JPH04228066A - 外来遺伝子発現用培養細胞 - Google Patents
外来遺伝子発現用培養細胞Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、実質的に蛋白性物質を
含有しない培地で増殖可能で、かつ、外来遺伝子の複製
を促進できる物質を含有する動物細胞、該動物細胞に発
現可能な外来遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡを導入した
形質転換体、及び該形質転換体を用いて外来遺伝子発現
産物を製造する方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】特定の遺伝子を組み込んだＤＮＡを培養
細胞に導入し、その遺伝子を発現せしめ、その発現産物
を取得するＤＮＡ組換え技術は既に広く普及している。 現在、培養可能な動物細胞でこの目的に使用されている
ものの大半は、血清等の化学的組成が不明の天然物を含
む培地中で生育されている。その例としては、マウスイ
ンターフェロンγを産生するＣＯＳ−１細胞をダルベッ
コ改変最小必須培地で培養することが知られている（Ｐ
． Ｗ． Ｇｒａｙ， Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ
， ８０： ５８４２−５８４６， １９８３）。その
ため、目的とする遺伝子産物を回収し精製する際、不純
物の除去に多大の労力を要している。この問題を解決す
るために、目的とする遺伝子産物を発現するように形質
転換した培養細胞を、適宜、血清含有培地培養から無血
清培地培養に変更して培養し、遺伝子産物の回収、精製
を容易にする方法が一般に採られている。 【０００３】しかるに、血清含有培地から無血清培地に
変更すると、培養細胞の増殖能は急速に低下する。これ
を防ぐためには、無血清培地中に、インスリン、トラン
スフェリン、アルブミン等の蛋白性物質の添加が必要と
される。これらの蛋白性物質は、他の培地成分である低
分子化合物に比べ、精製が困難で価格が高いため、培地
の価格を上昇せしめる要因となっている。 【０００４】蛋白性物質を含有しない培地で増殖できる
動物細胞としては、アフリカミドリザル腎臓由来Ｖｅｒ
ｏ−３１７細胞、マウス由来Ｌ−Ｐ３細胞、及びヒト子
宮癌由来ＨｅＬａ−Ｐ３ 細胞等が知られているが、こ
れらの細胞が外来遺伝子を核染色体に組み込むことなく
増幅できたことは報告されていない。ＤＮＡ組み換え技
術においてベクターとして使用されるウィルス由来等の
ＤＮＡのなかには、宿主細胞中において、宿主細胞の核
染色体に組み込まれることなく増幅されるものがある。 例えば、ＳＶ４０ウィルスＤＮＡの複製開始領域を含む
環状二本鎖ＤＮＡをＳＶ４０ウィルス由来のラージＴ抗
原を含むサルの細胞中に導入すると宿主細胞の核染色体
に組み込まれることなく、そのＤＮＡが複製され増幅す
る（内田驍、大石道夫、古沢満編、動物細胞利用実用化
マニュアル、ＰＰ．３８８−３９３ 、（株）エル・ア
イ・シー、１９８４年）。また、バキュロウィルスＤＮ
Ａを昆虫細胞中に導入すると宿主細胞の核染色体に組み
込まれることなく、バキュロウィルスＤＮＡが複製され
増幅する（前田進、実験医学、第７巻、Ｎｏ．１３ 、
１９８９年、第１４６ 〜第１５１頁、Ｓｅｋｉｎｅ
ｅｔ ａｌ， Ｇｅｎｅ， ｖｏｌ．６５， ｐ１８７
，（１９８８） 、及び Ｍｉｙａｊｉｍａ ｅｔ ａ
ｌ， Ｇｅｎｅ， ｖｏｌ．５８， ｐ２７３， （１
９８７））。 【０００５】現在、導入された外来遺伝子を核染色体に
組み込むことなく増幅できる動物細胞で、実質的に蛋白
性物質を含有しない培地で増殖可能なものは知られてい
ない。 【０００６】 【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、導
入された外来遺伝子を核染色体に組み込むことなく増幅
でき、かつ、実質的に蛋白性物質を含有しない培地で増
殖可能な動物細胞を提供することを目的とする。 【０００７】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意努力
した結果、実質的に蛋白性物質を含有しない培地で増殖
可能な動物細胞に外来遺伝子の複製を促進できる物質を
含有させることにより、外来遺伝子を核染色体に組み込
むことなく複製できることを見出し、本発明を完成させ
るに至った。 【０００８】本発明の動物細胞に発現可能な外来遺伝子
を含む組み換え体ＤＮＡを導入した形質転換体は、実質
的に蛋白性物質を含有しない培地中で培養することがで
き、また大量の外来遺伝子産物を発現させることができ
る。以下、本発明を詳細に説明する。本発明の、実質的
に蛋白性物質を含有しない培地で増殖可能で、かつ、外
来遺伝子の複製を促進できる物質を含有する動物細胞は
、以下のようにして作製することができる。 【０００９】まず、実質的に蛋白性物質を含有しない培
地で増殖できることのわかっている動物細胞を用意する
。上記の蛋白性物質は、インスリン、トランスフェリン
、アルブミン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、上
皮成長因子、インスリン様成長因子、ファイブロブラス
トグロースファクター等の蛋白性成分の他、血清、血漿
、乳汁等の化学的成分の不明の天然物を含有するものも
含む。 【００１０】「実質的に蛋白性物質を含有しない培地」
とは、蛋白性物質の含有率が０〜０．００１％、好まし
くは０％である培地をいう。蛋白性物質を含有しない培
地の例としては、ビオチンを終濃度０．０２ｍｇ／ｌ添
加した最小必須培地（以下、「ｂＭＥＭ培地」と記す）
、ＤＭ−１６０培地、Ｆ−１２培地、ダルベッコ改変最
小必須培地とＦ−１２培地の等量混合培地等が挙げられ
る。このうち、ｂＭＥＭ培地、ＤＭ−１６０培地が好ま
しい。 【００１１】上記の動物細胞は、哺乳類動物より分離培
養化された細胞を含む。実質的に蛋白性物質を含有しな
い培地で増殖できることのわかっている動物細胞の例と
しては、アフリカミドリザル腎臓由来Ｖｅｒｏ−３１７
細胞、マウス由来Ｌ−Ｐ３細胞、ヒト子宮癌由来ＨｅＬ
ａ−Ｐ３ 細胞（上記細胞は、理化学研究所細胞銀行よ
り入手可能）、チャイニーズハムスター由来ＣＨＬ−１
細胞及びＣＨＤ−３Ａ細胞（Ｒ． Ｇ． Ｈａｍ，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ
， ５３ ： ２８８−２９３， １９６５ ） 等を
挙げることができる。このうち、Ｖｅｒｏ−３１７細胞
が好ましい。 【００１２】次に、外来遺伝子の複製を促進できる物質
を調製する。上記の外来遺伝子は、細胞外から導入する
遺伝子を含む。上記の外来遺伝子の複製を促進できる物
質は、外来遺伝子の遺伝情報と同一のコピーを少なくと
も一以上複製するように促進できるあらゆる物質を含む
。外来遺伝子の複製を促進できる物質の例としては、Ｓ
Ｖ４０ウイルス由来のラージＴ抗原、ポリオーマウィル
ス由来のラージＴ抗原等、これらの蛋白を発現する遺伝
子を含むＤＮＡ、及びバキュロウィルスＤＮＡ等が挙げ
られる。このうち、ＳＶ４０ウイルス由来のラージＴ抗
原遺伝子を含むＤＮＡが好ましい。外来遺伝子の複製を
促進できる物質が、ウィルス由来のＤＮＡである場合に
は、該ＤＮＡ中にＤＮＡ複製開始領域を含まないことが
好ましい。ラージＴ抗原を発現する遺伝子を含むＤＮＡ
の例としては、ＳＶ４０ウィルスＤＮＡ（ベセスダリサ
ーチラボラトリーズ社より入手可能）、プラスミドｐＳ
ＶｔｓＡ５８ｏｒｉ（−）（理化学研究所遺伝子銀行よ
り入手可能）等を挙げることができる。このうち、ｐＳ
ＶｔｓＡ５８ｏｒｉ （−）が好ましい。 【００１３】ＳＶ４０ウィルス由来のラージＴ抗原遺伝
子を含むＤＮＡは、例えば、以下のようにして調製する
ことができる。まず、ＳＶ４０ウィルスＤＮＡを切断す
るが、ラージＴ抗原遺伝子領域を切断できない制限酵素
を選択する。該制限酵素の例としては、Ｂｇ１Ｉ、Ｋｐ
ｎＩ、ＥｃｏＲＶ、ＡｃｃＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ
、ＴａｑＩ、ＮｄｅＩ等が挙げられる。 該制限酵素でＳＶ４０ウィルスＤＮＡを十分消化し、消
化したＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離
し、ラージＴ抗原遺伝子を含むＤＮＡ断片を採取する。 これを外来遺伝子として、ベクターＤＮＡへ組み込んで
組み換え体ＤＮＡを作製する。この組み換え体ＤＮＡは
、ジェイ． サンブルックらの文献（Ｊ． Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ， Ｅ． Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ． Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ−
Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏ
ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９ （ 以
下、「モレキュラークローニング」と記す））の第１．
５３〜第１．７３頁の記載に準じて作製することができ
る。ベクターＤＮＡとしては、既存のいかなるベクター
も使用することができる。その例としては、ＳＶ【００
１４】 【外１】 【００１５】１ＭＴＨＡ、ｐＨＥＢｏ、ｐ２０５、ｐＭ
Ｔ３ＳＶ２（ 「モレキュラークローニング」， 第
１６．１−第１６．８１ 頁） 、ＣＤＭ８、ｐ９１０
２３（Ｂ） 、ｐｃＤＬ−ＳＲα２９６ （武部豊、実
験医学別冊（村松正実・岡山博人編、羊土社、東京、１
９９１年） 、第２９２頁〜第２９７頁）、ｐＢＲ３２
２、ｐＵＣ１２ 、ｐＵＣ１８ 、ｐＵＣ１９ （ 「
モレキュラークローニング」， 第１．１２− 第１．
２０、第 ４．１０−第４．１１頁） 等を挙げること
