ES2386228T3

ES2386228T3 - Método e inmunoabsorbentes para la detección específica y la absorción de anticuerpos asociados a la celiaquía y a la dermatitis herpetiforme

Info

Publication number: ES2386228T3
Application number: ES08748781T
Authority: ES
Inventors: Christian Probst; Wolfgang Schlumberger; Winfried STÖCKER; Cornelia DÄHNRICH; Lars Komorowski; Thomas Mothes
Original assignee: Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Current assignee: Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Priority date: 2007-05-30
Filing date: 2008-04-25
Publication date: 2012-08-14
Anticipated expiration: 2028-04-25
Also published as: US8124354B2; DE102007025291A1; WO2008145084A2; EP2149051B1; US20100203558A1; ATE554388T1; CN101688865A; EP2149051A2; WO2008145084A3

Abstract

Polipéptido, que contiene uno o varios péptidos conforme a SEQ ID NO: 2 y uno o varios péptidos conforme aSEQ ID NO: 3, habiéndose podido suprimir en cada caso hasta 30% de los aminoácidos o intercambiar por unreemplazamiento conservativos de aminoácidos, y/o pudiéndose solapar en parte SEQ ID NO: 2 y SEQ IDNO: 3, caracterizado porque comprende uno o varios polipéptidos 5 constituidos por al menos 14, al menos 15o al menos 16 aminoácidos sucesivos en SEQ ID NO 4, o que comprende uno o varios polipéptidos conformea SEQ ID NO 4.

Description

Metodo e inmunoabsorbentes para la deteccion especifica y la absorcion de anticuerpos asociados a la celiaquia y a la dermatitis herpetiforme.

La presente invencion se refiere a los peptidos de fusion que se derivan de componentes de la gliadina, a los reactivos de ensayo para la deteccion diagnostica de anticuerpos contra estos peptidos y a los procedimientos para la inmunoabsorcion de tales anticuerpos para la terapia de la celiaquia y de la dermatitis herpetiforme.

Estado actual de la tecnica:

En los pacientes con intolerancia al gluten (enteropatia sensible al gluten; ninos pequenos: celiaquia, adultos: esprue endemico; celiaquia se utiliza tambien en el marco de la presente solicitud como sinonimo de la enteropatia sensible al gluten dependiente de la edad) por el consumo de productos de cereales que contienen gluten se provoca un deterioro de la mucosa del intestino delgado. Se llega a una at rofia de las vellosidades y a perturbaciones funcionales. El cuadro clinico esta marcado por la diarrea y las consecuencias de la malabsorcion (especialmente perdida de peso; en ninos retraso del crecimiento). En algunos pacientes con enteropatia sensible al gluten existe adicionalmente una dermatitis herpetiforme de Duhring: una enfermedad cronica de la piel que transcurre con formacion de ampollas, pero que tambien puede aparecer por si sola.

Una importante contribucion para el diagnostico de la enteropatia sensible al gluten y de la dermatitis herpetiforme de Duhring la aporta el examen de dos anticuerpos diferentes: antigliadina y antitransglutaminasa tisular. Este asegura el diagnostico clinico y, ademas, es adecuado para el control de su transcurso y para el control de una dieta exenta de gluten o de una prueba de carga de gluten. Una diferenciacion especifica de estos dos anticuerpos a partir del plasma de los pacientes puede conllevar un efecto terapeutico positivo.

Durante la fase aguda de la enfermedad de la enteropatia sensible al gluten, asi como en la dermatitis herpetiforme se pueden detectar generalmente anticuerpos de gliadina de las clases IgA e IgG. Eventualmente, tambien se pueden detectar anticuerpos de la clase IgM, pero por lo regular solo cuando se presentan tambien al mismo tiempo anticuerpos antigliadina de las clases IgA e IgG.

Al comienzo de una dieta exenta de gluten los anticuerpos IgA antigliadina disminuyen ya al cabo de unos pocos meses a valores bajos, mientras que los anticuerpos de la clase IgG persisten por lo regular durante mas tiempo. Niveles permanentemente elevados de anticuerpos IgA antigliadina significan que no se sigue una dieta exenta de gluten. Bajo carga de gluten, en el caso de una recidiva, se llega en el espacio de unos pocos dias a un incremento de los anticuerpos IgG antigliadina, los anticuerpos IgA siguen algo mas tarde.

La funcion fisiologica de la transglutaminasa tisular consiste en la catalisis de la formacion de un enlace isopeptidico entre un grupo y-carboxamida de un grupo glutamina y el grupo £-amino de un radical lisina de las proteinas de la matriz extracelulares, por lo que estas se reticulan en cruz (Aeschlimann et al. 2000 Conective Tissue Res. 41;1-27; Gentile et al. 2002. Neurochem Int. 40: 79-83).

Las gliadinas ricas en glutamina ingeridas con el alimento se pueden modificar igualmente despues de la resorcion por la glutaminasa tisular. Sin embargo, aqui tiene lugar preferentemente la desamidacion enzimatica de radicales glutamina a radicales glutamato (recopilado en Schwertz et al. 2004 Clinical Chemistry 50:2370-2375). Esta da lugar a una union mas fuerte de los peptidos de gliadina a moleculas de clase MHC II y, por ello, a una estimulacion incrementada de celulas T en pacientes con celiaquia (Sjostrom et al. 1998. Scand J Gastroenterol. 48: 111-115; Molberg et al. 1998. Nat Med. 4:713-717).

Como epitope importante para anticuerpos de la clase IgA, especialmente de partes de la gliadina desamidada, se identifico el tripeptico prolina-glutamato-glutamina (PEQ) (Osman et al. 2000. Clin. Exp. Immunol. 121:248-254). Se puso de manifiesto, que la gliadina desamidada es reconocida por los anticuerpos de pacientes con celiaquia de forma mas especifica que la gliadina no modificada (Aleanzi et al. 2001. Clin Chem. 47:2023-2028). Para la deteccion de anticuerpos contra un peptido desamidado derivado de la gliadina en el caso de celiaquia, se obtuvo por los autores, para anticuerpos de la clase IgA, una sensibilidad de 95,0% con una especificidad de 86,7% y para anticuerpos de la clase IgG, una sensibilidad de 90,0% con una especificidad de 86,7%, en relacion a una enfermedad de celiaquia (vease tabla 1,a).

