ES2378157T3

ES2378157T3 - Promotores de arroz

Info

Publication number: ES2378157T3
Application number: ES07105544T
Authority: ES
Inventors: Yves Hatzfeld; Willem Broekaert
Original assignee: CropDesign NV
Current assignee: CropDesign NV
Priority date: 2003-02-04
Filing date: 2004-02-04
Publication date: 2012-04-09
Anticipated expiration: 2024-02-04
Also published as: ES2285423T3; US20130007914A1; ATE542911T1; CN1748032A; EP1801223A2; EP2180055B1; ES2375923T3; US7427676B2; CN104031918A; WO2004070039A2; US8847015B2; EP2172554A1; CN102586251B; EP1801223B1; DE602004006477D1; AU2004209624B2; WO2004070039A8; US8847016B2; ATE362541T1; CN1748032B

Abstract

Un promotor aislado capaz de dirigir y/o regular la expresión en tejido joven de una planta, que comprende: (a) un ácido nucleico aislado como se da en la SEQ ID NO: 5 o el complemento del mismo; o (b) un ácido nucleico aislado como se define en (a), que se interrumpe por una secuencia de intervención; o (c) un fragmento del ácido nucleico como se define en (a) o (b), cuyo fragmento es capaz de dirigir y/o regular la expresión específica del tejido joven o (d) un ácido nucleico aislado que tiene por lo menos 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de ADN como se da en la SEQ ID NO: 5.

Description

Promotores de Arroz

La presente invención se relaciona con el campo de la biología molecular de plantas, más particularmente con secuencias de ácido nucleico útiles para dirigir y/o regular la expresión de un ácido nucleico ligado en forma

5 operativa en plantas. Se describe el aislamiento de estas secuencias de ácido nucleico de arroz, así como también su uso en dirigir y/o regular la expresión de un ácido nucleico ligado en forma operativa. La presente invención por lo tanto se relaciona con promotores, promotores híbridos, construcciones genéticas, casetes de expresión, vectores de transformación, vectores de expresión, células anfitrionas y plantas transgénicas que comprenden los ácidos nucleicos aislados de acuerdo con la presente invención. La presente invención también se relaciona con métodos para dirigir y/o regular la expresión de un ácido nucleico y métodos para la producción de plantas transgénicas.

La expresión génica es dependiente del inicio de la transcripción, que está mediado a través del complejo de inicio de transcripción. La expresión génica también es dependiente de la regulación de la transcripción, que determina qué tan fuerte, cuándo o dónde se expresa un gen. Dicha regulación de la expresión génica se puede mediar a través de elementos de control transcripcionales, que se embeben de manera general en la zona de flanqueo 5’ de

15 la secuencia de ácido nucleico o la dirección 5’ del gen expresado. Esta región de ácido nucleico en la dirección 5’ se refiere frecuentemente a un "promotor" debido a que esto promueve la unión, formación y/o activación del complejo de inicio de transcripción y por lo tanto es capaz de dirigir y/o regular la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la dirección 3’.

La ingeniería genética de las plantas con la ayuda de obtener un fenotipo de planta útil, frecuentemente involucra la expresión génica heteróloga, que está mediada de manera general por un promotor capaz de dirigir y/o regular la expresión de un ácido nucleico heterólogo ligado en forma operativa. El fenotipo de la planta anfitriona solo depende de la contribución del ácido nucleico heterólogo, pero también en la contribución del patrón de expresión específico del promotor seleccionado que determina cómo, donde y cuando se expresa el ácido nucleico heterólogo. De acuerdo con lo anterior, la elección del promotor con un patrón de expresión adecuado es de importancia crucial

25 para obtener el fenotipo adecuado. Una persona experta en la técnica necesitará tener diferentes promotores disponibles, para determinar el promotor óptimo para un ácido nucleico particular. Para muchas plantas anfitrionas diferentes, esta disponibilidad se limita y por lo tanto existe una necesidad continúa para proporcionar nuevos promotores con diversos perfiles de expresión. Los ácidos nucleicos cuando se presentan en la SEQ ID NO 5 se aíslan de Oryza sativa y se ha encontrado que son capaces de dirigir y regular la expresión de un ácido nucleico ligado en forma operativa; también se ha caracterizado su patrón de expresión. Por lo tanto la presente invención ofrece una colección de los ácidos nucleicos aislados hasta ahora desconocidos, cuyos ácidos nucleicos aislados son útiles como promotores.

De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona un promotor aislado capaz de dirigir y/o regular la expresión en tejido joven de una planta, que comprende:

35 (a) un ácido nucleico aislado como se da en la SEQ ID NO 5 o el complemento de la SEQ ID NO 5; o

(b): un ácido nucleico aislado como se define en (a), que se interrumpe por una secuencia de intervención; o

(c): un fragmento del ácido nucleico como se define en (a) o (b), cuyo fragmento es capaz de dirigir y/o regular la expresión específica del tejido joven o

(d): un ácido nucleico aislado que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de ADN como se da en la SEQ ID NO 5.

El término "aislado" como se utiliza aquí significa que se retira de su fuente original. Preferiblemente, el promotor "aislado" está libre de secuencias (tales como secuencias que codifican la proteína u otras secuencias en el extremo 3’) que flanquea en forma natural el promotor en el ADN genómico del organismo del que se deriva el promotor. Adicionalmente preferiblemente, el promotor “aislado” también está libre de las secuencias que flanquean en forma

45 natural en el extremo 5’. Adicionalmente preferiblemente, el promotor “aislado” puede comprender menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1.5 kb, 1.2 kb, 1 kb, 0.8 kb, 0.5 kb o 0.1 kb de las secuencias de nucleótido que ocurren en forma natural con el promotor en ADN genómico del organismo del que se deriva el promotor.

La presente invención no está limitada al ácido nucleico como se presenta por la SEQ ID NO 5. Una persona experta en la técnica reconocerá que pueden ocurrir variantes o fragmentos de un ácido nucleico, mientras se mantiene la misma funcionalidad. Estas variantes o fragmentos se pueden hacer por el hombre (por ejemplo mediante ingeniería genética) o puede aún ocurrir en la naturaleza. Por lo tanto la presente invención se extiende a ácidos nucleicos variantes y fragmentos de la SEQ ID NO 5, cuyas variantes o fragmentos son útiles en los métodos de la presente invención. Tales variantes y fragmentos incluyen:

(a): un ácido nucleico aislado como se da en la SEQ ID NO 5 o el complemento de la SEQ ID NO 5; o

(c): un fragmento de los ácidos nucleicos como se define en (a) o (b), cuyo fragmento es capaz de dirigir y/o regular la expresión específica del tejido joven, o

(d): un ácido nucleico aislado que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de ADN como se da en una cualquiera de la SEQ ID NO 5.

Las variantes adecuadas de la SEQ ID NO 5 abarcan homólogos que tiene un orden aumentado de preferencia por lo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con uno cualquiera de los ácidos nucleicos como se representa en la SEQ ID NO 5.

El porcentaje de identidad se puede calcular utilizando un programa de alineación. Preferiblemente se puede utilizar un programa de alineación global en forma de par, que implementa el algoritmo de Needleman-Wunsch (J. Mol. Biol.

48: 443-453, 1970). Este algoritmo maximiza el número de coincidencias y minimiza el número de espacios. Tales programas son por ejemplo GAP, Needle (paquete EMBOSS), stretcher (paquete EMBOSS) o Align X (Vector NTI suite 5.5) y pueden utilizar los parámetros estándar (por ejemplo penalidad de abertura de espacio 15 y penalidad de extensión de espacio 6.66). Alternativamente, se puede utilizar un programa de alineación local que implementa el algoritmo de Smith-Waterman (Advances in Applied Mathematics 2, 482-489 (1981)). Tales programas son por ejemplo Water (paquete EMBOSS) o matcher (paquete EMBOSS). "Identidad de secuencia" como se utiliza aquí se calcula preferiblemente sobre la longitud completa de los promotores como se representa por la SEQ ID NO 5. La longitud de este promotor se presenta en la Tabla 2.

La búsqueda e identificación de ácidos nucleicos homólogos, estaría dentro del ámbito de una persona experta en la técnica. Tales métodos, involucran la detección de las bases de datos de secuencia con las secuencias proporcionadas por la presente invención, por ejemplo de la SEQ ID NO 5, preferiblemente en una forma legible por computador. Las bases de datos de secuencia útiles, incluyen pero no se limitan a Genbank (hftp://www.ncbi.nim.nih.gov/web/Genbank), la Base de datos de ácido Nucleico European Molecular Biology Laboratory (EMBL) (http:/w.ebi.ac.uk/ebi-docs/embl-db.html) o versiones de las mismas, o la base de datos MIPS (http://mips. gsf.de/). Se conocen bien en la técnica diferentes algoritmos de búsqueda y software para la alineación y comparación de las secuencias. Tal software incluye, por ejemplo GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA. Preferiblemente se utiliza el software BLAST, que calcula el porcentaje de identidad de secuencia y realiza un análisis estadístico de la similitud entre las secuencias. Los programas adecuados denominados como programas BLAST tienen 5 diferentes implementaciones: tres designadas para la consulta de secuencia de nucleótido (BLASTN, BLASTX, y TBLASTX) y dos designadas para la consulta de secuencia de proteína (BLASTP y TBLASTN) (Coulson, Trends in Biotechnology: 76-80, 1994; Birren et al., GenomeAnalysis, 1: 543, 1997). El software para realizar análisis BLAST está públicamente disponible a través del Centro Nacional para la Información Biotecnológica.

