JP2000511777A - クラミジア・ニューモニエ検出用核酸プライマーおよびプローブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明では、クラミジア・ニューモニエの検出に有用な核酸配列が提供される。これらの配列は、試験試料中のクラミジア・ニューモニエの存在を検出するために設計されたハイブリダイゼーションアッセイまたは増幅に基づくアッセイに使用できる。さらに、これらの配列はキットの一部としても提供できる。

Description

【発明の詳細な説明】クラミジア・ニューモニエ検出用核酸プライマーおよびプローブ 発明の分野 本発明はクラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉ ａｅ）に関し、特に試験試料中のクラミジア・ニューモニエを検出するためのオ リゴヌクレオチドに関する。 発明の背景 クラミジア属の三つの種はヒト宿主に感染し、疾患を起こしうることから臨床 的に重要である。クラミジア・トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）は 先進社会で最も一般的な性的伝染病であると報告されており、男女両性で性器感 染症を引き起こす。クラミジア・シッタシ（Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉ）は種々の呼 吸器感染症の原因となる。最も新しく特性化された臨床的に重要なクラミジア属 の一つはクラミジア・ニューモニエ（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）であり、これ も呼吸器感染症の原因となり、冠動脈疾患とも関連している。 おそらく、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅはかなり最近になって特性化されたため 、試験試料中のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを 検出するための主な方法には、培養物からの菌の単離や血清学的試験が含まれる 。単離には、組織培養細胞中で菌を増殖させて封入体を形成させ、次いで、標識 した種特異性抗体を使用して蛍光染色することにより封入体を検出することが含 まれる。血清学的検査には、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの感染が疑われる個体か ら採取した試料が二つ必要である。この理由は、かなりの数の個体がＣ．ｐｎｅ ｕｍｏｎｉａｅに対する抗体を有しており、最近のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感 染症の指標としてＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する抗体価の上昇または抗体ク ラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ）の変化を測定するからである。抗体価の上 昇または抗体クラスの変化を測定するためには、急性期および回復期の血清試料 を採取する。残念ながら、これらの試料は数週間または数カ月もの間隔で採取す ることが多い。そのため、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染症の検出には時間がか かる。従って、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを特異的に、そして適時に検出できる 方法および試薬が必要とされている。 発明の概要 本発明は、オリゴヌクレオチドプローブおよび／またはプライマーとして使用 することによりＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを 特異的に検出できる核酸配列を提供する。このようなプライマーまたはプローブ は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号 ７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３お よび配列番号１４で表される。これらの配列の相同体およびこれらの配列の組み 合わせも、試験試料中のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの検出に使用できることは当 業者には理解されよう。好ましくは、これらの配列は増幅反応に使用され、増幅 反応を実施するための他の試薬と共にキットとして提供することができる。 本発明が提供する方法には、ハイブリダイゼーションアッセイと増幅に基づく アッセイとが含まれる。従って、一方法によると、試験試料中のＣ．ｐｎｅｕｍ ｏｎｉａｅの存在を検出する方法は、（ａ）試験試料を一つまたは複数の上記の 配列またはその相同体と接触させるステップと（ｂ）試験試料中にＣ．ｐｎｅｕ ｍｏｎｉａｅが存在する指標として、上記配列とＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ標的 配列との間のハイブリダイゼーションを検出するステップとを含むことができる 。 