En el marco de un analisis sistematico de la union de anticuerpos asociados a la celiaquia de la clase IgA a antigenos sinteticos, presuntamente derivados de la gliadina, se identificaron dos nonapeptidos correspondientes a la secuencia SEQ-ID NO 2 (Pro Leu Gln Pro Glu Gln Pro Phe Pro) y SEQ-ID NO 3 (Pro Glu GLn Leu Pro Gln Phe Glu Glu) como antigenos mejor adecuados. (Schwertz et al. 2004. Clinical Chemistry 50:2370-2375. La sintesis de estos dos peptidos (segun Kramer et al. 1998. J. Methods Mol. Biol. 87:25-39) tuvo lugar quimicamente por separado, uno al lado de otro, sobre una membrana de celulosa que fue empleada a continuacion directamente en un ensayo quimioluminiscente para la union de anticuerpos asociados a la celiaquia El procedimiento es conocido a partir de la preparacion de bancos de peptidos basados en membrana en el marco de estudios de mapas de epitopos. Los correspondientes reactivos para la deteccion de anticuerpos en la produccion de sistemas de ensayo diagnosticos conducen a elevados costes de produccion.

Prescindiendo de ellos, Schwertz et al. realizaron dos ELISA basados en membrana para la deteccion de anticuerpos de la clase de inmunoglobulinas IgA antigliadina en el caso de celiaquia, con deteccion por quimioluminiscencia, los cuales en una evaluacion combinada de los dos antigenos correspondientes a SEQ ID NO 2 ySEQ ID NO 3 mostraron conjuntamente (vease tabla 1. b) una sensibilidad de 94,2% con una especificidad de

5 93,4%.

La deteccion por quimioluminiscencia es complejay esta obligada a caros aparatos de analisis.No se indico, si los datos de resultados diagnosticos podian ser alcanzados tambien con los procedimientos de deteccion colorimetricos, ampliamente extendidos. Los propios autores senalan esta desventaja y proponen para la ulterior mejora de su sistema de ensayo una nueva optimacion de la secuencia, asi como la comprobacion del sistema de

10 quimioluminiscencia basado en membrana en el formato de placas para microtitulacion, sin haber resuelto este problema.

Schwertz et al. solo incluyeron en el estudio sueros positivos de transglutaminasa tisular IgA. Las muestras de pacientes con carencia selectiva de IgA no conducen en el caso de Schwertz et al. a una di sminucion de la sensibilidad como en el caso de una seleccion de pacientes de resultados abiertos, de manera que aqui hay que

15 suponer una sensibilidad demasiado alta, realizada incorrectamente, del orden de medidas de 3-5%. Los datos de los resultados se basan, ademas, en una evaluacion combinada de dos determinaciones separadas, de mala validez para rutinas, basadas en las secuencias peptidicas SEQ ID NO 2, respectivamente SEQ ID NO 3.

Un ELISA basado en placas para microtitulacion para la determinacion de anticuerpos de la clase IgG en base de uno (conforme a la secuencia SEQ ID NO 2) de los dos nonapeptidos demostro igualmente en un estudio (Prause et

20 al. 2007. Posterbeitrag zur 22. Jahrestagung der gesellschaft fur padiatrische Gastroenterologie und Ernahrung, Bochum) una mejora frente el estado actual de la tecnica para la determinacion de anticuerpos de la clase IgG, para IgA no se mostraron resultados (vease tabla 1, c).

En el estudio de Schwertz et al. se ha puesto de manifiesto, que la determinacion de anticuerpos llevada a cabo por separado, pero evaluada de forma combinada empleando los peptidos conformes a SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 3, 25 hace posibleuna mejoradel diagnostico serologicode la celiaquia. Los datos de los resultados del trabajo de Aleanzi et al. fueron superados claramente por Schwertz et al. Pero en el caso de Schwertz et al. se tienen que hacer al menosdos sintesis y determinaciones separadas (antigenos correspondientes a SEQ ID NO 2 ySEQ ID NO 3), lo cual ocasiona el doble coste en material y trabajo. Seria posible mezclar los dos antigenos peptidicos y emplear la mezcla para el recubrimiento de la fase solida en el ELISA. Pero tales ensayos estan afectados por una

30 escasa reproducibilidad, un incremento de las reacciones no especificas y un impedimento esterico reciproco en la union de los componentes antigenicos a la superficie.

Clase de inmunoglobulina: Sensibilidad Especificidad Fuente

A: IgA 85,0% 86,7% Aleanzi et al., 2001 SEQ ID NO 1

IgG: 90,0% 86,7%

IgA: : 94,2% 93,4% Schwertz et al., 2004 SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 3

b*: IgG insuficiente? insuficiente?

IgA: insuficiente? insuficiente? Prause et al., 2007 SEQ ID NO 2

c: IgG 95,0% 94,7%

* eleccion de pacientes incorrectamente preseleccionada

Tabla 1: Compilacion de los datos de los resultados publicados de los sistemas de ensayo basados en antigenos peptidicos de homologos desamidados de gliadina.

35 Objeto de la invencion era superar las desventajas del estado actual de la tecnica, anteriormente descritas, y poner a disposicion un si stema d e ensayo d e a nticuerpos de mejor utilidad par a r utinas, que proporcione r esultados competentes.

Descripcion de la invencion

Este problema se soluciona por el objeto de las reivindicaciones,especialmente por los polipeptidos de fusion 40 descritos a continuacion.

