ES2386258T3 - Relaciones de adición conjugadas para la entrega controlada de compuestos farmacéuticamente activos - Google Patents

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Donald Elbert
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Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ
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Abstract

Un biomaterial formado de la reticulacion de al menos un primer y un segundo componente precursor, en dicho primer componente precursor se selecciona del grupo que consiste de: D-Y-C (0) - (CH2) n-S- (CH2) 2-C0X-P, D-Y-C (0) - (CH2) n-NH- (CH2) 2-C0X-P, D-Y-C (0) - (CH2) n-NH-U-P, D-Y-C (0) - (CH2) n-S-U-P, D-Y-C (0) - (CH2) n-S-L-S-CH2-CH2-C0-X-P; D-Y-C (0) - (CH2) n-S-L-U-P; D-Y-C (0) - (CH2) n-NH-L-S-CH2-CH2-C0-X-P; D-Y-C (0) - (CH2) n-NH-L-S-U-P; D-Y-C (0) - (CH2) n-S-L-NH-CH2-CH2-C0-X-P; D-Y-C (0) - (CH2) n-S-L-NH-U-P; D-Y-C (0) - (CH2) n-NH-L-NH-CH2-CH2-C0-X-P; o D-Y-C (0) - (CH2) n-NH-L-NH-U-P, donde D es una ramificacion farmaceuticamente activa o una ramificacion de enlace; n es 1, 2 o 3; Y es 0, NH o N; L es un enlazador lineal o ramificado; X es 0 o N; P es un polimero soluble en agua o un polimero hinchable en agua que tiene uno o mas grupos insaturados conjugados; y U es el producto de adicion de un nucleofilo a un grupo electrofilo que esta unido al polimero.

Description

Reacciones de adicion conjugadas para la entrega controlada de compuestos farmaceuticamente activos
Antecedentes de la Invenci6n
La presente invencion se refiere a la liberacion de compuestos farmaceuticamente activos a partir de biomateriales, incluyendo materiales a granel y materiales coloidales. Se usan reacciones de adicion nucleofila para la conjugacion de los compuestos farmaceuticamente activos a los polimeros para lograr las tasas de liberacion preferentes que presentan las composiciones de la invencion. Los biomateriales sinteticos, incluyendo los hidrogeles polimericos, se pueden usar en una diversidad de aplicaciones, incluyendo aplicaciones farmaceuticas y quirurgicas. Estos se pueden usar, por ejemplo, para aplicar moleculas terapeuticas a un sujeto, como adhesivos o selladores, como andamios de disero de tejidos y curacion de heridas, y como dispositivos de trasplante celular. El uso de materiales para la liberacion de compuestos farmaceuticamente activos ha sido estudiado por diversos grupos. Pitt y Schindler categorizaron los diversos tipos de esquemas de entrega controlada de farmacos (Pitt y colaboradores, Controlled Drug Delivery, CRC Press, Boca Raton, Florida, p. 53-80, 1983). Ellos definieron dos tipos de sistemas en los cuales el farmaco estaba unido covalentemente a un material. Los sistemas en los cuales el farmaco estaba unido de manera colgante al polimero fueron llamados sistemas tipo IV, y los sistemas en los cuales el farmaco estaba incorporado en la columna del polimero fueron llamados sistemas tipo V. Esta definicion de polimeros tipo V fue expandida adicionalmente por Baker (Controlled Release of Biologically Active Agents, p. 84-13, John Wiley and Sons, New York, 1987), quienes incluyeron sistemas en los cuales un grupo polimerizable por radicales libres era aradido a un farmaco, con la subsecuente polimerizacion por radicales libres del farmaco solo o con otros co-monomeros para formar un material (por ejemplo, ver Duncan y colaboradores, Adv. In Polym. Sci. 57:51-101, 1984). Los sistemas tipo Ivb son diferentes de los sistemas tipo V en que se utiliza una molecula enlazada para conectar un farmaco a un grupo activo en un polimero. W0 00/44808 divulga biomateriales polimericos formados por reacciones nucleopticas por adicion a grupos conjugados insaturados. La divulgacion de la W0 00/44808 se discutira mas adelante. Aunque se ha hecho mucho progreso en el campo de los biomateriales polimericos, se deben hacer desarrollos adicionales, con el proposito de que esos biomateriales se usen de manera optima en el cuerpo. Para la liberacion de un compuesto terapeutico a partir de un biomaterial durante un marco temporal clinicamente relevante, la vida media de la liberacion del compuesto terapeutico del biomaterial debe ser del orden de semanas o meses, mas que del orden de horas o aros, como ha sido el caso cuando se colocan los biomateriales bajo condiciones fisiologicas. De hecho, la utilidad clinica de la entrega de compuestos farmaceuticamente activos a partir de biomateriales ha sido limitada debido a la falta de control de la tasa de liberacion de compuestos farmaceuticamente activos del biomaterial y la gran dificultad y los bajos rendimientos asociados con la conjugacion de estos compuestos al polimero.
Sumario de la Invenci6n
El objeto de la presente invencion es un biomaterial tal y como se reivindica en la reivindicacion 1, el uso del biomaterial en un metodo como se reivindica en la reivindicacion 23, un compuesto farmaceutico activo como se reivindica en la reivindicacion 24, y un componente precursor apropiado para el uso en la formacion de de un biomaterial como se reivindica en la reivindicacion 27. En las reivindicaciones dependientes se reivindican realizaciones de la patente. La siguiente invencion incluye compuestos que son utiles en el acoplamiento de un compuesto farmaceuticamente activo a un polimero, usando una reaccion de adicion conjugada. Tambien se describe la polimerizacion o reticulacion de los polimeros para formar un biomaterial, usando en algunas formas de realizacion reacciones de adicion conjugada. Ademas de lo anterior, la polimerizacion o reticulacion pueden ser logradas mediante otros mecanismos, tales como polimerizacion de radicales libres. Un polimero acoplado a un compuesto farmaceuticamente activo puede tambien ser reticulado con otro polimero para formar un copolimero, tal como un biomaterial polimerico lineal, biomaterial coloidal, o un biomaterial en gel. Los compuestos, componentes precursores, y biomateriales de la invencion pueden ser usados en el tratamiento o prevencion de una enfermedad, un desorden, o una infeccion.
En un primer aspecto, la invencion provee un compuesto que tiene la formula:
D-Y-C(0)-(CH2)n-SH o D-Y-C(0)-(CH2)n-NH2
donde D es una ramificacion farmaceuticamente activa o una ramificacion de enlace; n es 1, 2 o 3; Y es 0, NH
o N. En un segundo aspecto, se describe un compuesto de la formula:
D-Y-C(0)-(CH2)n-S-(CH2)2-C0X-P, D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-(CH2)2-C0X-P, D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-U-P, o D-Y-C(0)-(CH2)n-S-U-P
donde D es una ramificacion farmaceuticamente activa o una ramificacion de enlace; n es 1, 2 o 3; X es N u 0; P es un polimero soluble en agua o un polimero hinchable en agua teniendo uno o mas grupos insaturados conjugados; Y es 0, NH o N; y U es el producto de la adicion de un nucleofilo a un grupo electrofilo que esta unido al polimero. La vida media del enlace ester o amida con la ramificacion farmaceuticamente activa o la ramificacion de enlace es de entre una hora y un aro en una solucion acuosa a un pH de 7.4 y 37°C. De manera deseable, la vida media es de entre un dia y nueve meses, con mayor preferencia entre dos dias y seis meses, y con la mayor preferencia entre cuatro dias y tres semanas. En un tercer aspecto, se describe un compuesto que tiene la formula:
D-Y-C(0)-CH=CH2 o D-Y-C(0)-(CH2)n-CH=CH2
donde D es una ramificacion farmaceuticamente activa o una ramificacion de enlace, Y es 0, NH o N. Tambien se contempla que el compuesto pueda tener una ramificacion hidrocarburo en lugar de uno o mas hidrogenos en el grupo alqueno (-CH=CH2). En diversas formas de realizacion, n es 1. En un cuarto aspecto, la invencion incluye un compuesto que tiene la formula:
D-Y-C(0)-(CH2)n-S-L-SH, D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-L-SH, D-Y-C(0)-(CH2)n-S-L-NH2, o D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-L-NH2
donde D es una ramificacion farmaceuticamente activa o una ramificacion de enlace; Y es 0, NH o N; y L es un grupo lineal o ramificado. En la presente invencion, n es 1, 2 o 3. En un quinto aspecto, se describe un compuesto que tiene la formula:
D-Y-C(0)-(CH2)n-S-L-S-CH2-CH2-C0-X-P; D-Y-C(0)-(CH2)n-S-L-U-P; D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-L-S-CH2-CH2-C0-X-P; D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-L-S-U-P; D-Y-C(0)-(CH2)n-S-L-NH-CH2-CH2-C0-X-P; D-Y-C(0)-(CH2)n-S-L-NH-U-P; D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-L-NH-CH2-CH2-C0-X-P; o D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-L-NH-U-P,
donde D es una ramificacion farmaceuticamente activa o una ramificacion de enlace; L es un grupo (grupo enlazador) lineal o ramificado; X es 0 o N; Y es 0, NH o N; P es un polimero soluble en agua o un polimero hinchable en agua que tiene uno o mas grupos insaturados conjugados; y U es el producto de adicion de un nucleofilo a un grupo electrofilo que esta unido al polimero. La vida media del enlace ester o amida con la ramificacion farmaceuticamente activa o la ramificacion de enlace es de entre una hora y un aro en una solucion acuosa a un pH de 7.4 y 37°C. En la presente invencion, n es 1, 2 o 3. Un sexto aspecto de se describe un biomaterial formado de la reticulacion de dos o mas componentes precursores que tienen la formula:
D-Y-C(0)-(CH2)n-S-(CH2)2-C0X-P, D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-(CH2)2-C0X-P, D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-U-P, D-Y-C(0)-(CH2)n-S-U-P, D-Y-C(0)-(CH2)2-S-L-S-CH2-CH2-C0-X-P, D-Y-C(0)-(CH2)2-S-L-S-U-P, D-Y-C(0)-(CH2)2-NH-L-S-CH2-CH2-C0-X-P, D-Y-C(0)-(CH2)2-NH-L-S-U-P, D-Y-C(0)-(CH2)2-S-L-NH-CH2-CH2-C0-X-P, D-Y-C(0)-(CH2)2-S-L-NH-U-P, D-Y-C(0)-(CH2)2-NH-L-NH-CH2-CH2-C0-X-P, D-Y-C(0)-(CH2)2-NH-L-NH-U-P, D-Y-C(0)-(CH2)3-S-L-S-CH2-CH2-C0-X-P, D-Y-C(0)-(CH2)3-S-L-S-U-P, D-Y-C(0)-(CH2)3-NH-L-S-CH2-CH2-C0-X-P, D-Y-C(0)-(CH2)3-NH-L-S-U-P,
D-Y-C(0)-(CH2)3-S-L-NH-CH2-CH2-C0-X-P, D-Y-C(0)-(CH2)3-S-L-NH-U-P, D-Y-C(0)-(CH2)3-NH-L-NH-CH2-CH2-C0-X-P, o D-Y-C(0)-(CH2)3-NH-L-NH-U-P
donde D es una ramificacion farmaceuticamente activa o una ramificacion de enlace; Y es 0, NH o N; L es un grupo (grupo enlazador) lineal o ramificado; X es 0 o N; P es un polimero soluble en agua o un polimero hinchable en agua teniendo uno o mas grupos insaturados conjugados; y U es el producto de la adicion de un nucleofilo a un grupo electrofilo que esta unido al polimero. La vida media del enlace ester o amida con la ramificacion farmaceuticamente activa o la ramificacion de enlace es de entre un dia y un aro en una solucion acuosa a un pH de 7.4 y 37°C. En una forma de realizacion deseable, la reticulacion ocurre mediante polimerizacion por radicales libres o adicion conjugada, posiblemente en presencia de un acelerador. En otra forma de realizacion deseable, la reticulacion forma un material coloidal, micro-esfera o nano-esfera. La reticulacion puede tambien ocurrir en presencia de moleculas biologicas sensibles o en o cerca de un sitio en el cuerpo de un mamifero, tal como un ser humano. De manera deseable, un compuesto farmaceuticamente activo es liberado y entregado al sitio. En la presente invencion, n es 1, 2 o 3. Una forma de realizacion deseable de los aspectos primero a sexto de la invencion, o descritos aqui respectivamente, la ramificacion farmaceuticamente activa es derivada de una del grupo que consiste en moleculas organicas sinteticas, moleculas organicas que ocurren naturalmente, moleculas de acido nucleico, proteinas o peptidos bio-sinteticos, peptidos o proteinas que ocurren naturalmente, y peptidos o proteinas que ocurren naturalmente modificados. Las moleculas organicas preferentes incluyen paclitaxel, doxorrubicina, 5fluorodesoxiuridina, estradiol, 2-metoxiestradiol, y sus derivados. En formas de realizacion preferentes de los aspectos segundo, cuarto, quinto y sexto, el polimero soluble en agua o hinchable en agua es seleccionado del grupo que consiste en poli(etilenglicol), oxido de poli(etileno), alcohol poli (vinilico), alcohol poli(etilen-co-vinilico), acido poli (acrilico), poli(etilen-co-alcohol vinilico), poli(vinil pirrolidona), poli(hidroxipropil metacrilamida), poli(N-isopropilacrilamida), poli(dimetil acrilamida), poli(acido acrilico), poli(etiloxazolina), copolimeros de bloque de poli(oxido de etileno)-co-poli(oxido de propileno), o copolimeros solubles en agua o hinchables en agua conteniendo estos polimeros, y sus derivados teniendo grupos insaturados conjugados. Los grupos insaturados pueden ser identicos o diferentes. En diversas formas de realizacion, uno o mas de los grupos insaturados pueden no estar acoplados a una ramificacion farmaceuticamente activa. De manera deseable, los grupos insaturados no son activados como para sufrir reacciones de sustitucion nucleofila. Grupos insaturados preferidos incluyen acrilatos, metacrilatos, acrilamidas, metacrilamidas, acrilonitrilos, quinonas, y sus derivados. En otra forma de realizacion deseable, la hidrolisis del compuesto da como resultado la liberacion de un compuesto farmaceuticamente activo que tiene la formula D-0H, D-NH2, o D-NH. En una forma de realizacion deseable de los aspectos cuarto al sexto, el enlace, i.e. grupo de enlace L, incluye uno o mas aminoacidos. De manera deseable, el enlazador comprende un sitio de adhesion, un sitio de enlace de factor de crecimiento, o sitio de enlace de proteasa. Los enlazadores preferentes tambien incluyen enlazadores degradables enzimaticamente. Si el enlazador, i.e. grupo de enlace L, de los aspectos cuarto a sexto es hidrofilo, puede incrementar la solubilidad en agua de la ramificacion farmaceuticamente activa y/o incrementar la tasa de liberacion del compuesto farmaceuticamente activo derivado. Si el enlazador es hidrofobo, puede reducir la solubilidad en agua de la ramificacion farmaceuticamente activa y/o reducir la tasa de liberacion de un compuesto farmaceuticamente activo derivado de D. En otras formas de realizacion preferentes, el enlazador incluye un grupo nucleofilo que incrementa la tasa de liberacion de un compuesto farmaceuticamente activo teniendo la formula D-0H-D-NH2, o D-NH, mediante reaccion con el enlace ester o amida en D. Enlazadores preferentes tambien incluyen fracciones hidrocarburo que contienen entre uno y cuatro atomos de carbono, inclusive. Si el enlazador de los aspectos cuarto a sexto es hidrofilo, puede tambien incrementar la solubilidad en agua de la ramificacion de enlace y/o incrementar la tasa de liberacion de un compuesto derivado de la ramificacion de enlace. Si el enlazador es hidrofobo, puede reducir la solubilidad en agua de la ramificacion de enlace y/o reducir la tasa de liberacion de un compuesto derivado de la ramificacion de enlace. En otras formas de realizacion preferentes, el enlazador incluye un grupo nucleofilo que incrementa la tasa de liberacion de un compuesto que tiene la formula D-0H-D-NH2, o D-NH, mediante reaccion con el enlace ester o amida en D. Enlazadores preferentes tambien incluyen fracciones hidrocarburo que contienen entre uno y cuatro atomos de carbono, inclusive. En un septimo aspecto, se describe un metodo para hacer un componente precursor de un biomaterial. El metodo incluye (a) unir un compuesto farmaceuticamente activo o un compuesto de enlace a una molecula enlazadora para producir un compuesto que tiene la formula:
D-Y-C(0)-(CH2)n-SH o D-Y-C(0)-(CH2)n-NH2
donde D es una ramificacion farmaceuticamente activa o una ramificacion de enlace; Y es 0, NH o N; y n es 1, 2 o 3; y (b) acoplar el producto formado en el paso (a) a un polimero soluble en agua o un polimero hinchable en agua teniendo dos o mas grupos insaturados conjugados mediante una reaccion de adicion conjugada. Un metodo para hacer un componente precursor de un biomaterial tambien se describe en un octavo aspecto.
Este metodo incluye (a) unir un compuesto farmaceuticamente activo o compuesto de enlace a una molecula enlazadora para producir un compuesto teniendo la formula:
D-Y-C(0)-CH=CH2 o D-Y-C(0)-CH2-CH=CH2
donde D es una ramificacion farmaceuticamente activa o una ramificacion de enlace, y Y es 0, NH o N; y (b) acoplar el producto formado en el paso (a) a un polimero soluble en agua o un polimero hinchable en agua teniendo dos o mas grupos insaturados conjugados mediante una reaccion de adicion conjugada. De preferencia, el paso (a) es llevado a cabo condensando un acido acrilico con un alcohol o amina en un compuesto farmaceuticamente activo o en una ramificacion de enlace para formar un enlace ester o amida y producir un compuesto farmaceuticamente activo modificado o un compuesto de enlace modificado. El noveno aspecto describe un metodo para hacer un componente precursor de un biomaterial que incluye (a) unir un compuesto farmaceuticamente activo o un compuesto de enlace a un enlazador para producir un compuesto que tiene la formula:
D-Y-C(0)-(CH2)n-S-L-SH, D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-L-SH, D-Y-C(0)-(CH2)n-S-L-NH2, o D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-L-NH2
donde D es una ramificacion farmaceuticamente activa o una ramificacion de enlace; Y es 0, NH o N; y L es un enlazador lineal o ramificado, y (b) acoplar el producto formado en el paso (a) a un polimero soluble en agua o un polimero hinchable en agua teniendo dos o mas grupos insaturados conjugados mediante una reaccion de adicion conjugada. De preferencia, el paso (a) es llevado a cabo condensando un acido acrilico con un alcohol
o amina en un compuesto farmaceuticamente activo o en un compuesto de enlace para formar un enlace ester
o amida, haciendo reaccionar el producto con un compuesto que tiene una amina o tiol protegidos y una amina
o tiol libres, y removiendo el grupo protector tiol o amina. En diversas formas de realizacion, n es 1, 2 o 3. En un decimo aspecto se describe un metodo para hacer un componente precursor de un biomaterial que incluye (a) condensar un enlazador que consiste en uno de los siguientes: un acido mercaptopropionico protegido con tiol, un acido mercaptoacetico protegido con tiol, un acido aminopropionico protegido con amina,
o una glicina protegida con amina; con un alcohol o amina en un compuesto farmaceuticamente activo o en un compuesto de enlace para formar un enlace ester o amida y producir un compuesto farmaceuticamente activo modificado o un compuesto de enlace modificado; (b) remover el grupo protector tiol o amina; y (c) acoplar el producto formado en el paso (b) a un polimero soluble en agua o un polimero hinchable en agua teniendo dos o mas grupos insaturados conjugados mediante una reaccion de adicion conjugada. En un decimo primer aspecto se describe un metodo para hacer un componente precursor de un biomaterial. Este metodo incluye (a) condensar un acido acrilico con un alcohol o amina en un compuesto farmaceuticamente activo o un compuesto de enlace para formar un enlace ester o amida y producir un compuesto farmaceuticamente activo modificado o un compuesto de enlace modificado; (b) hacer reaccionar el compuesto farmaceuticamente activo modificado o el compuesto de enlace modificado con un enlazador que contiene un tiol o una amina libres y un tiol o una amina protegidos mediante adicion conjugada; (c) remover el grupo protector tiol o amina; y (d) acoplar el producto formado en el paso (c) a un polimero soluble en agua o un polimero hinchable en agua teniendo dos o mas grupos insaturados conjugados por una reaccion de adicion conjugada. En un decimo segundo aspecto se describe un metodo para hacer un componente precursor de un biomaterial. Este metodo incluye (a) incorporar una amino o un tiol nucleofilos en un compuesto farmaceuticamente activo o un compuesto de enlace y (b) acoplar el producto formado en el paso (a) a un polimero soluble en agua o un polimero hinchable en agua teniendo dos o mas grupos insaturados conjugados mediante una reaccion de adicion conjugada. De preferencia, el compuesto farmaceuticamente activo es ADN, ARN, un peptido o una proteina. En una forma de realizacion deseable, el ADN o ARN tiene una base que se modifica para contener un tiol. En formas de realizacion preferentes de los aspectos septimo a decimo segundo, el compuesto farmaceuticamente activo es seleccionado del grupo que consiste en moleculas organicas sintetizadas, moleculas organicas que ocurren naturalmente, moleculas de acido nucleico, proteinas o peptidos biosinteticos, proteinas o peptidos que ocurren naturalmente, y peptidos o proteinas que ocurren naturalmente modificados. Moleculas organicas preferentes incluyen paclitaxel, doxorrubicina, camptotecina, 5fluorodesoxiuridina, estradiol, 2-metoxiestradiol, y sus derivados. En una forma de realizacion deseable, la secuencia de aminoacidos del peptido o proteina bio-sinteticos tiene una cisteina en vez de otro aminoacido encontrado en la ubicacion correspondiente en un peptido o proteina que ocurre naturalmente. La union del compuesto farmaceuticamente activo o la ramificacion de enlace a un enlazador o acido acrilico en el paso (a) puede llevarse a cabo en presencia de un agente de condensacion. En otras formas de realizacion preferentes de estos aspectos, el polimero soluble en agua o hinchable en agua es seleccionado del grupo que consiste en poli(etilen glicol), poli(oxido de etileno), poli(alcohol vinilico), poli(acido acrilico), poli(etileno-co-alcohol vinilico), poli(vinil pirrolidona), poli (hidroxipropil metacrilamida), poli(N-isopropilacrilamida), poli (dimetil acrilamida), poli(acido acrilico), poli(etiloxazolina), copolimeros de bloques de poli(oxido de etileno)-co-poli(oxido de
propileno), o copolimeros solubles en agua o hinchables en agua conteniendo estos polimeros, y sus derivados teniendo grupos insaturados conjugados. En otra forma de realizacion, los grupos insaturados conjugados son identicos. Grupos insaturados conjugados preferentes incluyen acrilatos, metacrilatos, acrilamidas, metacrilamidas, acrilonitrilos, y quinonas. En formas de realizacion preferentes de estos aspectos, uno o mas de los grupos insaturados no estan acoplados a la ramificacion farmaceuticamente activa. En otras formas de realizacion preferentes de estos aspectos, uno o mas de los grupos insaturados no estan acoplados a la ramificacion de enlace. En todavia otras formas de realizacion preferentes de estos aspectos, uno o mas de los grupos insaturados no estan acoplados a la ramificacion de enlace o a la ramificacion farmaceuticamente activa. De manera deseable, los grupos insaturados no son activados de modo de sufrir reacciones de sustitucion nucleofila. Los metodos pueden incluir un paso de purificacion que es llevado a cabo antes del ultimo paso. De manera deseable, el compuesto farmaceuticamente activo es liberado del componente precursor como el compuesto farmaceuticamente activo no modificado, original. En una forma de realizacion deseable, el numero de grupos insaturados conjugados en el polimero es mayor que el numero de grupos amina o tiol en el enlazador. La molecula enlazadora de los aspectos septimo a decimo segundo aqui descritos, puede tener las mismas formas de realizacion listadas para el enlazador de los aspectos cuarto a sexto. En un decimo tercer aspecto se describe un metodo de hacer un biomaterial. Este metodo incluye (a) unir un compuesto farmaceuticamente activo o compuesto de enlace a una molecula enlazadora o incorporar una amina o un tiol nucleofilos en un compuesto farmaceuticamente activo o compuesto de enlace, (b) remover cualesquiera grupos protectores tiol o amina en el enlazador, (c) acoplar un tiol, una amina, o grupo alqueno en el enlazador o incorporado en el compuesto farmaceuticamente activo o compuesto de enlace a un polimero soluble en agua o un polimero hinchable en agua teniendo dos o mas grupos insaturados conjugados mediante una reaccion de adicion conjugada para formar un componente precursor, y (d) reticular los grupos insaturados conjugados no acoplados en uno o mas de los componentes precursores. En una forma de realizacion deseable, un polimero que tiene uno o mas grupos insaturados conjugados y que no se acopla a una ramificacion farmaceuticamente activa es incorporado en el biomaterial llevando a cabo la reticulacion en presencia de este polimero. En otra forma de realizacion deseable, un polimero que tiene uno o mas grupos insaturados conjugados y que no esta acoplado a una ramificacion de enlace es incorporado en el biomaterial llevando a cabo la reticulacion en presencia de este polimero. En todavia otra forma de realizacion deseable, un polimero que tiene uno o mas grupos insaturados conjugados y que no esta acoplado a ya sea una ramificacion de enlace o un compuesto farmaceuticamente activo es incorporado en el biomaterial llevando a cabo la reticulacion en presencia de este polimero. En otra forma de realizacion deseable, la reticulacion es llevada a cabo en presencia de un compuesto objetivo teniendo dos o mas grupos nucleofilos, y el compuesto objetivo es con ello incorporado en el biomaterial. Compuestos objetivos preferentes incluyen un peptido con una secuencia de aminoacidos que es 80%, de preferencia 90%, o con mayor preferencia 100% identica a la secuencia GCNNRGDNNCG (SEQ ID N0: 73). 0tros compuestos objetivo preferentes incluyen aquellos que tienen una secuencia de aminoacidos o ramificacion que provee objetivacion a celulas, tejidos, organos, sistemas de organos, o sitios dentro de un mamifero. En una forma de realizacion deseable, el paso de reticulacion y/o la formacion de los componentes precursores del biomaterial ocurre dentro del cuerpo de un mamifero, tal como un ser humano. En otra forma de realizacion deseable, la reticulacion ocurre mediante polimerizacion por radicales libres o reacciones de adicion conjugada en o cerca de un sitio dentro del cuerpo de un mamifero. De manera deseable, la reticulacion ocurre mediante una reaccion auto-selectiva entre un tiol
o una amina y un grupo insaturado conjugado. En otra forma de realizacion deseable, la reticulacion forma un hidrogel, un material coloidal, una micro-esfera, o nano-esfera, que puede entregarse a un mamifero, tal como un ser humano. En todavia otra forma de realizacion deseable, el compuesto farmaceuticamente activo o un derivado del mismo es liberado del biomaterial y entregado a un sitio dentro del cuerpo. De preferencia, la vida media del enlace ester o amida en la ramificacion farmaceuticamente activa o en la ramificacion de enlace es de entre una hora y un aro en el sitio dentro del cuerpo. De manera deseable, la vida media es de entre una hora y un aro a un pH de 7.4 y 37°C en una solucion acuosa. Los grupos insaturados conjugados de este aspecto pueden tener las mismas formas de realizacion listadas para los grupos insaturados conjugados de cualesquiera de los aspectos previos. En un decimo cuarto aspecto se describe un biomaterial que tiene una ramificacion farmaceuticamente activa. El biomaterial incluye un enlace ester o amida en la ramificacion farmaceuticamente activa, y este enlace tiene una vida media de entre una hora y un aro en una solucion acuosa a un pH de 7.4 y 37°C. De manera deseable, la vida media del enlace ester o amida en la ramificacion farmaceuticamente activa para este biomaterial, el biomaterial del sexto aspecto de la invencion, y los biomateriales formados usando los metodos descritos, es de entre un dia y nueve meses, con mayor preferencia entre dos dias y seis meses, y con la mayor preferencia entre cuatro dias y tres semanas. En un aspecto relacionado, se describe un biomaterial que tiene una ramificacion de enlace. El biomaterial incluye un enlace ester o amida en la ramificacion de enlace, y este enlace tiene una vida media de entre una hora y un aro en una solucion acuosa a un pH de 7.4 y 37°C. De manera deseable, la vida media del enlace ester o amida en la ramificacion de enlace para este biomaterial es de entre un dia y nueve meses, con mayor preferencia entre dos dias y seis meses, y con la mayor preferencia entre cuatro dias y tres semanas. En otras formas de realizacion, la ramificacion de enlace es heparina, una ramificacion que se liga a heparina, una ramificacion de enlace de ion de metal, una ramificacion carbohidrato, una ramificacion de enlace de carbohidrato, o una ramificacion que se liga a grupos hidrofobos. Ejemplos de fracciones de enlace de ion de metal incluyen fracciones de enlace de Cu+2, fracciones
de enlace de Co+2, y fracciones de enlace de Zn+2. Fracciones de enlace de carbohidratos preferentes con acidos fenilboronicos. En otra forma de realizacion, el acido fenilboronico es enlazado al biomaterial mediante una amina secundaria en el anillo de fenilo del acido fenilboronico. Un ejemplo de una ramificacion que se liga a grupos hidrofobos es una ciclodextrina. En formas de realizacion preferentes, una ramificacion o un compuesto farmaceuticamente activo es ligado a la ramificacion de enlace en el biomaterial. Ejemplos de fracciones farmaceuticamente activas o compuestos que pueden ser ligados directa o indirectamente a la ramificacion de enlace incluyen moleculas organicas sinteticas, moleculas organicas que ocurren naturalmente, moleculas de acido nucleico, proteinas o peptidos bio-sinteticos, peptidos o proteinas que ocurren naturalmente, y peptidos o proteinas que ocurren naturalmente, modificados. Ejemplos de tales moleculas organicas incluyen paclitaxel, doxorrubicina, camptotecina, 5-fluorodesoxiuridina, estradiol, 2-metoxiestradiol, y sus derivados. En formas de realizacion preferentes de los aspectos decimo tercero y decimo cuarto, la ramificacion farmaceuticamente activa tiene cualquiera de las formas de realizacion preferentes de la ramificacion farmaceuticamente activa de los aspectos previos. En un decimo quinto aspecto, la invencion se usa junto en un metodo para tratar o prevenir una enfermedad, un desorden, o una infeccion, administrando a un mamifero, tal como un ser humano, un compuesto que tiene la formula:
D-Y-C(0)-(CH2)n-SH, D-Y-C(0)-(CH2)n-NH2, D-Y-C(0)-(CH2)n-S-(CH2)2-C0X-P, D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-(CH2)2-C0X-P, D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-U-P, D-Y-C(0)-(CH2)n-S-U-P, D-Y-C(0)-(CH2)2-S-L-S-CH2-CH2-C0-X-P, D-Y-C(0)-(CH2)2-S-L-S-U-P, D-Y-C(0)-(CH2)2-NH-L-S-CH2-CH2-C0-X-P, D-Y-C(0)-(CH2)2-NH-L-S-U-P, D-Y-C(0)-(CH2)2-S-L-NH-CH2-CH2-C0-X-P, D-Y-C(0)-(CH2)2-S-L-NH-U-P, D-Y-C(0)-(CH2)2-NH-L-NH-CH2-CH2-C0-X-P, D-Y-C(0)-(CH2)2-NH-L-NH-U-P, D-Y-C(0)-(CH2)3-S-L-S-CH2-CH2-C0-X-P, D-Y-C(0)-(CH2)3-S-L-S-U-P, D-Y-C(0)-(CH2)3-NH-L-S-CH2-CH2-C0-X-P, D-Y-C(0)-(CH2)3-NH-L-S-U-P, D-Y-C(0)-(CH2)3-S-L-NH-CH2-CH2-C0-X-P, D-Y-C(0)-(CH2)3-S-L-NH-U-P, D-Y-C(0)-(CH2)3-NH-L-NH-CH2-CH2-C0-X-P, o D-Y-C(0)-(CH2)3-NH-L-NH-U-P,
donde D es una ramificacion farmaceuticamente activa o una ramificacion de enlace; Y es 0, NH o N; L es un enlazador lineal o ramificado; X es 0 o N; P es un polimero soluble en agua o un polimero hinchable en agua teniendo uno o mas grupos insaturados conjugados; y U es el producto de la adicion de un nucleofilo a un grupo electrofilo que esta unido al polimero. La vida media del enlace ester o amida en la ramificacion farmaceuticamente activa o la ramificacion de enlace es de entre una hora y un aro en una solucion acuosa a un pH de 7.4 y 37°C. En diversas formas de realizacion, n es 1, 2 o 3. En un decimo sexto aspecto, se describe un metodo de tratar o prevenir una enfermedad, un desorden, o una infeccion en un mamifero. Este metodo incluye administrar al mamifero un biomaterial que tiene una ramificacion farmaceuticamente activa. La ramificacion farmaceuticamente activa puede estar ligada directamente al biomaterial mediante un enlace amida o ester o ligada indirectamente al material mediante una interaccion covalente o no covalente con una ramificacion de enlace que esta ligada al biomaterial mediante un enlace ester o amida. Este biomaterial es formado a partir de la reticulacion de uno o mas de los siguientes componentes precursores:
D-Y-C(0)-(CH2)n-S-(CH2)2-C0X-P, D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-(CH2)2-C0X-P, D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-U-P, D-Y-C(0)-(CH2)n-S-U-P, D-Y-C(0)-(CH2)n-P, D-Y-C(0)-(CH2)n-S-L-S-CH2-CH2-C0-X-P; D-Y-C(0)-(CH2)n-S-L-U-P; D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-L-S-CH2-CH2-C0-X-P; D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-L-S-U-P; D-Y-C(0)-(CH2)n-S-L-NH-CH2-CH2-C0-X-P; D-Y-C(0)-(CH2)n-S-L-NH-U-P; D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-L-NH-CH2-CH2-C0-X-P; D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-L-NH-U-P, o
Z-P, donde D es una ramificacion farmaceuticamente activa o una ramificacion de enlace; Y es 0, NH o N; L es un enlazador lineal o ramificado; X es 0 o N; Z es una ramificacion farmaceuticamente activa o una ramificacion de enlace en la cual se ha incorporado una amina o un tiol nucleofilos; P es un polimero soluble en agua o un polimero hinchable en agua teniendo uno o mas grupos insaturados conjugados; y U es el producto de la adicion de un nucleofilo a un grupo electrofilo que esta unido al polimero. La vida media del enlace ester o amida en la ramificacion farmaceuticamente activa o en la ramificacion de enlace es de entre una hora y un aro en una solucion acuosa a un pH de 7.4 y 37°C. En diversas formas de realizacion, n es 1, 2 o 3. En un decimo sexto aspecto, la invencion es para uso en un metodo de tratar o prevenir una enfermedad, un desorden, o una infeccion en un mamifero. Este metodo incluye administrar al mamifero un biomaterial que tiene una ramificacion farmaceuticamente activa. La ramificacion farmaceuticamente activa puede estar ligada directamente al biomaterial mediante un enlace amida o ester o ligada indirectamente al biomaterial mediante una interaccion covalente o no covalente con una ramificacion de enlace que se liga al biomaterial mediante un enlace amida o ester. Este biomaterial es formado a partir de la reticulacion de uno o mas de los siguientes componentes precursores:
D-Y-C(0)-(CH2)n-S-(CH2)2-C0X-P, D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-(CH2)2-C0X-P, D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-U-P, D-Y-C(0)-(CH2)n-S-U-P, D-Y-C(0)-(CH2)n-P, D-Y-C(0)-(CH2)n-S-L-S-CH2-CH2-C0-X-P; D-Y-C(0)-(CH2)n-S-L-U-P; D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-L-S-CH2-CH2-C0-X-P; D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-L-S-U-P; D-Y-C(0)-(CH2)n-S-L-NH-CH2-CH2-C0-X-P; D-Y-C(0)-(CH2)n-S-L-NH-U-P, o Z-P,
donde D es una ramificacion farmaceuticamente activa o una ramificacion de enlace; Y es 0, NH o N; L es un enlazador lineal o ramificado; X es 0 o N; Z es una ramificacion farmaceuticamente activa o ramificacion de enlace en la cual se ha incorporado una amina o un tiol nucleofilos; P es un polimero soluble en agua o un polimero hinchable en agua teniendo uno o mas grupos insaturados conjugados; y U es el producto de la adicion de un nucleofilo a un grupo electrofilo que esta unido al polimero. La vida media del enlace ester o amida en la ramificacion farmaceuticamente activa o en la ramificacion de enlace es de entre una hora y un aro en una solucion acuosa a un pH de 7.4 y 37°C. N es 1, 2 o 3. En un decimo septimo aspecto, se describe un metodo de tratar o prevenir una enfermedad, un desorden, o una infeccion en un mamifero. Este metodo incluye (a) unir un compuesto farmaceuticamente activo o un compuesto de enlace a una molecula enlazadora, (b) remover cualesquiera grupos tiol o amina protectores en el enlazador, (c) acoplar un grupo tiol, amina o alqueno en el enlazador a un polimero soluble en agua o un polimero hinchable en agua teniendo dos o mas grupos insaturados conjugados mediante una reaccion de adicion conjugada, y (d) reticular los grupos insaturados no acoplados en el polimero en un sitio dentro de un mamifero. En una forma de realizacion de este aspecto, tambien se llevan a cabo uno o mas de los pasos (a) a
(c) en un sitio dentro de un mamifero. En un decimo octavo aspecto, se describe un metodo de tratar o prevenir una enfermedad, un desorden, o una infeccion en un mamifero administrando al mamifero un biomaterial que tiene una ramificacion farmaceuticamente activa. El biomaterial puede incluir un enlace ester o amida en la ramificacion farmaceuticamente activa. Este enlace tiene una vida media de entre una hora y un aro en una solucion acuosa a un pH de 7.4 y 37°C. De manera alternativa, el biomaterial puede incluir un enlace ester o amida en la ramificacion de enlace, que interactua de manera covalente o no covalente con un compuesto o una ramificacion farmaceuticamente activos. Este enlace ester o amida en la ramificacion de enlace tiene una vida media de entre una hora y un aro en una solucion acuosa a un pH de 7.4 y 37°C. En un decimo noveno aspecto, se describe un metodo para entregar un compuesto farmaceuticamente activo a una celula, un tejido, un organo, un sistema de organos, o el cuerpo de un mamifero. Este metodo incluye poner en contacto la celula, el tejido, el organo, el sistema de organos o el cuerpo con un biomaterial que tiene un enlace ester o amida en una ramificacion farmaceuticamente activa. El enlace tiene una vida media de entre una hora y un aro en una solucion acuosa a un pH de 7.4 y 37°C, y el corte del enlace da como resultado la liberacion de un compuesto farmaceuticamente activo teniendo la ramificacion farmaceuticamente activa. Un aspecto relacionado incluye un metodo que implica poner en contacto la celula, el tejido, el organo, el sistema de organos o el cuerpo con un biomaterial que tiene un enlace ester o amida en una ramificacion de enlace, que interactua de manera covalente o no covalente con un compuesto o una ramificacion farmaceuticamente activos. El enlace tiene una vida media de entre una hora y un aro en una solucion acuosa a un pH de 7.4 y 37°C, y el corte del enlace da como resultado la liberacion de la ramificacion de enlace. La liberacion de la ramificacion de enlace tambien da como resultado la liberacion del compuesto o la ramificacion farmaceuticamente activos que esta asociado con la ramificacion de enlace del biomaterial. En un vigesimo aspecto, se describe un metodo para entregar un compuesto farmaceuticamente activo a una celula, un tejido, un organo, un sistema de organos, o el cuerpo de un mamifero. Este metodo incluye administrar al mamifero un biomaterial que tiene una ramificacion farmaceuticamente activa. El biomaterial es
formado de la reticulacion de un componente precursor en presencia de un compuesto de objetivacion teniendo dos o mas grupos nucleofilos. El componente precursor incluye una ramificacion farmaceuticamente activa acoplada a un polimero teniendo dos o mas grupos insaturados conjugados, y el compuesto de objetivacion provee objetivar una celula, un tejido, un organo, un sistema de organos, o sitio dentro del mamifero. Un compuesto farmaceuticamente activo que tiene la ramificacion farmaceuticamente activa es liberado del biomaterial en o cerca de la celula, el tejido, el organo, el sistema de organos, o el cuerpo del mamifero. En una forma de realizacion deseable de este aspecto, el biomaterial tiene un enlace ester o amida en la ramificacion farmaceuticamente activa, y el enlace tiene una vida media de entre una hora y un aro en una solucion acuosa a un pH de 7.4 y 37°C. En un aspecto relacionado, se describe un metodo que incluye administrar al mamifero un biomaterial que tiene una ramificacion de enlace. El biomaterial es formado a partir de la reticulacion de un componente precursor en presencia de un compuesto de objetivacion teniendo dos o mas grupos nucleofilos. El componente precursor incluye una ramificacion de enlace acoplada a un polimero que tiene dos o mas grupos insaturados conjugados, y el compuesto de objetivacion que provee objetivacion a una celula, un tejido, un organo, un sistema de organos, o sitio dentro del mamifero. La ramificacion de enlace liga de manera covalente o no covalente un compuesto o una ramificacion farmaceuticamente activos. La ramificacion de enlace y el compuesto o la ramificacion farmaceuticamente activos asociado con la ramificacion de enlace son liberados del biomaterial en o cerca de la celula, el tejido, el organo, el sistema de organos, o el cuerpo del mamifero. En una forma de realizacion deseable de este aspecto, el biomaterial tiene un enlace ester o amida en la ramificacion de enlace, y el enlace tiene una vida media de entre una hora y un aro en una solucion acuosa a un pH de 7.4 y 37°C. En un vigesimo primer aspecto, la invencion provee un metodo de prevenir adhesiones, trombosis, o restenosis, en un mamifero. Este metodo incluye poner en contacto un sitio en el mamifero con un componente precursor y reticular el componente precursor en el sitio. El componente precursor tiene la formula:
D-Y-C(0)-(CH2)n-S-(CH2)2-C0X-P,
D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-(CH2)2-C0X-P,
D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-U-P,
D-Y-C(0)-(CH2)n-S-U-P,
D-Y-C(0)-(CH2)n-P,
D-Y-C(0)-(CH2)n-S-L-S-CH2-CH2-C0-X-P;
D-Y-C(0)-(CH2)n-S-L-U-P;
D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-L-S-CH2-CH2-C0-X-P;
D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-L-S-U-P;
D-Y-C(0)-(CH2)n-S-L-NH-CH2-CH2-C0-X-P;
D-Y-C(0)-(CH2)n-S-L-NH-U-P;
D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-L-NH-CH2-CH2-C0-X-P, o
D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-L-NH-U-P,
donde D es una ramificacion farmaceuticamente activa o una ramificacion de enlace; Y es 0, NH o N; L es un enlazador lineal o ramificado; X es 0 o N; P es un polimero soluble en agua o un polimero hinchable en agua teniendo uno o mas grupos insaturados conjugados; y U es el producto de la adicion de un nucleofilo a un grupo electrofilo que esta unido al polimero. La vida media del enlace ester o amida en la ramificacion farmaceuticamente activa o en la ramificacion de enlace es de entre una hora y un aro en una solucion acuosa a un pH de 7.4 y 37°C. N es 1, 2 o 3. En un vigesimo segundo aspecto, la invencion provee un metodo de prevenir adhesiones, trombosis o restenosis en un mamifero. Este metodo incluye poner en contacto un sitio dentro del mamifero con un biomaterial que tiene un enlace ester o amida en una ramificacion farmaceuticamente activa. El enlace tiene una vida media de entre una hora y un aro en una solucion acuosa a un pH de 7.4 y 37°C, y el corte del enlace da como resultado la liberacion de un compuesto farmaceuticamente activo teniendo la ramificacion farmaceuticamente activa. En un aspecto relacionado, la invencion provee un metodo que incluye poner en contacto un sitio dentro del mamifero con un biomaterial que tiene un enlace ester o amida en una ramificacion de enlace. El enlace tiene una vida media de entre una hora y un aro en una solucion acuosa a un pH de 7.4 y 37°C, y el corte del enlace da como resultado la liberacion de la ramificacion de enlace (o un compuesto derivado de la ramificacion de enlace). La ramificacion de enlace puede ligar de manera covalente o no covalente un compuesto o una ramificacion farmaceuticamente activos. De esta manera, la liberacion de la ramificacion de enlace del biomaterial tambien da como resultado la liberacion del compuesto o la ramificacion farmaceuticamente activos. En una forma de realizacion deseable de los aspectos decimo quinto a vigesimo segundo, el compuesto, el componente precursor o el biomaterial es administrado por via oral, intravenosa, intramuscular, sub-cutanea, parental, o cualquiera otra ruta suficiente para proveer una dosis adecuada para la prevencion o el tratamiento de una enfermedad, un desorden, o una infeccion. En otra forma de realizacion deseable de estos aspectos, el enlace ester o amida en la ramificacion farmaceuticamente activa o en la ramificacion de enlace tiene una vida media de entre un dia y nueve meses en una solucion acuosa a un pH de 7.4 y 37°C. Con mayor preferencia, la vida media es de entre dos dias y seis meses, y con la mayor preferencia es de entre cuatro dias y tres semanas en una solucion acuosa a un pH de 7.4 y 37°C. Una enfermedad que puede ser tratada o prevenida usando los metodos de estos aspectos es cancer. De preferencia, el mamifero es un ser humano. El enlazador de estos aspectos puede tener las mismas formas de realizacion listadas para el enlazador de los aspectos
cuarto a sexto. La ramificacion farmaceuticamente activa o los grupos insaturados conjugados de estos aspectos pueden tener formas de realizacion preferentes correspondientes listadas para cualquiera de los aspectos previos. Los nuevos aspectos antes mencionados de la invencion y en los siguientes aspectos que se describan, pueden incluir reacciones de adicion conjugada auto-selectivas entre un nucleofilo fuerte y un grupo insaturado conjugado para reticulacion de los componentes precursores para formar un biomaterial, como se describio en la solicitud de patente US 09/ 496,231. Los metodos que alli se describen son adecuados para enlaces cruzados de los componentes precursores de la invencion a la forma de biomateriales de la invencion. Por ejemplo, los novedosos componentes precursores de la presente invencion, que tienen una ramificacion farmaceuticamente activa o ramificacion de enlace ligada covalentemente, pueden ser reticulados en presencia de un polimero que tiene dos o mas grupos nucleofilos para formar un copolimero en metodos que incluyen reacciones de adicion conjugada auto-selectivas. En adicion, los metodos de la presente invencion pueden utilizar una reaccion de adicion conjugada auto-selectiva para el acoplamiento de un grupo tiol o amina, enlazado a o incorporado en un compuesto farmaceuticamente activo o una ramificacion de enlace, a un grupo insaturado conjugado en un polimero para la produccion de compuestos novedosos. Se describen ahora los biomateriales polimericos que se han desarrollado previamente (solicitud de patente US 09/ 496,231; presentada el 1 de febrero de 2000), que son unicos en su uso de reacciones de adicion entre un nucleofilo fuerte y una insaturacion conjugada para polimerizar o reticular dos o mas componentes en una manera que puede lograrse en presencia de materiales biologicamente sensibles. U.S.S.N. 09/496,912 B1 ha sido concedida como US 7,744,912 B1, y corresponde a W0 00/44808 A1. Las aplicaciones del proceso incluyen la formacion de biomateriales en presencia de farmacos, incluyendo proteinas y ADN, formacion de biomateriales en presencia de celulas y agregados celulares, y tambien formacion de biomateriales in vivo ya sea dentro del cuerpo o o sobre la superficie del cuerpo. Es posible formar estos biomateriales en presencia de materiales biologicamente sensibles debido a la elevada auto-selectividad de las reacciones de adicion entre nucleofilos fuertes e insaturaciones conjugadas, que se emplean. El nucleofilo fuerte de interes particular en el metodo descrito en la presente es el tiol. En la formacion del biomaterial en la presencia de los materiales biologicos sensibles, se pueden mezclar juntos dos o mas componentes liquidos, y reaccionar para formar ya sea un solido elastico, un solido visco-elastico (como un gel solido tipico, por ejemplo, un gel como gelatina), un liquido visco-elastico (como un gel tipico que se puede inducir a fluir, por ejemplo, un gel como petrolato), un liquido visco-elastico que este formado de micro-particulas de gel (tal como un gel Carbopol), o hasta un liquido viscoso de una viscosidad considerablemente mas alta que cualquiera de los dos componentes precursores que se mezclen juntos. La conversion quimica de los precursores al material final es tan selectiva que esta se puede realizar en la presencia del material biologico sensible, incluyendo el caso cuando el material biologico es el cuerpo mismo. Se ha desarrollado un familia novedosa de polimeros sinteticos potencialmente muy bio-mimeticos. Estos polimeros pueden: (i) convertirse de precursores liquidos a biomateriales polimericos lineales o reticulados, ya sea en el laboratorio o in situ en un sitio de implantacion; (ii) ser hidrogeles o materiales mas sustancialmente que no se hinchen; (iii) presentar moleculas bio-activas que sirvan como sitios de adhesion, para proporcionar traccion para invasion celular; (iv) presentar moleculas bio-activas que sirvan como sitios de sustrato de proteasa, para hacer que el material se degrade en respuesta a las enzimas, tales como colagenasa o plasmina, que producen las celulas durante la migracion celular; (v) presentar sitios de enlace de factores de crecimiento, para hacer que el material interactue con los factores de crecimiento de una manera bio-mimetica, por medio de fijarlos y despues liberandolos segun la demanda celular; y (vi) permitir la aplicacion de farmacos de proteina mediante la hidrolisis o la degradacion enzimatica de los grupos contenidos adentro de la estructura base de los polimeros que forman el gel. De conformidad con lo anterior, en un vigesimo tercer aspecto se describe un metodo para hacer un biomaterial, que envuelve combinar dos o mas componentes precursores del biomaterial bajo condiciones que permitan la polimerizacion de los dos componentes, en donde la polimerizacion ocurre a traves de la reaccion auto-selectiva entre un nucleofilo fuerte y un enlace conjugado insaturado, o un grupo conjugado insaturado, mediante adicion nucleofila, tal y como se describe en W0 00/44808. La funcionalidad de cada componente es de cuando menos dos, y el biomaterial no comprende albumina no procesada. En adicion, el enlace o grupo conjugado insaturado no es una maleimida ni una vinil sulfona. En una modalidad del vigesimo tercer aspecto descrito aqui, los componentes se seleccionan a partir del grupo que consiste de oligomeros, polimeros, proteinas o peptidos bio-sinteticos, peptidos o proteinas naturalmente ocurrentes, peptidos o proteinas procesados naturalmente ocurrentes, y polisacaridos. El polimero puede ser poli(etilenglicol), oxido de poli(etileno), alcohol poli(vinilico), alcohol poli(etilen-co-vinilico), acido poli(acrilico), acido poli(etilen-co-acrilico), poli(etil-oxazolina), poli(vinilpirrolidona), poli(etilen-co-vinilpirro-lidona), acido poli(maleico), acido poli(etilen-co-maleico), poli(acrilamida), o copolimeros de bloque de oxido de poli(etileno)oxido de co-poli(propileno). El peptido puede comprender un sitio de adhesion, un sitio de enlace de factores de crecimiento, o un sitio de enlace de proteasa. En otra modalidad, los componentes se funcionalizan para que comprendan un nucleofilo fuerte o un grupo conjugado insaturado, o un enlace conjugado insaturado. De preferencia el nucleofilo fuerte es un tiol, o un grupo que contenga un tiol. De preferencia el grupo conjugado insaturado es un acrilato, una acrilamida, una quinona, o un vinilpiridinio, por ejemplo, 2- o 4-vinilpiridinio. En otra modalidad, un componente tiene una funcionalidad de cuando menos tres. En todavia otras modalidades del vigesimo tercer aspecto, el metodo tambien comprende combinar los
componentes precursores con una molecula que comprenda un sitio de adhesion, un sitio de enlace de factores de crecimiento, o un sitio de enlace de heparina, un sitio de enlace de ion de metal, o sitio de enlace de carbohidratos (v.gr., un grupo acido boronico) y tambien comprende ya sea un nucleofilo fuerte o un enlace conjugado insaturado, o un grupo conjugado insaturado. De preferencia el nucleofilo fuerte es un tiol, o el enlace conjugado insaturado o el grupo conjugado insaturado es un acrilato, una acrilamida, una quinona, o un vinilpiridinio. En todavia otras modalidades del vigesimo tercer aspecto, el biomaterial es un hidrogel. El biomaterial tambien puede ser degradable. El biomaterial se puede hacer en la presencia de moleculas biologicas sensibles, o en la presencia de celulas o tejidos. El biomaterial tambien se puede hacer adentro o sobre el cuerpo de un animal. En todavia otras modalidades del vigesimo tercer aspecto, el metodo comprende ademas combinar los componentes precursores con un acelerador, antes de la polimerizacion. El metodo tambien puede comprender mezclar los componentes precursores con un componente que comprenda cuando menos un enlace conjugado insaturado o grupo conjugado insaturado, y cuando menos un grupo reactivo de amina. Tambien se puede aplicar un componente adicional al sitio de polimerizacion de la superficie de la celula o el tejido, el componente adicional comprendiendo cuando menos un enlace conjugado insaturado o grupo conjugado insaturado, y cuando menos un grupo reactivo amina. En un vigesimo cuarto aspecto, se describe un biomaterial formado mediante la combinacion de dos o mas componentes precursores de un biomaterial, bajo condiciones que permitan la polimerizacion de los dos componentes, donde la polimerizacion ocurre a traves de la reaccion auto-selectiva entre un nucleofilo fuerte y un enlace conjugado insaturado, o un grupo conjugado insaturado, mediante adicion nucleofila tal y como se describe en W0 00/44808 A1. La funcionalidad de cada componente es de cuando menos dos, y el biomaterial no comprende albumina no procesada, y el enlace conjugado insaturado o grupo conjugado insaturado no es una maleimida ni una vinil sulfona. En una modalidad del vigesimo cuarto aspecto, los componentes se seleccionan a partir del grupo que consiste de oligomeros, polimeros, proteinas o peptidos bio-sinteticos, peptidos o proteinas naturalmente ocurrentes, peptidos o proteinas procesados naturalmente ocurrentes, y polisacaridos. El polimero puede ser poli(etilenglicol), oxido de poli(etileno), alcohol poli(vinilico), alcohol poli(etilen-co-vinilico), acido poli(acrilico), acido poli(etilen-co-acrilico), poli(etil-oxazolina), poli(vinilpirrolidona), poli(etilen-co-vinilpirro-lidona), acido poli(maleico), acido poli(etilen-co-maleico), poli(acrilamida), o copolimeros de bloque de oxido de poli(etileno)oxido de co-poli(propileno). El peptido puede comprender un sitio de adhesion, un sitio de enlace de factores de crecimiento, o un sitio de enlace de proteasa. En otra modalidad del vigesimo cuarto aspecto, los componentes se funcionalizan para que comprendan un nucleofilo fuerte o un grupo conjugado insaturado, o un enlace conjugado insaturado. De preferencia el nucleofilo fuerte es un tiol, o un grupo que contenga un tiol. De preferencia el grupo conjugado insaturado es un acrilato, una acrilamida, una quinona, o un vinilpiridinio, por ejemplo, 2-o 4-vinilpiridinio. En otra modalidad, un componente tiene una funcionalidad de cuando menos tres. En todavia otras modalidades del vigesimo cuarto aspecto, el metodo tambien comprende combinar los componentes precursores con una molecula que comprenda un sitio de adhesion, un sitio de enlace de factores de crecimiento, un sitio de enlace de heparina, un sitio de enlace de ion de metal, o sitio de enlace de carbohidratos (v.gr., un grupo acido boronico) y tambien comprende ya sea un nucleofilo fuerte o un enlace conjugado insaturado, o un grupo conjugado insaturado. De preferencia el nucleofilo fuerte es un tiol, o el enlace conjugado insaturado o el grupo conjugado insaturado es un acrilato, una acrilamida, una quinona, o un vinilpiridinio. En todavia otras modalidades del vigesimo cuarto aspecto, el biomaterial es un hidrogel. El biomaterial tambien puede ser degradable. El biomaterial se puede hacer en la presencia de moleculas biologicas sensibles, o en la presencia de celulas o tejidos. El biomaterial tambien se puede hacer dentro o sobre el cuerpo de un animal. En todavia otras modalidades del vigesimo cuarto aspecto, el metodo comprende ademas combinar los componentes precursores con un acelerador, antes de la polimerizacion. El metodo tambien puede comprender mezclar los componentes precursores con un componente que comprenda cuando menos un enlace conjugado insaturado o grupo conjugado insaturado, y cuando menos un grupo reactivo amina. Tambien se puede aplicar un componente adicional al sitio de polimerizacion de la superficie de la celula o el tejido, el componente adicional comprendiendo cuando menos un enlace conjugado insaturado o grupo conjugado insaturado, y cuando menos un grupo reactivo amina. En un vigesimo quinto aspecto, se describe un metodo para aplicar una sustancia terapeutica a una celula, tejido, organo, sistema organico, o cuerpo de un animal, el metodo envolviendo poner en contacto a la celula, tejido, organo, sistema organico o cuerpo con el biomaterial del vigesimo cuarto aspecto de la invencion, donde el biomaterial contiene una sustancia terapeutica, por medio de la cual se aplica la sustancia terapeutica a la celula, tejido, organo, sistema organico, o cuerpo de un animal. En una modalidad, la sustancia terapeutica se selecciona a partir del grupo que consiste de proteinas, moleculas organicas naturalmente ocurrentes o sinteticas, moleculas de acido nucleico, por ejemplo ADN o ARN, y una particula viral. En otra modalidad, la sustancia terapeutica es un pro-farmaco. En todavia otra modalidad, la molecula de acido nucleico es una molecula de acido nucleico anti-sentido. En un vigesimo sexto aspecto, se describe un metodo para regenerar un tejido, que envuelve introducir un andamio a un sitio, bajo condiciones que permitan el crecimiento interno de las celulas. El andamio puede comprender el biomaterial del vigesimo cuarto aspecto. En las modalidades del vigesimo sexto aspecto, el andamio se ha sembrado previamente con celulas. El tejido
