ES2385550T3 - Ácido 3'-desoxipentopiranosil-nucleico y su preparación - Google Patents
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Abstract
Eslabones de 3'-desoxipentopiranosil-nucleósidos de la fórmula (I), en la que R1 es igual a OH, Hal con Hal igual a Br o Cl, un radical escogido entre con i-Pr igual a isopropilo, o -O-PH-(>=O)(-O'), R2, R3 y R4, independientemente entre sí, iguales o diferentes, significan en cada caso H, NR5R6, OR7, SR8, >=O, CnH2n+1 siendo n un número entero de 1-12, de manera preferida 1-8, en particular 1-4, un grupo eliminable en la posición ß de la fórmula -OCH2CH2R18 con R18 igual a ciano o un radical p-nitrofenilo o un radical fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc), o (CnH2n)NR10R11, con R10R11 igual a H, CnH2n+1 o R10R11 unidos a través de un radical de la fórmula en la que R12, R13, R14 y R15, independientemente entre sí, iguales o diferentes, significan en cada caso H, OR7, ó CnH2n+1 ó CnH2n-1, teniendo n el significado arriba mencionado, y en la que R5, R6, R7 y R8 independientemente entre sí, iguales o diferentes, significan en cada caso H, CnH2n+1 ó CnH2n-1, teniendo n el significado arriba mencionado, -(CO)R9 con R9 igual a un radical alquilo lineal o ramificado, eventualmente sustituido, arilo, de manera preferida fenilo.
Description
Ácido 3'-desoxipentopiranosil-nucleico y su preparación.
El presente invento se refiere a 3'-desoxipentopiranosil-nucleósidos de la fórmula (I) o de la fórmula (II),
a su preparación y a su utilización para la preparación de ácidos 3'-desoxipentopiranosil-nucleicos.
Los ácidos piranosil-nucleicos (p-NA’s) son, por lo general, unos tipos estructurales isómeros con respecto al ARN natural, en los cuales las unidades de pentosa se presentan en la forma de piranosa y están unidas de manera repetitiva por medio de grupos fosfodiéster entre las posiciones C-2' y C-4'. Por el concepto de "nucleobase" se entienden en este caso las nucleobases canónicas A, T, U, C, G, pero también los pares de isoguanina e isocitosina y de 2,6-diaminopurina y xantina, y en el sentido del presente invento también otras purinas y pirimidinas. Los pNA’s, y ciertamente los p-RNA’s derivados de la ribosa fueron descritos por primera vez por Eschenmoser y colaboradores (véanse las citas bibliográficas de Helv. Chim. Acta 1993, 76, 2126; Helv. Chim. Acta 1995, 78, 1621; Angew. Chem. 1996, 108, 1619-1623; el documento de solicitud de patente internacional WO 98/25943, y las citas de Helv. Chim. Acta, 1996, 79, 2316, Helv. Chim. Acta, 1997, 80, 1901). Ellos forman exclusivamente los denominados duplicados emparejados según Watson-Crick, es decir unos duplicados emparejados como purinapirimidina y purina-purina, antiparalelos, que se "fusionan" reversiblemente, casi lineales y estables. Las cadenas homoquirales de p-ARN con un sentido opuesto de quiralidad, se emparejan asimismo de un modo controlable y en el duplicado formado son estrictamente no helicoidales. Esta especificidad, valiosa para la constitución de unidades supramoleculares, está relacionada con la relativamente pequeña flexibilidad del entramado de ribopiranosa-fosfato así como con la fuerte inclinación del plano de base con respecto al eje de la cadena, y de la tendencia, que resulta de esto, al apilamiento intercatenario de bases en el duplicado resultante, y se puede atribuir a fin de cuentas a la participación de un anillo de ribopiranosa disustituido en las posiciones 2',4´-cis en la constitución del entramado. Estas propiedades de emparejamiento, esencialmente mejores, hacen que los p-NA’s sean un sistema preferido de emparejamiento en comparación con los ADN’s y ARN’s para el uso en la constitución de unidades supramoleculares. Ellos forman un sistema ortogonal de emparejamiento con respecto a ácidos nucleicos naturales, es decir que no se emparejan con los ADN’s y ARN’s que se presentan en la forma natural, lo que es importante en particular en el sector del diagnóstico.
El p-ARN muestra, sin embargo, las siguientes desventajas, que se deben de atribuir a la presencia de la función hidroxilo en la posición 3':
- 1.
- La protección necesaria del grupo hidroxilo en las posición 3’ con un grupo protector benzoílo dificulta y prolonga considerablemente la ruta de síntesis para formar los eslabones monómeros.
- 2.
- Debido a la utilización del radical alilo como grupo protector de bases y fosfatos, se tienen que realizar la desprotección y la separación del oligonucleótido mediante dos etapas dispuestas una tras otra. Primeramente, se eliminan los radicales alilo según el método de Noyori (R. Noyori, J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 1691-6). A continuación, se tienen que separar los grupos acilo inestables frente a bases y eliminar el oligonucleótido con respecto del soporte.
- 3.
- Después de haberse terminado la síntesis de un oligonucleótido, la separación de los radicales 3'-benzoílo con respecto del oligonucleótido plantea dificultades. Con el fin de eliminar eficazmente estos radicales, es necesaria la utilización de hidrazina, lo que puede conducir a aperturas del anillo de las bases de pirimidina, sobre todo uracilo y timina.
4. En el caso de la síntesis de los oligonucleótidos, se emplea 5-(4-nitrofenil)-1H-tetrazol como reactivo de acoplamiento en la síntesis automatizada de p-ARN’s. La concentración de este reactivo en la solución de tetrazol en acetonitrilo es en este caso tan alta, que por lo general el 5-(4-nitrofenil)-1H-tetrazol se separa por cristalización en las delgadas mangueras del aparato sintetizador y, por consiguiente, la síntesis finaliza prematuramente. Además, se observó que los oligómeros estaban impurificados con el 5-(4-nitrofenil)-1H-tetrazol. También el triflato de bencimidazolio utilizado alternativamente, presenta aspectos negativos: se cristaliza, si bien más raramente, en las mangueras, es caro y además tiene que ser recristalizado antes de su utilización.
En las citas de Doboszweski B. y colaboradores, J. Org. Chem., 1995, tomo 60, página 7909; Diekmann E. y colaboradores J. Prak. Chem, 1993, tomo 335, página 415, Kripach N.B. y colaboradores Khim. Geterotskil. Soedin, 1982, página 111; Watanabe K.A. y colaboradores, Can. J. Chem., 1981, página 468; Watanabe K.A. y colaboradores, Am. Chem. Soc., 1974, página 2482; Seto H. y colaboradores, Biosynthesis of Blasticidin (Biosíntesis de blasticidina), 1973, página 2421; Böhringer M. y colaboradores, Helv. Chim. Act., 1992, tomo 75, página 1416; Doboszewski y colaboradores, Tetrahedron, 1995, tomo 51, página 12319, y en el documento WO 96/40711 se describen especiales pent-2'-enopiranosil-, didesoxirribo-nucleósidos, nucleósidos o respectivamente pentopiraninas glicosilados/as.
Por lo tanto, fue una misión del presente invento poner a disposición nuevos pentopiranosil-nucleósidos para sistemas ortogonales de emparejamiento y oligomerizarlos, con lo que se pueden evitar las desventajas arriba descritas.
Sorprendentemente, se encontró, por fin, que los ácidos 3'-desoxipentopiranosil-nucleicos (p-DANN) no tienen las desventajas descritas y poseen no obstante las ventajosas propiedades de emparejamiento ortogonal (véase la Fig. 3).
Un objeto del presente invento son, por lo tanto, unos 3'-desoxipentopiranosil-nucleósidos de la fórmula (I),
en la que R1 es igual a OH, Hal con Hal igual a Br o Cl, un radical escogido entre el conjunto que se compone de
con i-Pr igual a isopropilo, ó -O-PH-(=O)(-O-),
R2, R3 y R4 independientemente entre sí, iguales o diferentes, significan en cada caso H, NR5R6, OR7, SR8, =O, CnH2n+1 siendo n un número entero de 1-12, de manera preferida 1-8, en particular 1-4, un grupo eliminable en la
R18
posición β de la fórmula -OCH2CH2R18 con igual a un radical ciano o p-nitrofenilo o un radical fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc), o (CnH2n)NR10R11 con R10R11 igual a H, CnH2n+1 o R10R11 unidos a través de un radical de la fórmula
, R13, R14
en la que R12 y R15 independientemente entre sí, iguales o diferentes, significan en cada caso H, OR7, ó CnH2n+1 ó CnH2n-1, teniendo n el significado arriba mencionado, y
R5, R6, R7 y R8 independientemente entre sí, iguales o diferentes, significan en cada caso H, CnH2n+1 ó CnH2n-1, 5 teniendo n el significado arriba mencionado, -(CO)R9 con R9 igual a un radical alquilo lineal o ramificado, o arilo eventualmente sustituido, de manera preferida fenilo,
X, Y y Z independientemente entre sí, iguales o diferentes, significan en cada caso =N, =C(R16)- o -N(R17), en que
R16
y R17 independientemente entre sí, iguales o diferentes, significan en cada caso H o CnH2n+1 ó (CnH2n)NR10R11 con los significados arriba mencionados, y
10 Sc1 es hidrógeno o un grupo protector escogido entre un grupo protector acilo, tritilo, aliloxicarbonilo, inestable frente a la luz, de manera preferida un grupo benzoílo, fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) o 4,4'-dimetoxi-tritilo (DMT),
o de la fórmula (II)
en la que R1' es igual a OH, Hal con Hal igual a Br o Cl, un radical escogido entre
con i-Pr igual a isopropilo ó -O-PH-(=O)(-O-)
R2'
, R3' y R4' independientemente entre sí, iguales o diferentes, significan en cada caso =O, CnH2n+1 ó CnH2n-1, un grupo eliminable en la posición β de la fórmula -OCH2CH2R18
con R18 igual a un radical ciano o p-nitrofenilo o un radical fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc), o (C2H2n)NR10'R11', 20 teniendo R10' y R11', independientemente entre sí, el significado arriba mencionado de R10 o respectivamente R11, y
y R17'
X' significa =N, =C(R16')- ó =C(R17')-, teniendo R16' independientemente entre sí, el significado arriba mencionado de R16 o respectivamente R17, y teniendo Sc1' el significado arriba mencionado de Sc1.
