ES2382893T3

ES2382893T3 - Antígenos BVH-A2 y BVH-3 de streptococcus del grupo B

Info

Publication number: ES2382893T3
Application number: ES01978039T
Authority: ES
Inventors: Denis Martin; Stephane Rioux; Martine Boyer; Josée Hamel; Bernard R. Brodeur
Original assignee: ID Biomedical Corp of Quebec
Current assignee: ID Biomedical Corp of Quebec
Priority date: 2000-10-13
Filing date: 2001-10-15
Publication date: 2012-06-14
Anticipated expiration: 2021-10-15
Also published as: WO2002031156A2; JP2004510450A; EP1325133B1; AU2002210301A1; JP4102186B2; EP1325133A2; US7335368B2; US20080227706A1; CA2424433A1; WO2002031156A3; US20040071730A1; ATE547527T1

Abstract

Un polinucleótido aislado que comprende un polinucleótido elegido de: (a) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos el 70% de identidad con un segundo polipéptido que comprende una secuencia elegida de SEC ID Nº: 7 y 8; (b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos el 95% de identidad con un segundo polipéptido que comprende una secuencia elegida de: SEC ID Nº: 7 y 8; (c) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia elegida de: SEC ID Nº: 7 y 8; (d) un polinucleótido que codifica un polipéptido que puede producir anticuerpos que tienen especificidad de unión por un polipéptido que tiene una secuencia elegida de SEC ID Nº: 7 y 8; (e) un polinucleótido que codifica un epítope que lleva la porción de un polipéptido que tiene una secuencia elegida de SEC ID Nº: 7 y 8; y (f) un polinucleótido complementario a un polinucleótido en (a), (b), (c), (d) o (e) .

Description

Antígenos BVH-A2 y BVH-A3 de Streptococcus del grupo B

Campo de la invención

La presente invención está relacionada con polipéptidos de Streptococcus del grupo B (GBS) (S. agalactiae) y 5 fragmentos de ADN correspondientes que pueden ser útiles para prevenir, diagnosticar y/o tratar infecciones por GBS en individuos tales como seres humanos.

Antecedentes de la invención

Los Streptococcus son bacterias Gram (+) que se diferencian por antígenos de hidratos de carbono específicos para grupos A a O encontrados sobre su superficie celular. Los grupos de Streptococcus se distinguen adicionalmente

10 por antígenos de polisacáridos capsulares específicos para tipo. Se han identificado varios serotipos para GBS: Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII y VIII. Los GBS también contienen proteínas antigénicas conocidas como “proteínas C” (alfa, beta, gamma y delta), algunas de las cuales se han clonado.

Aunque GBS es un componente común de la flora vaginal y colónica humana normal, este patógeno se reconoce desde hace tiempo como una causa principal de infecciones en neonatos, futuras madres, algunas adultas no

15 embarazadas, además de mastitis en rebaños lecheros. Futuras madres expuestas a GBS están en riesgo de infección postparto y pueden transferir la infección a su bebé cuando el niño pasa por la vía del parto.

Las infecciones por GBS en lactantes están limitadas a una infancia muy temprana. Aproximadamente el 80% de las infecciones en lactantes se producen en los primeros días de vida, la llamada enfermedad de aparición temprana. Las infecciones de aparición tardía se producen en lactantes entre 1 semana y 2 a 3 meses de edad. Los síndromes

20 clínicos de enfermedad por GBS en recién nacidos incluyen septicemia, meningitis, neumonía, celulitis, osteomielitis, artritis séptica, endocarditis, epiglotis. Además de enfermedad aguda debida a GBS, que es por sí misma costosa, las infecciones por GBS en recién nacidos pueden producir muerte, discapacidad y, en casos raros, la reaparición de infección. Aunque el organismo es sensible a antibióticos, la alta tasa de ataque y la rápida aparición de septicemia en neonatos y meningitis en lactantes produce alta morbilidad y mortalidad.

25 Entre mujeres embarazadas, GBS produce enfermedad clínica que varía de infección del tracto urinario leve a septicemia y meningitis potencialmente mortales, que también incluyen osteomielitis, endocarditis, amnionitis, endometritis, infecciones por heridas (postcesárea y postepisiotomía), celulitis, fascitis.

Entre adultas no embarazadas, las presentaciones clínicas de enfermedad por GBS invasiva casi siempre toman la forma de bacteremia primaria, pero también piel de infección de tejido blando, neumonía, urosepticemia,

30 endocarditis, peritonitis, meningitis, empiema. La piel de infecciones de tejido blando incluye celulitis, úlceras periféricas infectadas, osteomielitis, artritis séptica e infecciones por decúbito o por heridas. Entre personas en riesgo, hay huéspedes debilitados tales como personas con una enfermedad crónica tal como diabetes mellitus y cáncer, o personas ancianas.

Las infecciones por GBS también pueden producirse en animales y producen mastitis en rebaños lecheros.

35 Para encontrar una vacuna que protegerá a los huéspedes de infección por GBS, los investigadores han vuelto a los antígenos específicos para tipo. Desafortunadamente, estos polisacáridos han demostrado ser escasamente inmunogénicos en huéspedes y están limitados al serotipo particular del que se origina el polisacárido. Además, los polisacáridos capsulares provocan una respuesta independiente de linfocitos T, es decir, sin producción de IgG. Consecuentemente, los antígenos de polisacáridos capsulares son inadecuados como componente de vacuna para

40 la protección contra infección por GBS.

Otros se han centrado en el antígeno beta de la proteína C que demostró propiedades inmunogénicas en modelos de ratón y modelos de conejo. Se encontró que esta proteína era inadecuada como vacuna humana debido a su propiedad no deseable de interaccionar con alta afinidad y en un modo no inmunogénico con la región Fc de IgA humana. Los antígenos alfa de la proteína C son raros en serotipos de tipo III de GBS, que es el serotipo

45 responsable de la mayoría de las afecciones mediadas por GBS y, por tanto, son de poco uso como componente de vacuna.

Por tanto, permanece la necesidad sin satisfacer de polipéptidos de GBS que pueden ser útiles para prevenir, diagnosticar y/o tratar infecciones por GBS en individuos tales como seres humanos.

El documento WO 99/42588 desvela antígenos de Streptococcus del grupo B que son antigénicos y útiles para

50 componentes de vacuna para la profilaxis o terapia de infección por Streptococcus en animales. También se desvelan procedimientos de producción de antígenos de proteína, además de ensayos de diagnóstico para detectar infección bacteriana por Streptococcus.

Resumen de la invención

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos el 70% de identidad con un segundo polipéptido que comprende una secuencia elegida de SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8 o fragmentos o análogos del mismo.

Según un aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8 o fragmentos o análogos de los mismos.

En otros aspectos se proporcionan polipéptidos codificados por polinucleótidos de la invención, composiciones farmacéuticas, vectores que comprenden polinucleótidos de la invención operativamente ligados a una región de control de la expresión, además de células huésped transfectadas con dichos vectores y procedimientos de producción de polipéptidos que comprenden cultivar dichas células huésped en condiciones adecuadas para la expresión.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa la secuencia de ADN del gen BVH-A2 de la cepa NCS954 de Streptococcus del grupo B de serotipo III; SEC ID Nº: 1.

La Figura 2 representa la secuencia de ADN del gen BVH-A2 de la cepa NCS954 de Streptococcus del grupo B de serotipo III sin la región que codifica su péptido conductor; SEC ID Nº: 2.

La Figura 3 representa la secuencia de aminoácidos del polipéptido de BVH-A2 de la cepa NCS954 de Streptococcus del grupo B de serotipo III; SEC ID Nº: 3.

La Figura 4 representa la secuencia de aminoácidos del polipéptido de BVH-A2 de la cepa NCS954 de Streptococcus del grupo B de serotipo III sin el péptido conductor de 37 residuos de aminoácidos; SEC ID Nº:

4.

La Figura 5 representa la secuencia de ADN del gen BVH-A3 de la cepa NCS954 de Streptococcus del grupo B de serotipo III; SEC ID Nº: 5.

La Figura 6 representa la secuencia de ADN del gen BVH-A3 de la cepa NCS954 de Streptococcus del grupo B de serotipo III sin la región que codifica el péptido conductor; SEC ID Nº: 6.

La Figura 7 representa la secuencia de aminoácidos del polipéptido de BVH-A3 de la cepa NCS954 de Streptococcus del grupo B de serotipo III; SEC ID Nº: 7.

La Figura 8 representa la secuencia de aminoácidos del polipéptido de BVH-A3 de la cepa NCS954 de Streptococcus del grupo B de serotipo III sin el péptido conductor de 28 residuos de aminoácidos; SEC ID Nº:

8.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona polinucleótidos purificados y aislados que codifican polipéptidos de Streptococcus del grupo B que pueden usarse para prevenir, tratar y/o diagnosticar infección estreptocócica. La presente invención proporciona cuatro polinucleótidos preferidos separados, cada uno definido individualmente y por separado por una de SEC ID Nº 1, 2, 5 y 6. En la presente invención se proporcionan adicionalmente cuatro polipéptidos separados, cada uno definido individualmente y por separado por una de SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8. Aquellos expertos en la materia apreciarán que la invención incluye polinucleótidos que codifican análogos tales como mutantes, variantes, homólogos y derivados de tales polipéptidos, como se describen en este documento en la presente solicitud de patente. La invención también incluye moléculas de ARN correspondientes a las moléculas de ADN de la invención. Además de las moléculas de ADN y ARN, la invención incluye los polipéptidos y anticuerpos monoespecíficos correspondientes que se unen específicamente a tales polipéptidos.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos el 80% de identidad con un segundo polipéptido que comprende una secuencia elegida de SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8 o fragmentos o análogos del mismo.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos el 85% de identidad con un segundo polipéptido que comprende una secuencia elegida de SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8 o fragmentos o análogos del mismo.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos el 90% de identidad con un segundo polipéptido que comprende una secuencia elegida de SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8 o fragmentos o análogos del mismo.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos el 95% de identidad con un segundo polipéptido que comprende una secuencia elegida de SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8 o fragmentos o análogos del mismo.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende una secuencia elegida de SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8 o fragmentos o análogos del mismo.

