ES2377029T3 - Reactivos y métodos para detectar Neisseria gonorrhoeae - Google Patents

Abstract

Oligonucleótido que comprende un ácido nucleico que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45 o un complementos de las mismas, presentando el oligonucleótido entre 10 y 50 nucleótidos.

Description

Reactivos y métodos para detectar Neisseria gonorrhoeae

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a los campos de la biología molecular y de la química de los ácidos nucleicos. La invención proporciona métodos y reactivos para detectar patógenos, tales como Neisseria gonorrhoeae y, por consiguiente, también se refiere a los campos del diagnóstico y pronóstico médicos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El género Neisseria consiste de bacterias aeróbicas Gram-negativas, incluyendo el patógeno humano N. gonorrhoeae, que es el agente causativo de la gonorrea. Las infecciones por N gonorrhoeae, que presentan una elevada prevalencia y baja mortalidad, generalmente se contrae mediante contacto sexual y típicamente afecta a las membranas mucosas de la uretra en los hombres y del endocérvix en las mujeres. Sin embargo, la infección también puede extenderse a otros tejidos. Por ejemplo, una infección genital en el hombre puede ascender por la uretra y producir síntomas de prostatis, mientras que en mujeres, una infección por N. gonorrhoeae del cérvix puede extenderse a los tubos de Falopio y finalmente provocar esterilidad, entre otras condiciones, si no se trata. El mecanismo patogénico de la N. gonorrhoeae implica la unión de la bacteria a células epiteliales no ciliadas mediante fimbrias. El mecanismo también incluye la producción de endotoxina y proteasas de IgA.

Con frecuencia se observa coinfección por N. gonorrhoeae y Chlamydia trachomatis. Ambas infecciones son dos causas conocidas de embarazo ectópico y también pueden conducir a infertilidad si no se tratan. También existen causas conocidas de síndrome clínicos agudos de cervicitis mucopurulentos y enfermedad inflamatoria pélvica. Por lo tanto, la detección de las infecciones por N. gonorrhoeae y C. trachomatis, que pueden ser asintomáticas, especialmente en mujeres, resulta importante para las personas que necesitan tratamiento y para poblaciones más amplias con riesgo de contraer y propagar más las infecciones.

La detección e identificación de las infecciones bacterianas tradicionalmente se ha llevado a cabo mediante aislamiento en cultivo puro y siguiendo procedimientos de determinación que aplican los conociientos disponibles sobre el origen del espécimen, los requisitos de crecimiento, las características visibles del crecimiento, la morfología microscópica, las reacciones de tinción y las características bioquímicas. Por ejemplo, entre los métodos preexistentes de detección e identificación de las infecciones por N. gonorrhoeae se incluyen la tinción Gram, el cultivo en medio agar selectivo y ensayos en los que se utiliza citocromo oxidasa y carbohidratos. También se han descrito ensayos serológicos, entre ellos la coaglutinación y la tinción con anticuerpos fluorescentes, para la detección de N. gonorrhoeae. Los métodos basados en cultivos, aunque relativamente sensibles, generalmente resultan de aplicación lenta, incluyendo con frecuencia la incubación durante la noche, y son laboriosos. Los ensayos de tinción Gram y los basados en anticuerpos típicamente proporcionan resultados en menos de una hora, aunque generalmente son de menor sensibilidad que los métodos basados en cultivos.

La utilización de secuencias polinucleótidas específicas como sondas para la identificación de agentes infecciosos es una alternativa a los ensayos de identificación inmunológicos, que son problemáticos, y otras metodologías preexistentes. Por ejemplo, las sondas de ácidos nucleicos complementarias a las secuencias de ácidos nucleicos diana han sido utlizadas en procedimientos de hibridación, tales como las transferencias southern y las transferencias por puntos, para detectar la secuencia diana de ácidos nucleicos. Muchos de dichos procedimientos de hibridación dependen del cultivo y/o enriquecimiento del organismo y, de esta manera, resultan inadecuados para el diagnóstico rápido. La aparición de técnicas para la amplificación rápida de secuencias específicas de ácidos nucleicos, tales como la reacción en cadena de la polimerasa, entre muchas otras, ha proporcionado un mecanismo para utilizar sondas específicas de secuencias directamente en especímenes clínicos, eliminando de esta manera el enriquecimiento y cultivo in vitro del patógeno antes de la realización del ensayo de hibridación. De esta manera, los ensayos de hibridación basados en la amplificación pueden proporcionar técnicas diagnósticas simples y rápidas para la detección de patógenos en muestras clínicas.

Muchas sondas utilizadas en la actualidad no presentan suficiente especificidad para diferenciar entre agentes patogénicos que presentan secuencias de ácidos nucleicos altamente homólogas, tales como N. gonorrhoeae, N. meningitidis y similares. Esto puede conducir a resultados de ensayo sesgados, incluyendo falsos positivos. Una consecuencia de este diagnóstico erróneo podría ser la administración a un paciente de un curso inapropiado de tratamiento.

La patente US nº 2005/0158768 da a conocer oligonucleótidos capaces de detectar Neisseria gonorrhoeae en una muestra. Sin embargo, los oligonucleótidos dados a conocer no son capaces de detectar específicamente Neisseria gonorrhoeae que comprende una secuencia variante en la repetición directa 9 (por ejemplo la cepa NG889).

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

La presente exposición proporciona métodos y reactivos para la detección rápida de Neisseria gonorrhoeae que son específicos de especie, es decir, sin detección sustancial de otras especies en el género Neisseria o de especies de otros géneros. Por ejemplo, los reactivos de detección de ácidos nucleicos de la exposición (por ejemplo sondas de ácidos nucleicos, anticuerpos específicos de especie, etc.) típicamente se unen a las secuencias de nucleótidos presentes en N. gonorrhoeae pero no en otras especies.Además, debido a que los pacientes infectados por N. gonorrhoeae con frecuencia también se encuentran infectados por Chlamydia trachomatis, la exposición también proporciona métodos de detectar concurrentemente N. gonorrhoea y C. trachomatis en las muestras. Este enfoque minimiza el número de procedimientos diagnósticos a los que se somete un paciente, lo que típicamente también minimiza el coste total del diagnóstico. Además de composiciones y mezclas de reacción, la exposición también se refiere a kits y sistemas para detectar dichos agentes patogénicos, y a medios informáticos y legibles por ordenador relacionados.

En un aspecto, la invención proporciona un oligonucleótido que consiste de un ácido nucleico con una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45 ó complementos de las mismas. En otro aspecto, la invención proporciona un oligonucleótido que comprende un ácido nucleico con una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45 y complementos de las mismas, presentando el oligonucleótido entre 10 y 50 nucleótidos. En todavía otro aspecto, la invención proporciona un oligonucleótido que incluye un ácido nucleico que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% (por ejemplo de por lo menos 95%, etc.) respecto a uno de entre SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45 ó complementos de las mismas. Típicamente, dichos oligonucleótidos son ácidos nucleicos cebadores, sondas de ácidos nucleicos, o similares en dichas realizaciones. En algunas de dichas realizaciones, los oligonucleótidos presentan 40 ó menos nucleótidos (por ejemplo 35 ó menos nucleótidos, 30 ó menos nucleótidos, etc.). En algunas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden por lo menos un nucleótido modificado. Opcionalmente, los oligonucleótidos comprenden por lo menos un marcaje y/o por lo menos una fracción desactivadora. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos incluyen por lo menos una variación modificada conservadoramente.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para detectar Neisseria gonorrhoeae en una muestra, incluyendo el método: (a) poner en contacto ácidos nucleicos procedentes de una muestra con por lo menos una primera pareja de ácidos nucleicos cebadores que comprenden por lo menos un ácido nucleico seleccionado de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45, una variante sustancialmente idéntica de las mismas, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45, y complementos de los SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45 y la variante, en por lo menos una reacción de amplificación de ácidos nucleicos. El método también incluye: (b) detectar los ácidos nucleicos y/o uno o más amplicones de los mismos de la reacción de amplificación de ácidos nucleicos durante o después de (a), detectando de esta manera Neisseria gonorrhoeae en la muestra. En algunas realizaciones,

(a)

comprende poner en contacto los ácidos nucleicos procedentes de la muestra con por lo menos una segunda pareja de ácidos nucleicos capaces de hibridarse con un ácido nucleico de Chlamydia trachomatis. En dichas realizaciones, (b) comprende detectar uno o más amplicones adicionales de la reacción de amplificación de ácidos nucleicos durante o después de (a), detectando de esta manera Chlamydia trachomatis en la muestra. En determinadas realizaciones, por lo menos uno de los ácidos nucleicos cebadores comprende un ácido nucleico cebador modificado. En algunas realizaciones, por lo menos uno de los ácidos nucleicos cebadores comprende por lo menos un marcaje. En dichas realizaciones, (b) opcionalmente comprende detectar una señal detectable producida por el marcaje, o amplificar una señal detectable producida por el marcaje con el fin de producir una señal amplificada y detectar la señal amplificada. En algunas realizaciones,

(b)

comprende realizar un seguimiento de la unión entre los amplicones y uno o más reactivos de detección de ácidos nucleicos que se unen detectablemente a un ácido nucleico con una secuencia que consiste de SEC ID nº 36, una variante sustancialmente idéntica a la misma en la que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a SEC ID nº 36, o un complemento de SEC ID nº 36 ó la variante. En la presente memoria, en determinadas realizaciones, por lo menos uno de los reactivos de detección de ácidos nucleicos comprende un oligonucleótido. Además, en realizaciones particulares por lo menos uno de los reactivos de detección de ácidos nucleicos comprende un ácido nucleico que presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45, una variante sustancialmente idéntica de las mismas, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45, y complementos de los SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45 y la variante.

Típicamente, por lo menos uno de los reactivos de detección de ácidos nucleicos comprende por lo menos un marcaje y/o por lo menos una fracción desactivadora. En dichas realizaciones, (b) opcionalmente comprende detectar una señal detectable producida por el marcaje, o amplificar una señal detectable producida por el marcaje con el fin de producir una señal amplificada y detectar la señal amplificada.

Se da a conocer adicionalmente un método para determinar la presencia de Neisseria gonorrhoeae en una muestra, comprendiendo el método: (a) poner en contacto ácidos nucleicos de la muestra y/o uno o más amplicones de los mismos con por lo menos una primera pareja de ácidos nucleicos cebadores en por lo menos una reacción de

amplificación de ácidos nucleicos, en el que cada uno de los ácidos nucleicos cebadores presenta entre 12 y 100 nucleótidos, y en el que uno de los ácidos nucleicos cebadores comprende una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una subsecuencia de SEC ID nº 36, o un complemento de la mismas. El método también incluye: (b) detectar los ácidos nucleicos y/o uno o más amplicones de los mismos de la reacción de amplificación de ácidos nucleicos durante o después de (a), detectando de esta manera Neisseria gonorrhoeae en la muestra. En determinados aspectos del método, (a) comprende poner en contacto los ácidos nucleicos de la muestra con por lo menos una segunda pareja de ácidos nucleicos cebadores que son por lo menos parcialmente complementarios respecto a un ácido nucleico de Chlamydia trachomatis, y (b) comprende detectar uno o más amplicones adicionales de la reacción de amplificación de ácidos nucleicos durante o después de (a), detectando de esta manera Chlamydia trachomatis en la muestra. En otro aspecto del método, por lo menos uno de los ácidos nucleicos cebadores comprende un ácido nucleico cebador modificado. En todavía otro aspecto, (b) comprende realizar un seguimiento de la unión entre los amplicones y uno o más reactivos de detección de ácidos nucleicos que se unen detectablemente a un ácido nucleico con una secuencia que consiste de SEC ID nº 36, una variante sustancialmente idéntica a la misma en la que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a SEC ID nº 36, o un complemento de SEC ID nº 36 ó la variante. En otros aspectos, uno o más de los ácidos nucleicos cebadores presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 37 a 60, una variante sustancialmente idéntica de los mismos, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 37 a 60 y complementos de SEC ID nº 37 a 60 y la variante.

Otro aspecto de la invención se refiere a un kit, que comprende: (a) por lo menos un oligonucleótido que presenta entre 10 y 50 nucleótidos, comprendiendo el oligonucleótido por lo menos un ácido nucleico seleccionado de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45, una variante sustancialmente idéntica de los mismos, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45, y complementos de los SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45 y la variante, y uno o más de entre: (b) instrucciones para determinar la presencia de Neisseria gonorrhoeae en una muestra mediante seguimiento de la unión entre los ácidos nucleicos y/o amplicones de los mismos procedentes de la muestra y el oligonucleótido, en el que la presencia de Neisseria gonorrhoeae en la muestra es desconocida o no se ha constatado, o (c) por lo menos un recipiente para contener por lo menos el oligonucleótido. En determinados aspectos, el oligonucleótido proporcionado en el kit presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45, una variante sustancialmente idéntica de los mismos, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45, y complementos de los SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45 y la variante. El kit puede comprender además uno o más reactivos de detección de ácidos nucleicos que se unen detectablemente a un ácido nucleico de Chlamydia trachomatis. En determinados aspectos, el kit comprende además por lo menos un enzima.

Todavía otro aspecto de la invención se refiere a una mezcla de reacción que comprende un conjunto de amplicones que presenta secuencias que corresponden a una o más subsecuencias de SEC ID nº 36, una variante sustancialmente idéntica a la misma en la que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a SEC ID nº 36, o un complemento de SEC ID nº 36 ó la variante, en donde los amplicones no presentan nucleótidos terminadores, en el que por lo menos un subconjunto del conjunto de amplicones se produce utilizando por lo menos un ácido nucleico cebador que presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45, una variante sustancialmente idéntica de los mismos, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45, y complementos de los SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45 y la variante.

Los reactivos de detección de ácidos nucleicos de la invención incluyen diversas realizaciones. A título ilustrativo, por lo menos uno de los reactivos de detección de ácidos nucleicos puede comprender un oligonucleótido (por ejemplo una sonda de ácidos nucleicos, un ácido nucleico cebador, etc.). Típicamente, el oligonucleótido comprende una identidad de secuencia de por lo menos 85% (por ejemplo de aproximadamente 90%, de aproximadamente 95%, etc.) respecto a una subsecuencia de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36, una variante sustancialmente idéntica de los mismos, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 1 ó 2 ó 36, o un complemento de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36 ó la variante. Opcionalmente, el oligonucleótido presenta una secuencia de longitud comprendida entre aproximadamente 8 y aproximadamente 100 nucleótidos. También se dan a conocer realizaciones, en las que el oligonucleótido presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60, una variante sustancialmente idéntica de las mismas, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 3 a 27 y37 a 60, y complementos de SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60 yla variante. Opcionalmente, se modifica por lo menos un nucleótido del oligonucleótido. En algunas realizaciones, por ejemplo, el nucleótido se modifica para alterar la estabilidad de la hibridación de los ácidos nucleicos respecto a los nucleótidos no modificados.

A título ilustrativo adicional, por lo menos uno de los reactivos de detección de ácidos nucleicos opcionalmente se une detectablemente a un segmento de ácidos nucleicos que comprende una o más posiciones nucleótidas de SEC ID nº 1 seleccionada de entre el grupo que consiste de 259, 260, 262, 264, 265, 266, 268, 269, 273, 275, 276, 277, 279, 297, 298, 300, 301,

302, 303, 304, 305, 306, 308, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 320, 321, 325, 326, 428, 429, 431, 432, 433, 434, 435, 440, 441 y 447. A modo de opción adicional, por lo menos uno de los reactivos de detección de ácidos nucleicos se une detectablemente a un segmento de ácidos nucleicos que comprende una o más posiciones nucleótidas de SEC ID nº 2 seleccionadas de entre el grupo que consiste de: 89, 90, 91, 92, 95, 98, 101, 105, 106, 107, 216, 217, 220, 222, 223, 225, 233, 235, 236, 238, 335, 336, 337, 338, 339, 342, 345, 346 y 351. En otras realizaciones, por lo menos uno de los reactivos de detección de ácidos nucleicos comprende, por ejemplo, un anticuerpo específico de una secuencia.

En determinadas realizaciones, los ácidos nucleicos, los amplicones de los mismos y/o los reactivos de detección de ácidos nucleicos comprenden por lo menos un marcaje y/o por lo menos una fracción desactivadora. Por ejemplo, el marcaje opcionalmente comprende un pigmento fluorescente, un marcaje débilmente fluorescente, un marcaje no fluorescente, un marcaje colorimétrico, un marcaje quimioluminiscente, un marcaje bioluminiscente, un anticuerpo, un antígeno, biotina, un hapteno, un grupo modificador de masa, un isótopo radioactivo, un enzima o similares. En dichas realizaciones, (b) típicamente comprende detectar una señal detectable producida por el marcaje. A título ilustrativo, (b) opcionalmente comprende (i) amplificar una señal detectable producida por el marcaje, produciendo una señal amplificada, e (ii) detectar la señal amplificada.

En algunas realizaciones, por lo menos un segmento de los ácidos nucleicos se amplifica antes o durante (a) utilizando por lo menos una técnica de amplificación de ácidos nucleicos para producir los amplicones, y (b) comprende el seguimiento de la unión entre los ácidos nucleicos y/o amplicones de los mismos, y los reactivos de detección de ácidos nucleicos, durante o después de la amplificación. Por ejemplo, la técnica de amplificación de ácidos nucleicos típicamente comprende una reacción en cadena de la polimerasa, una reacción en cadena de la ligasa y/o similares. En dichas realizaciones, el segmento opcionalmente se amplifica utilizando por lo menos un ácido nucleico cebador que comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60, una variante sustancialmente idéntica de las mismas, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60, y complementos de SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60 y la variante. En algunas de dichas realizaciones, el ácido nucleico cebador comprende por lo menos un marcaje, tal como se describe en la presente memoria o, de otro modo, conocido de la técnica. Opcionalmente, el ácido nucleico cebador comprende un ácido nucleico cebador modificado (por ejemplo una modificación alteradora de la especificidad de amplificación de los ácidos nucleicos, un conector de sitio de restricción, y/o similares).

También se da a conocer un método para detectar Neisseria gonorrhoeae en una muestra. El método incluye: (a) poner en contacto ácidos nucleicos de la muestra con por lo menos una primera pareja de ácidos nucleicos cebadores que comprende por lo menos un ácido nucleico seleccionado de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60, una variante sustancialmente idéntica de las mismas, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60, y complementos de SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60 y la variante, en por lo menos una reacción de amplificación de ácidos nucleicos. Además, el método también incluye: (b) detectar los ácidos nucleicos y/o uno o más amplicones de los mismos de la reacción de amplificación de ácidos nucleicos durante o después de (a), detectando de esta manera Neisseria gonorrhoeae en la muestra. En determinadas realizaciones, por ejemplo, los ácidos nucleicos y/o los amplicones de los mismos comprenden por lo menos una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 28-33. La muestra típicamente se deriva de un sujeto mamífero, tal como un sujeto humano. Opcionalmente, por lo menos uno de los ácidos nucleicos cebadores comprende un ácido nucleico cebador modificado. En algunas realizaciones, por ejemplo, el ácido nucleico cebador modificado comprende una modificación alteradora de la especificidad de amplificación de los ácidos nucleicos y/o una modificación del conector de sitio de restricción. En determinadas realizaciones, (a) comprende poner en contacto los ácidos nucleicos de la muestra con por lo menos una segunda pareja de ácidos nucleicos cebadores que son por lo menos parcialmente complementarios a un ácido nucleico de Chlamydia trachomatis, y (b) comprende detectar uno o más amplicones adicionales de la reacción de amplificación de ácidos nucleicos durante o después de (a), detectando de esta manera Chlamydia trachomatis en la muestra.

En algunas realizaciones, por lo menos uno de los ácidos nucleicos cebadores comprende por lo menos un marcaje. El marcaje opcionalmente comprende, por ejemplo, un pigmento fluorescente, un marcaje débilmente fluorescente, un marcaje no fluorescente, un marcaje colorimétrico, un marcaje quimioluminiscente, un marcaje bioluminiscente, un anticuerpo, un antígeno, biotina, un hapteno, un grupo modificador de masa, un isótopo radioactivo, un enzima, etc. En estas realizaciones, (b) típicamente comprende detectar una señal detectable producida por el marcaje. Opcionalmente, (b) comprende (i) amplificar una señal detectable producida por el marcaje, produciendo una señal amplificada, e (ii) detectar la señal amplificada. En determinadas realizaciones, (b) comprende realizar un seguimiento de la unión entre los amplicones y uno o más reactivos de detección de ácidos nucleicos que se unen detectablemente a un ácido nucleico con una secuencia que consiste de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36, una variante sustancialmente idéntica de los mismos, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 1 ó 2 ó 36, o un complemento de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36 ó la variante. Opcionalmente, por lo menos uno de los reactivos de detección de ácidos nucleicos comprende un oligonucleótido (por ejemplo una sonda de ácidos nucleicos, etc.). En algunas de dichas realizaciones, (b) comprende detectar la hibridación entre el oligonucleótido y los amplicones. Opcionalmente, el

oligonucleótido presenta una secuencia de longitud comprendida entre aproximadamente 8 y aproximadamente 100 nucleótidos. En determinadas realizaciones, se modifica por lo menos un nucleótido del oligonucleótido (por ejemplo para alterar la estabilidad de la hibridación de los ácidos nucleicos respecto a los nucleótidos no modificados o similares). Por ejemplo, por lo menos uno de los reactivos de detección de ácidos nucleicos comprende un ácido nucleico que presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60, una variante sustancialmente idéntica de las mismas, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60, y complementos de SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60 y la variante. A título ilustrativo adicional, por lo menos uno de los reactivos de detección de ácidos nucleicos opcionalmente se une detectablemente a un segmento de ácidos nucleicos que comprende una o más posiciones nucleótidas de SEC ID nº 1 seleccionadas de entre el grupo que consiste de: 259, 260, 262, 264, 265, 266, 268, 269, 273, 275, 276, 277, 279, 297, 298, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 308, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 320, 321, 325, 326, 428, 429, 431, 432, 433, 434, 435, 440, 441 y 447. A modo de opción adicional, por lo menos uno de los reactivos de detección de ácidos nucleicos se une detectablemente a un segmento de ácidos nucleicos que comprende una o más posiciones nucleótidas de SEC ID nº 2 seleccionadas de entre el grupo que consiste de: 89, 90, 91, 92, 95, 98, 101, 105, 106, 107, 216, 217, 220, 222, 223, 225, 233, 235, 236, 238, 335, 336, 337, 338, 339, 342, 345, 346 y 351. En algunas realizaciones, por lo menos uno de los reactivos de detección de ácidos nucleicos comprende un anticuerpo específico de secuencia o similar. Opcionalmente, por lo menos uno de los reactivos de detección de ácidos nucleicos comprende por lo menos un marcaje y/o por lo menos una fracción desactivadora. Un marcaje ejemplar opcionalmente comprende un pigmento fluorescente, un marcaje débilmente fluorescente, un marcaje no fluorescente, un marcaje colorimétrico, un marcaje quimioluminiscente, un marcaje bioluminiscente, un anticuerpo, un antígeno, biotina, un hapteno, un grupo modificador de masa, un isótopo radioactivo, un enzima o similares. En dichas realizaciones, (b) típicamente comprende detectar una señal detectable producida por el marcaje. En algunas de dichas realizaciones, (b) comprende (i) amplificar una señal detectable producida por el marcaje, produciendo una señal amplificada, e (ii) detectar la señal amplificada.

También se da a conocer un método para detectar Neisseria gonorrhoeae en una muestra, en el que el método incluye: (a) poner en contacto ácidos nucleicos de la muestra con por lo menos una primera pareja de ácidos nucleicos cebadores en por lo menos una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, en el que cada uno de los ácidos nucleicos cebadores presenta entre 12 y 100 nucleótidos, y en el que uno de los ácidos nucleicos cebadores comprende una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una subsecuencia SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36 ó un complemento de la mismas. El método también incluye: (b) detectar los ácidos nucleicos y/o uno o más amplicones de los mismos de la reacción de amplificación de ácidos nucleicos durante o después de (a), detectando de esta manera Neisseria gonorrhoeae en la muestra. Típicamente, la presencia de Neisseria gonorrhoeae en la muestra es desconocida o no se ha constatado antes de (a). En algunas realizaciones, uno o más de los ácidos nucleicos cebadores presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60, una variante sustancialmente idéntica de los mismos, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60, y complementos de SEC ID nº 3 a 27 y37 a 60y la variante.

También se da a conocer un método para determinar la presencia de Neisseria gonorrhoeae en una muestra en la que el método incluye: (a) poner en contacto ácidos nucleicos y/o amplicones de los mismos de la muestra con por lo menos un oligonucleótido que presenta entre 12 y 100 nucleótidos, comprendiendo el oligonucleótido una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una subsecuencia de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36 ó un complemento de la mismas. Además, el método también incluye (b) realizar un seguimiento de la unión entre los ácidos nucleicos y/o amplicones de los mismos, y el oligonucleótido, en el que la unión detectable entre los ácidos nucleicos y/o amplicones de los mismos, y el oligonucleótido, determina la presencia de Neisseria gonorrhoeae en la muestra. Típicamente, la presencia de Neisseria gonorrhoeae en la muestra es desconocida o no se ha constatado antes de (a). En determinadas realizaciones, uno o más de los ácidos nucleicos cebadores presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60, una variante sustancialmente idéntica de los mismos, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 3 a 27 y37 a 60, y complementos de SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60 yla variante.

También se da a conocer una composición que comprende una muestra derivada de un sujeto y uno o más reactivos de detección de ácidos nucleicos que se unen selectivamente a un ácido nucleico con una secuencia que consiste de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36, una variante sustancialmente idéntica de los mismos, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 1 ó 2 ó 36, o un complemento de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36 ó la variante. La presencia de Neisseria gonorrhoeae en la muestra es generalmente desconocida o no ha sido constatada. Típicamente, los reactivos de detección de ácidos nucleicos comprenden por lo menos un ácido nucleico sintetizado químicamente. En determinadas realizaciones, por lo menos uno de los reactivos de detección de ácidos nucleicos comprende un oligonucleótido (por ejemplo una sonda de ácidos nucleicos, un ácido nucleico cebador, o similar). Típicamente, el oligonucleótido comprende una identidad de secuencia de por lo menos 85% (por ejemplo de aproximadamente 90%, de aproximadamente 95%, etc.) respecto a una subsecuencia de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36 ó un complemento de la mismas. En algunas de dichas realizaciones, el oligonucleótido presenta una secuencia de longitud comprendida entre aproximadamente 8 y aproximadamente 100 nucleótidos (por ejemplo de longitud

comprendida entre aproximadamente 12 y aproximadamente 50 nucleótidos). En determinadas realizaciones, se modifica por lo menos un nucleótido del oligonucleótido (por ejemplo para alterar la estabilidad de la hibridación de los ácidos nucleicos respecto a los nucleótidos no modificados). Por ejemplo, los reactivos de detección de ácidos nucleicos comprenden por lo menos un ácido nucleico que presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60, una variante sustancialmente idéntica de las mismas, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60, y complementos de SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60 y la variante. A título ilustrativo adicional, por lo menos uno de los reactivos de detección de ácidos nucleicos opcionalmente se une detectablemente a un segmento de ácidos nucleicos que comprende una o más posiciones nucleótidas de SEC ID nº 1 seleccionadas de entre el grupo que consiste de: 259, 260, 262, 264, 265, 266, 268, 269, 273, 275, 276, 277, 279, 297, 298, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 308, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 320, 321, 325, 326, 428, 429, 431, 432, 433, 434, 435, 440, 441 y 447. A modo de opción adicional, por lo menos uno de los reactivos de detección de ácidos nucleicos se une detectablemente a un segmento de ácidos nucleicos que comprende una o más posiciones nucleótidas de SEC ID nº 2 seleccionadas de entre el grupo que consiste de: 89, 90, 91, 92, 95, 98, 101, 105, 106, 107, 216, 217, 220, 222, 223, 225, 233, 235, 236, 238, 335, 336, 337, 338, 339, 342, 345, 346 y 351. En algunas realizaciones, los reactivos de detección de ácidos nucleicos comprenden por lo menos un anticuerpo específico de secuencia. En determinadas realizaciones, la composición incluye además por lo menos un reactivo adicional de detección de ácidos nucleicos que se une detectablemente a un ácido nucleico de Chlamydia trachomatis.

Típicamente, por lo menos uno de los reactivos de detección de ácidos nucleicos comprende por lo menos un marcaje y/o por lo menos una fracción desactivadora. A título ilustrativo, el marcaje opcionalmente comprende un pigmento fluorescente, un marcaje débilmente fluorescente, un marcaje no fluorescente, un marcaje colorimétrico, un marcaje quimioluminiscente, un marcaje bioluminiscente, un anticuerpo, un antígeno, biotina, un hapteno, un grupo modificador de masa, un isótopo radioactivo, un enzima o similares.

Los reactivos de detección de ácidos nucleicos de las composiciones de la invención se proporcionan en diversos formatos. En algunas realizaciones, por ejemplo, por lo menos uno de los reactivos de detección de ácidos nucleicos se encuentra en solución. En otras realizaciones, un soporte sólido comprende por lo menos uno de los reactivos de detección de ácidos nucleicos. En dichas realizaciones, los reactivos de detección de ácidos nucleicos se encuentran no covalentemente o covalentemente unidos al soporte sólido. Los soportes sólidos ejemplares utilizados en dichas realizaciones se seleccionan opcionalmente de entre, por ejemplo, una placa, una placa de micropocillos, una perla, una microperla (por ejemplo una microperla magnética, etc.), un tubo (por ejemplo un microtubo, etc.), una fibra, una cerda, un peine, un chip de hibridación, una membrana, un cristal individual, una capa cerámica, una monocapa autoensamblante, y similares.

