un filtro de 0,45 micrometros, que se lavo posteriormente con una cantidad minima de IPA. El IPA KF de la corriente de fase ligera de IPA acuosa rica resultante se ajusto al 25% anadiendo agua. La corriente de fase ligera de IPA acuosa rica se ensayo para (2R, 3S)-1-cloro-2-hidroxi-3-N-(tercbutoxicarbonil)amino-4-fenilbutano, cuyos resultados se exponen en el presente documento mas adelante en la

23 5

Tabla 3 en la columna titulada �% e.d. de Fase Ligera de IPA Combinada (2R,3S)�.

La segunda fase pesada se ensayo para (2R, 3S)-1-cloro-2-hidroxi-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano, cuyos resultados se exponen en el presente documento mas adelante en la Tabla 3 en la columna titulada �% e.d. de Fase Pesada Residual (2R,3S)�.

Es importante indicar que aunque a escala de laboratorio la capa pesada recogida se seco a traves de una etapa de deshidratacion por centrifugacion, a escala de planta la etapa de centrifugacion de deshidratacion se puede eliminar centrifugando la pasta post-biotransformacion en un Westfalia Concurrent Extractor-Decanter (Westfalia Separator AG, 0elde, Alemania) para producir directamente una capa pesada suficientemente seca. Adicionalmente, aunque la escala de laboratorio requiere que las capas superior e inferior de la capa pesada seca se separen manualmente, a escala de planta la etapa de separacion manual se elimina seleccionando simplemente el anillo estando adecuado y optimizando la velocidad diferencial entre el desplazamiento y el cuenco del Westfalia Extractor-Decanter (Westfalia Separator AG, 0elde, Alemania). Es decir, los solidos de (2R,3S)-1-cloro-2-hidroxi-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4fenilbutano se puede separar directamente de las celulas PTA-6648 de la ATCC ajustando apropiadamente los ajustes del Westfalia Extractor-Decanter (Westfalia Separator AG, 0elde, Alemania).

El efecto resultante del procedimiento de centrifugacion anterior sobre el e.d. del diaestereomero de (2R,3S)-1-cloro2-hidroxi-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano deseado se expone mas adelante en el presente documento en la Tabla 3.

TABLA 3

Uso de centrifugacion de IPA para mejorar el E.D. de (2R,3S)-1-cloro-2-hidroxi-3-N-(terc-butoxicarbonil)ammo-4-fenilbutano

N° de Ej.

e.d. (%) Postbioconversion (2R, 3S) % de Fase ligera de IPA Combinada (2R, 3S) (%) Aumento en e.d.1 (2R, 3S) e.d. (%) del Sobrenadante (2R, 3S) e.d. (%) de Capa Superior de Color 0scuro (2R, 3S) e.d. (%) de Fase Pesada Residual (2R, 3S)

2

95,9 99,0 3,1 17,9 N/A2 98,8

3

96,6 99,0 2,4 23,6 N/A 98,4

5

97,1 99,1 2,0 2,3 86,7 99,1

6

95,0 96,8 1,8 32,5 Na 95,7

10

96,1 97,5 1,4 29,0 58,3 97,4

11

95,8 96,7 0,9 14,3 55,6 96,3

14

95,7 97,6 1,9 13,4 56,9 97,3

1. % de aumento en e.d. (2R,3S) = e.d. (%) de Fase Ligera de IPA Combinada (2R,3S) � e.d. (%) Post-bioconversion (2R,3S)�.2. N/A� significa no aplicable� y se usa para indicar que el parametro particular no se midio.