Según un aspecto, la presente invención se refiere a polinucleótidos que codifica una porción que lleva epítope de un polipéptido que tiene una secuencia elegida de SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8 o fragmentos o análogos del mismo.

Según un aspecto, la presente invención se refiere a porciones que llevan epítopes de un polipéptido que tiene una secuencia elegida de SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8 o fragmentos o análogos del mismo.

Según un aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que comprende las secuencias de SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8 o fragmentos o análogos de los mismos.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos el 70% de identidad con un segundo polipéptido que comprende una secuencia elegida de SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos el 80% de identidad con un segundo polipéptido que comprende una secuencia elegida de SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos el 85% de identidad con un segundo polipéptido que comprende una secuencia elegida de SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos el 90% de identidad con un segundo polipéptido que comprende una secuencia elegida de SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos el 95% de identidad con un segundo polipéptido que comprende una secuencia elegida de SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende una secuencia elegida de SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8.

Según un aspecto, la presente invención se refiere a polinucleótidos que codifican una porción que lleva epítope de un polipéptido que tiene una secuencia elegida de SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8.

Según un aspecto, la presente invención se refiere a porciones que llevan epítopes de un polipéptido que tiene una secuencia elegida de SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8.

En otra realización, la presente invención también se refiere a polinucleótidos que codifican un polipéptido que puede producir anticuerpos que tienen especificidad de unión por un polipéptido que tiene una secuencia elegida de SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8 o fragmentos o análogos de los mismos.

En otra realización, la presente invención también se refiere a polinucleótidos que codifican un polipéptido que puede producir anticuerpos que tienen especificidad de unión por un polipéptido que tiene una secuencia elegida de SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8.

El porcentaje de homología se define como la suma del porcentaje de identidad más el porcentaje de similitud o conservación del tipo de aminoácido.

Puede usarse un programa tal como el programa CLUSTAL para comparar secuencias de aminoácidos. Este programa compara secuencias de aminoácidos y encuentra el alineamiento óptimo insertando espacios en cualquier secuencia según convenga. Es posible calcular la identidad de aminoácidos o similitud (identidad más conservación del tipo de aminoácido) para un alineamiento óptimo. Un programa como BLASTx alineará la extensión más larga de secuencias similares y asignará un valor para el ajuste. Por tanto, es posible obtener una comparación en la que se encuentran varias regiones de similitud, teniendo cada una una puntuación diferente. Ambos tipos de análisis de identidad se contemplan en la presente invención.

En otra realización, los polipéptidos según la presente invención son antigénicos.

En otra realización, los polipéptidos según la presente invención son inmunogénicos.

En otra realización, los polipéptidos según la presente invención pueden provocar una respuesta inmunitaria en un individuo.

En otra realización, la presente invención también se refiere a polipéptidos que pueden producir anticuerpos que tienen especificidad de unión por los polipéptidos de la presente invención como se han definido anteriormente.

En otra realización, la presente invención también se refiere a polipéptidos que pueden producir anticuerpos que tienen especificidad de unión por un polipéptido que tiene una secuencia elegida de SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8 o fragmentos o análogos de los mismos.

En otra realización, la presente invención también se refiere a polipéptidos que pueden producir anticuerpos que tienen especificidad de unión por un polipéptido que tiene una secuencia elegida de SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8.

Un anticuerpo que “tiene especificidad de unión” es un anticuerpo que reconoce y se une al polipéptido seleccionado, pero que no reconoce sustancialmente y se une a otras moléculas en una muestra, por ejemplo, una muestra biológica que incluye naturalmente el péptido seleccionado. La unión específica puede medirse usando un ensayo de ELISA en el que el polipéptido seleccionado se usa como antígeno.

Según la presente invención, “protección” en los estudios biológicos se define por un aumento significativo en la curva, tasa o periodo de supervivencia. El análisis estadístico usando la prueba del orden logarítmico para comparar curvas de supervivencia y la prueba exacta de Fisher para comparar las tasas de supervivencia y números de días hasta la muerte, respectivamente, podrían ser útiles para calcular valores de P y determinar si la diferencia entre los dos grupos es estadísticamente significativa. Los valores de P de 0,05 se consideran como no significativos.

En un aspecto adicional de la invención se proporcionan fragmentos antigénicos/inmunogénicos de los polipéptidos de la invención, o de análogos de los mismos.

Los fragmentos de la presente divulgación deben incluir una o más de tales regiones epitópicas o ser suficientemente similares a tales regiones para retener sus propiedades antigénicas/inmunogénicas. Por tanto, para los fragmentos según la presente divulgación, el grado de identidad es quizás irrelevante, ya que pueden ser el 100% idénticos a una parte particular de un polipéptido o análogo del mismo como se describe en este documento. La presente divulgación proporciona además fragmentos que tienen al menos 10 residuos de aminoácidos contiguos de las secuencias de polipéptidos de la presente invención. En una realización, al menos 15 residuos de aminoácidos contiguos. En una realización, al menos 20 residuos de aminoácidos contiguos.

El experto apreciará que “fragmentos”, “análogos” o “derivados” de los polipéptidos de la invención también se usarán en el contexto de la presente invención, es decir, como material antigénico/inmunogénico. Por tanto, por ejemplo, los polipéptidos que incluyen una o más adiciones, deleciones, sustituciones o similares están englobados por la presente invención.

Como se usa en este documento, “análogos” de los polipéptidos de la invención incluye aquellos polipéptidos en los que uno o más de los residuos de aminoácidos están sustituidos con un residuo de aminoácido conservado (preferentemente conservado) y que puede ser natural o no natural. En una realización, los análogos de polipéptidos de la invención tendrán aproximadamente el 70% de identidad con aquellas secuencias ilustradas en las figuras o fragmentos de los mismos. Es decir, el 70% de los residuos son los mismos. En otra realización, los polipéptidos tendrán más del 80% de identidad. En otra realización, los polipéptidos tendrán más del 90% de identidad. En otra realización, los polipéptidos tendrán más del 95% de identidad. En otra realización, los polipéptidos tendrán más del 99% de identidad. En otra realización, los análogos de polipéptidos de la invención tendrán menos de aproximadamente 20 sustituciones, modificaciones o deleciones de residuos de aminoácidos, y más preferentemente menos de 10.

En una realización, los derivados y análogos de polipéptidos de la invención tendrán aproximadamente el 70% de homología con aquellas secuencias ilustradas en las figuras o fragmentos de los mismos. En otra realización, los derivados y análogos de polipéptidos tendrán más del 80% de homología. En otra realización, los derivados y análogos de polipéptidos tendrán más del 90% de homología. En otra realización, los derivados y análogos de polipéptidos tendrán más del 95% de homología. En otra realización, los derivados y análogos de polipéptidos tendrán más del 99% de homología. En otra realización, los derivados y análogos de derivados y análogos de polipéptidos de la invención tendrán menos de aproximadamente 20 sustituciones, modificaciones o deleciones de residuos de aminoácidos y más preferentemente menos de 10.

Según otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos que tienen al menos el 70% de identidad con un segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos elegida de: SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8 o fragmentos o análogos de los mismos.

Según otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos que tienen al menos el 80% de identidad con un segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos elegida de: SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8 o fragmentos o análogos de los mismos.

Según otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos que tienen al menos el 85% de identidad con un segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos elegida de: SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8 o fragmentos o análogos de los mismos.

Según otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos que tienen al menos el 90% de identidad con un segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos elegida de: SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8 o fragmentos o análogos de los mismos.

Según otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos que tienen al menos el 95% de identidad con un segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos elegida de: SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8 o fragmentos o análogos de los mismos.

Según otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos que comprenden una secuencia elegida de: SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8 o fragmentos o análogos de los mismos.

Según otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos caracterizados por una secuencia elegida de: SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8 o fragmentos o análogos de los mismos.

Según otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos que tienen al menos el 70% de identidad con un segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos elegida de: SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8.

Según otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos que tienen al menos el 80% de identidad con un segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos elegida de: SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8.

Según otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos que tienen al menos el 85% de identidad con un segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos elegida de: SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8.

Según otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos que tienen al menos el 90% de identidad con un segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos elegida de: SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8.

Según otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos que tienen al menos el 95% de identidad con un segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos elegida de: SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8.

Según otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos que comprenden una secuencia elegida de: SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8.

Según otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos caracterizados por una secuencia elegida de: SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8.