Las secuencias del genoma de Arabidopsis thaliana y el genoma de Oryza sativa ahora están disponibles en las bases de datos públicas tales como Genbank. Otros genomas se secuencian actualmente. Por lo tanto, se espera que como más secuencias de los genomas de otras plantas llegan a estar disponibles, pueden ser identificables promotores homólogos mediante alineación de secuencia con SEQ ID NO 5. La persona experta será fácilmente capaz de encontrar promotores homólogos de otras especies de planta, por ejemplo de otras plantas de cultivo, tales como maíz. Los promotores homólogos de otras plantas de cultivo son especialmente útiles para practicar los métodos de la presente invención en plantas de cultivo.

Un ejemplo de los homólogos que tienen por lo menos 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO 5 son variantes alélicas de SEQ ID NO 5. Las variantes alélicas son variantes del mismo gen que ocurre en dos individuos diferentes de la misma especie y usualmente variantes alélicas que difieren mediante cambios ligeros de secuencia.Las variantes alélicas pueden abarcar Polimorfismos de Nucleótido Único (SNP) así como también Polimorfismos de Inserción/Eliminación Pequeños (INDEL). El tamaño de los INDEL es usualmente menos de 100 bp. Los SNP e INDEL forman el conjunto más grande de variantes de secuencia en cepas polimórficas que ocurren en forma natural de la mayor parte de organismos.

Los homólogos adecuados para uso en los métodos de acuerdo con la invención se pueden aislar fácilmente de su organismo fuente por medio de la técnica de PCR o hibridación. Su capacidad de dirigir y/o regular la expresión se puede determinar fácilmente, por ejemplo, mediante los siguientes métodos descritos en la sección de Ejemplos al sustituir simplemente la secuencia utilizada en el Ejemplo actual con el homólogo.

Otra variante de la SEQ ID NO 5 abarcada por la presente invención son los ácidos nucleicos que corresponden a la SEQ ID NO 5 o variantes de los mismos como se describió aquí anteriormente, que se interrumpen por una secuencia de intervención. Por ejemplo, la SEQ ID NO 5 se puede interrumpir por una secuencia de intervención. Con "secuencias de intervención" significa cualquier ácido nucleico o nucleótido, que interrumpen otra secuencia. Ejemplos de las secuencias de intervención comprenden intrones, etiquetas de ácido nucleico, T-ADN y secuencias de ácidos nucleicos movilizables tales como transposones o ácido nucleicos que se pueden movilizar mediante recombinación. Ejemplos de transposones particulares comprenden Ac A (activador), Ds (Disociación), Spm (supresor-Mutador) o En. La introducción de los intrones en los promotores ahora se aplica ampliamente. Los métodos de acuerdo con la presente invención también se pueden practicar utilizando una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO 5 proporcionada con un intrón. En el caso de que la secuencia de intervención sea un intrón, pueden surgir variantes de corte y empalme alternativa de los ácido nucleicos de acuerdo con la invención. El término "variante de corte y empalme alternativa" como se utiliza aquí abarca variantes de una secuencia de ácido en la que intervienen intrones se han cortado, reemplazado o agregado. Tales variantes de corte y empalme se pueden encontrar en la naturaleza o se pueden hacer por el hombre. Los métodos para elaborar tales promotores con un intrón o para hacer las variantes de corte y empalme correspondientes son bien conocidos en la técnica.

Las variantes interrumpidas por una secuencia de intervención, adecuadas para uso en los métodos de acuerdo con la invención se pueden determinar fácilmente por ejemplo mediante los siguientes métodos descritos en la sección de Ejemplos al sustituir simplemente la secuencia utilizada en el Ejemplo actual con la variante.

Los ácidos nucleicos variantes como se describió aquí anteriormente se pueden encontrar en la naturaleza (por ejemplo variantes alélicas o variantes de corte y empalme). Adicionalmente y/o alternativamente, las variantes de la SEQ ID NO 5 como se describió aquí anteriormente se pueden hacer por el hombre por medio de técnicas bien conocidas en el arte que implican por ejemplo mutación, sustitución, inserción, eliminaciones o derivación. La presente invención también abarca tales variantes, así como también su uso en los métodos de la presente invención.

Una "variante de mutación" de un ácido nucleico se puede hacer fácilmente utilizando técnicas de manipulación de ADN recombinante o síntesis de nucleótido. Ejemplos de tales técnicas incluyen mutagenia dirigida a sitio por medio de mutagenia M13, mutagenia T7-Gen in vitro (USB, Cleveland, OH), mutagenia Dirigida a Sitio QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), mutagenia dirigida a sitio mediada por PCR u otros protocolos de mutagenia dirigida a sitio. Alternativamente, el ácido nucleico de la presente invención se puede mutar aleatoriamente.

Una "variante de sustitución" se refiere a aquellas variantes en las que por lo menos un residuo en la secuencia de ácido nucleico se ha retirado y un residuo diferente insertado en su lugar. Las sustituciones de ácido nucleico son típicamente de residuos únicos, pero se pueden agrupar dependiendo de las restricciones funcionales puestas en la secuencia de ácido nucleico; las inserciones usualmente son del orden de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 residuos de ácido nucleico, y las eliminaciones pueden variar de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 residuos.

Una "variante de inserción" de un ácido nucleico es una variante en la que uno o más residuos de ácido nucleico se introducen en un sitio predeterminado en este ácido nucleico. Las inserciones pueden comprender fusiones de terminal 5’ y/o de terminal 3’ así como también inserciones de intra-secuencia de múltiples nucleótidos o un único nucleótido. De manera general, las inserciones dentro de la secuencia de ácido nucleico serán más péquelas que las fusiones de terminal 5’-o 3’, del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos. Ejemplos de las fusiones de terminal 5’-o 3’ incluyen las secuencias codificantes de los dominios de unión o los dominios de activación de un activador transcripcional como se utiliza en el sistema de dos híbridos de levadura o un sistema de un híbrido de levadura, o de proteínas cubiertas con fago, etiqueta (histidina)6, etiqueta glutationa S-transferasa, proteína A, proteína de unión a maltosa, dihidrofolato reductasa, epítopo Tag•100, epítopo c-myc, epítopo FLAG®, lacZ, CMP (péptido de unión calmodulina), epítopo HA, epítopo de la proteína C y epítopo VSV.

El término "derivado" de un ácido nucleico puede comprender sustituciones, y/o eliminaciones y/o adiciones de residuos de ácido nucleico que ocurren en forma natural o no natural comparado con el ácido nucleico natural. Los derivados, por ejemplo, pueden comprender nucleótidos metilados, o nucleótidos artificiales.

También se abarcan con la presente invención promotores, que comprende un fragmento de la SEQ ID NO 5 o variantes del mismo como se describió aquí anteriormente. Un "fragmento" como se utiliza aquí significa una porción de una secuencia de ácido nucleico. Los fragmentos adecuados útiles en los métodos de la presente invención son fragmentos funcionales, que retienen por lo menos una de las partes funcionales del promotor y por lo tanto son aún capaces de dirigir y/o regular la expresión específica del tejido joven. Ejemplos de fragmentos funcionales de un promotor incluyen el promotor mínimo, los elementos reguladores en la dirección 5’, o cualquier combinación de los mismos.

Los fragmentos adecuados pueden variar de por lo menos aproximadamente 20 pares base o aproximadamente 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 o 1000 pares base, hasta aproximadamente la secuencia de longitud completa de la invención. Estos pares base están típicamente inmediatamente en la dirección 5’ del inicio de la transcripción, pero alternativamente puede estar en cualquier parte en la secuencia promotora.

Los fragmentos adecuados útiles en los métodos de la presente invención se pueden probar por su capacidad de controlar y/o regular la expresión específica del tejido joven mediante técnicas estándar bien conocidas por la persona experta, o mediante el siguiente método descrito en la sección de Ejemplos.

El promotor como se describe en la SEQ ID NO 5 se aísla como ácido nucleico de aproximadamente 1.2kb de la región en la dirección 5’ de las secuencias codificantes de arroz particular (CDS). Este ácido nucleico puede incluir elementos típicos de un promotor, que se presentan en la Figura 1. De manera general, un promotor puede comprender de la secuencia codificante hasta la dirección 5’: (i) un 5’UTR del ARN pre-mensajero, (ii) un promotor mínimo que comprende el elemento de inicio de transcripción (INR) y más en la dirección 5’ una caja TATA, y (iii) puede contener elementos reguladores que determinan el patrón de expresión específico del promotor.

El término "promotor" como se utiliza aquí se toma en un amplio contexto y se refiere a las secuencias de ácido nucleico reguladoras capaces de efectuar (controlar y/o regular) la expresión de las secuencias a las que se ligan en forma operativa. Un "promotor" abarca secuencias reguladoras transcripcionales derivadas de un gen genómico clásico. Usualmente un promotor comprende una caja TATA, que es capaz de dirigir el complejo de inicio de transcripción al sitio de inicio de transcripción apropiado. Sin embargo, algunos promotores no tienen una caja TATA (menos promotores TATA), pero aún son completamente funcionales para dirigir y/o regular la expresión. Un promotor puede comprender adicionalmente una secuencia de caja CCAAT y elementos reguladores adicionales (es decir secuencias de activación en la dirección 5’ o elementos cis tales como promotores e inhibidores). Un "promotor" también puede incluir las secuencias reguladoras transcripcionales de un gen procariótico clásico, en cuyo caso este puede incluir una secuencia de caja -35 y/o las secuencias reguladoras transcripcionales de caja -10.

"Conducir la expresión" como se utiliza aquí significa promover la transcripción de un ácido nucleico.

"Regular la expresión" como se utiliza aquí significa influenciar el nivel, tiempo o lugar de transcripción de un ácido nucleico. Los promotores de la presente invención así se pueden utilizar para aumentar, reducir o cambiar en tiempo y/o sitio de transcripción de un ácido nucleico. Por ejemplo, estos se pueden utilizar para limitar la transcripción a ciertos tipos celulares, tejidos u órganos, o durante un cierto periodo, o en respuesta a ciertas condiciones ambientales.