別の実施形態によると、試験試料中のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの存在を検出 する方法は、（ａ）核酸増幅試薬と、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ 標的配列を含む試験試料と、配列番号２および５、配列番号３および４、配列番 号２、３および４、配列番号２、３および５、配列番号２、３、４および５、配 列番号９および１１、配列番号１０および１２、配列番号９、１０および１１、 配列番号９、１０および１２、および配列番号９、１０、１１および１２からな る群から選択した少なくとも一つのプライマーと一つのプローブオリゴヌクレオ チドを含む反応混合物を形成するステップと、（ｂ）混合物をハイブリダイゼー ション条件において、標的配列と相補的な核酸配列を少なくとも一つ生成するス テップと、（ｃ）標的配列に相補的な核酸配列にプローブをハイブリダイゼーシ ョンさせて、プローブおよび相補的な核酸配列を含む複合体を形成するステップ と、（ｄ）試料中にＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが存在する指標として、そのよう に形成した複合体を検出するステップとを含むことができる。 別の実施態様によると、本発明は、土記の配列番号から選択したオリゴヌクレ オチドプライマーおよびプローブの組み合わせと増幅試薬とを含むキットを提供 する。 発明の詳細な説明 上記のように、本発明は核酸配列、これらの核酸配列を使用 する方法、およびこれらの配列を含むキットを提供し、これらはすべて、Ｃ．ｐ ｎｅｕｍｏｎｉａｅを特異的に検出するために使用できる。提供されるこれらの 配列は、本明細書では、配列番号２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１ ２、１３、１４およびそれらの相同体と表す。これらの配列は、Watson，M.W.他 、Journal of Clinical Microbiology、29(6)p．1188-1193（1991）に開示され たシステインに富む外膜タンパク質（ＯＭＰ）をコードするＣ．ｐｎｅｕｍｏｎ ｉａｅ遺伝子およびPerez-Melgosa，M.他、Infection and Immunity、62(3)p．8 80-886（1994）に開示された７６キロダルトンのタンパク質（７６ｋＤタンパク 質）をコードするＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ遺伝子由来のものである。 ここで提供される配列について、「相同体」とは、配列番号２〜７および９〜 １４と約８０％の相同性を有する配列を意味し、より好ましくは配列番号２〜７ および９〜１４と約９０％の相同性を有する配列を意味する。従って、ここで提 供される配列と約８０％の相同性を有し、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅと特異的に ハイブリッドを形成する配列は本発明の範囲に含まれるものと意図する。例えば 、この配列の伸長、この配列より短 いが、この配列のサブセットを含む配列、および塩基がわずかに置換されている ためにこの配列とは異なる配列も本発明の範囲に含まれるものと企図する。 Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを特異的に検出し、配列番号２〜７および配列番号 ９〜１４で表わされる配列と約８０％の相同性を有する能力を失うことなく、こ れらの配列に実施できる変更は当業者には理解されよう。例えば、ＯＭＰ遺伝子 または７６ｋＤタンパク質遺伝子のいずれかの後続または先行の塩基と相補的な 塩基でこの配列を３'または５'方向に伸長させたものは、この配列と約８０％の 相同性を有し、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを特異的に検出する場合には、本配列 の相同体と考えられる。また、ＯＭＰ遺伝子または７６ｋＤタンパク質遺伝子の いずれかの後続または先行の塩基と相補的でない塩基でこの配列を３'または５' 方向に伸長させた、この配列と約８０％の相同性を有し、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉ ａｅを特異的に検出するものは本発明の範囲に含まれるものと企図する。さらに 、配列番号２〜７および配列番号９〜１４の塩基を置換することができるが、こ れらの修飾された配列はＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅと特異的にハイブリッド形成 する能力を維持していて、配列番号２〜７ および配列番号９〜１４で表わされる配列と約８０％の相同性を有するであろう 。従って、これらも本発明の範囲に含まれるものと企図される。さらに、配列番 号２〜７および配列番号９〜１４で表わされる配列の約８０％を有するが、３' または５'末端から塩基を欠失させた配列は相同体の範囲に含まれるものと考え られる。 ここに開示する配列およびその相同体は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ 核酸（ＲＮＡ）、または国際特許出願ＷＯ９２／２０７０２に開示されたペプチ ド核酸（ＰＮＡ）または米国特許第５，１８５，４４４号、５，０３４，５０６ 号および５，１４２，０４７号に記載されたモルホリノ類似体を含むが、これら に限定されない非荷電核酸類似体などの核酸類似体からなることができる。上記 特許はすべて参考として本明細書に組み込むものとする。このような配列は現在 使用できる種々の手法を用いて日常的に合成できる。例えば、ＤＮＡの配列は従 来のヌクレオチド用ホスホロアミダイト化学を使用しApplied Biosystem社（カ リフォルニア州フォスターシティ）、DuPont社（デラウェア州ウィルミントン） またはMilligen(マサチューセッツ州ベッドフォード)から入手できる機器を使 用して合成できる。同様に、所望に応じて、米国特許出願第５，４６４，７４６ 号、第５，４２４，４１４号および第４，９４８，８８２号に記載されたものな どの当業界で周知の方法を使用してこれらの配列を標識することができる。これ らの特許出願は参考として本明細書に組み込むものとする。 