ES2377959T3

ES2377959T3 - Composiciones sólidas estabilizadas de factor VII modificado

Info

Publication number: ES2377959T3
Application number: ES03720286T
Authority: ES
Inventors: Hanne Nedergaard; Lars Lindgaard Hansen; Niels Kristian Klausen; Troels Kornfelt; James M. Flink
Original assignee: Novo Nordisk Health Care AG; Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk Health Care AG; Novo Nordisk AS
Priority date: 2002-05-03
Filing date: 2003-05-02
Publication date: 2012-04-03
Anticipated expiration: 2023-05-02
Also published as: ATE536886T1; EP1503798B1; JP5184738B2; AU2003223925A1; EP1503798A1; WO2003092731A1; EP1503798B8; JP2005530752A

Abstract

Composicion comprendiendo; i) factor VII modificado;ii) un agente adecuado para mantener el pH de dicha composicion en el intervalo de 4 a 7 cuando dicha composicion se disuelve en agua;iii) un alcohol de azucar, y donde el alcohol de azucar es manitol;iv) un sacarido, y donde el sacarido es sacarosa;v) un antioxidante, y donde el antioxidante se seleccionadel grupo consistente en acido ascorbico, cisteina, homocisteina, cistina, cistationina, metionina, glutation y peptidos con cualquier cisteina, homocisteina, cistina, cistationina, metionina y glutation; y vi) un contenido de humedad de como mucho 3%.

Description

Composiciones solidas estabilizadas de factor VII modificado Campo de la invencion [0001] La presente invencion se refiere a composiciones quimicamente al igual que fisicamente estables comprendiendo factor VII modificado que puede almacenarse, usarse y manejarse a temperatura ambiente. Antecedentes de la invencion [0002] Moleculas del factor VII modificado son derivados del factor VII de coagulacion humano donde el sitio catalitico se modifica de manera que la actividad catalitica de la forma activa, factor VIIa, disminuye, mientras la capacidad de union del factor tisular se mantiene. Factor VII (humano de tipo salvaje) se ha descrito en la patente US n° 4,784,950. Ejemplos de moleculas del factor VII modificado se han descrito en WO 92/15686, WO 94/27631, WO 96/12800 y WO 97/47651. Asi, en similitud a la molecula del factor VIIa nativo, el factor VIIa modificado se unira con factor tisular, pero al contrario que el factor VIIa nativo, el factor VII modificado no activara los pasos posteriores en la ruta de coagulacion extrinseca. Asi, el factor VII modificado actua como un inhibidor de la formacion de un coagulo de fibrina. Por lo tanto, moleculas del factor VIIa modificado se han sugerido en el tratamiento de lesion vascular por bloqueo de la produccion de trombina y la deposicion posterior de fibrina (WO 97/47651). [0003] Como proteina, las moleculas del factor VII modificado son susceptibles a degradacion fisica, incluyendo desnaturalizacion y agregacion, como la formacion de agregados insolubles o solubles en forma de dimeros, oligomeros y polimeros, o a degradacion quimica, incluyendo, por ejemplo, hidrolisis, desamidacion y oxidacion. La consecuencia total es perdida de actividad de la molecula del factor VII modificado, formacion de productos de degradacion inmunogenicos y toxicos, riesgo serio de introduccion de trombosis en la inyeccion de la molecula del factor VII modificado degradado, obstruccion de agujas usadas para inyecciones y riesgo de no-homogeneidad. Asi la seguridad y la eficacia de medicamentos comprendiendo factor VII modificado estan directamente relacionadas con la estabilidad del factor VII. [0004] El factor VII modificado puede proporcionarse hoy en dia en una formulacion liquida, que necesita almacenarse congelada a - 80 °C. [0005] Asi, composiciones comprendiendo factor VII modificado necesitan estabilizarse. En particular, hay una necesidad para almacenamiento y manipulacion de medicamentos comprendiendo factor VII modificado bajo condiciones ambientales sin el requisito de un congelador y donde las composiciones se pueden almacenar durante un tiempo prolongado como durante al menos 6 meses antes de uso. [0006] Un metodo de estabilizacion de una proteina se refiere a eliminacion de agua de la proteina, por ejemplo, como proporcionando la proteina en forma de un pastel liofilizado, la materia final obtenida en un proceso de liofilizacion. No obstante, el proceso de liofilizacion en si mismo es tambien nocivo para las proteinas; durante la liofilizacion, la solucion de proteina se enfria antes primero hasta que se congela adecuadamente y el volumen de agua en la solucion de proteina formara hielo en esta fase. La proteina es propensa por la presente a tension inducida por congelacion provocando deformacion y precipitacion. En el siguiente paso, la fase primaria denominada de secado, el hielo sublima y en la fase de secado secundaria, el agua unida o adsorbida se quita bajo temperaturas elevadas. Durante esta eliminacion de agua, las proteinas pueden perder su conformacion apropiada que se provee principalmente a traves de union de hidrogeno. [0007] Por lo tanto, para preservar la conformacion de proteina, actividad y estabilidad durante liofilizacion, la solucion de proteina necesita complementarse con cantidades suficientes de excipientes apropiados con propiedades crioprotectoras y/o lioprotectoras para proteger la proteina de tension inducida por congelacion y/o tension durante eliminacion de agua, respectivamente. [0008] Cuando se proporciona a un producto liofilizado una caracteristica esencial se refiere a las propiedades del pastel liofilizado. Necesita tener buenas propiedades en cuanto a su forma y estructura, es decir, este no deberia colapsarse, ya que estos pasteles colapsados pueden ser duros o incluso imposibles de disolver (reconstituir) antes de uso. Por el contrario, la estructura fisica del pastel liofilizado no puede estar suelta y blanda. Por lo tanto, uno o mas agentes denominados de carga se agregan a la solucion de proteina antes de liofilizacion. Agentes de carga son agentes que proporcionan buenas propiedades de pastel liofilizado y que ayudan a la proteina a superar varias tensiones asociadas al proceso de liofilizacion, por ejemplo, corte/congelacion. Ademas, los agentes de estabilizacion pueden ayudar en la formacion de productos farmaceuticamente elegantes y de aspecto agradable, que protegen la proteina durante liofilizacion al igual que durante almacenamiento posterior.

[0009] Durante el des arrollo de u n m edicamento est able c omprendiendo un f actor V II m odificado a propiado se administra parentalmente y se almacena en condiciones ambientales, excipientes adecuados deberian anadirse y sus niveles ajustarse cu idadosamente p ara proporcionar u n pr oducto q ue t ambien es aproximadamente i sotonico c on plasma ytieneun pH en unintervalo fisiologicamente adecuado para inyeccion o infusion. La eleccion de agentes capaces de modificar la tonicidad es crucial, ya que mas modificadores de tonicidad en forma de sales hacen el proceso de liofilizacion dificil.

[0010] Asi, es un objetivo de la presente invencion proporcionar composiciones estables de factor VII modificado, sustancialmente sin la presencia de productos de degradacion y sin actividad del factor VII modificado reducida, incluso despues de a lmacenamiento pr olongado e n co ndiciones am bientales. A demas, es un o bjetivo esencial que l as composiciones estables se adecuen para administracion parental y asi tengan una tonicidad fisiologicamente apropiada y un margen de pH para no causar cualquier inconveniente al paciente.

Resumen de la invencion

[0011] Se ha descubierto por los presentes investigadores que factor VII modificado se puede proporcionar en una composicion que es suficientemente estable para permitir almacenamiento a 25 °C durante aproximadamente al menos de 12 a 18 meses.

[0012] P or co nsiguiente, l a pr esente i nvencion se r efiere en un pr imer asp ecto a co mposiciones estabilizadas comprendiendo: i) factor VII modificado; ii) un agente adecuado para mantener el pH de dicha composicion en el intervalo de 4 a 7 cuando dicha composicion se disuelve en agua; y, ademas, ingredientes como en las reivindicaciones y iii) un contenido de humedad de como mucho 3%.

[0013] En otro aspecto, la invencion se refiere a un m etodo de preparacion de un factor VII modificado estable que incluye las etapas de: i) provision de dicho factor VII modificado en una solucion con pH en el intervalo de 4 a 7. ii) tratamiento de dicha solucion para obtener una composicion solida con un contenido de humedad de como mucho 3 % p/p.

[0014] Tal y como se menciona, factor VII modificado estabilizado se solicita para minimizar el riesgo de eventos adversos y para mejorar seguridad y eficacia cuando se administra el factor VII modificado para uso terapeutico. Por lo tanto, todavia otro aspecto de la invencion se refiere al uso de un factor VII modificado para la preparacion de un medicamento para evitar coagulacion de la sangre y/o reacciones mediadas por factor tisular, dicho medicamento comprende una composicion comprendiendo; i) factor VII modificado; ii) un agente adecuado para mantener del pH de dicha composicion en el intervalo de 4 a 7 cuando dicha composicion se disuelve en agua, y ademas ingredientes como en las reivindicaciones y iii) un contenido de humedad de como mucho 3%.

[0015] Finalmente, la invencion se refiere a administracion de dicho factor VII modificado estabilizado a un paciente para evitar coagulacion de la sangre y/o reacciones mediadas por factor tisular, comprendiendo administracion a un sujeto con necesidad de este, una cantidad eficaz de una composicion comprendiendo; i) factor VII modificado; ii) un agente adecuado para mantener el pH de dicha composicion en el intervalo de 4 a 7 cuando dicha composicion se disuelve en agua; y ademas ingredientes como en las reivindicaciones y iii) un contenido de humedad de como mucho 3%.

Descripcion detallada de la invencion

[0016] La presente invencion se refiere a composiciones estables en almacenamiento comprendiendo factor VII modificado. L as composiciones se p ueden al macenar a va rias temperaturas ambiente i ncluyendo t emperaturas ambiente durante un periodo de tiempo extendido sin causar degradacion sustancial del factor VII modificado.

[0017] La presente invencion se basa en el descubrimiento de que formulaciones estables en almacenamiento de factor VII modificado que son estables durante al menos aproximadamente de 12 a 18 meses sobre almacenamiento a 25 °C a oscuras. La presente invencion tambien incluye composiciones comprendiendo factor VII modificado que son estables incluso durante periodos de almacenamiento mas largos, como 32 meses. Asi, la presente invencion hace posible almacenar estas composiciones a temperatura ambiente sin aumento en el riesgo de eventos adversos en la administracion a p acientes de estas composiciones. V entajosamente, l a estabilidad de almacenamiento m ejorada tambien supondra coste reducido, ya que ninguna condicion especial de enfriado se requiere sobre almacenamiento, ademas dando como resultado manipulacion de la composicion mas conveniente para el usuario.

[0018] El termino factor VII modificado se denomina para significar cualquier proteina del factor VII, que se modifica para reducir l a actividad ca talitica de l f actor V IIa, m ientras todavia puede uni rse a f actor t isular. C omo r esultado, l as moleculas del factor VII modificado competiran con factor VII nativo y/o VIIa para unirse a factor tisular, asi se inhibe la activacion de los factores posteriores, X y IX, de la secuencia de coagulacion. La modificacion puede, por ejemplo, localizarse en el sitio catalitico.

[0019] El termino "factor VII modificado" abarca, sin limitacion, polipeptidos en los que la actividad biologica del factor VIIa se ha reducido sustancialmente en relacion a la actividad de factor VIIa humano de tipo salvaje (como se describe en la patente US n° 4,784,950). Estos polipeptidos incluyen, sin limitacion, factor VII o factor VIIa que se han modificado quimicamente y variantes del factor VII en las que una o mas alteraciones de la secuencia de aminoacidos especificas se han introducido que modifican o interrumpen la bioactividad del polipeptido. El termino "factor VII modificado" ademas abarca, sin limitacion, polipeptidos que han truncado secuencias de aminoacido relativas al factor VII humano (es decir, fragmentos del factor VII), y/o extremo N-terminal incluyendo deleciones oadiciones del aminoacido N-terminal, y/o modificaciones postranslacionales. El factor VII modificado se une a factor tisular con afinidad alta y especificidad, pero no inicia coagulacion de la sangre.