El promotor es preferiblemente un promotor que puede expresar la planta. El término "que puede expresar la planta" significa que es capaz de regular la expresión en una planta, célula de planta, tejido de planta y/o órgano de planta. De acuerdo con lo anterior, la invención abarca un ácido nucleico aislado como se mencionó anteriormente, capaz de regular la transcripción de un ácido nucleico ligado en forma operativa en una planta o en una o más células particulares, tejidos u órganos de una planta.

Se estudian en detalle el patrón de expresión de los promotores de acuerdo con la presente invención y se encuentra que muchos de estos son específicos de tejido. De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona promotores "específicos de tejido". El término "específico de tejido" se toma para indicar que la expresión está predominantemente en un tejido particular, tipo de tejido, órgano o cualquier otra parte del organismo, aunque no necesariamente exclusivo en dicho tejido, tipo de tejido, órgano u otra parte. De acuerdo con lo anterior, la invención abarca un ácido nucleico aislado como se mencionó anteriormente, capaz de dirigir y/o regular la expresión (de un ácido nucleico ligado en forma operativa) en una forma específica de tejido. La expresión se puede dirigir y/o regular en la semilla, embrión, escutelo, aleurona, endospermo, hojas, flores, callos, meristema, meristema de brote, centro discriminatorio, brote, meristema de brote y raíz. En pastos el meristema de brote se ubica en la así llamada zona de discriminación de donde se originan el brote y las hojas.

Un promotor específico de tejido es un ejemplo de un así llamado "promotor regulado". Estos promotores se regulan por señales endógenas tales como la presencia de ciertos factores de transcripción, metabolitos, hormonas de planta, o señales exógenas, tales como envejecimiento, estrés o estado nutricional. Estas regulaciones pueden tener efecto en uno o más niveles diferentes como especificidad espacial o especificidad temporal. Se abarca dentro de la presente invención un ácido nucleico como se describió aquí anteriormente, que es un "promotor regulado". Ejemplos de promotores regulados son promotores específicos de célula, promotores específicos de tejido, promotores específicos de órgano, promotores específicos del ciclo celular, promotores inducibles o promotores específicos de tejido joven.

Alternativamente y/o adicionalmente, algunos promotores de la presente solicitud exhibe un patrón de expresión constitutivo. De acuerdo con lo anterior, la presente solicitud proporciona un promotor como se describió aquí anteriormente, que es un promotor constitutivo. El término "constitutivo" significa que no tiene o tiene muy pocas regulaciones temporales o espaciales. El término "expresión constitutiva" como se utiliza aquí se refiere a una expresión sustancialmente continúa en sustancialmente todos los tejidos del organismo. El experto entenderá que un "promotor constitutivo" es un promotor que es activo durante la mayoría, pero no necesariamente todas, las fases de crecimiento y el desarrollo del organismo y a través de la mayoría, pero no necesariamente todas, las partes de un organismo.

El "patrón de expresión" de un promotor no solo está influenciado por los aspecto espaciales y temporales, sino también por el nivel de expresión. El nivel de expresión se determina por la así llamada "resistencia" de un promotor. Dependiendo del nivel de expresión resultante, se hace aquí una distinción entre promotores "débiles" o "fuertes". De manera general "promotor débil" significa un promotor que dirige la expresión de un ácido nucleico ligado en forma operativa a los niveles de aproximadamente 1/10000 transcriptos a aproximadamente 1/100000 transcriptos a aproximadamente 1/500000 transcriptos. De manera general, "promotor fuerte" significa un promotor que dirige la expresión en niveles de aproximadamente 1/10 transcriptos, a aproximadamente 1/100 o a aproximadamente 1/1000 transcriptos.

De acuerdo con una realización particular, la invención proporciona un promotor aislado como se mencionó aquí anteriormente, que es un promotor híbrido. El término "promotor híbrido" como se utiliza aquí se refiere a un promotor quimérico hecho, por ejemplo, sintéticamente, por ejemplo mediante ingeniería genética. Los promotores híbridos preferidos de acuerdo con la presente invención comprenden una parte, preferiblemente una parte funcional, de uno de los promotores de acuerdo con la presente invención y por lo menos otra parte, preferiblemente una parte funcional de un promotor. La última parte, puede ser una parte de cualquier promotor, que incluye uno cualquiera de los promotores de acuerdo con la presente invención y otros promotores. Un ejemplo de un promotor híbrido comprende los elementos reguladores de un promotor de acuerdo con la presente invención combinados con el promotor mínimo de otro promotor. Otro ejemplo de un promotor híbrido es un promotor que comprende elementos reguladores adicionales para mejorar adicionalmente su actividad y/o para alterar su patrón de expresión espacial y/o temporal.

La presente invención también proporciona uso de un fragmento funcional de la SEQ ID NO 5 o variante del mismo para cambiar el patrón de expresión de un promotor. En tales métodos, por lo menos parte de cualquiera de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención se combina con por lo menos un fragmento de otro promotor.

Adicionalmente, la invención proporciona una construcción genética que comprende:

(a): Un promotor aislado como se definió aquí anteriormente

(b): Una secuencia de ácido nucleico heteróloga ligada en forma operativa al promotor aislado de (a), y opcionalmente

(c): Un terminador de transcripción 3’

El término "construcción genética" como se utiliza aquí significa un ácido nucleico hecho mediante ingeniería genética.

El término "ligado en forma operativa" a un promotor como se utiliza aquí significa que la transcripción se dirige y/o regula por este promotor. Una persona experta en la técnica entenderá que se liga en forma operativa a un promotor preferiblemente significa que el promotor se posiciona en la dirección 5’ (es decir al extremo 5’) del ácido nucleico ligado en forma operativa. La distancia en el ácido nucleico ligado en forma operativa puede ser variable, mientras que el promotor de la presente invención es capaz de dirigir y/o regular la transcripción del ácido nucleico ligado en forma operativa. Por ejemplo, entre el promotor y el ácido nucleico ligado en forma operativa, puede ser un sitio de clonación, un adaptador, un mejorador de transcripción o traducción.

El ácido nucleico ligado en forma operativa puede ser cualquier ácido nucleico codificante o no codificante. El ácido nucleico ligado en forma operativa puede estar en la dirección codificante o anticodificante. Típicamente en el caso de ingeniería genética de células anfitrionas, el ácido nucleico ligado en forma operativa se introduce dentro de la célula anfitriona y se pretende que cambie el fenotipo de la célula anfitriona. Alternativamente, el ácido nucleico ligado en forma operativa es un ácido nucleico endógeno de la célula anfitriona.

El término "heterólogo" como se utiliza aquí se pretende que sea "heterólogo al promotor de la presente invención". Un ácido nucleico que es heterólogo al promotor de la presente invención no ocurre en la naturaleza en las secuencias de ácido nucleico que flanquean el promotor de la presente invención cuando está en su ambiente genómico biológico. Aunque el ácido nucleico puede ser heterólogo al promotor de la presente invención, este puede ser homólogo o natural o heterólogo o externo a la célula anfitriona de planta. El ácido nucleico ligado en forma operativa heterólogo puede ser cualquier ácido nucleico (por ejemplo que codifica cualquier proteína), dado que comprende o se flanquea mediante por lo menos un nucleótido que normalmente no flanquea el promotor de la presente invención.

El término "terminador de transcripción" como se utiliza en (c) se refiere a una secuencia de ADN al extremo de una unidad transcripcional que señala la terminación de la transcripción. Los terminadores son secuencias de ADN no traducidas 3’ que contienen usualmente una señal de poliadenilación, facilita la adición de las secuencias poliadeniladas en el extremo 3’ de un transcripto primerio. Los terminadores activos en y/o aislados de los virus, levaduras, mohos, bacterias, insectos, aves, mamíferos y plantas se conocen y se han descrito en la literatura. Ejemplos de terminadores adecuados para uso en las construcciones genéticas de la presente invención incluyen el terminador de gen de sintasa nopalina Agrobacterium tumefaciens (NOS), la secuencia terminadora de gen sintasa octapina Agrobacterium tumefaciens (OCS), la secuencia terminadora del gen 35S del virus mosaico de Coliflor (CaMV), la secuencia terminadora pirofosforilasa de ADP-glucosa Oryza sativa (t3’Bt2), la secuencia terminadora del gen zeína Zea mays, el terminador de gen rbcs-1A, y las secuencias terminadoras de gen rbcs-3A, entre otras.

La presente invención también proporciona un casete de expresión, un vector de transformación o un vector de expresión de planta que comprende una construcción genética como se describió anteriormente.

Un "casete de expresión" como significa aquí se refiere a una construcción genética mínima necesaria para la expresión de un ácido nucleico. Un casete de expresión típico comprende una combinación de promotor-genterminador. Un casete de expresión puede comprender adicionalmente sitios de clonación, por ejemplo sitios de recombinación GatewayTM o sitios de reconocimiento de enzima de restricción, para permitir la clonación fácil del ácido nucleico ligado en forma operativa o para permitir la transferencia fácil del casete de expresión dentro de un vector. Un casete de expresión puede comprender adicionalmente regiones no traducidas 5’, regiones no traducidas 3’, un marcador seleccionable, promotores de transcripción o promotores de traducción.

Con "vector de transformación" significa una construcción genética, que se puede introducir en un organismo mediante transformación y se puede mantener establemente en dicho organismo. Algunos vectores se pueden mantener en por ejemplo Escherichia coli, A. tumefaciens, Saccharomyces cerevisiae o Schizosaccharomyces pombe, mientras que otros tales como fagémidos y vectores cósmidos, se pueden mantener en bacterias y/o virus. Los vectores de transformación se pueden multiplicar en su célula anfitriona y se pueden aislar de nuevo de ellos para que se van a transformar en otra célula anfitriona. Las secuencias de vector de manera general comprenden un conjunto de sitios únicos reconocidos por las enzimas de restricción, los múltiples sitios de clonación (MCS), en donde se pueden insertar una o más secuencias sin vector. Las secuencias de vector pueden comprender adicionalmente un origen de replicación que se requiere para mantenimiento y/o replicación en una célula anfitriona específica. Ejemplos de orígenes de replicación incluyen, pero no se limitan a, f1-ori y coIE1.