Del estado actual de la tecnica se puede deducir que con ayuda de los peptidos individuales segun SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 3 es posible un diagnostico competente de la celiaquia. Por ello, los autores sintetizaron estos dos peptidos, primero quimicamente en forma biotinilizada y los emplearon para el recubrimiento de placas para microtitulacion. Por la deteccion de biotina ligada se pudo asegurar que los peptidos se habian ligado a la superficie, sin embargo no fue posible volver a ratificar los parametros de resultados diagnosticos derivados del estado actual de la tecnica. Por consiguiente, iniciaron los ensayos con los peptidos sintetizados quimicamente conforme a SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 3.

Como alternativa a la sintesis quimica hubiera sido posible expresar los peptidos conformes a SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 3 de forma recombinante(veanse ejemplos 1 y 2) y, por cierto, en forma de varias copiasfusionadas, separadas respectivamente entre si por radicales metionina, en cuya zona podian ser separadas mediante bromuro de cianogeno para su aislamiento. Entonces se habrian separado los componentes, se hubieran llevado a cabo en cada caso ELISA individualesy se hubieran utilizado paralelamente para eldiagnostico o se habria realizado el recubrimiento con la mezcla.

Pero los inventores han perseguido la idea de combinar conjuntamente los peptidos conforme a SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 3 para dar un nuevo peptido de fusion conforme a SEQ ID NO 4 (Pro Leu Gln Pro Glu Gln Pro Phe Pro Glu Gln Leu Pro Gln Phe Glu Glu). Varias copias de estos peptidos de fusion debian ser sintetizados, unidos entre si, y u na ve z r ealizada la sintesis recombinante, l os peptidos debian se r ai slados de nu evo. S intetizaron un correspondiente ADN y lo integraron en f orma trimera en un p lasmido de e xpresion de E. coli, demanera que obtuvieron el plasmido circular conforme a SEQ ID NO 6 (vease ejemplo 1). Conayudade este plasmido pudieron expresar en E. coli el polipeptido conforme a SEQ ID NO 7, designado en lo sucesivo como trimero, purificarlo (vease ejemplo 2) y, a continuacion, tal como se esperaba, escindir por tratamiento con bromuro de cianogeno. El producto de l a esci sion ( monomero) l o em plearon para e l r ecubrimiento de placas para microtitulacion. Paralelamente a esto, bajo condiciones identicas, llevaron a cabo controles con el trimero sin escindir. Sorprendentemente, con el trimero como sustrato antigenico, obtuvieron en el ELISA con deteccion colorimetrica (vease ejemplo 3) d atos de r esultados sensiblemente m ejores para l a cl ase d e i nmunoglobulina I gG par a la identificacion de pacientes de celiaquia que con los sistemas de ensayo del estado actual de la tecnica, altamente desarrollados (vease tabla 2).

Tambien con los monomeros que se obtuvieron por escision del trimero, ya se pudieron superar en ensayos previos los datos de resultados de los sistemas ELISA del estado actual de la tecnica, pero los mejores resultados se obtuvieron con el trimero sin escindir. Los antigenos peptidicos de mas de 3 secuencias polipeptidicas conforme a SEQ ID NO 4 pueden alcanzar igualmente notables datos de resultados.

Para la obtencion de los datos de resultados del ELISA en base del polipeptido conforme a SEQ ID NO 7 (trimero) los autores llevaron a cabo, a continuacion, un estudio con muestras de suero de personas con diagnostico positivo o, respectivamente, negativo de celiaquia, asegurado por biopsis (vease ejemplo 3). A diferencia de Schwertz et al., el colectivo de pacientes no fue seleccionado previamente, es decir que los pacientes con carencia selectiva de IgA no fueron excluidos. El colectivo se componia de la manera siguiente:

Grupo 1: pacientes de celiaquia sin dieta especial en el momento de la biopsia (Marsh 2-3). Este grupo comprende tambien pacientes con dermatitis herpetiforme.

Grupo 2: pacientes con dermatitis herpetiforme, en los cuales no se reconoce celiaquia alguna.

Grupo 3: pacientes en los cuales el examen por biopsis frente a una celiaquia es positivo

Grupo 4: pacientes con enfermedades intestinales inflamatorias cronicas (enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa), en los cuales se efectuo un examen por biopsia del intestino delgado y en el cual no se describieron modificaciones tipicas de la celiaquia.

El grupo 1 se clasifico como celiaquia positiva, clinicamente confirmada, el grupo 2 como dermatitis herpetiforme positiva, clinicamente confirmada, y los grupos 3 y 4, como grupos de control negativos para la determinacion de los parametros de r esultados por an alisis de se nal m ediante l as cu rvas caracteristicas de " Receiver O perating Characteristic" (ROC).

Resultados: tal como se reproduce en la tabla 2, se pone de manifiesto que el ELISA basado en el polipeptido conforme a SEQ ID NO 7 manifiesta una sensibilidad y especificidad mas elevadas para la deteccion de anticuerpos especificos de celiaquia de la clase IgG que en el ensayo descrito por Prause et al. Ademas de esto, con el mismo ELISA conforme a la invencion tambien es posible una determinacion de anticuerpos de la clase IgA, de alto valor cualitativo.

Los autores pudieron demostrar que por la union de las secuencias peptidicas conformes a SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 3 para dar un peptido conforme a SEQ ID NO 7 se pueden preparar antigenos, que son adecuados como sustratos para ELISA fuertes, faciles de producir, con deteccion colorimetrica. Con sistemas de ensayo, que contienen sustratos de antigenos conformes a la invencion, se pueden detectar anticuerpos asociados a la celiaquia de forma mas sencilla, mas segura y con gran exactitud frente al estado actual de la tecnica. Ademas de esto, el procedimiento conforme a la invencion tambien posibilita la deteccion especifica de anticuerpos de la clase IgA e IgG en pacientes con dermatitis herpetiforme (Vease Tabla 2).

Sensibilidad: Especificidad

Celiaquia: IgA 80,8% 94,6%

IgG: 98,0% 96,0%

Dermatitis: IgA 66,7% 94,6%

herpetiforme: IgG 66,7% 96,0%

Tabla 2: parametros de resultados del ELISA conforme a lainvencionen cuanto al diagnostico de una celiaquia, respectivamente de una dermatitis herpetiforme aislada.