ができる。このうち、ｐＢＲ３２２、及び、ｐＵＣ１９
が好ましい。他のウィルス由来のラージＴ抗原遺伝子
を含むＤＮＡも、該ウィルスＤＮＡを切断するが、ラー
ジＴ抗原遺伝子領域を切断できない制限酵素を選択して
、上記の操作を繰り返すことにより調製することができ
る。 【００１６】また、ＳＶ４０ウィルスＤＮＡをベクター
ＤＮＡに組み込むことなく、そのまま用いてもよい。ま
た、制限酵素等でＳＶ４０ウィルスＤＮＡを十分消化し
たＤＮＡ断片、あるいは、制限酵素等でＳＶ４０ウィル
スＤＮＡを十分消化したＤＮＡ断片から分離したラージ
Ｔ抗原遺伝子を含むＤＮＡ断片をベクターＤＮＡに組み
込むことなく用いてもよい。ＳＶ４０ウィルスＤＮＡ、
あるいは、制限酵素等でＳＶ４０ウィルスＤＮＡを十分
消化したＤＮＡ断片を用いる場合には、ＤＮＡ複製開始
領域を除去することが好ましい。他のウィルス由来のラ
ージＴ抗原遺伝子を含むＤＮＡについても同様である。 【００１７】外来遺伝子の複製を促進できる物質を上記
のようにして作製した後、上記の実質的に蛋白性物質を
含有しない培地で増殖可能な動物細胞に導入する。外来
遺伝子の複製を促進できる物質を動物細胞に導入する際
、外来遺伝子の複製を促進できる物質の動物細胞に対す
る比率は、細胞１０５個当たり０．１μｇ〜０．１ｍｇ
であり、このうち、０．５ 〜２０μｇが好ましい。 【００１８】外来遺伝子の複製を促進できる物質を動物
細胞に導入する前に、動物細胞を前培養する。この培地
としては、ウシ胎児血清、ウシ新生児血清、子ウシ血清
、及び／又はウマ血清等を０．５〜２０％（Ｖ／Ｖ）添
加した最小必須培地（以下、「ＭＥＭ培地」と記す）、
ＤＭ−１６０培地、Ｆ−１２培地、ダルベッコ改変最小
必須培地等をあげることができ、このうち、ウシ新生児
血清５％（Ｖ／Ｖ）添加したＭＥＭ培地が好ましい。動
物細胞を上記の培地中で、３３〜４０℃、５〜１０％の
炭酸ガスを含む空気下で、１〜１０日間培養することが
できるが、このうち、３７℃、５％の炭酸ガスを含む空
気下で２日間培養することが好ましい。 【００１９】上記のように前培養した動物細胞に、外来
遺伝子の複製を促進できる物質を導入する。外来遺伝子
の複製を促進できる物質を動物細胞へ導入する方法とし
ては、電界刺激法、マイクロインジェクション法、赤血
球ゴースト融合法、リポソーム融合法、ＤＮＡ導入補助
剤を用いる方法等を挙げることができる。このうち、外
来遺伝子の複製を促進できる物質がＤＮＡの場合には、
ＤＮＡ導入補助剤を用いる方法が好ましい。ＤＮＡ導入
補助剤の例としては、りん酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デ
キストラン、ポリブレン、リポフェクチン、ＤＯＴＭＡ
を挙げることができ、このうち、リポフェクチンが好ま
しい。外来遺伝子の複製を促進できる物質がＤＮＡ以外
の場合には、マイクロインジェクション法が好ましい。 【００２０】上記の外来遺伝子の複製を促進できる物質
は、外来遺伝子をベクターＤＮＡに組み込んだ組み換え
体ＤＮＡを動物細胞に導入する前後または同時に、該細
胞に導入することができる。また、該物質がＤＮＡの場
合には、外来遺伝子を組み込むベクターＤＮＡにこのＤ
ＮＡを組み込んで、この組み換え体ＤＮＡを動物細胞に
導入してもよい。例えば、外来遺伝子の複製を促進でき
る物質としてバキュロウィルスＤＮＡを使用する場合に
は、バキュロウィルスＤＮＡの多角体遺伝子領域に外来
遺伝子を組み込んだ組み換え体ＤＮＡとして昆虫細胞に
導入することができる。 【００２１】上記の外来遺伝子の複製を促進できる物質
を含有する細胞を選択及び確認する方法としては、間接
蛍光抗体染色法、薬剤耐性選択培地培養法等を挙げるこ
とができる。薬剤耐性選択培地培養法をとるときには、
上記の外来遺伝子の複製を促進できる物質を動物細胞に
導入する際、同時に薬剤に対する耐性遺伝子を含むＤ【
００２２】 【外２】 【００２３】。これらの方法のうち、間接蛍光抗体染色
法が好ましい。 上記の外来遺伝子の複製を促進でき
る物質を含有する動物細胞において、外来遺伝子の複製
を促進できる物質は、動物細胞の細胞質中に存在し得る
。 また、上記の外来遺伝子の複製を促進できる物質がＤＮ
Ａである場合には、該物質は、動物細胞の核染色体に組
み込まれても、また組み込まれていなくてもよい。 【００２４】上記のようにして作製した、実質的に蛋白
性物質を含有しない培地で増殖可能で、かつ、外来遺伝
子の複製を促進できる物質を含有する動物細胞は、外来
遺伝子を導入したとき、外来遺伝子の複製が促進されて
外来遺伝子発現産物の高い産生能を有する。また、上記
動物細胞は、外来遺伝子を導入したとき、外来遺伝子を
動物細胞の核染色体に組み込むことなく複製することが
できる。 【００２５】上記のようにして作製した、実質的に蛋白
性物質を含有しない培地で増殖可能で、かつ、外来遺伝
子の複製を促進できる物質を含有する動物細胞に、発現
可能な外来遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡを導入して、
形質転換体を作製することができる。本明細書中、「発
現」とは、該遺伝子に相当するＤＮＡ配列がメッセンジ
ャーＲＮＡに転写されることと定義される。 【００２６】発現可能な外来遺伝子を含む組み換え体Ｄ
ＮＡとしては、発現可能な外来遺伝子を適当なベクター
に組み込んだいかなるものも使用することができる。ま
た、該組み換え体ＤＮＡは、ＤＮＡ複製開始領域の全部
あるいは一部、及び／又はプロモーターを更に含むこと
が好ましい。ＤＮＡの複製開始領域としては、外来遺伝
子の複製を促進できる物質によって組み換え体ＤＮＡに
組み込まれた外来遺伝子の複製を開始するいかなるもの
も使用することができる。このうち、ＳＶ４０ウィルス
のＤＮＡ複製開始領域が好ましい。プロモーターの例と
しては、ＭＭＴＶ−ＬＴＲ（ 【００２７】 【外３】 【００２８】ックス社、プラスミドｐＴＫＧＨ として
入手可能）、ｍＭＴ−１ （ 日本メジフィジックス社
、プラスミドｐＸＧＨ５として入手可能）等が挙げられ
る。ＤＮＡの複製開始領域の全部あるいは一部、及び／
又はプロモーターを含む組み換え体ＤＮＡを用いること
により、宿主細胞中での外来遺伝子の複製量を増大させ
ることができる。組み換え体ＤＮＡの例としては、ｐＸ
ＧＨ５ 、ｐＴＫＧＨ 、及びｐΦＧＨ（ メジフィジ
ックス社製） 等を挙げることができる。 【００２９】また、組み換え体ＤＮＡは、以下のように
して作製してもよい。まず、発現可能な外来遺伝子を調
製する。発現可能な外来遺伝子の例としては、ヒト成長
ホルモン、ヒトインシュリン、ヒトセクレチン、ヒトエ
リスロポエチン等のペプチド性ホルモンの遺伝子、ヒト
血小板由来成長因子、ヒト上皮成長因子等の成長因子の
遺伝子、ヒトテッシュ−プラスミノーゲンアクチベータ
ー、ヒトアルブミン、ヒトフィブロネクチン等の蛋白の
遺伝子、ヒトミック遺伝子並びにヒトラス遺伝子等の発
癌遺伝子等を挙げることができる。これらの遺伝子は、
ヒトの脳下垂体、膵臓、腸管、腎臓、骨髄、血管、肝臓
、脾臓等の細胞の染色体ＤＮＡから採取することができ
、また、ヒトの食道、胃、脾臓、肝臓、腎臓、大腸、脳
、皮膚等に発生した腫瘍組織等の細胞中のメッセンジャ
ーＲＮＡを鋳型として酵素的に製造することもできるし
、さらに、化学的に合成してもよい。 【００３０】上記の発現可能な外来遺伝子をパッセンジ
ャーとしてプラスミド、ウィルスＤＮＡ等のベクターＤ
ＮＡに組み込んで、組換え体ＤＮＡを作製する。ベクタ
ーＤＮＡの例としては、ＳＶ４０ウィルス由来ＤＮＡの
全部もしくは一部、牛乳頭腫ウィルス由来ＤＮＡの全部
もしくは一部、ポリオーマウィルス由来ＤＮＡの全部も
しくは一部、Ｌ因子由来ＤＮＡの全部もしくは一部、ア
デノウィルス由来の全部もしくは一部、ワクシニアウィ
ルス由来ＤＮＡの全部もしくは一部、エプシュタイン・
バールウィルス由来ＤＮＡの全部もしくは一部、レトロ
ウィルス由来ＲＮＡより逆転写したＤＮＡの全部もしく
は一部を挙げることができる。上記ベクターＤＮＡは、
ＤＮＡの複製開始領域を含むことが好ましい。ＤＮＡの
複製開始領域としては、外来遺伝子の複製を促進できる
物質によって組み換え体ＤＮＡに組み込まれた外来遺伝
子の複製を開始するいかなるものも使用することができ
る。 このうち、ＳＶ４０ウィルスのＤＮＡ複製開始領域が好
ましい。具体的なベクターＤＮ 【００３１】 【外４】 【００３２】ましい。また、これらのベクターは、プラ
スミドとしての機能部分とベクターとしての複製開始領
域を有していれば、目的とする外来遺伝子を組み込む際
、適宜改変して用いてもよい。ベクターＤＮＡへの外来
遺伝子の組み込みは、以下のようにして行うことができ
る。ベクターＤＮＡを一箇所しか切断しない制限酵素を
選択し、該制限酵素でベクターＤＮＡを消化する。これ
に外来遺伝子をＤＮＡリガーゼを用いて結合させる。 この詳細な手順は、「モレキュラークローニング」の第
１．５３〜第１．７３頁に記載されている通りである。 上記のようにして、発現可能な外来遺伝子をベクターＤ
ＮＡに組み込んで、組換え体ＤＮＡが作製される。 【００３３】この組換え体ＤＮＡには、さらにプロモー
ターを挿入してもよい。プロモータ 【００３４】 【外５】 【００３５】可能） 、ＴＫ（ 日本メジフィジックス
社、プラスミドｐＴＫＧＨ として入手可能）、ｍＭＴ
−１ （ 日本メジフィジックス社、プラスミドｐＸＧ
Ｈ５として入手可能）等が挙げられる。上記のプロモー
ターは、外来遺伝子の組み込みと同じ手順に従って、組
み換え体ＤＮＡに挿入すればよい。上記の組換え体ＤＮ
Ａを上記の動物細胞に導入して形質転換体を作製するこ
とができる。動物細胞への組換え体ＤＮＡの導入の際、
組換え体ＤＮＡの動物細胞に対する比率は、１０５個の
細胞に対して０．１〜１００μｇ であり、このうち、
１〜１０μｇ が好ましい。 【００３６】組換え体ＤＮＡの導入を行う前に、動物細
胞を前培養するが、この培地としては、ウシ胎児血清、
