ES2385212T3 - Pasta de endurecimiento in situ, su fabricación y uso - Google Patents

Abstract

Una pasta de endurecimiento in situ que comprende:(a) un plastificante, que es un líquido orgánico biocompatible soluble en agua o miscible en agua,(b) un polímero insoluble en agua, que es biocompatible, biodegradable, y/o biorreabsorbible y soluble en elplastificante,(e) una carga sólida insoluble en agua, que es insoluble en el plastificante,en el que la pasta, que es inyectable y estable en su envase, que es capaz de endurecerse in situ para formar unimplante sólido al entrar en contacto con el medio acuoso o fluido corporal,en la que dicho plastificante es polietilenglicol (PEG) 400, PEG 200, PEG 300, PEG 600, 1 ,3-butanodiol, aceite dericino, N-metil-2-pirrolidona, 2-pirrolidona, alcanoles de C2 a C6, propilenglicol, solcetal, acetona, acetato de metilo,acetato de etilo, lactato de etilo, metiletilcetona, dimetilformamida, dimetilsulfona, tetrahidrofurano, caprolactama,decilmetilsulfóxido, ácido oleico, carbonato de propileno, triacetina, N,N-dietil-m-toluamida;l-dodecilazacicloheptan-2-ona o mezclas de los mismos.

Description

Pasta de endurecimiento in situ, su fabricación y uso

Una pasta de endurecimiento in situ, que contiene un plastificante soluble en agua o miscible que es un disolvente orgánico, un material de carga insoluble en agua orgánico o inorgánico y un polímero insoluble en agua, se desarrolló como una formulación inyectable y moldeable estable que presenta (una vez endurecida in situ) propiedades de armazón. Además, la pasta se puede usar como un sistema de administración para un agente activo en el campo de la regeneración de tejidos.

La adición de una carga de construcción de poro soluble en agua como agente anti-formador de piel incrementa la formación de poros con tamaños de poro de diámetros suficientes para la infiltración celular.

La pasta de endurecimiento es suficientemente estable mecánicamente para usarse como matriz de sustitución de hueso y cartílago, así como para regeneración de ligamento, tensión o tratamiento de enfermedades periodontales. Todos los componentes son totalmente biocompatibles, preferentemente biorreabsorbibles y están certificados para su aplicación parenteral. La liberación sostenida de péptidos y proteínas se puede modular por la composición y el diseño del procedimiento.

La invención abarca una composición farmacéutica que comprende la pasta de la invención y se refiere al uso de dicha pasta para la preparación de una composición farmacéutica que se va a usar para el aumento óseo, para tratar defectos óseos, para tratar discopatía degenerativa y traumática, para tratar dehiscencia de hueso o para usarse para la elevación del suelo sinusal, y regeneración de ligamentos y tensión incluyendo reparación periodontal. Finalmente, la invención se refiere a un kit que comprende la pasta de la invención.

Antecedentes tecnológicos

En el campo de la tecnología medicinal ya se han evaluado muchos materiales diferentes y/o todavía están en proceso de ser mejorados adicionalmente para su uso como material de sustitución ósea (injerto óseo), debido al amplio abanico de requisitos que los materiales deben cumplir. Dependiendo de la indicación, un sustituto de injerto óseo ideal debe tener las siguientes propiedades, inicialmente moldeable y fácil de conformar y administrar, pero mecánicamente estable con el tiempo, similar al hueso endógeno para unir defectos óseos, llenar cavidades o para el aumento óseo, preferentemente, el material debe poder endurecerse in situ para que sea aplicable por aplicaciones invasivas mínimas. El material debe ser biocompatible, preferentemente biodegradable y biorreabsorbible y promover la adhesión y proliferación celular. Debe tener una porosidad interconectada para permitir el crecimiento celular hacia dentro permitiendo una unión con el tejido óseo circundante (osteoconductividad). Además, el material debe poder actuar como un vehículo para factores de crecimiento óseo (BMP) para la liberación controlada de estas proteínas para introducir la formación ósea (osteoinductivitad). Idealmente, la proteína dentro del material está protegida contra el lavado y la degradación proteolítica en el lugar de la implantación. Finalmente, el material debe ser de origen sintético para evitar infecciones y reacciones inmunológicas, debe estar disponible en el acceso y ser de calidad reproducible. Idealmente, los materiales sustitutos de hueso sintéticos deben ser claramente visibles en los exámenes radiográficos para analizar el proceso de curación y determinar la cantidad y masa de formación ósea nueva.

Sin embargo, hasta ahora no existe ningún material, que pueda cumplir todos estos requisitos de un material preferente.

Debido a la necesidad médica de injertos óseos artificiales y a la disponibilidad limitada de hueso autólogo, con frecuencia se usan diferentes materiales. Los más destacados son fosfatos de calcio y pOlímeros biorreabsorbibles del tipo PLGA.

Material basado en fosfatos de calcio

Diversos fosfatos de calcio tales como fosfato de tricalcio beta (Ca3(P04M (beta-TCP), fosfato de tricalcio alfa (alfa-TCP) e hidroxiapatita (Ca1o(P04)e(OH)2) (HA) han demostrado ser eficaces como materiales de sustitución ósea. El beta-TCP, por ejemplo, es adecuado tanto en diversos granulados como en piezas (bloques) para el tratamiento de defectos óseos. Los materiales de sustitución ósea que contienen fosfato de calcio se usan normalmente cuando ya no es posible la regeneración del hueso o es posible sólo con dificultad. Además, los materiales de sustitución ósea se usan cuando la formación de hueso adicional es un requisito previo para un curado posterior de un implante. Los fosfatos de calcio presentan un efecto osteoconductivo, es decir, representan una estructura inerte que facilita la migración de células del hueso vecino. La presencia de huesos o diferentes células mesenquimales, sin embargo, es una condición previa para la nueva formación de huesos.

La adición de astillas de hueso autólogo puede incrementar significativamente el efecto de los fosfatos de calcio. Estas astillas de hueso no son sólo osteoconductivas, sino también osteoinductivas, es decir, provocan la transformación de células madre mesenquimales no diferenciadas en osteoblastos y condriocitos. Por razones de seguridad, se prefieren las astillas de hueso autogénico a las preparaciones alogénicas o xenogénicas. El uso de huesos autogénicos, sin embargo, siempre implica un segundo procedimiento quirúrgico, lo que es incómodo para el paciente y está limitado en el acceso. Además, las biopsias de material de injerto óseo autólogo tienen varias desventajas, incluyendo dolor después de la cirugía y complicaciones en la recogida de injerto.

Además de los gránulos y bloques sólidos mencionados anteriormente, los cementos de fosfato de calcio (CPC) representan otro gran grupo de materiales basados en fosfato de calcio. Se administran por medio de inyección o rascador en el defecto óseo como una pasta moldeable, se pueden adaptar al lugar del defecto y volverse sólidos después un periodo de tiempo (Driessens et al., 2002).

Uno de los primeros CPC de autoendurecimiento consiste en fosfato de tetracalcio (TTCP) y fosfato de dicalcio anhidro (DCPA) (Chow et al., 2000). Estos componentes reaccionan en presencia de agua para formar hidroxiapatita como producto final de la reacción de curado de cemento. Las reacciones son endotérmicas o bien exotérmicas. Las reacciones exotérmicas generan suficiente calor para degenerar las proteínas osteogénicas, mientras que las reacciones de curado endotérmicas evitan el daño térmico al tejido circundante.

Debido a que la hidroxiapatita se forma en un entorno acuoso, es más similar a las apatitas biológicas que a la hidroxiapatita formada por procedimientos de temperatura alta. Como consecuencia, el CPC es osteoconductivo y se osteointegra fácilmente (Chemg et al., 1997).

Aunque el CPC parece tener varias ventajas sobre los biomateriales de fosfato de calcio usados actualmente, una limitación aparente es su tiempo de endurecimiento relativamente largo junto con el efecto de lavado explicado a continuación (Chemg et al., 1997). En los últimos años, se ha desarrollado un CPC adicional que contiene fosfato de tricalcio alfa (alfa-TCP) y carbonato de calcio (CaCOa), monofosfato de calcio (MCPA), monofosfato de calcio monohidratado (MCPM), fosfato de dicalcio di hidratado (DCPD) o DCPA y Ca(OH)2 (Takagi et al., 2003). Sin embargo, la mayoría del CPC comercialmente disponible desarrollado en los últimos años tiene alfa-TCP como reactivo principal con diferentes tamaños de partícula de la fase en polvo inicial. Los productos comercialmente disponibles incluyen Biobon® (a-BSM), Biocement O y H, Biofill®, Bonesource®, Calcibon®, Cementek®, Mimics BiopeX® y Norian® SRS® (Driessens et al.,2002).

Alfa-BSM (ETEX Corporation, Cambridge, MA) está compuesto principalmente de dos fosfatos de calcio, el primero un fosfato de calcio amorfo (ACP) con una proporción Ca/P de 1 ,54, el segundo un fosfato de dicalcio deshidratado (DCPD o brushita). El material es un sustituto de hueso inyectable que se endurece a la temperatura corporal (37 oC) aproximadamente en 20 minutos después de mezclarse con agua o una solución salina, formando una fase de hidroxiapatita poco cristalina.

Otra pasta de CPC es Norian® SRS® (Sistema de reparación de esqueleto), que es un cemento de apatita carbonada de endurecimiento rápido, inyectable usado para llenar defectos en áreas de hueso esponjoso comprometido durante la restauración o el aumento del esqueleto. Norian SRS se endurece para formar dahlita, que reproduce de forma precisa la fase mineral del hueso y se remodela gradualmente al hueso en el cuerpo por medio de resorción osteoclástica y formación de hueso nuevo. Es necesario premezclar este CPC en un aparato aprobado especial antes de su aplicación.

La mayoría de estas formulaciones de CPC disponibles están compuestas de dos componentes que reaccionan y se endurecen cuando se mezclan (Seeherman et al. 2002). Los componentes en polvo se mezclan con una solución acuosa, incluyendo algunos un acelerador o promotor (por ejemplo, hidrógenofosfato de disodio, Na2HP04) inmediatamente antes de su aplicación. Este procedimiento de premezcla produce desviaciones en la calidad del producto final, dependiendo del manejo antes de su uso, por ejemplo, suspensión no homogénea. Por lo tanto, este procedimiento de premezcla puede conducir a una disminución en la estabilidad mecánica del implante y, por lo tanto, a dificultades respecto a la reproducibilidad.

Otra limitación de esta formulación es que si el polvo se mezcla con el componente acuoso, la mezcla comienza a solidificar, por lo tanto, el periodo de tiempo en el que se puede administrar el cemento se limita sólo a unos pocos minutos. En el ámbito clínico, el cirujano tiene que mezclar el cemento correctamente y después colocar la pasta de cemento en el defecto dentro del tiempo establecido, lo que es un factor esencial para lograr resultados óptimos.

Una pasta de CPC premezclada, que sea estable en la jeringuilla y se endurezca sólo después de exponerse al agua, contiene polvos de TTCP más DCPA y glicerol como líquido de cemento. Sin embargo, la pasta de CPC-glicerol no tuvo una buena resistencia de lavado cuando se aplicó a un campo abierto húmedo (Takagi et al., 2003).

Este efecto de lavado surge cuando la pasta de CPC entra en contacto con fluidos fisiológicos o cuando se produce una hemorragia debido a su dificultad en algunos casos para lograr la hemostasis. También se ha observado que a menudo estas pastas se desintegran parcial o completamente o presentan un comportamiento no homogéneo tan pronto como entran en contacto con fluidos corporales u otras soluciones acuosas (documento US 6.206.957 y referencias citadas en el mismo). Además, estas pastas se separan fácilmente durante la extrusión desde las jeringuillas, expulsándose la parte más líquida de la jeringuilla, mientras que las partes más sólidas permanecen en la jeringuilla y no se pueden retirar de ella, incluso por medio de mayor presión. Como resultado de una separación, se puede obtener así un material, que ya no es adecuado para el propósito previsto.

Se han realizado varios intentos en el pasado para mejorar las caracteristicas del CPC. Chemg et al. añadieron hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), carboximetilcelulosa (CMC), y quitosano a los líquidos de cemento (Cherng et al.,

1997) para mejorar las propiedades de manejo de CPC con ello. Sin embargo, se retrasó el tiempo de endurecimiento por la adición de HPMC y CMC, y se debilitó la resistencia mecánica por la adición de lactato de quitosano o bien de acetato de quitosano. Se han realizado otros intentos para mejorar la inyectabllidad de CCP mediante, por ejemplo, por un incremento de la proporción de líquido con respecto a polvo, la adición de iones citrato y la adición de fármacos poliméricos al componente líquido (Bohner y Baroud, 2004). Sin embargo, ninguna de estas mejoras dio como resultado una pasta de CPC premezclada estable.

Otro problema importante del CPC es que presentan microporos sólo con tamaños de poro de submicrómetros a unos micrómetros. Los estudios previos con implantes de hidroxiapatita han mostrado que se requiere un tamaño de poro de aproximadamente 100 IJm a varios cientos de IJm (macroporos) para el crecimiento óseo hacia dentro (del Real et al., 2002). Se ha demostrado que los macroporos con beneficiosos para facilitar la infiltración celular y el crecimiento tisular hacia dentro. Sin embargo, la macroporosidad siempre da lugar a una disminución significativa en la resistencia mecánica (Chow, 2000).

Otros grupos han intentado mejorar el comportamiento de resorción del CPC, por ejemplo, incrementando la porosidad del material (del Real et al., 2002). Los experimentos más amplios se han realizado mezclando el CPC con cristales de las dimensiones correctas de compuestos altamente solubles y no tóxicos, tales como manitol o sacarosa. La desventaja es que la porosidad no se puede crear durante el endurecimiento del cemento en el entomo in vivo. La adición de sacarosa o manitol requiere la disolución de estos componentes después de la aplicación y el endurecimiento del cemento en el defecto óseo, para conseguir la macroporosidad. Otro procedimiento consiste en añadir NaHC03 al polvo de cemento de partida y usar dos líquidos diferentes para crear macroporos (del Real et al.,

2002).

Se ha intentado un incremento en la resistencia del CPC mientras se forman los macroporos usando, por ejemplo, cristales de manitol o fibras de aramida (Xu et al., 2001). También se demostró que la incorporación de qultosano, un bipolímero natural, incrementa la resistencia del CPC, sin embargo, no se construyeron macroporos en el CPC que contenía quitosano (Takagi et al., 2003; Xu et al., 2002).

En general, el CPC sufre de una estabilidad mecánica relativamente baja (por ejemplo, resistencia a la compresión, fragilidad) y de la falta de macroporosidad, por ejemplo, osteoconductividad, limitando su aplicabilidad en ortopedia sólo a las aplicaciones que no soporten carga. Las diferentes reacciones de cemento provocan que la hidroxiapatita forme estados variables de cristalinidad lo que da como resultado un tiempo de resorción alterado. Debido a la falta de macroporosidad y, por lo tanto, osteoconductividad, muchas de las formulaciones de cemento son portadores malos para los factores de crecimiento osteogénico.

Se han realizado otros intentos para mejorar el CPC añadiendo micropartículas de polímeros biodegradables (por ejemplo, poli(ácido DL-Iáctido-co-glicólico, PLGA) como vehículos de liberación para moléculas bioactivas (Ruhe et al., 2003). Se añadieron micropartículas de PLGA de proteína al pOlvo de CPC y se usó una solución acuosa de Na2HP04 como líquido, que se añadió a la composición poco antes de su aplicación.

En general, se acepta que el CPC necesita otras mejoras para ampliar sus aplicaciones clínicas potenciales. Sin embargo, otra mejora en las propiedades del material debe tener en cuenta el modo en el que los cirujanos aplican los cementos óseos a través de técnicas de cirugía invasiva mínima (MIST citadas en Bohner, 2001). En este sentido, se debe considerar otra mejora del material una mejora en el compromiso entre lo que se considera, para una aplicación clínica determinada, la inyectabilidad de cemento óptima, el comportamiento de curado rápido, la macroporosidad y la resistencia mecánica.

Recientemente, estos sistemas de CPC se vuelven interesantes, especialmente en combinación con proteínas morfogenéticas óseas (Seeherman et al., 2003).

Material basado en PLGA sintético

Otro tipo biomaterial importante, que desempeña un papel predominante en el campo de la ingeniería de tejido óseo, son los polímeros biorreabsorbibles (Vert, 1989). En especial, el tipo de compuestos de poli(hidroxiácidos) tiene perspectivas de aplicación interesantes debido a su biodegradabilidad intrínseca. Estos materiales, de los que poli(ácido glicólico) (PGA) y poli(ácido láctico) (PLA) son los más destacados, se someten a una escisión de cadena hidrolítica (degradación) en un entorno húmedo. La degradación sostenida conduce finalmente a las unidades de hidroxiácido correspondientes. La mayoría de estos productos finales hidrolíticos se producen como metabolitos de muchas bacterias y fenotipos celulares.

El potencial de degradación y sus propiedades mecánicas ofrecen aplicaciones para el uso como sustratos para implantes temporales en la tecnología médica. Los estudios realizados para determinados polímeros en diferentes tejidos documentan la biocompatibilidad de estos compuestos in vivo formando las bases para el desarrollo de implantes comerciales como dispositivos médicos (Middleton et al., 2000).

En cirugía clínica, los poliésteres presumiblemente desempeñan el papel más importante en relación con la fijación, el aumento y la sustitución de hueso. Los dispositivos como tornillos, placas, anclajes o clavijas sirven para el posicionamiento y la fijaciÓn de los fragmentos óseos después de pérdida o daño óseo. La principal característica de estos polímeros absorbibles en aplicación es la carencia de la necesidad de una operación para su retirada. Otro punto importante es en favor de los dispositivos de fijación polimérica: la integración mecánica del implante en el tejido óseo.

Un importante inconveniente en los implantes basados totalmente en poliéster es la posible acumulación de productos de degradación que alcanzan niveles citotóxlcos y la acidificación acompañante en el lugar del implante debido al pH que disminuye la liberación monómeros ácidos, en especial cuando se usan implantes no porosos sólidos y la degradación procede de acuerdo con un mecanismo de degradación de masa (U et al., 1990).

Para evitar estas consecuencias negativas provocadas por la disminución de pH local, el implante debe presentar porosidad, por ejemplo, por el procedimiento de lixiviación de sal para evitar la degradación en masa y por lo tanto, una acumulación de monómeros de ácido y para reducir la cantidad neta del polímero. Además, se ha sugerido incorporar sales básicas dentro de implantes de PLAlPGA (Agrawal et al., 1997). Otras enfoques emplean materiales cerámicos básicos como fosfatos de calcio como cargas para poliésteres para equilibrar el valor de pH local e incrementar la estabilidad mecánica (Schiller et al., 2003). También se han producido compuestos de hidroxlapatita y PLAlPLGA (poliláctido-co-glicólido) (Durucan et al., 2000). El procesado de estos compuestos requiere tratamiento térmico y el uso de soluciones de cloroformo del componente polimérico (Ignjatovic et al., 1999). Como alternativa se pueden usar polímeros con mayor estabilidad hidrolítica como poli(ácido hidroxibutírico).

Para el uso de estos polímeros como sustitutos óseos, la estrategia común es la de diseñar un implante, que cumpla temporalmente la función para permitir un proceso de curación y para conservar la resistencia durante las primeras fases en el lugar de implantación después de la operación. Después, la pérdida de resistencia y el módulo del implante deben estar en armonfa con la creciente resistencia del tejido dañado (Tormala et al., 1995). La degradación que se produce crea un espacio para procesos de restablecimiento para llenar el hueco con crecimiento hacia dentro de tejido huésped vital. Actualmente, no está disponible ningún material que se ajuste a estos requisitos de forma satisfactoria para formar hueso homogéneo nuevo en defectos grandes (Rueger et al., 1996).

Biomateriales y proteínas osteolnductivas

Para lograr un efecto osteoinductivo, una altemativa al uso de huesos autogénicos es el uso de factores de crecimiento y diferenciación óseos específicos, tales como GDF-5 o diferentes proteínas morfogenéticas óseas (BMP). Numerosos estudios en animales muestran claramente que este efecto osteoinductivo se puede incrementar en gran medida si estos factores de proteínas se combinan con un portador que decelere la liberación de proteínas y, por lo tanto, incremente el tiempo de residencia eficaz de la proteína en el lugar del defecto y finalmente acelere la curación ósea en comparación con tampones de formulación líquida (SeeherlTlan et al., 2003). En la literatura, se describen como portadores fosfatos de calcio, colágeno, colágeno mineralizado (colágeno que contiene fosfato de calcio) y polímeros biorreabsorbibles, hidroxiapatita y beta-TCP (Hotz et al., 1994), apatita hidroxílica de extractos de algas (Gao et al., 1996), extractos óseos (Gombotz et al., 1996), colágeno (Friess et al., 1999) y poli(alfa-hidroxi)ácidos (Hollinger et al., 1996).

Los análisis de la potencia de los portadores recubiertos, que se describen en la literatura, no presentan una idea uniforme pero muestran variaciones significativas, que son una consecuencia del tipo de portador seleccionado o bien del procedimiento de recubrimiento (Terheyden et al., 1997). Se describen diversos procedimientos.

En el documento WO 98/21972, disolviendo en primer lugar GDF-5 en un disolvente orgánico y precipitándolo después añadiendo agua, se logra el recubrimiento por precipitación rápida de GDF-5 sobre beta-TCP. Debido a la toxicidad de muchos disolventes, sin embargo, no se prefiere dicho proceso para la producción de composiciones farmacéuticas. Und et al. (1996) llevan a cabo el recubrimiento de diversos productos cerámicos de fosfato de calcio en presencia de gelatina (obtenida normalmente a partir de huesos bovinos o porcinos) como proteína de protección. Debido al incremento del riesgo de infección y a reacciones inmunogénicas, sin embargo, debe evitarse el uso de sustancias de origen animal para la producción de composiciones farmacéuticas y medicamentos. Friess et al. (1999) y Gao et al. (1996) describen el recubrimiento de colágenos con BMP-2. Debido a la baja resistencia a la compresión de los colágenos, estos portadores, sin embargo, no son adecuados para muchas indicaciones. Esto se aplica en particular a las indicaciones con las que el hueso recién formado tiene que soportar una carga de presión posterior. Además, las calidades farmacéuticas del colágeno están disponibles hasta ahora sólo de fuentes de origen animal. Finalmente, de acuerdo con la rápida tasa de degradación y la liberación de los factores de crecimiento en los productos del estado de la técnica (por ejemplo, rhBMP-2 y esponja de colágeno) el contenido en sustancia de fármaco a menudo está sensiblemente por encima del nivel fisiológico en el tejido óseo.

