ES2378409T3

ES2378409T3 - Método para producir sustancias biológicas en cultivo sin proteínas

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Publication number: ES2378409T3
Application number: ES95937888T
Authority: ES
Inventors: Otfried Kistner; Noel Barrett; Wolfgang Mundt; Friedrich Dorner
Original assignee: Baxter Healthcare SA
Current assignee: Baxter Healthcare SA
Priority date: 1994-11-10
Filing date: 1995-11-10
Publication date: 2012-04-12
Anticipated expiration: 2015-11-10
Also published as: DK1213030T3; EP1213030A1; EP1213030B1; EP2290053A1; DK0791055T3; FI971998A0; HK1002285A1; WO1996015231A2; ATE542891T1; CA2205015C; CA2415990A1; CA2205015A1; CA2415990C; JPH10503093A; ATE429246T1; FI971998L; EP0791055B1; ES2323490T3; DE69535940D1; WO1996015231A3

Abstract

Un método para producir antígeno viral que comprende las etapas de: (a) proporcionar un cultivo de células de riñón de mono cultivadas exclusivamente en medios sin proteínas durante múltiples generaciones, (b) infectar dicho cultivo con un virus seleccionado entre el grupo que consiste en orthomyxoviridae;y (c) incubar dicho cultivo celular infectado con dicho virus para propagar dicho virus, (d) retirar una parte del cultivo celular de la etapa (c); (e) poner en contacto dicha parte del cultivo de la etapa (d) con al menos una proteasa que aumente la activación de dicho virus; (f) añadir a dicha parte de etapa (e) al menos un compuesto que inhiba o atenúe cualquier efecto tóxico celular de dicha proteasa; y (g) devolver dicha parte de etapa (f) a dicho cultivo.

Description

Método para producir sustancias biológicas en cultivo sin proteínas

Campo de la Invención

La presente invención se refiere a un procedimiento de estudio para propagar un virus seleccionado entre el grupo de orthgomyxoviridae, que incluye prácticamente todos los virus Influenza, con rendimientos comparativamente altos sin la necesidad de efectuar pases en cultivo, que incluye la producción de virus reordenantes y atenuados de crecimiento alto. La presente invención proporciona además la producción de vacunas a partir de esos virus. La invención también se refiere a una biomasa celular que es capaz de soportar el cultivo de dichos virus. La presente invención también se refiere a la producción de virus, antígenos de virus y proteínas recombinantes mediante el uso de esa biomasa celular.

Antecedentes de la Invención

La producción eficaz de vacunas requiere el crecimiento de grandes cantidades de virus producidas en altos rendimientos a partir de un sistema de hospedador. Diferentes tipos de virus requieren diferentes condiciones de cultivo para obtener rendimientos aceptables. Por lo tanto, el hospedador en el que se cultiva el virus es de enorme importancia. Como una función del tipo de virus, se puede cultivar un virus en células de cultivo de tejido primario, en líneas celulares establecidas o en huevos embrionados, tales como los de pollo.

Las condiciones de cultivo en las que se cultiva una cepa de virus también son de enorme importancia con respecto a conseguir un rendimiento aceptablemente alto de la cepa. Por tanto, para maximizar el rendimiento de una cepa de virus deseada, tanto el sistema de hospedador como las condiciones de cultivo se tienen que adaptar específicamente para proporcionar un entorno que sea provechoso para la producción de una cepa de virus deseada. Por lo tanto, para conseguir un rendimiento aceptablemente alto de las diversas cepas de virus, se requiere un sistema que proporcione condiciones de cultivo óptimas para un gran número de virus diferentes. Muchos virus están limitados a sistemas de hospedador muy específicos, algunos de los cuales son muy ineficaces con respecto a rendimientos de virus.

Algunas de las células de mamífero que se usan como sistemas de hospedador virales producen virus en rendimientos altos, pero la naturaleza tumorígena de tales células implica restricciones reguladoras contra su uso para producción de vacunas. De hecho, las directrices aplicables de la Organización Mundial de la Salud (OMS) indican que sólo se permiten unas pocas líneas celulares para la producción de vacunas de virus.

Los problemas que surgen a partir del uso de suero en cultivo de células y/o aditivos de proteína obtenidos a partir de una fuente animal o de humano añadidos al medio de cultivo, es decir, la calidad y composición variable de lotes diferentes y el riesgo de contaminación con micoplasma, virus o agente de BSE, son bien conocidos. En general, el suero o sustancias obtenidas de suero como albúmina, transferrina o insulina pueden contener agentes indeseados que pueden contaminar el cultivo y los productos biológicos producidos a partir del mismo. Adicionalmente, los aditivos obtenidos de suero de humano se tienen que ensayar para determinar todos los virus conocidos, como hepatitis o VIH, que se pueden transmitir por suero. El suero bovino y los productos obtenidos del mismo, por ejemplo tripsina, conllevan el riesgo de contaminación con BSE. Además, todos los productos obtenidos de suero se pueden contaminar con agentes aún desconocidos. Por lo tanto, se están realizando muchos intentos para proporcionar sistemas de hospedador eficaces y condiciones de cultivo que no requieran suero u otros compuestos obtenidos de suero.

A lo largo del tiempo, muchos virus cambian sus serotipos. Cualquier cambio en el serotipo de virus requiere un cambio correspondiente en una vacuna que tiene por objeto provocar inmunidad hacia el nuevo serotipo de virus. Para mantener la eficacia de la protección aportada por una vacuna a un nuevo serotipo de virus particular, se tiene que producir una nueva vacuna que confiera inmunidad para ese nuevo serotipo. Para producir la nueva vacuna, las cepas de virus nuevas se tienen que cultivar. Debido a que muchos virus, en particular virus Influenza, cambian de serotipo muy rápidamente, el sistema de cultivo tiene que ser capaz de producir antígeno viral, incluyendo viriones, en cantidades a gran escala lo suficientemente rápido para permitir producción de vacunas durante la temporada de infección del virus.

En muchos casos, las condiciones de cultivo óptimas para las nuevas cepas de virus son diferentes de las condiciones empleadas para cultivar sus predecesores. Por consiguiente, es altamente deseable un sistema de cultivo que se pueda ajustar fácilmente para proporcionar los requerimientos para crecimiento óptimo de nuevas cepas de virus. Además, consideraciones prácticas, tales como la necesidad de rendimiento alto de producción de la nueva cepa, vuelven altamente deseable un método que es aplicable a producción a gran escala del virus, tal como Influenza.

Un ejemplo típico de un virus que cambia su serotipo frecuentemente es el virus Influenza. Influenza es una enfermedad respiratoria grave en el hombre y es responsable de muchas miles de muertes cada año.

Existen tres tipos generales de virus Influenza, Tipo A, Tipo B y Tipo C. Los tipos se caracterizan por la ausencia de reactivad cruzada serológica entre sus proteínas internas. Los virus Influenza de Tipo A se clasifican adicionalmente en subtipos basándose en diferencias antigénicas de sus glicoproteínas, las proteínas hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA). Los seres humanos son susceptibles principalmente a enfermedades causadas por infección con virus Influenza de Tipo A, B y C.

Actualmente, los casos más significativos de infecciones de Influenza en seres humanos son los que se atribuyen al Tipo B y a los subtipos H1N1 y H3N2 de Influenza Tipo A. Por consiguiente, los antígenos de Tipo B y de subtipos H1N1 y H3N2 de Influenza Tipo A son aquellos que se incorporan generalmente en las vacunas de Influenza actuales. Las vacunas disponibles actualmente tienen índices de protección que varían del 75-90%.

El antígeno HA de Influenza es la diana principal para las respuestas inmunes protectoras de un hospedador hacia el virus. Uno de los problemas en el desarrollo de vacunas de Influenza eficaces proviene del alto índice de mutación del gen que codifica la proteína HA, dando como resultado cambios frecuentes en su antigenicidad. Por lo tanto, para producir vacunas eficaces, se tienen que producir frecuentemente nuevas vacunas a partir de aislados de Influenza recientes.

La práctica habitual de recuperar nuevos aislados virales implica recuperación con un frotis de garganta o fuente similar, seguido de cultivo de los aislados en huevos de pollo embrionados. Aunque el aislamiento inicial en huevos puede ser difícil, el virus se adapta a su hospedador de huevo y se puede llevar a cabo producción a gran escala del virus en huevos.

Los métodos convencionales para producir vacuna de influenza siempre han implicado el cultivo de los virus en huevos de pollo embrionados. Después, los virus cultivados mediante este método se usan para producir vacunas de virus atenuado vivo, virus entero muerto o de subunidad. Sin embargo, la metodología convencional que implica huevos de pollo embrionados para producir vacunas de influenza es extremadamente engorrosa, implicando el manejo de muchos miles de huevos por semana. En una operación típica, los huevos se tienen que mirar al trasluz, se tiene que esterilizar la cáscara y cada huevo se tiene que inocular mediante inyección de un volumen pequeño de virus en la cavidad alantoidea. Después, los huevos inyectados se incuban durante 48-72 horas a 33º-37ºC, se miran de nuevo al trasluz, se refrigeran durante la noche y se abren para permitir recolección del líquido alantoideo. Después, el líquido recolectado se tiene que aclarar mediante filtración y/o centrifugación antes de procesarse para purificación adicional. Después se requiere la purificación exhaustiva para asegurar la liberación a partir de la proteína del huevo. Requirements For Inactivated Influenza Vaccine, World Health Organization Technical Report Series, 384 (1966).

En una operación típica de embriones de pollo, se requieren entre uno y dos huevos para producir una dosis de vacuna de influenza. Por tanto, para producir un millón de dosis de vacuna, se tienen que procesar más de un millón de embriones de huevo. En resumen, el procedimiento de estudio convencional para producir vacunas de virus Influenza implica muchas etapas que son difíciles de automatizar y, por consiguiente, requieren mucho trabajo, requieren mucho tiempo, son costosas y están sujetas a contaminación. Por lo tanto, existe una necesidad de métodos que requieran menos trabajo, requieran menos tejido biológico por dosis producida y que sean menos susceptibles a la contaminación.

Se han realizado muchos intentos para adaptar la tecnología de cultivo tisular convencional con células de embriones de pollo primarias (“CEC”) o líneas celulares de mamífero establecidas para la producción de vacunas de virus Influenza. Estos intentos no fueron satisfactorios debido a que un gran número de cepas virales no se replican en cultivos convencionales. El uso de líneas celulares de mamífero establecidas, tales como línea de riñón canino Madin-Darby (MDCK), ha sido más satisfactorio para replicar algunas cepas. Sin embargo, varias cepas de virus no se replicarán en la línea MDCK. Además, los temores acerca de los posibles efectos secundarios asociados con emplear células con un potencial tumorígeno para la producción de vacunas humanas ha impedido el uso de MDCK, una línea celular altamente transformada, en este contexto.

Una de las dificultades principales para cultivar varias cepas de Influenza en cultivo tisular primario o líneas celulares establecidas surge de la necesidad de activación por escisión proteolítica de la hemaglutinina de Influenza en la célula hospedadora. La escisión del precursor de HAo del virus en los subfragmentos HA 1 y HA 2 es una etapa necesaria para que el virus infecte una célula nueva. Por tanto, se requiere escisión para convertir partículas de virus nuevas en las células hospedadoras en viriones capaces de infectar células nuevas. Se conoce que la escisión ocurre durante el transporte de la proteína de membrana HAo integral desde el retículo endoplasmático de la célula infectada hasta la membrana plasmática. En el recorrido de transporte, la hemaglutinina experimenta una serie de modificaciones co y post traduccionales que incluyen la escisión proteolítica del precursor HA en el fragmento amino terminal HA 1 y el carboxi terminal HA 2.

El hecho de que se han observado viriones de Influenza que contienen glicoproteínas HA no escindidas o escindidas indica que la escisión no es siempre necesaria para el ensamblaje y liberación del virus a partir de la célula infectada. Sin embargo, la escisión de HA es, de hecho, necesaria para el inicio de la infección de una nueva célula hospedadora.

Aunque se conoce que una HA no escindida puede mediar la unión del virus a sus receptores que contienen ácido neurámico en la superficie celular, no tiene la capacidad de la siguiente etapa en el ciclo infeccioso, que es fusión. Se ha indicado que se requiere la exposición del extremo amino hidrófobo de la HA 2 mediante escisión para que se pueda insertar en la célula diana, formando de ese modo un puente entre la membrana celular del virus y de la diana. Esto viene seguido de la fusión de las dos membranas y entrada del virus en la célula diana.

La activación proteolítica de hemaglutinina sigue un patrón observado en muchos precursores de enzimas y hormonas, tales como proinsulina, progastrina y proopiomelanocortina. La misma implica escisión en un residuo arginina mediante una endoproteasa similar a tripsina. La evidencia disponible sugiere que la endoproteasa es una enzima intracelular que es dependiente de calcio y tiene un pH neutral óptimo. Sin embargo, más allá de estas observaciones, se conoce poco acerca de la naturaleza de la proteasa intracelular. (Klenk et al, “The Molecular Biology of Influenza Virus Pathogenicity”, Adv. Virus Res., 34: 247-281 (1988)).

Ya que las proteasas activadoras son enzimas celulares, el tipo de células infectado determina si la hemaglutinina de Influenza se escinde. Las hemaglutininas de los virus Influenza de mamífero y los virus Influenza aviar no patógenos son sensibles a escisión proteolítica sólo en un número limitado de tipos celulares. Por otro lado, las hemaglutininas de virus aviares patógenos entre los subtipos H 5 y H 7 se escinden mediante proteasas presentes en una amplia variedad de células hospedadoras diferentes. Por tanto, existen diferencias en el intervalo de hospedadores que se producen a partir de las diferencias en la capacidad de escisión de hemaglutinina que se puede correlacionar con las propiedades patógenas del virus.

Las diferencias en la capacidad de escisión se deben a diferencias en la secuencia de aminoácidos del sitio de escisión de la hemaglutinina. Los análisis de secuencia han mostrado que los fragmentos HA1 y HA2 de la molécula de hemaglutinina de los virus de Influenza aviar no patógenos e Influenza de todos los mamíferos están enlazados por una arginina única. Por el contrario, las cepas aviares patógenas tienen una secuencia de varios aminoácidos básicos en el sitio de escisión siendo el denominador común lisina-arginina o arginina-arginina. Las hemaglutininas de todos los virus Influenza se escinden por el mismo mecanismo general que produce la eliminación de los aminoácidos básicos.