ウシ新生児血清、子ウシ血清、及び／又はウマ血清等を
０．５〜２０％（Ｖ／Ｖ）添加した最小必須培地（以下
、「ＭＥＭ培地」と記す）、ＤＭ−１６０培地、Ｆ−１
２培地、ダルベッコ改変最小必須培地等を挙げることが
でき、このうち、ウシ新生児血清５％（Ｖ／Ｖ）添加し
たＭＥＭ培地が好ましい。また、動物細胞を上記の培地
中で、３２〜４０℃、５〜１０％の炭酸ガスを含む空気
下で、１〜１０日間培養することができるが、このうち
、３７℃、５％の炭酸ガスを含む空気下で２日間培養す
ることが好ましい。 【００３７】前培養した動物細胞に組み換え体ＤＮＡを
導入して、形質転換体を得ることができる。組換え体Ｄ
ＮＡを動物細胞に導入する方法としては、ＤＮＡ導入補
助剤を用いる方法、電界刺激法、マイクロインジェクシ
ョン法、リポソーム融合法、赤血球ゴースト融合法等を
挙げることができる。このうち、ＤＮＡ導入補助剤を用
いる方法が好ましい。ＤＮＡ導入補助剤の例としては、
りん酸カルシウム、ＤＥＡＥ─デキストラン、ポリブレ
ン（「モレキュラークローニング」、第１６．３０−第
１６．４７ 頁） 、リポフェクチン（べセスダリサー
チラボラトリーズ社）、ＤＯＴＭＡ（ベーリンガーマン
ハイム山之内株式会社）が挙げられ、このうち、リポフ
ェクチンが好ましい。 【００３８】組換え体ＤＮＡが導入された形質転換体の
選択及び確認は、形質転換体を培養して、ベクターＤＮ
Ａが有する標識遺伝子（栄養要求性や薬剤耐性遺伝子等
）や外来遺伝子の遺伝情報を発現させることにより行う
ことができる。上記のようにして作製した形質転換体は
、実質的に蛋白性物質を含有しない培地で増殖可能であ
り、また外来遺伝子発現産物の高い産生能を有する。 また、前記形質転換体は、外来遺伝子を宿主細胞の核染
色体に組み込むことなく複製することができる。 【００３９】上記のようにして得られた形質転換体は、
ウシ胎児血清、ウシ新生児血清、子ウシ血清、及び／又
はウマ血清等を０．５〜２０％（Ｖ／Ｖ）添加した最小
必須培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆ−１２培地、ダルベッ
コ改変最小必須培地等の培地中で、３３〜４０℃、５〜
１０％の炭酸ガスを含む空気下で、１〜１０日間培養す
ることができ、このうち、ウシ新生児血清５％（Ｖ／Ｖ
）添加したＭＥＭ培地中で、３７℃、５％の炭酸ガスを
含む空気下で２日間培養することが好ましい。 【００４０】上記の形質転換体を実質的に蛋白性物質を
含有しない培地中で培養しながら、外来遺伝子発現産物
を産生させる。培養方法としては、最初から実質的に蛋
白性物質を含有しない培地で培養しても、又は、当初は
蛋白性物質を含有する培地で培養し、次いで培地を実質
的に蛋白性物質を含有しない培地に変更して培養しても
よい。好ましくは、当初は蛋白性物質を含有する培地で
培養し、目的とする外来遺伝子発現産物の産生量が最大
値に達した時点で、適宜、培地を実質的に蛋白性物質を
含有しない培地に変更して培養する。 【００４１】蛋白性物質を含有する培地の例としては、
１０％（Ｖ／Ｖ）ウシ胎児血清含有ＭＥＭ培地、５％（
Ｖ／Ｖ）ウシ新生児血清含有ＭＥＭ培地、ＡＳＦ３０１
培地等を挙げることができる。このうち、５％（Ｖ／Ｖ
）ウシ新生児血清含有ＭＥＭ培地が好ましい。蛋白性物
質を含有しない培地の例としては、ｂＭＥＭ培地、ＤＭ
−１６０培地、Ｆ−１２培地、ダルベッコ改変最小必須
培地とＦ−１２培地の等量混合培地等を挙げることがで
きる。このうち、ｂＭＥＭ培地が好ましい。 【００４２】さらに、これらの培地にプロリン等の非必
須アミノ酸、アスコルビン酸等のビタミン、トリヨード
サイロニン等のホルモン等を添加してもよい。これらの
添加物は、外来遺伝子発現産物の収率を高めることがで
きる。形質転換体は、上記培地中で、３２〜４０℃、５
〜１０％の炭酸ガスを含む空気下で培養することができ
、このうち、３７℃、５％の炭酸ガスを含む空気下で培
養することが好ましい。 【００４３】上記の培養培地から、外来遺伝子発現産物
を回収し、精製する。外来遺伝子発現産物は、以下のよ
うにして培養培地から回収し、精製することができる。 培養培地を透析膜、ホローファイバー等を用いて透析濃
縮する。もしくは、硫安を培養培地に添加し、外来遺伝
子発現産物を析出させ、遠心分離する。上記のようにし
て得られた外来遺伝子発現産物は、さらに、カラムクロ
マト法、電気泳動法、ゲル濾過法、アフィニティクロマ
ト法等を用いて精製することができる。このうち、アフ
ィニティクロマト法が好ましい。 【００４４】本発明の好ましい一実施態様において、Ｖ
ｅｒｏ−３１７細胞にＤＮＡの複製開始領域を有しない
ＳＶ４０ウィルス由来のラージＴ抗原遺伝子を導入し、
この細胞に、ヒト成長ホルモン遺伝子を含むプラスミド
ｐＸＧＨ５にＳＶ４０ＤＮＡ複製開始領域を組み込んだ
組み換え体ＤＮＡであるｐＸＧＨ５ｏｒｉを導入して形
質転換体を得、この形質転換体をｂＭＥＭ培地で培養し
てヒト成長ホルモンを製造させる。 【００４５】 【発明の効果】本発明の動物細胞により、哺乳類動物に
対して有用な物質を大量に、かつ、簡易に製造すること
が可能になった。また、本発明の動物細胞により、哺乳
類動物に対して有用な物質を製造した後、これを回収し
、精製することが容易になった。 【００４６】 【実施例】以下に、本発明を実施例を用いて、さらに具
体的に説明するが、本発明は、実施例に限定されるもの
ではない。 （実施例１） ＳＶ４０ウィルスのラージＴ抗原遺伝子のＶｅｒｏ−３
１７細胞への導入Ｖｅｒｏ−３１７細胞（理化学研究所
細胞銀行より入手した）１０６個を、５％（Ｖ／Ｖ）の
新生児ウシ血清を添加したＭＥＭ培地（以下、「増殖培
地」と記す）５ｍｌで３７℃、５％炭酸ガスを含む空気
下で３日間培養した。 【００４７】また、ｐＳＶｔｓＡ５８ｏｒｉ（−）を以
下のようにして調製した。ＳＶ４０ウィルスの温度感受
性変異株ｔｓＡ５８のＤＮＡをベクターｐＢＲ３２２に
含むプラスミドｐＳＶｔｓＡ５８（東京大学薬学部帯刀
益夫助教授より分与）を制限酵素ＳｆｉＩで切断したＤ
ＮＡ１５．６μｇの断端を、マンビーンヌクレアーゼ（
Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅ、宝酒造株式会
社製、２５単位）で処理し、ブラントエンドとした。処
理後の該ＤＮＡ断端を、ＤＮＡリガーゼを用いて結合さ
せた。この操作は、「モレキュラークローニング」、第
１．５３〜１．７３頁の記載に準じて行った。得られた
環状ＤＮＡを「モレキュラークローニング」、第１．１
〜１．１１０ 頁に記載の方法に従って、クローニング
し、該ＤＮＡ断端の再結合部分が制限酵素ＳａｃＩＩに
よって切断されるようになったクローンＤＮＡを選択し
た。該クローンＤＮＡがプラスミドｐＳＶｔｓＡ５８ｏ
ｒｉ（−）であった。プラスミドｐＳＶｔｓＡ５８ｏｒ
ｉ（−）は、選択するクローンにより、２種類存在した
。これらをプラスミドｐＳＶｔｓＡ５８ｏｒｉ（−）−
１及びプラスミドｐＳＶｔｓＡ５８ｏｒｉ（−）−２と
同定し、その制限酵素地図を図１及び図２に示した。プ
ラスミドｐＳＶｔｓＡ５８ｏｒｉ（−）−２は、理化学
研究所遺伝子銀行で入手可能とした。 【００４８】プラスミドｐＳＶｔｓＡ５８ｏｒｉ（−）
を制限酵素ＢａｍＨＩ 及びＢｇＩＩ（宝酒造製）で十
分に消【００４９】 【外６】 【００５０】ｄ Ｂ． Ｈｏｗａｒｄ， Ｍｏｌ． Ｃ
ｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ２ ：１０４４， １９８２
に記載されている。本実施例においては、大阪大学微生
物病研究所、岡田博人教授より入手した）を制限酵素Ｐ
ｖｕＩＩとＢａｍＨＩ（宝酒造株式会社製）で十分に消
化したＤＮＡ断片２μｇ を表１に記載した組成のマン
ニトール培地１ｍｌに溶解した。 【００５１】 【表１】 【００５２】上記の培養したＶｅｒｏ−３１７細胞をカ
ルシウム、マグネシウムを添加していないダルベッコの
りん酸緩衝生理食塩水（以下「ＰＢＳ（─）」と記す）
で十分に洗浄し、これにＰＢＳ（─）に溶解した０．２
５％（Ｗ／Ｖ）のトリプシン液１ ｍｌを添加し、直ち
にトリプシン液を吸収除去した。このＶｅｒｏ−３１７
細胞を３７℃に２〜３分間保温した。上記のトリプシン
処理したＶｅｒｏ−３１７細胞約２００，０００個を、
上記 【００５３】 【外７】 【００５４】トール培地に懸濁した。この懸濁マンニト
ール培地に、プロジェネーター（ホーファー・サイエン
テフィック・インスツルメント社製、カルフォルニア、
米国）を用いて、４８０Ｖの直流電圧を１ｍｓかけた。 この電圧印加を、約１分の時間間隔をおいて、５回繰り
返した。その後、この懸濁液を１５ｍｌ容量の遠心管に
移し、１０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を除去した
。残った沈澱物に増殖培地５ｍｌを加えた後、この懸濁
液を直径６ｃｍ、高さ１ｃｍの培養皿に移し、Ｖｅｒｏ
−３１７細胞を３７℃、５％炭酸ガスを含む空気下で５
日間培養した。その後、培養上清を捨て、増殖培地を抗
生物質Ｇ４１８（シグマ社製）を最終濃度で４００μｇ
／ｍｌ含有する増殖培地に交換し、Ｖｅｒｏ−３１７細
胞を３７℃、５％炭酸ガスを含む空気下で２５日間、培
養した。その結果、２３個のコロニーが生じた。この各
コロニーの周囲を抗生物質検定用カップで囲み、０．２
５％（Ｗ／Ｖ）トリプシン液０．５ｍｌを加え、直ちに
トリプシン液を捨て、３７℃で３〜５分間インキュベー
トし、その後増殖培地０．５ｍｌを加えて細胞を懸濁し
た。上記のようにして、個別にクローニングした各クロ
ーン細胞１，０００個を０．５ｍｌの増殖培地中で３７
℃、５％炭酸ガスを含む空気下で５日間培養した。これ
を、１０％（Ｖ／Ｖ）ホルマリン−ＰＢＳ（─）液で１
０分間固定し、９５％（Ｖ／Ｖ）エタノールで洗浄し、
ＰＢＳ（─）に溶解した抗ラージＴ抗原モノクローナル
抗体（東京大学医科学研究所、山口宣生教授より分与）
５０μｌを添加し、３７℃に３０分間保温した。これを