En l o r eferente al di agnostico de la ce liaquia, l os autores consiguieron, co n u n r eactivo co rrespondiente a la

5 invencion (variante SEQ ID NO 7, trimero) para la deteccion de anticuerpos asociados a la celiaquia de la clase IgG, una sensibilidad de 98,0% con una epecificidad de 96,0%. Estos valores se situan claramente por encima de los mejores datos publicados hasta el momento (Prause et al.: sensibilidad 95,0%, especificidad 94,7%).

En lo que se refiere a anticuerpos de la clase IgA, la sensibilidad es del 80,8% y con ello se situa por debajo de los datos publicados por Aleanzi et al. y Schwertz et al. (vease tabla 1 a y b). Sin embargo, Aleanzi et al. alcanzaron una 10 especificidad insuficiente, del 86,7%, y se situan por tanto, tomando conjuntamente la especificidad y la sensibilidad en referencia a IgA, a igual altura que nuestros resultados. Ademas, a los valores de Schwertz et al. solo se puede acudir co mparativamente, baj o co ndiciones, puest o q ue el co lectivo de paci entes se habi a se leccionado previamente. La renuncia a pruebas de pacientes con carencia selectiva de IgA (aproximadamente el 3% de los enfermos de celiaquia; Challacombe et al. 1995. Arch. Dis. Childhood 73:3-7; vease la observacion en tabla 1) refleja

15 en el caso de Schwertz et al. una sensibilidad de diagnostico demasiado elevada, la cual no se puede reproducir asi en un colectivo no preseleccionado, Ademas, el sistema de ensayo de Schwertz et al. no se puede emplear para una produccion industrial.

Para la clase de inmunoglobulinas IgG, se confirmo claramente la superioridad de un antigeno diana conforme a la invencion frente al estado actual de la tecnica. Puesto que segun toda experiencia, en el caso de celiaquia y

20 dermatitis herpetiforme los anticuerpos antigliadina de la clase de inmunoglobulina IgA e IgG estan dirigidos contra iguales epitopes de antigenos, hay que partir del hecho de que tambien para IgA, utilizando el material de pruebas del identico colectivo de pacientes en los sistemas de ensayo del estado actual de la tecnica y de la presente invencion, se pueden obtener para estos ultimos los mejores parametros de resultados.

Los antigenos conformes a la invencion sontecnicamente faciles de preparar en cantidad suficiente y de la mejor

25 calidad. Se pueden ligar sin mas a superficies definidas. Son adecuados, entre otras cosas, pero no exclusivamente, para inmunoensayos en fase solida y en procedimientos terapeuticos cromatograficos de inmunoafinidad.

Objeto de la invencion es un polipeptido que contiene en sucesion arbitraria uno o varios peptidos correspondientes a SEQ ID NO 2 y uno o varios peptidos correspondientes a SEQ ID NO 3, comprendiendo el polipeptido uno o varios polipeptidos constituidos por al menos diez, al menos 14, al menos 15 o al menos 16 aminoacidos sucesivos en 30 SEQ ID NO 4, o que comprende uno o varios polipeptidos conforme a SEQ ID NO 4. En este caso, en lugares arbitrarios se pueden haber suprimido hasta 30% de los aminoacidos o reemplazado por aminoacidos arbitrarios y/o que SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 3 se solapen en parte, por lo que la actividad del polipeptido deberia permanecer comparable, en particular la union a anticuerpos especificos de celiaquia y dermatitis herpetiforme. El polipeptido puede co ntener es pecialmente 1, 2, 3, 4 o 5 s ustituciones de aminoacidos, especialmente su stituciones

35 conservativas de aminoacidos, o delecciones (repartidas sobre las dos secuencias, especialmente 1, 2 o 3 sustituciones o delecciones de aminoacidos por cada secuencia).

Obviamente, el polipeptido puede contener tambien otras secuencias. En una forma de ejecucion, mas del 50% del peptido se debe atribuir a una de las secuencias segun SEQ ID NO 2 o 3. Se pueden anadir especialmente hasta 30% o hasta 40% de aminoacidos arbitrarios. Estos pueden servir, por ejemplo, para una purificacion mas sencilla

40 del peptido (por ejemplo His-Tag, Flag-Tag o analogos), para una mejor estabilidad o para una accesibilidad mas sencilla para los anticuerpos (por ejemplo como espaciadores entre las secuencias de epitopos). Obviamente, puede haber contenidos otros epitopos utilizables para el diagnostico o la terapia de celiaquia y/o dermatitis heptiforme, por ejemplo de transglutaminasas tisulares.

Los polipeptidos pueden c ontener t ambien, al ternativamente, so lo una co pia d e l as respectivas se cuencias

45 peptidicas, pero especialmente contienen secuencias peptidicas correspondientes a SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 3, es decir respectivamente un gran numero de copias. Talespolipeptidos comprenden preferentemente dos o mas, especialmente tres o mas o tres a veinte o 4 a 10 copias de las respectivas secuencias. En este caso, el numero de copias de SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 3 puede ser igual o tambien diferente, ylas secuencias en parte se pueden solapar entre si, pero no tienen que hacerlo. Por ejemplo, se pueden presentar 2 copias de SEQ ID NO 2 y 3 copias

50 de SEQ ID NO 3 o viceversa.

La unidad mas pequena del polipeptido preferido conforme a la invencion contiene los peptidos conformes a SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 3, descritos por Schwertz et al., en una secuencia que se solapa entre si conforme a SEQ ID NO

4.

Por t anto, en comparacion c on S chwertz et al . no se t ienen qu e ef ectuar dos ensayos paralelos. Las formas multimericas de la unidad conforme a la invencion, especialmente de la unidad mas pequena, despues de haber sido acopladas a una superficie, ofrecen una seguridad mas elevada que las formas monomeras, puesto que se dispone de s uficientes epi topos para l a r eaccion con los ant icuerpos es pecificos y t odavia qu edan s iempre s obrantes algunos, si existen zonas del polipeptido que han quedado inaccesibles para la reaccion de ligamiento a la superficie.