Las actividades de proteasa que son esenciales para la escisión de un amplio intervalo de cepas de virus Influenza están disponibles en el huevo embrionado y en agregados celulares que representan el embrión de pollo entero. Sin embargo, los cultivos de CEC convencionales preparados a partir de embriones de pollo, proporcionan sólo algunas de las actividades de proteasa de un embrión de pollo entero y, por lo tanto, permiten la replicación de un intervalo limitado de cepas de virus Influenza. Los procedimientos convencionales para preparación de cultivos de CEC implican retirar la cabeza y órganos internos y múltiples etapas de tratamiento con tripsina. Estos procedimientos producen específicamente la pérdida de células de cerebro, corazón, pulmón, hígado y riñón, que se ha demostrado que replican varias cepas de Influenza (Scholtissek et al., “Multiplication of Influenza A Viruses with Cleavage and Non-cleavable Hemagglutinin in Chicken Embryo Membranes or Organes, and Cell Cultures Derived Therefrom”, J. Gen. Virol., 69, 2155-2164 (1988). Por tanto, los procedimientos convencionales dan como resultado una población celular altamente seleccionada que consiste principalmente en fibroblastos, que están limitados en términos de las cepas de virus que los mismos pueden soportar.

Con anterioridad se han intentado mejoras en la producción de virus Influenza. Por ejemplo, se ha indicado que la replicación limitada de varias cepas de Influenza A en cultivos celulares convencionales se podría aliviar mediante la adición de tripsina al medio de cultivo tisular. Por ejemplo, la adición de tripsina aumenta significativamente la infectividad de diversas cepas cultivadas en cultivos de CEC (Lazarowitz et al., “Enhancement of the Infectifivity of Influenza and B Viruses by Proteolytic Cleavage of the Hemagglutinin Polupeptide”, Virology, 68: 440-454 (1975)). Además, Stieneke-Gröber et al., “Influenza Virus Hemagglutinin with Multibasic Site is Activated by Furin, a Subtilisin-like Endoprotease”, EMBO J., 11: 2407-2414 (1992), han identificado la enzima activadora de HA en células de MDBK como una proteína similar a furina. Tales enzimas se han aislado a partir de tejidos de humano y de ratón y constituyen una familia nueva de endoproteasas similares a subtilisina eucariotas.

Se han llevado a cabo otros intentos para desarrollar métodos de producción de vacunas alternativos. La patente de Estados Unidos Nº 4.783.411 de Gabliks trata un método para preparar vacunas de Influenza en cultivos de células de carpa dorada. Las partículas de virus para infectar los cultivos de Gabliks después de su establecimiento se obtuvieron a partir de cultivos de embriones de pollo o a partir de ratones infectados con cepa CD-1. Se efectuaron pases del virus al menos dos veces en tales cultivos de células de carpa dorada, dando como resultado un virus atenuado que se puede usar como una vacuna viva.

La patente de Estados Unidos Nº 4.500.513 de Brown et al. describe la producción de partículas de virus no modificadas para preparar vacunas a partir de cultivo celular líquido o cultivo monocapa celular en el que se incuba una enzima hidrolizante de proteína, tal como tripsina, quimotripsina o carboxipeptidasa, con un cultivo infectado parcialmente para aumentar la proporción de células adicionales infectadas por el virus y para asegurar el efecto citopático máximo. La recolección del virus se realiza en un punto en la fase de crecimiento del virus en el que muestra efecto citopático máximo. Sin embargo, todos los ejemplos de Brown, describen una línea celular de riñón de perro que no se puede usar para producción de vacunas humanas. Debido a los efectos citopáticos máximos del virus en el método de acuerdo con Brown et al., el rendimiento de virus está limitado a sólo una ronda de replicación del virus. Además, Brown no describe la manipulación del genoma del virus ni la optimización de condiciones de cultivo. Por lo tanto, el método de Brown no es aplicable para la producción a gran escala de virus, que es necesaria para la producción eficaz de vacunas correspondientes.

La patente de Estados Unidos Nº 4.205.131 de Almeida describe un método para propagar rotavirus en cultivo celular en presencia de medio sin suero que contiene la enzima proteolítica tripsina. Debido al efecto letal de la tripsina sobre las células a niveles elevados, el rendimiento de virus de Almeida, como el de Brown, estuvo limitado al producido en una ronda de replicación.

Más recientemente, otros han intentado producir virus Influenza en cultivos de líneas celulares. Por ejemplo, Katz et al., J. Infect. Dis. 160: 191-98 (1989) han comparado las características de crecimiento de Influenza en células MDCK y cavidad amniótica de huevos embrionados. Katz observó que el título de Influenza obtenido a partir de células MDCK se comparaba favorablemente con los huevos embrionados. Sin embargo, existen problemas con el uso de células MDCK. Por ejemplo, las células MDCK son una línea celular no autorizada para producción de vacunas humanas. Además, el procedimiento de Katz requiere que los virus se multipliquen y se pasen en cultivos en serie en la línea de células MDCK, lo cual es costoso y, más importante, requiere mucho tiempo.

Kaverin et al., J. Virol. 69: 2700-03 (1995) han intentado cultivar virus Influenza en células VERO cultivadas en medio que contiene suero, las células VERO están autorizadas por la Organización Mundial de la Salud para la producción general de vacunas.

Sin embargo, Kaverin observó dificultades para propagar virus Influenza en células VERO y relacionó estas dificultades con una pérdida de la actividad de tripsina en los cultivos celulares provocada por un factor liberado aparentemente por las células VERO. Kaverin abordó este problema añadiendo repetidamente tripsina y efectuando pases en cultivo en serie de los virus en las células VERO. Sólo después de 10 pases en células VERO, Kaverin obtuvo un título que fue tan alto como se podría haber obtenido con huevo embrionado y células MDCK. Govorkova et al., J. Infect. Dis. 172: 250-53 (1995) obtuvieron resultados similares.

Sin embargo, ni Kaverin ni Govorkova abordan los problemas del uso de medio que contiene suero. Los medios que contienen suero generalmente carecen de consistencia de lote a lote y contienen contaminantes indeseados que complican la producción viral y el proceso de purificación. Estos contaminantes incluyen virus contaminantes, tales como BVDV, virus de la lengua azul, priones o BSE y/o proteínas inmunógenas, que pueden presentar problemas de seguridad graves.

En la técnica anterior también se ha intentado el uso de medio sin suero para cultivar virus. Véanse los documentos EP 115442, U.S. 4.525.349, U.S. 4.664.912. En estos métodos, en primer lugar las células hospedadoras se cultivan en medio que contiene suero y, justo antes de la infección con los virus respectivos, el medio que contiene suero se reemplaza por medio sin suero.

Se han adaptado células VERO para cultivo en medio sin suero, tal como MDSS2. Merten et al., Cytotech. 14: 47-59 (1994). MDSS2 carece de factores de crecimiento, pero todavía tiene una presencia significativa de proteínas no séricas (30-40 mg de proteína/ml). Merten et al., Biologicals 23: 185-89 (1995). Por consiguiente, MDSS2 no está completamente libre de los problemas asociados con otros medios que contienen proteína, tales como medios que contienen suero.

Cinatl et al., 1993, Cell Biology International, 17: 885-895, describen el desarrollo de un medio sin suero (PFEK-1) específico para la propagación continua de células VERO en una superficie de cultivo formal de Polivinilo (PVF) y replicación de virus Coxsackie B4, HSV-1, HSV-2, Poliovirus 1, 2 y 3 en un cultivo de células VERO respectivo. Cinatl et al. no describen la replicación de antígeno viral u Orthomyxovirus tales como Influenza A, B o C en células VERO.

El documento EP-A-19218 describe la replicación de virus Influenza en un cultivo de células de riñón canino (MDCK, CLDK). Sin embargo, las células MDCK o CLDK no están autorizadas para la producción de vacunas humanas.

Existe una necesidad continuada de métodos seguros y eficaces para producir virus y sus antígenos, así como proteínas recombinantes en sistemas de expresión basados en virus. Además, existe la necesidad de un procedimiento de estudio para propagación viral, que emplee materiales que estén disponibles fácilmente y que requieran un número mínimo de manipulaciones que requieren tiempo, tales como adaptación de un virus a un sustrato celular particular mediante pases en cultivo en serie, que pueden satisfacer las normas reguladoras pertinentes y aún así hospedar muchos virus y cepas de virus diferentes, especialmente aquellos que no se pueden multiplicar eficazmente a través de métodos convencionales.

Sumario de la Invención

La presente invención se refiere a un método para la producción de alto rendimiento de orthomyxovirus a partir de cultivo celular y proporcionar la producción de vacunas a partir de esos virus.

Con este propósito la invención proporcionará:

1.: un método para la producción continua de virus a partir de cultivo sostenido de células de riñón de mono, tales como células VERO, con un mínimo de manipulación humana;

2.: un método para optimizar la actividad de un virus en cultivo mediante aumento con proteasa;

3.: un método para la producción de alto rendimiento de todos los tipos de productos celulares, es decir, virus o proteínas recombinantes u otros productos celulares, en un sistema flexible que se pueda adaptar fácilmente a los requerimientos específicos de los diversos productos;

4.: una biomasa celular que esté libre de proteínas contaminantes para la producción de productos biológicos, tales como virus, antígenos de virus o proteínas producidas por virus, que incluyen virus recombinantes;

5.: una biomasa celular que soporte el cultivo de un gran número de virus diferentes;

6.: la producción eficaz de antígenos de virus, que incluyen virus enteros, a partir de cultivo celular y la producción de vacunas obtenidas a partir de ese virus o antígeno de virus;

7.: la producción de proteínas recombinantes sin proteínas contaminantes obtenidas a partir del medio de cultivo.

Por consiguiente, la invención se refiere a un método para producir antígeno viral que comprende las etapas de:

(a): proporcionar un cultivo de células de riñón de mono cultivadas únicamente en medios sin proteínas durante múltiples generaciones,

(b): infectar dicho cultivo con un virus seleccionado entre el grupo que consiste en orthomyxoviridae; y

(c): incubar dicho cultivo celular infectado con dicho virus para propagar dicho virus,

(d): retirar una parte del cultivo celular de la etapa (c);

(e): poner en contacto dicha parte de la etapa (d) con al menos una proteasa que aumente la activación de dicho virus;

(f): añadir a dicha parte de etapa (e) al menos una proteasa que inhiba o atenúe cualquier efecto tóxico celular de dicha proteasa; y

(g): devolver dicha parte de etapa (f) a dicho cultivo.

Las modificaciones del método incluyen que las células de vertebrado, antes de la infección (etapa b), se cultiven en un medio sin proteínas durante al menos seis generaciones, preferiblemente durante al menos doce generaciones, más preferiblemente durante al menos dieciocho generaciones o aún más preferiblemente durante al menos veinticuatro generaciones.

En otra modificación del método, el virus se propaga sin pases múltiples en serie del mismo a través del cultivo.

Virus Influenza.

Más preferiblemente, el virus es un virus de influenza, tal como Influenza A, B y C. Las células usadas para propagar el virus incluyen células VERO, células CV-1, células LLC-MK2. Preferiblemente, las células son células VERO en una biomasa celular.

La proteasa que aumenta la activación de dicho virus es preferiblemente una proteasa que escinde una glicoproteína responsable de la fusión de la membrana del virus y de la célula hospedadora. Cuando el virus que se propaga es Influenza, la proteasa escinde la hemaglutinina de Influenza. Preferiblemente, la proteasa es de una fuente procariota, tal como una pronasa, termolisina, subtilisina A o una proteasa recombinante.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una biomasa celular que comprende células de vertebrado cultivadas exclusivamente en condiciones sin proteínas, donde dicha biomasa celular sostiene la propagación de virus sin pases en cultivo en serie de los mismos a través de dichas células. La biomasa celular se puede obtener cultivando células en un vehículo en un medio sin proteínas.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para producir una biomasa celular, que comprende las etapas de: (a) cultivar células en condiciones exclusivamente sin proteínas en un recipiente que contiene un vehículo y un medio sin proteínas para que las células crezcan en dicho vehículo y formen una biomasa unida al vehículo y (b) poner en contacto la biomasa celular y el vehículo con una sustancia para separar la biomasa celular del vehículo. Preferiblemente, la sustancia es una proteasa. La proteasa se obtiene preferiblemente a partir de un procariota, tal como termosilina, subtilisina A o pronasa.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para producir un virus donador a partir de Orthomyxovirus, para preparar virus reordenantes, que comprende las etapas de: (a) desarrollar un cultivo de células de vertebrado exclusivamente en medio sin proteínas; (b) infectar el cultivo con un virus; (c) incubar el cultivo celular infectado con el virus; (d) seleccionar una cepa de virus que muestre un fenotipo deseado en células de vertebrado y (e) aislar el virus donador a partir de la etapa (d). Preferiblemente, el virus es un virus Influenza y el fenotipo deseado es un fenotipo de alto rendimiento o un fenotipo de virulencia atenuada. El virus de la etapa (c) puede incluir virus Influenza atenuados, virus Influenza adaptados al frío, virus Influenza termosensibles, virus Influenza reordenantes, virus Influenza donador de alto rendimiento, virus Influenza de tipo silvestre aislados a partir de frotis de garganta de mamíferos infectados y virus que se han pasado en cultivo en huevos de pollo embrionados

o cepas adaptadas a cultivo celular de virus Influenza. Las células para propagar los virus pueden incluir células VERO, células CV-1, células LLC-MK2. Un virus donador preferido que se puede obtener de acuerdo con la invención es A/Orth/17/95 (H1N1), que muestra un fenotipo de alto rendimiento en células VERO.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para producir un virus Orthomyxovirus reordenante, que comprende las etapas de: (a) coinfectar un cultivo de células de vertebrado en medio sin proteínas con un primer Orthomyxovirus que tiene un fenotipo deseado, tal como un fenotipo de alto rendimiento y/o de virulencia atenuada y un segundo Orthomyxovirus que tiene al menos un determinante antigénico de la cepa de vacuna actual; incubar el cultivo de células de vertebrado de la etapa (a) para propagar los virus y reordenantes de dichos virus, (c) seleccionar a partir de dicho cultivo coinfectado un virus reordenante que comprenda el fenotipo deseado, tal como un fenotipo de alto rendimiento y/o de virulencia atenuada, del primer Orthomyxovirus y al menos un determinante antigénico de dicho segundo Orthomyxovirus. Preferiblemente, los virus Orthomyxovirus son virus Influenza. La etapa (c) puede emplear un anticuerpo que se une a determinantes antigénicos del primer Orthomyxovirus pero no se une a determinantes antigénicos del segundo Orthomyxovirus. Preferiblemente, el segundo Orthomyxovirus se designa para producción de vacunas.

En una realización preferida el Orthomyxovirus reordenante se produce en una biomasa de células VERO.

También se describe un anticuerpo para seleccionar virus reordenantes para producción de vacunas, donde el anticuerpo se une a determinantes antigénicos de un virus donador pero no se une a determinantes antigénicos de un virus designado para producción de vacunas. Preferiblemente, el anticuerpo se une a glicoproteínas de superficie exterior, tales como hemaglutinina y neuraminidasa, del virus donador.

La presente descripción también proporciona un método mejorado para preparar antígeno viral, incluyendo virus, que emplea las etapas de retirar una parte del medio que contiene virus, poner en contacto la parte con al menos una proteasa que aumente la activación del virus durante una cantidad de tiempo suficiente para que ocurra la activación, después añadir a la parte retirada uno o más compuestos que inhiban o atenúen cualquiera de los efectos tóxicos celulares de las al menos una o más sustancias durante una cantidad de tiempo suficiente para que ocurra la inhibición o atenuación y después devolver la parte al cultivo celular. Las células de vertebrado adecuadas para uso con la invención incluyen células VERO, células CV-1, células LLC-MK2.