Ventajosamente, tal como se describe en el documento WO 03/043673, se ha encontrado por los presentes inventores que las propiedades osteoinductivas mejoradas y fiables in vivo después de la implantación en un sujeto, preferentemente un ser humano, se logran en un dispositivo, en el que se puede realizar una distribución homogénea del portador de compuesto, tal como beta-TCP u otros fosfatos de calcio, con proteína osteoinductiva sin agregados, biológicamente activa. Dicha agregación provoca la microprecipitación, que es el motivo por el que una distribución no homogénea da como resultado al menos una disminución significativa en las propiedades osteoinductivas, tal como se describe para otros dispositivos en la técnica anterior, por ejemplo, en el documento W098/21972. Además, se ha encontrado que los efectos secundarios no deseados, tales como la inflamación y reacciones tóxicas del sujeto después del implante, se pueden evitar por el dispositivo del documento WO 03/043673, que está libre de impurezas tóxicas o contaminantes infecciosos. En particular, el uso de proteínas protectoras (tales como, por ejemplo, gelatina) como mediador de la solubilidad es totalmente innecesario para el dispositivo del documento WO 03/043673. Sin embargo, estos dispositivos no son adecuados para aplicaciones que requieren una liberación retardada del agente activo.

En el campo del aumento óseo, en especial se requieren sistemas de liberación retardada, en vista de la corta semivida de las proteínas o los péptidos en el cuerpo humano con respecto a la inducción ósea, debido a la dispersión del lugar del implante o bien a través de la degradación. En los primeros intentos de lograr una liberación retardada de proteínas morfogénicas óseas, se han dado a conocer dispositivos, en los que se han combinado estas proteínas con polímeros biorreabsorbibles. Hollinger et al. (1996) publicaron el uso de poli(alfa-hidroxiácidos) como portadores para BMP-2. En combinación con proteínas o péptidos osteogénicos, estos polímeros son de especial interés con relación a lograr una liberación controlada del agente activo. Wang et al. (2000) dan a conocer un procedimiento de secado por congelación de emulsión que se inicia con una solución de PLA en cloruro de metileno para la fabricación de un armazón biodegradable y que puede incorporar y liberar macromoléculas bioactivas para la regeneración ósea. Schmidmaier et al. (2000) da a conocer el uso de una solución en cloroformo de PLA junto con los factores osteoinductivos IGF-I y TGF-beta1 en los implantes de recubrimiento.

El documento WO 021070029 da a conocer una matriz de beta-TCP porosa que se mezcla opcionalmente con microesferas de PLGA encapsuladas con OP-1 (proteína osteogénica 1, una proteína morfogénica ósea) para formar un material heterogéneo. En contraste con el documento WO 03/043673, la matriz de beta-TCP en el documento W002l070029 muestra vados separados individuales en lugar de poros interconectados. Los poros de esta matriz no se pueden equipar con un recubrimiento homogéneo del polímero y/o componente de agente activo. Las microesferas se producen por Alkmeres, Inc y muestran un diámetro de 20 a 500 ~m, que permite la microagregación del agente activo encapsulado. Para la producción de estas microesferas, las soluciones de cloruro de metileno del componente polimérico junto con la proteína se pulverizan y se congelan en etanol muy frío (Herbert et al., 1998 y véase, por ejemplo, la solicitud de patente de los EE. UU. N.O 6.726.860), ambas etapas en combinación con dos disolventes orgánicos diferentes que imparten tensión química y mecánica a la proteína.

Sistemas de administración basados en polímeros blodegradables fluidos

La colocación de dispositivos médicos, tales como implantes y otros artículos sólidos en un cuerpo implica frecuentemente una intervención quirúrgica. Para algunas aplicaciones, por ejemplo, administración de fármaco o mínimamente invasiva, sin embargo, se ha descrito que los sistemas de administración basados en polímeros biodegradables se pueden introducir en un cuerpo como formulaciones fluidas similares a cementos de fosfato de calcio (véase, por ejemplo, los documentos EP0436667, EP0537559, EP0539751, E P0754032 , EP0862416, EP1126822, EP1147781, EP1404294, US 6.461.631, US 5.780.044 y US 5.278.202, como así como homólogos extranjeros, asignados a Atrix Laboratories, Inc.).

En contraste con el CPC también fluido, en el que la proteína está dentro o sobre el portador en contacto directo con el medio circundante, una proteína dentro de un portador que contiene el polímero (por ejemplo, poli(alfa-hidroxiácidos) se puede proteger y/o estabilizar. Además, la proteína o péptido se libera sólo por difusión del cemento de fosfato de calcio, mientras que la proteína o péptido dentro de la matriz polimérica se libera con el incremento de la degradación del polímero y/o por difusión de la matriz polimérica. Por lo tanto, la cinética de la liberación se puede ajustar más fácilmente que en el caso del cemento de fosfato de calcio puro.

Estas composiciones comprenden un polímero biodegradable insoluble en agua en un disolvente orgánico miscible en agua biocompatible para formar un implante sólido biodegradable in situ dentro del cuerpo por exposición a fluidos corporales o fluido acuoso y se administran como líquidos usando una jeringuilla para formar una matriz sólida in situ por disipación o dispersión del disolvente orgánico dentro del cuerpo. Durante el contacto con agua, se forma un armazón con una estructura de núcleo interno altamente porosa rodeada por una superficie casi no porosa.

Esta superficie no porosa inhibe la migración celular dentro del núcleo interno, por lo tanto, este material muestra propiedades no osteoconductivas. Estos implantes se usan como dispositivos protésicos y/o sistemas de administración controlada para agentes activos biológicos.

Otro inconveniente de este tipo de material es el tiempo de endurecimiento prolongado hasta que el material muestra una estabilidad mecánica suficiente. Sin embargo, la degradación in vivo posterior del polímero provoca problemas similares, como se describe anteriormente para armazones basados en polímeros convencionales. Presentan degradación, lo que conduce a una pérdida en las propiedades mecánicas, y una disminución del pH local hasta un nivel citotóxico. Como consecuencia, esto puede producir a una respuesta de cuerpo extraño inflamatoria.

El documento US 2004034434 (A 1) da a conocer un material implantable para su implementación en ubicaciones seleccionadas o se da a conocer tejido seleccionado para regeneración tisular. El implante comprende colágeno, productos cerámicos, y u otros materiales o aditivos biorreabsorbibles, en los que el implante también se puede usar para la administración de tratamiento.

El documento WO 2004073563 (A2) forma técnica anterior en virtud del Artículo 54 (3) EPC y da a conocer un dispositivo ortopédico para implantarse entre vértebras adyacentes que comprende un balón arqueado y un material endurecible dentro de dicho balón.

Además, no poseen las mismas propiedades bioactivas ni osteoconductivas de los sistemas de fosfato de calcio descritos anteriormente.

Por lo tanto, existe la necesidad de obtener una composición inyectable y biocompatible y biodegradable mejorada, que proporcione in vivo un armazón poroso interconectivo para infiltración y migración celular con un comportamiento de endurecimiento acelerado para sustituir el biomaterial por estructuras óseas mientras se reduce la carga (contenido de polímero) para el organismo.

Otro objeto que subyace en la presente invención es el de tener una pasta de endurecimiento in situ premezclada con una resistencia al lavado buena que sea estable en su envase que sólo se endurezca después de colocarse en el defecto con tiempo suficiente para ajustar la forma del material al tamaño del defecto, si fuera necesario.

Otro objeto de la presente invención es la provisión de una pasta de endurecimiento in situ adecuada para su implantación en un sujeto que necesita un aumento óseo por una composición que puede formar un armazón macroporoso por toda la superficie y el interior del armazón después de colocarse en el defecto.

Otro objeto que subyace en la presente invención es la provisión de una pasta de endurecimiento in situ adecuada para su implantación en un sujeto que necesita un aumento óseo con una resistencia mecánica suficiente ylo que evite los problemas asociados con una disminución del pH local inducida por la degradación de polímero.

Otro objeto que subyace en la presente invención es la provisión de una pasta de endurecimiento in situ adecuada para su implantación en un sujeto que necesita un aumento óseo por inyección, moldeo, carga o presión. La pasta in situ con un agente activo permitirá la liberación retardada de un agente activo unido a la matriz, preferentemente con una actividad local optimizada de dicho agente activo.

Otro objeto que subyace en la presente invención es la provisión de una pasta de endurecimiento in situ adecuada para su implantación en un sujeto que necesita un aumento óseo por inyección permitiendo una liberación retardada de un agente activo unido y evitando los problemas asociados con una disminución del pH local inducida por la degradación de polímero.

Otro objeto que subyace en la presente invención es la provisión de una pasta de endurecimiento in situ adecuada para su implantación en un sujeto que necesita un aumento óseo por inyección permitiendo una liberación retardada de un agente activo unido y evitando efectos secundarios tóxicos ylo respuestas inflamatorias.

Otro objeto que subyace en la presente invención es la provisión de una pasta de endurecimiento in situ adecuada para su implantación en un sujeto que necesita un aumento óseo por inyección permitiendo una liberación retardada de un agente activo unido y evitando dosis menores del agente activo en comparación con dispositivos convencionales.

Otro objeto que subyace en la presente invención es la provisión de una pasta de endurecimiento in situ adecuada para su implantación en un sujeto que necesita hueso permitiendo una liberación retardada de un agente activo unido por inyección, pasta que puede formar un armazón mecánicamente estable y poroso para llenar defectos de hueso y cartílago.

Otro objeto que subyace en la presente invención es la provisión de una pasta de endurecimiento in situ adecuada para su implantación en un sujeto que necesita hueso permitiendo una liberación retardada de un agente activo unido por inyección, pasta que se endurece bajo condiciones fisiológicas y que puede sustituir a dispositivos convencionales implantados por medio de cirugía.

Sumario de la invención

Sorprendentemente, los presentes inventores fueron capaces de proporcionar una pasta de endurecimiento in situ que resuelve estos objetos y los procedimientos correspondientes para la producción de dicha pasta.

Con ello, los presentes inventores proporcionan una pasta de endurecimiento in situ de la realización (1) que comprende un plastificante, un polímero insoluble en agua y una carga sólida insoluble en agua. pasta que es una pasta premezclada estable que se endurece después del contacto con un líquido acuoso, tal como agua, una solución fisiológica, medio de cultivo celular (por ejemplo, FCS) o fluido corporal y muestra una resistencia mecánica y una resistencia al lavado mejoradas en el lugar del implante, incluso si se implanta en un campo abierto húmedo, mientras que reduce la carga del contenido en polímero alto para el organismo, tal como seres humanos o animales. Además, los inventores proporcionan una pasta de endurecimiento in situ que comprende un plastificante, un polrmero insoluble en agua, una carga sólida insoluble en agua y una carga de construcción de poro soluble en agua con macroporosidad mejorada.

La resistencia mecánica alta como así como la porosidad, preferentemente macroporosidad con tamaño de poro de aproximadamente 1 00 ~m y más y la formación de un armazón poroso de interconexión suficiente para el crecimiento hacia dentro de células vivas, apoya la formación de hueso nuevo en el vacío llenado con la composición.

Las realizaciones de la invención son:

(1) Una pasta de endurecimiento in situ que comprende:

(a)

un plastificante, que es un líquido orgánico biocompatible soluble en agua o miscible en agua,

(b)

un polímero insoluble en agua, que es biocompatible, biodegradable, y/o biorreabsorbible y soluble en el plastificante,

(e)

una carga sólida insoluble en agua, que es Insoluble en el plastificante,

en el que la pasta, que es inyectable y estable en su envase, que es capaz de endurecerse in situ para formar un implante sólido al entrar en contacto con el medio acuoso o fluido corporal,

en el que el plastificante es como se define en (1 a).

(2)

La pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con (1), que comprende además una cantidad eficaz de una carga de construcción de poro soluble en agua.

(3)

La pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con cualquiera de (1) o (2), en la que el implante tiene poros de interconexión con un diámetro de igualo más de 100 11m.

(4)

La pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con cualquiera de (1) a (3), que comprende además un agente activo.

(5)

La pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con cualquiera de (1) a (4), que comprende un agente activo recubierto sobre una carga sólida insoluble en agua o disuelto o suspendido en el plastificante, preferentemente homogéneo recubierto sobre una carga sólida insoluble en agua.

(6)

La pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con cualquiera de (1) a (5), en la que la carga sólida insoluble en agua es

(a)

un compuesto inorgánico,

(b)

un compuesto orgánico.

En una realización preferida (6a) dicho compuesto inorgánico es óxido de magnesio; hidróxido de magnesio, carbonato de magnesio, o dióxido de silicio.

De forma alternativa (6b) dicho compuesto inorgánico es un compuesto de calcio, preferentemente sulfato de calcio o carbonato de calcio, más preferentemente fosfato de calcio; y lo más preferentemente fosfato de tricalcio, fosfato de tricalcio beta, fosfato de tricalcio alfa, apatita, cemento que contiene fosfato de calcio o fosfato de tetracalcio.

En una realización adicional (6c) dicho compuesto orgánico es quitosano, colágeno, alginato de calcio, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), ácido hialurónico o derivados del mismo, celulosa o derivados del mismo, o almidón o derivados del mismo.

También se abarcan (6d) combinaciones de uno o más compuestos de (6a), (6b) y (6c).

(7)

La pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con (6), en la que dicho compuesto inorgánico es fosfato de tricalcio alfa que tiene un tamaño de partícula que es igualo superior a 300 ¡.1m.

(8)

La pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con cualquiera de (1) a (7), con al menos una carga sólida insoluble en agua que contiene calcio adicional, preferentemente seleccionada del grupo de carbonato de calcio, hidrógenofosfato de calcio o hidroxlapatita.

(9)

La pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con cualquiera de (1) a (8), en la que la proporción (es decir, proporción en peso) de la carga sólida insoluble en agua y el polímero insoluble en agua es de entre 1: 1 y 5:1, preferentemente entre 1: 1 y 3:1 más preferentemente de aproximadamente 1,5:1 como en una mezcla que contiene menos de un 50 % en peso, preferentemente de un 30 a un 36 % en peso de carga sólida insoluble en agua y menos de un 40 % en peso, preferentemente de un 20 -25 % en peso de polímero insoluble en agua.

(10)

La pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con cualquiera de (1) a (9), en la que dicho polímero insoluble en agua es poli(alfa-hidroxiácidos), poli(orto-ésteres), poli(anhídridos), poli(aminoácidos), poli(ácido glicólido) (PGA), poli(ácido láctico) (PLLA), poli(ácido (D,L)-Iáctico) (PDLLA), poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), copolímeros de poli(ácido láctico-co-glicólico)-polietilenglicol (PLGA-PEG), poli(ácido 3-hidroxibutírico) (P(3-HB», poli (ácido 3-hidroxi-valérico) P(3-HV), poli(p-dioxanona) (PDS), poli(épsilon-caprolactona) (PCL), polianhídrido (PA) poliortoéster, polietileno (PE), polipropileno (PP), poli(tereftalato de etileno) (PET), poliglactina, poliamida (PA), poli(metacrilato de metilo) (PMMA), poli(metacrilato de hidroximetilo) (PHEMA), poli(cloruro de vinilo) (PVC), poli(alcohol vinílico) (PVA), politetrafluoretileno (PTFE), polieteretercetona (PEEK), polisulfona

(PSU), polivinilpirrolidona, poliuretano, polisiloxano, o copolímeros, terpolímeros, copollmeros de bloque, combinaciones, mezclas de los mismos. Estos polímeros son biocompatibles.

(11)

La pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con cualquiera de (1) a (10), en la que el pOllmero insoluble en agua es PLGA.

(12)

La pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con (11), en la que el polímero insoluble en agua es un polímero con un casquete en el extremo.

(13)

La pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con cualquiera de (1) a (12), en la que el contenido en polímero insoluble en agua de la composición es igualo menor de un 40 % en peso.

(14)

La pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con cualquiera de (1) a (13), en la que la densidad de la composición de pasta es igualo mayor de 1,21 g/mi, preferentemente entre 1,3 g/mi y 1,5 g/mI.

(1 a) La pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con (1), en la que dicho plastificante es polietilenglicol (PEG) 400, PEG 200, PEG 300, PEG 600, 1 ,3-butanodiol, aceite de ricino, N-metil-2-pirrolidona, 2-pirrolidona, alcanoles de C2 a C6, propilenglicol, solcetal, acetona, acetato de metilo, acetato de etilo, lactato de etilo, metiletilcetona, dimetilformamida, dimetilsulfona, tetrahidrofurano, caprolactama, decilmetilsulfóxido, ácido oleico, carbonato de propileno, triacetina, N,N-dietil-m-toluamida; l-dodecilazacicloheptan-2-ona o mezclas de los mismos.

(15)

Una pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con cualquiera de (1) a (14), en la que el contenido en plastificante es de un 40 -95 % en peso, preferentemente de un 40 -55 % en peso.

(16)

La pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con cualquiera de (1) a (15), en la que dicha carga de construcción de poro sólida soluble en agua comprende uno o más de un

(a)

agente de hinchamiento, preferentemente derivados de celulosa;

(b)

tensioactivo, preferentemente copolímeros de bloque de óxido de etileno y óxido de propileno, tales como PluronicS® o Tween® 80; o

(e)

agente porogénico tal como trehalosa, manitol, sacarosa, sorbitol, aminoácidos fisiolágicos, por ejemplo, glicina, glutamina, arginina, citrato de sodio, succinato de sodio y fosfatos de sodio, cloruro de sodio, polivinilpirrolidona (PVP), PEG sólidos tales como PEG 4000, PEG 10000, hidrágenocarbonato de sodio, sulfato de calcio o quitosano; o

(d)

gas o agente formador de gas, tal como carbonato de calcio o hidrógenocarbonato de sodio.

(17)

La pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con (16), en la que la carga de construcción de poro sólida soluble en agua es sal de carboximetilceiulosa, preferentemente una sal sódica de carboximetilcelulosa.

(18)

La pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con cualquiera de (16) y (17), en la que el contenido en carga de construcción de poro sólida soluble en agua de la composición es menor de un 10 % en peso, preferentemente menor de un 5 % en peso, más preferentemente menor de un 2,5 % en peso, lo más preferentemente igualo menor de un 1 % en peso.

(19)

La pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con cualquiera de (16) a (18), en la que la carga de construcción de poro sólida soluble en agua tiene un tamaño de partícula de menos de 1000, preferentemente entre 25 a 1000 IJm, preferentemente de 50 a 500 IJm, lo más preferentemente de 100 a 300 IJm.

(20)

La pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con cualquiera de (1) a (19), que comprende:

(a)

PEG 400

(b)

PLGA

(c)

fosfato de calcio seleccionado del grupo de cemento que contiene fosfato de calcio, carbonato de calcio, hidroxiapatita, hidrágenofosfato de calcio y fosfato de tricalcio alfa o una mezcla de los mismos; y

(d)

agente de hinchamiento, preferentemente una sal sódica de carboximetilcelulosa.

(21)

La pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con cualquiera de (1) a (20), que comprende:

(a)

PEG 400: de un 40 a un 50 % en peso, preferentemente de un 40 a un 45 %;

(b)

PLGA: de un 20 a un 25 % en peso, preferentemente de un 22 a un 25 %;

(c)fosfato de calcio seleccionado dei grupo de cemento que contiene fosfato de calcio y fosfato de tricalcio alfa: de un 25 a un 40 % en peso, preferentemente de un 30 a un 35 %; Y

(d) sal sódica de carboximetilcelulosa: igualo menor de un 10 % en peso. Preferentemente igual a o menor de un 5 % en peso, más preferentemente menor de un 2,5 % en peso, lo más preferentemente igual a o menor de un 1 en peso.

(22)

La pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con cualquiera de (1) a (21), en la dicha pasta de endurecimiento in situ tiene propiedades osteoinductivas y/o osteoconductivas, de regeneración de cartilago o de ligamento periodontal in vivo.

(23)

La pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con cualquiera de (4) a (22), en la que dicho agente activo se selecciona del grupo que consiste en hormonas, citocinas, factores de crecimiento, antibióticos y moléculas pequeñas.

(24)

La pasta de endurecimiento in situ de cualquiera de (4) a (23), en la que dicho agente activo es la hormona paratiroidea (PTH) y/o e/ péptido PTH1-34.

(25)

La pasta de endurecimiento in situ de cualquiera de (4) a (24), en la que dicho agente activo es una proteína osteoinductiva o inductiva de cartílago.

(26)

La pasta de endurecimiento in situ (25), en la que dicho agente activo es un miembro de la familia TGF-beta o un miembro de la familia BMP.

(27)

La pasta de endurecimiento in situ de (26) en la que dicho agente activo es BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15 o BMP-16.

(28)

La pasta de endurecimiento in situ de (25) en la que dicho agente activo es GDF-1, GDF-2, GDF-3, GDF-4. GDF-5, GDF-6, GDF-7, GDF-8. GDF-9, GDF-10 o GDF-11.

(29)

La pasta de endurecimiento in situ de (25), en la que dicho agente activo es la proteína sensible al ácido retinoico derivada del cartílago de regeneración de cartílago (CD-RAP).

(3:1) Un procedimiento para la producción de la pasta de endurecimiento in situ de cualquiera de (1) a (3) o (6) a (29), que comprende las etapas de:

(a)

mezclar un componente A que comprende el plastificante y un componente B que comprende el polímero insoluble en agua disolviendo el componente B en el componente A para proporcionar un líquido viscoso; y

(b)

mezclar dicho líquido viscoso obtenido en (a) con la carga sólida insoluble en agua para preparar la pasta.