El sa lto de c alidad al canzado nuevamente e n l a pr esente i nvencion frente a l est ado actual d e l a t ecnica es probablemente maximo en las nuevas secuencias peptidicas conformes a SEQ ID NO 4, respectivamente SEQ ID NO 7. Estas secuencias peptidicas frente al estado actual de l a tecnica se han d e considerar como de nu eva calidad. Los polipeptidos con mas o menos de tres copias del peptido conforme a SEQ ID NO 4, especialmente con 2 o mas, tres o mas, o 4 o mas copias, asi como de peptidos parciales constituidos por al menos diez, al menos 14, al menos 15 o al menos 16 aminoacidos que se suceden uno tras otro en SEQ ID NO 4, se pueden emplear como el polipeptido conforme a SEQ ID NO 7 y muestran preferentemente una union comparable de los anticuerpos.

Para los polipeptidos constituidos por la sucesion y numero arbitrario de polipeptidos conforme a SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 3, asi como tambien con o sin solapamientos de las secuencias, cabe esperar con el polipeptido de fusion conforme a SEQ ID NO 4 propiedades comparables en lo referente al ligamiento de anticuerpos especificos de celiaquia y dermatitis herpetiforme.

El experto en la materia sabe que se pueden generar derivados fisicoquimicamente parecidos a los polipeptidos descritos hasta ahora por una o varias sustituciones conservativas de aminoacidos (glutamato por aspartato E->D, glutamina por asparagina Q->N, fenilalanina por tirosina F->Y, leucina por isoleucina L->I) en posiciones arbitrarias. Tambien estos derivados son objeto de la invencion y estan siempre incluidos en el merco de la invencion, puesto que cabe esperar propiedades comparables en lo referente al ligamiento de anticuerpos especificos de celiaquia y dermatitis herpetiforme. P or pr opiedades comparables el e xperto e n l a m ateria e ntiende una e specificidad y sensibilidad parecidas, especialmente para la deteccion diagnostica de celiaquia y/o dermatitis herpetiforme, como se indica en la tabla 2 para la deteccion de IgA y/o IgG (-2% o mejor o preferentemente -1% o mejor), especialmente la union de los anticuerpos es por tanto comparable conla union al polipeptido de fusion segun SEQ ID NO 7. Especialmente, se pueden sustituir hasta el 10%, hasta el 20% o hasta el 30% de los aminoacidos por una o varias sustituciones conservativas de aminoacidos, siendo comparable la union de los anticuerpos especificos de celiaquia y dermatitis herpetiforme.

En una forma de ejecucion preferida un polipeptido conforme a la invencion contiene al menos una y como maximo 20 copias de la secuencia conforme a SEQ ID NO 4. En una forma de ejecucion particularmente preferida un polipeptido conforme a la invencion contiene al menos dos y como maximo diez copias de la secuencia conforme a SEQ ID NO 4 o al menos tres copias de la secuencia conforme a SEQ ID NO 4. En otra forma de ejecucion se emplea una mezcla de diferentes polipeptidos conformes a la invencion.

Los polipeptidos conformes a la invencion se pueden presentar tambien en f orma de polimeros, especialmente polimeros que comprenden 2 a 20 o 3 a 10 polipeptidos conformes a la invencion. Estos no tienen que estar unidos entre si por una union peptidica, sinoquetambien pueden estar acoplados covalentementede otra manera(por ejemplo a traves de un grupo de union) o asociados de forma no covalente.

Para el experto en la materia existen otros procedimientos para la preparacion, purificacion y aislamiento de los polipeptidos recombinantes co nformes a l a i nvencion, co n o si n p articipes de la f usion c omo, por ej emplo, procedimientos de f iltracion, cr omatografia, el ectroforesis y c entrifugacion o l a co mbinacion d e est os. T ales procedimientos para la purificacion de proteinas se describen, por ejemplo en Lottspeich y Zorbas (Bioanalytik, 1998, Spektrum akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin) o Sambrook et al. (Molecular cloning: a laboratory manual, 2000, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Por ello, tambien son objeto de la invencion los polipeptidos conformes a la invencion preparados, purificados o aislados con estos procedimientos. En una forma de ejecucion preferida, el polipeptido conforme a la invencion se prepara de forma recombinante en E. coli.

Por consiguiente, objeto de la invencion son tambien los acidos nucleicos (ADN o ARN), que codifican para uno o varios polipeptidos de fusion conformes a la invencion, por ejemplo para un polipeptido que comprende un peptido conforme a SEQ ID NO 4 o SEQ ID NO 7. Estos pueden estar presentes en un vector de expresion bajo el control de un promotor heterologico. El vector de expresion puede estar contenido en una celula huesped. En el marco de la invencion se ha puesto de manifiesto que, por ejemplo E. coli es adecuado para la expresion de los polipeptidos de fusion conformes a la invencion.

Tambien son objeto de la invencion los polipeptidos conformes a la invencion marcados con una molecula reportera. Como procedimientos quimicos de acoplamiento, son conocidos por el experto en la materia una serie de diferentes procedimientos como los que proveen a las moleculas reporteras primeramente con un grupo reactivo, por ejemplo pentafluofenilester, N-hidroxisuccinimida o maleimida y, despues, las moleculas reporteras asi provistas se ponen en contacto con la molecula diana a marcar, por ejemplo un antigeno o una proteina. Despues de la union de la molecula reportera y la molecula diana, se pueden separar a continuacion las moleculas reporteras en exceso mediante tecnicas de separacion quimicas, bioquimicas ofisicas, respectivamente por cromatografia o filtracion. Como moleculas reporteras le son conocidas al experto en la materia una serie de compuestos diferentes tales como fluoroforos, respectivamente fluoresceina o tetrametilrodamina, haptenos, por ejemplo biotina o H is-Tag y enzimas, por ejemplo p eroxidasa de r abano picante o fosfatasas alcalinas. P ara el em pleo d e los diferentes procedimientos de acoplamiento se pueden adquirir comercialmente para este fin moleculas reporteras ya activadas. El experto en la materia conoce otras moleculas reporteras y otros procedimientos de acoplamiento para el marcado de proteinas. Por ello, tambien son objeto de la invencion los polipeptidos marcados con moleculas reporteras, preparados con tales procedimientos.

