ES2377808T3

ES2377808T3 - Péptidos antibacterianos

Info

Publication number: ES2377808T3
Application number: ES09757269T
Authority: ES
Inventors: Andrea Giuliani; Giovanna Pirri; Silvia Fabiole Nicoletto
Original assignee: SPIDERBIOTECH Srl
Current assignee: SPIDERBIOTECH Srl
Priority date: 2008-06-02
Filing date: 2009-06-02
Publication date: 2012-04-02
Anticipated expiration: 2029-06-02
Also published as: WO2009146886A9; WO2009146886A3; AU2009254152A1; US8785399B2; EP2297195B1; US20110077192A1; JP2011521984A; EP2297195B9; EP2297195A2; CA2725981A1; ATE533780T1; WO2009146886A2; PL2297195T3

Abstract

Un compuesto peptídico que tiene una longitud de hasta 35 restos de aminoácidos, que comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula general (Ib): Z-[K]n-K-I-R-V-R-L-S-A (SEC ID NO: 26) en la que K es un resto de aminoácido con una cadena lateral de lisina, particularmente L- lisina, u otro resto de aminoácido con una cadena lateral cargada positivamente,I es un resto de aminoácido con una cadena lateral de isoleucina, particularmente L-isoleucina, R es un resto de aminoácido con una cadena lateral de arginina o una cadena lateral de guanidina N-alquil sustituida, particularmente L-arginina, V es un resto de aminoácido con una cadena lateral de valina, particularmente L-valina, S es un resto de aminoácido con una cadena lateral de serina, particularmente L-serina, A es un resto de aminoácido con una cadena lateral de alanina, particularmente L-alanina, L es un resto de aminoácido con una cadena lateral de leucina, particularmente L-leucina, en la que uno de los restos de aminoácidos K, I, R, L, V y S se puede sustituir por un resto de aminoácido con una cadena lateral de alanina, particularmente L-alanina, Z es el grupo N-terminal del compuesto peptídico, que comprende al menos un resto aminoácido, y se selecciona de (i) un resto de aminoácido aromático o un grupo di-, tri- o tetrapeptidílico que comprende al menos un resto de aminoácido aromático, en el que el resto de aminoácido aromático se selecciona particularmente de triptófano, N-metiltriptófano, fenilalanina, ß-fenilalanina, naftilalanina, ß-naftilalanina, ß-difenilalanina, ß-(4,4'-bifenil)alanina, ß-antracen-9-ilalanina y ß-indol-3-ilalanina, o sus derivados sustituidos, (ii) un resto de aminoácido alifático o un grupo di-, tri- o tetrapeptidílico que comprende al menos un resto de aminoácido alifático, en el que el resto alifático es un resto de α-aminoácido que comprende una cadena lateral alifática ramificada de al menos 3 átomos de carbono, (iii) combinaciones de uno cualquiera de (i)-(ii), y n es 0 ó 1, y en el que el compuesto peptídico puede comprender bloques de construcción de restos de L- y/o D-aminoácidos..

Description

Péptidos antibacterianos

La presente invención se refiere a compuestos peptídicos monoméricos y multiméricos que tienen actividad antimicrobiana, particularmente frente a bacterias grampositivas y gramnegativas. Adicionalmente, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden dichos compuestos peptídicos para uso médico, para uso como un desinfectante y/o detergente, o para uso como un conservante.

La mayor aparición de microorganismos multirresistentes ha alentado un renovado interés en el desarrollo de nuevos agentes antimicrobianos. La motivación para producir agentes más nuevos que seleccionen como dianas a nuevos sitios que puedan evitar la resistencia es crítica para el control a largo plazo de la infección bacteriana (Ref. 1).

La industria farmacéutica ha satisfecho previamente esta necesidad modificando antibióticos existentes y desarrollando nuevos antibióticos de una manera puntual. Los esfuerzos exitosos han producido la amplia variedad de clases farmacéuticas de antibióticos actualmente disponibles: beta-lactamas (penicilinas, carbapenems, cefalosporinas), glucopéptidos, macrólidos, cetólidos, aminoglucósidos, fluoroquinolonas, oxazolidinonas, y otros (Ref. 2). Sin embargo, recientemente se han detectado microorganismos que son resistentes frente a la mayoría o todas las clases conocidas de antibióticos. De este modo, hay una mayor necesidad de nuevos compuestos antibióticos.

Los péptidos antimicrobianos son componentes del sistema inmunitario no específico que representan una clase prometedora de agentes antiinfecciosos. Aunque su modo de acción no está bien comprendido, se cree que tienen múltiples dianas, incluyendo la membrana citoplásmica y los procesos de división celular y síntesis macromolecular (Ref. 3).

R.E.W. Hancock ha publicado una revisión de los antibióticos peptídicos (Ref. 4). La revisión se centra principalmente en las ventajas y desventajas de péptidos antimicrobianos (AMPs) catiónicos cuando se comparan con antibióticos convencionales, y resume los desarrollos clínicos recientes con estos péptidos. Se pueden definir como cortos (10-50 aminoácidos), con una carga global positiva (generalmente +2 a +9) y una porción sustancial (�30% o más) de restos hidrófobos. Estas propiedades permiten al péptido plegarse en una estructura anfifílica en tres dimensiones, a menudo al entrar en contacto con membranas, de manera que forman parches ricos en aminoácidos hidrófobos y cargados positivamente.

Los AMPs muestran un amplio espectro de actividad exterminadora in vitro frente a diversas dianas, tales como bacterias, hongos, virus encapsulados, parásitos, e incluso células tumorales (Ref. 5 y 6).

En los últimos 15 años, se han identificado casi 900 AMPs a lo largo de las especies, y ahora se reconocen como componentes esenciales del sistema inmunitario innato (Ref. 7). Las magaininas, por ejemplo magainina 2 y PGLa, están entre los AMPs mejor estudiados. Son péptidos lineales que se aislaron originalmente de la piel de la rana africana Xenopus laevis. Las magaininas son ionóforos de hélice a que poseen dos actividades importantes: un amplio espectro antimicrobiano y una actividad antiendotoxínica (Ref. 8).

Una gran familia de AMPs en mamíferos está representada por catelicidinas. Son AMPs que poseen un dominio inhibidor de catepsina L aminoterminal (catelina). El dominio de 37 aminoácidos C-terminal del la única catelicidina humana h-CAP 18, LL-37, es un péptido helicoidal anfipático que ejerce una amplia actividad antimicrobiana (Ref. 9).

Se han ensayado in vitro e in vivo diversos péptidos sintéticos. Por ejemplo, la Solicitud de Patente U.S. nº 60/651.270 describe hexapéptidos antimicrobianos y sus lipoderivados, activos frente a un intervalo de patógenos. Estos péptidos son particularmente efectivos en el tratamiento de enfermedades fúngicas y bacterianas en mamíferos, y demuestran un potencial para promover la actividad bactericida de antibióticos convencionales, tales como polimixina B, frente a bacterias multirresistentes.

El documento WO 2006/006195 describe péptidos antibacterianos, es decir, un péptido que tiene la secuencia QKKIRVRLSA (SEC ID NO: 1). Aunque estos péptidos muestran actividad antimicrobiana, también son inestables para uso práctico. De hecho, la Gln N-terminal proporciona derivados piroglutámicos, cuyo contenido aumenta durante el almacenamiento del producto.

La presente invención proporciona métodos para usar y obtener nuevos compuestos peptídicos antimicrobianos para tratar y/o prevenir enfermedades infecciosas.

Estos nuevos compuestos peptídicos se identificaron mediante un proceso de barrido de secuencias y una etapa de alargamiento en un decapéptido lineal. La síntesis peptídica, llevada a cabo en fase sólida mediante química de Fmoc/tBu, permitió aislar librerías de péptidos que tienen una mayor actividad antibacteriana cuando se comparan con la secuencia original SEC ID NO 1 como se describe en el documento WO 2006/006195.