(31)

El procedimiento para la producción de la pasta de endurecimiento in situ de (4) a (29) que comprende las etapas de:

(a)

mezclar un componente A que comprende el plastificante y un componente B, que comprende el polímero insoluble en agua disolviendo el componente B en el componente A para proporcionar un líquido viscoso;

(b)

disolver el agente activo en dicho líquido viscoso; y

(c)

mezclar dicho líquido viscoso obtenido en (b) con la carga sólida insoluble en agua para preparar la pasta. Este procedimiento es adecuado para un agente activo soluble en el líquido viscoso anterior.

(32)

El procedimiento para la producción de la pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con (4) a (29) que comprende las etapas de:

(a)

mezclar un componente A que comprende el plastificante y un componente B que comprende el polímero insoluble en agua disolviendo el componente B en el componente A para proporcionar un liquido viscoso;

(b)

mezclar dicho líquido viscoso obtenido en (a) con la carga sólida insoluble en agua para preparar la pasta, en el que dicha carga sólida insoluble en agua comprende el agente activo que se recubre sobre dicha carga sólida, preferentemente que se recubre homogéneamente sobre dicha carga.

Este procedimiento también es adecuado para un agente activo insoluble en el líquido viscoso anterior.

(33)

El procedimiento de cualquiera de (30) a (32), que comprende además la etapa de añadir la carga de construcción de poro soluble en agua.

(34)

Una composición farmacéutica que comprende la pasta de endurecimiento in situ de cualquiera de (1) a (29).

(35)

Uso de la pasta de endurecimiento in situ de cualquiera de (1) a (29) para la preparación de una composición farmacéutica que se va a usar para el aumento óseo.

En una realización preferida (35a) dicho aumento óseo sigue a defectos traumáticos, malignos o artificiales o es un requisito previo para el curado posterior de un implante. Otras realizaciones relacionadas con el aumento óseo se enumeran a continuación.

(36) Uso de la pasta de endurecimiento in situ de cualquiera de (1) a (29) para la preparación de una composición farmacéutica para tratar defectos óseos.

En una realización preferida (37a) dichos defectos óseos son defectos de hueso largo, defectos en el área maxilofacial

o defectos óseos tras apicoectomía, extirpación de quistes o tumores, extracción dental, o la extirpación quirúrgica de dientes retenidos.

(37)

Uso de la pasta de endurecimiento in situ de cualquiera de (1) a (29) para la preparación de una composición farmacéutica para tratar discopatía degenerativa, traumática, fusión de la columna vertebral, fractura del cuerpo vertebral, vertebroplastia y cifoplastia.

(38)

Uso de la pasta de endurecimiento in situ de cualquiera de (1) a (29) para la preparación de una composición farmacéutica para tratar la dehiscencia ósea.

(39)

Uso de la pasta de endurecimiento in situ de cualquiera de (1) a (29) para la preparación de una composición farmacéutica que se va a usar para la elevación del suelo sinusal o el aumento de la mandíbula atrofiada o del reborde mandibular.

(40)

Uso de la pasta de endurecimiento in situ de cualquiera de (1) a (29) para la preparación de una composición farmacéutica para llenar cavidades y/o apoyar la regeneración tisular guiada en periodontología.

(41)

Uso de la pasta de endurecimiento in situ de cualquiera de (1) a (29) para la preparación de una composición farmacéutica para promover la condrogénesis.

(42)

Uso de la pasta de endurecimiento in situ de cualquiera de (1) a (29) para la preparación de una composición farmacéutica que se va a usar para el tratamiento de al menos una enfermedad ósea.

Preferentemente, dicha enfermedad ósea se selecciona de las siguientes enfermedades en las que está implicada la diferenciación condrogénica: osteoartritis; artritis reumatoide, daño del cartílago articular debido a traumatismo, mantenimiento de fenotipos de condrocitos en trasplante de condrocitos autólogo, reconstrucción de cartílago en la oreja, tráquea o nariz, osteocondritis disecante, regeneración de disco intervetebral o menisco, fractura ósea y/o osteogénesis de cartnago.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra la Influencia de los ingredientes de la pasta de endurecimiento in situ en referencia a sus características de consistencia, porosidad y endurecimiento dependiendo de su proporción.

La figura 2 muestra diversas composiciones de armazón de formación in situ (IFS) o composiciones candidatas para la pasta de endurecimiento in situ de la presente invención con una variación de la proporción de polímero y cemento de fosfato de calcio y la dureza [%] de las diferentes composiciones en tres puntos de tiempo diferentes (después de 1, 9 Y 24 días).

negro: polietilenglicol400 (44,5 % en peso), cemento de fosfato de calcio (55,5 % en peso)

gris oscuro: PLGA RG 503H (11,0 % en peso), polietilenglicol 400 (44,5 % en peso), cemento de fosfato de calcio (44,5 % en peso).

gris claro: PLGA RG 503H (22,2 % en peso), polietilenglicol 400 (44,5 % en peso), cemento de fosfato de calcio (33,3 % en peso).

blanco: PLGA RG 503H (38,8 % en peso), polietilenglicol400 (44,5 % en peso), cemento de fosfato de calcio (16,7 % en peso).

blanco con puntos grises: PLGA RG 503H (38,9 % en peso), polietilenglicol 400 (61,2 % en peso).

gris con puntos blancos: cemento de fosfato de calcio (control)

El cemento de fosfato de calcio se compone de a-TCP (59,0 % en peso), CaHP04 (24,0 % en peso), CaC03 (8,5 % en peso), hidroxiapatita (8,5 % en peso).

La figura 3 muestra la dureza [ %] de diversas composiciones de IFS con una proporción de polímero con respecto a fosfato de calcio diferente en función del tiempo (después de 1, 72, Y 168 horas), donde O es el punto de tiempo en el que el espécimen de IFS se transfirió a un tampón de PBS a 37 oC y la dureza se determinó de acuerdo con los ejemplos descritos más adelante. La composición del cemento de fosfato de calcio usado se describe en la fig. 6.

Negro: PLGA RG 503H (19,4 % en peso), polietilenglicol400 (44,5 % en peso), cemento de fosfato de calcio (36,1 % en peso).

gris: PLGA RG 503H (22,2 % en peso), polietilenglicol400 (44,5 % en peso), cemento de fosfato de calcio (33,3 % en peso).

blanco: PLGA RG 503H (25,0 % en peso), polietilenglicol400 (44,5 % en peso), cemento de fosfato de calcio (30,5 % en peso).

La figura 4 muestra la dureza [ %1 para composiciones de IFS con diferentes contenidos de polietilenglicol 400 (PEG 400) como plastificante. La composición del cemento de fosfato de calcio usado se describe en la fig. 6.

negro: PLGA RG 503H (22,2 % en peso), polietilenglicol400 (44,5 % en peso), cemento de fosfato de calcio (33,3 % en peso).

gris: PLGA RG 503H (20,0 % en peso), polietilenglicol400 (50,0 % en peso), cemento de fosfato de calcio (30,0 % en peso).

blanco: PLGA RG 503H (16,0 % en peso), polietilenglicol400 (60,0 % en peso), cemento de fosfato de calcio (24,0 % en peso).

La figura 2 a 4 muestra cómo la composición, por ejemplo, la proporción polímero/carga inorgánica y el contenido en disolvente orgánico afectan a las propiedades mecánicas de la pasta de endurecimiento in situ de la Invención. La mayor estabilidad mecánica en estos ejemplos se observó para la proporción carga inorgánica/polímero de 1,5: 1. Las realizaciones preferidas que cumplen con los requisitos de estabilidad de la presente invención se describen anteriormente. Otros detalles se describen a continuación.

Los resultados experimentales para evaluar el contenido en plastificante óptimo en la composición para lograr la máxima estabilidad mecánica se muestran en la fig. 4. Dentro del intervalo entre un 44,5 % Ymenor de un 60 % se pudo lograr una estabilidad mecánica mejorada en estas muestras analizadas.

La figura 5 muestra el efecto del cemento de fosfato de calcio (CPC, negro) frente a I3-TCP (blanco) como fase inorgánica sobre la dureza [%] del IFS en función del tiempo. La composición del cemento de fosfato de calcio usado se describe en la fig. 6.

negro: PLGA RG 503H (22,2 % en peso), polietilenglicol400 (44,5 % en peso), cemento de fosfato de calcio (33,3 % en peso).

blanco: PLGA RG 503H (22,2 % en peso), polietilenglicol400 (44,5 % en peso), l3-fosfato de trlcalclo (33,3 % en peso).

La figura 6 muestra la dureza [ %] para diversas composiciones que contienen fosfato de calcio en función del tiempo (1 , 48,168 h).

Cada formulación comprende PLGA RG 503H (22,2 % en peso), polietilenglicol 400 (44,5 % en peso) y un componente inorgánico (33,3 % en peso). Se usó el componente inorgánico de las diferentes formulaciones como sigue:

negro: cemento de fosfato de calcio que consiste en a-TCP (62,5 % en peso), CaHP04 (26,8 % en peso), CaC03 (8,9 % en peso), hidroxiapatita (1,8 % en peso). gris: a-TCP blanco: a-TCP (99,0 % en peso), hidroxiapatita (1,0 % en peso)

blanco con puntos grises: a-TCP (98,0 % en peso), hidroxiapatita (2,0 % en peso) La figura 7 muestra la dureza [ %] del lFS dependiente del tamaño de partícula de a-TCP en función del tiempo (1 , 48 Y 144h).

Cada formulación comprende PLGA RG 503H (22,2 % en peso), polietilenglicol400 (44,5 % en peso) y un cemento de

fosfato de calcio (33,3 % en peso) El cemento de fosfato de calcio consiste en a-TCP (62,5 % en peso), CaHP04 (26,8 % en peso), CaC03 (8,9 % en peso), hidroxiapatita (1,8 % en peso).

Se varía el tamaño de partícula de a-TCP: negro: tamaño de partícula de gránulos a-TCP -+ 300 -500 ¡.1m

gris: tamaño de partícula de gránulos a-TCP -+ 500 -700 ¡.1m

blanco: tamaño de partícula de gránulos a-TCP ---> 700 -1000 IJm

blanco con puntos grises: tamaño de partícula de gránulos a-TCP -+ < 300 IJm

S

En la fig. 7 los inventores muestran la influencia del tamaño de partícula de la carga inorgánica analizada sobre las propiedades mecánicas de la pasta de endurecimiento in situ con estabilidad mecánica mejorada cuando se usa una carga con un tamaño de partícula de 300 IJm o mayor.

La figura 8 muestra el efecto de diferentes disolventes orgánicos en la dureza de las composiciones de IFS con el tiempo.

negro: PLGA RG S03H (22,2 % en peso), cemento de fosfato de calcio (33,3 % en peso), polietilenglicol400 (44,S % en peso). La composición del cemento de fosfato de calcio usado se describe en la fig. 6.

10

gris: PLGA RG 503H (22,2 % en peso), cemento de fosfato de calcio (33,3 % en peso), N-metilpirrolidona (NMP) (44,S % en peso).

blanco: cemento de fosfato de calcio (42,8 % en peso), N-metilpirrolidona (S7,2 % en peso)

1S

Los plastificantes preferidos de la presente invención son sustancias no tóxicas tales como PEG o DMSO (véase la fig. 11). Como se muestra en la figura 8, para PLGA (SO/SO) los PEG tales como PEG 400 proporcionan un incremento en la estabilidad mecánica con el tiempo (1 a 98 h) en comparación con la NMP, que se usa con frecuencia en líquidos poliméricos farmacéuticos de la técnica anterior, aunque se clasifican en "deutschen Gefahrstoffstoffverordnung" (Reglamento alemán sobre sustancias peligrosas) como "Xi" y como "Giftklasse (CH)S" (Clase de sustancias tóxicas (CH)S).

20

La figura 9 muestra el efecto plastificante de diferentes disolventes orgánicos en mezclas de IFS con PLGA RG S03H (determinación midiendo la disminución de la temperatura de transición vítrea (Tg) por DSC de acuerdo con el ejemplo 21). Dependiendo del disolvente orgániCO usado, la Tg del polímero se altera, mientras que una reducción en la Tg influye negativamente en las propiedades mecánicas del IFS.

negro: PLGA RG S03H/polietilenglicol 400 (1 :2)

gris: PLGA RG S03H/N-metilpirrolidona (1 :2)

2S

blanco: PLGA RG S03H/dimetilsulfóxido (1 :2)

gris con puntos blancos: PLGA RG S03H

30

La figura 10 muestra la dureza [ %) dependiente de diferentes tipos de PLGA. Los resultados revelan que se deben tener en cuenta varias características para la selección de un polímero, que sea adecuado como componente delIFS. Tanto la proporción de ácido láctico/ y glicólico con la cadena de polímero como la viscosidad inherente influyen en las propiedades mecánicas del IFS endurecido. La composición del cemento de fosfato de calcio usado se describe en la fig.6.

negro: PLGA RG 7S6 (22,2 % en peso), cemento de fosfato de calcio (33,3 % en peso), polietilenglicol400 (44,S % en peso).

3S

gris: PLGA RG S03 (22,2 % en peso), cemento de fosfato de calcio (33,3 % en peso), polietilenglicol400 (44,S % en peso).

blanco: PLGA RG 502 (22,2 % en peso), cemento de fosfato de calcio (33,3 % en peso), polietilenglicol400 (44,5 % en peso).

gris con puntos blancos: PLGA RG S03H (22,2 % en peso), cemento de fosfato de calcio (33,3 %), polietilenglicol400 (44,5 % en peso).

40 4S

De acuerdo con la aplicación de la pasta de endurecimiento in situ de la presente invención, las propiedades mecánicas de la pasta se pueden ajustar por selección del tipo de polímero (fig. 10). Gracias a la presente invención, los inventores han encontrado que la estabilidad mecánica a largo plazo del implante en medio acuoso se puede potenciar significativamente si se usan polímeros con una proporción ácido láctico/ácido glicólico menor de 7S:2S, preferentemente de SO:50 (RG 503H) en comparación con 7S:25 (RG 756H). Se puede lograr una mejora adicional de la estabilidad mecánica si se usan polímeros con un casquete en el extremo como se muestra para RG 503 en comparación con RG 503H (sin casquete en el extremo) mostrado en la fig. 10 Y 12. Además, las propiedades mecánicas se mejoran usando polímeros con un peso molecular incrementado (RG 503 en comparación con RG 502).

La figura 11 muestra el efecto de copolímeros de dibloque PLGA-PEG sobre la dureza [ %] del IFS

SO

negro: copolímero de dibloque (11,4 % en peso), dimetilsulfóxido (44,5 % en peso), cemento de fosfato de calcio (44,1 % en peso).

gris: copolímero de dibloque (7,6 % en peso), dimetilsulfóxido (44,5 % en peso), cemento de fosfato de calcio (47,9 % en peso).

blanco: copolímero de dibloque (3,8 % en peso), dimetilsulfóxido (44,5 % en peso), cemento de fosfato de calcio (51,7 % en peso).

No sólo se puede usar el PLGA como polímero adecuado para fabricar la pasta de endurecimiento in situ de la presente invención, los copolímeros de dibloque PLGA-PEG también dan como resultado una pasta con una dureza mayor de un 80 % de las concentraciones de polímero de entre un 3 y un 12 % en peso, si se usa con un plastificante en el que el polímero sea soluble, tal como dimetilsulfóxido.

La figura 12 muestra una degradación sostenida del IFS usando un copolímero de PLGA con un casquete en el extremo, como se determina midiendo la temperatura de transición vítrea (Tg) en función del tiempo por OSC, como se describe en el ejemplo 21. La composición del cemento de fosfato de calcio usado se describe en la fig. 6.

curva negra: PLGA RG 503 (22,2 % en peso, con casquete en el extremo), PEG 400 (44,5 % en peso), cemento de fosfato de calcio (33,3 % en peso).

curva blanca: PLGA RG 503H (22,2 % en peso, sin casquete en el extremo), PEG 400 (44,5 % en peso), cemento de fosfato de calcio (33,3 % en peso).

La figura 13 muestra la resistencia mecánica mejorada (dureza [%]) de la composición dellFS en comparación con otros dispositivos de autoendurecimiento relacionados con el tiempo. La composición del cemento de fosfato de calcio usado se describe en la fig. 6.

Gracias a la presente invención, se pudo desarrollar una pasta de endurecimiento in situ con una resistencia mecánica mayor dentro de una hora después del endurecimiento de la pasta in situ en comparación con un cemento de fosfato de calcio (barra blanca) o un sistema basado en polímero que consiste en PLGA y N-metilpirrolidona (barra gris). Además, después de 96 horas, la resistencia mecánica fue mayor que las propiedades mecánicas del cemento de fosfato de calcio.

negro: EIIFS consiste en PLGA RG 503H (22,2 % en peso), polietilenglicol 400 (44,5 % en peso) y un cemento de fosfato de calcio (33,3 % en peso).

gris, solución de polímero que consiste en PLGA RG 756 (45,0 % en peso)y N-metilpirrolidona (55,0 % en peso)

blanco: un cemento de fosfato de calcio que consiste en alfa-TCP (62,5 % en peso), hidrógenofosfato de calcio (26,8 % en peso), carbonato de calcio (8,9 % en peso) e hldroxiapatita (1,8 % en peso)

La figura 14 muestra la capacidad de formación de poros de la sal sódica de carboximetilcelulosa en diferentes concentraciones sobre la capacidad de formación de poros sobre la superficie externa del IFS. Gracias a la presente invención, se pudo evitar una formación de piel alrededor de la pasta de endurecimiento in situ por la adición de agentes de formación de poros tales como sal sódica de carboximetilcelulosa, que muestra propiedades de hinchamiento en un ambiente acuoso. Si se introduce la sal sódica de carboximetilcelulosa en la formulación delIFS, se produce un proceso de formación de poros sobre la superficie de la composición del IFS después de su aplicación (endurecimiento in situ) con tamaños de poro, que ahora facilitan la migración celular dentro de las estructuras internas del IFS. Sin embargo, sólo se puede lograr una macroporosidad suficiente después de la adición de, por ejemplo, sal sódica de carboximetilcelulosa en la composición de la presente invención, mientras que otras composiciones tales como las que comprenden NMP son menos porosas en la superficie externa de la matriz de formación in situ.

A) PLGA RG 503H (22,2 % en peso), polietilenglicol 400 (44,5 % en peso), cemento de fosfato de calcio (33,3 % en peso).

B) PLGA RG 503H (21,6 % en peso), polietilenglicol 400 (43,4 % en peso), cemento de fosfato de calcio (32,5 % en peso), sal sódica de carboximetilcelulosa (2,5 % en peso).

C) PLGA RG 503H (21,1 % en peso), polietilenglicol400 (42,3 % en peso), cemento de fosfato de calcio (31,6 % en peso), sal sódica de carboxlmetilcelulosa (5,0 % en peso).

O) PLGA RG 756 (45,0 % en peso), N-metilpirrolidona (55,0 % en peso)

E) PLGA RG 756 (43,9 % en peso), N-metilpirrolidona (53,6 % en peso), sal sódica de carboximetilcelulosa (2,5 %)

F) PLGA RG 756 (42,8 % en peso), N-metilpirrolidona (52,2 % en peso), sal sódica de carboximetilcelulosa (5,0 % en peso)

La figura 15 presenta una microfotografía SEM dellFS que muestra altos macroporos de la pasta endurecida y poros de interconexión.

A muestra una microfotografía SEM dellFS, que se tomó de acuerdo con el ejemplo 20. El espécimen mostrado es el resultado de dos secciones transversales en un ángulo de 900 Las dos direcciones principales en las que ha tenido

•

lugar la formación de poros en todo el armazón, conducen a una red tridimensional de poros de interconexión (micro y macroporos). Composición delIFS: PLGA RG 503H (22,2 % en peso), cemento de fosfato de calcio (33,3 % en peso), polietilenglicol 400 (44,S % en peso).

B muestra poros de interconexión del IFS

La foto realizada por microscopía óptica muestra el área de sección transversal de un espécimen de IFS de la siguiente composición: PLGA 503H (22,2 % en peso), cemento de fosfato de calcio (33,3 % en peso), polietilenglicol 400 (44,5 % en peso).

Gracias a la presente invención se pudo generar un armazón macroporoso similar al tejido esponjoso. Las flechas descifran las regiones, que muestran la interconectividad de poros generados dentro de la pasta de endurecimiento in situ de la invención, que están presentes en todo el armazón in situ formado.

La figura 16 muestra la liberación de rhGDF-5 de la composición de IFS con el tiempo en días. El IFS usado se compuso de PLGA RG 503H (22,2 % en peso), polietilenglicol 400 (44,5 % en peso); cemento de fosfato de calcio (33,3 % en peso), incluyendo gránulos de a-TCP recubiertos con rhGDF-5 (62,5 % en peso); dando como resultado una concentración de rhGDF-5: 104 IJglg de IFS. Se determinó la liberación de proteína como se describe por el ejemplo 15 a 4 oC. Gracias a la presente invención, se pudO demostrar una liberación sostenida de agente activo durante 7 días. Después de 7 días, sólo se administró un 60 % de agente activo.

La figura 17 muestra la estabilidad de gránulos de a-TCP recubiertos con rhGDF-5 en diversos disolventes orgánicos (A -Acetona, B -NMP, C -PEG 400) determinada de acuerdo con el ejemplo 14 bajo condiciones no estériles. D muestra gránulos de a-TCP recubiertos con rhGDF-5 sin tratamiento con disolvente orgánico como control. Se determinó la estabilidad de la proteína como área de pico relativa por la cantidad de rhGDF-5 nativa después de la extracción de los gránulos de a-TCP recubiertos. Se pudo lograr la mayor estabilidad para PEG 400 sobre los otros disolventes orgánicos analizados usando rhGDF-5 como agente activo ejemplar. Se puede incrementar adicionalmente la estabilidad si las condiciones de fabricación se mejoran adicionalmente, tales como la fabricación bajo condiciones estériles, gas inerte o adición de estabilizantes.