A título ilustrativo adicional, los reactivos de detección de ácidos nucleicos opcionalmente se conjugan con biotina o con un derivado de biotina y el soporte sólido opcionalmente se conjuga con avidina o con un derivado de avidina, o con estreptavidina o con un derivado de estreptavidina. En algunas realizaciones, un conector une los reactivos de detección de ácidos nucleicos al soporte sólido. El conector típicamente se selecciona de entre, por ejemplo, un oligopéptido, un oligonucleótido, una oligopoliamida, un oligoetilenglicerol, una oligoacrilamida, una cadena alquilo, y similares. Opcionalmente, una unión escindible une los reactivos de detección de ácidos nucleicos al soporte sólido. La unión escindible generalmente puede cortarse mediante, por ejemplo, calor, un enzima, un agente químico, radiación electromagnética, etc.

También se da a conocer una mezcla de reacción que incluye un conjunto de amplicones que presentan secuencias que corresponden a subsecueencias de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36, una variante sustancialmente idéntica de los mismos, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 1 ó 2 ó 36, o un complemento de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36 ó la variante, no presentando los amplicones ningún nucleótido terminador. Típicamente, por lo menos un subconjunto del conjunto de amplicones se produce utilizando por lo menos un ácido nucleico cebador que presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60, una variante sustancialmente idéntica de las mismas, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60, y complementos de SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60 y la variante. En determinadas realizaciones, el ácido nucleico cebador comprende un ácido nucleico cebador modificado. Por ejemplo, el ácido nucleico cebador modificado opcionalmente comprende una modificación alteradora de la especificidad de la amplificación de ácidos nucleicos, una modificación de conector de sitio de restricción, y/o similares. En algunas realizaciones, la mezcla de reacción incluye además un conjunto adicional de amplicones que comprende secuencias que corresponden a una secuencia de ácidos nucleicos de Chlamydia trachomatis.

También se da a conocer un kit que incluye: (a) por lo menos un oligonucleótido que presenta entre 12 y 100 ó unos pocos nucleótidos, comprendiendo el oligonucleótido una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una subsecuencia de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36 ó un complemento del mismo, y uno o más de entre: (b) instrucciones para determinar la presencia de Neisseria gonorrhoeae en una muestra mediante seguimiento de la unión entre los ácidos nucleicos y/o amplicones de los mismos procedentes de la muestra y el oligonucleótido, en el que la presencia de Neisseria gonorrhoeae en la muestra es desconocida o no se ha constatado, o (c) por lo menos un recipiente que contenga

por lo menos el oligonucleótido. En algunas de dichas realizaciones, el oligonucleótido presenta una secuencia de longitud comprendida entre aproximadamente 8 y aproximadamente 100 nucleótidos. En determinadas realizaciones, por ejemplo, el oligonucleótido presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60, una variante sustancialmente idéntica de las mismas, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60, y complementos de SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60 y la variante. A título ilustrativo adicional, el oligonucleótido opcionalmente se une detectablemente a un segmento de ácidos nucleicos que comprende una o más posiciones nucleótidas de SEC ID nº 1 seleccionada de entre el grupo que consiste de 259, 260, 262, 264, 265, 266, 268, 269, 273, 275, 276, 277, 279, 297, 298, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 308, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 320, 321, 325, 326, 428, 429, 431, 432, 433, 434, 435, 440, 441 y 447. A modo de opción adicional, el oligonucleótido se une detectablemente a un segmento de ácidos nucleicos que comprende una o más posiciones nucleótidas de SEC ID nº 2 seleccionadas de entre el grupo que consiste de: 89, 90, 91, 92, 95, 98, 101, 105, 106, 107, 216, 217, 220, 222, 223, 225, 233, 235, 236, 238, 335, 336, 337, 338, 339, 342, 345, 346 y 351. En otras realizaciones, el reactivo de detección de ácidos nucleicos es un anticuerpo específico de secuencia. En determinadas realizaciones, el kit puede incluir además uno o más reactivos de detección de ácidos nucleicos que se unen detectablemente a un ácido nucleico de Chlamydia trachomatis. En dichas realizaciones, el kit típicamente incluye además instrucciones para detectar Chlamydia trachomatis en la muestra mediante seguimiento de la unión entre ácidos nucleicos y/o amplicones de los mismos de la muestra y los reactivos adicionales de detección de ácidos nucleicos y/o uno o más recipientes para contener los reactivos adicionales de detección de ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, el kit típicamente incluye además por lo menos un enzima (por ejemplo una polimerasa, etc.) y/o uno o más nucleótidos.

En algunas realizaciones, el reactivo de detección de ácidos nucleicos se encuentra en solución, mientras que en otras, un soporte sólido comprende el reactivo de detección de ácidos nucleicos. El soporte sólido se selecciona opcionalmente de entre, por ejemplo, una placa, una placa de micropocillos, una perla, una microperla, un tubo, una fibra, una cerda, un peine, un chip de hibridación, una membrana, un cristal individual, una capa cerámica, una monocapa autoensamblante o similar.

Típicamente, el oligonucleótido comprende por lo menos un marcaje y/o por lo menos una fracción desactivadora. Entre los marcajes ejemplares se incluyen, por ejemplo, un pigmento fluorescente, un marcaje débilmente fluorescente, un marcaje no fluorescente, un marcaje colorimétrico, un marcaje quimioluminiscente, un marcaje bioluminiscente, un anticuerpo, un antígeno, biotina, un hapteno, un grupo modificador de masa, un isótopo radioactivo, un enzima o similares.

También se da a conocer un sistema (por ejemplo un sistema automático) para detectar Neisseria gonorrhoeae en una muestra. El sistema incluye: (a) por lo menos un oligonucleótido que presenta entre 12 y 100 ó unos pocos nucleótidos, comprendiendo el oligonucleótido una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una subsecuencia de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36 ó un complemento de la mismas. El sistema también incluye: (b) por lo menos un detector que detecta la unión entre ácidos nucleicos y/o amplicones de los mismos de la muestra y el oligonucleótido, y (c) por lo menos un controlador operablemente conectado al detector, comprendiendo el controlador una o más conjuntos de instrucciones que correlacionan la unión detectada por el detector con la presencia de Neisseria gonorrhoeae en la muestra. El oligonucleótido típicamente presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60 ó complementos de las mismas. A título ilustrativo adicional, el oligonucleótido opcionalmente se une detectablemente a un segmento de ácidos nucleicos que comprende una o más posiciones nucleótidas de SEC ID nº 1 seleccionada de entre el grupo que consiste de 259, 260, 262, 264, 265, 266, 268, 269, 273, 275, 276, 277, 279, 297, 298, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 308, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 320, 321, 325, 326, 428, 429, 431, 432, 433, 434, 435, 440, 441 y 447. A modo de opción adicional, el oligonucleótido se une detectablemente a un segmento de ácidos nucleicos que comprende una o más posiciones nucleótidas de SEC ID nº 2 seleccionadas de entre el grupo que consiste de: 89, 90, 91, 92, 95, 98, 101, 105, 106, 107, 216, 217, 220, 222, 223, 225, 233, 235, 236, 238, 335, 336, 337, 338, 339, 342, 345, 346 y 351. Además, el oligonucleótido típicamente comprende por lo menos un marcaje y/o por lo menos una fracción desactivadora. En determinadas realizaciones, el sistema incluye además uno o más reactivos adicionales de detección de ácidos nucleicos que se unen específicamente a un ácido nucleico de Chlamydia trachomatis en el que el detector detecta la unión entre los ácidos nucleicos y/o amplicones de los mismos procedentes de la muestra y los reactivos adicionales de detección de ácidos nucleicos, y en el que el controlador comprende por lo menos un conjunto de instrucciones que correlaciona la unión detectada por el detector con la presencia de Chlamydia trachomatis en la muestra. En algunas realizaciones, por lo menos un recipiente o soporte sólido comprende el oligonucleótido. En estas realizaciones, el sistema opcionalmente incluye además: (d) por lo menos un modulador térmico operablemente conectado al recipiente o soporte sólido para modular la temperatura en el recipiente o sobre el soporte sólido, y/o (e) por lo menos un componente de transferencia de fluidos que transfiere fluidos hacia y/o desde el recipiente o soporte sólido, por ejemplo para llevar a cabo una o más técnicas de amplificación de ácidos nucleicos en el recipiente o sobre el soporte sólido, etc.

También se da a conocer un sistema que incluye: (a) un ordenador o medio legible por ordenador que comprende una tabla de datos que comprende una pluralidad de cadenas de caracteres que corresponden a una pluralidad de secuencias que corresponden a subsecuencias de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36, una variante sustancialmente idéntica de los mismos, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos

90% respecto a una de entre SEC ID nº 1 ó 2 ó 36, o un complemento de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36 ó la variante. El sistema también incluye: (b) un sintetizador automático acoplado a una salida del ordenador o medio legible por ordenador, en el que el sintetizador automático acepta las instrucciones procedentes del ordenador o medio legible por ordenador, en el que las instrucciones dirigen la síntesis de uno o más ácidos nucleicos que corresponden a una o más cadenas de caracteres en la tabla de datos. Típicamente, por lo menos uno de las cadenas de caracteres correspodne a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60 ó complementos de las mismas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0033]

La figura 1 muestra una alineación de las secuencias de una repetición directa 9 de Neisseria gonorrhoeae (NGDR9) (SEC ID nº 1) con las secuencias de los amplicones de ADN genómico de diversas cepas de N. gonorrhoeae (cepa 1117, SEC ID nº 29; cepa 1120, SEC ID nº 30; cepa 6346, SEC ID nº 31; cepa 6359, SEC ID nº 32, y cepa 6364, SEC ID nº 33). La secuencia mayoritaria (de consenso) es SEC ID nº 28. La figura 2 es un diagrama de flujo que muestra un sistema ejemplar representativo para detectar N. gonorrhoeae en una muestra. La figura 3 es un diagrama de flujo que muestra un sistema ejemplar representativo que incluye un ordenador y un medio legible por ordenador en el que pueden incorporarse diversos aspectos de la presente invención. La figura 4 muestra una alineación de ClustalW de la secuencia NGDR9 (SEC ID nº 1) con una parte (SEC ID nº 34) de la secuencia de Brucella suis 1330 cromosoma I sección 155 (número de acceso de GenBank® A3014469). Las figuras 5A y B son fotografías de geles de agarosa que muestran la detección de un segmento de 190 pares de bases de NGDR9. Las figuras 6 A y B son fotografías de geles de agarosa que muestran la detección de un segmento de 190 pares de bases de NGDR9. La figura 7 es una fotografía de un gel de agarosa que muestra la detección de un segmento de 416 pares de bases de NGDR9. La figura 8 ilustra una alineación de ClustalW de la secuencia repetición directa 33 de Neisseria gonorrhoeae (NGDR33) (SEC ID nº 2) con una parte (SEC ID nº 35) de la secuencia de Neisseria meningitidis serogrupo B cepa Mc58 sección 77 (número de acceso de GenBank® AE002435). Las figuras 9A y B son fotografías de geles de agarosa que muestran la detección de un segmento de 265 pares de bases de NGDR33. La figura 10 es una fotografía de un gel de agarosa que muestra la detección de un segmento de 265 pares de bases de NGDR33. La figura 11 muestra una alineación de secuencias de una secuencia repetición directa 9 variante (NGDR9Var) de Neisseria gonorrhoeae (SEC ID nº 36) con las secuencias de amplicones de ADN genómico de diversas cepas de

N. gonorrhoeae (cepa 1137, SEC ID nº 61, cepa 6676, SEC ID nº 62, cepa 6677, SEC ID nº 63, cepa 6864A, SEC ID nº 64, cepa 2072, SEC ID nº 65, cepa 3533, SEC ID nº 66, y cepa 6864B, SEC ID nº 67) y la secuencia NGDR9 (SEC ID nº 1). Las figuras 12A y 12B son fotografías de geles de agarosa que muestran la detección de un segmento de 215 pares de bases de NGDR9Var. Las figuras 13A y 13B son fotografías de geles de agarosa que muestran la detección simultánea de un segmento de 473 pares de bases de NGDR9 y un segmento de 394 pares de bases de NGDR9Var.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

I. DEFINICIONES

Antes de describir la presente invención en detalle, debe interpretarse que la presente invención no se encuentra limitada a sondas oligonucleótidas particulares, métodos, composiciones, mezclas de reacción, kits, sistemas, ordenadores o medios legibles por ordenador, que evidentemente pueden variar. También debe interpretarse que la terminología utilizada en la presente memoria sirva para describir realizaciones particulares únicamente, y no pretende ser limitativa. Además, a menos que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria presentan los mismos significados entendidos por el experto ordinario en la materia a la que se refiere la presente invención. Durante la descripción y reivindicación de la presente invención, se utilizan las variantes terminológicas y gramaticales siguientes de acuerdo con las definiciones indicadas posteriormente.

Una "sonda 5'-nucleasa" se refiere a una sonda oligonucleótida que comprende por lo menos dos marcajes y emite radiación de intensidad creciente tras escindirse o separarse de otro modo de la sonda uno de los dos marcajes. En determinadas realizaciones, por ejemplo, se marca una sonda 5'-nucleasa con dos pigmentos fluorescentes diferentes, por ejemplo un pigmento informador 5'-terminal y la fracción o pigmento desactivador 3'-terminal. En el caso de que la sonda se encuentre intacta, la transferencia energética típicamente se produce entre los dos fluoróforos, de manera que la emisión fluorescente del pigmento informador se encuentra desactivada. Durante una

etapa de extensión de una reacción en cadena de la polimerasa, por ejemplo, una sonda 5'-nucleasa unida a un ácido nucleico molde resulta escindida por la actividad de 5'-nucleasa de, por ejemplo, una polimerasa Taq, de manera que la emisión fluorescente del pigmento informador ya no se encuentra desactivada. Se describen sondas 5'-nucleasa ejemplares en, por ejemplo, las patentes US nº 5.210.015, nº 5.994.056 y nº 6.171.785.

El término "alteración" se refiere a un cambio en una secuencia de ácidos nucleicos, incluyendo, aunque sin limitación, una sustitución, una inserción y/o una deleción.

Una "reacción de amplificación" se refiere a una replicación iniciada por cebador de una o más secuencias diana de ácidos nucleicos o complementos de las mismas.

Un "amplicón" se refiere a una molécula construida mediante copia o transcripción de otra molécula, por ejemplo tal como se produce durante la transcripción, clonación y/o en una reacción en cadena de polimerasa ("PCR") (por ejemplo amplificación por PCR mediante desplazamiento de cadena (SDA), amplificación por PCR dúplex, etc.) u otra técnica de amplificación de ácidos nucleicos. Típicamente, un amplicón es una copia de un ácido nucleico seleccionado (por ejemplo un ácido nucleico molde o diana) o es complementario al mismo.

Una "señal amplificada" se refiere a una señal detectable incrementada que puede producirse en ausencia o conjuntamente con una reacción de amplificación. Se describen las técnicas ejemplares de amplificación de señales en, por ejemplo, Cao et al. "Clinical evaluation of branched DNA signal amplification for quantifying HIV type I in human plasma", AIDS Res. Hum. Retroviruses 11(3):353-361, 1995, y en las patentes US nº 5.437.977, nº 6.033.853 y nº 6.180.777.

Un "anticuerpo" se refiere a un polipéptido codificado sustancialmente por como mínimo un gen de inmunoglobulina

o fragmentos de por lo menos un gen de inmunoglobulina que pueden participar en la unión detectable con un ligando. El término incluye formas naturales, así como fragmentos y derivados. Los fragmentos comprendidos dentro del alcance del término tal como se utiliza en la presente memoria incluyen aquellos producidos mediante digestión con diversas peptidasas, tales como fragmentos Fab, Fab' y F(ab)'2, aquellos producidos mediante disociación química, mediante corte químico, con la condición de que el fragmento siga presentando la capacidad de unirse detectablemente a una molécula diana, tal como un antígeno indicativo de una enfermedad.

Una "matriz" se refiere a un conjunto de elementos. El conjunto puede encontrarse espacialmente ordenado (una "matriz con patrón") o desordenado (una matriz "de patrón aleatorio"). La matriz puede estar formada o comprender uno o más elementos funcionales (por ejemplo una región sonda en una micromatriz) o puede ser no funcional.

El término "unido" o "conjugado" se refiere a interacciones y/o estados en los que el material o compuestos se encuentran contectados o unidos de otro modo entre sí. Estas interacciones y/o estados se producen típicamente mediante, por ejemplo, unión covalente, unión iónica, quimiosorción, fisiosorción y combinaciones de los mismos. En determinadas realizaciones, por ejemplo, se unen sondas oligonucleótidas a soportes sólidos. En algunas de dichas realizaciones, se conjuga una sonda oligonucleótida con biotina (es decir, se encuentra biotinilada) y se conjuga un soporte sólido con avidina de manera que la sonda se une al soporte sólido mediante la interacción de unión de, por ejemplo, biotina y avidina.

Las especies moleculares "se unen" en el caso de que se asocien entre sí mediante interacciones covalentes y/o no covalentes. Por ejemplo, dos ácidos nucleicos monocatenarios complementarios pueden hibridarse entre sí formando un ácido nucleico con por lo menos una región de doble cadena. A título ilustrativo adicional, los anticuerpos y antígenos correspondientes también se asocian no covalentemente entre sí.

El término "escisión" se refiere a un procedimiento de liberación de un material o compuesto respecto de una unión a otro material o compuesto. En determinadas realizaciones, por ejemplo, los oligonucleótidos se escinden de, por ejemplo, un soporte sólido para permitir el análisis de los oligonucleótidos mediante métodos en fase solución. Ver, por ejemplo, Wells e al. "Cleavage and Analysis of Material from Single Resin Beads", J. Org. Chem. 63:6430, 1998.

Un "carácter" utilizado en referencia a un carácter de una cadena de caracteres se refiere a una subunidad de la cadena. En una realización, el carácter de una cadena de caracteres codifica una subunidad de uan molécula biológica codificada. De esta manera, por ejemplo, en el caso de que la molécula biológica codificada sea un polinucleótido u oligonucleótido, un carácter de la cadena codifica un único nucleótido.

Una "cadena de caracteres" es cualquier entidada capaz de almacenar información de secuencia (por ejemplo la estructura de subunidades de una molécula biológica, tal como la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico, etc.). En una realización, la cadena de caracteres puede ser una simple secuencia de caracteres (letras, números u otros símbolos) o puede ser una representación numérica o codificada de dicha información en forma tangible o intangible (por ejemplo electrónica, magnética, etc.). La cadena de caracteres no es necesariamente "lineal", sino que también puede existir en varias otras forams, por ejemplo una lista conectada u otra matriz no lineal (por ejemplo utilizada como código para generar una matriz lineal de caracteres) o similar. Las cadenas de caracteres típicamente son aquéllas que codifican cadenas de oligonucleótidos o polinucleótidos, directa o indirectamente, incluyendo

cualquier cadena encriptada, o imágenes, o disposiciones de objetos que pueden transformarse inequívocamente en cadenas de caracteres que respresentan secuencias de monómeros o multímeros en polinucleótidos, o similares (constituidos de monómeros naturales o artificiales).

La expresión "Chlamydia trachomatis", "C. trachomatis" o "CT" se refiere a la especie bacteriana trachomatis del género Chlamydia. Ver, por ejemplo, Stephens et al. "Genome sequence of an obligate intracellular pathogen of humans: Chlamydia trachomatis", Science 282:754-759, 1988; Kalman et al. "Comparative genomes of Chlamydia pneumoniae and C. trachomatis," Nature Genetics 21:385-389, 1999, y Stephens, Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity, ASM Press (1999). Un número de acceso de GenBank® ejemplar para la secuencia completa del genoma de Chlamydia trachomatis es NC_000117. Ver también la base de datos de Chlamydia trachomatis, que se encuentra en internet en stdgen.lanl.gov desde 12 de marzo de 2004.

La expresión "ácido nucleico de Chlamydia trachomatis" o "ácido nucleico de C. trachomatis" se refiere a un ácido nucleico (y/o un amplicón del mismo) que se deriva o se aísla a partir de Chlamydia trachomatis.

La expresión "complemento del mismo" se refiere a un ácido nucleico que es tanto de la misma longitud como exactamente complementario a un ácido nucleico dado.

Una "composición" se refiere a una combinación de dos o más componentes diferentes. En determinadas realizaciones, por ejemplo, una composición incluye un soporte sólido que comprende una o más sondas oligonucleótidas, por ejemplo unidas covalente o no covalentemente a una superficie del soporte. En otras realizaciones, una composición incluye una o más sondas oligonucleótidas en solución.

El término "deleción" en el contexto de una secuencia de ácidos nucleicos se refiere a una alteración en la que se elimina por lo menos un nucleótido de la secuencia de ácidos nucleicos, por ejemplo de un extremo 5'-terminal, de un extremo 3'-terminal y/o de una posición interna de la secuencia de ácidos nucleicos.

El término "derivado" se refiere a una sustancia química estructuralmente relacionada con otra sustancia, o una sustancia química que puede prepararse a partir de otra sustancia (es decir, la sustancia a partir de la que se deriva), por ejemplo mediante modificación química o enzimática. A título ilustrativo, las sondas oligonucleótidas opcionalmente se conjugan con biotina o con un derivado de biotina. A título ilustrativo adicional, un ácido nucleico puede "derivarse" de otro mediante procedimientos tales como la síntesis química, basándose en información sobre la secuencia del otro ácido nucleico, la amplificación del otro ácido nucleico, o similares.

La expresión "se une detectablemente" se refiere a la unión entre por lo menos dos especies moleculares (por ejemplo una sonda de ácidos nucleicos y un ácido nucleico diana, un anticuerpo específico de secuencia y un ácido nucleico diana, etc.) que es detectable sobre una señal de fondo (por ejemplo ruido) utilizando uno o más métodos de detección. Los ácidos nucleicos se "extienden" o "alargan" al incorporarse nucleótidos adicionales (u otras moléculas análogas) en los ácidos nucleicos. Por ejemplo, un ácido nucleico opcionalmente se extiende con un biocatalizador que incorpora nucleótidos, tal como una polimerasa que típicamente añade nucleótidos en el extremo 3'-terminal de un ácido nucleico.

Un "ácido nucleico cebador extendido" se refiere a un ácido nucleico cebador al que se han añadido, o de otra manera incorporado (por ejemplo unido covalentemente), uno o más nucleótidos adicionales.

Los ácidos nucleicos "se hibridan" o "se unen" en el caso de que se asocien entre sí, típicamente en solución. Los ácidos nucleicos se hibridan debido a una diversidad de fuerzas físicoquímicas bien caracterizadas, tales como los enlaces de hidrógeno, la exclusión de solvente, el apilamiento de bases, y similares. Puede encontrarse una guía extensa de la hibridación de los ácidos nucleicos en Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes, parte 1, capítulo 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" (Elsevier, New York), 1993, así como en Ausubel (editor), Current Protocols in Molecular Biology, volúmenes I, II y III, 1997. Hames y Higgins, Gene Probes 1, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, Inglaterra, 1995 (Hames y Higgins 1), y Hames y Higgins, Gene Probes 2, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, Inglaterra, 1995 (Hames y Higgins 2) proporcionan información sobre la síntesis, marcaje, detección y cuantificación del ADN y ARN, incluyendo los oligonucleótidos.

La expresión "condiciones de lavado de hibridación restrictiva" en el contexto de los ensayos o experimentos de hibridación de ácidos nucleicos, tales como las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos, las hibridaciones southern y northern, o similares, son dependientes de la secuencia, y son diferentes bjao diferentes condiciones ambientales. Puede encontrarse una guía extensa de la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen, supra, 1993, y en Hames y Higgins 1 y 2.

Para los fines de la presente invención, generalmente, se seleccionan las condiciones de hibridación y lavado "altamente restrictivas" como por lo menos una temperatura aproximadamente 5ºC inferior a la temperatura de fusión (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos La Tm es la temperatura (bajo la fuerza iónica y pH definidos) a la que se hibrida el 50% de la secuencia de ensayo

con una sonda perfectamente correspondiente. Se seleccionan las condiciones muy restrictivas como iguales a la Tm para una sonda particular.

Un ejemplo de condiciones de hibridación restrictivas para la hibridación de los ácidos nucleicos complementarios sobre un filtro en una transferencia southern o northern es formalina al 50% con 1 mg de heparina a 42ºC, llevando a cabo la hibridación durante la noche. Un ejemplo de condiciones de lavado restrictivas es un lavado 0,2x SSC a 65ºC durante 15 minutos (ver Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), proporciona una descripción del tampón SSC. Con frecuencia antes del lavado de alta astringencia se lleva a cabo un lavado de baja astringencia para eliminar la señal de fondo de la sonda. Un ejemplo de lavado de baja astringencia es 2x SSC a 40ºC durante 15 minutos. En general, una proporción de señal a ruido 5x (o superior) a la observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridación particular indica la detección de una hibridación específica.

Puede utilizarse la hibridación comparativa para identificar ácidos nucleicos de la invención.

En particular, la detección de la hibridación restrictiva en el contexto de la presente invención indica una fuerte similitud estructural con, por ejemplo, los ácidos nucleicos proporcionados en el listado de secuencias en la presente memoria. Por ejemplo, resulta deseable identificar ácidos nucleicos de ensayo que se hibriden con los ácidos nucleicos ejemplares de la presente invención bajo condiciones restrictivas. Una medida de la hibridación restrictiva es la capacidad de hibridarse detectablemente con uno de los ácidos nucleicos listados (por ejempo ácidos nucleicos con secuencias seleccionadas de entre SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60 y complementos de las mismas) bajo condiciones restrictivas. Las condiciones de hibridación y lavado restrictivas pueden ser fácilmente determinadas empíricamente para cualquier ácido nucleico de ensayo.

Por ejemplo, para determinar las condiciones de hibridación y lavado altamente restrictivas, se incrementa gradualmente la astringencia de las condiciones de hibridación y lavado (por ejemplo incrementando la temperatura, reduciendo la concentración salina, incrementando la concentración de detergente y/o incrementando la concentración de solventes orgánicos, tales como formalina, en la hibridación o lavado), hasta cumplir un conjunto seleccionado de criterios. Por ejemplo, la astringencia de las condiciones de hibridación y lavado se incrementa gradualmente hasta que una sonda que consiste o que comprende una o más secuencias de ácidos nucleicos seleccionadas de entre SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60 y secuencias polinucleótidas complementarias a las mismas, se une a una diana complementaria perfectamente correspondiente (nuevamente, un ácido nucleico que comprende una o más secuencias de ácidos nucleicos seleccionadas de entre SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60 y secuencias polinucleótidas complementarias a las mismas), con una proporción de señal a ruido que es por lo menos 5x superior a la observada para la hibridación de la sonda con un ácido nucleico no diana. En este caso, los ácidos nucleicos no diana son aquellos procedentes de organismos diferentes de N. gonorrhoeae y, en determinadas realizaciones, C. trachomatis. Entre los ejemplos de dichos ácidos nucleicos no diana se incluyen, por ejemplo, aquellos con números de acceso de GenBank®, tales como AE01469 (Brucella suis 1330, cromosoma I, sección 155) y AE002435 (Neisseria meningitidis serogrupo B, cepa MC58, sección 77). El experto en la materia podrá identificar secuencias adicionales de este tipo en, por ejemplo, GenBank®.

Se afirma que un ácido nucleico diana se hibrida específicamente con un ácido nucleico sonda en el caso de que se hibride por lo menos la mitad de bien con la sonda que con la diana complementaria perfectamente correspondiente, es decir, con una proporción de señal a ruido por lo menos la mitad de elevada que en la hibridación de la sonda con la diana bajo condiciones en las que la sonda perfectamente correspondiente se une a la diana complementaria perfectamente correspondiente con una proporción de señal a ruido que es por lo menos aproximadamente 5x a 10x más elevada que la observada en la hibridación con los ácidos nucleicos no diana AE01469 (Brucella suis 1330, cromosoma I, sección 155) ó AE002435 (Neisseria meningitidis serogrupo B, cepa MC58, sección 77).

Las condiciones de hibridación y lavado de astringencia ultraelevada son aquéllas en las que se incrementa la astringencia de las condiciones de hibridación y lavado hasta que la proporción de señal a ruido para la unión de la sonda al ácido nucleico diana complementario perfectamente correspondiente es por lo menos 10x superior a la observada en la hibridación con los ácidos nucleicos no diana AE01469 (Brucella suis 1330, cromosoma I, sección 155) ó AE002435 (Neisseria meningitidis, serogrupo B, cepa MC58, sección 77). Un ácido nucleico diana que se hibrida con una sonda bajo dichas condiciones con una proporción de señal a ruido que es por lo menos la mitad de la del ácido nucleico diana complementario perfectamente correspondiente se dice que se une a la sonda bajo condiciones de astringencia ultraelevada.