Los antígenos virales, incluyendo virus, producidos de acuerdo con la invención incluyen los antígenos de Orthomyxoviridae y preferiblemente es un virus Influenza. La sustancia que aumenta la activación del virus preferiblemente es una proteasa que escinde una glicoproteína responsable de la fusión de la membrana celular del virus y el hospedador tal como una proteasa que escinde la hemaglutinina de Influenza. Las proteasas adecuadas se pueden seleccionar entre el grupo que consiste en las enzimas de la familia tripsina y de la familia similar a subtilisina. Más específicamente, la proteasa se puede seleccionar entre el grupo que consiste en tripsina, quimotripsina, termolisina, pronasa, subtilisina A, elastasa, pepsina, pancreatina, carboxipeptidasa y furina. La proteasa más preferida es una proteasa obtenida a partir de una fuente procariota, tal como pronasa, subtilisina A o termolisina. El método de acuerdo con la invención también puede tener la sustancia que aumenta la activación viral en un recipiente o inmovilizada sobre un vehículo.

En una realización específica el virus Influenza se ha alterado para modificar un sitio de escisión o para crear un nuevo sitio de escisión en la glicoproteína. Cuando el método se aplica al virus Influenza, la hemaglutinina del virus Influenza preferiblemente se altera para contener el sitio de escisión de aminoácidos KKRKKR. La invención también puede incluir el uso de un compuesto que inhiba, atenúe o retire cualquiera de los efectos tóxicos celulares de la sustancia activadora, tal como inhibidor de tripsina de soja, inhibidor de tripsina de huevo y aprotinina. Preferiblemente, dichos inhibidores se proporcionan en un recipiente o inmovilizados sobre un vehículo.

El método de la invención también puede incluir las etapas de supervisar los niveles de crecimiento, infección y activación del cultivo, para variar las condiciones del cultivo para maximizar los niveles de crecimiento, infección y activación, para recolectar el virus a partir del cultivo y para preparar una vacuna con el virus recolectado. El método de la invención proporciona además el tratamiento de infección de virus Influenza o la prevención de infección de virus Influenza administrando a un animal una vacuna que se puede obtener mediante los métodos descritos anteriormente.

El método de la invención también puede incluir las etapas de aumentar u optimizar la producción de antígeno viral, incluyendo virus, que comprende las etapas de proporcionar un cultivo celular de células de vertebrado, cultivar las células en medio sin proteínas, infectar el cultivo celular con un virus, incubar el cultivo celular infectado con el virus para propagar el virus en el medio para producir un medio que contiene virus, retirar una parte del medio que contiene virus, poner en contacto la parte con al menos una sustancia que aumente la activación del virus, añadir a la parte al menos un compuesto que inhiba, atenúe o retire los efectos tóxicos celulares de la una o más sustancias que aumentan la activación del virus y devolver la parte del medio que contiene virus retirada al cultivo celular y el medio.

El método de la invención también puede incluir las etapas de proporcionar, cultivar, infectar e incubar que opcionalmente se realizan en un primer recipiente y las etapas de poner en contacto y añadir se realizan en un segundo recipiente y además, que el primer y segundo recipientes estén conectados en un bucle para que las etapas de proporcionar, cultivar, infectar, incubar, retirar, poner en contacto, añadir y devolver se pueden realizar en un ciclo cerrado o similar. Otras opciones dentro del alcance de la invención incluyen las etapas de proporcionar, cultivar, infectar e incubar que se realizan en un primer recipiente, la etapa de poner en contacto se realiza en un segundo recipiente y la etapa de añadir se realiza en un tercer recipiente y, opcionalmente, donde el primer recipiente, el segundo recipiente y el tercer recipiente están conectados en un bucle para que todas las etapas se puedan realizar de una manera discontinua, de una manera cíclica o similar.

La invención se puede poner en práctica con células de riñón de mono. Por ejemplo, las células de vertebrado del método pueden comprender aquellas elegidas entre células VERO, células CV-1, células LLC-MK2.

En una forma preferida de la invención, el virus puede ser un virus Influenza y las células que se tienen que infectar son células VERO que se han cultivado desde el inicio en medios sin proteínas. Se añade una sustancia para activar el virus, tal como una proteasa que escinde la hemaglutinina de Influenza, que puede ser una o más proteasas seleccionadas entre las enzimas de la familia de tripsina o de la familia similar a subtilisina seleccionadas entre el grupo de tripsina, quimotripsina, termolisina, pronasa, subtilisina A, elastasa, pepsina, pancreatina, carboxipeptidasa y furina. La proteasa más preferida es una proteasa obtenida a partir de una fuente procariota, tal como pronasa, subtilisina A o termolisina.

El método de la invención también puede incluir las etapas de supervisar los niveles de crecimiento, infección y activación del cultivo y también para variar las condiciones del cultivo para maximizar los niveles de crecimiento, infección y activación de las células y virus y para recolectar el virus a partir del cultivo, preparar una vacuna con el virus recolectado y para el tratamiento de infección por virus Influenza y para la prevención de infección de virus Influenza administrando a un animal una vacuna obtenida por el método.

El método de la invención también puede incluir las etapas de optimizar la producción de uno o más productos de células cultivadas, comprendiendo las etapas de proporcionar células en cultivo en un primer recipiente, transferir una parte de las células a un segundo recipiente, activar la parte de las células en el segundo recipiente mediante la adición de una o más sustancias para optimizar la producción de un producto deseado, transferir la parte de las células a un tercer recipiente, añadir compuestos a la parte de las células en el tercer recipiente que atenúen los efectos tóxicos celulares de la una o más sustancias exógenas, donde el primer, segundo y tercer recipientes están conectados en un sistema de bucle circular o similar, devolviendo la parte de la células al primer recipiente. El método proporciona también producción discontinua o continua, para lograr el procesamiento de una parte del cultivo que puede incluir sustancialmente todas las células en el cultivo y cultivar las células y virus en un medio de cultivo que proporcione condiciones óptimas de cultivo y producción celular.

El método de la invención también puede incluir controlar, tal como aumentar, la infectividad de virus que expresan una proteína implicada en la activación del virus, que comprende las etapas de proporcionar un cultivo de células de vertebrado, cultivar las células en medio sin proteínas, infectar el cultivo con un virus que tiene un sitio de escisión modificado en la proteína implicada en la activación del virus, donde el sitio de escisión modificado aumenta la sensibilidad del virus a las enzimas de escisión en un cultivo de células de vertebrado e incubar el cultivo celular infectado con el virus para propagar el virus y para producir medio que contiene virus. El método es particularmente útil donde el virus es un virus Influenza que se ha alterado para modificar un sitio de escisión en su hemaglutinina o para crear un nuevo sitio de escisión, preferiblemente KKRKKR o similar, en su hemaglutinina y donde las células de vertebrado se eligen entre células VERO, células CV-1, células LLC-MK2.

El aspecto que se refiere a aumentar la infectividad de un virus también puede comprender las etapas de retirar una parte del medio que contiene el virus, poner en contacto la parte con al menos una sustancia que aumente la activación del virus, añadir a la parte que contiene virus al menos un compuesto que inhiba, atenúe o retire los efectos tóxicos celulares de la una o más sustancias que aumentan la activación del virus y devolver la parte retirada al cultivo celular y el medio. Las sustancias que aumentan la activación del virus son proteasas que activan una proteína implicada en activación de virus, por ejemplo, aquellas que escinden hemaglutinina de Influenza que incluyen las proteasas seleccionadas entre las enzimas de la familia de tripsina o de la familia similar a subtilisina, preferiblemente seleccionadas entre el grupo de tripsina, quimotripsina, termolisina, pronasa, subtilisina A, elastasa, pepsina, pancreatina, carboxipeptidasa y furina. La proteasa más preferida es una proteasa obtenida a partir de una fuente procariota, tal como pronasa, subtilisina A o termolisina.

De acuerdo con otro aspecto de la descripción se proporciona un virus cultivado sin proteína contaminante obtenido a partir del medio de cultivo, tal como una proteína obtenida de fuentes humanas o animales, tales como cerdos, vacas, ovejas y pollos (huevos) o una proteína que es un agente patógeno.

En otro aspecto de la invención se proporciona un antígeno de virus sin proteína contaminante obtenido a partir del medio de cultivo, tal como una proteína obtenida de fuentes humanas o animales, tal como cerdos, vacas, ovejas y pollos (huevos) o una proteína que es un agente patógeno. El virus o antígeno de virus preferiblemente se obtiene a partir de virus Influenza.

De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona una vacuna que comprende un antígeno de virus sin proteínas contaminantes obtenido a partir de medio de cultivo, tal como una proteína obtenida de fuentes humanas o animales, tales como cerdos, vacas, ovejas y pollos (huevos) o una proteína que es un agente patógeno. El virus puede ser un virus atenuado o puede estar inactivado. Preferiblemente, la vacuna comprende además del antígeno de virus un vehículo farmacéuticamente aceptable. La vacuna se puede aplicar a un mamífero por vía parenteral u oral. El antígeno de virus preferiblemente se usa para la preparación de una vacuna para el tratamiento o prevención de un mamífero frente a una infección de virus.

Descripción Detallada de las Realizaciones Preferidas

La presente invención proporciona un sistema nuevo para la producción de productos biológicos tales como virus o antígenos de virus. Se ha desarrollado una nueva metodología para preparar biomasa de células de vertebrado que se puede usar para producción a gran escala de productos biológicos que muestran seguridad aumentada con respecto a contaminantes no deseados. La “biomasa celular” de la invención comprende células de riñón de mono cultivadas en condiciones sin proteínas, que incluyen la ausencia de proteínas séricas. La necesidad de efectuar pases en cultivo en serie de virus a través de células se evita usando células de un entorno sin proteínas.

La expresión “sin proteínas” como se usa en este documento se refiere a la ausencia de proteínas, proteínas tanto séricas como no séricas, en un contexto determinado. Por ejemplo, un medio “sin proteínas” estaría libre de proteínas y puede estar hecho a partir de medios esenciales mínimos tales como DMEM o DMEM F12 de HAM. Un cultivo “sin proteínas” incluiría células que crecen en un medio sin proteínas y condiciones “sin proteínas” se referiría a células de cultivo en un medio sin proteínas. Un cultivo de este tipo contendría proteínas de las células. Por consiguiente, en el contexto de un cultivo sin proteínas de células, el cultivo contendría proteínas originadas de las células, pero no contendría proteínas de medios que contienen proteínas, tales como las proteínas en MDSS2.

Preferiblemente, las células se cultivan desde la ampolla original hasta la biomasa celular exclusivamente en condiciones sin proteínas. Preferiblemente, a continuación de la recepción de líneas celulares a partir de colecciones de cultivo u otras fuentes donde las mismas se pueden haber cultivado en medio que contiene suero, se mantienen posteriormente en condiciones de cultivo sin proteínas durante un número de generaciones suficiente para asegurar la carencia completa de proteínas así como un rendimiento alto de virus. Por tanto, de acuerdo con el presente método, el cultivo de células de mamífero en condiciones de cultivo sin proteínas ocurre durante múltiples generaciones, al menos seis generaciones de células, más preferiblemente durante al menos doce generaciones de células, aún más preferiblemente durante al menos dieciocho generaciones de células y todavía más preferiblemente durante al menos veinticuatro generaciones de células antes de la infección con un virus.

La presente descripción también proporciona una biomasa celular que se cultiva en condiciones sin proteínas desde la ampolla original o línea celular hasta una biomasa celular a gran escala. Una biomasa celular incluye células en cultivo y agregados de células, que incluyen células unidas a vehículos que, sorprendentemente, consiguen una densidad más grande que células cultivadas en medios que contienen proteínas. La biomasa celular de acuerdo con la invención no necesita ninguna fase de adaptación para condiciones de cultivo sin proteínas. Las células obtenidas a partir de una colección de cultivos tal como ATCC u OMS se obtienen en medio que contiene suero pero se pueden transferir inmediatamente a condiciones sin proteínas sin ningún proceso de adaptación.

El uso de la biomasa celular como se describe en este documento representa una mejora enorme sobre la técnica anterior, porque no se pierde tiempo debido a la carencia de una adaptación por las células. El número de generaciones de la biomasa celular que se tiene que cultivar antes de la infección no es mayor que el número que se necesita para cultivos celulares desarrollados en presencia de suero. Después de un número extenso de generaciones de cultivo, habitualmente entre 100 y aproximadamente 300 generaciones, determinadas líneas celulares transformadas se vuelven tumorígenas. Por tanto, la presente invención combina la ventaja de proporcionar una biomasa celular sin ningún compuesto contaminante obtenido a partir del medio de cultivo o procedimientos de subcultivo con la ventaja de evitar el riesgo de tumorigenicidad causado por la necesidad de crecimiento generacional extenso.

Además, el presente sistema proporciona una biomasa celular que tiene una densidad celular sorprendentemente aumentada en comparación con células cultivadas en medio de cultivo que contiene suero. Debido a la densidad celular mayor de la biomasa celular, se proporciona un proceso de producción más económico para productos biológicos.

En una realización preferida de la invención, las células se cultivan en vehículos, los cuales incluyen diversos sustratos insolubles tales como microportadores. En sistemas de fermentación a gran escala se usa una biomasa celular que comprende células unidas a un microportador. Las células unidas a microportadores crecen en multicapas sobre el vehículo y las células no se desprenden del vehículo en condiciones de cultivo sin proteínas. Este es un hallazgo extraordinario e inesperado ya que la técnica anterior indica el desprendimiento de células del vehículo seguido de formación de grumos y agregados celulares.

Las células de riñón de mono adecuadas para el uso de preparar una biomasa celular de la presente invención son células seleccionadas entre el grupo de VERO, CV-1, LLC-MK-2. Las células de la biomasa celular están unidas directamente o indirectamente a un vehículo. Los materiales que han demostrado ser bien adecuados como el material para el vehículo son vidrio, dextrano reticulado, gelatina o materiales sintéticos. Se ha demostrado que un microportador cuyo diámetro de partícula está en el intervalo entre 100 !m y 3.000 !m es muy eficaz en el contexto de la presente invención. El microportador puede tener una superficie lisa o una estructura porosa. En una realización preferida de la invención la biomasa celular se obtiene a partir de una línea celular de riñón de mono verde africano, preferiblemente una línea de células VERO.

La biomasa celular de la presente invención se obtiene mediante el uso de un medio no costoso y sintético que no contiene proteínas obtenidas a partir de fuentes humanas o animales, tales como cerdos, vacas, ovejas, cabras o pollos (huevos). El medio usado de acuerdo con la invención asegura una calidad alta con respecto a las normas de seguridad. Además, la presente invención proporciona una densidad celular aumentada por gramo de microportador. La invención da como resultado una eficacia de producción aumentada de productos biológicos. Además, se necesita una cantidad de microportador reducida para el proceso de producción.