se puede seleccionar a partir del grupo que consiste de hueso, piel, nervio, vaso sanguineo, y cartilago. En un vigesimo septimo aspecto, se describe un metodo para evitar adhesiones, trombosis, o restenosis, que implica poner en contacto un sitio con los componentes precursores del biomaterial del vigesimo cuarto aspecto de la invencion; y polimerizar los componentes en el sitio. En un vigesimo octavo aspecto, se describe un metodo para sellar un flujo de fluido o gas, el metodo comprendiendo los pasos de poner en contacto un sitio dentro del cuerpo de un animal, con los componentes precursores del biomaterial del vigesimo cuarto aspecto de la invencion, que pueden comprender ademas un componente que incluya cuando menos un enlace conjugado insaturado o grupo conjugado insaturado, y cuando menos un grupo reactivo amina; y polimerizar los componentes en el sitio. En las modalidades preferidas del vigesimo octavo aspecto de la invencion, el sitio es un pulmon, vaso sanguineo, piel, la barrera de la dura, o el intestino. En un vigesimo noveno aspecto, la invencion se describe un metodo para encapsular una celula o tejido, que implica combinar los componentes precursores de un biomaterial con una celula o tejido; y polimerizar los componentes, donde la polimerizacion ocurre a traves de la reaccion auto-seleccionada entre un nucleofilo fuerte y un enlace conjugado insaturado, o un grupo conjugado insaturado, y donde el biomaterial polimerizado encapsula a la celula o el tejido. En un trigesimo aspecto, la invencion se describe un metodo para hacer un biomaterial, que implica combinar dos o mas componentes precursores del biomaterial, bajo condiciones que permitan la polimerizacion de los dos componentes, donde la polimerizacion ocurre a traves de la reaccion auto-selectiva entre una amina y un enlace conjugado insaturado, o un grupo conjugado insaturado, mediante adicion nucleofila, donde la funcionalidad de cada componente es de cuando menos dos, y donde el biomaterial no comprende albumina no procesada, y el enlace o grupo conjugado insaturado no es una maleimida ni una vinil sulfona. En un trigesimo primer aspecto, se describe un biomaterial formado mediante la combinacion de dos o mas componentes precursores del biomaterial, bajo condiciones que permitan la polimerizacion de los dos componentes, donde la polimerizacion ocurre mediante la reaccion auto-selectiva entre una amina y un enlace conjugado insaturado o un grupo conjugado insaturado, mediante adicion nucleofila, donde la funcionalidad de cada componente es de cuando menos dos, y donde el biomaterial no comprende albumina no procesada, y el enlace o grupo insaturado no es una maleimida ni una vinil sulfona. En formas de realizacion de diversos aspectos de la invencion o descritos aquri respectivamente, el polimero es un octa-acrilato de PEG, tetra-acrilato de PEG, triacrilato de PEG, diacrilato de PEG, o monoacrilato de PEG. En otros aspectos, el polimero es octa-acrilamida de PEG, tetra-acrilamida de PEG, triacrilamida de PEG, o monoacrilamida de PEG. En todavia otros aspectos, el polimero contiene sitios acrilato mixtos y sitios acrilamida mixtos. En todavia otras formas descritos de realizacion, n es 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En diversas otras formas de realizacion de cualquiera de los aspectos anteriores descritos aqui, el biomaterial contiene una ramificacion de enlace enlazada covalente o no covalentemente, tal como un anti-cuerpo, una proteina, un acido nucleico, o una ramificacion organica que liga un compuesto farmaceuticamente activo. En todavia otras formas de realizacion, el biomaterial contiene una ciclodextrina que liga un compuesto farmaceuticamente activo hidrofobo. En otras formas de realizacion, la ramificacion de enlace es heparina, una ramificacion de enlace de heparina, una ramificacion de enlace de ion de metal, una ramificacion de carbohidrato, una ramificacion de enlace de carbohidratos, o una ramificacion que liga grupos hidrofobos. Ejemplos de las fracciones de enlace de ion de metal incluyen fracciones de enlace Cu+2, fracciones de enlace Co+2, y fracciones de enlace Zn+2. Fracciones de enlace de carbohidratos preferentes son acidos fenilboronicos. En otra forma de realizacion, el acido fenilboronico es enlazado al biomaterial mediante una amina secundaria en el anillo de fenilo del acido fenilboronico. En formas de realizacion preferentes, una ramificacion o un compuesto farmaceuticamente activos esta ligado directa o indirectamente a la ramificacion de enlace en el biomaterial. Ejemplos de fracciones o compuestos farmaceuticamente activos que pueden estar ligados directa
o indirectamente a la ramificacion de enlace incluyen moleculas organicas sinteticas, moleculas organicas que ocurren naturalmente, moleculas de acido nucleico, proteinas o peptidos bio-sinteticos, peptidos o proteinas que ocurren naturalmente, y peptidos o proteinas que ocurren naturalmente, modificados. Ejemplos de tales moleculas organicas incluyen paclitaxel, doxorrubicina, camptotecina, 5-fluorodesoxiuridina, estradiol, 2metoxiestradiol, y sus derivados. En otras formas de realizacion, un sitio de enlace de metal es incorporado en un compuesto farmaceuticamente activo tal como una proteina para promover la interaccion del compuesto farmaceuticamente activo con un metal ligado por una ramificacion de enlace en un biomaterial. Por ejemplo, uno o mas residuos histidina pueden ser aradidos a una proteina farmaceuticamente activa para incrementar su afinidad por los metales y de esta manera incrementar su afinidad por un biomaterial. En diversas formas de realizacion de cualquiera de los aspectos anteriores, una ramificacion farmaceuticamente activa puede ser ligada directamente al biomaterial mediante un enlace ester o amida o ligada indirectamente al biomaterial mediante una interaccion covalente o no covalente con una ramificacion de enlace que esta ligada al biomaterial mediante un enlace ester o amida. Una ramificacion o un compuesto farmaceuticamente activos pueden ligar directamente la ramificacion de enlace o pueden ligar indirectamente la ramificacion de enlace interactuando con una molecula (tal como un ion de metal o heparina) que se liga directamente a la ramificacion de enlace. En otras formas de realizacion de cualquiera de los aspectos anteriores aqui descritos, el biomaterial encapsula un compuesto farmaceuticamente activo. El compuesto farmaceuticamente activo puede ser atrapado en el biomaterial por la formacion del biomaterial en presencia de un compuesto farmaceuticamente activo. En materiales reticulados, la red polimerica forma una barrera fisica a la difusion de farmacos macro-moleculares
tales como peptidos, proteinas, oligonucleotidos, ARN y ADN. El tamaro de la red puede ser ajustado por el disero de los componentes de la red. Por ejemplo, materiales reticulados formados con concentraciones de masa de triacrilato de PEG pueden formar redes mas permeables que las formadas con una igual concentracion de masa del octa-acrilato de PEG bajo condiciones equivalentes. De esta manera, la permeabilidad de un farmaco macro-molecular puede ser modulada mediente el disero de la red de biomaterial para obtener liberacion controlada del farmaco. En la presente invencion, se utilizan las siguientes definiciones. Las definiciones son las mismas que las utilizadas en W0 00/44808. Con "biomateriales" se quiere decir material que se reserva para contacto con el cuerpo, ya sea sobre la superficie de este, o implantado adentro de este. De preferencia, el biomaterial se forma mediante una reaccion por adicion conjugada entre un nucleofilo fuerte y una insaturacion conjugada. Como se usan en la presente, las palabras "polimerizacion" y "reticulacion" se usan para indicar un enlace de multiples moleculas de componentes precursores, para dar como resultado un incremento sustancial en el peso molecular. "Reticulacion" tambien indica ramificacion, tipicamente para producir una red polimerica. Con "auto-selectiva" se quiere decir que un primer componente precursor de la reaccion reacciona mucho mas rapido con un segundo componente precursor de la reaccion que con otros compuestos presentes en la mezcla en el sitio de la reaccion, y el segundo componente precursor reacciona mucho mas rapido con el primer componente precursor que con otros compuestos presentes en la mezcla en el sitio de la reaccion. La mezcla puede contener otros materiales biologicos, por ejemplo, farmacos, peptidos, proteinas, ADN, celulas, agregados celulares, y tejidos. Como se usa en la presente, un nucleofilo fuerte se liga de preferencia a una insaturacion conjugada, en lugar de a otros compuestos biologicos, y un grupo conjugado insaturado se liga de preferencia a un nucleofilo fuerte, en lugar de a otros compuestos biologicos. Cuando se desea el grado mas elevado de auto-selectividad en los metodos utiles de la invencion, el nucleofilo selecto es un tiol. Cuando no se requiere el nivel mas elevado de selectividad estos metodos, se puede usar una amina como el nucleofilo fuerte. Se pueden alterar las condiciones que se utilizan para completar la reaccion auto-selectiva, para incrementar el grado de auto-selectividad, como se proporciona en la presente. Por ejemplo, si se usa una amina como el nucleofilo fuerte en la formacion de un biomaterial, mediante la seleccion de una amina con un pK bajo, y la solucion precursora final que se va a polimerizar se formula de tal manera que el pH esta cerca del pK, se favorece la reaccion de la insaturacion con la amina que se proporciona, y de esta manera se consigue la auto-selectividad. Con "nucleofilo fuerte" se quiere decir una molecula que es capaz de donar un par de electrones a un electrofilo en una reaccion de formacion de enlace polar. De preferencia el nucleofilo fuerte es mas nucleofilo que el H20 al pH fisiologico. Los ejemplos de nucleofilos fuertes son tioles y aminas. El nucleofilo fuerte preferido para usarse en la presente invencion es un tiol, puesto que este exhibe alta autoselectividad. En las proteinas que se encuentran afuera de las celulas estan presentes muy pocos tioles estericamente accesibles. Las aminas tambien pueden ser utiles y auto-selectivas, especialmente cuando la reaccion de formacion de biomaterial se conduce en la presencia de moleculas biologicas sensibles que no llevan aminas, por ejemplo, muchos farmacos. Con "enlace conjugado insaturado" se quiere decir la alternacion de enlaces multiples de carbono-carbono, carbono-heteroatomo, o heteroatomo-heteroatomo con enlaces individuales, o la enlace de un grupo funcional a una macromolecula, tal como un polimero sintetico o una proteina. Esos enlaces pueden experimentar las reacciones por adicion. Con "grupo conjugado insaturado" se quiere decir una molecula o una region de una molecula, que contiene una alternacion de enlaces multiples de carbono-carbono, carbono-heteroatomo, o heteroatomo-heteroatomo con enlaces individuales, que tienen un enlace multiple que puede experimentar las reacciones por adicion. Los ejemplos de grupos conjugados insaturados incluyen, pero no estan limitados a acrilamidas, quinonas, y vinilpiridinios, por ejemplo, 2- o 4-vinilpiridinio. Con "peptido sustancialmente puro", "polipeptido sustancialmente puro", o "proteina sustancialmente pura", se quiere decir un polipeptido que se ha separado de los componentes que naturalmente acomparan a este. Como se usan en la presente, los terminos peptido, polipeptido, y proteina se usan de manera intercambiable. Tipicamente, el polipeptido es sustancialmente puro cuando este esta cuando menos el 60 por ciento, en peso, libre de las proteinas y las moleculas organicas naturalmente ocurrentes con las cuales este esta naturalmente asociado. De preferencia, el polipeptido es cuando menos 75 por ciento, de mas preferencia cuando menos 90 por ciento, y de mayor preferencia cuando menos 99 por ciento, en peso, puro. Se puede obtener un polipeptido de interes sustancialmente puro, por ejemplo, mediante la extraccion de una fuente natural (por ejemplo, una celula, agregado celular, o tejido), mediante la expresion de un acido nucleico recombinante que codifique el polipeptido deseado, o mediante la sintesis quimica de la proteina. Se pueden hacer ensayos sobre la pureza mediante cualquier metodo apropiado, por ejemplo, mediante cromatografia de columna, electroforesis de gel de poliacrilamida, electroforesis de gel de agarosa, densidad optica, o analisis HPLC. Una proteina esta sustancialmente libre de componentes naturalmente asociados cuando esta se separa de esos contaminantes que la acomparan en su estado natural. De esta manera, una proteina que se sintetiza o produce quimicamente en un sistema celular diferente de la celula a partir de la cual se origina esta naturalmente, estara sustancialmente libre de sus componentes naturalmente asociados. De conformidad con lo anterior, los polipeptidos sustancialmente puros incluyen aquellos derivados a partir de organismos eucarioticos, pero sintetizados en E. coli u otros procariotes. Con "acido nucleico purificado" se quiere decir una molecula de acido nucleico que este libre de los genes que,
en el genoma naturalmente ocurrente del organismo a partir del cual se derivo el acido nucleico de la invencion, flanquean el gen. El termino incluye por lo tanto, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora dentro de un vector; dentro de un plasmido o virus autonomamente duplicador; o dentro del ADN genomico de un procariote o eucariote; o que existe como una molecula separada (por ejemplo, un ADNc o un genomico o un fragmento de ADNc producido mediante PCR o digestion de endonucleasa de restriccion) independiente de otras secuencias. Este tambien incluye ADN recombinante que es parte de un gen hibrido que codifica la secuencia de polipeptidos adicional. Con "funcionalizar" se quiere decir modificar de una manera que de como resultado la union de un grupo o ramificacion funcional. Por ejemplo, una molecula se puede funcionalizar mediante la introduccion de una molecula que haga a la molecula un nucleofilo fuerte o una insaturacion conjugada. De preferencia una molecula, por ejemplo PEG, se funcionaliza para convertirse en un tiol, amina, acrilato, o quinona. Las proteinas en particular tambien se pueden funcionalizar de manera efectiva mediante la reduccion parcial o completa de enlaces bisulfuro, para crear tioles libres.Con Afuncionalidad@ se quiere decir el numero de sitios reactivos en una molecula. Como se usa en la presente, la funcionalidad de un nucleofilo fuerte y una insaturacion conjugada sera cada una de cuando menos dos. La mezcla de dos componentes, por ejemplo, un nucleofilo fuerte y una insaturacion conjugada, con funcionalidades de dos cada uno, dara como resultado un biomaterial polimerico lineal, y la mezcla de dos componentes con funcionalidades de cuando menos dos cada uno, uno de los componentes teniendo una funcionalidad de mas de dos, dara como resultado un biomaterial reticulado. Con "sitio de adhesion" se quiere decir una secuencia de peptidos a la cual se fija una molecula, por ejemplo, un receptor promotor de adhesion en la superficie de una celula. Los ejemplos de sitios de adhesion incluyen, pero no estan limitados a, la secuencia RGD de la fibronectina, y la secuencia YIGSR de la laminina. De preferencia los sitios de adhesion estan incorporados dentro del biomaterial de la presente invencion. Con "sitio de enlace de factores de crecimiento" se quiere decir una secuencia de peptidos a la cual se liga un factor de crecimiento, o una(s) molecula(s) que enlaza(n) un factor de crecimiento. Por ejemplo, el sitio de enlace de factores de crecimiento puede incluir un sitio de enlace de heparina. El sitio fijara la heparina, que a su vez fijara los factores de crecimiento de enlace a la heparina, por ejemplo, bFGF, VEGF, BMP, o TGF�. Con "sitio de enlace de proteasa" se quiere decir una secuencia de peptidos que es un sustrato para una enzima. Con "acido nucleico anti-sentido" se quiere decir una secuencia de acidos nucleicos, sin importar la longitud, que es complementaria al gen de cadena de codificacion que codifica una proteina de interes. De preferencia, el acido nucleico anti-sentido es capaz de disminuir la actividad biologica de la proteina de interes cuando esta presente en una celula. De preferencia, la disminucion es de cuando menos el 10 por ciento, con relacion a un control, de mas preferencia el 25 por ciento, y de mayor preferencia el 100 por ciento. Con "actividad biologica" se quiere decir eventos funcionales mediados por una proteina de interes. En algunas modalidades, esta incluye eventos que se han ensayado mediante la medicion de las interacciones de un polipeptido con otro polipeptido. Esta tambien incluye hacer ensayos sobre el efecto que tiene la proteina de interes en el crecimiento, la diferenciacion, la muerte, la migracion, la adhesion, las interacciones con otras proteinas, la actividad enzimatica, la fosforilacion o desfosforilacion de proteinas, la transcripcion, o la traslacion de las celulas. Con "molecula biologica sensible" se quiere decir una molecula que se encuentra en una celula, o en un cuerpo, o que se puede usar como un producto terapeutico para una celula o un cuerpo, que puede reaccionar con otras moleculas en su presencia. Los ejemplos de moleculas biologicas sensibles incluyen, pero no estan limitados a, peptidos, proteinas, acidos nucleicos, y farmacos. En la presente invencion los biomateriales se pueden hacer en la presencia de materiales biologicos sensibles, sin afectar adversamente los materiales biologicos sensibles. Como se usa en la presente, con "regenerar" se quiere decir volver a crecer una porcion, o todo un tejido. Por ejemplo, aqui se describen metodos para regenerar el hueso despues de trauma, remocion de tumor, o fusion espinal, o para regenerar la piel para ayudar a la curacion de ulceras diabeticas del pie, llagas de presion, e insuficiencia venosa. 0tros tejidos que se pueden regenerar incluyen, pero no estan limitados a nervios, vasos sanguineos, y tejido de cartilago. Con "trasplante celular" se quiere decir trasplantar una celula, agregado celular, o tejido dentro de un sujeto. El biomaterial de la presente invencion se puede usar para aislar celulas, agregados celulares, o tejidos trasplantados en el sujeto, del sistema de defensa del sujeto, mientras que se permite el transporte selectivo de las moleculas requeridas para la funcion celular normal. Aunado a las definiciones antes menciondas, se utilizan las especificamente las siguientes en la presnete invencion. Con "ramificacion farmaceuticamente activa" se quiere decir una especie que difiere de un compuesto terapeuticamente activo en que no contiene un grupo reactivo, tal como un grupo alcohol o amina, que esta presente en el compuesto. La ramificacion farmaceuticamente activa puede er denotada por D, y el compuesto terapeuticamente activo es designado D-0H, D-NH2, o D-NH. En adicion a denotar una ramificacion farmaceuticamente activa ligada a un biomaterial mediante un enlace ester o amida, el simbolo "D" puede ser usado para denotar una ramificacion de enlace enlazada a un biomaterial mediante un enlace ester o amida. Por "ramificacion de enlace" se quiere decir un compuesto que liga directa o indirectamente una ramificacion o un compuesto farmaceuticamente activos. Por ejemplo, la ramificacion de enlace puede ligar directamente una ramificacion o un compuesto farmaceuticamente activos
por enlace a una molecula tal como un ion de metal o heparina que entonces liga la ramificacion o el compuesto farmaceuticamente activos. La ramificacion o el compuesto farmaceuticamente activos que esta asociado con la ramificacion de enlace no requiere contener un grupo -0H, -NH2, o -NH debido a que la ramificacion o el compuesto farmaceuticamente activos esta acoplado al biomaterial mediante su interaccion con la ramificacion de enlace. En este caso, un grupo -0H, -NH2, o -NH en la ramificacion o el compuesto farmaceuticamente activos no tiene que participar en un enlace ester o amida en el biomaterial. Por Acompuesto de enlace@ se quiere decir un compuesto que incluye una ramificacion de enlace. Con "polimero soluble en agua" se quiere decir un compuesto formado a partir de la reticulacion de dos o mas monomeros, con lo cual el compuesto es capaz de ser disuelto en agua. Con "polimero hinchable en agua" se quiere decir un compuesto formado a partir de la reticulacion de dos o mas monomeros, con lo cual el compuesto no se disuelve en agua. La interaccion entre el agua y el polimero ocasiona que el polimero incremente su volumen. Con "copolimero" se quiere decir un polimero que es formado a partir de dos o mas monomeros, donde al menos dos de los monomeros tendran una formula o estructura quimica diferente. Con "enlazador" se quiere decir un compuesto o una ramificacion dentro de un compuesto que es capaz de acoplar una ramificacion farmaceuticamente activa a un polimero mediante una serie de enlaces covalentes. El enlazador puede ya sea ligar un atomo que esta presente en la ramificacion farmaceuticamente activa o puede ligar un atomo que esta acoplado a la ramificacion farmaceuticamente activa mediante una serie de enlaces covalentes, i.e. el par de enlaces D y P. 0tro atomo en el enlazador puede reaccionar con un grupo insaturado conjugado que esta unido a un polimero. El enlazador puede incluir el grupo enlazador L. Con "tasa de liberacion" se quiere decir la tasa de produccion debida a la hidrolisis de un enlace en un biomaterial o un componente de un biomaterial. Si el enlace ester o amida en la ramificacion farmaceuticamente activa, denotada D, es hidrolizado, el compuesto farmaceuticamente activo original que fue usado en la formacion del compuesto o biomaterial es liberado. Si otro enlace, tal como un enlace dentro del enlazador o un enlace ester en el polimero, es hidrolizado, se libera una version modificada del compuesto farmaceuticamente activo original. El compuesto modificado puede ser representado como D-02C-Z, D-NH-C(0)-Z, o D-N-C(0)-Z, donde Z comprende la porcion del componente o biomaterial entre el enlace hidrolizado y el grupo D-02C, D-NH-C(0), o D-N-C(0). Con "compuesto farmaceuticamente activo derivado de D" se quiere decir un compuesto terapeuticamente activo que comprende la ramificacion farmaceuticamente activa D. El compuesto puede ser el mismo que el compuesto farmaceuticamente activo original; denotado D-0H, D-NH2, o D-NH, usado en la formacion del componente o biomaterial. De manera alternativa, el compuesto puede ser representado como D-02C-Z, DNH-C(0)-Z o D-N-C(0)-Z, como se describio antes; en este caso, el compuesto tiene el grupo -02C-Z en vez del grupo hidroxilo o el grupo NH-C(0)-Z o N-C(0)-Z en vez del grupo amina (NH2 o NH) que fue modificado durante la formacion del componente o biomaterial.Con Acompuesto farmaceuticamente activo o su derivado@ se quiere decir un compuesto terapeuticamente activo, denotado D-0H, D-NH2, o D-NH, o un derivado de este compuesto en el cual el grupo alcohol o amina es modificado tal que el derivado sea representado por D-02C-Z, D-NH-C(0)-Z o D-N-C(0)-Z, como se seralo antes. Con "acoplado a" se quiere decir reaccionado con o unido a, posiblemente mediante una serie de enlaces covalentes. Por ejemplo, "una ramificacion farmaceuticamente activa acoplada a un polimero" se quiere decir una ramificacion que esta presente en la misma molecula que el polimero y que esta enlazada a otro grupo, tal como un enlazador, que esta unido al polimero. Una ramificacion farmaceuticamente activa es considerada estar acoplada a solamente un grupo insaturado conjugado en un polimero. De esta manera, si una ramificacion farmaceuticamente activa o un grupo unido a la ramificacion farmaceuticamente activa es reaccionado con un grupo insaturado conjugado en un polimero, entonces la ramificacion se dice estar acoplada a ese grupo insaturado conjugado. El o los grupos insaturados conjugados remanentes unidos al polimero que no fueron reaccionados con el compuesto que tiene la ramificacion farmaceuticamente activa son referidos como "no acoplados a la ramificacion farmaceuticamente activa". Con "derivado" de una molecula organica se quiere decir un compuesto que tiene una porcion de la molecula organica y que tiene la misma actividad terapeutica que la molecula organica. El derivado puede tener uno o mas grupos funcionales que no estan presentes en la molecula organica farmaceuticamente activa. De manera adicional, el derivado puede no tener uno o mas grupos funcionales que estan presentes en la molecula organica farmaceuticamente activa. Con "ramificacion farmaceuticamente activa derivada de" se quiere decir una ramificacion en un compuesto farmaceuticamente activo que puede unirse a otro compuesto. Por ejemplo, un grupo reactivo -tal como un alcohol, una amina primaria o una amina secundaria-en un compuesto farmaceuticamente activo puede reaccionar con un compuesto que tiene un acido carboxilico, formando un producto que incluye la ramificacion farmaceuticamente activa. En este caso, la ramificacion no contiene un hidrogeno que esta presente en el compuesto farmaceuticamente activo, y el producto contiene un enlace ester o amida en la ramificacion farmaceuticamente activa. Con "reaccion de sustitucion nucleofila" se quiere decir una reaccion entre un nucleofilo y un electrofilo en la cual un enlace covalente es formado entre el nucleofilo y el electrofilo y un enlace es roto entre el electrofilo y un grupo que sale. De esta manera, un grupo que sale que habia estado ligado al electrofilo es reemplazado por el nucleofilo. Con "polimerizacion por radicales libres" se quiere decir la reticulacion de monomeros que es iniciada por un radical. El radical reacciona con un monomero, produciendo un radical que puede reaccionar con otro
monomero. Con "reaccion de adicion conjugada" se quiere decir una reaccion entre un nucleofilo y un grupo insaturado conjugado o enlace insaturado conjugado. Por ejemplo, un nucleofilo puede reaccionar con un aldehido o cetona Q,� insaturado, dando como resultado la formacion de un enlace covalente entre el nucleofilo y el carbono y un enlace entre un atomo de hidrogeno y el carbono Q. En esta reaccion, un enlace entre los carbonos Q y es tambien convertido de un enlace doble a uno sencillo. Ejemplos adicionales son listados en la seccion de la descripcion detallada. Por "en o cerca de un sitio dentro del cuerpo" quiere decir ubicado cerca de un sitio dentro del cuerpo, tal que el compuesto farmaceuticamente activo liberado este localizado en el area deseada. Con "material coloidal" se quiere decir un copolimero de dimensiones mayores de 5 nm y menor de 1 !m. Con "micro-esfera" se quiere decir un biomaterial que tiene una forma esferica con un diametro entre 1 y 1,000 !m. Con "nano-esfera" se quiere decir un biomaterial que tiene una forma esferica con un diametro de entre 1 y 1,000 nm. Con "base que es modificada para contener un tiol" se quiere decir una base que tiene un tiol o un grupo que tiene azufre. Por ejemplo, un derivado de 6-cloropurina puede er reaccionado con H2S para formar una adenosina que tiene un azufre en vez de un grupo amina. Con "peptidos o proteinas que ocurren naturalmente, modificados" se quiere decir peptidos o proteinas que ocurren naturalmente que han sido reaccionados con un grupo que tiene un tiol o una amina tal que el producto sea capaz de reaccionar con un grupo insaturado conjugado o enlace mediante una reaccion de adicion conjugada. Con "paso de purificacion" se quiere decir un paso que incrementa la pureza de un producto. El producto puede ser separado de algunos de los demas componentes de una mezcla tales como materiales iniciales, aceleradores, productos secundarios, y solventes. Los productos pueden ser purificados con base en sus caracteristicas -tales como tamaro, forma, carga, hidrofobicidad, solubilidad, o punto de ebullicion-usando tecnicas estandard. Con "agente de condensacion" se quiere decir un compuesto que acelera la reaccion entre un alcohol o amina y un acido carboxilico. El agente de condensacion reacciona con el acido carboxilico tal que el grupo hidroxilo del acido carboxilico sea convertido en un grupo que sale mejor para la reaccion de sustitucion nucleofila entre este acido carboxilico activado y el alcohol o amina. Los agentes de condensacion son bien conocidos en la materia de la sintesis organica. Con "tratar o prevenir una enfermedad, un desorden, o una infeccion" se quiere decir administrar a un mamifero un biomaterial, que tiene una ramificacion farmaceuticamente activa ligada de manera covalente. Tambien se describe la aplicacion de un componente precursor de un biomaterial, o un compuesto que tiene una union covalente de una fraccion farmaceuticamente activa. En una forma de realizacion deseable aqui descrita, los componentes precursores administrados reticulan dentro del cuerpo para formar un biomaterial. Un compuesto terapeuticamente activo es liberado del biomaterial debido a la hidrolisis de un enlace entre la ramificacion farmaceuticamente activa y el polimero, tal como el enlace ester o amida en la ramificacion farmaceuticamente activa. Este compuesto es capaz de reducir o retrasar la aparicion de sintomas o remover o prevenir la causa de una enfermedad, un desorden o una infeccion. No se pretende que la administracion este limitada a un modo particular de administracion, dosis, o frecuencia de dosificacion; el presente modo contempla todos los modos de administracion, incluyendo ruta oral, intravenosa, intramuscular, sub-cutanea, parenteral o cualquier otra ruta suficiente para proveer una dosis adecuada para impedir o tratar una enfermedad, un desorden o una infeccion. Uno o mas de los biomateriales, los componentes precursores, o los compuestos, puede administrarse a un mamifero en una sola dosis o dosis multiples, posiblemente en presencia de compuestos estabilizadores farmaceuticos. Cuando se administran dosis multiples, las dosis pueden ser separadas entre si, por ejemplo una semana a un mes. Debera entenderse que para cualquier sujeto particular, deben ajustarse con el tiempo los regimenes de dosificacion especificos, de acuerdo con la necesidad del individuo y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administracion de las composiciones.