De manera similar, pueden determinarse niveles todavía mayores de astringencia mediante el incremento gradual de la astringencia de las condiciones de hibridación y/o lavado del ensayo de hibridación relevante. Por ejemplo, pueden identificarse aquellos en los que se incrementa la astringencia de las condiciones de hibridación y lavado hasta que la proporción de señal a ruido para la unión de la sonda al ácido nucleico diana complementario perfectamente complementario es por lo menos 10x, 20x, 50x, 100x ó 500x, o más, superior a la observada para la hibridación con los ácidos nucleicos no diana AE01469 (Brucella suis 1330, cromosoma I, sección 155) ó AE002435 (Neisseria meningitidis, serogrupo B, cepa MC58, sección 77). Un ácido nucleico diana que se hibrida con una sonda bajo dichas condiciones, con una proporción de señal a ruido que es por lo menos la mitad de la del ácido

nucleico diana complementario perfectamente correspondiente se dice que se une a la sonda bajo condiciones de astringencia ultra-ultraelevada.

La detección de los ácidos nucleicos diana que se hibridan con los ácidos nucleicos representados por los SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60 bajo condiciones de astringencia elevada, ultraelevada y ultra-ultraelevada es una característica de la invención. Entre los ejemplos de dichos ácidos nucleicos se incluyen aquellos con una o unas cuantas sustituciones conservadoras o silenciosas de ácidos nucleicos en comparación con una secuencia dada de ácidos nucleicos.

Los términos "idéntico" o "porcentaje de identidad" en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o polipeptídicas se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o que presentan un porcentaje especificado de residuos aminoácidos o nucleótidos que son iguales tras compararlas y alinearlas para la máxima correspondencia, por ejemplo según las mediciones efectuadas con uno de los algoritmos de comparación de secuencias disponibles para el experto en la materia o mediante inspección visual. Los algoritmos ejemplares que resultan adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y de similitud de secuencias son los programas BLAST, que se describen en, por ejemplo, Altschul et al. "Basic local alignment search tool", J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990; Gish et al. "Identification of protein coding regions by database similarity search", Nature Genet. 3:266-272, 1993; Madden et al., "Applications of network BLAST server", Meth. Enzymol. 266:131-141, 1996; Altschul et al. "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs" Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; y Zhang et al. "PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation", Genome Res. 7:649-656, 1997. Muchos otros algoritmos de alineación óptima también son conocidos de la técnica y se utilizan opcionalmente para determinar el porcentaje de identidad de secuencia.

La expresión "en solución" se refiere a un ensayo o condición de reacción en la que los componentes del ensayo o reacción no se encuentran unidos a un soporte sólido y se encuentran presentes en un medio líquido. Entre los medios líquidos ejemplares se incluyen los líquidos acuosos y orgánicos. Por ejemplo, determinados ensayos de la invención comprenden la incubación de las sondas oligonucleótidas conjuntamente con ácidos nucleicos de N. gonorrhoeae y amplicones de ácidos nucleicos de N. gonorrhoeae en solución para permitir que se produzca la hibridación.

El término "inserción" en el contexto de una secuencia de ácidos nucleicos se refiere a una alteración en la que se añade por lo menos un nucleótido a la secuencia de ácidos nucleicos, por ejemplo en un extremo 5'-terminal, en un extremo 3'-terminal y/o de una posición interna de la secuencia de ácidos nucleicos.

Un "marcaje" se refiere a una fracción unida (covalente o no covalentemente), o capaz de unirse, a una molécula, proporcionando, o siendo capaz de proporcionar, dicha fracción, información sobre la molécula (por ejemplo información descriptiva, identificativa, etc. de la molécula) o sobre otra molécula con la que interactúa la molécula marcada (por ejemplo mediante hibridación, etc.). Entre los marcajes ejemplares se incluyen los marcajes fluorescentes (incluyendo, por ejemplo, los desactivadores o absorbedores), los marcajes débilmente fluorescentes, los marcajes no fluorescentes, los marcajes colorimétricos, los marcajes quimioluminiscentes, los marcajes bioluminiscentes, los marcajes radioactivos, los grupos modificadores de masa, los anticuerpos, los antígenos, biotina, los haptenos, los enzimas (incluyendo, por ejemplo, peroxidasa, fosfatasa, etc.) y similares.

Un "conector" se refiere a un grupo químico que une covalente o no covalentemente un compuesto o grupo sustituyente a otro grupo, por ejemplo un ácido nucleico, una sonda oligonucleótida, un ácido nucleico cebador, un amplicón, un soporte sólido o similar. Por ejemplo, los conectores se utilizan opcionalmente para unir sondas oligonucleótidas a un soporte sólido (por ejemplo en una matriz de sondas lineal o de otro tipo lógico). A título ilustrativo adicional, un conector opcionalmente une un marcaje (por ejemplo un pigmento fluorescente, un isótopo radioactivo, etc.) a una sonda oligonucleótida, ácido nucleico cebador o similar. Los conectores típicamente son grupos químicos bifuncionales y en determinadas realizaciones, comprenden uniones cortables que pueden cortarse mediante, por ejemplo, calor, un enzima, un agente químico y/o radiación electromagnética, liberando materiales o compuestos de, por ejemplo, un soporte sólido. Una elección cuidadosa del conector permite realizar el corte bajo condiciones apropiadas compatibles con la estabilidad del compuesto y el método de ensayo. Generalmente, un conector no presenta ninguna actividad biológica específica aparte de, por ejemplo, la unión de especies químicas o la conservación de cierta distancia mínima u otra relación espacial entre dichas especies. Sin embargo, los constituyentes de un conector pueden seleccionarse para influir sobre alguna propiedad de la especie química unida, tal como la conformación tridimensional, la carga neta, la hidrofobicidad, etc. Entre los conectores ejemplares se incluyen, oligopéptidos, oligonucleótidos, oligopoliamidas, oligoetilengliceroles, oligoacrilamidas, cadenas alquilo

o similares. Se proporciona una descripción adicional de moléculas conectoras en, por ejemplo, Hermanson, Bioconjugate Techniques, Elsevier Science, 1996; Lyttle et al. Nucleic Acids Res. 24(14):2793, 1996; Shchepino et al. Nucleosides, Nucleotides, & Nucleic Acids 20:369, 2001; Doronina et al., Nucleosides, Nucleotides, & Nucleic Acids 20:1007, 2001; Trawick et al. Bioconjugate Chem. 12:900, 2001; Olejnik et al. Methods in Enzymology 291:135, 1998; y Pljevaljcic et al. J. Am. Chem. Soc. 125(12):3486, 2003.

Un grupo "modificador de masa" modifica la masa, típicamente medida en términos de peso molecular en daltons,

de una molécula que comprende el grupo. Por ejemplo, los grupos modificadores de masa que incrementan la discriminación de tamaño o secuencia entre por lo menos dos ácidos nucleicos con diferencias de bases individuales, pueden utilizarse para facilitar la secuenciación utilizando, por ejemplo, determinaciones del peso molecular.

Una "mezcla" se refiere a una combinación de dos o más componentes diferentes. Una "mezcla de reacción" se refiere a una mezcla que comprende moléculas que pueden participar y/o facilitar una reacción dada. La expresión "mezcla de reacción de amplificación" se refiere a una solución que contiene los reactivos necesarios para llevar a cabo una reacción de amplificación, y típicamente contiene cebadores, una ADN polimerasa termoestable, dNTPs y un catión metálico divalente en un tampón adecuado. Se indica que una mezcla de reacción es completa en el caso de que contenga todos los reactivos necesarios para llevar a cabo la reacción, e incompleta en el caso de que contiene únicamente un subconjunto de los reactivos necesarios. El experto en la materia entenderá que los componentes de reacción se almacenan rutinariamente en forma de soluciones separadas, conteniendo cada una un subconjunto de los componentes totales, por motivos de comodidad, estabilidad de almacenamiento, o para permitir el ajuste dependiente de la aplicación de las concentraciones de componentes, y que los componentes de reacción se combinan antes de la reacción para crear una mezcla de reacción completa. Además, el experto en la materia entenderá que los componentes de reacción se empaquetan separadamente para su comercialización y que los kits comerciales útiles pueden contener cualquier subconjunto de los componentes de reacción, incluyendo los cebadores modificados de la invención.

La expresión "ácido nucleico cebador modificado" se refiere a un ácido nucleico cebador que comprende una fracción o secuencia de nucleótidos que proporciona una propiedad deseada al ácido nucleico cebador. En determinadas realizaciones, por ejemplo, los ácidos nucleicos cebadores modificados comprenden "modificaciones alteradoras de la especificidad de la amplificación de ácidos nucleicos" que, por ejemplo, reducen la amplificación de los ácidos nucleicos no específicos (por ejemplo minimizando la formación de dímeros de cebadores o similares), incrementan el rendimiento de un amplicón diana deseado y/o similares. Se describen ejemplos de modificaciones alteradoras de la especificidad de la amplificación de ácidos nucleicos en, por ejemplo, la patente US nº 6.001.611. Entre otras modificaciones ejemplares de ácidos nucleicos cebadores se incluyen una "modificación de un conector de sitio de restricción" en la que se une una secuencia de nucleótidos que comprende un sitio de restricción seleccionado, por ejemplo en el extremo 5'-terminal de un ácido nucleico cebador. Los conectores de sitio de restricción típicamente se unen a ácidos nucleicos cebadores para facilitar la clonación de amplicón posterior o similar.

Una "fracción" o "grupo" se refiere a una de las partes en las que se divide algo, tal como una molécula (por ejemplo un grupo funcional, un grupo sustituyente o similar). Por ejemplo, una sonda oligonucleótida opcionalmente comprende una fracción desactivadora, una fracción marcadora o similar.

La expresión "Neisseria gonorrhoeae", "N. gonorrhoeae" o "NG" se refiere a la especie bacteriana gonorrhoeae del género Neisseria. Ver, por ejemplo, Schoolnik (editor), Pathogenic Neisseriae: Proceedings of the Fourth International Symposium, Asilomar, California, 21a 25 de octubre de 1984, Amer. Society for Microbiology, 1986. Se proporciona una descripción general adicional de N. gonorrhoeae y de C. trachomatis en, por ejemplo, Struthers y Westran, Clinical Bacteriology, ASM Press and Manson Publishing, 2003; Persing et al., Molecular Microbiology: Diagnostic Principles and Practice, ASM Press, 2003; Murray, Manual of Clinical Microbiology, 8a edición, ASM Press, 2003. Ver también la base de datos de Neisseria gonorrhoeae, proporcionada en Internet en stdgen.lanl.gov el 12 de marzo de 2004.

La expresión "ácido nucleico de Neisseria gonorrhoeae" o "ácido nucleico de N. gonorrhoeae" se refiere a un ácido nucleico (y/o un amplicón del mismo) que se deriva o se aísla a partir de Neisseria gonorrhoeae.

La expresión "ácido nucleico" se refiere a nucleótidos (por ejemplo ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, dideoxinucleótidos, etc.) y polímeros que comprenden dichos nucleótidos unidos covalentemente entre sí, lineal o ramificadamente. Entre los ácidos nucleicos ejemplares se incluyen los ácidos desoxirribonucleicos (ADNs), ácidos ribonucleicos (ARNs), híbridos de ADN-ARN, oligonucleótidos, polinucleótidos, genes, ADNc, aptámeros, ácidos nucleicos antisentido, ARNs interfirientes (ARNi), balizas moleculares, sondas de ácidos nucleicos, ácidos péptido nucleicos (APNs), ácidos nucleicos bloqueados (LNATMS), conjugados de APN-ADN, conjugados de APN-ARN, conjugados de LNATM-ADN, conjugados de LNATM-ARN, etc.

Un ácido nucleico típicamente es de una cadena o de doble cadena y generalmente contiene enlaces fosfodiéster, aunque en algunos casos, tal como se describe de manera general en la presente memoria, se incluyen análogos de ácidos nucleicos que pueden presentar esqueletos alternativos, incluyendo, a título ejemplar no limitativo, fosforamida (Beaucage et al. Tetrahedron 49(10):1925, 1993, y las referencias en la misma; Letsinger, J. Org. Chem. 35:3800, 1970; Sprinzl et al. Eur. J. Biochem. 81:579, 1977; Letsinger et al. Nucl. Acids Res. 14: 3487, 1986; Carty et al. Chem. Lett. 805, 1984; Letsinger et al. J. Am. Chem. Soc. 110:4470, 1988; Pauwels et al. Chemica Scripta 26: 1419, 1986; fosforotioato (Mag et al. Nucleic Acids Res. 19:1437, 1991, y la patente US nº 5.644.048), fosforoditioato (Briu et al. J. Am. Chem. Soc. 111:2321, 1989), enlaces O-metilfosforoamidita (Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press, 1992), y esqueletos y enlaces de

ácidos péptidonucleicos (ver Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114:1895, 1992; Meier et al. Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008, 1992; Nielsen, Nature 365:566, 1993; y Carlsson et al. Nature 380:207, 1996). 207). Entre otros análogos de ácidos nucleicos se incluyen aquellos con esqueletos con carga positiva (Denpcy et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097, 1995), esqueletos no iónicos (patentes US nº 5.386.023, nº 5.637.684, nº 5.602.240, nº 5.216.141 y nº 4.469.863; Angew, Chem. Intl. Ed. English 30: 423, 1991; Letsinger et al. J. Am. Chem. Soc. 110:4470, 1988; Letsinger et al. Nucleoside & Nucleotide 13:1597, 1994; capítulos 2 y 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", editores Y.S. Sanghvi y P. Dan Cook; Mesmaeker et al. Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4: 395, 1994; Jeffs et al. J. Biomolecular NMR 34:17, 1994; y Tetrahedron Lett. 37:743, 1996) y esqueletos no de ribosa, incluyendo los indicados en las patentes US nº 5.235.033 y 5.034.506, y los capítulos 6 y 7, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, editores Y.S. Sanghvi y P.Dan Cook. Los ácidos nucleicos que contienen uno o más azúcares carbocíclicos también se encuentran incluidos dentro de la definición de ácidos nucleicos (Jenkins et al. Chem. Soc. Rev., páginas 169 a 176, 1995). También se describen varios análogos de ácidos nucleicos en, por ejemplo, Rawls C. & E. News, 2 de junio de 1997, página 35. Pueden realizarse modificaciones del esqueleto de ribosa-fosfato para facilitar la adición de fracciones adicionales, tales como marcajes, o para alterar la estabilidad y vida media de dichas moléculas en ambientes fisiológicos.

Además de dichas bases heterocíclicas naturales que se encuentran típicamente en los ácidos nucleicos (por ejemplo adenina, guanina, timina, citosina y uracilo), los análogos de ácidos nucleicos también incluyen aquellos que presentan bases heterocíclicas o modificadas no naturales, muchas de las cuales se describen, o se hace referencia a las mismas, en la presente memoria. En particular, muchas bases no naturales también se describen adicionalmente en, por ejemplo, Seela et al. Helv. Chim. Acta 74:1790, 1991; Grein et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 4:971-976, 1994; y Seela et al. Helv. Chim. Acta 82:1640, 1999. A título ilustrativo adicional, determinadas bases utilizadas en los nucleótidos que actúan como modificadores de la temperatura de fusión (Tm) se encuentran opcionalmente incluidas. Por ejemplo, entre algunas de ellas se incluyen las 7-deazapurinas (por ejemplo 7deazaguanina, 7-deazaadenina, etc.), las pirazolo[3,4-d]pirimidinas y propinil-dN (por ejepmlo propinil-dU, propinildC, etc.) y similares. Ver, por ejemplo, la patente US nº 5.990.303. Entre otras bases heterocíclicas representativas se incluyen, por ejemplo, hipoxantina, inosina, xantina; derivados 8-aza de 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 2amino-6-cloropurina, hipoxantina, inosina y xantina; derivados 7-deaza-8-aza de adenina, guanina, 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina, inosina y xantina; 6-azacitosina; 5-fluorocitosina; 5clorocitosina; 5-yodocitosina; 5-bromocitosina; 5-metilcitosina; 5-propinilcitosina; 5-bromoviniluracilo; 5-fluorouracilo; 5-clorouracilo; 5-yodouracilo; 5-bromouracilo; 5-trifluorometiluracilo; 5-metoximetiluracilo; 5-etiniluracilo; 5propiniluracilo, y similares.

También se describen ejemplos de bases y nucleótidos modificados en, por ejemplo, las patentes US nº 5.484.908, nº 5.645.985, nº 5.830.653, nº 6.303.315 y publicación de patente US nº 2003/0092905.

La expresión "reactivo de detección de ácidos nucleicos" se refiere a un reactivo que se une detectablemente (por ejemplo enlaces de hidrógeno en la hibridación de ácidos nucleicos, en el reconocimiento anticuerpo-antígeno,

o similar, u otros tipos de interacciones de unión) a un ácido nucleico que comprende SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36, una variante sustancialmente idéntica de los mismos, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 1 ó 2 ó 36, o un complemento de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36 ó la variante. Por ejemplo, los ácidos nucleicos (por ejemplo ácidos nucleicos sonda, ácidos nucleicos cebadores, etc.) que comprenden secuencias seleccionadas de entre SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60 ó complementos de las mismas se unen específicamente a ácidos nucleicos que presentan dichas secuencias. Entre otros reactivos ejemplares de detección de ácidos nucleicos se incluyen anticuerpos específicos de secuencia que se unen específicamente a ácidos nucleicos que comprenden SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36, una variante sustancialmente idéntica de los mismos, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 1 ó 2 ó 36, o un complemento de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36 ó la variante.

Un "nucleótido" se refiere a un éster de un nucleósido, por ejemplo un éster fosfato de un nucleósido. Por ejemplo, un nucleótido puede incluir 1, 2, 3 ó más grupos fosfato unidos covalentemente en una posición 5' de una fracción sacárida del nucleósido.

Un "catalizador biológico que incorpora nucleótidos" se refiere a un catalizador que cataliza la incorporación de nucleótidos en un ácido nucleico. Los catalizadores biológicos que incorporan nucleótidos son típicamente enzimas. Un "enzima" es un catalizador basado en proteínas y/o ácidos nucleicos que actúa reduciendo la energía de activación de una reacción química en la que participan otros compuestos o "sustratos". Un "enzima que incorpora nucleótidos" se refiere a un enzima que cataliza la incorporación de nucleótidos en un ácido nucleico, por ejemplo durante la amplificación de ácidos nucleicos o similar. Entre los enzimas ejemplares que incorporan nucleótidos se incluyen, por ejemplo, polimerasas, transferasas terminales, transcriptasas inversas, telomerasas, polinucleótido fosforilasas y similares.

Un "oligonucleótido" se refiere a un ácido nucleico que incluye por lo menos dos unidades monoméricas de ácidos nucleicos (por ejemplo nucleótidos), típicamente más de tres unidades monoméricas, y más típicamente más de diez unidades monoméricas. El tamaño exacto de un oligonucleótido generalmente depende de diversos factores,

incluyendo la función última o utilización del oligonucleótido. Los oligonucleótidos opcionalmente se preparan mediante cualquier método adecuado, incluyendo, aunque sin limitación, el aislamiento de una secuencia existente o natural, la replicación o amplificación del ADN, la transcripción inversa, la clonación y digestión de restricción de secuencias apropiadas, o la síntesis química directa mediante un método tal como el método del fosfotriéster de Narang et al. Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979; el método del fosfodiéster de Brown et al. Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979; el método de la dietilfosforamidita de Beaucage et al. Tetrahedron Lett. 22:1859-1862, 1981; el método del triéster de Matteucci et al. J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191, 1981; métodos automáticos de síntesis, o el método de soporte sólido de la patente US nº 4.458.066, u otros métodos conocidos de la técnica.

La expresión "sonda oligonucleótida", "ácido nucleico sonda" o "sonda" se refiere a un oligonucleótido marcado

o no marcado capaz de hibridarse selectivamente con un ácido nucleico diana bajo condiciones adecuadas. Típicamente, una sonda es suficientemente complementaria a una secuencia diana específica (por ejemplo un ácido nucleico de N. gonorrhoeae que comprende SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36, una variante sustancialmente idéntica de los mismos, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 1 ó 2 ó 36, o un complemento de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36, o la variante), una secuencia de ácidos nucleicos de C. trachomatis, etc.) contenida en una muestra de ácidos nucleicos formando un dúplex de hibridación estable con la secuencia diana bajo condiciones de hibridación seleccionadas, tales como, aunque sin limitación, condiciones restrictivas de hibridación. Un ensayo de hibridación llevado a cabo utilizando una sonda bajo condiciones de hibridación suficientemente restrictivas permite la detección selectiva de una secuencia diana específica. La expresión "región hibridante" se refiere a aquella región de un ácido nucleico que es exacta o sustancialmente complementaria a la secuencia diana, y por lo tanto capaz de hibridarse con la misma. Para la utilización en un ensayo de hibridación para la discriminación de diferencias de nucleótidos individuales en la secuencia, la región hibridante típicamente presenta una longitud de entre aproximadamente 8 y aproximadamente 100 nucleótidos. Aunque la región hibridante generalmente se refiere al oligonucleótido entero, la sonda puede incluir secuencias de nucleótidos adicionales que funcionan, por ejemplo, como sitios de unión a conectores, proporcionando un sitio para la unión de la secuencia sonda a un soporte sólido o similar. En determinadas realizaciones, una sonda oligonucleótida de la invención comprende uno o más marcajes (por ejemplo un pigmento informador, una fracción desactivadora, etc.), tal como una sonda FRET, una baliza molecular o similar, que también puede utilizarse para detectar la hibridación entre la sonda y los ácidos nucleicos diana en una muestra. En algunas realizaciones, la región hibridante de la sonda oligonucleótida es completamente complementaria a la secuencia diana. Sin embargo, en general, la complementariedad completa no resulta necesaria; los dúplex estables pueden contener bases incorrectamente apareadas o desapareadas. Puede resultar necesaria la modificación de las condiciones restrictivas para permitir la formación de un complejo de hibridación estable con uno o más apareamientos incorrectos de pares de bases o bases desapareadas. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), proporciona guías para realizar las modificaciones adecuadas. La estabilidad del dúplex de diana/sonda depende de varias variables, entre ellas la longitud del oligonucleótido, la composición de bases y la secuencia del oligonucleótido, la temperatura y las condiciones iónicas. El experto en la materia reconocerá que, en general, el complemento exacto de una sonda dada, de manera similar, resulta útil como sonda. Las sondas ejemplares de la invención, que se unen a un ácido nucleico de N. gonorrhoeae con una secuencia que consiste de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36, una variante sustancialmente idéntica de los mismos, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 1 ó 2 ó 36, o un complemento de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36, o la variante, comprenden secuencias seleccionadas de entre SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60 y complementos de las mismas. El experto en la materia también reconocerá que, en determinadas realizaciones, también pueden utilizarse ácidos nucleicos sonda como ácidos nucleicos cebadores.

Un "ácido nucleico cebador" o "cebador" es un ácido nucleico que puede hibridarse con un ácido nucleico molde (por ejemplo un ácido nucleico de N. gonorrhoeae que comprende SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36, una variante sustancialmente idéntica de los mismos, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 1 ó 2 ó 36, o un complemento de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36, o la variante, un ácido nucleico de C. trachomatis, etc.) y permite la extensión o alargamiento de cadena utilizando, por ejemplo, un catalizador biológico incorporador de nucleótidos, tal como una polimerasa bajo condiciones de reacción apropiadas. Un ácido nucleico cebador típicamente es un oligonucleótido natural o sintético (por ejemplo un oligodesoxirribonucleótido de una sola cadena, etc.). Aunque opcionalmente se utilizan otras longitudes de ácido nucleico cebador, típicamente comprende regiones hibridantes de longitud comprendida entre aproximadamente 8 y aproximadamente 100 nucleótidos. Los ácidos nucleicos cebadores cortos generalmente requieren temperaturas más bajas para formar complejos híbridos suficientemente estables con ácidos nucleicos molde de N. gonorrhoeae o de C. trachomatis. Un ácido nucleico cebador que es complementario por lo menos parcialmente respecto a una subsecuencia de un ácido nucleico molde de N. gonorrhoeae o de C. trachomatis típicamente resulta suficiente para la hibridación con el molde para que se produzca la extensión. Puede marcarse un ácido nucleico cebador, si se desea, mediante la incorporación de un marcaje detectable mediante, por ejemplo, técnicas espectroscópicas, fotoquímicas, bioquímicas, inmunoquímicas, químicas u otras. A título ilustrativo, entre los marcajes útiles se incluyen isótopos radioactivos, pigmentos fluorescentes, reactivos electrodensos, enzimas (utilizados comúnmente en la realización de los ELISAs), biotina o haptenos y proteínas para las que encuentran disponibles antisueros o anticuerpos monoclonales. Muchos de dichos marcajes, y otros marcajes, se describen adicionalmente en la presente memoria y/o son conocidos de otro modo por la técnica. Los ácidos nucleicos

cebadores ejemplares de la invención, que se unen a un ácido nucleico de N. gonorrhoeae con una secuencia que consiste de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36, una variante sustancialmente idéntica de los mismos, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 1 ó 2 ó 36, o un complemento de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36, o la variante, comprenden secuencias seleccionadas de entre SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60 y complementos de las mismas. El experto en la materia reconocerá que, en determinadas realizaciones, también pueden utilizarse ácidos nucleicos cebadores como sondas de ácidos nucleicos.

Una "fracción desactivadora" o "desactivador" se refiere a una fracción que reduce y/o es capaz de reducir la emisión detectable de radiación, por ejemplo radiación fluorescente o luminiscente, de una fuente que de otro modo la habría emitido. Un desactivador típicamente reduce la radiación detectable emitida por la fuente en por lo menos 50%, típicamente en por lo menos 80%, y más típicamente en por lo menos 90%. Se proporcionan desactivadores ejemplares en, por ejemplo, la patente US nº 6.465.175.

El término "muestra" se refiere a cualquier sustancia que contiene o que se presume que contiene ácidos nucleicos de N. gonorrhoeae y/o de C. trachomatis, incluyendo, aunque sin limitación, tejido o líquidos aislados a partir de uno

o más sujetos o individuos, constituyentes de cultivo celular in vitro, así como de muestras clínicas. Entre las muestras ejemplares se incluyen sangre, plasma, suero, orina, líquido sinovial, líquido seminal, plasma seminal, líquido prostático, líquido vaginal, líquido cervical, líquido uterino, raspados cervicales, líquido amniótico, raspados anales, moco, esputo, tejido y similares.

La expresión "muestra derivada de un sujeto" se refiere a una muestra obtenida del sujeto, se someta o no la muestra a una o más etapas de procesamiento (por ejemplo lisis celular, eliminación de residuos, estabilización, etc.) previamente al análisis. A título ilustrativo, las muestras pueden derivarse de sujetos mediante raspado, venipunción, torunda, biopsia u otras técnicas conocidas de la técnica.

La expresión "se unen selectivamente" o"unión selectiva" en el contexto de los reactivos de detección de ácidos nucleicos se refiere a un reactivo de detección de ácidos nucleicos que se une a un ácido nucleico de N. gonorrhoeae con una secuencia que consiste de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36, una variante sustancialmente idéntica de los mismos, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 1 ó 2 ó 36, o un complemento de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36, o la variante en mayor grado que la unión del reactivo de detección de ácidos nucleicos, bajo las mismas condiciones de hibridación, a ácidos nucleicos procedentes de por lo menos tres organismos seleccionados de cada una de las Tablas X y XI.

La expresión "detectar selectivamente" se refiere a la capacidad de detectar un ácido nucleico de N. gonorrhoeae con una secuencia que consiste de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36, una variante sustancialmente idéntica de los mismos, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 1 ó 2 ó 36, o un complemento de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36, o la variante, en un grado mayor que los ácidos nucleicos procedentes de otros organismos.

Se produce la "hibridación selectiva" o un ácido nucleico "se hibrida selectivamente" en el caso de que una secuencia de ácidos nucleicos se hibride con una secuencia diana de ácidos nucleicos especificada en un grado detectablemente superior que su hibridación con secuencias no diana de ácidos nucleicos. Las secuencias que se hibridan selectivamente presentan una identidad (es decir, complementariedad) de secuencia de por lo menos 50%, 60%, 70%, 80% ó 90% o más, por ejemplo típicamente 95% a 100%, entre sí.

Una "secuencia" de un ácido nucleico se refiere al orden e identidad de los nucleótidos en el ácido nucleico. Una secuencia típicamente se lee en la dirección 5' a 3'.

Un "anticuerpo específico de secuencia" se refiere a un anticuerpo que se une detectablemente a ácidos nucleicos con secuencias que consisten de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36, una variante sustancialmente idéntica de los mismos, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 1 ó 2 ó 36, o un complemento de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36 ó la variante.

Una "reacción de secuenciación" se refiere a una reacción que incluye, por ejemplo, la utilización de nucleótidos terminadores y que se ha diseñado para elucidar la secuencia de nucleótidos en un ácido nucleico dado.

Un "conjunto" se refiere a una colección de por lo menos dos cosas. Por ejemplo, un conjunto puede incluir 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 1.000 u otro número de moléculas o tipos de secuencia. Por ejemplo, entre determinados aspectos de la invención se incluyen mezclas de reacción que presentan conjuntos de amplicones. Un "subconjunto" se refiere a cualquier parte de un conjunto.

Un "soporte sólido" se refiere a un material sólido que puede derivatizarse, o de otro modo unirse a una fracción química, tal como una sonda oligonucleótida o similar. Entre los soportes sólidos ejemplares se incluyen placas, perlas, microperlas, tubos, fibras, cerdas, peines, chips de hibridación (incluyendo sustratos micromatrices, tales

como los utilizados en matrices de sondas GeneChip® (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA, USA)), membranas, cristales individuales, capas cerámicas, monocapas autoensamblantes y similares.