[0020] Como se usa aqui, factor VII modificado puede estar en forma del zimogeno (es decir, una molecula monocatenaria) o se puededividir en su sitio de activacion. Asi, el termino "factor VII modificado" se destina para significar un factor VII modificado que, sobre activacion a factor VIIa modificado, al igual que las moleculas del factor VIIa modificado que son capaces de unirse a factor tisular, capaces de competir con factor VII autentico y/o factor VIIa para unirse a factor tisular en la coagulacion en cascada inhibiendo asi la activacion de factor IX a IXa y factor X a Xa. Esta competicion puede determinarse facilmente mediante, por ejemplo, un ensayo de coagulacion de competicion, un ensayo de competicion FIXa o de generacion de FXa, o un ensayo de union de competicion, usando, por ejemplo, una linea celular con factor tisular de superficie de la celula, como la linea de celula de carcinoma de vejiga humano J82 (Sakai et al. J. Biol. Chem. 264: 9980-9988 (1989), incorporado aqui como referencia), por ejemplo, como se describe en la presente especificacion (ver seccion "ensayo", abajo),

[0021] En una forma de realizacion de la invencion, factor VII modificado abarca aquellos polipeptidos que muestran al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 8 0%, a l m enos a proximadamente 90% , al menos aproximadamente 100%, al m enos aproximadamente 110%, o al menos aproximadamente 120% de la afinidad de TF-union especifica de factor VIIa de tipo salvaje, cuando se evalua en uno o mas ensayos de union TF como se describe en la presente especificacion. En una forma de realizacion preferida, los antagonistas de TF muestran al menos aproximadamente 75% de la afinidad de enlace de factor VIIa de tipo salvaje. El termino "actividad de enlace de TF", como se utiliza en este caso, significa la capacidad de un polipeptido FVlla o antagonista de TF para inhibir la union de 125I-FVIIa humano recombinante a TF humano de superficie celular. La actividad de enlace de TF puede medirse, por ejemplo, como se describe en el ensayo 3 (de la presente especificacion). En otra forma de realizacion, factor VII modificado abarca aquellos polipeptidos que muestran menos de aproximadamente 25%, mas preferiblemente menos de aproximadamente 10%, o 5%, o 3%, o 2%, y de forma mas preferida menos de aproximadamente1 % de la actividad especifica de factor VIIa de tipo salvaje, cuando se evaluan en uno o mas de un ensayo de coagulacion, ensayo de generacion de FIXa o FXa, amidolisis o ensayo de proteolisis como se describe en los ensayos 1-2 y 4-7 de la presente descripcion.

[0022] Los terminos "sitio activo" o "sitio catalitico", cuando se usan aqui con referencia a FVIIa, se refieren al sitio de union de sustrato de zimogeno y catalitico, incluyendo el sitio "S1" de FVlla como el termino definido por Schecter, I. and Berger, A., (1967) Biochem. Biophys. Res. Commun. 7:157-162.

[0023] El sitio catalitico de proteinas del factor VII humano y bovino comprende los aminoacidos Ser344; Asp242 y His193 (numeracion de subindice indicando la posicion en la secuencia) que forman un catalitico denominado "triada". Los sitios cataliticos en el factor VII de otras especies mamiferas pueden determinarseusando tecnicas actualmente disponibles incluyendo, entre otros, aislamiento de proteina y analisis de secuencia de aminoacidos. Sitios cataliticos pueden determinarse tambien alineando una secuencia con la secuencia de otras serina proteasas, particularmente quimiotripsina, cu yo si tio ac tivo ha s ido d eterminado previamente ( Sigler et al ., J. Mol. Biol., 35:143-164 (1968), incorporado aqui como referencia, y desde ahi determinando dicho alineamiento los residuos de sitio activo analogos. Asi, como se usa aqui, factor VII modificado abarca polipeptidos del factor VII derivados de cualquier especie mamifera.

[0024] Lamodificacion dela actividad catalitica del factor VIIa se puede efectuar de variasmaneras, incluyendo, sin limitacion, derivatizacion quimica, reacciones enzimaticas o por substitucion, insercion o delecion de aminoacidos.

[0025] Enuna forma de realizacion, la actividad catalitica del factor VIIa se inhibe por derivatizacion quimica del sitio catalitico, o triada. La derivatizacion se puede realizar al reaccionar factor VII con un inhibidor irreversible como un compuesto de organofosforo, un sulfonil fluoruro, una cetona de halometilo peptidica o un azapeptido, o por acilacion, como ejemplos no limitativos. Inhibidores incluyen, sin limitacion, clorometilcetonas peptidicas o peptidil clorometanos; azapeptidos; agentes acilantes como varios derivados de guanidinobenzoato y 3-alcoxi-4-cloroisocumarinas; sulfonil fluoruros como f enilmetilsulfonilfluoruro ( PMSF); di isopropilfluorofosfato ( DFP); t osilpropilclorometil ce tona ( TPCK); tosilisilclorometil ce tona ( TLCK); ni trofenilsulfonatos; i nhibidores de proteasa het erociclicos como i socumarinas y cumarinas.

[0026] H alometilcetonas peptidicas preferidas incluyen P he-Phe-Arg cl orometilcetona ( FFR-cmk), D -Phe-Phe-Arg clorometilcetona (D-FFR-cmk), Phe-Pro-Arg clorometilcetona (FPR-cmk), D-Phe-Pro-Arg clorometilcetona (D- FPR-cmk) (ver patente US n° 4,318,904 incorporada aqui como referencia), L-Glu-Gly-Arg clorometilcetona (EGR- cmk) y D-Glu-Gly-Arg clorometilcetona (D-EGR-cmk), Dansil-Phe-Phe-Arg clorometilcetona, Dansil-D-Phe-Pro-Arg clorometilcetona, Dansil-Phe-Pro-Arg clorometilcetona, Dansil-D-Phe-Pro-Arg clorometilcetona, Dansil-L- Glu-Gly-Arg clorometilcetona y Dansil-D-Glu-Gly-Arg clorometilcetona.

[0027] En la forma de realizacion donde la molecula del factor VII modificado esta en forma activada, es posible modificar FVIIa reaccionado con un inhibidor de serina proteasa. En una forma de realizacion, el inhibidor de proteasa es un compuesto de organofosforo, un sulfanil fluoruro, una halometil cetona peptidica, o un azapeptido. En una forma de realizacion, el inhibidor de proteasa es una halometil cetona peptidica seleccionada de Phe-Phe-Arg clorometilcetona (FFR-cmk), D -Phe-Phe-Arg c lorometilcetona ( D-FFR-cmk), Phe-Pro-Arg cl orometilcetona ( FPR-cmk), D -Phe-Pro-Arg clorometilcetona (D- FPR-cmk), L-Glu-Gly-Arg clorometilcetona (EGR-cmk) yD-Glu-Gly-Arg clorometilcetona (D-EGRcmk), D ansil- Phe-Phe-Arg cl orometilcetona, Dansil-D-Phe-Pro-Arg cl orometilcetona, D ansyl-L-Glu-Gly-Arg clorometilcetona, Dansil-D-Glu-Gly-Arg clorometilcetona, Dansil-L-Glu-Gly-Arg clorometilcetona y Dansil-D-Glu-Gly-Arg clorometilcetona. En una forma de realizacion, el inhibidor de proteasa es una halometil cetona peptidica seleccionada de D ansil-L-Phe-Pro-Arg cl orometilcetona, D ansil-L-Glu-Gly-Arg cl orometilcetona, D ansil-L-Phe-Phe-Arg clorometilcetona y L -Phe-Phe-Arg c lorometilcetona, D ansil-D-Phe-Pro-Arg cl orometilcetona, D ansil-D-Glu-Gly-Arg clorometilcetona, Dansil-D-Phe-Phe-Arg cetona de clorometilo y D-Phe-Phe-Arg clorometilcetona. En una forma de realizacion, el inhibidor de proteasa es D-Phe-Phe-Arg clorometilcetona (FFR-FVIIa).

[0028] Debe entenderse que cuando la designacion "D" precede inmediatamente una abreviacion de letra para un aminoacido como se muestra arriba, este aminoacido es el d-enantiomero no natural.

[0029] En otras formas de realizacion, la actividad catalitica de factor VIIa se inhibe por substitucion, insercion o delecion de aminoacidos. En una s erie de formas de realizacion, una o mas sustituciones de aminoacido se hacen en la secuencia de aminoacidos de la triada catalitica del factor VII, definida aqui como las regiones que contienen los aminoacidos que contribuyen en el sitio catalitico del factor VIIa. Las sustituciones, inserciones o deleciones en la triada catalitica estan generalmente en o adyacentes a los aminoacidos que forman el sitio catalitico. En proteinas del factor VII humano y bovino, los aminoacidos que forman una "triada" catalitica son Ser344; Asp242 y His193 (numeracion de subindice indicando posicion en el factor VII humano de tipo salvaje). Los sitios cataliticos en el factor VII de otras especies mamiferas pueden determinarse usando tecnicas actualmente disponibles incluyendo, entre otros, aislamiento de proteina y analisis de secuencia de a minoacidos. Sitios cataliticos pueden determinarse tambien alineando una secuencia con la secuencia de otras serina proteasas, particularmente quimiotripsina, cuyo sitio activo se ha determinado previamente (Sigler et al., J. Mol. Biol., 35:143-164 (1968), incorporado aqui como referencia), y desde ahi determinando dicho alineamiento los residuos de sitio activo analogos.

[0030] Las sustituciones de aminoacido, inserciones o deleciones se hacen para prevenir o, de otra manera, inhibir activacion por el factor VIIa de factores X y/o IX. El factor VII asi modificado deberia, no obstante, retener tambien la capacidad para concurrir con factor VII y/o factor VIIa autenticos para union a factor tisular en la coagulacion en cascada. Esta competicion puede determinarse facilmente mediante, por ejemplo, un ensayo de coagulacion o un ensayo de enlace de competicion como se describe en la presente especificacion, usando, por ejemplo, una linea celular con factor tisular de superficie de la celula, como la linea de celula de carcinoma de vejiga humano J82 (Sakai et al. J. Biol. Chem. 264: 9980-9988 (1989)).

[0031] En la presente invencion, se prefiere cambiar solo un unico aminoacido, minimizando asi la probabilidad de aumentar la antigenicidad de lamolecula o inhibir su capacidad para union a factor tisular. No obstante, dos o mas cambios en aminoacidos (sustituciones, adiciones o deleciones)pueden hacerse y combinaciones de sustitucion(es), adicion(es) y delecion(es) pueden tambien hacerse. Los aminoacidos que forman el sitio catalitico en el factor VII, como Ser344, Asp242 y His193 en el factor VII humano y bovino, pueden sustituirse tambien o eliminarse. En una forma de realizacion preferida para factor VII humano y bovino, Ser344 se sustituye preferiblemente con Ala, pero Gly, Met, Thr u otros aminoacidos pueden sustituirse tambien. Se prefiere reemplazar Asp con Glu y reemplazar His con Lys o Arg. En general, sustituciones se eligen para interrumpir la estructura de la proteina terciaria lo menos posible. El modelo de Dayhoff et al. (en Atlas of Protein Structure 1978, Nat. Biomed. Res. Found. Washington, D.C.), incorporado aqui como referencia, se puede utilizar como una guia en la seleccion de otras sustituciones de aminoacido. Uno puede introducir alteraciones de residuo como se ha descrito anteriormente en el sitio catalitico de la secuencia del factor VII humano apropiada, bovino u otras especies yprobar la proteina resultante para un nivel deseado de inhibicion de actividad catalitica y actividad anticoagulante resultante como se describe en este caso.

[0032] En formas de realizacion preferidas de factor VII humano y VII bovino, sitio activo del residuo de Ser344 se modifica, se sustituye con Gly, Met, Thr, o mas preferiblemente, Ala. Esta sustitucion podria hacerse separadamente o en combinacion con sustitucion(es) en otros sitios en la triada catalitica, que incluye His193 y Asp242.

[0033] Ejemplos no limitativos de factor VII modificado con actividad biologica sustancialmente reducida relativo a factor de tipo salvaje VII incluyen R152E-FVIIa (Wildgoose it et al., Biochem 29:3413-3420, 1990), S344A-FVIIa (Kazama et al., J. Biol. Chem. 270:66-72, 1995 ), FFR-FVlla (Holst et al., Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 15:515-520, 1998), y factor VIIa carente del dominio Gla, (Nicolaisen et al., FEBS Letts. 317:245-249, 1993). Ejemplos no limitativos tambien incluyen FVIIa humano, que tiene el residuo de lisina en la posicion 341 sustituido por otro residuo de aminoacido; FVlla humano, que tiene el residuo de serina en la posicion 344 sustituido por otro residuo de aminoacido; FVlla humano, que tiene el residuo de acido aspartico en la posicion 242 sustituido por otro residuo de aminoacido; FVlla humano, que tiene el residuo de histidina en la posicion 193 sustituido por otro residuo de aminoacido; FVII-(K341A); FVII-(S344A); FVII(D242A); FVII-(H193A); Phe-Phe-Arg-FVII (FFR- FVII), D-Phe-Phe-Arg-FVII (D-FFR-FVII), Phe-Pro-Arg-FVII (FPR-FVII), D-Phe-Pro-Arg-FVII (D-FPR-FVII), L-Glu-Gly-Arg-FVII (EGR-FVII) and D -Glu-Gly-Arg-FVII (D-EGR-FVII), Dansil-Phe-Phe-Arg-FVII, Dansil-D-Phe-Phe-Arg-FVII, Dansil-Phe-Pro- Arg-FVII, Dansil-D-Phe-Pro-Arg-FVII, Dansil-L-Glu-Gly-Arg-FVII y Dansil-D-Glu-Gly-Arg-FVII. Ejemplos no limitativos de polipeptidos del factor VII quimicamente modificados y variantes de secuencia se describen, por ejemplo, en la patente US n° 5,997,864.