La figura 18 muestra la resistencia de lavado dellFS en comparación con otros sistemas del estado de la técnica tales como pasta de hidroxiapatita Ostim® adquirido de Heraeus Kulzer (A) y cemento de fosfato de calcio Calcibon® adquirido de Merck (C) con ellFS de la presente invención (B) después de la aplicación de la pasta a agua pura. La pasta de endurecimiento in situ usada está compuesta de PLGA RG 503H (22,2 % en peso), polietilenglicol 400 (44,S % en peso) y cemento de fosfato de calcio hasta el 100 % que contiene a-TCP (62,5 % en peso), hidrógenofosfato de calcio (26,8 % en peso), carbonato de calcio (8,9 % en peso) e hidroxiapatita (1,8 % en peso). El ensayo se llevó a cabo a temperatura ambiente. Se inyectó Ostim® directamente en el medio acuoso. Se premezcló Calcibon ® combinando 1 g de polvo de cemento y 0,32 mi de líquido de cemento. Después de 5 minutos, la mezcla de cemento pastosa resultante se colocó en medio acuoso. Se pudo observar, que ellFS mostró resistencia de lavado excelente, se mantuvo estable, y se endureció mientras se sumergía en agua, en contraste con el otro espécimen analizado.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

Con el fin de promover la comprensión de los principios de la invención, las referencias se realizarán para determinadas realizaciones de la misma y el lenguaje específico que se usa para describir la misma. No obstante, se entenderá que no se desea en consecuencia ninguna limitación del alcance de la invención, contemplándose que estas alteraciones, otras aplicaciones y modificaciones del principio de la invención como se ilustra en el presente documento se producen normalmente para un experto en la técnica al que se refiere la invención.

A. La pasta de endurecimiento in situ

Como se indica anteriormente, en general la presente invención proporciona una composición de pasta de endurecimiento in situ que incluye al menos tres componentes: un plastificante, que es un líquido orgánico biocompatible soluble en agua o miscible en agua, un polimero insoluble en agua, que es biocompatible, biodegradable, y/o biorreabsorbible y soluble en el plastificante, y una carga sólida insoluble en agua. que es insoluble en el plastificante, donde la pasta, es inyectable y estable en su envase y se endurece después de colocarse en el defecto. Después de ponerse en contacto con un medio acuoso o fluido corporal, la pasta de endurecimiento in situ se es capaz de endurcerse in situ para formar un implante sólido. Preferentemente, la estabilidad en el envase de la pasta premezclada es de al menos varias semanas, más preferentemente de varios meses, lo más preferentemente de al menos un año. Se puede entender la estabilidad como una consistencia y moldeabilidad de la pasta de endurecimiento in situ premezclada sin alteraciones drásticas en la consistencia con el tiempo. El envase es un envase resistente al agua usado comúnmente, tal como se usa comúnmente para aplicaciones parenterales en aplicaciones farmacéuticas.

El término pasta de endurecimiento in situ, armazón de formación in situ (IFS), pasta de formación in situ, IFS, composición de IFS, pasta de compuesto cerámico/polimérico y pasta se usan de forma Intercambiable dentro de la presente Invención.

El término "endurecimiento in situ" como se usa en la presente invención se refiere a un implante sólido que se forme después del contacto con un medio acuoso, tal como agua, una solución fisiológica o fluido corporal después de la disipación o disolución del disolvente orgánico en entomo ex vivo así como en un organismo tal como un cuerpo de tejido humano o animal. Dependiendo de la indicación y la utilización de la pasta tal implante sólido comprendería también un implante que al menos tiene una mayor resistencia mecánica después de ponerse en contacto con un fluido corporal circundante que la pasta antes de su aplicación, por ejemplo, en el caso de una pasta de endurecimiento in situ para su reparación.periodontal.

El término "pasta" como se usa de acuerdo con la presente invención se refiere a una mezcla o material blando, suave, espeso, o entidad similar a pasta administrable usando una jeringuilla o aplicación invasiva mínima, que comprende al menos tres componentes, preferentemente al menos cuatro componentes, 1.0 más preferentemente al menos cinco componentes como se establece anteriormente. La pasta es adecuada para llenar un defecto quirúrgico, regeneración de tejidos o aumento óseo. En otra realización la pasta se usa como sistema de administración de fármaco para la liberación controlada de sustancias activas después de la implantación.

En una realización preferida, la pasta de la presente invención está libre de sustancias tóxicas. Preferentemente, estas sustancias tóxicas ya se evitan en el proceso de producción, ya que su producción requiere gastos adicionales debido a las etapas de eliminación requeridas durante el proceso de producción y los medios costosos necesarios para un análisis químico altamente sensible.

El término "sustancias tóxicas", en particular, abarca los disolventes orgánicos tóxicos y aditivos que se usan por los procedimientos descritos en la técnica, que se clasifican por ICH como disolventes de clase 2 (ICH, tema Q 3 C Impurezas: Disolventes residuales), por ejemplo, cloruro de metileno. Dichas sustancias pueden provocar efectos tóxicos sistémicos o locales, inflamación y/u otras reacciones después de la implantación de dispositivos que contengan dichas sustancias. Estos dispositivos de la técnica anterior son terapéuticamente menos aceptables debido a dichos efectos secundarios no deseados, que no se pueden evitar por los procedimientos de recubrimiento convencionales descritos en la técnica. Además, la guía internacional para el desarrollo de las proteínas terapéuticas requiere que en el proceso de fabricación se eviten las sustancias perjudiciales y tóxicas (para más detalles véase: Conferencia internacional sobre armonización (ICH), Tema Q3C; www.emea.eu.intl). Sin embargo, la pasta de la presente invención o una pasta, que se pueda obtener por el procedimiento de la presente invención está libre, de forma ventajosa, de estas sustancias tóxicas clasificadas en la clase 1. Además, la presente invención sólo contiene disolventes clasificados como de clase 3 por la ICH tema Q 3C y, por lo tanto, son terapéuticamente bien aceptados y cumplen con los requisitos de las autoridades reguladoras. Preferentemente, los mismos requisitos para los disolventes en común son válidos para el plastificante, la carga sólida insoluble en agua y/o la carga de construcción de poro soluble en agua de la pasta de endurecimiento in situ de la presente invención.

El término "densidad" significa la densidad de la formulación pastosa antes de la aplicación en un organismo y antes del endurecimiento. Se calcula de acuerdo con el ejemplo 23. La densidad de la composición de pasta de la presente invención es igualo mayor de 1,21 mg/ml.

Además, en otra realización preferida de la pasta o del procedimiento de la invención, dicha pasta está libre de material infeccioso.

Además de las sustancias tóxicas, el material infeccioso compuesto por un dispositivo de la técnica anterior puede provocar infecciones graves en un sujeto en el que se ha trasplantado el dispositivo. Sin embargo, se usa gelatina potencialmente infecciosa derivada de hueso bovino o porcino como una proteína protectora en muchos procedimientos del estado de la técnica (Lind et al., 1996).

La variación en la concentración de los componentes de la pasta de endurecimiento in situ de la presente invención conduce a una adaptación para una aplicación médica específica por cambios dentro de la consistencia de la pasta inyectable, tiempo de endurecimiento in situ, porosidad y propiedades mecánicas del implante final. Adicionalmente, la variación de estos parámetros es un medio potente para adaptar la cinética de liberación del agente activo por el comportamiento de degradación cambiada del polímero insoluble en agua.

B. El plastificante

El término "plastificante" de acuerdo con la presente invención significa un líquido orgánico soluble en agua o miscible en agua o disolvente que sea farmacéuticamente aceptable o una mezcla de los mismos. Dependiendo de la característica del agente activo, la función del plastificante es disolver el polrmero blodegradable, biocompatible y/o biorreabsorblble insoluble en agua o disolver el pOlímero biodegradable, biocompatible y/o biorreabsorbible insoluble en agua y disolver o suspender el agente activo; suspender el material de carga sólido insoluble en agua; o disolver el polímero insoluble suspendiendo adicionalmente la carga sólida insoluble en agua. Durante el endurecimiento in situ en contacto con medio acuoso o fluido corporal el plastificante se difunde fuera de la pasta, dejando poros y conduciendo a un dispositivo de compuesto de forma estable o implante in situ. Por lo tanto, el plastificante tiene que ser disolvente soluble en agua o miscible en agua, y es un líquido, preferentemente un polímero soluble en agua. Preferentemente, el plastificante tiene un escaso efecto en la temperatura de transición vítrea del polímero insoluble en agua en el implante endurecido in situ y es compatible con el agente activo. Dependiendo del polímero insoluble en agua, de debe usar un plastificante seleccionado de un grupo de plastificantes definido adicionalmente a continuación con el menor impacto en la temperatura de transición vítrea del polímero después del curado.

El término "disolver" significa la disolución o suspensión de una sustancia en un líquido, proporciona una distribución homogénea de la sustancia en el líquido.

Preferentemente, dicho plastificante es biocompatible. Dicho plastificante se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG) 400, PEG 200, PEG 300, PEG 600, 1,3-butanodiol, aceite de ricino, alcanoles C2 a C6, propilenglicol, solcetal, acetona, acetato de metilo, acetato de etilo, lactato de etilo, metiletilcetona, dimetilformamida, dimetilsulfóxido, dimetilsulfona, tetrahidrofurano, caprolactama, decilmetilsulfóxido, ácido oleico, carbonato de propileno, triacetina, N,N-dietil-m-toluamida, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona o mezclas de los mismos.

Lo más preferentemente, dicho plastificante es polietilenglicol, debido a su impacto relativamente bajo sobre la Tg del componente polimérico (fig. 8, 9), al proceso de endurecimiento acelerado de pastas que comprenden polietilenglicol en comparación con las que comprenden N-metilpirrolidona (fig. 13) Y a la alta compatibilidad de polietilenglicol con las proteínas (fig. 17).

Preferentemente, la pasta de endurecimiento in situ de la presente invención contiene menos de un 60 % del plastificante, más preferentemente menos de un 55 %, más preferentemente menos de un 50 %, incluso más preferentemente igualo menor de un 45 %, pero más de un 40 %, lo más preferentemente de entre un 40 % Y un 45 %. En los armazones de formación in situ de la presente invención que contienen tal cantidad de PEG muestran propiedades mecánicas mejoradas (fig. 4).

El término "biocompatible" significa la capacidad de un material de actuar con una respuesta de huésped apropiada en una aplicación específica (Wintermantel P. et al., 2002). Además, el término "biocompatible" significa que el material no presenta ninguna propiedad tóxica y que no induce ninguna reacción inmunológica ni inflamatoria después de su aplicación.

El término "biodegradable" especifica materiales, por ejemplo polímeros, que se rompen debido a la degradación macromolecular con dispersión in vivo pero para los que no existe ninguna prueba de eliminación del cuerpo. La disminución en masa de material biodegradable dentro del cuerpo es el resultado de un proceso pasivo, que se cataliza por las condiciones fisicoquímicas (por ejemplo, humedad, valor de pH) dentro del tejido huésped.

El término "biorreabsorbible" especifica materiales tales como materiales poliméricos, que experimentan degradación y resorción adicional in vivo; es decir, polímeros, que se eliminan a través de vías naturales debido a la filtración sencilla de subproductos de degradación o bien después de su metabolización. Por tanto, la biorreabsorción es un concepto que refleja la eliminación total del material extraño inicial. En una realización preferida de la pasta o del procedimiento de la invención, dicho polímero biorreabsorbible es un polímero que experimenta una escisión de cadena debido a la degradación macromolecular en un medio acuoso. Se ha de mencionar que el término "resorción" siempre describe un proceso activo.

C. El polímero insoluble en agua

El término ·polímero insoluble en agua" significa un polímero no soluble en agua, es decir, no forma una fase homogénea cuando se mezcla con agua, que es soluble en el plastificante y que puede solidificarse en medio acuoso para formar un implante sólido en el que se incorpora la carga sólida insoluble en agua después de la retirada del plastificante en el tejido circundante. Preferentemente, dicho polímero insoluble en agua es un polímero "biocompatible", "biodegradable" y/o "biorreabsorbible". Más preferentemente, dicho polímero insoluble en agua es un polímero alifático, preferentemente con una temperatura de transición vítrea superior a 35 oC de la sustancia de polímero puro. La viscosidad inherente (viscosidad medida a 25 oC, 0,1 % en cloroformo) de los polímeros de la invención variará de desde aproximadamente 0,1 dl/g hasta 5 dl/g, preferentemente de desde aproximadamente 0,1 dl/g hasta 1 dl/g.

De forma alternativa, dicho polímero insoluble en agua se selecciona del grupo que consiste en polietileno (PE), polipropileno (PP), poli(terettalato de etileno) (PET), poliglactina, poliamida (PA), poli(metacrilato de metilo) (PMMA), poli(metacrilato de hidroximetilo) (PHEMA), poli(cloruro de vinilo) (PVC), poli (alcohol vinílico) (PVA), politetrafluoretileno (PTFE), poliéteretercetona (PEEK), polisulfona (PSU), poliuretano, polisiloxano o mezclas de los mismos. Estos polímeros son, al menos, biocompatibles.

Más preferentemente, dicho polímero se selecciona del grupo que consiste en poli(alfa-hidroxiácidos), poli(orto ésteres), poli(anhídridos), poli(aminoácidos), poliglicólido (PGA), poliláctido (PLLA), poli(D,L-láctido) (POLLA), poli(D,L-láctido-co-glicólido) o poli(L-láctido-co-glicólido) (PLGA), copolímeros de poli(ácido láctico-co-glicólico)-polietilenglicol (PLGA-PEG), poli(ácido 3-hidroxibutírico) (P(3-HB», poli(ácido 3-hidroxivalérico) (P(3-HV», poli(p-dioxanona) (POS), poli(épsilon-caprolactona) (PCL), polianhídrido (PA), copolímeros, terpolímeros, copolímeros de bloque, combinaciones, mezclas de los mismos. Estos polímeros son, al menos, biocompatibles y biodegradables.

El término "contenido en polímero de la composición" significa la proporción en peso del polímero, contenido en una formulación relativa al peso total de la composición. Preferentemente, la pasta de endurecimiento in situde la presente invención tiene un contenido en polfmero igualo menor de un 40 % en peso del polímero, más preferentemente igual

o menor de un 35 % en peso de polímero, incluso más preferentemente igualo menor de un 33 % en peso, lo más preferentemente de un 20 a un 25 % en peso. Estas composiciones con una cantidad seleccionada de polímero muestran las mejores propiedades mecánicas de la pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con la invención (fig. 2

a 4).

Más preferentemente, dicho polímero es PLGA, lo más preferentemente de PLGA (50:50). Cambiando la proporción de ácido láctico: ácido glicólico, es posible adaptar la tasa de degradación a la requerida para la aplicación o uso específico variando la composición de ácido glicólico dentro de la cadena de polímero entre un Oy un 100 % en mol ( % m) de ácido glicólico, preferentemente 50 % m (50:50) dentro de la cadena de polímero. Otro parámetro posible para afinar el comportamiento de degradación del polímero es la selección de la proporción enantlomérica del ácido láctico (forma-d O forma-I). PLGA (50:50) significa una proporción de monómero de ácido láctico: ácido glicólico en la cadena de polímero de aproximadamente 1:1.

De acuerdo con la presente invención, el PLGA con un peso molecular más alto da como resultado implantes con una estabilidad mecánica mayor con el tiempo, tal como se observa para el polímero de peso molecular mayor RG 503 en comparación con el polímero de peso molecular menor RG 502, como se muestra en la fig. 10. Por lo tanto, preferentemente, los polímeros con un peso molecular mayor son favorables.

En otra realización de la presente invención, el polímero insoluble en agua es un polímero con un casquete en el extremo. El término "polímero con un casquete en el extremo" significa que el grupo ácido carboxilico libre de la cadena polimérica lineal como está presente, por ejemplo, en el polímero RG 503H se ha esterificado con alcoholes. Usando polímeros con un casquete en el extremo y con la regulación de la cantidad de grupos de ácido carboxílico libres dentro del polímero, la tasa de degradación del polímero se puede regular dependiendo de la aplicación de la pasta de endurecimiento in situde la presente invención. Los inventores han encontrado además en extensos estudios de degradación que la estabilidad mecánica a largo plazo del implante en medio acuoso se puede potenciar significativamente si se usan como polímeros con un casquete en el extremo, como se muestra para un PLGA (50:50), tal como RG 503 (fig. 10). La degradación se puede demostrar, por ejemplo, investigando la disminución de la temperatura de transición vítrea (Tg) del polímero (fig. 12). Otros experimentos analíticos muestran una relación entre la temperatura de transición vítrea del polímero y la estabilidad mecánica in vitro, como se determina en los ejemplos. Una temperatura de transición vítrea baja da como resultado una disminución de la estabilidad mecánica del armazón de formación in situ. Además, estos productos de degradación (por ejemplo, oligómeros) pueden ejercer un efecto plastiflcante sobre la entidad polimérica residual reduciendo la resistencia mecánica.

En otra realización de la presente invención, el polímero insoluble en agua es un copolfmero PLGA-PEG, preferentemente un copolímero de dibloque o tribloque PLGA-PEG. Como se muestra en la fig. 11, también se pueden generar pastas de endurecimiento in situ adecuadas en las que los componentes poliméricos son copolímeros de dibloque PLGA-PEG. Por la alteración de la proporción PLGAlPEG dentro de la cadena polimérica, estos polímeros permiten un ajuste adicional del comportamiento de degradación. En lugar de los polímeros de PLGA convencionales sin PEG, estos materiales permiten la liberación de agentes activos incorporados por difusión. Como se mostró de acuerdo con la invención, las formulaciones de copolímeros de dibloque PLGA-PEG muestran propiedades mecánicas comparables a las formulaciones que contienen PLGA como componente polimérico. De hecho, el copolímero de dibloque PLGA-PEG usado apenas fue soluble en polietilenglicol. En tales casos, es necesario seleccionar otro plastificante tal como dimetilsulfóxido (DMSO).

D. Carga sólida insoluble en agua

El término "carga sólida insoluble en agua" significa un compuesto insoluble en agua así como en el plastificante, es decir, no forma una fase homogénea cuando se mezcla con agua o con el plastificante. La carga sólida insoluble en agua sirve como matriz en la pasta, y como portador para el agente activo dentro del armazón formado in vivo, una vez se endurece la pasta. Además, la carga sólida insoluble en agua puede incrementar adicionalmente la biocompatibilidad (por ejemplo, la unión celular) para estabilizar el pH local durante la degradación del polímero.

Preferentemente, dicha carga sólida insoluble en agua es un compuesto inorgánico u orgánico.

Preferentemente, el compuesto inorgánico se selecciona del grupo de óxido de magnesio, hidróxido de magnesio, carbonato de magnesio, dióxido de silicio o un compuesto de calcio. Dicha carga sólida insoluble en agua forma una matriz inorgánica dentro del polímero insoluble en agua. Dicha matriz inorgánica consiste en productos cerámicos y mejora en el estado endurecido las propiedades osteoconductivas así como el comportamiento mecánico del armazón. Usando un material de carga sólida insoluble en agua es posible reducir la cantidad del polímero insoluble en agua sin disminuir el comportamiento global del armazón. Más preferentemente, dicha carga sólida insoluble en agua es un fosfato de calcio; sulfato de calcio o carbonato de calcio, lo más preferentemente, fosfato de tricalcio, fosfato de tricalcio beta (j3-TCP), fosfato de tricalcio alfa (a-TCP), apatita, cemento que contiene fosfato de calcio o fosfato de tetracalcio, o una mezcla de diferentes compuestos inorgánicos anteriores, preferentemente compuestos que contengan calcio.

El término "fosfato de calcio" abarca composiciones que comprenden los iones de calcio (Ca2+), iones fosfato (P033-), opcionalmente, otros iones similares a iones hidroxilo (OH"), carbonato (COl") o magnesio (Mg2+) u otros iones que sean adecuados para la carga sólida insoluble en agua de la presente invención. Los fosfatos de calcio tal como se usan de acuerdo con la presente invención son cristales que tienen una estructura tridimensional adecuada para la pasta de la presente invención, como se establece anteriormente. Dichos fosfatos de calcio se adaptan particularmente bien como portadores para la pasta de la presente invención. Se han descrito sus propiedades in vivo en Hotz, 1994, Gao, 1996, yen el documento W098/21972. Una lista de fosfatos de calcio muy conocidos se da anteriormente.

Los cementos que contienen fosfato de calcio (CPC) incluyen pero no se limitan a, por ejemplo, apatita CPC, brushita CPC, mezclas de fosfato de tetracalcio (TICP) y fosfato de dicalcio anhidro (DCPA), mezclas de alfa-TCP e hidroxiapatita o cemento Calcibon® (Biomet Merck Darmstadt), que consiste en una mezcla de un 62,5 % en peso de fosfato de tricalcio alfa, un 26,8 % en peso de fosfato de dicalcio anhidro (DCPA), un 8,9 % en peso de carbonato de calcio (CaC03) Y un 1,8 % en peso de hidroxiapatita (HA). Otros ejemplos de CPC se describen supra e infra. Los cementos que contienen fosfato de calcio se pueden combinar una o más cargas insolubles en agua inorgánicas.

Preferentemente, el compuesto orgánico se selecciona de quitosano, colágeno, alginato de calcio, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), ácido hialurónico o sus derivados, celulosa o sus derivados, o almidón o derivados y/o cualquier combinación de los mismos.

Se pueden añadir cargas orgánicas para incrementar la bioadhesión del implante, por ejemplo, colágeno. Estos componentes pueden afectar adicionalmente a las propiedades mecánicas (por ejemplo, resistencia a la tracción, torsión) del implante en comparación con la función del colágeno dentro del hueso natural, tal como refuerzo de fibra.

