ES2332139T3 - Polinucleotidos con mimetico de fosfato. - Google Patents
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Abstract
Oligonucleótido que contiene al menos una vez la estructura **(Ver fórmula)** A representa el extremo 5'' de un nucleótido o de una cadena nucleótida, B el extremo 3'' de un nucleótido o de una cadena nucleótida, y D es hidroxilo o CH3, Acc un aceptor de electrones, opcionalmente sustituido con un radical R, siendo R cualquier sustituyente orgánico, caracterizado porque Acc se elige de un grupo formado por - -CN, - -SO2-R'', donde R'' contiene como mínimo un alquilo sustituido con amino, un arilo opcionalmente sustituido o un heterociclo opcionalmente sustituido, - y heterociclos-N+ de seis miembros escogidos de un grupo formado por piridinio, pirimidinio y quinolinio.
Description
Polinucleótido con mimético de fosfato.
La presente invención se refiere a nuevas
sustancias y a sus métodos de preparación, en el sector de la
química de los nucleótidos. Se trata de los llamados miméticos de
fosfatos, en los cuales un grupo hidroxilo está sustituido por un
mimético adecuado.
La presente invención se refiere particularmente
a una nueva clase de oligonucleótidos modificados y a métodos para
su preparación.
Anteriormente ya se han descrito diferentes
métodos de preparación de nucleótidos u oligonucleótidos modificados
en el resto de fosfato.
Los (desoxi)oligonucleótidos sintéticos
se preparan generalmente en una fase sólida mediante la química de
la fosforamidita. Como fase sólida suelen usarse perlas de vidrio
con poros de tamaño definido (en lo sucesivo llamadas de modo
abreviado CPG = controlled pore glass [vidrio de poro
controlado]). El primer monómero va unido al soporte mediante
un grupo separable, con lo cual al terminar la síntesis en fase
sólida se puede desprender el oligonucleótido libre. Además el
primer monómero lleva un grupo hidroxilo protegido, usándose
normalmente dimetoxitritilo (DMT) como grupo protector. El grupo
protector se puede eliminar por tratamiento ácido. Luego, en un
proceso cíclico, se acoplan sucesivamente derivados
3'-fosforamidita de (desoxi)ribonucléosidos
- provistos asimismo de un grupo protector DMT en el extremo 5' - al
respectivo grupo reactivo liberado del grupo protector. Como
alternativa, en la síntesis inversa de oligonucleótidos se usan
5'-fosforamiditas protegidas con dimetoxitritilo en
3'. Especialmente, para introducir modificaciones en la estructura
de fosfato, p.ej. para preparar fósforotioatos marcados
radiactivamente, también se emplea la estrategia del
H-fosfonato. Asimismo se conocen varias estrategias
relativas a la preparación de oligonucleótidos modificados o
marcados: para preparar oligonucleótidos marcados en el extremo 3'
se emplean, según el estado técnico, materiales soporte
trifuncionales (US 5,290,925, 5,401,837). Para preparar
oligonucleótidos marcados en el extremo 5' se emplean habitualmente
fosforamiditas marcadas con un grupo que va unido a la fosforamidita
mediante un conector C3-12 (US 4,997,928, US
5,231,191). Además los oligonucleótidos se pueden modificar en las
bases individuales (US 5,241,060, US 5,260,433, US 5,668,266) o
introduciendo conectores internos no nucleósidos (US 5,656,744, US
6,130,323).
Como alternativa pueden marcarse en el
internucleósido-fosfato por marcación postsintética
de fósforotioatos (Hodges, R.R., y otros, Biochemistry 28 (1989)
261-7) o marcando a posteriori un fosforamidato
funcionalizado (S. Agrawal en Methods in Mol. Biology [Métodos
en biología molecular], vol. 26, Protocols for Oligonucleotide
Conjugates [Protocolos para conjugados de oligonucleótidos],
Humana Press, Totowa, NJ, 1993, capítulo 3). Sin embargo estos
métodos no han impuesto, debido a la inestabilidad de los
fosforamidatos y de los tio-ésteres del ácido fosfórico.
También se conoce del estado técnico la
introducción de modificaciones en el resto de fosfato del
inter-nucleósido. En los casos principales se trata
de fósforotioatos (Burgers, Peter M.J. y Eckstein, Fritz,
Biochemistry 18, (1979) 592-6), fosfonatos de
metilo (Miller, P.S. y otros, Biochemistry 18 (1979)
5134-43) o borano-fosfatos (WO
91/08213). Para preparar
metilfosfonato-oligonucleótidos hay que sintetizar
monómeros especiales. En cambio para sintetizar fósforotioatos y
borano-fosfatos se pueden usar fosforamiditas o
H-fosfonatos, introduciendo directamente la borano-
o tiomodificación por medio de reactivos especiales que reaccionan
con el H-fosfonato trivalente o con el triéster de
ácido fosfónico, durante o después de la síntesis del
oligonucleótido. Aunque todos estos métodos dan lugar a
oligonucleótidos modificados, las condiciones de la química de
síntesis aplicada en ellos no permite introducir directamente de
esta manera marcaciones detectables o grupos funcionales en la
estructura de fosfato, durante la síntesis de los
oligonucleótidos.
Baschang, G. y Kvita, V. describen en Angewandte
Chemie [Química aplicada] 85(1) (1973)
43-44 la reacción de un
nucleótido-triéster de ácido fosfórico con azidas,
como por ejemplo
metil-sulfonil-azida, para preparar
tri-alquil(aril)-imidofosfatos,
que de todos modos son inestables y se descomponen.
Nielsen, J. y Caruthers, M.H., J. Am. Chem. Soc.
110 (1988) 6275-6276, describen la reacción de
desoxinucleósido-fosfitos dotados de un grupo
protector
2-ciano-1,1,-dimetil-etilo,
en presencia de alquil-azida. Además los autores
exponen que este principio es adecuado para preparar nucleótidos
modificados en el resto de fosfato, sin detallar qué tipo de
modificaciones efectuadas con la ayuda del método revelado podrían
presentar ventajas especiales. Los autores proponen especialmente
la introducción de radicales alquilo.
La patente WO 89/091221 revela
N-alquil-fosforamidatos u
oligonucleótidos sustituidos con N-alquilo en, al
menos, un resto fosfato, que se preparan por oxidación de
nucleósido-fosfitos (provistos de un grupo
protector) con yodo en presencia de alquilaminas apropiadas.
La patente WO 03/02587 revela la preparación de
oligonucleótidos modificados, en los cuales se convierten
H-fosfatos en fósforo-amidatos por
aminación.
Así pues, todas estas publicaciones describen la
preparación de moléculas que en vez de un resto de fosfato
contienen un fosforamidato. Sin embargo, las moléculas que llevan
fosforamidato son sensibles a la hidrólisis, porque el grupo amino
se protona en medio ácido y puede sustituirse por agua.
Además la patente WO 01/14401 propone bloques
funcionales de nucleótidos u oligonucleótidos en que un resto de
fosfato está sustituido con N- -ClO3, N- -NO2 o
N- -SO2R. Según revela la patente WO 01/14401 tales sustancias
pueden prepararse por reacción del grupo hidroxilo libre de un
desoxi-nucleósido con cloruro de amidofosfonilo en
presencia de piridina. Sin embargo este modo de preparación es
complejo, requiere mucho tiempo y no es apropiado para síntesis
rutinarias de nucleótidos y oligonucleótidos.
El planteamiento técnico de la presente
invención consistía pues en proporcionar mejores oligonucleótidos
marcados y métodos sencillos para su preparación.