"Vectores de expresión" forman un subconjunto de vectores de transformación, que, por virtud de comprender las secuencias reguladoras apropiadas, permiten la expresión de las secuencias insertadas sin vector. Se han descrito vectores de expresión que son adecuados para la expresión en bacterias (por ejemplo E. coli), hongos (por ejemplo

S. cerevisiae, S. pombe, Pichia pastoris), células de insecto (por ejemplo vectores de expresión baculovíricos), células de animal (por ejemplo células COS o CHO) y célula de plantas. Un vector de expresión adecuado de acuerdo con la presente invención es un vector de expresión de planta, útil para la transformación de células de planta, la integración estable en el genoma de la planta, el mantenimiento en célula de planta y la expresión de las secuencias sin vector en la célula de planta.

Típicamente, un vector de expresión de planta de acuerdo con la presente invención comprende un ácido nucleico de la SEQ ID NO 5 o una variante del mismo como se describió aquí anteriormente, opcionalmente ligada en forma operativa a un segundo ácido nucleico. Típicamente, un vector que puede expresar la planta de acuerdo con la presente invención, comprende adicionalmente regiones de T-ADN para integración estable dentro del genoma de la planta (por ejemplo las regiones de límite izquierdo y límite derecho del plásmido Ti).

Las construcciones genéticas de la invención pueden comprender adicionalmente un "marcador seleccionable". Como se utiliza aquí, el término "marcador seleccionable" incluye cualquier gen, que confiere un fenotipo a una célula en la que se expresa, para facilitar la identificación y/o selección de células que se transfectan o se transforman. Los marcadores adecuados se pueden seleccionar de marcadores que confieren resistencia antibiótica o herbicida. Las células que contienen la construcción genética así sobrevivirán a concentraciones antibióticas o herbicidas que matarán las células no transformadas. Ejemplos de genes marcadores seleccionables incluyen genes que confieren resistencia a los antibióticos (tales como fosfotransferasa de neomicina que codifica nptll capaz de fosforilar la neomicina y la canamicina, o fosfotransferasa de higromicina que codifica hpt capaz de fosforilar la higromicina), a los herbicidas (por ejemplo bar que proporciona resistencia a Basta; aroA o gox que proporciona resistencia contra el glifosato), o genes que proporcionan un rasgo metabólico (tal como manA que permite que las plantas utilice mannosa como fuente única de carbono). Los genes marcadores visuales resultan en la formación de color (por ejemplo beta-glucuronidasa, GUS), luminiscencia (tal como luciferasa) o fluorescencia (Proteína Fluorescente Verde, GFP, y derivados de los mismos). Ejemplos adicionales de genes marcadores seleccionables adecuados incluyen el gen de resistencia a ampicilina (Ampr), gen de resistencia a tetraciclina (Tcr), gen de resistencia a la canamicina bacteriana (Kanr), gen de resistencia a fosfinotricina, y el gen acetiltransferasa cloramfenicol (CAT), entre otros.

Adicionalmente, la presente invención abarca una célula anfitriona que comprende un promotor aislado, o una construcción genética, o un casete de expresión, o un vector de transformación o un vector de expresión de acuerdo con la invención como se describió aquí anteriormente. En realizaciones particulares de la invención, la célula anfitriona se selecciona de bacterias, algas, hongos, levaduras, plantas, células anfitrionas de insecto o animal.

En una realización particular, la invención proporciona una célula de planta transgénica que comprende un promotor aislado de acuerdo con la invención, o un ácido nucleico aislado, o una construcción genética, o un casete de expresión, o un vector de transformación o un vector de expresión de acuerdo con la invención como se describió aquí anteriormente. Preferiblemente dicha célula de planta es una célula de planta dicotiledónea o una célula de planta monocotiledónea, más preferiblemente una célula de cualquiera de las plantas mencionadas aquí. Preferiblemente, en la célula de planta transgénica de acuerdo con la invención, el promotor o la construcción genética de la invención se integra establemente dentro del genoma de la célula de planta.

La invención también proporciona un método para la producción de una planta transgénica, que comprende:

(a): Introducir dentro de una célula de planta un promotor aislado, por ejemplo la SEQ ID NO 5, o una variante o fragmento de la misma como se describió anteriormente, o una construcción genética, o un casete de expresión, o un vector de transformación o un vector de expresión de acuerdo con la presente invención y como se describió aquí anteriormente, y

(b): Cultivar dicha célula de planta bajo condiciones que promueven el crecimiento de la planta.

"Introducir" el promotor aislado mencionado anteriormente, o construcción genética, o casete de expresión, o vector de transformación o vector de expresión, en una célula anfitriona (por ejemplo célula de planta) se logra preferiblemente mediante transformación. El término "transformación" como se utiliza aquí abarca la transferencia de un polinucleótido exógeno en una célula anfitriona, independiente del método utilizado para transferencia. En particular para plantas, tejidos capaces de propagación clínica, mediante organogenia o embriogenia, son adecuados para ser transformados con una construcción genética de la presente invención y se puede regenerar una planta completa. El tejido particular variará dependiendo de sistemas de propagación clónicos disponibles para, y mejor adecuados para, las especies de planta particulares que se van a transformar. Los objetivos de tejido de ejemplo incluyen discos de hoja, polen, embriones, cotiledóneas, hipocotiledóneas, megagametofitos, tejido de callo, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristema apical, brotes axilares, y meristemas de raíz), y tejido de meristema inducido (por ejemplo, meristema cotiledóeno y meristema hipocotiledóneo). El polinucleótido se puede introducir transitoriamente o establemente dentro de una célula de planta y se puede mantener no integrado, por ejemplo, como un plásmido. Alternativamente, este se puede integrar dentro del genoma de la planta.

Las especies de transformación de una planta es ahora una técnica de rutina fácil. Ventajosamente, se pueden utilizar cualquiera de varios métodos transformación para introducir los ácidos nucleicos de la invención en una célula ancestral adecuada. Los métodos de transformación incluyen el uso de liposomas, electroporación, químicos que aumentan la retoma de ADN libre, inyección del ADN directamente dentro de la planta, bombardeo de pistola de partículas, transformación utilizando virus o polen y microproyección. Se pueden seleccionar métodos a partir del método de calcio/polietilenglicol para protoplastos (Krens, F.A. et al., 1882, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373); electroporación de protoplastos (Shillito R.D. et al., 1985 Bio/ Technol 3, 10991102); microinyección en el material de planta (Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen Genet 202, 179-185); bombardeo de partícula cubierto con ARN o ADN (Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70) virus de infección con (no integrativo) y similares. Un método de transformación preferido para la producción de células de planta transgénicas de acuerdo con la presente invención, es un método de transformación mediado por Agrobacterium.

Las plantas de arroz transgénicas que comprenden uno cualquiera de los promotores de la presente solicitud se producen preferiblemente por medio de la transformación mediada por Agrobacterium utilizando cualquiera de los métodos bien conocidos para la transformación de arroz, tal como aquellos descritos en cualquiera de los siguientes: solicitud de patente Europea publicada A1, Aldemita and Hodges (Plant, 199, 612-617, 1996); Chan et al. (Plant Mol. Biol. 22 (3) 491-506, 1993); Hiei et al. (Plant J. 6 (2) 271-282, 1994); cuyas descripciones se incorporan aquí como referencia cuando se establece completamente. En el caso de la transformación de maíz, el método preferido es como se describe en Ishida et al. (Nat. Biotechnol. 1996 Jun; 14(6): 745-50) o Frame et al. (Plant Physiol. 2002 May; 129(1): 13-22), cuyas descripciones se incorporan aquí como referencia cuando se establecen completamente.

De manera general después de transformación, se seleccionan células de planta o grupos de células para la presencia de uno o más marcadores que se codifican por genes que pueden expresar la planta cotransferidos con el gen de interés (que puede estar bajo el control de cualquiera de los promotores de la presente invención), luego de lo cual se puede cultivar el material transformado bajo condiciones que promueven el crecimiento de la planta.

La célula de planta transformada resultante luego se puede utilizar para regenerar una planta transformada en una forma conocida por las personas expertas en la técnica. De acuerdo con lo anterior, el método para la producción de una planta transgénica como se describió aquí anteriormente, puede comprender adicionalmente regenerar una planta de dicha célula de planta de (a).

La presente invención proporciona adicionalmente una planta que comprende una célula de planta como se describió aquí anteriormente. Las plantas también pueden ser capaces de crecer, o aún alcanzan madurez que incluye por ejemplo producción de frutos, formación de semillas, maduración de semillas y endirecimiento de semillas.

Adicionalmente, se puede producir progenie de estas semillas, la cual progenie puede ser fértil. Alternativamente o adicionalmente, las plantas transformadas y regeneradas también pueden producir progenie mediante propagación no sexual tal como clonación, injerto. Las plantas transformadas generadas se pueden propagar mediante una variedad de medios, tales como mediante técnicas de propagación clónica o siembra clásica. Por ejemplo, una planta transformada de primera generación (o T1) se puede autofecundar para dar transformantes de segunda generación homocigotas (o T2), y las plantas T2 se propagan adicionalmente a través de técnicas de siembra clásicas.

Los organismos transformados generados pueden tomar una variedad de formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras de células transformadas y células no transformadas; transformantes clónicos (por ejemplo, todas las células transformadas por contener el casete de expresión); injertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, en plantas, un injerto de rizoma de vástago no transformado).