[0034] Por otra parte, el termino "factor VII modificado" se refiere a moleculas del factor VII modificado que derivan de animales, como seres humanos o producidos por medios sinteticos y/o recombinantes.

[0035] En una forma de realizacion, la molecula del factor VII modificado es factor VIIa, preferiblemente factor VII bovino

o humano, que se modifica por el inhibidor de proteasa D-Phe-Phe-Arg clorometilcetona.

[0036] E n una f orma de r ealizacion, l a m olecula d el f actor V II m odificado es factor V IIa hum ano de t ipo sa lvaje modificado por el inhibidor de proteasa D-Phe-Phe-Arg clorometilcetona. En que forma de realizacion, la molecula del factor VII modificado se abrevia FFR- FVIIa.

[0037] Como se utiliza en este caso, concentracion de FFR-FVIIa se expresa convenientemente como mg/ml o como U/ml, con 1 mg/ml aproximadamente equivalente a 20 U/ml.

[0038] El polipeptido del factor VII modificado puede estar presente en una concentracion de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 10,0 mg/ml, como de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 8,0 mg/ml, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5,0 mg/ml, o de aproximadamente 1,0 mg/ml a aproximadamente 5,0 mg/ml.

[0039] Como se utiliza en este caso, "estabilizacion" abarca minimizacion de la formacion de agregados (soluble y/o insoluble) y/o degradacion quimica al igual que provision de mantenimiento de pH yconformacion apropiada de la proteina durante almacenamiento o produccion de las composiciones, de modo que retencion sustancial de actividad biologica y estabilidad d e p roteina se mantienen. P or ot ra par te, e stabilizacion t ambien abarca lioproteccion y crioproteccion de la proteina durante produccion de las composiciones a condiciones de liofilizacion.

[0040] El termino "estabilidad estructural" o "estabilizacion estructural" abarca la capacidad para formar un t apon o pastel liofilizado con buenaspropiedades y apariencia, por ejemplo, demanera que este no tieneun colapso yse disuelve facilmente antes de uso.

[0041] Un producto estable en el almacenamiento es un producto que se estabiliza sobre almacenamiento a temperaturas entre 5°C -50°C y permanece dentro de especificaciones de producto preseleccionadas para un periodo de tiempo predeterminado, frecuentemente varios meses.

[0042] Estabilidad fisica se refiere a la formacion (o falta) de agregados solubles y/o insolubles en forma de formas polimericas, dimericas y oligomericas de factor VII modificado al igual que cualquier deformacion estructural y desnaturalizacion de la molecula.

[0043] La estabilidad quimica se refiere a la formacion (o falta) de cualquier cambio quimico en el factor VII modificado sobre almacenamiento en estado disuelto o solido a condiciones aceleradas. Por ejemplo nolimitativo son hidrolisis, desamidacion y oxidacion. Particularmente, los aminoacidos con azufre son propensos a oxidacion con la formacion de los sulfoxidos correspondientes.

[0044] El termino "crioprotectores", como se utiliza en este caso, incluye generalmente agentes, que proporcionan estabilidad a la proteina de tensiones inducidas por la congelacion. Ejemplos no limitativos de crioprotectores incluyen polioles, co mo, por ej emplo, m anitol, e incluyen sa caridos, co mo, por ej emplo, sa carosa, al igual que incluye tensioactivos,como, por ejemplo, polisorbato, poloxamero o polietilenglicoly similares.Los crioprotectores tambien contribuyen a la tonicidad de las formulaciones.

[0045] El termino "lioprotector", como se utiliza en este caso, incluye agentes que proporcionan estabilidad a la proteina durante eliminacion de agua sobre el proceso de secado del proceso de liofilizacion, como, por ejemplo, manteniendo la conformacion apropiada de la proteina. Ejemplos no limitativos de lioprotectores incluyen sacaridos, particularmente di

o trisacaridos. Los crioprotectores pueden tambien tener efectos lioprotectores.

[0046] Eltermino "agente adecuado paramantener el pH en el intervalo de 4 a 7" abarca aquellos agentes que mantienen la solucion en un intervalo de pH aceptable entre 4,0 a 7,0. Ejemplos tipicos no limitativos de agentes capaces de mantener el pH dentro de un intervalo de 4 a 7 son citrato(sodio o potasio), acetato (amonio, sodioo calcio), histidina (L- histidina), malato, fosfato (sodio o potasio), acido tartarico, acido succinico, MES, HEPES, imidazol, TRIS, lactato, glutamato y glicil-glicina.

[0047] El termino "pastel liofilizado", como se utiliza en este caso, abarca la composicion solidaobtenida sobre el tratamiento de una composicion disuelta o al menos parcialmente disuelta bajo condiciones implicando al menos un paso de enfriamiento de dicha composicion disuelta/parcialmente disuelta a hielo seguida de al menos un paso de secado al vacio.

[0048] EL "liofilizacion" abarca un proceso durante el que el liquido se quita de una composicion disuelta o al menos parcialmente disuelta bajo condiciones i mplicando al menos u n p aso d e c ongelacion d e la s olucion d isuelta o parcialmente disuelta a hielo seguido de secado al vacio. La liofilizacion es el proceso mas comun para hacer farmacos de proteina solidos. El proceso consiste en dos pasos mayores: congelacion de una solucion de proteina y secado del solido congelado al vacio. El paso de secado se divide posteriormente en dos fases: secado primario y secundario. El secado primario retira el agua congelada (sublimacion de hielo) y el secado secundario retira el agua "unida" no congelada (desorcion de agua). Analisis mas detallado de cada paso de liofilizacion se provee en, por ejemplo, Wang et al, International Journal of Pharmaceutics 203 (2000): 1-60 (ver seccion 4, pagina 16 ff.).

[0049] T ipicamente, una c omposicion se l iofiliza r ellenando e n vi ales, co ngelando en los estantes del liofilizador, despues de lo cual un vacio se establece y los estantes calentados para implementar secado primario (o sublimacion de hielo). Luego, secado secundario (o desorcion de agua sorbida) se desarrolla a una temperatura mas alta hasta que la finalizacion del proceso, es decir, donde la composicion contiene un contenido suficientemente bajo de humedad (agua). Metodos para liofilizacion se conocen generalmente en la tecnica, ver, por ejemplo, Wang et al, International Journal of Pharmaceutics 203 (2000): 1 -60. E sta en la habilidad comun d el pr ofesional p ara opt imizar l as co ndiciones de liofilizacion teniendo en cuenta temperatura(s), tiempo(s) a cada temperatura, y tambien presionque debe usarse durante el proceso para una composicion especifica.

[0050] El termino "contenido de humedad" se entiende que abarca agua asociada al producto, incluyendo, sin limitacion, agua en forma adsorbida, como agua no congelada atrapada en o a dsorbida en lafase de soluto congelada y/o asociada a l a f ase amorfa o adsorbida al so lido cr istalino. E l t ermino " contenido de ag ua" se us a de f orma intercambiable con "contenido de humedad". El nivel de humedad residual deseado (contenido de humedad) en una funcion de la duracion y la temperatura del paso de secado secundario. Varios metodos para determinar el contenido de humedad residual durante liofilizacion se conocen en la tecnica; por ejemplo, un higrometro electronico o un analizador de gas residual pueden utilizarse. El contenido de humedad de formulaciones liofilizadas se puede determinar por diferentes metodos conocidos en la tecnica, como, por ejemplo, perdida-en-secado, valoracion de Karl Fischer, analisis termogravimetrico (TGA), cromatografia de gases (GC), o cerca de IR (ver, por ejemplo Wang et al, international Journal of Pharmaceutics 203 (2000): 1-60). Metodos para determinacion del contenido de agua (contenido de humedad) se describen tambien en las farmacopeas europeas y estadounidenses. Por ejemplo, determinacion del contenido de agua se puede realizar por valoracion colorimetrica de Karl Fischer como se describe en la farmacopea estadounidense (USP <921, Ic») o en la famacopoea europea (EP <2.5.32»)). En resumen, el metodo es el siguiente: Determinacion de contenido de agua por valoracion colorimetrica: la reaccion Karl Fischer se usa en la determinacion colorimetrica de agua basada en la reaccion cuantitativa de agua con dioxido de azufre y yodo en un medio anhidro. Yodo se produce electroquimicamente en la celula de reaccion por oxidacion de yoduro. El yodo producido en el anodo reacciona inmediatamente con el agua y el dioxido de azufre contenido en la celula de reaccion. La cantidad de agua en la sustancia es directamente proporcional a la cantidad de electricidad hasta el punto final de valoracion. Cuando todo el agua en la celula se ha consumido, el punto final se alcanza yasi un exceso de yodo aparece que es detectado electrometricamente, indicando asi el punto final. El porcentaje de contenido de agua presente en la sustancia se calcula luego.

[0051] El contenido de humedad se puede definir en cuanto al peso de la muestra en el vial en el tiempo de analisis (es decir, solidos mas el agua presente llamada base de peso en humedo) o se puede definir en terminos donde este se corrige para el agua medida en la muestra (es decir, base de peso en seco). En caso de productos liofilizados con contenido de humedad bajo las dos mediciones (base de peso en humedo frente a base de peso en seco) produjeron resultados muy similares. Como se utiliza en este caso, contenido de humedad se define en cuanto a los solidos mas el agua presente (es decir, base de peso en humedo).

[0052] El termino "agente de carga" generalmente incluye agentes, que proporcionan buenas propiedades de pastel liofilizado, que forman un producto farmaceuticamente elegante, que ayudan a la proteina a superar varias tensiones, corte/congelacion, por ejemplo, asociados a procesos de liofilizacion, y que ayudan a mantener niveles de actividad de proteina durante el proceso de liofilizacion y almacenamiento posterior. Ejemplos no limitativos de agentes de carga incluyen manitol, glicina, sacarosa, lactosa. Estos agentes pueden contribuir tambien a la tonicidad de las formulaciones.

[0053] El termino "modificador de tonicidad" abarca cualquier agente capaz de contribuir a la osmolalidad de la solucion, ajustando asi la tonicidad de la composicion, de manera que sobre la disolucion de la composicion durante el uso, la composicion tiene una tonicidad en el intervalo fisiologico de la sangre, liquido peritoneal u otros liquidos biologicos pertinentes. Obviamente, la tonicidad puede tambien depender en si la solucion de reconstitucion comprende agentes de modificadores de tonicidad.

[0054] El termino "tensioactivos" generalmente incluye aquellos agentes, que protegen a la proteina de tensiones inducidas por interfaz de aire/solucion y tensiones inducidas por solucion/superficie. Por ejemplo tensioactivos pueden proteger a la proteina de agregacion. Tensioactivos adecuados pueden incluir, sin limitacion, polisorbato como T�een 20, T�een 80, o poloxamero como poloxamero 188 o 407, y otros polimeros en bloque de etileno/polipropileno o polietilenoglicol ( PEG) co mo P EG8000. D etergentes preferidos son p oloxameros, p or ej emplo, p oloxamero 1 88, poloxamero 407, alquil eteres, por ejemplo Cremofor A25, Sympatens ALM/230;/ALM/230 y polisorbatos/T�eens, por ejemplo, polisorbato 20, polisorbato 80. Mas preferidos son poloxameros, por ejemplo, poloxamero 188, y T�eens, por ejemplo, T�een 20 y T�een 80.

[0055] El termino "contenido teorico" se refiere a la cantidad de factor VII modificado anadido a una composicion durante la preparacion. La concentracion dada aqui (mg/ml) se refiere a la concentracion en la solucion de factor VII modificado antes de liofilizacion o se refiere como % p/p (peso/peso), que luego se refiere a la concentracion en el pastel liofilizado.

[0056] Como se utiliza en este caso, cantidades especificas se entienden que son � aproximadamente 10%; asi aproximadamente 50 mM incluye 50 mM � 5mM, 4% incluye 4% � 0,4%, etc.

[0057] Como se declara arriba, la presente invencion proporciona metodos ycomposiciones para estabilizacion de proteinas del factor VII modificado, permitiendo asi almacenamiento a largo plazo sin causar riesgo aumentado e inconveniente al usuario.

[0058] Los presentes investigadores handescubierto que un numero de parametros cruciales necesita ajustarse en estabilizacion del factor VII modificado. Como un primer parametro se refiere, al menos en parte, el contenido de humedad, p or ej emplo, ag ua. E l co ntenido de h umedad de beria se r l imitado. C omo ot ro par ametro ese ncial, l a composicion deberia incluir un agente adecuado para mantener el pH dentro de pH 4 a 7.

[0059] Asi, en un primer aspecto, la invencion se refiere a una composicion comprendiendo: i) factor VII modificado; ii) un agente adecuado para mantener el pH de dicha composicion en el intervalo de 4 a 7 cuando dicha composicion se disuelve en agua; y iii) un contenido de humedad de como mucho 3%.