Los 3'-desoxipentopiranosil-nucleósidos son por lo general 3'-desoxirribo-, 3'-desoxiarabino-, 3'-desoxilixo- y/o 3'desoxixilo-piranosil-nucleósidos,
25 de manera preferida 3'-desoxirribopiranosil-nucleósidos, pudiendo tener la parte de 3'-desoxipentopiranosilo la configuración D, pero también la configuración L.
Usualmente, en el caso de los 3'-desoxipentopiranosil-nucleósidos se trata de 3'-desoxipentopiranosil-purina, -2,6diaminopurina, -6-purinatiol, -adenina, -guanina, -isoguanina, -xantina, -hipoxantina, -timina, -indol, -triptamina, -Nftaloíl-triptamina, -cafeína, -teobromina, -teofilina, en particular 3'-desoxipentopiranosil-purina, -adenina, -guanina, -timina, -triptamina o -N-ftaloíl-triptamina.
Entre los compuestos se cuentan también unos 3'-desoxipentopiranosil-nucleósidos, que se pueden utilizar como engarzadores, es decir como compuestos con grupos funcionales, que se pueden unir covalentemente a biomoléculas, tales como p.ej. unos ácidos nucleicos que se presentan en su forma natural o modificados, tales como un ADN, un ARN o también unos p-NA’s, de manera preferida p-DNA’s.
Por ejemplo, dentro de éstos se cuentan unos 3'-desoxipentopiranosil-nucleósidos, en los que R2, R3, R4, R2', R3' y/o R4' significan un radical 2-ftalimido-etilo.
También se adecuan unos engarzadores basados en uracilo, en los que había sido modificada de manera preferida la posición 5 del uracilo, p.ej. N-ftaloílaminoetil-uracilo, pero también unos engarzadores basados en indol, de manera preferida derivados de triptamina, tales como p.ej. N-ftaloíl-triptamina.
Además de esto, el presente invento abarca unos 3'-desoxipentopiranosil-nucleósidos, que llevan un grupo protector exclusivamente junto al átomo de oxígeno situado en la posición 4' de la parte de 3'-desoxipentopiranósido, en particular un grupo tritilo, de manera especialmente preferida un grupo dimetoxitritilo.
Los siguientes compuestos constituyen unos ejemplos preferidos de pentopiranosil-nucleósidos, que pueden estar presentes en el ácido nucleico conforme al invento, o respectivamente que son especialmente adecuados para su preparación:
A) [(2',4'-di-O-benzoíl)-3'-desoxi-β-ribopiranosil]-nucleósidos, en particular una [(2',4'-di-O-benzoíl)-3'-desoxi-βribopiranosil]-adenina, -guanina, -timidina, -xantina o -hipoxantina, así como un N-benzoíl-2',4'-di-O-benzoíl-3'desoxi-ribopiranosil-nucleósido, en particular una -adenina o -guanina, así como un N-isobutiroíl-2',4'-di-O-benzoíl-3'desoxi-ribopiranosil-nucleósido, en particular una -adenina o -guanina, así como un O6-(2-cianoetil)-N2-isobutiroíl2',4'-di-O-benzoíl-3'-desoxi-ribopiranosil-nucleósido, en particular una -guanina, así como un O6-(2-(4-nitrofenil)etil)N2-isobutiroíl-2',4'-di-O-benzoíl-3'-desoxi-ribopiranosil-nucleósido, en particular una -guanina.
B) 3'-desoxi-β-ribopiranosil-nucleósidos, en particular una 3'-desoxi-β-ribopiranosil-adenina, -guanina, -timidina, -xantina o -hipoxantina, así como un N-benzoíl, N-isobutiroíl, O6-(2-cianoetil)- u O6-(2-(4-nitrofenil)etil)-N2-isobutiroíl3'-desoxi-β-ribopiranosil-nucleósido, en particular una -guanina.
C) 4'-DMT-3'-desoxipentopiranosil-nucleósidos, de manera preferida un 4'-DMT-3'-desoxi-ribopiranosil-nucleósido, en particular una 4'-DMT-3'-desoxi-ribopiranosil-adenina, -guanina, -timidina, -xantina o -hipoxantina, así como un Nbenzoíl-4'-DMT-3'-desoxi-ribopiranosil-nucleósido, en particular una N-benzoíl-4'-DMT-3'-desoxi-ribopiranosil-adenina o -guanina, así como un N-isobutiroíl-4'-DMT-3'-desoxi-ribopiranosil-nucleósido, en particular una Nisobutiroíl-4'-DMT-3'-desoxi-ribopiranosil-adenina o -guanina así como un O6-(2-cianoetil)-N2-isobutiroíl-4'-DMT-3'desoxi-ribopiranosil-nucleósido, en particular una O6-(2-cianoetil)-N2-isobutiroíl-4'-DMT-3'-desoxi-ribopiranosilguanina, así como un O6-(2-(4-nitrofenil)etil)-N2-isobutiroíl-4'-DMT-3'-desoxi-ribopiranosil-nucleósido, en particular una O6-(2-nitrofenil)etil)-N2-isobutiroíl-4'-DMT-3'-desoxi-ribopiranosil-guanina.
D) 3'-desoxi-β-ribopiranosil-N,N'-dibenzoíl-adenosina o 3'-desoxi-β-ribopiranosil-N,N'-dibenzoíl-guanosina.
Como compuestos precursores para la síntesis de oligonucleótidos se adecuan, por ejemplo, 4'-DMT-3'desoxipentopiranosil-nucleósidos-2'-fosfitamida/-H-fosfonato, de manera preferida un 4'-DMT-3'-desoxi-ribopiranosilnucleósido-2'-fosfitamida/H-fosfonato, en particular un 4'-DMT-3'-desoxi-ribopiranosil-adenina-, -guanina-, -timidina-, -xantina- o -hipoxantina--2'-fosfitamida/-H-fosfonato, así como un N-benzoíl-4'-DMT-3'-desoxi-ribopiranosil-adeninao -guanina-2'-fosfitamida/-H-fosfonato así como un N-isobutiroíl-4'-DMT-3'-desoxi-ribopiranosil-adenina- o -guanina-2'-fosfitamida/-H-fosfonato, un O6-(2-cianoetil)-4'-DMT-3'-desoxi-ribopiranosil-guanina-, -xantina-, -hipoxantina-2'-fosfitamida/-H-fosfonato u O6-(2-(4-nitrofenil)etil)-N2-isobutiroíl-4'-DMT-3'-desoxi-ribopiranosil-guanina, y para el acoplamiento a los soportes sólidos, por ejemplo, 4'-DMT-3'-desoxipentopiranosil-nucleósidos-2'-succinatos, de manera preferida un 4'-DMT-3'-desoxi-ribopiranosil-nucleósido-2'-succinato, en particular un 4'-DMT-3'-desoxiribopiranosil-adenina-, -guanina-, -timidina-, -xantina- o -hipoxantina-2'-succinato, así como una N-benzoíl-4'-DMT-3'desoxi-ribopiranosil-adenina- o –guanina-2'-succinato, una O-(2-cianoetil)-4'-DMT-3'-desoxi-ribopiranosil-guanina-2'succinato, así como una O6-(2-(4-nitrofenil)etil)-N2-isobutiroíl-4'-DMT-3'-desoxi-ribopiranosil-guanina-2'-succinato.
Los 3'-desoxi-ribopiranosil-nucleósidos se pueden preparar p.ej. mediante un procedimiento, en el que
- (a)
- una nucleobase eventualmente protegida se hace reaccionar con una 3'-desoxi-ribopiranosa protegida,
- (b)
- los grupos protectores se separan de la parte de 3'-desoxi-ribopiranosilo del producto procedente de la etapa (a), y eventualmente
- (c)
- el producto procedente de la etapa (b) se protege junto a la posición 4' del 3'-desoxipentopiranósido.
En una forma especial de realización, el 3'-desoxi-piranosil-nucleósido está protegido por un grupo protector Sc1 o Sc1' inestable frente a ácidos, inestable frente a bases, inestable frente a la luz, eliminable en la posición β o separable de un modo catalizado por metales.