Por lo tanto la presente invención tiene por
objeto un oligonucleótido que contiene al menos una vez la
estructura
donde
A representa el extremo 5' de un nucleótido o de
una cadena nucleótida, y
B el extremo 3' de un nucleótido o de una cadena
nucleótida,
D es hidroxilo o CH3 y
Acc un aceptor de electrones, opcionalmente
sustituido con un radical R, siendo R cualquier sustituyente
orgánico, y
Acc se elige de un grupo formado por
- -
- -CN,
- -
- -SO2-R', donde R' contiene como mínimo un alquilo sustituido con amino, un arilo opcionalmente sustituido o un heterociclo opcionalmente sustituido,
- -
- y heterociclos-N+ de seis miembros escogidos de un grupo formado por piridinio, pirimidinio y quinolinio.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prefieren particularmente los
oligonucleótidos en que R o R', solos o combinados, contienen una
unidad o un grupo funcional detectable.
Según la presente invención, estos
oligonucleótidos se preparan mediante métodos caracterizados porque
un derivado fosfórico trivalente correspondiente a la estructura
química
donde E es un grupo metilo o un
grupo hidroxilo
protegido,
donde A representa el extremo 5' de un
nucleótido o de una cadena nucleótida, y
donde B representa el extremo 3' de un
nucleótido o de una cadena nucleótida,
se hace reaccionar con una azida de
estructura
N=N=N-Acc,
donde Acc se escoge de un grupo
formado
por
- -
- -CN, -SO2-R'
- -
- y heterociclos-N+ de seis miembros escogidos de un grupo formado por piridinio, pirimidinio y quinolinio.
\vskip1.000000\baselineskip
En una forma de ejecución especial para la
preparación de un oligonucleótido según la presente invención
primero tiene lugar
- a)
- la reacción de una 3'-fosforamidita con el extremo 5'-OH de un oligonucleótido naciente y a continuación
- b)
- la reacción con una azida de estructura
N=N=N-Acc,
- en que Acc es un aceptor de electrones, opcionalmente sustituido con un radical R, siendo R un sustituyente orgánico cualquiera.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prefieren especialmente los métodos en que R
contiene una unidad o un grupo funcional detectable.
Los oligonucleótidos de la presente invención
obtenidos de este modo se pueden emplear en todas las aplicaciones
que requieren componentes de hibridación - sobre todo derivados o
marcados - en cualquier forma.
Estos oligonucleótidos pueden utilizarse
concretamente como sondas de hibridación para detectar secuencias
diana.
Otro uso potencial es el empleo de los
oligonucleótidos modificados según la presente invención como
oligonucleótidos antisentido o siARNs para inactivar la expresión
genética.
\vskip1.000000\baselineskip
El objetivo de la presente invención es preparar
de modo sencillo nucleótidos u oligonucleótidos que contienen
restos de fosfato modificados y, por tanto, también pueden contener,
preferiblemente, marcaciones detectables.
En este sentido la idea básica de la presente
invención era partir de un átomo de fósforo trivalente y hacerlo
reaccionar con un reactivo, para obtener un mimético de fosfato
estable. Para ello, según la presente invención, un átomo de
fósforo que lleva al menos un resto hidroxilo, provisto de un grupo
protector, se hace reaccionar con una azida de estructura
N=N=N-Acc, en la cual Acc es un aceptor de
electrones, opcionalmente sustituido con un radical R, siendo R un
sustituyente orgánico cualquiera. De este modo se forma un átomo de
fósforo pentavalente que va unido por enlace covalente a través de
un átomo de N con un grupo aceptor y fuertemente atrayente de
electrones. Este grupo hace que los compuestos así preparados,
contrariamente a los compuestos de fosforamidato conocidos del
estado técnico, sean mesoméricamente estables y resistentes a la
hidrólisis.
Este fundamento de la presente invención es
extensible a todos los procesos en que aparece un fósforo trivalente
como producto intermedio.
Durante una síntesis convencional de
oligonucleótidos con empleo de fósforo-amiditas se
forman triésteres de ácido fosfónico con un átomo de fósforo
trivalente, como productos intermedios. La primera y segunda unión
estérica constituyen el enlace internucleósido. El átomo de fósforo
va unido por el tercer enlace éster a un grupo hidroxilo protegido,
p.ej. con un grupo
beta-cianoetil-oxi. Luego, en lugar
de una oxidación con yodo, el oligonucleótido naciente se puede
hacer reaccionar, según la presente invención, con una azida
apropiada, con lo cual el átomo de fósforo trivalente se oxida a un
átomo pentavalente, desprendiéndose nitrógeno y uniéndose por
enlace covalente a -N-Acc.
A continuación, la síntesis del oligonucleótido
puede proseguir tal como se conoce en el estado técnico. Como
producto final se obtienen oligonucleótidos estables modificados
prácticamente a voluntad en uno o varios restos de fosfato
internucleótidos.
\newpage
En el marco de la presente invención hay que
definir como sigue algunos de los conceptos empleados:
Se designan como grupos reactivos aquellos
grupos de una molécula que en condiciones adecuadas son capaces de
reaccionar con otra molécula, formando un enlace covalente. Ejemplos
de grupos reactivos son hidroxilo, amino, tiol, hidrazino,
hidroxilamino, dienos, alquinos y carboxilos.
Se denominan grupos protectores aquellas
moléculas que reaccionan con uno o más grupos reactivos de una
molécula, de manera que en el marco de una reacción de síntesis de
varias etapas solo pueda reaccionar con el correactante deseado un
determinado grupo reactivo no protegido. Como ejemplos de grupos
protectores usados frecuentemente para proteger grupos hidroxilo
cabe citar los grupos
beta-ciano-etilo, -metilo,
trialquilsililo- y alilo. Grupos protectores para proteger grupos
amino son trifluoroacetilo y fmoc. En publicaciones estándar se
recogen otros posibles grupos protectores (Greene T.W. Protective
groups in organic synthesis [Grupos protectores en síntesis
orgánica]. Wiley Interscience Publications John Wiley &
Sons, 1981 New York, Chichester, Brisbane Toronto; Souveaux, E.,
Methods in Mol. Biology [Métodos en biología molecular], vol.
26, Protocols for Oligonucleotide Conjugates [Protocolos para
conjugados de oligonucleótidos], Humana Press, Totowa, NJ,
1994, capítulo 1, ed. S. Agrawal).
Se designan como conectores las cadenas
hidrocarbonadas de 1-30 átomos de C. Estas cadenas
conectoras pueden contener asimismo uno o más átomos de nitrógeno,
oxígeno, azufre y/o fósforo. Además los conectores pueden ser
ramificados, p.ej. también pueden ser dendríticos.
Como unidad detectable hay que entender
sustancias que pueden identificarse mediante métodos analíticos. Por
ejemplo puede tratarse de unidades, sustancias, detectables
mediante métodos de espectrometría de masas, inmunológicos o por
RMN. Particularmente también deben entenderse como unidades
detectables las sustancias que se pueden identificar por métodos
ópticos tales como fluorescencia y espectroscopia UV/VIS, por
ejemplo fluoresceína, rodamina o incluso partículas de oro. Entre
ellas también cabe citar intercaladores y ligandos del surco menor,
que al mismo tiempo influyen en el proceso de fusión y alteran su
fluorescencia por hibridación.
Se denominan fosforamiditas las moléculas con un
átomo de fósforo trivalente que pueden acoplarse al extremo 5'
terminal de un nucleósido o derivado de nucleósido. Por tanto las
fosforamiditas se pueden emplear en la síntesis de
oligonucleótidos. Además de las
(desoxi)-ribonucleótido-fosforamiditas
empleadas para un alargamiento de cadena existen fosforamiditas
derivadas con una marcación, que se pueden utilizar en procesos
análogos, durante o al final de la síntesis de oligonucleótidos,
para marcar el oligonucleótido (Beaucage, S.L., Methods in
Molecular Biology [Métodos en biología molecular], 20 (1993)
33-61, ed. S. Agrawal, Wojczewski, C., y otros,
Synlett 10 (1999) 1667-1678).