Estas sustituciones son aquellas que tienen una influencia mínima sobre la estructura secundaria y naturaleza hidropática del polipéptido. Sustituciones preferidas son aquellas conocidas en la técnica como conservadas, es decir, los residuos sustituidos comparten propiedades físicas o químicas tales como hidrofobia, tamaño, carga ogrupos funcionales. Éstas incluyen sustituciones tales como aquellas descritas por Dayhoff, M. en Atlas of Protein Sequence and Structure 5, 1978 y por Argos, P. en EMBO J. 8, 779-785, 1989. Por ejemplo, los aminoácidos, tanto naturales como no naturales, que pertenecen a uno de los siguientes grupos, representan cambios conservativos:

ala, pro, gly, gln, asn, ser, thr, val;

cys, scr, tyr, thr;

val, ile, leu, met, ala, phe;

lys, arg, orn, his;

y phe, tyr, trp, his.

Las sustituciones preferidas también incluyen sustituciones de D-enantiómeros para los L-aminoácidos correspondientes.

Preferentemente, un fragmento, análogo o derivado de un polipéptido de la invención comprenderá al menos una región antigénica, es decir, al menos un epítope.

En un enfoque alternativo, los análogos podrían ser polipéptidos de fusión que incorporaran restos que hicieran que la purificación fuera más fácil, por ejemplo, marcando eficazmente el polipéptido deseado. Puede ser necesario eliminar la “marca” o puede ser el caso que el propio polipéptido de fusión retenga suficiente antigenicidad para ser útil.

Por tanto, lo que es importante para análogos, derivados y fragmentos es que posean al menos un grado de antigenicidad/inmunogénico de los polipéptidos de la invención de los que se derivan.

También están incluidos polipéptidos que se han fusionado a otros compuestos que alteran las propiedades biológicas o farmacológicas del polipéptido, es decir, polietilenglicol (PEG) para aumentar la semivida, secuencias de aminoácidos conductoras o secretoras para facilitar la purificación, prepro-y pro- secuencias y (poli)sacáridos.

Además, en aquellas situaciones en las que se encuentra que las regiones de aminoácido son polimórficas puede desearse variar uno o más aminoácidos particulares para imitar más eficazmente los diferentes epítopes de las diferentes cepas de GBS.

Además, los polipéptidos de la presente invención pueden modificarse por acilación de -NH2 terminal (por ejemplo, por acetilación, o amidación de ácido tioglicólico, amidación del carboxi terminal, por ejemplo, con amoniaco o metilamina) para proporcionar estabilidad, aumento de la hidrofobia para el enlace o unión a un soporte u otra molécula.

También se contemplan multímeros de hetero y homopolipéptidos de los fragmentos de polipéptidos y análogos. Estas formas poliméricas incluyen, por ejemplo, uno o más polipéptidos que se han reticulado con reticuladores tales como avidina/biotina, glutaraldehído o dimetilsuperimidato. Tales formas poliméricas también incluyen polipéptidos que contienen dos o más secuencias contiguas en tándem o invertidas producidas a partir de ARNm multicistrónicos generados por tecnología de ADN recombinante.

En otra realización, la presente invención también se refiere a polipéptidos quiméricos que comprenden uno o más polipéptidos o fragmentos o análogos de los mismos como se define en las figuras de la presente solicitud.

En otra realización, la presente invención también se refiere a polipéptidos quiméricos que comprenden dos o más polipéptidos que tienen una secuencia elegida de SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8 o fragmentos o análogos de los mismos; siempre que los polipéptidos estén unidos de manera que formen un polipéptido quimérico.

En otra realización, la presente invención también se refiere a polipéptidos quiméricos que comprenden dos o más polipéptidos que tienen una secuencia elegida de SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8, siempre que los polipéptidos estén unidos de manera que formen un polipéptido quimérico.

Con el fin de lograr la formación de polímeros antigénicos (es decir, multímeros sintéticos), pueden utilizarse polipéptidos que tienen grupos bishaloacetilo, haluros de nitroarilo o similares, en los que los reactivos son específicos para grupos tio. Por tanto, el enlace entre dos grupos mercapto de los diferentes polipéptidos puede ser un enlace sencillo o puede estar compuesto por un grupo de enlace de al menos dos, normalmente al menos cuatro, y no más de 16, pero normalmente no más de aproximadamente 14, átomos de carbono.

En una realización particular, los fragmentos de polipéptidos o análogos de la invención no contienen un residuo de partida de metionina (Met). Preferentemente, los polipéptidos no incorporarán una secuencia conductora o secretora (secuencia señal). La porción señal de un polipéptido de la invención puede determinarse según técnicas biológicas moleculares establecidas. En general, el polipéptido de interés puede aislarse de cultivo de GBS y posteriormente secuenciarse para determinar el residuo inicial de la proteína madura y, por tanto, la secuencia del polipéptido maduro.

Según otro aspecto de la divulgación, también se proporciona (i) una composición de materia que contiene un polipéptido de la invención, junto con un vehículo, diluyente o adyuvante; (ii) una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de la invención y un vehículo, diluyente o adyuvante; (iii) una vacuna que comprende un polipéptido de la invención y un vehículo, diluyente o adyuvante; (iv) un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria contra GBS en un individuo administrando al individuo una cantidad inmunogénicamente eficaz de un polipéptido de la invención para provocar una respuesta inmunitaria, por ejemplo, una respuesta inmunitaria protectora a GBS; y particularmente, (v) un procedimiento para prevenir y/o tratar una infección por GBS, administrando una cantidad profiláctica o terapéutica de un polipéptido de la invención a un individuo en necesidad.

Antes de la inmunización, los polipéptidos de la invención también pueden acoplarse o conjugarse a proteínas transportadoras tales como toxina tetánica, toxina diftérica, antígeno de superficie del virus de la hepatitis B, antígeno del virus de la poliomielitis VP1 o cualquier otra toxina o antígeno vírico o bacteriano o cualquier proteína adecuada para estimular el desarrollo de una respuesta inmunitaria más fuerte. Este acoplamiento o conjugación puede hacerse químicamente o genéticamente. Una descripción más detallada de la conjugación péptido-vehículo está disponible en Van Regenmortel, M.H.V., Briand J.P., Muller S., Plaué S., «Synthetic Polypeptides as antigens» en Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 19 (ed.) Burdou, R. H. & Van Knippenberg

P.H. (1988), Elsevier New York.

Según otro aspecto se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más polipéptidos de GBS de la invención en una mezcla con un diluyente o adyuvante de vehículo farmacéuticamente aceptable. Adyuvantes adecuados incluyen (1) formulaciones de emulsión de aceite en agua tales como MF59™, SAF™, Ribi™; (2) adyuvante completo o incompleto de Freund; (3) sales, es decir, AlK(SO4)2, AlNa(SO4)2, AlNH4(SO4)2, Al(OH)3, AlPO4, sílice, caolín; (4) derivados de saponina tales como Stimulon™ o partículas generadas a partir de la misma tales como ISCOM (complejos inmunoestimulantes); (5) citocinas tales como interleucinas, interferones, factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF) ; (6) otras sustancias tales como polinucleótidos de carbono, es decir, poli IC y poli AU, toxina de la cólera desintoxicada (CTB) y toxina lábil al calor de E. coli para la inducción de inmunidad mucosa. Una descripción más detallada de adyuvantes está disponible en una revisión por M. Z. I Khan y col. en Pharmaceutical Research, vol. 11, nº 1 (1994) pag.2-11, y también en otra revisión por Gupta y col., en Vaccine, vol. 13, nº 14, pág. 1263-1276 (1995) y en el documento WO 99/24578. Adyuvantes preferidos incluyen QuilA™, QS21™, Alhydrogel™ y Adjuphos™.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse parenteralmente por inyección, infusión rápida, absorción nasofaríngea, dermoabsorción, o bucal u oral.

Las composiciones farmacéuticas de la invención se usan para el tratamiento o la profilaxis de infección estreptocócica y/o enfermedades y síntomas mediados por infección estreptocócica, en particular Streptococcus del grupo A (S. pyogenes), Streptococcus del grupo B (GBS o S. agalactiae), S. dysgalactiae, S. uberis, S. nocardia, además de Staphylococcus aureus. Información general sobre Streptococcus, y más particularmente GBS, está disponible en Manual of Clinical Microbiology por P. R. Murray y col. (1995, 6ª edición, ASM Press, Washington, D.C.).

En una realización, las composiciones farmacéuticas de la invención se usan para el tratamiento o la profilaxis de infección por GBS y/o enfermedades y síntomas mediados por infección por GBS.

En una realización particular, las composiciones farmacéuticas se administran a aquellos individuos en riesgo de infección por GBS tales como mujeres embarazadas para infección urinaria leve a septicemia y meningitis potencialmente mortales, que también incluyen osteomielitis, endocarditis, amnionitis, endometritis, infecciones por heridas (postcesárea y postepisiotomía), celulitis, fascitis.

En una realización particular, las composiciones farmacéuticas de la invención se administran a aquellos individuos en riesgo de infección por GBS tales como neonatos y lactantes para septicemia, meningitis, neumonía, celulitis, osteomielitis, artritis séptica, endocarditis, epiglotis.

En una realización particular, las composiciones farmacéuticas de la invención se administran a aquellos individuos en riesgo de infección por GBS tales como adultas no embarazadas para bacteremia primaria, pero también piel de infección de tejido blando, neumonía, urosepticemia, endocarditis, peritonitis, meningitis, empiema. La piel de infecciones de tejido blando incluye celulitis, úlceras periféricas infectadas, osteomielitis, artritis séptica e infecciones por decúbito o por heridas. Entre personas en riesgo, hay individuos debilitados tales como personas con una enfermedad crónica tal como diabetes mellitus y cáncer, o personas mayores.