Objeto de l a i nvencion son tambien l os polipeptidos conformes a la i nvencion que est an u nidos directa o indirectamente con una fase solida (por ejemplo un soporte de plastico tal como una placa para microtitulacion, una bolita magnetica, una membrana por ejemplo de nitrocelulosa).

Objeto de la invencion son tambien los procedimientos para el diagnostico de celiaquia y/o hepatitis herpetiforme, en los cuales una muestra biologica liquida de un paciente (especialmente sangre, plasma o una muestra de heces opcionalmente di luida co n a gua o co n u na so lucion t ampon ad ecuada) s e p one en c ontacto c on polipeptidos conformes a la invencion, efectuandose o pudiendo efectuarse la union de anticuerpos de la muestra biologica a estos polipeptidos, por lo que mediante la deteccion de estos anticuerpos contra uno de estos anticuerpos se puede diagnosticar una celiaquia o dermatitis herpetiforme. En estos procedimientos se puede utilizar una mezcla de al menos dos polipeptidos diferentes conformes a la invencion.

En el marco de la invencion se puso de manifiesto que los polipeptidos conformes a la invencion son particularmente adecuados para llevar a cabo procedimientos inmunologicos tales como por ejemplo Westernblot, LinienBlot, Dot Blot o ensayos inmunofluorescentes. O bjeto de la invencion s on por t anto t ambien t ales procedimientos, respectivamente procedimientos diagnosticos, en los cuales la union de los anticuerpos se detecta con un ensayo de inmunofluorescencia, Microarray, ELISA, ensayo de luminiscencia, Blot, ensayo radioinmune, Western Blot o Dot Blot.

La invencion tambien pone a disposicion un equipo de ensayo para la deteccion de anticuerpos, el cual comprende uno o varios polipeptidos conformes a la invencion. Este hace posible, por ejemplo, llevar a cabo un procedimiento diagnostico conforme a la invencion. Un equipo de ensayo de este tipo puede contener tambien anticuerpos secundarios, por ejemplo IgA antihumano y/o anticuerpos IgG antihumanos, los cuales opcionalmente pueden estar marcados con una molecula reportera. En una forma de ejecucion, el equipo de ensayo comprende, ademas, antigenos que adicionalmente son adecuados para el diagnostico de celiaquiay/o dermatitis herpetiforme, por ejemplo transglutaminasa tisular o polipeptidos con epitopos de ellos, que sean adecuados para el diagnostico. Con ello, el equipo de ensayo se puede utilizar, por ejemplo para un ensayo combinado, en el cual se detectan anticuerpos IgA antitransglutaminasa tisular y anticuerpos IgG contra los polipeptidos conformes a la invencion.

Otro objeto de la invencion es la utilizacion terapeutica de los polipeptidos para la separacion de anticuerpos especificos de celiaquia de la sangre o plasma sanguineo, preferentemente de pacientes con celiaquia y dermatitis herpetiforme. Esto se puede efectuar ex vivo, por ejemplo por inmunoadsorcion (inmunaferasa) en polipeptidos inmovilizados, conformes a la invencion (conforme al ejemplo 4).

Por la puesta en contacto con la sangre o el plasma se separan los anticuerpos especificos para los polipeptidos inmovilizados y, a continuacion, el liquido corporal se puede reinfundir de nuevo. Procedimientos correspondientes se describen, por ejemplo, para la terapia de la cardiomiopatia dilatativa en base de la secuencia de los receptores beta-andrenergicos (Ronspeck et al. 2003 Ther Apher Dial. 7:91-97). En una forma de ejecucion preferida, un polipeptido conforme a la secuencia SEQ ID NO 7 se inmovilizapor acoplamiento quimico a una matriz soliday se emplea como base para un inmunoensayo o para un procedimiento de absorcion terapeutico por cromatografia de inmunoafinidad.

Con ello, l a i nvencion pr epara l os polipeptidos para s u ut ilizacion e n l a t erapia de ce liaquia y/o dermatitis herpetiforme, en l a cu al sa ngre o p lasma de un paciente se pone e n co ntacto co n un o o v arios polipeptidos conformes a la invencion ligados a una fase solida, teniendo lugar la union de los anticuerpos asociados a la enfermedad, d e l a sa ngre o pl asma, a es tos polipeptidos, de m odo q ue la s angre o p lasma em pobrecida e n anticuerpos es adecuada para la reinfusion al paciente. En este caso, en una forma de ejecucion, los polipeptidos conformes a la invencion se utilizan en combinacion con polipeptidos con epitopos de la transglutaminasa tisular.

La invencion se refiere tambien a la utilizacion de uno o varios de los polipeptidos descritos para la preparacion de una c omposicion f armaceutica, esp ecialmente para l a terapia d e ce liaquia y/o dermatitis herpetiforme. Esta composicion farmaceutica es especialmente adecuada para la union / absorcion de anticuerpos de diferentes clases (IgA, IgG) procedentes de sangre o plasma sanguineo de pacientes.

Ejemplo�:2 Clonacion depET24e-(Gliadin-rd)3

Preparacion del fragmento del vector:

Primero se destruyo el unico punto de corte AdeI del plasmido pET24d (Novagen). La separacion de los 3'-extremos colgantes de cadena sencillatras la linearizacion-AdeI del plasmido pET24d fue catalizada por la polimerasa PfU (Fermentas) en ausencia de dNTP's. A continuacion tuvo lugar la religacion del fragmento del vector por T4-ADNligasa (Fermentas). Este plasmido de ADN fue amplificado a continuacion con ayuda del ADN de los oligonucleotidos cebadores sentido pET24e (SEQ ID NO 8) y antisentido pET24e (SEQ ID NO 9) y, despues de la restriccion A deI y desf osforilacion d e l os extremos 5', s e em pleo co mo f ragmento d el ve ctor pET24e para l a incorporacion de la secuencia sintetica de ADN derivada de gliadina parcialmente desamidada.