Una materia objeto de la presente invención es un compuesto peptídico que tiene una longitud de hasta 35 restos de aminoácidos, que comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula general (Ib):

Z-[K]n-K-I-R-V-R-L-S-A (SEC ID NO: 26)

en la que K es un resto de aminoácido con una cadena lateral de lisina, particularmente L-o D-lisina, u otro resto de aminoácido con una cadena lateral cargada positivamente,

I es un resto de aminoácido con una cadena lateral de isoleucina, particularmente L-o D-isoleucina,

R es un resto de aminoácido con una cadena lateral de arginina o una cadena lateral de guanidina N-alquil sustituida, particularmente L-o D-arginina,

V es un resto de aminoácido con una cadena lateral de valina, particularmente L-o D-valina,

en la que uno de los restos de aminoácidos K, I, R, y V se puede sustituir por un resto de aminoácido con una cadena lateral de alanina, particularmente L-o D-alanina,

A es un resto de aminoácido con una cadena lateral de alanina, particularmente L-alanina,

S es un resto de aminoácido con una cadena lateral de serina, particularmente L-serina,

L es un resto de aminoácido con una cadena lateral de leucina, particularmente L-leucina, y

en la que uno o más de los restos de aminoácidos K, I, R, L, V y S se pueden sustituir por un resto de aminoácido con una cadena lateral de alanina,

Z es el grupo N-terminal del compuesto peptídico, que comprende al menos un resto aminoácido, y se selecciona de

(i): un resto de aminoácido aromático o un grupo di-, tri-o tetrapeptidílico que comprende al menos un resto de aminoácido aromático, en el que el resto de aminoácido aromático se selecciona particularmente de triptófano, N-metiltriptófano, fenilalanina, 1-fenilalanina, naftilalanina, 1-naftilalanina, 1-difenilalanina, 1-(4,4’-bifenil)alanina, 1-antracen-9-ilalanina y 1-indol-3-ilalanina, o sus derivados sustituidos,

(ii): un resto de aminoácido alifático o un grupo di-, tri-o tetrapeptidílico que comprende al menos un resto de aminoácido alifático, en el que el resto alifático se selecciona particularmente de restos de aaminoácidos que comprenden una cadena lateral alifática, preferiblemente una cadena lateral alifática ramificada de al menos 3 átomos de carbono,

(iii) un resto de ácido piroglutámico (pyrE) o un grupo di-, tri-o tetrapeptidílico que comprende un resto de aminoácido piroglutámico N-terminal,

(iv): un resto Q* o un grupo di-, tri-o tetrapeptidílico que comprende un resto Q* N-terminal,

en el que Q* es un resto de aminoácido protegido con una cadena lateral glutamínica, particularmente un resto de L-glutamina protegido, y

(v): combinaciones de uno cualquiera de (i)-(iv), por ejemplo (i) y (iii), (i) y (iv), (ii) o (iii) y (ii) o (iv),

y n es 0 ó 1.

En una realización adicional, la presente invención se refiere a un compuesto multimérico que comprende una pluralidad de compuestos peptídicos como se define anteriormente, en el que los compuestos peptídicos individuales están enlazados covalentemente, por ejemplo mediante restos multifuncionales, por ejemplo di-o trifuncionales, tales como aminoácidos di-o trifuncionales.

La presente invención se refiere a compuestos peptídicos. La expresión “compuestos peptídicos” engloba compuestos que comprenden al menos parcialmente bloques de construcción de aminoácidos o sus análogos, que están enlazados mediante enlaces covalentes, preferiblemente enlaces carboxamídicos. Los bloques de construcción se seleccionan preferiblemente de ácidos aminocarboxílicos, por ejemplo ácidos a-aminocarboxílicos, u otros tipos de ácidos carboxílicos, por ejemplo ácidos 1-o incluso w-aminocarboxílicos. Los bloques de construcción de aminoácidos se pueden seleccionar de ácidos L-a-aminocarboxílicos codificados genéticamente y/o sus enantiómeros D, y/o de bloques de construcción de aminoácidos de origen no natural. Los bloques de construcción individuales de los compuestos peptídicos están enlazados mediante enlaces covalentes, por ejemplo enlaces carboxamídicos, de carbamato, de éster y de tioéster. Los compuestos peptídicos de la presente invención pueden ser lineales o cíclicos. Los compuestos peptídicos monoméricos tienen una longitud de hasta 35 restos de aminoácidos, y preferiblemente una longitud de al menos 8, más preferiblemente al menos 10, y hasta 15 bloques de construcción de aminoácidos.

En una realización, los compuestos peptídicos de la invención comprenden un grupo Z N-terminal que comprende un resto de aminoácido aromático, preferiblemente un resto de a-aminoácido que comprende al menos un anillo aromático mono-o policíclico, preferiblemente al menos un anillo aromático bi-o tricíclico, por ejemplo fenilo, naftilo, antracenilo, difenilo, indolilo, etc., o un grupo di-, tri-o tetrapeptidílico que comprende al menos un bloque de construcción de aminoácido aromático como se describe anteriormente.

Los ejemplos específicos para restos de aminoácidos aromáticos son triptófano, N-metiltriptófano, fenilalanina, 1fenilalanina, naftilalanina, 1-naftilalanina, 1-difenilalanina, 1-(4,4’-bifenil)alanina, 1-antracen-9-ilalanina y 1-indol-3ilalanina, o sus derivados sustituidos, por ejemplo mono-o polialquil sustituidos. Más preferiblemente, el resto de aminoácido aromático comprende una cadena lateral de triptófano (W), por ejemplo L (o D)-triptófano.

En una realización adicional, los compuestos peptídicos de la invención comprenden un grupo Z N-terminal que comprende un resto de aminoácido alifático, preferiblemente un resto de a-aminoácido que comprende una cadena lateral alifática, más preferiblemente una cadena lateral alifática ramificada de al menos tres átomos de carbono, por ejemplo 3, 4, 5, 6 ó 7 átomos de carbono, o un grupo di-, tri-o tetrapeptidílico que comprende al menos un bloque de construcción de aminoácido alifático como se describe anteriormente. Los ejemplos específicos para restos de aminoácidos alifáticos son derivados alquílicos ramificados, por ejemplo metílicos, de ácido 2-aminopentanoico, ácido 2-aminohexanoico o ácido 2-aminoheptanoico, o sus formas enantioméricas L o D. Más preferiblemente, el resto de aminoácido alifático comprende una cadena lateral de leucina (L), por ejemplo L-leucina.

En una realización adicional de la invención, el compuesto peptídico comprende un grupo N-terminal que es un resto de ácido piroglutámico (pyrE), o un grupo di-, tri-o tetrapeptidílico que comprende un resto de ácido piroglutámico Nterminal.

En todavía una realización adicional de la presente invención, el compuesto peptídico comprende un grupo Nterminal, que es un resto Q*, en el que Q* es un resto de aminoácido protegido con una cadena lateral de glutamina, particularmente L-glutamina protegida, o un grupo di-, tri-o tetrapeptidílico que comprende un resto Q* N-terminal para un derivado del mismo. Los ejemplos preferidos de restos Q* son restos dipeptidílicos X-Q, en los que X es un resto de aminoácido diferente de Q, tal como G (glicina), o un resto Q, en los que el aminoácido N-terminal y/o el grupo de cadena lateral carboxílica está protegido, por ejemplo mediante acilo, tal como grupos acetilo, grupos amino, etc.

En todavía una realización adicional, el compuesto peptídico de la presente invención comprende una combinación de un resto de aminoácido aromático y un resto de ácido piroglutámico N-terminal, o una combinación de un resto de aminoácido aromático y un resto Q* N-terminal.

En una realización especialmente preferida, el grupo Z N-terminal del compuesto peptídico se selecciona de Ar, Ar-Q, Q* tal como G-Q o acetilo-Q, Q*-Ar tal como G-Q-Ar o acetilo-Q-Ar, pyrE y pyrE-Ar, en los que Ar es un resto de aminoácido aromático como se define anteriormente.

Los ejemplos específicos de compuestos peptídicos según la presente invención comprenden una secuencia de

aminoácidos seleccionada de:

WKKIRVRLSA: (SEC ID NO: 6)

pyrEWKIRVRLSA: (SEC ID NO: 27)

GQWKIRVRLSA: (SEC ID NO: 14)

Acetil-QWKIRVRLSA: (SEC ID NO: 12)

Aoa-QWKIRVRLSA: (SEC ID NO: 16)

(GQWKIRVRLSA)2 K-1-Ala (SEC ID NO: 19)

en las que pyrE es un resto de ácido piroglutámico, Aoa es un resto de ácido 8-aminooctanoico, 1-Ala es un resto de 1-alanina, y en los que los péptidos anteriores están opcionalmente amidados en sus términos C.

En una realización preferida, la invención se refiere a un compuesto multimérico que comprende una pluralidad de compuestos peptídicos como se describe anteriormente. Por ejemplo, un compuesto multimérico de la presente invención puede comprender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más de los compuestos peptídicos. El compuesto multimérico puede comprender los compuestos peptídicos multimerizados en una matriz, por ejemplo una matriz a base de un polipéptido, un mono-, oligo-o polisacárido, o un polímero orgánico, preferiblemente un polímero orgánico lineal. Por ejemplo, la matriz se puede seleccionar de poli(N-alquil(met)acrilamida), poli(N,N-dialquil(met)acrilamida), polimelamina, dextrano, ciclodextrina, polietilenglicol y/o polivinilpirrolidona. El acoplamiento de los compuestos peptídicos a la matriz se produce preferiblemente vía los términos N y/o C del compuesto peptídico, por ejemplo usando ligadores homo-y/o hetero-bifuncionales que permiten el acoplamiento a grupos reactivos, por ejemplo grupos hidroxi, amino, tiol o carboxilo en la matriz.

En una realización preferida adicional, el compuesto multimérico tiene una estructura ramificada, particularmente 5 una estructura dendrímera.