En una realización particular, las composiciones farmacéuticas de la invención se administran a aquellos individuos en riesgo de infección por GBS tal como ganado vacuno para el tratamiento de mastitis en ganado vacuno.

En otro aspecto, la invención proporciona el uso de la composición farmacéutica de la invención para el tratamiento profiláctico o terapéutico de infección bacteriana por GBS en un individuo susceptible a infección por GBS que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapéutica o profiláctica de una composición de la invención.

Según otro aspecto, los polipéptidos de GBS de la invención pueden usarse en un kit que comprende los polipéptidos de la invención para la detección de diagnóstico de infección por GBS.

Como se usa en la presente solicitud, el término “individuo” incluye mamíferos. En otra realización, los mamíferos son seres humanos. En otra realización, los mamíferos son seres no humanos, tales como rebaños.

En una realización particular, las composiciones farmacéuticas de la invención se administran a aquellos individuos en riesgo de infección por GBS tal como neonatos.

Las composiciones farmacéuticas de la invención están preferentemente en forma de dosificación unitaria de aproximadamente 0,001 a 100 μg/kg (antígeno/peso corporal) y más preferentemente de 0,01 a 10 μg/kg y lo más preferentemente de 0,1 a 1 μg/kg, 1 a 3 veces, con un intervalo de aproximadamente 1 a 6 semanas entre inmunizaciones.

Las composiciones farmacéuticas están preferentemente en forma de dosificación unitaria de aproximadamente 0,1 μg a 10 mg y más preferentemente μg a 1 mg y lo más preferentemente 10 a 100 μg, 1 a 3 veces, con un intervalo de aproximadamente 1 a 6 semanas entre inmunizaciones.

En una realización, los polinucleótidos son aquellos ilustrados en SEC ID Nº: 1, 2, 5 y 6 que pueden incluir los marcos de lectura abiertos (ORF) que codifican los polipéptidos de la invención.

En una realización, los polinucleótidos son aquellos ilustrados en SEC ID Nº: 1, 2, 5 y 6 que codifican los polipéptidos de la invención.

Se apreciará que las secuencias de polinucleótidos ilustradas en las figuras pueden alterarse con codones degenerados y, sin embargo, codificar los polipéptidos de la invención. Por consiguiente, la presente invención proporciona además polinucleótidos en descritos anteriormente este documento (o la secuencia de complemento de

los mismos) que tienen al menos el 50% de identidad entre secuencias. En una realización, al menos el 70% de identidad entre secuencias. En una realización, al menos el 75% de identidad entre secuencias. En una realización, al menos el 80% de identidad entre secuencias. En una realización, al menos el 85% de identidad entre secuencias. En una realización, al menos el 90% de identidad entre secuencias. En otra realización, los polinucleótidos son hibridables bajo condiciones rigurosas, es decir, que tienen al menos el 95% de identidad. En otra realización, más del 97% identidad.

Condiciones rigurosas adecuadas para la hibridación pueden ser fácilmente determinadas por un experto en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook y col., (1989) Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology, (1999) editado por Ausubel F.M. y col., John Wiley & Sons, Inc., N.Y.).

En otra realización, la presente invención proporciona polinucleótidos que se hibridan bajo condiciones rigurosas con tanto con

(a): un polinucleótido que codifica un polipéptido, como con

(b): el complemento de un polinucleótido que codifica un polipéptido; en los que dicho polipéptido comprende SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8, o fragmentos o análogos del mismo.

(a): un polinucleótido que codifica un polipéptido, como con

(b): el complemento de un polinucleótido que codifica un polipéptido; en los que dicho polipéptido comprende al menos 10 residuos de aminoácidos contiguos de un polipéptido que comprende SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8 o fragmentos o análogos del mismo.

(a): un polinucleótido que codifica un polipéptido, como con

(b): el complemento de un polinucleótido que codifica un polipéptido; en los que dicho polipéptido comprende SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8.

(a): un polinucleótido que codifica un polipéptido, como con

(b): el complemento de un polinucleótido que codifica un polipéptido;

en los que dicho polipéptido comprende al menos 10 residuos de aminoácidos contiguos de un polipéptido que comprende SEC ID Nº: 3, 4, 7 y 8.

Como será fácilmente apreciado por un experto en la materia, los polinucleótidos incluyen tanto ADN como ARN.

La presente invención también incluye polinucleótidos complementarios a los polinucleótidos descritos en la presente solicitud.

En otro aspecto, los polinucleótidos que codifican polipéptidos de la invención, o fragmentos o análogos de los mismos, pueden usarse en un procedimiento de inmunización con ADN. Es decir, pueden incorporarse en un vector que es replicable y expresable tras la inyección, reduciéndose así el polipéptido antigénico in vivo. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden incorporarse en un vector de plásmido bajo el control del promotor del CMV que es funcional en células eucariotas. Preferentemente, el vector se inyecta intramuscularmente.

Según otro aspecto se proporciona un proceso o procedimiento de fabricación para producir polipéptidos de la invención por técnicas recombinantes expresando un polinucleótido que codifica dicho polipéptido en una célula huésped y recuperando el producto de polipéptido expresado. Alternativamente, los polipéptidos pueden producirse según técnicas químicas sintéticas establecidas, es decir, síntesis en fase de disolución o fase sólida de oligopéptidos que se ligan para producir el polipéptido completo (ligación en bloque).

Procedimientos generales para la obtención y evaluación de polinucleótidos y polipéptidos se describen en las siguientes referencias: Sambrook y col. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology, (1999) editado por Ausubel F.M. y col., John Wiley & Sons, Inc., N.Y.; PCR Cloning Protocols, from Molecular Cloning to Genetic Engineering, (1997) editado por White B.A., Humana Press, Totowa, Nueva Jersey, 490 páginas; Protein Purification, Principles and Practices, (1993) Scopes R.K., Springer-Verlag, 5 N.Y., 3ª edición, 380 páginas; Current Protocols in Immunology, (1999) editado por Coligan J.E. y col., John Wiley & Sons Inc., N.Y.

Para la producción recombinante, células huésped se transfectan con vectores que codifican los polipéptidos de la invención y luego se cultivan en un medio nutritivo modificado según convenga para activar promotores, seleccionando transformantes o amplificando los genes. Vectores adecuados son aquellos que son viables y replicables en el huésped elegido e incluyen secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas, por ejemplo, plásmidos bacterianos, ADN de fago, baculovirus, plásmidos de levadura, vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fago. La secuencia de polipéptidos puede incorporarse en el vector en el sitio apropiado usando enzimas de restricción de forma que esté operativamente ligada a una región de control de la expresión que comprende un promotor, sitio de unión a ribosoma (región consenso o secuencia de Shine-Dalgarno), y opcionalmente un operador (elemento de control). Pueden seleccionarse componentes individuales de la región de control de la expresión que sean apropiados para un huésped dado y vector según principios de biología molecular establecidos (Sambrook y col., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (1999), editado por Ausubel F.M. y col., John Wiley and Sons, Inc. N.Y.). Promotores adecuados incluyen, pero no se limitan a, LTR o promotor del SV40, lac de E. coli, tac o promotores de trp y el promotor del fago lambda PL. Los vectores incorporan preferentemente un origen de replicación, además de marcadores de selección, es decir, gen de resistencia a antibiótico. Vectores bacterianos adecuados incluyen pET, pQE70, pQE60, pQE-9, pD10, Phagescript, PSIX174, pBluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16A, pNH46A, ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 y los vectores eucariotas pBlueBacIII, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG, pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL. Las células huésped pueden ser bacterianas (es decir, E. coli, Bacillus subtilis, Streptomyces), fúngicas (es decir, Aspergillus niger, Aspergillus nidulins), de levadura (es decir, Saccharomyces) o eucariotas (es decir, CHO, COS).

Tras la expresión del polipéptido en cultivo, las células se recogen normalmente por centrifugación, luego se rompen por medios físicos o químicos (si el polipéptido expresado no se secreta en los medios) y el extracto bruto resultante se conserva para aislar el polipéptido de interés. La purificación del polipéptido del medio de cultivo o lisado puede lograrse por técnicas establecidas dependiendo de las propiedades del polipéptido, es decir, usando precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía en hidroxilapatita y cromatografía en lectina. La purificación final puede lograrse usando HPLC.

El polipéptido puede expresarse con o sin una secuencia conductora o de secreción. En el primer caso, el conductor puede eliminarse usando procesamiento postraduccional (véanse los documento US 4.431.739; US 4.425.437; y US 4.338.397) o eliminarse químicamente posterior a la purificación del polipéptido expresado.

Según otro aspecto, los polipéptidos de GBS de la invención pueden usarse en una prueba de diagnóstico para infección por GBS, en particular infección por GBS. Varios procedimientos de diagnóstico son posibles, por ejemplo, para la detección del organismo de GBS en una muestra biológica puede seguirse el siguiente procedimiento:

a.: obtener una muestra biológica de un individuo;

b.: incubar un anticuerpo o fragmento del mismo reactivo con un polipéptido de GBS de la invención con la muestra biológica para formar una mezcla, y

c.: detectar anticuerpo específicamente unido o fragmento unido en la mezcla que indica la presencia de GBS.