Con ayudadelos ADN de losoligonucleotidos 5'-fosforilados sentido dpGlia (SEQ ID NO 10) yantisentido dpGlia (SEQ ID NO 11) se genero una secuencia de enlazador que portaextremos colgantes 5' fosforilados compatibles con AdeI y dirigida a traves de estos se liga al fragmento del vector pET24e, cortado en AdeI y desfosforilado con ayuda del ADN de la ligasa-T4 (Fermentas).

La hibridacion del enlazador tuvo lugar en una tanda de 50 Il de la siguiente composicion:

Tris-HCl 75 mM (pH 8,8 a 25DC)

(NH4)2SO4 20 mM

0,01% (v/v) de Tween 20;

MgCl2 2 mM de

1 IM sentido Glia-dp (SEQ ID NO 10)

1 IM antisentido Glia-dp (SEQ ID NO 11)

La tanda se incubo 1 minuto a 95DC y, a continuacion, se enfrio hasta 25DC con una tasa de bajada de temperatura de 2DC por minuto.

Los fragmentos de enlazador hibridizados se purificaron utilizando el extracto NucleoSpin* del sistema de limpieza II (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG) de forma correspondiente a las instrucciones del fabricante y se recogieron en respectivamente 50 Il de Tris-HCl 5 mM, pH 8,5.

Los enlazadores portan a cada lado un extremo colgante 3'-ATG, por lo que es posible una incorporacion dirigida en el vector pET24 cortado en AdeI.

Los fragmentos de enlazador 5'-fosforilados y purificados se integraron a continuacion por ligamiento en el plasmido pET24e cortado en AdeI. Para el ligamiento se empleo el kit para ligacion rapida de ADN de la sociedad Fermentas, de forma correspondiente a las indicaciones del fabricante. A continuacion, la tanda de ligamiento se transformo en E.coli BL21 (DE3) (Stratagene).

Se seleccionaron clones positivos en virtud de la resistencia a la kanamicina [50 Ig/ml]. A partir de estos clones se aislaron los plasmidos contenidos y se examinaron por analisis de restriccion y secuenciacion del ADN. La secuencia de ADN que codifica para la proteina recombinante (peptido de fusion GAF(3X) analogo a la gliadina) segun SEQ ID NO 7 esta representada en SEQ ID NO 5 y la secuencia del ADN del plasmido de expresion completo con la designacion pET24e-GAF(3x) esta representada en SEQ ID NO 6. Se eligieron plasmidos correctos para la realizacion de la expresion, se inocularon en 20 ml de medio LB que contiene antibiotico y se incubaron a 37DC hasta alcanzar un OD600(d=1 cm) de 0,6. Por adicion de IPTG (concentracion final: 1 mM) se induce la expresion de la proteina y , a co ntinuacion, dur ante otras 3 horas se incubo a 37DC. Despues de este tiempo las celulas se sedimentan por centrifugacion a 2.200 x g durante10 minutos, se vuelven a suspender en 20 ml de PBS, se centrifugan de nuevo y finalmente se vuelven a suspender en 1 ml de PBS.

La ruptura de las celulas tiene lugar por adicion de un tercio del volumen de 4 x tampon de muestra NuPAGE-LDS (Invitrogen), seguida de una incubacion de 10 minutos a 70DC. El ADN cromosomal se fragmenta a continuacion por tratamiento con ultrasonidos (Sonificador Branson, nivel 7, microTip).

El lisado celular se transfiere despues de la separacion por SDS-PAGE sobre una membrana de nitrocelulosa. A continuacion se bloquean las posiciones no saturadas de la membrana por 15 minutos de incubacion con "tampon universal" (EUROIMMUN) con 3% p/v de leche en polvo). A continuacion, se incuba 1 hora con un anticuerpo monoclonal de raton (Merck Bioscience GmbH) dirigido contra His-Tag y diluido 1:2000 en "tampon universal" con 3% (p/v) de leche en polvo. Despues, se lava tres veces durante respectivamente 5 minutos con "tampon universal". En una segunda etapa de incubacion, los anticuerpos que en caso positivo se han unido a las proteinas reaccionan con una solucion del conjugado diluida 1:2000 en "tampon universal", la cual como conjugado contiene un anticuerpo IgG antiraton marcado con fosfatasa alcalina (Sigma).A continuacion, se lava con suero como despues de la incubacion. En una tercera etapa de incubacion se detectan entonces los anticuerpos ligados con una "solucion sustrato" NBT/BCIP (cloruro de 4-tetrazolio nitro-azul / clorobromoindolilfosfato, EUROIMMUN).

En el Westerblot, en el caso de la expresion de la construccion (GAF)3(HIS)6conforme a SEQ ID NO 7, se puede detectar una proteina His-Tag-reactiva, cuya magnitud coincide bien con la masa de 7,9 kDa predicha en base de la secuencia de aminoacidos. Las celulas que contienen el vector del plasmido inalterado, no presentan ninguna proteina correspondiente.

Ejemplo�:2 purificacion del peptido de fusion GAF(3x) recombinante, trimero, analogo a gliadina, por cromatografia de afinidad

En el caso de la columna de afinidad, se trata de una columna de centrifugacion (Spin) NINTA (Quiagen), que se manejo segun recomendaciones del fabricante.

Las celulas recolectadas conforme al ejemplo 1 se centrifugaron de nuevo tal como se ha descrito, se volvieron a suspender en 1 ml de "tampon TNI-10" (Tris-HCl 5 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM) y se rompieron por triple tratamiento con ultrasonidos durante 1 minuto (Sonificador Branson, nivel 7, MicroTip). Las proteinas insolubles se separaron por centrifugacion a 21.250 x g durante 10 minutos. A continuacion, 0,5 ml del sobrenadante se aplicaron sobre una columna de centrifugacion NINTA, equilibrada con "tampon TNI-10".

