ES2384835A1 - Procedimiento para el registro de imágenes en tomografía óptica de fluorescencia y sistema de aplicación. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para el registro de imágenes en tomografía óptica de fluorescencia y sistema de aplicación.Permite determinar la distribución tridimensional de una muestra (M) que contiene moléculas o partículas fluorescentes que se excitan mediante la iluminación con un haz de barrido alargado en la dirección axial (Z) y compacto en la dirección transversal.Para cada posición de barrido (X, Y), la luz de fluorescencia procedente de la excitación de los emisores se analiza utilizando una matriz de microlentes (MML) situada en un plano transversal, paralelo al plano (X, Y), y acoplada a un sensor de imagen (S). Este último, está conectado a un ordenador en dónde se ejecuta un algoritmo que encuentra la distribución de la concentración de emisores en función de la coordenada (Z) cuya emisión de luz mejor se corresponde con la imagen registrada. Finalmente se dispone de un conjunto de datos sobre la distribución de concentración de emisores tridimensional.De utilidad especial como técnica de microscopia en biología y biomedicina.
Description
PROCEDIMIENTO PARA EL REGISTRO DE IMÁGENES EN TOMOGRAFíA ÓPTICA DE FLUORESCENCIA Y SISTEMA DE APLICACiÓN
5 La presente invención se refiere a un sistema para la obtención de imágenes tomográficas de la distribución de concentración de marcadores ópticos fluorescentes especialmente indicado para el estudio de muestras de interés biológico en la escala milimétrica o micrométrica.
10 La microscopia de fluorescencia pretende determinar la distribución de marcadores ópticos en muestras biológicas. Estos marcadores consisten en moléculas (endógenas o exógenas) o nano-partículas con la propiedad de que, cuando son excitados con luz con una cierta longitud de onda, emiten luz incoherente en otra (fluorescencia) gracias a procesos de absorción-emisión mono o
15 multifotónicos. Los marcadores exógenos son especialmente interesantes debido a que, una vez funcionalizados, sirven para señalar, a nivel molecular, procesos o estados en interior de los tejidos o las células. El conocimiento derivado puede ser fundamental tanto en investigación básica como aplicada en el desarrollo de nuevos fármacos para estudiar el tráfico, localización final y actividad en los tejidos de
20 moléculas o nano-partículas a diferentes escalas, desde la milimetrica a la micrométrica.
Los tejidos y las células son estructuras tridimensionales donde la localización espacial de determinados agentes es fundamental en numerosos procesos. Es interesante por lo tanto, contar con instrumentos que proporcionen información
25 tomográfica de la concentración de marcadores fluorescentes. Sin embargo, este tipo de instrumentación conlleva una mayor complejidad en comparación con los sistemas básicos de microscopía que proporcionan solamente imágenes planas de proyecciones o secciones.
El microscopio confocal (véase por ejemplo el documento US 3013467), ha
30 sido la herramienta tradicionalmente utilizada para resolver microestructuras tridimensionales. En este sistema, la información tomográfica se obtiene registrando diferentes imágenes de barrido correspondientes a diferentes posiciones axiales de un detector puntual en correspondencia con el foco del haz de excitación en el interior de la muestra, cuando el proceso de fluorescencia es lineal, o solo desplazando la posición del foco cuando se trata de procesos multifotónicos. En cualquier caso, la adquisición completa de un volumen de tejido es lenta comprometiendo el estudio de procesos de corta duración.
Alternativamente, se han propuesto técnicas basadas en la tomografía computerizada de rayos-x (empleada en imagen médica) tras ser adaptada al uso de luz en muestras en la escala micro y milimétrica (véase Kikuchi, S., K. Sonobe, et al. (1996), "Three-dimensional microscopic computed tomography based on generalized Radon transform for optical imaging systems", Opt. Comm. 123: 725-733; así como, Sharpe, J., U. Ahlgren, et al. (2002), "Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies", Science 296: 541-545 y también Fauver, M., E. J. Seibel, et al. (2005), "Three-dimensional imaging of single isolated cell nuclei using optical projection tomography", Opt. Express 13(11): 4210-4223).