En relación con la presente invención el término
"oligonucleótidos" incluye no solo
(desoxi)-oligo-ribonucleótidos,
sino también oligonucleótidos que llevan uno o más análogos de
nucleótidos con modificaciones en la estructura de fosfato (como
por ejemplo fosfonato de metilo, fosfotionato), en el azúcar (como
p.ej.
2'-O-alquil-derivados,
3'- y/o 5'-amino-ribosa, LNA, HNA,
TCA) o bien bases modificadas como p.ej. las
7-deazapurinas. En este contexto también forman
parte de la presente invención conjugados y quimeras con análogos no
nucleósidos como p.ej. PNAs u otros biopolímeros como p.ej.
péptidos. Además los oligonucleótidos de la presente invención
pueden contener en cada posición una o más unidades no
nucleosídicas, como espaciadores, p.ej. hexaetilenglicol o Cn (n =
3,6).
El término "aceptor de electrones"
comprende estructuras atómicas que tienden a fijar pares de
electrones libres. Una medición de ello es la constante de Hammet.
Son especialmente objeto de la presente invención las formas de
ejecución en que la constante de Hammet \sigma_{p} supera un
determinado valor de 0,30, preferiblemente 0,45 y con especial
preferencia 0,60.
\vskip1.000000\baselineskip
Además el aceptor de electrones tiene que ser
compatible con todas las reacciones químicas incluidas en la
síntesis de oligonucleótidos, es decir
- -
- no debe ser oxidable por yodo,
- -
- tiene que ser inerte frente a los ácidos dicloroacético y tricloroacético, y
- -
- tiene que ser inerte frente a las bases, especialmente amoniaco, y
- -
- no debe reaccionar con fosforamidatos trivalentes.
\vskip1.000000\baselineskip
Son ejemplos de aceptores de electrones que
cumplen estas condiciones:
- -
- -NO2, -SO2-R, -CN, -CO-R, pirinidinil-, piridinil-, piridazinil-, hexafluorofenil-, benzotriazolil-, etc. (Hansch, C., y otros, Chem Reviews 91 (1991) 165-195). Estos aceptores también pueden ir unidos al átomo de nitrógeno como vinílogos o fenílogos.
\vskip1.000000\baselineskip
El término "... sustituido" significa que
la estructura calificada como sustituida lleva otro radical en
cualquier posición, a no ser que ésta se haya definido
concretamente. El término "eventualmente sustituido" u
"opcionalmente sustituido" significa que la estructura así
calificada comprende formas de ejecución con o sin radicales
adicionales.
El término "alquilo
amino-sustituido" comprende alquilo
C_{1}-C_{30} lineal o ramificado que lleva al
menos un grupo amino, el cual va protegido o unido a una unidad
detectable mediante un conector.
El término "heterociclo-N+ de
seis miembros pobre en electrones" incluye
N-heterociclos alquilizados en un nitrógeno sp2,
debido a lo cual la carga global del heterociclo es positiva. Como
ejemplos cabe citar piridinio, pirimidinio y quinolinio.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención comprende cualquier tipo
de oligonucleótido que contenga al menos una vez la estructura
donde
A representa el extremo 5' de un nucleótido o de
una cadena nucleótida, y
B el extremo 3' de un nucleótido o de una cadena
nucleótida y Acc un aceptor de electrones, opcionalmente sustituido
con un radical R, siendo R cualquier sustituyente orgánico. Además
este radical debe ser compatible con todas las reacciones químicas
comprendidas en la síntesis de oligonucleótidos, es decir
- -
- no debe ser oxidable por yodo,
- -
- tiene que ser inerte frente a los ácidos dicloroacético y tricloroacético, y
- -
- tiene que ser inerte frente a las bases, especialmente amoniaco, y
- -
- no debe reaccionar con fosforamidatos trivalentes.
\vskip1.000000\baselineskip
En primer lugar los radicales de por sí
incompatibles pueden convertirse mediante el empleo de grupos
protectores conocidos del especialista en derivados que tienen un
comportamiento inerte en las condiciones químicas de la síntesis de
oligonucleótidos.
La presente invención comprende asimismo
fosfonatos de metilo de la estructura
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En función del empleo propuesto del
oligonucleótido las estructuras arriba descritas pueden encontrarse
una vez, dos veces, muchas veces o incluso en todos los restos de
fosfato presentes en el oligonucleótido. Los restos de fosfato en
el oligonucleótido son los denominados internucleósidofosfato,
donde
A representa el extremo 5' de un primer
nucleósido y
B el extremo 3' de un segundo nucleósido dentro
de la cadena nucleótida.
\vskip1.000000\baselineskip
Además las estructuras de la presente invención
pueden encontrarse en el extremo 3' o 5' de un oligonucleótido. En
caso de hallarse en el extremo 5' del oligonucleótido
A representa el extremo 5' de la cadena
nucleótida y
B un grupo hidroxilo o un conector que
opcionalmente puede llevar un grupo detectable u otro grupo reactivo
y mediante el cual se puede sintetizar un grupo detectable en el
oligonucleótido.
\vskip1.000000\baselineskip
Si el aceptor de electrones contiene un
sustituyente que también constituye una unidad detectable, entonces
se tiene según la presente invención un oligonucleótido con
marcación dual en el extremo 5'. Si la estructura de la presente
invención se encuentra en el extremo 3' de una cadena
nucleótida,
B representa el extremo 3' de dicho
oligonucleótido y
A es hidroxilo o un conector unido a una fase
sólida, formada preferentemente por partículas de vidrio de poro
controlado iguales a las utilizadas como material de partida para la
síntesis rutinaria de oligonucleótidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los nucleósidos individuales dentro de los
oligonucleótidos de la presente invención pueden contener cualquier
tipo de nucleósidos o nucleósidos modificados o bien derivados de
nucleósidos. Las unidades de azúcar son generalmente desoxirribosas
para oligonucleótidos de ADN o ribosas para oligonucleótidos de ARN.
Las bases nucleicas contenidas en los oligonucleótidos de la
presente invención pueden ser bases de origen natural como adenina,
guanina, timidina, citidina, uridina, sus derivados o bases llamadas
universales, como por ejemplo el nitroindol. Los oligonucleótidos
de la presente invención contienen grupos aceptores de electrones
que están unidos mediante un enlace amídico al respectivo fosfato.
En concreto pueden emplearse los siguientes grupos aceptores de
electrones:
- a)
- -CN,
- b)
- -SO2-R', donde R' contiene al menos un alquilo sustituido con amino, un arilo opcionalmente sustituido o un heterociclo opcionalmente sustituido,
- c)
- heterociclos-N+ de seis miembros elegidos de un grupo formado por piridinio, pirimidinio y quinolinio.
\vskip1.000000\baselineskip
Indudablemente también son parte de la presente
invención las formas de ejecución de -SO2-R' en que
R' es un alquilo sustituido con amino, un arilo opcionalmente
sustituido o un heterociclo opcionalmente sustituido.
La presencia de todos los aceptores de
electrones mencionados en los oligonucleótidos de la presente
invención da lugar a oligonucleótidos modificados que pueden usarse
para las más variadas aplicaciones. No obstante son de especial
interés todos los aceptores de electrones que puedan llevar
cualquier radical orgánico R, porque los métodos de síntesis
descritos en el marco de esta patente permiten así la preparación
sencilla de oligonucleótidos modificados con los radicales
orgánicos deseados.
