ES2384630T3

ES2384630T3 - Procedimiento para el aislamiento de polihidroxialcanoatos (PHA) de c�lulas bacterianas mediante extracci�n en disolvente

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Publication number: ES2384630T3
Application number: ES06721599T
Authority: ES
Inventors: Paulo Eduardo Mantelatto; Nazareno Ant�nio Sert�ri DUR�O
Original assignee: PHB Industrial SA
Current assignee: PHB Industrial SA
Priority date: 2005-03-04
Filing date: 2006-03-06
Publication date: 2012-07-10
Anticipated expiration: 2026-03-06
Also published as: CN101171338A; CN101171338B; DOP2006000053A; MY147592A; GT200600099A; KR20070118618A; CA2599990A1; US8357508B2; EP1853713A2; EP1853713B1; CA2599990C; PT1853713E; BRPI0501844A; WO2006092033A3; WO2006092033A2; WO2006092033A8; KR101225161B1; AU2006220255A1; AU2006220255B2; MX2007010829A

Abstract

Un procedimiento para extraer y recuperar polihidroxialcanoatos (PHA) a partir de una biomasa celular bacteriana,obteniéndose dicha biomasa mediante fermentación, caracterizada por que comprende las etapas de:i) Someter la biomasa celular a operaciones concomitantes de inyección de disolvente de PHA, agitaciónenérgica y calentamiento rápido en el interior de un reactor, con el fin de estimular la rotura de la pared de lascélulas de biomasa y la disolución del PHA contenido en el ultimo, y para formar una suspensión quecomprende disolvente de PHA enriquecido con PHA disuelto en una concentración de al menos 2 % en pesode la suspensión y los residuos insolubles de la biomasa celular, en el que el disolvente de PHA usado seselecciona de los grupos de disolventes consistentes en formiato de metilo, formiato de etilo, formiato depropilo, formiato de butilo, formiato de isoamilo, formiato de pentilo (amilo) y formiato de caproílo (o hexilo) ymezclas de estos disolventes; propionato de etilo, propionato de isopropilo, propionato de isoamilo, propionatode caproílo (o hexilo) y mezclas de estos disolventes; butirato de metilo, butirato de propilo, butirato deisopropilo, butirato de isoamilo, butirato de pentilo (amilo), butirato de caproílo (o hexilo) y mezclas de estosdisolventes; isobutirato de metilo, isobutirato de propilo, isobutirato de isopropilo, isobutirato de isoamilo,isobutirato de pentilo (amilo), isobutirato de caproílo (o hexilo) y mezclas de estos disolventes; valerato depropilo, valerato de isopropilo, valerato de butilo, valerato de isobutilo, valerato de isoamilo (3-metil-1-butilo),valerato de pentilo (amilo) y valerato de caproílo (o hexilo) y mezclas de estos disolventes; e isoamilato demetilo (isovalerato) (butanoato de 3-metil-1-metilo), isoamilato de etilo (isovalerato) (butanoato de 3-metil-1-etilo), isoamilato de propilo (isovalerato) (butanoato de 3-metil-1-etilo), isoamilato de isopropilo (isovalerato)(butanoato de 3-metil-1-isopropilo), isoamilato de butilo (isovalerato) (butanoato de 3-metil-1-butilo), isoamilatode isobutilo (isovalerato) (butanoato de 3-metil-1-isobutilo), isoamilato de isoamilo (isovalerato) (butanoato de 3-metil-1-isoamilo), isoamilato de pentilo (isovalerato) (amilo) (butanoato de 3-metil-1-pentilo o de amilo) eisoamilato de caproílo (isovalerato) (hexilo) y mezclas de estos disolventes;ii) someter la suspensión formada en el reactor a una etapa de separación para recuperar el disolventeenriquecido con el PHA disuelto de los residuos insolubles de la biomasa celular restante;iii) someter la solución de disolvente de PHA enriquecido con PHA a operaciones de agitación y lavado conagua y/o vapor a una temperatura que es suficiente y adecuada para estimular la eliminación, medianteevaporación, de casi todo el disolvente de PHA y la precipitación del PHA, con el fin de formar una suspensiónque comprende PHA precipitado en agua el disolvente restante;iv) someter la suspensión del PHA precipitado a evaporación del disolvente restante hasta la depleción delmismo a través de la inyección de vapor en dicha suspensión de PHA, con el fin de obtener partículas de PHApurificado en suspensión acuosa; v) enfriar la suspensión en medio acuoso, del que se deplecionó el disolventede PHA, hasta aproximadamente 45 ºC o menos, y separar las partículas de PHA de dicha suspensión; yvi) someter las partículas de PHA separado a una etapa de secado.

Description

Procedimiento para el aislamiento de polihidroxialcanoatos (PHA) de c�lulas bacterianas mediante extracci�n en disolvente. 5

Campo de la invenci�n

La presente invenci�n se refiere a un procedimiento para la extracci�n y recuperaci�n de polihidroxialcanoatos (PHA) de una biomasa celular bacteriana usando disolventes de PHA no halogenados que no son agresivos para el medio ambiente, en el que el procedimiento permite obtener polihidroxialcanoatos (PHA) de pureza elevada y de alto peso molecular.

Antecedentes de la invenci�n

15 Es actualmente sabido en la industria mundial que existe una necesidad de producci�n de materiales biodegradables y biocompatibles usando materias primas renovables y fuentes de energ�a a trav�s de procedimiento que no sean agresivos con el medio ambiente.

En la sociedad moderna actual, el uso de materiales pl�sticos a gran escala est� llevando a una diversidad de problemas medioambientales serios cada vez mayores. En vista de estos problemas, el desarrollo de resinas pl�sticas biodegradables ha recibido atenci�n mundial, principalmente las producidas por medio de una tecnolog�a limpia, utilizando fuentes renovables. Las aplicaciones de estos biopol�meros biodegradables con mayores posibilidades de �xito en el mercado incluyen productos tales como materiales desechables, por ejemplo, embalajes, recipientes para cosm�ticos y agroqu�micos t�xicos, art�culos m�dicos y farmac�uticos, como se describe en la

25 introducci�n de la solicitud de patente brasile�a P104005622-1 (PCT/BR04/000237) del mismo solicitante. Una importante familia de los biopol�meros biodegradables es la de los polihidroxialcanoatos (PHA), que son poli�steres sintetizados de forma natural por un gran n�mero de seres vivos. Con m�s de 170 representantes descritos en la literatura, el inter�s comercial en los PHA est� directamente relacionado no s�lo con la biodegradabilidad, sino tambi�n con sus propiedades termo-mec�nicas y con sus costes de producci�n. De esta forma, �nicamente algunos PHA han encontrado aplicaci�n industrial, siendo los m�s representativos el PHB (poli-3-hidroxibutirato), el PHB-V (poli(hidroxibutirato-co-hidroxivalerato)), el P4HB (poli(4-hidroxibutirato)), el P3HB4HB (poli(3-hidroxibutirato-co-4hidroxibutirato)) y algunos PHAmcl (polihidroxialcanoatos de cadena media), siendo el representante t�pico de esta �ltima familia el PHHx (polihidroxihexanoato).

35 La estructura qu�mica de los PHA puede describirse como una cadena polim�rica formada por repeticiones de la siguiente unidad:

en la que R es un grupo alquilo o alquenilo de longitud variable, y m y n son n�meros enteros, m asumiendo R y m en los pol�meros antes mencionados los siguientes valores:

PHB: R=CH3, m=1 PBH-V: R=CH3 o CH3-CH2, m=1

45 P4HB: R=H, m=2 P3HB-4HB: R=H o CH3, m=1 or2 PHHx: R=CH3-CH2-CH2-, m=1

El gran desarrollo de las ciencias naturales en las �ltimas dos d�cadas, particularmente en el campo de la biotecnolog�a, ha permitido el uso de los m�s diversos organismos, naturales o modificados gen�ticamente, en la producci�n comercial de PHA. Especialmente relevante para la presente divulgaci�n es el uso de determinadas cepas bacterianas, que son capaces de producir y acumular cantidades importantes de estos pol�meros en su interior. Cultivadas en condiciones espec�ficas, que permiten alcanzar una alta densidad celular, un alto contenido de pol�mero intracelular y resultan compatibles con el proceso industrial, estas cepas bacterianas pueden usar 55 diferentes materias primas renovables, tales como la ca�a de az�car, las melazas o los extractos de celulosa hidrolizada. Aunque se han realizado intentos para aplicar las c�lulas bacterianas en la naturaleza (sin usar agentes solubilizantes de PHA), como material moldeable, conforme se divulga en la patente de EE.UU. n� 3107172, las aplicaciones comerciales de los PHA en la mayor�a de los casos precisan una pureza lo suficientemente alta como para conseguir las propiedades pl�sticas deseadas. Con el fin de obtener los niveles adecuados de pureza para el procesamiento del biopol�mero, especialmente de los PHA, existen fases normalmente requeridas en las cuales es

indispensable el uso de disolventes para la extracci�n y recuperaci�n del PHA de la biomasa residual.