Una sonda oligonucleótida es "específica" para una secuencia diana en el caso de que el número de apareamientos incorrectos entre el oligonucleótido y la secuencia diana sea inferior al número de apareamientos incorrectos entre el oligonucleótido y secuencias no diana que puedan encontrarse presentes en una muestra. Pueden seleccionarse condiciones de hibridación bajo las que se formen dúplex estables únicamente en el caso de que el número de apareamientos incorrectos presente no sea superior al número de apareamientos incorrectos presentes entre el oligonucleótido y la secuencia diana. Bajo estas condiciones, el oligonucleótido específico de diana puede formar un dúplex estable únicamente con una secuencia diana. De esta manera, la utilización de cebadores específicos de diana bajo condiciones de amplificación convenientemente restrictivas permite la amplificación específica de aquellas secuencias que contengan los sitios diana de unión de cebador. De manera similar, la utilización de sondas específicas de diana bajo condiciones de hibridación convenientemente restrictivas permite la detección de una secuencia diana específica.

Un "sujeto" se refiere a un organismo. Típicamente, el organismo es un organismo mamífero, concretamente un organismo humano. En determinadas realizaciones, por ejemplo un sujeto es un paciente que se sospecha que presenta una infección por NG y/o una infección por CT.

Una "subsecuencia" o "segmento" se refiere a cualquier parte de una secuencia entera de ácidos nucleicos.

Una "variante sustancialmente idéntica" en el contexto de los ácidos nucleicos o polipéptidos se refiere a dos o más secuencias que presentan una identidad de secuencia o de nucleótidos de por lo menos 85%, típicamente de por lo menos 90%, más típicamente de por lo menos 95% entre ellas al compararlas y alinearlas para la máxima correspondencia, en una medición efectuada utilizando, por ejemplo, un algoritmo de comparación de secuencias o mediante inspección visual. La identidad sustancial generalmente existe a lo largo de una región de las secuencias que presenta una longitud de aproximadamente 15 nucleótidos o aminoácidos, más típicamente a lo largo de una región que presenta una longitud de por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos o aminoácidos, y todavía más típicamente las secuencias son sustancialmente idénticas a lo largo de una región de una longitud de por lo menos aproximadamente 25 nucleótidos o aminoácidos. En algunas realizaciones, por ejemplo, las secuencias son sustancialmente idénticas a lo largo de la longitud completa de los ácidos nucleicos o polipéptidos que se comparan. SEC ID nº 36 puede considerarse una variante ejemplar de SEC ID nº 1.

El término "sustitución" en el contexto de una secuencia de ácidos nucleicos se refiere a una alteración en la que por lo menos un nucleótido de la secuencia de ácidos nucleicos se sustituye por un nucleótido diferente.

Las expresiones "secuencia diana", "región diana" y "ácido nucleico diana" se refieren a una región de un ácido nucleico que debe amplificarse, detectarse o, de otro modo, analizarse.

Un "nucleótido terminador" se refiere a un nucleótido que, tras la incorporación en un ácido nucleico, impide la extensión adicional del ácido nucleico, por ejemplo por parte de un catalizador biológico que incorpora nucleótidos.

Un "enzima termoestable" se refiere a un enzima que es estable frente al calor, es resistente al calor y conserva suficiente actividad catalítica al someterlo a temperaturas elevadas durante periodos seleccionados de tiempo. Por ejemplo, una polimerasa termoestable conserva suficiente actividad para llevar a cabo las reacciones posteriores de extensión de cebadores al someterla a temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para llevar a cabo la desnaturalización de los ácidos nucleicos de doble cadena. Las condiciones de calentamiento necesarias para la desnaturalización de los ácidos nucleicos son bien conocidas de la técnica y se ejemplifican en las patentes US nº

4.683.202 y nº 4.683.195. Tal como se utiliza en la presente memoria, una polimerasa termoestable típicamente resulta adecuada para la utilización en una reacción de ciclado térmico tal como la reacción en cadena de la polimerasa ("PCR"). Para una polimerasa termoestable, la actividad enzimática se refiere a la catálisis de la combinación de los nucleótidos de manera apropiada para formar productos de extensión de cebadores que son complementarios al ácido nucleico molde (por ejemplo subsecuencias seleccionadas de un genoma de N. gonorrhoeae o de C. trachomatis).

II. DESCRIPCIÓN GENERAL

La invención se refiere a la detección selectiva de Neisseria gonorrhoeae. En particular, basándose en nuevas estrategias de detección que utilizan por lo menos una de las dos regiones diana del genoma de N. gonorrhoeae, las infecciones por N. gonorrhoeae pueden diagnosticarse utilizando los métodos y reactivos descritos en la presente memoria. Cada una de dichas regiones diana presenta múltiples copias en el genoma de N. gonorrhoeae. Por consiguiente, lo anterior típicamente facilita la detección de N. gonorrhoeae en muestras utilizando los enfoques descritos en la presente memoria referentes a técnicas con diana en regiones de una copia del genoma. Además, los reactivos de detección de ácidos nucleicos descritos en la presente memoria generalmente se unen detectablemente, bajo condiciones de ensayo seleccionadas, a secuencias de nucleótidos que se encuentran

presentes en N. gonorrhoeae, pero que no se encuentran presentes en otras especies, minimizando de esta manera la producción de, por ejemplo, falsos positivos. Esta especificidad se ilustra en, por ejemplo, las figuras 5 a 7, 9 y 10, y en la descripción relacionada en los Ejemplos, proporcionada posteriormente. En la presente memoria también se describen muchas otras características de la invención.

A título ilustrativo adicional, entre determinados métodos de la invención se incluyen la puesta en contacto o la incubación de reactivos de detección de ácidos nucleicos con ácidos nucleicos presentes en muestras o procedentes de muestras derivadas de sujetos (por ejemplo pacientes humanos que se sospecha que presentan infecciones por N. gonorrhoeae, etc.). En determinadas realizaciones, se amplifican regiones diana de los ácidos nucleicos en la muestra antes o simultáneamente a la puesta en contacto con los reactivos de detección de ácidos nucleicos. Los reactivos de detección de ácidos nucleicos se unen detectablemente a un ácido nucleico con una secuencia que consiste de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36, una variante sustancialmente idéntica de los mismos, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 1 ó 2 ó 36, o un complemento de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36 ó la variante. Tal como se describe en mayor detalle posteriormente, SEC ID nº 1 y SEC ID nº 2 son secuencias de consenso que corresponden a dos regiones del genoma de N. gonorrhoeae que son dianas en los métodos de la invención; SEC ID nº 36 es una variante de SEC ID nº 1. Entre dichos métodos también se incluyen el seguimiento (por ejemplo en un único punto del tiempo, en múltiples puntos del tiempo discretos, continuamente durante un periodo de tiempo seleccionado, etc.) de la unión entre los ácidos nucleicos y/o amplicones, y los reactivos de detección de ácidos nucleicos, para determinar si Neisseria gonorrhoeae se encuentra presente en las muestras, por ejemplo para diagnosticar los pacientes a partir de los que se derivaron las muestras, para el seguimiento de cursos de tratamiento de pacientes en los que se han diagnosticado infecciones por Neisseria gonorrhoeae, y/o similares.

En algunas realizaciones, dichos métodos incluyen además la puesta en contacto de los ácidos nucleicos y/o amplicones de las regiones diana con reactivos adicionales de detección de ácidos nucleicos que se unen detectablemente a ácidos nucleicos de Chlamydia trachomatis. En estas realizaciones, los métodos también incluyen el seguimiento de la unión entre los ácidos nucleicos y/o los amplicones, y los reactivos adicionales de detección de ácidos nucleicos con el fin de determinar si Chlamydia trachomatis también se encuentra presente en las muestras. Opcionalmente, dichos métodos también se repiten una o más veces utilizando muestras adicionales (por ejemplo del mismo sujeto) para llevar a cabo el seguimiento de, por ejemplo, cursos de tratamiento para sujetos en los que se han diagnosticado infecciones por Neisseria gonorrhoeae y/o por Chlamydia trachomatis, la recurrencia de infecciones y/o similares.

Entre otros métodos de la invención se incluyen la puesta en contacto o la incubación de ácidos nucleicos de muestras con por lo menos una primera pareja de ácidos nucleicos cebadores que incluye por lo menos un ácido nucleico seleccionado de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60 ó complementos de las mismas, en reacciones de amplificación de ácidos nucleicos. Tal como se describe en mayor detalle posteriormente, SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60 son oligonucleótidos que incluyen subsecuencias de SEC ID nº 1 ó a la secuencia SEC ID nº 2 ó a la secuencia SEC ID nº 36. Además, dichos métodos también incluyen la detección de amplicones durante o después de las reacciones de amplificación para detectar si Neisseria gonorrhoeae se encuentra presente en las muestras. Opcionalmente, dichos métodos incluyen además la puesta en contacto de los ácidos nucleicos de las muestras con por lo menos una segunda pareja de ácidos nucleicos cebadores que son por lo menos parcialmente complementarios a un ácido nucleico de Chlamydia trachomatis y la detección de amplicones adicionales durante o después de que se lleven a cabo las reacciones de amplificación con el fin de determinar si Chlamydia trachomatis se encuentra presente en las muestras. Dichos métodos también se repiten opcionalmente en puntos del tiempo seleccionados.

Además de composiciones y mezclas de reacción, la invención también se refiere a kits y sistemas para detectar dichos agentes patogénicos, y a medios informáticos y legibles por ordenador relacionados.

III. REACTIVOS DE DETECCIÓN DE �?CIDOS NUCLEICOS

Entre los reactivos de detección de ácidos nucleicos de la invención se incluyen diversas realizaciones, incluyendo sondas de ácidos nucleicos, ácidos nucleicos cebadores y anticuerpos específicos de secuencia. Algunos de dichos reactivos de detección de ácidos nucleicos presentan como diana la repetición 130 (también denominada en la presente memoria "NGDR9"), que es una repetición directa de 806 pares de bases en el genoma de N. gonorrhoeae que se cree que codifica una proteína. El genoma de N. gonorrhoeae incluye dos copia de NGDR9, una situada en las posiciones nucleótidas 458182-458988 y la otra situada en las posiciones nucleótidas 1586504-1587310. Una secuencia de consenso de NGDR9 corresponde a SEC ID nº 1, que se muestra en la Tabla 1. Aunque únicamnete se muestra una cadena del locus NGDR9 en la Tabla 1, el experto en la materia apreciará que SEC ID nº 1 identifica una región de ácido nucleico genómico de doble cadena, y que las secuencias de ambas cadenas son totalmente especificadas por la información de secuencias proporcionada.

TABLA I SEC ID nº 1

A título ilustrativo, los reactivos de detección de ácidos nucleicos que comprenden SEC ID nº 3 a 12, 17 a 20, 24 a 26, o complementos de las mismas, presentan como diana NGDR9 ó complementos del mismo. SEC ID nº 3 a 12, 17 a 20 y 24 a 26 se muestran en la Tabla II.

10 TABLA II

SEC ID nº 3

5’-CGTTCTCTCAATGCCCAATCA-3’

SEC ID nº 4

5’-AGCAGACGAAGCGGATACCTC-3’

SEC ID nº 5

5’-CTCTCAATGCCCAATCATAAAGC-3’

SEC ID nº 6

5’-GTATCCGCTTCGTCTGCTTTATC-3’

SEC ID nº 7

5’-GTTTGGCGGCAAGCATCT-3’

SEC ID nº 8

5’-AAATGGGATGCTGTCGTCAA-3’

SEC ID nº 9

5’-GGCAAGCTTGTTTGGCGGCAAGCATCT-3’

SEC ID nº 10

5’-GGCGGATCCTTGACGACAGCATCCCATTT-3’

SEC ID nº 11

5’-AAACGCAATCTTCAAACACCTCA-3’

SEC ID nº 12

5’-TTTGACGGCCTCACGCATAA-3’

SEC ID nº 17

5’-CGAGGTCGCCGAATTTAAATTGATAGTT-3’

SEC ID nº 18

5’-AACTATCAATTTAAATTCGGCGACCTCG-3’

SEC ID nº 19

5’-CGAGGTCGCCGAATTTAAATTGATAGTTCA-3’

SEC ID nº 20

5’-TGAACTATCAATTTAAATTCGGCGACCTCG-3’

SEC ID nº 24

5’-GATAAAGCAGACGAAGCGGATAC-3’

SEC ID nº 25

5’-TTGACGACAGCATCCCATTT-3’

SEC ID nº 26

5’-TTATGCGTGAGGCCGTCAAA-3’

Otros reactivos de detección de ácidos nucleicos de la invención presentan como diana la repetición 116 (también denominada en la presente memoria "NGDR33"), que es una repetición directa de 1.142 pares de bases en el 5 genoma de N. gonorrhoeae que se cree que codifica un polipéptido. El genoma de N. gonorrhoeae incluye dos copias de NGDR33, una situada en las posiciones nucleótidas 491768-492910 y la otra situada en las posiciones nucleótidas 1606987-1608129. Una secuencia de consenso de NGDR33 corresponde a SEC ID nº 2, que se muestra en la Tabla III. Aunque únicamente se muestra en la Tabla III una cadena del locus NGDR33, el experto en la materia apreciará que SEC ID nº 2 identifica una región de ácido nucleico genómico de doble cadena, y que las

10 secuencias de ambas cadenas son totalmente especificadas por la información de secuencias proporcionada.

TABLA III SEC ID nº 2

Por ejemplo, los reactivos de detección de ácidos nucleicos comprenden SEC ID nº 13 a 16, 21 a 23, 27 ó complementos de las mismas, presentan como diana NGDR33 ó complementos del mismo. SEC ID nº 13 a 16, 21 a 23 y 27 se muestran en la Tabla IV.

TABLA IV

SEC ID nº 13

5’-TCAATGTCGGGTTTGACGAA-3’

SEC ID nº 14

5’-AACGTCCGACAACCGGTAAC-3’

SEC ID nº 15

5’-AATGTCGGGTTTGACGAAACTC-3’

SEC ID nº 16

5’-GTTACCGGTTGTCGGACGTT -3’

SEC ID nº 21

5’-GCGGCAATCAGGGCAATATGGTAT-3’

SEC ID nº 22

5’-ATACCATATTGCCCTGATTGCCGC-3’

SEC ID nº 23

5’-GGCGGCAATCAGGGCAATATGGTAT-3’

SEC ID nº 27

5’-AACGTCCGACAACCGGTAAC-3’

En determinadas realizaciones en las que NGDR9 es la diana, las sondas y/o cebadores opcionalmente se unen

10 detectablemente a un segmento de ácidos nucleicos que comprende una o más posiciones nucleótidas de SEC ID nº 1 seleccionadas de entre el grupo que consiste de: 259, 260, 262, 264, 265, 266, 268, 269, 273, 275, 276, 277, 279, 297, 298, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 308, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 320, 321, 325, 326, 428, 429, 431, 432, 433, 434, 435, 440, 441 y 447. Estas posiciones nucleótidas, que se encuentran en negrita y subrayadas en la Tabla V, denotan determinados apareamientos incorrectos ejemplares con la secuencia de Brucella suis 1330

15 cromosoma I, sección 155 (número de acceso de GenBank® AE014469) que se identificaron en una alineación de las secuencias de NGDR9 y B. suis 1330 cromosoma 1, sección 155. Otros apareamientos incorrectos con esta secuencia del genoma de Brucella suis se ilustran en la figura 4. Esta secuencia del genoma de B. suis presenta un nivel de identidad más elevado con NGDR9 que las secuencias de otras especies bacterianas. Una alineación de la secuencia de NGDR9 con dicha secuencia de B. suis se describe en mayor detalle en un ejemplo proporcionado

20 posteriormente.

TABLA V

SEC ID nº 1

En algunas realizaciones en las que NGDR33 es la diana, las sondas y/o cebadores opcionalmente se unen detectablemente a un segmento de ácidos nucleicos que comprende una o más posiciones nucleótidas de SEC ID nº 2 seleccionadas de entre el grupo que consiste de: 89, 90, 91, 92, 95, 98, 101, 105, 106, 107, 216, 217, 220, 222, 10 223, 225, 233, 235, 236, 238, 335, 336, 337, 338, 339, 342, 345, 346 y 351. Estas posiciones nucleótidas, que se encuentran en negrita y subrayadas en la Tabla VI, denotan algunos apareamientos incorrectos ejemplares con la secuencia de Neisseria meningitidis serogrupo B cepa MC58, sección 77 (número de acceso de GenBank® AE002435) que se identificaron en una alineación de las secuencias de NGDR33 y N. meningitidis serogrupo B, cepa MC58, sección 77. Otros apareamientos incorrectos con esta secuencia del genoma de N. meningitidis se

15 ilustran en la figura 8. Esta secuencia del genoma de N. meningitidis presenta un nivel de identidad más alto con NGDR33 que las secuencias de otras especies bacterianas. Una alineación de la secuencia de NGDR33 con dicha secuencia de N. meningitidis se describe en mayor detalle en un ejemplo proporcionado posteriormente.

TABLA VI

SEC ID nº 2

Otros reactivos de detección de ácidos nucleicos de la invención presentan como diana una secuencia variante de la repetición 130 (también denominada en la presente memoria "NGDR9Var"). Una secuencia de consenso de

NGDR9Var corresponde a SEC ID nº 36, que se muestra en la Tabla A. Aunque únicamente se muestra una cadena del locus NGDR9Var en la Tabla A, el experto en la materia apreciará que SEC ID nº 36 identifica una región de ácido nucleico genómico de doble cadena, y que las secuencias de ambas cadenas son totalmente especificadas por la información de secuencias proporcionada.

TABLA A

A título ilustrativo, los reactivos de detección de ácidos nucleicos comprenden SEC ID nº 37 a 45, o complementos 10 de las mismas, con diana en NGDR9Var o complementos del mismo. SEC ID nº 37 a 45 se muestran en la Tabla B:

TABLA B

SEC ID nº 37

5’-GTTTCGACAGGCTTGCGAAC-3’

SEC ID nº 38

5’-GTTTCGACAGGCTTGCGAA-3’

SEC ID nº 39

5’-TTTGTTGTTGCCGTTTGCA-3’

SEC ID nº 40

5’-CCTGTTTGCGACAAAGAGGA-3’

SEC ID nº 41

5’-TGCGACAAAGAGGATTCCAA-3’

SEC ID nº 42

5’-TTCCCGCGCCTGCCTGATTCCTA-3’

SEC ID nº 43

5’-ACATCCGCACCGTAGGAATCAGGCA-3’

Otros reactivos de detección de ácidos nucleicos de la invención presentan como diana tanto NGDR9 como NGDR9Var. A título ilustrativo, los reactivos de detección de ácidos nucleicos comprenden SEC ID nº 46 a 60, o complementos de las mismas, con diana en NGDR9 y NGDR9Var o complementos de los mismos. Dichas secuencias también pueden denominarse secuencias "universales". SEC ID nº 46 a 60 se muestran en la Tabla C:

TABLA C

SEC ID nº 46

5’-CGTTTGGCGGCAAGCATC-3’

SEC ID nº 47

5’-GCGGCAAGCATCTGTTTTGC-3’

SEC ID nº 48

5’-GTAGCAGGCGCGAAGATTGAA-3’

SEC ID nº 49

5’-AGTAGCAGGCGCGAAGATTGA-3’

SEC ID nº 50

5’-GGGCGGAAGAATTTGCAGATTA-3’

SEC ID nº 51

5’-GCCATCAGAAAAGCGATTGAAA-3’

SEC ID nº 52

5’-GGACAAAACCGCCATCAGAAA-3’

SEC ID nº 53

5’-TAATCTGCAAATTCTTCCGCCCTTCAATCTT-3’

SEC ID nº 54

5’-TTTATCTAATCTGCAAATTCTTCCGCCCTTCA-3’

SEC ID nº 55

5’-CAAATTCTTCCGCCCTTCAATCTTCGC-3’

SEC ID nº 56

5’-CTTCAATCTTCGCGCCTGCTACTTGCC-3’

SEC ID nº 57

5’-AAGATTGAAGGGCGGAAGAATTTGCAGATTA-3’

SEC ID nº 58

5’-GCGAAGATTGAAGGGCGGAAGAATTTG-3’

SEC ID nº 59

5’-TCAGGGCTTCGTCTTCCGA-3’

SEC ID nº 60

5’-TTTAAAGCCTCGTTCCGCAA-3’

Tal como se ha indicado anteriormente, los reactivos de detección de ácidos nucleicos comprenden oligonucleótidos (por ejemplo sondas de ácidos nucleicos, ácidos nucleicos cebadores, etc.) en determinadas realizaciones de la invención. Aunque opcionalmente se utilizan otras longitudes, los oligonucleótidos generalmente comprenden secuencias que típicamente presentan una longitud de entre aproximadamente 8 y aproximadamente 100 nucleótidos, más típicamente de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 75 nucleótidos, todavía más típicamente de entre aproximadamente 12 y aproximadamente 50 nucleótidos, y todavía más típicamente de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 35 nucleótidos (por ejemplo de una longitud aproximada de 20, 25 ó 30 nucleótidos). Los métodos de preparación de oligonucleótidos, tales como la síntesis de ácidos nucleicos, se describen en mayor detalle posteriormente.

El experto en la materia podrá utilizar diversos enfoques para diseñar oligonucleótidos (por ejemplo variantes sustancialmente idénticas de ácidos nucleicos que presentan secuencias seleccionadas de entre SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60 ó complementos de las mismas) que se unen selectivamente a NGDR9 y/o a NGDG9Var o a NGDR33, pudiéndose utilizar dichos oligonucleótidos para detectar N. gonorrhoeae. A título ilustrativo, el paquete informático DNAstar disponible de DNASTAR, Inc. (Madison, WI) puede utilizarse para las alineaciones de secuencias. Por ejemplo, las secuencias de ácidos nucleicos de NGDR9 y B. suis o NGDR33 y N. meningitidis puede subirse al programa EditSeq de DNAstar en forma de archivos individuales.Las parejas de archivos de secuencia (por ejemplo NGDR9 y B. suis) pueden abrirse en el programa de alineación de secuencias MegAlign de DNAstar y puede aplicarse el método Clustal W de alineación. Los parámetros utilizados para las alineaciones con Clustal W opcionalmente son los parámetros por defecto en el programa. El programa MegAlign típicamenten o proporciona un resumen del porcentaje de identidad entre dos secuencias. Esto generalmente se calcula manualmente. A partir de las alineaciones pueden identificarse típicamente las regiones que presentan, por ejemplo, una identidad inferior a 85% entre sí y pueden seleccionarse las secuencias oligonucleótidas en estas regiones. Opcionalmente también se utilizan muchos otros algoritmos y paquetes informáticos de alineación de secuencias. Los algoritmos de alineación de secuencias también se describen en, por ejemplo, Mount, Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001, y en Durbin et al., Biological Sequence Analysis: Probabilistic Models of Proteins and Nucleic Acids, Cambridge University Press, 1998.

A título ilustrativo adicional, puede llevarse a cabo la alineación óptima de secuencias para su comparación mediante, por ejemplo, el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981, mediante el algoritmo de alineación de homologías de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970, mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988, y mediante las implementaciones informáticas de dichos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete informático de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, Madison, WI), o incluso mediante inspección visual.

Otro algoritmo ejemplar que resulta adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en, por ejemplo, Altschul et al. J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990. El software para llevar a cabo versiones de análisis BLAST se encuentra disponible públicamente en el National Center for Biotechnology Informatión en Internet, en el sitio ncbi.nlm.nih.gov/ desde el 12 de marzo de 2004. Este algoritmo

implica en primer lugar identificar las parejas de secuencias de alta puntuación (HSPs) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia problema que correspondan o satisfagan una puntuación umbral de valor positivo T al alinearse con una palabra de la misma longitud en una secuencia de una base de datos. T se denomina umbral de puntuación de palabras vecinas (Altschul et al., supra). Estos palabras vecinas iniciales actúan como gérmenes para iniciar búsquedas de HSPs más largas que las contienen. A continuación, las palabras encontradas se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta que ya no pueda incrementarse la puntuación de alineación acumulada. Las puntuaciones acumuladas se calculan utilizando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de premio para una pareja de residuos correspondientes, siempre >0) y N (puntuación de penalización para residuos incorrectamente apareados, siempre <0). Para las secuencias de aminoácidos se utiliza una matriz de puntuaciones para calcular la puntuación acumulada. La extensión en cada dirección de las palabras encontradas se detiene cuando: la puntuación de alineación acumulada cae en una cantidad X respecto a su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulada baja a cero o a un nivel inferior debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos con puntuación negativa, o se alcanza el final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para las secuencias de nucleótidos) utiliza como valores por defecto una longitud de palabra (W) de 11, un valor esperado (E) de 10, un valor de corte de 100, M=5, N=-4 y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como valores por defecto una longitud de palabra (W) de 3, un valor esperado (E) de 10 y la matriz de puntuaciones BLOSUM62 (ver Henikofl' y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989).

Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencias, el algoritmo BLAST también lleva a cabo un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (ver, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma mínima (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad de que una correspondencia entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos se produzca al azar. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia (y, por lo tanto, es homóloga) en el caso de que la probabilidad de suma mínima en una comparación entre el ácido nucleico de ensayo y el ácido nucleico de referencia sea inferior a aproximadamente 0,1,

o inferior a aproximadamente 0,01, o incluso inferior a aproximadamente 0,001.

Un ejemplo adicional de un algoritmo de alineación de secuencias útil es PILEUP. PILEUP crea una alineación de múltiples secuencias a partir de un grupo de secuencias relacionadas utilizando alineaciones por parejas progresivas. También puede proporcionar un árbol que muestra las relaciones de agrupamientos utilizadas para crear la alineación. PILEUP utiliza una simplificación del método de alineación progresiva de Feng y Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360, 1987. El método utilizado es similar al método descrito por Higgins y Sharp, CABIOS 5:151-153, 1989. El programa puede alinear, por ejemplo, hasta 300 secuencias de una longitud máxima de 5.000 letras. El procedimiento de alineación múltiple se inicia con la alineación por parejas de las dos secuencias más similares, produciendo una agrupación de dos secuencias alineadas. Esta agrupación seguidamente puede alinearse con la siguiente secuencia, o agrupación de secuencias alineadas, más relacionada Dos agrupaciones de secuencias pueden alinearse mediante una simple extensión de la alineación por parejas de dos secuencias individuales. La alineación final se consigue mediante una serie de alineaciones por parejas progresivas. El programa también puede utilizarse para generar un dendrograma o representación en árbol de las relaciones de agrupamiento. El programa se implementa mediante la designación de secuencias específicas y sus coordinadas de aminoácidos o nucleótidos para regiones de comparación de secuencias.

Las sondas y cebadores de la invención opcionalmente incluyen uno o más marcajes, que se describen en mayor detalle posteriormente. Además, las sondas y cebadores opcionalmente incluyen diversas otras modificaciones, tales como nucleótidos modificados que alteran las temperaturas de fusión de hibridación, los conectores de sitio de restricción para facilitar la clonación de amplicones, grupso modificadores que incrementan la especificidad de las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos y/o similares. Por ejemplo, determinados nucleótidos modificados que incrementan las temperaturas de fusión de hibridación de ácidos nucleicos se incluyen opcionalmente para permitir la utilización de sondas y cebadores de menor tamaño, tales como los que incluyen entre aproximadamente 8 y aproximadamente 14 nucleótidos. Entre los ejemplos de dichos oligonucleótidos modificados se incluyen aquellos que presentan uno o más monomeros LNATM. Se describen en mayor detalle análogos de nucleótidos tales como los indicados anteriormente en, por ejemplo, las patentes US nº 6.639.059, nº 6.303.315 y publicación de patente US nº 2003/0092905. Los oligonucleótidos que comprenden monómeros LNATM se encuentran disponibles comercialmente de, por ejemplo, Exiqon A/S (Vedbæk, Dinamarca). Se hace referencia en la presente memoria a modificaciones adicionales de sondas y de cebadores, incluyendo en las definiciones proporcionadas anteriormente.

En determinadas realizaciones, los reactivos de detección de ácidos nucleicos utilizados tal como se describe en la presente memoria son anticuerpos específicos de secuencia con diana en SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36, o una variante sustancialmente idéntica de los mismos, en los que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una secuencia de entre SEC ID nº 1 ó 2 ó 36, o un complemento de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36 ó la variante. SEC ID nº 1 ySEC ID nº 2 ySEC ID nº 36 se han descrito en mayor detalle anteriormente y se proporcionan en las Tablas I, II y A, respectivamente. Los anticuerpos adecuados para la utilización en dichas realizaciones de la invención pueden prepararse mediante métodos convencionales y/o mediante ingeniería genética. Pueden manipularse genéticamente fragmentos de anticuerpos,

por ejemplo de las regiones variables de las cadenas ligera y/o pesada (VH y VL), incluyendo las regiones hipervariables, o de tanto la región VH como la VL. Por ejemplo, el término "anticuerpos" tal como se utiliza en la presente memoria incluye los anticuerpos policlonales y monoclonales y los fragmentos biológicamente activos de los mismos, incluyendo, entre otras posibilidades, anticuerpos "univalentes" (Glennie et al. Nature 295:712, 1982); proteínas Fab, incluyendo los fragmentos Fab' y F(ab')2, agregados covalente o no covalentemente; cadenas ligeras

o pesadas solas, típicamente regiones variables de cadenas pesadas y ligeras (regiones VH y VL), y más típicamente incluyendo las regiones hipervariables (también conocidas como regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de las regiones VH y VL); proteínas Fc; anticuerpos "híbridos" capaces de unión a más de un antígeno; quimeras de región constante-región variable; inmunoglobulinas "compuestas" con cadenas pesadas y ligeras de diferentes orígenes; anticuerpos "alterados" con especificidad mejorada y otras características, preparadas mediante técnicas de recombinación estándares, mediante técnicas mutagénicas u otras técnicas evolutivas dirigidas conocidas de la técnica.