La pasta de endurecimiento in situ de la presente invención es eficaz para su uso en organismos tales como seres humanos y animales, en el que la composición proporciona un armazón mineral duradero para apoyar el crecimiento óseo hacia dentro. Por consiguiente, una característica de la presente invención es la provisión de una composición estable premezclada útil, por ejemplo, como carga de vacío o para el aumento óseo.

De acuerdo con la presente invención, la matriz de compuesto se basa preferentemente en un fosfato de calcio, que es un fosfato de tricalcio beta, fosfato de tricalcio alfa, apatita, hidroxiapatita, carbonato de calcio, hidrógenofosfato de calcio y/o cemento que contiene fosfato de calcio o una mezcla de los mismos.

En un material de compuesto de este tipo, el fosfato de calcio muestra una capacidad tamponante local excelente y la estructura de compuesto permeable evita incluso la disminución de pH local cuando el polímero se degrada in vivo. Por lo tanto, los efectos secundarios citotóxicos debidos a la degradación del polímero se reducen o se evitan. Esto es especialmente válido, ya que el material cerámico es el ingrediente principal del material de compuesto cerámico/polímero de la presente invención, que contiene preferentemente menos de un 40 % en peso del polímero, más preferentemente menos de un 35 % en peso de polímero tal como PLGA, incluso más preferentemente igualo menor de un 33 % en peso de PLGA, lo más preferentemente de un 20 a un 25 % en peso.

En una realización preferida de la presente invención, el contenido de la carga sólida insoluble en agua en la pasta de endurecimiento in situ de la presente invención es menor de un 50 % en peso, entre un 25 % en peso y un 50 % en peso, preferentemente entre un 28 % en peso y un 38 % en peso, más preferentemente entre un 30 % en peso y un 36 % en peso. Además, el contenido de la carga sólida insoluble en agua se elige preferiblemente dependiendo del polímero insoluble en agua, por ejemplo, con una proporción de carga sólida insoluble en agua con respecto al polímero soluble en agua de 1,2:1 a 4:1, preferentemente de 1,2:1 a 2:1, más preferentemente de 1,2:1 a 1,8: 1, lo más preferentemente de 1 ,5: 1. La presente invención se basa en los sorprendentes resultados adicionales de que en un día, la pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con la invención que contiene una carga sólida insoluble en agua en el intervalo de igual a o mayor que aproximadamente un 15 % en peso y un polímero insoluble en agua de menos de un 40 % en peso tiene una resistencia mecánica mayor que otros sistemas tales como CPC, CPC y plastificante o un sistema de polímero/disolvente orgánico convencional (PLGAlPEG) (fig. 2). Durante 24 días, la pasta de endurecimiento in situ que contiene una carga sólida insoluble en agua en el intervalo de más de un 20 % Y un polímero insoluble en agua de menos de un 38 % tiene una dureza comparable a CPC o CPC y plastificante y una dureza significativamente mejorada sobre PLGAlPEG solo, como se muestra en la fig. 2 Y 3. La influencia de la proporción de fosfato de calcio en función del tiempo sobre la dureza de diversas pastas de endurecimiento in situ también se analizó como se muestra, por ejemplo, en la fig. 3. Los ejemplos seleccionados han demostrado composiciones preferidas con una resistencia mecánica ideal que contiene una proporción de carga sólida insoluble en agua con respecto a polímero insoluble en agua de aproximadamente 1,5:1 (barra gris en la fig. 3).

Además, los inventores han encontrado sorprendentemente que los cementos de fosfato de calcio tales como un cemento de fosfato de calcio que consiste en a-TCP (62,5 % en peso), CaHP04 (26,8 % en peso), CaC03 (8,9 % en peso), hidroxiapatita (1,8 % en peso), a-TCP con diversas concentraciones de hidroxiapatita o a-TCP puede mejorar adicionalmente las propiedades mecánicas de la pasta de endurecimiento in situ, en comparación con las formulaciones, que sólo contienen I3-TCP como carga inorgánica (fig. 5, 6). Esto también incluye que la cantidad de hidroxiapatita como cristal de sembrado se puede variar al menos entre un O% Yun 2 % dando como resultado un IFS con propiedades mecánicas fuertes.

En otra realización, el tamaño de partícula del fosfato de tricalcio alfa de la pasta de endurecimiento in situ es igualo mayor de 300 IJm, más preferentemente igualo mayor de 500 IJm, lo más preferentemente de entre 500 IJm y 1000 IJm.

Los inventores han encontrado de forma inesperada que el tamaño de partícula del fosfato de tricalcio tiene un impacto adicional en el comportamiento mecánico de la pasta de endurecimiento in situ (fig. 7), donde un incremento del tamaño de partícula de a-TCP mejora adicionalmente las propiedades mecánicas de la pasta de endurecimiento in situ. Un incremento en el tamaño de partícula a 300 IJm o más incrementa además las propiedades mecánicas.

E. Carga de construcción de poro soluble en agua

El término 'carga de construcción de poro soluble en agua' significa un compuesto que es farmacéuticamente aceptable e hinchable o soluble en fluido acuoso, tal como agua o fluido corporal, que cuando se añade a la pasta de endurecimiento in situ incrementa el número y el tamaño de los micro y macroporos dentro del implante sólido de endurecimiento in situ ex vivo y en el organismo. La porosidad del implante sólido formado se incrementará dependiendo de la cantidad de carga de construcción de poro soluble en agua usada. La carga de construcción de poro soluble en agua usada incrementa el número de poros, preferentemente macroporos, de un tamaño suficiente para el crecimiento hacia dentro de células vivas en el interior del implante sólido de endurecimiento in situ, preferentemente, la capa exterior del implante.

En una realización preferida, la carga de construcción de poro soluble en agua es un agente anti-formador de piel, tal como un agente que reduce o elimina una formación de piel alrededor de la pasta de endurecimiento cuando se sitúa la pasta de endurecimiento in situ en un defecto y entra en contacto con un fluido acuoso o fluido corporal. La frase "carga de construcción de poro soluble en agua" pretende incluir la formación de macroporos no sólo en el interior del armazón formado in situ, sino también dentro de la superficie exterior o piel para permitir el crecimiento hacia dentro y la sustitución del material de formación de hueso nuevo.

La carga de construcción de poro soluble en agua incluye compuestos aceptables farmacéuticos que se disipan desde el implante in situ y, por lo tanto, dan como resultado la formación de poro dentro del implante.

En una realización, las cargas de construcción de poro solubles en agua son agentes de hinchamiento. En contacto con medios acuosos, estos excipientes incrementan su volumen y se disuelven en el fluido circundante dejando atr~s una estructura porosa interconectada. Usando diferentes cantidades de carga de construcción de poro soluble en agua, la porosidad de la pasta de endurecimiento in situ se puede aprobar y la cantidad y el tamaño de poro se puede regular. Una ventaja del uso de agentes de hinchamiento como cargas de construcción de poro solubles en agua en comparación con las cargas de construcción de poro tales como sales (por ejemplo, cloruro de sodio) es que una cantidad reducida de estos materiales es eficaz ya que el volumen se incrementará debido a la captación de agua. Otros agentes de hinchamiento de acuerdo con la presente invención son ag'entes desintegrantes conocidos por los expertos en el campo de la fabricación de comprimidos.

Los agentes de hinchamiento de la presente invención incluyen tales como alginato de sodio, amilasa, amilopectina, almidón, ácido hialurónico, hialuronato de sodio, gelatina, colágeno, carboximetilcelulosa, metilcelulosa, sal cálcica de carboximetilcelulosa, sal cálcica de carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxibutilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxietilcelulosa o metilhidroxietilcelulosa.

En otra realización, las cargas de construcción de poro solubles en agua son tensioactivos, preferentemente copolímeros de bloque de óxido de etileno/sorbitano y óxido de propileno, tales como PluronicS® o Tween® 80 (por ejemplo, polisorbato 80; MontanoX® 80; monooleato de polioxietilensorbitano). Estas cargas de construcción de poro introducen una porosidad por disolución en medio acuoso análogo a cloruro de sodio (efecto de lixiviación salina) pero también pueden estabilizar la estructura porosa que se forma. Este efecto está relacionado con su naturaleza anfipática (anfifílica) y su actividad de superficie y, por lo tanto, estos materiales se usan ampliamente como agentes estabilizadores de espuma.

En otra realización la carga de construcción de poro soluble en agua adecuada que se puede usar en la presente invención incluye sustancias porogénicas tales como azúcares o sales de tamaño de cristal, que proporcionarán poros cuando se disuelven en el implante in situ.

Otros agentes de formación de poro forman burbujas de gas C02 y, por lo tanto, dejan poros cuando se mueven desde el implante.

El experto sabe que parámetros se pueden ajustar para lograr tamaños de poro de más de 100 IJm, preferentemente de 100 a 500 IJm con las cargas de construcción de poro anteriores. Estos tamaños de poro no sólo están presentes en los poros de interconexión, sino también sobre la superficie de la pasta de endurecimiento in situ para permitir el crecimiento hacia dentro de células del entorno celular en la zona del implante (fig. 15).

Preferentemente, el porcentaje en peso de la carga de construcción de poro soluble en agua es menor de un 10 % en peso, más preferentemente menor de un 5 % en peso, incluso más preferentemente menor de un 2,5 % en peso, lo más preferentemente menos de un 1 % en peso.

Más preferentemente, la carga de construcción de poro soluble en agua es una sal de carboximetilcelulosa, lo más preferentemente una sal sódica de carboximetilcelulosa, de manera óptima con un tamaño de partícula de menos de 1000 IJm, más preferentemente con un tamaño de partícula de 25 a 1000 IJm. Preferentemente, el porcentaje en peso de la sal sódica de carboximetilcelulosa es menor de un 10 % en peso, más preferentemente menor de un 5 % en peso, incluso más preferentemente menor de un 2,5 % en peso, lo más preferentemente menos de un 1 % en peso.

El término "tamaño de partícula" de acuerdo con la presente invención significa una distribución promedio del diámetro de tamaño del material tal como fosfato de tricalcio y carboximetilcelulosa en micrómetros (IJm), que se puede determinar por difracción láser. Un intervalo de tamaño de partícula específico de material se puede lograr, por ejemplo, por tamizado.

También fue inesperado que la carboximetilcelulosa supere los obstáculos de una formación de piel exterior no macroporosa, preferentemente de carboximetilcelulosa, con un diámetro de tamaño de partícula de entre 25 y 1000 IJm incrementó significativamente el número de macroporos mayores de 200 IJm dentro de la superficie exterior de la pasta de endurecimiento in situ después del contacto con un medio acuoso como se muestra en la tabla 3. Una observación inesperada adicional en términos de porosidad en la piel se refiere al disolvente orgánico usado en combinación con la carga de construcción de poro soluble en agua. Los datos presentados en la fig. 14 demuestran una porosidad ventajosa en la piel cuando se usa PEG, tales como PEG 400 como plastificante en comparación con NMP. Usando diferentes concentraciones de la carga de construcción de poro, el número de macroporos se puede ajustar de acuerdo con la aplicación de la pasta de endurecimiento in situ.

En otra realización, la pasta de endurecimiento in situ tiene poros de interconexión con un diámetro igualo mayor de 100 IJm.

El término "poros de interconexión" significa una red de poros y canales de poros con micro y macroporos por todo el implante, lo más preferentemente macroporos y macrocanales que crean una porosidad con un tamaño de poro suficiente para infiltración celular tal como de células óseas o células precursoras. De acuerdo con la presente invención, se pudo desarrollar una pasta de endurecimiento in situ con una red de dichos poros de interconexión que apoya el crecimiento hacia dentro de células vivas para la formación de hueso nuevo (fig. 15).

F. El agente activo

El término "agente activo· comprende un polipéptido o un fármaco de moléculas pequeñas, que se inmoviliza sobre la carga sólida insoluble en agua y/o se disuelve o se suspende en el plastificante. Preferentemente, dicho polipéptido o fármaco se distribuye homogéneamente sobre el portador que contiene fosfato de calcio y/o dentro del polímero.

El término "recubierto/a" de la presente invención significa que la superficie de la carga sólida insoluble en agua se recubre totalmente con el agente activo, donde cantidades esencialmente idénticas de proteínas están presentes en todas y cada una de las zonas de la superficie de dicho vehículo. Un vehículo homogéneamente recubierto de acuerdo con la presente invención, preferentemente, muestra una máxima cubierta con la proteína osteoinductiva sobre su superficie. Se entenderá que los polipéptidos osteoinductivos están no agregados y parcial o completamente inactivados debido a la precipitación o micro-precipitación.

El término "homogéneamente recubierto" u "homogéneamente distribuido' significa que el agente activo se distribuye homogéneamente dentro de la fase respectiva coincide con la descripción de los procedimientos de las realizaciones

(32)

y (33). Esto se puede lograr por la característica del agente activo que se disuelve en el polímero soluble en agua

o bien se adsorbe en la carga insoluble en agua lo que conduce a una suspensión de la carga insoluble en agua recubierta en el polímero soluble en agua. La distribución homogénea es un requisito previo para la liberación y la actividad eficaces del agente activo en el tejido que rodea la zona del implante. Además, se entenderá que el agente activo está no agregado y parcial o completamente inactivado debido a la precipitación o micro-precipitación, más bien la unión de proteínas no agregadas, biológicamente activas, que se logra por recubrimiento homogéneo.

El recubrimiento homogéneo del portador con dicho agente activo y la distribución simultánea y/o adicional del portador dentro del pOlímero insoluble en agua logra una estructura que actúa de dos formas: como una protección del agente activo y como una barrera de difusión para retardar la disolución de la proteína o péptido para lograr una liberación sostenida. Los procedimientos descritos (véase (32) y (33)) permiten la distribución homogénea y la inmovilización del agente activo osteoinductivo en y/o sobre el portador y la liberación sostenida del agente activo debido al componente polimérico como se muestra en la fig. 17.

Por otra parte, la eficacia del procedimiento de recubrimiento está apoyada por el portador debido a las fuerzas de capilaridad que resultan de la presencia de macro y microporos numerosos, preferentemente interconectados que debido a su tamaño pueden empapar las soluciones dentro de los poros.

Además, en contraste con otros procedimientos descritos en la técnica, por ejemplo, en el documento W098/21972, el agente activo se aplica (de acuerdo con los procedimientos de la presente invención) por unión a los portadores desde el estado soluble para lograr un recubrimiento homogéneo.

Los hallazgos que subyacen en la presente invención demuestran que la agregación de las proteínas se puede evitar en un sistema tri-componente por el uso de aditivos adecuados como se describe en el presente documento. Una importante condición previa es el conocimiento de la solubilidad del agente activo osteoinductivo dependiente de la naturaleza del disolvente, es decir, disolvente acuoso y/u orgánico, el valor del pH, la fuerza iónica y las superficies presentes. Para el procedimiento (33), el agente activo está de forma homogénea sobre el vehículo. Esta distribución homogénea se realiza como se describe, por ejemplo, en el documento WOO3/043673 usando una solución acuosa y un tampón. El término 'solución acuosa' especifica cualquier solución que comprende agua. La ralentización del incremento de pH provocada por el contacto de la solución de recubrimiento con los fosfatos de calcio en el portador que reacciona de forma alcalina, en particular, desempeña un papel importante durante el recubrimiento.

Los procedimientos (32) y (33) de la presente invención, distribuyen el agente activo de forma homogénea en toda la superficie interior del material portador y permiten la unión a la superficie antes de que tenga lugar una precipitación de dicha proteína dentro de la solución de recubrimiento. Para el procedimiento B, se pudo demostrar que el incremento de pH que tiene lugar durante el recubrimiento de fosfatos de calcio se decelera suficientemente por el uso de un ácido débil, tal como ácido acético. Además, la adición de compuestos orgánicos tales como etanol o sacarosa demuestra que es además ventajoso. Además, una fuerza iónica baja es una condición previa importante para el recubrimiento exitoso de la proteína o péptido sobre el fosfato de calcio. Además, nuestros ensayos muestran que el volumen de las soluciones de recubrimiento (solución que contiene agente activo y/o polímero), también tiene un efecto considerable sobre la calidad de ambos recubrimientos.

El término 'osteoconductivo' se refiere a sustratos que proporciona una estructura porosa favorable para infiltración celular de ingreso vascular y para la unión, formación de cartflago y depósito de tejido calcificado. Los materiales osteoconductivos pueden apoyar la generación ósea por medio del efecto de estructura (Kenley et al., 1993)

El término "osteoinductivo/a" se refiere a la capacidad de transformación de células madre mesenquimales en osteoblastos y condriocitos. Un requisito previo para la osteoinducción es una señal, que se distribuye por la pasta en los tejidos circundantes, donde los precursores de osteoblastos mencionados anteriormente se han activado. La osteoinducción como se usa en el presente documento abarca la diferenciación de células mesenquimales en las células precursoras óseas, los osteoblastos. Además, la osteoinducción también comprende la diferenciación de dichos osteoblastos en osteocitos, las células maduras del hueso. Además, la osteoinducción también abarca la diferenciación de células mesenquimales en condrocitos. En particular en los huesos largos, los condroblastos y los condrocitos que residen en el pericondrio del hueso también se pueden diferenciar en osteocitos. Por tanto, la osteoinducción requiere la diferenciación de células no diferenciadas o poco diferenciadas en osteocitos, que pueden formar el hueso. Por tanto, un requisito previo para la osteoinducción es una señal, que se distribuye por la pasta en los tejidos circundantes, donde los precursores de osteocitos mencionados anteriormente residen normalmente. Como se ha descrito anteriormente, las proteínas o péptidos osteoinductivos usado de acuerdo con la presente invención se liberan de forma sostenida desde la pasta, una vez dicha pasta ha formado in situ un armazón duro después del implante y dichas proteínas o péptidos osteoinductivos se distribuyen posteriormente de forma eficaz en los tejidos circundantes, como se muestra en la fig. 17.

El término "osteogénico/a' describe la síntesis de hueso nuevo por osteoblastos. De acuerdo con la presente invención, el hueso preexistente en el entorno en el lado del implante de la pasta crece dentro de la pasta endurecida usando la estructura de la pasta endurecida, especialmente formada durante el proceso de endurecimiento, como una matriz sobre la que se pueden adherir las células (por ejemplo, células óseas).

Las proteínas y péptidos comprendidos en la pasta de endurecimiento in situ de la presente invención tienen propiedades osteoinductivas in vivo. Por ejemplo, es muy conocido en la técnica que la superfamilia del factor de crecimiento de transformación 13 (TGF-I3) abarca miembros que tienen propiedades osteoinductivas. Los miembros individuales de la superfamilia del TGF-I3, que tienen propiedades osteoinductivas particularmente buenas se enumeran infra. En conclusión, las proteínas o péptidos osteoinductivos de la pasta de la presente invención después de que se han liberado del portador sirven como una señal osteoinductiva para los precursores de osteocitos del tejido que rodea el lado del implante de la pasta.

El término 'polipéptido osteoinductivo' se refiere a polipéptidos, tales como los miembros de la superfamilia del factor de crecimiento de transformación 13 (TGF-I3), que tienen propiedades osteoinductivas.

En otra realización preferida de la pasta o del procedimiento de la Invención, dicha proteína osteolnductiva es miembro de la familia de TGF-j3.

Se ha demostrado que la familia de TGF-13 de los factores de crecimiento y diferenciación está implicada en numerosos procesos biológicos que comprenden la formación de hueso. Todos los miembros de dicha familia son pOlipéptidos secretados que comprenden una estructura de dominio característica. En el extremo N-terminal, los miembros de la familia de TGF-13 comprenden un péptido señalo líder de secreción. Esta secuencia está seguida en el extremo C-terminal por el prodominio y por la secuencia del polipéptido maduro. La secuencia del polipéptido maduro comprende siete cisteínas conservadas, de las que se requieren seis para la formación de enlaces disulfuro intramoleculares mientras que se requiere una para la dimerización de dos polipéptidos. El miembro de la familia de TGF-¡3 biológicamente activo es un dímero, preferentemente compuesto de dos polipéptidos maduros. Los miembros de la familia de TGF-¡3 se secretan normalmente como proteínas que comprenden además de la secuencia madura el prodominio. Los prodominios se escinden extracelularmente y no forman parte de la molécula de señalización.

En el contexto de la presente invención, el término "miembro de la familia de TGF-¡3" o las proteínas de dicha familia mencionadas a continuación abarcan todas las variantes biológicamente activas de dichas proteínas o miembros y todas las variantes, así como sus precursores inactivos. Por tanto, las proteínas que comprenden simplemente la secuencia madura así como proteínas que comprenden la proteína madura y el prodominio o la proteína madura, el prodominio y la secuencia líder están dentro del alcance de la invención así como fragmentos biológicamente activos de las mismas. Si un fragmento de un miembro de TGF-¡3 tiene la actividad biológica se puede determinar fácilmente por ensayos biológicos descritos, por ejemplo en: Katagiri T, Yamaguchi A, Ikeda T, Yoshikl S, Wozney JM, Rosen V, Wang EA, Tanka H, Omura S, Suda T, (1990): The non-osteogenic mouse pluripotent cellline, C3H10T1/2, is induced to differentiate into osteoblastic cells by recombinant human bone morphogenetic protein-2. Biochem. Biophys. Res. Commun. 172: 295-299 o Nishitoh H, Ichijo H, Kimura M, Matsumoto T, Makishima F, Yamaguchi A, Yamashita H, Enomoto S, Miyazono K (1996): Identification of type serine/ threonine kinase receptors for growth/ differentiation factor-5. J. Biol. Chem. 271: 21345-21352).

Preferentemente, los modelos in vivo como se describen en los ejemplos que acompañan pueden determinar la actividad biológica de acuerdo con la invención. Además, la presente invención abarca variantes de los miembros de TGF-¡3 que tienen secuencias de aminoácidos que son al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idénticas a las secuencias de aminoácidos de los miembros de la familia de TGF-¡3.