En todavía una realización adicional, el compuesto multimérico se selecciona de:

(i) R-(Y1 -R)m-Y1 -(R)m’ (IIa)

en el que R es un compuesto peptídico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, Y1 es un enlace covalente o un ligador bifuncional, por ejemplo un dialcohol tal como propilenglicol, un ácido dicarboxílico tal

10 como ácido succínico, una diamina tal como etilendiamina, un aminoácido, un ácido hidroxicarboxílico, por ejemplo un ácido hidroxialcanoico, o un diisocianato, y m es 0 o un número entero positivo, y m’ es 0 ó 1,

(ii) [[(R)n1 Y1’]n2] Y2 (IIb)

en la que R es un compuesto peptídico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-5,

Y1’ es, en cada caso, independientemente, un ligador que tiene una funcionalidad de al menos 3, por ejemplo

15 un aminoácido trifuncional tal como lisina, ornitina, norlisina, aminoalanina, ácido aspártico o ácido glutámico, y

Y2 es un ligador que tiene una funcionalidad de al menos 2, y

n1 y n2 son, en cada caso, independientemente, un número entero de al menos 2, preferiblemente 2, 3 ó 4, más preferiblemente 2,

20 (iii) {[[(R)n1 Y1]n2] Y2’}n3 Y3 (IIc)

Y1 e Y2’ son, en cada caso, ligadores independientes que tienen una funcionalidad de al menos 3, por ejemplo un aminoácido trifuncional tal como lisina, ornitina, norlisina, aminoalanina, ácido aspártico o ácido glutámico,

Y3 es un ligador que tiene una funcionalidad de al menos 2, y

25 n1, n2 y n3 son, en cada caso, independientemente, números enteros de al menos 2, preferiblemente 2, 3 ó 4, más preferiblemente 2.

El compuesto multimérico (IIa) es un compuesto lineal multimérico, en el que una pluralidad de compuestos peptídicos están conectados vía enlaces covalentes y/o ligadores homo-o hetero-bifuncionales Y1. Preferiblemente, el compuesto multimérico comprende hasta 8, más preferiblemente hasta 4 unidades de compuesto peptídico (Ib).

30 Los compuestos multiméricos (IIb) y (IIc) son compuestos ramificados, en los que las unidades peptídicas individuales R están conectadas vía ligadores que tienen una funcionalidad de al menos 3. En una realización preferida, el compuesto multimérico (IIb) comprende 4 unidades peptídicas, y tiene la estructura:

En una realización preferida adicional, el compuesto multimérico (IIc) comprende 8 unidades peptídicas, y tiene una 35 estructura:

En todavía una realización adicional de la presente invención, los compuestos peptídicos y multiméricos comprenden al menos una modificación, particularmente seleccionada de un resto lipídico, amídico, de éster, acílico y/o alquílico unido a los mismos, por ejemplo unido a un grupo N-terminal, un grupo C-terminal y/o un grupo de cadena lateral. Se prefieren las modificaciones N-y/o C-terminales.

Una modificación especialmente preferida es la unión de al menos un resto lipídico, que es al menos un ácido aminocarboxílico que comprende un grupo hidrocarbonado lineal o cíclico, saturado o mono-o poliinsaturado, que tiene 3 a 25, y preferiblemente 5 a 25 átomos de carbono, por ejemplo ácido 5-aminovaleroico, ácido 8aminooctanoico, o ácido 2-aminodecanoico. Preferiblemente, el resto lipídico está unido al término N y/o C del compuesto. Los restos lipídicos se pueden unir, por ejemplo, a términos N o C libres de compuestos peptídicos y/o compuestos multiméricos. Sin embargo, los restos lipídicos también se pueden unir a ligadores N-y/o C-terminales, por ejemplo como se describe para los compuestos (IIa), (IIb) y (IIc). En una realización preferida de compuestos (IIb) y (IIc), los ligadores C-terminales Y2 e Y3 son ligadores trifuncionales a los que se puede unir un resto lipídico.

Una realización preferida adicional es la unión de grupos acílicos, por ejemplo acetilo, a los términos N, y/o la amidación de los términos C libres.

Los compuestos de la presente invención pueden tener actividad antimicrobiana, particularmente actividad frente a organismos patógenos seleccionados de organismos procariotas, por ejemplo eubacterias o arqueas, y organismos eucariotas, por ejemplo hongos, algas o parásitos. Preferiblemente, los compuestos tienen actividad antibacteriana, por ejemplo actividad frente a bacterias gramnegativas y/o grampositivas.

Los compuestos de la presente invención también pueden tener actividad anti-biopelícula. Están surgiendo con el tiempo infecciones relacionadas con la inserción de dispositivos médicos en el organismo. El proceso implica la adhesión del organismo sobre dispositivos, la multiplicación y la formación de biopelículas. Las biopelículas son difíciles de erradicar con agentes antimicrobianos convencionales, estando la resistencia antimicrobiana determinada por alguna peculiaridad del crecimiento de la biopelícula (Ref. 10). En consecuencia, en un aspecto adicional, los compuestos según la invención también se pueden usar para prevenir o inhibir el crecimiento y proliferación de bacterias embebidas en biopelículas, tales como, pero sin limitarse a: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, y Staphylococcus aureus.

Una materia objeto adicional de la presente invención es una composición para uso médico que comprende al menos un compuesto como se define anteriormente por ejemplo un compuesto peptídico o multimérico como se define anteriormente, junto con vehículos, diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables. Para uso en medicina humana o veterinaria, la composición está preferiblemente en forma de una forma de dosificación farmacéutica seleccionada de sólidos, líquidos o geles, y sus combinaciones, por ejemplo como un colirio, colutorio, ungüento, aerosol o producto tópico. La forma de dosificación farmacéutica comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva del compuesto peptídico monomérico o multimérico de la invención, es decir, una cantidad del agente activo que es efectiva para el tratamiento y/o prevención de trastornos provocados por, asociados con o acompañados de la presencia de organismos patógenos. La frase “farmacéuticamente aceptable” se emplea aquí para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que son, dentro del alcance del juicio médico razonable, adecuados para uso en contacto con los tejidos de seres humanos o, según sea el caso, un animal, sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica, u otro problema o complicación, en proporción con una relación razonable de beneficio/riesgo.

La cantidad real del agente activo en la forma de dosificación farmacéutica de la invención puede variar dependiendo de la vía de administración y del tipo y gravedad de trastorno a tratar. Para lograr el efecto o efectos deseados, el compuesto peptídico monomérico o multimérico se puede administrar como una única dosis o como dosis divididas, por ejemplo, de al menos alrededor de 0,01 mg/kg a alrededor de 200 a 550 mg/kg, de al menos alrededor de 0,01 mg/kg a alrededor de 100 a 300 mg/kg, al menos alrededor de 0,1 mg/kg a alrededor de 50 a 100 mg/kg, o al menos alrededor de 1 mg/kg a alrededor de 10 a 50 mg/kg de peso corporal, o al menos alrededor de 1 mg/kg a alrededor de 20 mg/kg de peso corporal, aunque otras dosis pueden proporcionar resultados beneficiosos.

Para preparar la composición farmacéutica, los péptidos de la invención se sintetizan o se obtienen de otro modo, se purifican según sea necesario o se desee, y después preferiblemente se liofilizan y se estabilizan. El péptido se puede ajustar entonces a la concentración adecuada y se puede combinar opcionalmente con los otros agentes farmacéuticamente aceptables.

De este modo, se puede administrar una o más formas de dosificación unitaria adecuadas que comprenden los péptidos terapéuticos de la invención mediante una variedad de vías, incluyendo las vías oral, tópica, parenteral (incluyendo la subcutánea, intravenosa, intramuscular e intraperitoneal), vaginal, rectal, dérmica, transdérmica, intratorácica, intrapulmonar e intranasal (respiratoria).

Para administración tópica, los agentes activos se pueden formular como se conoce en la técnica para aplicación directa a un área diana, por ejemplo uñas y piel. Las formas principalmente acondicionadas para aplicación tópica toman la forma de, por ejemplo, lacas, cremas, leches, geles, polvos, dispersiones o microemulsiones, lociones espesadas en mayor o menor medida, almohadillas impregnadas, ungüentos o palitos, formulaciones en aerosol (por ejemplo pulverizaciones o espumas), jabones, detergentes, lociones o tortas de jabón. Otras formas convencionales para este fin incluyen gasas para heridas, vendajes revestidos u otros recubrimientos poliméricos, ungüentos, cremas, lociones.

En una realización preferida adicional, los compuestos monoméricos o multiméricos o la composición de la presente invención se usan en aplicaciones de medicina veterinaria. Por tanto, la presente invención también se refiere a una composición veterinaria que comprende al menos un compuesto como se describe anteriormente.

Todavía una realización adicional de la presente invención se refiere a una composición para uso como un desinfectante y/o detergente, que comprende al menos un compuesto como se describe anteriormente, o para uso de un conservante, por ejemplo un conservante para productos médicos, cosméticos o alimentarios, que comprende al menos un compuesto descrito anteriormente.

Una realización adicional de la presente invención se refiere a una composición para disminuir el crecimiento o proliferación de microorganismos embebidos en biopelículas, que comprende al menos un compuesto como se describe anteriormente.

En todavía una realización adicional de la presente invención, los compuestos peptídicos y las composiciones se usan para tratar la superficie de un dispositivo, preferiblemente un dispositivo médico que es deseable que sea resistente a microorganismos. En particular, según este aspecto de la invención, los compuestos peptídicos y su composición se revisten sobre la superficie de un dispositivo médico, en particular uniendo, revistiendo y/o embebiendo los compuestos y composiciones de la invención en un dispositivo médico. Los ejemplos de dispositivos médicos incluyen tubos y cánulas, endoprótesis vasculares, instrumentos quirúrgicos, catéteres, marcapasos, válvulas protésicas de corazón, articulaciones protésicas, prótesis de la voz, lentes de contacto, y dispositivos intrauterinos.