Por lo general, en el caso de los mencionados grupos protectores se trata de un grupo protector eliminable en la posición β, de manera preferida de un grupo fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc), de un grupo protector inestable frente a la luz, de un grupo acilo, de manera preferida de un grupo acetilo, benzoílo, nitrobenzoílo y/o metoxibenzoílo, o de grupos tritilo, de manera preferida de un grupo 4,4'-dimetoxi-tritilo (DMT).
Asi, la introducción del grupo DMT se efectúa, por ejemplo, mediante una reacción con DMTCl en presencia de una base, p.ej. de N-etildiisopropilamina (la base de Hünig), y p.ej. de piridina, cloruro de metileno o de una mezcla de piridina y cloruro de metileno a la temperatura ambiente.
El eslabón de ribopiranosilo que de manera preferida es puro en cuanto a los anómeros, se prepara por lo general partiendo de la 1,2-isopropiliden-5-O-trifenilmetil-α-D-xilofuranosa (1 en la Fig. 1) según procedimientos conocidos
(W. Sowa, Can. J. Chem, 1968, 46, 1568; Z.J. Witczak y colaboradores Carbohydrate Research, 1982, 110. 326) pero en general con unos rendimientos mejorados. Análogamente al procedimiento conocido, se tritila el compuesto 1 (Fig. 1) y de manera preferida se utiliza hidruro de sodio en lugar de lejía de sosa para la preparación del éster metil-xantogenato en la posición 3' (2 en la Fig. 1). Después de haber eliminado el metil-xantogenato, los grupos protectores tritilo e isopropilideno se separan de manera preferida con el ácido trifluoroacético en lugar del ácido acético glacial al 80 % que se ha descrito en la bibliografía. Por medio de estas modificaciones se pueden mejorar los rendimientos parcialmente de una manera considerable.
En una forma adicional de realización, se prepara ventajosamente un engarzador de acuerdo con la fórmula (II), en la que R4' significa (CnH2n)NR10'R11' y R10'R11' está unido a través de un radical de la fórmula (III) con el significado ya señalado, por medio del siguiente procedimiento:
- (a)
- un compuesto de la fórmula (II) con R4' igual a (CnH2n)OSc3 o (CnH2n)Hal, en la que n tiene el significado antes mencionado, Sc3 significa un grupo protector, de manera preferida un grupo mesilato, y Hal significa cloro o bromo, se hace reaccionar con una azida, de manera preferida en presencia de DMF (dimetilformamida), a continuación
- (b)
- el producto de reacción procedente de (a) se reduce de manera preferida con trifenilfosfina p.ej. en presencia de piridina, luego
- (c)
- el producto de reacción procedente de (b) se hace reaccionar con una correspondiente ftalimida, p.ej. Netoxicarbonilftalimida, y
- (d)
- el producto de reacción procedente de (c) se hace reaccionar con una correspondiente piranosa protegida, p.ej. 2',4'-di-O-benzoíl-3'-desoxi-ribopiranosa, y finalmente
- (e)
- se separan los grupos protectores, p.ej. con un metilato, y
- (f)
- se llevan a cabo las otras etapas, tal como se han descrito más arriba.
Junto a esto, los derivados de indol tienen, como engarzadores, la ventaja consistente en la capacidad de emitir fluorescencia, y por lo tanto son especialmente preferidos para unos usos en la nanotecnología, en los que se trata eventualmente de la detección de unas cantidades pequeñísimas de las sustancias. Así, ya se describieron indol-1ribósidos en las citas de N. N. Suvorov y colaboradores, Biol. Aktivn. Soedin., Akad. Nauk SSSR 1965, 60 y de Tetrahedron 1967, 23, 4653. No obstante, no hay ningún procedimiento análogo para preparar derivados sustituidos en la posición 3. Por lo general, su preparación se efectúa a través de la formación de un aminal del componente de azúcar desprotegido y de una indolina, que se transforma luego mediante oxidación en el indol-1-ribósido. P.ej. se describieron indol-1-glucósidos y -1-arabinósidos (Y. V. Dobriynin y colaboradores, Khim.-Farm. Zh. 1978, 12, 33), cuyos derivados sustituidos en la posición 3 se habían preparado en la mayoría de los casos mediante una reacción de Vielsmeier. Sin embargo, esta ruta para la introducción de unidades de aminoetilo en la posición 3 del indol es muy costosa para un uso industrial.
En otra forma especial de realización se prepara, por lo tanto, de una manera ventajosa un engarzador de acuerdo con la fórmula (I), en la que X e Y, independientemente entre sí, iguales o diferentes, significan en cada caso =C(R16) con R16 igual a H o CnH2n y Z igual a =C(R16)- con R16 igual a (CnH2n)NR10R11, mediante el siguiente procedimiento:
- (a)
- la correspondiente indolina, p.ej. N-ftaloíl-triptamina, se hace reaccionar con una piranosa, p.ej. D-3'-desoxiribosa, para dar un nucleósidodiol, luego
- (b)
- los grupos hidroxilo de la parte de piranosilo del producto procedente de (a) se protegen de manera preferida con grupos acilo, p.ej. mediante el anhídrido de ácido acético, a continuación
- (c)
- el producto procedente de (b), se oxida p.ej. mediante 2,3-dicloro-5,6-dicianoparaquinona, y
- (d)
- los grupos protectores de hidroxilo de la parte de piranosilo del producto procedente de (c) se separan p.ej. mediante un metilato, y a continuación
- (e)
- se llevan a cabo las etapas adicionales, tal como ya se ha descrito más arriba.
En otra forma adicional de realización, en otra etapa adicional los 3’-desoxipentopiranosil-nucleósidos protegidos en la posición 4' o respectivamente 2' se fosfitilan o se unen a una fase sólida.
La fosfitilación se efectúa por ejemplo mediante cloruro de la diisopropil-amida del éster cianoetílico de ácido fosforoso en presencia de una base, p.ej. N-etildiisopropilamina o mediante tricloruro de fósforo e imidazol o respectivamente tetrazol y una subsiguiente hidrólisis mediando adición de bases. En el primer caso, el producto es un fosforoamidito y en el segundo caso un H-fosfonato. La unión de un pentopiranosil-nucleósido protegido conforme al invento a una fase sólida, p.ej. un "long-chain-alkylamino-controlled pore glass" (CPG = vidrio de poros controlados con alquil de cadena larga - amino de Sigma Chemie, Munich, Alemania) se puede efectuar, por ejemplo, a través de un engarzador de succinoílo.
Los compuestos obtenidos pueden servir para la preparación de los ácidos 3'-desoxipentopiranosil-nucleicos conformes al invento.
Un objeto adicional del presente invento es, por lo tanto, un procedimiento para la preparación de un ácido 3'desoxipentopiranosil-nucleico de acuerdo con la reivindicación 7, con las siguientes etapas:
- (a)
- en una primera etapa un 3'-desoxipentopiranosil-nucleósido protegido, tal como ya se ha descrito más arriba, se une a una fase sólida y
- (b)
- en una segunda etapa el 3'-desoxipentopiranosil-nucleósido protegido en la posición 4', unido a una fase sólida según la etapa (a), se prolonga con un 3'-desoxipentopiranosil-nucleósido protegido en la posición 4', fosfitilado en la posición 2' y, en el caso del empleo de fosforoamiditos, se oxida a continuación p.ej. mediante una solución acuosa de yodo, y
- (c)
- se repite la etapa (b) con los mismos o con diferentes 3'-desoxipentopiranosil-nucleósidos fosfitilados protegidos en las posiciones 3’, 4', durante tanto tiempo hasta que se presente el ácido 3'-desoxipentopiranosil-nucleico deseado.
En el caso del empleo de H-fosfonatos, la oxidación para dar los correspondientes diésteres de ácido fosfórico se efectúa por lo general al final de la cadena de reacciones, p.ej. mediante una solución acuosa de yodo.
Como reactivo de acoplamiento, en el caso del empleo de fosforoamiditos se adecua en particular el hidrocloruro de piridinio, puesto que, en contraposición a los reactivos de acoplamiento utilizados usualmente, no se efectúa ninguna recristalización del reactivo de acoplamiento, no se produce ninguna obstrucción de las conducciones para el reactivo de acoplamiento, y se efectúa una condensación esencialmente más rápida.
Como reactivo de acoplamiento, en el caso del empleo de H-fosfonatos, se adecuan en particular cloruros de arisulfonilo, clorofosfato de difenilo, cloruro de pivaloílo o cloruro de adamantoílo.
Una ventaja esencial del método con un H-fosfonato consiste en que no se necesita ningún grupo protector de fosfato. Los grupos protectores acilo de las bases se pueden separar p.ej. mediante amoníaco acuoso. En el caso de la utilización del radical 2-(4-nitrofenil)etilo como grupo protector de la posición O6 de la guanina, éste se puede eliminar, por ejemplo, sin problemas mediante un tratamiento durante 40 minutos con DBU 1 M.
Además, es ventajoso el hecho de que no es necesaria ninguna hidrazinolisis separadora de grupos protectores de oligonucleótidos, y por consiguiente, no se debe de temer ninguna apertura de anillo, sobre todo en los casos de uracilo y timina. Los radicales cianoetilo se pueden separar en común con los grupos protectores acilo de las bases mediante amoníaco acuoso. En el caso de la utilización del radical 2-(4-nitrofenil)etilo como grupo protector de la posición O6 de la guanina, el radical se puede separar sin problemas mediante un tratamiento durante 40 minutos con DBU 1 M.