Breve Descripci6n de los Dibujos
Las figuras 1 a 15 se describen en W0 00/44808 y se reproducen en la presente con proposito ilustrativo. La figura 1 es una grafica del efecto del cambio de residuos aminoacidos adyacentes a la cisteina sobre la velocidad de la adicion de conjugado en los acrilatos (acrilato de PEG).La figura 2 es una representacion esquematica de una reaccion por adicion de conjugado, que se usa como un modelo para estudiar la cinetica de la adicion de un tiol (en cisteina) al acrilato en el diacrilato de PEG. La figura 3 es una grafica que muestra el efecto del pH sobre la reaccion por adicion entre un tiol (en cisteina) y el diacrilato de PEG. La figura 4 es una grafica del efecto de diferentes contenidos de PEGDA sobre la absorbencia por mol de reactivo, el coeficiente de extincion promedio (es decir, la absorbencia dividida entre la suma de PEGDA y la concentracion de cisteina; esta suma se mantiene constante a 2.5x10-3 M). La figura 5 es una grafica que muestra el efecto que tiene la influencia esterica de los grupos cerca del sitio de la insaturacion conjugada sobre la reaccion entre un tiol (en la cisteina) y un acrilato, crotonoato, o dimetilacrilato de un PEG funcionalizado de conformidad con lo anterior.
La figura 6 es una grafica que muestra el efecto de la incorporacion de una secuencia de peptidos RGD adentro de los hidrogeles de la presente invencion, sobre la adherencia y propagacion de las celulas. La figura 7 es una grafica que muestra la liberacion de mioglobina de las esponjas de colageno incluido en hidrogel (Helistat). Notese que el dia 14 se aradio plasmina a los materiales y esto llevo a la liberacion de mas mioglobina de los hidrogeles sensibles a la plasmina. La figura 8 es una curva de esfuerzo-tension para un gel solido al 75 por ciento, preparado en un sistema acuoso. Los geles se prepararon usando tetraquis(3-mercaptopropionato) de pentaeritritol y diacrilato de PEG 570 en solido al 75 por ciento en solucion salina regulada en el pH con fosfato a un pH de 9.0. Los geles mostraron aproximadamente el 37 por ciento de deformacion 2 MPa de resistencia maxima cuando se sometieron a cargas compresivas. La figura 9 muestra curvas de tension-esfuerzo para un gel solido al 75 por ciento preparado en un sistema acuoso con diferentes contenidos de triacrilato de pentaeritritol reemplazando el diacrilato de PEG 570. Los geles se prepararon usando tetraquis(3-mercaptopropionato) de pentaeritritol y diacrilato de PEG 570, y triacrilato de pentaeritritol en solido al 75 por ciento en solucion salina regulada en el pH con fosfato a un pH de
9.0. Los geles mostraron que la rigidez del gel se manipulo por el contenido del triacrilato hidrofobo. La figura 10 es una grafica que muestra el efecto de la adicion de particulas inorganicas o tensioactivos a los geles sobre la resistencia maxima de los geles. Se compararon los geles preparados en el sistema acuoso en solido al 75 por ciento (geles solidos al 75 por ciento), con aquellos en los que se aradio BaS04 al 10 por ciento, o cuando se aradio un tensioactivo, monooleato de sorbitan (Emulsion) al 1 por ciento. Tambien se compararon los geles obtenidos a partir de los precursores reaccionados previamente, con los geles obtenidos por medio de los precursores tetraquis(3-mercaptopropionato) de pentaeritritol y diacrilato de PEG 570 (precursores reaccionados previamente). La figura 11 es una grafica que muestra el efecto de la adicion de particulas inorganicas o tensioactivos a los geles, sobre la rigidez de los geles. Se compararon los geles preparados en el sistema acuoso en solido al 75 por ciento (geles solidos al 75 por ciento), con aquellos en los que se aradio BaS04 al 10 por ciento, o cuando se aradio un tensioactivo, monooleato de sorbitan (Emulsion) al 1 por ciento. Tambien se compararon los geles obtenidos a partir de los precursores reaccionados previamente, con los geles obtenidos por medio de los precursores tetraquis(3-mercaptopropionato) de pentaeritritol y diacrilato de PEG 570 (precursores reaccionados previamente). La figura 12 es una curva de tension-esfuerzo para un gel preparado en un sistema acuoso cargado con silice ahumado (14 nm). Los geles se prepararon usando tetraquis(3-mercaptopropionato) de pentaeritritol y diacrilato de PEG 570 en solucion salina regulada en el pH con fosfato a un pH de 9.0, reforzada con particulas de silice ahumado (14 nm). La figura 13 muestra una curva de tension-esfuerzo para un gel solido al 10 por ciento, preparado en un cosolvente de N-metilpirrolidona/PEG 400. Los geles se prepararon usando tetraquis(3-mercaptopropionato) de pentaeritritol y diacrilato de PEG 570 en solido al 10 por ciento en N-metilpirrolidona/PEG 400. La figura 14 muestra los modulos elastico y de complejo (G= y G==) para el tetraquis(3-mercaptopropionato) de pentaeritritol y el diacrilato de PEG 570. Se mezclaron el tetraquis(3-mercaptopropionato) de pentaeritritol y el diacrilato de PEG 570 con 1 SH a una proporcion de 1 C=C, sin regulador del pH con pH de 9.0 de solucion salina regulada en el pH con fosfato. Se puso la mezcla en un remolino, y despues se determinaron los modulos elastico y de complejo con el tiempo mediante reologia. La figura 15 muestra los modulos elastico y de complejo (G= y G==) a 37°C para el tetraquis(3mercaptopropionato) de pentaeritritol y el diacrilato de PEG 570 activados con solucion salina regulada en el pH con fosfato a un pH de 9.0. Se mezclaron el tetraquis(3-mercaptopropionato) de pentaeritritol y el diacrilato de PEG 570 con 1 SH a una proporcion de 1 C=C, y se aradio la solucion salina regulada en el pH con fosfato a un pH de 9.0. Se puso la mezcla en un remolino, y despues se determinaron los modulos elastico (+) y complejo (_) con el tiempo mediante reologia. Las figuras 16 a 25 ilustran la presente invencion. La figura 16 es una representacion esquematica de la ruta de sintesis para la modificacion de paclitaxel (Ejemplo 19) o la cadena lateral de paclitaxel (Ejemplo 16) con un enlazador que contiene tiol. Este enlazador es entonces acoplado a una insaturacion enlazada mediante PEG mediante una reaccion de adicion conjugada, y los grupos insaturados conjugados enlazados mediante PEG remanentes son reticulados para formar un biomaterial.La figura 17 es una representacion esquematica de la ruta de sintesis para la modificacion de paclitaxel (Ejemplo 20) o la cadena lateral de paclitaxel (Ejemplo 17) con un acrilato. Este acrilato es entonces acoplado a una insaturacion enlazada mediante PEG mediante un enlazador que contiene un tiol o una amina, y los grupos insaturados conjugados enlazados mediante PEG remanentes son reticulados para formar un biomaterial. La figura 18 es una representacion esquematica de la ruta de sintesis para la formacion de un componente precursor de biomaterial que contiene la cadena lateral de paclitaxel. Este componente precursor es representado por la formula: D-0C(0)(CH2)3-S-(CH2)2C(0)NH-P, en la cual D es una ramificacion farmaceuticamente activa (v.gr., el ester metilo de la cadena lateral de paclitaxel) y P es un polimero (v.gr., PEG) (Ejemplo 26). La figura 19A es una grafica que ilustra la cinetica para la liberacion de la cadena lateral de paclitaxel de una solucion de un conjugado enlazado mediante PEG en PBS, pH 7.4 a 37°C (Ejemplo 27). El Aenlazador C3" denota el conjugado enlazado mediante PEG teniendo la formula D-0C(0)(CH2)2-S-(CH2)2C(0)NH-P, en la cual D es el ester metilo de la cadena lateral de paclitaxel y P es PEG (Ejemplo 16). Este conjugado contiene tres
atomos de carbono entre la cadena lateral de paclitaxel y el atomo de azufre en el enlazador. El Aenlazador C4" denota el conjugado enlazado mediante PEG teniendo la formula D-0C(0)(CH2)3-S-(CH2)2C(0)NH-P, en la cual D es el ester metilo de la cadena lateral de paclitaxel y P es PEG (Ejemplo 26). Este conjugado contiene cuatro atomos de carbono entre la cadena lateral de paclitaxel y el atomo de azufre en el enlazador. La figura 19B es una grafica que ilustra la cinetica para la liberacion de la cadena lateral de paclitaxel de un hidrogel foto-polimerizado que fue de los conjugados enlazados mediante PEG listados en la figura 19A. La cinetica de liberacion fue medida en PBS, pH 7.4 a 37°C. La figura 20 es una representacion esquematica de la ruta de sintesis para la formacion de un ligando de enlace de ion de metal de acido iminodiacetico para incorporacion en biomateriales (Ejemplo 28). La figura 21 es una representacion esquematica de la ruta de sintesis para la formacion de un ligando de acido fenilboronico para incorporacion en biomateriales (Ejemplo 28). Las figuras 22A y 22B son graficas que ilustran la hinchazon de geles de PEG reticulados en agua amortiguada. Dentro de las primeras pocas horas despues de la reticulacion, los geles se hincharon de manera considerable, pero alcanzaron un volumen de equilibrio dentro de las 24 horas. La relacion de hinchazon Q describe el volumen del gel relativo a su volumen bajo las condiciones de reticulacion (figura 22A). La figura 22B muestra la ramificacion de volumen calculado de PEG en el gel durante el primer dia de hinchazon. Los geles fueron hechos a partir de PEG-ditiol y uno de los siguientes: octa-acrilato de PEG, 40% (.); tetra-acrilato de PEG, 40% (_); tetra-acrilato de PEG, 30% (0); o triacrilato de PEG, 40% (0). Los porcentajes se refieren al porcentaje de PEG en el precursor del gel durante la reticulacion. Los datos son valores promedio con base en tres geles. La figura 24 es una grafica que ilustra la cinetica de la liberacion de proteinas de los hidrogeles de PEG. Particulas solidas de proteina fueron incorporadas en hidrogeles de PEG por mezcla de las particulas de proteina con multi-acrilato de PEG y PEG-ditiol. La liberacion de proteina fue monitoreada midiendo la absorbencia a 280 nm de la solucion de lavado sobre el gel, que fue reemplazada diariamente. La liberacion acumulada es mostrada para (_) geles hechos de tetra-acrilato de PEG (peso molecular de 14,800; hecho a una concentracion de 40% de PEG) y (.) geles hechos de octa-acrilato de PEG (peso molecular de 20,000; hecho a una concentracion de 40% de PEG). Las barras de error muestran las desviaciones estandard (n = 3). Las figuras 25A y 25B son imagenes de geles SDS-PAGE ilustrando la auto-selectividad de la reaccion de reticulacion. En la figura 25A, los carriles 1 y 6 contienen marcadores de peso molecular; el carril 2 contiene albumina y amortiguador corriente con DTT; y el carril 3 contiene albumina incubada con diacrilato de PEG (20 moles PEG/mol de albumina) por una hora a 37°C y luego disuelta en amortiguador corriente con DTT. El carril 5 contiene albumina que fue disuelta en urea 8M y reducida con TCEP. La albumina reducida fue incubada con diacrilato de PEG (350 moles PEG/mol de albumina) por una hora a 37°C y luego disuelta en amortiguador corriente con DTT. El carril 10 contiene albumina disuelta en amortiguador corriente sin DTT. En la figura 25B, el carril 1 contiene marcadores de peso molecular, y el carril 2 contiene albumina disuelta en amortiguador corriente con DTT. El carril 3 contiene albumina que habia sido liberada de un hidrogel hecho de tetra-acrilato de PEG y PEG-ditiol y luego disuelta en amortiguador corriente con DTT. El carril 4 contiene albumina incubada con acido acrilico (20,000 moles acido acrilico/mol de albumina) por 15 minutos a 37°C y luego disuelta en amortiguador corriente con DTT. El carril 5 contiene albumina disuelta en amortiguador corriente sin DTT. El carril 6 contiene albumina incubada con acido acrilico (20,000 moles acido acrilico/mol albumina) por 15 minutos a 37°C y luego disuelta en amortiguador corriente sin DTT. El carril 7 contiene albumina incubada con PEG-ditiol (20 moles PEG/mol albumina) por una hora a 37°C y luego incubada con acido acrilico (10,000 moles acido acrilico/mol albumina) por 15 minutos a 37°C. La albumina fue entonces disuelta en amortiguador corriente sin DTT. El carril 8 contiene albumina incubada con PEG-ditiol por una hora a 37°C y luego disuelta en amortiguador corriente sin DTT. El carril 9 contiene albumina incubada con urea 8M y PEG-ditiol (20 moles PEG/mol albumina) por una hora a 37°C y luego incubada con acido acrilico (10,000 moles acido acrilico/mol albumina) por 15 minutos a 37°C. La albumina fue entonces disuelta en amortiguador corriente sin DTT. El carril 10 contiene albumina incubada con urea 8M y PEG-ditiol (20 moles PEG/mol albumina) por una hora a 37°C y luego disuelta en amortiguador corriente sin DTT.
Descripci6n Detallada
I. Sintesis o Aplicaci6n In vivo de los biomateriales
El sistema de reacci6n quimica que se us6 para la formaci6n del biomaterial
Se ha desarrollado un esquema de reaccion quimica mediante el cual polimerizar o reticular (las palabras se usan como sinonimos en la presente) dos o mas componentes precursores de un biomaterial in situ, o en la presencia de materiales biologicos sensibles, de una manera muy auto-selectiva. Este esquema de reaccion quimica se describe en W0 00/44808 y se usa analogamente en la presnete invencion. Comunmente se mezclan juntos dos componentes precursores. Estos dos componentes precursores son auto-selectivos en sus velocidades de reaccion (es decir, un primer componente precursor reacciona mucho mas rapido con un segundo componente precursor que con otros componentes en el material biologico sensible, y el segundo componente precursor reacciona mucho mas rapido con el primer componente precursor que con otros componentes en el material biologico sensible). Cuando ambos componentes precursores tienen una funcionalidad de cuando menos dos, y cuando uno de ellos tiene una funcionalidad mayor que dos, el sistema
reaccionara auto-selectivamente para formar un biomaterial reticulado. La palabra Afuncionalidad@ se usa en la presente en el sentido que se usa en la ciencia de polimeros (es decir, el numero de sitios reactivos). De esta manera, la mezcla de dos componentes con funcionalidades de dos cada uno dara como resultado un biomaterial polimerico lineal, y la mezcla de dos componentes con funcionalidades de cuando menos dos cada uno, uno de los componentes teniendo una funcionalidad de mas de dos, dara como resultado un biomaterial reticulado. Pueden ser utiles ambos tipos de biomateriales. En biomateriales reticulados los componentes pueden ser muy hidrofilos, y el material global puede permanecer aun como un solido intacto, sin dispersarse a lo largo del cuerpo. Si se desea ese sistema no dispersante para un biomaterial polimerico lineal, este es util si cuando menos un componente precursor es hidrofobo, de tal manera que el biomaterial resultante tambien sea insoluble en aguo o en fluidos corporales. Tambien son posibles otros planteamientos, por ejemplo, cuando los dos componentes precursores interactuan de otra manera para volverse insolubles, o cuando uno o ambos precursores responden al pH, la temperatura u otros estimulos para volverse mas o menos solubles, o cuando un componente precursor es un poli-cation y el otro componente precursor es un poli-anion, o cuando un componente precursor se enlaza fuertemente por el hidrogeno al otro. Este sistema de reaccion quimica hace uso de las reacciones por adicion, en las que un componente posee un nucleofilo fuerte y el otro componente posee una insaturacion conjugada, o una insaturacion conjugada. De interes particular para use en esta invencion como nucleofilos fuertes son los tioles. De preferencia, el sistema hace uso de reacciones por adicion de conjugados entre un tiol y una insaturacion conjugada (por ejemplo, un acrilato o una quinona). Este sistema de reaccion se puede hacer para que sea auto-selectivo, queriendo decir sustancialmente no reactivo con otros grupos quimicos que se encuentran en la mayoria de los compuestos biologicos sensibles de interes (la mayoria de farmacos, peptidos, proteinas, ADN, celulas, agregados celulares, y tejidos). Este es particularmente util cuando uno o ambos componentes son parte de un polimero u oligomero, sin embargo, en la presente tambien se indican otras posibilidades. Muchas proteinas contienen el aminoacido cisteina, cuya cadena lateral termina en un tiol. A pesar de esto, hay muy pocos tioles libres adentro de la proteina: la mayoria de las proteinas contienen un numero par de residuos de cisteina, y entonces estos se ponen en pares y forman reticulaciones de bisulfuro entre diferentes regiones de la proteina. Algunas proteinas contienen un numero non de residuos de cisteina, y la mayoria de estos estan presentes como dimeros enlazados por bisulfuro, nuevamente dando como resultado que ningun residuo de tiol libre este presente en la proteina nativa. De esta manera, hay muy pocos tioles libre en la proteina. Algunas moleculas de transferencia de electrones importantes, tales como glutationa, contienen un tiol libre, pero estas moleculas generalmente estan restringidas en su localizacion espacial al interior de una celula. De conformidad con lo anterior, las estructuras conjugadas insaturadas presentadas afuera de la celula seran sustancialmente no reactivas con la mayoria de las proteinas en condiciones casi fisiologicas. Las aminas tambien son nucleofilos, aunque no tan buenos nucleofilos como los tioles. El pH del ambiente de la reaccion es importante en esta consideracion. En particular, las aminas no protonadas son generalmente mejores nucleofilos que las aminas protonadas. A un pH fisiologico, las aminas de la cadena lateral de la lisina son casi exclusivamente protonadas, y en consecuencia no muy reactivas. La amina alfa del termino N de peptidos y proteinas tiene un pK mucho mas bajo que la amina epsilon de la cadena lateral; de conformidad con lo anterior, a un pH fisiologico es mas reactiva para conjugar adiciones que las aminas epsilon de la cadena lateral de lisina. No obstante, el tiol es sustancialmente mas reactivo que la amina no protonada. Como se declaro, el pH es importante en esta consideracion: el tiol desprotonado es sustancialmente mas reactivo que el tiol protonado. En conclusion, las reacciones por adicion que envuelven una insaturacion conjugada, tal como un acrilato o una quinona, con un tiol para convertir dos componentes precursores en un biomaterial, frecuentemente se realizaran mejor (queriendo decir mas rapido, mas auto-selectiva) a un pH de aproximadamente 8, en donde la mayoria de los tioles de interes son desprotonados (y de esta manera mas reactivos), y en donde la mayoria de las aminas de interes todavia estan protonadas (y por lo tanto menos reactivas). Cuando se usa un tiol como el primer componente, es altamente deseable una estructura de conjugado que sea selectiva en su reactividad para el tiol con relacion a las aminas. Si las estructuras conjugadas se mantienen afuera de las celulas, hay muy pocos nucleofilos reactivos con los cuales reaccionar para inducir toxicidad. Uno puede realizar tipicamente esta restriccion espacial por medio de hacer que el componente conjugado sea de alto peso molecular, sea hidrofilo, o ambos. El polietilenglicol (PEG) proporciona un bloque de construccion muy conveniente. Uno puede comprar o sintetizar facilmente los PEGs lineales (queriendo decir con dos extremos) o ramificados (queriendo decir mas de dos extremos), y despues funcionalizar los grupos extremos de PEG para introducir ya sea un nucleofilo fuerte, tal como un tiol, o una estructura conjugada, tal como un acrilato o una quinona. Cuando estos componentes ya sea se mezclan uno con el otro, o se mezclan con un componente correspondiente, se formara un material de hidrogel. Uno puede hacer reaccionar un componente PEG con un componente no PEG, controlando el peso molecular o la hidrofilicidad de cualquier componente, para manipular las caracteristicas mecanicas, la permeabilidad, y el contenido de agua del biomaterial resultante. Estos materiales generalmente son utiles en implantes medicos, como se describe con mayor detalle posteriormente. En la formacion de biomateriales, especialmente biomateriales que se desea que se degraden in vivo, los peptidos proporcionan un bloque de construccion muy conveniente. Este es directo para sintetizar peptidos que contienen dos o mas residuos de cisteina, y este componente puede servir entonces facilmente como el componente precursor nucleofilo de un biomaterial, especialmente un biomaterial de hidrogel. Por ejemplo, un
peptido con dos residuos de cisteina libres formara rapidamente un hidrogel cuando se mezcle con un triacrilato de PEG a un pH fisiologico o ligeramente mas alto (por ejemplo, 8 o 9; la gelacion tambien procedera bien a un pH aun mas alto, pero a costa potencial de la auto-selectividad). Cuando se mezclan juntos los dos componentes precursores liquidos, estos reaccionan durante un periodo de unos pocos minutos para formar un gel elastico, que consiste de una red de cadenas de PEG, que llevan los nodos de la red, con los peptidos, como enlaces de conexion. Los peptidos se pueden seleccionar como sustratos de proteasa, con el proposito de hacer a la red capaz de ser infiltrada y degradada por las celulas, muy parecido a como lo harian en una red basada en proteinas. La gelacion es auto-selectiva, queriendo decir que el peptido reacciona mayormente con el componente PEG y ningun otro componente, y el componente PEG reacciona mayormente con el peptido y ningun otro componente; si se desea, uno puede diserar e incorporar agentes bio-funcionales para proporcionar el enlace quimico a otras especies (por ejemplo, una superficie de tejido). Estos geles son operacionalmente simples para formarse: uno mezcla dos precursores liquidos, uno que contenga el peptido y el otro que contenga el PEG funcional. Debido a que en este ejemplo la solucion salina fisiologica puede servir como el solvente, y debido a que se genera calor minimo por la reaccion, y debido a que ni el triacrilato de PEG ni el peptido pueden difundir rapidamente las celulas internas, la gelacion se puede realizar in vivo o in vitro, en contacto directo con el tejido, sin toxicidad desfavorable. Esta claro que se pueden usar polimeros diferentes al PEG, ya sea telequelicamente modificados o modificados en sus grupos laterales.