Adicionalmente, la presente invención se explicará con más detalle mediante las siguientes figuras y ejemplos.

Breve descripción de los dibujos:

La Figura 1 muestra una gráfica de supervivencia de Kaplan-Meyer de los ensayos in vivo de eficiencia, en los que el compuesto peptídico dimérico ID24 (SEC ID NO:24, véase Tabla 4) de la invención se compara con el compuesto antibiótico de referencia colistin metanosulfonato de sodio (CMS) al mismo régimen de dosis en un modelo de septicemia en ratones.

La Figura 2a y la Figura 2b muestran dos gráficas de histogramas, en las que se da a conocer la exposición de una biopelícula de 24 horas de P. aeruginosa ATCC 27853 a diferentes concentraciones del compuesto peptídico dimérico ID24 y el compuesto antibiótico de referencia CMS, respectivamente.

En particular, la Figura 2a muestra la exposición de la biopelícula de 24 horas de P. aeruginosa ATCC 27853 a diferentes concentraciones del compuesto ID24 de la invención. El número de réplicas/concentración es n = 2.

En particular, la Figura 2b, por otro lado, muestra la exposición de la biopelícula de 24 horas de P. aeruginosa ATCC 27853 a diferentes concentraciones de la colistin metanosulfonato de sodio (CMS). El número de réplicas/concentración es n = 2.

EJEMPLOS

Materiales

Los disolventes, todos de grado HPLC, se obtuvieron de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, US) y se usaron sin purificación adicional. La N,N-diisopropiletilamina (DIPEA), la piperidina, el ácido trifluoroacético y el triisopropilsilano se adquirieron de Aldrich y Fluka (St. Louis, MO, US). Los Fmoc-aminoácidos, HOBT, HBTU y las resinas se suministraron de Chem-Impex International (Wooddale, III.) y Merck (Darmstadt, Alemania).

Síntesis peptídica. Todos los péptidos se sintetizaron mediante síntesis en fase sólida en un MultiSynTech Syro (Witten, Alemania), usando química de Fmoc/tBu. La activación del acoplamiento se llevó a cabo mediante HOBt/DIPEA/HBTU (1/2/0,9) en DMF, y la protección mediante Fmoc en la amina se eliminó empleando piperidina al 40% en NMP. Los grupos protectores de las cadenas laterales fueron: éster terc-butílico para Glu y Asp; tritilo para His, Gln y Asn; 2,2,4,6,7-pentametildihidro-benzofuran-5-sulfonilo (Pbf) para Arg; éter terc-butílico para Ser, Thr y Tyr; terc-butiloxicarbonilo (Boc) para Lys, Pro y Trp. Fmoc-Lys(Fmoc)-OH fue el aminoácido usado para sintetizar péptidos diméricos y tetraméricos. El ácido Fmoc-5-aminovalérico (5-Ava) y el ácido Fmoc-8-aminooctanoico (8-Aoa) se usaron para llevar a cabo la lipidación en el término N y/o C tanto en péptidos lineales como diméricos. Los péptidos tetraméricos, diméricos y lineales se prepararon en resina de 4-benzhidrilamina de amida de Rink (MBHA), evaluando mediante medidas espectrofotométricas la carga final en grupos amino libres, mientras que los péptidos ácidos se prepararon en una resina de cloruro de 2-clorotritilo. Todos los péptidos se escindieron de las resinas y se desprotegieron mediante tratamiento con ácido trifluoroacético, agua y triisopropilsilano (TIPS, 95:2.5:2,5). Los péptidos brutos, obtenidos mediante precipitación en éter dietílico, se purificaron mediante Waters HPLC-UV (Milford, MA) en una columna Phenomenex C12, y se caracterizaron mediante espectrometría de MALDI-TOF de Bruker (Billerica, Massachusetts).

Determinación de MIC. Las MICs se determinaron en MHB mediante la metodología de microdilución en caldo, según el procedimiento de CLSI (antiguamente NCCLS, Ref. 11) usando inóculos bacterianos finales de 1-5 x 105 CFU/ml. Los ensayos se llevaron a cabo en placas de microtitulación de 96 pocillos estériles con pocillos de fondo redondo (Corning Costar). Las placas se incubaron a 37ºC y se leyeron después de 20-24 h. La MIC se definió como la concentración más baja de fármaco que provoca la supresión completa de crecimiento bacteriano visible. Todos los compuestos se disolvieron en 5% v/v de DMSO.

EJEMPLO I

Síntesis de minilibrería 2-X1

La síntesis peptídica se llevó a cabo en una resina de cloruro de 2-clorotritilo, como se describe anteriormente. Se sintetizaron seis péptidos ácidos lineales, que tienen la secuencia general H-X1-KKIRVRLSA-OH, con X1= F, I, L, V, W, Y, y se combinaron en cantidades equimolares. La mezcla peptídica bruta resultante se purificó en una columna de HPLC C12 a fin de eliminar las sales y depuradores procedentes de la escisión, y se analizó mediante LC-MS (ESI/trampa de iones) acoplado a un sistema de HPLC (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), eluyendo los componentes con un modo de gradiente (B: 5 -95% en 20 min.; A: 0,1% de TFA en agua, B: 0,1% de TFA en acetonitrilo) a un caudal de 1,0 ml/min. MS (LC-MS ESI/trampa de iones): (ID2) calculado para C56H100N18O12 (X1=F) es (M) 1216, encontrado es 1217 (M+H); (ID3) calculado para C53H102N18O12 (X1 = I) es (M) 1182, encontrado es 1183 (M+H); (ID4) calculado para C53H102N18O12 (X1 = L) es (M) 1182, encontrado es 1183 (M+H); (ID5) calculado para C52H100N18O12 (X1 = V) es (M) 1168, encontrado es 1169 (M+H); (ID6) calculado para C58H101N19O12 (X1 = W) es (M) 1255, encontrado es 1256 (M+H); (ID7) calculado para C56H100N18O13 (X1 = Y) es (M) 1232 , encontrado es 1233 (M+H).

EJEMPLO II

Síntesis de minilibrería 3-X1

La síntesis peptídica se llevó a cabo como se describe anteriormente. Se sintetizaron seis péptidos ácidos lineales, que tienen la secuencia general H-Q-X1-KIRVRLSA-OH con X1 = F, I, L, V, W, Y, y se combinaron en cantidades equimolares. La mezcla peptídica bruta se purificó como se da a conocer en el Ejemplo I. MS (LC-MS ESI/trampa de iones): (ID8) calculado para C55H96N18O13 (X1 = F) es (M) 1216, encontrado es 1217 (M+H); (ID9) calculado para C53H101N18O13 (X1 = I) es (M) 1197, encontrado es 1198 (M+H); (ID10) calculado para C52H98N18O13 (X1 = L) es (M) 1182, encontrado es 1183 (M+H); (ID11) calculado para C51H96N18O13 (X1 = V) es (M) 1168, encontrado es 1169 (M+H); (ID12) calculado para C57H97N19O13 (X1 = W) es (M) 1255, encontrado es 1256 (M+H); (ID13) calculado para C55H96N18O14 (X1 = Y) es (M) 1232, encontrado es 1233 (M+H).

EJEMPLO III

Síntesis de péptido ácido lineal: ID1, ID6 e ID14

La síntesis del péptido ácido se llevó a cabo como se describe anteriormente. Después de la síntesis, los péptidos brutos se purificaron mediante HPLC-UV mediante un gradiente B 5 -95% en 20 min., y se caracterizaron

mediante MALDI-TOF. Los valores de las masas (M+H) fueron: (ID1) calculado es (M) 1197, encontrado es 1198 (M+H); (ID6) calculado es (M) 1255, encontrado es 1256 (M+H); (ID14) calculado es (M) 1383, encontrado es 1384 (M+H).

EJEMPLO IV

Síntesis de amidopéptido lineal N-acilado: ID15, ID16 e ID17

La síntesis del amidopéptido se llevó a cabo en una resina de amida de Rink, como se describe en el párrafo de Síntesis Peptídica. Después de la síntesis, los péptidos brutos se purificaron mediante HPLC-UV y se caracterizaron mediante MALDI-TOF, como se da a conocer en el Ejemplo I. Los valores de las masas (M+H) fueron: (ID15) calculado es (M) 1395, encontrado es 1397 (M+H) ; (ID16) calculado es (M) 1395, encontrado es 1397 (M+H); (ID17) calculado es (M) 1337, encontrado es 1339 (M+H).

EJEMPLO V

Síntesis de péptido dimérico: ID18, ID19 e ID20

La síntesis peptídica se llevó a cabo como se describe anteriormente. Tras la síntesis, los péptidos brutos se purificaron mediante HPLC-UV y se caracterizaron mediante MALDI-TOF, como se da a conocer en el Ejemplo I. Los valores de las masas (M+H) fueron: (ID18) calculado es (M) 2694, encontrado es 2696 (M+H); (ID19) calculado es (M) 2807, encontrado es 2808 (M+H); (ID20) calculado es (M) 2691, encontrado es 2692 (M+H).