En un aspecto adicional, la biomasa celular de la invención permite la producción de virus eficaz y producción de alto rendimiento de diferentes virus y, en una realización preferida, de todos los tipos y cepas de virus Influenza. El método de la presente invención permite la propagación viral en la biomasa celular que da rendimientos similares o incluso mayores que los cultivos celulares que contienen suero infectados con el mismo virus. Sorprendentemente, los virus que no se propagaron en los cultivos celulares de técnica anterior, tales como Influenza A, B y C muestran replicación y propagación de virus eficaz en la biomasa celular del método de la presente invención. Además, los virus, en particular virus Influenza, que no se propagaron en cultivos celulares obtenidos de suero, se propagan en la biomasa celular. Fue altamente inesperado que los virus que no se propagaron en cultivos celulares convencionales dieron origen a producción de virus eficaz con la biomasa celular.

La biomasa del método de la invención proporciona un sistema económico y fácil de preparar para la producción a gran escala de un cultivo celular. Además, el presente sistema permite el uso de un esquema de cultivo idéntico para una línea celular en cualquier momento ya que no se puede garantizar para la producción celular en condiciones que contienen suero. La biomasa proporcionada se puede usar en sistemas de fermentación a gran escala de al menos 500 litros. Debido a su flexibilidad, el sistema se puede adaptar a la producción de virus, antígeno de virus o productos recombinantes.

Además, si el presente sistema se usa para la producción de productos biológicos, tales como vacunas o productos farmacéuticos, se pueden reducir o eliminar las etapas de purificación para retirar contaminantes obtenidos del medio. Se conoce bien en la técnica, que los componentes de suero están unidos a proteínas, virus o antígenos de virus producidos en un cultivo celular. Mediante el uso de un medio sin componentes proteicos para preparar una biomasa celular, se pueden evitar las etapas de purificaciones que requieren mucho tiempo. Adicionalmente, los procesos realizados para inactivar agentes contaminantes potenciales, tales como BSE, virus de diarrea bovina o virus de la lengua azul, algunas veces son muy rigurosos y, por tanto, tienen efectos negativos sobre la actividad biológica del producto obtenido. La biomasa celular puede producir un producto biológico que está desprovisto de un agente contaminante obtenido del medio de cultivo. El producto biológico obtenido mediante el método de la invención es más fácil de purificar y más seguro con respecto a agentes patógenos potenciales obtenidos del medio de cultivo o aditivos del medio de cultivo.

La biomasa celular usada en el método de la presente invención representa el medio más económico para satisfacer los criterios de proporcionar un sistema de cultivo celular seguro y de calidad asegurada para la producción de productos biológicos seguros.

La presente descripción también proporciona un método para la producción de una biomasa celular que comprende las etapas de proporcionar una línea celular de riñón de mono original o cultivo celular primario y cultivar la línea celular o cultivo en un medio sin proteínas para preparar un banco celular maestro. La línea celular original se puede obtener de la Colección Americana de Cultivos Tipo (“ATCC”), OMS o cualquier instituto que proporcione líneas celulares aceptadas para la producción de productos biológicos que se usan para una aplicación a seres humanos. La línea celular original también puede ser una línea celular nueva que satisfaga todos los criterios establecidos por la OMS para producción a gran escala de productos biológicos. La línea celular original se cultiva en el medio sin proteínas sin la necesidad de adaptación adicional a ese medio. Se pueden realizar métodos de subcultivo de una manera similar a la que se usa con condiciones convencionales que contienen suero, con la excepción de que para las etapas de subcultivo se usa una proteasa obtenida de una fuente procariota, tal como pronasa, termolisina o subtilisina A. Por lo tanto, la biomasa celular de la invención es segura con respecto a los riesgos asociados con el uso de una proteasa eucariota, tal como tripsina.

Determinados virus requieren una etapa de activación para la propagación. Estos virus incluyen los de la familia orthomyxoviridae, tales como virus Influenza A, B y C, los de la familia paramyxoviridae, tales como virus de parainfluenza de Tipo 1, 2, 3 y 4 o virus de la Enfermedad de Newcastle y los de la familia reoviridae, por ejemplo, rotavirus de Tipos A, B y C. La activación de estos virus implica una reacción de escisión proteolítica.

Para el crecimiento de virus Influenza, la activación preferiblemente se conduce con una proteasa de una fuente procariota, tal como pronasa, termolisina o subtilisina A, en lugar de una proteasa obtenida de una fuente eucariota. El método también puede comprender la etapa de preparar un banco celular de trabajo a partir del banco celular maestro permitiendo el cultivo adicional en medio sin proteínas.

El método de la invención también puede incluir las etapas de proporcionar una biomasa celular como se ha descrito con detalle anteriormente, infectar la biomasa celular con un virus e incubar la biomasa infectada con ese virus en condiciones sin proteínas. Preferiblemente, la biomasa celular se obtiene a partir de células cultivadas durante generaciones en medios sin proteínas. Las células de riñón de mono adecuadas de la biomasa son células seleccionadas entre el grupo de VERO, CV-1, LLC-MK-2, preferiblemente las obtenidas a partir de una línea de células de riñón de mono verde africano, lo más preferible a partir de una línea de células VERO. La biomasa celular se infecta con el virus en condiciones convencionales y la biomasa celular infectada con ese virus se cultiva en condiciones convencionales, con la excepción de que se usa medio sin proteínas. El cultivo celular, la infección y la producción de virus se supervisan periódicamente. La supervisión puede ser mediante métodos automatizados o de otro tipo y los resultados de la supervisión se pueden usar para controlar el proceso de producción.

Infectando e incubando la biomasa celular con el virus, se obtiene un cultivo celular que comprende sobrenadante que contiene virus y/o una biomasa celular que comprende virus y antígeno de virus. Dependiendo de la naturaleza del virus usado, las partículas de virus producidas se encuentran en el sobrenadante del cultivo celular y/o están asociadas con la biomasa celular.

Los ejemplos de virus líticos incluyen virus Influenza. Los virus producidos y liberados en el medio de cultivo celular se separan de la biomasa celular mediante métodos convencionales, tales como centrifugación o ultrafiltración y se recogen.

Durante la infección y propagación no todas las partículas de virus producidas por las células se liberan en el sobrenadante. En lugar de eso, estas partículas todavía están asociadas con las células de la biomasa celular. Por lo tanto, el cultivo celular contiene partículas de virus en el sobrenadante y partículas de virus completas así como proteínas de virus asociadas con la biomasa celular. Para obtener un rendimiento de virus aumentado, las partículas de virus del sobrenadante se recolectan y el virus y/o antígeno de virus asociado con la biomasa celular se aísla. El virus observado en las células de la biomasa celular se libera desde las células por lisis. Las células se pueden lisar por métodos convencionales, tales como tratamiento de las células con un detergente, tratamiento con calor, sonicación, prensa francesa u otros métodos de lisis celular. Los virus liberados a partir de la célula se recolectan, se concentran y se purifican.

Los antígenos virales todavía asociados con la biomasa celular o con fragmentos celulares se pueden extraer de las células o fragmentos celulares mediante métodos químicos o mecánicos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen ultrasonicación o tratamiento con un detergente apropiado para liberar el antígeno de virus de las células o fragmentos de células, especialmente de la membrana. Después el antígeno de virus, incluyendo virus, aislado a partir de la biomasa celular se puede someter adicionalmente a una etapa de purificación que incluye separación en un gradiente de sacarosa, adsorción a una columna de cromatografía, lavado y elución del virus o antígeno de virus purificado. La columna de cromatografía usada se selecciona entre cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad o cromatografía de filtración por tamaño.

Adicionalmente, el método de la invención puede comprender la etapa de separar el virus de la biomasa celular, recolectar el virus del sobrenadante, purificar el virus y preparar una vacuna con el virus. El método también puede comprender la etapa de liberar virus intracelular a partir de las células de la biomasa celular, aislar y purificar el virus y preparar una vacuna del virus. Adicionalmente, la invención puede comprender las etapas de extraer un antígeno de virus asociado con las células o fragmentos celulares de la biomasa celular, separar el antígeno de virus de la biomasa celular, aislar el antígeno de virus, purificar el antígeno y preparar una vacuna con el antígeno.

El método proporcionado por la presente invención puede combinar una biomasa celular y un proceso de producción de producto, donde todas las etapas se realizan en condiciones sin proteínas con una accesibilidad aumentada de virus diferentes a la biomasa celular y un método mejorado para obtener virus y antígeno de virus a partir de la misma biomasa celular. Mediante este método, se obtienen rendimientos máximos de virus y de antígeno de virus empleando esta biomasa celular y este proceso de producción.

En una realización preferida, la biomasa celular se obtiene a partir de células VERO, CV-1 o LLC-MK2 y el virus es virus Influenza.

Los virus que se usan para la invención son aquellos de orthomyxoviridae, preferiblemente virus Influenza.

Los vectores virales recombinantes que comprenden un ácido nucleico extraño que se tiene que expresar bajo el control de un elemento transcripcional y traduccional también se pueden cultivar de acuerdo con la presente invención. El ácido nucleico extraño insertado en el vector viral puede codificar una proteína recombinante, tal como proteínas virales, preferiblemente antígenos. Los antígenos virales preferidos son los del VIH, tales como gp160 o gp120, los de HBV, tales como HBsAg, preS2 o preS1, los de HCV, los de parvovirus, los de HAV, los de TBEV, tales como prM/M o E, los de virus Influenza, tales como HA o NA.

En una realización preferida del método de la invención, la biomasa celular se obtiene a partir de células VERO, CV1 o LLC-MK2 y el virus es virus Influenza. El uso de una biomasa celular que se obtiene a partir de células cultivadas durante generaciones en condiciones sin proteínas no se ha descrito en la técnica anterior. Con la presente invención, se ha hecho posible la producción de todas las cepas de virus Influenza en líneas celulares como VERO, CV-1, LLC-MK2. Sorprendentemente, se ha observado que las cepas de Influenza se propagan en la biomasa celular de la invención, mientras que no se observó propagación o se observó propagación muy pequeña en cultivos celulares convencionales que contienen suero.

Como se ha descrito anteriormente, la infectividad del virus Influenza depende con frecuencia de una etapa de activación. La activación del virus Influenza es el resultado de la actividad de una proteasa celular que escinde la hemaglutinina de influenza (HA). Ya que se ha observado que varias cepas de Influenza se propagan en la biomasa celular de la presente invención pero no en cultivos celulares convencionales, la biomasa celular del método proporciona una proteasa activa que es responsable de la infectividad aumentada del virus Influenza y que no está disponible en cultivos celulares convencionales. Una proteasa activadora, se puede usar con la biomasa celular de acuerdo con la invención. La activación se puede conseguir mediante la adición de proteasas extrañas obtenidas a partir de fuentes procariotas, tales como subtilisina A, pronasa o termolisina o una proteasa que se produce mediante técnicas recombinantes.

Además, el método de la invención proporciona el uso de la proteasa en concentraciones mucho mayores que las toleradas habitualmente por células de cultivo, aumentando adicionalmente de ese modo el nivel de activación de HA. Este aumento en la infectividad se consigue mediante el uso de un “bucle de aumento”, mediante el cual partes de medio que contiene virus, células o ambos a partir de un fermentador celular que contiene células cultivadas e infectadas de acuerdo con la presente invención se retiran periódicamente o continuamente a un recipiente o a una columna que contiene una o más proteasas, tales como subtilisina A o pronasa. Después de un tiempo determinado de incubación, el medio retirado, las células o ambos se transfieren a un recipiente que contiene una sustancia que inhibe la actividad de proteasa y el medio se devuelve posteriormente al fermentador que contiene células. El aspecto de bucle de aumento de la invención también se puede adaptar para optimizar parámetros de crecimiento celular o rendimiento tal como para aumentar la producción de una proteína particular o virus.

De acuerdo con otro aspecto de la descripción, se proporciona un virus que está libre de un compuesto contaminante obtenido del medio de cultivo.

En otra realización preferida de la descripción, se proporciona un antígeno de virus que está libre de un compuesto contaminante obtenido del medio de cultivo. Estos compuestos contaminantes incluyen los obtenidos a partir de fuentes humanas o animales, tales como cerdos, vacas, ovejas, cabras o pollos (huevos) o una proteína que es un agente patógeno. La biomasa celular usada para la producción de virus se obtiene a partir de células que se cultivan en condiciones sin proteínas y que se someten a pases en cultivo y se subcultivan con una proteasa obtenida de una fuente procariota. Durante los procesos de infección y producción de virus, no se usan aditivos diferentes a los que se emplean durante el proceso de producción de biomasa. Este proceso, en este documento, asegura que el producto biológico obtenido del proceso de producción esté libre de cualquier compuesto contaminante obtenido de fuentes humanas o animales, tales como cerdos, vacas, ovejas, cabras o pollos (huevos) o una proteína que es un agente patógeno. De acuerdo con otro aspecto de la descripción, se proporciona una vacuna de virus que comprende un virus o un antígeno de virus que está libre de cualquier compuesto contaminante obtenido de fuentes humanas o animales, tales como cerdos, vacas, ovejas, cabras o pollos (huevos). Este virus puede ser un virus atenuado o puede estar inactivado. El antígeno viral se usa para la preparación de una vacuna para el tratamiento y prevención de infecciones de virus. Los antígenos de virus preferidos para la preparación de vacuna son los obtenidos a partir de virus Influenza.

La presente invención también permite control de las variantes propagadas en última instancia. Por ejemplo, el virus de la vacuna de Influenza, como se produce comúnmente en huevos de pollo embrionados, no replica completamente el virus original tomado a partir del paciente infectado. La producción de virus en huevos no sólo permite la acumulación de mutaciones múltiples durante la propagación del virus, sino que también selecciona las variantes específicas de huevo que podrían no surgir nunca en una población de mamíferos. Esta es una razón fundamental de la poca eficacia de algunas vacunas de virus Influenza.

La presente descripción proporciona métodos eficaces para transferir cepas de virus Influenza directamente desde el mamífero infectado hasta un cultivo de células de vertebrado y la propagación de alto rendimiento del virus mientras elimina las desventajas de procedimientos realizados en huevos de pollo embrionados. También se elimina el riesgo de seleccionar variantes específicas de huevo que no contienen las antigenicidades apropiadas para las cepas de virus de una epidemia de Influenza actual así como los riesgos relacionados con contaminantes de material de huevo en preparaciones de vacunas.

Un aspecto importante del método de la presente invención es su flexibilidad con respecto a las cepas de virus que se pueden producir a alto rendimiento. En particular, la presente invención proporciona métodos para la producción de cualquier tipo de virus Influenza en rendimientos altos desconocidos hasta este momento. El presente método es útil con respecto a cualquier cepa de Influenza que ya exista o una cepa de influenza que pueda surgir en el futuro. El método proporcionado por la presente invención se puede adaptar a cualquier requerimiento posible de un virus Influenza.