ＰＢＳ（─）で十分にすすいだ後、ＰＢＳ（─）に溶解
したＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ザイメット社製
）５０μｌ を添加し、３７℃に３０分間保温した。こ
れをＰＢＳ（─）で十分すすいだ後、オリンパス社製蛍
光顕微鏡を用いて、ラージＴ抗原を発現しているクロー
ンを検索した。その結果、３クローンの細胞株が得られ
、各々、Ｖｅｒｏｔｓ Ｓ１、Ｖｅｒｏｔｓ Ｓ２、Ｖ
ｅｒｏｔｓ Ｓ３と命名した。 【００５５】上記細胞株のうち、Ｖｅｒｏｔｓ Ｓ３は
、平成２年９月２５日付けで工業技術院微生物工業技術
研究所に受託番号微工研条寄第３３７０号（ＦＥＲＭ
ＢＰ−３３７０）として受託された。親株のＶｅｒｏ
−３１７細胞及びＶｅｒｏｔｓ Ｓ３細胞の各々３×１
０４個を直径３．５ｃｍ、高さ０．５ｃｍの培養皿に植
えこみ、細胞が培養皿の培養面に付着したのを確認して
からｂＭＥＭ培地で十分すすぎ、最終的に５ｍｌのｂＭ
ＥＭ培地を加えて、３７℃５％炭酸ガスを含む空気下で
７日間培養し、その間の細胞の増殖速度を以下のように
して測定した。培養細胞をＰＢＳ（─）で十分すすぎ、
０．２５％（Ｖ／Ｖ）トリプシン液を培養面積１ｃｍ２
当たり０．１ｍｌ加え、３７℃に５分間保温した。培
養面に付着している細胞が全部はがれたことを確認して
から、浮遊している細胞数をタタイ式血球計算盤で計数
した。その結果を表２に示す。 【００５６】 【表２】 【００５７】また、上記の３クローン及び親株のＶｅｒ
ｏ−３１７細胞を３７℃５％炭酸ガスを含む空気下で７
日間ｂＭＥＭ培地で培養した後、ラージＴ抗原の発現性
を上記の方法によって検出した。その結果を表３に示す
。 【００５８】 【表３】 【００５９】上記の表２及び表３から明らかなように、
Ｖｅｒｏｔｓ Ｓ３ 細胞はｂＭＥＭ培地でも親株のＶ
ｅｒｏ−３１７細胞と同程度の増殖を続けた。また、３
クローンともラージＴ抗原の発現性に変化はなかった。 （実施例２） Ｖｅｒｏｔｓ Ｓ１細胞、Ｖｅｒｏｔｓ Ｓ２細胞、及
びＶｅｒｏｔｓ Ｓ３細胞の形質転換体を利用したヒト
成長ホルモンの製造ヒト成長ホルモン遺伝子を含むプラ
スミドｐＸＧＨ５（日本メジフィジックス社製）にＳＶ
４０ウィルスのＤＮＡ複製開始領域を挿入したプラスミ
ドｐＸＧＨ５ｏｒｉを以下のように作製した。 【００６０】 【外８】 【００６１】 【外９】 【００６２】で合成したＤＮＡ断片 ５′─ＣＴＣＧＡＧ−３′ ３′−ＧＡＧＣＴＣ−５′ をＤＮＡリガーゼで結合させた後、制限酵素ＸｈｏＩ（
宝酒造株式会社製）で消化した。 【００６３】一方、ｐＸＧＨ５ は制限酵素ＨｉｎｄＩ
ＩＩとＳａｌＩ（宝酒造株式会社製）で消化し、アガロ
ースゲル電気泳動法によって６．７ｋｂのＤＮＡ断片を
得た。これを前記のＸｈｏＩで消化したＤＮＡ断片と混
合し、ＤＮＡリガーゼで結合させ、ｐＸＧＨ５ｏｒｉを
得た。ＤＮＡリガーゼによる結合方法は、「モレキュラ
ークローニング」第１．５３〜１．７３頁の記載に従っ
た。 【００６４】２０μｇのプラスミドｐＸＧＨ５ｏｒｉを
１．５ｍｌのｂＭＥＭ培地に溶解した。図３にプラスミ
ドｐＸＧＨ５ｏｒｉの制限酵素地図を示す。ＤＮＡ導入
補助剤リポフェクチン（ベセスダリサーチラボラトリー
ズ社製）５０μｇ をｂＭＥＭ培地１．５ｍｌに溶解し
た。約１０００，０００個のＶｅｒｏｔｓ Ｓ１細胞及
び３ｍｌのｂＭＥＭ培地を含む直径６ｃｍ、高さ１ｃｍ
の培養皿中の培養液から培地を除いた後、プラスミドｐ
ＸＧＨ５ｏｒｉを含むｂＭＥＭ培地とリポフェクチンを
含有するｂＭＥＭ培地を併せて、添加した。３３℃、５
％炭酸ガスを含む空気下で６時間培養後、培養上清を捨
て、増殖培地４ｍｌを加えて３３℃、５％炭酸ガスを含
む空気下で２４時間以上培養した。増殖培地は、２４時
間毎に新鮮な増殖培地４ｍｌに交換した。この増殖培地
の培養上清１００μｌ を取り、Ｔｒａｎ−ＧＥＳキッ
ト（日本メフィジックス社製）を用いてヒト成長ホルモ
ン濃度を測定した。 【００６５】上記の操作をＶｅｒｏ−３１７細胞、Ｖｅ
ｒｏｔｓ Ｓ２細胞、Ｖｅｒｏｔｓ Ｓ３細胞を用いて
繰り返した。さらに、比較例として、上記の操作をＣＯ
Ｓ−１細胞（ 理化学研究所細胞銀行から入手）を用い
て繰り返した。 その結果を表４に示す。 【００６６】 【表４】 【００６７】表４から明らかなように、Ｖｅｒｏｔｓ
Ｓ３ 細胞は、プラスミド導入後４日以後、ＣＯＳ−１
細胞よりも多量のヒト成長ホルモンを産生した。ＣＯＳ
−１細胞はラージＴ抗原を常時発現していることが知ら
れている（実施例３） Ｖｅｒｏｔｓ Ｓ３細胞の形質転換体を利用したヒト成
長ホルモンの製造実施例２と同じ手順で、プラスミドｐ
ＸＧＨ５ｏｒｉをＶｅｒｏｔｓ Ｓ３細胞に導入して、
得られた形質転換体を３３℃及び３７℃で培養した。 【００６８】また、比較サンプルとしては、ＣＯＳ−７
細胞（ 理化学研究所細胞銀行から入手） を用いた。 上記の形質転換体によるヒト成長ホルモンの産生状況を
表５に示す。 【００６９】 【表５】 【００７０】（実施例４）Ｖｅｒｏｔｓ Ｓ３ 細胞の
形質転換体を利用したヒト成長ホルモンの製造（プラス
ミドｐＸＧＨ５とｐＸＧＨ５ｏｒｉを使用した場合の比
較）実施例２と同じ手順で、Ｖｅｒｏｔｓ Ｓ３ 細胞
にプラスミドｐＸＧＨ５又はｐＸＧＨ５ｏｒｉを導入し
、得られた形質転換体を培養した。 【００７１】上記の形質転換体によるヒト成長ホルモン
の産生状況を表６に示す。 【００７２】 【表６】 【００７３】表６からわかるように、導入するプラスミ
ドにＤＮＡ複製開始領域ｏｒｉが含まれている場合には
、ヒト成長ホルモンの産生量は、非常に上昇した。 （ 実施例５） Ｖｅｒｏｔｓ Ｓ３ 細胞の形質転換体を利用したヒト
成長ホルモンの製造（培地を増殖培地からｂＭＥＭに変
更した例）プラスミド導入後５日目に、培地を血清を含
有する増殖培地からｂＭＥＭ培地に変更し、その後、２
４時間毎に培地を新鮮なｂＭＥＭ培地４ｍｌに交換して
培養を継続した他は、実施例４の手順を繰り返した。 【００７４】上記の培養条件下での、Ｖｅｒｏｔｓ Ｓ
３細胞の形質転換体によるヒト成長ホルモンの産生状況
を表７に示す。 【００７５】 【表７】 【００７６】５日目のデータは、血清を含有する増殖培
地中で上記形質転換体が産生したヒト成長ホルモンの濃
度である。尚、ｐＸＧＨ５ をＶｅｒｏｔｓ Ｓ３ 細
胞に導入した形質転換体の、導入後８日目のヒト成長ホ
ルモン濃度は測定しなかった。表７からわかるように、
プラスミド導入後６日目までは、形質転換体は、いずれ
も高いヒト成長ホルモンの産生能を有していた。導入後
１１日目でも、ｐＸＧＨ５ｏｒｉを導入したＶｅｒｏｔ
ｓ Ｓ３細胞では、ｐＸＧＨ５ を導入したＶｅｒｏｔ
ｓ Ｓ３細胞に対し１０倍のヒト成長ホルモンの産生能
を有していた。
含有しない培地で増殖可能で、かつ、外来遺伝子の複製
を促進できる物質を含有する動物細胞、該動物細胞に発
現可能な外来遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡを導入した
形質転換体、及び該形質転換体を用いて外来遺伝子発現
産物を製造する方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】特定の遺伝子を組み込んだＤＮＡを培養
細胞に導入し、その遺伝子を発現せしめ、その発現産物
を取得するＤＮＡ組換え技術は既に広く普及している。 現在、培養可能な動物細胞でこの目的に使用されている
ものの大半は、血清等の化学的組成が不明の天然物を含
む培地中で生育されている。その例としては、マウスイ
ンターフェロンγを産生するＣＯＳ−１細胞をダルベッ
コ改変最小必須培地で培養することが知られている（Ｐ
． Ｗ． Ｇｒａｙ， Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ
， ８０： ５８４２−５８４６， １９８３）。その
ため、目的とする遺伝子産物を回収し精製する際、不純
物の除去に多大の労力を要している。この問題を解決す
るために、目的とする遺伝子産物を発現するように形質
転換した培養細胞を、適宜、血清含有培地培養から無血
清培地培養に変更して培養し、遺伝子産物の回収、精製
を容易にする方法が一般に採られている。 【０００３】しかるに、血清含有培地から無血清培地に
変更すると、培養細胞の増殖能は急速に低下する。これ
を防ぐためには、無血清培地中に、インスリン、トラン
スフェリン、アルブミン等の蛋白性物質の添加が必要と
される。これらの蛋白性物質は、他の培地成分である低
分子化合物に比べ、精製が困難で価格が高いため、培地
の価格を上昇せしめる要因となっている。 【０００４】蛋白性物質を含有しない培地で増殖できる
動物細胞としては、アフリカミドリザル腎臓由来Ｖｅｒ
ｏ−３１７細胞、マウス由来Ｌ−Ｐ３細胞、及びヒト子
宮癌由来ＨｅＬａ−Ｐ３ 細胞等が知られているが、こ
れらの細胞が外来遺伝子を核染色体に組み込むことなく
増幅できたことは報告されていない。ＤＮＡ組み換え技
術においてベクターとして使用されるウィルス由来等の
ＤＮＡのなかには、宿主細胞中において、宿主細胞の核
染色体に組み込まれることなく増幅されるものがある。 例えば、ＳＶ４０ウィルスＤＮＡの複製開始領域を含む
環状二本鎖ＤＮＡをＳＶ４０ウィルス由来のラージＴ抗
原を含むサルの細胞中に導入すると宿主細胞の核染色体
に組み込まれることなく、そのＤＮＡが複製され増幅す
る（内田驍、大石道夫、古沢満編、動物細胞利用実用化
マニュアル、ＰＰ．３８８−３９３ 、（株）エル・ア
イ・シー、１９８４年）。また、バキュロウィルスＤＮ
Ａを昆虫細胞中に導入すると宿主細胞の核染色体に組み
込まれることなく、バキュロウィルスＤＮＡが複製され
増幅する（前田進、実験医学、第７巻、Ｎｏ．１３ 、
１９８９年、第１４６ 〜第１５１頁、Ｓｅｋｉｎｅ
ｅｔ ａｌ， Ｇｅｎｅ， ｖｏｌ．６５， ｐ１８７
，（１９８８） 、及び Ｍｉｙａｊｉｍａ ｅｔ ａ
ｌ， Ｇｅｎｅ， ｖｏｌ．５８， ｐ２７３， （１