En dichos sistemas, la reconstrucción se realiza mediante algoritmos matemáticos que procesan la información obtenida midiendo la intensidad de la luz que emana de la muestra para diferentes proyecciones rotando la muestra o el sistema de registro. Sin embargo, de la misma forma que en microscopía confocal, el instrumento debe realizar operaciones adicionales a las requeridas para el registro de imágenes bi-dimensiones que pueden llegar a ser muy complejas (especialmente en microscopía) e involucran un aumento del tiempo total de registro.
El sistema de iluminación y adquisición de datos para tomografía óptica que la invención propone, resuelve, de forma plenamente satisfactoria, la problemática anteriormente expuesta en los distintos aspectos comentados. En particular: simplifica el procedimiento de adquisición limitándolo al barrido de la muestra y, por tanto, el tiempo total de registro.
Para ello, la invención se basa en la utilización de un sistema convencional de barrido de un haz de luz especialmente construido para excitar la emisión de fluorescencia de marcadores a través de procesos mono o multifotónicos generando en el interior de la muestra, para cada posición transversal, una fuente de luz incoherente aproximadamente unidimensional con un patrón de emisión dependiente de la distribución axial de concentración de moléculas o partículas emisoras en cada punto.
Para conseguirlo, el haz de excitación se concentra en el interior de la muestra mediante componentes ópticos de manera tal que se transporte energía suficiente para la excitación sólo a un volumen en la muestra estructurado, de forma que quede restringido transversalmente y extendido axialmente, utilizando, entre otras posibilidades, un objetivo con una apertura anular, una lente cilíndrica o mediante la incorporación de un axicón para generar un haz de Bessel.
La luz que emana de la muestra, excitada de la forma anteriormente indicada, se filtra espectralmente para seleccionar la componente de fluorescencia que es analizada con el fin de obtener la información necesaria para encontrar la distribución que genera la emisión.
En particular, el procedimiento de análisis propuesto se basa en el modelado de la luz de fluorescencia como una superposición incoherente de ondas esféricas divergentes con una distribución de orígenes dependiente de la distribución tridimensional de emisores.
Tomando como base este modelo, se sigue el siguiente procedimiento: una vez filtrada, la luz de fluorescencia se hace pasar por un objetivo --cuya focal se sitúa en el espacio donde se emplaza la muestra-y posteriormente por una matriz de microlentes orientada perpendicular al eje axial. Este componente proporciona, gracias al uso de un sensor opto-electrónico acoplado, una imagen relacionada con la concentración de emisores en el volumen de excitación que, en virtud su particular estructura, está unívocamente relacionada con la concentración axial.
El proceso anterior se repite para diferentes coordenadas transversales procesándose cada imagen obtenida mediante un ordenador para obtener la distribución axial en cada punto. Una vez finalizado el barrido, se dispone de la información necesaria para componer una imagen tomográfica de la concentración de emisores en todo el volumen de la muestra.
De forma más concreta, la invención describe un procedimiento de iluminación y adquisición de datos en tomografía óptica de moléculas o partículas fluorescentes embebidas en muestras, que emiten luz de fluorescencia debido a procesos de excitación-emisión incoherente mono o multifotónicos. Las características principales del procedimiento son que:
se ilumina una muestra mediante el uso de una óptica que genera un volumen de excitación, alargado en la dirección axial y compacto en direcciones transversales;
se selecciona la luz de fluorescencia mediante un filtro y se conduce utilizando un sistema óptico para hacerla pasar finalmente a través de una matriz de microlentes acoplada a un sensor que sirve para registrar imágenes que son procesadas por un ordenador.