En otra forma especial de realización, en la etapa (a) y/o en la etapa (b) se pueden incorporar también pentofuranosil-nucleósidos, p.ej. la adenosina, la guanosina, la citidina, la timidina y/o el uracilo que se presentan en su forma natural, lo que da lugar p.ej. a un p-DNA-ADN o respectivamente un p-DNA-ARN mixto.
Los p-NA’s y en particular los p-DNA’s forman entre sí unos duplicados estables, y por lo general no se emparejan con los ADN’s y ARN’s que se presentan en su forma natural. Esta propiedad hace que los p-NA’s sean unos sistemas preferidos de emparejamiento.
Tales sistemas de emparejamiento son unos sistemas supramoleculares con una interacción no covalente, que se distinguen por su selectividad, su estabilidad y su reversibilidad, y sobre cuyas propiedades se influye de manera preferida por medios termodinámicos, es decir por la temperatura, el valor del pH y la concentración. Tales sistemas de emparejamiento, p.ej. debido a sus propiedades selectivas, se pueden utilizar también como un "pegamento molecular" para la reunión de diversos racimos metálicos para formar asociaciones de racimos con unas propiedades potencialmente nuevas [véanse p.ej. las citas de R. L. Letsinger, y colaboradores, Nature 1996, 382, 607-9; y de P. G. Schultz y colaboradores, Nature 1996, 382, 609-11]. Como consecuencia de ello, los p-NA’s se adecuan también para el uso en el sector de la nanotecnología, por ejemplo, para la producción de nuevos materiales, agentes de diagnóstico y agentes terapéuticos así como de piezas componentes microelectrónicas, fotónicas o respectivamente optoelectrónicas, y para realizar la reunión controlada de especies moleculares para formar unidades supramoleculares, tal como p.ej. para la estructuración (combinatoria) de conjuntos de proteínas (véase p.ej. la cita de A. Lombardi, J.W. Bryson, W. F. DeGrado, Biomoleküls (Biomoléculas) (Pept. Sci.) 1997, 40, 495-504], puesto que los p-NA’s forman unos sistemas de emparejamiento, que son fuertes y controlables por medios termodinámicos. Otro uso adicional se establece, por lo tanto, dentro de los sectores del diagnóstico y del descubrimiento de fármacos (en inglés "drug discovery") mediante la posibilidad de proveer a unidades funcionales, de manera preferida biológicas, tales como proteínas o segmentos de ADN o ARN, de un código de p-NA, que no interfiera con los ácidos nucleicos naturales (véase p.ej. el documento WO 93/20242).
Una biomolécula, p.ej un ADN o ARN, se puede utilizar para la unión (el engarce) no covalente con otra biomolécula, p.ej. un ADN o ARN, cuando ambas biomoléculas contienen unos segmentos que, debido a unas secuencias complementarias de nucleobases, pueden unirse entre sí mediante una formación de puentes de hidrógeno. Tales biomoléculas encuentran utilización p.ej. en sistemas analíticos destinados a la amplificación de señales, en donde una molécula de ADN que se ha de analizar en cuanto a su secuencia, a través de un tal engarzador no covalente de ADN, debe de ser inmovilizada, por un lado, junto a un soporte sólido y debe de ser fijada, por otro lado, a una molécula de ADN ramificado (en inglés branchedDNA, bDNA), que refuerza la señal (véase la Fig. 3 en la cita de S. Urdea, Bio/Technol. 1994, 12, 926, o en el documento de patente de los EE.UU. n° 5.624.802). Una desventaja esencial de los sistemas descritos en último luga consiste en que ellos son hasta ahora inferiores, en lo que respecta a la sensibilidad, a los procedimientos para el diagnóstico con ácidos nucleicos mediante una reacción en cadena de la polimerasa (en inglés Polymerase-Chain-Reaction, PCR) (K. Mullis, Methods Enzymol. 1987, 155, 335). Este hecho se debe de atribuir, entre otras cosas, a que la unión no covalente del soporte sólido con la molécula de ADN que se ha de analizar, no siempre se efectúa de un modo específico, con lo que se llega a una mezcladura de las funciones de "reconocimiento de la secuencia" y "unión no covalente". La utilización de p-NA’s como un sistema ortogonal de emparejamiento, que no interviene en el suceso de emparejamiento con un ADN o respectivamente ARN, resuelve este problema de una manera ventajosa, con lo que se puede aumentar manifiestamente la sensibilidad de los procedimientos analíticos descritos.
Otro objeto del presente invento es, por lo tanto, un conjugado que contiene un 3'-desoxipentopiranosil-nucleósido conforme al invento de la fórmula (I) o (II) y una biomolécula, que se escoge entre el conjunto de los péptidos, las proteínas y los ácidos nucleicos.
En el sentido del presente invento, los conjugados son unos híbridos unidos covalentemente a base de p-NA’s y de un péptido, una proteína o un ácido nucleico,
por ejemplo, un anticuerpo o una parte funcional de éste o un ADN y/o ARN que se presenta en su forma natural. Las partes funcionales de anticuerpos son, por ejemplo, fragmentos Fv (Skerra & Plückthun (1988) Science 240, 1038), fragmentos Fv monocatenarios (scFv; Bird y colaboradores (1988), Science 242, 423; Huston y colaboradores (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 5879) o fragmentos Fab (Better y colaboradores (1988) Science 240, 1041).
En una forma preferida de realización se trata en este caso de conjugados de un p-DNA y un ADN o respectivamente de un p-DNA y un p-ARN.
Los conjugados se utilizan de manera preferida en el caso de que las funciones de "reconocimiento de la secuencia" y "unión no covalente" se tengan que realizar en una molécula, puesto que los conjugados conformes al invento contienen dos sistemas de emparejamiento que son ortogonales entre sí.
Para la preparación de conjugados se adecuan unos procedimientos tanto secuenciales como también convergentes.
En un procedimiento secuencial, p.ej. después de haber efectuado una síntesis automática de un oligómero de p-RNA directamente en el mismo sintetizador - después de haber reajustado los reactivos y el protocolo de acoplamiento -se sintetiza ulteriormente p.ej. un oligonucleótido de ADN. Este proceso se puede llevar a cabo también en un orden de sucesión inverso.
En un procedimiento convergente, se sintetizan p.ej. unos oligómeros de un p-RNA con unos engarzadores situados en el extremo terminal de amino y p.ej. unos oligómeros de ADN con p.ej. unos engarzadores de tioles en procesos separados. A continuación, se efectúa de manera preferida una yodoacetilación del oligómero de p-DNA y el acoplamiento de ambas unidades según protocolos conocidos a partir de la bibliografía (T. Zhu y colaboradores, Bioconjug. Chem. 1994, 5, 312).
Debido a su flexibilidad, los procedimientos convergentes se acreditan como especialmente preferidos.
Por el concepto de conjugado en el sentido del presente invento, se deben de entender también las denominadas matrices (en inglés "arrays"). Las matrices son unas disposiciones de especies de reconocimiento inmovilizadas, que especialmente en la analítica y el diagnóstico desempeñan un cometido importante en el caso de la determinación simultánea de analitos. Unos ejemplos son matrices de péptidos (Fodor y colaboradores, Nature 1993, 364, 555) y matrices de ácidos nucleicos (Southern y colaboradores, Genomics 1992, 13, 1008; Heller, documento de patente de los EE.UU. n° 5.632.957). Una flexibilidad más alta de estas matrices se puede conseguir mediante el recurso de que las especies de reconocimiento se unen a oligonucleótidos codificadores, y de que las pertinentes cadenas complementarias se unen a determinadas posiciones sobre un soporte sólido. Mediante aplicación de las especies codificadas de reconocimiento sobre el soporte sólido codificado en sentido opuesto (“anti-codificado”) y mediante ajuste de las condiciones de hibridación, las especies de reconocimiento se unen de un modo no covalente a las posiciones deseadas. De esta manera, sobre un soporte sólido se pueden disponer simultáneamente diferentes tipos de especies de reconocimiento, tales como p.ej. segmentos de ADN y anticuerpos, solamente mediante la aplicación de unas condiciones de hibridación (véase la Fig. 4). Sin embargo, una premisa para esto son unos codones y anticodones extremadamente fuertes, selectivos - con el fin de mantener a los segmentos codificadores lo más cortos que sea posible -, y que no interfieran con un ácido nucleico natural. Los p-NA’s, de manera preferida los p-DNA’s se adecuan para esto de una manera especialmente ventajosa.