９８７））。 【０００５】現在、導入された外来遺伝子を核染色体に
組み込むことなく増幅できる動物細胞で、実質的に蛋白
性物質を含有しない培地で増殖可能なものは知られてい
ない。 【０００６】 【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、導
入された外来遺伝子を核染色体に組み込むことなく増幅
でき、かつ、実質的に蛋白性物質を含有しない培地で増
殖可能な動物細胞を提供することを目的とする。 【０００７】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意努力
した結果、実質的に蛋白性物質を含有しない培地で増殖
可能な動物細胞に外来遺伝子の複製を促進できる物質を
含有させることにより、外来遺伝子を核染色体に組み込
むことなく複製できることを見出し、本発明を完成させ
るに至った。 【０００８】本発明の動物細胞に発現可能な外来遺伝子
を含む組み換え体ＤＮＡを導入した形質転換体は、実質
的に蛋白性物質を含有しない培地中で培養することがで
き、また大量の外来遺伝子産物を発現させることができ
る。以下、本発明を詳細に説明する。本発明の、実質的
に蛋白性物質を含有しない培地で増殖可能で、かつ、外
来遺伝子の複製を促進できる物質を含有する動物細胞は
、以下のようにして作製することができる。 【０００９】まず、実質的に蛋白性物質を含有しない培
地で増殖できることのわかっている動物細胞を用意する
。上記の蛋白性物質は、インスリン、トランスフェリン
、アルブミン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、上
皮成長因子、インスリン様成長因子、ファイブロブラス
トグロースファクター等の蛋白性成分の他、血清、血漿
、乳汁等の化学的成分の不明の天然物を含有するものも
含む。 【００１０】「実質的に蛋白性物質を含有しない培地」
とは、蛋白性物質の含有率が０〜０．００１％、好まし
くは０％である培地をいう。蛋白性物質を含有しない培
地の例としては、ビオチンを終濃度０．０２ｍｇ／ｌ添
加した最小必須培地（以下、「ｂＭＥＭ培地」と記す）
、ＤＭ−１６０培地、Ｆ−１２培地、ダルベッコ改変最
小必須培地とＦ−１２培地の等量混合培地等が挙げられ
る。このうち、ｂＭＥＭ培地、ＤＭ−１６０培地が好ま
しい。 【００１１】上記の動物細胞は、哺乳類動物より分離培
養化された細胞を含む。実質的に蛋白性物質を含有しな
い培地で増殖できることのわかっている動物細胞の例と
しては、アフリカミドリザル腎臓由来Ｖｅｒｏ−３１７
細胞、マウス由来Ｌ−Ｐ３細胞、ヒト子宮癌由来ＨｅＬ
ａ−Ｐ３ 細胞（上記細胞は、理化学研究所細胞銀行よ
り入手可能）、チャイニーズハムスター由来ＣＨＬ−１
細胞及びＣＨＤ−３Ａ細胞（Ｒ． Ｇ． Ｈａｍ，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ
， ５３ ： ２８８−２９３， １９６５ ） 等を
挙げることができる。このうち、Ｖｅｒｏ−３１７細胞
が好ましい。 【００１２】次に、外来遺伝子の複製を促進できる物質
を調製する。上記の外来遺伝子は、細胞外から導入する
遺伝子を含む。上記の外来遺伝子の複製を促進できる物
質は、外来遺伝子の遺伝情報と同一のコピーを少なくと
も一以上複製するように促進できるあらゆる物質を含む
。外来遺伝子の複製を促進できる物質の例としては、Ｓ
Ｖ４０ウイルス由来のラージＴ抗原、ポリオーマウィル
ス由来のラージＴ抗原等、これらの蛋白を発現する遺伝
子を含むＤＮＡ、及びバキュロウィルスＤＮＡ等が挙げ
られる。このうち、ＳＶ４０ウイルス由来のラージＴ抗
原遺伝子を含むＤＮＡが好ましい。外来遺伝子の複製を
促進できる物質が、ウィルス由来のＤＮＡである場合に
は、該ＤＮＡ中にＤＮＡ複製開始領域を含まないことが
好ましい。ラージＴ抗原を発現する遺伝子を含むＤＮＡ
の例としては、ＳＶ４０ウィルスＤＮＡ（ベセスダリサ
ーチラボラトリーズ社より入手可能）、プラスミドｐＳ
ＶｔｓＡ５８ｏｒｉ（−）（理化学研究所遺伝子銀行よ
り入手可能）等を挙げることができる。このうち、ｐＳ
ＶｔｓＡ５８ｏｒｉ （−）が好ましい。 【００１３】ＳＶ４０ウィルス由来のラージＴ抗原遺伝
子を含むＤＮＡは、例えば、以下のようにして調製する
ことができる。まず、ＳＶ４０ウィルスＤＮＡを切断す
るが、ラージＴ抗原遺伝子領域を切断できない制限酵素
を選択する。該制限酵素の例としては、Ｂｇ１Ｉ、Ｋｐ
ｎＩ、ＥｃｏＲＶ、ＡｃｃＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ
、ＴａｑＩ、ＮｄｅＩ等が挙げられる。 該制限酵素でＳＶ４０ウィルスＤＮＡを十分消化し、消
化したＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離
し、ラージＴ抗原遺伝子を含むＤＮＡ断片を採取する。 これを外来遺伝子として、ベクターＤＮＡへ組み込んで
組み換え体ＤＮＡを作製する。この組み換え体ＤＮＡは
、ジェイ． サンブルックらの文献（Ｊ． Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ， Ｅ． Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ． Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ−
Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏ
ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９ （ 以
下、「モレキュラークローニング」と記す））の第１．
５３〜第１．７３頁の記載に準じて作製することができ
る。ベクターＤＮＡとしては、既存のいかなるベクター
も使用することができる。その例としては、ＳＶ【００
１４】 【外１】 【００１５】１ＭＴＨＡ、ｐＨＥＢｏ、ｐ２０５、ｐＭ
Ｔ３ＳＶ２（ 「モレキュラークローニング」， 第
１６．１−第１６．８１ 頁） 、ＣＤＭ８、ｐ９１０
２３（Ｂ） 、ｐｃＤＬ−ＳＲα２９６ （武部豊、実
験医学別冊（村松正実・岡山博人編、羊土社、東京、１
９９１年） 、第２９２頁〜第２９７頁）、ｐＢＲ３２
２、ｐＵＣ１２ 、ｐＵＣ１８ 、ｐＵＣ１９ （ 「
モレキュラークローニング」， 第１．１２− 第１．
２０、第 ４．１０−第４．１１頁） 等を挙げること
ができる。このうち、ｐＢＲ３２２、及び、ｐＵＣ１９
が好ましい。他のウィルス由来のラージＴ抗原遺伝子
を含むＤＮＡも、該ウィルスＤＮＡを切断するが、ラー
ジＴ抗原遺伝子領域を切断できない制限酵素を選択して
、上記の操作を繰り返すことにより調製することができ
る。 【００１６】また、ＳＶ４０ウィルスＤＮＡをベクター
ＤＮＡに組み込むことなく、そのまま用いてもよい。ま
た、制限酵素等でＳＶ４０ウィルスＤＮＡを十分消化し
たＤＮＡ断片、あるいは、制限酵素等でＳＶ４０ウィル
スＤＮＡを十分消化したＤＮＡ断片から分離したラージ
Ｔ抗原遺伝子を含むＤＮＡ断片をベクターＤＮＡに組み
込むことなく用いてもよい。ＳＶ４０ウィルスＤＮＡ、
あるいは、制限酵素等でＳＶ４０ウィルスＤＮＡを十分
消化したＤＮＡ断片を用いる場合には、ＤＮＡ複製開始
領域を除去することが好ましい。他のウィルス由来のラ
ージＴ抗原遺伝子を含むＤＮＡについても同様である。 【００１７】外来遺伝子の複製を促進できる物質を上記
のようにして作製した後、上記の実質的に蛋白性物質を
含有しない培地で増殖可能な動物細胞に導入する。外来
遺伝子の複製を促進できる物質を動物細胞に導入する際
、外来遺伝子の複製を促進できる物質の動物細胞に対す
る比率は、細胞１０５個当たり０．１μｇ〜０．１ｍｇ
であり、このうち、０．５ 〜２０μｇが好ましい。 【００１８】外来遺伝子の複製を促進できる物質を動物
細胞に導入する前に、動物細胞を前培養する。この培地
としては、ウシ胎児血清、ウシ新生児血清、子ウシ血清
、及び／又はウマ血清等を０．５〜２０％（Ｖ／Ｖ）添
加した最小必須培地（以下、「ＭＥＭ培地」と記す）、
ＤＭ−１６０培地、Ｆ−１２培地、ダルベッコ改変最小
必須培地等をあげることができ、このうち、ウシ新生児
血清５％（Ｖ／Ｖ）添加したＭＥＭ培地が好ましい。動
物細胞を上記の培地中で、３３〜４０℃、５〜１０％の
炭酸ガスを含む空気下で、１〜１０日間培養することが
できるが、このうち、３７℃、５％の炭酸ガスを含む空
気下で２日間培養することが好ましい。 【００１９】上記のように前培養した動物細胞に、外来
遺伝子の複製を促進できる物質を導入する。外来遺伝子
の複製を促進できる物質を動物細胞へ導入する方法とし
ては、電界刺激法、マイクロインジェクション法、赤血
球ゴースト融合法、リポソーム融合法、ＤＮＡ導入補助
剤を用いる方法等を挙げることができる。このうち、外
来遺伝子の複製を促進できる物質がＤＮＡの場合には、
ＤＮＡ導入補助剤を用いる方法が好ましい。ＤＮＡ導入
補助剤の例としては、りん酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デ
キストラン、ポリブレン、リポフェクチン、ＤＯＴＭＡ
を挙げることができ、このうち、リポフェクチンが好ま
しい。外来遺伝子の複製を促進できる物質がＤＮＡ以外
の場合には、マイクロインジェクション法が好ましい。 【００２０】上記の外来遺伝子の複製を促進できる物質
は、外来遺伝子をベクターＤＮＡに組み込んだ組み換え
体ＤＮＡを動物細胞に導入する前後または同時に、該細
胞に導入することができる。また、該物質がＤＮＡの場
合には、外来遺伝子を組み込むベクターＤＮＡにこのＤ
ＮＡを組み込んで、この組み換え体ＤＮＡを動物細胞に
導入してもよい。例えば、外来遺伝子の複製を促進でき
る物質としてバキュロウィルスＤＮＡを使用する場合に
は、バキュロウィルスＤＮＡの多角体遺伝子領域に外来