Por tanto también son objeto de la presente
invención, sobre todo, los oligonucleótidos donde un aceptor de
electrones lleva R como sustituyente y unidad detectable o
alternativamente un grupo funcional al que se le pueda acoplar una
unidad detectable por "marcación posterior" tras la síntesis
del oligonucleótido. Como alternativa, la presente invención
comprende asimismo formas de ejecución en que el aceptor de
electrones es un componente de la unidad detectable. También como
alternativa, el radical R puede constituir como tal la unidad
detectable o un grupo funcional.
Estos oligonucleótidos marcados pueden usarse
ventajosamente para múltiples aplicaciones en biología molecular,
por ejemplo en la PCR a tiempo real. Por tanto, en el caso de la
marcación detectable se trata preferentemente de un colorante
fluorescente o de una molécula extintora de fluorescencia. El
especialista ya conoce suficientemente colorantes o moléculas
adecuadas que pueden servir como unidades detectables de los
oligonucleótidos. Como ejemplos no limitativos del alcance de
protección de la presente invención cabe citar fluoresceína,
rodamina, cianina, merocianina, carbocianina y también compuestos
azoicos y poliazoicos.
También son objeto de la presente invención
sondas de PCR a tiempo real con la estructura arriba descrita, en
que al menos hay un marcador de fluorescencia unido al átomo de
fósforo de la cadena nucleótida mediante un grupo amido/aceptor de
electrones. Como ejemplos cabe citar las sondas de hibridación FRET
(WO 97/46707) o las denominadas sondas marcadas simples (WO
02/14555). En este contexto se prefieren, sobre todo, las sondas
oligonucleótidas que llevan una modificación interna según la
presente invención en un resto de fosfato internucleósido.
La presente invención también se refiere
especialmente a oligonucleótidos con marcación dual, que poseen dos
unidades detectables. Como ejemplos cabe mencionar las sondas TaqMan
(US 5,804,375) y las balizas moleculares (US 5,118,801). En este
contexto la presente invención se refiere a oligonucleótidos con
marcación dual, en los cuales hay un primer marcador fluorescente
unido a un átomo de fósforo internucleósido de la cadena
oligonucleótida mediante un grupo amido/aceptor de electrones, y
una segunda unidad detectable terminal en el extremo 5' o 3' del
oligonucleótido. Las moléculas que presentan estas marcaciones y las
posibilidades de prepararlas son conocidas en el mundo
científico.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención también se refiere a
métodos para preparar oligonucleótidos modificados y sobre todo a
métodos para preparar oligonucleótidos como los arriba
descritos.
En general la presente invención se refiere a
métodos para preparar oligonucleótidos modificados, que se
caracterizan porque un derivado fosfórico trivalente de estructura
química
donde SG representa un grupo
protector,
donde A representa el extremo 5' de un
nucleótido o de una cadena nucleótida, y
donde B representa el extremo 3' de un
nucleótido o de una cadena nucleótida,
se hace reaccionar con una azida de
estructura
N=N=N-Acc
en la cual Acc es un aceptor de
electrones opcionalmente sustituido con un radical R, siendo R
cualquier sustituyente
orgánico.
Como grupos aceptores se prefieren especialmente
beta-cianoetilo, metilo, alilo o sililo. Como
alternativa también pueden prepararse según la presente invención
fosfonatos de metilo en que -O-SG está sustituido
por CH_{3}.
\vskip1.000000\baselineskip
Según la presente invención las azidas llevan
cualquier grupo aceptor de electrones. Estos grupos se unen luego
con el respectivo átomo de fósforo. Según la presente invención se
usan los siguientes grupos aceptores de electrones:
- a)
- -CN,
- b)
- -SO2-R,
- c)
- heterociclos-N+ de seis miembros elegidos de un grupo formado por piridinio, pirimidinio y quinolinio.
\vskip1.000000\baselineskip
El método de la presente invención también puede
usarse de forma rutinaria, especialmente en el marco de una
síntesis convencional de oligonucleótidos. Por tanto también es
objeto de la presente invención un método que comprende los pasos
siguientes
- a)
- reacción de una 3' fosforamidita con el extremo 5'-OH de una cadena oligonucleótida naciente,
- b)
- reacción con una azida de estructura
N=N=N-Acc
- en la cual Acc es un aceptor de electrones opcionalmente sustituido con un radical R, siendo R cualquier sustituyente orgánico.
\vskip1.000000\baselineskip
En este caso el extremo 5'-OH de
la cadena oligonucleótida naciente puede ser el extremo 5' de un
nucleótido 5' terminal o el grupo OH libre de un CPG.
\newpage
La química convencional de los oligonucleótidos
empieza en un material soporte reactivo de fase sólida. Se
denominan materiales soporte de fase sólida las sustancias
poliméricas formadas por una fase sólida con un grupo reactivo,
sobre las que se pueden inmovilizar otras moléculas. En general, en
el caso de la síntesis de oligonucleótidos, se trata de perlas de
vidrio porosas con un tamaño de poro definido, denominadas
partículas de vidrio de poro controlado (CPG). Como alternativa
también pueden emplearse resinas de poliestireno y otros polímeros
y copolímeros orgánicos (J. Indian. Chem. Soc. 1998, 75,
206-218). Cuando los oligonucleótidos deben quedar
inmovilizados en el substrato tras la síntesis, como material
soporte de fase sólida se puede usar vidrio o también chips
semiconductores. Estos materiales soporte de fase sólida se pueden
adquirir en el comercio.
El soporte puede estar unido al grupo hidroxilo
reactivo en posición terminal - protegido con un grupo como p.ej.
DMT (dimetoxitritilo) - mediante un denominado grupo de unión que
contiene un enlace disociable. Se llaman grupos de unión con enlace
disociable aquellos grupos que se encuentran entre el espaciador
trifuncional y el material soporte de fase sólida, y que se pueden
separar por una reacción química sencilla. Se trata de grupos
succinilo u oxalilo o de otros grupos de compuestos que contienen un
enlace éster disociable. Hay otros grupos de compuestos que son
conocidos del especialista (J. Indian. Chem. Soc. 1998, 75,
206-218).
Estos grupos de compuestos son esenciales para
el uso del material soporte en la síntesis de oligonucleótidos que
una vez terminada la síntesis deben ir en solución acuosa. En
cambio, al igual que en la preparación de matrices de ácido
nucleico (US 5,624,711, Shchepinov, M.S., y otros, Nucl. Acids. Res.
25 (1997) 1155-1161), si el oligonucleótido tiene
que permanecer en la superficie del material soporte después de la
síntesis, no es necesario ningún grupo de compuestos disociables,
sino más bien se prefiere un grupo de compuestos no disociables.
Una síntesis de oligonucleótidos para incorporar
las estructuras de la presente invención transcurre en detalle del
modo siguiente:
Después de eliminar el grupo protector por
tratamiento ácido se forma un grupo hidroxilo reactivo por el cual
se puede llevar a cabo un alargamiento de cadena en dirección
3'-5'. Luego mediante un proceso cíclico se acoplan
sucesivamente al grupo reactivo, correspondientemente liberado del
grupo protector DMT, en presencia de tetrazol, derivados de
fosforamidita de (desoxi)-ribonucleósidos igualmente
dotados de un grupo protector DMT en el extremo 5'. Ahí se genera
un producto intermedio con un átomo de fósforo trivalente, que forma
respectivamente un enlace éster con los nucleósidos unidos entre sí
por la reacción y un tercer enlace éster con un grupo hidroxilo
protegido que ya está contenido en la fosforamidita empleada. A
continuación, este grupo protector, que, por ejemplo, puede estar
formado por beta-cianoetilo, metilo, alilo o sililo,
se separa con amoniaco una vez terminada la síntesis del
oligonucleótido, disociándose también los grupos protectores de las
bases y el conector al CPG.