Alternativamente, un procedimiento para la detección de anticuerpo específico para un antígeno de GBS en una muestra biológica que contiene o de la que se sospecha que contiene dicho anticuerpo puede realizarse del siguiente modo:

a.: obtener una muestra biológica de un individuo;

b.: incubar uno o más polipéptidos de GBS de la invención o fragmentos de los mismos con la muestra biológica para formar una mezcla; y

c.: detectar antígeno específicamente unido o fragmento unido en la mezcla que indica la presencia de anticuerpo específico para GBS.

Un experto en la materia reconocerá que esta prueba de diagnóstico puede tomar varias formas, que incluyen una prueba inmunológica tal como un enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), un radioinmunoensayo o un ensayo de aglutinación en látex, esencialmente para determinar si anticuerpos específicos para el polipéptido están presentes en un organismo.

Los polinucleótidos que codifican polipéptidos de la invención también pueden usarse para diseñar sondas de ADN para su uso en detectar la presencia de GBS en una muestra biológica de la que se sospecha que contiene tales bacterias. El procedimiento de detección de la presente invención comprende:

a.: obtener la muestra biológica de un individuo;

b.: incubar una o más sondas de ADN que tienen una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de la invención o fragmentos del mismo con la muestra biológica para formar una mezcla; y

c.: detectar sonda de ADN específicamente unida en la mezcla que indica la presencia de bacterias GBS.

Las sondas de ADN de esta invención también pueden usarse para detectar GBS en circulación (es decir, ácidos nucleicos de GBS) en una muestra, por ejemplo, usando una reacción en cadena de la polimerasa como procedimiento de diagnóstico de infecciones por GBS. La sonda puede sintetizarse usando técnicas convencionales y puede inmovilizarse sobre una fase sólida, o puede marcarse con una marca detectable. Una sonda de ADN preferida para esta aplicación es un oligómero que tiene una secuencia complementaria a al menos aproximadamente 6 nucleótidos contiguos de los polipéptidos de GBS de la invención.

Otro procedimiento de diagnóstico para la detección de GBS en un individuo comprende:

a.: marcar un anticuerpo reactivo con un polipéptido de la invención o fragmento del mismo con una marca detectable;

b.: administrar el anticuerpo marcado o fragmento marcado al individuo; y

c.: detectar anticuerpo marcado específicamente unido o fragmento marcado en el individuo que indica la presencia de GBS.

Otro aspecto de la invención es el uso de los polipéptidos de GBS de la invención como inmunógenos para la producción de anticuerpos específicos para el diagnóstico y en particular el tratamiento de infección por GBS. Anticuerpos adecuados pueden determinarse usando procedimientos de cribado apropiados, por ejemplo, midiendo la capacidad de un anticuerpo particular para proteger pasivamente contra infección por GBS en un modelo de prueba. Un ejemplo de un modelo animal es el modelo de ratón descrito en el ejemplo en este documento. El anticuerpo puede ser un anticuerpo completo o un fragmento de unión a antígeno del mismo y puede pertenecer a cualquier clase de inmunoglobulina. El anticuerpo o fragmento puede ser de origen animal, específicamente de origen mamífero, y más específicamente de origen murino, de rata o humano. Puede ser un anticuerpo natural o un fragmento del mismo o, si se desea, un anticuerpo recombinante o fragmento de anticuerpo. El término anticuerpo recombinante o fragmento de anticuerpo significa anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se produjo usando técnicas de biología molecular. El anticuerpo o fragmentos de anticuerpos pueden ser policlonales, o preferentemente monoclonales. Puede ser específico para varios epítopes asociados a los polipéptidos de GBS, pero es preferentemente específico para uno.

Otro aspecto desvelado en este documento es el uso de una composición farmacéutica de la invención para el tratamiento profiláctico o terapéutico de infección por GBS que comprende administrar a dicho individuo una cantidad profiláctica o terapéutica de la composición.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que comúnmente es entendido por un experto en la materia a la que pertenece la presente invención.

Ejemplo 1

Este ejemplo ilustra la identificación de genes BVH-A2 y BVH-A3 de GBS.

Se aisló ADN cromosómico de diferentes cepas de GBS como se ha descrito previamente (Jayarao BM y col. 1991.

J. Clin. Microbiol. 29:2774-2778). Se construyó una biblioteca genómica AZAPExpress usando ADN cromosómico purificado de la cepa NCS954 de GBS del serotipo III y se cribó según las instrucciones del fabricante (Stratagene, La Jolla, CA) con un conjunto de sueros normales humanos. Brevemente, el ADN cromosómico purificado se digirió parcialmente con enzima de restricción tsp509I, y los fragmentos resultantes se sometieron a electroforesis sobre un 1% de gel de agarosa (Bio-Rad). Los fragmentos en el intervalo de 5 a 10 kb de tamaño se extrajeron del gel y se ligaron a los brazos de EcoRI del vector de AZAPExpress y el vector se encapsidó usando el extracto de encapsidación Gigapack II (Stratagene). Los fagos recombinantes se usaron para infectar XL1-Blue MRF' de E. coli [l(mcrA)183l(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac (F' proAB lacIqZlM15 Tn10 [TetR])], que luego se sembró sobre agar LB. Las placas resultantes se levantaron sobre membranas de nitrocelulosa Hybond-C (Amersham Pharmacia Biotech, Baie d'Urfée, Canadá) preimpregnadas con isopropil-�-dtiogalactopiranósido 10 mM (IPTG: ICN Biomedicals Inc., Costa Mesa, CA). Las membranas se bloquearon usando solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 3% de leche desnatada y se incubaron secuencialmente con los sueros humanos reunidos, antisueros de cabra dirigidos contra inmunoglobulina humana marcada con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA) y sustrato. Se aislaron placas positivas, se purificaron dos veces y los plásmidos pBK-CMV (Stratagene) recombinantes se escindieron con el fago auxiliar ExAssist (Stratagene) según las instrucciones del fabricante. Las inmunotransferencias usando vectores de fagémido que contenían los insertos clonados revelaron que los sueros humanos reunidos reaccionaron con una banda de proteína con un peso molecular aproximado de 65 kDa para el clon H31-29, mientras que reaccionó con dos bandas de proteína con un peso molecular aproximado entre 40-60 kDa para el clon F8. Estos clones se identificaron respectivamente como BVH-A2 y BVH-A3. La secuencia de los insertos se determinó usando el kit de secuenciación Taq Dye Deoxy Terminator Cycle con un secuenciador automatizado Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA) modelo 373A según recomendaciones del fabricante.

Ejemplo 2

Este ejemplo ilustra la clonación de genes BVH-A2 y BVH-A3 de GBS.

Las regiones codificantes de genes BVH-A2 (SEC ID Nº: 1) y BVH-A3 (SEC ID Nº: 5) estreptocócicos del grupo B se amplificaron respectivamente por PCR (ciclador térmico de ADN GeneAmp PCR system 2400 Perkin Elmer, San Jose, CA) a partir del clon H31-29 de fagémido recombinante purificado y ADN genómico de la cepa NCS954 estreptocócica del grupo B de serotipo III usando cebadores de oligonucleótidos que contenían extensiones de 5 bases para la adición de sitios de restricción NdeI (CATATG) y XhoI (CTCGAG). Los cebadores de oligonucleótidos (Tabla 1) DMAR172 (SEC ID Nº: 9) y DMAR173 (SEC ID Nº: 10) se usaron para amplificar el gen BVH-A2, mientras que DMAR204 (SEC ID Nº: 15) y DMAR205 (SEC ID Nº: 16) se usaron para amplificar el gen BVH-A3. Los productos de PCR se purificaron en gel de agarosa usando un kit de extracción en gel QIAquick de QIAgen siguiendo las instrucciones del fabricante (Chatsworth, CA) y se digirieron con NdeI y XhoI (Pharmacia Canada Inc, 10 Baie d'Urfé, Canadá). El vector pET-21b(+) (Novagen, Madison, WI) se digirió con NdeI y XhoI y se purificó en gel de agarosa usando un kit de extracción en gel QIAquick de QIAgen (Chatsworth, CA). Los productos de PCR NdeI-XhoI se ligaron al vector de expresión NdeI-XhoI pET-21b(+). Los productos ligados se transformaron en la cepa DH5a de

E. coli [<80dlacZlM15 l(lacZYA-argF)U169 endA1 recA1 hsdR17 (rk-mk+) deoR thi-1 supE44 A-gyrA96 relA1] (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) según el procedimiento de Simanis (Hanahan, D. DNA Cloning, 1985, D.M. Glover

15 (ed), pág. 109-135). Los plásmidos de pET-21b(+) recombinantes (rpET21b(+)) que contenían los genes BVH-A2 o BVH-A3 se purificaron usando un kit de plásmidos QIAgen (Chatsworth, CA) y los insertos de ADN se secuenciaron (kit de secuenciación Taq Dye Deoxy Terminator Cycle, ABI, Foster City, CA).