Así, el volumen de excitación se desplaza en el interior de la muestra barriendo diferentes coordenadas transversales (X, Y) mientras que permanece orientado paralelo al eje perpendicular (Z). La incorporación de esa capacidad en el haz de luz que genera el volumen de excitación y en la óptica de adquisición se consigue solo en el haz que genera el volumen de excitación, o bien a través del desplazamiento controlado transversal de la muestra.
La invención también describe un sistema de iluminación y adquisición de datos para tomografía óptica según dicho procedimiento, en el que se utiliza un volumen de excitación alargado.
En una configuración alternativa, se utiliza como sistema de excitación un haz alargado utilizando una apertura anular.
En otra configuración alternativa, se utiliza como sistema de excitación un haz alargado utilizando un prisma con simetría de rotación o axicón para generar un haz de Bessel.
En otra configuración alternativa, se utiliza un volumen de excitación alargado utilizando una lente cilíndrica.
En otra configuración alternativa, se utiliza una matriz de microlentes para analizar la estructura de la luz de fluorescencia con el fin de encontrar la distribución tridimensional de emisores que la genera.
En otra configuración alternativa, se utiliza un sensor de frente de onda para obtener información de la distribución tridimensional de emisores.
Para complementar la descripción que se realiza y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características de la invención, de acuerdo con un ejemplo preferente de realización práctica del mismo, se acompaña, como parte integrante de dicha descripción, un juego de dibujos en donde, con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo siguiente:
La figura 1 muestra de forma esquemática el principio general del instrumento que se propone.
La figura 2 representa el tipo de imágenes que pueden obtenerse para cada posición de barrido de la muestra y, de forma esquemática, el proceso de reconstrucción de la distribución de marcadores a partir de dichas imágenes.
A la vista de las figuras reseñadas puede observarse cómo el procedimiento de la invención se basa en la utilización de un sistema óptico para generar un volumen de excitación de forma aproximadamente cilíndrica y de un sistema optoelectrónico de análisis que incluye una matriz de micro lentes acoplada a un detector que genera una imagen que es finalmente procesada por un ordenador.
Primeramente, un sistema óptico de iluminación genera un volumen alargado en la dirección axial donde se genera suficiente energía como para excitar la muestra. La luz, producto de la excitación, se emite desde diferentes puntos del volumen. Aquella procedente de emisores emplazados en el plano focal de un sistema óptico de registro, presentará un frente de onda plano o de referencia una vez lo haya atravesado. La luz emitida desde otras posiciones presentará, después del sistema óptico de registro, cierta curvatura en correspondencia con su posición en el volumen iluminado. Además, un filtro elimina la componente de excitación dejando que solo la luz generada en la muestra mediante excitación llegue a una matriz de microlentes. Este componente, produce una imagen sobre un detector que dependerá de la distribución de curvaturas e intensidades de la luz.
Tal como se representa en la figura 1, se ilumina una muestra (M) situada en un soporte que permita su desplazamiento según los ejes X e y, con un haz estructurado de tal forma que solo exista intensidad significativa en un volumen (V) aproximadamente cilíndrico estrecho con eje mayor en la dirección Z. Como ejemplo, se muestran dos emisores puntuales (81) Y (82) situados en diferentes puntos respecto al plano focal (PF) de un sistema óptico (O). Por la forma de generación, la luz emitida por cada uno es mutuamente incoherente. La luz compuesta por las contribuciones de todos los emisores, se recoge con un objetivo o sistema óptico (O). Un filtro (F), selecciona solo la componente espectral correspondiente a la luz excitada. En un plano posterior, se sitúa una matriz de microlentes (MML) que produce una imagen sobre un sensor (8). Como ejemplo del funcionamiento, la fuente (81), situada en el plano (PF) genera sub-imágenes puntuales, entre otras, en las posiciones indicadas como (11) e (12). De forma diferente, la fuente (82) produce imágenes puntuales, entre otras, en las posiciones (13) e (12), pero no en (11). Dado que (81) Y (82) son emisores independientes en virtud del proceso físico de absorción-emisión de fotones, las imágenes formadas por la luz procedente de cada
5 uno se superpondrán linealmente sobre el sensor (8) para formar una única imagen que se envía a un ordenador.