En la patente EPA-01455233 A2 se describen varias posibilidades para llevar a cabo la digesti�n de una suspensi�n acuosa de c�lulas que contienen PHA, usando enzimas y/o tensioactivos para solubilizar el material celular que no es PHA, considerando que las enzimas son muy caras y no se pueden recuperar en el proceso, al contrario de lo que ocurre cuando se usa el disolvente. Tambi�n se precisa una alta diluci�n del material celular, lo que lleva a un alto volumen de residuos generados en el proceso.

Los procedimientos de extracci�n propuestos habitualmente consisten, b�sicamente, en exponer la biomasa celular seca o h�meda que contiene el biopol�mero a un contacto intensivo con un disolvente que lo solubiliza, seguido de una etapa en la que se separa el residuo celular. A continuaci�n, la soluci�n que contiene el biopol�mero recibe la adici�n de un agente insolubilizante, lo que induce su precipitado en el disolvente (v�ase, por ejemplo, la patente brasile�a PI 9103116-8, presentada el 16 de julio de 1991 y publicada el 24 de febrero de 1993).

En los procesos de extracci�n a trav�s de disolventes org�nicos, los disolventes usados son hidrocarburos parcialmente halogenados, tales como el cloroformo (patente US-3275610), el cloruro de metileno-etanol (documento US-3044942), los cloroetanos y los cloropropanos con un punto de ebullici�n dentro del intervalo de 65 a 170 �C, el 1,2-dicloroetano y el 1,2,3-tricloropropano (patentes EP-0014490 B y EP-2446859).

Otros compuestos halogenados, tales como diclorometano, dicloroetano y dicloropropano, se citan en las patentes de EE.UU. 4.562.245 (1985), 4.310.684 (1982), 4.705.604 (1987) y en la patente europea 036.699 (1981) y en la patente alemana 239.609 (1986).

Los procedimientos de extracci�n y purificaci�n de biopol�meros de la biomasa que usan disolventes halogenados, est�n hoy d�a totalmente prohibidos, debido a que son muy agresivos para el medio ambiente y para la salud humana. Por lo tanto, un disolvente que se puede usar como un potencial extractor del biopol�mero de una biomasa celular debe primeramente cumplir la condici�n de no ser agresivo con el medio ambiente

En este sentido, la patente brasile�a PI 9302312-0 (presentada en 1993 y concedida el 30 de abril de 2002) presenta un procedimiento de extracci�n de biopol�mero de la biomasa bacteriana que usa como disolventes alcoholes de cadena larga con 3 carbonos o los acetatos derivados de los mismos. Esta patente prefiere alcohol isoam�lico (3-metil-1-butanol), acetato de amilo (o �ster amiloac�tico) y aceite condensado, una mezcla de alcoholes altos obtenida como subproducto de la fermentaci�n alcoh�lica y que tiene como componente principal al alcohol isoam�lico. Esta patente se caracteriza tambi�n por usar un �nico disolvente como extractor y purificador, sin precisar el uso de un agente insolubilizante o contra-disolvente y/o un no disolvente m�nimo. La precipitaci�n del soluto (biopol�mero) de la soluci�n de PHA se realiza mediante el enfriamiento de la soluci�n.

La patente de EE.UU. 6.043.063 (presentada el 14 de abril de 1998 y concedida el 28 de marzo de 2000), la patente de EE.UU. 6.087.471 (presentada el 14 de abril de 1998 y concedida el 11 de junio de 2000) y la solicitud de patente internacional WO-98/46783 (presentada el 15 de abril de 1997) mencionan una extensa lista de disolventes no halogenados, que podr�an usarse potencialmente como disolventes para la extracci�n de biopol�mero de la biomasa, pero muchos de ellos presentan caracter�sticas tales como una dif�cil manipulaci�n industrial, toxicidad, adem�s de un alto coste. En dicha extensa lista, que incluye tambi�n los disolventes citados en la patente brasile�a PI 9302312 0, �nicamente un peque�o n�mero de disolventes presentan potencial para usarse comercialmente para la extracci�n de biopol�mero de la biomasa vegetal o bacteriana, bien debido a problemas relacionados con la incompatibilidad con el biopol�mero, o debidos a su toxicidad, explosividad y a su elevado coste.

Debido a que los biopol�meros son termosensibles, es decir cuando se someten a temperaturas por encima de un valor determinado se degradan de forma irreversible, pierden peso molecular, lo que puede afectar definitivamente a las propiedades que los caracterizan como termopl�sticos, es fundamental tener presente que la lista de disolventes con potencial para ser utilizados industrialmente se vuelve incluso m�s restringida. El potencial para el uso industrial del disolvente elegido para estimular la extracci�n del biopol�mero aumentar� si se asocia con un procedimiento adecuado que permita extraer el biopol�mero sin producir alteraciones significativas en su peso molecular. Aunque diversas aplicaciones usan PHA con peso molecular bajo en el intervalo de 10.000 a 50.000, son deseables pesos moleculares superiores a 500.000 Da en un intervalo mucho mayor de aplicaciones comerciales.

Con el fin de producir polihidroxialcanoatos (PHA) con peso molecular lo m�s cercano posible al peso molecular original, es decir del PH dentro de la c�lula, es importante considerar el caso en el que se necesita calentar los disolventes de PHA a m�s de 70 �C para solubilizar el biopol�mero; cuando m�s tiempo permanezca expuesto a esta temperatura durante el procesamiento, m�s se degradar�, hecho que irremediablemente puede alterar sus propiedades termopl�sticos, como se trata en la solicitud de patente anterior mencionada anteriormente P104005622-1 (PCT/BR04/000237), del mismo solicitante. Por ejemplo, el polihidroxibutirato, que inicialmente contiene un peso molecular de 1.000.000 Da y presentado a una extracci�n en alcohol isoam�lico a 110 �C dar�a, para un tiempo de 5 minutos de exposici�n, 951.230 Da; para 15 minutos de exposici�n, 853.692 Da; para 30 minutos de exposici�n, 707.410 Da; para 60 minutos , 414.771 Da; y para 90 minutos, 122.230 Da. Considerando que adem�s de la extracci�n son necesarias otras operaciones, tales como evaporaci�n y secado del disolvente, para obtener un producto puro con buenas propiedades mec�nicas y que estas operaciones muchas veces exponen el biopol�mero a situaciones cr�ticas sobre el material, no es dif�cil imaginar las dificultades inherentes del procesamiento de este tipo de material. Adem�s del disolvente, es deseable tener un proceso adecuado que no degrade t�rmicamente el producto.

Teniendo en cuenta la sensibilidad t�rmica del biopol�mero y a efectos de producir material con alto peso molecular, deber�a tenerse en cuenta que el potencial para el uso industrial de los disolventes, por ejemplo los disolventes mencionados en la patente de EE.UU. 6,043,063, est� �ntimamente relacionado con el tiempo de exposici�n del biopol�mero durante el procedimiento de extracci�n y recuperaci�n a las altas temperaturas que definir�n el nivel de degradaci�n t�rmica sufrida por el biopol�mero. En las patentes citadas no se hace referencia a las propiedades del material obtenido, especialmente en relaci�n con el peso molecular del producto.

Otro hecho relevante concerniente a la viabilidad industrial de este modo de extracci�n del PHA es que, dado que es un procedimiento de intenso consumo de energ�a, la viabilidad del producto tambi�n est� estrechamente relacionada con la disponibilidad de una fuente de energ�a renovable de bajo coste. Considerando los hechos expuestos anteriormente, es posible concluir que los procesos industriales para producir PHA deber�an contemplar: Cepas de microorganismos que presentan una eficiencia elevada a la hora de convertir la materia prima en pol�mero, con un sencillo y eficiente protocolo de producci�n; las materias primas de bajos costes y rendimientos altos; un procedimiento para extraer y purificar el pol�mero que permita obtener un producto de pureza elevada, conservando el m�ximo de las caracter�sticas originales del biopol�mero, con altos rendimientos y eficiencia, y mediante procedimientos que no son agresivos para el medio ambiente.