En las posiciones de la cadena nucleótida donde
deben introducirse miméticos de fosfato, en lugar de oxidarlo con
yodo, el oligonucleótido naciente se hace reaccionar conforme a la
presente invención con una azida de estructura
N=N=N-Acc
donde Acc es un aceptor de
electrones, opcionalmente sustituido con un radical R, siendo R
cualquier radical orgánico. La síntesis química descrita permite
incorporar en principio cualquier radical R y especialmente
cualquier tipo de colorante
fluorescente.
La preparación de Acc-Azidas,
como p.ej. acilazidas y sulfonilazidas, es fácil y conocida desde
hace tiempo (resumen: Bräse, S., y otros, Angewandte Chemie 117
(2005) 5320-5374, 3.4 y 3.5.2). Se preparan
preferentemente a partir de los cloruros de acilo o de sulfonilo
con azidas sódicas, o a partir de las hidrazidas con ácido
nitroso.
Los colorantes de sulfonilazida también se
emplean p.ej. en procesos de tinción (p.ej. DE 19650252). La
cianazida se puede preparar fácilmente por reacción de azida sódica
con cianuro de bromo en acetonitrilo (McMurry, J.E., y otros, J.
Organic Chemistry 38(16) (1973) 2821-7). Las
heteroarilazidas pueden obtenerse por sustitución nucleófila de un
halógeno con azida o a partir de heteroarilhidrazinas. La condición
es que el nitrógeno atrayente de electrones se halle en posición
para u orto respecto al grupo azido, pues solo así se forma un
mimético de fosfato estabilizado por resonancia. En este contexto
son especialmente adecuadas las
N-alquil-piridinio-azidas.
Las acil-, sulfonil- y piridilazidas también pueden obtenerse en
parte en el comercio.
Además son objeto de la presente invención
procesos como los arriba descritos en que el radical R es una unidad
detectable. R es preferiblemente un colorante fluorescente o una
molécula extintora de fluorescencia.
Ciertas formas de ejecución de la presente
invención se refieren a la preparación de sondas oligonucleótidas
de marcación dual, una marcación introducida en el oligonucleótido,
con preferencia internamente según el método de la presente
invención, y otra marcación introducida preferentemente en el
extremo 5' o 3' del oligonucleótido según el método conocido del
estado técnico.
En una marcación 5' en la posición 5' de la
ribosa del nucleótido 5'-terminal la incorporación
tiene lugar por métodos habituales mediante una fosforamidita
marcada con colorante al final de la síntesis del oligonucleótido
(Beaucage, S.L., Methods in Molecular Biology 20 (1993)
33-61, ed. S. Agrawal).
La marcación en el extremo 3' se realiza
empleando CPG asequible comercialmente como soporte de fase sólida,
que, además del grupo funcional hidroxilo tritilado, ya contiene una
marcación detectable. Tras separar el grupo protector DMT se puede
iniciar la síntesis estándar del oligonucleótido en el grupo
hidroxilo libre.
Alternativamente, para otra marcación en 5' o 3'
pueden utilizarse los métodos conocidos del estado técnico para la
marcación a posteriori (US 5,002,885, US 5,401,837).
También son objeto de la presente invención
productos intermedios de síntesis que se pueden preparar antes de
la síntesis estándar de los oligonucleótidos. En tal caso se
prefieren los intermedios sin desproteger todavía unidos a la fase
sólida, que pueden llevar grupos espaciadores abásicos. En la
preparación se usan preferentemente CPGs conocidos del especialista
como fosfato-CPGs, ya que tras la oligosíntesis se
forma un oligonucleótido fosforilado en 3'. Estos
fosfato-CPGs se hacen reaccionar tras la
destritilación con un espaciador de fosforamidita en presencia de
un activador: el intermedio de fósforo trivalente resultante se hace
reaccionar luego con una Acc-azida que comprende
una unidad detectable. Estos productos intermedios de síntesis se
pueden conservar y usar como CPGs trifuncionales para marcación 3'
universal.
La presente invención también comprende una
síntesis de fosforamiditas que en lugar de p.ej. un oxígeno
protegido con beta-cianoetilo llevan un grupo
N-Acc protegido, para hacer posible la síntesis de
N-Acc-fósforotioatos o de bis
N-Acc-miméticos de fosfato. Tal
estrategia de síntesis sirve para casos especiales, p.ej. para
preparar oligonucleótidos que contengan P=N-CN.
En la síntesis de los metilfosfonatos también se
forma un producto intermedio de fósforo trivalente que puede
transformarse con azidas. Las metilfosforamiditas también pueden
adquirirse en el comercio.
En una estrategia de síntesis inversa (EP 1 155
027) que se usa tanto para oligonucleótidos estándar como,
especialmente, para análogos, p.ej. para la síntesis de
N3'->P5'-oligonucleótidos, también se forma un
intermedio que lleva un fósforo trivalente y que puede transformarse
con azidas según la presente invención. Las correspondientes
fosforamiditas se pueden adquirir en el comercio.
La estrategia de síntesis de la presente
invención permite preparar oligonucleótidos modificados de diverso
modo en la estructura de fosfato. El grado, la diversidad y la carga
de las modificaciones depende de la aplicación propuesta.
Por ejemplo, los oligonucleótidos de la presente
invención se pueden usar en la hibridación con ADN y ARN natural,
p.ej. para fines de captura o detección: los oligonucleótidos con
P-N=Acc-miméticos de fosfato, solos
o como quimeras con fosfatos normales, también se pueden utilizar
con éxito como cebadores en reacciones de amplificación.
Las sondas oligonucleótidas de este tipo son la
base de múltiples aplicaciones, p.ej. PCR a tiempo real, FISH,
técnicas de transferencia, secuenciación (P.M Jung y otros en
Nucleic Acid Amplification Technologies BioTechniques Books,
Ediciones Div. Eaton Publishing 1997. H.H.Lee, S.A Morse, O. Olsvik,
capítulo 10 Bustin, Stephen A. y Nolan, Tania. Chemistries. IUL
Biotechnology Series (2004), 5(A-Z of
Quantitative PCR), 215-278).
Los oligonucleótidos marcados de la presente
invención son especialmente adecuados como sondas marcadas con
fluorescencia en diversos formatos de PCR a tiempo real:
Para el formato de baliza molecular (US
5,118,801) y el formato de sonda para TaqMan (US 5,210,015, US
5,538,848, y US 5,487,972, US 5,804,375) suelen usarse sondas con
marcación dual, una de ellas introducida con preferencia
internamente y una segunda que se halla en el extremo 5' o 3' de la
sonda. Aquí conviene especialmente que al menos la marcación
interna se realice mediante un método de la presente invención, en
el marco de una síntesis de oligonucleótidos basada en la química
de las fosforamiditas. La segunda unidad detectable en el extremo
5' o 3' de la respectiva sonda también se puede introducir mediante
uno de los métodos descritos en la presente invención o con la
ayuda de métodos conocidos del estado técnico.
Para el formato de hibridación FRET (Matthews,
J.A., y Kricka, L.J., Analytical Biochemistry 169 (1988)
1-25), (Bernard, P.S., y otros, Analytical
Biochemistry 255 (1998) 101-107) se usa generalmente
una sonda marcada en 5' terminal y otra marcada en 3' terminal.
Resulta especialmente ventajosa la obtención de la sonda marcada en
5' mediante el empleo de una síntesis de oligonucleótidos basada en
la química de las fosforamiditas.