遺伝子を組み込んだ組み換え体ＤＮＡとして昆虫細胞に
導入することができる。 【００２１】上記の外来遺伝子の複製を促進できる物質
を含有する細胞を選択及び確認する方法としては、間接
蛍光抗体染色法、薬剤耐性選択培地培養法等を挙げるこ
とができる。薬剤耐性選択培地培養法をとるときには、
上記の外来遺伝子の複製を促進できる物質を動物細胞に
導入する際、同時に薬剤に対する耐性遺伝子を含むＤ【
００２２】 【外２】 【００２３】。これらの方法のうち、間接蛍光抗体染色
法が好ましい。 上記の外来遺伝子の複製を促進でき
る物質を含有する動物細胞において、外来遺伝子の複製
を促進できる物質は、動物細胞の細胞質中に存在し得る
。 また、上記の外来遺伝子の複製を促進できる物質がＤＮ
Ａである場合には、該物質は、動物細胞の核染色体に組
み込まれても、また組み込まれていなくてもよい。 【００２４】上記のようにして作製した、実質的に蛋白
性物質を含有しない培地で増殖可能で、かつ、外来遺伝
子の複製を促進できる物質を含有する動物細胞は、外来
遺伝子を導入したとき、外来遺伝子の複製が促進されて
外来遺伝子発現産物の高い産生能を有する。また、上記
動物細胞は、外来遺伝子を導入したとき、外来遺伝子を
動物細胞の核染色体に組み込むことなく複製することが
できる。 【００２５】上記のようにして作製した、実質的に蛋白
性物質を含有しない培地で増殖可能で、かつ、外来遺伝
子の複製を促進できる物質を含有する動物細胞に、発現
可能な外来遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡを導入して、
形質転換体を作製することができる。本明細書中、「発
現」とは、該遺伝子に相当するＤＮＡ配列がメッセンジ
ャーＲＮＡに転写されることと定義される。 【００２６】発現可能な外来遺伝子を含む組み換え体Ｄ
ＮＡとしては、発現可能な外来遺伝子を適当なベクター
に組み込んだいかなるものも使用することができる。ま
た、該組み換え体ＤＮＡは、ＤＮＡ複製開始領域の全部
あるいは一部、及び／又はプロモーターを更に含むこと
が好ましい。ＤＮＡの複製開始領域としては、外来遺伝
子の複製を促進できる物質によって組み換え体ＤＮＡに
組み込まれた外来遺伝子の複製を開始するいかなるもの
も使用することができる。このうち、ＳＶ４０ウィルス
のＤＮＡ複製開始領域が好ましい。プロモーターの例と
しては、ＭＭＴＶ−ＬＴＲ（ 【００２７】 【外３】 【００２８】ックス社、プラスミドｐＴＫＧＨ として
入手可能）、ｍＭＴ−１ （ 日本メジフィジックス社
、プラスミドｐＸＧＨ５として入手可能）等が挙げられ
る。ＤＮＡの複製開始領域の全部あるいは一部、及び／
又はプロモーターを含む組み換え体ＤＮＡを用いること
により、宿主細胞中での外来遺伝子の複製量を増大させ
ることができる。組み換え体ＤＮＡの例としては、ｐＸ
ＧＨ５ 、ｐＴＫＧＨ 、及びｐΦＧＨ（ メジフィジ
ックス社製） 等を挙げることができる。 【００２９】また、組み換え体ＤＮＡは、以下のように
して作製してもよい。まず、発現可能な外来遺伝子を調
製する。発現可能な外来遺伝子の例としては、ヒト成長
ホルモン、ヒトインシュリン、ヒトセクレチン、ヒトエ
リスロポエチン等のペプチド性ホルモンの遺伝子、ヒト
血小板由来成長因子、ヒト上皮成長因子等の成長因子の
遺伝子、ヒトテッシュ−プラスミノーゲンアクチベータ
ー、ヒトアルブミン、ヒトフィブロネクチン等の蛋白の
遺伝子、ヒトミック遺伝子並びにヒトラス遺伝子等の発
癌遺伝子等を挙げることができる。これらの遺伝子は、
ヒトの脳下垂体、膵臓、腸管、腎臓、骨髄、血管、肝臓
、脾臓等の細胞の染色体ＤＮＡから採取することができ
、また、ヒトの食道、胃、脾臓、肝臓、腎臓、大腸、脳
、皮膚等に発生した腫瘍組織等の細胞中のメッセンジャ
ーＲＮＡを鋳型として酵素的に製造することもできるし
、さらに、化学的に合成してもよい。 【００３０】上記の発現可能な外来遺伝子をパッセンジ
ャーとしてプラスミド、ウィルスＤＮＡ等のベクターＤ
ＮＡに組み込んで、組換え体ＤＮＡを作製する。ベクタ
ーＤＮＡの例としては、ＳＶ４０ウィルス由来ＤＮＡの
全部もしくは一部、牛乳頭腫ウィルス由来ＤＮＡの全部
もしくは一部、ポリオーマウィルス由来ＤＮＡの全部も
しくは一部、Ｌ因子由来ＤＮＡの全部もしくは一部、ア
デノウィルス由来の全部もしくは一部、ワクシニアウィ
ルス由来ＤＮＡの全部もしくは一部、エプシュタイン・
バールウィルス由来ＤＮＡの全部もしくは一部、レトロ
ウィルス由来ＲＮＡより逆転写したＤＮＡの全部もしく
は一部を挙げることができる。上記ベクターＤＮＡは、
ＤＮＡの複製開始領域を含むことが好ましい。ＤＮＡの
複製開始領域としては、外来遺伝子の複製を促進できる
物質によって組み換え体ＤＮＡに組み込まれた外来遺伝
子の複製を開始するいかなるものも使用することができ
る。 このうち、ＳＶ４０ウィルスのＤＮＡ複製開始領域が好
ましい。具体的なベクターＤＮ 【００３１】 【外４】 【００３２】ましい。また、これらのベクターは、プラ
スミドとしての機能部分とベクターとしての複製開始領
域を有していれば、目的とする外来遺伝子を組み込む際
、適宜改変して用いてもよい。ベクターＤＮＡへの外来
遺伝子の組み込みは、以下のようにして行うことができ
る。ベクターＤＮＡを一箇所しか切断しない制限酵素を
選択し、該制限酵素でベクターＤＮＡを消化する。これ
に外来遺伝子をＤＮＡリガーゼを用いて結合させる。 この詳細な手順は、「モレキュラークローニング」の第
１．５３〜第１．７３頁に記載されている通りである。 上記のようにして、発現可能な外来遺伝子をベクターＤ
ＮＡに組み込んで、組換え体ＤＮＡが作製される。 【００３３】この組換え体ＤＮＡには、さらにプロモー
ターを挿入してもよい。プロモータ 【００３４】 【外５】 【００３５】可能） 、ＴＫ（ 日本メジフィジックス
社、プラスミドｐＴＫＧＨ として入手可能）、ｍＭＴ
−１ （ 日本メジフィジックス社、プラスミドｐＸＧ
Ｈ５として入手可能）等が挙げられる。上記のプロモー
ターは、外来遺伝子の組み込みと同じ手順に従って、組
み換え体ＤＮＡに挿入すればよい。上記の組換え体ＤＮ
Ａを上記の動物細胞に導入して形質転換体を作製するこ
とができる。動物細胞への組換え体ＤＮＡの導入の際、
組換え体ＤＮＡの動物細胞に対する比率は、１０５個の
細胞に対して０．１〜１００μｇ であり、このうち、
１〜１０μｇ が好ましい。 【００３６】組換え体ＤＮＡの導入を行う前に、動物細
胞を前培養するが、この培地としては、ウシ胎児血清、
ウシ新生児血清、子ウシ血清、及び／又はウマ血清等を
０．５〜２０％（Ｖ／Ｖ）添加した最小必須培地（以下
、「ＭＥＭ培地」と記す）、ＤＭ−１６０培地、Ｆ−１
２培地、ダルベッコ改変最小必須培地等を挙げることが
でき、このうち、ウシ新生児血清５％（Ｖ／Ｖ）添加し
たＭＥＭ培地が好ましい。また、動物細胞を上記の培地
中で、３２〜４０℃、５〜１０％の炭酸ガスを含む空気
下で、１〜１０日間培養することができるが、このうち
、３７℃、５％の炭酸ガスを含む空気下で２日間培養す
ることが好ましい。 【００３７】前培養した動物細胞に組み換え体ＤＮＡを
導入して、形質転換体を得ることができる。組換え体Ｄ
ＮＡを動物細胞に導入する方法としては、ＤＮＡ導入補
助剤を用いる方法、電界刺激法、マイクロインジェクシ
ョン法、リポソーム融合法、赤血球ゴースト融合法等を
挙げることができる。このうち、ＤＮＡ導入補助剤を用
いる方法が好ましい。ＤＮＡ導入補助剤の例としては、
りん酸カルシウム、ＤＥＡＥ─デキストラン、ポリブレ
ン（「モレキュラークローニング」、第１６．３０−第
１６．４７ 頁） 、リポフェクチン（べセスダリサー
チラボラトリーズ社）、ＤＯＴＭＡ（ベーリンガーマン
ハイム山之内株式会社）が挙げられ、このうち、リポフ
ェクチンが好ましい。 【００３８】組換え体ＤＮＡが導入された形質転換体の
選択及び確認は、形質転換体を培養して、ベクターＤＮ
Ａが有する標識遺伝子（栄養要求性や薬剤耐性遺伝子等
）や外来遺伝子の遺伝情報を発現させることにより行う
ことができる。上記のようにして作製した形質転換体は
、実質的に蛋白性物質を含有しない培地で増殖可能であ
り、また外来遺伝子発現産物の高い産生能を有する。 また、前記形質転換体は、外来遺伝子を宿主細胞の核染
色体に組み込むことなく複製することができる。 【００３９】上記のようにして得られた形質転換体は、
ウシ胎児血清、ウシ新生児血清、子ウシ血清、及び／又
はウマ血清等を０．５〜２０％（Ｖ／Ｖ）添加した最小
必須培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆ−１２培地、ダルベッ
コ改変最小必須培地等の培地中で、３３〜４０℃、５〜
１０％の炭酸ガスを含む空気下で、１〜１０日間培養す
ることができ、このうち、ウシ新生児血清５％（Ｖ／Ｖ
）添加したＭＥＭ培地中で、３７℃、５％の炭酸ガスを
含む空気下で２日間培養することが好ましい。 【００４０】上記の形質転換体を実質的に蛋白性物質を
含有しない培地中で培養しながら、外来遺伝子発現産物
を産生させる。培養方法としては、最初から実質的に蛋
白性物質を含有しない培地で培養しても、又は、当初は
蛋白性物質を含有する培地で培養し、次いで培地を実質
的に蛋白性物質を含有しない培地に変更して培養しても
よい。好ましくは、当初は蛋白性物質を含有する培地で
培養し、目的とする外来遺伝子発現産物の産生量が最大
値に達した時点で、適宜、培地を実質的に蛋白性物質を
含有しない培地に変更して培養する。 【００４１】蛋白性物質を含有する培地の例としては、
１０％（Ｖ／Ｖ）ウシ胎児血清含有ＭＥＭ培地、５％（
Ｖ／Ｖ）ウシ新生児血清含有ＭＥＭ培地、ＡＳＦ３０１
培地等を挙げることができる。このうち、５％（Ｖ／Ｖ
）ウシ新生児血清含有ＭＥＭ培地が好ましい。蛋白性物
質を含有しない培地の例としては、ｂＭＥＭ培地、ＤＭ
−１６０培地、Ｆ−１２培地、ダルベッコ改変最小必須
培地とＦ−１２培地の等量混合培地等を挙げることがで