Siguiendo la transferencia de ADN y el crecimiento de las células transformadas, las células de planta transformadas putativamente o plantas se pueden evaluar, por ejemplo utilizando análisis Southern, para la presencia del gen de interés, el número de copia y/u organización genómica. Alternativamente o adicionalmente, los niveles de expresión

o los patrones de expresión del nuevo ADN introducido se pueden abordar utilizando análisis northern y/o Western, ambas técnicas son bien conocidas por las personas que son medianamente versadas en la técnica.

La presente invención se extiende claramente a plantas que se pueden obtener mediante cualquiera de los métodos de acuerdo con la presente invención, cuyas plantas comprenden cualquiera de los promotores aislados o las construcciones de la presente invención. La presente invención se extiende claramente a cualquier parte de la planta y propágulos de tal planta. La presente invención se extiende adicionalmente para abarcar la progenie de una célula transformada primaria, tejido, órgano o planta completa que se ha producido por cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, el único requerimiento es que la progenie exhibe las mismas características genotípicas y/o genotípicas como aquellas producidas en el progenitor mediante los métodos de acuerdo con la invención. La invención también se extiende a partes cosechables de una planta, tal como pero no limitado a semillas, hojas, frutos, flores, cultivos de tallo, tallo, rizomas, raíces, tubérculos, bulbos y fibras de algodón.

El término "planta" o "plantas" como se utiliza aquí abarca plantas completas, ancestros y progenie de plantas y partes de planta, que incluye semillas, brotes, tallos, raíces (que incluyen tubérculos), y células de planta, tejidos y órganos. El término "planto" por lo tanto también abarca cultivos de suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callo, gametofitos, esporofitos, polen, y microesporas. Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas que incluyen una legumbre de forraje o pienso, planta ornamental, cultivo de alimento, árbol, o arbusto seleccionado de la lista que comprende Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp.,Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chaenomeles spp.,Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Diheteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Doycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehrartia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalyptus spp., Euclea schimperi, Eulalia villosa, Fagopyrum spp., Feijoa sellowiana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksii, Geranium thunbergii, Ginkgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemarthia altissima, Heteropogon contortus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hyperthelia dissoluta, Indigo incarnata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesii, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago sativa, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Omithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativum, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonarthria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp.,

Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys verticillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorgo bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp. Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica,

5 Zea mays, amaranto, alcachofa, espárragos, brócoli, col de bruselas, repollo, canola, zanahoria, coliflor, apio, col rizada, lino, col rizada, lenteja, aceite de semilla de colza, okra, cebolla, papa, arroz, soja, paja, remolacha, caña de azúcar, girasol, tomate, calabaza, y te, árboles y algas entre otras. De acuerdo con una característica preferida de la presente invención, la planta es una planta de cultivo tal como soja, girasol, canola, alfalfa, colza, algodón, tomate, papa, tabaco, calabaza, papaya, álamo, leguminosa, lino, lupino o sorgo. De acuerdo con otra realización preferida de la presente invención la planta es una planta monocotiledónea, tal como caña de azúcar, adicionalmente se prefiere un cereal tal como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno o avena.

La invención proporciona adicionalmente un método para dirigir y/o regular la expresión de un ácido nucleico en una planta o célula de planta, que comprende:

a) Ligar en forma operativa un ácido nucleico a un ácido nucleico aislado de acuerdo con la invención como se

15 describió aquí anteriormente, tal SEQ ID NO 5 o una variante o fragmento de la misma como se describió anteriormente, y

b) Introducir la construcción genética resultante dentro de una planta o célula de planta.

Preferiblemente el ácido nucleico ligado en forma operativa de (a) es heterolólogo a los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención.

Este método puede comprender adicionalmente cultivar la planta transformada o célula de planta bajo condiciones que promueven el crecimiento, que promueven la regeneración y/o que promueven la maduración.

Adicionalmente, la expresión del ácido nucleico ligado en forma operativa puede dirigir y/o regular en células particulares, tejidos u órganos de una planta. De acuerdo con lo anterior, la invención proporciona un método como se describió anteriormente, en donde la expresión es específica de la expresión de tejido. Para estas realizaciones,

25 se hace referencia a la sección de ejemplos en donde los patrones de expresión específicos de los promotores de acuerdo con la invención se describen y en donde se detallan diferentes tipos de expresión específica de tejido.

La presente invención abarca adicionalmente el uso de un ácido nucleico aislado como se definió aquí anteriormente para dirigir y/o regular la expresión de un ácido nucleico ligado en forma operativa.

La persona experta en la técnica reconocerá que la provisión de la secuencia SEQ ID NO 5, fácilmente hace disponible las herramientas para aislar los promotores relacionados, que pueden tener identidad de secuencia sustancial a la SEQ ID ID NO 5. Adicionalmente, la provisión de la secuencia SEQ ID NO 27 (CDS que corresponde al promotor de la presente invención, ver Tabla 1), hace fácilmente que las herramientas aíslen los promotores relacionados, de los que los CDS relacionados pueden tener identidad de secuencia sustancial a la SEQ ID NO 27. Por lo tanto la presente solicitud también abarca un método para aislar los ácidos nucleicos, capaz de dirigir y/o

35 regular la expresión de un ácido nucleico ligado en forma operativa, que comprende detectar una base de datos de la secuencia de ácido nucleico para encontrar homólogos de cualquiera de las secuencias representadas por la SEQ ID NO 5 o SEQ ID NO 27. Posteriormente se utilizan estos homólogos para detectar una colección con ADN genómico, cuya colección se prepara por ejemplo del organismo de origen del homólogo mencionado anteriormente. El procedimiento de detección por ejemplo puede involucrar hibridación. Posteriormente, el ADN genómico que coincide con el homólogo, se analiza para identificar el sitio de inicio de transcripción y el sitio de inicio de traducción del gen que corresponde al homólogo. Finalmente, los cebadores específicos se diseñan para amplificación de un ácido nucleico ubicado en la región en el extremo 5’ (en el extremo 5’) de dicho sitio de inicio de traducción.

La presente solicitud se extiende a la identificación de las proteínas reguladoras que están implicadas en la regulación de la actividad de los promotores de acuerdo con la presente invención. Tal identificación se puede lograr

45 utilizando un sistema de un híbrido de levadura. En tal sistema de un híbrido de levadura las secuencias de acuerdo con una cualquiera de la SEQ ID NO 5 se ligan en forma operativa al activador de transcripción GAL y se transforma a un cultivo celular de levadura. Este cultivo de célula de levadura de nuevo se transforma con una colección de construcciones que codifican los factores reguladores candidatos.

La presente invención ahora se describirá con referencia a las siguientes figuras en las que:

La figura 1 muestra una representación esquemática general de un promotor. Los elementos reguladores son secuencias que por ejemplo pueden ser responsables para la regulación especial y/o temporal de la actividad del promotor. El promotor mínimo es la secuencia mínima necesaria y suficiente para dirigir la expresión. Esto incluye una caja TATA, que es necesario para dirigir correctamente la polimerasa II de ADN al sitio de inicio de transcripción.

El elemento de inicio de transcripción (INR) incluye el sitio de inicio de transcripción. La región no traducida 5’ (5’UTR) es la región que se transcribe en el ARN pre-mensajero y eventualmente en el mARN, pero que no se traduce en la proteína. El codón de inicio de traducción está representado por el codón de inicio ATG.

La figura 2 es un mapa del vector p4581 útil para la expresión en plantas de un gen �-glucuronidasa (GUS) bajo el

5 control de uno cualquiera de los promotores de acuerdo con la invención. Este vector binario comprende un casete de recombinación Gateway, adecuado para la clonación de recombinación de uno cualquiera de los promotores de la presente invención en la parte frontal del gen �-glucuronidasa Escherichia coli (GUS). Este casete contiene un gen de resistencia a cloramfenicol (CamR) y el gen suicida ccdB para la selección de los plásmidos no recombinados, Este casete de expresión GUS comprende adicionalmente la secuencia terminadora doble T-zeína y T-rbcS-deltaGA. Este casete de expresión se ubica dentro del límite izquierdo (repetición LB, LB Ti C58) y el límite derecho (repetición RB, RB Ti C58) del plásmido nopalina Ti. También están clonados dentro de estos límites el marcador seleccionable y los genes de marcador detectables cada uno bajo el control de un promotor constitutivo y una secuencia terminadora. Este vector también contiene un origen de replicación (pBR322) para replicación bacteriana y un marcador seleccionable bacteriano (Spe/SmeR) para selección bacteriana. Las siguientes figuras

15 muestran los resultados de la tinción GUS de plantas o partes de plantas transformadas con el vector reportero p4581 que lleva un promotor de acuerdo con la presente invención ligado en forma operativa al gen reportero GUS. Las plantas denominadas "plantas C" son plantas transgénicas que crecen a aproximadamente 5 cm; las plantas denominadas "plantas B" se cultivan a aproximadamente 10 cm; y las plantas denominadas "plantas A" se cultivan hasta madures. Estas plantas A se utilizan para recolectar diferentes muestras de tejido de hojas maduras, hojas jóvenes y semillas.

La figura 3 muestra el patrón de expresión de PRO0061 (beta expansina EXPB9, SEQ ID NO 5). La tinción GUS es visible en flores jóvenes de una planta (A) y en otros tejidos de expansión jóvenes de plantas B (B) y plantas C (C).