Ejemplo 24

Reaccion de epoxidacion

Se convirtio (2R,3S)-1-cloro-2-hidroxi-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano en (2R,3S)-1,2-epoxi-3-N-(tercbutoxicarbonil)amino-4-fenilbutano calentando en primer lugar la corriente IPA rica en (2R,3S)-1-cloro-2-hidroxi-3-N(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano del Ejemplo 19 a 30 °C, y despues combinando la corriente calentada con 1,5 equiv. (en relacion a la actividad de (2R,3S)-1-cloro-2-hidroxi-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano) de 45% p/p de solucion de K0H/agua para formar una mezcla de reaccion que contiene (2R,3S)-1,2-epoxi-3-N-(tercbutoxicarbonil)amino-4-butano sustituido. La mezcla de reaccion que contiene epoxido se agito vigorosamente a 30 °C durante 5 minutos y despues se enfrio inmediatamente a 5 °C. La mezcla de reaccion se ensayo posteriormente para (2R,3S)-1,2-epoxi-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano, los resultados del mismo se exponen mas adelante en el presente documento en la Tabla 4.

(2R,3S)-1,2-epoxi-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano retirado por cristalizacion

Se colocaron 400 mg de cristales de siembra de (2R,3S)-1,2-epoxi-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano en un matraz de fondo redondo de 3 l y se anadio una mezcla que contenia 6 ml de agua y 2 ml de IPA al matraz para formar una suspension de cristal de siembra/agua/IPA. La suspension se enfrio a 0-5 °C y, mientras se agitaba vigorosamente, se anadio conjuntamente una proporcion 3:1 antidisolvente frio de agua a 1-5 °C y epoxido que

contenia la mezcla de reaccion al matraz que contenia el cristal de siembra de manera que provoca so que el (2R,3S)-1,2-epoxi-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano se retire por cristalizacion de la mezcla de reaccion que contiene epoxido. Es decir, el (2R,3S)-1,2-epoxi-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano se retira por cristalizacion de la mezcla de reaccion que contiene epoxido, anadiendo conjuntamente agua y la mezcla de 5 reaccion que contiene epoxido al matraz que contiene el cristal de siembra a una velocidad tal, que la suspension resultante comprenda cristales de (2R,3S)-1,2-epoxi-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano contenidos en una proporcion de agua a IPA de aproximadamente 3:1. Despues de anadir toda la mezcla de reaccion que contiene epoxido, la suspension se enfrio a 0-5 °C y se agito suavemente durante 3 horas. Despues, la suspension se filtro a traves de un papel de filtro N° 604 de 24 y la torta de (2R,3S)-1,2-epoxi-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano

10 se lavo con 360 ml de agua a 1-5 °C. Los cristales de epoxido de (2R,3S)-1,2-epoxi-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino4-fenilbutano se secaron al vacio con un arrastre de nitrogeno a 25-30 °C hasta que se obtuvo un peso constante.

El procedimiento completo de biotransformacion a epoxidacion produjo 80,5% en M de (2R,3S)-1,2-epoxi-3-N-(tercbutoxicarbonil)amino-4-fenilbutano.

TABLA 4

Epoxidacion de (2R,3S)-1-cloro-2-hidroxi-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano a (2R,3S)-1,2-epoxi-3-N-(tercbutoxicarbonil)amino-4-fenilbutano

N° de Ej.

Rendimiento en % de M de Cristales Epoxido (2R,3S) e.d (2R,3S) de ensayo epoxido (%) e.d de (2R,3S)-1-cloro2-hidroxi-3-N-(tercbutoxicarbonil)amino4-fenilbutano despues de centrifugacion Impureza Des-Cloro. despues de epoxidacion (% de area)

10

80,5 97,4 97,5 0,19%

14(A)

78,4 97,7 97,6 0,15%

14(B)

78,2 97,6 97,6 0,15%

25 5

Claims (31)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento que comprende preparar (2R,3S)-1-halo-2-hidroxi-3-(protegido)amino-4-butano sustituido de la formula:

   en la que X es a halogeno, R se selecciona entre alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, y arilo sustituido, y R1 representa un grupo protector de amino, poniendo en contacto un Rhodococcus erythropolis mutagenizado que tiene N° de deposito de ATCC PTA-6648 con de 2,5 a aproximadamente 6% p/v, basado en sustrato, de sustrato de (3S)-1-halo-2-oxo-3-(protegido)amino-4-butano sustituido de la formula:

   en la que X, R, y R1 son como se han definido anteriormente.