EJEMPLO VI

Síntesis de péptido lipidado dimérico: ID21, ID22, ID23 e ID24

La síntesis peptídica se llevó a cabo como se describe anteriormente. Tras la síntesis, los péptidos brutos se purificaron mediante HPLC-UV y se caracterizaron mediante MALDI-TOF, como se da a conocer en el Ejemplo I. Los valores de las masas (M+H) fueron: (ID21) calculado es (M) 2891, encontrado es 2892 (M+H); (ID22) calculado es (M) 2891, encontrado es 2893 (M+H); (ID23) calculado es (M) 2859, encontrado es 2862 (M+H); (ID24) calculado es (M) 2763, encontrado es 2764 (M+H).

EJEMPLO VII

Ensayo de citotoxicidad in vitro

Se hicieron crecer HeLa (estirpe celular de carcinoma epitelial humano), HepG2 (estirpe celular de carcinoma hepático hepatocelular humano) y HaCat (queratinocito humano) hasta confluencia, y después se cultivaron en placas a 20.000, 12.500 y 30.000 células por pocillo (previamente se había determinado el recuento celular óptimo para cada estirpe celular). Después de 24 horas, se añadió ID24 en DMEM sin FBS, a una concentración que oscila desde 800 a 100 ug/ml. Como controles positivos, también se añadieron 100 ul de células lavadas con medio sin suero que representan 100% de viabilidad, y, como negativos, 100 ul de medio sin suero.

Después de 24 horas de incubación a 37ºC en una atmósfera de CO2 al 5% v/v, se añadieron a cada pocillo 10 ul de reactivo MTT [bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrasodio, concentración final 0,5 mg/ml], y se incubó durante 2 a 4 horas. La solubilización de formazano, formado mediante reducción metabólica de MTT, se obtuvo usando la disolución de mezcla de parada (10% p/v de dodecilsulfato de sodio, 45% v/v de dimetilformamida, ajustada a pH 4,5 con ácido acético glacial). Las placas se leyeron en un espectrofotómetro de microplacas (Biorad, Benchmark plus). Los cultivos expuestos a ID24 o expuestos al medio solo se midieron espectrofotométricamente a longitud de onda dual (565-650 nm). El experimento se llevó a cabo en tres réplicas.

EJEMPLO VIII

Hemólisis in vitro

La hemólisis se determinó mediante dos ensayos diferentes. Uno de ellos se adaptó del método de Shin et al. (Ref. 12), usando sólo eritrocitos humanos recientes. En el segundo, se incubó una disolución de ID24 en sangre completa.

Primer método

El ensayo de hemólisis se adaptó del método de Shin et al. (Ref. 12). Se usaron eritrocitos humanos recientes para ensayar las actividades hemolíticas de los péptidos. Se recogió sangre completa en un tubo estéril con una disolución al 4% p/v de citrato de sodio (en una relación 1:10 de citrato de sodio:sangre completa), se puso en hielo y se centrifugó a 1000 g durante 5 minutos a 4ºC.

El sobrenadante, que incluye los leucocitos encima del pelete de eritrocitos, se retiró con cuidado y se desechó. Los eritrocitos intactos se lavaron tres veces con 2 volúmenes (1 ml) de disolución salina libre de pirógenos preenfriada (PBS 1x). Las suspensiones de eritrocitos se ajustaron a 0,8% (8 ul en 1 ml o 160 ul en 20 ml) de PBS 1x.

Para el ensayo de hemólisis, se prepararon diluciones de dos veces en serie de ID24 en PBS 1x, y se añadieron alícuotas de 100 ul a volúmenes iguales de 0,8% de suspensión eritrocítica en PBS 1x en placas estériles de microtitulación de 96 pocillos (Nunc) por triplicado. Las placas se incubaron a 37ºC durante 2 h.

Subsiguientemente, el eritrocito intacto se peletizó centrifugando a 1000 g durante 5 minutos a 4ºC. En consecuencia, se transfirieron cien microlitros de sobrenadante desde cada pocillo a una nueva placa de microtitulación de 96 pocillos, y la cantidad de hemoglobina liberada en el sobrenadante se determinó leyendo la absorbancia a 414 nm frente a una longitud de onda de referencia de 490 nm. Un control positivo con 100 ul de 0,4% de eritrocito lisado en 1% de Triton X-100 en PBS 1x (200 ul de suspensión eritrocítica 0,8% en PBS 1x y 200 ul de PBS 1x con 2% (4 ul) de Triton X-100) se tomó como una lisis del 100%. El control negativo fueron eritrocitos en PSB 1x solo, que dio una lisis mínima. Esto se tomó como 0% de hemólisis

Segundo método

Se recogió sangre completa en un tubo estéril con una disolución al 4% p/v de citrato de sodio (en una relación 1:10 de citrato de sodio:sangre completa), y se conservó en hielo. Se añadieron diluciones en serie de ID24 (1 mg/ml a 62,5 ug/ml) a sangre completa en una relación 1:1 ó 1:10. El potencial hemolítico se expresó con relación a saponina, añadida en la misma relación, considerada como hemólisis del 100%. El control negativo fue sangre completa en disolución fisiológica, que dio una lisis mínima. Se añadieron alícuotas de 100 ul de cada suspensión en placas estériles de microtitulación de 96 pocillos (Nunc) por triplicado. Las placas se incubaron a 37ºC durante 30 minutos.

Subsiguientemente, la suspensión se peletizó mediante centrifugación a 1000 g durante 10 minutos a 4ºC. Cien microlitros de sobrenadante procedente de cada pocillo se transfirió en consecuencia a una nueva placa de microtitulación de 96 pocillos, y la cantidad de hemoglobina liberada en el sobrenadante se determinó leyendo la absorbancia a 560 nm.

EJEMPLO IX

Eficacia in vivo en un modelo de septicemia en ratones

Se administró intravenosamente ID24 a ratones infectados intraperitonealmente con 7,5 x 102 CFU de E. coli EC47 en un volumen final de 0,5 ml. En particular, ID24 se administró a dosis de 3 mg/kg a 15 min. y 6 h después de la infección. Se administró colistin metanosulfonato de sodio (CMS) como una inyección única 15 min. después de la infección a una dosis de 3 mg/kg.

Animales

Se usaron ratones hembra ICR (Harlan Italy, San Pietro al Natisone, Italia) que pesan 25 g el día del experimento. Los ratones se enjaularon durante al menos 5 días en una habitación de temperatura y humedad controladas antes de comenzar el experimento, y se alimentaron con pienso estándar de laboratorio y agua a voluntad.

Compuestos de ensayo y de referencia

Los compuestos de ensayo y de referencia, ID24 y colistin metanosulfonato de sodio (CMS) respectivamente, se disolvieron en 0,1 M de disolución salina tamponada con fosfato pH 6,9, a las concentraciones de fármaco requeridas. Se obtuvieron disoluciones justo antes de la administración, y se almacenaron a 4ºC hasta el final de los tratamientos programados. El valor de MIC de ID24 en la cepa EC47 de E. coli es 2 ug/ml [MIC se determinó mediante el método de microdilución en caldo en medio de Muller Hinton (directrices de NCCLS), usando un inóculo bacteriano de aproximadamente 105CFU/ml].

Preparación de suspensión infectante

Para inocular 50 ml de caldo de infusión de cerebro-corazón de Difco, se usó un vial congelado de la cepa EC47 de Escherichia coli, el cultivo se incubó en un baño de agua agitador giratorio (New Brunswick Scientific, N.J., USA) durante 20 horas a 35ºC, y después se diluyó 1:1.000.000 en 5% de mucina bacteriológica de Difco. El tamaño real del inóculo se determinó cultivando en placas dos alícuotas de 0,025 ml de disoluciones de 10 veces de la suspensión en placas de agar Difco Todd Hewitt.

A los animales se les infectó intraperitonealmente con 7,5 x 102 CFU de EC47 de Escherichia coli en un volumen final de 0,5 ml. Este inóculo fue suficiente para exterminar al 100% de los animales sin tratar en 72 h de infección.

Tratamiento antibiótico

Se administró ID24 a dosis de 3 mg/kg, a 15 min. y 6 h después de la infección. La dosis global es 6 mg/kg. Se administró colistin metanosulfonato de sodio (CMS) a una dosis, a saber, 3 mg/kg en una única inyección a 15 min. después de la infección.

El tratamiento se realizó mediante vía intravenosa (0,25 ml/ratón); se trataron ocho animales con cada dosis de cada antibiótico. La mortalidad se registró una vez al día durante 7 días tras la inoculación bacteriana.

EJEMPLO X

Procedimiento experimental de erradicación de biopelícula

Se vertió un inóculo de fase exponencial de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 de aproximadamente 1 x 107 CFU/ml en un depósito para reactivos de placas de Innovotech para el ensayo de alto rendimiento de MBEC TM (Innovotech Inc., Edmonton, Canadá). Se añadieron 22 ml de inóculo al pocillo, y se le colocó encima la tapa de peg. El dispositivo se colocó en una incubadora de agitación a 800 rpm en una caja humidificada a 37ºC.

Después de 24 horas de incubación, los pegs se enjuagaron en una placa que contiene 200 ul de disolución fisiológica, para eliminar células planctónicas poco adherentes de la biopelícula, y después se colocaron en una microplaca que contiene 200 ul de diferentes disoluciones antibióticas diluidas en serie en TSB.