[0060] El factor VII modificado que se puede formular conforme a la presente invencion se describe anteriormente. En formas de realizacion adecuadas de la invencion, el factor VII modificado se selecciona del grupo consistente en dansil- EGR-FVIIa, dans il-EGR-FVII, FFR -FVlla, F FR-FVII, PPA -FVIIa, PPA-FVII, S er344-FVIIa a nd S er344-FVII. Preferiblemente, el factor VII modificado es FFR-FVIIa o FFR-FVII.

[0061] Como se declara, el pH deberia mantenerse en el intervalo de pH dentro de 4 a 7 cuando se disuelve en el agua. Ventajosamente, este margen de pH esta tambien en el intervalo fisiologico deseado, causando asi ningun dano al usuario sobre administracion de la composicion por medios parentales. Preferiblemente el pH de la solucion es de 5,0 a 7,0, de 5,5 a 7,0 o de 5,8 a 6,8, como cercano a un pH de 6,0 y 6,5.

[0062] A lgunos de l os agentes adecuados para m antener el pH en el i ntervalo deseado necesitan an adirse e n cantidades limitadas para co nseguir el p H dese ado. P or ej emplo, cuando e l age nte es glicil-glicina, su co ntenido necesita ajustarse.

[0063] Asi, en todavia otras formas de realizacion interesantes, donde el agente adecuado para mantener el pH de dicha composicion en el intervalo de 4 a 7 es glicil-glicina, esta presente en una cantidad de como mucho 7 mg/ml. Por consiguiente, en formas de realizacion adecuadas de esta, el agente adecuado para mantener el pH en el intervalo de 4 a 7 se selecciona del grupo consistente en citrato, histidina, malato, fosfato, acido tartarico, acido succinico, MES, HEPES, imidazol, TRIS, lactato, glutamato y glicil-glicina, con la condicion de que cuando dicho agente es glicil-glicina, esta presente en una cantidad de como mucho 7 mg/ml.

[0064] En otras formas de realizacion relacionadas aqui, la cantidad de glicil-glicina esta incluso mas restringida, de manera que la cantidad de glicil-glicina es de como mucho aproximadamente 4 mg/ml, preferiblemente de como mucho aproximadamente 3 mg/ml, de forma mas preferida de como mucho aproximadamente 2 mg/ml.

[0065] Ademas, el agente adecuado para mantener el pH en el intervalo de 4 a 7 puede tambien ser una mezcla de al menos dos de estos agentes enumerados, donde la mezcla es capaz de proporcionar un valor de pH en el intervalo definido. La concentracion de los agentes adecuados esta en el intervalo de aproximadamente 1 mM a 100 mM; de 1 mM a aproximadamente 50 mM; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 25 mM; de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 20 mM; o aproximadamente 10 mM.

[0066] Como se declara arriba, el contenido de humedad deberia ser limitado. Asi, en formas de realizacion adecuadas de la invencion, el contenido de humedad esta a como mucho 2% p/p, de forma mas preferida a como mucho 1% p/p.

[0067] Tipicamente, proteinas del factor VII modificado, cuando se proporcionan en masa, estan en forma liquida. Asi, ademas procesamiento de las proteinas en masa para la fabricacion de composiciones requiere los pasos de adicion de excipientes adecuados y eliminacion del liquido de la masa, dicha adicion de excipientes se puede llevar a cabo antes o despues de la eliminacion del liquido. Un medio para la eliminacion de liquido de una proteina se refiere a liofilizacion. Por lo tanto, en una forma de realizacion preferida de la presente invencion, la composicion esta en forma de un pastel liofilizado.

[0068] Asi, en formas de realizacion adecuadas segun la invencion, la composicion comprende ademas, crioprotectores lioprotectores y/o agentes de carga. En una forma de realizacion de esta, la composicion comprende ademas un alcohol de azucar seleccionado del grupo consistente en m anitol, sorbitol y xilitol. En otra forma de r ealizacion de esta, la composicion c omprende ad emas un sa carido se leccionado d el grupo consistente e n sa carosa, d extrosa, lactosa, maltosa, trehalosa, ciclodextrinas, maltodextrinas y dextranas.

[0069] T ipicamente, el co ntenido de c rioprotectores, l ioprotectores y agentes de c arga necesitan a justarse adecuadamente para contribuir a la estabilidad de proteinas del factor VII modificado durante liofilizacion y despues de terminacion de liofilizacion, durante almacenado a varias condiciones.

[0070] Los presentes investigadores han descubierto que el alcohol de azucar deberia estar en una cantidad que varia de a proximadamente 30% p/p a 95% p/p. P referiblemente, l a ca ntidad del al cohol d e az ucar deberia va riar d e aproximadamente 35% p/p a 95% p/p, mas preferiblemente de aproximadamente 40% p/p a 90% p/p y de forma mas preferida de aproximadamente 45% p/p a 90% p/p.

[0071] Como se puede observar en el ejemplo 3, los presentes investigadores han proporcionado composiciones con contenido bajo de productos de degradacion en la terminacion del proceso de liofilizacion (menos de 24 horas despues de terminacion del proceso liofilizacion) incluyendo un contenido apropiado de manitol correspondiente a 40 mg/ml (concentracion antes de liofilizacion). Asi, las composiciones segun la invencion se caracterizan por tener un bajo contenido inicial de formas oxidadas y agregados antes de estar sometidos a almacenamiento.

[0072] Tipicamente, las composiciones se estabilizan en la terminacion de la liofilizacion de manera que menos de 4% p/p del factor VII modificado se convierte en sus formas oxidadas, menos de 1% p/p se recupera como formas dimericas y formas polimericas de orden mayor no se detectan usando metodos convencionales analiticos (como, por ejemplo, los metodos descritos en el ejemplo 2 de la presente descripcion).

[0073] Por otra parte y ventajosamente, las composiciones de la invencion son estables en almacenamiento, por ejemplo, menos de 5% p/p, como 4%, 3%, o 2,5%, del factor VII modificado se convierte en una forma oxidada y menos de 5% p/p, como 4%, 3%, o 2,5% se convierte en una forma dimerica sobre almacenamiento a 25 °C durante 12 meses a oscuras, o 2,5% se convierte en forma dimerica sobre almacenamiento a 25 °C durante 12 meses a oscuras.

[0074] Los presentes investigadores proporcionan datos aqui indicando que ademas degradacion de factor VII modificado es minima sobre almacenamiento bajo condiciones ambientales. Como se puede observar en el ejemplo 4, el aumento es de manera que menos de 2% p/p de factor VII modificado, como aproximadamente 1% p/p se recupera como formas oxidadas de factor VII modificado ademas del contenido inicial de dichas formas oxidadas presentes sobre terminacion de liofilizacion. Por otra parte, menos de 2% p/p, como aproximadamente 1% p/p de factor VII modificado se recupera adicionalmente como formas dimericas sobre almacenamiento durante 12 meses a 25°C. De gran importancia, ningun aumento en el contenido de formas polimericas se monitoreo durante dicho almacenamiento a 25°C durante 12 meses.

[0075] T al y como se m enciona, l a d egradacion de f actor V II m odificado puede s uponer o xidacion a l i gual que agregacion. No obstante, la ruta oxidante resulto ser mas sensible a almacenamiento por lo que las formas oxidadas de factor VII modificado son utiles como un parametro indicador de estabilidad.

[0076] Asi, en algunas formas de realizacion, la invencion se refiere a una composicion que es estable en el almacenamiento de la composicion durante 12 meses a 25 °C, de manera que formas oxidadas de dicho factor VII modificado estan en una cantidad de como maximo aproximadamente 4% p/p en relacion al contenido inicial teorico de dicho factor VII modificado. El contenido inicial teorico de dicho factor VII modificado es la cantidad anadida ala composicion en la preparacion de la composicion antes del paso de liofilizacion. Por optimizacion apropiada del contenido de crioprotectores, lioprotectores y agentes de carga, las formas oxidadas de dicho factor VII modificado estan e n un a ca ntidad d e como m ucho apr oximadamente 3,5% p/p, m as preferiblemente d e como m ucho aproximadamente 3,0% p/p. En otra forma de realizacion adecuada de esta, las formas oxidadas de dicho factor VII modificado estan en una cantidad de como mucho aproximadamente 2,5% p/p en relacion al contenido inicial teorico de dicho factor VII modificado.

[0077] Tal y como se menciona, la invencion se refiere en parte para limitar la degradacion de factor VII modificado del tiempo de fabricacion de la composicion solida de factor VII modificado, por ejemplo, despues de terminacion de liofilizacion hasta el tiempo de uso, por ejemplo, al mismo tiempo cuando la composicion debe administrarse a un paciente. P or lo t anto, se gun l a presente i nvencion, co mposiciones adecuadas tienen un aumento l imitado e n e l contenido de formas oxidadas sobre almacenamiento durante largo plazo a condiciones ambientales. �ue en otras formas de realizacion, la composicion es estable de manera que en el almacenamiento de la composicion durante 12 meses a 25 ° C, f ormas oxidadas de dicho f actor VII m odificado a umentan e n c ontenido en co mparacion co n su contenido inicial por como mucho aproximadamente 2,0% p/p en relacion al contenido inicial teorico de dicho factor VII modificado. En otras formas de realizacion adecuadas de esta, el aumento en el contenido de formas oxidadas esta a como mucho aproximadamente 1,5% p/p, a como mucho aproximadamente 1,0% p/p, o preferiblemente a como mucho aproximadamente 0,5% p/p. El aumento en contenido de formas oxidadas expresa la cantidad de factor VII modificado recuperado como formas oxidadas sobre almacenamiento.

[0078] Las composiciones segun la invencion son adecuadas tambien para almacenamiento a largo plazo a 25°C y pueden incluso poseer una estabilidad apropiada a condiciones causando degradacion acelerada, como a temperaturas mas altas, por ejemplo, a 45°C.

[0079] E n otras formas de r ealizacion, l a co mposicion es estable d e m anera q ue en el almacenamiento de l a composicion durante 18 meses a 25 °C, formas oxidadas de dicho factor VII modificado estan en una cantidad a como mucho aproximadamente 4,5% p/ p e n relacion al c ontenido i nicial t eorico d e di cho f actor V II m odificado. Preferiblemente, la cantidad de formas oxidadas esta a como mucho aproximadamente 4,0 % p/p, mas preferiblemente a como mucho aproximadamente 3,5% p/p, incluso mas preferiblemente a como mucho aproximadamente 3,0% p/p de forma mas preferida a como mucho aproximadamente 3,5% p/p.

[0080] � ue es mas que decir qu e l a co mposicion es estable de m anera q ue el s iguiente a lmacenamiento de la composicion durante 18 meses a 25 °C, formas oxidadas de dicho aumento factor VII modificado en el contenido en comparacion con su contenido inicial por como mucho aproximadamente 2,8% p/p en relacion al contenido inicial teorico de dicho factor VII modificado. En otras formas de realizacion de esta, el aumento corresponde a un aumento en el contenido de formas oxidadas en una cantidad de a como mucho aproximadamente 2,5% p/p y en formas de realizacion mas preferidas de a como mucho aproximadamente 2,0% p/p. En todavia otras formas de realizacion, el aumento en el contenido de formas oxidadas es de como mucho aproximadamente 1,5% p/p, de forma mas preferida de como mucho aproximadamente 1,0% p/p, como a como mucho aproximadamente 0,5 % p/p.

[0081] Todavia otras formas de realizacion de la invencion se refieren a donde la composicion es estable de manera que en el almacenamiento de la composicion durante 32 meses a 25 °C, formas oxidadas de dicho factor VII modificado estan en una cantidad de como mucho aproximadamente 9,0% p/p en relacion al contenido inicial teorico de dicho factor VII m odificado, pr eferiblemente en un a cantidad de como m ucho apr oximadamente 8,0 % p/p, i ncluso mas preferiblemente de como mucho a proximadamente 7,0% p/ p, t odavia m as preferiblemente de como mucho aproximadamente 6% p/p, como aproximadamente 5% p/p, preferiblemente de como mucho aproximadamente 4% p/p, de forma mas preferida como mucho aproximadamente 3% p/p.

[0082] En todavia otras formas de realizacion, la composicion es estable de manera que el siguiente almacenamiento de la composicion durante 32 meses a 25 °C, formas oxidadas de dicho factor VII modificado aumentan en el contenido en comparacion con su contenido inicial por como mucho aproximadamente 7,0% p/p en relacion al contenido inicial teorico de dicho factor VII modificado, preferiblemente en una cantidad de como mucho aproximadamente 6,0% p/p, mas preferiblemente de como mucho aproximadamente 5,0% p/p, tal como, como mucho aproximadamente 4% p/p y3% p/p, incluso mas preferiblemente de como mucho aproximadamente 2,0% p/p de forma mas preferida de como mucho aproximadamente 1,0% p/p.

[0083] En condiciones aceleradas, la composicion todavia tiene estabilidad superior. Como tal, en otras formas de realizacion, la invencion se refiere a una composicion que es estable de manera que en el almacenamiento de la composicion durante 8 semanas a 45 °C, formas oxidadas de dicho factor VII modificado estan en una cantidad de como m ucho aproximadamente 4% p/ p e n r elacion al contenido i nicial t eorico de di cho f actor V II m odificado, preferiblemente en una cantidad de como mucho aproximadamente 3,5% p/p, incluso mas preferiblemente de como mucho aproximadamente 3,0% p/p, de forma mas preferida de como mucho aproximadamente 2,5% p/p.