Adem�s de estos aspectos econ�micos, dado que es un producto mejor para el medio ambiente, todo el procedimiento del mismo deber�a ser compatible. Por tanto, deber�a evitarse el uso de productos da�inos para el medio ambiente en cualquier etapa de producci�n. Adem�s, la fuente de energ�a usada para realizar el proceso de producci�n deber�a proceder de una fuente renovable. No tendr�a ning�n sentido producir un pl�stico de bajo impacto ambiental si, por ejemplo, solo se emplean fuentes de energ�a no renovables.

Una energ�a renovable y barata aliada con la disponibilidad de materias primas baratas, az�car y meladas, y disolventes naturales obtenidos como subproductos de la fermentaci�n alcoh�lica hace de la industria del az�car y del alcohol la cuna ideal para la producci�n de biopl�sticos.

Con el objetivo de obtener con eficiencia un PHA de pureza alta y de alto peso molecular a partir de materia prima de bajo coste, la solicitud de patente anterior PI 04005622-1 (PCT/BR2004/000237) del mismo solicitante propone un procedimiento para recuperar PHA de biomasa celular bacteriana, que se obtiene mediante fermentaci�n, en el que dicho procedimiento presenta caracter�sticas de no agresi�n al medio ambiente, usando disolventes no halogenados.

Considerando la idoneidad de los disolventes para llevar a cabo el procedimiento, los �ltimos usos, como materia prima, una pasta de biomasa celular en suspensi�n acuosa y con un contenido de material celular seco no inferior a aproximadamente 18 en peso, en el que la pasta se presenta a un disolvente, agitaci�n y calentamiento en un reactor, con el fin de producir una suspensi�n que comprende disolvente y PHA disuelto, que despu�s se separa, todav�a caliente, de los residuos insolubles del resto de la biomasa celular. Despu�s, la soluci�n de PHA y disolvente se enfr�a hasta una temperatura que permita la precipitaci�n del PHA y se presenta a una microfiltraci�n, con el fin de obtener una pasta de PHA con una concentraci�n de Pa. de aproximadamente al 5 % o m�s, pasta que se calienta y agita de nuevo mediante inyecci�n de vapor de agua, con el fin de eliminar el disolvente y formar una suspensi�n acuosa de gr�nulos de PHA, que se someter�n a una separaci�n final.

Usando los disolventes indicados en el procedimiento anterior descrito anteriormente, la concentraci�n del PHA disuelto en el disolvente es inferior al 5 %, lo que requiere una operaci�n de microfiltraci�n con el fin de permitir que dicha concentraci�n de PHA en la suspensi�n alcance un valor m�nimo, que permita la continuidad del procedimiento en t�rminos de viabilidad econ�mica. Con el fin de conservar el peso molecular del biopol�mero, la soluci�n se enfr�a r�pidamente antes de microfiltrar.

Por tanto, en el procedimiento anterior, el requisito de energ�a es relativamente grande, ya que el gran volumen de suspensi�n diluida inicialmente calentada se enfr�a y despu�s se vuelve a calentar antes de la evaporaci�n del disolvente. Adem�s, este procedimiento requiere instalaciones provistas de equipos de alto coste necesarios para llevar a cabo las etapas de enfriamiento r�pido y de microfiltraci�n. Considerando, la baja solubilidad del PHA en los disolventes mencionados, el volumen de los disolventes en circulaci�n requeridos en este procedimiento es alto, requiere planta de bombeo y equipos m�s grandes, adem�s de mayores cantidades de energ�a el�ctrica y t�rmica para operaciones y evaporaci�n del disolvente.

El documento EP 0 479 043 A1 divulga un procedimiento para obtener un polihidroxialcanoato, sintetizado intracelularmente por un microorganismo, del material celular de una suspensi�n celular acuosa fermentada, procedimiento en el que al menos parte de la soluci�n de fermentaci�n o del agua contenida en la soluci�n de fermentaci�n, se elimina de la suspensi�n celular, tras lo cual el material celular se trata con un disolvente acuoso para el polihidroxialcanoato, que es inmiscible con agua y que tiene un punto de ebullici�n inferior a 100 �C, con o sin la adici�n de agua, de modo que la mezcla de extracci�n formada se agita a temperaturas desde la temperatura ambiente hasta el punto de ebullici�n del disolvente org�nico y se deja reposar, con o sin centrifugaci�n, formando una fase acuosa y una org�nica, y la fase org�nica que contiene el polihidroxialcanoato en forma disuelta se separa de la fase acuosa que contiene los residuos celulares en forma sin disolver, procedimiento que se caracteriza porque la fase org�nica se inyecta en agua caliente a una temperatura que es superior al punto de ebullici�n del disolvente org�nico, hacienda que el disolvente org�nico se evapore y que el polihidroxialcanoato precipite en el agua, siendo el ultimo obtenido del modo habitual. Como disolventes adecuados se divulgan hidrocarburos halogenados, tales como cloruro de metileno, cloroformo y tricloroetileno.

Nonato R.V. y coI., "Integrated production of biodegradable plastic, sugar and ethanol", APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, vol. 57, n� 1-2, October 2001, p�ginas 1-5, describen que el �cido poli 3-hidroxibut�rico (PHB) y copol�meros relacionados se pueden producir de forma ventajosa cuando se integran en un molino de ca�a de az�car. La energ�a necesaria para el procedimiento de producci�n la proporciona la biomasa, las emisiones de di�xido de carbono al medio ambiente son asimiladas fotosint�ticamente por el cultivo de ca�a de az�car y los residuos se reciclan en los campos de ca�a y el pol�mero se puede producir a costes bajos considerando la disponibilidad de una fuente de carbono y energ�a a precios bajos.

Sumario de la invenci�n

A partir de lo anterior, es un objetivo gen�rico de la presente invenci�n proporcionar un procedimiento para recuperar PHA de biomasa celular bacteriana, obtenida mediante fermentaci�n, usando disolventes no halogenados que no son agresivos para el medio ambiente, con el fin de generar, por medio de instalaciones relativamente simplificadas y menos consumo de energ�a, un producto de pureza alta y de alto peso molecular usando materia prima y energ�a renovables.

De acuerdo con la invenci�n, el procedimiento en cuesti�n comprende las etapas de:

i) someter la biomasa celular a operaciones concomitantes de inyecci�n de disolvente de PHA, agitaci�n en�rgica y calentamiento r�pido en el interior de un reactor con el fin de estimular la rotura de la pared de las c�lulas de biomasa y disoluci�n del PHA contenido en esta �ltima, y para formar una suspensi�n que comprende disolvente de PHA enriquecido con PHA disuelto en una concentraci�n de al menos 2 %, preferentemente superior al 5 %, en peso de la suspensi�n, y residuos insolubles de la biomasa celular (residuos); ii) someter la suspensi�n formada en el reactor a una etapa de separaci�n para recuperar el disolvente enriquecido con el PHA disuelto de los residuos insolubles de la biomasa celular restante; iii) someter la soluci�n de disolvente de PHA enriquecido con PHA a operaciones de agitaci�n y lavado con agua y/o vapor a una temperatura que es suficiente y adecuada para estimular la eliminaci�n, mediante evaporaci�n, de casi todo el disolvente de PHA y la precipitaci�n del PHA, con el fin de formar una suspensi�n que comprende PHA precipitado en agua el disolvente restante; iv) someter la suspensi�n del PHA precipitado a evaporaci�n del disolvente restante hasta la depleci�n del mismo a trav�s de la inyecci�n de vapor en dicha suspensi�n de PHA, con el fin de obtener part�culas de PHA purificado en suspensi�n acuosa; v) enfriar la suspensi�n en medio acuoso, del que se deplecion� el disolvente de PHA, hasta aproximadamente 45 �C o menos, y separar las part�culas de PHA de dicha suspensi�n; y vi) someter las part�culas de PHA separado a una etapa de secado.