本明細書で使用する「標識」とは、検出可能な特性または特徴を有する分子ま たは部分を意味する。標識は、例えば放射性同位元素、フルオロフォア、ケミル ミノフォア、酵素、コロイド粒子、蛍光微粒子等により直接検出可能なものであ ってもよく、あるいは、例えば特異的結合要素により間接的に検出可能なもので あってもよい。直接検出可能な標識は、例えば標識の検出を可能にする基質、ト リガー試薬、光等の追加成分を必要とすることがあるものと理解されたい。間接 的に検出可能な標識を使用する場合、これらの標識は一般に「抱合体（conjugat e）」と組合せて使用される。抱合体は一般に、直接検出可能な標識に付着また は結合させてある特異的結合要素である。抱合体を合成するための結合化学は当 業界で周知であり、例えば、特異的結合要素または標識の検出可能な特性を壊さ ない任意の化学的および／または物理的手段を含むことがで きる。本明細書で使用する「特異的結合要素」とは、結合対、すなわち、一方の 分子が、例えば、化学的または物理的手段を介して、他方の分子と特異的に結合 している二つの異なる分子の構成要素を意味する。抗原と抗体との特異的結合対 の他に、その他の特異的な結合対にはアビジンとビオチン、ハプテンとハプテン 特異抗体、相補的なヌクレオチド配列、酵素のコファクターまたは基質と酵素等 があるが、これらに限定されるものではない。 一般に、ここで提供される配列は、試験試料をここで提供される配列の少なく も一つとハイブリッド形成条件下で接触させ、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの標識 配列と配列番号２〜７および配列番号９〜１４で表わされる配列の少なくとも一 つとの間でのハイブリダイゼーションを検出することにより、試験試料中のＣ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの存在を検出するために使用できる。本発明では、ハイブ リダイゼーションを検出する数種の周知の方法を使用でき、これらの方法には、 例えば、ゲルおよび染色の使用または、例えば、ドットブロットまたは増幅反応 実施後にここで提供される一つまたは複数の配列と結合した標識を検出すること を含みうる。 本明細書で使用する「試験試料」とは、標的配列を含むであろうと思われるす べてのものを意味する。試験試料は、例えば血液、気管支および肺の洗浄液、唾 液、喉のスワブ、眼球液、脳脊髄液、汗、喀痰、尿、乳汁、腹水、粘液、滑液、 腹腔液、羊水、心臓組織などの組織などの任意の生物起源のもの、または発酵用 ブロス、細胞培養物、化学反応混合物等由来のものであってよい。試験試料は（ ｉ）その採取源から採取したまま、直接使用することができ、あるいは、（ｉｉ ）予処理によって、試料の特性を変化させた後に使用することもできる。従って 、試験試料は、例えば、血液から血清を調製する、細胞を破壊する、固体材料か ら液体を調製する、粘性な液体を希釈する、液体を濾過する、液体を蒸留する、 液体を濃縮する、妨害成分を不活化する、試薬を添加するなどの方法で使用前に 予処理することができる。 本明細書で使用する「標的配列」とは、検出、増幅または検出かつ増幅される 核酸配列またはここに提供される配列の一つと相補的な核酸配列を意味する。従 って、標的配列はここで提供される配列と約８０％の相同性を有する。さらに、 標的配列は一本鎖と呼ばれることもあるが、実際には二本鎖でありうる ことは当業者には理解されよう。 「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリッドを形成する」条件とは、一 般に、相補的な核酸配列間のアニーリングまたは一つまたは複数の核酸配列のア ニーリングおよび伸長を促進する条件と定義される。このようなアニーリングは 、温度、イオン強度、配列長および配列のＧ：Ｃ含量を含むいくつかの要因に予 想可能に依存することは当業界で周知である。例えば、相補的な核酸配列の環境 温度が低下するとアニーリングが促進される。任意の所与の配列の組み合わせに ついて、融解温度すなわちＴｍは、数種の公知方法のいずれでも推定できる。一 般に、診断の用途では、融解温度よりやや低いハイブリダイゼーション温度を使 用する。小さい陽イオンはホスホジエステル骨格の負の電荷を打ち消すことによ り二重鎖（duplex）の形成を安定化させる傾向を有するため、イオン強度または 「塩」濃度も融解温度に影響を与える。一般的な塩濃度は陽イオンの種類および 原子価に依存するが、当業者には容易に理解されよう。同様に、Ｇ：Ｃ対には三 つの水素結合が関与するが、Ａ：Ｔ対は二つの水素結合しか含まないこと、長い 配列の方が配列を結合保持するための水素結合をより多く有することから、Ｇ： Ｃ 含量が高いことや配列長が長くなることによっても二重鎖の形成が安定化される ことが知られている。従って、高いＧ：Ｃ含量およびより長い配列長は、融解温 度を上昇させることによって、ハイブリダイゼーション条件に影響を与える。 所与の診断の用途に対して配列を選択すると、Ｇ：Ｃ含量および配列長が判り 、どのハイブリダイゼーション条件が含まれるかを正確に明らかにすることがで きる。イオン強度は一般に酵素活性に対して最適化するため、変化させうる残り の要因は温度である。特異性を高めるためには、ハイブリダイゼーション温度に は、プライマーまたはプローブのＴｍよりやや低い、一般にＴｍより２〜１０℃ 低い温度を選択する。従って、特定のプライマー、プローブ、またはプライマー とプローブの組み合わせに好適なハイブリダイゼーション条件を得ることは当業 界の一般的技術に含まれる。 ここで提供される配列は当業界で周知の増幅手順に従って増幅プライマーまた はプローブとしても使用できる。