La imagen registrada depende de la distribución axial de emisores. Para ilustrar el proceso de formación de imágenes en el sensor y de la reconstrucción tomográfica, en la figura 2, se ha representado una muestra (M) que contiene una
10 distribución simple embebida de marcadores. La imagen (IM1) se corresponde con el registro efectuado cuando se excita la muestra en un punto de coordenadas (X1 ,Y1) y la imagen (1M2) cuando se excita en el punto (X2,Y2). El ordenador utiliza un procedimiento minimización del error para ajustar la mejor distribución discreta de emisión en función del eje Z a la imagen, obteniendo, en el ejemplo, la distribución
15 (01) en un caso y (02) en el otro. Estas distribuciones sirven para asociar un valor de concentración de marcadores a cada voxel (elemento de volumen) de una distribución tridimensional (R) que ocupa el volumen de la muestra.
Claims (1)
- REIVINDICACIONES1ª.-Procedimiento de iluminación y adquisición de datos en tomografía óptica de moléculas o partículas fluorescentes embebidas en muestras, que emiten luz de 5 fluorescencia debido a procesos de excitación-emisión incoherente mono omultifotónicos, caracterizado por que,ilumina una muestra (M) mediante el uso de una óptica que genera un volumen(V) de excitación, alargado en la dirección axial (Z) y compacto en direcciones transversales sobre el plano (X, Y);10 se selecciona la luz de fluorescencia mediante un filtro (F) y se conduce utilizando un sistema óptico (O) para hacerla pasar finalmente a través de una matriz de microlentes (MML) acoplada a un sensor (S) que sirve para registrar imágenes que son procesadas por un ordenador;donde el volumen de excitación se desplaza en el interior de la muestra barriendo15 diferentes coordenadas transversales (X, Y) mientras que permanece orientado paralelo al eje (Z), de manera que la incorporación de esa capacidad en el haz de luz que genera el volumen de excitación y en la óptica de adquisición se consigue sólo en el haz que genera el volumen de excitación, o bien a través del desplazamiento controlado transversal de la muestra.20 2ª.-Sistema de iluminación y adquisición de datos para tomografía óptica que emplea el procedimiento de la reivindicación 1 ª, caracterizado por que se utiliza un volumen de excitación alargado.3ª.-Sistema de iluminación y adquisición de datos para tomografía óptica que emplea el procedimiento de la reivindicación 1 ª, caracterizado por que se utiliza como 25 sistema de excitación un haz alargado utilizando una apertura anular.4ª.-Sistema de iluminación y adquisición de datos para tomografía óptica que emplea el procedimiento de la reivindicación 1 ª, caracterizado por que se utiliza como sistema de excitación un haz alargado utilizando un prisma con simetría de rotación o axicón para generar un haz de Bessel.30 5ª.-Sistema de iluminación y adquisición de datos para tomografía óptica que emplea el procedimiento de la reivindicación 1 ª, caracterizado por que se utiliza un volumen (V) de excitación alargado utilizando una lente cilíndrica.6ª.-Sistema de iluminación y adquisición de datos para tomografía óptica que emplea el procedimiento de la reivindicación 1 ª, caracterizado por que se utiliza una matriz de microlentes para analizar la estructura de la luz de fluorescencia con el fin de encontrar la distribución tridimensional de emisores que la genera.5 7ª.-Sistema de iluminación y adquisición de datos para tomografía óptica que emplea el procedimiento de la reivindicación 1 ª, caracterizado por que se utiliza un sensor de frente de onda para obtener información de la distribución tridimensional de emisores.
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