Con el fin de extraer el PHA de la biomasa celular fermentada, el procedimiento propuesto en el presente documento usa al menos uno de los disolventes seleccionados de los grupos siguientes: grupo 1: formiato de metilo, formiato de etilo, formiato de propilo, formiato de butilo, formiato de isoamilo, formiato de pentilo y formiato de capro�lo (o de hexilo); grupo 2: propionato de isopropilo, propionato de isoamilo, propionato de capro�lo (o de hexilo); grupo 3: butirato de metilo, butirato de propilo, butirato de isopropilo, butirato de isoamilo, butirato de ventilo (amilo), butirato de capro�lo (o de hexilo); grupo 4: isobutirato de metilo, isobutirato de etilo, isobutirato de butilo, isobutirato de propilo, isobutirato de isopropilo, isobutirato de isoamilo, isobutirato de ventilo (amilo), isobutirato de capro�lo; grupo

5: valerato de propilo, valerato de isopropilo, valerato de butilo, valerato de isobutilo, valerato de isoamilo (valerato de 3-metil-1-butil), valerato de ventilo (amilo) y valerato de capro�lo (o de hexilo); grupo 6: isoamilato de metilo (isovalerato) (3-metil-1-metil butanoato), isoamilato de etilo (isovalerato) (3-metil-1etil butanoato), isoamilato de propilo (isovalerato) (3-metil-1-propil butanoato), isoamilato de isopropilo (isovalerato) (butanoato de 3-metil-1isopropilo), isoamilato de butilo (isovalerato) (3-metil-1-butil butanoato), isoamilato de isobutilo (isovalerato) (butanoato de 3-metil-1-isobutilo), isoamilato de isoamilo (isovalerato) (butanoato de 3-metil-1-isoamilo), isoamilato de pentilo (isovalerato) (amilo) (butanoato de 3-metil-1-pentilo o de amilo) e isoamilato de capro�lo (isovalerato) (hexilo).

El procedimiento como se ha descrito es relativamente simple, usa fuentes de energ�a renovable y materia prima, ya que se asocia con alcohol y producci�n de az�car a partir de ca�a de az�car, es compatible con el medio ambiente y la salud humana, y define una alternativa econ�mica para extraer y recuperar los polihidroxialcanoatos (PHA) a gran escala.

Breve descripci�n de las figuras

La invenci�n descrita m�s adelante presenta sus etapas ilustradas a modo de ejemplo en un diagrama de flujo, que se representa en la �nica figura 1 de los dibujos adjuntos.

Descripci�n detallada de la invenci�n

A continuaci�n se describe una lista de definiciones de los t�rminos usados en la descripci�n de la presente invenci�n:

“Alquenilo” significa una cadena carb�nica insaturada, desde C1 a Cn, en la que n var�a desde 2 hasta aproximadamente 20, cuya cadena carb�nica puede ser lineal, ramificada o c�clica, y la insaturaci�n puede ser monoinsaturada, es decir, con un enlace doble o triple en la cadena carb�nica; o poliinsaturada, es decir, con dos o m�s enlaces dobles o con dos o m�s enlaces triples o incluso con uno o m�s enlaces dobles y uno o m�s enlaces triples en la cadena carb�nica. “Alquilo” significa una cadena carb�nica saturada, desde C1 a Cn, en la que n var�a desde 2 hasta aproximadamente 20, cuya cadena carb�nica puede ser lineal, ramificada o c�clica. “Biomasa Celular” significa una biomasa procedente de cualquier microorganismo o planta, que sea capaz de producir PHA de forma natural o por medio de modificaci�n gen�tica, con el fin de convertirla en un productor de PHA o un alto productor de PHA. “Comprende” o “comprender” significa que pueden a�adirse, o estar presentes, otras etapas, u otros estadios, u otros compuestos u otros ingredientes, que no afectan al resultado final. Este t�rmino se puede sustituir por,

o sustituye los t�rminos: “constituido por”, “formado por”, “constituido esencialmente por” y “formado esencialmente por”. "Da" significa Dalton, la unidad de medida del peso molecular de pol�meros. “Extraer polihidroxialcanoatos de una biomasa” o “extracci�n de polihidroxialcanoatos de una biomasa” significa extraer o la extracci�n de un PHA determinado producido por una biomasa que produce un solo tipo de PHA y, adicionalmente, tambi�n puede significar extraer o la extracci�n de m�s de un tipo de PHA producido por una biomasa, para situaciones en las que la biomasa celular productora de PHA produce m�s de un solo tipo de PHA. “Extracto Bruto” significa la suspensi�n constituida por el disolvente de PHA enriquecido con el PHA extra�do de la masa celular de PHA que contiene, disuelta en ella, agua e impurezas extra�das de la masa celular, y por los s�lidos insolubles, que son el residuo de la biomasa celular de la que se extrajo el PHA. “Sustancialmente presi�n atmosf�rica” significa una presi�n muy cercana a la atmosf�rica, es decir igual o ligeramente superior o inferior a la presi�n atmosf�rica. “Reactor de Extracci�n” significa el equipo en el que se procesa la operaci�n de extracci�n del PHA de la biomasa celular productora de PHA. “Enfriamiento r�pido” de una corriente (soluci�n o suspensi�n) significa: enfriar esta corriente (soluci�n o suspensi�n) en algunos segundos, por medio de expansi�n, a trav�s de intercambio t�rmico con otra corriente m�s fr�a y/o por enfriamiento por medio de intercambiadores t�rmicos. “Disolvente” significa una sustancia capaz de disolver otra sustancia denominada soluto, con el fin de formar una mezcla denominada soluci�n, de un soluto uniformemente dispersado en el disolvente, en relaci�n con el tama�o molecular o el tama�o i�nico. “Disolvente de PHA” significa una sustancia capaz de disolver los polihidroxialcanoatos. “Disolvente enriquecido con PHA” o “soluci�n de disolvente enriquecido con PHA” significa una soluci�n de disolvente de PHA que contiene el PHA extra�do de la biomasa celular productora de PHA. “Virtualmente libre de” o “pr�cticamente libre de” significa “tener una cantidad muy peque�a de” o “tener presencia de restos de” o “presentar una cantidad insignificante de” o “presentar una cantidad casi imperceptible de”. Hay un n�mero relativamente grande de publicaciones que describen la extracci�n de PHA por medio de disolventes no halogenados de microorganismos o de fuentes de biomasa vegetal. No obstante, cuando se desee aplicar las ense�anzas descritas a escala comercial, existe una gran dificultad en la obtenci�n de un producto en el que las propiedades originales del biopol�mero intracelular se conservan sustancialmente, cuyas caracter�sticas son, la mayor�a del tiempo, fundamentales para elaborar productos comerciales. Se observa que en la mayor�a de dichas publicaciones se presta poca atenci�n a la termosensibilidad del producto a temperaturas elevadas. La mayor�a de los disolventes no halogenados mencionados como candidatos para usar en la extracci�n de PHA presentan una solubilidad baja para este soluto y requieren temperaturas elevadas, normalmente por encima de 70 �C, para la extracci�n y recuperaci�n de PHA. Cuando se desea procesar la extracci�n de PHA con dichos disolventes a escala comercial, normalmente los tiempos necesarios para la recuperaci�n de PHA son demasiado largos, degrad�ndolos t�rmicamente de un modo irreversible. El producto obtenido de este modo, en funci�n del tiempo de exposici�n a una temperatura elevada, queda restringido a un n�mero muy limitado de aplicaciones en la industria, o incluso a cualquier otra aplicaci�n.

La presente invenci�n se refiere a un proceso a escala industrial, en el que las etapas de procesamiento se combinan de un modo tal que permita: a) minimizar el tiempo de exposici�n a altas temperaturas de la mayor parte del PHA extra�do de la biomasa celular, utilizando disolventes no halogenados, lo que permite minimizar su

degradaci�n, con el fin de preservar al m�ximo sus propiedades originales, especialmente su peso molecular;

b) obtener un producto de alta pureza, normalmente superior al 99%, conservando el color natural del biopol�mero y con la ausencia virtual de disolvente residual, sin que haya necesidad de incluir en el proceso etapas adicionales 5 espec�ficas para decolorar y purificar el PHA producido;

c) obtener un alto grado de recuperaci�n de PHA de la biomasa, normalmente superior al 90%;

d) usar, de una manera integrada, materias primas renovables y fuentes de energ�a originadas por la industria del az�car y del alcohol, incrementando de esta forma los beneficios de los grupos industriales que producen az�car y alcohol.

Los procedimientos de la presente invenci�n se pueden aplicar a los PHA producidos por microorganismos o plantas naturales o gen�ticamente modificados o a PHA producidos sint�ticamente. El polihidroxialcanoato o PHA es un 15 pol�mero constituido por repeticiones de la unidad siguiente:

en la que R es un grupo alquilo o alquenilo de longitud variable, y m y n son n�meros enteros, m asumiendo R y m en los pol�meros antes mencionados los siguientes valores: PHB: R=CH3, m=1 PHB-V: R=CH3 o CH3-CH2, m=1 P4HB: R=H, m=2 P3HB-4HB: R=H o CH3, m=1 o 2

25 PHHx: R=CH3-CH2-CH2-, m=1

La presente invenci�n se aplica a los PHA recuperados de biomasa de microorganismos, preferentemente a PHB (Poli-3-hidroxibutirato), PHB-V (poli(hidroxibutirato-cohidroxivalerato), P4HB (poli-4-hidroxibutirato, P3HB4HB (poli(3hidroxibutirato-co-4-hidroxibutirato)) y algunos PHAmcl (polihidroxialcanoatos de cadena media), siendo el representante t�pico de esta �ltima familia el PHHx (polihidroxihexanoato).