このような反応には米国特許第４，６８３，１ ９５号および第４，６８３，２０２号に記載のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） 、ＥＰ−Ａ−３２０，３０８に記載のリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）および米 国特許第５，４２７，９３０号に記載のギャップＬＣＲ（ＧＬＣＲ）が含まれる が、これらに限定されるものではない。上記特許明細書はすべて参考として本明 細書に組み込むものとする。 好ましい実施形態によると、１９９５年８月１４日出願の米国特許出願第０８ ／５１４，７０４号に記載の「オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションＰＣ Ｒ（本明細書では「ＯＨＰＣＲ」とも呼ぶ）増幅反応にこれらの配列を使用する 。上記特許出願も参考として本明細書に組み込むものとする。簡単に述べると、 好ましい方法に使用する試薬は少なくとも一つの増幅プライマーと少なくとも一 つの内部ハイブリダイゼーションプローブと増幅反応を実施するためのその他の 試薬とを含む。 プライマー配列は標的配列の一つのコピーの伸長を開始するために使用し、捕 捉用標識または検出用標識のいずれかで標識する。プローブ配列はプライマー配 列により生成された配列とハイブリッドを形成するために使用し、一般にプライ マー配列を含まない配列とハイブリッドを形成する。プライマー配列と同様に、 プローブ配列も捕捉用標識または検出用標識のいずれかで標識するが、プライマ ー配列を捕捉用標識で標識した場合には、プローブ配列は検出用標識で標識し、 プライマー配列を 検出用標識で標識した場合には、プローブ配列は捕捉用標識で標識する。検出用 標識は前記定義の「標識」と同じ定義であり、「捕捉用標識」は一般に伸長産物 およびこのような産物のいずれかと結合しているプローブをその他の増幅反応体 から分離するために使用される。（前記定義の）特異的結合要素はこの目的に非 常に適している。また、この方法に従って使用するプローブは、ハイブリダイゼ ーション条件下で伸長しないように、３'末端でブロックされているのが好まし い。プローブの伸長を防止する方法は周知であり、当業者が選択できる。一般に 、プローブの３'末端にリン酸基を加えることで、プローブの伸長を阻止する目 的には十分である。 「増幅反応を実施するためのその他の試薬」または「核酸増幅試薬」には、周 知の試薬が含まれ、ポリメラーゼ活性を有する酵素、マグネシウムなどの酵素コ ファクター、塩、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）および、例 えば、デオキシアデニン三リン酸、デオキシグアニン三リン酸、デオキシシトシ ン三リン酸およびデオキシチミン三リン酸などのデオキシヌクレオチド三リン酸 （ｄＮＴＰ）を含みうるが、これらに限定されない。 好ましい方法は一般に、（ａ）核酸増幅試薬と、少なくとも一つのハイブリダ イゼーションプローブと、少なくとも一つの増幅プライマーと、標的配列を含む と思われる試験試料とを含む反応混合物を形成するステップと、（ｂ）この混合 物をハイブリダイゼーション条件において、標的配列に相補的な核酸配列のコピ ーを少なくとも一つ生成させるステップと、（ｃ）プローブを標的配列に相補的 な核酸配列とハイブリッド形成させて、標的配列に相補的な核酸配列とプローブ とを含むハイブリッドを形成するステップと、（ｄ）試料中にＣ．ｐｎｅｕｍｏ ｎｉａｅが存在する指標としてこのハイブリッドを検出するステップとを含む。 当業界で周知のように、反応混合物を熱循環にかけることにより、ステップ（ｃ ）を実施する前に上記方法のステップ（ｂ）を数回反復できることは理解されよ う。 上記方法によれば、プローブ配列の融解温度がプライマー配列の融解温度より 低く、反応混合物をハイブリダイゼーション条件に置くと、プローブのＴｍ以上 の温度で標的配列またはその相補配列のコピーが生成されるように、プライマー とプローブを選択するのが好ましい。このようなコピーを合成した後、コピーを 変性させ、混合物を冷却することにより、プローブと 標的配列またはその相補配列の一本鎖のコピーとの間でハイブリッドを形成でき る。変性温度からプローブが一本鎖コピーと結合するであろう温度まで温度を低 下させる速度は非常に速い（例えば８〜１５分）のが好ましく、特に、ポリメラ ーゼ活性を有する酵素がプライマー伸長活性を有する温度域で速いのが好ましい 。このように迅速な冷却はプライマーとコピー配列とのハイブリダイゼーション より、コピー配列とプローブとのハイブリダイゼーションに有利である。 コピー配列とプローブとのハイブリッドが形成されると、コピー配列上の識別 用標識（すなわち、捕捉用標識および検出用標識）を使用してこのようなハイブ リッドを分離および検出で イリノイ州、アボット・パークのAbbott Laboratories）で使用するプロトコー ルに従って検出を実施する。 従って、好ましい方法に留意すると、本発明の配列は、少なくとも二つの異な る配列の組み合わせ（すなわち、少なくとも一つのプライマー配列と少なくとも 一つのプライマーの伸長産物と相補的なプローブ配列）として提供されるのが好 ましい。従って、配列番号２および５、配列番号３および４、配列番号 ２、３および４、配列番号２、３および５、配列番号２、３、４および５、配列 番号９および１１、配列番号１０および１２、配列番号９、１０および１１、配 列番号９、１０および１２、および配列番号９、１０、１１および１２またはこ れらの配列の相同体が合わさって提供されるのが好ましい。 本発明の配列はＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを検出するために有用なキットの一 部としても提供できる。このキットは本発明の一つまたは複数の配列、ポリメラ ーゼ活性を有する酵素およびデオキシヌクレオチド三リン酸を含有する一つまた は複数の好適な容器を含む。