Sitios de Proteasa
Una caracteristica especial del esquema de reticulacion quimica aplicable en esta invencion es que este es auto-selectivo, queriendo decir que este no reacciona con otras caracteristicas sobre los peptidos o proteinas. De esta manera, uno puede emplear peptidos como un componente, como se describio anteriormente, y no reaccionar quimicamente con grupos laterales en el peptido aparte de los residuos de cisteina. Esto significa que se pueden incorporar una diversidad de peptidos bio-activos adentro de la estructura del biomaterial resultantes. Por ejemplo, se puede diserar un peptido que se use como un ditiol para propositos de reticulacion, para que sea un sustrato para una enzima que use la migracion celular a traves de los tejidos y remodelar tejidos (por ejemplo, como un sustrato para plasmina, elastasa o metaloproteinasas de matriz (MMPs), tales como colagenasa). Las caracteristicas de degradacion de los geles se puede manipular por medio de cambiar los detalles del peptido que sirve como los nodos de reticulacion. Uno puede hacer un gel que sea degradable por colagenasa, pero no plasmina, o por plasmina, pero no colagenasa. Ademas, es posible hacer que el gel se degrade mas rapido o mas lento, en respuesta a una enzima, simplemente por medio de cambiar la secuencia de aminoacidos con el proposito de alterar el Km o kcat, o ambos, de la reaccion enzimatica. Uno puede de esta manera hacer un biomaterial que sea bio-mimetico, en el sentido de que este sea capaz de ser remodelado por las caracteristicas de remodelacion normales de las celulas.
Sitios de Adhesion
Uno puede incorporar sitios de peptido para la adhesion de celulas, a saber peptidos que se fijan a receptores promotores de adhesion en las superficies de las celulas adentro de los biomateriales de la presente invencion. El principio se describe en W0 00/44808. Este se dirige para incorporar una diversidad de esos peptidos promotores de adhesion, tal como la secuencia RGD de la fibronectina, o la secuencia YIGSR de la laminina. Como anteriormente, esto se puede hacer, por ejemplo, simplemente por medio de mezclar un peptido que contenga cisteina con diacrilato o triacrilato de PEG, diacrilamida o triacrilamida de PEG, o diquinona o triquinona de PEG, unos pocos minutos antes de mezclar con el resto del componente precursor que contiene tiol. Durante este primer paso, el peptido promotor de adhesion llegara a estar incorporado dentro de un extremo del PEG funcionalizado de manera multiple con una insaturacion conjugada; cuando se arade el multitiol restante al sistema se formara una red reticulada. De esta manera, por ejemplo, cuando se mezcla un peptido de adhesion que contiene una cisteina con un triacrilato de PEG (en, por ejemplo, 0.1 mol de peptido por mol de grupo extremo de acrilato), y despues se arade un peptido de sustrato de proteasa que contiene dos residuos de cisteina, para formar la red tridimensional (en, por ejemplo, equimolar menor de 0.1 mol de peptido por mol de grupo extremo de acrilato), el material resultante sera altamente bio-mimetico: la combinacion de sitios de adhesion incorporados y sitios de proteasa permite que una celula establezca traccion en el material a medida que degrada una trayectoria para su migracion, exactamente como lo haria de manera natural la celula en la matriz extra-celular in vivo. En este caso, el sitio de adhesion esta incorporado suspendido dentro del material. Uno tambien puede incorporar el sitio de adhesion directamente en la estructura base del material. Esto se puede hacer en mas de una manera. Una manera seria incluir dos o mas tioles (por ejemplo, cisteina) en el peptido o proteina de adhesion. Uno puede sintetizar alternativamente el peptido de adhesion (por ejemplo, usando quimica de fase de solucion) directamente sobre un polimero, tal como PEG, e incluir cuando menos un tiol (por ejemplo, cisteina) o insaturacion conjugada por extremo de cadena.
Sitios de enlace de factores de crecimiento
Uno puede incrementar adicionalmente la naturaleza biometrica de los biomateriales de la presente invencion, especialmente cuando estos se forman a partir de componentes solubles en agua, con el proposito de ser
hidrogeles, mediante la incorporacion de dominios de enlace de factores de crecimiento. El principio se describe en W0 00/44808. Por ejemplo, se pueden emplear peptidos de enlace de heparina para fijar la heparina, que a su vez se puede emplear para fijar factores de crecimiento de enlace a la heparina, tales como bFGF, VEGF, BMP o TGF �. En si, si el factor de crecimiento de enlace a la heparina, la heparina, y el peptido de enlace a la heparina activado se mezclaran con el PEG activado (de manera similar a la que se describio en la seccion precedente), el gel resultante liberaria lentamente el factor de crecimiento, reteniendo la mayoria de este hasta que una celula invasora liberara el factor de crecimiento por la degradacion del gel. Esta es una de las funciones naturales de la matriz extra-celular in vivo, para servir como un deposito para factores de crecimiento que llegan a liberarse en la lesion por la actividad celular local. 0tra manera relacionada para secuestrar los factores de crecimiento de enlace a la heparina seria mas directamente a traves del uso de mimicos de heparina covalentemente incorporados, por ejemplo, peptidos con cadenas laterales negativamente cargadas, que directamente fijar los factores de crecimiento. Por otra parte, puesto que el material mismo en una red, este se puede usar para liberar un factor de crecimiento que este simplemente incorporado fisicamente, y se ibera lentamente mediante degradacion o difusion, o una combinacion de los mismos. Se debe entender que debido a que la quimica de la gelacion es auto-selectiva, el factor de crecimiento mismo y los otros peptidos bio-activos no se modifican quimicamente con el proposito de destruir su actividad biologica. Este aspecto importante de la auto-selectividad hace obvia la necesidad, por ejemplo, de encapsular el factor de crecimiento en particulas de polimero (para protegerlo mediante lo mismo de la quimica de la gelacion, si la quimica de la gelacion fuera a reaccionar con grupos laterales que este presentes libres en el factor de crecimiento, tal como las aminas epsilon presentes en las cadenas laterales de la lisina en la proteina).
Entrega de Farmacos desde Hidrogeles Formados Mediante Reacciones por Adici6n Conjugada (como se describen en W0 00/44808)
Los hidrogeles son particularmente utiles para la aplicacion de productos terapeuticos de proteinas. Los hidrogeles son bio-compatibles, y proporcionan un ambiente suave para las proteinas, con el proposito de minimizar la desnaturalizacion de las proteinas. Las reacciones por adicion de conjugados con tioles se utilizan para la produccion de geles en la presencia de proteinas, debido a la auto-selectividad de estas reacciones, en comparacion con las reacciones por sustitucion nucleofila, las reacciones de radicales libres, o las reacciones que envuelven aminas para reactividad. De esta manera, las proteinas se atrapan fisicamente adentro de los geles. Adicionalmente, se pueden incorporar segmentos degradables adentro de los polimeros que forman el hidrogel, y por medio de la degradacion de los segmentos adentro del gel, las proteinas se liberaran a medida que el gel se degrade. Una modalidad particularmente util de la invencion ocurre en el caso cuando la reaccion por adicion de conjugados misma lleva a una estructura que es particularmente propensa a la hidrolisis. En la mayoria de los casos, los farmacos de proteinas o productos terapeuticos de peso molecular elevado, tales como oligonucleotidos o genes anti-sentido, se liberan desde los materiales hidrofobos degradables, tales como el acido polilactico. Sin embargo, se describen aqui mas materiales hidrofilos, tales como polietilenglicol reticulado funcionalizado con tioles, con insaturaciones conjugadas, o ambos. Existen otros ejemplos, incluyendo polietilenglicol foto-reticulado (Pathak y colaboradores, Journal of the American Chemical Society 114:8311-8312, 1992) y polietilenglicol reticulado mediante reacciones por sustitucion nucleofila (Zhao y colaboradores, Polymer Preprints 38:526-527, 1997; W0 99/2270; W0 99/34833, y W0 99/14259). La reticulacion por medio de quimicas por adicion de conjugados con tioles exhibe excelente auto-selectividad, en el sentido de que la reaccion entre el grupo conjugado y otros grupos, tales como aminas, en proteinas, sera bastante lenta. Cuando la proteina que se va a incorporar contiene un tiol libre, este se hara reaccionar con el sistema del biomaterial, a menos que este se proteja o haga reaccionar de otra manera. Una ventaja adicional para el uso de biomateriales formados mediante la adicion de conjugados con tioles, para encapsular y liberar proteinas surge debido a la quimica de los grupos generados mediante la reticulacion por adicion de conjugados. Si el grupo conjugado es un acrilato, entonces en el sistema esta presente un ester relativamente inestable. Si el acrilato se sometiera a la reticulacion de radicales libres, se ha encontrado que esos geles se degradan solamente muy lentamente a un pH de 7.4 y a 37°C, con un gel que se degrada durante el periodo de aproximadamente un aro. Sin embargo, si el grupo acrilato se hace reaccionar con un tiol, el ester del grupo acrilato se hidroliza con una vida media de aproximadamente 3 semanas, produciendo geles que se degradan durante aproximadamente 3 semanas (como se describe posteriormente). Mientras que en el caso de la reticulacion de radicales libres, se deben incluir grupos especiales entre el polietilenglicol y el acrilato, para promover la degradacion del gel (tal como oligomeros de acido polilactico; Pathak, supra), no se requieren grupos especiales entre el acrilato y el polietilenglicol en el caso de la reticulacion por adicion de conjugados. Uno puede emplear enlazadores mas estables entre la insaturacion conjugada y el polimero, y entonces incorporar un dominio que sea degradable por hidrolisis, tal como un oligomero de acido glicolico, acido lactico, caprolactona epsilon, o carbonato de trimetileno, entre el polimero y la insaturacion conjugada, para obtener la degradacion del biomaterial mediante la degradacion de estos dominios.
Aplicaciones Bio-Medicas para los Hidrogeles (como se describen en W0 00/44808)
Los hidrogeles son materiales polimericos que se hinchan altamente con agua. Para muchas aplicaciones, los hidrogeles son especialmente utiles. Los hidrogeles son de interes para miriadas de aplicaciones bio-medicas. Estas incluyen, pero no estan limitadas a aplicaciones de barreras (preventivos de adhesion, selladores),
dispositivos de aplicacion de farmacos, disero de tejidos y andamios para curacion de heridas, materiales para encapsulacion y trasplante celular, materiales para el aumento quirurgico de tejidos, y materiales para selladores y adhesivos. A continuacion se da una lista de aplicaciones incompleta pero ilustrativa para los hidrogeles en bio-medicina:
1.
Son preferentes los hidrogeles para la prevencion de adhesiones, para minimizar las adhesiones no deseadas postoperatorias u otras adhesiones post-traumaticas. Esas adhesiones pueden ser proteinaceas o celulares, o ambas. Por ejemplo, las adhesiones abdominopelvicas postoperatorias pueden llevar a dolor cronico, obstruccion del intestino, e infertilidad. Como un segundo ejemplo, la adhesion no deseada entre las plaquetas de la sangre y la superficie de la pared del vaso sanguineo despues de la angioplastia de globo en el sistema vascular puede llevar a trombosis y restenosis. Los materiales curados in situ sobre un sitio quirurgico puede ser util para evitar las adhesiones postoperatorias, especialmente cuando estos materiales se degradan durante un periodo de muchos dias a semanas. Los materiales curados in situ sobre una arteria lesionada puede ser util para evitar la trombosis sobre el sitio del trauma vascular asociado con la intervencion de cateteres, el despliegue de un stent, o cirugia.
2.
Los hidrogeles como pegamentos o selladores son preferentes para sellar fugas en tejidos que aislan (fase de gas o liquido) cavidades que contengan fluidos. Algunos ejemplos son los vasos sanguineos, la piel, el pulmon, la barrera dura, y el intestino. Los materiales pueden ser utiles internamente, por ejemplo, para sellar fugas de aire en el pulmon, y externamente, por ejemplo, para cerrar incisiones en la piel.
3.
Los hidrogeles tambien pueden ser utiles como dispositivos de aplicacion de farmacos localizada. Un farmaco puede ser cualquier molecula biologicamente activa, por ejemplo, un producto natural, farmaco sintetico, proteina (tal como factores de crecimiento o enzimas), o material genetico. Las propiedades funcionales ese farmaco deben ser conservadas por su portador. El farmaco se puede liberar mediante mecanismos difusivos, o mediante la degradacion del portador del gel, a traves de una diversidad de mecanismos (tal como hidrolisis o degradacion enzimatica), o mediante otros mecanismos de deteccion (por ejemplo, hinchazon inducida por el pH). Dado que muchos farmacos contienen grupos reactivos, es importante que el material que sirve como el portador no reaccione con el material de una manera indeseable; en si, la alta auto-selectividad de las reacciones entre las insaturaciones conjugadas y los tioles es muy util en la encapsulacion de farmacos. El Ejemplo 29 (ejemplo de referencia) ilustra que proteinas (v.gr., albumina de suero bovino) pueden ser encapsuladas durante la formacion de hidrogeles sin ser modificadas covalentemente por atrapamiento. Adicionalmente, de acuerdo con la invencion, las proteinas pueden ser liberadas de los hidrogeles en forma no modificada. La tasa de liberacion puede ser optimizada para una aplicacion clinica particular. Por ejemplo, enlazadores hidrolizables o sitios de corte de proteasa pueden ser incorporados en los hidrogeles para incrementar la tasa de liberacion. Adicionalmente, la tasa de liberacion puede ser alterada variando el peso molecular de los polimeros, la concentracion de los polimeros, o la funcionalidad de los polimeros usados para formacion de hidrogeles.
4.
Los hidrogeles como andamios son preferentes para el disero de tejidos y aplicaciones de curacion de heridas: regeneracion de nervios, angiogenesis, y reparacion y regeneracion de piel, huesos y cartilagos. Esos andamios se pueden introducir al cuerpo sembrados previamente con celulas, o pueden depender de la infiltracion celular desde afuera del material en los tejidos cerca del biomaterial implantado. Esos andamios pueden contener (a traves de enlaces covalentes o no covalentes) moleculas interactivas con celulas como peptidos de adhesion y factores de crecimiento.
5.
Los hidrogeles tambien tienen aplicaciones bio-medicas como dispositivos de trasplante celular. Esos dispositivos sirven para aislar celulas (por ejemplo, aloinjerto o xenoinjerto) del sistema de defensa de un anfitrion (inmuno-proteccion), mientras permite el transporte selectivo de moleculas tales como oxigeno, dioxido de carbono, glucosa, hormonas, e insulina y otros factores de crecimiento, habilitando asi a las celulas para retener sus funciones normales, y para proporcionar beneficios deseados, tales como la liberacion de una proteina terapeutica que se pueda difundir a traves de la membrana de hidrogel de inmuno-proteccion al receptor.
6.
Los hidrogeles pueden responder a su ambiente. Estos se pueden diserar para incrementar la formacion de la red, y de esta manera la union, entre el gel y el tejido porque cuando se inyectan inicialmente los componentes se originan en agua y son solubles en agua. Despues de la transicion los estimulos activos (por ejemplo, la temperatura o el pH) uno o ambos precursores se vuelven insolubles en agua, dando un contenido de agua promedio mas bajo, y dando como resultado una rigidez incrementada y propiedades mecanicas mejoradas del gel resultante.
En algunos de estos ejemplos citados anteriormente, es deseable formar hidrogeles terapeuticos en su destino final en el cuerpo. Por lo tanto son de interes los materiales implantables que se pueden inyectar en la fase liquida a un sitio objetivo, en donde estos se puedan transformar entonces en materiales solidos. La forma de ese implante puede corresponder con la topografia del tejido, y un implante relativamente grande se puede
aplicar a traves de metodos minimamente invasivos. Frecuentemente, se puede conseguir una buena adhesion al sustrato del tejido subyacente, por ejemplo, por medio de la penetracion intima de los precursores liquidos dentro de la textura en la superficie del tejido, o por medio de la interpenetracion de fase para formar una red de polimeros inter-penetrante entre la red de polimeros del biomaterial y los materiales extra-celulares del tejido natural, que tambien son una red de polimeros. Uno tambien puede diserar materiales adicionales para jugar un papel como agente de acoplamiento para mejorar la adhesion. Por ejemplo, uno puede diserar un agente de acoplamiento hetero-bifuncional con un ester activado (tal como un derivado de ester activado de Nsuccinimidilo) o un grupo epoxido en un extremo, y una estructura conjugada que reaccione lentamente con las aminas en el otro extremo. Ese agente reaccionaria con las proteinas en la superficie del tejido cuando se aplique a la superficie del tejido, y entonces inmovilizaria los grupos conjugados para incorporacion quimica dentro de la red del biomaterial, durante la polimerizacion o reticulacion. Este paso de tratamiento previo introduciria mediante lo mismo, sobre la superficie del tejido, grupos quimicos que pueden participar en la reticulacion auto-selectiva entre los dos componentes de la solucion precursora final. Hay muchas maneras para formar biomateriales que incluyan hidrogeles. Sin embargo, los materiales hechos en contacto con materiales biologicos sensibles, incluyendo celulas o tejido, o reservados para implantacion u otro contacto con el cuerpo, se someten a restricciones especiales. En el texto que sigue se considera la situacion de la formacion de un hidrogel de biomaterial, debido a la utilidad especial de los hidrogeles de biomaterial. Los planteamientos generalmente son los mismos para materiales no de hidrogel, y se debe entender que los planteamientos descritos a continuacion se pueden generalizar. El proceso de formacion de la red debe proceder en condiciones relativamente suaves con respecto al sistema solvente, la temperatura y la exotermicidad, y el pH. Los precursores y productos (de las reacciones de gelacion y de degradacion de gel) deben ser sustancialmente no toxicos, con toxico siendo definido como que induce una reaccion del tejido medicamente inaceptable en un contexto medicamente relevante. Los planteamientos descritos en la presente que usan reacciones por adicion de conjugados con tioles, para formar biomateriales, simplifican el proceso de la formacion de gel (no se requieren cambios de luz o temperatura), y aradir grandemente a la utilidad por medio de ser auto-selectivo (en general sin reaccionar con proteinas que esten incorporadas como productos bio-farmaceuticos, o que esten presentes en las superficies de celulas y tejidos). Ademas, debido a la auto-selectividad, es posible incorporar mucho mas flexiblemente peptidos dentro del biomaterial mismo, por ejemplo, como sitios de disociacion de proteasa (para proporcionar la degradacion), sitios de adhesion celular, o sitios de enlace de heparina o de factores de crecimiento. Existen numerosas aplicaciones en la medicina en donde se desea la reticulacion in situ, pero en donde no se desean los hidrogeles. Estas pueden incluir aplicaciones en donde se desea un material de alta resistencia. Se pueden formar hidrogeles de alta resistencia, pero en general los materiales no de hidrogel pueden ser mas resistentes. Estos materiales se pueden obtener ya sea mediante reticulacion, usando el esquema descrito, en presencia de un solvente no acuoso de baja toxicidad, tal como etilacetato, un PEG de bajo peso molecular, o a partir de reticulacion pura sin ningun solvente, a partir de precursores liquidos. Por ejemplo, se puede formar un material fuerte, hidroliticamente degradable, a partir de un diacrilato de caprolactona poli(epsilon) de bajo peso molecular (que es un liquido) como un componente hidrofobo. Esos materiales pueden ser ya sea biomateriales lineales polimericos, o biomateriales polimericos reticulados. Esto tambien se puede conseguir mediante el uso de precursores que exhiban sensibilidad al pH, a la temperatura, o a otros estimulos que se puedan manipular. De la misma manera, los precursores experimentaran una transicion de solubles a insolubles despues/durante la aplicacion. Esto permitira un manejo facil, pero permite la mejora de las propiedades mecanicas mediante el uso de materiales no de hidrogel (bajo contenido de agua). Es posible preparar materiales estructurales con resistencia mecanica significativa in situ, usando adicion de conjugados con tioles. Si se usan una densidad de reticulacion alta y/o un contenido de agua bajo, se pueden obtener geles o materiales con alta resistencia mecanica. Se pueden combinar precursores multi-funcionales, de bajo peso molecular con solubilidad en agua limitada o ninguna solubilidad, para formar materiales reticulados fuertes. Estos precursores insolubles o parcialmente solubles se pueden combinar, si son liquidos, mediante dispersion en medio acuoso, con o sin la ayuda de emulsificantes. Este emulsificante pueden ser tensioactivos no toxicos o minimamente toxicos, tales como monooleato de sorbitan, o este puede ser una proteina tal como albumina. Las particulas inorganicas tambien pueden ayudar en la dispersion en agua de esos precursores. Se pueden modificar las propiedades mecanicas de los geles estructurales obtenidos mediante este metodo, mediante la adicion de particulas inorganicas, aditivos hidrofilos o hidrofobos, o mediante el uso de precursores de peso molecular de multiples modos (precursores con multiples pesos moleculares discretos). La adicion de particulas inorganicas incrementa la rigidez del material reticulado, y puede incrementar la resistencia maxima y la resistencia a la fatiga del material. La adicion de aditivos hidrofilos se puede usar para incrementar el contenido de agua, y para suavizar los materiales. Dependiendo de la composicion quimica, la adicion de aditivos hidrofobicos se puede usar para reducir el contenido de agua del gel, y se puede usar para endurecer y/o fortalecer los materiales. Esto tambien se puede usar para mejorar la elasticidad. La densidad de reticulacion se puede afectar mediante el peso molecular de los precursores originales. El incremento del peso molecular puede reducir la densidad de reticulacion, y usarse para modular las propiedades mecanicas del biomaterial final.
II. Quimica de la Reticulaci6n
La quimica de reticulacion aplicable en la presnete invencion se divulga en W0 00/44808 y se describe a
continuacion. Como se usa en la presente, el simbolo p1 se emplea para indicar la parte de una molecula que se encuentra entre dos sitios reactivos (sentido telequelico) o que se injerta con sitios reactivos (sentido injertado). Con los polimeros telequelicos, p1 se encontrara entre dos nucleofilos fuertes, tal como dos tioles, o entre dos insaturaciones conjugadas (por ejemplo, en el caso de un diacrilato de PEG o un ditiol de PEG, p1 es una cadena PEG). En el caso de una triquinona o un tritiol de PEG, p1 es un PEG ramificado de tres brazos. En el caso de un bloque copolimerico de acrilato-(oligomero de acido lactico)-PEG -(oligomero de acido lactico)acrilato o quinona-(oligomero de acido lactico)-PEG-(oligomero de acido lactico)-quinona, p1 es el copolimero de bloque de (oligomero de acido lactico)-PEG-(oligomero de acido lactico). En el caso de un copolimero de injerto (por ejemplo, polilisina-injerto-(acrilato de PEG) o polilisina-injerto-(quinona de PEG), o polilisina-injerto(tiol de PEG)), en el que la geometria del polimero es como una botella-cepillo con las puntas de las cerdas conteniendo ya sea las insaturaciones conjugadas o el nucleofilo fuerte, p1 es polilisina-injerto-(PEG). p1 tambien puede presentar los grupos reactivos en las cadenas laterales: todo polimero que lleve alcoholes o aminas en las cadenas laterales se acrilata facilmente, por ejemplo, con el proposito de presentar multiples grupos conjugados insaturados para la reaccion por adicion de conjugados. Los polimeros que contienen acidos carboxilicos se pueden derivar para exponer, por ejemplo, grupos de quininas. p1 no necesita ser polimerico en el sentido usual de la palabra. Por ejemplo, en el caso del diacrilato o diquinona de etilenglicol, p1 es la unidad de etileno. En el caso de un peptido, por ejemplo, YCXXXXXXCY (SEQ ID N0: 1) o CXXXXXXC (SEQ ID N0: 2), en donde C es la cisteina del aminoacido y X e Y son otros aminoacidos, de tal manera que XXXXXX (SEQ ID N0:3), pueda ser una secuencia que funcione como un sustrato para una proteasa tal como colagenasa, p1 es XXXXXX. La longitud de XXXXXX o el numero de X (por ejemplo, Xn) puede ser cualquier longitud o numero (n=0). En el caso del ditiol de 1,2-etileno, p1 es el etileno. De esta manera p1 es la parte molecular del componente precursor que esta interpuesto entre los dos o mas grupos reactivos en el componente precursor. Frecuentemente esto es conveniente cuando este es polimerico u oligomerico, pero en ningun caso es necesario; las moleculas pequeras tambien son de interes y uso. Los ejemplos de pequeras moleculas que se pueden usar incluyen, pero no estan limitadas a azucares reducidos o compuestos analogos tales como manitol, eritritol, pentaeritrol, trimetilolpropano, y glicerol, que pueden estar total o parcialmente acrilatados, o pueden reaccionar con acido beta-mercaptopropionico para dar tioles. Los acidos di-o multicarboxilicos, tales como EDTA, acido citrico, acido succinico, y acido sebasico, se pueden convertir a quinonas.