En una realización preferida, el método proporcionado por la presente invención comprende la extracción periódica o continua de “partes de tratamiento” del medio de cultivo que contiene virus del recipiente de cultivo en un “bucle de aumento” y la devolución posterior de las partes de tratamiento al recipiente de cultivo. En el bucle de aumento, la parte de tratamiento se somete a exposición a una o más sustancias que aumentan la infectividad del virus. El término “sustancias” se refiere a proteasas de origen natural o sintético, que incluyen homólogos, análogos, muteínas, miméticos, proenzimas y fragmentos de proteasas. Por ejemplo, concentraciones altas de proteasas que aumentan la activación del virus, tales como tripsina o subtilisina A, se pueden introducir en la parte de tratamiento. Después las proteasas se pueden neutralizar, inhibir o retirar y la parte de tratamiento devuelta al recipiente de cultivo. Por tanto, los efectos positivos de las proteasas sobre los virus se producen mientras que los efectos negativos de las proteasas sobre el cultivo se reducen o eliminan. Como una consecuencia, el método de la presente invención permite la producción de alto rendimiento de virus que se puede aumentar de escala fácilmente hasta índices de producción a gran escala. Hasta ahora, los métodos que empleaban proteasas para activación viral no eran aplicables para la producción a gran escala de virus, ya que la extracción de proteasas mediante lavados repetidos es prácticamente imposible de realizar con fermentadores grandes.

El aspecto de “bucle de aumento” del método de la presente invención permite el uso de unas enzimas proteolíticas en concentraciones mucho mayores que las toleradas habitualmente por células en cultivo, aumentando de ese modo el nivel de activación viral, por ejemplo la escisión de HA, mientras elimina sustancialmente los efectos tóxicos de proteasas sobre las células. Este aspecto provechoso se consigue mediante el uso de un sistema, mediante el cual una parte del medio que contiene virus a partir de un recipiente de fermentación celular se retira hasta un segundo emplazamiento tal como una columna, tubo, tubería, colector de distribución, matraz de reacción u otro tipo de segundo recipiente y se pone en contacto en el mismo con una proteasa o sustancias que aumentan la activación del virus. Después de un período de incubación suficiente para activar el virus, la parte retirada se transfiere a un tercer emplazamiento tal como una columna, tubo, tubería, colector de distribución, matraz de reacción u otro tipo de segundo recipiente y se pone en contacto en el mismo con inhibidor de proteasa o compuestos que inhiben o atenúan los efectos tóxicos celulares de las proteasas o sustancias que aumentan la activación del virus. Después de un período de incubación suficiente para inhibir o atenuar los efectos tóxicos celulares de las proteasas o sustancias que aumentan la activación del virus, la parte retirada se devuelve al recipiente de fermentación celular. La presente descripción también incluye el aspecto de alterar la sensibilidad de una cepa de virus a tripsina u otras enzimas proteolíticas para asegurar la producción eficaz de nuevas cepas de virus que no se pueden activar mediante metodologías convencionales. Los conceptos específicos subyacentes en la invención reivindicada no se han reconocido antes de la presente invención. En el aspecto de bucle de aumento del método de la presente invención, se pueden utilizar, de hecho, concentraciones altas de enzimas exógenas para aumentar la activación de virus en líneas celulares de vertebrado sin proteínas así como en cultivos de CEC. Específicamente, a continuación de la incubación de medios que contienen células infectadas y virus, la proteasa u otras enzimas se neutralizan o retiran en intervalos mediante inhibidores de proteasa o mediante inhibidores de la enzima usada tales como anticuerpos inmovilizados que se pueden unir a una proteasa. Este aspecto de la invención permite un grado mayor de activación en comparación con otros métodos que emplean concentraciones más bajas de tripsina y, debido a que el presente método proporciona que la tripsina se neutralice o retire en intervalos regulares, permite la producción y recolección continua del virus en lugar de la producción por lotes y una recolección única. Aún más importante, la presente invención proporciona un método que se puede aumentar de escala fácilmente hasta fermentación a gran escala para la producción de alto rendimiento de Influenza y otros virus. Para permitir la producción de alto rendimiento de todos los tipos de virus, incluyendo todas las cepas de virus Influenza, la presente invención proporciona un método de producción de virus eficaz en células de riñón de mono. Habiéndose diseñado principalmente para la producción de alto rendimiento de virus Influenza, el método de la presente invención se puede usar para la producción de alto rendimiento de cualquier virus que requiera sustancias, tales como proteasas, que son dañinas para hospedadores celulares. Los ejemplos de virus que requieren una etapa de activación son los de la familia orthomyxoviridae, tales como virus Influenza A, B y C, los de la familia paramyxoviridae, tales como virus de parainfluenza de Tipo 1, 2, 3 y 4 o virus de la Enfermedad de Newcastle y los de la familia reoviridae, por ejemplo, rotavirus de Tipos A, B y C. La activación de estos virus implica proteólisis. Para aumento adicional de los niveles de producción de virus, los inventores proporcionan el método opcional de tratar el cultivo de células que producen virus con una o más proteasas, que escinden hemaglutinina de Influenza volviendo, de ese modo, al virus recién producido infeccioso.

De acuerdo con un aspecto del método de la invención, la escisión de hemaglutinina de influenza mediante una proteasa se separa físicamente del cultivo primario de las células hospedadoras y la infección de las células hospedadoras mediante el virus. Esto permite concentraciones mucho más altas de proteasa que las descritas en la técnica anterior. En la técnica anterior donde la proteasa era parte del medio en el cultivo primario, las concentraciones de proteasa se tenían que mantener bajas para minimizar los efectos tóxicos sobre los procesos celulares e índices de crecimiento de células hospedadoras. Como resultado, la activación de virus Influenza mediante escisión proteolítica de hemaglutinina no era completa y partículas de virus no infecciosas se mantenían en el cultivo. Los procedimientos de estudio de técnica anterior para tratar este problema implican cultivar virus Influenza en huevos de pollo embrionados. Sin embargo, esta técnica tiene muchas desventajas ya que existen muchas etapas que requieren mucho trabajo que son sensibles a contaminación. En el método de la invención, después de la incubación de células hospedadoras con virus durante un período de tiempo que permita al menos una ronda de replicación de virus, se añaden una o más proteasas. De acuerdo con un aspecto de la invención, la activación de proteasa del virus ocurre en un emplazamiento retirado a partir del recipiente de cultivo primario, empleando un “recipiente de activación” que puede ser una columna, tubería, tubo, serpentín u otro recipiente que facilite el contacto del virus con la proteasa activadora, mientras elimina o minimiza los efectos tóxicos celulares de la proteasa. Por consiguiente, se proporciona un método que permite el uso de proteasas, tales como subtilisina A, en concentraciones mucho mayores que las toleradas normalmente por células de cultivo para aumentar adicionalmente de ese modo el nivel de activación viral, tal como escisión de HA de Influenza A continuación de la incubación del medio que contiene células infectadas, virus y una o más proteasas en el recipiente de activación del bucle, las proteasas se inactivan o se retiran mediante inhibidores de proteasas o similares. De acuerdo con un aspecto, esta etapa de neutralización ocurre en un emplazamiento que está separado tanto del recipiente de cultivo primario como del recipiente de activación. Después de la inactivación eficaz de las proteasas, los virus activados se pueden reciclar de nuevo hacia el proceso de cultivo sin una interferencia negativa de las proteasas con el crecimiento de las células hospedadoras. Debido a estos aspectos, la presente invención proporciona un método provechoso y eficaz para la producción y recolección continua de virus.

El aspecto de bucle de aumento del método de la presente invención se puede adaptar a la producción de cualquier tipo de virus y cualquier tipo de producto celular. El sistema de bucle de aumento permite la optimización independiente de parámetros de índices de crecimiento y síntesis celular. Por lo tanto, el sistema de bucle de aumento se puede usar en todos los casos en los que los índices de síntesis eficaces de un virus u otro producto celular, por ejemplo, una proteína recombinante, requieran una etapa de activación que de otra manera sería tóxica

o dañina para procesos celulares del cultivo primario.

Debido a la separación física de las etapas de fermentación, activación e inactivación, las etapas de activación e inactivación pueden ocurrir en condiciones químicas o físicas que de otra manera no tolerarían las células en un sistema de cultivo celular convencional. Como consecuencia, las etapas de activación del método de la presente invención son más eficaces y aumentan enormemente las velocidades de producción. Las condiciones que las células en un sistema de cultivo celular convencional no toleran pueden ser de naturaleza química o física, es decir, sustancias que se requieren en concentraciones que son dañinas para células así como condiciones físicas tales como temperaturas o presiones que son dañinas para células cuando se muestran durante un período de tiempo determinado.

Los virus Influenza producidos en rendimientos altos de acuerdo con el método de la presente invención pueden ser de origen diverso. Los mismos pueden ser virus Influenza de tipo silvestre que se aíslan directamente a partir de frotis de garganta de mamíferos infectados, preferiblemente seres humanos. Por ejemplo, de acuerdo con un aspecto del presente método, se diluye un frotis de garganta a partir de un ser humano infectado con cualquier cepa de virus Influenza y se usa para inocular directamente las células de vertebrado sin proteínas proporcionadas por la presente invención.

Los virus Influenza que se pueden producir en rendimiento alto de acuerdo con el método de la presente invención pueden además ser virus Influenza de tipo silvestre que se han pasado previamente a través de células hospedadoras antes de la inoculación de la célula de vertebrado sin proteínas. Los pases pueden haber ocurrido en huevos de pollo embrionados o en células de cultivo de vertebrado, por ejemplo células VERO, MDCK, MDBK, LLC-MK2 o CV-1, en líneas primarias de células de embriones de pollo o en agregados celulares que comprenden una pluralidad de tipos celulares, por ejemplo, de embriones de vertebrado.

Los virus Influenza pueden además ser virus Influenza reordenantes o virus Influenza donadores, tales como virus con fenotipos de alto rendimiento o de virulencia atenuada. Los virus de virulencia atenuada incluyen cepas de virus Influenza termosensibles o adaptados al frío.

En una realización específica del método de la presente invención, las células de cultivo de riñón de mono sin proteínas son células VERO. Las células VERO son provechosas en que las mismas están entre las pocas líneas celulares que están registradas para la producción de vacunas para uso en medicina humana. Por tanto, la aprobación adicional para el uso de células VERO para producir vacunas para usarse para inmunizar seres humanos no es necesaria. Sin embargo, hasta la presente invención, los intentos de uso de células VERO para la producción de virus Influenza han producido rendimientos inaceptablemente bajos o han requerido el uso de medios que contienen proteínas y pases múltiples.

En una realización, el virus que se propaga para producir finalmente una vacuna de virus, es un ortomixovirus reordenante, preferiblemente un virus Influenza. El reordenamiento es una característica específica de los virus segmentados, por ejemplo virus Influenza. La infección doble de una célula hospedadora, es decir, infección de la célula hospedadora con al menos dos cepas de virus segmentados tales como virus Influenza, conduce a la producción de una mezcla de segmentos obtenidos a partir de dos virus infectantes en una única célula hospedadora. Durante el ensamblaje del virus, todas las combinaciones de estos segmentos son teóricamente posibles.

Por lo tanto, algunos de los descendientes del virus son idénticos a uno de los virus originalmente infectantes y otros descendientes son nuevas combinaciones, es decir, “reordenantes”. Los reordenantes deseados se pueden seleccionar específicamente para las actividades preferidas suprimiendo o eliminando virus con propiedades indeseadas. La supresión o eliminación se puede conseguir con los anticuerpos apropiados dirigidos contra los antígenos indeseados. Existen métodos de técnica anterior para obtener reordenantes. Véase Kilbourne, E.D. in Plotkin S.A., y Mortimer,

E.A. eds., Vaccines, 1994. En resumen, se usan un virus Influenza donador y una cepa de virus Influenza para los cuales se tiene que preparar una vacuna para infectar simultáneamente el saco alantoideo del embrión de pollo. La técnica, como se ha descrito en la técnica anterior, emplea virus donadores que se han pasado en huevos varias veces. Más importante, de acuerdo con la técnica anterior, el proceso que conduce al reordenamiento ocurre en el huevo. Esto tiene la desventaja de seleccionar variantes de virus específicas para huevo. Las variantes de virus específicas para huevo no representan necesariamente completamente la antigenicidad de las variantes de Influenza que se propagan en la población de ser humano a ser humano. Por consiguiente, la eficacia de inmunidad de vacunas desarrolladas con virus reordenantes que se seleccionaron para variantes de virus específicas para huevo se puede reducir.

Los problemas asociados con la técnica anterior se pueden evitar de acuerdo con la presente invención. De acuerdo con la presente descripción, un virus donador es un virus que preferiblemente proporciona propiedades al reordenante diferentes a la antigenicidad de superficie exterior. Las propiedades del donador pueden ser aquellas que se refieren a un fenotipo de alto rendimiento, un fenotipo de virulencia atenuada u otros fenotipos deseados. Por consiguiente, un virus donador proporciona propiedades deseadas al virus reordenante sin interferir negativamente con la capacidad del virus reordenante de simular o mimetizar las propiedades antigénicas exteriores del virus Influenza para el que se desea una vacuna.

Con anticuerpos supresores para los antígenos de superficie exterior del virus donador, se seleccionan reordenantes en los que las propiedades antigénicas del virus deseado están acopladas con las propiedades deseadas del virus donador. Por ejemplo, un “virus Influenza donador de alto rendimiento” es uno de los virus que se emplea preferiblemente para producir un virus Influenza reordenante. La presente descripción proporciona un método para la producción de un virus Influenza donador de alto rendimiento de este tipo. Específicamente, se proporciona un cultivo de células de riñón de mono, por ejemplo células VERO, CV-1, LLC-MK2, donde el cultivo celular se ha adaptado a condiciones de cultivo sin proteínas durante al menos una generación, preferiblemente durante al menos seis generaciones de células, más preferiblemente durante al menos doce generaciones de células, e incluso más preferiblemente durante al menos dieciocho generaciones de células y aún más preferiblemente durante al menos veinticuatro generaciones de células antes de la infección con un virus. Este cultivo se infecta con virus Influenza de tipo silvestre.

El virus Influenza de tipo silvestre se puede aislar directamente a partir de un mamífero infectado con virus Influenza, preferiblemente un ser humano. La presente descripción proporciona el aislamiento directo de un virus Influenza de tipo silvestre por medio de métodos que comprenden, por ejemplo, las etapas de tomar y diluir un frotis de garganta del mamífero infectado e infectar directamente un cultivo sin proteínas de células de vertebrado. El virus Influenza de tipo silvestre se puede pasar adicionalmente en huevos de pollo embrionados o células de cultivo de mamífero, por ejemplo en células VERO, células MDCK o en agregados celulares que comprendan una pluralidad de tipos celulares, por ejemplo de embriones de vertebrado antes de la propagación en un cultivo de células de vertebrado sin proteínas de acuerdo con el método de la presente invención.