[0084] Por otra parte, el aumento de formas oxidadas despues de terminacion del proceso de liofilizacion esta limitado. Asi, en aun o tras formas de r ealizacion, la co mposicion es estable de m anera q ue en el almacenamiento de l a composicion durante 8 semanas a 45 °C, formas oxidadas de dicho aumento del factor VII modificado en el contenido en comparacion con su contenido inicial por como mucho aproximadamente 2,0% p/p en relacion al contenido inicial teorico de dicho factor VII modificado, preferiblemente en una cantidad de como mucho aproximadamente 1,5% p/p, incluso mas preferiblemente de como mucho aproximadamente 1,0% p/p, incluso mas preferiblemente de como mucho aproximadamente 0,8% p/p de forma mas preferida de como mucho aproximadamente 0,5% p/p de formas oxidadas.

[0085] Mejor estabilidad se consigue sobre almacenamiento a condiciones mas frias como a 5°C. A esta temperatura, las composiciones pueden almacenarse tambien durante un periodo de tiempo mas largo antes de la degradacion de factor VII modificado es inadecuado. Como se puede observar en el ejemplo 4, menos de aproximadamente 1,5% p/p de factor VII modificado se degrada sobre almacenamiento durante 32 meses.

[0086] Asi, otras formas de realizacion de la invencion se refieren a composiciones estables de manera que en el almacenamiento de la composicion durante 32 meses a 5 °C, formas oxidadas de dicho factor VII modificado estan en una cantidad de como mucho aproximadamente 5,0 % en peso en relacion al contenido inicial teorico de dicho factor VII modificado, preferiblemente en una cantidad de como mucho aproximadamente 4,5% p/p, mas preferiblemente de como mucho aproximadamente 4,0 % p/p, incluso mas preferiblemente de como mucho aproximadamente 3,5 % p/p de forma mas preferida de como mucho aproximadamente 3,0% p/p, como aproximadamente 2,5% p/p.

[0087] A demas, en t odavia ot ras formas de r ealizacion, l a c omposicion es estable de m anera que el s iguiente almacenamiento de l a co mposicion d urante 32 m eses a 5 ° C, f ormas oxi dadas de dicho aum ento del factor V II modificado en el contenido en comparacion con su contenido inicial por como mucho aproximadamente 2,5% p/p en relacion al contenido inicial teorico de dicho factor VII modificado, preferiblemente en una cantidadde como mucho aproximadamente 2,0% p/p, mas preferiblemente de como mucho aproximadamente 1,5% p/p, incluso mas preferiblemente de como mucho aproximadamente 1,0% p/p, de forma mas preferida de como mucho aproximadamente 0,5% p/p.

[0088] Como se ha mencionado anteriormente, la estabilidad mejorada se refiere, en parte, a seleccion adecuada de crioprotectores, lioprotectores y agentes de carga y a ajustar su contenido. Como se declara al menos un grupo de estos excipientes deberia estar presente en la composicion de la invencion para conseguir la estabilidad apropiada. No obstante, c omo se d escubrio por l os presentes investigadores, l a estabilidad es incluso m as favorable s obre combinacion de excipientes con las propiedades mencionadas anteriormente. Por lo tanto, formas de realizacion de la invencion adecuadas se refieren a composiciones comprendiendo ademas un sacarido. Sacaridos de interes son di-y trisacaridos, p ero t ambien algunos polisacaridos de m anera qu e los sa caridos p ueden s eleccionarse de l grupo consistente en sacarosa, dextrosa, lactosa, maltosa, trehalosa, ciclodextrinas, maltodextrinas y dextranos.

[0089] Los presentes investigadores han reconocido la combinacion apropiada de los polialcoholes y los sacaridos al igual que su contenido para, al menos en parte, conseguir estabilidad favorable.

[0090] Asi, en algunas formas de realizacion de la invencion, el sacarido esta presente en la composicion en una cantidad que varia de aproximadamente 1% p/p a 45% p/p. En otras formas de realizacion interesantes de esta, la cantidad varia de aproximadamente 5% p/p a 40% p/p, de manera mas interesante de aproximadamente 5% p/p a 35% p/p y mas adecuadamente de aproximadamente 10% p/p a 30% p/p.

[0091] De manera importante, la proporcion entre el alcohol de azucar y el sacarido necesita ajustarse debidamente. En algunas formas de realizacion de la invencion, dicho alcohol de azucar esta en una proporcion de peso en relacion a dicho sacarido que varia de aproximadamente 100:1 a 1:20. En otras formas de realizacion de esta, dicha proporcion en peso es de aproximadamente 50:1 a 1:10, mas preferiblemente de aproximadamente 20:1 a 1:5. En otras formas de realizacion, la proporcion en peso se refiere a intervalos de aproximadamente 10:1 a 1:2 y de aproximadamente 4:1 a

1:2. No obstante, como se descubrio por los presentes investigadores (vease ejemplo 5), la incorporacion de pastel liofilizado colapsado sobre incorporacion de cantidades mas altas delos sacaridos. Como tal, algunas formas de realizacion se refieren a donde dicho alcohol de azucar esta en una proporcion en peso en relacion a dicho sacarido que varia de aproximadamente 3:1 a 1:1, como de aproximadamente 3:1 a 3:2.

[0092] Por otra parte, la estabilidad favorable se refiere, al menos en parte, al contenido de dicho alcohol de azucar y dicho sacarido en relacion al contenido de dicho factor VII modificado. Por lo tanto, en otras formas de realizacion de la invencion, l as co mposiciones comprendiendo f actor V II m odificado t ienen un a pr oporcion en peso de f actor V II modificado en relacion a la suma de dicho alcohol de azucar y dicho sacarido que varia de aproximadamente 1:200 a

1:5. P referiblemente, l a pr oporcion en p eso va ria de a proximadamente 1: 100 a 1: 8 y, m as preferiblemente, de aproximadamente 1:75 a 1:10. En otras formas de realizacion, la proporcion en peso varia de aproximadamente 1:60 a 1:15, como de aproximadamente 1:50 a 1:20.

[0093] En algunas formas de realizacion de la invencion, el alcohol de azucar es manitol y en todavia otras formas de realizacion, el sacarido es sacarosa.

[0094] Asi, en aquellas formas de realizacion, la proporcion entre manitol y sacarosa es de manera que dicho manitol esta e n una proporcion e n peso e n r elacion a d icha sacarosa q ue varia d e a proximadamente 10:1 a 1: 10. Mas interesante, dicha proporcion es de aproximadamente 10:1 a 1:5, todavia mas interesante de aproximadamente 5:1 a

1:2. No obstante, cuando la composicion se provee como un pastel liofilizado, formas de realizacion muy adecuadas se refieren a aquellas donde dicho manitol esta en una proporcion en peso en relacion a dicho sacarido que varia de aproximadamente 5:1 a 1:1, de forma mas preferida de aproximadamente 4:1 a 5:4, como de aproximadamente 3:1 a

3:2.

[0095] En otras formas de realizacion de la invencion, dicho factor VII modificado esta en una proporcion en peso en relacion a la suma de dicho manitol y dicha sacarosa que varia de aproximadamente 1:100 a 1:5, preferiblemente de aproximadamente 1:75 a 1:10, mas preferiblemente de aproximadamente 1:60 a 1:15, de forma mas preferida de aproximadamente 1:50 a 1:20.

[0096] Como puede entenderse, la composicion estabilizada segun la presente invencion esta en forma solida; es decir, la composicion se ha sometido a liofilizacion. No obstante, esto implica que la composicion se provee originalmente como un liquido que debe liofilizarse. Para fines, al menos en parte, de estabilizar la composicion liquida antes de eliminacion d e hum edad y para f ines de estabilizar l a co mposicion solida so bre a lmacenamiento, l a co mposicion comprende un agente capaz de mantener el pH a un nivel optimo para evitar degradacion. De gran importancia este margen de pH de 4-7 esta tambien en el intervalo fisiologico de administracion parental de la composicion.

[0097] O pcionalmente, l as composiciones pueden i ncluir un a ntioxidante. E l t ermino ant ioxidante abarca cualquier sustancia que impide oxidacion quimica del factor VII modificado. Asi, en algunas formas de realizacion de la invencion favorables, las composiciones ademas comprenden un antioxidante. Ejemplos no limitativos de antioxidantes adecuados incluyen acido ascorbico, cisteina, homocisteina, cistina, cistationina, metionina, glutation y peptidos con cualquier cisteina,homocisteina, cistina, cistationina, metioninayglutation, en particular, peptidos con de 2 a 5 r esiduos de aminoacidos donde al menos uno de los residuos es residuo de cisteina, homocisteina, cistina, cistationina, metionina o glutation. E n algunas formas de r ealizacion de esta, el ant ioxidante es metionina, en par ticular L -metionina. El antioxidante s e i ncluye a u na c oncentracion de aproximadamente 0,01 a a proximadamente 5,0 m g/ml, co mo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 5,0 mg/ml, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 4,0 mg/ml, de aproximadamente 0,1 a 3,0 mg/ml, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 2,0 mg/ml, o de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 3,0 mg/ml, de aproximadamente 1.0 a aproximadamente 2,7 mg/ml, como aproximadamente 2,5 mg/ml,.

[0098] El antioxidante contribuye, al menos en parte, a estabilizar la composicion durante el tiempo de almacenamiento proporcionando la composicion con un contenido de humedad de m as del 3%, por ejemplo, de l a terminacion del procesode liofilizacion hastauso. Como se puede observar enel ejemplo 4, el aumento en formasoxidadas sobre almacenamiento de una composicion comprendiendo metionina durante 32 meses a 25°C es 0,9 % en peso.

[0099] Las co mposiciones pueden f ormularse a demas p or i ncorporacion de ot ros excipientes farmaceuticamente aceptables para conseguir composiciones aceptables para administracion parenteral, en particular, administracion intravenosa. Metodos para preparar composiciones para administracion parental se conoceran o seran evidentes a los expertos en la tecnica y se describen con mas detalle en, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th ed., M ack Publishing C ompany, E aston, P A ( 1995). E l t ermino " excipientes" i ncluye r eactivos farmaceuticos aceptables para proporcionar buenas propiedades de pastel liofilizado (agentes de carga) al igual que proporcionar lioproteccion y crioproteccion de la proteina, mantenimiento de pH, mantenimiento de tonicidad aceptable al igual que conformacion apropiada de la proteina durante almacenamiento de modo que retencion sustancial de actividad biologica y estabilidad de proteina se mantienen.

[0100] Asi, segun la invencion, las composiciones ademas comprenden un modificador de tonicidad. Modificadores de tonicidad incluyen, pero de forma no limitativa, aminoacidos; peptidos pequenos (p. ej., teniendo de 2 a 5 residuos de aminoacido); sales neutras; mono- o disacaridos; polisacaridos; polialcoholes, o una mezcla de al menos dos de dichos modificadores. Ejemplos de modificadores de tonicidad incluyen, pero de forma no limitativa, cloruro sodico, cloruro de potasio, citrato sodico, sacarosa, glucosa, glicil-glicina y manitol. Normalmente, los modificadores estan presentes en una concentracion de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 mM; de aproximadamente 1 a aproximadamente 300 mM; de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 mM; o de aproximadamente 20 a aproximadamente 150 mM, dependiendo de los otros ingredientes presentes. Sales neutras como, por ejemplo, cloruro sodico o cloruro de potasio se pueden utilizar. Por "sal neutra" se entiende una sal que no es ni un acido ni una base cuando se disuelve en solucion acuosa.

[0101] En una forma de realizacion, el modificador de tonicidad se selecciona del grupo consistente en acetato sodico, lactato sodico, cloruro sodico, cloruro de potasio y cloruro de calcio. Tambien se nota que, estas composiciones pueden comprender concentraciones mucho mas altas del agente modificador de tonicidad, puesto que la composicion se hace isotonica antes de uso, por ejemplo, composiciones en masa no necesitan ser isotonicas con el intervalo fisiologico. Composiciones que deben administrarse por inyeccion o infusion deberian ser preferiblemente isotonicas con suero antes de uso (es decir, aproximadamente 300 � 50 milliosmol/kg).