Procedimiento para extraer PHA usando disolventes no halogenados, con un tiempo de exposici�n corto del biopol�mero a la condici�n de degradaci�n t�rmica

35 La presente invenci�n se refiere a un procedimiento que usa un material fermentado de biomasa celular bacteriana y que, en una etapa de extracci�n, se somete a operaciones concomitantes de inyecci�n de disolvente de PHA, preferentemente, en la forma l�quida calentada y la forma de vapor, de agitaci�n en�rgica y calentamiento r�pido en un reactor, con el fin de provocar r�pidamente calentamiento de la biomasa celular hasta una temperatura entre aproximadamente 90 �C hasta la temperatura de ebullici�n del disolvente, a la presi�n sustancialmente atmosf�rica y la disoluci�n de PHA contenida en la biomasa y para generar un extracto bruto definido por una suspensi�n que comprende disolvente de PHA enriquecido disuelto en una concentraci�n de al menos un 2 % y, con frecuencia, superior al 5 % en peso de la suspensi�n, y residuos insolubles de la biomasa celular.

En una forma preferida de la invenci�n, en la que la biomasa celular bacteriana se introduce en la forma seca en la

45 operaci�n de extracci�n, el extracto bruto obtenido en la etapa de extracci�n est� constituido por una fase l�quida, que comprende disolvente de PHA enriquecido con PHA, y una fase s�lida, que est� definida por residuos insolubles de la biomasa celular residual (residuos).

En otra forma de llevar a cabo la invenci�n, la biomasa celular bacteriana se lleva a una etapa de extracci�n en una forma de suspensi�n acuosa, preferentemente concentrada por encima del 10 % del material seco (peso/peso) en ella y tambi�n denominada pasta, con el fin de obtener un extracto bruto que consiste en una fase l�quida que comprende disolvente de PHA enriquecido con PHA y el agua restante de la biomasa celular; una fase s�lida definida por los residuos insolubles de la biomasa celular residual; y una fase de vapor que contiene agua y vapores del disolvente de PHA. El agua y los vapores del disolvente de PHA, que se generan en varias etapas del

55 procedimiento, se condensan y se separan en dos fases l�quidas: una fase rica en disolvente, que retorna al procedimiento en la fase de extracci�n y recuperaci�n de PHA; y una fase pobre en disolvente, que se recircula en el procedimiento para permitir recuperar el disolvente de PHA contenido en ella.

Este procedimiento, adem�s de calentar la biomasa celular, tambi�n estimula el efecto de eliminar el exceso de agua suministrada con la pasta en forma de un vapor, que es una mezcla binaria consistente en disolvente de PHA y agua. La fase de vapor, que sustancialmente contiene la mayor parte del agua introducida con la biomasa en el reactor, se puede extraer despu�s del reactor para condensarla despu�s, dejando atr�s una suspensi�n que consiste en una soluci�n de disolvente de PHA enriquecida con PHA y una peque�a fracci�n de agua disuelta en el disolvente, adem�s de residuos insolubles de la biomasa celular extra�da.

En el procedimiento para extraer y recuperar PHA se usa al menos un disolvente de PHA, seleccionado de los grupos siguientes:

Grupo 1 de disolventes consistente en: formiato de metilo, formiato de etilo, formiato de propilo, formiato de butilo, formiato de isoamilo, formiato de pentilo (amilo) y formiato de capro�lo (o hexilo) y mezclas de estos disolventes, m�s preferentemente formiato de propilo, formiato de butilo, formiato de isoamilo, formiato de ventilo e, incluso m�s preferentemente, formiato de isoamilo. Grupo 2 de disolventes consistente en: propionato de etilo, propionato de isopropilo, propionato de isoamilo, propionato de capro�lo (o hexilo) y mezclas de estos disolventes y, m�s preferentemente, propionato de isopropilo, propionato de isoamilo e, incluso m�s preferentemente, propionato de isoamilo. Grupo 3 de disolventes consistente en: butirato de metilo, butirato de propilo, butirato de isopropilo, butirato de isoamilo, butirato de pentilo (amilo), butirato de capro�lo (o hexilo) y mezclas de estos disolventes, y, m�s preferentemente, butirato de propilo, butirato de isopropilo, butirato de isoamilo, butirato de pentilo (amilo) e, incluso m�s preferentemente, butirato de isoamilo (butirato de 3-metil-1-butilo). Grupo 4 de disolventes consistente en: isobutirato de metilo, isobutirato de propilo, isobutirato de isopropilo, isobutirato de isoamilo, isobutirato de pentilo (amilo), isobutirato de capro�lo (o hexilo) y mezclas de estos disolventes, y, m�s preferentemente, isobutirato de propilo, isobutirato de isopropilo, isobutirato de isoamilo, isobutirato de pentilo (amilo) e, incluso m�s preferentemente, isobutirato de isoamilo (butirato de 3-metil-1-butilo). Grupo 5 de disolventes consistente en: valerato de propilo, valerato de isopropilo, valerato de butilo, valerato de isobutilo, valerato de isoamilo (3-metil-1-butilo), valerato de pentilo (amilo) y valerato de capro�lo (o hexilo) y mezclas de estos disolventes, m�s preferentemente valerato de propilo, valerato de isopropilo, valerato de butilo, valerato de isobutilo, valerato de isoamilo, valerato de pentilo (amilo) e, incluso m�s preferentemente, valerato de isoamilo. Grupo 6 de disolventes consistente en: isoamilato de metilo (isovalerato) (3-metil-1-metil butanoato), isoamilato de etilo (isovalerato) (3-metil-1etil-butanoato), isoamilato de propilo (isovalerato) (3-metil-1-propil-butanoato), isoamilato de isopropilo (isovalerato) (3-metil-1-isopropil-butanoato), isoamilato de butilo (isovalerato) (3-metil-1-butilbutanoato), isoamilato de isobutilo (isovalerato) (3-metil-1-isobutil-butanoato), isoamilato de isoamilo (isovalerato) (3metil-1-isoamil-butanoato), isoamilato de pentilo (isovalerato) (amilo) (butanoato de 3-metil-1-pentilo o de amilo) e isoamilato de capro�lo (isovalerato) (hexilo), y mezclas de estos disolventes y, m�s preferentemente, isoamilato de propilo (isovalerato), isoamilato de isopropilo (isovalerato), isoamilato de butilo (isovalerato), isoamilato de isobutilo (isovalerato), isoamilato de isoamilo (isovalerato), isoamilato de ventilo (isovalerato) (amilo) e, incuso m�s preferentemente, isoamilato de isoamilo (isovalerato).

En cualquiera de las formas de invenci�n, el extracto bruto obtenido, que es efluente de la etapa de extracci�n, se somete despu�s a un procedimiento de separaci�n de s�lidos insolubles de la soluci�n de disolvente de PHA enriquecido con PHA, por ejemplo mediante filtraci�n, centrifugaci�n, m�s preferentemente mediante filtraci�n, que genera una corriente filtrada de s�lidos insolubles y que comprende la soluci�n de PHA enriquecida con PHA y una torta que contiene los s�lidos insolubles separados.

El uso de los disolventes considerados en el presente documento permite que la suspensi�n del disolvente de PHA enriquecida con PHA disuelto presente una concentraci�n de PHA de al menos aproximadamente un 2 % en peso y, para una parte relevante de los disolventes escogidos, al menos superior a aproximadamente 5 % en peso de la suspensi�n. Cuando los disolventes usados son aqu�llos con una solubilidad del PHA igual o superior a aproximadamente 5 % en peso, la etapa de eliminar el disolvente de la soluci�n de PHA se realiza sin pasar por las etapas intermedias de enfriar y microfiltrar. La soluci�n que contiene PHA disuelto y libre de residuos insolubles de biomasa, preferentemente a la temperatura de extracci�n, se introduce despu�s en un flujo de vapor, preferentemente de un modo pulverizado y, despu�s, se expande instant�neamente en un reactor, que se mantiene a una presi�n que var�a desde vac�o hasta la presi�n sustancialmente atmosf�rica, preferentemente a vac�os de 100 a 600 mmHg, en el que se generan: un flujo de vapor binario que contiene agua y una parte sustancial del disolvente de PHA que es parte de la soluci�n de alimentaci�n y una suspensi�n de part�culas de PHA finamente divididas en agua y una fracci�n de disolvente residual resultante de la condensaci�n de parte del vapor introducido. Esta suspensi�n se somete despu�s a evaporaci�n del disolvente residual final hasta depleci�n de la misma en el l�quido restante (licor madre) mediante la inyecci�n de vapor. Por tanto, al final del proceso se obtiene una suspensi�n de part�culas de PHA finamente dispersadas en agua. Esta suspensi�n se enfr�a r�pidamente hasta aproximadamente 45 �C o menos y se somete a un proceso para separar las part�culas de PHA dispersas en esta suspensi�n, por ejemplo filtrando y lavando la torta filtrada, que contiene las part�culas de PHA, con agua sustancialmente libre de disolvente. Las part�culas de PHA obtenidas de este modo se someten despu�s a un proceso de secado, obteniendo PHA e forma de polvo, que presenta un nivel de pureza alto, niveles muy bajos de disolvente residual, color, cenizas e impurezas co un rendimiento global muy alto, es decir una cantidad de PHA recuperada en relaci�n con el PHA contenido en la biomasa original, superior a aproximadamente 90 % (peso/peso) y pesos moleculares superiores a 300.000 Da, normalmente de 400.000 a 800.000 Da.