2. 2.

   El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, que comprende ademas poner en contacto el sustrato de formula (3) con la Rhodococcus erythropolis mutagenizada que tiene N° de deposito de ATCC PTA-6648 en presencia de aproximadamente 2 a aproximadamente 6% (p/v) de glicerol.

3. 3.

   El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 2, en el que la el compuesto de formula (4) se obtiene en un exceso diastereomerico de al menos el 95,6%.

4. 4.

   El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 2, en el que el compuesto de formula (4) se obtiene a una pureza diastereomerica de al menos el 97,9%.

5. 5.

   El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 2, en el que la puesta en contacto del Rhodococcus erythropolis mutagenizado que tiene un N° de deposito de ATCC PTA-6648 con el sustrato de formula (3) produce menos de aproximadamente el 0,6 porciento de area de impureza des-halo alcohol de (3S)-2-hidroxi-3-(protegido)amino-4butano sustituido de la formula

   en la que R se selecciona entre alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo o arilo sustituido y R1 representa un grupo protector de amino.

6. 6.

   El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 5, en el que la impureza del des-halo alcohol es ((1S)-1-bencil2-hidroxipropil)carbamato de terc-butilo.

7. 7.

   El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 2, que comprende ademas la utilizacion de la centrifugacion para separar el compuesto de formula (4) de al menos una impureza.

8. 8.

   El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 7, en el que dicha centrifugacion provoca un incremento en el exceso diastereomerico del compuesto de formula (4) de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 3,5%.

9. 9.

   El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el Rhodococcus erythropolis mutagenizado que tiene N° de deposito de ATCC PTA-6648 se pone en contacto con de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 6% p/v, basado en sustrato, de sustrato de formula (3).

10. 10.

    El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 9, que comprende ademas poner en contacto el sustrato de formula (3) con el Rhodococcus erythropolis mutagenizado que tiene N° de deposito de ATCC PTA-6648 en

    26 5

    presencia de aproximadamente 2 a aproximadamente 6% (p/v) de glicerol.

11. 11.

    El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 10, en el que al menos el 99,6% del sustrato de formula (3) se biotransforma para dar el compuesto de formula (4).

12. 12.

    El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 10, en el que el compuesto de formula (4) se obtiene en un exceso diastereomerico de al menos aproximadamente el 95,1%.

13. 13.

    El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 10, en el que el compuesto de formula (4) se obtiene a una pureza diastereomerica de al menos aproximadamente el 96%.

14. 14.

    El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el Rhodococcus erythropolis mutagenizado que tiene N° de deposito de ATCC PTA-6648 se pone en contacto con aproximadamente 6% p/v, basado en sustrato, del sustrato de formula (3).

15. 15.

    El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que X es cloro, R es fenilo y R1 es terc-butoxicarbonilo.

16. 16.

    El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, que comprende ademas la utilizacion de la centrifugacion para separar el compuesto de formula (4) de al menos una impureza.

17. 17.

    El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 16, en el que dicha centrifugacion provoca un incremento en el exceso diastereomerico del compuesto de formula (4) de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 3,5%.

18. 18.

    El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 16, que comprende ademas mezclar el compuesto de formula

    (4) con al menos una base en presencia de al menos un disolvente seleccionado ente un disolvente organico polar y un disolvente organico polar y agua para producir una mezcla de reaccion que comprende (2R,3S)-1,2-epoxi-3(protegido)amino-4-butano sustituido de la formula

    en la que R se selecciona entre alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo o arilo sustituido y R1 representa un grupo protector de amino.

19. 19.

    El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 18, en el que R es fenilo y R1 es terc-butoxicarbonilo.

20. 20.

    El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 18, que comprende ademas retirar por cristalizacion el compuesto de formula (6) de la mezcla de reaccion anadiendo conjuntamente agua y la mezcla de reaccion juntas.