Según la presente invención pueden prepararse de
forma sencilla oligonucleótidos funcionalizados, modificando el
aceptor de electrones Acc con un radical R que contiene un grupo
funcional debidamente protegido para la oligosíntesis. Si este
radical es un grupo amino o hidroxilamino, se pueden preparar p.ej.
con matrices de oligonucleótidos por deposición sobre superficies
modificadas con epóxidos (Seliger, H., y otros, Current
Pharmaceutical Biotechnology, 4 (2003) 379-395). En
cambio los grupos tiol pueden usarse para la inmovilización sobre
superficies o partículas de oro. En este caso, según la presente
invención, resulta especialmente ventajoso introducir de manera
sencilla varias funciones tiol, a fin de obtener una unión estable
de la sonda de captura a la superficie de oro. Si como grupo
funcional se introduce un grupo OH protegido también pueden
prepararse oligonucleótidos ramificados o dendríticos.
Dichos grupos funcionales, sobre todo los grupos
amino, también se pueden emplear para preparar oligonucleótidos
marcados, haciéndolos reaccionar después de la oligosíntesis con el
éster activo de un colorante. No obstante es útil introducir
directamente la unidad detectable durante la síntesis del
oligonucleótido, conforme al método de la presente invención.
Como los oligonucleótidos de la presente
invención son resistentes a las nucleasas, también sirven para
inactivar la expresión genética en el marco de diversos métodos
conocidos del mundo científico, es decir, los oligonucleótidos de
la presente invención se usan como oligonucleótidos antisentido o
también como componentes de sustancias activas de siARN. En este
caso las modificaciones se seleccionan con el fin de facilitar la
absorción celular y/o mejorar la fijación al ácido nucleico
diana.
Además los oligonucleótidos de la presente
invención se pueden usar como conector hidrófilo entre una unidad
detectable y una proteína o también como marcador de masa definida.
Asimismo pueden formarse bibliotecas de sustancias aptámeras,
empleando distintas sulfonil- y acilazidas o heteroarilazidas en la
síntesis, para introducir diferentes radicales R en el fosfato.
Luego estas bibliotecas se pueden ensayar en cuanto a la fijación a
proteínas o a otras biomoléculas. La ventaja respecto a los
aptámeros conocidos del estado técnico es que el método de la
presente invención permite preparar y ensayar de forma simple una
gran variedad de distintas modificaciones adicionales.
La dimerización se realizó a una escala de 10
\mumoles en un sintetizador ABI 394. Como fase sólida se utilizó
soporte dT-CPG comercial. Todos los productos
químicos para la síntesis estándar se tomaron de Glen Research.
La solución oxidante convencional que contiene
yodo fue sustituida por una solución 0,1 M de
p-NAc-fenilsulfonilazida (Sigma
Aldrich) en acetonitrilo anhidro. El tiempo de oxidación se prolongó
a 16 minutos.
El producto se disoció del soporte con amoniaco
al 33% a temperatura ambiente durante 2 h y se separó mediante
cromatografía de fase inversa en una columna Poros Oligo R3, de 4,6
x 50 mm. Cromatografía: tampón A: acetato de trietilamonio 0,1 M en
agua a pH 6,8; tampón B: acetato de trietilamonio 0,1 M en
agua/acetonitrilo 1:1; gradiente: 2 min. 0% de B hasta 100% de B en
45 min. La absorción UV del eluyente se midió a 260 nm. Se obtuvo
una fracción principal que contenía el producto deseado. Los
disolventes se eliminaron al vacío en una centrífuga. El residuo se
recogió en agua bidestilada y se evaporó de nuevo al vacío. Este
proceso se repitió tres veces. Luego el residuo se disolvió en agua
bidestilada y se liofilizó.
RMN H1: (Bruker DPX 300) en D20: 7,82 d [2H,
arilo], 7,56 d[2H arilo] 7,47 s[ 1H, C6-H],
7,40[1H, C6-H], 6,21 m [1 H, H1'], 6,21 m [1
H, H1'], 6,07 m[1 H, H1'], 4,38 m [1H, H 3'], 4,10 [m 4 H,
H4', H5'] 2,38- 2,24 m [4 H, H2'] 2,22 [3 H, CH3] 2,16[3 H,
CH3], 2,14 [3 H, CH3]
RMN P31: (Bruker DPX 300) en D2O: 2,14
Espectroscopia de masas
(ESI-MS), calculado 742,66, hallado
[M-H]: 741,73
\vskip1.000000\baselineskip
La síntesis del oligonucleótido se realizó a una
escala de 1 \mumol en un sintetizador ABI 394. Como fase sólida
se usó soporte dT-CPG comercial. Todos los productos
químicos para la síntesis estándar se tomaron de Glen Research.
En el primer ciclo de síntesis el oxidante que
contiene yodo fue sustituido por una disolución 0,1 M de
p-NAc-fenil-sulfonilazida
(Sigma Aldrich) en acetonitrilo anhidro. El tiempo de oxidación se
prolongó a 16 minutos. La anexión de las restantes
dT-fosforamiditas se efectuó según el protocolo
estándar.
El producto se disoció del soporte con amoniaco
al 33% a temperatura ambiente durante 2 h y se separó mediante
cromatografía de fase inversa en una columna Poros Oligo R3, de 4,6
x 50 mm. Cromatografía: tampón A: acetato de trietilamonio 0,1 M en
agua a pH 6,8; tampón B: acetato de trietilamonio 0,1 M en
agua/acetonitrilo 1:1; gradiente: 2 min. 0% de B hasta 100% de B en
45 min. La absorción UV del eluyente se midió a 260 nm. Se obtuvo
una fracción principal que contenía el producto deseado. Los
disolventes se eliminaron al vacío en una centrífuga. El residuo se
recogió en agua bidestilada y se evaporó de nuevo al vacío.
Este proceso se repitió tres veces. Luego el
residuo se disolvió en agua bidestilada y se liofilizó.
Espectroscopia de masas
(ESI-MS), calculado 3176,25, hallado
[M-H]: 3176,0
\vskip1.000000\baselineskip
5' AAT ACC TGT ATT CCT CGC CTG TC
fluoresceína-3' en que cada P=O se sustituye por
P=N-pPh-NAc.
La síntesis del oligonucleótido se realizó a una
escala de 1 \mumol en un sintetizador ABI 394. Como material
soporte se usó LightCycler Fluorescein CPG (Roche Applied Science).
Todos los productos químicos para la síntesis estándar se
obtuvieron de Glen Research. Se utilizaron fosforamiditas con grupos
protectores terc-butilfenoxiacetilo (conocidas como
monómeros "tac" o "Expedite") de Proligo.
En la síntesis se empleó el protocolo estándar,
sustituyendo el oxidante que contiene yodo por una disolución 0,1 M
de p-NAc-fenilsulfonilazida (Sigma
Aldrich) en acetonitrilo anhidro y el tiempo de oxidación se alargó
a 16 minutos.
El producto se disoció del soporte con amoniaco
al 33% a temperatura ambiente durante 2 h y se separó mediante
cromatografía de fase inversa en una columna Poros Oligo R3, de 4,6
x 50 mm. Cromatografía: tampón A: acetato de trietilamonio 0,1 M en
agua a pH 6,8; tampón B: acetato de trietilamonio 0,1 M en
agua/acetonitrilo 1:1; gradiente: 2 min. 0% de B hasta 100% de B en
45 min. La absorción UV del eluyente se midió a 260 nm. Se obtuvo
una fracción principal que contenía el producto deseado. Los
disolventes se eliminaron al vacío en una centrífuga. El residuo se
recogió en agua bidestilada y se evaporó de nuevo al vacío. Este
proceso se repitió tres veces. Luego el residuo se disolvió en agua
bidestilada y se liofilizó.