De acuerdo con la invenci�n, la eliminaci�n del disolvente de la soluci�n de PHA se lleva a cabo en una c�mara de evaporaci�n pulverizando directamente la soluci�n de PHA en un flujo de vapor, seguido de precipitaci�n de PHA en la mezcla de disolvente y agua.

De acuerdo con un modo de llevar a cabo la invenci�n, el vapor usado para eliminar el disolvente de la soluci�n de PHA es un vapor supercalentado en relaci�n con la presi�n de operaci�n en la c�mara de evaporaci�n. Debe entenderse que la c�mara de evaporaci�n se podr�a mantener a una presi�n inferior a la presi�n atmosf�rica o a una presi�n sustancialmente atmosf�rica. En modo de llevar a cabo la invenci�n, la eliminaci�n del disolvente de la soluci�n de PHA se lleva a cabo inyectando directamente la soluci�n en agua y vapor, y calentando en agitaci�n en un reactor mantenido a una presi�n inferior a la presi�n atmosf�rica o a una presi�n sustancialmente atmosf�rica. En la presente divulgaci�n, los disolventes seleccionados y pertenecientes a los grupos de 1 a 6 se pueden obtener mediante, por ejemplo, reacciones conocidas de s�ntesis org�nica entre un alcohol y un �cido carbox�lico en presencia de un catalizador �cido (ion H+) y las denominadas reacciones de esterificaci�n (MORRISON, R. e BOYD, R., Quimica Organica, 9� ed., Calouste Gulbenkian, Lisboa, Portugal, p�g. 991-1016, 1990 e Solomons, T.W. G., Organic Chemistry, 2� ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, EE.UU., p�g. 749-801, 1980). Particularmente en el Grupo 6, en el que el �cido implicada en la reacci�n de esterificaci�n �cido 3-metil-1-butanoico o �cido isoam�lico, debe enfatizarse que se puede obtener mediante, por ejemplo, reacciones conocidas de s�ntesis org�nica entre un alcohol y oxidaci�n catalizada con �cido, alcohol isoam�lico (3-metil-1-butanol), alcohol primario, mediante un proceso de cat�lisis de transferencia de fase como de detalla en la literatura de qu�mica org�nica tradicional (p. ej., MORRISON, R. e BOYD, R., Quimica Organica, 9� ed., Calouste Gulbenkian, Lisboa, Portugal, p�g. 616-618, 471 e Solomons, T.W. G., Organic Chemistry, 2� ed., John Wiley &Sons, Inc., New York, EE.UU., p�g. 654-657, 1980).

El uso de los disolventes seleccionados descritos anteriormente presenta la ventaja de solubilizar aproximadamente 2-20 veces el PHA que, por ejemplo, los disolventes descritos en la patente PI 9302312-0, en la solicitud de patente PI 04005622-1 (PCT/BR04/000237) y en la patente de EE.UU. 6,043,063, tal como, por ejemplo, acetato de isoamilo, acetato de butilo, 1-hexanol, alcohol am�lico, alcohol isoam�lico y propionato de propilo. El grado de solubilidad depende del disolvente usado y de la temperatura de extracci�n escogida.

La buena estabilidad conseguida con el uso de los disolventes seleccionados como objeto de la invenci�n asociada con la metodolog�a descrita en el presente documento permite:

a) obtener una extracci�n r�pida y eficiente del PHA de la biomasa de microorganismos; b) evaporar instant�neamente una cantidad sustancial del disolvente contenido en la soluci�n de PHA inyectada en el flujo de vapor y expandida en una c�mara de evaporaci�n, preferentemente al vac�o, en el que se recupera una parte relevante del calor sensible contenido en la soluci�n de PHA alimentada, al mismo tiempo estimula la precipitaci�n de PHA en agua condensada del vapor, que simult�neamente se enfr�a con el vapor y que sale del sistema; conteniendo esto �ltimo parte del agua admitida en el vapor inyectado y una cantidad sustancial del disolvente contenido en la soluci�n de PHA introducido junto con ella; c) para los disolventes con una solubilidad del PHA igual o superior al 5 % en peso usando una etapa como se describe en el punto b), eliminando las etapas adicionales de enfriamiento de PHB, cristalizaci�n o precipitaci�n y concentraci�n mec�nica (o con membranas), de modo que se reduce considerablemente la unidad de evaporaci�n de la suspensi�n de PHB en el disolvente, dispensando simult�neamente la necesidad de a�adir un agente de insolubilizaci�n del PHA (contradisolvente); d) para los disolventes cuya solubilidad del PHA entre aproximadamente 2 % y aproximadamente 5 % en peso usando una etapa como se describe en el punto b), reduciendo el tama�o del enfriamiento de PHB, cristalizaci�n o precipitaci�n, y concentraci�n mec�nica (o con membranas), de modo que se dispensa la necesidad de a�adir un agente de insolubilizaci�n del PHA (contradisolvente); e) Mediante acci�n con vapor, como se describe en el punto b, evaporaci�n de disolvente y precipitaci�n del PHA, que reduce las posibilidades de producir da�os en el peso molecular, eliminando simult�neamente mediante acci�n termomec�nica las impurezas disueltas en el disolvente de PHA cuando est�n en contacto, transfiriendo a la fase de agua; permitiendo adem�s obtener part�culas de PHA finamente divididas, que facilita la eliminaci�n del disolvente residual y las impurezas, y, tambi�n, la posterior operaci�n de secado; f) mediante la acci�n impulsada del vapor, de acuerdo con el procedimiento descrito en el punto b, estimular la pulverizaci�n de la soluci�n de PHA en el flujo de vapor; y g) reducir significativamente las cantidades de disolvente en circulaci�n requeridas en el procedimiento de extracci�n de PHA, que implica una reducci�n proporcional del tama�o de una parte sustancial del equipo que se puede usar industrialmente y que, adem�s de estimular una reducci�n acentuada del consumo de energ�a t�rmica y el�ctrica requerida en el proceso, permite reducir significativamente las inversiones en el procedimiento de extracci�n y purificaci�n.

Ejemplos

Ejemplo 1: extracci�n y recuperaci�n usando propionato de isoamilo como disolvente.

A un matraz de destilaci�n de fondo redondo de 500 ml se a�adieron 50 g de biomasa de Alcaligenes eutrophus, que contienen un 78,4 % de material seco y 58,8 % de PHB con peso molecular de 1.000.000 Da y 300 g de propionato de isoamilo. La suspensi�n se someti� despu�s, en agitaci�n, a evaporaci�n de una fracci�n de disolvente y agua, usando una manta t�rmica acoplada al matraz de destilaci�n. El vapor binario generado de este 2do se llev� a un condensador de tubo recto (de tipo Liebig) para condensaci�n y el condensado resultante se recogi� en un recipiente Erlenmeyer. La suspensi�n se mantuvo en un proceso de evaporaci�n en agitaci�n hasta alcanzar la temperatura de extracci�n. La temperatura se ley� en un term�metro de mercurio fijado a una de las boquillas del matraz y se mantuvo en contacto con la fase de vapor dentro del matraz. La temperatura de extracci�n se alcanz� despu�s de transcurrido un tiempo de evaporaci�n de aproximadamente 3 minutos y la temperatura de ebullici�n de la mezcla pas� de aproximadamente 95 �C (temperatura inicial) a aproximadamente 115 �C (temperatura de extracci�n). Despu�s, la suspensi�n se mantuvo en un r�gimen de reflujo condensado en agitaci�n durante aproximadamente 5 minutos a la temperatura de 115 �C (temperatura de extracci�n) y despu�s, todav�a caliente, se filtr� en un papel de filtro para separar la parte insoluble de la parte disuelta en el disolvente filtrado. El material filtrado caliente que contiene aproximadamente 8,82% (p/p) de PHB solubilizado se enfri� despu�s para precipitar el PHB, se concentr� mediante filtraci�n, se someti� a evaporaci�n del disolvente y, despu�s, a secado. El PHB obtenido present� un peso molecular de aproximadamente 558.000 Da. La cantidad de biomasa concentrada usada en las pruebas fue aproximadamente 2,0-3,5 veces mayor que la cantidad necesaria para alcanzar la concentraci�n de saturaci�n de PHB en el disolvente a la temperatura de extracci�n empleada. Por tanto, se pudo determinar la concentraci�n de la saturaci�n del soluto (PHB) en el disolvente (propionato de isoamilo) para la temperatura de extracci�n empleada.