Independientemente de su origen, el virus de tipo silvestre después se incuba con el cultivo de células de riñón de mono. Se pueden seleccionar las células de las cepas de virus Influenza de mejor crecimiento. Esta cepa de Influenza de mejor crecimiento se aísla y purifica de acuerdo con métodos conocidos en la técnica y se vuelve la cepa parental o “virus donador Influenza de alto rendimiento” de todos los tipos de virus Influenza reordenantes ya que se proporcionan mediante aspectos adicionales de acuerdo con la presente invención.

Un aspecto sobresaliente del método de la presente invención es que el virus Influenza donador de alto rendimiento está bien adaptado para la amplificación de alto rendimiento en células de cultivo de riñón de mono. En una realización específica, el virus Influenza donador de alto rendimiento está perfectamente adaptado para la amplificación de alto rendimiento en células VERO.

En una realización particular, por ejemplo, la presente invención proporciona un virus Influenza donador de alto rendimiento que está perfectamente adaptado a células de riñón de mono y que nunca ha tenido ningún contacto con material de huevo. Por ejemplo, como muestra el Ejemplo 11, una cepa de virus Influenza donador de alto rendimiento es A/Orth/17/95 (H1N1). A/Orth/17/95 (H1N1) es un virus Influenza donador de alto rendimiento que se ha pasado directamente a partir de un frotis de garganta de un paciente humano infectado con una cepa de virus Influenza de la temporada 1994/1995 en células VERO cultivadas en un medio sin proteínas. Está perfectamente adaptado a células hospedadoras VERO y da una producción de alto rendimiento de virus y antígenos de virus en células VERO. Significativamente, la cepa A/Orth/17/95 (H1N1) nunca ha tenido contacto con material de huevo de pollo, es decir, la cepa está 100% libre de material de huevo. Una ventaja adicional de cepas contempladas en este documento se refiere al hecho de que las mismas se han seleccionado para amplificación de alto rendimiento en una línea de células de mamífero y no para adaptabilidad específica a huevo o específica a embriones de huevo.

A fin de aumentar anticuerpos que se unen a los antígenos de superficie exterior del virus Influenza donador de alto rendimiento, la presente descripción proporciona además un método que comprende aislar los antígenos de superficie exterior del virus Influenza donador de alto rendimiento y la administración de los antígenos aislados a un mamífero. El aislamiento de los antígenos de superficie exterior de virus Influenza emplea escisión de los antígenos de la envuelta del virus mediante bromelina. Los antígenos de superficie exterior son las glicoproteínas hemaglutinina y neuraminidasa de un virus Influenza donador de alto rendimiento.

La presente descripción proporciona además los anticuerpos que se unen a glicoproteínas de superficie exterior de un virus Influenza donador de alto rendimiento. En una realización específica, los anticuerpos se unen a las glicoproteínas de superficie exterior, hemaglutinina y neuraminidasa del virus Influenza donador de alto rendimiento A/Orth/17/95 (H1N1). Un aspecto específico de la presente descripción es la producción de Ortomixovirus reordenantes, preferiblemente virus Influenza.

Un procedimiento de estudio para producir reordenantes de acuerdo con la presente invención es el siguiente: en primer lugar, se proporciona un cultivo de células de riñón de mono, por ejemplo células VERO, CV-1, LLC-MK2, que se han adaptado a condiciones de cultivo sin proteínas durante al menos una generación, preferiblemente durante al menos seis generaciones de células, más preferiblemente durante al menos doce generaciones de células, aún más preferiblemente durante al menos dieciocho generaciones de células y todavía más preferiblemente durante al menos veinticuatro generaciones de células antes de infección con un virus. Este cultivo se coinfecta con dos cepas de virus Influenza diferentes, cepas de virus Influenza (I) y (II).

Para propósitos de explicación, la cepa (II) de virus Influenza es una cepa de virus Influenza designada para producción de vacuna. Las glicoproteínas de superficie exterior de la cepa de virus (II) son los antígenos que se desea que estén contenidos en una vacuna. Típicamente, la cepa de virus Influenza (II) puede variar de temporada en temporada. La OMS determina qué cepa de Influenza se designa para la producción de vacunas para cada temporada. Ya que en la vacuna designada tienen que estar presentes los antígenos de superficie exterior de un virus que causa una epidemia de Influenza actual, este virus no lo puede elegir libremente el fabricante de una vacuna.

Típicamente, una cepa de virus Influenza de tipo silvestre resiste la producción de alto rendimiento. Con frecuencia, un fabricante prefiere emplear virus con virulencia atenuada para uso como vacuna viral viva. Por consiguiente, se puede emplear un virus Influenza donador que muestra virulencia atenuada, como una alternativa o además del alto rendimiento, para preparar el virus reordenante.

Por consiguiente, la presente descripción proporciona un procedimiento de estudio para obtener virus con la capacidad de alto rendimiento y/o virulencia atenuada mientras que posee las antigenicidades deseadas del virus frente al que se tiene que desarrollar la vacuna. El procedimiento de estudio produce virus reordenantes que están libres de antigenicidades y contaminantes indeseados que de otra manera se originarían a partir de la producción en huevos o embriones de pollo.

Para la producción de reordenantes de virus Influenza, se proporciona un cultivo sin proteínas de células de vertebrado de acuerdo con la presente descripción. Después de coinfección de este cultivo celular con cepas de virus Influenza (I) y (II), el cultivo se incuba para propagar cada una de las dos cepas de virus Influenza diferentes y todos los tipos de reordenantes de estos virus. Después, se selecciona un virus Influenza reordenante deseado. Para la selección de la cepa de virus Influenza reordenante deseada, se emplean anticuerpos de selección específicos. Véase Kilbourne ED en Plotkin SA y Mortimer EA eds. Vaccines, (1994).

Los anticuerpos de selección específicos se dirigen hacia las glicoproteínas de superficie exterior del virus donador, típicamente, hemaglutinina y neuraminidasa. Los anticuerpos de selección específicos se incorporan en el medio durante varios ciclos de cultivo. Mediante la unión a las glicoproteínas de superficie exterior del virus donador, que estén en un descendiente idéntico del virus donador original o en un reordenante que porta hemaglutinina y/o neuraminidasa del virus donador, estos anticuerpos suprimen la amplificación de las cepas de virus no deseadas. Sólo los virus que portan los antígenos de superficie exterior del virus Influenza designado para producción de vacunas pueden, por lo tanto, proliferar. Tras varios ciclos de cultivo, que incluyen los anticuerpos supresores, los reordenantes deseados se enriquecen profundamente y se pueden aislar. Los reordenantes aislados después se pueden propagar de acuerdo con la presente invención y se prepararán vacunas a partir del reordenante.

En una realización, la cepa de virus Influenza (I) que se usa para producir un virus Influenza reordenante es un virus Influenza donador de alto rendimiento. El método para la producción de un donador de alto rendimiento de este tipo así como el mismo virus Influenza donador de alto rendimiento se proporcionan mediante la presente descripción. El fenotipo de alto rendimiento del reordenante se selecciona efectuando pases múltiples. El reordenante seleccionado porta los segmentos de genes que codifican las glicoproteínas de superficie exterior proporcionadas por la cepa de virus (II) y todos los segmentos de genes responsables del fenotipo de alto rendimiento de la cepa de virus (I). Los segmentos que no han estado bajo presión selectiva pueden ser de cualquiera de las dos cepas de virus.

En otra realización, la cepa (I) de virus Influenza que se usa para producir un virus Influenza reordenante es un virus Influenza con virulencia atenuada. La producción de virus Influenza de virulencia atenuada se conoce en la técnica. Para la producción de un virus reordenante que porta los antígenos de superficie exterior de una cepa de virus Influenza designada para la producción de vacunas y el fenotipo atenuado de un virus de donador, es deseable una “cepa maestra atenuada”. Una cepa maestra atenuada es una que se ha ensayado y ha demostrado estar atenuada en seres humanos y que puede transmitir estas características atenuadas a reordenantes a través de la donación de segmentos de genes diferentes a los que codifican las glicoproteínas de superficie exterior. Las cepas maestras atenuadas que se pueden usar como cepas de virus Influenza (I) preferiblemente son mutantes de virus adaptados al frío o termosensibles.

El reordenante seleccionado porta los segmentos de genes que codifican las glicoproteínas de superficie exterior proporcionadas por la cepa de virus (II) y los segmentos de genes que contienen los determinantes del fenotipo atenuado de cepa de virus (I). Los segmentos que no están asociados con cualquiera de estas características se pueden obtener a partir de cepa de virus (I) o cepa de virus (II).

Los virus Influenza reordenantes que portan los antígenos de superficie exterior de una cepa de virus Influenza designada para producción de vacuna y el fenotipo atenuado de un virus Influenza donador se pueden usar para producir una vacuna de virus Influenza vivo, es decir, virus de vacuna que no se tienen que inactivar antes de la administración a un ser humano u otro mamífero.

La presente descripción proporciona un virus Influenza reordenante, que porta los antígenos de superficie exterior de un virus Influenza designado para producción de vacuna y muestra un fenotipo de alto rendimiento o atenuado obtenido a partir de la cepa de virus donadora apropiada. Todos los virus reordenantes se pueden propagar mediante el método de la presente invención.

En una realización específica de un virus reordenante, el virus es un virus Influenza que porta la hemaglutinina y la neuraminidasa de un virus designado para producción de vacuna y el fenotipo de alto rendimiento de un virus donador de alto rendimiento. Por ejemplo, una realización específica de este aspecto se consigue cuando el virus donador de alto rendimiento es A/Orth/17/95 (H1N1).

En otra realización, el virus reordenante es un virus Influenza que porta tanto la hemaglutinina como la neuraminidasa de un virus designado para producción de vacuna así como el fenotipo atenuado de una cepa de virus maestra atenuada. En una realización más específica de este aspecto, la cepa de virus maestra atenuada es una cepa de virus Influenza mutante termosensible. En otra realización más específica de este aspecto, la cepa de virus maestra atenuada es una cepa de virus Influenza adaptada al frío. Los virus Influenza reordenantes de este aspecto se pueden usar para producir vacunas de virus vivos.

En otra realización preferida, un virus que se obtiene directamente a partir de un ser humano infectado u otro mamífero, se cultiva en un cultivo de células de vertebrado de acuerdo con la presente invención, es decir, un cultivo que se ha preadaptado a condiciones de cultivo sin proteínas. En una realización específica adicional, el virus que se obtiene directamente a partir de un mamífero infectado, preferiblemente un ser humano, es un virus Influenza que se toma directamente a partir del mamífero infectado y se pone en contacto con un cultivo de células de riñón de mono de acuerdo con el método de la presente invención, es decir, un cultivo que se ha preadaptado a condiciones de cultivo sin proteínas.

Si se obtiene un virus de tipo Influenza a partir de un mamífero infectado recientemente, probablemente un virus de este tipo sea la causa de una epidemia actual y, por tanto, será una cepa de virus que se designe para producción de vacunas.

Se ha descrito que subpoblaciones seleccionadas de huevos de pollo de virus Influenza son antigénicamente diferentes de virus de la misma fuente desarrollados en cultivos de células de mamífero (Schild et al., 1983. Nature

303: 706-709). Empleando cultivos de células de mamífero, la producción de una cepa de virus Influenza obtenida a partir de un mamífero infectado recientemente de acuerdo con el método descrito en la presente invención conduce a una descendencia de virus Influenza homogénea que presenta propiedades antigénicas idénticas o altamente similares al virus Influenza que se toma directamente del mamífero infectado. Por tanto, el método de la presente invención proporciona un método que elimina la selección de variantes de células hospedadoras mientras que continúa proporcionando la retención de las propiedades antigénicas originales del virus, aún después de pases múltiples.

Durante el proceso de producción, puede ser deseable adaptar el virus objeto a una célula hospedadora específica. La adaptación se puede conseguir alterando la capacidad de escisión de la hemaglutinina (HA) del virus adaptado. Las alteraciones en la capacidad de escisión de la HA de una cepa de virus particular se puede generar mediante técnicas conocidas de mutagénesis dirigida a sitio y PCR. Empleando estas técnicas en el método de la presente invención, se puede modificar prácticamente cualquier cepa de virus Influenza para que sea sensible a activación enzimática. Esto se puede realizar a la vez que se mantiene el perfil inmune nativo de la hemaglutinina. Por tanto, la metodología de la presente invención permite la producción a gran escala de todos los tipos de virus Influenza en un título alto.

De acuerdo con un aspecto, el virus Influenza se modifica para crear un sitio de escisión modificado y preferiblemente más eficaz, en la hemaglutinina. Un sitio de escisión modulado de este tipo preferiblemente es KKRKKR o similar, es decir, lisina, lisina, arginina, lisina, lisina, arginina, que son aminoácidos básicos. El sitio de escisión modulado se diseña para reemplazar el sitio de escisión de hemaglutinina de origen natural de cualquier tipo de virus Influenza. El sitio de escisión preferido (o “maestro”) KKRKKR, se diseñó de acuerdo con la secuencia de consenso para reconocimiento de proteasa, R-X-K/R-R como se ha descrito por Vet et al., Virology, 188: 408-13 (1992).

Por tanto, la presente descripción comprende el aspecto provechoso de alterar la sensibilidad de una cepa de virus a una proteasa, tal como tripsina, en el caso de que se origine una cepa que no se pueda activar mediante otras metodologías. En el caso de Influenza, existen varias propiedades estructurales de la HA que determinan la capacidad de escisión diferencial, pero el factor clave es la secuencia de aminoácidos en el sitio de escisión. Se ha demostrado que la sensibilidad de hemaglutinina a la escisión no es una característica fija de la molécula. La presente descripción proporciona provechosamente la alteración de hemaglutinina para asegurar su sensibilidad a escisión mediante proteasas disponibles. Específicamente, la hemaglutinina se puede alterar para adaptar virus objeto a una célula hospedadora nueva. La capacidad de escisión de la hemaglutinina del virus adaptado en un tipo de célula hospedadora nuevo se puede obtener, en ocasiones, mediante sustitución de un aminoácido único próximo al sitio de escisión. Por tanto, las alteraciones en la capacidad de escisión de la HA de una cepa de virus particular se pueden generar mediante técnicas conocidas de mutagénesis dirigida a sitio y PCR. Empleando estas técnicas en la presente invención, se puede modificar prácticamente cualquier cepa de virus Influenza para que sea sensible a activación enzimática. Esto se puede realizar a la vez que se mantiene el perfil inmune nativo de la hemaglutinina. Por tanto, la metodología de la presente invención permite la producción a gran escala de todos los tipos de virus Influenza en títulos altos. Hasta la presente invención, sólo era posible cultivar rendimientos altos de virus Influenza cuando las mismas cepas de virus proporcionaban un sitio de escisión eficaz. La modificación del sitio de escisión de hemaglutinina como se proporciona mediante la presente descripción permite el desarrollo en cultivo de células de vertebrado de cualquier tipo de virus Influenza en rendimientos altos. Como consecuencia, se pueden preparar vacunas que son eficaces frente a todas las cepas de Influenza presentes en una población determinada en un momento determinado. De acuerdo con un aspecto, la producción de alto rendimiento de virus Influenza se consigue mediante un aumento en el nivel de activación de HA, es decir, activación del virus y el uso de un sistema de bucle de aumento, mediante el cual se retira continuamente medio que contiene virus a partir de un fermentador celular que contiene células cultivadas e infectadas de acuerdo con la presente invención hasta un recipiente que contiene una o más proteasas, tales como tripsina. Después de un tiempo de incubación determinado, el medio se transfiere a un recipiente que contiene una sustancia que inhibe o retira la actividad de proteasa y, finalmente, el medio se devuelve posteriormente al fermentador que contiene células.