Espectroscopia de masas
(ESI-MS), calculado 11839, hallado
[M-H]: 11839,9
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron 0,71 g (2,19 mmoles) de cloruro
de dabsilo en 10 ml de acetona. Enfriando con hielo y agitando se
añadieron lentamente gota a gota 142 mg (2,19 mmoles) de azida
sódica en 2 ml de agua. Se agitó 2 h a 0ºC y después 2 h a
temperatura ambiente. Luego se agregó una solución de 32 mg de azida
sódica (0,5 mmoles) en 500 \mul de agua y se agitó 1 h a
temperatura ambiente. (Cromatografía de capa fina en gel de sílice,
CH2Cl2). Después la suspensión se mezcló con 200 ml de cloruro de
metileno y se filtró. El filtrado se extrajo 2 veces con agua, una
vez con disolución de bicarbonato sódico al 5% y luego dos veces con
agua. La fase orgánica separada se secó sobre sulfato sódico. El
disolvente se destiló en un evaporador rotativo, con una temperatura
de baño < 20ºC. El residuo se suspendió en 2 ml de acetonitrilo
y se separó por filtración. Este residuo se lavó con éter.
Rendimiento de producto crudo 280 mg. La azida
se emplea directamente, sin purificar, en el sintetizador de ADN o
en la preparación de un soporte.
Las síntesis se realizaron a una escala de 1 mol
en un sintetizador ABI 394. Para no tener que cambiar el oxidante
durante la síntesis, el programa de síntesis se modificó de manera
que la solución de N3-Acc se pudiera fijar a una
posición de base extra. Por limitaciones de la programación se hizo
reaccionar la azida junto con el activador, sin que ello influyera
en la modificación. El tiempo de reacción del N3-Acc
con el intermedio de fósforo trivalente fue de 5 min.
Todos los productos químicos para la síntesis
estándar se obtuvieron de Glen Research. Se usaron fosforamiditas
con grupos protectores terc-butilfenoxiacetilo
(conocidas como monómeros "tac" o "Expedite") de Proligo.
La purificación se efectuó tal como se describe arriba.
Soporte: fluoresceína-CPG:
N3-Acc:
p-NAc-fenilsulfonil-azida
(Sigma Aldrich)
\newpage
Se sintetizaron las siguientes sondas
correspondientes a la SEQ. ID. Nº: 4 y a continuación se analizaron
por espectroscopia de masas:
\vskip1.000000\baselineskip
De
referencia
CPG-Icaa-NHC(=O)-CH_{2}CH_{2}-C(=O)-O-CH_{2}-CH_{2}-SO_{2}-CH_{2}-CH_{2}-O-P(O-CH_{2}-CH_{2}-CN)(=N-SO_{2}-Ph-p-N=N-Ph-p-NMe_{2})-OCH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-ODMTr
Se introdujeron 1,2 g de Phospholink CPG Load 49
\mumol/g en una frita Schlenk y se lavó con acetonitrilo anhidro
en atmósfera de argón. Después se lavó con ácido dicloroacético 0,1
M en cloruro de metileno hasta que el filtrado fue incoloro.
Seguidamente se lavó a fondo con acetonitrilo anhidro. Después se
lavó con 2 ml de dicianoimidazol 0,25 M en acetonitrilo (activador)
y se añadieron 2 ml de activador y enseguida 2 ml de solución 0,1 M
del espaciador C3 fosforamidita. La suspensión se dejó luego 3
minutos en reposo. Se filtró bajo atmósfera de argón. Luego se lavó
con 2 ml de activador y se añadieron otra vez 2 ml de activador y
enseguida 2 ml de solución 0,1 M del espaciador C3 fosforamidita.
Después de dejó reposar el preparado durante 12 minutos. Los
disolventes se separaron por filtración bajo atmósfera de argón, se
agregaron 2 ml de una solución de dabsilazida 0,1 M en cloruro de
metileno y la mezcla se dejó 15 minutos en reposo. Por último el CPG
modificado se lavó con 100 ml de cloruro de metileno, luego con 100
ml de acetonitrilo anhidro y se secó al vacío.
5' Fluoresceína-GCA CCA GAT CCA
CGC CCT TGA TGA
GC-OCH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-O(O_{2})P(=N-SO_{2}-Ph-p-N=N-Ph-p-NMe_{2})
La síntesis del oligonucleótido se realizó a una
escala de 1 \mumol en un sintetizador ABI 394. Como material
soporte se empleó el dabsil-CPG del ejemplo 5a. Para
la marcación 5' se utilizó
6-carboxifluoresceín-fosforamidita
(Glen Research, Report No. 10 (GR10-1) (1997)
1-12).
Todos los demás productos químicos para la
síntesis estándar se obtuvieron de Glen Research. Tal como está
descrito en 4b) se usaron fosforamiditas con grupos protectores
terc-butilfenoxiacetilo (conocidas como monómeros
"tac" o "Expedite") de Proligo. La síntesis se realizó
conforme al protocolo estándar. La disociación y purificación
también se efectuó del modo descrito en 4b.
Espectroscopia de masas
(ESI-MS), calculado 8973, encontrado
[M-H]: 8973,1
\vskip1.000000\baselineskip
Para analizar la influencia de los miméticos de
fosfato en la hibridación se realizó una PCR cuantitativa a tiempo
real del Factor V ADN, seguida por el análisis de la curva de fusión
en el aparato LightCycler 1.2® Instrument (Roche Diagnostics GmbH).
Se utilizaron cebadores en combinación con un par de sondas de
hibridación FRET marcadas con fluoresceína/ LightCycler Red 640.
Los cebadores y la sonda 5'-LightCycler Red 640 se
mantuvieron constantes. Como sondas donantes de FRET se emplearon
sondas de 3'-fluoresceína de los ejemplos 4 marcadas
diversamente en el fosfato o bien como referencia las sondas de
fluoresceína no modificadas. Se evaluó la influencia sobre el punto
de corte, que es una medida de la eficiencia de la amplificación, y
sobre el punto de fusión.
\vskip1.000000\baselineskip
Para amplificar un fragmento de ADN Factor V se
prepararon 20 \mul de una mezcla reactiva de PCR como la
siguiente:
- 10^{6}
- copias de un plásmido que lleva el gen factor V natural y mutantes (nº M-014335 de acceso al banco de genes)
- 13 mM
- MgCl2
- 500 nM
- cada uno, cebadores con las SEQ. ID. Nº: 1 y 2
- 200 nM
- cada uno, sondas de hibridación FRET con las SEQ. ID. Nº: 3 y 4
Para todos los demás componentes de la PCR se
usó el kit "LightCycler DNA Master Hyb Probes" (Roche Applied
Science, nº de cat. 2158825) según las instrucciones del
fabricante.
\vskip1.000000\baselineskip
Como cebadores y sondas se usaron las siguientes
secuencias:
SEQ ID Nº:1
Cebador directo
5' GAG AGA CAT CGC CTC TGG GCT A
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº:2
Cebador inverso
5'TGT TAT CAC ACT GGT GCT AA
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº:3
Sonde aceptora de FRET
5' LC-Red 640 AGG GAT CTG CTC
TTA CAG ATT AGA AGT AGT CCT ATT
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº:4
Sonde donante de FRET
5' AAT ACC TGT ATT CCT CGC CTG
TC-fluoresceína
\newpage
Para la amplificación en el LightCycler 1.2
(Roche Applied Science) se usó el siguiente programa de
temperatura:
\vskip1.000000\baselineskip
El control en tiempo real se realizó mediante el
método del umbral de la 2ª derivada durante 45 ciclos, midiendo la
señal de fluorescencia en un canal detección específico para la
emisión del LightCycler Red 640 (a 640 nm) y utilizando el modo
aritmético de corrección de fondo para la normalización de la señal
inicial.