Ejemplo 2: extracci�n y recuperaci�n de phb usando butirato de propilo como disolvente.

A un matraz de destilaci�n de fondo redondo de 500 ml se a�adieron 50 g de biomasa de Alcaligenes eutrophus, que contienen un 78,4 % de material seco y 58,8 % de PHB con peso molecular de 1.000.000 Da y 300 g de butirato de butilo. La suspensi�n se someti� despu�s, en agitaci�n, a evaporaci�n de una fracci�n de disolvente y agua, usando una manta t�rmica acoplada al matraz de destilaci�n. El vapor binario generado de este modo se llev� a un condensador de tubo recto (de tipo Liebig) para condensaci�n y el condensado resultante se recogi� en un recipiente Erlenmeyer. La suspensi�n se mantuvo en un proceso de evaporaci�n en agitaci�n hasta alcanzar la temperatura de extracci�n. La temperatura se ley� en un term�metro de mercurio fijado a una de las boquillas del matraz y se mantuvo en contacto con la fase de vapor dentro del matraz. La temperatura de extracci�n se alcanz� despu�s de transcurrido un tiempo de evaporaci�n de aproximadamente 3 minutos y la temperatura de ebullici�n de la mezcla pas� de aproximadamente 98 �C (temperatura inicial) a aproximadamente 120 �C (temperatura de extracci�n). Despu�s, la suspensi�n se mantuvo en un r�gimen de reflujo condensado en agitaci�n durante aproximadamente 5 minutos a la temperatura de 120 �C (temperatura de extracci�n) y despu�s, todav�a caliente, se filtr� en un papel de filtro para separar la parte insoluble de la parte disuelta en el disolvente filtrado. El material filtrado caliente que contiene aproximadamente 3,0% (p/p) de PHB solubilizado se enfri� despu�s para precipitar el PHB, se concentr� mediante filtraci�n, se someti� a evaporaci�n del disolvente y, despu�s, a secado. El PHB obtenido present� un peso molecular de aproximadamente 638.000 Da. La cantidad de biomasa concentrada usada en las pruebas se a�adi� en exceso de aproximadamente 2,0-3,5 veces mayor que la cantidad necesaria para alcanzar la concentraci�n de saturaci�n de PHB en el disolvente a la temperatura de extracci�n empleada. Por tanto, se pudo determinar la concentraci�n de la saturaci�n del soluto (PHB) en el disolvente (butirato de butilo) para la temperatura de extracci�n empleada.

Ejemplo 3: extracci�n y recuperaci�n de phb a partir de biomasa seca usando valerato de isoamilo como disolvente.

A un matraz de destilaci�n de fondo redondo de 500 ml se a�adieron 50 g de biomasa de Alcaligenes eutrophus, que contienen un 78,4 % de material seco y 58,8 % de PHB con peso molecular de 1.000.000 Da y 300 g de valerato de isoamilo. La suspensi�n se someti� despu�s, en agitaci�n, a evaporaci�n del disolvente y agua, usando una manta t�rmica acoplada al matraz de destilaci�n. El vapor binario generado de este modo se llev� a un condensador de tubo recto (de tipo Liebig) para condensaci�n y el condensado resultante se recogi� en un recipiente Erlenmeyer. La suspensi�n se mantuvo en un proceso de evaporaci�n en agitaci�n hasta alcanzar la temperatura de extracci�n. La temperatura se ley� en un term�metro de mercurio fijado a una de las boquillas del matraz y se mantuvo en contacto con la fase de vapor dentro del matraz. La temperatura de extracci�n se alcanz� despu�s de transcurrido un tiempo de evaporaci�n de aproximadamente 3 minutos y la temperatura de ebullici�n de la mezcla pas� de aproximadamente 98 �C (temperatura inicial) a aproximadamente 130 �C (temperatura de extracci�n). Despu�s, la suspensi�n se mantuvo en un r�gimen de reflujo condensado en agitaci�n durante aproximadamente 10 minutos a la temperatura de 130 �C (temperatura de extracci�n) y despu�s, todav�a caliente, se filtr� en un papel de filtro para separar la parte insoluble de la parte disuelta en el disolvente filtrado. El material filtrado caliente que contiene aproximadamente 27,8% (p/p) de PHB solubilizado se enfri� despu�s para precipitar el PHB, se concentr� mediante filtraci�n, se someti� a evaporaci�n del disolvente y, despu�s, a secado. El PHB obtenido present� un peso molecular de aproximadamente 735.000 Da. La cantidad de biomasa concentrada usada en las pruebas se a�adi� en exceso de aproximadamente 2,0-3,5 veces mayor que la cantidad necesaria para alcanzar la concentraci�n de saturaci�n de PHB en el disolvente a la temperatura de extracci�n empleada. Por tanto, se pudo determinar la concentraci�n de la saturaci�n del soluto (PHB) en el disolvente (valerato de isoamilo) para la temperatura de extracci�n empleada.

Ejemplo 4: extracci�n y recuperaci�n de phb a partir de biomasa seca usando isoamilato de isoamilo (isovalerato) (3metil-1-butanoato de 3-metil-1-butanol) como disolvente.

A un matraz de destilaci�n de fondo redondo de 500 ml se a�adieron 50 g de biomasa de Alcaligenes eutrophus, que contienen un 78,4 % de material seco y 58,8 % de PHB con peso molecular de 1.000.000 Da y 300 g de isoamilato de isoamilo (isovalerato) (3-metil-1-butanoato de 3-metil-1-butanol). La suspensi�n se someti� despu�s, en agitaci�n, a evaporaci�n del disolvente y agua, usando una manta t�rmica acoplada al matraz de destilaci�n. El vapor binario generado de este modo se llev� a un condensador de tubo recto (de tipo Liebig) para condensaci�n y el condensado resultante se recogi� en un recipiente Erlenmeyer. La suspensi�n se mantuvo en un proceso de evaporaci�n en agitaci�n hasta alcanzar la temperatura de extracci�n. La temperatura se ley� en un term�metro de mercurio fijado a una de las boquillas del matraz y se mantuvo en contacto con la fase de vapor dentro del matraz. La temperatura de extracci�n se alcanz� despu�s de transcurrido un tiempo de evaporaci�n de aproximadamente 3 minutos y la temperatura de ebullici�n de la mezcla pas� de aproximadamente 98 �C (temperatura inicial) a aproximadamente 125 �C (temperatura de extracci�n). Despu�s, la suspensi�n se mantuvo en un r�gimen de reflujo condensado y en agitaci�n durante aproximadamente 10 minutos a la temperatura de 125 �C (temperatura de extracci�n) y despu�s, todav�a caliente, se filtr� en un papel de filtro para separar la parte insoluble de la parte disuelta en el disolvente filtrado. El material filtrado caliente que contiene aproximadamente 9,8% (p/p) de PHB solubilizado se enfri� despu�s para precipitar el PHB, se concentr� mediante filtraci�n, se someti� a evaporaci�n del disolvente y, despu�s, a secado. El PHB obtenido present� un peso molecular de aproximadamente 575.000 Da. La cantidad de biomasa concentrada usada en las pruebas se a�adi� en exceso de aproximadamente 2,0-3,5 veces mayor que la cantidad necesaria para alcanzar la concentraci�n de saturaci�n de PHB en el disolvente a la temperatura de extracci�n empleada. Por tanto, se pudo determinar la concentraci�n de la saturaci�n del soluto (PHB) en el disolvente (isovalerato de isoamilo) para la temperatura de extracci�n empleada.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un procedimiento para extraer y recuperar polihidroxialcanoatos (PHA) a partir de una biomasa celular bacteriana, obteni�ndose dicha biomasa mediante fermentaci�n, caracterizada por que comprende las etapas de:

i) Someter la biomasa celular a operaciones concomitantes de inyecci�n de disolvente de PHA, agitaci�n en�rgica y calentamiento r�pido en el interior de un reactor, con el fin de estimular la rotura de la pared de las c�lulas de biomasa y la disoluci�n del PHA contenido en el ultimo, y para formar una suspensi�n que comprende disolvente de PHA enriquecido con PHA disuelto en una concentraci�n de al menos 2 % en peso de la suspensi�n y los residuos insolubles de la biomasa celular, en el que el disolvente de PHA usado se selecciona de los grupos de disolventes consistentes en formiato de metilo, formiato de etilo, formiato de propilo, formiato de butilo, formiato de isoamilo, formiato de pentilo (amilo) y formiato de capro�lo (o hexilo) y mezclas de estos disolventes; propionato de etilo, propionato de isopropilo, propionato de isoamilo, propionato de capro�lo (o hexilo) y mezclas de estos disolventes; butirato de metilo, butirato de propilo, butirato de isopropilo, butirato de isoamilo, butirato de pentilo (amilo), butirato de capro�lo (o hexilo) y mezclas de estos disolventes; isobutirato de metilo, isobutirato de propilo, isobutirato de isopropilo, isobutirato de isoamilo, isobutirato de pentilo (amilo), isobutirato de capro�lo (o hexilo) y mezclas de estos disolventes; valerato de propilo, valerato de isopropilo, valerato de butilo, valerato de isobutilo, valerato de isoamilo (3-metil-1-butilo), valerato de pentilo (amilo) y valerato de capro�lo (o hexilo) y mezclas de estos disolventes; e isoamilato de metilo (isovalerato) (butanoato de 3-metil-1-metilo), isoamilato de etilo (isovalerato) (butanoato de 3-metil-1etilo), isoamilato de propilo (isovalerato) (butanoato de 3-metil-1-etilo), isoamilato de isopropilo (isovalerato) (butanoato de 3-metil-1-isopropilo), isoamilato de butilo (isovalerato) (butanoato de 3-metil-1-butilo), isoamilato de isobutilo (isovalerato) (butanoato de 3-metil-1-isobutilo), isoamilato de isoamilo (isovalerato) (butanoato de 3metil-1-isoamilo), isoamilato de pentilo (isovalerato) (amilo) (butanoato de 3-metil-1-pentilo o de amilo) e isoamilato de capro�lo (isovalerato) (hexilo) y mezclas de estos disolventes; ii) someter la suspensi�n formada en el reactor a una etapa de separaci�n para recuperar el disolvente enriquecido con el PHA disuelto de los residuos insolubles de la biomasa celular restante; iii) someter la soluci�n de disolvente de PHA enriquecido con PHA a operaciones de agitaci�n y lavado con agua y/o vapor a una temperatura que es suficiente y adecuada para estimular la eliminaci�n, mediante evaporaci�n, de casi todo el disolvente de PHA y la precipitaci�n del PHA, con el fin de formar una suspensi�n que comprende PHA precipitado en agua el disolvente restante; iv) someter la suspensi�n del PHA precipitado a evaporaci�n del disolvente restante hasta la depleci�n del mismo a trav�s de la inyecci�n de vapor en dicha suspensi�n de PHA, con el fin de obtener part�culas de PHA purificado en suspensi�n acuosa; v) enfriar la suspensi�n en medio acuoso, del que se deplecion� el disolvente de PHA, hasta aproximadamente 45 �C o menos, y separar las part�culas de PHA de dicha suspensi�n; y vi) someter las part�culas de PHA separado a una etapa de secado.
2.

El procedimiento de acuerdo con la reivindicaci�n 1, caracterizado por que el disolvente de PHA usado se selecciona del grupo de disolventes que consiste en propionato de isoamilo, butirato de propilo, valerato de isoamilo e isoamilato de isoamilo o mezclas de los mismos.
3.

El procedimiento de acuerdo con la reivindicaci�n 1, caracterizado por que el disolvente de PHA es propionato de isoamilo.
4.

El procedimiento de acuerdo con la reivindicaci�n 1, caracterizado por que el disolvente de PHA usado permite presentar una solubilidad de PHA en el mismo de al menos 5 % en peso.
5.

El procedimiento de acuerdo con la reivindicaci�n 1, caracterizado por que el PHA usado se selecciona del grupo definido por poli-3-hidroxibutirato (PHB), poli(hidroxibutirato-co-hidroxivalerato), PHBV y mezclas de estos pol�meros y copol�meros.
6.

procedimiento de acuerdo con la reivindicaci�n 5, caracterizado por que el PHA se produce mediante fermentaci�n bacteriana usando microorganismos que son capaces de biosintetizar PHA usando, como materia prima principal, az�cares extra�das de ca�a de az�car, y porque la fuente principal de energ�a usada para generar la energ�a t�rmica y la energ�a el�ctrica requeridas por el procedimiento es bagazo de ca�a de az�car.
7.

El procedimiento de acuerdo con la reivindicaci�n 1, caracterizado por que la etapa de inyectar disolvente en la biomasa celular concentrada comprende operaciones de inyectar disolvente de PHA l�quido y disolvente de PHA en forma de vapor, con el fin de estimular el calentamiento de la biomasa celular a una temperatura entre 90 �C y la temperatura de ebullici�n del disolvente a una presi�n sustancialmente atmosf�rica.
8.

El procedimiento de acuerdo con la reivindicaci�n 1, caracterizado por que la eliminaci�n del disolvente de la soluci�n de PHA se lleva a cabo en una c�mara de evaporaci�n pulverizando directamente la soluci�n de PHA en un flujo de vapor, seguido de precipitaci�n de PHA en la mezcla de disolvente y agua.
9.

El procedimiento de acuerdo con la reivindicaci�n 8, caracterizado por que el vapor usado para eliminar el disolvente de la soluci�n de PHA mediante evaporaci�n, inyectando directamente la soluci�n en un flujo de vapor, es

un vapor supercalentado en relaci�n con la presi�n de operaci�n en la c�mara de evaporaci�n.
10.

El procedimiento de acuerdo con la reivindicaci�n 8, caracterizado por que la eliminaci�n del disolvente de la soluci�n de PHA se lleva a cabo inyectando directamente la soluci�n en un flujo de vapor y en la c�mara de evaporaci�n mantenida a una presi�n inferior a la presi�n atmosf�rica.
11.

El procedimiento de acuerdo con la reivindicaci�n 8, caracterizado por que la eliminaci�n del disolvente de la soluci�n de PHA se lleva a cabo inyectando directamente la soluci�n en un flujo de vapor y en la c�mara de evaporaci�n mantenida a una presi�n sustancialmente atmosf�rica.
12.

El procedimiento de acuerdo con la reivindicaci�n 8, caracterizado por que la eliminaci�n del disolvente de la soluci�n de PHA comprende inyectar directamente la soluci�n en agua y vapor y calentando en agitaci�n en un reactor mantenido a una presi�n inferior a la presi�n atmosf�rica.
13.

El procedimiento de acuerdo con la reivindicaci�n 8, caracterizado por que la eliminaci�n del disolvente de la soluci�n de PHA se lleva a cabo inyectando directamente la soluci�n en agua y calentando en agitaci�n en un reactor mantenido a una presi�n sustancialmente atmosf�rica.
14.

El procedimiento de acuerdo con la reivindicaci�n 1, caracterizado por que la biomasa usada en el proceso de extracci�n es una forma de suspensi�n acuosa.
15.

El procedimiento de acuerdo con la reivindicaci�n 14, caracterizado por que el disolvente de PHA forma con agua, en una fase de vapor, una mezcla binaria.
16.

El procedimiento de acuerdo con la reivindicaci�n 15, caracterizado por que la etapa de inyectar disolvente en la suspensi�n de la biomasa celular comprende operaciones de inyectar disolvente de PHA l�quido y disolvente de PHA en forma de vapor, con el fin de estimular el calentamiento de la biomasa celular a una temperatura entre 90 �C y la temperatura de ebullici�n del disolvente a una presi�n sustancialmente atmosf�rica y para formar: una fase l�quida que comprende disolvente de PHA enriquecida con PHA y el agua estante de la biomasa celular; una fase s�lida definida por los residuos insolubles de la biomasa celular residual; y una fase de vapor que contiene agua y vapores del disolvente de PHA.
17.

El procedimiento de acuerdo con la reivindicaci�n 16, caracterizado por que comprende la etapa adicional de extraer la fase de vapor que contiene sustancialmente exceso del agua introducida en el interior del reactor a trav�s de la biomasa.
18.

El procedimiento de acuerdo con la reivindicaci�n 1, caracterizado por que la biomasa celular procede de microorganismos naturales o gen�ticamente modificados.