Después de 4 horas de contacto e incubación a 37ºC en la incubadora de agitación, la tapa de peg se retiró del pocillo y se sumergió en una placa de enjuagado durante 2 minutos.

Después, un nuevo microtítulo con disolución salina que contiene los pegs de muestra se colocó en la bandeja del limpiador ultrasónico y se sometió a ultrasonidos durante 30 minutos para destruir la biopelícula de la superficie de los 96 pegs.

Se extendieron sobre la placa de MHA alícuotas duplicadas de 0,01 ó 0,005 ml de una dilución en serie de diez veces de cada pocillo, y las colonias se leyeron en busca de células viables contando después de 24 horas de incubación.

EJEMPLO XI

Toxicidad aguda in vivo

Animales

En el día del experimento, se usaron ratones hembra CD1 de 9-10 semanas (Charles River Lab. Italia s.r.l. Via Indipendenza, 11-23885 Calco (LC), Italia), que pesan de media 28,23 g. Los ratones se enjaularon durante 3 días en una habitación de temperatura y humedad controladas antes de comenzar el experimento, y se alimentaron con pienso estándar de laboratorio y agua a voluntad

Compuesto de ensayo

Se disolvió ID24 y se sometió a ultrasonidos en disolución estéril de NaCl al 0,9% p/v (Sigma-Aldrich) para la administración a seres humanos a las concentraciones de dosis de 20 y 40 mg/kg. La preparación del compuesto se llevó a cabo justo antes de la administración.

Administración de antibiótico

Se administraron dos dosis de ID24 con una única inyección intraperitoneal a ratones: 20 mg/kg y 40 mg/kg. Se trataron cinco animales con cada dosis de antibiótico. Los síntomas adversos se monitorizaron diariamente durante 7 días después de la inyección.

Evaluación de resultados

Las supervivencias y los signos clínicos/de comportamiento se registraron diariamente durante 14 días.

Parámetros observados

Parámetros de comportamiento y signos clínicos principales proporcionados por el test de Irwin (Ref. 13).

La observación de todos los grupos después de una única inyección de la dosis nos permite resaltar los siguientes síntomas y alteraciones de comportamiento: -20 mg/kg: sin alteraciones de comportamiento; -40 mg/kg: sin alteraciones de comportamiento.

No se registraron síntomas adversos, ni alteraciones de comportamiento ni muertes tras la administración IP de ID24, también a la dosis más elevada de 40 mg/kg.

RESULTADOS

Construcción de minilibrerías y determinación de las MICS

5 El decapéptido lineal SEC ID NO 1 descrito en el documento WO 2006/006195 se optimizó en términos de actividad frente a bacterias gramnegativas. Este péptido fue activo cuando está presente como una estructura tetrámera en un núcleo de lisina. En forma monómera, el péptido sólo tuvo actividad insignificante. El enfoque de optimización consistió en la síntesis de nueve minilibrerías peptídicas, obtenidas mediante un barrido de secuencias como se da a conocer esquemáticamente en la Tabla 1.

10 Tabla 1. Las nueve librerías de barrido posicional decapeptídicas

Entrada de barrido*: Secuencia (A1 término N-A10 término C)

1-Xn: O -A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10

2-Xn: O -A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10

3-Xn: A1-O -A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10

4-Xn: A1-A2-O -A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10

5-Xn: A1-A2-A3-O -A5-A6-A7-A8-A9-A10

6-Xn: A1-A2-A3-A4-O -A6-A7-A8-A9-A10

7-Xn: A1-A2-A3-A4-A5-O -A7-A8-A9-A10

8-Xn: A1-A2-A3-A4-A5-A6-O -A8-A9-A10

9-Xn: A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-O -A9-A10

*: Xn corresponde a un grupo de seis aminoácidos que contiene: Si n = 1, O = F, I, L, V, W, Y; si n = 2, O = K R, H, N, P, Q; Si n = 3, O = G, A, S, T, D, E.

Todos los aminoácidos naturales se han dividido en tres grupos basándose en sus propiedades quimicofísicas. Se obtuvo una cantidad total de 27 minilibrerías, conteniendo cada una seis péptidos en cantidades equimolares, y se evaluó frente a E. coli ATCC 25922 como cepa de referencia. Los valores de la actividad, expresados en términos de

15 MIC, se dan en la Tabla 2. La MIC (Concentración Inhibidora Mínima) se define como la concentración más baja que inhibe el 100% de crecimiento visible.

Tabla 2. Las nueve minilibrerías de barrido posicional decapeptídicas: actividad de las 27 minilibrerías peptídicas resultantes frente a E. coli ATCC 25922

Entrada de barrido: MIC (ug/ml) Entrada de barrido MIC (ug/ml) Entrada de barrido MIC (ug/ml)

E. coli
E. coli
E. coli

1-X1: 125 4-X1 250 7-X1 125

1-X2: 125 4-X2 250 7-X2 >250

1-X3: 125 4-X3 >250 7-X3 >250

2-X1: 62,5 5-X1 125 8-X1 62,5-125

2-X2: 62,5 5-X2 >250 8-X2 250

2-X3: 125 5-X3 >250 8-X3 250

3-X1: 31,25-62,5 6-X1 125 9-X1 125

3-X2: 250 6-X2 250 9-X2 >250

3-X3: 125-250 6-X3 >250 9-X3 >250

SEC ID 1ª: >250

a: secuencia 10 mérica original inactiva

20 Se identificaron cuatro minilibrerías, que tienen una MIC de 62,5 ug/ml, como más activas que SEC ID NO 1. Estos péptidos se sintetizaron individualmente, a fin de evaluar la actividad de cada secuencia. Las librerías más activas 2-X1, 2-X2, 3-X1 y 8-X1 -se abrieron, y se evaluó la contribución de cada resto en cada posición de la secuencia a la actividad antimicrobiana. Además, también se han llevado a cabo modificaciones, tales como la N-y C-acilación y dimerización sobre Lys-1-Ala o Lys-8-Aoa (ácido 8-aminooctanoico), sobre las secuencias más activas aisladas de

25 las minilibrerías. En la Tabla 3, se dan los péptidos que pertenecen a las minilibrerías 2-X1, y 3-X1 ensayadas frente a las cepas gramnegativas E. coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 y Klebsiella pneumoniae ATCC 10031, y frente a la cepa grampositiva Staphylococcus aureus ATCC 25923. Las otras dos minilibrerías más activas, denominadas 2-X2, y 8-X1, también se abrieron, pero cada péptido ensayado individualmente resultó tener una actividad > 128 ug/ml (datos no mostrados).

Tabla 3. Los péptidos de las minilibrerías se sintetizaron individualmente: se dan las MICs (ug/ml) frente a bacterias gramnegativas y grampositivas

Nombre de la minilibrería 2-X1 3-X1: Nombre ID2 ID3 ID4 ID5 ID6 ID7 ID8 ID9 ID10 ID11 ID12 ID13 ID1 Secuencia peptídica H-F-KKIRVRLSA-OH H-I-KKIRVRLSA-OH H-L-KKIRVRLSA-OH H-V-KKIRVRLSA-OH H-W-KKIRVRLSA-OH H-Y-KKIRVRLSA-OH H-Q-F-KIRVRLSA-OH H-Q-I-KIRVRLSA-OH H-Q-L-KIRVRLSA-OH H-Q-V-KIRVRLSA-OH H-Q-W-KIRVRLSA-OH H-Q-Y-KIRVRLSA-OH H-QKKIRVRLSA-OH E. coli 256 256 256 512 64-128 256 128 512 128 256 64 >256 >512 MIC (ug/ml) P. aeruqinosa K. pneumoniae 256 512 256 512 256 512 512 >512 128 256 256 >512 128 >512 >512 512 128 >512 256 >512 64 >512 >512 >512 >512 >512 S. aureus 512 512 >512 512 512 >512 >512 >512 >512 >512 >512 >512 -

La introducción de ácido piroglutámico o el dipéptido Gly-Gln se puede llevar a cabo en la posición A1 sin afectar a la 5 actividad del péptido (datos no mostrados). Estas modificaciones evitan la formación de piroglutamato a partir de la ciclación de glutamina N-terminal.

Se sintetizaron dos péptidos seleccionados (SEC ID NO 6 y 14), aislados de las dos minilibrerías denominadas 2-X1-W y 3-X1-W, en forma dimérica (SEC ID NO 18 y 19), a fin de demostrar la mayor actividad relacionada con la polivalencia con respecto a sus contrapartes lineales. El péptido SEC ID NO 14 es un derivado del péptido

10 seleccionado SEC ID NO 12 con una Gly introducida en el término N a fin de evitar la ciclación de Gln. Además, se llevaron a cabo modificaciones tales como la lipidación con ácido 5-aminovalérico (5-Ava) y ácido 8-aminooctanoico (8-Aoa) en el término N (SEC ID NO 16, 16, 17, 21, 22 y 23) y en el término C (SEC ID NO 24) de los péptidos tanto lineal como dimérico, y se ensayaron los productos resultantes.

En la Tabla 4 se dan los valores de MIC de los péptidos lineal y dimérico, y sus lipoderivados.