En una realización, la presente invención proporciona un método para producir virus Influenza que se caracteriza por elementos altamente provechosos. El presente método, entre otros, permite la producción de alto rendimiento de virus Influenza, permite el uso de concentraciones de proteasas mucho mayores que en métodos anteriores y, por consiguiente, la activación eficaz de virus, incluyendo todas las cepas de virus Influenza. Además, debido a la flexibilidad del presente método, su aspecto de bucle de aumento permite la adaptación fácil de condiciones de producción a cualquier serotipo de virus Influenza y otros virus.

Una ventaja adicional se observa en los aspectos que se refieren a la modificación del sitio de escisión de una proteína implicada en la activación, tal como hemaglutinina de Influenza, para permitir de ese modo aumentos sustanciales en el rendimiento de virus que con métodos convencionales se pueden cultivar sólo a rendimiento bajo. Las ventajas adicionales del método actualmente reivindicado se refieren a su producción resultante de virus Influenza que están sustancialmente libres de proteínas de huevo. Además, el presente método de producción de virus Influenza da un título de virus mucho más alto cuando se compara con otros métodos de cultivo celular. También, la presente invención proporciona un método que permite el cultivo de todas las cepas de virus Influenza humanas ensayadas hasta niveles que se acercan a los obtenidos en el huevo embrionado sin las desventajas de usar el huevo embrionado. Finalmente, el método permite el aumento de escala de la producción de virus a fermentadores de gran escala, permitiendo de ese modo la consecución de eficacias de producción elevadas.

Las ventajas de la presente invención se ilustran en los siguientes ejemplos. Los ejemplos son ilustrativos de la invención pero no limitan su alcance. En los ejemplos y tablas más adelante, B/Massachusetts se refiere a B/Massachusetts/71; B/Panama se refiere a B/Panama/45/90; B/Yamagata se refiere a B/Yamagata/16/88; Brazil se refiere a A/Brazil/11/78 (H1N1); California se refiere a A/California/10/78 (H1N1); Singapore 6 se refiere a A/Singapore/6/86 (H1N1); Taiwan se refiere a A/Taiwan/1/86 (H1N1); Texas 36 se refiere a A/Texas/36/91 (H1N1); USSR se refiere a A/USSR/90/77 (H1N1); A2 Singapore se refiere a A/Singapore/1/57 (H2N2); Beijing se refiere a A/Beijing/353/89 (H3N2); Guizho se refiere a A/Guizho/54/89 (H3N2); Hongkong se refiere a A/Hongkong/1/68 (H3N2); Hongkong 5 se refiere a A/Hongkong/5/83 (H3N2); Shanghai 16 se refiere a A/Shanghai/16/89 (H3N2); Texas se refiere a A/Texas/1/77 (H3N2) y Victoria se refiere a A/Victoria/3/75 (H3N2).

Ejemplo de Referencia A: Títulos de hemaglutinina obtenidos a partir de diversas cepas de Influenza producidas por cultivo en huevos embrionados y con agitación centrífuga con o sin proteasas

Las cepas de Influenza enumeradas en la Tabla 1 se usaron para infección de huevos de pollo embrionados o el cultivo con agitación centrífuga de CEC.

Los agregados de cultivo con agitación centrífuga de CEC se produjeron disgregando mecánicamente embriones aislados de huevos de pollo como se describe en el documento WO 91/09937. Se requieren dos huevos embrionados para generar 100 ml de cultivo de biomasa. Se infectaron 100 ml de cultivo con agitación centrífuga de CEC con 1 ml de virus Influenza que contenía líquido alantoideo. La adición de la proteasa se realizó inmediatamente después de la infección. Se añadió Tripsina (Seromed) o Subtilisina A (Fa. Novo) al medio en una concentración de 20 mU/ml y 30 !g/ml, respectivamente. El cultivo con agitación centrífuga de CEC se incubó durante 3-4 días con extracción de la mitad del volumen de medio (50 ml) cada día. Se añadió medio fresco con o sin proteasa hasta un volumen final de 100 ml de cultivo. Después de 4 días de incubación y recolección diaria de medio que contenía virus, el medio de cultivo celular combinado se recogió y se determinó el título de HA. El título de HA se determinó como se ha descrito por Hirst, “The Agglutination of Red Cells by Allantoic Fluid of Chick Embryos Infected with Influenza Virus”, Science, 94: 22-23 (1941) y Barrett et al., “Viruses” en Methods of Immunological Analysis, Masseyeff R.F., Albert W.H., y Staines N.A. (eds), Vol. 2, VCH Weinheim, 116-132 (1993).

Se infectaron huevos embrionados de 10-11 días de edad con 200 !l por huevo de líquido alantoideo que contenía virus. Los huevos infectados se incubaron durante 2-3 días a 37ºC como se ha descrito por Burnett, “Influenza Virus Infections of the Chick Embryo by the Amniotic Route”, Austral. J. Exp. Biol. Med. Sci., 18: 353-360 (1940). El huevo se abrió y se determinó el título de HA como se ha descrito anteriormente.

La Tabla 1 compara los títulos de hemaglutinina obtenidos a partir de diversas cepas de Influenza producidos por cultivo en huevos embrionados y cultivo con agitación centrífuga con o sin proteasas. Los datos muestran que el uso del cultivo con agitación centrífuga de CEC y la adición de proteasa de acuerdo con la presente invención aumentan el rendimiento de la mayoría de cepas hasta un nivel que se aproxima a los rendimientos de cepas de virus cultivadas en los cultivos de huevos embrionados, todo sin las desventajas intrínsecas de otros métodos de cultivo.

Tabla 1: Título de HA máximo obtenido para cepas de Influenza diferentes en cultivos en huevos embrionados y con agitación centrífuga de CEC con y sin las proteasas Tripsina y Subtilisina A

Subtipo: Cepa Año de vacuna Título de HA

Cultivo con agitación centrífuga de CEC/Proteasa: Huevo

ninguno: Tripsina Subtilisina A

B: B/Massachusetts 7 8 n.r. 9

B/Panama: 1991/92, 92/93 6 4 5 8

B/Yamagata: 90/91, 91/92, 92/93 3 5 5 8

A/H1N1: Brazil 7 1 n.r. 10

California: 2 2 6 8

USSR: 7 2 n.r. 10

Singapore 6: 1990/91, 91/92, 92/93 2 4 4 7

Taiwan: 1991/92 4 6 4 9

Texas 36: 1992/93 5 4 n.r. 6

A/H2N2: A2 Singapore 2 7 n.r. 9

A/H3N2: Hong Kong 2 8 6 10

Hong Kong 5: 2 7 6 8

Texas: 2 6 n.r. 8

Victoria: 2 6 n.r. 8

Guizho: 1990/91 2 6 5 6

Shanghai 16: 1990/91 2 6 6 6

Beijing: 1991/92, 92/93 2 6 6 8

n.r. = no realizado

5 Ejemplo de Referencia B: Gran aumento de escala de producción de virus Influenza en cultivos de fermentador de CEC

Se realizó un aumento de escala de los 100 ml de cultivo con agitación centrífuga a un fermentador de 2 litros 10 automatizado. Un fermentador de 2 litros de cultivo celular de biomasa se inoculó con 2 ml de líquido alantoideo que contenía virus Influenza con un título de HA de 6-8 con cambios de medio continuos a 37ºC.

El método de la invención que usa cultivo de fermentador de gran escala emplea activación con tripsina en un sistema de bucle de aumento, mediante el cual partes del medio que contiene el virus deseado se retiran 15 continuamente del fermentador hasta un recipiente que contiene tripsina o cualquier otra proteasa requerida. En el recipiente que contiene tripsina o subtilisina A con una concentración de 20 mU/ml y 30 !g/ml, respectivamente, el virus se activa a lo largo de un período de aproximadamente una hora. El medio que contiene el virus activado con tripsina después se bombea hacia un recipiente que contiene inhibidor de tripsina de soja (Sigma) durante aproximadamente 1 h con una concentración suficiente para neutralizar la actividad residual de tripsina. Después, el 20 medio que contiene tripsina neutralizada con virus se devuelve al fermentador para un ciclo adicional de replicación. Mediante extracción continua del medio de cultivo celular de biomasa desde el fermentador y adición de medio de cultivo fresco, se obtuvieron 4-5 litros de medio que contenía virus durante un período de tiempo de 96 horas. El método de la invención permite la activación de virus con concentración mucho mayor de tripsina que lo que sería posible con métodos convencionales, en los que concentraciones altas de la proteasa tendrían efectos nocivos

25 sobre el cultivo celular y el virus si se incubaran con las mismas durante un período prolongado.

La Tabla 2 muestra las ventajas del método aplicadas a la cepa de virus California, que se puede activar con tripsina usando el sistema de bucle de aumento y después empleando un inhibidor de tripsina.

30 Tabla 2: Título de HA máximo obtenido para cepas de Influenza diferentes en 100 ml de cultivos con agitación centrífuga de CEC y cultivos de fermentador de CEC de 2 litros.

Subtipo: Cepa Año de vacuna Título de HA

Cultivo de CEC: Huevo

Proteasa: centrífuga Fermentador

B: B/Panama 91/92, 92/93 N 6 6 8

A/H1N1: Brazil N 7 7 10

California: S 6 6 8

T: 2 6

Singapore 6: 90/91, 91/92, 92/93 S 4 4 7

T: 4 4

A/H3N2: Hong Kong 5 S 6 6 8

T: 7 7

Beijing: 91/92, 92/93 S 6 7 8

T: 6 7

N: ninguno S: Subtilisina A T: Tripsina

Ejemplo 1: Comparación de títulos de HA de diferentes cepas de Influenza en cultivos monocapa de VERO en 5 medio convencional que contiene suero fetal de ternera y en medio sin proteínas en presencia y ausencia de tripsina.

Se infectaron células VERO convencionales y células VERO sin proteínas con cepas de virus Influenza como se ha enumerado en la Tabla 3. Se propagaron líneas celulares continuas de células VERO como monocapas en medio 10 DMEM convencional (Medio de Eagle de Dulbecco) que contenía suero fetal de ternera al 5% (FCS) o en medio DMEM sin proteínas. Se infectaron células con líquido alantoideo que contenía virus Influenza con un título de HA de 6-8 unidades. La incubación se realizó hasta desarrollo del efecto citopático máximo o durante un máximo de 72 horas y se determinaron los títulos de HA como se ha descrito previamente. Después de la infección, el medio no contenía tripsina o contenía tripsina al 0,002% (Seromed). Los datos que se resumen en la Tabla 3 demuestran que

15 la adición de tripsina a un medio que contiene FCS al 5% para algunas cepas de virus permite producción de virus de bajo rendimiento.

Sin embargo, significativamente, el uso de medio sin proteínas más tripsina da producción de alto rendimiento para todas las cepas de virus ensayadas.

20 Tabla 3: Títulos de HA máximos obtenidos para diferentes cepas de Influenza en cultivos monocapa de VERO convencionales y en cultivos monocapa de VERO sin proteínas con y sin tripsina.

Subtipo: Cepa Año de Vacuna “Monocapa” de VERO convencional “Monocapa” de VERO sin proteínas

-tripsina: +tripsina -tripsina +tripsina

A/H1N1: Brazil 0 3 5 8

California: 0 0 0 6

A/H3N2: Hongkong 0 3 0 6

Hongkong 5: 0 3 0 7

Beijing: 91/92;92/93 0 0 2 8

Ejemplo 2: Comparación de títulos de HA obtenidos para diferentes cepas de Influenza en huevos 25 embrionados, cultivos monocapa de VERO sin proteínas y en cultivos de fermentador de VERO sin proteínas en presencia y ausencia de tripsina

Huevos embrionados, cultivos monocapa de VERO sin proteínas y cultivos de fermentador de VERO sin proteínas se infectaron con cepas de virus Influenza como se ha enumerado en la Tabla 4. La infección de huevos

30 embrionados se realizó como se ha descrito en el Ejemplo de referencia A y del cultivo de fermentador como se ha descrito en el Ejemplo de referencia B. Se propagaron líneas celulares continuas de células VERO sin proteínas como monocapas e infectaron con líquido alantoideo que contenía virus Influenza con un título de HA de 6-8 unidades. La incubación se realizó hasta desarrollo del efecto citopático máximo (cpe) o durante un máximo de 72 horas y se determinó el título de HA como se ha descrito previamente.

35 Los datos se resumieron en la Tabla 4 y demuestran que las cepas diferentes de virus cultivadas en células VERO sin proteínas se aproximan a los títulos de HA de las cepas de virus cultivadas en huevos embrionados.

Tabla 4: Títulos de HA máximos obtenidos para diferentes cepas de Influenza en huevos embrionados, en cultivos monocapa de VERO sin proteínas y en cultivos de fermentador de VERO sin proteínas con y sin tripsina.

Subtipo: Cepa Año de vacuna Título de HA

-Tripsina: +Tripsina Huevo

Monocapa: Fermentador Monocapa Fermentador

B: B/Panama 91/92,92/93 93/94,94/95 6 0 8 7 8

A/H1N1: Brazil 5 0 8 8 10

Singapore 6: 90/91,91/92 92/93,93/94 94/95 3 0 6 6 7

Taiwán: 91/92 5 n.r. 6 n.r. 9

A/H3N2: Hongkong 5 0 0 7 7 8

Beijing: 91/92,92/93 2 0 8 8 8

Shang 16: 90/91 2 n.r. 8 n.r. 6

Guizho: 90/91 2 n.r. 6 n.r. 6

Ejemplo 3: Comparación de títulos de HA obtenidos a partir de diversas cepas de Influenza en células CV-1 y 5 LLC-MK 2 cultivadas en presencia de suero o en condiciones sin proteínas.

Se cultivaron células CV-1 y células LLC-MK 2 como monocapas en condiciones sin proteínas (PF) o en condiciones que contenían proteínas en presencia de suero fetal de ternera al 5% (FCS) como se ha indicado en la tabla. Se infectaron células con líquido alantoideo que contenía virus Influenza con un título de HA de 6-8. Las cepas de virus

10 Influenza fueron como se ha indicado en la tabla. Para demostrar el efecto de tripsina sobre títulos de HA, todos los experimentos se realizaron en ausencia de tripsina o en presencia de tripsina al 0,002% como se ha indicado en la Tabla 5. Se realizaron experimentos como se ha descrito en el Ejemplo 1.