Una visión general de los miembros de la superfamilia de TGF-¡3 se da en: Wozney JM, Rosen V (1998): Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair. Clin Orthop 346: 26-37. Las secuencias de aminoácidos de los miembros de la familia de TGF-j3 se pueden obtener a partir de bases de datos muy conocidas tales como Swiss-Prot a través de Internet (http://www.expasy.ch/sprotlsprot-top.html). También se conocen secuencias de aminoácidos para BMP-2, BMP-7 y GOF-5, miembros de la familia de TGF con un potencial osteoinductivo particularmente alto, en la SEC ID N.o: 1 a 3, respectivamente. También se conocen secuencias de aminoácidos para BMP-2, BMP-7 Y GOF-5, miembros de la familia de TGF-j3 con un potencial osteogénico particularmente alto, en la SEC ID N.o: 1 a 3, respectivamente.

Más preferentemente, dicho miembro de la superfamilia de TGF-¡3 es un miembro de la subfamilia de BMP. Se ha demostrado que los miembros de la subfamilia de la proteína morfogenética ósea (BMP) están implicados, entre otras, en la inducción y remodelación del tejido óseo. Las BMP se aislaron originalmente a partir de matriz ósea. Estas proteínas se caracterizan por su capacidad para inducir la formación de hueso nuevo en zonas ectópicas. Diversos estudios in vivo demostraron la promoción de osteogénesis y condrogénesis de células precursoras por las BMP e incrementan la posibilidad de que cada molécula de BMP tenga un papel distinto durante el desarrollo esquelético. Se describen más detalles sobre las propiedades moleculares y biológicas de las BMP en:

Wozney JM, Rosen V (1998): Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair. Clin Orthop 346:26-27, SchmittJ, Hwang K, Winn, SR, Hollinger J (1999): Bone morphogenetic proteins: an update on basic biology and clinical relevance. J Orthop Res 17: 269-278 y Lind M (1996): Growth factors: possible new clinical tools. A review. Acta Orthop Scand 67:407-17.

El polipéptido osteoinductivo de la presente invención se selecciona preferentemente del grupo que consiste en BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-ll, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15 YBMP-16. Lo más preferentemente, dicho miembro de la familia de BMP es BMP-2 o BMP-7.

La secuencia de aminoácidos para la preproforma de BMP-2 está depositada bajo el número de acceso de Swiss-Prot P12643 y se muestra a continuación. Los aminoácidos 1 a 23 corresponden a la secuencia señal, los aminoácidos 24 a 282 corresponden al propéptido y los aminoácidos 283 a 396 corresponden a la proteína madura. La secuencia de aminoácidos para la preproforma de BMP-7 está depositada bajo el número de acceso de Swiss-Prot P18075 o se muestra en SEC ID N.O: 2. Los aminoácidos 1 a 29 corresponden a la secuencia líder, los aminoácidos 30 a 292 corresponden al proforma y los aminoácidos 293 a 431 corresponden a la proteína madura. Preferentemente, BMP-2 o BMP-7 se refiere a la preproforma, a la proforma o al péptido de BMP-2 o BMP-7 maduro, respectivamente. Además, también se abarcan fragmentos de dichas proteínas que tienen esencialmente la misma actividad biológica, preferentemente propiedades osteoinductivas. A continuación se proporciona más información de secuencias para BMP-2 y BMP-7.

De forma alternativa, el polipéptido osteoinductivo de la presente invención se selecciona de otra familia de TGF-j3, es decir, la familia GOF.

Se ha demostrado que el factor de crecimiento y diferenciación (GOF) están implicados, entre otras, en la inducción y remodelación del tejido óseo. El factor de crecimiento y diferenciación 5 (GOF-5), también conocido como proteína morfogenética derivada de cartílago 1 (CDMP-1) es un miembro de un subgrupo de la familia de BMP, que también incluye otras proteínas relacionadas, preferentemente, GDF-6 y GDF-7. La forma madura de la proteína es un homodímero de 27 kDa. Diversos estudios in vivo e in vitro demuestran el papel de GDF-5 durante la formación de diferentes características morfológicas en el esqueleto de un mamífero. Las mutaciones de GDF-5 son responsables

5 de anomalías esqueléticas, incluyendo disminución de la longitud de los huesos largos de las extremidades, el desarrollo de articulación anormal en las extremidades y el esternón (Storm y Kingsley (1999), Development Biology, 209, 11-27). La secuencia de aminoácidos entre ratón y humano está altamente conservada.

Preferentemente, el polipéptido osteoinductivo de la presente invención se selecciona del grupo que consiste en GDF-1, GDF-2, GDF-3, GDF-4, GDF-5, GDF-6, GDF-7, GDF-8, GDF-9, GDF-10 Y GDF-11. Lo más preferentemente,

10 dicho miembro de la subfamilia GDF es GDF-5. La secuencia de aminoácidos para la preproforma de GDF-5 está depositada bajo el número de acceso de Swiss-Prot P 43026 o se muestra en la SEC ID N.o: 3. Los aminoácidos 1 a 27 corresponden a la secuencia líder, los aminoácidos 28 a 381 corresponden a la proforma y los aminoácidos 382 a 501 corresponden a la proteína madura. Preferentemente, el GDF-5 se refiere a la preproforma, a la proforma o al péptido GDF-5 maduro. Además, también se abarcan los fragmentos de GDF-5 que tienen esencialmente la misma actividad

15 biológica, preferentemente propiedades osteoinductivas. Lo más preferentemente, dicho fragmento comprende los aminoácidos 383 a 501 de la secuencia mostrada en SEC ID N.o: 3.

Las siguientes tablas muestran las secuencias de aminoácidos para BMP-2, BMP-7 Y GDF-5: BMP-2 humano (Swiss-Prot, número de acceso primario P12643); SEC ID N.o. 1:

Clave 5 Desde Hasta Longitud

SEÑAL 1 23 10 23

PROPEP 24 282 259

15 hBMP2 283 396 114

10 20 30 40 50 60

I J I I I I

MVAGTRCLLA LLLPQVLLGG AAGLVPELGR RKFAAASSGR PSSQPSDEVL SEE'ELRLLSM 70 80 90 100 110 120

I I I I I I

FGLKQRPTPS RDAVVPPYML DLYRRHSGQP GSPAPDHRLE RAASRANTVR SFHHEESLEE 130 140 150 160 170 180

I I I I I I

LPETSGKTTR RFFFNLSSIP TEEFITSAEL QVFREQMQDA LGNNSSFHHR INlYEIIKPA

190 200 210 220 230 240

I I I I I I

TANSKFPVTR LLOTRLVNQN ASRWESFDVT PAVMRWTAQG HANHGFVVEV AHLEEKQGVS 250 260 270 280 290 300

I I I I I

J

KRHVRISRSL HQDEHSWSQI RPLLVTFGHD GKGHPLHKRE KRQAKHKQRK RLKSSCKRHP

310 320 330 340 350 360 I I I I I I

LYVDFSDVGW NDWIVAPPGY HAFYCHGECP FPLADHLNST NHAIVQTLVN SVNSKIPKAC 370 380 390

I I I

CVPTELSAIS MLYLDENEKV VLKNYQDMVV EGCGCR

20 Referencias

[1 ]

SECUENCIA DE ÁCIDO NUCLEICO. MEDLlNE=89072730; PubMed=3201241;

Wozney J.M., Rosen V., Celeste A.J., Mitsock L.M., Whitters M.J., Kriz R.W., Hewick R.M., Wang E.A.;

25 "Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities."; Science 242:1528-1534(1988).

[2]

CRISTALOGRAFíA DE RAYOS X (2,7 ANGSTROMS) DE 292-396. MEDLlNE=99175323; PubMed=1 007441 O; Scheufler C., Sebald W-, Huelsmeyer M.; "Crystal structure of human bone morphogenetic protein-2 at 2.7 A resolution.";

J.

Mol. Biol. 287:103-115 (1999). BMP-7 humano (Swiss-Prot, número de acceso primario: P18075); SEC ID N.o. 2:

10

Clave Desde Longitud Hasta

15

SEÑAL 1 29 PROPEP 30 263 29 292

20

hBMP-7 293 139 431

10 20 I I MHV~LRAAA PHSFVALWAE?

70 I

80 I

I

LFLLRSALAD

I

ILGLPHRPRP

I

LQDSHFLTDA

r

lRERFDNETF

I

HNLGLQLSVE

I

QNRSKTPKNQ

370 I GECAFPLNSY

I

RNMVVRACGC

HLQGKHNSAP MFMLOLYNAM

I

DMVMSFVNLV

r

RISVYQVLQE

I

TLOGQSINPK

I

EALRMANVAE

380 I MNATNHAIVQ

H

I

EHDKEFFHPR

I

HLGRESDLFL

I

LAGLIGRHGP

I

NSSSDQRQAC

390 I TLVHFINPET

I

FSLDNEVHSS

I

AVEEGGGPGG

I

YHHREFRFDL

r

LDSRTLWASE

I

QNKQPFMVAF

I

KKHELYVSFR

400 I VPKPCCAPTQ

50 60

I I

FIHRRLRSQE RREMQREILS

110 120

,

I

QGFSYPYKAV FSTQGPPLAS

170 180 I I

SKIPEGEAVT AAEFRIYKDY

230 240

,

r

EGWLVFDITA TSNHWVVNPR

290 300

I I

FKATEVHFRS IR~TGSKQR.9

350 360

I I

DLGWQD~lIIA PEGYAAYYC E

410 420 I 1 LNAISVLYFO DSSNVILKKY

Referencias

[1] SECUENCIA DE ÁCIDOS NUCLEICOS, y SECUENCIA PARCIAL. TEJIDO=Placenta;

5 MEDLlNE=90291971; PubMed=2357959; Oezkaynak E., Rueger D.C., Drier EA, Corbett C., Ridge A.J., Sampath T.K., Oppermann H.; 'OP-1 cDNA encodes an osteogenic protein in the TGF-beta family."; EMBO J. 9:2085-2093(1990).

10 [2] SECUENCIA DE ÁCIDO NUCLEICO. MEDLlNE=910 8 8608; PubMed=22 63 63 6; Celeste A.J., lannazzi JA, Taylor A.C., Hewick A.M., Rosen V., Wang EA, Wozney J.M.; "Identification of transforming growth factor beta family members present in bone-inductive protein purified from bovine

15 bone."; Proc. Nat!. Acad. Sci. U.SA 87:9843-9847(1990).

[3] CRISTALOGRAFíA DE RAYOS X (2,8 ANGSTROMS) DE 293-431.

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growth factor beta superfamily."; Proc. Nat!. Acad. Sci. U.S.A. 93:878-883(1996). 25 GDF-5 humano (Swiss-Prot, número de acceso primario: P 43026); SEC ID N.O 3:

Clave Desde Hasta Longitud

30 SEÑAL 1 27 27

PROPEP 35 28 381 354

hGDF-5 382 501 40 120

10 20 30 40 50 60

I I I I I I

MRLPKLLTFL LWYLAWLDLE FICTVLGAPD LGQRPQGSRP GLAKAEAKER PPLARNVFRP 70 eo 90 100 110 120 I I I I I

GGHSYGGGAT NANARAKGGT GQTGGLTQPK KDEPKKLPPR PGGPEPKPGH PPQTRQATAR 130 140 150 160 170 180

,

I I I I I

TVTJ?KGQLl?G GKAPPKAGSV PSSFLLKKAR EPGPPREPKE PFRPPPITPH EYMLSLYRTL

190 200 210 220 230 240

I I I I I

I

SDADRKGGNS SVKLEAGLAN TITSFIDKGQ DDRGPVVRKQ RYVFDISALE KDGLLGAELR 250 260 270 290 290 300

, I

I I I I

ILRKKPSDTA KPAVPRSRRA AQLKLSSCPS GRQPAALLOV RSVPGLDGSG WEVFDIWKLF 310 320 330 340 350 360

I I I I f

RNFKNSAQLC LELEAWERGR TVDLRGLGFD RAARQVHEKA LFLVFGRTKK RDLFFNEtKA 370 380 390 400 410 420

I I , I I I

RSGQDDKTVY EYLFSQRRKR RAPLATRQGK RPSKNLKARC SRKALHVNFK DMGWDDWIIA 430 440 450 460 470 480

, I I , J ,

PLEYEAFHCE GLCEFPLRSH LEPTNHAVIQ TLMNSMDPES TPPTCCVPTR LSPISILFIO· 490 500

,

I SANNVVYKQY EDMVVESCGC R

Referencias

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J. Biol. Chem. 269:28227-28234(1994).

La presente invención también abarca realizaciones, en las que dicho agente activo se selecciona de hormonas, 5 citocinas, factores de crecimiento, antibióticos y otras sustancias de fármacos naturales y/o sintetizadas tales como esteroides, prostaglandinas, etc.

Preferentemente, dicho agente activo es la hormona paratiroidea (PTH) y/o el péptido PTH 1-34.

En otra realización de la invención, el agente activo es una proteína "inductiva de cartílago' o 'regeneradora de cartílago' . Una proteína inductiva de cartílago preferida es MIA/CD-RAP (MIA, actividad inhibidora de melanoma, 10 proteína sensible a ácido retinoico derivada de cartílago), más preferentemente MIA/CD-RAP humana.

La secuencia de aminoácidos para la preproforma de MIA/CD-RAP está depositada bajo el número de acceso de Swiss-Prot Q 16674 o se muestra en la SEC ID N.o: 4. Los aminoácidos 1 a 24 corresponden a la secuencia señal, los aminoácidos 25 a 131 corresponden a la secuencia de codificación.

La siguiente tabla muestra las secuencias de aminoácidos para MIA/CD-RAP:

15 MIA/CD-RAP humana (Swiss-Prot, número de acceso primario: Q 16674); SEC ID N.o 4:

Clave

Desde Hasta

Longitud

20 SEÑAL 1 24 24

h MIA/CD-RAP

25 25 131

MARSLVCL.GVlILlSAFSGPGVRGGPMPKLADRKLCADOECSHPlSMAVAlQOYMAPDCR

FLTIHRGQWVVFSKLKGRGRlFWGGSVOOOVYGDlAARlGYFPSSIVREDOTlKPGKVD

VKTDKWDFYCQ

G. Preparaciones específicas e ingredientes opcionales

La pasta de la presente invención, opcionalmente, puede comprender excipientes adicionales. Estos excipientes

30 sirven para la estabilización de la proteína o péptido, por ejemplo, sacáridos, aminoácidos, polioles, detergentes o el mantenimiento del pH, por ejemplo, sustancias tampón. Otros componentes de la pasta de formación in situ podrían ser promotores de endurecimiento, tales como fosfato de sodio, Na2HP04 o citrato de sodio y los otros descritos anteriormente.

Los procedimientos (31) a (34) de la presente invención permiten no usar disolventes orgánicos tóxicos (ver a

35 continuación), por ejemplo, el uso de dimetilsulfóxido, anisol o ácido glacial. Los disolventes tóxicos, sin embargo, se usan sistemáticamente en los procedimientos descritos en la técnica. Normalmente, dañan la proteína durante el contacto y/o en especial durante el secado, pero este daño se evita sorprendentemente usando la técnica de secado especial de la presente invención, ya que el agente activo se adsorbe /0 se une al portador sólido inorgánico.

En una realización preferida del procedimiento (33) de la invención, dicho tampón tiene una concentración de tampón

40 de 10 mmol/I para lograr una solubilidad suficiente del agente activo durante el proceso de adsorción y para evitar cualquier modificación de la ¡3-TCP cerámica de calcio monofásica. El valor del pH de los cambios en la solución se controló durante el proceso de recubrimiento y secado desde pH 3 hasta pH 7. El cambio en el pH provoca una reducción de la solubilidad del factor de crecimiento óseo homogénea, definida en la TCP.

El término "Irquido viscoso" significa un líquido con una disminución en la fluidez en comparación con el agua. Por 45 ejemplo, un líquido viscoso de acuerdo con la presente invención se refiere a una consistencia similar a la miel a temperatura ambiente, lo que permite una administración sencilla.

En otra realización preferida del procedimiento de la invención, dicha solución que contiene tampón para el procedimiento (33) comprende un poliol y/o alcohol. Los alcoholes o polio les adecuados son muy conocidos en la técnica y se describen en libros de texto estándar, tales como Rompp, diccionario de química. Más preferentemente, dicho alcohol es etanol y dicho poliol es manitol.

En una realización más preferida, la concentración del poliol y o del alcohol es de entre un Oy un 10 % (p/v).

El término "sacáridos· abarca mono-, di-y polisacáridos. La estructura y composición de mono-, di-y polisacáridos son muy conocidas en la técnica y se describen en libros de texto estándar, tales como R6mpp, diccionario de química.

Más preferentemente, dicho sacárido es un disacárido. Lo más preferentemente, dicho disacárido es sacarosa o trehalosa.

Otros medios y procedimientos para controlar la distribución homogénea, la cuantificación y la caracterización del agente activo se describen en los ejemplos que acompañan.

Sorprendentemente, los agentes activos, en particular, sorprendentemente, las proteínas, cuando se adsorben sobre la superficie de portadores I cargas cerámicas son mucho más resistentes frente a la degradación provocada por disolventes orgánicos que las proteínas disueltas libremente o suspendidas en soluciones orgánicas o integradas en sistemas de emulsión bifásicos. Por tanto, este aspecto de la invención abre una nueva posibilidad de producir sistemas de administración de fármaco basados en polímeros para proteínas sin desnaturalización nilo modificación de polipéptidos en sistemas orgánicos singulares o multifase.

Todas las proteínas, polipéptidos y fármacos de moléculas pequeñas son adecuados para uno de los dos procedimientos de la presente invención como agentes activos. En especial, estos agentes activos con poca o ninguna afinidad por matrices de portadores inorgánicos se pueden inmovilizar en el material de poli mero -compuesto de fosfato de calcio. Preferentemente, la unión de dicho agente activo al vehículo es reversible.

Por lo tanto, se permite la disolución de dicho agente activo una vez se ha llevado la pasta a un entorno in vivo adecuado, tal como una cavidad ósea o dentro de un entorno acuoso intramuscular o subcutáneo. La pasta de endurecimiento in situ se endurece por difusión del plastificante fuera del polímero insoluble en agua, mientras que los fluidos corporales acuosos se difunden en el polímero insoluble en agua. En consecuencia, el polímero solidifica debido a su insolubilidad en agua (Shively et al., 1995).

Más preferentemente, dicha disolución de los compuestos inmovilizados es una liberación sostenida que permite la difusión del agente activo en el tejido, lo que rodea la pasta endurecida. Por tanto, la pasta endurecida es adecuada para servir como fuente in vivo para, por ejemplo, péptidos, antibióticos, fármacos de moléculas pequeñas o proteínas osteoinductivas, que se liberan lentamente y que, por tanto, se puede distribuir eficazmente en los tejidos circundantes

o que tienen un efecto en la forma inmovilizada.

El poli mero insoluble en agua y la carga junto con el plastificante forman el material de pasta de portadorl polímero compuesto de la presente invención, que se une a un agente activo para dar como resultado la pasta de la presente invención, lo que permite la liberación sostenida de dicho agente activo in vivo, una vez se endurece la pasta en pocos minutos a horas por difusión fuera del polímero soluble en agua (plastificante) mientras que los fluidos corporales acuosos se difunden en el polfmero. En consecuencia, el polímero solidifica debido a su insolubilidad en agua (Shively et al., 1995). Se puede controlar el tiempo hasta que se alcanza la estabilidad mecánica completa por la variación de los ingredientes del material de implante.

El término "tampón" que ayuda a mantener el agente activo disuelto en soluciones acuosas durante un tiempo suficiente para permitir el "recubrimiento homogéneo· se refiere a un componente que permite que el agente activo osteoinductivo se disuelva eficazmente y se mantenga en la solución. Este tampón puede evitar y o equilibrar el incremento de pH provocado al poner en contacto la solución con el portador de fosfato de calcio para que la proteína no precipite inmediatamente, por ejemplo, debido a un incremento de pH. El experto en la técnica puede determinar dicho tampón considerando la solubilidad de la proteína osteoinductiva (que depende del pH y de la fuerza iónica) y la influencia del portador sobre dichos parámetros después de poner en contacto el portador con dicha solución que contiene el tampón. De acuerdo con la presente invención, se ha encontrado que se necesita un tampón adecuado para la distribución homogénea del agente activo sobre la superficie del portador, por ejemplo, fosfato de calcio, comprendiendo preferentemente dicho tampón un ácido débil, un alcohol y un sacárido.

H. Aplicaciones farmacéuticas

La invención abarca una composición farmacéutica que comprende la pasta de la invención o una pasta, que se puede obtener por el procedimiento de la invención.

El producto de la presente invención se puede formular como una composición farmacéutica o un dispositivo médico. La composición de dicho producto puede comprender compuestos adicionales como estabilizadores, sustancias tampón y otros excipientes. La cantidad del producto de la presente invención aplicada al paciente se determinará por el médico encargado y otros factores clínicos; preferentemente, de acuerdo con cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente. Como es bien conocido en las técnicas médicas, la cantidad aplicada a un paciente depende de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, el área de superficie corporal, la edad, sexo, tiempo y vía de administración, condiciones de salud general, y otros fármacos que se están administrando simultáneamente. Se puede monitorizar el progreso por una evaluación periódica. Gracias a la presente invención es posible tener un sistema, que permite atender defectos dentales u ortopédicos por la adaptación óptima del material similar a pasta a la zona de implante y al mismo tiempo una liberación controlada de un agente activo.

Preferentemente, el procedimiento de aplicación es mínimamente invasivo, incluso más preferible, la aplicación se aplica por inyección.

Gracias a la presente invención, es posible tratar diversos defectos óseos incluyendo cavidades grandes de un nuevo modo. En particular, las grandes cavidades no se pudieron tratar eficazmente o sólo con el uso de material óseo autógeno. Sin embargo, debido a las propiedades osteoinductivas y/o osteoconductivas fiables y eficaces de la pasta de la presente invención o del dispositivo que se pueden obtener por el procedimiento de la invención, el tratamiento de defectos óseos que requiere un aumento o reparación ósea extensa ha pasado a ser posible ahora sin una segunda cirugía.

La invención también abarca el uso de la pasta de la invención o una pasta que se puede obtener por el procedimiento de la invención para la preparación de una composición farmacéutica para el aumento óseo.