一般には、少なくとも一つの配列が標識を有してい るが、標識がなくても検出はできる。 以下の実施例は本発明をさらに説明するためのものであって、本発明を限定す ることを意図するものではない。実施例 以下の実施例は、ここで提供されるＤＮＡオリゴマープライマーおよびプロー ブのＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの検出への使用を説明している。実施例で使用し たプライマーおよびプローブは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番 号９、配列番号１０および配列番号１１と同定される。配列番号２、３ および４は６０ｋＤのシステインに富むＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの外膜タンパ ク質（ＯＭＰ）をコードする遺伝子に特異的であり、その一部を本明細書では配 列番号１と表す。配列番号９、１０および１１はＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの７ ６ｋＤのタンパク質をコードし、その一部を本明細書では配列番号８と表す。以 下の実施例では、配列番号２および３をＯＭＰ領域に特異的なＣ．ｐｎｅｕｍｏ ｎｉａｅ増幅プライマーとして使用する。配列番号４はＯＭＰ増幅産物用の内部 ハイブリダイゼーションプローブとして使用する。配列番号９および１０はＣ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの７６ｋＤ領域に特異的な増幅プライマーとして使用し、 配列番号１１は７６ｋＤ増幅産物用の内部ハイブリダイゼーションプローブとし て使用する。 以下の実施例では、「Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ配列の陽性対照」（「Ｃ．ｐ ｎｅｕｍｏｎｉａｅ標準」とも呼ぶ）はＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞株ＴＷ− １８３、ＡＲ−３９およびＣＷＬ−０２９（米国、メリーランド州、ロックビル のAmerican Type Culture Collection(ATCC)から入手）由来のものであった。こ れらの配列は、三種の細胞株全てについて同数の細胞を混合し、ＱＩＡｇｅｎ核 酸精製法（米国、カリフォルニア州、 ＣｈａｔｓｗｏｒｔｈのＱＩＡｇｅｎ社）でＤＮＡを集めることにより得られた 。 実施例１ Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプライマーおよびプローブの調製 Ａ．ＯＭＰプライマーおよびプローブ オリゴヌクレオチドハイブリダイゼー ションＰＣＲでＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＯＭＰ標的配列を検出するための標 的特異性プライマーおよびプローブを設計した。プライマーは配列番号２および 配列番号３であった。プライマー配列は標準的なオリゴヌクレオチド合成法を使 用して合成し、米国特許第５，４２４，４１４号に記載の標準的なシアノエチル ホスホロアミダイト結合化学を使用して、５’末端をアダマンタンでハプテン化 した。この特許明細書は参考として本明細書に含むものとする。 オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションで増幅させたＣ．ｐｎｅｕｍｏｎ ｉａｅのＯＭＰ標的配列とハイブリッドを形成するための検出用プローブを設計 した。このプローブは配列番号４である。プローブ配列は標準的なオリゴヌクレ オチド合成法を使用して合成し、米国特許第５，４６４，７４６号に記載の標準 的なシアノエチルホスホロアミダイト結合化学を使用し て、５’末端を２−カルバゾールでハプテン化し（この特許明細書は参考として 本明細書に含むものとする）、３’末端をホスフェートでブロックした。Ｃ．ｐ ｎｅｕｍｏｎｉａｅ標準に対する反応性を評価した。 Ｂ．７６ｋＤプライマーおよびプローブ オリゴヌクレオチドハイブリダイゼ ーションＰＣＲでＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの７６ｋＤ標的配列を検出するため の標的特異性プライマーおよびプローブを設計した。プライマーは配列番号９お よび配列番号１０であった。プライマー配列は標準的なオリゴヌクレオチド合成 法を使用して合成し、米国特許第５，４２４，４１４号に記載の標準的なシアノ エチルホスホロアミダイト結合化学を使用して、５’末端をアダマンタンでハプ テン化した。 オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションで増幅させたＣ．ｐｎｅｕｍｏｎ ｉａｅの７６ｋＤ標的配列とハイブリッドを形成するための検出用プローブを設 計した。このプローブは配列番号１１である。プローブ配列は標準的なオリゴヌ クレオチド合成法を使用して合成し、標準的なシアノエチルホスホロアミダイト 結合化学（上記）を使用して、５’末端を２−カルバゾールでハプテン化し、３ ’末端をホスフェートでブロックした。 Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ標準に対する反応性を評価した。 実施例２ Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの増幅および検出 Ａ．Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＯＭＰの検出 実施例１．Ａ．に記載のＯＭ Ｐプライマー（配列番号２および３）およびＯＭＰ検出用プローブ（配列番号４ ）を使用して、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ標準試料をＰＣＲで増幅し、検出した 。