Ejemplos

El promotor de acuerdo con la presente invención se aísla como regiones de ADN que abarca aproximadamente 1.2

25 kb de la secuencia en la dirección 5’ del codón de inicio de traducción (es decir el primer ATG, cuyo codón se excluye) de un gen de arroz. Para la determinación de su secuencia de ácido nucleico y su patrón de expresión, se sigue el siguiente procedimiento: Primero se realizan estudios de sílice en secuencias de arroz genómico. Sin embargo, los procedimientos con base en los programas de predicción automáticos para ubicar la secuencia de ácido nucleico similar al promotor son altamente propensos a error, aún para la localización de los elementos de control de promotor mejor caracterizados tales como una caja TATA y el elemento de inicio de transcripción (INR). También, en la determinación del sílice del patrón de expresión es extremadamente especulativa. Por lo tanto, para obtener datos no ambiguos data aproximadamente la secuencia de ácido nucleico y el patrón de expresión de los promotores, se realizan estudios in vivo que abarcan (i) aislamiento del promotor de la secuencia de ácido nucleico;

(ii) ligar en forma operativa un gen reportero al promotor e introducir la construcción genética resultante en los

35 organismos anfitriones; (iii) cultivar la célula anfitriona transformada bajo condiciones que permiten la expresión del gen reportero, y (iv) determinación de la actividad del gen reportero en los diferentes tejidos del organismo anfitrión. Estos métodos ahora se describen en más detalle.

Ejemplo 1. Identificación y aislamiento de los promotores

Identificación de EST de arroz, los genes correspondientes y su ubicación en el genoma del arroz

Las bases de datos de secuencia, que comprenden las secuencias de arroz, se buscan para etiquetas de secuencia expresadas de arroz (EST). Posteriormente se realiza Northern blot "en sílice" para permitir la identificación de las familias EST que se expresan fuertemente o que son específicas para un órgano particular. Este análisis incluye la normalización de los números de los EST aislados de diferentes órganos de planta. Las familias EST con una distribución interesante entre las colecciones de cADN fuente se seleccionan para análisis adicional y búsquedas de 45 homología de secuencia. Después de las búsquedas de homología de secuencia en combinación con datos científicos de exploración, los genes que corresponden a aquellas familias de EST se identifican de las bases de datos de secuencia y una función (putativa) y se da el nombre del gen correspondiente (ver Tabla 1). Posteriormente, la región promotora correspondiente se aísla mediante el siguiente procedimiento. En una primera etapa se busca en la base de datos TIGR para encontrar una tentativa contig que corresponde a una familia EST. La homología de secuencia se encuentra utilizando programas de ordenador estándar, tal como Blast N utilizando parámetros estándar (típicamente Coste G para abrir un espacio = 5, Coste E para extender un espacio = 2, Penalidad q para un emparejamiento incorrecto en la porción blast de la serie = -3, r Recompensa por coincidencia en la porción blast de la serie = 1, valor de expectativa e = 10.0, W Tamaño de palabra = 11, Número v de descripciones de una línea = 100, Número b de alineaciones para mostrar = 100, Matriz = BLOSUM62). La base de 55 datos TIGR (The Institute for Genomic Research), proporciona Contigs Tentativos (TC) que son predicciones de secuencia con base en la construcción contig de todos los EST conocidos, de todos los cADN conocidos y del mARN reconstruido. Los TC utilizados para la identificación de los promotores de la presente invención se representan en la Tabla 1. En una segunda etapa se utilizan estos TC para ubicar el gen correspondiente en una

secuencia genómica, cuyo gen comprende la región codificante así como también la región promotora. De manera general, estas secuencias genómicas son clones BAC, que se representan aquí por su número de acceso Genbank (ver Tabla 1). A partir de estos clones BAC se puede determinar la identidad de secuencia de la región promotora.

Tabla 1: lista de promotores de arroz de la presente invención. Las secuencias promotoras se representan aquí por su SEQ ID NO y número promotor (PRO). Las secuencias codificantes (CDS) que se dirigen en forma natural mediante un promotor de la presente invención se representan por su nombre, por la SEQ ID NO y por el número de acceso contig Tentativo (TC) de la base de datos TIGR. Las secuencias Genómicas (clones o genes BAC) que comprenden una región promotora de la presente invención se representan por su número de acceso Genbank.

Prom SEQ ID NO: Número Prom Nombre CDS CDS de la SEQ ID No. CDS TC Clon BACgen) (*o

5: PRO0061 Expansina beta EXPB9 27 TC89913 AC020666

Identificación y aislamiento de las regiones promotoras de los genes de arroz

Partiendo de la información de la secuencia de los genes y su ubicación en el genoma de arroz, las regiones promotoras de estos genes se aíslan como la región de ADN que abarca aproximadamente 1.2 kb en la dirección 5’ del codón de inicio de traducción (es decir el primer ATG), cuyo codón se excluye. Cuando está presente una 5 secuencia de intervención tal como un intrón, en la región no traducida 5’ del gen, se toma la región de ADN aislada como la región que abarca aproximadamente 1.2 kb más la longitud de la secuencia de intervención. Las regiones promotoras se aíslan del ADN genómico de Oryza sativa Japonica o excepcionalmente de Oryza sativa Indica por medio PCR utilizando cebadores específicos. Estos cebadores específicos comprenden los sitios de recombinación AttB, adecuados para la clonación de recombinación de la región promotora aislada. Estos cebadores específicos

10 aquí se representan como la SEQ ID NO 45 a 88 y se enumeran en la Tabla 2. Las condiciones para PCR son como sigue: 1 ciclo de 2 min a 94° C, 35 ciclos de 1 min a 94° C, 1 min a 58° C y 2 min a 68° C, y 1 ciclo de 5 min a 68° C. La longitud del fragmento PCR esperado también se indica en la Tabla 2. El fragmento PCR correspondiente se purifica de la mezcla de reacción PCR por medio de electroforesis de gel y purificación posterior utilizando el Equipo de Recuperación de ADN de Gel Zymoclean (Zymo Research, Orange, California).

15 Tabla 2: Resumen de los cebadores utilizados para aislar los promotores de arroz de la presente invención y la longitud de las regiones promotoras de arroz.

Prom SEQ ID NO: Número Prom Longitud prom Cebador delantero ID No. SEQ Cebador delantero Cebador inverso SEQ ID No. Cebador inverso

5: PRO0061 1243 49 prm2426 71 prm2427

Ejemplo 2. Clonación de los vectores reporteros de promotor-GUS para transformación de planta

Los fragmentos purificados PCR del Ejemplo 1, que corresponden a las regiones promotoras de la presente invención, se clonan en el plásmido de entrada pDONR201 del sistema GatewayTM (Life Technologies) utilizando la "reacción de recombinación BP". La identidad y composición de par base del inserto clonado se confirma mediante secuenciamiento y adicionalmente, el plásmido resultante se prueba por medio de las digestiones de restricción.

Con el fin de clonar cada uno de los promotores de la presente invención en la parte frontal de un gen reportero, cada clon de entrada del Ejemplo 1 se utiliza posteriormente en una "reacción de recombinación LR" (Gateway TM) con el vector de destinación p4581. Este vector de destinación se designa para ligar en forma operativa cada promotor de la presente invención al gen beta-glucuronidasa Escherichia coli (GUS) por medio de la sustitución del casete de recombinación Gateway en la parte frontal del gen GUS. Adicionalmente este vector de destinación es adecuado para la transformación de plantas y comprende dentro de los límites derecho e izquierdo del T-ADN y el casete promotor-GUS y el marcador seleccionable y los casetes marcadores detectables (ver figura 2). Los vectores reporteros resultantes, que comprenden un promotor de la presente invención ligada en forma operativa a GUS, se transforman posteriormente en la cepa Agrobacterium LBA4044 y posteriormente en plantas de arroz utilizando técnicas de transformación estándar.

Ejemplo 3. Patrones de expresión del casete reportero de promotor-GUS en el Crecimiento de plantas y la cosecha de plantas transgénicas o partes de plantas en diversas etapas (plantas C, plantas B y plantas A)

Para cada construcción reportera del promotor-GUS, se generan 3 plantas de arroz transgénicas T0 de células transformadas. El crecimiento de la planta se desarrolla bajo condiciones normales. La primera planta transgénica se sacrifica para tinción GUS cuando alcanza un tamaño de aproximadamente 5 cm, cuya planta se denomina aquí "planta C". La segunda planta transgénica se sacrifica para tinción GUS cuando esta ha alcanzado un tamaño de aproximadamente 10 cm, cuya planta se denomina aquí "planta B". La tercera planta transgénica se mantiene para producción de semilla y se denomina aquí "planta A". Se realiza tinción GUS en las plantas completas C y B. En las plantas A, se realiza tinción GUS en piezas de hojas, flores y la sección de las semillas en diversas etapas de desarrollo. A las plantas se les permite que produzcan semillas, dichas semillas se utilizan después de cosecha para confirmación del patrón de expresión en las plantas T1.

Tinción GUS

Las plantas sacrificadas o las partes de la planta se cubren con 90 % de acetona enfriada con hielo y se incuban durante 30 min a 4 °C. Después de 3 lavados de 5 min con regulador Tris [15,76 g de Trizma HCl (Sigma T3253) + 2,922 g de NaCl en 1 I bidi, ajustado a pH 7,0 con NaOH], el material se cubre por una solución de Tris/ferricianato/X-Gluc [9,8 ml de regulador Tris + 0,2 ml de solución madre ferricianato (0,33 g de ferricianato de potasio (Sigma P3667) en 10 ml de regulador Tris)+ 0,2 ml de solución madre X-Gluc (26,1 mg de X-Gluc (Europa Bioproducts ML 113A) en 500 µl de DMSO)]. Se aplica filtración por vacío durante 15 a 30 minutos. Las plantas o las partes de la planta se incuban durante hasta 16 horas a 37 °C hasta es visible el desarrollo del color azul. Las muestras se lavan 3 veces durante 5 minutos con regulador Tris. Se extrae clorofila en series de etanol de 50 %, 70 % y 90 % (cada uno durante 30 minutos).

Patrones de expresión de los promotores de la presente invención

Los patrones de expresión de los promotores de arroz de la presente invención se resumen en la Tabla 3.