El término "aumento óseo· se refiere a la formación inducida de hueso, que está indicada para tratar defectos óseos, cavidades en huesos, o para tratar enfermedades y trastornos acompañados con pérdida de tejido óseo o para preparar el posterior curado de un implante. Las enfermedades y trastornos descritos a continuación son muy conocidos en la técnica y se describen en detalle en libros médicos estándar, tales como Pschyrembel o Stedman.

Preferentemente, dicho aumento óseo sigue a defectos traumáticos, malignos o artificiales.

Otra realización de la presente invención se refiere al uso de la pasta de la invención o a la preparación de una composición farmacéutica para tratar defectos óseos.

Más preferentemente, dichos defectos óseos incluyen fracturas tales como fractura de radio y fractura de cabeza de tibia, reparación sin fractura, fusión vertebral, defectos de hueso largo o defectos óseos que siguen a apicoectomía, extirpación de quistes o tumores, extracción dental, o extirpación quirúrgica de dientes retenidos.

La invención también se refiere al uso de la pasta de la invención para llenar cavidades y apoyar la regeneración de tejidos guiada en periodontología.

Otra realización de la presente invención se refiere al uso de la pasta de la invención para la preparación de una composición farmacéutica para la elevación del suelo sinusal, el aumento de la mandíbula atrofiada y reborde mandibular y la estabilización de los implantes inmediatos.

Dentro del alcance de la presente invención también está un procedimiento para tratar una o más de las enfermedades mencionadas, de acuerdo con los usos de la presente invención, en el que dicho procedimiento comprende al menos la etapa de administrar la pasta de la invención en una forma farmacéuticamente aceptable a un sujeto. Preferentemente, dicho sujeto es un ser humano.

Finalmente, la invención se refiere a un kit que comprende la pasta de la invención. Los ingredientes del kit se describen además anteriormente.

Las partes del kit de la invención se pueden envasar individualmente en viales u otros medios apropiados, dependiendo del ingrediente respectivo o en combinación con recipientes o unidades con múltiples recipientes adecuadas. La fabricación del kit sigue preferentemente procedimientos estándar, que son conocidos para el experto en la técnica.

1) Beneficios de la pasta de endurecimiento in situ de la presente Invención

De acuerdo con la presente invención, se pudo desarrollar una pasta de endurecimiento in situ con resistencia de lavado excelente debido al curado rápido, lo que permite que la pasta premezclada, tal como pasta que contiene CPC, se forme estable en un entorno húmedo (por ejemplo, indicaciones con sangrado grave) antes de que se complete el endurecimiento. Estas pastas premezcladas de acuerdo con la presente invención tienen la ventaja de que presentan un tiempo ilimitado para la aplicación y modulación y el polímero que contiene el portador sólido insoluble en agua comienza a endurecerse después de que se llegue a exponer al agua o fluido corporal del tejido circundante.

Gracias a la presente invención, se pudo generar una pasta de endurecimiento in situ moldeable preferentemente inyectable, de autoendurecimiento y reabsorbible evitando las desventajas tales como la fragilidad de las composiciones de CPC con mejores propiedades mecánicas que las composiciones de CPC convencionales.

Preferentemente, con la selección del plastificante, tal como PEG 400, PEG 200, PEG 300, PEG 600 o glicerol, se pudo mejorar además la resistencia mecánica después de la disipación del plastificante. Los inventores han encontrado que dependiendo del polímero usado el plastificante tiene un impacto en la temperatura de transición vítrea del polímero en el implante endurecido, lo que influye en la resistencia mecánica de la pasta de endurecimiento in situ. Este impacto es diferente para los diferentes plastificantes usados. Sorprendentemente, el PEG fue el plastificante con el menor impacto en el polímero usado (fig. 9). El DMSO, que es un plastificante preferido para disolver los copolímeros de bloque debido a que por sus características de solubilidad es comparable a PEG respecto al impacto sobre la disminución de la temperatura de transición vítrea del polímero y, por lo tanto, la resistencia mecánica de la pasta de endurecimiento in situ.

Además, la pasta de compuesto cerámico/polimérico de la presente invención muestra una estabilidad mecánica mejorada en comparación con los sistemas de flujo convencionales usando matrices poliméricas para la liberación retardada.

Preferentemente, la pasta de endurecimiento in situ tiene una dureza de un 20 % en una hora determinada por el procedimiento muy conocido por el experto en el campo y descrito además en el ejemplo 12, más preferentemente de un 30 % tras una hora, lo más preferentemente de un 40 % en una hora después del contacto con un medio acuoso.

De acuerdo con la presente invención, la pasta de endurecimiento in situ es superior sobre los sistemas de flujo convencionales tales como CPC (fig. 13, barra blanca) o los sistemas de polímero libres de fosfato de calcio (fig. 13, barra gris) con respecto a la resistencia mecánica inicial en una hora después de haber estado en contacto con un medio acuoso o fluido corporal, como se muestra en la fig. 13.

El material de portador de compuesto cerámico/polimérico de la presente invención muestra una estabilidad mecánica mejorada en comparación con los sistemas convencionales usando matrices poliméricas para la liberación retardada. En realizaciones porosas, la matriz de compuesto tiene en cuenta las propiedades osteoconductivas mejoradas en comparación con los sistemas de la técnica anterior, debido al sistema poroso, en particular libre de poros interconectados.

El material de portador de compuesto cerámico/polimérico de la presente invención es adecuado para sustituir gránulos poliméricos de encapsulado convencionales importantes para la liberación retardada. Debido al contenido del portador cerámico del sistema (portador cerámico más recubrimiento polimérico), la cantidad de polímero se puede reducir significativamente en comparación con los sistemas de flujo convencionales basados totalmente en polímeros usando matrices poliméricas. La cantidad reducida de polimero conduce a una reducción en el riesgo de citotoxicidad. Otro aspecto de la invención es el incremento en la estabilidad mecánica del material compuesto en comparación con los armazones basados totalmente en polímeros.

Ahora se describirá la invención por referencia a los siguientes ejemplos que son meramente ilustrativos y que no deben limitar el alcance de la presente invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: Recubrimiento de polvo de beta-TCP con rhGOF-5

Se pipetearon 333 mg de beta-TCP y 147 IJI de rhGDF-5 en HCI10 mM (3,4 mg/ml) sobre la beta-TCP y se absorbió. Se incubó el polvo húmedo durante aprox. 1 hora a 25 oC y se secó en una etapa de liofilización posterior.

Ejemplo 2: Preparación de un IFS (rhGOF-5/ beta-TCP / PLGA / PEG 400)

Se disolvieron 167 IJI de PEG 400 Y 83 mg de PLGA calentando suavemente hasta conseguir una solución viscosa. Después de enfriar a temperatura ambiente, se añadieron 333 mg de polvo beta-TCP recubierto con rhGDF-5 bajo agitación continua hasta conseguir una pasta homogénea.

Ejemplo 3: Preparación del IFS (beta-TCP / PLGA / PEG 400)

Se disolvieron 1 mi de PEG 400 Y 500 mg de PLGA calentando suavemente hasta conseguir una solución viscosa. Después de enfriar a temperatura ambiente, se añadieron 2000 mg de polvo beta-TCP bajo agitación continua hasta conseguir una pasta homogénea.

Ejemplo 4: Extracción de la protefna Inmovilizada

(etapa A)

Extracción de 417 mg de muestra de prueba endurecida (1 h, a 4 OC) en 1 mi de solución en cloroformo para disolver el polímero. Después de retirar la solución de cloroformo-polímero, se retiró el cloroformo residual en un desecador a vacío.

(etapa B)

Para la extracción de la proteína inmovilizada de la beta-TCP, se sumergió la muestra resultante de la etapa A (gránulos recubiertos y libres de polímero) en urea 8 M, Tris 10 mM, EDTA 100 mM durante 1 ha 4 oC.

En la etapa posterior, se centrifugó la solución (9300· g, 3 min). Se cuantificaron el contenido en proteína y los productos de degradación en el sobrenadante por RP-HPLC.

Ejemplo 5: Preparación de muestras de prueba

El endurecimiento de las muestras de prueba tiene lugar por sustitución del PEG con agua del fluido corporal. Bajo condiciones fisiológicas simuladas, se representó el fluido corporal por solución salina tamponada con fosfato (PBS).

5 Después de vaciar la pasta en un molde hueco, se endureció posteriormente la pasta incubando el molde hueco en PBS durante la agitación suave del PBS para apoyar la difusión de PEG fuera de la muestra de prueba. La dureza final se alcanzó ya después de tres horas a temperatura ambiente.

Ejemplo 6: Propiedades mecánicas mejoradas por variación del tamaño de grano de beta-TCP

Se usaron diferentes tamaños de grano:

10 • beta-TCP de aproximadamente 10 -100 IJm

• beta-TCP de aproximadamente 100 -300 IJm

• beta-TCP de aproximadamente 10 IJm Ejemplo 7: Propiedades mecánicas mejoradas por la variación del contenido en polímero Se preparan las diferentes pastas por variación del procedimiento descrito en el ejemplo 3. Para la fabricación de las

15 muestras de prueba se endureció la pasta de acuerdo con el ejemplo 5. Se determinó la estabilidad mecánica como se describe en el ejemplo 9. Tabla 1: composición de la pasta:

14% PLGA

29 % PEG 57 % beta-TCP

18 % PLGA

29% PEG 53 % beta-TCP

~1 % PLGA

29% PEG 50 % beta-TCP

~5%PLGA

29% PEG 46 % beta-TCP

Tabla 2: composición de muestras de prueba endurecidas:

20 % PLGA

80 % beta-TCP

~5 % PLGA

175 % beta-TCP

130 % PLGA

~O % beta-TCP

135 % PLGA

155 % beta-TCP

Ejemplo 8: Propiedades mecánicas mejoradas por la variación del contenido en polímero 20 Se usaron diferentes calidades de PLGA para fabricar los cuerpos de prueba

Tipo de PLGA

peso molecular [g/mol]

~O % PLGA (Resomer® RG 503 H)

34000

~O % PLGA (Resomer® RG 502 H)

18600

Ejemplo 9: Determinación del tamaño de poro y de la orientación de poro

Durante el endurecimiento de las muestras de prueba de acuerdo con el ejemplo 5, se forma la porosidad estructurada. Se determinaron el tamaño de poro y la orientación de poro por la composición de la pasta por el contenido en

25 plastificante soluble en agua. Se sometieron a prueba y se analizaron diversas formulaciones. Se analizaron el tamaño de poro y la estructura por microscopía de luz y por microscopía electrónica de trama de diversas secciones cruzadas a través de las muestras de prueba.

Se formaron los poros de interconexión estructurados en la dirección al tejido circundante. Se determinó el tamaño de poro. Los poros estructurados permiten un movimiento rápido celular guiado en el núcleo del armazón para apoyar la sustitución y la vascularización acelerada con tejido nuevo.

Ejemplo 10: Selección de diferentes composiciones analizadas del IFS

polímero

(% (p)] disolvente orgánico (%(p)] Carga inorgánica (% (p)] agente de formación de poros (% (p)]

PLGA RG 503H

11,0 PEG 400 44,5 CPC 44,5

16,0

60,0 24,0

19,4

44,5 36,1

20,0

50,0 30,0

22,2

44,5 ~-TCP 33,3

44,5

a-TCP 33,3

22,0

44,0 33,0 CMC 1,0

44,5

CPC 33,3 - -

22,0

44,1 33,0 PEG 4000 en polvo 0,9

22,0

44,1 33,0 PEG 4000 disuelto 0,9

21,5

43,2 32,3 PEG 4000 disuelto 3,0

22,0

44,1 33,0 PEG 10000 en polvo 0,9

22,0

44,1 33,0 PEG 10000 disuelto 0,9

21,5

43,2 32,3 PEG 10000 disuelto 3,0

22,0

44,1 33,1 NMP 0,8

21,1

42,3 31,6 CaS04 5,0

18,4

37,0 27,6 NaCI 17,0

18,4

37,0 27,6 sacarosa 17,0

22,0

44,0 33,0 Quitosano 1,0

21,6

43,4 32,5 2,5

21,1

42,3 31,6 5,0

22,0

44,0 33,0 PVP en polvo 1,0

21,6

43,4 32,5 PVP en polvo 2,5

21,1

42,3 31,6 PVP en polvo 5,0

22,0

44,0 33,0 Pluronic F68 1,0

22,2

44,4 33,3 [Tween 80 0,1

22,0

44,0 33,0 CMC 1,0

21,8

43,7 32,7 1,8

21,6

43,4 32,5 2,5

21,1

42,3 31,6 5,0

25,0

30,5 - -

38,8

16,7

(continuación)

polímero

[% (p)] disolvente orgánico [% (p)] Carga inorgánica [% (p)] agente de formación de poros [% (p)]

PLGA RG 503H

121,5 PEG 400 ~3, 2 CPC 132,3 32,0 NaHCO:¡/ NaH2P04 1,0/2,0

121 ,3

~2,7 12,0/2,0

121,1

42,3 31,6 2,0/3,0

120,9

41,8 31 ,3 3,0/3,0

120,9

41,8 31,3 ~, 0/2, 0

12°,4

40,9 30,7 5,0/3,0

PLGA RG 503

~2,2 PEG 400 44,5 33,3 - -

PLGA RG ~02

PLGA RG ~56

PLGA-PEG ~opolímero ~e dibloque

3,8 DMSO 44,1

7,6

47,9

11,4

51,7

PLGA RG ~03H

122,2 NMP ~, 5 33,3 -

RG503H; PLGA; composición polimérica: 48-52 % mol de D,L-Iáctido y 48-52 % mol de glicólido; viscosidad inherente: 0,32-0,44 dl/g, 25 oC, 0,1 % en CHCI3; (Boehringer, Ingelheim)

RG502H; PLGA; composición polimérica: 48-52 % mol de D,L-Iáctido y 48-52 % mol de gllcólido; viscosidad Inherente: 5 0,16-0,24 dl/g, 25 oC, 0,1 % en CHCb: (Boehringer, Ingelheim)

RG503; PLGA; composición polimérica: 48-52 % mol de D,L-Iáctido y 48-52 % mol de glicólido; viscosidad inherente: 0,32-0,44 dl/g, 25 oC, 0,1 % en CHCI3; (Boehringer, Ingelheim)

RG502; PLGA; composición polimérica: 48-52 % mol de D,L-Iáctido y 48-52 % mol de glicólido; viscosidad inherente: 0,16-0,24 dl/g, 25 oC, 0,1 % en CHCb; (Boehringer, Ingelheim)

10 Ejemplo 11: Preparación dellFS

Inicialmente, se pesó la cantidad obligada de disolvente orgánico en un crisol de porcelana. En una segunda etapa, se añadió el polímero. Se homogeneizaron estos dos componentes y se calentaron a una temperatura de aproximadamente 60 oC hasta que se disolvió completamente el polímero en el disolvente orgánico. Posteriormente, la carga inorgánica (por ejemplo, TCP o un cemento de fosfato de calcio, por ejemplo, que consistía en un 62,5 % en

15 peso de fosfato de tricalcio alfa, 26,8 % en peso de fosfato de dicalcio anhidro (DCPA), 8,9 % en peso de carbonato de calcio (CaC03), y un 1,8 % en peso de hidroxiapatita (HA)) y opcionalmente otros excipientes (por ejemplo, agentes de formación de poros como sal sódica de carboximetilcelulosa) se dispersaron en la solución polimérica.

Ejemplo 12: Prueba mecánica del IFS (y sistemas relacionados)

EIIFS en su forma pastosa, preparada como se describe en el ejemplo 11 , se transfirió a una jeringuilla. Por lo tanto, se

20 facilitó el llenado de la formulación en los pocillos de una placa de 96 pocillos. Posteriormente, la placa de 96 pocillos, que contenía los especímenes de IFS pastoso (150 -200 mg por pocillo), se transfirió en un baño de incubación, que permaneció constantemente a 37 oC para simular condiciones fisiológicas, mientras que el tampón de PBS sirve como medio de incubación. En tiempos predefinidos, se retiró la placa de 96 pocillos del baño de incubación para llevar a cabo las pruebas mecánicas. Se sometió a prueba la dureza de los especímenes usando un TH 2730 (Fa Thuemler).

25 Sustancialmente, este aparato consiste en una herramienta de punzonado metálica, que permite aplicar a fuerzas compresivas sobre los especímenes y un transductor-LVDT, que sirve para controlar y medir la fuerza aplicada y para determinar la distancia, cubierta durante la medida. Antes de someter a prueba los diferentes especímenes, se ha de definir la altura (hl) de un pocillo que no contiene ningún espécimen. Por lo tanto, se fijó el punto de partida de la herramienta de punzonado para las siguientes medidas. La determinación real de la dureza de los especímenes

30 abarca dos etapas. En una primera medida, se ha de determinar la altura del espécimen particular (h2), mientras que la velocidad de la cruceta de la herramienta de punzonado fue de 40 mm por minuto y la fuerza aplicada se limitó a 0,2 N. Se llevó a cabo una segunda medida para determinar la distancia (d), cubierta por la herramienta de punzonado dentro del espécimen durante un periodo de 30 segundos, donde se mantuvo constante la fuerza aplicada a 20 N. Se calculó la dureza del espécimen de la siguiente manera:

dureza [%] = (h2 -d)/ h2 • 100 %

El procedimiento descrito se basó en la determinación de la dureza de acuerdo con Shore (DI N 53505).

Ejemplo 13: Preparación del IFS (con un agente activo, para pruebas in vitro, que requieren condiciones estériles)

Se han de esterilizar las materias primas de manera adecuada. Inicialmente, se colocaron 500 mg de a-TCP (100 -350 IJm de tamaño de gránulos) en una forma seca en un vidrio 2R. Se diluyó la solución madre de rhGDF-5 (3,4 mg/ml en HCI10 mM) hasta 0,54 IJg/m I con el medio del correspondiente tampón de recubrimiento. Se pipetearon 4751J1 de la solución de rhGDF-5 obtenida de ese modo sobre la a-TCP y se absorbió. Se incubó el granulado húmedo durante 1 hora a 25°C y después se liofilizó. Al usar a-TCP sola como carga inorgánica, los gránulos recubiertos se dispersaron de forma directa y precisa en la solución del polímero biodegradable (por ejemplo, PLGA RG 503H). De otro modo, se combinaron los gránulos recubiertos con otros compuestos de calcio para formar un CPC, que por su parte se dispersó de forma precisa en la solución del polimero biodegradable.

Ejemplo 14: Pruebas de estabilidad de gránulos recubiertos con rhGDF-5 y rhBMP-2 en diferentes disolventes orgánicos

Se usaron disolventes tales como polietilenglicol400, N-metilpirrolidona (NMP) y acetona. Se prepararon las muestras así como las referencias recubriendo 500 mg de ~-TCP con la proteína respectiva (rhGDF-5 o rhBMP-2) para lograr una concentración final de 500 lJg/g de ~-TCP. Después, se añadieron 4251J1 del disolvente respectivo a cada muestra, mientras que se dejaron sin tratar las referencias. Después de la incubación durante 24 horas a una temperatura de 25 oC, se extrajeron tanto las muestras como las referencias a 4 oC durante una hora con 3 mi de un tampón de extracción, que consistía en urea (8 M), Tris (10 mM) y EDTA (100 mM), cuyo valor de pH se ajustó a 6,7 con ácido clorhídrico. Después de esta etapa de extracción, se centrifugaron todas las muestras y referencias durante 3 minutos a 4500 rpm. Posteriormente, se diluyó el sobrenadante con disolvente A (0,15 % de ácido trifluoroacético y 20 % de acetonitrilo en agua) en una proporción de 1 :1. El disolvente B estaba compuesto de 0,15 % de ácido trifluoroacético y 84 % de acetonitrilo en agua. Se llevó a cabo la caracterización de las proteinas usando una columna C18 de Vydac, 2,1 x 250 mm, a un caudal de 0,3 ml/min. Se registró el perfil de elución midiendo la absorbancia a 220 nm. Se calcularon las cantidades de rhGDF-5, rhBMP-2 y sus productos de degradación a partir del área de pico a 220 nm.

Ejemplo 15: Estudios de liberación de rhGDF-5

Se transfirieron especímenes incubados previamente (preparación descrita en el ejemplo 11), cuyo peso estaba bien definido (150-300 mg), en un tubo de 50 mi, que contenía 48 mi de medio (a-ME;M con un 10 % de FCS). Se llevaron a cabo estudios de liberación a una temperatura de 4 oC. La etapa de incubación previa fue necesaria para obtener especímenes de una forma constante para eliminar cualquier influencia de superficies alteradas sobre la tasa de liberación de rhGDF-5 fuera de las formulaciones.

Ejemplo 16: Cuantificación de la liberación de rhGDF-5

Se cuantificó la liberación de rhGDF-5 por medio de ELISA. Se fijó inicialmente el anticuerpo aMP-5 para rhGDF-5 sobre la superficie de una placa de microvaloración. Después de saturar los sitios de unión libres, se incubó la placa con las muestras que contenían rhGDF-5. Posteriormente, el rhGDF-5 unido se incubó con el anticuerpo aMP4, que se cuantificó por medio de una reacción inmunitaria con estreptavidina PODo

Ejemplo 17: Extracción del rhGDF-5 inmovilizado

Se extrajo el rhGDF-5 inmovilizado por medio de un tampón de extracción, que consistía en urea (8 M), Tris (10 mM) y EDTA (100 mM). Se ajustó el nivel de pH hasta pH6,7 con ácido clorhídrico. Se transfirieron 500 mg de gránulos de TCP recubiertos (500 mg de rhGDF-5/g TCP) en un tubo de 15 mi y se suspendieron en 3 mi de tampón de extracción. Posteriormente, se incubaron los gránulos durante 60 minutos a 4 oC. Finalmente, se centrifugó el sobrenadante y se diluyó con disolvente A en una proporción de 1 :1. Esta solución sirve para la caracterización y cuantificación de rhGDF-5 por medio de RP-HPLC.