[0102] Otra estabilizacion de la proteina liofilizada se puede obtener por la adicion de tensioactivos. Asi, en algunas formas de r ealizacion de l a invencion, l as co mposiciones comprenden ad emas un tensioactivo, el tensioactivo se selecciona del grupo consistente en polisorbatos, por ejemplo, T�een�, como polisorbato 20 o 80, polioxietilen alquil eteres o po loxameros, co mo pol oxamero 188 ( p. ej . P luronic�) o pol oxamero 407, ( por ej emplo; Lut rol�) y ot ros polimeros en bloque de etileno/polipropileno o polietilenoglicol (PEG) como PEG8000. Tipicamente, los tensioactivos se agregan en una cantidad de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 5 mg/ml, como de aproximadamente 0,01a aproximadamente 5.0 mg/ml, de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 3,0 mg/ml, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 3,0 mg/ml, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 2,0 mg/ml, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1,0 mg/ml, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,5 mg/ml, de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,5 mg/ml, o de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,25 mg/ml. Cantidades preferidas son de 0,01 a 3 mg/ml, como de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 2,0 mg/ml, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1,0 mg/ml, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,5 mg/ml, de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,5 mg/ml, o de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,25 mg/ml, como aproximadamente 0,1 mg/ml para T�een 20 y/oT�een 80, yde aproximadamente 0,05 a 3,0 mg/ml, comode aproximadamente 0,05 a aproximadamente 2,0 mg/ml, de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 1,0 mg/ml, de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,5 mg/ml, o de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,25 mg/ml para poloxamero 188.

5 [0103] En algunas formas de realizacion de la invencion, la composicion comprende ademas otros excipientes farmaceuticos que actuan como, por ejemplo, agente de carga. Esto quiere decir que otros agentes de carga que manitol pueden tambien incluirse en las composiciones. En particular, agentes de carga se incluyen en composiciones preparadas por liofilizacion.

10 [0104] En una forma de realizacion, la composicion contiene: FVII modificado, CaCl2, NaCl, glicil-glicina, manitol y T�een 80, tiene un contenido de humedad de como maximo 3% y tiene un pH en el intervalo de 4,0 a 7,0 cuando la composicion se disuelve en agua.

[0105] E n ot ra f orma d e realizacion, l a co mposicion c ontiene: FVII modificado, C aCl2, NaCl, gl icil-glicina, manitol,

15 sacarosa, metionina, y T�een 80, tiene un contenido de humedad de como maximo 3% y tiene un pH en el intervalo de 4,0 a 7,0 cuando la composicion se disuelve en agua.

[0106] En otras formas de realizacion, la composicion contiene:

Compuesto: Formulacion A Formulacion B Formulacion C

FFR-rFVIIa: de 1,8 a 2,2 mg/ml de 1,8 a 2,2 mg/ml de 1,8 a 2,2 mg/ml

CaCl2 x2H2O: de 1,3 a 1,7 mg/ml de 1,3 a 1,7 mg/ml de 9,3 a 1,7 mg/ml

NaCl: de 2,7 a 3,1 mg/ml de 2,7 a 3,1 mg/ml de 2,7 de 3,1 mg/ml

Glicil-glicina Manitol: de 1,1 a 1,5 mg/ml de 25 a 30 mg/ml de 1,1 a 1,5 mg/ml de 35 a 45 mg/ml de 1,1 a 1,5 mg/ml de 25 a 30 mg/ml

Sacarosa: de 20 a 5 mg/ml - de 20 a 5 mg/ml

Metionina: - - 0,25 mg/ml

T�een 80: de 0,05 a 0,15 mg/ml de 0,05 a 0,15 mg/l de 0,05 a 0,15 mg/ml

pH: de 5,0 a 7,0 de 5,0 a 7,0 de 5,0 a 7,0

[0107] En otras formas de realizacion, la composicion contiene:

Compuesto: Formulacion D Formulacion E Formulacion F

FFR-rFVIIa: 2.0 mg/ml 2,0 mg/ml 2,0 mg/ml

CaCl2 x2H2O: 1,47 mg/ml 1,47 mg/ml 1,47 mg/ml

NaCl: 2,92 mg/ml 2,92 mg/ml 2,92 mg/ml

Glicil-glicina: 1,32 mg/ml 1,32 mg/ml 1,32 mg/ml

Manitol: 26,7 mg/ml 40 mg/ml 26,7 mg/ml

Sacarosa: 13,3 mg/ml - 13,3 mg/ml

Metionina T�een 80: -0,1 mg/ml -0,1 mg/ml 0,25 mg/ml 0,1 mg/ml

pH: 6,0 6,0 6,0

[0108] Como se h a m encionado anteriormente, l os presentes i nvestigadores h an proporcionado un m etodo para

25 estabilizacion de pr oteinas del f actor V II m odificado proporcionando l as proteinas en c omposiciones solidas comprendiendo excipientes farmaceuticamente aceptables seleccionados, de los cuales es importante incluir un agente capaz de mantener el pH en el intervalo de 4 a 7.

[0109] Por lo tanto, otro aspecto de la invencion se refiere a un metodo para preparar un factor VII modificado estable. El

30 metodo comprende los pasos de: i) provision de dicho factor VII modificado en una solucion con pH en el intervalo de 4 a 7. ii) tratamiento de dicha solucion para obtener una composicion solida con un contenido de humedad de como mucho 3 % p/p.

[0110] En otras formas de realizacion de esta, el metodo comprende que dicha solucion comprende ademas un alcohol de azucar seleccionado del grupo consistente en manitol, sorbitol y xilitol. En todavia otras formas de realizacion interesantes, dicha solucion comprende ademas un sacarido seleccionado del grupo consistente en sacarosa, dextrosa, lactosa, maltosa, trehalosa, ciclodextrinas, maltodextrinas y dextranos. En formas de realizacion preferidas, el alcohol de azucar es manitol y el sacarido es sacarosa.

[0111] Preferiblemente, el contenido del alcohol de azucar y opcionalmente el contenido del sacarido en dicha solucion i) deberia ajustarse para conseguir proteinas del factor VII modificado estabilizado superiores. Segunla invencion, el alcohol de azucar deberia estar en una cantidad que varia de aproximadamente 1 mg/ml a 60 mg/ml, preferiblemente de aproximadamente 10 mg/ml a 50 mg/ml, mas preferiblemente de aproximadamente 15 mg/ml a 45 mg/ml, de forma mas preferida de aproximadamente 20 mg/ml a 40 mg/ml. El sacarido, si esta presente, deberia proporcionarse en una cantidad que varia de aproximadamente 1 mg/ml a 50 mg/ml, preferiblemente de aproximadamente 2 mg/ml a 35 mg/ml, mas preferiblemente de aproximadamente 5 mg/ml a 25 mg/ml, de forma mas preferida de aproximadamente 10 mg/ml a 20 mg/ml.

[0112] Por otra parte, la proporcion entre el alcohol de azucar y el sacarido deberia ajustarse. Formas de realizacion adecuadas se refieren a donde el alcohol de azucar esta en una proporcion en peso en relacion a dicho sacarido que varia de aproximadamente100:1 a 1:10, preferiblemente de aproximadamente 50:1a 1:5, mas preferiblemente de aproximadamente 20:1 a 1:3, incluso mas preferiblemente de aproximadamente 10:1 a 1:2, todavia mas preferiblemente de aproximadamente 4:1 a 1:2, como todavia mas preferiblemente de aproximadamente 3:1 a 1:1, de forma mas preferida de aproximadamente 3:1 a 3:2.

[0113] En unaforma derealizacion preferida, el metodo para preparar un factor VII modificado estable comprende liofilizacion. La liofilizacion se refiere a un proceso, donde la solucion comprendiendo dicho factor VII modificado se rellena en viales de liofilizacion o similares. Dicho factor VII modificado puede opcionalmente someterse a filtracion esteril antes del inicio de la liofilizacion. Enfriamiento se aplica a los estantes de los liofilizadores para congelar los viales y la solucion por debajo de temperaturas de producto criticas. El agua se quita introduciendo vacio y condensacion de vapor de agua en el condensador de hielo del liofilizador. Cuando el producto se seca, normalmente menos de 1% de contenido de humedad residual, (p. ej., medido por valoracion colorimetrica de Karl Fischer como se ha descrito anteriormente) los viales se cierran y se cubren. La fabricacion se finaliza y la composicion esta ahora en forma de un pastel liofilizado.

[0114] Estas composiciones, cuando se administran a un paciente por medios inyectables, necesitan reconstituirse en un liquido adecuado antes de uso. Pueden reconstituirse tambien para otros fines, por ejemplo, para reformulacion en otras composiciones farmaceuticas. No obstante, la presente invencion no excluye que las composiciones se pueden administrar a un paciente en su forma solida.

[0115] Las composiciones se reconstituyen usando un portador o un diluyente aceptable, preferiblemente esteril, preferiblemente un portador acuoso. Una variedad de portadores acuosos pueden utilizarse, por ejemplo, agua (p. ej. agua para inyeccion/WFI), agua tamponada, solucion salina (p. ej. 0,4% de solucion salina), glicina (p. ej. 0,3% de glicina) y similares. El diluyente de reconstitucion puede tambien contener una o mas sales, como una sal de calcio (p. ej. CaCl2) o una combinacion de un sodio y una sal de calcio (p. ej. NaCl y CaCl2).

[0116] Asi, reconstitucion de una composicion segun la invencion en solucion de Ringer esteril podria componer una composicion farmaceutica tipica para infusion intravenosa.

[0117] Las co mposiciones reconstituidas se d estinan para administracion par ental para t ratamiento pr ofilactico y/o terapeutico. P referiblemente, l as composiciones farmaceuticas se ad ministran parentalmente, es deci r, por vi a intravenosa, subcutaneamente, o intramuscularmente, o se administran a modo de infusion pulsatil o continua.

[0118] Por lo tanto, otro aspecto adicional de la invencion se refiere al uso de la composicion solida estabilizada para la preparacion de un m edicamento para t ratamiento t erapeutico, co mo pr evencion de co agulacion de la s angre o prevencion de reacciones mediadas por factor tisular.

[0119] Esto quiere decir que un aspecto de la invencion se refiere al uso de un factor VII modificado para la preparacion de un m edicamento par a e vitar co agulacion de sa ngre y/o pr evenir reacciones mediadas por f actor t isular, di cho medicamento comprendiendo una composicion comprendiendo; i) factor VII modificado; ii) un agente adecuado para mantener el pH de dicha composicion en el intervalo de 4 a 7 cuando dicha composicion se disuelve en agua; y iii) un contenido de humedad de como mucho 3%.

[0120] Ademas, en otro aspecto, la invencion se refiere a administracion de dicho factor VII modificado estabilizado a un paciente para evitar coagulacion de la sangre y/o prevenir reacciones mediadas por factor tisular. Asi, la invencion se refiere a un metodo de prevencion de coagulacion de la sangre y/o prevencion de reacciones mediadas por factor tisular

comprendiendo administracion a un sujeto con la necesidad de este, una cantidad eficaz de una composicion comprendiendo; i) factor VII modificado; ii) un agente adecuado para mantener el pH de dicha composicion en el intervalo de 4 a 7 cuando dicha composicion se disuelve en agua; y iii) un contenido de humedad de como mucho 3%.

[0121] En diferentes formas de realizacion, la coagulacion de la sangre se une con una condicion seleccionada del grupo co nsistente en : angioplastia, t rombosis venosa p rofunda, em bolia pulmonar, derrame ce rebral, co agulacion intravascular diseminada (DIC), deposicion de fibrina en pulmones y rinones asociada a endotoxemia gram-negativa, e infarto de miocardio.

[0122] En todavia otras formas de realizacion, las reacciones mediadas por factor tisular se asocian con una condicion seleccionada del grupo consistente en SIRS, ARDS, MOF, HUS y TTP.

[0123] Como se declara, la composicion esta en forma solida. Por consiguiente, en una forma de realizacion adecuada, el medicamento deberia ser adecuado para disolverse, lo que permite administracion parental del medicamento. Asi, cuando la administracion de las composiciones aun paciente comprende el paso de disolver la composicion en un liquido adecuado antes del paso de administracion.

[0124] Abreviaturas

FVII Factor VII de coagulacion en su forma monocatenaria FVIIa Factor VII de coagulacion en su forma bicatenaria activada dividida rFVII (rFVIIa) Factor VII recombinante (factor VIIa recombinante) FVIIai Factor V II m odificado que es factor V II de co agulacion c on a l menos una

modificacion en su centro catalitico, esta modificacion inhibe sustancialmente la

capacidad del factor VII modificado para activar factor de plasma X o IX. RFVIIai Factor VIIa modificado recombinante (recombinante FVIIai) Dansil-EGR- FVIIa Factor F Vlla ( FVII) de co agulacion d onde el ce ntro ca talitico se ha inactivado

reaccionando quimicamente FVlla (FVII) con Dansil-Glu-Gly-Arg clorometilcetona (dansil-EGR- FVII) (dansil-EGR-cmk) FFR-FVlla Factor FVIIa (FVII) de coagulacion donde el centro catalitico se ha inactivado por (FFR-FVII) Reaccionando quimicamenteFVlla (FVII) con Phe-Phe-Arg clorometilcetona (FFR

cmk) PPA-FVIIa FVIIa (FVII) reaccionado con D-Phe-Pro-Arg clorometilcetona (PPA-cmk) (PPA-FVII) Dansil-EGR-cmk Dansil-Glu-Gly-Arg clorometilcetona FFR-cmk D-Phe-Phe-Arg o Phe-Phe-Arg clorometilcetona PPACK D-Phe-Pro-Arg clorometilcetona (PPA-cmk) DFFR-cmk Dansil-D-Phe-Phe-Arg o dansil-Phe-Phe-Arg clorometilcetona Ser344-FVIIa Factor FVIIa (FVII) de coagulacion donde el centro catalitico se ha inactivado (Ser344-FVII) reemplazando el aminoacido nativo en la posicion 344 con serina.