Los anticuerpos específicos de secuencia utilizados tal como se describe en la presente memoria pueden marcarse

o no marcarse. Entre los marcajes adecuados se incluyen, por ejemplo, radionucleidos, enzimas, coenzimas, pigmentos fluorescentes, pigmentos quimioluminiscentes, cromógenos, sustratos o cofactores enzimáticos, inhibidores enzimáticos, radicales libres y similares. Dichos reactivos marcados pueden utilizarse en una diversidad de ensayos bien conocidos, tales como radioinmunoensayos, inmunoensayos enzimáticos, por ejemplo ELISA, inmunoensayos fluorescentes y similares. Ver, por ejemplo, las patentes US nº 3.766.162, nº 3.791.932, nº

3.817.837 y nº 4.233.402. Se describen en mayor detalle en la presente memoria marcajes adicionales.

En algunas realizaciones, los ARN transcritos y/o las proteínas traducidas codificadas por NGDR9 y NGDR33 y NGDR9Var son dianas para la detección. Muchas técnicas para detectar los ARN y/o proteínas son conocidas de la técnica. Por ejemplo, los ácidos nucleicos de sondas y cebadores de la invención pueden adaptarse para la utilización en ensayos de reacción en cadena de la polimerasa-transcripción inversa (RT-PCR) para la detección de productos de transcripción de NGDR9 y/o NGDR9Var o NGDR33. Además, diversos ensayos electroforéticos (por ejemplo SDS-PAGE o similares), inmunoensayos, ensayos de espectrometría de masas (por ejemplo análisis basados en la desorción láser asistida por matriz/ionización (MALDI), los ensayos basados en la desorción/ionización por láser en superficie (SELDI), etc.) y/o otros enfoques pueden utilizarse para detectar proteíans codificadas por NGDR9 y/o NGDR9Var o NGDR33. Muchos de dichos métodos y otros métodos adecuados de detección de ARN y proteínas se encuentran descritos en las referencias citadas en la presente memoria.

En la práctica de la presente invención, se utilizan opcionalmente muchas técnicas convencionales de la biología molecular y de ADN recombinante. Dichas técnicas son bien conocidas y se explican en, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, volúmenes I, II y III, 1997 (F.M. Ausubel, editor); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001; Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, volumen 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger), DNA Cloning: A Practical Approach, volúmenes I y II, 1985 (D. N. Glover, editor); Oligonucleotide Synthesis, 1984 (M. L. Gait, editor); Nucleic Acid Hybridization, 1985, (Hames y Higgins); Transcription and Translation, 1984 (Hames y Higgins, editores); Animal Cell Culture, 1986 (Freshney, editor); Immobilized Cells and Enzymes, 1986 (IRL Press); Perbal, 1984, A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987 (J. H. Miller y M.

P. Calos, editores, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods in Enzymology vol. 154 y vol. 155 (Wu y Grossman, y Wu, editores, respectivamente).

IV. VARIACIONES DE SECUENCIA

Numerosas secuencias de ácidos nucleicos y de polipéptidos se encuentran comprendidas dentro del alcance de la presente invención. A título ilustrativo, la figura 1 muestra una alineación de secuencias de la repetición directa 9 de Neisseria gonorrhoeae (NGDR9) con las secuencias de por lo menos partes de los amplicones de ADN genómico procedentes de diversas cepas de N. gonorrhoeae. Más concretamente, el ADN genómico de 5 cepas de N. gonorrhoeae (es decir, las cepas de NG 1117, 1120, 6346, 6359 y 6364) se amplificó y se secuenció con ácidos nucleicos cebadores correspondientes a DK101 (SEC ID nº 7) y DK1024 (SEC ID nº 25). La localización de los oligonucleótidos DK101 y del complemento de DK102R (es decir, DK102 (SEC ID nº 8)) y los oligonucleótidos NG519 (SEC ID nº 5) y NG514 (SEC ID nº 6) se encuentran subrayados en la secuencia de NGDR9 mostrada en la figura 1. Además, también se indican la secuencia mayoritaria o de consenso entre la secuencia de DR9 y las cinco cepas de N. gonorrhoeae.

A título ilustrativo adicional, determinadas variaciones ejemplares de la secuencia de ácidos nucleicos relacionada con NGDR9 se asocian a los números Gene ID NG0465, NG0466, NG0467, IGR0389, IGR0390, NG1616, NG1617, NG1618, IGR1318 e IGR1319, y determinadas variaciones ejemplares de la secuencia de ácidos nucleicos relacionada con NGDR33 se asocian a los números Gene ID NG0518, NG0519, NG0520, IGR0430, IGR0431, NG1649, NG1650, IGR1345 e IGR1346, la totalidad de los cuales se proporciona en Internet, en stdgen.lanl.gov desde el 12 de marzo de 2004. Sin embargo, la secuencia de NGDR9Var (SEC ID nº 36) no se encontró en ninguna

de las bases de datos de acceso público en fecha de 1 de agosto de 2007. Se identificó inesperadamente la SEC ID nº 36 durante un estudio extensivo de análisis de secuencias de la región de NGDR9.

VARIACIONES SILENCIOSAS

El experto en la materia apreciará que, debido a la degeneración del código genético, puede producirse una multitud de secuencias de ácidos nucleicos codificantes de los polipéptidos NGDR9 y NGDR33 y NGDR9Var, algunos de los cuales pueden mostrar una homología de secuencias mínima con las secuencias de ácidos nucleicos dadas a conocer explícitamente en la presente memoria. Los polipéptidos NGDR9 ejemplares se asocian a los números Gene ID NG0465, NG0466, NG0467, NG 1616, NG1617 y NG1618, y los polipéptidos NGDR33 ejemplares se asocian a los números Gene ID NG0518, NG0519, NG0520, NG1649 y NG1650, la totalidad de los cuales se proporciona en Internet, en stdgen.lanl.gov desde el 12 de marzo de 2004.

TABLA VII

Tabla de codones

Aminoácidos

Codón

Alanina

Ala A GCA GCC GCG GCU

Cisteína

Cys C UGC UGU

�?cido aspártico

Asp D GAC GAU

�?cido glutámico

Glu E GAA GAG

Fenilalanina

Phe F UUC UUU

Glicina

Gly G GGA GGC GGG GGU

Histidina

His H CAC CAU

Isoleucina

lle I AUA AUC AUU

Lisina

Lys K AAA AAG

Leucina

Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU

Metionina

Met M AUG

Asparagina

Asn N AAC AAU

Prolina

Pro P CCA CCC CCG CCU

Glutamina

GIn Q CAA CAG

Arginina

Arg R GA AGG CGA CGC CGG CGU

Serina

Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU

Treonina

Thr T ACA ACC ACG ACU

Valina

Val V GUA GUC GUG GUU

Triptófano

Trp W UGG

Tirosina

Tyr Y UAC UAU

Por ejemplo, el examen de la tabla de codones (Tabla VII) muestra que los codones AGA, AGG, CGA, CGC, CGG y CGU codifican todos ellos el aminoácido arginina. De esta manera, en cada posición de los ácidos nucleicos de la invención en la que una arginina sea especificada por un codón, el codón puede alterarse en cualquiera de los codones correspondientes indicados anteriormente sin alterar el polipéptido codificado. Se entiende que U en una secuencia de ARN corresponde a T en una secuencia de ADN.

Dichas "variaciones silenciosas" son una especie de "variaciones conservadoramente modificadas", comentadas posteriormente. El experto en la materia reconocerá que cada codón de un ácido nucleico (excepto AUG, que habitualmente es el único codón de la metionina) podrá modificarse mediante técnicas estándares para codificar un polipéptido funcionalmente idéntico. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido se encuentra implícita en cualquier secuencia descrita. La invención proporciona todas y cada una de las posibles variaciones de la secuencia de ácidos nucleicos codificante de los polipéptidos NGDR9, NGDR33 y NGDR9Var que podrían prepararse mediante la selección de combinaciones basadas en las posibles elecciones de codones. Estas combinaciones se preparan de acuerdo con el código genético estándar de tripletes (por ejemplo tal como se proporciona en la Tabla 1), aplicado a las secuencias de ácidos nucleicos codificantes de los polipéptidos NGDR9, NGDR33 y NGDR9Var. La totalidad de dichas variaciones de todos los ácidos nucleicos en la presente memoria se proporcionan específicamente y se describen a partir de la consideración de la secuencia en combinación con el código genético.

VARIACIONES CONSERVADORAS

Las "variaciones conservadoramente modificadas" o simplemente, "variaciones conservadoras", de una secuencia particular de ácidos nucleicos se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas o en las que el ácido nucleico no codifica secuencias de aminoácidos esencialmente idénticas. El experto en la materia reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales que alteran, añaden o delecionan un único aminoácido o un porcentaje reducido de aminoácidos (típicamente menos de 5%, más típicamente menos de 4%, 2% ó 1%) en una secuencia codificada son "variaciones

conservadoramente modificadas", en la que las alteraciones resultan en la deleción de un aminoácido, la adición de un aminoácido o la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar.

Las tablas de sustituciones conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas de la técnica. La Tabla VIII proporciona seis grupos que contienen aminoácidos que son "sustituciones conservadoras" mutuas.

TABLA VIII

Grupos de sustitución conservadora

1

Alanina (A) Serina (S) Treonina (T)

2

�?cido aspártico (D) �?cido glutámico (E)

3

Asparagina (N) Glutamina (Q)

4

Arginina (R) Lisina (K)

5

Isoleucina (I) Leucina (L) Metionina (M) Valina (V)

6

Fenilalanina (F) Tirosina (Y) Triptófano (W)

De esta manera, las "variaciones conservadoramente sustituidas" de un polipéptido NGDR9, NGDR33 ó NGDR9Var al que se hace referencia en la presente memoria, incluyen sustituciones de un porcentaje reducido, típicamente menos de 5%, más típicamente menos de 2% ó 1%, de los aminoácidos de la secuencia polipeptídica, por un aminoácido seleccionado conservadoramente del mismo grupo de sustitución conservadora.

La adición de secuencias que no alteran la actividad codificada por una molécula de ácidos nucleicos, tal como la adición de una secuencia no funcional, es una variación conservadora del ácido nucleico básico.

El experto en la materia apreciará que muchas variaciones conservadoras de los ácidos nucleicos indicados en la presente memoria proporcionan un ácido nucleico funcionalmente idéntico. Por ejemplo, tal como se ha comentado anteriormente, debido a la degeneración del código genético, las "sustituciones silenciosas" (es decir, sustituciones en una secuencia de ácidos nucleicos que no resultan en una alteración de un polipéptido codificado) son una característica implícita de cada una de las secuencias de ácidos nucleicos codificante de un aminoácido. De manera similar, "las sustituciones conservadoras de aminoácidos" en un aminoácido o en unos cuantos de una secuencia de aminoácidos sustituidos por aminoácidos diferentes con propiedades altamente similares, también se identifican fácilmente como altamente similares a uno de los constructos dados a conocer. Dichas variaciones conservadoras de cada secuencia dada a conocer son una característica de la presente invención.

V. S�?NTESIS DE SONDAS Y CEBADORES

Las sondas y cebadores oligonucleótidos de la invención se preparan opcionalmente utilizando esencialmente cualquier técnica conocida de la técnica. En determinadas realizaciones, por ejemplo, las sondas y cebadores oligonucleótidos indicados en la presente memoria se sintetizan químicamente utilizando esencialmente cualquier método de síntesis de ácidos nucleicos, incluyendo, por ejemplo, el método de triéster de fosforamidita en fase sólida descrito por Beaucage y Caruthers, Tetrahedron Letts. 22(20):1859-1862, 1981, u otra técnica sintética conocida de la técnica, por ejemplo utilizando un sintetizador automático, tal como se describe en Needham-VanDevanter et al. Nucleic Acids Res. 12:6159-6168, 1984. Se encuentra comercialmente disponible una amplia diversidad de equipos para la síntesis automática de oligonucleótidos. También se utilizan opcionalmente enfoques de síntesis de multinucleótidos (por ejemplo la síntesis de trinucleótido, etc.). Además, los ácidos nucleicos cebadores indicados en la presente memoria opcionalmente incluyen diversas modificaciones. En determinadas realizaciones, por ejemplo, entre los cebadores se incluyen conectores de sitio de restricción, por ejemplo para facilitar la posterior clonación de amplicones, o similares. A título ilustrativo adicional, los cebadores también se modifican opcionalmente con el fin de mejorar la especificidad de las reacciones de amplificación, tal como se describe en, por ejemplo, la patente US nº 6.001.611. También pueden sintetizarse cebadores y sondas con diversas otras modificaciones tal como se describe en la presente memoria o, de otro modo, tal como es conocido de la técnica.

Opcionalmente se utiliza esencialmente cualquier marcaje para marcar los reactivos de detección de ácidos nucleicos de la invención. En algunas realizaciones, por ejemplo, el marcaje comprende un pigmento fluorescente (por ejemplo un pigmento rodamina (por ejemplo R6G, R110, TAMRA, ROX, etc.), un pigmento fluoresceína (por ejemplo JOE, VIC, TET, HEX, FAM, etc.), un pigmento halofluoresceína, un pigmento cianina (por ejemplo CY3, CY3.5, CY5, CY5.5, etc.), un pigmento BODIPY® (por ejemplo FL, 530/550, TR, TMR, etc.), un pigmento ALEXA FLUOR® (por ejemplo 488, 532, 546, 568, 594, 555, 653, 647, 660, 680, etc.), un pigmento diclororodamina, un pigmento de transferencia energética (por ejemplo los pigmentos BIGDYETM v1, los pigmentos BIGDYETM v2, los

pigmentos BIGDYETM v3, etc.), los pigmentos Lucifer (por ejemplo amarillo Lucifer, etc.), CASCADE BLUE®, verde de Oregón, y similares. Se proporcionan ejemplos adicionales de pigmentos fluorescentes en, por ejemplo, Haugland, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, 9a edición, 2003, y ediciones actualizadas del mismo. Los pigmentos fluorescentes se encuentran generalmente disponibles de diversos proveedores comerciales, incluyendo, por ejemplo, Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR), Amersham Biosciences Corp. (Piscataway, NJ), Applied Biosystems (Foster City, CA), etc. Entre otros marcajes se incluyen, por ejemplo, biotina, marcajes débilmente fluorescentes (Yin et al. Appl. Environ. Microbiol. 69(7):3938, 2003; Babendure et al. Anal. Biochem. 317(1): 1, 2003, y Jankowiak et al. Chem. Res. Toxicol. 16(3):304, 2003), marcajes no fluorescentes, marcajes colorimétricos, marcajes quimioluminiscentes (Wilson et al. Analyst. 128(5):480, 2003, y Roda et al. Luminescence 18(2):72, 2003), marcajes Raman, marcajes electroquímicos, marcajes bioluminiscentes (Kitayama et al. Photochem. Photobiol. 77(3):333, 2003; Arakawa et al. Anal. Biochem. 314(2):206, 2003, y Maeda, J. Pharm. Biomed. Anal. 30(6):1725, 2003), y un reactivo de marcaje alfa-metil-PEG tal como el descrito en, por ejemplo, la solicitud provisional de patente US nº 60/428,484. También se describe en mayor detalle posteriormente el marcaje de los ácidos nucleicos.

Además, puede obtenerse esencialmente cualquier ácido nucleico (y prácticamente cualquier ácido nucleico marcado, sea estándar o no), en un pedido específico o estándar, de una diversidad de fuentes comerciales, tales como The Midland Certified Reagent Company, The Great American Gene Company, ExpressGen Inc., Operon Technologies Inc. o Proligo LLC.

VI. PREPARACIÓN DE MUESTRAS Y AMPLIFICACIÓN DE �?CIDOS NUCLEICOS

Las muestras generalmente se derivan o se aíslan de sujetos, típicamente sujetos mamíferos, más típicamente sujetos humanos, que se sospecha que presentan una infección por N. gonorrhoeae y/o por C. trachomatis. Entre las muestras o especímenes ejemplares se incluyen sangre, plasma, suero, orina, líquido sinovial, líquido seminal, plasma seminal, líquido prostático, líquido vaginal, líquido cervical, líquido uterino, raspados cervicales, líquido amniótico, raspados anales, moco, esputo, tejido y similares. Se utiliza opcionalmente esencialmente cualquier técnica para obtener dichas muestras, incluyendo, por ejemplo, el raspado, la venipunción, el uso de torundas, la biopsia u otras técnicas conocidas de la técnica. A título ilustrativo adicional, se obtienen exudados faríngeos de los sujetos en determinadas realizaciones, por ejemplo como parte de cribados para faringitis gonocócica o similar. Los métodos de almacenamiento de especímenes, de cultivo de células, de aislamiento y preparación de ácidos nucleicos a partir de dichas fuentes son generalmente conocidos de la técnica y muchos de ellos se describen en mayor detalle en las referencias y/o en los ejemplos proporcionados en la presente memoria.

A título ilustrativo adicional, previamente al análisis de los ácidos nucleicos diana indicados en la presente memoria, pueden purificarse o aislarse los ácidos nucleicos a partir de muestras, que típicamente incluyen mezclas complejas de diferentes componentes. Las células en las muestras recogidas típicamente se lisan para liberar el contenido celular. Por ejemplo, pueden lisarse las células de N. gonorrhoeae y otras células en la muestra particular, mediante su puesta en contacto con diversos enzimas o compuestos químicos, y/o lisarse mediante otros enfoques conocidos de la técnica, que degradan, por ejemplo, las paredes celulares bacterianas. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos se analizan directamente en el lisado celular. En otras realizaciones, los ácidos nucleicos se purifican adicionalmente o se extraen de los lisados celulares previamente a la detección. Puede utilizarse esencialmente cualquier método de extracción de ácidos nucleicos para purificar los ácidos nucleicos en las muestras utilizadas en los métodos de la presente invención. Entre las técnicas ejemplares que pueden utilizarse para purificar ácidos nucleicos se incluyen, por ejemplo, la cromatografía de afinidad, la hibridación con sondas inmovilizadas sobre soportes sólidos, la extracción líquido-líquido (por ejemplo la extracción con fenol-cloroformo, etc.), la precipitación (por ejemplo utilizando etanol, etc.), la extracción con papel de filtro, la extracción con reactivos formadores de micelas (por ejemplo el bromuro de cetiltrimetilamonio, etc.), la unión a pigmentos intercalantes inmovilizados (por ejemplo bromuro de etidio, acridina, etc.), la adsorción a gel de sílice o tierras diatomáceas, la adsorción a partículas de vidrio magnéticas o partículas de organosilano bajo condiciones caotrópicas, y/o similares. También se describe el procesamiento de muestras en, por ejemplo, las patentes US nº 5.155.018, nº 6.363.393 y nº 5.234.809.

A título de ejemplo adicional, los ácidos nucleicos no modificados pueden unirse a un material con una superficie de sílice. Muchos de estos procedimientos que se adaptan opcionalmente para la utilización en la realización de los métodos de la presente invención se encuentran descritos en la técnica. A título ilustrativo, Vogelstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:615-619, 1979, describe la purificación de ácidos nucleicos a partir de geles de agarosa en presencia de yoduro sódico utilizando vidrio flint molido. Marko et al. Anal. Biochem. 121:382-387, 1982, describen la purificación de ácidos nucleicos de bacterias sobre polvo de vidrio en presencia de perclorato sódico. En la patente DE nº A-3734442 se aíslan ácidos nucleicos sobre filtros de fibra de vidrio. Los ácidos nucleicos unidos a dichos filtros de fibra de vidrio se lavan y después se eluyen con un tampón Tris/EDTA que contiene metanol. Se describe un procedimiento similar en Jakobi et al. Anal. Biochem. 175:196-201, 1988. En particular, Jakobi et al. describen la unión selectiva de ácidos nucleicos a superficies de vidrio en soluciones salinas caotrópicas y la separación de los ácidos nucleicos de contaminantes, tales como agarosa, proteínas y residuos celulares. Con el fin de separar las partículas de vidrio de los contaminantes, las partículas pueden centrifugarse o pueden aspirarse los líquidos a través de filtros de fibra de vidrio. Además, la utilización de partículas magnéticas para inmovilizar los ácidos

nucleicos tras la precipitación mediante la adición de sales y etanol se describe en, por ejemplo, Alderton et al., Anal. Biochem. 201:166-169, 1992 y la patente PCT nº GB91/00212. En este procedimiento, los ácidos nucleicos se aglutinan conjuntamente con las partículas magnéticas. El aglutinado se separa del solvente original mediante aplicación de un campo magnético y la realización de una o más etapas de lavado. Tras por lo menos una etapa de lavado, los ácidos nucleicos típicamente se disuelven en un tampón Tris.

Las partículas magnéticas en una matriz de vidrio porosa recubierta con una capa que incluye, por ejemplo, estreptavidina, también pueden utilizarse en determinadas realizaciones de la invención. Dichas partículas pueden utilizarse, por ejemplo, para aislar ácidos nucleicos y proteínas conjugadas con biotina. Las partículas ferrimagnéticas, ferromagnéticas y superparamagnéticas también se utilizan opcionalmente. Las partículas de vidrio magnéticas y métodos relacionados que pueden adaptarse para la utilización en la realización de los métodos descritos en la presente memoria también se describen en, por ejemplo, la patente WO nº 01/37291.

Una de las tecnologías más potentes y básicas para derivar y detectar ácidos nucleicos es la amplificación de ácidos nucleicos. En la presente invención, la amplificación de ácidos nucleicos de interés típicamente es anterior o simultánea a la detección de ese ADN. Además, las sondas oligonucleótidas indicadas en la presente memoria también se amplifican opcionalmente, por ejemplo mediante síntesis química o similar. En algunas realizaciones, se amplifican señales detectables, por ejemplo utilizando ácidos nucleicos ramificados u otros formatos de amplificación de señales conocidos de la técnica.

Entre los métodos de amplificación que se utilizan opcionalmente o se adaptan para la utilización con los oligonucleótidos y métodos descritos en la presente memoria se incluyen, por ejemplo, diversos métodos de amplificación mediados por polimerasa o ligasa, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), la amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA), la amplificación por círculo rodante (RCA) y/o similares. Los detalles referentes a la utilización de dichos métodos y otros métodos de amplificación pueden encontrarse en diversos artículos y/o cualquiera de entre una diversidad de textos estándares, incluyendo, por ejemplo, Berger, Sambrook, Ausubel, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., editores), Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1990 (Innis); Schweitzer et al., "Combining nucleic acid amplification and detection", Curr. Opin. Biotechnol. 12(1):21-27, 2001. Muchos textos de biología disponibles también presentan comentarios extensos sobre los métodos de amplificación por PCR y relacionados. La amplificación de ácidos nucleicos también se describe en, por ejemplo, Mullis et al., patente US nº 4.683.202, 1987, y Sooknanan y Malek, Biotechnology 13:563, 1995. Se proporciona un resumen de los métodos mejorados de amplificación de ácidos nucleicos de gran tamaño mediante PCR en Cheng et al., Nature 369:684, 1994. En determinadas realizaciones, se utiliza la PCR dúplex para amplificar los ácidos nucleicos diana. Se describe adicionalmente la amplificación por PCR dúplex en, por ejemplo, Gabriel et al. "Identification of human remains by immobilized sequence-specific oligonucleotide probe analysis of mtDNA hypervariable regions I and II", Croat. Med. J. 44(3):293, 2003, y La et al. "Development of a duplex PCR assay for detection of Brachyspira hyodysenteriae and Brachyspira pilosicoli in pig feces," J. Clin. Microbiol. 41(7):3372, 2003. Opcionalmente, se utilizan cebadores marcados (por ejemplo cebadores biotinilados, cebadores Scorpion, etc.) para amplificar los ácidos nucleicos en una muestra, por ejemplo para facilitar la detección de amplicones y similares. Los cebadores Scorpion también se describen en, por ejemplo, Whitcombe et al., "Detection of PCR products using selfprobing amplicons and fluorescence", Nat. Biotechnol. 17(8):804-807, 2001. Se describe el marcaje en mayor detalle en la presente memoria.

Los amplicones opcionalmente se recuperan y se purifican de otros componentes de reacción mediante cualquiera de entre varios métodos bien conocidos de la técnica, incluyendo la electroforesis, la cromatografía, la precipitación, la diálisis, la filtración y/o la centrifugación. Se describen aspectos de la purificación de ácidos nucleicos en, por ejemplo, Douglas et al., DNA Chromatography, Wiley, John & Sons, Inc., 2002, y Schott, Affinity Chromatography: Template Chromatography of Nucleic Acids and Proteins, Chromatographic Science Series, nº 27, Marcel Dekker, 1984. En determinadas realizaciones, los amplicones no se purifican previamente a la detección. La detección de amplicones se describe en mayor detalle posteriormente.

VII. MATRICES DE SONDAS

En determinadas realizaciones de la invención, las sondas oligonucleótidas descritas en la presente memoria se unen covalente o no covalentemente a soporte sólidos que seguidamente se ponen en contacto con muestras que comprenden ácidos nucleicos amplificados y marcados procedentes de un sujeto. En otras realizaciones, las sondas de la invención se proporcionan libres en solución. Opcionalmente se adapta esencialmente cualquier material de sustrato para la utilización en dichos aspectos de la invención. En determinadas realizaciones, por ejemplo, los sustratos se fabrican de silicio, vidrio o materiales poliméricos (por ejemplo portaobjetos de microscopía de vidrio o poliméricos, obleas de silicio, etc.). Los sustratos de vidrio o poliméricos adecuados, incluyendo los portaobjetos de microscopía, se encuentran disponibles de diversos proveedores comerciales, tales como Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) o similares. En algunas realizaciones, los soportes sólidos utilizados en la invención son membranas. Los materiales de membrana adecuados se seleccionan opcionalmente de entre, por ejemplo, membranas de poliaramida, membranas de policarbonato, membranas de matriz plástica porosa (por ejemplo

plástico poroso POREX®, etc.), membranas de matriz metálica porosa, membranas de polietileno, membranas de poli(difluoruro de vinilideno), membranas de poliamida, membranas de nilón, membranas cerámicas, membranas de poliéster, membranas de politetrafluoroetileno (TEFLON®), membranas de malla tejida, membranas de microfiltración, membranas de nanofiltración, membranas de ultrafiltración, membranas de diálisis, membranas compuestas, membranas hidrofílicas, membranas hidrofóbicas, membranas basadas en polímeros, membranas no basadas en polímeros, membranas de carbono activado en polvo, membranas de polipropileno, membranas de fibra de vidrio, membranas de vidrio, membranas de nitrocelulosa, membranas de celulosa, membranas de nitrato de celulosa, membranas de acetato de celulosa, membranas de polisulfona, membranas de polietersulfona, membranas de poliolefina o similares. Muchas de dichos materiales membranosos se encuentran ampliamente disponibles de diversos proveedores comerciales, tales como P.J. Cobert Associates, Inc. (St. Louis, MO), Millipore Corporation (Bedford, MA) o similares. Entre otros soportes sólidos ejemplares que se utilizan opcionalmente se incluyen, por ejemplo, cerámicas, metales, resinas, geles, placas, perlas, microperlas (por ejemplo microperlas magnéticas, etc.), tubos (por ejemplo microtubos, etc.), cerdas, fibras, peines, cristales individuales y monocapas autoensamblantes.

Las sondas oligonucleótidas de la invención se unen directa o indirectamente (por ejemplo mediante conectores, tales como la albúmina de suero bovino (BSA) o similar) a los soportes, por ejemplo mediante cualquier método químico o físico disponible. Se encuentra disponible una amplia diversidad de reacciones químicas de enlace para unir moléculas a una amplia diversidad de soportes sólidos. Más concretamente, los ácidos nucleicos pueden unirse al soporte sólido mediante enlace covalente, tal como mediante conjugación con un agente de acoplamiento, o mediante unión no covalente, tal como interacciones electrostáticas, enlaces de hidrógeno o acoplamiento de anticuerpo-antígeno, o mediante combinaciones de los mismos. Entre los agentes de acoplamiento típicos se incluyen biotina/avidina, biotina/estreptavidina, proteína A de Staphylococcus aureus/fragmento Fc de anticuerpo IgG y quimeras de estreptavidina/proteína A (Sano et al., Bio/Technology 9:1378, 1991) o derivados o combinaciones de dichos agentes. Los ácidos nucleicos pueden unirse al soporte sólido mediante un enlace fotoclavable, un enlace electrostático, un enlace disulfuro, un enlace peptídico, un enlace diéster o una combinación de dichos enlaces. Los ácidos nucleicos también se unen opcionalmente a soporte sólidos mediante un enlace selectivamente liberable, tal como 4,4'-dimetoxitritilo o un derivado del mismo. Entre los derivados que se ha encontrado que resultan útiles se incluyen ácido 3 ó 4[bis-(4-metoxifenil)]-metilbenzoico, ácido N-succinimidil-3 ó 4[bis-(4-metoxifenil)]-metilbenzoico, ácido N-succinimidil-3 ó 4[bis-(4-metoxifenil)]hidroximetilbenzoico, ácido N-succinimidil-3 ó 4[bis-(4-metoxifenil)]clorometilbenzoico, y sales de dichos ácidos.