Por lo tanto, el presente invento hace posible también un procedimiento con el que se pueden codificar inequívocamente unas especies de reconocimiento, de manera preferida unas cadenas de ADN o ARN naturales y unas proteínas, en este caso de manera preferida anticuerpos o partes funcionales de anticuerpos, por medio deunos segmentos de p-NA, de manera preferida unos segmentos de p-DNA. Éstos se pueden hibridar entonces de acuerdo con la Fig. 4 con los correspondientes codones sobre un soporte sólido. De esta manera, sobre un soporte sólido, que está provisto de codones en forma de una matriz, tan sólo mediante un ajuste de las condiciones de hibridación con unas combinaciones cada vez nuevas de especies de reconocimiento junto a las posiciones deseadas, se pueden constituir unas matrices cada vez nuevas, que son útiles para diagnóstico. Si entonces se aplica el analito, por ejemplo, una muestra biológica tal como un suero o de otro tipo, seguidamente las especies, que se han de detectar son fijadas en un patrón determinado sobre la matriz, que entonces es registrada indirectamente (p.ej. mediante una marcación por fluorescencia de la especie de reconocimiento) o directamente (p.ej. mediante medición de la impedancia en el punto de unión del codón). Luego se suprime la hibridación mediante una condición adecuada (temperatura, sales, disolventes, procesos electroforéticos) de tal manera que sólo quede otra vez el soporte con los codones. Éste se carga entonces de nuevo con otras especies de reconocimiento y se utiliza p.ej. para los mismos analitos para la determinación de otro patrón. La cada vez nueva disposición de las especies de reconocimiento en el formato de matriz y la utilización de unos p-NA’s como sistemas de emparejamiento, es especialmente ventajosa en comparación con otros sistemas, véase p.ej. el documento WO 96/13522 (página 16, abajo).
Las Figuras y los Ejemplos siguientes deben de describir más detalladamente el invento, pero sin restringirlo.
La Fig. 1 muestra la síntesis del componente de azúcar, significando T trifenil-metilo (tritilo).
La Fig. 2 muestra la ruta de síntesis para los eslabones monómeros, significando B una nucleobase, que se presenta en la naturaleza o sintética.
La Fig. 3 muestra un segmento de la estructura de un ARN en su forma que se presenta en la naturaleza (a la izquierda) y de un p-DNA (derecha).
La Fig. 4 muestra esquemáticamente una disposición de estructuras de reconocimiento inmovilizadas (matrices) sobre un soporte sólido.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
1,2-O-Isopropiliden-3-O-[(metiltio)tiocarbonil]-5-O-tritil-α-D-xilofuranosa (3)
444,3 g (1,027 moles) de 1,2-O-isopropiliden-5-O-tritil-α-D-xilofuranosa (2) se disolvieron en 1.000 ml de DMF absoluta. Mediando refrigeración, agitación con un agitador KPG, bajo una atmósfera de N2 y una ligera corriente de N2, a 0-5°C se añadieron en porciones en el transcurso de 1 h 29,58 g (1,232 moles) de NaH. Después de haberse terminado la adición del NaH, se agitó todavía durante otros 15 minutos mediando refrigeración. Se agitó todavía durante una hora más sin refrigeración hasta que ya no resultase nada de hidrógeno. La temperatura interna de la solución transparente fue de 12°C. Seguidamente se añadieron gota a gota 57,7 ml (1,027 moles) de sulfuro de carbono en el transcurso de 20 minutos. La temperatura de reacción se mantuvo en 20-25°C mediando refrigeración. Después de 30 minutos, se añadieron lentamente 77,4 ml (1,027 moles) de yodometano en el transcurso de 20 minutos mediando una ligera refrigeración (T = 20-25°C). Durante la reacción se tuvieron que añadir otros 500 ml de DMF. Después de otras 2 h, la tanda se añadió a 2 l de una mezcla de agua y hielo y 1,5 l de diclorometano, y se extrajo por agitación. La fase orgánica se extrajo 4 veces con 0,7 l de agua, se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró por evaporación. Se obtuvieron 610,5 g de un producto en bruto, que directamente se hizo reaccionar ulteriormente.
DC (= cromatografía en capa fina) (en gel de sílice, con una mezcla de acetona y heptano 1:4): Rf = 0,30.
1H RMN (300 MHz, CDCI3): 1,32, 1,56 (2s, 3H, 2 x CH3), 2,41 (s, 3H, S-CH3) , 3,32 (dd, 1H, H-C(5)), 3,47 (dd, 1H, HC(5)), 4,54 (m, 1H, H-C(4)), 4,64 (m, 1H, H-C(2)), 5,89 (m, 1H, H-C(3)), 6,09 (d, J = 3 Hz, 1H, H-C(1)), 7,18-7,43 (m, 15H, Harom).
Ejemplo 2
3-Desoxi-1,2,4-tri-O-benzoíl-α-D-eritro-pentosa (6)
4,16 g (1 mmol) de 3-desoxi-1,2-O-isopropiliden-5-O-tritil-α-D-xilofuranosa (4) se disolvieron en 20,0 ml de diclorometano. Mediando agitación a la TA (= temperatura ambiente) se añadieron 20,0 ml de agua y 2,0 ml de ácido trifluoroacético y se agitó durante 17 h a la TA. Las fases se separaron, la fase acuosa se extrajo 2 veces con en cada caso 20 ml de diclorometano y se concentró algo por evaporación. El residuo se disolvió todavía 2 veces en cada caso en 20 ml de agua y se concentró por evaporación. El residuo se disolvió otra vez en 20 ml de agua, se mezcló agitando durante 15 minutos con 2,0 g de un intercambiador de iones fuertemente básico (valor del pH 7-8), el intercambiador de iones se separó por filtración y se concentró por evaporación hasta sequedad. El aceite, que tenía un color ligeramente amarillento, se mezcló con 27 ml de una mezcla de piridina absoluta y diclorometano 2:1,se añadieron 2,0 g de un tamiz molecular de 4 Å y se agitó durante 1 h bajo argón. Seguidamente se añadieron gota a gota 6,1 ml de cloruro de benzoílo en 6,1 ml de piridina absoluta a -30°C. Después de 1 hora se dejó llegar a la temperatura ambiente y se agitó durante una noche. Después de la adición de 2 ml de MeOH se concentró por evaporación, el residuo sólido se evaporó conjuntamente con tolueno, se recogió de nuevo en tolueno, se mezcló agitando y se separó por filtración. El material filtrado se concentró por evaporación y se purificó a través de una columna de gel de sílice (gel de sílice 60, 4 x 33 cm) con un gradiente lineal desde heptano hasta una mezcla de heptano y EtOAC 2:1 en 4 l. Las fracciones de producto obtenidas se concentraron por evaporación, se mezclaron agitando en 30 ml de dietil-éter y el material sólido se filtró con succión. Se obtuvieron 1,07 g (25 %) de un material sólido de color blanco.
DC (en gel de sílice, con una mezcla de diclorometano y MeOH 4:1): Rf = 0,45.
DC (en gel de sílice, con una mezcla de heptano y EtOAc 2:1): Rf = 0,35.
1H RMN (300 MHz, CDCI3):
2,51 (m, 2H, H-C(3)), 4,01 (dd, 1H, H-C(5)), 4,21 (dd,1H, H-C(5)), 5,17 (m, 2H, H-C(4), H-C(2)), 6,38 (d, J=2 Hz, 1H, H-C(1)), 7,18-7,95 (m,16 H, Harom ), 7,40 (m, 4H, Harom), 752 (m, 1H, Harom), 7,95 (m, 6H, Harom).
13C RMN (300 MHz, CDCI3):
27,28 (s, C(3)), 63,45 (s, C(5)), 65,56 (s, C(4)), 66,24 (s, C(2)), 91,202 (s, C(1)), 128,2-129,9 (m, 12Carom), 133,07 (s, Carom, para), 133,22 (s, Carom, para), 133,71 (s, Carom, para), 164,22 (s, C=O), 165,60 (s, C=O), 166,06 (s, C=O).
Ejemplo 3
Síntesis del 2'-O-(2-cianoetil-N,N-diisopropil)-fosforoamidito de 1-{3'-desoxi-4'-O-[(4,4'-dimetoxitrifenil)-metil]-β-Dribopiranosil}timina (10α)
Síntesis de la 1-(3'-desoxi-2,4-di-O-benzoíl-β-D-ribopiranosil)-timina (7a)
1,0 g (2,24 mmol) de 3'-desoxi-1,2,4-tri-O-benzoíl-ribopiranosa (6) y 283 mg (2,24 mmol) de timina se suspendieron en 11,0 ml de acetonitrilo y se calentaron a 60°C. A esta mezcla se le añadieron gota a gota con una jeringa en el transcurso de 10 minutos 957 mg (4,7 mmol) de la N,O-bis-(trimetilsilil)-amida de ácido acético (BSA) y se dejó reposar durante 15 min a 60°C. A la solución resultante se le añaden 2,02 g (9,07 mmol) del éster trimetilsilílico de ácido trifluorometanosulfónico (= triflato de TMS) en el transcurso de 45 min y se agita posteriormente durante 2 h a 60°C. Le mezcla de reacción se deja enfriar a la TA, se diluye con EtOAc y se extrae frente a una solución diluida de NaHCO3. La fase de EtOAc se extrajo otra vez con agua, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró por evaporación. Mediante una cromatografía en presencia de gel de sílice 60 (3 x 28 cm) con un gradiente lineal de desde heptano hasta una mezcla de heptano y acetato de etilo 1:1 en 4 l, después de haber concentrado por evaporación las fracciones que contenían el producto, se obtuvo un material sólido amorfo incoloro, que se recogió en 20 ml de dietil-éter y se mezcló agitando. Resultaron 1,0 g (99 %) del producto deseado.
DC (en gel de sílice, con una mezcla de EtOAc y heptano 1:1): Rf = 0,27.