15 Tabla 4. Valores de MIC de péptidos lineales y diméricos y sus lipoderivados

SEC ID N°: Secuencia peptídica MIC (ug/ml)

E. coli: P. aeruginosa K. pneumoniae S. aureus

ID6: H-W-KKIRVRLSA-OH 64-128 128 256 512

ID14: H-G-Q-W-KIRVRLSA-OH 64 64 >512 >512

ID1: H-QKKIRVRLSA-OH >512 >512 >512 -

ID15: H-8-Aoa-W-KKIRVRLSA-NH2 32 >64 >64 ND

ID16: H-8-Aoa-Q-W-KIRVRLSA-NH2 32 >64 >64 ND

ID17: H-8-Aoa-QKKIRVRLSA-NH2 64 >64 >64 ND

ID18: (H-W-KKIRVRLSA)2-Lys-1-Ala-NH2 4 32 32 ND

ID19: (H-G-Q-W-KIRVRLSA)2-Lys-1-Ala-NH2 16 >64 >64 ND

ID20: (H-G-QKKIRVRLSA)2-Lys-1-Ala-NH2 16-32 >64 >64 ND

ID21: (H-5-Ava-W-KKIRVRLSA)2-Lys-1-Ala-NH2 8-16 64 64 ND

ID22: (H-5-Ava-Q-W-KIRVRLSA)2-Lys-1-Ala-NH2 16 >64 >64 ND

ID23: (H-8-Aoa-QKKIRVRLSA)2-Lys-1-Ala-NH2 32 >64 >64 ND

ID24: (H-W-KKIRVRLSA)2-Lys-8-Aoa-NH2 4 32 ND ND

ND: no determinado

Los dos compuestos ID18 e ID24 resultaron ser los más activos. Estos compuestos se ensayaron frente a un gran panel de aislados clínicos gramnegativos, y los valores relativos de MIC se dan en la Tabla 5 (partes 1-3).

Tabla 5. Actividad in vitro de ID24 e ID18 frente a varios aislados clínicos de bacterias gramnegativas (parte 1)

Microorganismo: Código de la cepa MIC ( g/ml)

ID24: ID18

Acinetobacter baumannii N=3: ND000407 16 16

ND021408: 8 8

ND021808: 8 8

Intervalo: 8-16 8-16

Acinetobacter iwoffi: ND033508 32 16

Enterobacter cloacae N=4: ND001607 4 4

ND020808: 16 32

ND029008: 16 32

ND029408: 16 16

Intervalo: 4-16 4-32

Klebsiella oxytoca N=2: ND021308 32 32

ND023408: 16 32

Intervalo: 16-32 32

Pseudomonas aeruginosa N=5: ATCC10145,L4 16 16

ND000207: 16 16

ND010907: 8 8

ND033808: 8 8

ND035408: 8 8

Intervalo: 8-16 8-16

Tabla 5. Actividad in vitro de ID24 e ID18 frente a varios aislados clínicos de bacterias gramnegativas (parte 2) Tabla 5. Actividad in vitro de ID24 e ID18 frente a varios aislados clínicos de bacterias gramnegativas (parte 3)

Microorganismo: Código de la cepa MIC ( g/ml)

ID24: ID18

Escherichia coli N=28: VECO2526 4 4

L47: 4 8

ND008007: 8 8

ND020408: 32 32

ND021608: 16 32

ND021708: 8 32

ND022008: 4 8

ND022108: 4 8

ND022308: 4 4

ND022508: 4 4

ND022608: 8 8

ND023008: 8 16

ND023208: 4 2

ND023808: 8 8

ND023908: 4 4

ND027008: 8 8

ND027408: 16 16

ND027608: 16 8

ND027708: 8 8

ND027808: 16 16

ND028408: 8 16

ND028608: 8 8

ND028808: 16 16

ND028908: 16 32

ND029208: 4 2

ND029508: 4 4

ND033208: 16 16

ND034008: 16 16

Intervalo: 4-32 2-32

Proteus mirabilis N=9: ND022208 >128 >128

ND022408: >128 >128

ND022808: >128 >128

ND022908: >128 >128

ND023308: >128 >128

Microorganismo: Código de la cepa MIC ( g/ml)

ID24: ID18

ND023508: >128 >128

ND027108: >128 >128

ND027508: >128 >128

ND029108: >128 >128

Intervalo: >128 >128

Microorganismo: Código de la cepa MIC ( g/ml)

ID24: ID18

Klebsiella pneumoniae N=17: ND003407 4 8

ND007507: 8 8

ND020308: 16 16

ND020507: 16 8

ND022708: 4 8

ND023608: 8 16

ND023708: 16 8

ND026408: 8 8

ND027208: 8 8

ND027308: 8 8

ND027908: 4 8

ND028008: 8 8

ND028108: 16 16

ND028208: 8 4

ND028308: 8 8

ND028508: 8 16

ND028708: 8 8

Intervalo: 4-16 4-16

Serratia marcescens: ND024008 >128 >128

Shigella: ND024108 4 4

Stenotrophomonas maltophilia N=3: ND006507 16 16

ND021508: 32 32

ND029308: 8 8

Intervalo: 8-32 8-32

Efectos in vitro de citotoxicidad y hemólisis Citotoxicidad in vitro La citotoxicidad in vitro de ID24 se ensayó en tres estirpes celulares, usando el ensayo de reducción del colorante MTT. Los valores de CC50 para ID24 se resumen en la Tabla 6. Tabla 6. Citotoxicidad in vitro de ID24

Estirpe celular CC50 ID24 (ug/ml) CC50 ID24 (uM)

HeLa 430 0,156

(Estirpe celular de carcinoma epitelial humano) HepG2 (Estirpe celular de carcinoma de hígado 215 0,078 hepatocelular humano) HaCat

442,5 0,160(Queratinocito humano)

10 Hemólisis in vitro

La hemólisis se determinó mediante dos ensayos diferentes, como se describe en el Ejemplo VIII. En las Tablas 7-9 se dan todos los valores en porcentaje de la hemólisis, determinados mediante espectrofotometría de UV-VIS. En particular, en la Tabla 7 se dan los porcentajes de hemólisis de ID24 a diferentes concentraciones y en una relación

1:1 con la suspensión de eritrocitos. Los porcentajes de hemólisis se determinaron mediante espectrofotometría de 15 UV-VIS, determinando la cantidad de hemoglobina liberada en el sobrenadante leyendo la absorbancia a 414 nm (longitud de onda de referencia 490 nm). Estos resultados se refieren al primer método del Ejemplo VIII, según el protocolo de Shin (Ref. 12).

Tabla 7. Porcentajes de hemólisis de ID24 a diferentes concentraciones en una suspensión de eritrocitos

Abs media* Desviación Hemólisis, % RSD, % estándar

Triton 1% 0,664 0,006 100,0 0,834

Disolución fisiológica 0,000 0,002 0,0 8,646 ID24 500 ug/ml 0,090 0,008 13,6 7,232 ID24 250 ug/ml 0,078 0,003 11,8 2,756 ID24 125 ug/ml 0,079 0,002 11,9 1,786 ID24 62,5 ug/ml 0,050 0,001 7,6 1,471 ID24 31,2 ug/ml 0,037 0,005 5,6 9,024

*: valor de la absorbancia restado del blanco (disolución fisiológica).Se llevaron a cabo tres mediciones

para cada tratamiento.

En la Tabla 8 se dan los porcentajes de hemólisis de diferentes cantidades de ID24 en una relación 1:1 con sangre completa, mientras que en la Tabla 9 se dan los porcentajes de hemólisis de diferentes cantidades de ID24 en una relación 1:10 con sangre completa. La cantidad de hemoglobina liberada en el sobrenadante se determinó leyendo la absorbancia a 560 nm. Estos resultados se refieren al segundo método del Ejemplo VIII.

Tabla 8. Porcentajes de hemólisis de ID24 en una relación 1:1 con sangre completa.

Abs media* Desviación Hemólisis % RSD % estándar

Saponina (1:1) 1,461 0,030 100 2,003 Disolución fisiológica (1:1) 0,000 0,003 0 5,623 ID24 1 mg/ml 0,006 0,001 0,43 1,903 ID24 500 ug/ml -0,008 0,004 -0,55 7,580 ID24 250 ug/ml -0,008 0,002 -0,55 3,297 ID24 125 ug/ml -0,011 0,002 -0,75 3,525 ID24 62,5 ug/ml -0,013 0,003 -0,89 7,777

*: valor de la absorbancia restado del blanco (disolución fisiológica). Se llevaron a cabo tres mediciones para cada tratamiento.

Tabla 9. Porcentajes de hemólisis de ID24 en una relación 1:10 con sangre completa

Abs media* Desviación Hemólisis % RSD estándar

Saponina (1:10) 2,139 0,063 100 2,872

Disolución fisiológica (1:10) 0,000 0,005 0 7,588 ID24 (1:10) 500 ug/ml -0,013 0,003 -0,62 4,992 ID24 (1:10) 250 ug/ml -0,019 0,002 -0,87 4,845 ID24 (1:10) 125 ug/ml -0,013 0,006 -0,61 10,986 ID24 (1:10) 62,5 ug/ml -0,009 0,004 -0,41 6,565

Eficacia in vivo en un modelo de septicemia en ratones

Se administró intravenosamente ID24 a ratones infectados intraperitonealmente con 7,5 x 1012 CFU de E. coli EC47.