Tabla 3: Patrones de expresión de los promotores de arroz de la presente invención

PRO SEQ ID NO: Número del promotor Nombre del promotor Patrón de expresión

(continuación)

5: PRO0061 Expansina beta EXPB9 Debilidad en tejidos jóvenes

Los siguientes párrafos describen los patrones de expresión observados de los promotores de la presente invención en más detalle. Las observaciones se basan en la inspección visual de los tejidos teñidos GUS como se describió 5 anteriormente. Se entiende que para algunos promotores de expresión puede ser débil y que la expresión en ciertos tejidos solo puede ser visible con métodos de detección muy sensibles.

PRO0061 -SEQ ID NO 5-expansina beta EXPB9

Se investigan 2 construcciones (OS1441 y OS1460. Se analizan 20 callos, 32 C, 32 plantas B y 32 plantas A. Se observa expresión débil en las hojas de las plantas C y B. En una planta se observa la expresión en las flores (44

10 %), más particularmente en lema de espículas jóvenes. Esto concluye que el promotor PRO0061 es adecuado para la expresión en tejido joven, más preferiblemente en tejido de expansión, de desarrollo o joven, más preferiblemente en tejido verde.

Ejemplo 4. Estabilidad de los patrones de expresión de los promotores de la presente invención en generaciones adicionales

Se realizan los análisis mencionados anteriormente en plantas T0 que se originan de los tejidos transformados. La estabilidad de la actividad del promotor en las siguientes generaciones o plantas progenie de la planta original T0, las así llamadas plantas T1 y T2, se evalúa como sigue. La planta T0 transformada con las construcciones indicadoras como se mencionó en los párrafos anteriores del Ejemplo 2, se cultivan hasta madurez (plantas A), de las que se cosechan las semillas (semillas T1) y se siembran para generar las plantas de progenie T1. Estas plantas se analizan como se describió anteriormente en el Ejemplo 3 y las plantas A T1 se dejan alcanzar la madurez y establecer las semillas T2.

El patrón de expresión de los promotores de la presente invención se estudia en plantas T0, semillas T1, plantas T1 y semillas T2 y en todos los tejidos (que incluyen semillas y tejidos de semilla) como se describe en el Ejemplo 3. Los patrones de expresión específicos como se reporta de las semillas T0 y T1 y se describen en el Ejemplo 3 se confirman en las siguientes semillas generación T1 y T2. Se concluye que el patrón de expresión de los promotores presentes se heredan en forma estable en plantas de generaciones posteriores.

Ejemplo 5. Estabilidad de los patrones de expresión de los promotores de la presente invención en otras plantas

Se realizan los análisis de planta mencionados anteriormente en plantas de arroz. Esta elección se basa en la consideración práctica que la ingeniería genética de la planta es más rentable para plantas de cultivo. También en otras plantas de cultivo, tales como por ejemplo Zea Mays, las construcciones indicadoras que comprenden los promotores de acuerdo con la presente invención que se introducen y transforman la planta se evalúan como se describió aquí anteriormente. Los patrones de expresión de los promotores de acuerdo con la presente invención se conservan entre las plantas. Por lo tanto, los promotores de acuerdo con la presente invención también son adecuados para dirigir y/o regular la expresión de un ácido nucleico ligado en forma operativa en monocotiledóneas, tales como maíz.

Para muchos otros propósitos tales como investigación y horticultura, las hierbas (pequeñas) se modifican genéticamente, lo que implica el uso de promotores. Por lo tanto las construcciones indicadoras que comprendenlos promotores de acuerdo con la presente invención se introducen dentro de otras especies de plantas tales como por ejemplo Arabidopsis thaliana y las plantas transformadas se evalúan como se describió aquí anteriormente. Los patrones de expresión de los promotores de acuerdo con la presente invención se conservan entre las plantas. Por lo tanto, los promotores de acuerdo con la presente invención también son adecuados para dirigir y/o regular la expresión de un ácido nucleico ligado en forma operativa en otras especies de planta tales como por ejemplo dicotiledóneas, tales como Arabidopsis.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> CropDesign N.V.

<120> Promotores de arroz 5 <130> PF58322

<150> EP 03075331.3

<151> 2003-02-04

<160> 88

<170> PatentIn version 3.1 10 <210> 1

<211> 1264

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220> 15 <221> misc_feature

<223> PR00110 -RCc3

<400> 1

<210> 2 20 <211> 1215

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> misc_feature

<223> PR00005 -beta-amilasa putativa

<400> 2

<210> 3

<211> 1038

<212> ADN 10 <213> Oryza sativa

<220>

<221> misc_feature

<223> PR00009 – sintasa celulosa putativa

<400> 3

<210> 4

<211> 1301

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> misc_feature

<223> PR00058 -inhibidor proteinasa Rgpi9

<400> 4

<210> 5

<211> 1243

<212> ADN

<213> Oryza sativa 15 <220>

<221> misc_feature

<223> PR00061 -beta-expansina EXPB9

<400> 5

5 <210> 6

<211> 1019

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220> 10 <221> misc_feature

<223> PR00063 – proteína estructural

<400> 6

<210> 7 15 <211> 1212

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> misc_feature

<223> PR00081 -cafeoil-CoA 3-O-metiltransferasa putativa

<400> 7

<210> 8

<211> 1052 10 <212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> misc_feature

<223> PR00091 -prolamina RP5 15 <400> 8

<210> 9

<211> 1216

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> misc_feature

<223> PR00095 -metionina aminopeptidasa putativa

<400> 9

<210> 10

<211> 1237

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> misc_feature

<223> PRO0111 – proteína similar a uclacianina 3

<400> 10

<210> 11

<211> 1100

<212> ADN

<213> Oryza sativa 10 <220>

<221> misc_feature

<223> PRO0116 – subunidad 11 no-ATPasa de partícula reguladora de proteasoma 26S

<400> 11

<210> 12

<211> 1216

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> misc_feature

<223> PR00117 – proteína ribosómica 40S putativa

<400> 12

<210> 13

<211> 1210

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> misc_feature

<223> PR00122 – precursor de la proteína de unión a/b de clorofila (Cab27)

<400> 13

<210> 14

<211> 1179 10 <212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> misc_feature

<223> PR00123 -reductasa de protoclorofiluro putativa 15 <400> 14

<210> 15

<211> 1808

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> misc_feature

<223> PR00133 -chitinasa Cht-3

<400> 15

<210> 16

<211> 1828

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> misc_feature

<223> PRO0151 WSI18

<400> 16

<210> 17

<211> 1267

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> misc_feature

<223> PR00169 -acuaporina

<400> 17

<210> 18

<211> 1130

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> misc_feature

<223> PR00170 – proteína del grupo de movilidad alta

<400> 18

<210> 19

<211> 1230

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> misc_feature

<223> PR00171 -proteína RGP1 reversiblemente glucosilada

<400> 19

<210> 20

<211> 1234

<212> ADN 10 <213> Oryza sativa

<220>

<221> misc_feature

<223> PR00173 – MDH citosólico

<400> 20

<210> 21

<211> 1553

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> misc_feature

<223> PRO0175 RAB21

<400> 21

<210> 22

<211> 1087

<212> ADN

<213> Oryza sativa 15 <220>

<221> misc_feature

<223> PRO0177 -Cdc2-1

<400> 22

5 <210> 23

<211> 1272

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220> 10 <221> misc_feature

<223> TC89946 (PRO0110)

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(17) 15 <223> n = cualquier nucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (50)..(50)

<223> n = cualquier nucleótido 20 <400> 23

<210> 24

<211> 2425

<212> ADN 5 <213> Oryza sativa

<220>

<221> misc_feature

<223> TC90358 (PRO0005)

<220> 10 <221> misc_feature

<222> (1558)..(1558)

<223> n = cualquier nucleótido

<400> 24

<210> 25

<211> 3410

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> misc_feature

<223> TC83635 (PRO0009)

<400> 25

<210> 26

<211> 602

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> misc_feature

<223> TC83117 (PRO0058)

<400> 26

<210> 27

<211> 1170

<212> ADN 5 <213> Oryza sativa

<220>

<221> misc_feature

<223> TC89913 (PRO0061)

<220> 10 <221> misc_feature

<222> (15)..(16)

<223> n = cualquier nucleótido

<220>

<221> misc_feature 15 <222> (1162)..(1162)

<223> n = cualquier nucleótido

<400> 27

<210> 28

<211> 861

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> misc_feature

<223> TC89985

<400> 28

<210> 29

<211> 1252

<212> ADN

<213>: Oryza sativa 15 <220>

<221> misc_feature

<223> TC89891 (PRO0081)

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> n = cualquier nucleótido

<400> 29

<210> 30

<211> 671

<212> ADN

<213>: Oryza sativa 10 <220>

<221> misc_feature

<223> TC89670 (PRO0091)

<220>

<221> misc_feature 15 <222> (3)..(3)

<223> n = cualquier nucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(14) 20 <223> n = cualquier nucleótido

<400> 30

<210> 31

<211> 436

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> misc_feature

<223> TC89883 (PRO0095)

<400> 31

<210> 32

<211> 860

<212> ADN

<213> Oryza sativa 15 <220>

<221> misc_feature

<223> TC90434 (PRO0111)

<220>

<221> misc_feature 20 <222> (1)..(1)

<223> n = cualquier nucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> n = cualquier nucleótido

<400> 32

5 <210> 33

<211> 1167

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220> 10 <221> misc_feature

<223> TC83072 (PRO0116)

<400> 33

<210> 34 15 <211> 871

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> misc_feature

<223> TC90038 (PRO0117)

<400> 34

<210> 35

<211> 1245

<212> ADN

<213> Oryza sativa 10 <220>

<221> misc_feature

<223> TC82936 (PRO0122)

<400> 35

15 <210> 36

<211> 1416

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> misc_feature

<223> TC89839 (PRO0123)

<400> 36

<210> 37

<211> 1149 10 <212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> misc_feature