Definici6n de la reacci6n tipo Michael
Se hace referencia a la reaccion por adicion 1,4 de un nucleofilo en un sistema insaturado de conjugados, como una reaccion tipo Michael. El mecanismo de adicion puede ser puramente polar, o proceder a traves de un estado(s) intermedio parecido a radical; los acidos Lewis o las especies de enlace de hidrogeno apropiadamente diseradas pueden actuar como catalizadores. El termino conjugacion puede referirse tanto a la alternacion de enlaces multiples de carbono-carbono, carbono-heteroatomo, o heteroatomo-heteroatomo con enlaces individuales, o al enlace de un grupo funcional a una macromolecula, tal como un polimero sintetico o una proteina. Se hace referencia a los enlaces dobles separados por una unidad de CH o CH2, como enlaces dobles homo-conjugados. La adicion tipo Michael a grupos conjugados insaturados puede tener lugar en rendimientos buenos a cuantitativos a la temperatura ambiente o temperatura corporal, y en condiciones suaves, con una amplia diversidad de nucleofilos (Pathak, supra; Mathur y colaboradores, Journal of Macromolecular Science-Reviews in Macromolecular Chemistry and Physics," C36:405-430, 1996; Moghaddam y colaboradores, Journal of Polymer Science: Part A: Polymer Chemistry 31:1589-1597, 1993; y Zhoa, supra). Se han usado grupos conjugados insaturados, tales como vinil sulfonas (Pathak, supra) o acrilamidas (Mathur, supra), para enlazar el PEG o polisacaridos a proteinas, a traves de reacciones tipo Michael con grupos amino o mercapto. Se proporciona rapidamente una gelacion bio-compatible de precursores de biomaterial para formar un biomaterial, mediante el uso de una amplia variedad de compuestos conjugados insaturados que reaccionan con tioles de una manera auto-selectiva. La cinetica de la formacion de geles y las propiedades mecanicas y de transporte del producto se hacen a la medida de las necesidades de la aplicacion. La posibilidad de incorporar material proteinaceo o de peptidilo se contempla principalmente con el proposito de obtener un material proteoliticamente degradable, o para procesos de reconocimiento especificos adentro de este, pero principalmente mediante la reaccion con residuos de cisteina intencionalmente incorporados; la PEGilacion de proteina pura esta fuera del alcance de la presente invencion, puesto que esta no da como resultado un biomaterial. Los grupos tales como maleimidas y vinil sulfonas son utiles en estas reacciones de reticulacion, pero estos tienden a ser menos utiles que otros, debido a una velocidad de reactividad relativamente alta con las aminas, con relacion a otros nucleofilos segun se comparan con algunos de los sistemas conjugados descritos posteriormente. En si, el uso de insaturaciones conjugadas que despliegan reactividad global mas lenta, incluye quinonas y acrilatos.
Estructuras conjugadas insaturadas
Es posible realizar las reacciones por adicion tipo Michael en una amplia variedad de compuestos conjugados insaturados. En las estructuras que se muestran posteriormente, una estructura oligomerica o polimerica se
indica como p1. En la presente tambien se describen diferentes posibilidades para la identidad especifica de p1 . p1 se puede acoplar a grupos conjugados insaturados reactivos, en estructuras tales como aquellas numeradas del 1 al 20, de esta forma se obtiene el polimero P soluble o disolvente en agua. En los dibujos se pretende que p1 termine con un grupo CH2, CH o C.
5 Los enlaces dobles reactivos se pueden conjugar a uno o mas grupos carbonilo en una cetona lineal, estructura de ester o amida (1,2), o a dos en un sistema de anillo, como en un derivado maleico o paraquinoide (3,4,5,6,7,8,9,10). En el ultimo caso el anillo se puede fusionar para dar una naftoquinona (6,7,10) o una 4,7bencimidazolediona (8) (Pathak, supra), y los grupos carbonilo se pueden convertir a una oxima (9,10). El enlace doble se puede conjugar a un enlace doble de heteroatomo -heteroatomo, tal como una sulfona (11), un
10 sulfoxido (12), un sulfonato o una sulfonamida (13), un fosfonato o fosfonamida (14). Finalmente, el enlace doble se puede conjugar a un sistema aromatico deficiente en electrones, tal como un ion de 4-vinilpiridinio (15). Se pueden usar enlaces triples en conjugacion con enlaces multiples basados en carbonilo o heteroatomo (16,17,18,19,20). Se debe resaltar que las estructuras 1-20 constituyen ejemplos para el polimero P, los cuales pueden, en otro
15 orden, reaccionar con el enlazador de la presente invencion en una reaccion de adicion conjugada a la forma de los componente del precursor de la presente invencion, y de otra forma reticular por una reaccion de adicion conjugada o un mecanismo de reaccion radical a la forma de un biomaterial de la presente invencion.
Las estructuras tales como 1 y 2 se basan en la conjugacion de un enlace doble de carbono-carbono, con uno o mas grupos de retiro de electrones. Uno de ellos siempre es un carbonilo, incrementando la reactividad que pasa de una amida a un ester, y despues a una estructura de fenona. La adicion nucleofila es mas facil despues de la disminucion del impedimento esterico, o del incremento de la potencia de retiro de electrones en la posicion alfa: CH3<H<C00W<CN. La reactividad mas alta que se obtiene mediante el uso de las dos ultimas estructuras se puede modular por medio de variar el volumen de los sustituyentes en la posicion beta, en donde tiene lugar el ataque nucleofilo; la reactividad disminuye en el orden de P<W<Ph<H. De manera que la posicion de p tambien se puede usar para sintonizar la reactividad hacia los nucleofilos. Esta familia incluye algunos compuestos para los cuales se conoce mucho sobre su toxicologia y uso en la medicina. Por ejemplo, los polimeros solubles en agua con acrilatos y metacrilatos en sus terminos se polimerizan (mediante mecanismos de radicales libres) in vivo, en selladores de hidrogel y cementos de huesos, respectivamente. De esta manera, se han visto polimeros que contienen acrilato y metacrilato en el cuerpo antes en productos quimicos, pero para usarse con un esquema de reaccion quimica dramaticamente diferente. Las estructuras 3-10 exhiben muy alta reactividad hacia los nucleofilos, debido tanto a la configuracion cis del enlace doble, como a la presencia de dos grupos de retiro de electrones. Las cetonas insaturadas reaccionan mas rapido que las amidas o las imidas, debido a la electronegatividad mas fuerte de estos grupos carbonilo. De manera que los derivados de ciclopentendiona reaccionan mas rapido que los maleimidicos (3), y las para-quinonas reaccionan mas rapido que las hidrazidas maleicas (4) y tambien mas rapido que las ciclohexanonas, debido a la conjugacion mas extendida. La reactividad mas elevada la muestran las naftoquinonas (7). p1 se puede colocar en posiciones en donde este no reduzca la reactividad del grupo insaturado, esto es, en la parte opuesta del anillo (3,5), en otro anillo (7,8) o enlazado a 0 a traves de una mono-oxima de para-quinona (9,10). p1 tambien se puede enlazar al enlace doble reactivo (6,8), si se va a disminuir la velocidad de adicion nucleofila. La activacion de enlaces dobles a la adicion nucleofila se puede obtener tambien por medio del uso de grupos de retiro de electrones basados en heteroatomos. De hecho, los analogos de cetonas (11,12), esteres y amidas (13,14) que contienen heteroatomos, proporcionan un comportamiento electronico similar. Las estructuras 13 y 14 tambien se pueden usar como grupos facilmente hidrolizables, que puedan promover una degradacion rapida del gel. La reactividad hacia la adicion nucleofila se incrementa con la electronegatividad del grupo, que es en el orden de 11> 12> 13> 14, y se mejora por medio del enlace con un anillo aromatico. Tambien se puede obtener una activacion fuerte de los enlaces dobles, usando grupos de retiro de electrones basados en anillos aromaticos. Cualquier estructura aromatica que contenga un cation parecido a piridinio (por ejemplo, derivados de quinolina, imidazol, pirazina, pirimidina, piridazina, y compuestos similares que contengan sp2-nitrogeno) polariza fuertemente el enlace doble, y hace posibles las adiciones tipo Michael rapidas. Los enlaces triples de carbono-carbono, conjugados con grupos de retiro de electrones basados en carbono o heteroatomo, pueden reaccionar facilmente con nucleofilos de azufre, para dar productos de la adicion simple y doble. La reactividad se ve influenciada por los sustituyentes, como para los compuestos analogos que contienen doble enlace. La formacion de agregados ordenados (liposomas, micelas) o la separacion de fase simple en ambiente de agua, incrementa la concentracion local de grupos insaturados, y en consecuencia la velocidad de la reaccion. En este caso, lo ultimo depende tambien del coeficiente de separacion de los nucleofilos, que se incrementa para las moleculas con caracter lipofilo mejorado.
Nucle6filos
Los nucleofilos que son utiles son aquellos que son reactivos hacia grupos conjugados insaturados por medio de reacciones por adicion. La reactividad del nucleofilo depende de la identidad del grupo insaturado, como se describe con mayor detalle en otro lugar en la presente, pero la identidad del grupo insaturado primero esta limitada por su reaccion con agua a un pH fisiologico. De esta manera, los nucleofilos utiles generalmente seran mas nucleofilos que el H20 a un pH fisiologico. Los nucleofilos preferidos seran los que se encuentran comunmente en los sistemas biologicos, por razones de toxicologia, pero unos que no se encuentren comunmente libres en los sistemas biologicos afuera de las celulas. De esta manera, aunque pueden haber ejemplos en los cuales se puedan emplear aminas como nucleofilos efectivos, el nucleofilo mas preferido es el tiol. Los tioles estan presentes en los sistemas biologicos afuera de las celulas en forma de pares, como enlaces de bisulfuro. Cuando se desea el grado mas elevado de auto-selectividad (por ejemplo, cuando se incorpora una proteina terapeutica, cuando la reaccion de gelacion se conduce en la presencia de tejido y no es deseable la modificacion quimica de ese tejido), entonces un tiol representara el nucleofilo fuerte de eleccion. Existen otras situaciones, sin embargo, cuando pudiera no ser necesario el nivel mas elevado de autoselectividad. Estas incluirian situaciones cuando no esta incorporada ninguna proteina terapeutica, y cuando la reaccion de gelacion se conduce in situ, pero cuando el enlace quimico al tejido es ya sea deseable o sea indeseable. En estos casos, una amina puede servir como un nucleofilo adecuado. Aqui, se pone atencion particular al pH, en el sentido de que la amina desprotonada es un nucleofilo mucho mas fuerte que la amina protonada. De esta manera, por ejemplo, la amina alfa en un aminoacido tipico (pK tan bajo como 8.8 para la asparagina, promedio de 9.0 para todos los 20 aminoacidos comunes, excepto la prolina) tiene un pK mucho mas bajo que la amina epsilon de cadena lateral de la lisina (pK de 10.80). En si, si se pone atencion particular al pK de una amina que se use como el nucleofilo fuerte, se puede obtener una auto-selectividad sustancial. Las proteinas tienen unicamente una amina alfa (en el termino N). Mediante la seleccion de una amina con un pK bajo, y entonces la formular la solucion precursora final de tal manera que el pK este cerca de ese pK, uno puede favorecer la reaccion de la insaturacion proporcionada con la amina proporcionada, en lugar de otras aminas presentes en el sistema. En casos en donde no se desea ninguna auto-selectividad, uno necesita poner atencion al pK de la amina usada como el nucleofilo, sin embargo, para obtener velocidades de reaccion que sean aceptablemente rapidas, uno debe ajustar el pH de la solucion precursora final, de tal manera que se desprotonen un numero adecuado de esta aminas. En resumen, los tioles son el nucleofilo fuerte preferido apropiado en esta invencion, por razones del pH en la solucion precursora, y la maxima auto-selectividad, pero existen situaciones en las que las aminas tambien serviran como nucleofilos fuertes utiles; la utilidad de los nucleofilos particulares depende de la situacion contemplada y de la cantidad de auto-selectividad deseada. El concepto de grupo nucleofilo es extendido en la presente, de tal manera que el termino se usa algunas veces para incluir no solamente los grupos funcionales mismos (por ejemplo, tiol o amina), pero tambien moleculas que contienen el grupo funcional (por ejemplo, residuo de cisteina o cistilo, o residuo de lisina o lisilo). Los grupos nucleofilos pueden estar contenidos en moleculas con gran flexibilidad en su estructura global. Por ejemplo, se puede presentar un nucleofilo difuncional en la forma de Nuc-p1-Nuc, en donde p1 se usa en el sentido descrito en la presente, y Nuc se refiere al nucleofilo. De la misma manera, un polimero ramificado p1 se puede derivar con un numero de nucleofilos para crear p1-(Nuc)i, donde i=2 seria util. Nuc no se necesita desplegar en los terminos de cadena de p1, por ejemplo, se puede contemplar una estructura de repeticion: (p1Nuc)i, en donde i=2 seria util. Claramente, no todos de los p1 o de Nuc en esa estructura no necesitan ser identicos. Solamente es necesario que un precursor nucleofilo contenga mas que o igual a dos de esos grupos Nuc. De la misma manera, se pueden formar estructuras similares de p1 y los grupos conjugados insaturados descritos en detalle anteriormente. Unicamente es necesario que un precursor conjugado insaturado contenga mas que igual a dos de esos grupos conjugados insaturados. Se debe notar y entender que no es necesario que ambos componentes precursores, por ejemplo, tanto el componente precursor nucleofilo como el componente precursor conjugado insaturado, sean de hecho polimericos en el sentido usual de la palabra. Unicamente importa la funcionalidad. En la practica, esto es conveniente si cuando menos un componente es polimerico en el sentido usual de la palabra, pero esto no es absolutamente necesario. Por ejemplo, resultan materiales utiles de la reaccion de un triacrilato de PEG con dicisteina, y de la misma manera, resultan materiales utiles de la reaccion de un tritiol de PEG y un diacrilato de peso molecular bajo. Finalmente, tambien resultan materiales utiles para algunas aplicaciones, por la reaccion de una dicisteina y un diacrilato de peso molecular bajo. En la practica, es conveniente y util que uno o mas de los componentes precursores sea polimerico en el sentido usual de la palabra. En estos casos, p1 pueden ser polimeros hidrofilos sinteticos, liquidos polimericos hidrofobos sinteticos, polimeros hidrofobicos sinteticos que sean solubles en solventes de toxicidad aceptable o influencia biologica para la aplicacion contemplada, proteinas o peptidos bio-sinteticos, proteinas naturalmente ocurrentes o proteinas procesadas naturalmente ocurrentes, o polisacaridos.
polimeros Hidr6filos
En las modalidades preferidas, el polimero sintetico p1 puede ser poli(etilenglicol), oxido de poli(etileno), alcohol poli(vinilico), alcohol poli(etilen-co-vinilico), acido poli(acrilico), acido poli(etilen-co-acrilico), poli(etil-oxazolina), poli(vinilpirrolidona), poli(etilen-co-vinil-pirrolidona), acido poli(maleico), acido poli(etilen-co-maleico), poli (acrilamida), o copolimeros de bloque de oxido de poli(etileno)-oxido de co-poli(propileno). Esta no es una lista detallada puesto que tambien se pueden usar otros polimeros hidrofilos. p1 tambien pueden ser copolimeros, copolimeros de bloque, copolimeros de injerto, o copolimeros aleatorios. Los bloques, que se polimerizan en los extremos de los polimeros hidrofilos, pueden estar compuestos de, por ejemplo, acido lactico, acido glicolico, epsilon -caprolactona, oligomeros de acido lacti-co-glicolico, carbonato de trimetileno, anhidridos, y aminoacidos, por ejemplo, para conferir degradabilidad por medios hidroliticos o enzimaticos. Esta lista no es detallada; tambien se pueden usar otros oligomeros para los copolimeros de bloque. Los copolimeros aleatorios se pueden basar en alcohol vinilico, tal como alcohol poli(N-vinilpirrolidon-covinilico) o alcohol poli(etilen-co-vinilico), con diferentes composiciones, se pueden derivar con grupos conjugados insaturados, tales como acrilatos, benzoquinonas, naftoquinonas y otros. Los copolimeros de alcohol vinilico se pueden funcionalizar con grupos (CH2)nC00H, mediante la reaccion con acidos w-bromocarboxilicos. Los polimeros resultantes o copolimeros de acido acrilico o metacrilico se pueden usar para la union de los grupos quinona. La composicion de co-monomeros y el grado de funcionalizacion no tienen influencia dramatica en las velocidades de reaccion, a menos que estos determinen la solubilidad o la transicion de fase. Por otra parte, estos determinan las propiedades mecanicas finales. Se debe notar que un componente p hasta puede ser un solido, tal como una particula coloidal ya sea con nucleofilos o sitios de insaturacion conjugada sobre esta.
proteinas y proteinas bio-sinteticas
p puede ser una proteina. La proteina puede ser una proteina naturalmente ocurrente o recombinante. En terminos generales, las proteinas recombinantes son material de aminoacidos de cualquier longitud, generado a traves de tecnologia de ADN recombinante. Los ejemplos de los componentes que estos pueden tener incluyen secuencias de peptidos que codifican los sitios de degradacion para las proteasas, secuencias de peptidos para otras serales biologicas y secuencias no bio-interactivas. Tambien puede ser p1 cualquier proteina naturalmente ocurrente. Mas especificamente, una proteina naturalmente ocurrente esta compuesta de muchos p1s que estan separados por nucleofilos. Por ejemplo, albumina de suero, una proteina de 584 aminoacidos, contiene 5.7 por ciento de cisteina, 9.9 por ciento de lisina, y 3.1 por ciento de tirosina. Las secuencias de aminoacidos que ocurren entre, por ejemplo, cisteina, tirosina y lisina, conforman distintos p1 s. Aunque la albumina en su estado natural puede ser menos que util para los propositos de reticulacion mediante reacciones por adicion de conjugados entre insaturaciones conjugadas y tioles en la proteina, la albumina se puede procesar rapidamente mediante reduccion, con el proposito de formar un poli(aminoacido) con algunos o todos sus residuos de cisteina libres, o esta se puede derivar quimicamente para introducir multiples grupos tiol.
peptidos
En algunos casos, p1 puede ser un peptido o un polipeptido, en donde el nucleofilo es la cisteina de aminoacido, que da como resultado los peptidos de estructuras similares a H2N-CXXXXXCXXXXXC-C00H (SEQ ID N0: 4) o H2N-CXXXXXC-C00H (SEQ ID N0: 5), en donde es la representacion de una letra de la cisteina, y X representa cualquier aminoacido excepto cisteina, en una modalidad, o Acetil-NH-YXXXXXYXXXXXY-C00H (SEQ ID N0: 6), en donde Y es la representacion de una letra de la tirosina, y X representa cualquier aminoacido excepto cisteina o tirosina, en otra modalidad. La longitud de XXXXX (SEQ ID N0: 7) o el numero de X (por ejemplo, Xn) puede ser de cualquier longitud o numero (n=0). Es particularmente util cuando las secuencias en los dominios que se muestran como XXXXX anteriormente, son sustratos para las enzimas que estan envueltas en la migracion de celulas (por ejemplo, como sustratos para enzimas tales como colagenasa, plasmina, o elastasa), aunque no se deben limitar los dominios a estos. En los ejemplos se describe una de esas secuencias particularmente util, como un sustrato para la enzima plasmina. Se puede aprender una diversidad de esos peptidos por un estudio de la literatura de estas enzimas. Por ejemplo, ese estudio muestra sitios de sustrato para la importante plasmina de proteasa (Tabla 1; SEQ ID N0S: 8-24):
Tabla 1. Sitios de Sustrato de plasmina que se encontraron en el Fibrin(6geno) (Fg)**
Sitios de Arginilo
P3
P2 P1 P1= P2= P3= Cadena y sitio Fg Referencia
G
P R+ V* V* E- Q 19 3
N
N
R+ D- N T Q 104 2.4
Y
N R+ V* S E- Q 110 2
Q
M* R+ M* E- L* Q 239 1
G
F* R+ H+ R+ H+ Q 491 5
G
Y R+ A* R+ P 42 2.3
Sitios de Lisilo
Y
Q K+ N N K+ Q 78 3
L*
I* K+ M* K+ P Q 206 1.2
N
F* K+ S Q L* Q 219 1
E-
W K+ A* L* T Q 230 1
S
Y K+ M* A* D Q 583 5
T
Q K+ K+ V* E � 53 3
R+
Q K+ Q V* K+ � 130 2
Q
V* K+ D- N E � 133 4
L*
I* K+ A* I* Q V 62 4
T
L* K+ S R+ K+ V 85 2.3
S
R+ K+ M* L* E- V 88 2
Ref. 1: Takagi T. y R.F. Doolittle, Biochemistry 14:5149, 1975; Ref. 2: Hantgan R.R., y colaboradores, Hemostasis and Thrombosis: Basic Principles and Clinical Practice, Tercera Edicion. Editado por R.W. Colman y
5 colaboradores, J.B. Lippincott Company; Philadelphia, 1994; Ref. 3: Takagi T. y R.F. Doolittle, supra; Ref. 4: Nomura S., y colaboradores, Electrophoresis 14:1318-1321, 1993; Ref. 5: Stander L, y colaboradores, Biochemical and Biophysical Research Communications 215:896-902 (1995).
* Indica un aminoacido hidrofobo: +/- indica una cadena lateral cargada, ya sea cationica (+) o anionica (-).
10 ** Codigo de aminoacido de una sola letra: A, alanina; C, cisteina; D, acido aspartico; E, acido glutamico; F, fenilalanina; G, glicina; H, histidina; I, isoleucina; K, lisina; M, metionina; N, asparagina; P, prolina; Q, glutamina; R, arginina; S, serina; T, treonina; V, valina; W, triptofano; Y, tirosina.
Dado que la plasmina es una enzima importante en la migracion de celulas y remodelacion de tejidos/coagulos,
15 estos sustratos o partes de estos sustratos representan secuencias utiles adentro de los sitios indicados anteriormente como XXXXX en p1 . De la misma manera, la colagenasa es una enzima importante en la migracion de celulas y la remodelacion de tejidos. Un estudio de la literatura sobre la colagenasa indica tambien una diversidad de sitios de sustrato, que representan identidades utiles para XXXXX en p1 (Tabla 2; SEQ ID N0S: 25-31):
Tabla 2. Sitios de Sustrato de Colagenasa que se encontraron en el Colageno
P3
P2 P1 P1= P2= P3= Tipo y sitio de Colageno Ref.
P
Q G I* A* G Becerro y pollo Q 1 (I): cartilago humano Q 1 (II) 6
P
Q G L* L* G Becerro Q 2 (I) 6
P
Q G I* L* G Pollo Q 2 (I) 6
P
Q G L* A* G Pollo Q 2 (I): piel humana Q 1 (III) 6
P
L* G I* A* G Higado humano Q 1 (III) 6
P
L* G L* W A* Humano 7
P
L* G L* A* G Humano 8
Ref. 6: Netzel-Arnett S., y colaboradores, The Journal of Biological Chemistry 266:6747-6755, 1991; Ref. 7: Upadhye S. y V.S. Ananthanarayanan, Biochemical and Biophysical Research Communications 215:474-482, 1995; Ref. 8: Liko Z., y colaboradores, Biochem Biophys Res Commun 227:351-35, 1996.
El uso de los sitios de degradacion de enzimas adentro de p1, ya sea en el componente precursor de nucleofilo (mas facilmente, puesto que se puede usar la cisteina en la secuencia para proporcionar un tiol como un nucleofilo), o como el componente precursor conjugado insaturado, es que la velocidad de resorcion o remodelacion del biomaterial puede estar ligada a la velocidad y el progreso de la curacion, por ejemplo, como
10 se indica por la infiltracion celular. Es particularmente poderoso notar que la velocidad de la resorcion del biomaterial se puede modular por medio de ajustes a la secuencia de oligopeptidos, con el proposito de alterar el Km y el kcat del sitio de sustrato. Por ejemplo, un estudio de la literatura sobre la enzimologia de los sitios de sustrato de la colagenasa muestra que es posible ajustar la velocidad de degradacion de los sustratos por medio del disero de la secuencia de los
15 sustratos (Tabla 3: SEQ ID N0S: 32-38):
Tabla 3. Disefo de Secuencias de peptidos Sensibles a la Colagenasa (Matriz metaloproteinasa I)
No.
Secuencia Kcat/Km relativos a aquellos de PQGIAG
1
GPQGIAGQ 100% (normal)
2
GPVGIAGQ 30% (lento)
3
GPQGVAGQ 9% (mas lento)
4
GPQGRAGQ <5% (muy lento)
5
GPQGIASQ 130% (rapido)
6
GPQGIFGQ >300% (mas rapido)
7
GPQGIWGQ >700% (muy rapido)
20 Netzel-Arnett S., y colaboradores, The Journal of Biological Chemistry 266:6747-6755, 1991.
Aceleradores
Se hace referencia a los nucleofilos que reaccionan de manera deficiente como teniendo una vida media de
25 pseudo primer orden de mas de aproximadamente 15 minutos (con el grupo conjugado insaturado presente en exceso; las reacciones mas lentas pueden ser utiles en algunas circunstancias medicas), a un pH generalmente definido como un pH de mas de 5 y menos de 9, y a una temperatura mayor que 25°C y menor que 40°C. Se hace referencia a los iniciadores de radicales como moleculas organicas o solubles en agua que experimentan la escision espontanea homolitica, termica o foto-quimicamente iniciada, de los enlaces de carbono
30 heteroatomo o heteroatomo-heteroatomo, para producir radicales basados en carbono o heteroatomo. Se debe entender que el uso de esos iniciadores de radicales como aceleradores, aunque no se prefiere, es superior a la polimerizacion, en el sentido de que la concentracion de radicales libres que se emplea puede ser mucho mas baja. La velocidad de adicion de nucleofilos que reaccionan deficientemente a los grupos conjugados insaturados se puede mejorar mediante la presencia de sustancias aceleradoras; estas pueden ser iniciadores
de radicales, foto-sensibilizadores; (solos o en combinacion con iniciadores de radicales; Pathak, supra), acidos Lewis de bajo peso molecular (Pathak, supra), catalizadores de estado solido caracterizados por la acidez Lewis, o por la presencia de iones de amonio cuaternario, tales como una resina de Amberlyst (Pathak, supra),
o receptores de enlace de hidrogeno, basados en urea N,N-disustituida o estructuras peptidicas (Pathak, supra). En el ultimo caso, el mecanismo de aceleracion se basa en la estabilizacion mediante el enlace de hidrogeno del estado de transicion parecido a enolato, despues del ataque del nucleofilo en la olefina conjugada; con este proposito se pueden usar anti-cuerpos hechos a la medida (Pathak, supra). En un experimento tipico se mezcla rapidamente una solucion concentrada (tipicamente mayor que o igual al 10 por ciento en peso/peso, pero simplemente a una concentracion suficientemente alta para conseguir el comportamiento deseado) de un derivado de p1 que contiene un numero de grupos conjugados insaturados mayor que uno por residuo de p1, con una solucion concentrada (>10 por ciento, pero simplemente a una concentracion suficientemente alta para conseguir el comportamiento deseado) de un compuesto que contiene un tiol o amino adecuado (especialmente tioles, en aplicaciones en donde pudiera no requerirse el grado mas alto de auto-selectividad), con un numero de especies nucleofilas mayor que dos. Se puede introducir una especie aceleradora en cantidades cataliticas (<1-2 por ciento en peso/peso) durante la etapa de mezclado. Se pueden usar temperaturas mas elevadas (hasta de 60°C) durante un tiempo mas corto, despues de mezclar para activar la reaccion de reticulacion. Para situaciones cuando se va a inyectar el material dentro del cuerpo, y despues se va a permitir que reaccione in situ para formar el biomaterial final, pudieran ser aceptables temperaturas de inyeccion de hasta aproximadamente 50°C.