Tal como se ha indicado anteriormente, las sondas oligonucleótidas se unen opcionalmente a soporte sólidos mediante conectores entre los ácidos nucleicos y el soporte sólido. Entre los conectores útiles se incluyen un agente de acoplamiento, tal como se ha indicado anteriormente para la unión a otras parejas de acoplamiento o a parejas de acoplamiento adicionales, o para convertir en cortable la unión al soporte sólido.

Pueden crearse uniones cortables mediante la unión de fracciones químicas cortables entre las sondas y el soporte sólido, incluyendo, por ejemplo, un oligopéptido, oligonucleótido, oligopoliamida, oligoacrilamida, oligoetilenglicerol, cadenas alquilo de entre aproximadamente 6 y 20 átomos de carbono, y combinaciones de los mismos. Estas fracciones pueden cortarse mediante, por ejemplo, la adición de agentes químicos, radiación electromagnética o enzimas. Entre las uniones ejemplares cortables por enzimas se incluyen enlaces peptídicos que pueden cortarse con proteasas, y enlaces fosfodiéster que pueden cortarse con nucleasas.

Algunos agentes químicos tales comof -mercaptoetanol, ditiotreitol (DTT) y otros agentes reductores cortan los enlaces disulfuro. Entre otros agents que pueden resultar útiles se incluyen los agentes oxidantes, los agentes hidratantes y otros compuestos selectivamente activos. La radiación electromagnética, tal como la luz ultravioleta, infrarroja y visible corta los enlaces fotocortables. Las uniones también pueden ser reversibles, por ejemplo utilizando un tratamiento térmico o enzimático, o uniones químicas o magnéticas reversibles. La liberación y nueva unión pueden llevarse a cabo utilizando, por ejemplo, campos magnéticos o eléctricos.

La hibridación basada en matrices resulta particularmente adecuada para detectar ácidos nucleicos de N. gonorrhoeae y/o de C. trachomatis, ya que puede utilizarse para detectar la presencia de muchos amplicones simultáneamente. Se han descrito varios sistemas de matrices y pueden adaptarse para la utilización con la presente invención, incluyendo los disponibles de proveedores comerciales, tales como Affymetrix, Inc. (Santa Clara, CA, USA) y similares. También se describen aspectos de la construcción y utilización de las matrices en, por ejemplo, Sapolsky et al., "High-throughput polymorphism screening and genotyping with high-density oligonucleotide arrays", Genetic Analysis: Biomolecular Engineering 14:187-192, 1999; Lockhart, "Mutant yeast on drugs", Nature Medicine 4:1235-1236, 1998; Fodor, "Genes, Chips and the Human Genome", FASEB Journal 11:A879, 1997; Fodor, "Massively Parallel Genomics" Science 277: 393-395, 1997; y Chee et al. "Accessing Genetic Information with High-Density DNA Arrays", Science 274:610-614, 1996.

Otras sondas y cebadores para detectar ácidos nucleicos de N. gonorrhoeae y/o de C. trachomatis, que se utilizan opcionalmente además de las sondas y cebador indicados anteriormente para llevar a cabo los métodos y otros aspectos de la invención, se describe en, por ejemplo, las patentes US nº 5.550.040 y nº 6.090.557.

VIII. HIBRIDACIÓN DE �?CIDOS NUCLEICOS

La hibridación de sondas oligonucleótidas a sus ácidos nucleicos diana, de N. gonorrhoeae y/o de C. trachomatis, puede conseguirse mediante la elección de las condiciones de hibridación apropiadas. La estabilidad del híbrido de sonda:ácido nucleico diana típicamente se selecciona para que resulte compatible con las condiciones de ensayo y de lavado, de manera que se formen híbridos detectables estables únicamente entre las sondas y los ácidos nucleicos diana de N. gonorrhoeae y/o de C. trachomatis. La manipulación de uno o más de los diferentes parámetros de ensayo determina la sensibilidad y especificidad exactas de un ensayo de hibridación particular.

Más concretamente, la hibridación entre las bases complementarias de ADN, ARN, APN o combinaciones de los mismos, se produce bajo una amplia diversidad de condiciones que varían de temperatura, concentración salina, fuerza electrostática, composición del tampón, y similares. Se describen ejemplos de dichas condiciones y métodos de aplicación de las mismas en, por ejemplo, Tijssen, supra , 1993, y en Hames e Higgins, supra. La hibridación generalmente tiene lugar entre aproximadamente 0ºC y aproximadamente 70ºC, durante periodos de entre aproximadamente un minuto y aproximadamente una hora, dependiendo de la naturaleza de la secuencia que debe hibridarse y su longitud. Sin embargo, se reconoce que las hibridaciones pueden producirse en segundos u horas, dependiendo de las condiciones de la reacción. A título ilustrativo, las condiciones de hibridación típicas para una mezcla de dos 20-meros es llevar la mezcla a 68ºC, seguido del enfriamiento hasta la temperatura ambiente (22ºC) durante cinco minutos a temperaturas muy bajas, tales como 2ºC en 2 microlitros. La hibridación entre ácidos nucleicos puede facilitarse utilizando tampones tales como Tris-EDTA (TE), Tris-HCl y HEPES, soluciones salines (por ejemplo de NaCl, KCl o CaCl2) u otras soluciones acuosas, reactivos y compuestos químicos. Entre los ejemplos de dichos reactivos se incluyen proteínas de unión de una cadena, tales como la proteína Rec A, la proteína del gen 32 de T4, la proteína de unión de una cadena de E. coli y las proteínas de unión del surco mayor o menor de ácidos nucleicos. Entre otros ejemplos de dichos reactivos y compuestos químicos se incluyen iones divalentes, iones polivalentes y sustancias intercalantes tales como bromuro de etidio, actinomicina D, psoralén y angelicina. Un procedimiento de hibridación ejemplar de utilización en la presente invención sigue condiciones similares a las indicadas en el protocolo de ensayo de COBAS AMPLICOR® Chlamydia trachomatis (CT)/Neisseria gonorrhoeae (NG) (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN).

IX. DETECCIÓN Y VARIACIONES DE LA SONDA

Tal como se ha indicado anteriormente, los ácidos nucleicos diana amplificados de N. gonorrhoeae y/o de C. trachomatis en las muestras utilizadas en los métodos de la invención se marcan opcionalmente para permitir la detección de dúplex de hibridación de sonda oligonucleótida-diana. En general, un marcaje puede ser cualquier fracción que pueda unirse, por ejemplo, a un cebador utilizado para la amplificación y proporcionar una señal detectable (por ejemplo una señal cuantificable). Los marcajes pueden unirse a un cebador directa o indirectamente mediante una diversidad de técnicas conocidas de la técnica. Dependiendo del tipo de marcaje utilizado, el marcaje puede unirse a un nucleótido terminal (extremo 5' ó 3' del cebador) o a un nucleótido no terminal, y puede unirse indirectamente mediante conectores o brazos espaciadores de diversos tamaños y composiciones. Utilizando reactivos fosforamidita disponibles comercialmente, pueden producirse oligómeros que contengan grupos funcionales (por ejemplo tioles o aminas primarias) en el extremo 5' ó 3' mediante una fosforamidita apropiadamente protegida, y pueden marcar dichos oligonucleótidos utilizando protocolos descritos en, por ejemplo, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al, editores Academic Press, Inc., 1990). En una realización, el marcaje consiste de una molécula de biotina unida covalentemente al cebador en el extremo 5'. La expresión "cebador biotinilado" se refiere a un cebador con una o más moléculas de biotina unidas directamente al cebador o indirectamente mediante moléculas conectoras intermedias.

A título ilustrativo adicional, la detección de dúplex de hibridación de sonda oligonucleótida-diana opcionalmente se lleva a cabo mediante un ensayo quimioluminiscente utilizando un reactivo basado en el luminol, tal como se describe en, por ejemplo Whitehead et al., Nature 30(5):158, 1983, y que se encuentra disponible comercialmente. Tras la hibridación de la sonda con el ADN diana marcado, la molécula de biotina unida al ADN diana se conjuga con, por ejemplo estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (SA-HRP). Alternativamente, el ADN diana puede marcarse con peroxidasa de rábano picante directamente, eliminando de esta manera la etapa separada de conjugación. En cualquier caso, la oxidación posterior del luminol por parte del enzima peroxidasa de rábano picante resulta en la emisión de fotones, que después se detectan en, por ejemplo, película estándar de autorradiografía. La intensidad de la señal es una función de la cantidad de ADN. Típicamente se someten a ensayo una serie de estándares de ADN que contienen cantidades conocidas de ADN, conjuntamente con una o más muestras desconocidas. Las intensidades de señal de los estándares de ADN conocidos permiten realizar una determinación empírica de la relación funcional entre la intensidad de la señal y la cantidad de ADN, lo que permite la cuantificación de las muestras desconocidas. También se pueden utilizar opcionalmente muchos otros métodos de detección para llevar a cabo los métodos de la invención y se hace referencia a ellos en las referencias citadas en la presente memoria y/o son generalmente conocidos de la técnica.

Puede utilizarse en la presente invención cualquier método disponible para detectar amplicones de N. gonorrhoeae

y/o de C. trachomatis. Entre los enfoques comunes se incluyen la detección mediante amplificación en tiempo real con balizas moleculares o sondas 5'-nucleasa, la detección de pigmentos intercalantes, la detección de marcajes incorporados en las sondas de amplificación o en los ácidos nucleicos amplificados mismos, por ejemplo tras la separación electroforética de los productos de amplificación respecto de marcajes no incorporados, los ensayos basados en la hibridación (por ejemplo ensayos basados en matrices) y/o la detección de reactivos secundarios que se unen a los ácidos nucleicos. Por ejemplo, se detecta NG y/o CT utilizando los oligonucleótidos indicados en la presente memoria en un formato de ensayo AMPLICOR® en determinadas realizaciones de la invención.

A título ilustrativo adicional, opcionalmente se diseña una baliza molecular o una sonda 5'-nucleasa para que incluya una sonda oligonucleótida de la invención (es decir, se selecciona de entre SEC ID nº 3 a 27) o complementos de las mismas), pudiendo utilizar dicha baliza molecular o sonda 5'-nucleasa para detectar amplicones de N. gonorrhoeae y/o de C. trachomatis. Las balizas moleculares o las sondas 5'-nucleasas se describen en mayor detalle posteriormente. Se puede encontrar información sobre dichos enfoques generales en las referencias citadas en la presente memoria, por ejemplo en Sambrook y Ausubel. Pueden encontrarse estrategias adicionales de marcaje para marcar ácidos nucleicos y las estrategias de detección correspondientes en, por ejemplo, Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, novena edición de Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR), 2003.

Las balizas moleculares (MBs) son oligonucleótidos diseñados para la detección y cuantificación en tiempo real de ácidos nucleicos diana (por ejemplo amplicones diana de N. gonorrhoeae y/o de C. trachomatis). Los extremos 5' y 3' de las MBs comprenden colectivamente una pareja de fracciones que proporcionan las propiedades detectables de la MB. Uno de los extremos se une a un fluoróforo y el otro se une a una molécula desactivadora capaz de desactivar una emisión fluorescente del fluoróforo. Por ejemplo, una pareja ejemplar de fluoróforo-desactivador puede utilizar un fluoróforo tal como EDANS o fluoresceína, por ejemplo en el extremo 5' y un desactivador, tal como dabcilo, por ejemplo, en el extremo 3'. En el caso de que la MB se encuentre presente libre en solución, es decir, no hibridada con un segundo ácido nucleico, se estabiliza el tallo de la MB mediante apareamiento de bases complementarias. El apareamiento autocomplementario resulta en una estructura de "bucle de horquilla" de la MB en la que las fracciones de fluoróforo y de desactivador se encuentran próximas entre sí. En esta conformación, la fracción fluorescente resulta desactivada por el fluoróforo. El bucle de la baliza molecular típicamente comprende una sonda oligonucleótida descrita en la presente memoria (es decir, se selecciona de entre SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60 ó complementos de las mismas) y de acuerdo con lo anteriormente expuesto es complementaria a una secuencia que debe detectarse en el ácido nucleico diana de N. gonorrhoeae y/o de C. trachomatis, de manera que la hibridación del bucle con su secuencia complementaria en la diana fuerza la disociación del tallo, distanciando de esta manera el fluoróforo y el desactivador. Lo anterior resulta en la reactivación del fluoróforo, provocando un incremento de fluorescencia de la MB.

Los detalles de los métodos estándares de preparación y utilización de las MBs se encuentran bien establecidos en la literatura y las MBs se encuentran disponibles de varios proveedores comerciales de reactivos. Puede entrarse más información sobre los métodos de preparación y utilización de las MBs en, por ejemplo, Leone et al., "Molecular beacon probes combined with amplification by NASBA enable homogenous real-time detection of RNA", Nucleic Acids Res. 26:2150-2155, 1995; Hsuih et al., "Novel, ligation-de-pendent PCR assay for detection of hepatitis C in serum", J. Clin. Microbiol. 34:501-507, 1997; Kostrikis et al., "Molecular beacons: spectral genotyping of human alleles", Science 279:1228-1229, 1998; Sokol et al., "Real time detection of DNA:RNA hybridization in living cells", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:11538-11543, 1998; Tyagi et al., "Multicolor molecular beacons for allele discrimination", Nature Biotechnol. 16:49-53, 1998; Fang et al., "Designing a novel molecular beacon for surface-immobilized DNA hybridization studies", J. Am. Chem. Soc. 121:2921-2922, 1999; y Marras et al., "Multiplex detection of singlenucleotide variation using molecular beacons", Genet. Anal. Biomol. Eng. 14: 151-156, 1999. También pueden encontrarse aspectos de la construcción y utilización de las MBs en la literatura de patentes, tales como las patentes US nº 5.925.517, nº 6.150.097 y nº 6.037.130.

Los componentes de las MBs (por ejemplo oligos, incluyendo los marcados con fluoróforos o desactivadores) pueden sintetizarse utilizando métodos convencionales. Algunos de estos métodos se han descrito en mayor detalle anteriormente. Por ejemplo, los oligonucléotidos o los ácidos péptidonucleicos (APNs) pueden sintetizarse en aparatos de síntesis automática de oligonucleótidos/APNs disponibles comercialmente utilizando métodos estándares. Pueden unirse marcajes a los oligonucleótidos o APNs durante la síntesis automática o mediante reacciones postsintéticas que han sido descritas anteriormente; ver, por ejemplo, Tyagi y Kramer, supra , 1996. También pueden encontrarse aspectos relacionados con la síntesis de oligonucleótidos funcionalizados en Nelson et al., "Bifunctional Oligonucleotide Probes Synthesized Using A Novel CPG Support Are Able To Detect Single Base Pair Mutations", Nucleic Acids Res. 17:7187-7194, 1989. Pueden introducirse marcajes/desactivadores en los oligonucleótidos o APNs, por ejemplo mediante la utilización de una columna de vidrio de poro controlado con el fin de introducir, por ejemplo, el desactivador (por ejemplo una fracción 4-dimetilaminoazobenceno-4'-sulfonilo (DABSYL)). Por ejemplo, el desactivador puede añadirse en el extremo 3' de los oligonucleótidos durante la síntesis automática; puede utilizarse un éster succinimidilo del ácido 4-(4'-dimetilaminofenilazo)benzoico (dabsilo) en el caso de que el sitio de unión sea un grupo amino primario, y la 4-dimetilaminofenilazofenil-4'-maleimida (DABMI) puede utilizarse en el caso de que el sitio de unió nsea un grupo sulfhidrilo. De manera similar, puede introducirse fluoresceína en los oligonucleótidos, utilizando una fluoresceína fosforamidita que sustituya un nucleósido por

fluoresceína, o mediante la utilización de una fluoresceína dT-fosforamidita que introduzca una fracción fluoresceína en un anillo timidina mediante un conector. Para unir una fracción fluoresceína a un sitio terminal, puede acoplarse yodoacetoamidofluoresceína a un grupo sulfhidrilo. Puede introducirse tetraclorofluoresceína (TET) durante la síntesis automática utilizando una 5'-tetraclorofluoresceína fosforamidita. Entre otros derivados fluoróforos reactivos y sus sitios respectivos de unión se incluyen el éster succinimidilo de 5-carboxirrodamina-6G (RHD) acoplado a un grupo amino; una yodoacetamida de tetrametilrrodamina acoplada a un grupo sulfhidrilo; un isotiocianato de tetrametilrrodamina acoplado a un grupo amino, o un cloruro de sulfonilo de rojo Texas acoplado a un grupo sulfhidrilo. Durante la síntesis de estos componentes marcados, pueden purificarse los oligonucleótidos o APNs conjugados, si se desea, por ejemplo mediante cromatografía líquida de alta presión u otros métodos.

Una diversidad de proveedores comerciales produce balizas moleculares estándares y específicas, incluyendo Cruachem (cruachem.com), Oswel Research Products Ltd. (Reino Unido, oswel.com), Research Genetics (una división de Invitrogen, Huntsville, AL (resgen.com)), The Midland Certified Reagent Company (Midland, TX, mcrc.com) y Gorilla Genomics, LLC (Alameda, CA). También se encuentra disponible comercialmente una diversidad de kits que utilizan balizas moleculares, tales como los kits de balizas moleculares de discriminación alélica SentinelTM de Stratagene (La Jolla, CA, USA) y diversos kits de Eurogenetec SA (Bélgica, eurogentec.com) e Isogen Bioscience BV (Países Bajos, isogen.com).

En determinadas realizaciones, se utiliza un sistema de ensayo PCR en tiempo real que incluye una o más sondas 5'-nucleasa para detectar ácidos nucleicos amplificados de N. gonorrhoeae y/o de C. trachomatis. Estos sistemas funcionan mediante la utilización de la actividad de nucleasa endógena de determinadas polimerasas para cortar separando un desactivador o marcaje de un oligonucleótido de la invención que comprende el desactivador y el marcaje, resultando en la reactivación del marcaje. La polimerasa únicamente corta el desactivador o marcaje al iniciarse la replicación, es decir, al unirse el oligonucleótido al molde y extender la polimerasa el cebador. De esta manera, una sonda oligonucleótida correctamente marcada y la polimerasa que comprende la actividad de nucleasa apropiada pueden utilizarse para detectar un ácido nucleico de interés de N. gonorrhoeae y/o de C. trachomatis. El análisis de productos de la PCR en tiempo real mediante, por ejemplo, FRET o similar (y PCR de transcripción inversa en tiempo real relacionada) proporciona una técnica bien conocida para el seguimiento de la PCR en tiempo real utilizada en una diversidad de contextos, que puede adaptarse para la utilización con las sondas y métodos descritos en la presente memoria (ver Laurendeau et al., "TaqMan PCR-based gene dosage assay for predictive testing in individuals from a cancer family with INK4 locus haploinsufficiency" Clin Chem 45(7): 982-6, 1999; Laurendeau et al., "Quantitation of MYC gene expression in sporadic breast tumors with a real-time reverse transcription-PCR assay" Clin Chem 59(12):2759-65, 1999; y Kreuzer et al. "LightCycler technology for the quantitation of bcr/abl fusion transcripts", Cancer Research 59(13):3171-4, 1999).

X. SISTEMAS

La invención también proporciona un sistema para detectar N. gonorrhoeae y/o C. trachomatis en una muestra. El sistema incluye uno o más reactivos de detección de ácidos nucleicos tal como se describe en la presente memoria (por ejemplo ácidos nucleicos sonda, anticuerpos específicos de secuencia, etc.). En determinadas realizaciones, los reactivos de detección de ácidos nucleicos se disponen ordenadamente en un soporte sólido, mientras que en otras, se proporcionan en uno o más recipientes, por ejemplo para ensayos realizados en solución. El sistema también incluye por lo menos un detector (por ejemplo un espectrómetro, etc.) que detecta la unión entre ácidos nucleicos y/o amplicones de los mismos procedentes de la muestra y el reactivo de detección de ácidos nucleicos. Se describen en mayor detalle posteriormente otros detectores. Además, el sistema también incluye por lo menos un controlador operablemente conectado al detector. El controlador incluye uno o más conjuntos de instrucciones que correlacionan la unión detectada por el detector con la presencia de Neisseria gonorrhoeae y/o C. trachomatis en la muestra.

En algunas realizaciones, el reactivo de detección de ácidos nucleicos se encuentra en por lo menos un recipiente. En estas realizaciones, el sistema opcionalmente incluye además por lo menos un modulador térmico operablemente conectado al recipiente para modular la temperatura en el recipiente y/o por lo menos un componente de transferencia de líquidos (por ejemplo un pipeteador automático, etc.) que transfiere líquidos hacia el recipiente y/o desde el recipiente, por ejemplo para llevar a cabo una o más técnicas de amplificación de ácidos nucleicos en el recipiente, etc.

Entre los sistemas ejemplares disponibles comercialmente que se utilizan opcionalmente para detectar ácidos nucleicos de N. gonorrhoeae y/o de C. trachomatis utilizando los reactivos de detección de ácidos nucleicos descritos en la presente memoria (por ejemplo sondas oligonucleótidas que comprenden secuencias seleccionadas de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60 ó complementos de las mismas, anticuerpos específicos de secuencia, etc.) se incluyen, por ejemplo, un analizador COBAS AMPLICOR®, que se encuentra disponible de Roche Diagnostics Corporation (Indianapolis, IN), un sistema LUMINEX 100TM, que se encuentra disponible de la Luminex Corporation (Austin, TX) y un sistema de detección de secuencias ABI PRISM®, que se encuentra disponible de Applied Biosystems (Foster City, CA) y similares.

La invención proporciona además un ordenador o un medio legible por ordenador que incluye una tabla de datos

que comprende una pluralidad de cadenas de caracteres que corresponden a una pluralidad de secuencias que corresponden a subsecuencias de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36, una variante sustancialmente idéntica de los mismos, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 1 ó 2 ó 36, o un complemento de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36 ó la variante. Típicamente, por lo menos uno de las cadenas de caracteres correspodne a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60 ó complementos de los mismos. Typically, the computer or computer readable medium further includes an automatic synthesizer coupled to an output of the computer or computer readable medium. El sintetizador automático acepta instrucciones del ordenador o medio legible por ordenador, dirigiendo las instrucciones la síntesis de, por ejemplo uno o más ácidos nucleicos sonda que corresponden a una o más cadenas de caracteres en la tabla de datos. Se describen en mayor detalle posteriormente sistemas y componentes de sistema ejemplares.

Los detectores se estructuran para detectar las señales detectables producidas, por ejemplo, en otro componente o en una posición próxima al mismo del sistema (por ejemplo en un recipiente y/o sobre un soporte sólido, etc.). Los detectores de señales adecuados que se utilizan opcionalmente, o adaptados para la utilización en dichos sistemas, detectan, por ejemplo, fluorescencia, fosforescencia, radioactividad, absorbancia, índice refractivo, luminiscencia o similar. Los detectores opcionalmente realizan un seguimiento de una señal o de una pluralidad de señales desde antes y/o desde después de la realización de, por ejemplo, una etapa de ensayo dada. Por ejemplo, el detector opcionalmente sigue una pluralidad de señales ópticas, que corresponden en posición a los resultados "en tiempo real". Entre los ejemplos de detectores o sensores se incluyen tubos fotomultiplicadores, matrices CCD, sensores ópticos, sensores de temperatura, sensores de presión, sensores de pH, sensores de conductividad, detectores de escaneo, o similares. Cada uno de ellos, así como otros tipos de sensores, opcionalmente se incorporan fácilmente en los sistemas descritos en la presente memoria. Opcionalmente, los sistemas de la presente invención incluyen múltiples detectores.

Entre los detectores ejemplares más específicos que se utilizan opcionalmente en dichos sistemas se incluyen, por ejemplo, un detector de dispersión lumínica resonante, un espectroscopio de emisión, un espectroscopio de fluorescencia, un espectroscopio de fosforescencia, un espectroscopio de luminiscencia, un espectrofotómetro, un fotómetro y similares. También se utilizan diversos componentes sintéticos, o se adaptan para la utilización en los sistemas de la invención, incluyendo, por ejemplo, sintetizadores automáticos de ácidos nucleicos, por ejemplo para sintetizar las sondas oligonucleótidas indicadas en la presente memoria. Los detectores y componentes sintéticos que se incluyen opcionalmente en los sistemas de la invención se describen en mayor detalle en, por ejemplo, Skoog et al., Principles of Instrumental Analysis, 5a edición, Harcourt Brace College Publishers, 1998, y Currell, Analytical Instrumentation: Performance Characteristics and Quality, John Wiley & Sons, Inc., 2000.

Entre los sistemas de la invención también se incluyen típicamente controladores que se encuentran operablemente conectados a uno o más componentes (por ejemplo detectores, componentes sintéticos, moduladores térmicos y/o componentes de transferencia de líquidos) del sistema para controlar el funcionamiento de los componentes. Más concretamente, los controladores generalmente se incluyen como componentes separados o integrales del sistema que se utilizan, por ejemplo, para recibir datos de los detectores, para llevar a cabo y/o regular la temperatura en los recipientes, para producir y/o regular el flujo de líquido hacia o desde recipientes seleccionados, o similares. Los controladores y/o otros componentes del sistema opcionalmente se acoplan a un procesador programado apropiadamente, a un ordenador, dispositivo digital u otro dispositivo de procesamiento de la información (por ejemplo incluyendo un conversor de analógico a digital o de digital a analógico, según resulte necesario), que funciona ordenando el funcionamiento de dichos instrumentos de acuerdo con instrucciones preprogramadas o introducidas por el usuario, recibiendo datos e información de dichos instrumentos, e interpretando, manipulando y comunicando esta información al usuario. Los controladores adecuados son generalmente conocidos de la técnica y se encuentran disponibles de diversas fuentes comerciales.

Cualquier controlador u ordenador incluye opcionalmente una pantalla, que con frecuencia es una pantalla de tubo de rayos catódicos ("CRT"), una pantalla plana (por ejemplo una pantalla de cristal líquido con matriz activa, una pantalla de cristal líquido, etc.) u otros. Los circuitos del ordenador con frecuencia se introducen en una caja, que incluye numerosos chips de circuito integrado, tales como un microprocesador, memoria, circuitos de interfaz y otros. La caja también incluye opcionalmente un disco duro, una disquetera, un disco extraíble de alta capacidad tal como un CD-ROM grabable y otros elementos periféricos comunes. Los dispositivos de introducción, tales como un teclado o un ratón opcionalmente permiten la introducción de información por parte de un usuario. Dichos componentes se ilustran en mayor detalle posteriormente.

El ordenador típicamente incluye software apropiado para recibir instrucciones del usuario, en forma de introducción por parte del usuario en un conjunto de campos paramétricos, por ejemplo en un GUI, o en forma de instrucciones preprogramadas, por ejemplo preprogramadas para una diversidad de diferentes operaciones específicas. A continuación, el software convierte estas instrucciones en lenguaje apropiado para ordenar la activación de uno o más controladores para que se lleve a cabo la operación deseada. Seguidamente el ordenador recibe los datos de, por ejemplo, sensores/detectores incluidos en el sistema, e interpreta los datos, los proporciona en un formato comprensible para el usuario, o utiliza los datos para iniciar instrucciones adicionales del controlador, de acuerdo con la programación, por ejemplo el control de reguladores del flujo de líquido en respuesta a datos de peso de

líquido recibidos de básculas o similares.

El ordenador puede ser, por ejemplo, un PC (máquina compatible con un chip Intel x86 o Pentium en entorno DOSTM, OS2TM, WINDOWSTM, WINDOWS NTTM WINDOWS95TM, WINDOWS98TM, WINDOWS2000TM, WINDOWS XPTM, LINUX, MACINTOSHTM, Power PC o UNIX (por ejemplo una estación de trabajo SUNTM) u otro ordenador común comercialmente disponible conocido por el experto en la materia. Pueden adaptarse a la presente invención aplicaciones de sobremesa estándares, tales como programas de procesamiento de textos (por ejemplo Microsoft WordTM o Corel WordPerfectTM) y programas de gestión de bases de datos (por ejemplo programas de hojas de cálculo, tales como Microsoft ExcelTM, Corel Quattro ProTM o programas de gestión de bases de datos tales como Microsoft AccessTM o ParadoxTM). Los programas para llevar a cabo, por ejemplo moduladores de control de la temperatura y reguladores del flujo de líquidos, opcionalmente son construidos por el experto en la materia utilizando un lenguaje de programación estándar, tal como Visual Basic, Fortran, Basic, Java o similar.

Las figuras 2 y 3 son esquemas que muestran ejemplos de sistemas representativo que incluyen un dispositivo lógico en el que pueden encontrarse realizados diversos aspectos de la presente invención. Tal como entenderá el experto en la materia a partir de las enseñanzas proporcionadas en la presente memoria, la invención se implementa opcionalmente en hardware y/o software. En algunas realizaciones, se implementan diferentes aspectos de la invención en lógica del lado del cliente o en lógica del lado del servidor. Tal como se entenderá en la técnica, la invención o componentes de la misma pueden encontrarse realizados en un componente programa multimedia (por ejemplo un componente multimedia fijo) que contiene instrucciones lógicas y/o datos que, al ser cargados en un dispositivo de informática configurado apropiadamente, causan que el dispositivo funcione según la invención. Tal como también se entenderá en la técnica, un medio fijo que contenga instrucciones lógicas puede proporcionarse a un usuario en un medio fijo para la carga física en el ordenador de un usuario o un medio fijo que contenga instrucciones lógicas puede residir en un servidor remoto al que accede un usuario a través de un medio de comunicación con el fin de descargar un componente del programa.