<223> TC85888 (PRO0133) 15 <400> 37

<210> 38

<211> 981

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> misc_feature

<223> TC84300 (PRO0151)

<400> 38

<210> 39

<211> 1203

<212> ADN

<213> Oryza sativa 15 <220>

<221> misc_feature

<223> TC89687 (PRO0169)

<400> 39

<210> 40 5 <211> 964

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> misc_feature 10 <223> TC89846 (PRO0170)

<400> 40

<210> 41

<211> 1542 15 <212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> misc_feature

<223> TC82935 (PRO0171)

<400> 41

<210> 42

<211> 1432

<212> ADN

<213> Oryza sativa 10 <220>

<221> misc_feature

<223> TC82977 (PRO0173)

<220>

<221> misc_feature 15 <222> (1429)..(1429)

<223> n = cualquier nucleótido

<400> 42

<210> 43

<211> 659

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> misc_feature

<223> TC83646 (PRO0175

<400> 43

<210> 44

<211> 1310

<212> ADN

<213> Oryza sativa 15 <220>

<221> misc_feature

<223> TC90619 (PRO0177)

<400> 44 <212> ADN <211> 53 <210> 55

<210> 45

5: <211> 55

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm 3780

10: <400> 45

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cgacgctact caagtggtgg gaggc: 55

<210> 46

<211> 55

<212> ADN

15: <213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm2768

<400> 46

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc ccgatttagt agaccacatt ttggc: 55

20: <210> 47

<211> 54

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm2420

<400> 47

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta tgccatcgag tggtgtgccg atac: 54

<210> 48

<211> 54

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm2853

<400> 48

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt ctcttctgaa gctgaagccc tgcg: 54

<210> 49

<211> 53

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm2426

<400> 49

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta aaaccaccga gggacctgat ctg: 53

<210> 50

<211> 55

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm2855

<400> 50

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc ctagctatat gcagaggttg acagg: 55

<210> 51

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3025

<400> 51

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta tggtgccatg tcaataagac atc: 53

<210> 52

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3029

<400> 52

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctg tttttctatg aaccggtcat taaacc: 56

<210> 53

<211> 55

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3061

<400> 53

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc ctgatggatg atgaatcact gatcg: 55

<210> 54

<211> 57

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3031

<400> 54

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cgttaagttt gatgatttct gatgacc: 57

<211> 53

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3051

<400> 55

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtg ccgccgctcg ctcgcttcgt tcg: 53

<210> 56

<211> 58

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3592

<400> 56

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc gtgttcatgt tcgcatttag gattggac: 58

<210> 57

<211> 55

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm5131

<400> 57

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc agatgccaca gtatggtgta ccacc: 55

<210> 58

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3782

<400> 58

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt tgcagttgtg accaagtaag ctgagc: 56

<210> 59

<211> 54

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm2844

<400> 59

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt ttggcgcggg gcagaagagt ggac: 54

<210> 60

<211> 57

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm2973

<400> 60

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctg cttgagtcat agggagaaaa caaatcg: 57

<210> 61

<211> 53

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3770

<400> 61

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc gtcctccttt tgtaacggct cgc: 53

<210> 62

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3772

<400> 62 <223> prm5135 <220> <213> Secuencia artificial

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc atgcggctaa tgtagatgct cactgc: 56

<210> 63

<211> 53

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3774

<400> 63

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt agtaccattc ttccctcgtg agc: 53

<210> 64

<211> 53

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> pm3776

<400> 64

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctg tttggttggt gaccgcaatt tgc: 53

<210> 65

<211> 55

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3800

<400> 65

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctg tcaccaccgt catgtacgag gctgc: 55

<210> 66

<211> 55

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 66

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc agacacctag aatatagaca ttccc: 55

<210> 67

<211> 55

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3781

<400> 67

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtg atcacaagcg cagctaatca ctagc: 55

<210> 68

<211> 57

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm2769

<400> 68

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc gtgtagaaaa tcttaacccg aaaatcg: 57

<210> 69

<211> 55

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm2421

<400> 69

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtg gtgaggtgcc ggggaagcga cgttg: 55

<210> 70

<211> 54

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<223> prm2854

<400> 70

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt tcttctttcc cttggaacta accg: 54

<210> 71

<211> 54

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm2427

<400> 71

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt gtcgctttta tttggcttgg tgtg: 54

<210> 72

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm2856

<400> 72

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc tctagctcga tctctcttgc aaaagc: 56

<210> 73

<211> 49

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3026

<400> 73

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtg gcgatgagat cttcctccg: 49

<210> 74

<211> 59

<212> ADN

<220>

<223> prm3030

<400> 74 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt tttgtaggat tctactacta tgcttcaac 59

<210> 75

<211> 62

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3062

<400> 75

<210> 76

<211> 54

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3032

<400> 76

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtg atggcagagt taattagcaa acgc: 54

<210> 77

<211> 50

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3052

<400> 77

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc taagggcagc agccattggg: 50

<210> 78

<211> 60 <210> 82

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3049

<400> 78

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtg gcggcggcgg cggcggcggc ggctgggtct: 60

<210> 79

<211> 54

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm2195

<400> 79

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc ggcttagaga ggggaggaag cgaa: 54

<210> 80

<211> 58

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm2197

<400> 80

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt ggtgtgagtg tttgagtttg gagtgagc: 58

<210> 81

<211> 57

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm2845

<400> 81

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc ggcaatgtga tgcaatgcaa attaagc: 57

<211> 55

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm2974

<400> 82

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc gcaaacttgg ctggaatcac tcacc: 55

<210> 83

<211> 54

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3771

<400> 83

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt gtcgcctctc ctctgcaatg cgtg: 54

<210> 84

<211> 52

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3773

<400> 84

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtg gctgaatcct gcgagaaggg cg: 52

<210> 85

<211> 54

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3775

<400> 85

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtg atctctccct ctccctctcc ctgg: 54

<210> 86

<211> 52

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3777

<400> 86

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt ggagcggaag ggggggggga gc: 52

<210> 87

<211> 57

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3801

<400> 87

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc actctcagag atcgaggtgt tcttctg: 57

<210> 88

<211> 52

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm5136

<400> 88

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc gcccgcagct cgcccccgtc cg: 52

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un promotor aislado capaz de dirigir y/o regular la expresión en tejido joven de una planta, que comprende:

(a)

un ácido nucleico aislado como se da en la SEQ ID NO: 5 o el complemento del mismo; o

(b)

un ácido nucleico aislado como se define en (a), que se interrumpe por una secuencia de intervención; o

(c)

un fragmento del ácido nucleico como se define en (a) o (b), cuyo fragmento es capaz de dirigir y/o regular la expresión específica del tejido joven o

(d)

un ácido nucleico aislado que tiene por lo menos 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de ADN como se da en la SEQ ID NO: 5.
2.

Un promotor de acuerdo con la reivindicación 1, que es un promotor híbrido que comprende por lo menos una parte de un promotor como se define en la reivindicación 1 y que comprende adicionalmente otra parte de un promotor.
3.

Una construcción genética que comprende:

(a)

Un promotor aislado como se define en la reivindicación 1 o 2; y

(b)

una secuencia de ácido nucleico heteróloga ligada en forma operativa a dicho promotor de (a); y opcionalmente

(c)

un terminador de transcripción 3’.
4.

Un casete de expresión que comprende una construcción genética como se define en la reivindicación 3.
5.

Un vector de transformación que comprende una construcción genética como se define en la reivindicación
6.

Un vector de expresión que comprende una construcción genética como se define en la reivindicación 3.
7.

Una célula anfitriona que comprende una construcción genética como se define en la reivindicación 3, o un casete de expresión como se define en la reivindicación 4, o un vector de transformación como se define en la reivindicación 5, o un vector de expresión como se define en la reivindicación 6.
8.

Una célula de planta transgénica que comprende una construcción genética como se define en la reivindicación 3, o un casete de expresión como se define en la reivindicación 4 o un vector de transformación como se define en la reivindicación 5 o un vector de expresión como se define en la reivindicación 6.
9.

La célula de planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 8, que es una célula de planta monocotiledónea.
10.

La célula de planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 9, que es una célula de planta dicotiledónea.
11.

Una planta transgénica que comprende una célula de planta transgénica como se define en la reivindicación 9 o 10.
12.

Una planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 11, en donde dicha planta se selecciona de arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, avena, centeno, sorgo, soja, girasol, canola, caña de azúcar, alfalfa, fríjol, guisantes, lino, lupino, colza, tabaco, tomate, papa, calabaza, papaya, álamo y algodón.
13.

Parte de planta, preferiblemente una parte cosechable, un propágulo o progenie de una planta como se define en la reivindicación 11 o 12 y que comprende un promotor aislado como se define en la reivindicación 1 o2.
14.

Método para dirigir y/o regular la expresión de un ácido nucleico en una planta o célula de planta, que comprende:

(a)

Ligar en forma operativa dicho ácido nucleico a uno cualquiera de los ácidos nucleicos aislados como se define en la reivindicación 1, y

(b)

introducir la construcción genética resultante dentro de una planta o célula de planta.
15. Método de acuerdo con la reivindicación 14, en donde dicha expresión es específica de tejido.

5 16. Método para la producción de una planta transgénica, que comprende:

(a) introducir dentro de una célula de planta un promotor aislado como se define en la reivindicación 1 o 2, o una construcción genética como se define en la reivindicación 3, o un casete de expresión como se define en la reivindicación 4, o un vector de transformación como se define en la reivindicación 5 o un vector de expresión como se define en la reivindicación 6, y

10 (b) Cultivar dicha célula de planta bajo condiciones que promueven el crecimiento de la planta.
17. Uso de cualquiera de los ácidos nucleicos aislados como se define en la reivindicación 1 para dirigir y/o regular la expresión de un ácido nucleico ligado en forma operativa.