きる。このうち、ｂＭＥＭ培地が好ましい。 【００４２】さらに、これらの培地にプロリン等の非必
須アミノ酸、アスコルビン酸等のビタミン、トリヨード
サイロニン等のホルモン等を添加してもよい。これらの
添加物は、外来遺伝子発現産物の収率を高めることがで
きる。形質転換体は、上記培地中で、３２〜４０℃、５
〜１０％の炭酸ガスを含む空気下で培養することができ
、このうち、３７℃、５％の炭酸ガスを含む空気下で培
養することが好ましい。 【００４３】上記の培養培地から、外来遺伝子発現産物
を回収し、精製する。外来遺伝子発現産物は、以下のよ
うにして培養培地から回収し、精製することができる。 培養培地を透析膜、ホローファイバー等を用いて透析濃
縮する。もしくは、硫安を培養培地に添加し、外来遺伝
子発現産物を析出させ、遠心分離する。上記のようにし
て得られた外来遺伝子発現産物は、さらに、カラムクロ
マト法、電気泳動法、ゲル濾過法、アフィニティクロマ
ト法等を用いて精製することができる。このうち、アフ
ィニティクロマト法が好ましい。 【００４４】本発明の好ましい一実施態様において、Ｖ
ｅｒｏ−３１７細胞にＤＮＡの複製開始領域を有しない
ＳＶ４０ウィルス由来のラージＴ抗原遺伝子を導入し、
この細胞に、ヒト成長ホルモン遺伝子を含むプラスミド
ｐＸＧＨ５にＳＶ４０ＤＮＡ複製開始領域を組み込んだ
組み換え体ＤＮＡであるｐＸＧＨ５ｏｒｉを導入して形
質転換体を得、この形質転換体をｂＭＥＭ培地で培養し
てヒト成長ホルモンを製造させる。 【００４５】 【発明の効果】本発明の動物細胞により、哺乳類動物に
対して有用な物質を大量に、かつ、簡易に製造すること
が可能になった。また、本発明の動物細胞により、哺乳
類動物に対して有用な物質を製造した後、これを回収し
、精製することが容易になった。 【００４６】 【実施例】以下に、本発明を実施例を用いて、さらに具
体的に説明するが、本発明は、実施例に限定されるもの
ではない。 （実施例１） ＳＶ４０ウィルスのラージＴ抗原遺伝子のＶｅｒｏ−３
１７細胞への導入Ｖｅｒｏ−３１７細胞（理化学研究所
細胞銀行より入手した）１０６個を、５％（Ｖ／Ｖ）の
新生児ウシ血清を添加したＭＥＭ培地（以下、「増殖培
地」と記す）５ｍｌで３７℃、５％炭酸ガスを含む空気
下で３日間培養した。 【００４７】また、ｐＳＶｔｓＡ５８ｏｒｉ（−）を以
下のようにして調製した。ＳＶ４０ウィルスの温度感受
性変異株ｔｓＡ５８のＤＮＡをベクターｐＢＲ３２２に
含むプラスミドｐＳＶｔｓＡ５８（東京大学薬学部帯刀
益夫助教授より分与）を制限酵素ＳｆｉＩで切断したＤ
ＮＡ１５．６μｇの断端を、マンビーンヌクレアーゼ（
Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅ、宝酒造株式会
社製、２５単位）で処理し、ブラントエンドとした。処
理後の該ＤＮＡ断端を、ＤＮＡリガーゼを用いて結合さ
せた。この操作は、「モレキュラークローニング」、第
１．５３〜１．７３頁の記載に準じて行った。得られた
環状ＤＮＡを「モレキュラークローニング」、第１．１
〜１．１１０ 頁に記載の方法に従って、クローニング
し、該ＤＮＡ断端の再結合部分が制限酵素ＳａｃＩＩに
よって切断されるようになったクローンＤＮＡを選択し
た。該クローンＤＮＡがプラスミドｐＳＶｔｓＡ５８ｏ
ｒｉ（−）であった。プラスミドｐＳＶｔｓＡ５８ｏｒ
ｉ（−）は、選択するクローンにより、２種類存在した
。これらをプラスミドｐＳＶｔｓＡ５８ｏｒｉ（−）−
１及びプラスミドｐＳＶｔｓＡ５８ｏｒｉ（−）−２と
同定し、その制限酵素地図を図１及び図２に示した。プ
ラスミドｐＳＶｔｓＡ５８ｏｒｉ（−）−２は、理化学
研究所遺伝子銀行で入手可能とした。 【００４８】プラスミドｐＳＶｔｓＡ５８ｏｒｉ（−）
を制限酵素ＢａｍＨＩ 及びＢｇＩＩ（宝酒造製）で十
分に消【００４９】 【外６】 【００５０】ｄ Ｂ． Ｈｏｗａｒｄ， Ｍｏｌ． Ｃ
ｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ２ ：１０４４， １９８２
に記載されている。本実施例においては、大阪大学微生
物病研究所、岡田博人教授より入手した）を制限酵素Ｐ
ｖｕＩＩとＢａｍＨＩ（宝酒造株式会社製）で十分に消
化したＤＮＡ断片２μｇ を表１に記載した組成のマン
ニトール培地１ｍｌに溶解した。 【００５１】 【表１】 【００５２】上記の培養したＶｅｒｏ−３１７細胞をカ
ルシウム、マグネシウムを添加していないダルベッコの
りん酸緩衝生理食塩水（以下「ＰＢＳ（─）」と記す）
で十分に洗浄し、これにＰＢＳ（─）に溶解した０．２
５％（Ｗ／Ｖ）のトリプシン液１ ｍｌを添加し、直ち
にトリプシン液を吸収除去した。このＶｅｒｏ−３１７
細胞を３７℃に２〜３分間保温した。上記のトリプシン
処理したＶｅｒｏ−３１７細胞約２００，０００個を、
上記 【００５３】 【外７】 【００５４】トール培地に懸濁した。この懸濁マンニト
ール培地に、プロジェネーター（ホーファー・サイエン
テフィック・インスツルメント社製、カルフォルニア、
米国）を用いて、４８０Ｖの直流電圧を１ｍｓかけた。 この電圧印加を、約１分の時間間隔をおいて、５回繰り
返した。その後、この懸濁液を１５ｍｌ容量の遠心管に
移し、１０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を除去した
。残った沈澱物に増殖培地５ｍｌを加えた後、この懸濁
液を直径６ｃｍ、高さ１ｃｍの培養皿に移し、Ｖｅｒｏ
−３１７細胞を３７℃、５％炭酸ガスを含む空気下で５
日間培養した。その後、培養上清を捨て、増殖培地を抗
生物質Ｇ４１８（シグマ社製）を最終濃度で４００μｇ
／ｍｌ含有する増殖培地に交換し、Ｖｅｒｏ−３１７細
胞を３７℃、５％炭酸ガスを含む空気下で２５日間、培
養した。その結果、２３個のコロニーが生じた。この各
コロニーの周囲を抗生物質検定用カップで囲み、０．２
５％（Ｗ／Ｖ）トリプシン液０．５ｍｌを加え、直ちに
トリプシン液を捨て、３７℃で３〜５分間インキュベー
トし、その後増殖培地０．５ｍｌを加えて細胞を懸濁し
た。上記のようにして、個別にクローニングした各クロ
ーン細胞１，０００個を０．５ｍｌの増殖培地中で３７
℃、５％炭酸ガスを含む空気下で５日間培養した。これ
を、１０％（Ｖ／Ｖ）ホルマリン−ＰＢＳ（─）液で１
０分間固定し、９５％（Ｖ／Ｖ）エタノールで洗浄し、
ＰＢＳ（─）に溶解した抗ラージＴ抗原モノクローナル
抗体（東京大学医科学研究所、山口宣生教授より分与）
５０μｌを添加し、３７℃に３０分間保温した。これを
ＰＢＳ（─）で十分にすすいだ後、ＰＢＳ（─）に溶解
したＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ザイメット社製
）５０μｌ を添加し、３７℃に３０分間保温した。こ
れをＰＢＳ（─）で十分すすいだ後、オリンパス社製蛍
光顕微鏡を用いて、ラージＴ抗原を発現しているクロー
ンを検索した。その結果、３クローンの細胞株が得られ
、各々、Ｖｅｒｏｔｓ Ｓ１、Ｖｅｒｏｔｓ Ｓ２、Ｖ
ｅｒｏｔｓ Ｓ３と命名した。 【００５５】上記細胞株のうち、Ｖｅｒｏｔｓ Ｓ３は
、平成２年９月２５日付けで工業技術院微生物工業技術
研究所に受託番号微工研条寄第３３７０号（ＦＥＲＭ
ＢＰ−３３７０）として受託された。親株のＶｅｒｏ
−３１７細胞及びＶｅｒｏｔｓ Ｓ３細胞の各々３×１
０４個を直径３．５ｃｍ、高さ０．５ｃｍの培養皿に植
えこみ、細胞が培養皿の培養面に付着したのを確認して
からｂＭＥＭ培地で十分すすぎ、最終的に５ｍｌのｂＭ
ＥＭ培地を加えて、３７℃５％炭酸ガスを含む空気下で
７日間培養し、その間の細胞の増殖速度を以下のように
して測定した。培養細胞をＰＢＳ（─）で十分すすぎ、
０．２５％（Ｖ／Ｖ）トリプシン液を培養面積１ｃｍ２
当たり０．１ｍｌ加え、３７℃に５分間保温した。培
養面に付着している細胞が全部はがれたことを確認して
から、浮遊している細胞数をタタイ式血球計算盤で計数
した。その結果を表２に示す。 【００５６】 【表２】 【００５７】また、上記の３クローン及び親株のＶｅｒ
ｏ−３１７細胞を３７℃５％炭酸ガスを含む空気下で７
日間ｂＭＥＭ培地で培養した後、ラージＴ抗原の発現性
を上記の方法によって検出した。その結果を表３に示す
。 【００５８】 【表３】 【００５９】上記の表２及び表３から明らかなように、
Ｖｅｒｏｔｓ Ｓ３ 細胞はｂＭＥＭ培地でも親株のＶ
ｅｒｏ−３１７細胞と同程度の増殖を続けた。また、３
クローンともラージＴ抗原の発現性に変化はなかった。 （実施例２） Ｖｅｒｏｔｓ Ｓ１細胞、Ｖｅｒｏｔｓ Ｓ２細胞、及
びＶｅｒｏｔｓ Ｓ３細胞の形質転換体を利用したヒト
成長ホルモンの製造ヒト成長ホルモン遺伝子を含むプラ
スミドｐＸＧＨ５（日本メジフィジックス社製）にＳＶ
４０ウィルスのＤＮＡ複製開始領域を挿入したプラスミ
ドｐＸＧＨ５ｏｒｉを以下のように作製した。 【００６０】 【外８】 【００６１】 【外９】 【００６２】で合成したＤＮＡ断片 ５′─ＣＴＣＧＡＧ−３′ ３′−ＧＡＧＣＴＣ−５′ をＤＮＡリガーゼで結合させた後、制限酵素ＸｈｏＩ（
宝酒造株式会社製）で消化した。 【００６３】一方、ｐＸＧＨ５ は制限酵素ＨｉｎｄＩ
ＩＩとＳａｌＩ（宝酒造株式会社製）で消化し、アガロ
ースゲル電気泳動法によって６．７ｋｂのＤＮＡ断片を
得た。これを前記のＸｈｏＩで消化したＤＮＡ断片と混
合し、ＤＮＡリガーゼで結合させ、ｐＸＧＨ５ｏｒｉを
得た。ＤＮＡリガーゼによる結合方法は、「モレキュラ
ークローニング」第１．５３〜１．７３頁の記載に従っ
た。 【００６４】２０μｇのプラスミドｐＸＧＨ５ｏｒｉを
１．５ｍｌのｂＭＥＭ培地に溶解した。図３にプラスミ
ドｐＸＧＨ５ｏｒｉの制限酵素地図を示す。ＤＮＡ導入
補助剤リポフェクチン（ベセスダリサーチラボラトリー
ズ社製）５０μｇ をｂＭＥＭ培地１．５ｍｌに溶解し
た。約１０００，０００個のＶｅｒｏｔｓ Ｓ１細胞及
び３ｍｌのｂＭＥＭ培地を含む直径６ｃｍ、高さ１ｃｍ
の培養皿中の培養液から培地を除いた後、プラスミドｐ