En particular, la figura 2 ilustra esquemáticamente el ordenador 200 al que se encuentran operablemente conectados el detector 202 y el componente de transferencia de líquidos 204. Opcionalmente, el detector 202 y/o el componente de transferencia de líquidos 204 se conectan operablemente a un ordenador 200 mediante un servidor (no mostrado en la figura 2). Durante el funcionamiento, el componente de transferencia de líquidos 204 típicamente transfiere líquidos, tal como alícuotas de muestra que comprenden amplicones marcados de N. gonorrhoeae y/o de

C. trachomatis, a la matriz de reactivos de detección de ácidos nucleicos 206, que comprende, por ejemplo, sondas oligonucleótidas, anticuerpos específicos de secuencia, etc., tal como se describe en la presente memoria, dispuestas ordenadamente sobre la misma. A continuación, el detector 202 típicamente detecta señales detectables (por ejemplo emisiones fluorescentes, etc.) producidas por los amplicones marcados que se hibridan con las sondas unidas a la matriz de reactivos de detección de ácidos nucleicos 206 después de la realización de una o más etapas de lavado para lavar los ácidos nucleicos no hibridados de la matriz de reactivos de detección de ácidos nucleicos 206 utilizando el componente de transferencia de líquidos 204. Tal como se muestra adicionalmente, el modulador térmico 208 también se encuentra operablemente conectador al ordenador 200. Antes de llevar a cabo un ensayo de hibridación, pueden amplificarse los ácidos nucleicos diana de N. gonorrhoeae y/o de C. trachomatis utilizando ácidos nucleicos cebadores marcados (por ejemplo cebadores que comprenden secuencias seleccionadas de entre SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60). Los amplicones de dichas reacciones de amplificación seguidamente se transfieren típicamente a una matriz de reactivos de detección de ácidos nucleicos 206 utilizando el componente de transferencia de líquidos 204, tal como se ha descrito anteriormente, para llevar a cabo el ensayo de unión. En algunas realizaciones, los ensayos de unión se llevan a cabo concurrentemente con la amplificación de ácidos nucleicos de N. gonorrhoeae y/o de C. trachomatis en el modulador térmico 208 utilizando, por ejemplo, balizas moleculares, sondas 5'-nucleasa o similares que comprenden secuencias seleccionadas de entre SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60. En dichas realizaciones, el detector 202 detecta las señales detectables producidas al llevarse a cabo las reacciones de amplificación utilizando el modulador térmico 208.

La figura 3 muestra esquemáticamente el dispositivo de información o dispositivo digital 300 que puede entenderse como un aparato lógico que puede leer instrucciones del puerto de medios 302 y/o de red 304, que opcionalmente puede conectarse a un servidor 306 que presente medios fijos 308. El dispositivo digital 308 seguidamente puede utilizar dichas instrucciones para dirigir al servidor o cliente lógico, tal como se entiende en la técnica, para realizar aspectos de la invención. Un tipo de aparato lógido que puede realizar la invención es un sistema informático tal como se ilustra en 300, que contiene una CPU 310, dispositivo de entrada opcionales 312 y 314, unidades de disco 316 y pantalla opcional 318. Los medios fijos 302 o medios fijos 308 en el puerto 304 pueden utilizarse para programar dicho sistema y pueden representar un medio óptico de tipo disco o magnético, cinta magnética, memoria dinámica o estática de estado sólido, o similar. En realizaciones específicas, la invención puede realizarse en su totalidad o en parte como programas registrados en dichos medios fijos. El puerto de comunicación 304 también puede utilizarse para recibir inicialmente instrucciones que se utilicen para programar dicho sistema y pueden representar cualquier tipo de conexión de comunicación. Opcionalmente, la invención se realiza en su totalidad o en parte dentro de los circuitos de un circuito integrado específico de aplicación (ACIS) o un dispositivo lógico programable (PLD). En dicho caso, la invenció puede realizarse en un lenguaje descriptivo comprensible para un ordenador, que puede utilizarse para crear un ASIC o PLD.

La figura 3 también incluye un sintetizador automático 320, que se encuentra operablemente conectado a un dispositivo digital 300 mediante un servidor 306. Opcionalmente, el sintetizador automático 320 se encuentra directamente conectado al dispositivo digital 300. Durante el funcionamiento, el sintetizador automático 320 típicamente recibe instrucciones para sintetizar uno o más cebadores o sondas que comprenden una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60 o complemento de las mismas, que se incluyen en una tabla de datos comprendida por, por ejemplo el dispositivo digital 300 y/o un medio legible por ordenador, tal como medios fijos 302 y/o 308.

XI. KITS

Los reactivos de detección de ácidos nucleicos utilizados en los métodos de la presente invención se empaquetan opcionalmente en kits. Tal como se describe en la presente memoria, los reactivos de detección de ácidos nucleicos de la invención se unen detectablemente a un ácido nucleico con una secuencia que consiste de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36, una variante sustancialmente idéntica de los mismos, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 1 ó 2 ó 36, o un complemento de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 36 ó la variante. Además, los kits también pueden incluir reactivos convenientemente empaquetados y materiales necesarios para la inmovilización, hibridación y/o detección del ADN, tales como soportes sólidos, tampones, enzimas y estándares de ADN, así como instrucciones para llevar a cabo el ensayo. Opcionalmente, los reactivos de detección de ácidos nucleicos (por ejemplo sondas oligonucleótidas, anticuerpos específicos de secuencia, etc.) de la invención se proporcionan ya unidos o de otro modo inmovilizados sobre soportes sólidos. A modo de otra opción, los reactivos de detección de ácidos nucleicos se proporcionan libres en solución en recipientes, por ejemplo para llevar a cabo los métodos de detección de la invención en la fase solución. En algunas de dichas realizaciones, los reactivos de detección de ácidos nucleicos de los kits comprenden marcajes y/o fracciones desactivadoras, tales como en el caso de que las balizas moleculares, sondas 5'-nucleasa o similares comprendan secuencias seleccionadas de entre SEC ID nº 3 a 27 y 37 a 60. En determinadas realizaciones, los kits incluyen además cebadores marcados para amplificar secuencias diana de N. gonorrhoeae y/o de C. trachomatis en una muestra.

El kit también incluye uno o más de entre: un conjunto de instrucciones para poner en contacto los reactivos de detección de ácidos nucleicos con ácidos nucleicos de una muestra o amplicones de los mismos y detectar la unión entre los reactivos de detección de ácidos nucleicos y los ácidos nucleicos de N. gonorrhoeae y/o de C. trachomatis, en caso de encontrarse, o por lo menos un recipiente para contener los reactivos de detección de ácidos nucleicos y el conjunto de instrucciones. Los soportes sólidos ejemplares incluidos en los kits de la invención se seleccionan opcionalmente de entre, por ejemplo, una placa, una placa de micropocillos, una perla, una microperla, un tubo (por ejemplo un microtubo, etc.), una fibra, una cerda, un peine, un chip de hibridación, una membrana, un cristal individual, una capa cerámica, una monocapa autoensamblante o similar.

En algunas realizaciones, el kit incluye además por lo menos un ácido nucleico cebador que es por lo menos parcialmente complementario a por lo menos un segmento de un ácido nucleico de N. gonorrhoeae, por ejemplo para amplificar un segmento del ácido nucleico de N. gonorrhoeae. En determinadas realizaciones, el kit también incluye uno o más cebadores para amplificar uno o más segmentos de un ácido nucleico de C. trachomatis. En estas realizaciones, el kit típicamente incluye además un conjunto de instrucciones para amplificar una o más subsecuencias de dichos ácidos nucleicos con los ácidos nucleicos cebadores, por lo menos un catalizador biológico incorporador de nucleótidos y uno o más nucleótidos. En determinadas realizaciones, los ácidos nucleicos cebadores comprenden por lo menos un marcaje (por ejemplo un pigmento fluorescente, un isótopo radioactivo, etc.). Los marcajes adecuados se describen en mayor detalle en la presente memoria. Por ejemplo, el ácido nucleico cebador se conjuga opcionalmente con biotina o con un derivado de biotina. En estas realizaciones, el kit típicamente incluye además un enzima conjugado con avidina o con un derivado de avidina, o estreptavidina o un derivado de estreptavidina, por ejemplo, para llevar a cabo la detección de la unión entre los reactivos de detección de ácidos nucleicos de la invención y los ácidos nucleicos diana. En estas realizaciones, el kit generalmente incluye además por lo menos un catalizador biológico incorporador de nucleótidos (por ejemplo una polimerasa, una ligasa o similar). En estas realizaciones, el kit típicamente también comprende además uno o más nucleótidos, por ejemplo para la utilización en la amplificación de los ácidos nucleicos diana. Opcionalmente, por lo menos uno de los nucleótidos comprende un marcaje. En algunas de dichas realizaciones, los kits incluyen además por lo menos una pirofosfatasa (por ejemplo una pirofosfatasa termoestable), por ejemplo utilizados para minimizar la pirofosforolisis y/o la uracilo N-glucosilasa (UNG) (por ejemplo una NG termoestable), por ejemplo para la utilización en aplicaciones en las que la protección frente a la contaminación cruzada resulta deseable.

XII. Ejemplos

Se entiende que los ejemplos y realizaciones descritos en la presente memoria se proporcionan únicamente a título ilustrativo y no pretenden limitar el alcance de la invención reivindicada.

Ejemplo I: DETECCIÓN DE N. GONORRHOEAE MEDIANTE LA REPETICIÓN DIRECTA 9 DE NEISSERIA GONORRHOEAE

Selección y síntesis de los cebadores oligonucleótidos específicos de la repetición directa 9 de Neisseria gonorrhoeae para el análisis de PCR

La repetición directa 9 de Neisseria gonorrhoeae (NGDR9) previamente había sido identificada como una secuencia de ADN de dos copias en el genoma de Neisseria gonorrhoeae. La secuencia de NGDR9 se obtuvo de la base de datos de enfermedades de transmisión sexual del Los Alamos National Laboratory a través de Internet en stdgen.lanl.gov/stdgen/bacteria/ngon/. La secuencia entera de 806 pares de bases de NGDR9 no presenta identidad sustancial con ninguna secuencia del genoma de Neisseria meningitidis, pero presenta una identidad de 36,85% con huecos (identidad de 44,4% sin huecos) con Brucella suis 1330 cromosoma I, sección 155 (número de acceso de GenBank® AE014469). La figura 4 ilustra una alineación de Clustal W de la secuencia de NGDR9 (SEC ID nº 1) con una parte de dicha secuencia de Brucella (SEC ID nº 34). Se escaneó la secuencia de NGDR9 para regiones de identidad de secuencia mínima con B. suis y se sintetizaron cebadores oligonucleótidos situados cadena arriba y abajo (NG519 (5'-CTCTCAATGCCCAATCATAAAGC-3' (SEC ID nº 5)) y un complemento de NG514 (es decir, 5'-GATAAAGCAGACGAAGCGGATAC-3' (SEC ID nº 24)), comprendiendo respectivamente una región de 190 pares de bases de NGDR9. Las unidades de desoxicitidilato en los extremos 3' de los dos cebadores se habían modificado para incluir grupos t-butil-bencilo tal como se describe en, por ejemplo, la patente US nº 6.001.611. Las posiciones de NG519 y NG514 en NGDR9 se encuentran subrayadas en la figura 4.

Las posiciones de otras parejas ejemplares de cebadores oligonucleótidos situados cadena arriba y abajo también se encuentran subrayadas en la figura 4. En particular, se muestra DK101 (5'-GTTTGGCGGCAAGCATCT-3' (SEC ID nº 7)) y DK102 (5'-AAATGGGATGCTGTCGTCAA-3' (SEC ID nº 8). La pareja de cebadores DK101 y un complemento de DK102 (es decir, 5'-TTGACGACAGCATCCCATTT-3' (SEC ID nº 25)) se diseñaron para amplificar una región de 416 pares de bases de NGDR9. También se sintetizaron los cebadores correspondientes a DK101 y el complemento de DK102, que incluía además los conectores de extremo 5' de sitio de restricción, es decir, HINDDK101 (5'-GGCAAGCTTGTTTGGCGGCAAGCATCT-3' (SEC ID nº 9), el sitio de restricción HindIII se encuentra subrayado) y BAMDK102 (5'-GGCGGATCCTTGACGACAGCATCCCATTT-3' (SEC ID nº 10); el sitio de restricción BamHI se encuentra subrayado). Se proporciona posteriormente una fotografía de un gel de agarosa que muestra la detección de N. gonorrhoeae utilizando dicha pareja de cebadores. DK103 (5’-AAACGCAATCTTCAAACACCTCA-3’ (SEC ID nº 11)) y DK104 (5’-TTTGACGGCCTCACGCAT-AA-3’ (SEC ID nº 12)) también se han subrayado en la figura 4. La pareja de cebadores DK103 y un complemento de DK104 (es decir, 5’-TTATGCGTGAGGCCGTCAAA-3’ (SEC ID nº 26)) se diseñaron para amplificar una región de 384 pares de bases de NGDR9.

Purificación de ADN genómico de Neisseria

La extracción del ADN genómico de diversas cepas de Neisseria se llevó a cabo utilizando el sistema de purificación de ADN PureGene® (Gentra Systems, Minneapolis, MN). Se cultivaron células bacterianas durante 48 horas en agar chocolate (Hardy Diagnostics, Santa Maria, CA) a 37ºC en 5% de CO2. Se rasparon las células de la superficie del agar, se resuspendieron en PBS y se centrifugaron a 13.000-16.000xg durante 5 segundos para peletizar las células. Se eliminó el sobrenadante mediante aspirado, dejando 10 a 20 ml de líquido residual. Se agitaron con vórtex las muestras vigorosamente para resuspender el pellet en el líquido residual. La extracción del ADN se llevó a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, se añadieron 300 ml de solución de lisis celular a las células resuspendidas y se pipetearon hacia arriba y hacia abajo para lisar las células. Tras la adición de 1,5 ml de solución de ARNasa A al lisado celular, las muestras se mezclaron mediante inversión de los tubos 25 veces y se incubaron durante 5 minutos a 37ºC. Las muestras se enfriaron a temperatura ambiente colocándolas sobre hielo durante 1 minuto. Se añadió un volumen de 100 ml de solución de precipitación de proteínas al lisado celular tratado con ARNasa y las muestras se mezclaron con vórtex vigorosamente a velocidad elevada durante 20 segundos. Se precipitaron los residuos de proteínas mediante centrifugación a 13.000-16.000xg durante 1 minuto. El sobrenadante que contenía las muestras de ADN se transfirió a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml limpios, conteniendo cada uno 300 ml de isopropanol al 100%. Se mezclaron las muestras mediante inversión suave de los tubos 50 veces y después se centrifugaron a 13.000-16.000xg durante 1 minuto. Se decantó el sobrenadante y se lavó el pellet con 300 ml de etanol al 70%. Los tubos se centrifugaron nuevamente a 13.000-16.000xg durante 1 minuto. Tras eliminar el sobrenadante, los tubos se drenaron mediante inversión y los pellets de ADN se resuspendieron en 50 ml de solución de hidratación. Se cuantificó el ADN genómico utilizando los reactivos de cuantificación de ADNdc PicoGreen (Molecular Probes, Eugene, OR) y el ADN resuspendido se almacenó a -20ºC hasta la utilización.

Amplificación de segmentos de NGDR9

Se llevaron a cabo reacciones separadas de PCR utilizando ADN genómico aislado a partir de varias especies de Neisseria como moldes y la pareja de cebadores, NG519 y el complemento de NG514 (tal como se ha descrito

anteriormente). Se llevaron a cabo PCRs en volúmenes de 100 ml que contenían tricina 50 mM (pH 8,3), K(OAc)2 80 mM (pH 7,5), Mn(OAc)2 2 mM (pH 6,5), dATP 50 mM, dGTP 50 mM, dCTP 50 mM, dUTP 100 mM, 20 U de ADN polimerasa ZO5 (Roche Molecular Systems, Alameda, CA), 5 U de UNG (uracil-N-glucosilasa) AmpErase®, 0,5 mM de cada cebador y 1 ng/ml de bromuro de etidio. Se añadió ADN genómico como molde a razón de 103 equivalentes 5 genómicos en cada reacción en el caso de Neisseria gonorrhoeae y de 106 equivalentes genómicos en cada reacción en el caso de Neisseria meningitidis y otras cepas de Neisseria. Las reacciones se llevaron a cabo durante 60 ciclos de desnaturalización a 95ºC durante 15 segundos, apareamiento a 58ºC durante 20 segundos y una extensión final a 72ºC durante 5 minutos utilizando un sistema de PCR COBAS TaqMan® (Roche Molecular Systems, Alameda, CA). También se llevaron a cabo reacciones separadas de PCR utilizando ADN genómico

10 aislado a partir de diversas especies de Neisseria como moldes y la pareja de cebadores HINDDK101 y BAMDK102 (descritos anteriormente), utilizando un procedimiento similar al descrito anteriormente para amplificar el segmento de 190 pares de bases de NGDR9.

Electroforesis en gel de agarosa analítica de productos de PCR

15 Se prepararon los productos de PCR para el análisis de electroforesis en gel mediante la adición de 20 ml de muestras de ADN a 8 ml de 10X tampón de carga de gel (pigmento azul de bromofenol al 0,025%, EDTA 100 mM y sacarosa al 30%). A continuación, las muestras se cargaron en carriles de un gel sumergido horizontalmente que contenía Nusieve al 3,0% (p/v), gel de agarosa al 0,5% (p/v) y bromuro de etidio 0,5 mg/ml en 1X tampón TB (Tris

20 0,089 M, ácido bórico 0,09 M, EDTA 2 mM, pH 8,0). El tampón de corrido de la electroforesis era 1X tampón TB que contenía bromuro de etidio 0,5 mg/ml. El gel se corrió a 95-100 V durante 1 hora, después se sacó y se visualizó en un transiluminador UV de longitud de onda larga. Los geles particulares se examinaron para la presencia o ausencia de productos de amplificación de PCR en los tamaños esperados de 190 ó 416 pb.

25 Las figuras 5A y B y 6A y B son fotografías de geles de agarosa que muestran la detección del segmento de 190 pares de bases de NGDR9, mientras que la figura 7 es una fotografía de un gel de agarosa que muestra la detección del segmento de 416 pares de bases de NGDR9.

Ejemplo II: ENSAYOS QUE ILUSTRAN LA DETECCIÓN SELECTIVA DE N. GONORRHOEAE

El presente ejemplo proporciona listas de organismos que se analizaron en ensayos que incluían la utilización de los ácidos nucleicos cebadores NG519 (que presenta una secuencia correspondiente a SEC ID nº 5) y NG514R (que presenta una secuencia correspondiente a SEC ID nº 24) y una sonda 5'-nucleasa (que presenta una secuencia correspondiente a SEC ID nº 18) solos o en combinación con cebadores de C. trachomatis. En particular, la

35 inclusividad (es decir, una medida de la capacidad de detectar el organismo diana, N. gonorrhoeae en muestras) de estos ensayos se ilustra en la Tabla IX.

TABLA IX

Género

Especie Número Cebadores Resultados

Neisseria

gonorrhoeae 108 CT/NG Todos positivos

40 La exclusividad (es decir, una medida de la capacidad de excluir los falsos positivos en el caso de que se encuentren presentes organismos Neisseriales de especies diferentes de gonorrhoeae en las muestras) de estos ensayos se ilustra en la Tabla X.

45 TABLA X:

Género

Especie Número Cebadores Resultados

Neisseria

animalis 3 CT/NG Todos negativos

Neisseria

caviae 2 " "

Neisseria

cinerea 6 " "

Neisseria

cuniculi 1 " "

Neisseria

denitrificans 2 " "

Neisseria

elongata 4 " "

Neisseria

flava 1 " "

Neisseria

flavescens 7 " "

Neisseria

kochi 1 " "

Neisseria

lactamica 6 " "

Neisseria

meningitidis 21 " "

Neisseria

mucosa 14 " "

Neisseria

perflava 6 " "

Neisseria

polysaccharea 3 " "

Neisseria

sicca 7 " "

Neisseria

subflava 1 " "

Neisseria

subflava biovar flava 1 " "

Neisseria

subflava biovar perflava 2 " "

Neisseria

subflava biovar subflava/flava 2 " "

Neisseria

subflava perflava 5 " "

Total

95 Todos negativos

La especificidad (es decir, una medida de la capacidad de excluir los falsos positivos en el caso de que se encuentren presentes organismos no Neisseriales en las muestras) de estos ensayos se ilustra en la Tabla XI.

TABLA XI

Género

Especie Número Cebadores Resultados

Chlamydia

trachomatis 15 NG Todos negativos

Chlamydia

pneumonae 1 " "

Chlamydia

psittaci 1 " "

Achromobacter

xerosis 1 " "

Acinetobacter

lwoffi 1 " "

Acinetobacter

calcoaceticus 1 " "

Acinetobacter

sp. genoespecie 3 1 " "

Actinomyces

isrealii 1 " "

Aerococcus

viridans 1 " "

Aeromonas

hydrophila 1 " "

Agrobacterium

radiobacter 1 "

Alcaligenes

faecalis 1 " "

Bacillus

thuringiensis 1 " "

Bacillus

subtilis 1 " "

Bacteriodes

fragilis 1 " "

Bacteroides

caccae 1 " "

Bifidobacillus

longum 1 " "

Bifidobacterium

adolescentis 1 " "

Branhamella

catarrhalis 1 " "

Brevibacterium

linens 1 " "

Candida

albicans 1 " "

Chromobacter Citrobacter

violaceum freundii 1 1 " " " "

Clostridium

innocuum 1 " "

Clostridium

perfringens 1 " "

Corynebacterium

genitalium 1 " "

Corynebacterium

xerosis 1 " "

Cryptococcus

neoformans 1 " "

Deinococcus

radiopugnans 1 " "

Derxia

gummosa 1 " "

Echerichia

coli 1 " "

Eikenella

corrodens 1 " "

Enterobacter

cloacae 1 " "

Enterococcus

avium 1 "

Enterococcus

faecalis 1 " "

Enterococcus

faecium 1 " "

Erysipelothrix

rhusiopathiae 1 " "

Ewingella

americana 1 " "

Flavobacterium

meningosepticum 1 " "

Gamella

haemolysans 1 " "

Gamella

morbillorum 1 " "

Gardnerella

vaginalis 1 " "

Haemophilus

influenzae 1 " "

Haemophilus

ducreyi 1 " "

Kingella

kingae 1 " "

Klebsiella

pneumoniae ss ozaenae 1 " "

Lactobacillus

oris 1 " "

Lactobacillus

vaginalis 1 " "

Lactobacillus

acidophillus 1 " "

Lactobacillus

breves 1 " "

Lactobacillus

crisptus 1 " "

Lactobacillus

lactis 1 " "

Lactobacillus

parabuchnerri 1 " "

Lactococcus

lactis cremoris 1 " "

Legionella

bozemanii 1 " "

Legionella

pneumophila 1 " "

Leuconostoc

paramesenteroides 1 " "

Micrococcus

luteus 1 " "

Moraxella

osloensis 1 " "

Morganella

morganii 1 " "

Mycobacterium

smegmatis 1 " "

Mycoplasma

hominis 1 " "

Serratia

denitrificans 1 " "

Pasteurella

maltocida 1 " "

Pediococcus

acidilactica 1 " "

Peptostreptococcus

magnums 1 " "

Peptostreptococcus

productus 1 " "

Prevotella

bivia 1 " "

Prevotella

corporis 1 " "

Prevotella

intermedia 1 " "

Propionibacterium

acnes 1 " "

Proteus

mirabilis 1 " "

Providencia

stuartii 1 " "

Pseudomonas

aeruginosa 1 " "

Pseudomonas

putida 1 " "

Rahnella

aquatilis 1 " "

Salmonella

minnesota 1 " "

Salmonella

typhimurium 1 " "

Serratia

marscence 1 " "

Staphylococcus

aureus 1 " "

Staphylococcus

epidermidis 1 " "

Streptococcus

salivarius 1 " "

Streptococcus

agalactiae 1 " "

Streptococcus

anginosus 1 " "

Streptococcus

bovis 1 " "

Streptococcus

dysgalatia 1 " "

Streptococcus

equinis 1 " "

Streptococcus

pneumoniae 1 " "

Streptococcus

pyogenes 1 " "

Vibrio

parahaemolyticus 1 " "

Yersinia

enterocolitica 1 " "

Treponema

pallidum 1 " "

Virus 1 herpes simplex

1 " "

Virus 2 herpes simplex

1 " "

Virus de Epstein-Barr

1 " "

Virus del papiloma humano tipo 16

1 " "

Virus del papiloma humano tipo 18

1 " "

Total

111 Todos negativos

EJEMPLO III: DETECCIÓN DE N. GONORRHOEAE MEDIANTE LA REPETICIÓN DIRECTA 33 DE NEISSERIA GONORRHOEAE

Selección y síntesis de los cebadores oligonucleótidos específicos de la repetición directa 33 de Neisseria gonorrhoeae para el análisis de PCR

La repetición directa 33 de Neisseria gonorrhoeae (NGDR33) previamente había sido identificada como una secuencia de ADN de dos copias en el genoma de Neisseria gonorrhoeae. La secuencia de NGDR33 se obtuvo de la base de datos de enfermedades de transmisión sexual del Los Alamos National Laboratory a través de Internet en stdgen.lanl.gov/stdgen/bacteria/ngon/. Una búsqueda de homología BLAST de NGDR33 reveló numerosas correspondencias significativas con Neisseria meningitidis y la secuencia entera de 1.142 pares de bases de NGDR33 presentaba una identidad de 38,09% con huecos (50,44% sin huecos) con N. meningitidis serogrupo B, cepa MC58, sección 77 (número de acceso de Genbank® AE002435). La figura 8 ilustra una alineación de Clustal W de la secuencia de NGDR33 (SEC ID nº 2) con una parte de dicha secuencia de N. meningitidis (SEC ID nº 35). Se escaneó la secuencia de NGDR33 para regiones de identidad de secuencia mínima con N. meningitidis, y se sintetizaron cebadores oligonucleótidos situados cadena arriba y abajo (NG613 (5’-AATGTCGGGTTTGACGAAACTC-3’ (SEC ID nº 15)) y un complemento de NG614 (es decir, 5’-AACGTCCGACAACCGGTAAC-3’ (SEC ID nº 27)), respectivamente, comprendiendo una región de 265 pares de bases de NGDR33. Las posiciones de NG613 y NG614 se encuentran subrayadas en la figura 8. Las unidades de desoxicitidilato en los extremos 3' de ambos cebadores han sido modificadas, tal como se ha indicado anteriormente, para que incluyan grupos t-butil-bencilo.

Purificación, amplificación y electroforesis en gel de agarosa analítica de ADN genómico de Neisseria

Se purificó el ADN genómico de diversas especies de Neisseria tal como se ha descrito anteriormente, en el Ejemplo

1. Se llevaron a cabo reacciones de PCR separadas utilizando ADN genómico aislado a partir de diversas especies de Neisseria como moldes y la pareja de cebadores NG613 y el complemento de NG614 (descritos anteriormente), utilizando un procedimiento similar al descrito anteriormente y utilizado para amplificar el segmento de 190 pares de bases de NGDR9. Además, los productos de PCR de dichas reacciones de amplificación se separaron por electroforesis tal como se ha descrito anteriormente, en el Ejemplo 1. Los geles se examinaron para la presencia o ausencia de productos de amplificación de PCR en el tamaño esperado de 265 pb. Las figuras 9A y B, y la figura 10 son fotografías de geles de agarosa que muestran la detección de este segmento de 265 pares de bases de NGDR33.

EJEMPLO IV: DETECCIÓN DE N. GONORROHEAE / C. TRACHOMATIS EN MUESTRAS CL�?NICAS

El presente ejemplo profético describe un protocolo para la detección de N. gonorrhoeae y C. trachomatis en muestras clínicas.

Muestras clínicas

Se recogieron especímenes de torundas endocervicales de mujeres y especímenes de torundas uretrales de hombres siguiendo procedimientos estándares conocidos de la técnica. Las torundas se inocularon en medio de transporte de cultivo adecuado (por ejemplo 2SP, M-4 (Microtest, Inc., Atlanta, GA)), medio clamidial de Bartel (Intracel Corp., Issaquah, WA), etc.) que después se utilizó para el análisis de PCR (ver también Van der Pol et al. J. Clin. Microbiol. 38:1105-1112, 2000). Dichos especímenes generalmente se almacenan a una temperatura de entre 2ºC y 8ºC y típicamente se transportan al laboratorio en las 24 a 72 horas posteriores a la recolección. Los especímenes típicamente se agitan con vórtex con la torunda todavía dentro del tubo; se inoculan los cultivos celulares y una alícuota de cada espécimen se transfiere a un tubo nuevo, que generalmente se almacena a una temperatura de entre 2ºC y 8ºC durante un máximo de 7 días después de la recolección y después se procesan para el análisis de PCR.