Tras la amplificación se realizó un análisis de
la curva de fusión conforme a las instrucciones del manual
LightCycler (Roche Applied Sciences). Se utilizó el siguiente
programa de temperatura:
Las señales absolutas de fluorescencia se
midieron como arriba en el canal de 640 nm y luego se calculó su
primera derivada.
En la tabla siguiente se indican los puntos de
corte como medida del coeficiente de amplificación para el uso de
varias sondas donantes modificadas. También figuran en la tabla las
mediciones de las temperaturas de fusión de diversas sondas
donantes para la secuencia del factor V de tipo natural y de sus
mutantes.
Como se desprende de la tabla, la introducción
de las modificaciones de la presente invención no influye
esencialmente en el punto de corte, es decir, la eficiencia de la
PCR permanece inalterada.
Además tampoco se aprecia ninguna influencia en
la temperatura de fusión de las sondas modificadas
1-2 veces. Solo las sondas con múltiples
modificaciones presentan una ligera variación del punto de fusión,
como máximo de 4ºC, con lo cual se conserva la capacidad de
discriminación por disparidad.
\vskip1.000000\baselineskip
Una disolución de 195 mg (3,0 mmoles) de azida
sódica en 5 ml de agua se añadió por goteo, a 0ºC, a una disolución
de 577 mg (1 mmol) de cloruro ácido de sulforrodamina B en 20 ml de
acetona. La mezcla se agitó 2 h a 0ºC y luego 6 h a temperatura
ambiente. Después se pasó a un embudo de decantación y se mezcló con
300 ml de agua y 300 ml de cloruro de metileno. La fase orgánica se
separó y se lavó 2 veces con 100 ml de agua, luego se secó sobre
sulfato sódico. El disolvente se separó por destilación en un
evaporador rotativo. El residuo (140 mg) se usó en la síntesis del
oligonucleótido sin purificarlo más.
Ap*GG GAT CTG CTC TTA CAG ATT AGA AGT AGT CCT
ATT-p
p* = P=N S(O)2-
rodamina-B
\vskip1.000000\baselineskip
La síntesis del oligonucleótido se realizó a una
escala de 1 \mumol en un sintetizador ABI 394. Como material
soporte se usó Phospholink CPG (Glen Research) comercial. Todos los
productos químicos para la síntesis estándar se obtuvieron de Glen
Research. Se usaron fosforamiditas protegidas con grupos
terc-butilfenoxiacetilo (conocidas como monómeros
"tac" o "Expedite") de Proligo.
Para la síntesis se usó el protocolo estándar
(separación de tritilo), sustituyendo en el último ciclo el
oxidante por una disolución de lisamin-azida 0,1 M
en acetonitrilo anhidro y prolongando el tiempo de oxidación a 16
minutos.
El producto se disoció del soporte con amoniaco
al 33% a temperatura ambiente durante 2 h y se separó mediante
cromatografía de fase inversa en una columna Poros Oligo R3, de 4,6
x 50 mm. Cromatografía: tampón A: acetato de trietilamonio 0,1 M en
agua a pH 6,8; tampón B: acetato de trietilamonio 0,1 M en
agua/acetonitrilo 1:1; gradiente: 2 min. 0% de B hasta 100% de B en
45 min. La absorción UV del eluyente se midió a 260 nm. Se obtuvo
una fracción principal que contenía el producto deseado. Los
disolventes se eliminaron al vacío en una centrífuga. El residuo se
recogió en agua bidestilada y se evaporó de nuevo al vacío. Este
proceso se repitió tres veces. Luego el residuo se disolvió en agua
bidestilada y se liofilizó. Espectroscopia de masas
(ESI-MS), calculado 11710, encontrado
[M-H]: 11710,5.
Para demostrar la idoneidad en la PCR a tiempo
real se realizó una PCR a tiempo real del Factor V ADN en el
Light-Cycler 2.0. Se utilizaron cebadores en
combinación con un par de sondas de hibridación FRET marcadas con
fluoresceína/lisa-mina, donde la lisamina actúa como
aceptor de FRET. Se registraron curvas de cuantificación y se
calculó el valor Pc en función de la concentración del ácido
nucleico diana.
Para la amplificación a 10^{4} o 10^{6}
copias de un fragmento de ADN Factor V se realizó una PCR a tiempo
real y se hicieron análisis de curvas de fusión según el ejemplo 6.
Se usó una sonda donante de fluoresceína, no modificada
adicionalmente, según el ejemplo 6 (SEQ ID Nº:4) y una sonda
aceptora de FRET según el ejemplo 7b (SEQ ID Nº:3).
La señal fluorescente se midió en el canal de
detección de 610 nm. Se usó el modo de corrección de fondo 610/530
para la normalización de la señal bruta. Como valores pc se halló un
pc de 22 para 10^{6} copias y un pc de 26 para 10^{4}
copias.
Se encontró un punto de fusión de 64,69ºC para
el tipo natural y de 56,24ºC para los mutantes (10^{6}
copias).
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Polinucleótido con mimético de
fosfato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 23428
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patente en versión 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagagacatc gcctctgggc ta
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgttatcaca ctggtgctaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagggatctgc tcttacagat tagaagtagt cctatt
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatacctgta ttcctcgcct gtc
\hfill23
Claims (5)
1. Oligonucleótido que contiene al menos una vez
la estructura
donde
A representa el extremo 5' de un nucleótido o de
una cadena nucleótida,
B el extremo 3' de un nucleótido o de una cadena
nucleótida, y
D es hidroxilo o CH_{3},
Acc un aceptor de electrones, opcionalmente
sustituido con un radical R, siendo R cualquier sustituyente
orgánico,
caracterizado porque Acc se elige de un
grupo formado por
- -
- -CN,
- -
- -SO2-R', donde R' contiene como mínimo un alquilo sustituido con amino, un arilo opcionalmente sustituido o un heterociclo opcionalmente sustituido,
- -
- y heterociclos-N+ de seis miembros escogidos de un grupo formado por piridinio, pirimidinio y quinolinio.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método para preparar un oligonucleótido
modificado según la reivindicación 1, caracterizado porque un
derivado fosfórico trivalente correspondiente a la estructura
química
donde E es un grupo metilo o un
grupo hidroxilo
protegido,
donde A representa el extremo 5' de un
nucleótido o de una cadena nucleótida, y
donde B representa el extremo 3' de un
nucleótido o de una cadena nucleótida, se hace reaccionar con una
azida de la estructura
N=N=N-Acc,
donde Acc es un aceptor de
electrones, opcionalmente sustituido con un radical R, siendo R
cualquier sustituyente
orgánico,
caracterizado porque
Acc se escoge de un grupo formado por
-CN,
-SO2-R'
y heterociclos-N+
de seis miembros escogidos de un grupo formado por piridinio,
pirimidinio y
quinolinio.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Método según la reivindicación 2, que consta
de los siguientes pasos
- a)
- la reacción de una 3'-fosforamidita con el extremo 5'-OH de un oligonucleótido naciente y a continuación
- b)
- la reacción con una azida de estructura
N=N=N-Acc,
en que Acc es un aceptor de
electrones, opcionalmente sustituido con un radical R, siendo R un
sustituyente orgánico
cualquiera.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Uso de un oligonucleótido según la
reivindicación 1 como componente de hibridación.
5. Uso según la reivindicación 4 como sonda de
hibridación.
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