1H RMN (300 MHz, CDCI3): 1,94 (d, 3H, CH3), 2,12 (dd, 1H, Heq-C(3')), 2,93 (m, 1H, Hax-C(3')), 3,70 (t, 1H, Heq-C(5')), 4,40 (m, 1H, Hax-C(5')), 5,25 (m, 1H, H-C(4')), 5,32 (m, 1H, H-C(2')), 5,93 (d, J = 9,3 Hz, 1H, H-C(1')), 7,22 (d, 1H, H-C(6)), 7,38-7,50 (m, 4H, 3,5-Harom), 7,54-7,63 (m, 2H, 4-Harom), 7,94-8,04 (m, 4H, 2,6-Harom), 8,26 (bs, 1H, H-N(3)).
13C RMN (300 MHz, CDCI3): 12,52 (CH3), 165,10 (C=O), 34,63 (C(3')), 65,85 (C(4')), 67,64 (C(2')), 69,16 (C(5')), 82,22 (C(1')), 111,94 (C(5)), 128,50 (Carom), 128,54 (Carom), 128,72 (Carom), 129,21 (Carom), 129,71 (Carom), 129,85 (Carom), 133,51 (Carom), 133,63 (Carom), 134,66 (C(6)), 150,69 (C(2)), 163,31 (C(4)), 165,34 (C=O).
Síntesis de la 1-(3'-desoxi-ribopiranosil)-timina (8a)
807 mg (1,79 mmol) del compuesto 1 se agitaron en 20 ml de amoníaco metanólico durante 48 h a la TA. Después de esto, la solución de reacción se concentró por evaporación, el residuo sólido se mezcló agitando en una mezcla de EtOAc y MeOH 9:1 y se filtró con succión. Se obtuvieron 345 mg (80 %) de un material sólido cristalino de color blanco. Las aguas madres se concentraron por evaporación y se purificaron a través de una columna de gel de sílice (gel de sílice 60, 3 x 15 cm) con un gradiente lineal de desde EtOAc hasta una mezcla de EtOAc y MeOH 9:1 en 3 l. Se obtuvieron otros 70 mg (16 %) del producto deseado. En total se aislaron 415 mg (96 %) del compuesto 2.
DC (en gel de sílice, con una mezcla de EtOAc y MeOH 9:1): Rf = 0,28.
1H-RMN (300 MHz, MeOD): 1,48 (q, 1H, Hb(3'), 1,80 (d, 3H, CH3), 2,37 (m, 1H, Hb(3')), 3,20 (t, 1H, Hb(5')), 3,24 (m, 2H, OH), 3,70 (m, 1H, H(4')), 3,75 (m, 1H, H(2')), 3,90 (ddd, 1H, Ha(5')), 5,22 (d, 1H, J=9 Hz, H(1')), 7,37 (d, 1H, H(6)).
Síntesis de la 1-{3'-desoxi-4'-O-[(4,4'-dimetoxitrifenil)-metil]-β-D-ribopiranosil}-timina (9a).
320 mg (1,32 mmol) del compuesto 8a se disolvieron bajo una atmósfera de N2 en 6 ml de una mezcla de diclorometano absoluto y de piridina 1:2, se añadió 1 g de un tamiz molecular de 4 Å y la tanda se agitó durante 15 min a la TA. Seguidamente, se enfrió a -10°C, se añadieron 0,47 ml de diisopropilamina y 0,76 g (2,24 mmol) de cloruro de dimetoxitritilo (DMTCl) y se dejó llegar a la TA. Se agitó durante una noche. Una adición renovada de 0,38 g (1,12 mmol) de DMTCl en 2 ml de diclorometano absoluto y una agitación durante una noche llevaron a la reacción completarse. La tanda se filtró con succión con respecto del tamiz molecular, se vertió sobre una solución semisaturada de NaHCO3 y se extrajo con cloruro de metileno. La fase de cloruro de metileno se extrajo 2 veces por agitación con agua, se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró por evaporación. Se purificó sobre una columna de gel de sílice (gel de sílice 60; 3 x 20 cm) y con un gradiente (2 l de n-heptano y 2 l de una mezcla de n-heptano y acetato de etilo 1:1, como un gradiente lineal). Finalmente, se lavó la columna con una mezcla de heptano, EtOAc y MeOH 5:5:1, las fracciones que contenían el producto se concentraron por evaporación rotatoria, se mezclaron agitando con 50 ml de tetracloruro de carbono y se concentraron otra vez por evaporación. El residuo se secó en un HV (alto vacío) durante una noche. Se obtuvieron 352 mg (32 %) del producto 12a tritilado dos veces. Las fracciones polares se separaron otra vez sobre una columna de gel de sílice (gel de sílice 60, 3 x 25 cm) con un gradiente lineal desede diclorometano hasta una mezcla de diclorometano y MeOH 19:1 en 4 l. Se aislaron 50 mg (7 %) de 1-{3'desoxi-2'-O-[(4,4'-dimetoxitrifenil)-metil]-β-D-ribopiranosil}-timina 11a y 293 mg (41 %) del compuesto 9a.
DC (en gel de sílice):
9a (con una mezcla de CH2Cl2 y MeOH 19:1) Rf = 0,26
11a (con una mezcla de CH2Cl2 y MeOH 19:1) Rf = 0,29
12a (con una mezcla de EtOAc y heptano 4:1) Rf = 0,49
1H-RMN (300 MHz, CDCI3): 1,75 (s, 3H, CH3), 2,20 (m, 1H, Hax(3 ')), 2,92 (m, 1H, Heq(3')), 3,11 (m, 2H, H(4'), HaxC(5')), 3,34 (m, 1H, Heq(5')), 3,64 (m, 1H, H(2')), 3,71 (d, 6H, 2 x OCH3) , 5,26 (d, 1H, J=9 Hz, H(1')), 6,76 (m, 4H, Harom), 6,89 (d, 1H, H(6)), 7,10-7,44 (m, 9H, Harom), 9,14 (bs (= s ancho), 1H, H-N(3))
Síntesis del 2'-O-(2-cianoetil-N,N-diisopropil)-fosforoamidito de 1-{3'-desoxi-4'-O-[(4,4'-dimetoxitrifenil)-metil]-β-Dribopiranosil}-timina (10a)
218 mg (0,4 mmol) de 1-{3'-desoxi-4'-O-[(4,4'-dimetoxitrifenil)-metil]-β-D-ribopiranosil}-timina 9a se disolvieron en 2,0 ml de diclorometano absoluto y se mezclaron con 155 mg (1,2 mmol) de N-etildiisopropilamina. A la TA se añadieron seguidamente gota a gota en el transcurso de dos minutos 237 mg (1,0 mmol) del cloruro de la diisopropil-amida del mono-(éster 2-ciano-etílico) de ácido fosforoso. La tanda se agitó durante 3 h a la TA, se diluyó con CH2Cl2 hasta un volumen de 40 ml y se extrajo con 50 ml de un tampón de fosfato (de pH = 7), la fase orgánica se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró por evaporación. El producto en bruto se purificó a través de una columna de gel de sílice (3 x 15 cm) con un gradiente lineal de desde una mezcla de acetato de etilo y heptano 1:2 hasta acetato de etilo en 4 l. Se obtuvieron 266 mg (89 %) de una resina incolora.
DC (en gel de sílice, con una mezcla de heptano y EtOAc 4:1): Rf = 0,47/0,54 1H-RMN (400 MHz, CDCI3):
1,10 (m, 6H, 2x CH3); 1,83 (m, 1H, Hax-C(3')); 1,88 (m, 3H, CH3-C(5)); 2,21 (m, 1H, Heq-C(3')); 2,41-2,61 (m, 2H, CH2CN); 2,98 (m, 1H, Heq-C(5')); 3,19 (m, 1H, Hax-C(5')); 3,35-3,80 (m, 6H, CH2OP, H-C(4'), H-C(2'); 2xCH); 3,8 (m, 6H, 2xCH3); 5,41 (d, J=8,86 Hz, 1H, H-C(1')); 6,8 (m, 4H, HDMT); 6,97 (m, 1H, H-C(6)); 7,20-7,52 (m, 9H, Harom); 8,25 (s,1H, H-N(3)).
Ejemplo 4
Síntesis del 2'-O-(2-cianoetil-N,N-diisopropil)-fosforoamidito de N6-benzoíl-3-{3'-desoxi-4'-O-[(4,4'-dimetoxitrifenil)metil)-β-D-ribopiranosil}-adenina (10b)
Síntesis de la N6-benzoíl-3-(3'-desoxi-2,4-di-O-benzoíl-ribopiranosil)-adenina (7b)
2,23 g (5 mmol) del compuesto 6 y 1,20 g (5 mmol) de N6-benzoíl-adenina se mezclaron bajo una atmósfera de argón con 35 ml de acetonitrilo absoluto y se agitaron durante 15 minutos. Se calentó a un ligero reflujo. A esta suspensión se le añadieron gota a gota en el transcurso de 20 minutos 2,14 g (10,5 mmol) de BSA y se agitó durante 15 min a 68°C. Seguidamente, en el transcurso de 5 minutos, se añadieron gota a gota 4,7 g (18 mmol) de tetracloruro de estaño y se agitó durante 1 h bajo reflujo. Se dejó llegar a la TA, se vertió sobre 150 ml de una solución saturada de NaHCO3 y se extrajo frente a 100 ml de EtOAc. El material precipitado depositado se filtró con succión y se lavó con 150 ml de EtOAc. La fase orgánica se extrajo por agitación otra vez con 100 ml de agua, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró por evaporación. Se purificó a través de una columna de gel de sílice (3 x 26 cm) con una mezcla de gradientes (2 l de una mezcla de EtOAc y heptano 2:1 y 2 l de EtOAc como un gradiente lineal), se reunieron las tandas que contenían el producto, y se aislaron 2,7 g (96 %) de un material sólido de color blanco.