Opcionalmente, también se recogen alícuotas de 50 ml de la primera orina procedente tanto de hombres como de mujeres. Los especímenes de orina femenina se recogen antes o después de la recolección de las torundas. Los especímenes de orina masculina se recogen después de la obtención de los especímenes de torunda uretral. Los especímenes de orina típicamente se almacenan a temperatura ambiente y se transportan al laboratorio dentro de las 24 horas posteriores o se almacenan a una temperatura, por ejemplo, de entre 2ºC y 8ºC si no se transportan dentro de las 24 horas posteriores a la recolección. Tras su llegada al laboratorio, típicamente se almacena una alícuota de 500 ml a una temperatura de entre 2ºC y 8ºC durante un máximo de 7 días desde el momento de la recolección hasta su procesamiento para el análisis de PCR.

Análisis de PCR

Cada espécimen típicamente se procesa y se somete a ensayos AMPLICOR® y COBAS AMPLICOR® tal como se describe en los prospectos del fabricante en el paquete. Para cada espécimen procesado, los ADNs diana de C. trachomatis, de N. gonorrhoeae y de control interno (IC) se amplifican simultáneamnete en una única mezcla de reacción que contiene por lo menos dos parejas de cebadores, por lo menos una pareja específica para C. trachomatis y por lo menos una pareja específica para N. gonorrhoeae (que comprende, por ejemplo, por lo menos una secuencia seleccionada de entre SEC ID nº 3 a 27). Los productos de amplificación resultantes generalmente

se capturan separadamente y se detectan colorimétricamente mediante hibridación en placas de micropocillos (formato AMPLICOR®) (Crotchfelt et al., "Detection of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis in genitourinary specimens from men and women by a coamplification PCR assay", J. Clin. Microbiol. 35:1536-1540, 1997) o en micropartículas magnéticas (formato de COBAS AMPLICOR®) recubiertas con sondas oligonucleótidas específicas de N. gonorrhoeae (comprendiendo, por ejemplo, secuencias seleccionadas de entre SEC ID nº 3 a 27), de C. trachomatis y específicos del IC. El analizador COBAS AMPLICOR® lleva a cabo automáticamente todas las etapas de amplificación, hibridación y detección (DiDomenico et al., "COBAS AMPLICORTM: a fully automated RNA and DNA amplification and detection system for routine diagnostic PCR", Clin. Chem. 42:1915-1923, 1996; Jungkind et al., "Evaluation of automated COBAS AMPLICOR PCR system for detection of several infectious agents and its impact on laboratory management", J. Clin. Microbiol. 34:2778-2783, 1996). En el formato AMPLICOR®, se lleva a cabo la amplificación con, por ejemplo, un sistema de PCR por ciclado térmico GeneAmp® modelo 9700 (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) y la hibridación y detección se llevan a cabo manualmente (Loeffelholz et al., "Detection of Chlamydia trachomatis in endocervical specimens by polymerase chain reaction", J. Clin. Microbiol. 30:2847-2851, 1992).

Análisis de los datos

Los especímenes que rinden señales a un nivel superior a un valor de corte positivo (densidad óptica [DO] de 2,0 (A660) para C. trachomatis y DO de 3,5 (A660) para N. gonorrhoeae) típicamente se interpretan como positivas para el organismo particular, con independencia del resultado del IC. Los especímenes que rinden señales de N. gonorrhoeae o de C. trachomatis a un nivel inferior a un valor de corte negativo (por ejemplo una DO de 0,2) típicamente se interpretan como negativas para el organismo particular, con la condición de que la señal de IC sea superior al valor de corte asignado (por ejemplo una DO de 0,2) y el ensayo se considere válido. Los especímenes que rinden señales de N. gonorrhoeae o de C. trachomatis a un nivel inferior a valores de corte para tanto N. gonorrhoeae o C. trachomatis e IC se interpretan generalmente como inhibidores. Los especímenes inhibidores típicamente se someten a ensayo nuevamente mediante procesamiento de una alícuota congelada del espécimen original. Los resultados del ensayo de repetición se clasifican utilizando los criterios anteriormente indicados.

Los especímenes que rinden resultados entre los valores de corte negativo y positivo (N.

�0,2, <3,� para gonorrhoeae y �0,2, <2,0 para C. trachomatis) típicamente se consideran ambiguos para el organismo particular, con independencia de la señal del IC. Los resultados ambiguos generalmente se resuelven mediante procesamiento de una alícuota del espécimen original, sometiendo a ensayo nuevamente por duplicado y comparando los resultados con el ensayo inicial. Estos especímenes típicamente se interpretan como positivos para el organismo particular en el caso de que por lo menos dos ensayos válidos proporcionen una DO de N. gonorrhoeae o de C. trachomatis �2,0 para el organismo particular. Dichos especímenes generalmente se interpretan como negativos para el organismo particular en el caso de que dos ensayos de repetición proporcionen señales de DO de N. gonorrhoeae o de C. trachomatis de <0,2 para el organismo particular, con la condición de que las señales del IC sean de valor superior al valor de corte asignado. En el caso de que los dos ensayos de repetición rindan una DO de N. gonorrhoeae o de C. trachomatis <0,2 para el organismo particular y la señal del IC sea inferior al valor de corte asignado para cualquiera de los ensayos de repetición por duplicado, el espécimen generalmente se interpreta como inhibidor.

EJEMPLO V: DETECCIÓN DE N. GONORRHOEAE A PARTIR DE LA VARIANTE DE LA REPETICIÓN DIRECTA 9

DE NEISSERIA GONORRHOEAE

Selección y síntesis de oligonucleótidos NGDR9Var para el análisis de PCR

Tal como se describe en el Ejemplo 1, la repetición directa 9 de Neisseria gonorrhoeae (NGDR9) previamente había sido identificada como una secuencia de ADN de dos copias en el genoma de Neisseria gonorrhoeae. Se confirmó posteriormente que era una secuencia de ADN de 3 copias. Sin embargo, durante los ensayos de inclusividad de un ensayo de NG prototipo con cebadores NGDR9, no se amplificaron 4 cepas de N. gonorrhoeae (incluyendo la cepa NG889) aisladas a partir de muestras clínicas. El análisis de secuencias posterior del ADN genómico de la cepa NG889 reveló la presencia de 3 copias idénticas de una secuencia variante (NGDR9Var), con apareamientos incorrectos significativos dentro de la región diana de NGDR9 que impedían la amplificación con los cebadores NG519 (SEC ID nº 5) y NG514 (SEC ID nº 24). La secuencia NGDR9Var de 727 pares de bases (SEC ID nº 36) no presenta identidad alguna con ninguna secuencia del genoma de Neisseria meningitidis pero presenta una identidad global de 70% con la secuencia NGDR9 (SEC ID nº 1). Se escaneó la secuencia NGDR9Var para la máxima identidad de secuencia con las secuencias variantes procedentes de las cepas de N. gonorrhoeae adicionales, y se sintetizaron los cebadores oligonucleótidos cadena arriba y cadena abajo NG579 (5'-GTTTCGACAGGCTTGCGAA3') (SEC ID nº 38) y NG552 (5'-CCTGTTTGCGACAAAGAGGA-3') (SEC ID nº 40) que comprendían una región de 215 pb de NGDR9Var. La base desoxiadenosian en los extremos 3' de los dos cebadores se habían modificado para incluir grupos t-butil-bencilo tal como se describe en, por ejemplo, la patente US nº 6.001.611. Las posiciones de NG519 y NG552 en NGDR9Var se encuentran subrayadas en la figura 11.

Amplificaicón del segmento de 215 pb de NGDR9Var Se llevaron a cabo reacciones separadas de PCR utilizando ADN genómico aislado a partir de varias especies de

Neisseria (descritas en el Ejemplo 1) como moldes y la pareja de cebadores NG519 y NG552 (tal como se ha descrito anteriormente). Se llevaron a cabo PCRs en volúmenes de 100 ml que contenían tricina 50 mM (pH 8,3), K(OAc)2 80 mM (pH 7,5), Mn(OAc)2 1 mM (pH 6,5), glicerol al 5%, Mg(OAc)2 1 mM (pH 6,5), dATP 50 mM, dGTP 50 mM, dCTP 50 mM, dUTP 100 mM, 20 U de ADN polimerasa ZO5® (Roche Molecular Systems, Alameda, CA), 5 U de UNG (uracil-N-glucosilasa) AmpErase® y 0,5 mM de cada cebador. Se añadió ADN genómico como molde a razón de 103 equivalentes genómicos en cada reacción en el caso de Neisseria gonorrhoeae y de 106 equivalentes genómicos en cada reacción en el caso de Neisseria meningitidis y otras cepas de Neisseria. Las reacciones se llevaron a cabo durante 60 ciclos de desnaturalización a 95ºC durante 15 segundos, apareamiento a 58ºC durante 40 segundos y una extensión final a 72ºC durante 5 minutos utilizando un sistema de PCR COBAS TaqMan® (Roche Molecular Systems, Alameda, CA).

Electroforesis analítica en gel de agarosa de productos de PCR de NGDR9Var

Los productos de PCR se prepararon para el análisis de electroforesis en gel tal como se describe en el Ejemplo 1. Los geles se examinaron para la presencia o ausencia de productos de amplificación de PCR en el tamaño esperado de 215 pb.

Las figuras 12A y 12B son fotografías de geles de agarosa que muestran la detección de un segmento de 215 pares de bases de NGDR9Var.

EJEMPLO VI: DETECCIÓN DE N. GONORRHOEAE MEDIANTE LA REPETICIÓN DIRECTA 9 DE NEISSERIA GONORRHOEAE

Selección y síntesis de oligonucleótidos NGDR9Univ para el análisis de PCR

Con el fin de utilizar un único conjunto de oligonucleótidos para la amplificación y detección simultáneas de las secuencias de NGDR9 y NGDR9Var, se escanearon ambas secuencias para las regiones de máxima identidad de secuencia y se sintetizaron los oligonucleótidos cadena arriba y cadena abajo de la secuencia de consenso NGSU2 (5'-GCGGCAAGCATCTGTTTTGC-3') (SEC ID nº 47) y NG552 (5'-AGTAGCAGGCGCGAAGATTGA-3') (SEC ID nº 49), que comprendían una región de 473 pares de bases de NGDR9 y una región de 394 pares de bases de NGDR9Var. Las bases desoxicitosina y desoxiadenosina en los extremos 3' de los cebadores NGSU2 y NGSL2, respectivamente, se habían modificado para incluir grupos t-butil-bencilo tal como se describe en, por ejemplo, la patente US nº 6.001.611. Las posiciones de NGSU2 y NGSL2 en NGDR9 y NGDR9Var se encuentran subrayadas en la figura 11.

Se llevaron a cabo reacciones separadas de PCR utilizando ADN genómico aislado a partir de varias especies de Neisseria (descritas en el Ejemplo 1) como moldes y la pareja de cebadores NGSU2 y NGSL2 (descritas anteriormente). Se llevaron a cabo PCRs en volúmenes de 100 ml que contenían tricina 50 mM (pH 8,3), K(OAc)2 80 mM (pH 7,5), Mn(OAc)2 1 mM (pH 6,5), glicerol al 5%, Mg(OAc)2 1 mM (pH 6,5), dATP 50 mM, dGTP 50 mM, dCTP 50 mM, dUTP 100 mM, 20 U de ADN polimerasa ZO5® (Roche Molecular Systems, Alameda, CA), 5 U de UNG (uracil-N-glucosilasa) AmpErase® y 0,5 mM de cada cebador. Se añadió ADN genómico como molde a razón de 103 equivalentes genómicos en cada reacción en el caso de Neisseria gonorrhoeae y de 106 equivalentes genómicos en cada reacción en el caso de Neisseria meningitidis y otras cepas de Neisseria. Las reacciones se llevaron a cabo durante 60 ciclos de desnaturalización a 95ºC durante 15 segundos, apareamiento a 58ºC durante 40 segundos y una extensión final a 72ºC durante 5 minutos utilizando un sistema de PCR COBAS TaqMan® (Roche Molecular Systems, Alameda, CA).

Electroforesis analítica en gel de agarosa de productos de PCR de NGDR9Univ Los productos de PCR se prepararon para el análisis de electroforesis en gel tal como se describe en el Ejemplo 1. Los geles se examinaron para la presencia o ausencia de productos de amplificación de PCR en los tamaños esperados, de 473 pb para NGDR9 y de 394 pb para NGDR9Var.

Las figuras 13A y B son fotografías de geles de agarosa que muestran la detección de un segmento de 473 pares de bases de NGDR9 y de un segmento de 394 pares de bases de NGDR9Var.

EJEMPLO VII: ENSAYOS QUE ILUSTRAN LA DETECCIÓN SELECTIVA DE N. GONORRHOEAE CON CEBADORES NGDR9VAR El presente ejemplo proporciona listas de organismos que se analizaron en ensayos que incluían la utilización de los ácidos nucleicos cebadores NG519 (SEC ID nº 38) y NG552 (SEC ID nº 40) y una sonda 5'-nucleasa (que presenta una secuencia correspondiente a SEC ID nº 42) solos o en combinación con cebadores de C. trachomatis.

La inclusividad (es decir, una medida de la capacidad de detectar el organismo diana, N. gonorrhoeae en muestras) de estos ensayos se ilustra en la Tabla XII.

TABLA XII

Género

Especie Número sometido a ensayo Cebadores Número que era positivo

Neisseria

gonorrhoeae 538 NGDR9Var 62

La exclusividad (es decir, una medida de la capacidad de excluir los falsos positivos en el caso de que se encuentren presentes organismos Neisseriales de especies diferentes de gonorrhoeae en las muestras) de estos ensayos se ilustra en la Tabla XIII.

TABLA XIII

Género

Especie Número Cebadores Resultados

Neisseria

animalis 3 NGDR9Var Negativo

Neisseria

caviae 2 " "

Neisseria

cinerea 5 " "

Neisseria

cuniculi 1 " "

Neisseria

denitrificans 2 " "

Neisseria

elongata 5 " "

Neisseria

flava 1 " "

Neisseria

flavescens 7 " "

Neisseria

kochi 1 " "

Neisseria

lactamica 6 " "

Neisseria

meningitidis 24 " "

Neisseria

mucosa 14 " "

Neisseria

perflava 6 " "

Neisseria

polysaccharea 3 " "

Neisseria

sicca 7 " "

Neisseria

subflava 1 " "

Neisseria

subflava biovar flava subflava biovar 1 " "

Neisseria

subflava/flava 3 " "

Neisseria

subflava perflava 7 " "

Total

99

10 La especificidad (es decir, una medida de la capacidad de excluir los falsos positivos en el caso de que se encuentren presentes organismos no Neisseriales en las muestras) de estos ensayos se ilustra en la Tabla XIV.

TABLA XIV

Género

especie Número Cebadores Resultados

Chlamydia

trachomatis 15 NGDR9 Var Negativo

Chlamydia

pneumoniae 1 " "

Chlamydia

psittaci 1 " "

Achromobacter

xerosis 1 " "

Acinetobacter

lwoffi 1 " "

Acinetobacter

calcoaceticus 1 " "

Actinomyces

isrealii 1 " "

Aerococcus

viridans 1 " "

Aeromonas

hydrophila 1 " "

Agrobacterium

radiobacter 1 " "

Alcaligenes

faecalis 1 " "

Bacillus

thuringiensis 1 " "

Bacillus

subtilis 1 " "

Bacteriodes

fragilis 1 " "

Bacteroides

caccae 1 " "

Bifidobacillus

longum 1 " "

Bifidobacterium

adolescentis 1 " "

Branhamella

catarrhalis 1 " "

Brevibacterium

linens 1 " "

Candida

albicans 1 " "

Chromobacter

violaceum 1 " "

Citrobacter

freundii 1 " "

Clostridium

innocuum 1 " "

Clostridium

perfringens 1 " "

Corynebacterium

genitalium 1 " "

Corynebacterium

xerosis 1 " "

Cryptococcus

neoformans 1 " "

Echerichia

coli 1 " "

Eikenella

corrodens 1 " "

Enterobacter

cloacae 1 " "

Enterococcus

avium 1 " "

Enterococcus

faecalis 1 " "

Enterococcus

faecium 1 " "

Erysipelothrix

rhusiopathiae 1 " "

Ewingella

americana 1 " "

Flavobacterium

meningosepticum 1 " "

Gamella

morbillorum 1 " "

Gardnerella

vaginalis 1 " "

Haemophilus

influenzae 1 " "

Haemophilus

ducreyi 1 " "

Kingella

kingae 1 " "

Klebsiella

pneumoniae ss ozaenae 1 " "

Lactobacillus

oris 1 " "

Lactobacillus

vaginalis 1 " "

Lactobacillus

acidophillus 1 " "

Lactobacillus

brevis 1 " "

Lactobacillus

parabuchnerri 1 " "

Legionella

bozemanii 1 " "

Legionella

pneumophila 1 " "

Leuconostoc

paramesenteroides 1 " "

Micrococcus

luteus 1 " "

Moraxella

osloensis 1 " "

Morganella

morganii 1 " "

Mycobacterium

smegmatis 1 " "

Mycoplasma

hominis 1 " "

Serratia

denitrificans 1 " "

Pasteurella

maltocida 1 " "

Peptostreptococcus

magnus 1 " "

Peptostreptococcus

productus 1 " "

Prevotella

bivia 1 " "

Prevotella

corporis 1 " "

Prevotella

intermedia 1 " "

Propionibacterium

acnes 1 " "

Proteus

mirabilis 1 " "

Providencia

stuartii 1 " "

Pseudomonas

aeruginosa 1 " "

Pseudomonas

putida 1 " "

Salmonella

minnesota 1 " "

Salmonella

typhimurium 1 " "

Serratia

marcescens 1 " "

Staphylococcus

aureus 1 " "

Staphylococcus

epidermidis 1 " "

Streptococcus

salivarius 1 " "

Streptococcus

agalactiae 1 " "

Streptococcus

bovis 1 " "

Streptococcus

dysgalatia 1 " "

Streptococcus

equis 1 " "

Streptococcus

pneumoniae 1 " "

Streptococcus

pyogenes 1 " "

Vibrio

parahaemolyticus 1 " "

Yersinia

enterocolitica 1 " "

Treponema

pallidum 1 " "

Virus 1 herpes simplex

1 " "

Virus 2 herpes simplex

1 " "

Virus de Epstein-Barr

1 " "

Virus del papiloma humano tipo 16

1 " "

Virus del papiloma humano tipo 18

1 " "

Total

100

Aunque la invención ha sido descrita en cierto detalle con fines de claridad y comprensión, resultará evidente para el experto en la materia a partir de una lectura de la presente exposición que pueden llevarse a cabo diversos cambios de forma y detalle sin apartarse del alcance real de la invención. Por ejemplo, todas las técnicas y aparatos

5 indicados anteriormente pueden utilizarse en diversas combinaciones.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> ROCHE DIAGNOSTICS GMBH 10 F. HOFFMANN-LA ROCHE AG

<120> REACTIVOS Y MÉTODOS PARA DETECTAR NEISSERIA GONORRHOEAE

<130> 24326 EP-HS

<140> 11/873,324

<141> 2007-10-16

<150> 11/017,476 20 <151> 2004-12-17

<160> 67

<170> PatentIn Ver. 3.3

<210> 1

<211> 806

<212> ADN

<213> Neisseria gonorrhoeae

<400> 1

<210> 2

<211> 1142 35 <212> ADN

<213> Neisseria gonorrhoeae

<400> 2

<210> 3

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético

<400> 3 cgttctctca atgcccaatc a 21

<210> 4

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético

<400> 4 agcagacgaa gcggatacct c 21

<210> 5

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético

<400> 5 ctctcaatgc ccaatcataa agc 23

<210> 6

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético

<400> 6 gtatccgctt cgtctgcttt atc 23

<210> 7

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético

<400> 7 gtttggcggc aagcatct 18

<210> 8

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético

<400> 8 aaatgggatg ctgtcgtcaa 20

<210> 9

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético

<400> 9 ggcaagcttg tttggcggca agcatct 27

<210> 10

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético

<400> 10 ggcggatcct tgacgacagc atcccattt 29

<210> 11

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético

<400> 11 aaacgcaatc ttcaaacacc tca 23

<210> 12

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético

<210> 32

<211> 405

<212> ADN

<213> Neisseria gonorrhoeae

<400> 12 tttgacggcc tcacgcataa 20

<210> 33

<211> 20

<212> ADN

<213> Neisseria gonorrhoeae

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético

<400> 13 tcaatgtcgg gtttgacgaa 20

<210> 14

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético

<400> 14 aacgtccgac aaccggtaac 20

<210> 15

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético

<400> 15 aatgtcgggt ttgacgaaac tc 22

<210> 16

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético

<400> 16 gttaccggtt gtcggacgtt 20

<210> 17

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético

<400> 17 cgaggtcgcc gaatttaaat tgatagtt 28

<210> 18

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético

<400> 18 aactatcaat ttaaattcgg cgacctcg 28

<210> 19

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético

<400> 19 cgaggtcgcc gaatttaaat tgatagttca 30

<210> 20

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético

<400> 20 tgaactatca atttaaattc ggcgacctcg 30

<210> 21

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético

<400> 21 gcggcaatca gggcaatatg gtat 24

<210> 22

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético

<400> 22 ataccatatt gccctgattg ccgc 24

<210> 23

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético

<400> 23 ggcggcaatc agggcaatat ggtat 25

<210> 24

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético

<400> 24 gataaagcag acgaagcgga tac 23

5 <210> 25

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético

<400> 25 ttgacgacag catcccattt 20

<210> 26

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético

<400> 26 25 ttatgcgtga ggccgtcaaa 20

<210> 27

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético

35 <400> 27 aacgtccgac aaccggtaac 20

<210> 28

<211> 405

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: secuencia sintética de consenso

<400> 28

<210> 29

<211> 370

<212> ADN

<213> Neisseria gonorrhoeae

<400> 29

<210> 30

<211> 375

<212> ADN

<213> Neisseria gonorrhoeae

<400> 30

<210>

31 10 <211> 400

<212> ADN

<213> Neisseria gonorrhoeae

<211> 405

<212> ADN

<213> Neisseria gonorrhoeae

<400> 32

<210>

33 25 <211> 405

<212> ADN

<213> Neisseria gonorrhoeae

<210> 34

<211> 11498

<212> ADN

<213> Brucella suis

<400> 34

<210> 35

<211> 11133

<212> ADN

<213> Neisseria meningitidis

<400> 35

<210> 36

<211> 727

<212> ADN

<213> Neisseria gonorrhoeae

<400> 36

10 <210> 37

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador sintético

<400> 37 gtttcgacag gcttgcgaac 20

<210> 38

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador sintético

<400> 38 30 gtttcgacag gcttgcgaa 19

<210> 39

<211> 19

<212> ADN 35 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador sintético

<400> 39 tttgttgttg ccgtttgca 19

<210> 40

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador sintético

<400> 40 cctgtttgcg acaaagagga 20

<210> 41

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador sintético

<400> 41 tgcgacaaag aggattccaa 20

<210> 42

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: sonda sintética

<400> 42 ttcccgcgcc tgcctgattc cta 23

<210> 43

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: sonda sintética

<400> 43 acatccgcac cgtaggaatc aggca 25

<210> 44

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: sonda sintética

<400> 44 aatcccgaca tccgcaccgt aggaatca 28

<210> 45

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: sonda sintética

<400> 45 aatcccgaca tccgcaccgt aggaat 26

<210> 46

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador sintético

<400> 46 cgtttggcgg caagcatc 18

<210> 47

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador sintético

<400> 47 gcggcaagca tctgttttgc 20

<210> 48

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador sintético

<400> 48 gtagcaggcg cgaagattga a 21

<210> 49

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador sintético

<400> 49 agtagcaggc gcgaagattg a 21

<210> 50

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador sintético

<400> 50 gggcggaaga atttgcagat ta 22

<210> 51

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador sintético

<400> 51 gccatcagaa aagcgattga aa 22

<210> 52

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador sintético

<400> 52 ggacaaaacc gccatcagaa a 21

<210> 53

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: sonda sintética

<400> 53 taatctgcaa attcttccgc ccttcaatct t 31

<210> 54

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: sonda sintética

<400> 54 tttatctaat ctgcaaattc ttccgccctt ca 32

<210> 55

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: sonda sintética

<400> 55 caaattcttc cgcccttcaa tcttcgc 27

<210> 56

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: sonda sintética

<400> 56 cttcaatctt cgcgcctgct acttgcc 27

<210> 57

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: sonda sintética

<400> 57 aagattgaag ggcggaagaa tttgcagatt a 31

5 <210> 58

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<223> Descripción de secuencia artificial: sonda sintética

<400> 58 gcgaagattg aagggcggaa gaatttg 27

<210> 59

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador sintético

<400> 59 25 tcagggcttc gtcttccga 19

<210> 60

<211> 20

<212> ADN 30 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador sintético

35 <400> 60 tttaaagcct cgttccgcaa 20

<210> 61

<211> 727 40 <212> ADN

<213> Neisseria gonorrhoeae

<400> 61

45 <210> 62

<211> 711

<212> ADN

<213> Neisseria gonorrhoeae

50 <400> 62

<210> 63

<211> 647

<212> ADN

<213> Neisseria gonorrhoeae

<400> 63

<210>

64 10 <211> 727

<212> ADN

<213> Neisseria gonorrhoeae

<210> 65

<211> 806

<212> ADN

<213> Neisseria gonorrhoeae

<400> 65

<210> 66

<211> 800

<212> ADN

<213> Neisseria gonorrhoeae

<400> 66

<210>

67 10 <211> 806

<212> ADN

<213> Neisseria gonorrhoeae

<400> 67

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Oligonucleótido que comprende un ácido nucleico que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45 o un complementos de las mismas, presentando el oligonucleótido entre 10 y 50 nucleótidos.

2. 2.

   Oligonucleótido según la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico presenta una identidad de secuencia de por lo menos 95% respecto a una de entre SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45 ó el complemento de las mismas.

3. 3.

   Oligonucleótido según la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido comprende por lo menos un nucleótido modificado.

4. 4.

   Oligonucleótido según la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido comprende por lo menos un marcaje y/o por lo menos una fracción desactivadora.

5. 5.

   Método para detectar Neisseria gonorrhoeae en una muestra, comprendiendo el método:

   (a)

   poner en contacto ácidos nucleicos de la muestra con por lo menos una primera pareja de ácidos nucleicos, comprendiendo dichos ácidos nucleicos cebadores por lo menos un ácido nucleico seleccionado de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45, una variante sustancialmente idéntica de los mismos, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45, y complementos de los SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45 y la variante, en por lo menos una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, y

   (b)

   detectar los ácidos nucleicos y/o uno o más amplicones de los mismos de la reacción de amplificación de ácidos nucleicos durante o después de (a), detectando de esta manera Neisseria gonorrhoeae en la muestra.

6. 6.

   Método según la reivindicación 5, en el que (a) comprende poner en contacto los ácidos nucleicos de la muestra con por lo menos una segunda pareja de ácidos nucleicos cebadores capaces de hibridarse con un ácido nucleico de Chlamydia trachomatis, y (b) comprende detectar uno o más amplicones adicionales de la reacción de amplificación de ácidos nucleicos durante o después de (a), detectando de esta manera Chlamydia trachomatis en la muestra.

7. 7.

   Método según la reivindicación 5, en el que (b) comprende realizar un seguimiento de la unión entre los amplicones y uno o más reactivos de detección de ácidos nucleicos que se unen detectablemente a un ácido nucleico con una secuencia que consiste de SEC ID nº 36, una variante sustancialmente idéntica a la misma en la que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a SEC ID nº 36, o un complemento de SEC ID nº 36 ó la variante.

8. 8.

   Método según la reivindicación 7, en el que por lo menos uno de los reactivos de detección de ácidos nucleicos comprende un ácido nucleico que presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45, una variante sustancialmente idéntica de los mismos, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45, y complementos de los SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45 y la variante.

9. 9.

   Kit, que comprende:

   (a)

   por lo menos un oligonucleótido que presenta entre 10 y 50 nucleótidos, comprendiendo el oligonucleótido por lo menos un ácido nucleico seleccionado de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45, una variante sustancialmente idéntica de los mismos, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 37 a 38y 40 a 45, y complementos de los SEC ID nº 37a 38 y 40 a 45 y lavariante, y uno o más de entre:

   (b)

   instrucciones para determinar la presencia de Neisseria gonorrhoeae en una muestra mediante seguimiento de la unión entre los ácidos nucleicos y/o amplicones de los mismos procedentes de la muestra y el oligonucleótido, en el que la presencia de Neisseria gonorrhoeae en la muestra es desconocida o no se ha constatado, o

   (c)

   por lo menos un recipiente para empaquetar por lo menos el oligonucleótido.

10. 10.

    Kit según la reivindicación 9, en el que el oligonucleótido presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45, una variante sustancialmente idéntica de los mismos,

    en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45, y complementos de los SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45 y la variante.
11. 11. Kit según la reivindicación 9, que comprende además uno o más reactivos de detección de ácidos nucleicos 5 que se unen detectablemente a un ácido nucleico de Chlamydia trachomatis.
12. 12. Mezcla de reacción que comprende un conjunto de amplicones que presenta secuencias que corresponden a una o más subsecuencias de SEC ID nº 36, una variante sustancialmente idéntica a la misma en la que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a SEC ID nº 36, o un

    10 complemento de SEC ID nº 36 ó la variante, en donde los amplicones no presentan nucleótidos terminadores, en el que por lo menos un subconjunto del juego de amplicones se produce utilizando por lo menos un ácido nucleico cebador que presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45, una variante sustancialmente idéntica de los mismos, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 37

    15 a 38 y 40 a 45, y complementos de los SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45 y la variante.