Se determinó que el marco de lectura abierto (ORF) que codifica el gen BVH-A2 (SEC ID Nº: 1) contiene 1626 pb y codifica un polipéptido de 541 residuos de aminoácidos con un pl predicho de 8,99 y una masa molecular predicha 20 de 59730,66 Da. El análisis de la secuencia de residuos de aminoácidos predicha (SEC ID Nº: 3) usando el software Spscan (Wisconsin Sequence Analysis Package; Genetics Computer Group) sugirió la existencia de un péptido señal de 37 residuos de aminoácidos (MRGSLSTKQSYSLRKYKFGLASVILGSFIMVTSPVFA), que termina con un sitio de escisión situado entre un residuo de alanina y de ácido aspártico. El análisis de este ORF no reveló la presencia de estructuras repetitivas, o motivo de unión a IgA (MLKKIE), pero se identificó un motivo de anclaje a la 25 pared celular putativa (LPKTG) próximo al extremo C entre los residuos de aminoácidos 479 y 483. La comparación de la secuencia de aminoácidos de BVH-A2 (SEC ID Nº 3) con las secuencias compiladas en las bases de datos disponibles reveló el 18% identidad con una proteína exportada transmembrana de 40 kDa hipotética de Streptococcus mutans que se localizó en la dirección 5' del gen sr que codifica la proteína SR implicada en las interacciones de S. mutans con glicoproteínas salivales (número de acceso GeneBank: c60328: Ogier y col. 1991.

30 Infection and Immunity, 59:1620-1626).

Tabla 1. Cebadores de oligonucleótidos usados para amplificaciones por PCR de genes BVH-A2 y BVH-A3 de GBS

Genes: ID de cebadores de oligonucleótidos Secuencias

BVH-A2: DMAR172 (SEC ID Nº 9) 5'-CTTTGGGGAACATATGAGGGGATCTC-3'

BVH-A2: DMAR173 (SEC ID Nº 10) 5'-CTAAAAAGATTTACTCGAGAATTTCAATATAGCG-3'

BVH-A2: DMAR373 (SEC ID Nº 11) 5'-ATGAGGGGATCTCTCAGTACTAAGCAATCTT-3'

BVH-A2: DMAR374 (SEC ID Nº 12) 5'-TTAAATTTCAATATAGCGACGAATACCGGA-3'

BVH-A2: DMAR464 (SEC ID Nº 13) 5'-CATAGGATCCGGATCAAACTACATCGGTTCAAG-3'

BVH-A2: DMAR465 (SEC ID Nº 14) 5'-CCGGGTCGACTTAAATTTCAATATAGCGACG-3'

BVH-A3: DMAR204 (SEC ID Nº 15)

BVH-A3: DMAR205 (SEC ID Nº 16) 5'-CTTTCTCGAGTGCACCTTGATGGCGATCAGC-3'

BVH-A3: DMAR466 (SEC ID Nº 17)

BVH-A3: DMAR467 (SEC ID Nº 18) 5'-CATAGTCGACTTATGCACCTTGATGGCGATCAG-3'

Se determinó que el marco de lectura abierto (ORF) que codifica el gen BVH-A3 (SEC ID Nº: 5) contenía 1590 pb y codificaba un polipéptido de 529 residuos de aminoácidos con un pI predicho de 6,14 y una masa molecular 35 predicha de 59019,48 Da. El análisis de la secuencia de residuos de aminoácidos predicha (SEC ID Nº: 7) usando el software Spscan (Wisconsin Sequence Analysis Package; Genetics Computer Group) sugirió la existencia de un péptido señal de 28 residuos de aminoácidos (MKIKKIISGFAAALIISSLSTINYEVKA), que termina con un sitio de escisión situado entre un residuo de alanina y de ácido aspártico. El análisis de este ORF no reveló la presencia de

estructuras repetitivas, motivo de anclaje a la pared celular (LPXTG) o motivo de unión a IgA (MLKKIE). La comparación de la secuencia de aminoácidos de BVH-A3 (SEC ID Nº 7) con las secuencias compiladas en las bases de datos disponibles no reveló ninguna homología significativa con secuencias disponibles en los bancos de datos.

Ejemplo 3

5 Este ejemplo describe la amplificación por PCR de genes BVH-A2 y BVH-A3 de GBS de otras cepas de GBS

Para confirmar la presencia por amplificación por PCR de genes BVH-A2 (SEC ID Nº: 1) y BVH-A3 (SEC ID Nº: 5) se usaron las 11 siguientes cepas de GBS serológicamente distintas: C388/90 (serotipo Ia/c), ATCC12401 (serotipo Ib), ATCC27591 (serotipo Ic), NCS246 (serotipo II/R), NCS954 (serotipo III), NCS97SR331 (serotipo IV), NCS535 (serotipo V), NCS9B42 (serotipo VI), NCS7271 (serotipo VII), NCS970886 (serotipo VIII), ATCC27956 (cepa aislada 10 bovina). Estos cepas se obtuvieron de la Colección americana de cultivos tipo (Rockville, MD, EE.UU.) y el Centro nacional para Streptococcus, Laboratorio provincial de salud pública de Alberta del Norte (Edmonton, Canadá). En estos experimentos se usó la cepa XL1-Blue MRF' de E. coli como control negativo. Se aisló ADN cromosómico de cada cepa estreptocócica del grupo B como se ha descrito previamente (Jayarao BM y col. 1991. J. Clin. Microbiol. 29:2774-2778). Los genes BVH-A2 (SEC ID Nº: 1) y BVH-A3 (SEC ID Nº: 5) se amplificaron por PCR (ciclador 15 térmico de ADN GeneAmp PCR system 2400 Perkin Elmer, San Jose, CA) a partir del ADN genómico purificado de las 11 cepas de GBS y la cepa de E. coli de control usando los oligonucleótidos presentados en la Tabla 1. Los cebadores de oligonucleótidos DMAR373 (SEC ID Nº: 11) y DMAR374 (SEC ID Nº: 12) se usaron para amplificar el gen BVH-A2 (SEC ID Nº: 1), mientras que DMAR204 (SEC ID Nº: 15) y DMAR205 (SEC ID Nº: 16) se usaron para amplificar el gen BVH-A3 (SEC ID Nº: 5). Se realizó PCR con 35 ciclos de 45 s a 94ºC, 45 s a 55ºC y 2 min a 72ºC y 20 un periodo de extensión final de 10 min a 72ºC. Los productos de PCR se fraccionaron a tamaño en 1% de geles de agarosa y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Los resultados de estas amplificaciones por PCR se presentan en la Tabla 2. El análisis de los productos de amplificación revelaron que tanto los genes BVH-A2 (SEC ID Nº: 1) como BVH-A3 (SEC ID Nº: 5) estaban presentes en el genoma de las 11 cepas de GBS probadas. No se detectó tal producto cuando el ADN de E. coli de control se sometió a idénticas amplificaciones por PCR con ambos

25 conjuntos de cebadores de oligonucleótidos.

Tabla 2. Identificación de genes BVH-A2 y BVH-A3 por amplificación por PCR

Identificación de cepas: Identificación por amplificación por PCR de

Cepas aisladas de GBS: BVH-A2 BVH-A3

C388/90 (serotipo Ia/c): + +

ATCC12401 (serotipo Ib): + +

ATCC27591 (serotipo Ic): + +

NCS246 (serotipo II/R): +. +

NCS954 (serotipo III): + +

NCS97SR331 (serotipo IV): + +

NCS535 (serotipo V): + +

NCS9842 (serotipo VI): + +

NCS7271 (serotipo VII): + +

NCS970886 (serotipo VIII): + +

ATCC27956 (cepa aislada bovina): + +

Cepa XL1 Blue MRF' de control de E. coli: - -

Ejemplo 4

Este ejemplo ilustra la clonación de genes BVH-A2 y BVH-A3 de GBS en el plásmido pCMV-GH del CMV.

30 La región codificante de ADN de los polipéptidos de BHV-A2 (SEC ID Nº: 4) y BVH-A3 (SEC ID Nº: 8) estreptocócicos del grupo B se insertaron en fase en la dirección 3' de un gen de hormona de crecimiento humana (hGH) que estaba bajo el control de la transcripción del promotor del citomegalovirus (CMV) en el vector de plásmido pCMV-GH (Tang y col., Nature, 1992, 356:152). El promotor del CMV es plásmido no funcional en células de E. coli,

pero es activo tras la administración del plásmido a células eucariotas. El vector también incorporó el gen de resistencia a ampicilina.

Las regiones codificantes de los genes BVH-A2 (SEC ID Nº: 2) y BVH-A3 (SEC ID Nº: 6) sin sus regiones de péptido conductor se amplificaron por PCR (ciclador térmico de ADN GeneAmp PCR system 2400 Perkin Elmer, San Jose, CA) a partir de ADN genómico de la cepa NCS954 de GBS del serotipo III usando cebadores de oligonucleótidos que contenían extensiones de bases para la adición de sitios de restricción BamHI (GGATCC) y SalI (GTCGAC). Los cebadores de oligonucleótidos DMAR464 (SEC ID Nº: 13) y DMAR465 (SEC ID Nº: 14) se usaron para amplificar el gen BVH-A2 (SEC ID Nº: 2), mientras que DMAR466 (SEC ID Nº: 17) y DMAR467 (SEC ID Nº: 18) se usaron para amplificar el gen BVH-A3 (SEC ID Nº: 6). Los productos de PCR se purificaron en gel de agarosa usando un kit de extracción en gel QIAquick de QIAgen (Chatsworth, CA), se digirieron con enzimas de restricción (Pharmacia Canada Inc, Baie d'Urfe, Canadá). El vector pCMV-GH (Laboratorio del Dr. Stephen A. Johnston, Departamento de Bioquímica, Universidad de Texas, Dallas, Texas) se digirió con BamHI y SalI y se purificó en gel de agarosa usando el kit de extracción en gel QIAquick de QIAgen (Chatsworth, CA). Los fragmentos de ADN de BamHI-SalI se ligaron al vector de pCMV-GH de BamHI-SalI para crear los polipéptidos de fusión hGH-BVH-A2 y hGH-BVH-A3 bajo el control del promotor del CMV. Los productos ligados se transformaron en la cepa DH5a de E. coli [<80dlacZlM15 l(lacZYA-argF)U169 endA1 recA1 hsdR17 (rk-mk+) deoR thi-1 supE44 A-gyrA96 relA1] (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) según el procedimiento de Simanis (Hanahan, D. DNA Cloning, 1985, D.M. Glover (ed), pág. 109-135). Los plásmidos de pCMV recombinantes se purificaron usando un kit de plásmidos QIAgen (Chatsworth, CA) y las secuencias de nucleótidos de los insertos de ADN se verificaron por secuenciación de ADN.