プライマーは各々０．２μＭの濃度で使用した。Ｔａｑポリメラーゼは２．５ 単位の濃度で使用した。ＰＣＲ伸長は、１０倍量の１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ ８．３）および５００ｍＭＫＣｌからなるＰＣＲバッファ（米国、カリフォルニ ア州、フォスターシティのＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を使用し、最終濃度１ 倍で実施した。総反応量０．２ｍｌ中のＭｇＣｌ₂の最終濃度は２ｍＭ、ヌクレ オチドの最終濃度は各々０．２ｍＭであった。 反応混合物を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ４８０型熱サイクル装置内で、９７ ℃３０秒、５９℃３０秒、７２℃３０秒のサイクルを４０回繰り返すというサイ クリング条件で増幅させた。 増幅後、上記反応混合物のアリコート１００μｌを、４０ ｎＭの濃度の検出用プローブ１０μｌを入れた別の試験管に加えた（従って、検 出用プローブの最終濃度は３．６ｎＭであった）。初回の変性ステップを９７℃ で５分間実施した後、温度を１５℃に１０分間低下させて、プローブとオリゴヌ クレオチドとのハイブリダイゼーションを完了させた。 プローブのハイブリダイゼーション後、反応生成物をＡｂｂｏｔｔ Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手できる）で検出した。抗カル バゾール抗体で被覆した微粒子の縣濁液と抗アダマンタン抗体／アルカリ性ホス ファターゼ抱合体（これらはすべて米国、イリノイ州、アボットパークのＡｂｂ ｏｔｔ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの検出にＯＭＰプライマー／プローブのセットを使用する と、１１４４．１ｃ／ｓ／ｓの陽性反応率を示した。 Ｂ．Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの７６ｋＤの検出 実施例１．Ｂ．に記載のよ うに、７６ｋＤプライマー（配列番号９および１０）および７６ｋＤ検出用プロ ーブ（配列番号１１）を使用 して、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ標準試料をＰＣＲで増幅させ、検出した。この 実施例で使用した試薬の濃度は上記実施例２．Ａ．で使用したものと同じであっ た。 上記実施例２．Ａ．と同様に、反応混合物を増幅させた後、プローブとオリゴ ヌクレオチドをハイブリダイゼーションさせた。 プローブのハイブリダイゼーション後、上記実施例２．Ａ．ｋＤプライマー／プローブのセットを使用すると、９９４．０ｃ／ｓ／ｓの陽性 反応率を示した。 実施例３ Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ検出の特異性 クラミジア属の他の２種、クラミジア・シッタシおよびクラミジア・トラコマ アチス由来のＤＮＡをＡＢＩ（米国、メリーランド州、コロンビアのＡｄｖａｎ ｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）から購入し、各々基本小体７．１ ×１０⁴および１．２６×１０⁵の濃度まで希釈し、下記のように実施例２からの Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの標準品 と共にアッセイした。 Ａ．ＯＭＰプライマーおよびプローブを使用したＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの特 異的検出 実施例１に記載のＯＭＰプライマー（配列番号２および配列番号３ ）およびＯＭＰ検出用プローブ（配列番号）を使用して、上記２．Ａに記載の方 法により、クラミジア属（表１）の三つの試料を増幅させ、検出した。この実験 のデータは表１に示すが、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのみが特異的に増幅および 検出され、クラミジア属の他の２種の試料は非反応性であることを示している。 Ｂ．７６ｋＤプライマーおよびプローブを使用したＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの 特異的検出 実施例１に記載の７６ｋＤプライマー（配列番号９および配列番 号１０）および７６ｋＤ検出用プローブ（配列番号１１）を使用して、上記実施 例２．Ｂ．に記載の方法で、クラミジア属の三種の試料（表２） を増幅させ、検出した。この実験のデータは表２に示すが、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎ ｉａｅのみが特異的に増幅および検出され、他のクラミジア属の試料は非反応性 であることを示している。 実施例４ Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ検出の感受性 各試料中の封入体形成単位（Inclusion Forming Unit）(ＩＦＵ)数を免疫蛍光 法で既に定量してあるＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞を融解させ、最新の方法で 検査した。サケ精子ＤＮＡを陰性対照として使用し、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ 標準のＤＮＡを陽性対照として使用した。 Ａ．Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＯＭＰプライマーおよびプローブの感受性 実施例１に記載のＯＭＰプライマー（配列番号２および配列番号３）およびＯＭ Ｐ検出用プローブ（配列番号４）を使用して、実施例２および３で使用した方法 である単 位用量修飾法（unit dose modification）で、定量したＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｅ細胞を増幅させ、検出した（表３）。すなわち、各０．３μＭの濃度のプライ マー、８ｎＭの濃度の検出用プローブおよびその他の試薬を一つの増幅用容器に 入れた。Ｔａｑポリメラーゼは２．５単位の濃度で使用した。ＰＣＲ伸長は、１ ０倍量の１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）および５００ｍＭ ＫＣｌからな るＰＣＲバッファ（米国、カリフォルニア州、フォスターシティのＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を使用して、最終濃度１倍で実施した。総反応量０．２ｍｌ中 のＭｇＣｌ₂の最終濃度は２ｍＭ、ヌクレオチドの最終濃度は０．２ｍＭであっ た。 反応混合物をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ４８０型熱サイクル装置内で、９７℃ ３０秒、５９℃３０秒、７２℃３０秒のサイクルを４０回繰り返すというサイク リング条件で増幅させた。反応混合物を９７℃に５分間維持した後、温度を１５ ℃に１０分間低下させて、プローブとオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼー ションを完了させた。 プローブハイブリダイゼーション後、反応生成物をＡｂｂｏｔｔ ０．０６ＩＦＵ／反応という低い濃度で、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが検出され ることを示している。 １ＩＦＵ／反応より低い濃度で三回ずつ検査を実施した。表４に示す結果は、 ０．３８ＩＦＵ／反応の濃度でＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが一貫して検出される ことを示している。Ｂ．Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ７６ｋＤプライマーおよびプローブの感受性 実施例１に記載の７６ｋＤプライマー（配列番号９および配列番号１０）およ びプローブ（配列番号１１）を使用して、上記実施例４．Ａ．に記載の単位用量 法で、定量されたＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞（表５）を増幅および検出した 。プライマーは０．３μＭの濃度で、検出用プローブは８ｎＭの濃度で使用した 。反応混合物のその他の成分は上 記４．Ａ．と同じであったが、但し、ＭｇＣｌ₂の最終濃度は１ｍＭで使用した 。 上記４．Ａ．と同様に、反応混合物を増幅させた後、プローブとオリゴヌクレ オチドのハイブリダイゼーションを実施した。 プローブハイブリダイゼーション後、反応生成物をＡｂｂｏｔｔ が、０．０５ＩＦＵ／反応という低い濃度でＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが検出さ れることを示している。 さらに、１ＩＦＵ／反応より低い濃度で三回ずつ検査を実施した。表６に示す 結果は、０．３８ＩＦＵ／反応の濃度でＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが一貫して検 出されることを示している。 実施例５ Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＯＭＰおよび７６ｋＤプライマーおよびプローブの 感受性および特異性 実施例１に記載のＯＭＰプライマー（配列番号２および配列 番号３）およびＯＭＰ検出用プローブ（配列番号４）または７６ｋＤプライマー （配列番号９および配列番号１０）および７６ｋＤ検出用プローブ（配列番号１ １）を使用し、上記実施例４に記載の各方法を使用して、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉ ａｅおよびマイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍ ｏｎｉａｅ）由来の予め定量してあるゲノムＤＮＡを増幅させ、検出した。この 実験のデータは表７に示すが、ゲノムＤＮＡ濃度１５．６ｐｇ／ｍｌではＯＭＰ および７６ｋＤいずれのプライマー／プローブのセットでもＣ．ｐｎｅｕｍｏｎ ｉａｅが検出され、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅゲノムＤＮＡが交叉検出されるこ とはないことを示している。 実施例６ ＯＨ−ＰＣＲと培養とのＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ検出の比較 Ａ．鼻咽頭スワブ試料中のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＯＨ−ＰＣＲと培養によ る検出 従来の培養法でＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅについて検査した患者から 得た鼻咽頭スワブ試料２５検体の検査結果を、実施例１に記載のＯＭＰプライマ ー（配列番号２および配列番号３）およびＯＭＰ検出用プローブ（配列番号４） または７６ｋＤプライマー（配列番号９および配列番号１０）および７６ｋＤ検 出用プローブ（配列番号１１）を使 用して得た結果と比較した。試料のＤＮＡはＱＩＡｇｅｎ核酸精製法を使用して 単離し、上記実施例４と同様に各々ＯＭＰまたは７６ｋＤ法を使用して、増幅さ せ、検出した。結果は表８に示す。Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを陽性対照として 、サケ精子ＤＮＡを陰性対照として使用した。 培養により１０個の試料（＃１２、１５、１６、１７、１８、２０、２１、２ ２、２４および２５）がＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ陽性と確認され、これらの試 料は全てＯＭＰアッセイ法および７６ｋＤアッセイ法のいずれでも陽性と検出さ れた。さらを使用するＯＭＰおよび７６ｋＤのＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ用プライマー／プ ローブのセットのいずれでも陽性と判定された。 Ｂ．ＯＭＰプライマー／プローブのセットおよび培養を使用する咽喉スワブおよ び鼻咽喉スワブ試料のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの検出 患者から採取した１ ８組の咽喉スワブおよび鼻咽喉スワブ試料をＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅについて 従来の培養法で検査し、実施例１に記載のＯＭＰプライマー（配列番号２および 配列番号３）およびＯＭＰ検出用プローブ（配列番号４）を使用したＣ．ｐｎｅ ｕｍｏｎｉａｅの検出と比較した。試料のＤＮＡはＱＩＡｇｅｎ核酸精製法を使 用して単離し、上記実施例４．Ａ．に記載のＯＭＰ法により増幅および検出した 。 Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＯＭＰ プライマー／プローブのセットを使用し た結果は、標準培養法で得た結果と一致し、 どちらの方法でもすべての試料が陰性であった。 本発明を具体的な実施形態により詳細に説明してきたが、本発明の精神および 範囲を逸脱することなくこのような実施形態に種々の変更や修正を実施できるこ とは当業者には明らかであろう。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブであって、前記オリゴヌクレ オチドプライマーまたはプローブが配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列 番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、 配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４並びにそれらの相同体およびそ れらの組み合わせからなる群から選択されたオリゴヌクレオチドプライマーまた はプローブ。 ２．配列番号２および５、配列番号３および４、配列番号２、３および４、配列 番号２、３および５、配列番号２、３、４および５、配列番号９および１１、配 列番号１０および１２、配列番号９、１０および１１、配列番号９、１０および １２、および配列番号９、１０、１１および１２からなる群から選択された請求 の範囲第１項に記載のオリゴヌクレオチドの組み合わせ。 ３．試験試料中のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの存在を検出する方法であって、 ａ）前記試験試料を請求の範囲第１項に記載のオリゴヌクレオ チドと接触させるステップと、 ｂ）試験試料中にＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが存在する指標として、前記オリゴ ヌクレオチドとＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ標的配列との間のハイブリダイゼーシ ョンを検出するステップとを含む方法。 ４．前記オリゴヌクレオチドを標識する請求の範囲第３項に記載の方法。 ５．試験試料中のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの存在を検出する方法であって、 ａ）核酸増幅試薬と、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ標的配列を含む試験試料と、配 列番号２および５、配列番号３および４、配列番号２、３および４、配列番号２ 、３および５、配列番号２、３、４および５、配列番号９および１０、配列番号 １０および１２、配列番号９、１０および１１、配列番号９、１０および１２、 および配列番号９、１０、１１および１２並びにそれらの相同体からなる群から 選択された少なくとも一つのプライマーと一つのプローブとを含む反応混合物を 形成するステップと、 ｂ）前記混合物を、前記標的配列と相補的な少なくとも一つの核酸配列を生成す るハイブリダイゼーション条件におくステッ プと、 ｃ）前記プローブを前記標的配列と相補的な前記核酸とハイブリッド形成させて 、前記プローブと前記核酸を含むハイブリッドを形成するステップと、 ｄ）前記試料中にＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが存在する指標として前記ハイブリ ッドを検出するステップと を含む方法。 ６．前記プローブを標識する請求の範囲第５項に記載の方法。 ７．前記プローブを捕捉用標識で標識し、前記プライマーを検出用標識で標識す る請求の範囲第５項に記載の方法。 ８．前記プローブを検出用標識で標識し、前記プライマーを捕捉用標識で標識す る請求の範囲第５項に記載の方法。 ９．ａ）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列 番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１ ３および配列番号１４並びにそれらの相同体およびそれらの組み合わせからなる 群から選択されたオリゴヌクレオチドと ｂ）増幅用試薬と を含むキット。