Ejemplo 18: Cuantificación de rhGDF-5 en solución por RP-HPLC

Se determinó el contenido de rhGDF-5 por análisis de fase inversa (RP-HPLC). Se analizaron alícuotas de la muestra usando una columna Porous 10 R1 C4 (autoempaquetada). Se usaron un 0,045 % de ácido trifluoroacético en agua (disolvente A) y un 0,025 % de ácido trifluoroacético en un 84 % de acetonitrilo (disolvente B) como disolventes a un caudal de 0,4 ml/min. Se registró el perfil de elución midiendo la absorbancia a 220 nm. Se calcularon las cantidades de rhGDF-5 del área de pico a 220 nm usando una curva estándar.

Ejemplo 19: Caracterización de rhGDF-5 en solución por RP-HPLC

Se llevó a cabo la caracterización de rhGDF-5 y sus modificaciones potenciales por medio de Rp·HPLC. Se analizaron las allcuotas de la muestra usando una Vydac C18, 2,1 x 250 mm. Se usaron un 0,1 % de ácido trifluoroacético en agua (disolvente A) y un 0,15 % de ácido trifluoroacético en acetonitrilo (disolvente B) como disolventes a un caudal de 0,4 ml/min. Se registró el perfil de elución midiendo la absorbancia a 220 nm. Se calculó el contenido relativo de rhGDF-5 del área de pico a 220 nm.

Ejemplo 20: Análisis dellFS por microscopía electrónica de barrido (SEM)

Se pulverizaron los especímenes endurecidos y secados a vacío con carbón. Por lo tanto, se aplicó un vacío de 5 aproximadamente 10-4 mbar. Las estructuras diana para estos análisis fueron la superficie y el núcleo de los especímenes de IFS particulares y en especial la porosidad mostrada por estas estructuras.

Ejemplo 21: Análisis dellFS por calorimetría de barrido diferencial (OSe)

Se secaron a vacío los especímenes. Se pesaron de forma precisa 10-20 mg de los especímenes y se analizaron, mientras que las tasas de calentamiento y de enfriamiento estaban entre 10 Y 30 Klmin. Se llevó a cabo el enfriamiento 10 por medio de nitrógeno líquido.

Ejemplo 22: Análisis dellFS por microscopía de luz

Se prepararon los especímenes incubando la formulación de IFS pastosa en tampón de PBS durante al menos 48 horas. Para lograr una forma reproducible de los especímenes de IFS endurecidos, se dosificaron 1,5 g (por especimen) de la formulación de pasta en un pocillo de una placa de 24 pocillos. Después de terminar la incubación, se

15 retiraron los especímenes de los pocillos particulares y se secaron a vacío. Las estructuras diana para estos análisis fueron la superficie y el núcleo de los especímenes de IFS particulares y en especial la porosidad mostrada por estas estructuras. Se contó el número de poros. Se midió el tamaño de poro de los poros contabilizados por medio del programa informático denominado Soft Imaging SystemS®. Estos datos sirvieron para el cálculo del tamaño de poro promedio, la desviación estándar relativa y para la determinación de la distribución del tamaño de poro.

La tabla 3 muestra el impacto de diferentes tamaños de partícula de la sal sódica de carboximetilcelulosa (NaCMC) en la distribución del tamaño de poro en la superficie y en el núcleo dellFS

IFS -composición (sin NaCMC): PLGA RG 503H (22,2 % en peso), cemento de fosfato de calcio (33,3 % en peso), polietilenglicol400 (44,5 % en peso), IFS-composición (con NaCMC): PLGA RG 503H (22 % en peso), cemento de fosfato de calcio (33 % en peso), polietilenglicol400 (44 % en peso), NaCMC (1 % en peso).

Ejemplo 23: Determinación de la densidad dellFS y sistemas relacionados

Se cargó un molde vacío con un volumen definido con las formulaciones particulares. Por lo tanto, se determinó la masa de la fractura de formulación, lo que se requirió. Por tanto, se calculó la densidad como la proporción de masa y volumen (g/mi). Los datos se muestran en la tabla 3. Añadiendo una carga Inorgánica a la pasta de endurecimiento in situ, la cantidad de polímero insoluble en agua en relación al volumen del defecto se puede reducir considerablemente en aproximadamente un tercio en contraste con implantes basados en polfmeros convencionales. Esto influye en el valor de pH local dentro del tejido o zona del defecto y evita reacciones secundarias adversas o tóxicas debido a la disminución del pH durante la degradación del polímero dentro del cuerpo.

La Tabla 4 muestra la determinación del contenido en PLGA en un volumen del defecto definido

IFS IFS (eMC) libre de CaP Solución de polímero

polímeroSolución de libre de CaP (eMe)

densidad [g/mi] 1,38 1,46 1,07

1,17

contenido en PLGA* [% en peso] 22,2 ~2,0 145,0

144,6

masa de PLGA en 1 mi de defecto** [9] 0,31 ~,32 0,48

¡O,52

1. IFS: PLGA RG 503H (22,2 % en peso), cemento de fosfato de calcio (33,3 % en peso), polietilenglicol400 (44,5 % en peso).

2. IFS (CMC): PLGA 503H (22,0 % en peso), cemento de fosfato de calcio (33,0 % en peso), polietilenglicol400 (44,0 % en peso), sal sódica de carboximetilcelulosa (1,0 % en peso)

3. Solución de polímero libre de CaP: PLGA RG 756 (45,0 % en peso), N-metilpirrolidona (55,0 % en peso)

4. Solución de polímero libre de CaP (CMC): PLGA RG 756 (44,6 % en peso), N-metilpirrolidona (54,4 % en peso), sal sódica de carboximetilcelulosa (1 ,0 % en peso), *en la formulación antes de su aplicación, ""después del endurecimiento

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LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Scil Technology GmbH

5 <120> Pasta de endurecimiento in situ, su fabricación y uso

<130> EP31498EP

<150> EP04013668.1 10 < 151> 2004-06-09

<160> 4

<170> Patentln version 3.1 15

<210> 1

<211> 396

<212> PRT

<213> Horno sapiens 20 <400> 1

Met Val Ala Gly Thr Arg cys Leu Leu Ala Leu Leu Leu Pro Gln Val 1 5 10 15

Leu Leu Gly Gly Ala Ala Gly Leu Val Pro Glu Leu Gly Axg Arg Lys 20 25 30

Phe Ala A1a Ala Ser Ser Gly ALg Pro Ser Ser Gln Pro Ser Asp Glu

35 40 45

Val Leu Ser Glu Phe Glu Leu Arg Leu Leu Ser Met Ph~ Gly Leu Lys

50 55 60

Gln AIg Pro Thr Pro Ser AIg Asp Ala Val Val Pro Pro Tyr Met Leu

65 70 75 80

Asp Leu Tyr Arg Arg Mis Ser Gly Gln Pro Gly Ser Pro Ala Pro Asp 85 90 95

His Arg Leu Glu Arg Ala Ala Ser Arg Ala Asn Thr Val Arg Ser Phe 100 105 110

His His Glu Glu Ser Leu Glu Glu Leu Pro Glu Thr Ser Gly Lys Thr 115 120 125

Thr Arg Arg Phe Phe Phe Asn Leu Ser Ser Ile Pro Thr Glu Glu Phe 130 135 140

Ile Thr Ser Ala Glu Leu Gln Val Phe Arg Glu Gln Met Gln Asp ~a 145 150 155 160

Leu Gly Asn Asn Ser Ser Phe His His AIg I1e Asn Ile Tyr Glu Ile

165 170 175

Ile Lys Pro ~a Thr ~a Asn Ser Lys Phe Pro Val Thr Arq Leu Leu 180 185 190

Asp ThrAJ:q Leu Val Asn Gln Asn Ala Ser 1.rq 'l'rp Glu Ser Phe Asp 195 200 205

Val Thr Pro Ala Val Met Arq Trp Thr Ala Gln Gly His Ala .Asn His 210 215 220

Gly Phe Val Val Glu Val Ala His Leu Glu Glu Lys Gln Gly Val Ser 225 230 2JS 24 O

Lys Árq Mis Val 1.rq Ile Ser Arg Ser Leu His Gln Asp Glu Bis Ser 245 250 255

Trp ser Gln lle 1.rg Pro Leu Leu Val Thr Phe Gly His Asp Gly Lys 260 265 270

Gly His Pro Leu His Lys Arq Glu Lys Arg Gln ~a Lys His Lys Gln 275 280 285

Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Val Asp

290 295 300

Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro G1y Tyr 305 310 315 320

His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His

325 330 335

Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val

340 345 350

~n Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val ~ro Thr Glu Leu Ser Ala 355 360 365

Ile Ser Met Leu Tyr Leu 1.sp Glu Aso Glu Lys Val Val Leu Lys Asn 370 375 380

Tyr Gln ASp Met Val Val Glu Gly cys Gly Cys Arg

385 390 395

<210> 2

<211> 431

<212> PRT 5 <213> Horno sapiens

<400> 2

Met His Val Are¡ Ser Leu Are¡ Ala Ala Ala Pro His Ser Phe Val Ala 1 5 10 15

Leu Trp ~a Pro Leu Phe Leu Leu Arg Ser ~a Leu ~a Asp Phe Ser

20 25 30

Leu Asp Asn Glu Val His Ser Ser Phe 1le His Are¡ Are¡ Leu Are¡ Ser . 35 40 45

Gln Glu Are¡ Are¡ Glu Met Gln Arg G1u Ile Leu Ser Ile Leu Gly Leu 50 55 60

Pro Bis Arg Pro Arg Pro His Leu G1n Gly Lys His Asn Ser Ala Pro 65 70 7S 80

Met Phe Met Leu Asp Leu Tyr Asn Ala Met Ala Val Glu Glu Gly Gly

85 90 95

Gly Pro Gly Gly Gln Gly Phe Ser Tyr Pro Tyr Lys Ala Val Phe Ser 100 105 110

Thr Gln Gly Pro Pro Leu ~a Ser Leu Gln Asp Ser His Phe Leu Thr 115 120 125

Asp Ala Asp Met Val Met Ser Phe Val Asn Leu Val Glu His Asp Lys 130 135 140

Glu Phe Phe His Pro ALg Tyr His His Arg Glu Phe Arg Phe Asp Leu 145 150 155 160

Ser Lys Zle Pro Glu Gly Glu Ala Val Thr Ala Ala Glu Phe Arg 11e 165 170 175

Tyr Lys Asp Tyr Ile Are¡ Glu Are¡ Phe Asp Asn Glu Thr Phe Are¡ 11e 180 185 190

Ser Val Tyr Gln Val Leu Gln G1u His Leu Gly Arg Glu Ser Asp Leu 195 200 205

Phe Leu Leu Asp Ser Are¡ Thr Leu Trp Ala Ser Glu Glu Gly Trp Leu 210 215 220

Val Phe Asp Ile Thr Ala Thr Ser Asn His Trp Val Val Asn Pro Arg

225 230 235 24 O

His Asn Leu Gly.Leu Gln Leu Ser Val Glu Thr Leu Asp Gly Gln Ser 245 250 255

Ile Asn Pro Lys Leu Ala Gly Leu Ile Gly Arg His Gly Pro Gln Asn 260 265 270

Lys Gln Pro Phe Met Val ~a Phe Phe Lys Ala Thr Glu·Val His Phe 275 280 285

Arg Ser Ile Arg Ser Thr Gly Ser Lys Gln AIg Ser Gln Asn Arg Ser 290 295 300

Lys Thr Pro Lys Asn Gln Glu Ala Leu AIg Met Ala Asn Val Al.a Glu 305 310 315 320

Asn Ser Ser Ser Asp Gln Arg Gln Ala Cy3 Lys Lys His Glu Leu Tyr 325 330 335

Val Ser Phe Arg Asp Leu Gly Trp Gln.Asp Trp Ile I~e ~a Pro Glu 340 345 350

Gly Tyr Ala Ala Tyr Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Ala Phe Pro Leu Asn 355 360 365

Ser Tyr Met Asn Ala Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His 370 375 380

phe Ile Asn Pro Glu Thr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Gln 385 390 395 400

Leu Asn Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Ser Ser Asn Val Ile 40S 410 415

Leu Lys Lys Tyr AIg Asn Met .Val Val Arg Ala Cys Gly Cys Rís 420 425 430

<210> 3

<211> 501

<212> PRT 5 <213> Horno sapiens

<400> 3

Met Ar9 Leu Pro Lys Leu Leu Thr Phe Leu Leu Trp Tyr Leu Ala Trp 1 5 10 15

Leu Asp Leu Glu Phe Ile Cys Thr Val LeU Gly Ala Pro Asp Leu Gly

20 25 30

Gln Arg Pro GIn Gly Ser Arg Pro Gly Leu Ala Lys Ala Glu Ala Lys 35 40 45

Glu Axg Pro Pro Leu Ala Arg Asn val Phe Arg Pro Gly G1y His Ser

50 55 60

Tyr Gly Gly Gly Ala Thr Asn Ala Asn Ala Arg Ala Lys Gly Gly Thr 65 70 75 80

Gly Gln Thr Gly Gly Leu Thr Gln Pro Lys Lys Asp Glu Pro Lys Lys 85 90 95

Leu Pro Pro Arg Pro Gly Gly Pro Glu Pro Lys Pro Gly His Pro Pro 100 105 110

GIn Thr Arq GIn Ala Thr Ala Arg Thr Val Thr Pro Lys Gly Gln Leu 115 120 125

Pro G1y GIy Lys Ala Pro Pro Lys Ala Gly Ser Val Pro Ser Ser Phe 130 135 140

Leu Leu Lys Lys Ala Arg Glu Pro Gly Pro Pro Arg Glu Pro Lys Glu 145 150 155 160

Pro Phe Arq Pro Pro Pro !le Thr Pro His Glu Tyr Met Leu Ser Leu 165 170 175

Tyr Arg Thr Leu Ser Asp Ala Asp Arg Lys Gly Gly Asn Ser Ser Val 180 185 190

Lys Leu Glu Ala Gly Leu Ala Asn Thr Ile Thr Ser Phe Ile Asp Lys 195 200 20S

Gly Gln Asp Asp Axg Gly Pro Val Val Arg Lys Gln Arq Tyr Val Phe 210 215 220

ASp Ile Ser Ala Leu Glu Lys Asp Gly Leu Leu Gly Ala Glu Leu ALg 225 230 235 240

Ile Leu ALg Lys Lys Pro Ser Asp Thr Ala Lys Pro Ala Val Pro Arg 245 250 255

Ser Arg Arg Ala Ala GIn Leu Lys Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gly Arg 260 265 270

Gln Pro Ala Ala Leu Leu Asp Val Arg Ser Val Pro Gly Leu Asp GIy 275 260 285

Ser Gly T~p Glu Val Phe Asp Ile Trp Lys Leu Phe Arg ~n Phe Lys

290 295 300

Asn Ser Ala Gln Leu Cys Leu Glu Leu Glu Ala Trp Glu Arg Gly Mg 305 310 315 320

Thr Val Asp Leu Arg Gly Leu Gly [lhe ASp A.rg Ala Ala Arg Gln Val 325 330 335

His Glu Lys Ala Leu Phe Leu Val Phe Gly Arg Thr Lys Lys A.rg Asp 340 345 350

Leu Phe Phe Asn Glu Ile Lys A1a Arg Ser Gly Gln Asp Asp Lys Thr 355 360 365

Val Tyr Glu Tyr Leu Phe Ser Gln Arg Arg Lys Arg Arg Ala Pro Leu 370 375 380

A1a Thr ALg Gln Gly Lys Axg Pro Ser Lys Asn Leu Lys Ala Arg Cys 385 390 395 400

Ser Arg Lys Ala Leu His Val Asn Phe Lys Asp Met Gly Trp Asp Asp 405 410 415

Trp Ile Ile Ala Pro Leu Glu Tyr Glu Ala Pbe His Cys Glu Gly Leu 420 425 430

. Cys Glu Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn Hi~ Ala Val 435 440 445

Ile Gln Thr Leu Met Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr Pro Pro Thr 450 455 460

Cys Cys Val Pro Thr Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu Phe Ile Asp 465 470 475 480

Ser Ala Asn Asn Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met Val Val Glu 485 490 495

Ser cys Gly Cys Arg 500

<210> 4

<211> 131

<212> PRT 5 <213> Horno sapiens

<400> 4

Met Ala Arg Ser Leu Val Cys Leu Gly Val ¡le ¡le Leu Leu Ser Ala 1 5 10 15

Phe Ser Gly Pro Gly Val Arq Gly Gly Pro Met Pro Lys Leu Ala Asp 20 25 30

Arg Lys Leu Cys Ala Asp Gln Glu Cys Ser His Pro Ile Ser Met Ala

35 40 45

Val Ala Leu Gln Asp Tyr Met Ala Pro Asp Cys AIg Phe Leu Thr Ile 50 55 60

His Arg Gly Gln Val Val Tyr Val Phe Ser Lys Leu Lys Gly Arg Gly 65 70 75 BO

Arg Leu Phe Trp Gly Gly Ser Val G1n Gly A5p Tyr Tyr Gly Asp Leu 65 90 95

~a Ala Arg Leu Gly Tye Phe Pro Ser Ser rle Val Arq Glu Asp Gln 100 105 110

Thr Leu Lys Pro Gly Lys Val Asp Val Lys Thr Asp Lys Trp Asp Phe 115 120 125

Tyr Cys Gln 130

Claims (21)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una pasta de endurecimiento in situ que comprende:

   (a)

   un plastificante, que es un líquido orgánico biocompatible soluble en agua o miscible en agua,

   (b)

   un polímero insoluble en agua, que es biocompatible, biodegradable, y/o biorreabsorbible y soluble en el plastificante,

   (e)

   una carga sólida insoluble en agua, que es insoluble en el plastificante,

   en el que la pasta, que es inyectable y estable en su envase, que es capaz de endurecerse in situ para formar un implante sólido al entrar en contacto con el medio acuoso o fluido corporal,

   en la que dicho plastificante es polietilenglicol (PEG) 400, PEG 200, PEG 300, PEG 600, 1 ,3-butanodiol, aceite de ricino, N-metil-2-pirrolidona, 2-pirrolidona, alcanoles de C2 a C6, propilenglicol, solcetal, acetona, acetato de metilo, acetato de etilo, lactato de etilo, metiletilcetona, dimetilformamida, dimetilsulfona, tetrahidrofurano, caprolactama, decilmetilsulfóxido, ácido oleico, carbonato de propileno, triacetina, N,N-dietil-m-toluamida; l-dodecilazacicloheptan-2-ona o mezclas de los mismos.

2. 2.

   La pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además una cantidad eficaz de una carga de construcción de poro soluble en agua.

3. 3.

   La pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el implante tiene poros de interconexión con un diámetro de igualo más de 100 IJm.

4. 4.

   La pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además un agente activo.

5. 5.

   La pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende un agente activo recubierto sobre la carga sólida Insoluble en agua.

6. 6.

   La pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la carga sólida insoluble en agua es fosfato de tricalcio alfa que tiene un tamaño de partícula que es igualo superior a 300 IJm.

7. 7.

   La pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la proporción de la carga sólida insoluble en agua y el polímero insoluble en agua es de entre 1:1 y 5: 1.

8. 8.

   La pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el polímero insoluble en agua es PLGA.

9. 9.

   La pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con la reivindicación 8, en la que el polímero insoluble en agua es un polímero con un casquete en el extremo.

10. 10.

    La pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el contenido en polímero insoluble en agua de la composición es igualo menor de un 40 % en peso.

11. 11.

    La pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la densidad de la composición de pasta es igualo superior a 1,21 g/mI.

12. 12.

    La pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el plastificante es polietilenglicol (PEG) 400.

13. 13.

    La pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con la reivindicación 1 , en la que el contenido en plastificante es de un 40 -95 % en peso.

14. 14.

    La pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con la reivindicación 2, en la que la carga de construcción de poro sólida soluble en agua es la sal sódica de carboximetilcelulosa.

15. 15.

    La pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el contenido de la carga de construcción de poro sólida soluble en agua de la composición es menor de un 10 % en peso.

16. 16.

    La pasta de endurecimiento in situ de acuerdo con la reivindicación 2, en la que la carga de construcción de poro sólida soluble en agua tiene un tamaño de partícula de 25 a 1000 IJm.

17. 17.

    La pasta de endurecimiento in situ de la reivindicación 4, en la que dicho agente activo es una proteína osteoinductiva o inductiva de cartílago.

18. 18.

    Un procedimiento para la producción de la pasta de endurecimiento in situ de la reivindicación 1 , que comprende las etapas de:

    (a)

    mezclar un componente A que comprende el plastificante y un componente B que comprende el polímero insoluble en agua disolviendo el componente B en el componente A para proporcionar un líquido viscoso; y

    (b)

    mezclar dicho líquido viscoso obtenido en (a) con la carga sólida insoluble en agua para preparar la pasta.

19. 19. El procedimiento para la producción de la pasta de endurecimiento in situ de la reivindicación 4, que comprende las 5 etapas de:

    (a)

    mezclar un componente A que comprende el plastificante y un componente B que comprende el polímero insoluble en agua disolviendo el componente B en el componente A para proporcionar un líquido viscoso;

    (b)

    disolver el agente activo en dicho líquido viscoso; y

    (c)

    mezclar dicho líquido viscoso obtenido en (b) con la carga sólida insoluble en agua para preparar la pasta.

    10 20. El procedimiento para la producción de la pasta de endurecimiento in situ de la reivindicación 4, que comprende las etapas de:

    (a) mezclar un componente A que comprende el plastificante y un componente B que comprende el polímero insoluble en agua disolviendo el componente B en el componente A para proporcionar un líquido viscoso;

    (b) mezclar dicho líquido viscoso obtenido en (a) con la carga sólida insoluble en agua para preparar la pasta, en el 15 que dicha carga sólida insoluble en agua comprende el agente activo recubierto sobre dicha carga sólida.

20. 21.

    Un procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica que comprende combinar la pasta de endurecimiento in situ de la reivindicación 1, con un agente activo.

21. 22.

    La pasta de endurecimiento in situ de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, para su uso en aumento óseo.