DC (en gel de sílice): 4 (EtOAc): Rf = 0,40.
1H-RMN (300 MHz, CDCI3): 2,16 (m, 1H, Hax(3')), 2,97 (m, 1H, Heq(3')), 3,76 (m, 1H, Hax(5')), 4,41 (m, 1H, Heq(5')), 5,38 (m, 1H, H(4')), 5,62 (m, 1H, H(2')), 5,98 (d, 1H, J = 8,92 Hz, H(1')), 7,22-8,0 (m, 15H, Harom), 8,21 (s, 1H, H(8)), 8,74 (s, 1H, H(2)), 8,91 (bs, 1H, NH).
13C-RMN (300 MHz, CDCI3): 34,57 (C(3')), 65,80 (C(4')), 68,86 (C(2')), 69,13 (C(5')), 82,67 (C(1')), 122,53 (C(6)), 127,76-133,62 (12 x C(arom)), 140,62 (C(8)), 149,63 (C(6)), 151,91 (C(4)), 153,03 (C(2)), 164,44 (C=O junto a NC(6)), 164,77 (C=O), 165,32 (C=O).
Síntesis de la N6-benzoíl-3-(3'-desoxi-β-D-ribopiranosil)-adenina (8b)
280 mg (0,5 mmol) del compuesto 7b se disolvieron en 7 ml de una mezcla de THF, MeOH y H2O 5:4:1, se enfrió a -5°C, y se añadieron lentamente 2,22 ml de una solución al 32 % de NaOH en una mezcla de THF, MeOH y H2O 5:4:1, de tal manera que la temperatura quedó por debajo de 0°C. Se agitó durante 20 min mediando refrigeración, se mezcló con 400 mg (7,5 mmol) de cloruro de amonio y se dejó que la solución llegase hasta la TA. Se eliminaron los disolventes, el residuo se disolvió en 20 ml de MeOH, se extendió sobre 10 g de gel de sílice y se purificó por cromatografía a través de una columna de gel de sílice (3 x 12 cm con 1 l de diclorometano y 2 l de una mezcla de CH2Cl2 y MeOH 4:1 como un gradiente lineal). Se aislaron 157 mg (88 %) del material sólido incoloro 8b.
DC (en gel de sílice): 5 (en una mezcla de EtOAc y MeOH 4:1): Rf = 0,34.
1H-RMN (300 MHz, MeOD): 1,58 (q, 1H, Hax(3')), 2,45 (m, 1H, Heq(3')), 3,33 (m, 1H, Hax(5')), 3,87 (m, 1H, H(4')), 3,97 (m, 1H, Heq(5')), 4,25 (m, 1H, H(2')), 5,40 (d, 1H, J=9,2 Hz, H(1')), 7,30-8,02 (m, 5H, Harom), 8,47 (s, 1H, H(8)), 8,63 (s, 1H, H(2).
Síntesis de la N6-benzoíl-3-{3'-desoxi-4'-O-[(4,4'-dimetoxitrifenil)-metil]-β-D-ribopiranosil}-adenina (9b)
Bajo una atmósfera de argón se disolvieron 1,02 g (2,87 mmol) del compuesto 8b en 9,0 ml de piridina absoluta, seañadieron 1,56 g (12 mmol) de N-etildiisopropilamina y 1,0 g de un tamiz molecular de 4 Å y se agitó durante 30 min a la TA. Seguidamente, se enfrió a -10°C, en el transcurso de 30 min se añadieron gota a gota 2,2 g (6,49 mmol) de DMTCl disueltos en 5,0 ml de cloroformo absoluto. La mezcla de ensayo se agitó a la TA durante una noche. Después de 22 h, se añadieron de nuevo 200 mg (0,59 mmol) de DMTCl y, a las 2 h después de esto, se añadieron otros 430 mg (1,27 mmol) de DMTCl en una forma sólida. Después de nuevamente 22 h a la TA, se vertió la tanda sobre 100 ml de una solución semisaturada de NaHCO3, se mezcló y extrajo con 100 ml de cloruro de metileno. La fase orgánica se extrajo de retorno todavía 2 veces con en cada caso 100 ml de H2O, se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró por evaporación. La purificación a través de una columna de gel de sílice (3 x 25 cm) con un gradiente (de desde 2 l de una mezcla de EtOAc y heptano 2:1 hasta 2 l de EtOAc con un gradiente lineal) proporcionó: 520 mg (27,5 %) del compuesto 9b, 430 mg (23 %) de una mezcla de los compuestos 9b y 11b, 370 mg (13,4 %) del compuesto 12b y 370 mg (20 %) del educto.
DC (en gel de sílice, con EtOAc):
9b: Rf = 0,29
11b: Rf = 0,12
12b: Rf = 0,55
1H-RMN (500 MHz en CDCI3):
1,92 (m, 1H, Hax(3')), 2,42 (m, 1H, Heq(3')), 2,99 (m, 1H, Heq(5')), 3,21 (m, 1H, Hax(5')), 3,79 (d, 6H, 2 x (OCH3),
3,84 (m, 1H, H(4')), 4,13 (m, 1H, H(2')), 5,17 (bs, 1H, OH), 5,32 (d, 1H, J=8,7 Hz, H(1')), 6,86 (dd, 4H, Harom),
7,20-7,75 (m, 12H, Harom) , 7,96 (m, 3H, 1H(8), 2Harom), 8,54 (s, 1H, H(2)), 8,94 (bs, 1H, NH).
13C-RMN (500 MHz en CDCI3):
39,13 (C(3')), 55,26 (2 x OCH3), 66,59 (C(4')), 67,72 (C(2')), 70,76 (C(5')), 86,69 (Cterc.-tritilo), 86,93 (C(1')), 113,31
(2Carom), 113,34 (2Carom), 121,8 (C(5)), 127,04 - 136,74 (11Carom), 141,74 (C(8)), 145,51 (Carom), 148,85 (C(6)), 151,56 (C(2)), 158,74 (2Carom), 164,61 (C=O).
Síntesis del 2'-O-(2-cianoetil-N,N-diisopropil)-fosforoamidito de N6-benzoíl-3-{3'-desoxi-4'-O-[(4,4'-dimetoxitrifenil)metil)-β-D-ribopiranosil}-adenina (10b)
380 mg (0,58 mmol) de N6-benzoíl-3-{3'-desoxi-4'-O-[(4,4'-dimetoxitrifenil)-metil]-β-D-ribopiranosil}-adenina 9b se disolvieron en 2,0 ml de diclorometano absoluto y se mezclaron con 224 mg (1,73 mmol) de N-etildiisopropilamina. A la TA se añadieron gota a gota seguidamente 342 mg (1,44 mmol) del cloruro de la diisopropil-amida del mono(éster 2-cianoetílico) de ácido fosforoso en el transcurso de dos minutos. La tanda se agitó durante 3 h a la TA, se diluyó con CH2Cl2 hasta un volumen de 40 ml y se extrajo con 50 ml de un tampón de fosfato (pH = 7). La fase orgánica se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró por evaporación. La columna de gel de sílice (3 x 15 cm) se purificó con un gradiente lineal de desde una mezcla de EtOAc y heptano (1:2) hasta una mezcla de EtOAc y heptano (4:1) como un gradiente lineal. Se obtuvieron 400 mg (80 %) de una espuma amarillenta.
DC (en gel de sílice, en una mezcla de EtOAc y heptano 4:1) Rf = 0,38
1H-RMN (400 MHz en CDCI3):
1,05 (m, 6H, 2xCH3) ; 1,87 (m, 1H, Hax-C(3')); 2,23 (m, 1H, Heq-C(3')); 2,32 & 2,55 (2 x m, 2H, CH2CN); 3,05-3,70 (m, 6H, 2xCH, CH2OP, 2xH-C(5')); 3,79 (m, 6H, 2xOCH3) ; 3,90 (m, 1H, H-C(4')); 4,12 (m, 1H, H-C(2')); 5,47 (2xd, J=8,87Hz, 1H, H-C(1')); 6,85 (m, 4H, HDMT); 7,20-7,65 (m, 13 H, Harom); 8,0 (m, 2H, Harom); 8,09 (s, 1H, H-C(8)); 8,80 (s, 1H, H-C(2)); 8,97 (s, ancho, 1H, HN)
Síntesis del N6-benzoíl-3-{3'-desoxi-4'-O-[(4,4'-dimetoxitrifenil)-metil]-β-D-ribopiranosil}-adenina-2'-O-succinoílo (13b)
115 mg (0,174 mmol; 1 eq) de N6-benzoíl-3-{3'-desoxi-4'-O-[(4,4'-dimetoxitrifenil)-metil]-β-D-ribopiranosil}-adenina (9b) se agitaron en común con 35 mg (0,35 mmol; 2 eq) de anhídrido de ácido succínico y 25 mg (0,21 mmol; 1,2 eq) de DMAP en 1,0 ml de CH2Cl2 absoluto bajo una atmósfera de N2 durante 2 1/2 h a la TA. Luego se diluyó con cloruro de metileno hasta un volumen de 20 ml, se extrajo 1 vez con 20 ml de ácido cítrico al 10 % y 3 veces con en cada caso 20 ml de agua. La fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró por evaporación. Se obtuvieron 130 mg (99 %) del compuesto 13b.