21. 21.

    El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 20, en el que la adicion conjunta de agua y la mezcla de reaccion juntas produce una suspension que comprende al menos un cristal de formula (6) y una proporcion del agua con el menos uno de los disolventes de de aproximadamente 3:1.

22. 22.

    El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, que comprende ademas mezclar el compuesto de formula

    (4) con al menos una base en presencia de al menos un disolvente seleccionado entre un disolvente organico polar y un disolvente organico polar y agua para producir una mezcla de reaccion que comprende (2R,3S)-1,2-epoxi-3(protegido)amino-4-butano sustituido de la formula

    en la que R se selecciona entre alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo o arilo sustituido y R1 representa un grupo protector de amino.

23. 23.

    El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 22, en el que R es fenilo y R1 es terc-butoxicarbonilo.

24. 24.

    El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 22, que comprende ademas retirar por cristalizacion el compuesto de formula (6) de la mezcla de reaccion anadiendo conjuntamente agua y la mezcla de reaccion juntas.

25. 25.

    El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 24, en el que dicha adicion conjunta del agua y la mezcla de reaccion juntas produce una suspension que comprende al menos un cristal de formula (6) y una proporcion del agua con al menos uno de los disolventes de aproximadamente 3:1.

26. 26.

    Un Rhodococcus erythropolis mutagenizado que tiene N° de deposito de ATCC PTA-6648.

27. 27.

    Un procedimiento que comprende preparar (2R,3S)-1-cloro-2-hidroxi-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4fenilbutano poniendo en contacto un Rhodococcus erythropolis mutagenizado que tiene N° de deposito de ATCC PTA-6648 con de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 6% p/v, basado en sustrato, de sustrato de (3S)-1

    5 cloro-2-oxo-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano.

28. 28.

    El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 27, en el que el sustrato de (3S)-1-cloro-2-oxo-3-N-(tercbutoxicarbonil)amino-4-fenilbutano se pone en contacto con el Rhodococcus erythropolis mutagenizado que tiene N° de deposito de ATCC PTA-6648 en presencia de aproximadamente 2 a aproximadamente 6% (p/v) de glicerol.

29. 29.

    El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 28, que comprende ademas mezclar el (2R,3S)-1-cloro-2

    10 hidroxi-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano con de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 equivalentes de hidroxido potasico en presencia de alcohol isopropilico para producir una mezcla de reaccion que comprende (2R,3S)-1,2-epoxi-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano; y retirar por cristalizacion dicho (2R,3S)-1,2-epoxi-3N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano de la mezcla de reaccion anadiendo conjuntamente agua y la mezcla de reaccion juntas para producir una suspension que comprende al menos un cristal de (2R,3S)-1,2-epoxi-3-N-(terc

    15 butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano y una proporcion de agua con el alcohol isopropilico de aproximadamente 3:1.

30. 30.

    El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 28, que comprende ademas la utilizacion de la centrifugacion para separar el (2R,3S)-1-cloro-2-hidroxi-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano de al menos una impureza.

31. 31.

    El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 30, que comprende ademas mezclar el (2R,3S)-1-cloro-2hidroxi-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano con de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 equivalentes

    20 de hidroxido potasico en presencia de alcohol isopropilico para producir una mezcla de reaccion que comprende (2R,3S)-1,2-epoxi-3-N-(terc-butoxicarbonil)amino-4-fenilbutano; y cristalizar dicho (2R,3S)-1,2-epoxi-3-N-(tercbutoxicarbonil)amino-4-fenilbutano de la mezcla de reaccion anadiendo conjuntamente agua y la mezcla de reaccion juntas para producir una suspension que comprende al menos un cristal de (2R,3S)-1,2-epoxi-3-N-(tercbutoxicarbonil)amino-4-fenilbutano y una proporcion del agua con el alcohol isopropilico de aproximadamente 3:1.