Ejemplo 5

Este ejemplo ilustra el uso de ADN para provocar una respuesta inmunitaria a antígenos de polipéptidos de BVH-A2 y BVH-A3 de GBS.

Grupos de 8 ratones BALB/c hembra (Charles River, St-Constant, Québec, Canadá) se inmunizaron por inyección intramuscular tres veces con 100 μl a intervalos de dos o tres semanas con 50 μg de pCMV-GH recombinante que codifica los genes BVH-A2 (SEC ID Nº: 2) o BVH-A3 (SEC ID Nº: 6) en presencia de 50 μg del plásmido pCMV-GH-GM-CSF que expresa el factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) (Laboratorio del Dr. Stephen A. Johnston, Departamento de Bioquímica, Universidad de Texas, Dallas, Texas). Como control, grupos de ratones se inyectaron con 50 μg de pCMV-GH en presencia de 50 μg de pCMV-GH-GM-CSF. Las muestras de sangre se recogieron tanto del seno orbital antes de cada inmunización como siete días tras la tercera inyección y las respuestas de anticuerpos en suero se determinaron por ELISA usando polipéptidos recombinantes tanto de BVH-A2-His·Tag como de BVH-A3-His·Tag purificados como antígenos de recubrimiento.

Ejemplo 6

Este ejemplo ilustra la producción y purificación de polipéptidos de BVH-A2 y BVH-A3 de GBS recombinantes.

Los plásmidos pET-21b(+) recombinantes con genes BVH-A2 o BVH-A3 respectivamente correspondientes a SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 5 se usaron para transformar por electroporación (aparato Gene Pulser II, BIO-RAD Labs, Mississauga, Canadá) la cepa BL21(DE3) de E. coli (F-ompT hsdSB (r-Bm-B) gal dcm (DE3)) (Novagen, Madison, WI). En esta cepa de E. coli, el T7 promotor que controla la expresión del polipéptido recombinante es específicamente reconocido por la ARN polimerasa T7 (presente en el profago ADE3) cuyo gen está bajo el control del promotor lac que es inducible por isopropil-1-d-tio-galactopiranósido (IPTG). Los transformantes BL21(DE3)/rpET se cultivaron a 37ºC con agitación a 250 rpm en caldo LB (peptona 10 g/l, extracto de levadura 5 g/l, NaCl 10 g/l) que contenía 100 μg de carbenicilina (Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, Canadá) por ml hasta que la A600 alcanzó un valor de 0,6. Con el fin de inducir la producción de polipéptidos recombinantes de BVH-A2-His·Tag y BVH-A3-His·Tag de GBS, las células se incubaron durante 3 horas adicionales en presencia de IPTG a una concentración final de 1 mM. Las células inducidas a partir de un cultivo de 500 ml se sedimentaron por centrifugación y se congelaron a -70ºC.

La purificación de los polipéptidos recombinantes a partir de la fracción citoplásmica soluble de BL21(DE3)/rpET21b inducido por IPTG (+) se hizo por cromatografía de afinidad basándose en las propiedades de la secuencia His·Tag (6 residuos de histidina consecutivos) para unirse a cationes divalentes (Ni2+) inmovilizados sobre la resina de quelación metálica His·Bind. Brevemente, las células sedimentadas obtenidas de un cultivo de 500 ml inducidas con IPTG se resuspendieron en tampón de lisis (Tris 20 mM, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM, pH 7,9) que contenía PMSF 1 mM, se sonicaron y se centrifugaron a 12.000 x g durante 20 min para eliminar los residuos. El sobrenadante se depositó sobre una columna de agarosa Ni-NTA (Qiagen, Mississauga, Ontario, Canadá). Los polipéptidos recombinantes de BVH-A2-His·Tag y BVH-A3-His·Tag de GBS se eluyeron con imidazol 250 mM-NaCl 500 mM-Tris 20 mM a pH 7,9. La eliminación de la sal e imidazol de las muestras se hizo por diálisis contra PBS a 4ºC. Las cantidades de polipéptidos recombinantes obtenidas de la fracción soluble de E. coli se estimó por MicroBCA (Pierce, Rockford, Illinois).

Ejemplo 7

Este ejemplo ilustra la accesibilidad a anticuerpos de los polipéptidos de BVH-A2 y BVH-A3 de GBS en la superficie de cepas de GBS.

Se cultivaron bacterias en caldo Todd Hewitt (TH) (Difco Laboratories, Detroit MI) con 0,5% de extracto de levadura (Difco Laboratories) y 0,5% de extracto de peptona (Merck, Darmstadt, Alemania) a 37ºC en una atmósfera de 8% de CO2 dando una DO490 nm de 0,600 (~108 UFC/ml). Luego se añadieron diluciones de anti-BVH-A2, anti-BVH-A3 o sueros de control y se dejó que se unieran a las células, que se incubaron durante 2 h a 4ºC. Las muestras se lavaron 4 veces en tampón de bloqueo [solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía 2% de albúmina de suero bovino (BSA)], y luego se añadió 1 ml de anticuerpo de cabra dirigido contra IgG + IgM de ratón conjugada con fluoresceína (FITC) diluido en tampón de bloqueo. Después de una incubación adicional de 60 min a temperatura ambiente, las muestras se lavaron 4 veces en tampón de bloqueo y se fijaron con 0,25% de formaldehído en tampón PBS durante 18-24 h a 4ºC. Las células se lavaron 2 veces en tampón PBS y se resuspendieron en 500 μl de tampón PBS. Las células se mantuvieron en la oscuridad a 4ºC hasta que se analizaron por citometría de flujo (Epics® XL; Beckman Coulter, Inc.).

Ejemplo 8

Este ejemplo ilustra la protección contra infección por GBS mortal inducida por inmunización pasiva de ratones con sueros hiperinmunes de conejo.

Conejos New Zealand (Charles River Laboratories, St-Constant, Canadá) se inyectaron subcutáneamente en múltiples sitios con 50 μg y 100 μg de polipéptidos de BVH-A2-His·Tag o BVH-A3-His·Tag que se produjeron y se purificaron como se ha descrito en el Ejemplo 6 y se adsorbieron sobre adyuvante Alhydrogel (Superfos Biosector a/s). Los conejos se inmunizaron tres veces a intervalos de tres semanas con los polipéptidos de BVH-A2-His·Tag o BVH-A3-His·Tag. Se recogieron muestras de sangre tres semanas después de la tercera inyección. Los anticuerpos presentes en el suero se purificaron mediante precipitación usando 40% de sulfato de amonio saturado. Los grupos de 10 ratones CD-1 hembra (Charles River) se inyectaron intravenosamente con 500 μl de suero purificado recogido de conejos inmunizados tanto con BVH-A2-His·Tag como con BVH-A3-His·Tag, o conejos inmunizados con una proteína recombinante de control sin relacionar. Dieciocho horas después, los ratones se expusieron a aproximadamente 8x104 UFC de la cepa C388/90 de GBS (Ia/c). Las muestras del inóculo de exposición a GBS se sembraron sobre placas de agar sangre para determinar las UFC y para verificar la dosis de exposición. Las muertes se registraron durante un periodo de 14 días.

Ejemplo 9

Este ejemplo ilustra la protección de ratones contra infección por GBS mortal inducida por inmunización.

Grupos de 8 ratones CD-1 hembra (Charles River) se inmunizaron subcutáneamente tres veces a intervalos de tres semanas con 20 μg de polipéptidos de tanto BVH-A2-His·Tag como BVH-A3-His·Tag que se produjeron y se purificaron como se ha descrito en el Ejemplo 6 en presencia de 10 μg de adyuvante QuilA (Cedarlane Laboratories Ltd, Hornby, Canadá). Los ratones de control se inyectaron con adyuvante QuilA solo en PBS. Se recogieron muestras de sangre del seno orbital en el día 1, 22 y 43 antes de cada inmunización y siete días (día 50) tras la tercera inyección. Dos semanas después, los ratones se expusieron a aproximadamente 8x104 UFC de la cepa C388/90 de GBS (Ia/c). Las muestras del inóculo de exposición a GBS se sembraron sobre placas de agar sangre para determinar las UFC y para verificar la dosis de exposición. Las muertes se registraron durante un periodo de 14 días.

Lista de secuencias

<110> SHIRE BIOCHEM INC. MARTIN, Denis RIOUX, Stephane BOYER, Martine HAMEL, Josee BRODEUR, Bernard R.