DC (en gel de sílice, una mezcla de EtOAc y MeOH 19:1) Rf = 0,14
1H-RMN (500 MHz, CDCI3):
1,82 (m, 1H, Hax(3')), 2,20 (m, 2H, 2 x CH2) , 2,32 (m, 1H, Heq (3')), 3,02 (m, 1H, Heq(5')), 3,30 (m, 1H, Hax(5'), 3,73 (d, 6H, 2 x OMe), 3,82 (m, 1H, H(4'), 5,06 (m, 1H, H(2')), 5,55 (d, J = 9,5 Hz, 1H, H(1')), 6,79 (m, 4H, o para OMe), 7,147,49 (m, 12H, 9Htritilo, 3HBz), 7,87-7,91 (m, 2H, 2HBz), 7,94 (s, 1H, H-C(8)), 8,55 (s, 1H, H(2), 9,6 (bs, 1H, -COOH).
Claims (14)
- REIVINDICACIONES1. Eslabones de 3'-desoxipentopiranosil-nucleósidos de la fórmula (I),en la que R1 es igual a OH, Hal con Hal igual a Br o Cl, un radical escogido entrecon i-Pr igual a isopropilo, o -O-PH-(=O)(-O'),R2, R3 y R4, independientemente entre sí, iguales o diferentes, significan en cada caso H, NR5R6, OR7, SR8, =O, CnH2n+1 siendo n un número entero de 1-12, de manera preferida 1-8, en particular 1-4, un grupo eliminable en laR1810 posición β de la fórmula -OCH2CH2R18 con igual a ciano o un radical p-nitrofenilo o un radical fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc), o (CnH2n)NR10R11, con R10R11 igual a H, CnH2n+1 o R10R11 unidos a través de un radical de la fórmula, R13, R14en la que R12 y R15, independientemente entre sí, iguales o diferentes, significan en cada caso H, OR7, ó 15 CnH2n+1 ó CnH2n-1, teniendo n el significado arriba mencionado, yen la que R5, R6, R7 y R8 independientemente entre sí, iguales o diferentes, significan en cada caso H, CnH2n+1 ó CnH2n-1, teniendo n el significado arriba mencionado, -(CO)R9 con R9 igual a un radical alquilo lineal o ramificado, eventualmente sustituido, arilo, de manera preferida fenilo,X, Y y Z independientemente entre sí, iguales o diferentes, significan en cada caso =N-, =C(R16)- o -N(R17) en queR16y R17 independientemente entre sí, iguales o diferentes, significan en cada caso H o CnH2n+1 ó (CnH2n)NR10R11 con los significados arriba mencionados, ySc1 es hidrógeno o un grupo protector escogido entre un grupo protector escogido entre un grupo protector acilo, tritilo, fluorenilmetiloxicarbonilo o inestable frente a la luz, un grupo dansilo o aliloxicarbonilo, en particular un grupo benzoílo o 4,4'-dimetoxitritilo (DMT),o de la fórmula (II)en la que R1' es igual a OH ó Hal, con Hal igual a Br o Cl, un radical escogido entrecon i-Pr igual a isopropilo ó -O-PH-(=O)(-O'),R2', R3' y R4' independientemente entre sí, iguales o diferentes, significan en cada caso =O, CnH2n+1 ó CnH2n-1, un grupo eliminable en la posición β de la fórmula -OCH2CH2R18 con R18 igual a un radical ciano o p-nitrofenilo o uny R11radical fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc), o (CnH2n)NR10R11, teniendo R10 independientemente entre sí el significado arriba mencionado de R10 o respectivamente R11,y'y R17'X' significa =N-, =C(R16')-, ó N(R17')-, teniendo R16 independientemente entre sí, el significado arriba mencionado de R16 o respectivamente R17, y teniendo Sc1' el significado arriba mencionado de Sc1.
-
- 2.
- 3'-Desoxipentopiranosil-nucleósidos de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizados porque el 3'desoxipentopiranosil-nucleósido es un 3'-desoxi-ribo-, 3'-desoxiarabino-, 3'-desoxilixo- y/o 3'-desoxixilo-piranosilnucleósido, de manera preferida un 3'-desoxi-ribo-piranosil-nucleósido.
-
- 3.
- 3'-Desoxipentopiranosil-nucleósidos de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizados porque la parte del 3'-desoxipentopiranosilo está configurada D o L.
-
- 4.
- 3'-Desoxipentopiranosil-nucleósidos de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-2, caracterizados porque el 3'-desoxipentopiranosil-nucleósido es una/un 3'-desoxipentopiranosil-purina, -2,6-diaminopurina, -6-purinatiol, -adenina, -guanina, -isoguanina, -xantina, -hipoxantina, -timina, -indol, -triptamina, -N-ftaloíl-triptamina, -cafeína, -teobromina o -teofilina.
-
- 5.
- 3'-Desoxipentopiranosil-nucleósidos de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-4, caracterizados porque R2, R3 y/o R4 significan un radical 2-ftalimidoetilo o aliloxi o un radical de la fórmula -N[C(O)R9]2, y/o R2', R3' y/o R4' significan un radical 2-ftalimidoetilo.
-
- 6.
- 3'-Desoxipentopiranosil-nucleósidos de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-5, caracterizados porque el 3'desoxipentopiranosil-nucleósido es un [(2',4'-di-O-benzoíl)-3'-desoxi-β-ribopiranosil]-nucleósido, un N-benzoíl-2',4'-di
O-benzoíl-3'-desoxi-ribopiranosil-nucleósido, un N-isobutiroíl-2',4'-di-O-benzoíl-3'-desoxi-ribopiranosil-nucleósido, un O6-(2-(4-nitrofenil)etil)-N2-isobutiroíl-2',4'-di-O-benzoíl-3'-desoxi-ribopiranosil-nucleósido, un 3'-desoxi-β-ribopiranosilnucleósido, un N-benzoíl-, N-isobutiroíl-, O6-(2-cianoetil)- u O6-(2-(4-nitrofenil)etil)-N2-isobutiroíl-3'-desoxi-βribopiranosil-nucleósido, un 4'-DMT-3'-desoxipentopiranosil-nucleósido, de manera preferida un 4'-DMT-3'-desoxiribopiranosil-nucleósido, un N-benzoíl-4'-DMT-3'-desoxi-ribopiranosil-nucleósido, un N-isobutiroíl-4'-DMT-3'-desoxiribopiranosil-nucleósido, un O6-(2-cianoetil)-N2-isobutiroíl-4'-DMT-3'-desoxi-ribopiranosil-nucleósido, un O6-(2-(4nitrofenil)etil)-N2-isobutiroíl-4'-DMT-3'-desoxi-ribopiranosil-nucleósido, una 3'-desoxi-β-ribopiranosil-N,N'-dibenzoíladenosina o una 3'-desoxi-β-ribopiranosil-N,N'-dibenzoíl-guanosina. -
- 7.
- Procedimiento para la preparación de un ácido 3'-desoxipentopiranosil-nucleico, caracterizado porque
- (a)
- en una primera etapa un 3'-desoxipentopiranosil-nucleósido protegido, de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-6, se une a una fase sólida y
- (b)
- en una segunda etapa el 3'-desoxipentopiranosil-nucleósido protegido en la posición 4', que está unido a una fase sólida de acuerdo con la etapa (a), se prolonga con un 3'-desoxipentopiranosil-nucleósido protegido en la posición 4' y fosfitilado en la posición 2', y
- (c)
- se repite la etapa (b).
-
- 8.
- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque en la etapa (a) y/o en la etapa (b) se incorporan también pentofuranosil-nucleósidos.
-
- 9.
- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, caracterizado porque como reactivo de acoplamiento para realizar la prolongación de acuerdo con la etapa (b) se emplea hidrocloruro de piridinio en el caso del empleo de fosforoamiditos, y en el caso del empleo de H-fosfonatos se emplean cloruros de arilsulfonilo, clorofosfato de difenilo, cloruro de pivaloílo o cloruro de adamantoílo.
-
- 10.
- Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 7-9, caracterizado porque en otra etapa adicional (d) se separan los grupos protectores y el oligómero formado se separa con respecto de la fase sólida.
-
- 11.
- Ácidos 3'-desoxipentopiranosil-nucleicos caracterizados porque ellos están constituidos por 3'desoxipentopiranosil-nucleósidos de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 6.
-
- 12.
- Utilización de 3'-desoxipentopiranosil-nucleósidos de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 6 para la preparación de ácidos 3'-desoxipentopiranosil-nucleicos.
-
- 13.
- Conjugados, que contienen un ácido 3'-desoxipentopiranosil-nucleico, de acuerdo con la reivindicación 11 y una biomolécula que se escoge entre el conjunto que se compone de los péptidos, las proteínas o los ácidos nucleicos.
-
- 14.
- Conjugado de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque la biomolécula es un anticuerpo o una parte funcional de éste o un ADN y/o un ARN.
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