15 En particular, ID24 se administró a una dosis a 15 min. y 6 h después de la infección. Los resultados se muestran en la Fig. 1, que da la curva de supervivencia de Kaplan-Meier, en la que ID24 se administró dos veces, a una dosis de 3 mg/kg, a 15 min. y 6 horas p.i., mientras que colistin metanosulfonato de sodio (CMS) se administró una sola vez, a 15 min. p.i. a una dosis de 3 mg/kg. Los ratones incluidos en el grupo de control murieron todos hacia el día 3. Cada grupo estaba formado por 8 ratones.

20 ID24 demostró que da protección a los ratones frente a la infección provocada por un aislado clínico de E. coli (EC47).

Actividad antibiopelícula

La exposición a diferentes concentraciones de ID24 (a 1/4, 1/2, 1, 2 y 4 veces el valor de MIC) dio como resultado una reducción sustancial de la biopelícula bacteriana; en los dos experimentos llevados a cabo, se observó un porcentaje de inhibición que oscila desde 88,7% a 99,9% (de 0,95 a 3,05 log10 de reducción) para todas las concentraciones ensayadas, en comparación con los controles sin tratar. A concentraciones subinhibidoras, se observó de 0,9 a 2,35 log10 de reducción a 1/4 y 1/4 veces el valor de MIC, respectivamente.

Por otra parte, la colistina resultó ser menos activa que ID24; para todas las concentraciones ensayadas, las reducciones de la biopelícula fueron de 88,3% a 97,1% (de 0,88 a 1,55 log10 de CFU/ml de reducción). Los resultados se muestran en las Figuras 2a y 2b.

Bibliografía

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6.: R.I. Lehrer y T. Ganz, “Antimicrobial peptides in mammalian and insect host defence” (1999), Current Opinion in Immunology, 11: 23-27

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90.

13. S. Irwin, “Comprehensive observational assessment: A systematic, quantitative procedure for assessing the behavioral and physiologic state of the mouse” (1968), Psychopharmacologica, 13: 222-257

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto peptídico que tiene una longitud de hasta 35 restos de aminoácidos, que comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula general (Ib):

Z-[K]n-K-I-R-V-R-L-S-A (SEC ID NO: 26)

en la que K es un resto de aminoácido con una cadena lateral de lisina, particularmente L-lisina, u otro resto

de aminoácido con una cadena lateral cargada positivamente,

I es un resto de aminoácido con una cadena lateral de isoleucina, particularmente L-isoleucina,

R es un resto de aminoácido con una cadena lateral de arginina o una cadena lateral de guanidina N-alquil

sustituida, particularmente L-arginina,

V es un resto de aminoácido con una cadena lateral de valina, particularmente L-valina,

S es un resto de aminoácido con una cadena lateral de serina, particularmente L-serina,

A es un resto de aminoácido con una cadena lateral de alanina, particularmente L-alanina,

L es un resto de aminoácido con una cadena lateral de leucina, particularmente L-leucina,

en la que uno de los restos de aminoácidos K, I, R, L, V y S se puede sustituir por un resto de aminoácido con

una cadena lateral de alanina, particularmente L-alanina, Z es el grupo N-terminal del compuesto peptídico, que comprende al menos un resto aminoácido, y se selecciona de

(i)

un resto de aminoácido aromático o un grupo di-, tri-o tetrapeptidílico que comprende al menos un resto de aminoácido aromático, en el que el resto de aminoácido aromático se selecciona particularmente de triptófano, N-metiltriptófano, fenilalanina, 1-fenilalanina, naftilalanina, 1-naftilalanina, 1-difenilalanina, 1-(4,4’-bifenil)alanina, 1-antracen-9-ilalanina y 1-indol-3-ilalanina, o sus derivados sustituidos,

(ii)

un resto de aminoácido alifático o un grupo di-, tri-o tetrapeptidílico que comprende al menos un resto de aminoácido alifático, en el que el resto alifático es un resto de a-aminoácido que comprende una cadena lateral alifática ramificada de al menos 3 átomos de carbono,

(iii) combinaciones de uno cualquiera de (i)-(ii),

y n es 0 ó 1, y en el que el compuesto peptídico puede comprender bloques de construcción de restos de L-y/o D-aminoácidos.
2.

El compuesto peptídico según la reivindicación 1, en el que el grupo Z N-terminal se selecciona de Ar, Ar-Q, Q*-Ar tal como G-Q-Ar o acetilo-Q-Ar, pyrE y pyrE-Ar, en los que Ar es un resto de aminoácido aromático.
3.

El compuesto peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, que comprende una secuencia de

aminoácidos seleccionada de:

WKKIRVRLSA

(SEC ID NO: 6)

pyrEWKIRVRLSA

(SEC ID NO: 27)

GQWKIRVRLSA

(SEC ID NO: 14)

Acetil-QWKIRVRLSA

(SEC ID NO: 12)

Aoa-QWKIRVRLSA

(SEC ID NO: 16)

(GQWKIRVRLSA)2 K-1-Ala

(SEC ID NO: 19)

en las que pyrE es un resto de ácido piroglutámico, Aoa es un resto de ácido 8-aminooctanoico, 1-Ala es un resto de 1-alanina, y en los que los péptidos anteriores están opcionalmente amidados en sus términos C.
4.

Un compuesto peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que tiene una longitud de hasta 15 restos de aminoácidos.
5.

Un compuesto peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que tiene una forma lineal o cíclica.
6.

Un compuesto multimérico que comprende una pluralidad de compuestos peptídicos como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
7.

El compuesto multimérico de la reivindicación 6, que está multimerizado en una matriz, particularmente seleccionada de poli(N-alquil(met)acrilamida), poli(N,N-dialquil(met)acrilamida), polimelamina, dextrano, ciclodextrina, polietilenglicol y/o polivinilpirrolidona.
8.

El compuesto multimérico de la reivindicación 6, que tiene una estructura ramificada, particularmente una estructura dendrítica.
9.

El compuesto multimérico de la reivindicación 6 ó 7, que se selecciona de:

(i) R-(Y1 -R)m-Y1 -(R)m’ (IIa)

en el que R es un compuesto peptídico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-5,

Y1 es un enlace covalente o un ligador bifuncional, por ejemplo un dialcohol tal como propilenglicol, un ácido dicarboxílico tal como ácido succínico, una diamina tal como etilendiamina, un aminoácido, un ácido hidroxicarboxílico, o un diisocianato, y m es 0 o un número entero positivo, y m’ es 0 ó 1,

(ii) [[(R)n1 Y1’]n2] Y2 (IIb)

en la que R es un compuesto peptídico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-5,

Y1’ es, en cada caso, independientemente, un ligador que tiene una funcionalidad de al menos 3, por ejemplo un aminoácido trifuncional tal como lisina, ornitina, norlisina, aminoalanina, ácido aspártico o ácido glutámico, e

Y2 es un ligador que tiene una funcionalidad de al menos 2, y

n1 y n2 son, en cada caso, independientemente, un número entero de al menos 2, preferiblemente 2, 3 ó 4, más preferiblemente 2,

(iii) {[[(R)n1 Y1]n2] Y2’}n3 Y3 (IIc)

en la que R es un compuesto peptídico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-5,

Y1’ eY2’ son, en cada caso, ligadores independientes que tienen una funcionalidad de al menos 3, por ejemplo un aminoácido trifuncional tal como lisina, ornitina, norlisina, aminoalanina, ácido aspártico o ácido glutámico,

Y3 es un ligador que tiene una funcionalidad de al menos 2, y

n1, n2 y n3 son, en cada caso, independientemente, números enteros de al menos 2, preferiblemente 2, 3 ó 4, más preferiblemente 2.
10.

El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que comprende al menos una modificación, particularmente seleccionada de un resto lipídico, amídico, de éster, acílico y/o alquílico unido al mismo.
11.

El compuesto de la reivindicación 10, que comprende al menos un resto lipídico, que es al menos un ácido aminocarboxílico que comprende un grupo hidrocarbonado lineal o cíclico, saturado o mono-o poliinsaturado que tiene 3 a 25 átomos de carbono, por ejemplo ácido 5-aminovalérico, ácido 8-aminooctanoico o ácido 2aminodecanoico, y que está unido preferiblemente al término N y/o C del compuesto.
12.

El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, que tiene actividad frente a organismos patógenos seleccionados de organismos procariotas, por ejemplo eubacterias o arqueas, y organismos eucariotas, por ejemplo hongos, algas o parásitos.
13.

El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, que tiene actividad antibacteriana.
14.

Una composición para uso médico, que comprende al menos un compuesto como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, junto con vehículos, diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables.
15.

La composición de la reivindicación 14, en forma de una forma de dosificación farmacéutica, seleccionada de sólidos, líquidos o geles, y sus combinaciones, por ejemplo como un colirio, colutorio, ungüento, aerosol o producto tópico.
16.

Una composición para uso como un desinfectante y/o detergente, que comprende al menos un compuesto como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-13.
17.

Una composición para uso como un conservante, que comprende al menos un compuesto como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-13.
18.

El composición de la reivindicación 17, como conservante para productos médicos, cosméticos o alimentarios.
19.

El compuesto de la reivindicación 17, para disminuir el crecimiento o proliferación de microorganismos embebidos en una biopelícula.
20.

Una composición veterinaria que comprende al menos un compuesto como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-13.