Ensayos:

Actividad biologica de factor VII

[0125] La actividad biologica de factor VIIa en la coagulacion de la sangre deriva de su capacidad para (i) unirse con factor tisular (TF) y (ii) catalizar la escision proteolitica de factor IX o factor X para producir factor IX o X activado (factor IXa o Xa, respectivamente).

[0126] Actividad biologicade polipeptidos del factor VII("actividad biologica del factor VII") se puede cuantificar por medicion de la capacidad de una preparacion para promover coagulacion de la sangreusando plasma de factor VII deficiente y tromboplastina (descrito, por ejemplo, en la patente US n° 5,997,864). Alternativamente, actividad biologica del factor VIIa se puede cuantificar por (i) medicion de la capacidad del factor VIIa o un polipeptido relacionado con factor VIIa para producir factor X activado (factor Xa) en un sistema comprendiendo TF introducido en una membrana lipidica y factor X. (Persson et al., J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997); (ii) medicion de hidrolisis de factor X en un sistema acuoso; (iii) medicion de la union fisica de polipeptido relacionado con factor VIIa o con factor VIIa para TF usando un instrumento basado en la resonancia de plasmones superficiales (Persson, FEBS Letts. 413:359-363, 1997);

(iv) medicion de hidrolisis de un sustrato sintetico por un polipeptido relacionado con factor VIIa y/o factor VIIa; y(v) medicion de generacion de trombina en un sistema independiente de TF in vitro.

Actividad biologica de factor VII modificado:

[0127] La actividad biologica de factor VII modificado puede medirse, por ejemplo, por un ensayo de coagulo de competicion esencialmente como descrito en WO 92/15686 (ejemplo III) (ensayo 1) o en uno o mas de los ensayos 2 a 7 de debajo.

[0128] Inhibicion de FVIIa-fosfolipidos-introducidos TF-catalizado activacion de FX por factor VII modificado -Ensayo de generacion de FXa (ensayo 2): En el si guiente ej emplo t odas las concentraciones son finales. T F l ipidado ( 10 pM ), F VIIa ( 100 pM ) y f actor V II modificado (0 -50 nM) en HBS/BSA (50 mM hepes, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 5 mM de CaCl2, 1 mg/ml de BSA) se incuban 60 min a temperatura ambiente antes de que FX (50 nM) se anada. La reaccion se detiene despues de otros 10 min por adicion de � volumen de tampon de parada (50 mM de Hepes, pH 7,4, 100 mM de NaCl, 20 mM de EDTA). La cantidad de FXa generada se determina anadiendo sustrato S2765 (0,6 mM, Chromogenix y medicion de absorbencia a 405 nm s e puede ca lcular co ntinuamente d urante 1 0 m in. V alores I C50 par a i nhibicion d e antagonista T F de FVIIa/lipidado TF-mediado activacion de FX se pueden calcular. El valor IC50 para FFR-rFVIIa es 51 �/- 26 pM en este ensayo.

Inhibicion de union de 125I-FVIIa a superficie celular TF por factor VII modificado

Ensayo de union TF (ensayo 3):

[0129] En el siguiente ejemplo todas las concentraciones son finales. Estudios de union se emplean usando la linea de celula d e ca rcinoma de ve jiga humano J82 ( ATTC n� HTB-1) o l a l inea de c elula d e qu eranocito hum ano (CCD1102KerTr ATCC n� CRL-2310) o NHEK P166 (Clonetics n� CC-2507) todos constitutivamente expresando TF. Monocapas confluyentes en placas de cultivo de tejido de 24 pocillos se lavan una vez con tampon A (10 mM de Hepes, pH 7,45, 150 mM de NaCl, 4 mM de KCl y 11 mM de glucosa) complementado con 5 mM de EDTA y luego una vez con tampon A y una vez con tampon B (tampon A complementado con 1 mg/ml de BSA y 5 mM de Ca2�). Las monocapas se pr eincuban 2 m in co n 1 00 �l d e t ampon B f rio. C oncentraciones va riables de f actor V II m odificado y F VIIa radiomarcado (0,5 nM de 125I-FVIIa) se anaden simultaneamente a las celulas (volumen final 200 �l). Las placas se incuban durante 2 horas a 4 °C. Al final de la incubacion, el material no unido se quita, las celulas se lavan 4 veces con tampon B enfriado con hielo y lisadas con 300 �l de tampon de lisis (200 mM de NaOH, 1 % de SDS y 10 mM de EDTA). La radioactividad se mide en un contador gamma (Cobra, Packard Instruments). Los datos de union se analizan y se ajusta la curva usando GraFit4 (Erithacus Soft�are, Ltd., (U.K.). El valor IC50 para FFR-rFVIIa es 4 nM en este ensayo.

Inhibicion de actividad amidolitica FVIIa/sTF (ensayo 4):

[0130] Inhibicion de actividad amidolitica FVlla-TF catalizada por factor VII modificado se evalua utilizando TF humano soluble ( 10 nM), F Vlla hu mano r ecombinante ( 10 nM) y co ncentraciones crecientes de f actor V II m odificado. Concentraciones variables del factor VII modificado se preincuban con 10 nM de sTF y 10 nM Fde VIIa en tampon BSA (50 mM de Hepes, pH 7,4, 100 mM de NaCl, 5 mM de CaCl2 y 1 mg/ml de BSA) durante 60 min a temperatura ambiente antes de adicion de sustrato S2288 (1,2 mM, Chromogenix). El desarrollo de color se mide continuamente durante 30 min a 405 nm. Actividad amidolitica se presenta como mOD/min. Valores IC50 para inhibicion de actividad amidolitica de FVIIa/TF por el factor VII modificado puede calcularse.

Inhibicion de generacion de FXa (ensayo 5).

[0131] TF lipidado (10 pM), FVlla (100 pM) y factor VII modificado (0 -50 nM) en tampon BSA (ver ensayo 4) se incuban 60 min a temperatura ambiente antes de que FX (50 nM) se anada. La reaccion se detiene despues de otros 10 min por adicion de � volumen de tampon de parada (50 mM de Hepes, pH 7,4, 100 mM de NaCl, 20 mM de EDTA). La cantidad de FXa generada se determina por adicion de sustrato S2765 (0,6 mM, Chromogenix y medicion de absorbencia a 405 nm se puede calcular continuamente durante 10 min. Valores IC50 para inhibicion factor VII modificado de FVlla/lipidado TF-mediado activacion de FX.

Ensayo de coagulacion dependiente de TF (ensayo 6):

[0132] El ensayo se realiza en un aparato de investigacion de coagulacion ACL300 (ILS Laboratories). Diluciones de factor VII modificado en 50 mM de imidazol, pH 7,4, 100 mM de NaCl, 0,1 % de BSA se mezclan con 25 mM de CaCl2 en la proporcion de 2 a 5 y se anade a recipientes de muestras en el aparato de coagulacion. Tromboplastina de humano, rata, conejo, babuino, o cerdo diluida con el tampon de imidazol para dar tiempo de coagulacion de aproximadamente 30 seg en muestras sin factor VII modificado se coloca en deposito reactivo 2, y plasma de humano, rata, conejo, babuino, o cerdo, en el deposito reactivo 3. Durante el analisis 70 �l de la mezcla de factor VII modificado y CaCl2 se transfieren a 25 �l de reactivo de tromboplastina y se preincuban 900 seg antes de adicion de 60 �l de plasma y medicion del tiempo de coagulacion. El tiempo de coagulacion maxima se fija a 400 seg. Una dilucion de la tromboplastina se usa como curva estandar para tiempos de coagulacion de conversion en actividad TF en relacion al control sin FVII modificado anadido.

[0133] I nhibicion de s uperficie de F VIIa/celula T F ca talizo act ivacion de F X p or f actor V II m odificado ( ensayo 7):

5 monocapas de celulas expresando TF humano, por ejemplo, fibroblastos de pulmon humanos WI-38 (ATTC n� CCL-75), linea de celula de carcinoma de vejigahumana J82(ATTC n� HTB-1), linea de celula de queranocito humano CCD 1102KerTr (ATCC n� CRL-231 0), linea celular de glioblastoma humano U87, o linea celular de cancer de mama humano MDA-MB231, se emplean como fuente TF en FVIIa/TF catalizada activacion de FX. Monocapas de celula confluyentes en una placa de 24, 48, o 96 pocillos se lavan una vez en el tampon A (10 mM de Hepes, pH 7,45, 150 mM

10 de NaCl, 4 mM de KCI y 11 mM de glucosa) y una vez en el tampon B (tampon A complementado con 1 mg/ml de BSA y 5 mM de Ca2�). FVIIa (1 nM), FX (135 nM) y concentraciones variables de factor VII modificado en el tampon B se anaden simultaneamente a las celulas. Alternativamente las celulas se preincuban 15min con factor VII modificado antes de adicion de rFVIIa y FX. Formacion de FXa se permite durante 15 min a 37°C. 50-�l de partes alicuotas se quitan de cada pocillo yse anaden a 50 �l de tampon de parada (tampon A complementado con 10 mM de EDTA y 1

15 mg/ml de BSA). La cantidad de FXa generada se determina por transferencia de 50 �l de la mezcla anterior a una placa de microtitulacion de pocillo y por adicion de 25 �l deChromozym X(concentracion final 0,6 mM) a lospocillos. La absorbencia a 405 nm se mide co ntinuamente y los indices iniciales de desa rrollo de co lor se co nvierten a concentraciones de FXa usando una curva de estandar de FXa.

20 [0134] Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustracion, no a modo de limitacion.

Ejemplos

Ejemplo 1

[0135] Composiciones tipicas se muestran. La tabla 1 muestra la concentracion de sustancia activa y excipientes en el

25 evento donde l a co mposicion est a en f orma l iquida, es decir, co mposicion a ntes de l iofilizacion o en la s olucion reconstituida despues de liofilizacion. La tabla 2 muestra la concentracion de sustancia activa y excipientes en el evento donde la composicionesta en forma solida, es decir, en forma liofilizada. Composiciones 04y05 son composiciones comparativas.

30 Tabla 1. Composiciones, contenido de excipientes en la solucion

Funcion principal: Ingrediente activo: Excipientes: FFR-FVII o FRR-FVlla Contenido de composiciones mg/ml (mmol/l) 05 04 107 2 2 2

Modificador de tonicidad: Cloruro sodico 2,92 (50) 2,92 (50) 2,92 (50)

Modificador de tonicidad / estabilizador Agente de carga: Cloruro de calcio, 2H20 Glicil-glicina 1,4 (10) 1,32 (10) 1,47(10) 1,32 (10) 1,47(10) 1,32 (10)

Tensioactivo: T�een 0,1 0,1 0,1

Agente de carga/ Crioprotector / Lioprotector: Manitol 26,7 (147) 40 (220) 26,7 (147)

Agente de carga / Crioprotector/ Lioprotector: Sacarosa 13,3 (39) - 13,3 (39)

Antioxidante: Metionina - - 0,25

pH: 6 6 6

Tabla 2. Composiciones, contenido de excipientes en forma solida

Funcion: Ingredientes Contenido de composiciones (% p/p)

05: 04 107

Ingrediente activo: FFR-FVII o FRR-FVIIa 4,2 4,2 4,2

Modificador de tonicidad: Cloruro sodico 6,1 6,1 6,1

Modificador de tonicidad / estabilizador: Cloruro de calcio, 2H20 3,1 3,1 3,1

Agente de carga: Glicil-glicina 2,8 2,8 2,8

Tensioactivo: T�een 0,2 0,2 0,2

Agente de carga/ Crioprotector / Lioprotector: Manitol 55,8 83,7 55,8

Agente de carga/ Crioprotector / Lioprotector: Sacarosa 27,8 27,8

Antioxidante: Metionina 0,5

pH: 6 6 6

Ejemplo 2

[0136] Metodos analiticos usados en determinacion de parametros indicadores de estabilidad: 5

A. Determinacion de formas oxidadas por HPLC en fase inversa (RP-HPLC):

[0137] Columna de HPLC: 4,5x250 mm columna embalada con silice unido con butilo con un tamano de particula de 5�m y tamano de poro 300A. Temperatura de columna: 70°C. Eluyente A: agua 99,9% V/V y acido trifluoracetico 0.1 % 10 V/V. Eluyente B: acetonitrilo 80% V/V, acido trifluoracetico 0.09% V/V y agua 19.91 % V/V. La columna fue eluida con un gradiente lineal de X% B a (X�13) % B en 30 minutos. Velocidad de flujo: 1,0 ml/min. Deteccion: 214 nm.