III. Formacion de la red de polimeros
La formacion de la red de polimeros aplicable en la presente invencion se divulga en W0 00/44808 y se describe a continuacion.
Funcionalidad
Utilizando la terminologia de la ciencia de polimeros, los polimeros se pueden hacer mediante la reaccion de monomeros con una funcionalidad de 2. Las redes reticuladas de polimeros se pueden hacer si algunos o todos los monomeros tienen una funcionalidad mayor que 2. Las moleculas se describen en la presente como teniendo una funcionalidad mayor que o igual a 2 (monomeros y macromeros), las cuales se pueden hacer reaccionar juntas para formar una red reticulada, en donde la funcionalidad se define en terminos de reacciones por adicion. Como se usa en la presente, polimerizacion se refiere a la reaccion de monomeros o macromeros, algunos o todos de los cuales tienen una funcionalidad mayor que 2. El termino monomeros en la presente no esta limitado a moleculas pequeras, sino que tambien se puede referir a polimeros y bio-polimeros. Los monomeros descritos son de dos clases, que cuando se hacen reaccionar juntas forman un biomaterial lineal o reticulado. Se requiere que ambas clases de monomeros se mezclen juntas para que ocurra la reticulacion (inmediatamente a continuacion se describen diferentes planteamientos para mezclado). Una clase de monomero contiene 2 o mas grupos conjugados insaturados (por lo tanto, una funcionalidad de 2 o mas), de preferencia conjugados. La otra clase de monomero contiene 2 o mas nucleofilos (por lo tanto, una funcionalidad de 2 o mas), de preferencia nucleofilos que son nucleofilos mas fuertes que otros presentes como otros componentes del sistema, por ejemplo, tioles cuando se comparan con aminas que pueden estar presentes como componentes deseablemente no reactivos del sistema. Cuando se mezclan juntos monomeros precursores solubles en agua (a los que se hace referencia como la solucion precursora final), se forman geles o redes lineales o ramificados, y esas reacciones pueden proceder en agua a concentraciones de sal y pH fisiologicos o casi fisiologicos. No es necesario que los monomeros sean enteramente solubles en agua, y de hecho algunas veces es benefico que estos no sean solubles en agua. En esos casos, pudieran no obtenerse geles como el material final, sino mas bien materiales que se hinchan menos con agua, mas hidrofobicos. Estos pueden ser particularmente utiles en la aplicacion de farmacos hidrofobicos, y en la formacion de materiales con resistencia estructural sustancial. Unicamente es necesario que los dos componentes sean ya sea solubles uno en el otro, o cuando menos finamente dispersables uno en el otro, probablemente en la presencia de un agente emulsificante. De esta manera, los dos componentes pueden llegar a acercarse lo suficiente uno al otro para reaccionar, para formar el material lineal o reticulado. Tambien es posible trabajar con soluciones de monomeros formados en una solucion diferente al agua. Por ejemplo, se conoce el uso de N-metilpirrolidona (NMP) como un solvente en sistemas de biomaterial inyectables, y en si es posible, cuando uno desea trabajar con los componentes precursores en solucion, pero con componentes precursores que no sean libremente solubles en agua, para emplear ciertos solventes organicos que sean aceptables para usarse con el material biologico sensible bajo consideracion. Cuando se esta incorporando un farmaco en el laboratorio o en una linea de fabricacion, entonces existe gran flexibilidad en la seleccion de este solvente organico, puesto que cuando menos se removera la mayoria de este antes de que se proporcione el implante al sujeto. Cuando se esta formando un material en la piel, entonces tambien existe mucha de la flexibilidad, debido a la baja toxicidad a la piel de muchos solventes organicos, incluyendo NMP, acetona, etanol, isopropanol, y acetato de etilo. Cuando se esta formando un material en el cuerpo, entonces la lista de solventes aceptables es considerablemente mas pequera, y esta dominada por las preocupaciones de toxicidad. En esos casos, la NMP es un solvente organico particularmente
favorable. La toxicidad del sistema de solventes tambien se puede modular mediante el empleo de un sistema de solventes mezclados, que comprenda el solvente organico y agua, para reducir la concentracion global de solvente organico, pero que todavia proporcione buena solubilidad o dispersabilidad en el sistema de solventes mezclados. El mezclado para formar la solucion precursora final puede ocurrir mediante muchos medios. Mas directamente, una solucion contiene el componente precursor nucleofilo, y una solucion contiene el componente precursor conjugado insaturado. Estos dos componentes se formulan en solvente y sistemas reguladores del pH, de tal manera que el pH y las concentraciones obtenidas despues del mezclado sean apropiados para la reaccion quimica que procedera. Ese mezclado pudiera ocurrir en un mezclador estatico a la funcion de dos jeringas, por ejemplo. Se pueden visualizar otros planteamientos de mezclado. Por ejemplo, el mezclado puede ocurrir entre particulas finas de cada una de las dos soluciones precursoras en un rocio de aire. Una solucion se puede preparar a partir de ambos componentes precursores, pero a un pH, por ejemplo, tal que la reaccion no proceda, o proceda unicamente de manera lenta. Despues de la colocacion de la solucion precursora mezclada previamente, se puede ajustar el pH (por ejemplo, mediante el cambio de temperatura, o mezclando con acido
o base, o mediante una reaccion quimica para crear un acido o base, o la difusion de un acido o base), para dar como resultado una condicion final en la solucion precursora final, que sea apropiada para que proceda la reaccion quimica. 0tro planteamiento puede ser preparar la solucion precursora final a una temperatura tal que la reaccion no proceda o proceda unicamente de manera muy lenta, ya sea relacionada con la energia de activacion de la reaccion, o con un regulador del pH con caracteristicas sensibles a la temperatura, o ambos. Despues del calentamiento o enfriamiento (mas utilmente el calentamiento) a la temperatura de aplicacion final (por ejemplo, a la temperatura corporal despues de la inyeccion), las condiciones en la solucion precursora final seran apropiadas para que proceda la reaccion quimica.
Aplicaciones medicas
Puesto que los biomateriales son utiles como implantes o dispositivos medicos, o para la aplicacion de farmacos en humanos, el sistema de moleculas que se use en la solucion precursora debe satisfacer ciertos criterios. Estos incluyen:
1.
La velocidad de la reaccion tipo Michael debe ocurrir durante un periodo de tiempo clinicamente relevante, a una temperatura y pH clinicamente relevantes. Generalmente, es deseable la gelacion durante un periodo de menos de aproximadamente 15 minutos, a un pH generalmente de mas de 7 y de menos de 9, y a una temperatura mayor de 25 y menor de 40°C.
2.
La reaccion debe ser suficientemente auto-selectiva, con consideraciones de auto-selectividad que incluyan las siguientes. Para la formacion de geles en la presencia de farmacos que contengan aminas, o en donde es indeseable la reaccion con componentes celulares y tejidos, la insaturacion conjugada debe reaccionar muy lentamente con las aminas al pH de aplicacion de la solucion precursora final. De preferencia, se desea una velocidad de reactividad de la insaturacion conjugada para el nucleofilo de reactividad intencional a la amina, en este caso el nucleofilo de reactividad no intencional o indeseable, en exceso de diez y mas, de preferencia aun mas alta. Tipicamente, el planteamiento de la adicion tipo Michael entre insaturaciones conjugadas y tioles no sera util para farmacos que contengan ellos mismos insaturaciones de conjugados o tioles. Las excepciones incluyen casos cuando la reactividad del grupo sobre el farmaco es considerablemente menor que la reactividad sobre el grupo correspondiente en el precursor del biomaterial, y casos cuando esas reacciones no son darinas, por ejemplo, cuando el injerto a la red del biomaterial no es darina.
3.
Los reactivos deberan ser estables en el agua, cuando las soluciones precursoras se preparen en agua. Se define estable como haciendo reaccion lentamente, definiendose lentamente como suficientemente lento como para permitir la reaccion entre los dos componentes para proceder y todavia dar como resultado la formacion del biomaterial deseado.
4.
La reaccion de adicion en la solucion precursora final no debera ser exotermica hasta el punto de provocar daro al tejido, rompimiento del farmaco u otros resultados darinos al material biologico bajo consideracion. La temperatura de la solucion gelante generalmente no se debera elevar por arriba de los 60°C durante la gelacion, y de preferencia son preferentes temperaturas de reaccion maximas aun mas frias.
5.
Los componentes de la solucion precursora no deberan ser toxicos a concentraciones que disuelven la solucion precursora final a medida que se aplica, definiendose la palabra toxico como lo que induce una reaccion medicamente inaceptable del tejido en un contexto medicamente relevante.
Los criterios que se definen anteriormente en esta seccion limitan la identidad de las moleculas que pudieran ser utiles en la solucion precursora, por medio de limitar la identidad del grupo quimico que se usa para la reticulacion.
Bio-funcionalidad adicional
Un fuerte beneficio del uso de las reacciones de adicion que se describen en la presente, es que se pueden incorporar otros grupos bio-funcionales bio-activos dentro del biomaterial, por ejemplo, para proporcionar sitios para la enlace de receptores promotores de la adhesion sobre la superficie de la celula o sitios para la enlace
5 del factor del crecimiento.
Peptidos de adhesion
Se ha identificado una variedad de peptidos promotores de la adhesion como si fueran los dominios activos de
10 las proteinas promotoras de la adhesion tal como la fibronectina, vitronectina, laminina, colageno, el factor de von Willebrand, osteonectina, y asi por el estilo. Estos peptidos se pueden incorporar facilmente dentro del biomaterial, cuando se diseran con un nucleofilo fuerte en la cadena de peptidos, tal como la cisteina. En los ejemplos se demuestra este ejemplo. A continuacion se muestra una lista parcial de los peptidos que serian de interes (Tabla 4: SEQ ID N0S:39-49):
Tabla 4: Secuencias del Dominio de enlace Celular de las proteinas de Matriz Extra-Celular
proteina
Secuencia papel
Fibronectina
RGDS Adhesion de la mayoria de las celulas, por medio de Q5 1
LDV
Adhesion
REDV
Adhesion
Vitronectina
RGDV Adhesion de la mayoria de las celulas, por medio de Qv 1
Laminina A
LRGDN Adhesion
IKVAV
Extension de neurita
Laminina B1
YIGSR Adhesion de muchas celulas, por medio del receptor de laminina 67 kD
PDSGR
Adhesion
Laminina B2
RNIAEIIKDA Extension de neurita
Colageno I
RGDT Adhesion de la mayoria de las celulas
DGEA
Adhesion de plaquetas, otras celulas
Trombospondina
RGD Adhesion de la mayoria de las celulas
VTXG
Adhesion de plaquetas
Segun Yamada, Y., y Kleinman, H.K., Curr. 0pin. Cell Biol 4:S19,1992.
20 Estos peptidos son potencialmente utiles para el control de una diversidad de reacciones celulares, tal como la union de celulas, la migracion y el crecimiento excesivo sobre un superficie del material (especialmente cuando el material no es degradable o se degrada lentamente), la migracion celular a traves de un material (esencialmente cuando el material es mas facilmente degradable mediante la incorporacion de los sustratos de
25 proteasa dentro de uno de los dos componentes precursores), y la induccion de fenotipos celulares particulares (por ejemplo, el estimulo a un macrofago para liberar los factores de crecimiento beneficos, pero no para formar las celulas gigantes de un cuerpo extraro). Los peptidos que se muestran en la Tabla 5 (SEQ ID N0S: 50-57) se fijan a los receptores superficiales de la celula que son glico-proteinas. Existen otras de estas secuencias de peptidos que se fijan a los proteoglicanos que contienen sulfato de heparina y sulfato de condroitina de la
30 superficie de la celula, que se llaman peptidos fijadores de heparina familiar. Estos tambien se pueden incorporar para conferir adhesion celular por medio de la enlace a estos componentes de la superficie de la celula.
Tabla 5: Secuencias del Dominio de enlace del proteoglicano de las proteinas de Matriz Extra-celular
proteina
Secuencia*
xBBxBx *
Secuencia de consenso
PRRARV
Fibronectina
YEKPGSPPREVVPRPRPGV
Fibronectina
RPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGR
Vitronectina
RIQNLLKITNLRIKFVK
Laminina
K(�A)FAKLAARLYRKA
Anti-trombina III
KHKGRDVILKKDVR
Molecula de adhesion de la celula neuronal
YKKIIKKL
Factor 4 de la plaqueta
Las referencias para las primeras cinco entradas se dan en Massia, S.P., y Hubbell, J.A., J. Biol. Chem. 267:10133-10141, 1992; la secuencia de la anti-trombina III de Tyler-Cross, R. y colaboradores, Protein Sci. 3:620-627, 1994; la secuencia de la molecula de adhesion de la celula neuronal de Kallapur, S.G., y Akeson, R.A., J. Neurosci. Res. 33:538-548, 1992; secuencia del factor 4 de la plaqueta de Zucker, M.B., I.R., Proc. Soc. Biol. Med. 198, 693-702, 1991. *x indica un aminoacido hidrofobo. Los aminoacidos basicos se muestran subrayados.
Se debera notar que el metodo practico para la incorporacion del peptido de adhesion mediante el metodo descrito es mucho mas sencillo que el estado de la tecnica (Pathak, supra). Mediante ese metodo, como se usa en la tecnica anterior (tomando el ejemplo de la formacion de un Peptido-PEG-Acrilato), se debe sintetizar un PEG hetero-bifuncional, con un ester activado en un extremo y un acrilato en el otro extremo. Esto se debera injertar en el peptido, y purificarse. Este agente es util entonces ya sea para la incorporacion mediante el metodo aqui descrito o mediante la polimerizacion de los grupos extremos de acrilato, por ejemplo, en un diacrilato de PEG como lo enseran Hubbell y colaboradores. En contraste, el presente metodo de incorporacion es mucho mas sencillo. El nucleofilo (por ejemplo, cisteina con un tiol libre) que contiene el peptido, simplemente se mezcla con el diacrilato de PEG (o la estructura no saturada del conjugado de PEG multifuncional), se permite que haga reaccion durante un periodo corto de tiempo, y despues se agrega el resto de un multi-nucleofilo diferente o se foto-polimeriza el sistema. No existe una sintesis de un agente heterobifuncional, y no hay purificacion despues del acoplamiento. Esto es posible debido a la auto-selectividad del sistema.
Peptidos de enlace del Factor de Crecimiento
Un segundo tipo de bio-funcionalidad que es util en los biomateriales, son las estructuras que fijan los factores de crecimiento. Estas se pueden usar en la administracion y liberacion controlada de los factores de crecimiento. Se puede encontrar un ejemplo excelente para los factores de crecimiento fijadores de heparina, los cuales incluyen FGFa, FGFb, VEGF, TGF �, y BMP. Es correcto incorporar los peptidos que fijan la heparina (como se describe anteriormente, y mas adelante). Se puede agregar la heparina a esta mezcla, junto con el factor de crecimiento. Debido a la auto-selectividad del sistema, no se esperaria que ocurriera la reaccion quimica con la heparina y el factor de crecimiento. De este modo, si se mezclara un peptido fijador de heparina que contiene un solo tiol libre en un residuo de cisteina con la heparina y un factor de crecimiento fijador de heparina, y si se mezclara estos componentes con, por ejemplo, un triacrilato de PEG, y si esto se mezclara con un peptido de sustrato de proteasa con dos tioles mediante la incorporacion de dos residuos de cisteina (cada uno en ambos lados del dominio del sustrato), el resultado seria el siguiente biomaterial bio-mimetico: el biomaterial seria biodegradable mediante las proteasas asociadas con la celula, y el factor de crecimiento estaria fijo dentro del biomaterial mediante la enlace no covalente a la heparina, la cual a su vez esta fija de manera no covalente al peptido fijador de heparina, el cual, a su vez, se fija de manera covalente al biomaterial de hidrogel. De manera alternativa, uno podria funcionalizar la heparina directamente de manera que contenga un solo nucleofilo fuerte y que se fije quimicamente de manera directa dentro de la red del polimero. 0tra manera relacionada para secuestrar los factores de crecimiento fijadores de heparina seria mas directa mediante el uso de los mimicos incorporados de manera covalente (por ejemplo, peptidos con cadenas laterales cargadas negativamente) que fijan directamente los factores de crecimiento.
45 Sitios de enlace de Ion de Metal
Los sitios de afinidad a iones de metal, tales como cationes de metal divalentes, pueden tambien ser incorporados en biomateriales, como se describe en el Ejemplo 28, el cual constituye un ejemplo de acuerdo con la presente invencion. Sitios de enlace de metal ejemplares incluyen acidos iminodiaceticos y peptidos que contienen uno o mas residuos histidina contiguos o aglomerados. Estos sitios de enlace de ion de metal pueden ligar metales que entonces interactuan con proteinas de enlace de metal deseadas. Esta asociacion de las proteinas de enlace de metal con sitios de afinidad en biomateriales puede facilitar la encapsulacion y la retencion de proteinas de enlace de metal (v.gr., hormona del crecimiento humana) dentro de los biomateriales de la presente invencion. El sitio de enlace de ion de metal acoplado sirve como una ramificacion de enlace para ligar farmacos de proteina con esa afinidad de enlace de ion de metal.
Sitios de enlace de Carbohidratos
De manera similar, los grupos que ligan carbohidratos pueden incrementar la afinidad de los biomateriales a las glico-proteinas. Ejemplos de grupos que ligan carbohidratos incluyen fracciones acido boronico tales como acido fenilboronico (Ejemplo 28). De interes particular son las fracciones de acido fenilboronico que ligan residuos de carbohidratos al pH fisiologico, tales como las mostradas en el Ejemplo 28.
Liberaci6n controlada de compuestos farmaceuticamente activos ligados de manera covalente
De acuerdo con la presente invencion, se han desarrollado metodos y compuestos para la union covalente de compuestos farmaceuticamente activos a biomateriales y su liberacion subsecuente. Se han desarrollado enlazadores que tienen cualidades que facilitan el acoplamiento a biomateriales y de preferencia promueven la eventual liberacion del compuesto farmaceuticamente activo original, no modificado. Los biomateriales o compuestos precursores de biomateriales a que pueden unirse los compuestos farmaceuticamente activos son adecuados para colocacion en muchos sitios dentro del cuerpo de un animal. Los sistemas de la presente invencion son similares a los sistemas tipo IVb en los cuales se arade a un farmaco un grupo polimerizable por radicales libres, con polimerizacion por radicales libres subsecuente del farmaco solo o con otros co-monomeros para formar un material (Baker, supra y Duncan y colaboradores, supra). Sin embargo, los grupos de la presente invencion pueden ser polimerizados ya sea por reacciones de adicion conjugada o por polimerizacion por radicales libres. Como en otros sistemas tipo IVb, se usa una molecula enlazadora para conectar un farmaco a un grupo activo en un polimero. En contraste con las reacciones de sustitucion nucleofila usadas por otros para acoplar un farmaco a un polimero, los metodos de la presente invencion implican una reaccion de adicion conjugada entre un compuesto farmaceuticamente activo o un compuesto farmaceuticamente activo modificado y un grupo insaturado conjugado adicionadas a un polimero. Las reacciones de adicion conjugada, que han sido descritas antes, son un sub-conjunto de las reacciones de adicion nucleofila, y de esta manera son quimicamente distintas de la reaccion de sustitucion nucleofila usada por otros. En reacciones de adicion conjugada, no hay grupo que sale, como se requiere para las reacciones de sustitucion nucleofila, y un nucleofilo se arade mediante un enlace doble o triple. La alta auto-selectividad de las reacciones de adicion conjugada en comparacion con las reacciones de sustitucion nucleofila es ventajosa para la aplicacion de este metodo a la formacion in situ de biomateriales en presencia de moleculas biologicas sensibles. El proceso aqui descrito implica el acoplamiento de una molecula enlazadora a un alcohol o amina en el compuesto farmaceuticamente activo mediante un enlace ester o amida, donde la molecula enlazadora presenta entonces un grupo quimico util en reacciones de adicion conjugada. Despues del acoplamiento del compuesto farmaceuticamente activo a un polimero mediante una reaccion de adicion conjugada, un tioeter o una amina secundaria esta presente en la molecula enlazadora cerca del ester o amida carbonilo que une el enlazador al compuesto farmaceuticamente activo. La vida media a temperatura y pH fisiologico de este ester o amida es mucho mas larga que las vidas medias de muchos de los eslabones previamente descritos para entrega de farmacos a partir de biomateriales; sin embargo, la vida media de este enlace sera mas corta que la vida media de un ester completamente alifatico o amida debido al tioeter. Estas tasas de liberacion terapeuticamente relevantes son un importante aspecto de la invencion, pues la mayoria de los pro-farmacos que han sido previamente descritos han demostrado vidas medias en condiciones fisiologicas del orden de horas, mientras que muchos de los compuestos de la presente invencion tienen enlaces en la ramificacion farmaceuticamente activa o entre la ramificacion farmaceuticamente activa y el polimero que hidrolizan en cuestion de semanas o meses. Tal mejora puede permitir la incorporacion de mayores cantidades de compuesto farmaceuticamente activo dentro de los biomateriales, y puede alargar el tiempo durante el cual el biomaterial libera el compuesto farmaceuticamente activo. Los compuestos farmaceuticamente activos pueden contener una variedad de grupos quimicos, algunos de los cuales son nucleofilos y algunos de los cuales son electrofilos. En terminos de estabilidad de farmaco, los grupos altamente reactivos son tipicamente inpreferentes, y de esta manera rara vez se encuentran grupos altamente reactivos en los compuestos farmaceuticamente activos. Muchos ejemplos de compuestos farmaceuticamente activos pueden encontrarse que no contienen grupos nucleofilos distintos de los alcoholes. La reactividad de estos grupos alcohol es generalmente tan baja que el acoplamiento del compuesto farmaceuticamente activo a un material es un reto. Se requeririan largos tiempos de reaccion, y cualesquiera reacciones en competencia serian sumamente problematicas debido a que la purificacion de un complejo de
compuesto farmaceuticamente activo y polimero seria sumamente dificil. Las tecnicas de separacion que son comunmente usadas en quimica fueron desarrolladas para moleculas relativamente pequeras y no son muy efectivas con polimeros debido a su elevado peso molecular. La mayor pureza que puede obtenerse para una ramificacion farmaceuticamente activa acoplada a un enlazador en comparacion con un polimero acoplado a un enlazador es importante para el uso clinico de compuestos precursores o biomateriales hechos a partir de estos compuestos, pues las impurezas remanentes pueden ocasionar efectos secundarios inpreferentes en mamiferos. De esta manera, pueden lograrse diversas ventajas convirtiendo un solo alcohol en el compuesto farmaceuticamente activo a un tiol o amina usando un enlazador. En el caso de oligonucleotidos o peptidos, esto puede ser bastante simple, pues el grupo que contiene tiol puede ser facilmente aradido durante la sintesis de la molecula. En el caso de moleculas organicas, esto requiere de mas esfuerzo, pero es a menudo factible. Las modificaciones a la sintesis de un compuesto farmaceuticamente activo particular, especialmente uno que ya ha pasado aprobacion regulatoria gubernamental, es altamente indeseable. De preferencia, cualquier modificacion llevada a cabo para acoplar un compuesto farmaceuticamente activo en un biomaterial es realizada en una manera tal que el compuesto farmaceuticamente activo original es eventualmente regenerado por la hidrolisis del enlace ester o amida en la ramificacion farmaceuticamente activa. Debido a que ciertos compuestos farmaceuticamente activos retienen su actividad terapeutica despues de modificacion de un grupo reactivo, tal como un alcoholo amina, los biomateriales que liberan compuestos con tales modificaciones pueden ser tambien terapeuticamente utiles. La presente invencion convierte un alcohol o amina en el compuesto farmaceuticamente activo a un grupo tiol o amina mas reactivo. Debido a la nucleofilicidad superior del grupo tiol en comparacion con un grupo amina y debido a que los grupos amina son a menudo encontrados en compuestos farmaceuticamente activos, un enlazador que contiene un grupo tiol es deseable sobre uno que contiene un grupo amina. Sin embargo, en algunos casos, la presencia de una amina en vez de un tiol en el enlazador puede dar una tasa de liberacion mas deseable del compuesto farmaceuticamente activo. Los metodos descritos en la presente incluyen aradir una molecula enlazadora al compuesto farmaceuticamente activo, mas que al biomaterial o el polimero. La naturaleza quimica de esta molecula enlazadora puede ser bastante diversa, pero consiste en la estructura general R1-C00H antes de reaccion con el compuesto farmaceuticamente activo, donde R1 es una ramificacion organica que no contiene un grupo sustancialmente nucleofilo o electrofilo. Esta molecula que contiene acido carboxilico es entonces condensada con un alcohol o amina a partir del compuesto farmaceuticamente activo. En un caso, un atomo de azufre o nitrogeno reactivo esta contenido dentro del grupo R1, y mediante el uso de quimicas de desproteccion adecuadas puede entonces generarse un tiol o una amina libres. En otro caso, R1 es CH2=CH-, que puede reaccionarse con una segunda molecula enlazadora de la estructura R2-SH o R2-NH2. Un atomo de azufre o nitrogeno pobremente reactivo esta incluido en R2, y mediante el uso de quimicas de desproteccion adecuadas puede generarse un tiol o una amina libres. La union de la molecula enlazadora es entonce seguida por purificacion extensa, lo que no seria posible si los compuestos farmaceuticamente activos estuvieren unidos directamente a un biomaterial o polimero. De manera adicional, la union de tales enlazadores puede ser incorporada en la sintesis global de un compuesto farmaceuticamente activo, mas que ocurra despues de la sintesis completa del compuesto. De manera adicional, pueden diserarse nuevos compuestos farmaceuticamente activos, con base en las estructuras de compuestos farmaceuticamente activos existentes, que son mas facilmente unidos a un polimero usando los metodos descritos en la presente, pero que tengan farmaco-cineticas similares al compuesto original.