ＸＧＨ５ｏｒｉを含むｂＭＥＭ培地とリポフェクチンを
含有するｂＭＥＭ培地を併せて、添加した。３３℃、５
％炭酸ガスを含む空気下で６時間培養後、培養上清を捨
て、増殖培地４ｍｌを加えて３３℃、５％炭酸ガスを含
む空気下で２４時間以上培養した。増殖培地は、２４時
間毎に新鮮な増殖培地４ｍｌに交換した。この増殖培地
の培養上清１００μｌ を取り、Ｔｒａｎ−ＧＥＳキッ
ト（日本メフィジックス社製）を用いてヒト成長ホルモ
ン濃度を測定した。 【００６５】上記の操作をＶｅｒｏ−３１７細胞、Ｖｅ
ｒｏｔｓ Ｓ２細胞、Ｖｅｒｏｔｓ Ｓ３細胞を用いて
繰り返した。さらに、比較例として、上記の操作をＣＯ
Ｓ−１細胞（ 理化学研究所細胞銀行から入手）を用い
て繰り返した。 その結果を表４に示す。 【００６６】 【表４】 【００６７】表４から明らかなように、Ｖｅｒｏｔｓ
Ｓ３ 細胞は、プラスミド導入後４日以後、ＣＯＳ−１
細胞よりも多量のヒト成長ホルモンを産生した。ＣＯＳ
−１細胞はラージＴ抗原を常時発現していることが知ら
れている（実施例３） Ｖｅｒｏｔｓ Ｓ３細胞の形質転換体を利用したヒト成
長ホルモンの製造実施例２と同じ手順で、プラスミドｐ
ＸＧＨ５ｏｒｉをＶｅｒｏｔｓ Ｓ３細胞に導入して、
得られた形質転換体を３３℃及び３７℃で培養した。 【００６８】また、比較サンプルとしては、ＣＯＳ−７
細胞（ 理化学研究所細胞銀行から入手） を用いた。 上記の形質転換体によるヒト成長ホルモンの産生状況を
表５に示す。 【００６９】 【表５】 【００７０】（実施例４）Ｖｅｒｏｔｓ Ｓ３ 細胞の
形質転換体を利用したヒト成長ホルモンの製造（プラス
ミドｐＸＧＨ５とｐＸＧＨ５ｏｒｉを使用した場合の比
較）実施例２と同じ手順で、Ｖｅｒｏｔｓ Ｓ３ 細胞
にプラスミドｐＸＧＨ５又はｐＸＧＨ５ｏｒｉを導入し
、得られた形質転換体を培養した。 【００７１】上記の形質転換体によるヒト成長ホルモン
の産生状況を表６に示す。 【００７２】 【表６】 【００７３】表６からわかるように、導入するプラスミ
ドにＤＮＡ複製開始領域ｏｒｉが含まれている場合には
、ヒト成長ホルモンの産生量は、非常に上昇した。 （ 実施例５） Ｖｅｒｏｔｓ Ｓ３ 細胞の形質転換体を利用したヒト
成長ホルモンの製造（培地を増殖培地からｂＭＥＭに変
更した例）プラスミド導入後５日目に、培地を血清を含
有する増殖培地からｂＭＥＭ培地に変更し、その後、２
４時間毎に培地を新鮮なｂＭＥＭ培地４ｍｌに交換して
培養を継続した他は、実施例４の手順を繰り返した。 【００７４】上記の培養条件下での、Ｖｅｒｏｔｓ Ｓ
３細胞の形質転換体によるヒト成長ホルモンの産生状況
を表７に示す。 【００７５】 【表７】 【００７６】５日目のデータは、血清を含有する増殖培
地中で上記形質転換体が産生したヒト成長ホルモンの濃
度である。尚、ｐＸＧＨ５ をＶｅｒｏｔｓ Ｓ３ 細
胞に導入した形質転換体の、導入後８日目のヒト成長ホ
ルモン濃度は測定しなかった。表７からわかるように、
プラスミド導入後６日目までは、形質転換体は、いずれ
も高いヒト成長ホルモンの産生能を有していた。導入後
１１日目でも、ｐＸＧＨ５ｏｒｉを導入したＶｅｒｏｔ
ｓ Ｓ３細胞では、ｐＸＧＨ５ を導入したＶｅｒｏｔ
ｓ Ｓ３細胞に対し１０倍のヒト成長ホルモンの産生能
を有していた。
【図１】図１は、プラスミドｐＳＶｔｓＡ５８ｏｒｉ（
−）−１の制限酵素地図である。
−）−１の制限酵素地図である。
【図２】図２は、プラスミドｐＳＶｔｓＡ５８ｏｒｉ（
−）−２の制限酵素地図である。
−）−２の制限酵素地図である。
【図３】図３は、プラスミドｐＸＧＨ５ｏｒｉの制限酵
素地図である。
素地図である。
【図４】図４は、Ｖｅｒｏｔｓ−Ｓ３ 細胞又はＣＯＳ
−７ 細胞にｐＸＧＨ５ｏｒｉを導入した後の日数と培
養液中のヒト成長ホルモンの濃度の関係を示すグラフで
ある。
−７ 細胞にｐＸＧＨ５ｏｒｉを導入した後の日数と培
養液中のヒト成長ホルモンの濃度の関係を示すグラフで
ある。
Claims (15)
- 【請求項１】 実質的に蛋白性物質を含有しない培地
で増殖可能で、かつ、外来遺伝子の複製を促進できる物
質を含有する動物細胞。 - 【請求項２】 動物細胞が哺乳類動物細胞である請求
項１記載の細胞。 - 【請求項３】 請求項１記載の動物細胞に、発現可能
な外来遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡを導入した形質転
換体。 - 【請求項４】 動物細胞が哺乳類動物細胞である請求
項３記載の形質転換体。 - 【請求項５】 実質的に蛋白性物質を含有しない培地
で増殖可能な動物細胞に、外来遺伝子の複製を促進でき
る物質及び発現可能な外来遺伝子を含む組み換え体ＤＮ
Ａを導入した形質転換体。 - 【請求項６】 組み換え体ＤＮＡが、ＤＮＡ複製開始
領域を含む請求項３〜５項のいずれか一項に記載の形質
転換体。 - 【請求項７】 組み換え体ＤＮＡが、プロモーターを
含む請求項３〜６項のいずれか一項に記載の形質転換体
。 - 【請求項８】 組み換え体ＤＮＡが、ＳＶ４０ウィル
ス由来ＤＮＡの全部もしくは一部、牛乳頭腫ウィルス由
来ＤＮＡの全部もしくは一部、ポリオーマウィルス由来
ＤＮＡの全部もしくは一部、Ｌ因子由来ＤＮＡの全部も
しくは一部、アデノウィルス由来の全部もしくは一部、
ワクシニアウィルス由来ＤＮＡの全部もしくは一部、エ
プシュタイン・バールウィルス由来ＤＮＡの全部もしく
は一部、レトロウィルス由来ＲＮＡより逆転写したＤＮ
Ａの全部もしくは一部から成る群より選ばれるベクター
ＤＮＡを含む請求項３〜７のいずれか一項に記載の形質
転換体。 - 【請求項９】 動物細胞が霊長類由来細胞で、組み換
え体ＤＮＡがＳＶ４０ウィルス由来ＤＮＡの全部もしく
は一部、アデノウィルス由来の全部もしくは一部、ワク
シニアウィルス由来ＤＮＡの全部もしくは一部、エプシ
ュタイン・バールウィルス由来ＤＮＡの全部もしくは一
部、霊長類レトロウィルス由来ＲＮＡより逆転写したＤ
ＮＡの全部もしくは一部から成る群より選ばれるベクタ
ーＤＮＡを含む請求項３〜７項のいずれか一項に記載の
形質転換体。 - 【請求項１０】 動物細胞が牛由来細胞で、組み換え
体ＤＮＡが牛乳頭腫ウィルス由来ＤＮＡの全部もしくは
一部であるベクターＤＮＡを含む請求項３〜７項のいず
れか一項に記載の形質転換体。 - 【請求項１１】 動物細胞がげっ歯類由来細胞で、組
み換え体ＤＮＡが牛乳頭腫ウィルス由来ＤＮＡの全部も
しくは一部、ポリオーマウィルス由来ＤＮＡの全部もし
くは一部、Ｌ因子由来ＤＮＡの全部もしくは一部、げっ
歯類レトロウィルス由来ＲＮＡより逆転写したＤＮＡの
全部もしくは一部から成る群より選ばれるベクターＤＮ
Ａを含む請求項３〜７項のいずれか一項に記載の形質転
換体。 - 【請求項１２】 発現可能な外来遺伝子が、ペプチド
性ホルモンの遺伝子、成長因子の遺伝子、蛋白の遺伝子
、及び発癌遺伝子から成る群より選ばれる請求項３〜７
項のいずれか一項に記載の形質転換体。 - 【請求項１３】 請求項３又は５に記載の形質転換体
を培養し、培養物から外来遺伝子発現産物を採取するこ
とを特徴とする外来遺伝子発現産物の製造方法。 - 【請求項１４】 形質転換体を培養当初から実質的に
蛋白性物質を含有しない培地で培養する請求項１３項に
記載の方法。 - 【請求項１５】 形質転換体を、培養当初は蛋白性物
質を含有する培地で培養し、次いで培地を実質的に蛋白
性物質を含有しない培地に変更して培養する請求項１３
記載の方法。
Priority Applications (4)
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|---|---|---|---|
| JP3107932A JPH04228066A (ja) | 1990-10-23 | 1991-05-14 | 外来遺伝子発現用培養細胞 |
| US07/714,639 US5254462A (en) | 1990-10-23 | 1991-06-13 | Animal cell line useful for expression of exogenous genes |
| EP91109759A EP0485689B1 (en) | 1990-10-23 | 1991-06-14 | Cells growing in protein-free medium, and enhancing replication of exogenous genes |
| DE69132759T DE69132759T2 (de) | 1990-10-23 | 1991-06-14 | In protein-freiem Medium wachsende Zellen, die die Replication von exogenen Genen steigern |
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|---|---|---|---|
| JP28517190 | 1990-10-23 | ||
| JP2-285171 | 1990-10-23 | ||
| JP3107932A JPH04228066A (ja) | 1990-10-23 | 1991-05-14 | 外来遺伝子発現用培養細胞 |
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Family
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Family Applications (1)
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| EP (1) | EP0485689B1 (ja) |
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-
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