[0138] Las formas oxidadas son sulfoxido de metionina de FFR-FVlla. Los dos derivados principales son Met(O)298-FFR- FVlla y Met(O)306-FFR-FVIIa.

15 [0139] El contenido de formas oxidadas se expresa como el porcentaje de la cantidad inicialdeFFR-FVIIa en la composicion que se recupera como formas oxidadas de FFR-FVIIa. La cantidad inicial de FFR-FVIIa se refiere a la cantidad de FFR-FVlla en la preparacion de la composicion antes de liofilizacion.

20 B. Determinacion de polimeros, oligomeros o dimeros de FFR-FVII por cromatografia de permeacion en gel de alto rendimiento (GP-HPLC).

[0140] GP-HPLC fue se realizo en una columna Waters Protein Pak 300 SW, 7.5x300 mm, usando 0,2 M de sulfato de amonio pH 7,0 como la fase movil. Velocidad de flujo: 0,5 ml/min y deteccion: 215 nm.

25 [0141] El contenido de agregados se expresa como el porcentaje de la cantidad inicial de FFR-FVlla en la composicion que se recupera como formas polimericas y dimericas deFFR-FVlla. La cantidad inicial de FFR-FVIIa se refiere a la cantidad de FFR-FVIIa en la preparacion de la composicion antes de liofilizacion.

30 Ejemplo 3

[0142] El contenido de formas dimericas, polimericas y oxidadas de FFR-VIIa despues de terminacion de liofilizacion se proporcionan para las composiciones del ejemplo 1. El contenido expresa la cantidad de factor VII modificado (aqui FFR-VIIa) que se recupera como formas de dimeros, polimeros u oxidadas.

35 Tabla 3. Contenido de dimeros, polimeros y formas oxidadas de FFR-VIIa

Parametros indicadores de estabilidad: Composiciones

05: 04 107

manitol-sacarosa 2:1: manitol-sacarosa 3:0 manitol-sacarosa 2:1 � metionina

Dimeros (% p/p) Polimeros (% p/p): 0,3 < 0,3 0,5 < 0,3 0,3 < 0,3

Formas oxidadas (% p/p): 2,1 2,2 1,9

< 0,3: el limite de cuantificacion es 0,3.

Ejemplo 4

40 [0143] El aumento en el contenido de dimeros, polimeros y formas oxidadas de FFR-VIIa durante almacenamiento a 5 °C durante 18 meses, 25 °C durante 6, 12, 18 y 32 meses o a 45 ° C durante 8 semanas se proporciona para las composiciones del ejemplo 1. El tiempo de almacenamiento se calcula del tiempo determinacion de liofilizacion. El aumento en el co ntenido e xpresa l a ca ntidad a dicional de F FR-VIIa q ue s e r ecupera co mo una f orma dimerica,

45 polimerica u oxidada sobre dicho almacenamiento en el que la composicion tipicamente comprende una cantidad inicial de productos de degradacion sobre finalizacion de la produccion de la composicion.

Tabla 4. Almacenamiento a 5 °C durante 18 meses

Parametros indicadores de estabilidad: Composiciones

05: 04 107

Dimeros: sin aumento sin aumento sin aumento

Polimeros: sin aumento sin aumento sin aumento

Formas oxidadas: sin aumento sin aumento sin aumento

Tabla 5. Almacenamiento a 25 °C durante 6 meses

Parametros indicadores de estabilidad: Composiciones

05: 04 107

Dimeros: sin aumento sin aumento sin aumento

Polimeros: sin aumento sin aumento sin aumento

Formas oxidadas: 0,5 0,7 sin aumento

Tabla 6. Almacenamiento a 25 °C durante 12 meses

Parametros indicadores de estabilidad: Composiciones

05: 04 107

Dimeros: manitol-sacarosa 2:1 sin aumento manitol-sacarosa 3:0 0,7 manitol-sacarosa 2:1 � metionina sin aumento

Polimeros: sin aumento sin aumento sin aumento

Formas oxidadas: 0,7 1,0 sin aumento

Tabla 7. Almacenamiento a 25 °C durante 18 meses

Parametros indicadores de estabilidad: Composiciones

05: 04 107

Dimeros: manitol-sacarosa 2:1 sin aumento manitol-sacarosa 3:0 sin aumento manitol-sacarosa 2:1 � metionina sin aumento

Polimeros: sin aumento sin aumento sin aumento

Formas oxidadas: 0,7 1,7 0,4

Tabla 8. Almacenamiento a 25 °C durante 32 meses

Parametros indicadores de estabilidad: Composiciones

05: 04 107

manitol-sacarosa 2:9: manitol-sacarosa 3:0 manitol-sacarosa 2:1 � metionina

Dimeros: sin aumento 0.6 sin aumento

Polimeros: sin aumento sin aumento sin aumento

Formas oxidadas: 2,0 6,1 0,9

Tabla 9. Almacenamiento a 45 °C durante 8 semanas

Parametros indicadores de estabilidad: Composiciones

05: 04 107

Dimeros: 0,4 0,9 sin aumento

Polimeros: sin aumento sin aumento sin aumento

Formas oxidadas: 0,8 0,9 sin aumento

Ejemplo 5

5 [0144] Estabilidad estructural del pastel liofilizado se muestra para varias composiciones, 1-6. El contenido de manitol y sacarosa se proporciona de cada composicion (tabla 10). Las composiciones comprenden o bien FFR-FVII o FRR-FVIIa en concentracion de 1 mg/ml y comprenden ademas otros excipientes en una cantidad de 5,7 mg/ml, incluyendo cloruro sodico, cloruro de calcio 2H2 0, glicil-glicina y t�een. La estabilidad estructural del pastel liofilizado se proporciona en la

10 tabla 11.

[0145] Composiciones 1 y 4 son composiciones comparativas

Tabla 10. Composiciones comprendiendo varias cantidades de manitol y sacarosa 15

Contenido de manitol / sacarosa:: Composiciones

1: 2 3 4 5 6

Manitol: mg/ml 25 16,7 8,3 40 26,8 13,2

% p/p: 79 53 26 86 57 28

mM: 137 92 46 220 147 72

Sacarosa: mg/ml - 8,3 16,7 - 13,2 26,8

% p/p: - 26 53 - 28 57

mM: - 24 49 - 39 78

Tabla 11. Estabilidad del pastel liofilizado segun la proporcion entre manitol y sacarosa

Composiciones

1: 2 3 4 5 6

Proporcion en peso de Man : Sac: 2:1 1:2 2:1 1:2

Proporcion en peso de Man : Sac: 4:1 9:10 4:1 9:10

Proporcion en peso de Man � Sac : FFR-FVlla: 25:1 25:1 25:1 40:1 40:1 40:1

Proporcion en peso de Man: FFR-FVlla: 25:1 17:1 8:1 40:1 27:1 13:1

Proporcion en peso de Sac : FFR-FVIIa: 8:1 17:1 13:1 27:1

Pastel liofilizado: OK OK C OK OK C

Solucion reconstituida: Sol. clara Sol. clara nd Sol. clara Sol. clara nd

C: pastel colapsado, Man: manitol, Sac: sacarosa, sol. clara.: solucion clara, nd: no determinado

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Composicion comprendiendo; i) factor VII modificado; ii) un agente adecuado para mantener el pH de dicha composicion en el intervalo de 4 a 7 cuando dicha composicion se disuelve en agua; iii) un alcohol de azucar, y donde el alcohol de azucar es manitol; iv) un sacarido, y donde el sacarido es sacarosa; v) un antioxidante, y donde el antioxidante se seleccionadel grupo consistente en acido ascorbico, cisteina, homocisteina, cistina, cistationina, metionina, glutation y peptidos con cualquier cisteina, homocisteina, cistina, cistationina, metionina y glutation; y vi) un contenido de humedad de como mucho 3%.
2.

Composicion segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el agente adecuado para mantener el pH de dicha composicion en el intervalode 4 a 7 es glicilglicina, luego estapresente en una cantidad decomo mucho7 mg/ml.
3.

Composicion segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el pH de dicha composicion esta en el intervalo de aproximadamente 5,5 a 7,0 cuando dicha composicion se disuelve en agua.
4.

Composicion segun cualquiera de l as reivindicaciones precedentes, donde dicho alcohol de azucar esta en una proporcion en peso en relacion a dicho sacarido que varia de aproximadamente 100:1 1 a 1:50, preferiblemente de aproximadamente 50:1 a 1:10, mas preferiblemente de aproximadamente 20: 1 a 1:5, incluso mas preferiblemente de aproximadamente 10:1 a 1:2, todavia mas preferiblemente de aproximadamente 4:1 a 1:2, como todavia mas preferiblemente de aproximadamente 3:1 a 1:1, de forma mas preferida de aproximadamente 3:1 a 3:2.
5.

Composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicho factor VII modificado esta en una proporcion en peso en relacion a la suma de dicho alcohol de azucar y dicho sacarido que varia de aproximadamente 1:200 a 1:5, preferiblemente de aproximadamente 1:100 a 1:8, mas preferiblemente de aproximadamente 1:75 a 1:10, incluso mas preferiblemente de aproximadamente 1:60 a 1:15, de forma mas preferida de aproximadamente 1:50 a 1:20.
6.

Composicion segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el alcohol de azucar esta en una cantidad que varia de aproximadamente 30% p/p a 95% p/p, preferiblemente de aproximadamente 35% p/p a 95% p/p, mas preferiblemente de aproximadamente 40% p/p a 90% p/p, de forma mas preferida de aproximadamente 45% p/p a 90% p/p.
7.

Composicion segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el sacarido esta en una cantidad que varia de aproximadamente 1% p/p a 45% p/p, preferiblemente de aproximadamente 5% p/p a 40% p/p, mas preferiblemente de aproximadamente 5% p/p a 35% p/p, de forma mas preferida de aproximadamente 10% p/p a 30% p/p.
8.

Composicion segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicho manitol esta en una proporcion en peso en relacion a dicha sacarosa que varia de aproximadamente 10:1 a 1:10, preferiblemente de aproximadamente

10:1 a 1:5, mas preferiblemente de aproximadamente 5:1 a 1:2, incluso mas preferiblemente de aproximadamente 5:1 a 1:1, de forma mas preferida de aproximadamente 4:1 a 5:4, como de aproximadamente 3:1 a 3:2.
9.

Composicion segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicho factor VII modificado esta en una proporcion en peso en relacion a la suma de dicho manitol y dicha sacarosa que varia de aproximadamente 1:100 a 1:5, preferiblemente de aproximadamente 1:75 a 1:10, mas preferiblemente de aproximadamente 1:60 a 1:15 de forma mas preferida de aproximadamente 1:50 a 1:20.
10.

Composicion segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, comprendiendo ademas un modificador de tonicidad.
11.

Composicion segun la reivindicacion 10, donde el modificador de tonicidad se selecciona del grupo consistente en acetato sodico, lactato sodico, cloruro sodico, cloruro de potasio y cloruro de calcio.
12.

Composicion segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, comprendiendo ademas un tensioactivo.
13.

Composicion segun la reivindicacion 12, donde el tensioactivo se selecciona del grupo consistente en polisorbatos, como polisorbato 20 u 80, polioxietilen alquil eteres o poloxameros, como poloxamero 188 o 407.
14.

Composicion segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el factor VII modificado se selecciona de la lista de: factor VII humano y bovino, donde el residuo del sitio activo Ser344 se modifica, se sustituye con Gly, Met, Thr, o mas preferiblemente, Ala; factor VII humano, donde el residuo Lys341 se sustituye; factor VII humano, donde el residuo Asp242 se sustituye; factor VII humano, donde el residuo His193 se sustituye; FVII-(K341A); FVII-(S344A); FVII- (D242A); FVII-(H193A); un polipeptido del factor VII modificado en el sitio activo por reaccion con un reactivo

seleccionado de la lista de: clorometilcetonas peptidicas o peptidil clorometanos; azapeptidos; agentes acilantes como varios derivados de guanidinobenzoato y3-alcoxi-4-cloroisocumarinas; sulfonil fluoruros como fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF); d iisopropilfluorofosfato (D FP); t osilpropilclorometil ce tona ( TPCK); tosilisilclorometil ce tona ( TLCK); nitrofenilsulfonatos; inhibidores de proteasa heterociclicos como isocumarinas y cumarinas.
15. Composicion segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el agente adecuado para mantener el pH en el intervalo de 4 a 7 se selecciona del grupo consistente en citrato, histidina, malato, fosfato, acido tartarico, acido succinico, MES, HEPES, imidazol, TRIS, lactato, glutamato y glicilglicina, con la condicion de que cuando dicho agente es glicilglicina, esta presente en una cantidad de como mucho 7 mg/ml.
16. Composicion segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicho contenido de humedad es como mucho 2% p/p, de forma mas preferida como mucho aproximadamente 1% p/p de humedad.
17. Composicion segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la composicion es un pastel liofilizado. 15
18. Uso de una composicion tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones precedentes para la preparacion de un medicamento.