Las proteinas no o debilmente ligantes fueron separadas de la columna por multiples lavados con 0,5 ml de "tampon TNI-10". La elucion se efectua con 0,2 ml de "tampon TNI-150" (Tris-HCl 5 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM, imidazol 150 mM). La fraccion de elucion se analizo por Westernblot como en el ejemplo 1.

Los eluidos contienen esencialmente una proteina que, tras la tincion de la membrana de Westerblot con solucion de tincion Ponceau-S, corresponde en cada caso a una banda correspondiente a un magnitud de 7,9 kDa. Segun Westernblot, se puede ver una banda de la misma magnitud. Este resultado indica que la proteina expresada segun la cromatografia esta esencialmente libre de componentes de E. coli.

Ejemplo�3: ELISA para la determinacion de anticuerpos especificos de celiaquia y dermatitis herpetiforme

Las placas para microtitulacion de ELISA (Maxisorb, Nunc) se recubren con antigeno diluido en PBS, durante una noche a la temperatura ambiente. Como antigeno particularmente preferido los autores utilizaron un peptido de fusion recombinante, constituido por un nonapeptido desamidado de la gliadina, inmunologicamente dominante, enlazado con un octapeptido sintetico homologo de la gliadina (conforme a SEQ ID NO 7).

A continuacion, las placas recubiertas con antigeno se lavan con PBS (0,1% de Tween 20) y durante 2 horas se bloquean con suero fetal de bovino en 10% de PBS. Despues se vuelven a lavar las placas para microtitulacion con Tween-20 en PBS-0,1%. La incubacion de las placas se efectua tal como se describe en las instrucciones de trabajo de EUROIMMUN. Los datos para la evaluacion de resultados de este ELISA estan recopilados en la tabla 2.

Ejemplo�7: procedimiento inmunoterapeutico para el tratamiento de la celiaquia y la dermatitis herpetiforme

El ant igeno p urificado co nforme a l a i nvencion se aco pla a un a f ase so lida y se emplea co mo material p ara cromatografia de afinidad en columna. El plasma de un paciente con celiaquia o dermatitis herpetiforme se hace fluir de manera continua por esta columna y, liberado de anticuerpos por purificacion, se aporta de nuevo al paciente.

LISTA�DE �SECUENCIAS

10

11

13

14

Claims

REIVINDICACIONES?

:C�

Polipeptido, que contiene uno o varios peptidos conforme a SEQ ID NO: 2 y uno o varios peptidos conforme a SEQ ID NO: 3, habiendose podido suprimir en cada caso hasta 30% de los aminoacidos o intercambiar por un reemplazamiento conservativos de aminoacidos, y/o pudiendose solapar en parte SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, caracterizado porque comprende uno o varios polipeptidos constituidos por al menos 14, al menos 15 o al menos 16 aminoacidos sucesivos en SEQ ID NO 4, o que comprende uno o varios polipeptidos conforme a SEQ ID NO 4.

:C�

Polipeptido segun la reivindicacion 1, que comprende tres polipeptidos conforme a SEQ ID NO: 4.

3C�

Polipeptido segun una de l conforme a SEQ ID NO: 7. as reivindicaciones precedentes, que c omprende u no o va rios polipeptidos

7C�

Polipeptido segun una de las reivindicaciones precedentes en forma de un polimero que comprende 2 a 20 polipeptidos.

5C�

Polipeptido s egun una d e l as reivindicaciones precedentes, ca racterizado porque se pr epara de f orma recombinante o con medios bioquimicos convencionales de sintesis de polipeptidos.

�C�

Polipeptido segun una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque esta unido con una molecula reportera o con una fase solida.

7C�

Procedimiento para el diagnostico de celiaquia y/o dermatitis herpetiforme, caracterizado porque una muestra biologica l iquida de un p aciente se p one en co ntacto con un o o va rios polipeptidos segun un a de l as reivindicaciones precedentes, pudiendo tener lugar la union de los anticuerpos de la muestra biologica a estos polipeptidos, de modo que por la deteccion de anticuerpos contra uno de estos polipeptidos se diagnostica una celiaquia o una dermatitis herpetiforme.

8C�

Procedimiento se gun l a r eivindicacion 7, ca racterizado por que se utiliza una m ezcla de al m enos dos polipeptidos diferentes segun una de las reivindicaciones 1 a 6.

�C�

Procedimiento segun la reivindicacion 7 u 8, caracterizado porque la union de los anticuerpos se detecta mediante u n ensa yo de inmunofluorescencia, M icroarray, ELISA, un ensa yo de l uminiscencia, B lot , un ensayo radioinmune, Western Blot o Dot Blot.

:2C

Equipo de ensayo para la deteccion de anticuerpos, caracterizado porque comprende un polipeptido segun una de las reivindicaciones 1 a 6.

::C

Polipeptido segun una de las reivindicaciones 1 a 6 para su utilizacion en la terapia de celiaquia y/o dermatitis herpetiforme, caracterizado porque la s angre o el pl asma de un pa ciente s e p one en co ntacto co n un polipeptido segun una de las reivindicaciones 1 a 7, teniendo lugar la union de los anticuerpos asociados a la enfermedad, de la sangre o del plasma, al polipeptido por lo que la sangre o el plasma empobrecido en anticuerpos es adecuado para la reinfusion al paciente.

::C

Composicion farmaceutica, caracterizada porque comprende un polipeptido segun una de las reivindicaciones 1 a 6.

:3C

Utilizacion de un polipeptido segun una de las reivindicaciones 1 a 6 para el diagnostico i� vivo de celiaquia y/o dermatitis herpetiforme.

:7C

Utilizacion de un polipeptido segun una de las reivindicaciones 1 a 6 para la preparacion de un medicamento para la terapia de celiaquia y/o dermatitis herpetiforme.

:5C

�cido nucleico, que codifica para uno o varios polipeptidos segun una de las reivindicaciones 1 a 6.