Los datos resumidos en la Tabla 5 demuestran que para ambas líneas celulares, CV-1 y LLC-MK, se obtienen títulos 15 de HA máximos en condiciones sin proteínas y en presencia de tripsina.

Tabla 5: Títulos de HA máximos obtenidos para cepas de Influenza en células CV-1 y LLC-MK 2 cultivadas en presencia de suero (FCS) o en condiciones sin proteínas (PF)

Línea: Proteína Título de HA

celular: Brazil Beijing Hongkong 5

-tripsina: +tripsina -tripsina +tripsina -tripsina +tripsina

CV-1: FCS 3 5 2 3 0 0

PF: 6 7 7 7 5 8

LLC-MK2: FCS 0 0 0 0 0 0

PF: 2 7 2 7 0 6

20 Ejemplo 4: Alteración del sitio de escisión de HA de cepa de virus Influenza A/Hongkong/1/68 al “sitio de escisión maestro” KKRKKR

Se cultivó Influenza A/Hongkong/1/68 en huevos de pollo embrionados, se purificaron para anticuerpos, se lisaron y se preparó ARN viral de acuerdo con metodología de mutagénesis dirigida a sitio convencional (Enami et al. Proc. 25 Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3802-3805 (1990)). El ARN viral se sometió a transcripción inversa y PCR empleando cebadores complementarios a las regiones terminales no codificantes conservadas de HA. Debido a la conservación de esta región, el cebador 5’ (Secuencia 1: 5’-ATGATGTCTAGAAGCAAAAGCAGGGGATAATTC-3’) y el cebador 3’ (Secuencia 2: 5’-ATGATGCTGCAGTTTAGTGAGGGTTAATAGTAGTAACAAGGGTGTTTT-3’) se pueden usar para una amplia variedad de cepas de virus Influenza. Para clonación adicional, el cebador 5’ portaba un sitio de

30 restricción XbaI y el cebador 3’ portaba un sitio de restricción PstI, adicionalmente, el cebador 3’ portaba la secuencia promotora T3. Después de cortar los sitios de restricción con las enzimas de restricción apropiadas (XbaI y PstI), el ADNc de HA se subclonó en los sitios XbaI y PstI de la región de clonación múltiple de pUC19 (New England BioLabs) para obtener el vector pUC19-HA. Se realizó mutagénesis dirigida a sitio como se ha descrito por Palese et al. (documento WO 91/03552).

35 Para mutar el sitio de escisión de HA de Influenza A/Hongkong/1/68 al “sitio de escisión maestro”, la secuencia del cebador 3’ empleada fue (Secuencia 3: 5’-ATGATGAGGCCTCTTTTTTTTCTCTTTTTCTCTGGTACATTCCGCA-3’), en la que la secuencia de nucleótidos TCT TTT TTT TCT CTT TTT es la secuencia de complemento inversa de la secuencia AAA AAG AGA AAA AAA AGA-3’ que codifica la secuencia de aminoácidos deseada, KKRKKR que

40 reemplaza el sitio de escisión original, KQTR. Cadena arriba de esta secuencia de nucleótidos, el cebador 3’ portaba un sitio de restricción StuI, que permitía su fusión a la parte 3’ del ADNc de HA. El cebador 5’, Secuencia 1, fue el mismo que el cebador 5’ empleado para clonación como se ha descrito anteriormente, es decir, no portaba ninguna mutación con respecto a Influenza A/Hongkong/1/68 y en su extremo 5’ portaba un sitio de restricción XbaI.

El producto de PCR se aisló y cortó con las enzimas de restricción apropiadas (XbaI y StuI). El vector pUC19-HA que portaba el ADNc de HA de Influenza A/Hongkong/1/68 también se digirió con las enzimas de restricción XbaI y StuI para retirar la parte de pUC19-HA que correspondía al producto de PCR. En lugar de esta parte, el producto de PCR cortado se ligó en el plásmido. El sitio de restricción StuI se encuentra naturalmente en la secuencia de HA de Influenza A/Hongkong/1/68. Para verificar mutagénesis satisfactoria, el producto de PCR insertado en el vector pUC19-HA que portaba el producto de PCR se linealizó mediante digestión con Ksp632I y se transcribió desde el promotor T3 para dar una cadena de ARN negativa que representa el segmento de HA de Influenza A/Hongkong/1/68 que tiene un sitio de escisión de HA alterado de la secuencia de aminoácidos KKRKKR. Empleando el sistema de transfección de ribonucleoproteína (RNP) de acuerdo con Luytjes et al., “Amplification, Expression, and Packaging of a Foreign Gene by Influenza Virus”, Cell, 59: 1107-13 (1989), se amplificó un Influenza A/Hongkong/1/68 que portaba el sitio de escisión de HA KKRKKR en células MDCK. A diferencia del método de Palese et al., no se requirió sistema de selección ya que la selección automáticamente prefirió el sitio de escisión más eficaz. Además, debido a que no hubo otra diferencia entre los dos tipos de virus que el sitio de escisión de HA, los dos virus, el original y la versión mutada, pertenecieron al mismo serotipo. La presencia del sitio de escisión maestro en la cepa de virus Influenza modificada Influenza A/Hongkong/1/68 se confirmó mediante secuenciación de nucleótidos en un Secuenciador de ADN de Applied Biosystems 373.

Estos datos demuestran que no hubo diferencia significativa en los títulos de anticuerpo de HAI y ELISA generados mediante inmunización con la cepa Brazil cultivada mediante tecnología de huevo convencional o mediante el método descrito en este documento anteriormente.

EJEMPLO 5: Construcción de la cepa de virus Influenza donadora de alto rendimiento A/Orth/17/95 (H1N1)

Se tomó un frotis de garganta de un paciente que mostraba todos los síntomas de una infección de Influenza aguda. El frotis de garganta se diluyó en 2 ml de PBS, pH 7,2 y se agitó para retirar material de células nasales. Se infectó una línea celular continua de células VERO sin proteínas que se habían propagado como monocapas con diversas cantidades de esta solución. Después de 3 días, el virus se colocó en células VERO monocapa sin proteínas nuevas. Esto se repitió tres veces. Después, se observó que una única cepa de virus se había enriquecido. Su fenotipo de alto rendimiento se determinó mediante ensayo de hemaglutinación y sus propiedades antigénicas se determinaron mediante ensayo de inhibición de hemaglutinación. Esta cepa de virus Influenza se denominó Influenza A/Orth/17/95 (H1N1) y se convirtió en una cepa donadora de alto rendimiento para usarse en la producción de reordenantes de virus. Se efectuaron pases exhaustivamente en el laboratorio a la vez que se mantenía su fenotipo de alto rendimiento.

Se prepararon hemaglutinina y neuraminidasa de Influenza A/Orth/17/95 mediante tratamiento de virus purificado con bromelina y se purificaron por sedimentación en gradientes de sacarosa. Después se produjo antisuero policlonal de cabra así como anticuerpos monoclonales dirigidos a las dos glicoproteínas de Influenza A/Orth/17/95.

EJEMPLO 6: Construcción de un virus Influenza reordenante de alto rendimiento empleando cepa A/Orth/17/95 (H1N1) como un virus donador de alto rendimiento.

Se coinfectaron células VERO monocapa sin proteínas con diversas diluciones del virus donador de alto rendimiento Influenza A/Orth/17/95 y de un virus Influenza como recomendó la OMS para producción de vacunas para la temporada 1995/1996, A/Johannesburg/33/94 (H3N2). La descendencia con el título de HA más alto se trató con anticuerpos policlonales dirigidos contra las glicoproteínas de superficie exterior, hemaglutinina y neuraminidasa de Influenza A/Orth/17/95. Después se efectuaron pases de la descendencia del virus a dilución limitada. Los pases en presencia de dichos anticuerpos policlonales se repitieron dos o más veces. Después, se efectuaron pases una vez sin los anticuerpos. Este cuarto pase se analizó para determinar los determinantes antigénicos del virus reordenante que eran claramente diferentes de los de Influenza A/Orth/17/95 pero idénticos a los del virus Influenza A/Johannesburg/33/94 (H3N2). La presencia de hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) de A/Johannesburg/33/94 en la superficie exterior del virus reordenante se determinó mediante ensayo de inhibición de hemaglutinación usando antisuero policlonal dirigido contra HA y NA de esta cepa de virus específica.

Ejemplo 7: Producción de células VERO sin proteínas

A partir de la ampolla obtenida de la ATCC (ATCC CCL 81) se tomó una alícuota y se inoculó en medio sin proteínas. Después de 4 ciclos de células a través del medio, se obtuvo un banco de células de trabajo que se almacenó para uso posterior.

A partir del banco de células de trabajo, se usaron frascos rotativos para cultivar las células VERO sin proteínas a una densidad de 2,5 x 108/botella después de 4 ciclos. Células de 16 de tales frascos se transfirieron a un fermentador de 12 l. Los pases se realizaron usando pronasa (concentración de 0,1 mg/108 células) para desprender las células de su soporte.

Se efectuaron pases del cultivo del fermentador 3 veces para obtener 4 x 1012 células. Después estas células se 5 infectaron con el virus respectivo.

La propagación de virus se describe en los siguientes ejemplos. Después de la propagación de virus, se retiraron los microportadores usando un tamiz (malla 200), se retiraron células y fragmentos celulares por centrifugación a 30.500

g. El virus se preparó mediante ultrafiltración (NMWI, 200 k).

10 El cultivo de células VERO en medio sin proteínas da una densidad celular mayor que el cultivo de células VERO en medio que contiene suero. Una fermentación de 7 días en un fermentador de 150 l en condiciones sin proteínas da 2,2 x 109 células/l, mientras que un cultivo comparable en un medio que contiene FCS al 2,5% da 1,8 x 109 células/l. Los números proporcionados en este documento representan los valores medios de cinco experimentos

15 individuales, respectivamente.

Ejemplo 8: Comparación de títulos de HA obtenidos a partir de diversas cepas de virus Influenza en huevos embrionados con los títulos respectivos obtenidos en células VERO sin proteínas con las proteasa procariotas Subtilisina A (30 !g/ml) y pronasa (0,1 mg/108 células).

20 Se produjeron células VERO sin proteínas como se ha descrito en el Ejemplo 7. Las células se infectaron con líquido alantoideo que contenía virus Influenza con un título de HA de 6-8. La incubación se realizó hasta desarrollo de efecto citopático máximo o durante un máximo de 72 horas y se determinaron los títulos de HA como se ha descrito previamente. Los datos resumidos en la Tabla 6 demuestran que los rendimientos de virus Influenza obtenidos

25 mediante propagación en células VERO sin proteínas en presencia de una proteasa procariota, Subtilisina A o pronasa, alcanzan los obtenidos en el huevo embrionado.

Tabla 6: Título de HA máximo obtenido para cepas de virus Influenza diferentes en huevos embrionados y en cultivos con agitación centrífuga de VERO sin proteínas (VERO-PF) con las proteasas Subtilisina A y pronasa

Subtipo: Cepa Año de vacuna Título de HA

Subtilisina A: Pronasa Huevo

B: B/Panama 91/92, 92/93 93/94, 94/95 7 n.r. 8

A/H1N1: Brazil 8 n.r. 10

Singapore 6: 90/91,91/92 92/93, 93/94 94/95 7 n.r. 7

Texas 36: 92/93 6 6 6

A/H3N2: Hongkong 5 7 n.r. 8

Beijing: 91/92, 92/93 8 n.r. 8

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir antígeno viral que comprende las etapas de:

(a)

proporcionar un cultivo de células de riñón de mono cultivadas exclusivamente en medios sin proteínas durante múltiples generaciones,

(b)

infectar dicho cultivo con un virus seleccionado entre el grupo que consiste en orthomyxoviridae;y

(c)

incubar dicho cultivo celular infectado con dicho virus para propagar dicho virus,

(d)

retirar una parte del cultivo celular de la etapa (c);

(e)

poner en contacto dicha parte del cultivo de la etapa (d) con al menos una proteasa que aumente la activación de dicho virus;

(f)

añadir a dicha parte de etapa (e) al menos un compuesto que inhiba o atenúe cualquier efecto tóxico celular de dicha proteasa; y

(g)

devolver dicha parte de etapa (f) a dicho cultivo.
2.

Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho virus se propaga sin pases en cultivo en serie múltiples del mismo a través de dicho cultivo.
3.

Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho virus es un virus Influenza A, B o C.
4.

Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicho virus Influenza se ha alterado para modificar un sitio de escisión o para crear un nuevo sitio de escisión en la hemaglutinina.
5.

Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 4, en el que dichas células de riñón de mono se seleccionan entre el grupo que consiste en células VERO, células CV-1 y células LLC-MK2.
6.

Un método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicho cultivo de células de riñón de mono es una biomasa celular de células VERO.
7.

Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha proteasa es de una fuente procariota.
8.

Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicha proteasa se selecciona entre el grupo que consiste en pronasa, termolisina y subtilisina A.
9.

Un método de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicha proteasa está en un recipiente o está inmovilizada en un vehículo.
10.

Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho compuesto que inhibe o atenúa cualquiera de los efectos tóxicos celulares de dicha proteasa se selecciona entre el grupo que consiste en inhibidor de tripsina de soja, inhibidor de tripsina de huevo y aprotinina.
11.

Un método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho compuesto que inhibe o atenúa cualquiera de los efectos tóxicos celulares de dicha sustancia está en un recipiente o está inmovilizada en un vehículo.
12.

El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que las etapas (a) – (d) se realizan en un primer recipiente y las etapas (e) y (f) se realizan en un segundo recipiente.
13.

El método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que dicho primer recipiente y dicho segundo recipiente están conectados en un bucle de forma que las etapas (a) – (g) de puedan realizar de una manera cíclica.
14.

El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que las etapas (a) a (d) se realizan en un primer recipiente, la etapa (e) se realiza en un segundo recipiente y la etapa (f) se realiza en un tercer recipiente.
15.

El método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que en el que dicho primer recipiente, dicho segundo recipiente y dicho tercer recipiente están conectados en un bucle de forma que las etapas (a) – (g) de puedan realizar de una manera cíclica.
16.

El método de acuerdo con la reivindicación 15, en el que las etapas (a) – (g) se realizan de manera discontinua.
17.El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, comprendiendo además las etapas de:

(h)

supervisar los niveles de crecimiento, infección y activación de dicho cultivo; y

(i)

variar las condiciones de dicho cultivo para maximizar los niveles de crecimiento, infección y activación.
18. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, comprendiendo además la etapa de 5 recolectar dicho virus o antígeno viral de dicho cultivo.
19. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, comprendiendo además la etapa de preparar una vacuna con dicho virus o antígeno viral recolectado.

10 20. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 19, en el que las células se cultivan en la etapa (a) durante al menos seis, preferentemente durante al menos doce generaciones.
21. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 19, en el que las células se cultivan en la etapa (a) durante al menos dieciocho generaciones.

15 22 .El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 19, en el que las células se cultivan en la etapa (a) durante al menos veinticuatro generaciones.