<120> ANTÍGENOS DE BVH-A2 y BVH-A3 DE GBS

<130> 12806-23PCT

<140> PCT/CA01/01465

<141>

<150> US 60/239.919

<151>

<160> 21 5 <170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

<210> 1

<211> 1626

<212> ADN 10 <213> Streptococcus del grupo B

<400> 1

<210> 2

<211> 1515

<212> ADN

<213> Streptococcus del grupo B

<400> 2

<210> 3

<211> 541

<212> PRT

<213> Streptococcus del grupo B

<400> 3

<210> 4

<211> 504

<212> PRT

<213> Streptococcus del grupo B

<400> 4

<210> 5

<211> 1590

<212> ADN

<213> Streptococcus del grupo B

<400> 5

<210> 6

<211> 1506

<212> ADN

<213> Streptococcus del grupo B

<400> 6

<210> 7

<211> 529

<212> PRT

<213> Streptococcus del grupo B

<400> 7

<210> 8

<211> 501

<212> PRT

<213> Streptococcus del grupo B

<400> 8

<210> 9 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador oligonucleotídico DMAR172

<400> 9 ctttggggaa catatgaggg gatctc: 26

<210> 10 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador oligonucleotídico DMAR173

<400> 10 ctaaaaagat ttactcgaga atttcaatat agcg: 34

<210> 11 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador oligonucleotídico DMAR373

<400> 11 atgaggggat ctctcagtac taagcaatct t: 31

<210> 12 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador oligonucleotídico DMAR374

<400> 12 ttaaatttca atatagcgac gaataccgga: 30

<210> 13 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador oligonucleotídico DMAR464

<400> 13 cataggatcc ggatcaaact acatcggttc aag: 33

<210> 14 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador oligonucleotídico DMAR465

<400> 14 ccgggtcgac ttaaatttca atatagcgac g: 31

5: <210> 15 <211> 46 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico DMAR204

10: <400> 15 cacaggagaa catatgaaga ttaaaaaaat tattaatggc tttgcc 46

15: <210> 16 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador oligonucleotídico DMAR205

20: <400> 16 ctttctcgag tgcaccttga tggcgatcag c 31

25: <210> 17 <211> 41 <212> ADN <213> Secuencia artificial

30: <220> <223> Cebador oligonucleotídico DMAR466 <400> 17 cataggatcc tgatgacacc accagtgagt atcactatat c 41

35: <210> 18 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial

40: <220> <223> Cebador oligonucleotídico DMAR467

<400> 18 catagtcgac ttatgcacct tgatggcgat cag: 33

45: <210> 19 <211> 28 <212> PRT <213> Streptococcus del grupo B

50: <220> <221> SEÑAL <222> (1)...(28)

55: <400> 19

<210> 20

<211> 5

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 5 <223> Motivo de anclaje a la pared celular

<221> VARIANTE

<222> (1)...(5)

<223> Xaa = Cualquier aminoácido 10

<400> 20

15 <210> 21

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Motivo de unión a IgA

<400> 21

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polinucleótido aislado que comprende un polinucleótido elegido de:

(a)

un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos el 70% de identidad con un segundo polipéptido que comprende una secuencia elegida de SEC ID Nº: 7 y 8;

(b)

un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos el 95% de identidad con un segundo polipéptido que comprende una secuencia elegida de: SEC ID Nº: 7 y 8;

(c)

un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia elegida de: SEC ID Nº: 7 y 8;

(d)

un polinucleótido que codifica un polipéptido que puede producir anticuerpos que tienen especificidad de unión por un polipéptido que tiene una secuencia elegida de SEC ID Nº: 7 y 8;

(e)

un polinucleótido que codifica un epítope que lleva la porción de un polipéptido que tiene una secuencia elegida de SEC ID Nº: 7 y 8; y

(f)

un polinucleótido complementario a un polinucleótido en (a), (b), (c), (d) o (e).
2. El polinucleótido aislado según la reivindicación 1 seleccionado de

(a)

un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos idéntica al menos el 80% a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEC ID Nº: 5 ó 6;

(b)

un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos idéntica al menos el 90% a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEC ID Nº: 5 ó 6;

(c)

un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos idéntica al menos el 95% a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEC ID Nº: 5 ó 6; y

(d)

un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos expuesta en SEC ID Nº: 5 ó 6.
3.

El polinucleótido aislado de tanto la reivindicación 1 como la reivindicación 2, en el que dicho polinucleótido es ADN.
4.

El polinucleótido aislado de tanto la reivindicación 1 como la reivindicación 2, en el que dicho polinucleótido es ARN.
5.

El polinucleótido aislado de la reivindicación 1 que se hibrida bajo condiciones rigurosas con tanto

(a)

un polinucleótido que codifica un polipéptido como

(b)

el complemento de un polinucleótido que codifica el polipéptido;

en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en tanto SEC ID Nº: 7 como SEC ID Nº: 8.
6. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1, parte (e), que se hibrida bajo condiciones rigurosas con tanto

(a)

un polinucleótido que codifica un polipéptido como

(b)

el complemento de un polinucleótido que codifica el polipéptido;

en el que dicho polipéptido comprende al menos 10 residuos de aminoácidos contiguos de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 7 o SEC ID Nº: 8.
7.

Un vector que comprende el polinucleótido aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que dicho polinucleótido aislado está operativamente ligado a una región de control de la expresión.
8.

Una célula huésped transfectada con el vector de la reivindicación 7.
9.

Un procedimiento para producir un polipéptido codificado por el polinucleótido aislado según tanto la reivindicación 1 como la reivindicación 2, comprendiendo dicho procedimiento cultivar la célula huésped según la reivindicación 8 en condiciones adecuadas para la expresión de dicho polipéptido.
10.

Un polipéptido aislado elegido de:

(a)

un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al menos el 70% a la secuencia de aminoácidos expuesta en tanto SEC ID Nº: 7 como SEC ID Nº: 8;

(b)

un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al menos el 90% a la secuencia de aminoácidos expuesta en tanto SEC ID Nº: 7 como SEC ID Nº: 8

(c)

un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al menos el 95% a la secuencia de aminoácidos expuesta en tanto SEC ID Nº: 7 como SEC ID Nº: 8;

(d)

un polipéptido que comprende una secuencia elegida de: SEC ID Nº: 7 y 8;

(e)

un polipéptido que puede producir anticuerpos que tienen especificidad de unión por un polipéptido que tiene una secuencia elegida de SEC ID Nº: 7 y 8;

(f)

un polipéptido que comprende un epítope que lleva la porción de un polipéptido que tiene una secuencia elegida de SEC ID Nº: 7 y 8;

(g)

el polipéptido de (a), (b), (c), (d), (e) o (f) en el que el residuo Met del extremo N está delecionado; y

(h)

el polipéptido de (a), (b), (c), (d), (e) o (f) en el que la secuencia de aminoácidos secretora está delecionada.
11.

Un polipéptido quimérico que comprende el polipéptido aislado de SEC ID Nº: 7 u 8.
12.

Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido aislado según la reivindicación 10 o el polipéptido quimérico según la reivindicación 11 y un vehículo, diluyente o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
13.

Uso del polipéptido aislado según la reivindicación 10 o el polipéptido quimérico según la reivindicación 11 para la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o profiláctico de infección bacteriana por Streptococcus del grupo B (GBS) en un individuo.
14.

Uso según la reivindicación 13, en el que el individuo es un neonato o un lactante.
15.

Uso según la reivindicación 13 ó 14, en el que dicha infección es septicemia, meningitis, neumonía, celulitis, osteomielitis, artritis séptica, endocarditis o epiglotis.
16.

Uso según la reivindicación 13, en el que el individuo es una mujer embarazada.
17.

Uso según la reivindicación 13 o la reivindicación 16, en el que dicha infección es una infección urinaria, septicemia, meningitis, osteomielitis, endocarditis, amnionitis, endometritis, infección por heridas poscesárea, infección por heridas postepisiotomía, celulitis o fascitis.
18.

Uso según la reivindicación 13, en el que el individuo es un adulto no embarazado.
19.

Uso según la reivindicación 18, en el que dicha infección es bacteremia primaria, piel de una infección de tejido blando, neumonía, urosepticemia, endocarditis, peritonitis, meningitis o empiema.
20.

Uso según la reivindicación 13, en el que el individuo es una vaca.
21.

Uso según la reivindicación 20, en el que dicha infección es mastitis.
22.

Un procedimiento para diagnosticar una infección bacteriana por Streptococcus del grupo B (GBS) en un individuo susceptible a infección por GBS que comprende

a) incubar un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, con una muestra biológica del individuo para formar una mezcla, en el que el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, tiene especificidad de unión por un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 7 u 8; y

b) detectar anticuerpo específicamente unido, o fragmento de unión a antígeno del mismo, en la mezcla que indica la presencia de GBS.
23. Kit que comprende el polipéptido aislado según la reivindicación 10 o el polipéptido quimérico según la reivindicación 11 para la detección o diagnóstico de infección por GBS.

Figura 1 (SEC ID Nº: 1)

Figura 2 (SEC ID Nº: 2)

Figura 3 (SEC ID Nº: 3)

Figura 4 (SEC ID Nº: 4) Figura 5 (SEC ID Nº: 5) Figura 6 (SEC ID Nº: 6) Figura 7 (SEC ID Nº: 7)

Figura 8 (SEC ID Nº: 8)