Union de compuestos farmaceuticamente activos a enlazadores que contienen tiol o amina
En un metodo de la invencion, un compuesto farmaceuticamente activo cuyo caracter nucleofilo consiste en la presencia de aminas, alcoholes o nucleofilos mas debiles, se reacciona de modo que los grupos amina sean protegidos contra reaccion adicional usando tecnicas estandard. Un grupo alcoholico en el compuesto farmaceuticamente activo protegido o un compuesto farmaceuticamente activo que contiene solamente grupos alcoholicos reactivos es objetivado para reaccion adicional con un derivado de un acido mercaptopropionico o acido mercaptoacetico en el cual el grupo mercapto es protegido o acido aminopropionico o glicina en el grupo amina sean protegidos. Un enlace ester es formado condensado el acido carboxilico en compuesto que contiene tiol o amina protegido con el alcohol en el compuesto farmaceuticamente activo. El grupo protector en el grupo amina o mercapto y los grupos protectores, si los hay, en la ramificacion farmaceuticamente activa, son entonces removidos usando tecnicas estandard. Este producto es entonces reaccionado con un polimero soluble en agua contenido los grupos insaturados conjugados como se describe mas adelante en mayor detalle. En un metodo relacionado, un compuesto farmaceuticamente activo conteniendo una amina primaria o secundaria libre puede reaccionarse como se describio antes para formar un compuesto que contiene amida que puede unirse a un polimero.
Union de compuestos farmaceuticamente activos a derivados acriloflo
En otro metodo, un derivado acriloilo, tal como acido acrilico, es reaccionado con un alcohol en un compuesto farmaceuticamente activo, que puede contener grupos amina protegidos, para producir un ester. De manera alternativa, los derivados acriloilo pueden reaccionarse con una amina en el compuesto farmaceuticamente activo para producir una amida. El acrilato resultante en el compuesto farmaceuticamente activo es entonces reaccionado con una molecula enlazadora conteniendo un tiol o una amina libres y un tiol o una amina
protegidos. El grupo protector en el tiol o la amina de la molecula enlazadora puede ser removido, y este tiol o amina puede entonces reaccionarse con un polimero soluble en agua conteniendo dos o mas grupos insaturados conjugados.
Papeles llevados a cabo por los enlazadores
Un aspecto importante de la invencion es que los grupos tiol o amina en el enlazador provean una funcion dual. Primero, los grupos permiten una reaccion rapida y cuantitativa con un polimero via una reaccion de adicion conjugada, de modo que el compuesto farmaceuticamente activo pueda ser acoplado al polimero. Segundo, la presencia de un tioeter cerca del enlace ester o amida que une el compuesto farmaceuticamente activo al enlazador acrecienta la tasa de hidrolisis del enlace, con relacion a un ester o amida alifatico simple. Tipicamente, se espera que un ester completamente alifatico tenga una vida media de hidrolisis en agua amortiguada a un pH de 7.4, 37°C del orden de aros, debido a la hidrofobicidad de la cadena alifatica. Si se une un grupo acrilato al polietilenglicol via un ester, el acceso incrementado de agua al enlace ester del acrilato reduce la vida media en agua amortiguada a un pH de 7l4, 37°C a alrededor de tres meses. De manera similar, si un grupo acrilato unido a un polietilenglicol es reaccionado con un compuesto que contiene tiol, el tioeter resultante cerca del ester reduce la vida media de la hidrolisis a aproximadamente tres semanas. Los compuestos de la invencion que tienen la formula D-02C-(CH2)n-SH tienen una vida media de aproximadamente cuatro dias cuando n es 1 y 18 dias cuando n es 2. Los compuestos que contienen amida correspondientes tienen una vida media mas larga, aproximadamente cuatro veces mas larga que los esteres, lo que es clinicamente relevante. De manera adicional, se sabe que un tiol unido al carbono alfa con relacion a un enlace ester tiene una vida media a un pH de 7.4, 37°C de aproximadamente cuatro dias (Nicolaou y colaboradores, patente US 5,817,840). Los compuestos que tienen la formula D-02C-(CH2)-NH tienen una vida media de alrededor de cuatro meses. En terminos de la entrega de compuestos farmaceuticamente activos, el programa de dosificacion deseable para la administracion a un mamifero de componentes precursores de un biomaterial o un biomaterial no es mas de una vez al dia, de preferencia alrededor de una vez por semana a una vez por mes. De esta manera, una vida media de hidrolisis de entre una hora y un aro, de preferencia entre un dia y nueve meses, con mayor preferencia entre dos dias y seis meses, y con la mayor preferencia entre cuatro dias y tres semanas, es deseable para aplicaciones clinicas. De manera adicional, un enlazador altamente soluble en agua puede facilitar la reaccion del compuesto farmaceuticamente activo modificado con un polimero incrementando la solubilidad del compuesto modificado. Si el enlazador es hidrofilo, el enlazador puede incrementar la tasa de liberacion del compuesto farmaceuticamente activo exponiendo el enlace hidrolizable al agua. Si el enlazador es hidrofobo, el enlace puede ser removido del ambiente del agua, y la hidrolisis puede ser mas lenta. Si el enlazador contiene un grupo nucleofilo tal como una amina, entonces el nucleofilo puede reaccionar con el enlace ester o amida que acopla el compuesto farmaceuticamente activo al polimero, y de esta manera puede acelerar la liberacion del compuesto farmaceuticamente activo original, no modificado. De manera adicional, el enlazador puede comprender uno o mas aminoacidos, un peptido degradable enzimaticamente, un sitio de adhesion, un sitio de enlace de factor de crecimiento, un sitio de proteasa, una ramificacion hidrocarburo, o una secuencia de peptido para objetivacion a un sitio deseado.
Compuestos farmaceuticamente activos modificados que contienen un tiol o una amina libres
En adicion a moleculas organicas que ocurren naturalmente o sintetizadas, ADN terapeutico, ARN, peptidos, o proteinas pueden ligarse covalentemente dentro del biomaterial, como se describio antes. De manera adicional, el ADN, ARN, peptido o proteina puede ser modificado de modo que tenga un solo tiol libre, que es entonces reaccionado directamente con un polimero soluble en agua que contiene grupos insaturados conjugados multiples y el producto es reticulado. En este caso, que constituye una alternativa al metodo de la invencion usando un enlazado, los compuestos farmaceuticamente activos originales no son regenerados; sin embargo, la modificacion de ADN, ARN, peptido y terapias a base de proteinas es mucho mas comun y aceptable que la modificacion de productos farmaceuticos tradicionales. La modificacion al ADN, ARN, peptido
o proteina usualmente no afecta la actividad de la molecula si la modificacion es realizada en un sitio en la molecula que esta distante del sitio activo. En el caso de peptidos o de oligonucleotidos, un tiol o una amina pueden aradirse en un sitio distante al sitio activo de la molecula, por inclusion del aminoacido cisteina o por el uso de un oligonucleotido derivado. En estos casos, la molecula que contiene tiol o amina puede reaccionarse directamente con un grupo acrilato en el polimero. La molecula que se libera debido a la hidrolisis no es la molecula original, pero contiene un tiol o amina que se modifica con acido propionico. Como porciones de los peptidos y oligonucleotidos terapeuticos que estan distantes del sitio activo pueden variarse en gran medida sin una perdida de actividad, estos compuestos habitualmente conservan su actividad terapeutica.
Acoplamiento de compuestos farmaceuticamente activos a un polfmero y reticulacion subsecuente (como alternativa para usar un enlazador como se reivindica)
El tiol o la amina libres que se arade a, o que esta originalmente presente en, el compuesto farmaceuticamente activo, es entonces usado para acoplar el compuesto farmaceuticamente activo a un polimero. Los
biomateriales son a menudo formados de polimeros hidrofobos, pero estos no son preferentes aqui pues la liberacion del compuesto farmaceuticamente activo unido de manera covalente depende de la presencia de agua alrededor del compuesto farmaceuticamente activo. De esta manera, el compuesto farmaceuticamente activo puede ser unido a polimeros solubles en agua o polimeros hinchables en agua. Los polimeros solubles en agua pueden ser formados en un material en una variedad de maneras, mediante la formacion de reticulaciones covalentes o fisicas. Las reticulaciones covalentes pueden ser establecidas aradiendo grupos a los polimeros que son capaces de polimerizacion por radicales libres (Hubbell y colaboradores, patente US 5,410,016), sustitucion nucleofila (Zhao y colaboradores, Polymer Preprints 38(1):526-527, 1997), y otros metodos quimicos, incluyendo reacciones de adicion conjugada. La union del compuesto farmaceuticamente activo al polimero soluble en agua o polimero hinchable en agua debe llevarse a cabo en una manera que es complementaria a la reticulacion subsecuente del polimero soluble en agua para formar un biomaterial. Para lograr este acoplamiento de compuesto farmaceuticamente activo a un polimero y la subsecuente reticulacion del polimero, otros han usado polimeros solubles en agua bifuncionales que contienen una clase de grupos quimicos para la union del compuesto farmaceuticamente activo y otra clase de grupos quimicos para la reaccion de reticulacion. Como se esperaria, los polimeros bifuncionales son mas costosos y mas dificiles de producir que los polimeros monofuncionales. Aqui, monofuncional se refiere al hecho de que solamente un tipo de grupo funcional esta presente en el polimero, no que cada molecula de polimero contenga un solo grupo funcional. En la presente invencion, los polimeros monofuncionales tienen un solo tipo de grupo funcional y son usados para dos diferentes tipos de reacciones. Un tipo de reaccion es usado para la union de compuestos farmaceuticamente activos, el cual de acuerdo con la presente invencion es por medio de un enlazdor, y el otro tipo de reaccion es usado para reticulacion. El tipo de grupo funcional que es util en este contexto es un grupo que es un aceptante en una reaccion de adicion conjugada. Estos grupos incluyen acrilatos, metacrilatos, acrilamidas, metacrilamidas, derivados de acrilonitrilo, quinonas, sus derivados, y otros grupos con enlaces dobles conjugados. Tales reacciones entre un tiol y un acrilato prosiguen rapidamente en agua amortiguada a un pH cercano al neutro (con una vida media del orden de minutos). De esta manera, la reaccion para acoplar el compuesto farmaceuticamente activo al polimero el cual de acuerdo con la presnete invencion es por medio de un enlazdor, puede ocurrir bajo condiciones sumamente tenues que no lesionaran el compuesto farmaceuticamente activo. La reaccion puede tambien ser llevada a cabo en un solvente organico o una mezcla de agua y un solvente organico polar. En agua amortiguada a un pH cercano al neutro, la reaccion entre el tiol y el acrilato ocurre mucho mas rapidamente que la reaccion entre dos tioles (para formar un enlace bisulfuro) o la reaccion entre dos acrilatos (para formar un polimero, asumiendo una ausencia de iniciadores de radicales libres). De preferencia, la reaccion entre el tiol y el acrilato ocurre 10, con mayor preferencia 100, y con la mayor preferencia 1,000 veces mas rapidamente que la reaccion entre dos de los tioles. La reaccion entre el tiol y el acrilato es tambien de preferencia 100, con mayor preferencia 1,000, y con la mayor preferencia 10,000 veces mas rapida que la reaccion entre dos de los acrilatos en ausencia de iniciadores de radicales libres. Para la reaccion correspondiente entre una amina y el acrilato, la tasa de reaccion es de preferencia 10, con mayor preferencia 100, y con la mayor preferencia 1,000 veces mas rapida que la reaccion entre dos de los acrilatos en ausencia de iniciadores de radicales libres. La reaccion de reticulacion subsecuente puede ocurrir generalmente por dos rutas principales, utilizando ya sea polimerizacion por radicales libres (Lau y colaboradores, Bioorg. Med. Chem. 3:1305-1312, 1995) o por reacciones de adicion conjugada. Los grupos insaturados conjugados que son reaccionados con buenos nucleofilos via reacciones de adicion conjugada pueden tambien polimerizarse generalmente por mecanismos de radicales libres. De esta manera, en tanto a menos un grupo insaturado conjugado permanezca en el polimero despues del acoplamiento del compuesto farmaceuticamente activo, entonces ese polimero puede ser incorporado en un biomaterial mediante mecanismos de radicales libres. La presencia de al menos un grupo insaturado sin reaccionar en el polimero es asegurada manteniendo el numero de grupos insaturados en exceso en comparacion con los grupos tiol o amina, o acoplados a, la ramificacion farmaceuticamente activa. La segunda ruta para reticular estos materiales implica hacer reaccionar los grupos insaturados conjugados remanentes en el polimero acoplados a una ramificacion farmaceuticamente activa con moleculas enlazadoras conteniendo dos o mas nucleofilos, tales como el peptido GCNNRGDNNCG (SEQ ID N0: 73) que incrementa la adhesion celular a las membranas de basamento. La reticulacion para formar un material ocurre entonces mediante otra reaccion de adicion conjugada. Tales reacciones de reticulacion, como se describio antes, pueden ocurrir en presencia de celulas y tejidos vivos (Lau y colaboradores, supra). De esta manera, el material que contiene el farmaco puede ser colocado o reticulado en practicamente cualquier sitio dentro del cuerpo. El material sirve como un deposito para la entrega de agentes terapeuticos en el sitio deseado de actividad. Un ejemplo util consiste en la entrega de un agente terapeutico a partir de un biomaterial dispuesto o polimerizado en el tejido que contiene un tumor maligno. De manera alternativa, un tumor maligno puede ser removido de un tejido quirurgicamente, y un biomaterial que contiene una ramificacion farmaceuticamente activa ligada de manera covalente puede ser colocado o polimerizado cerca del sitio de remocion del tumor maligno. La liberacion del compuesto farmaceuticamente activo original o modificado a partir de este biomaterial puede impedir la siembra de celulas tumorales que son expulsadas del tumor durante su remocion o puede impedir el desarrollo adicional de celulas malignas que no pudieron ser removidas durante la cirugia. Aunque la forma de realizacion deseable de la invencion es el uso de reacciones de adicion conjugada para unir un polimero a un grupo tiol o amina acoplado a un compuesto farmaceuticamente activo, puede usarse una
reaccion de sustitucion nucleofila para reaccionar el grupo tiol o amina con el polimero. Esta forma de realizacion usa un enlazador para acrecentar la reaccion del compuesto farmaceuticamente activo con el polimero para permitir la liberacion del compuesto farmaceuticamente activo original durante un periodo de tiempo debido a la hidrolisis del enlazador.
Liberaci6n controlada de compuestos farmaceuticamente activos ligados indirectamente
En adicion a la enlace covalente de compuestos farmaceuticamente activos, es posible liberar compuestos farmaceuticamente activos ligandolos de manera directa, mediante fracciones de enlace que estan ellas mismas ligadas de manera covalente, como alternativa a la presnete invencion. Aunque el acoplamiento de un agente farmaceuticamente activo directamente a un polimero es atractivo y ventajoso, puede tambien ser ventajoso acoplarlo de manera indirecta. Usando tales medios, no se necesita realizar sintesis organica directamente sobre el agente, sino mas bien en una ramificacion de enlace que muestra afinidad de enlace al agente. Si la ramificacion de enlace, que tambien puede ser representada por el simbolo D usado en la presente, es acoplada a un polimero con un enlazador hidrolizable que interviene, la presencia de la ramificacion de enlace da como resultado la enlace de un agente farmaceuticamente activo, y la perdida de la ramificacion de enlace dara como resultado la perdida de sitios de enlace para el agente y de esta manera liberara el agente farmaceuticamente activo del polimero. En caso de un biomaterial coloidal o un material de gel, cuando la ramificacion de enlace esta acoplada al material, su presencia de manera tridimensional a traves del material provee acoplamiento sostenido, incluso si la tasa de disociacion entre la ramificacion farmaceuticamente activa y la ramificacion de enlace es relativamente elevada: cuando ocurre un evento de disociacion, el agente farmaceuticamente activo tiene la oportunidad de difundirse solamente a una pequera distancia antes de ligarse a otra ramificacion de enlace. Esta tasa de re-enlace depende de la densidad de fracciones de enlace dentro del material. Al liberarse la ramificacion de enlace del material mediante hidrolisis del sitio de hidrolisis que interviene, esta concentracion se reduce, llevando a la liberacion proporcionalmente mas rapida del agente biologicamente activo. Como tal, puede tomarse dos enfoques: (1) acoplamiento directo, donde D representa el agente farmaceuticamente activo mismo, y (2) acoplamiento indirecto, donde D representa una ramificacion de enlace con afinidad de enlace al agente farmaceuticamente activo. Existen diversas clases de fracciones de enlace. Muchas proteinas biologicamente activas poseen afinidad de enlace por iones de metal inmovilizados, especialmente iones tales como Cu2+, Co2+, y Zn2+. Estas proteinas tienen tipicamente residuos histidina superficiales o pares de residuos histidina separados por dos aminoacidos en una alfa-helice. Un ejemplo de una proteina farmaceuticamente activa con afinidad por tales iones de metal inmovilizados es la hormona del crecimiento humana. De esta manera, sitios de enlace de ion de metal, tales como grupos acido iminodiacetico, histidina, o peptidos his-X-X-his, pueden ser incorporados como fracciones de enlace D. Muchos agentes biologicamente activos de proteinas son producidos como glico-proteinas, es decir poseyendo estructuras de sacarido ligadas. Existen fracciones de enlace para tales estructuras, tales como residuos de acido boronico. Se han descrito residuos de acido boronico particularmente favorables, unos teniendo un pKa en el rango de relevancia fisiologica, como se ensera por Winblade y colaboradores (Biomacromolecules 1:523-533, 2000). Como tales, pueden incorporarse fracciones de acido fenilboronico como fracciones de enlace D. Muchos agentes farmaceuticamente activos de proteinas ligan estructuras de polisacaridos tales como heparina, y como tal, se puede acoplar a heparina como D o acoplar a peptidos de enlace de heparina como D mas heparina soluble. Las fracciones de enlace pueden tambien ser identificadas de manera combinatorial usando una variedad de tecnicas, tales como sistemas de despliegue de peptido en fago o peptido en perla en sintesis en fase solida de mezclado y division. Como tales, peptidos determinados de manera combinatorial y otras moleculas pueden incorporarse como moleculas de enlace D. Muchas moleculas organicas hidrofobas, pequeras, se ligan como huespedes como complejos de inclusion dentro de anfitriones tales como ciclodextrinas. Como tales, las fracciones ciclodextrina pueden ser incorporadas como fracciones de enlace D.
Liberaci6n controlada de compuestos farmaceuticamente activos atrapados
En adicion a la enlace covalente de compuestos farmaceuticamente activos directamente, y la enlace indirecta de compuestos farmaceuticamente activos via la enlace covalente de fracciones de enlace, es posible liberar compuestos farmaceuticamente activos atrapandolos dentro de redes de biomateriales. En materiales reticulados, la red polimerica forma una barrera fisica a la difusion, particularmente de farmacos macromoleculares tales como peptidos, proteinas, oligonucleotidos, ARN y ADN. El tamaro de la red puede ser ajustado mediante el disero de los componentes de la red; v.gr., los materiales reticulados formados con concentraciones de masa de triacrilato de PEG pueden formar redes mas permeables que aquellas formadas con una concentracion de masa igual de octa-acrilato de PEG bajo condiciones equivalentes. De esta manera, la permeabilidad de un farmaco macro-molecular puede ser modulada por el disero de la red de biomaterial para obtener la liberacion controlada del farmaco. Siguen ahora ejemplos particulares que describen la preparacion de las composiciones de la invencion, y los metodos de la invencion. Estos ejemplos se proporcionan con el proposito de ilustrar la invencion, y no se deberan considerar como limitantes. Lo ejemplos 1-15 se han divulgado en W0 00/44808. Los ejemplos 1-15 no involucran el concepto de la
presnete invencion, i.e. el uso de un enlazador especifico para enlazar D y P, pero se incluyen con propositos ilustrativos.
EJEMpLOS DE REFERENCIA 1-15
Ejemplo 1: preparaci6n de Reactivos Basicos
Acrilaci6n del diol de poli(etilenglicol)
Se agrego polietilenglicol, peso molecular 8,000 (50 gramos, 6.24 mmol, 12.5 mmol grupos hidroxilo, Aldrich, Milwaukee, Wisconsin, Estados Unidos) a tolueno (500 ml) y se seco mediante destilacion azeotropica. Se enfrio esta mezcla a 0°C y se agregaron 100 ml de diclorometano anhidrico (Aldrich). Se agrego trietilamina
(2.61 ml, 18.75 mmol, 1.5 eq. Basado en grupos hidroxi, Aldrich), seguido por la adicion por goteo de cloruro de acriloilo (2.03 ml, 18.75 mmol, 1.5 eq., Aldrich). Se mantuvo la reaccion bajo Ar durante toda la noche en la oscuridad. Se filtro el producto y despues se recupero mediante precipitacion en hexano con agitacion. Se volvio a disolver el producto en 75 ml de diclorometano y se precipito nuevamente en hexano con agitacion. Se seco el producto durante toda la noche bajo vacio. El producto se disolvio en 500 ml de agua con 25 gramos de NaCl, y se ajusto el pH a un pH 6. Se extrajo la solucion con diclorometano (Aldrich) 3 veces (no se debera agitar vigorosamente la primera extraccion con diclorometano para evitar la formacion de una emulsion). Las fracciones de diclorometano se combinaron y se agregaron al hexano de agitacion. Se recupero el producto mediante filtracion y se seco bajo vacio durante toda la noche. Mediante 1H-NMR, se acrilata el 80 por ciento de los alcoholes sobre el polietilenglicol (se hace referencia al producto como diacrilato de polietilenglicol).
Acrilaci6n del triol de poli(etilenglicol)
El triacrilato de PEG (PEG-3A) es un PEG armado triple con nucleo de glicerol, Las anotaciones del peso molecular (PEG-2500-3A PEG-3500-3A) se refieren al peso molecular promedio total y no al peso molecular de un solo brazo. La acrilacion se realizo usando exactamente las mismas proporciones molares de reactivos, como se describe para el diol de PEG.
Crotonilaci6n y dimetilacrilaci6n del diol de poli(etilenglicol)
Se sintetizaron de manera simultanea PEG-8000 (PEG-8000-2C) de crotonoilo (crotonilo, -00C-CH=CHCH3) y PEG-8000 (PEG-8000-2DMA) de dimetacriloilo (dimetilacriloilo, -00C-CH=C(CH3)2) en reacciones lado a lado. Se disolvieron 27 gramos de PEG-8000 (3.375 mmol, 6.75 mmol grupos hidroxilo; Aldrich) en benceno y se destilaron de manera azeotropica hasta que el destilado aparecio transparente. Se permitio que la solucion de PEG-benceno se enfriara a la temperatura ambiente. Despues, se transfirieron 100 ml de la solucion de manera anhidrida a un matraz de separacion de fondo redondo. Se agrego trietilamina (1.1 ml a la muestra de 100 ml y
1.7 ml a la muestra mas grande (150 ml), 3 equivalentes que se basan en los grupos de hidroxilo; Aldrich) a cada matraz. Se agrego por goteo crotonoilo-Cl (1.2 ml, 3 equivalentes que se basan en grupos hidroxilo; Fluka) a la muestra de 150 ml. Se agrego por goteo el dimetacriloilo-C1 (0.9 ml, 3 equivalentes que se basan en grupos hidroxilo; Fluka) a la muestra de 100 ml. Se corrieron las reacciones 20 horas en la oscuridad. Se filtraron las soluciones a traves de papel y se precipitaron en hexano. Se secaron al vacio los dos precipitados. Se determinaron los grados de modificacion mediante 1H NMR para que fueran el 85 por ciento para el PEG8000-2C y 89 por ciento para el PEG-8000-2DMA (por grado de esterificacion).
preparaci6n de pEG de bis(benzoquinonas)
PASO A) Preparacion de PEG de bis-carboxilo
Se disolvieron 17 gramos (5 mmol) de 3400 PEG en 500 ml de tolueno y se secaron mediante destilacion azeotropica; se agregaron 15 ml 1M de solucion de THF de oxido term-but de potasio (15 mmol) y se refleja la mezcla de reaccion durante 10 minutos, despues se enfrio a la temperatura ambiente, despues se agregaron
5.4 ml (50 mmol) de 2-bromoacetato de etilo; se agito la solucion durante 24 horas a 40°C, despues se filtro para remover el KBr, se concentro en el evaporador giratorio y se precipito en eter de dietilo frio. Despues se disolvio el solido en 250 ml de 0.2 N Na0H (el pH se mantuvo en 12 mediante adicion por goteo de 4 N Na0H); se agito la solucion durante 12 horas, y despues se disminuyo el pH a 4 mediante adicion por goteo de HCl concentrado, se extrajo con diclorometano; se seco la fase organica sobre sulfato de sodio y se precipito en eter de dietilo frio. Se determino el grado de modificacion mediante 1H NMR.
PASO B) Preparacion de PEG de bis(2,5-dimetoxianilida de carboxilo)
Se disolvieron 10 gramos (2.8 mmol, 5.7 meq) de PEG de 2400 bis-carboxilo en 200 ml de THF junto con 2.0 gramos (6 mmol) de 2,5-dimetoxianilina (recristalizada tres veces a partir de hexano); despues se agregaron
0.73 gramos (5.8 mmol) de carbodiimida de diisopropilo y se agito la solucion durante 24 horas a la temperatura ambiente. Se filtro la urea de diisopropilo precipitado, se evaporo el THF en el evaporador giratorio; despues se volvio a disolver el polimero en tolueno, se filtro la solucion y despues se precipito en eter de dietilo frio. Se
repitio el procedimiento dos veces. Se determino el grado de modificacion mediante 1H-NMR.
PASO C) Preparacion de PEG de bis(2,5-hidroxianilida de carbonilo)
Se disolvieron 5 gramos (1.4 mmol, 5.2 meq) de PEG de 3400 bis (2,5-dimetoxianilida de carboxilo) en 50 ml de diclorometano seco en atmosfera de nitrogeno seco; despues se agregaron 1.2 gramos (6 mmol, 0.82 ml) de yodotri-metilsilano y se agito la solucion durante 24 horas a la temperatura ambiente. Despues se lavo la solucion de diclorometano con agua hasta alcanzar la neutralidad, se seco sobre sulfato de sodio, se concentro a un volumen pequero y se precipito en hexano. Se determino el rendimiento de la reaccion mediante 1H-NMR
PASO 0) Preparacion de PEG de bis(2,5-benzoquinonas de carboxamida)
Se disolvieron 5 gramos (1.4 mmol, 5.6 meq) de PEG de 3400 bis(2,5-hidroxianilida de carbonilo) en 50 ml de etanol y 1.2 gramos (7.4 mmol) de cloruro de hierro (III). Se agito la solucion durante 24 horas a la temperatura ambiente, despues se agregaron 150 ml de diclorometano y 150 ml de agua y se separaron dos gases; se lavo la fase de diclorometano tres veces con agua, despues se concentro y se precipito en eter de dietilo frio. Se determino el rendimiento de la reaccion mediante 1H-NMR.
preparaci6n del copolimero de bloque de a,w-bis(benzo-quinonas) poli(acido lactico)-pEG-poli(acido lactico) (ejemplo con 2.5 unidades monomericas de acido lactico por extremo de pEG)
PASO A) Preparacion del copolfmero en bloque de poli(acido lactico)-PEG-poli(acido lactico)
Se mezclaron juntos 17 gramos (5 mmol) de diol de PEG 3400 seco, 3.60 gramos (0.025 mmol) de dl lactida y 15 ml de octanoato estaroso, bajo atmosfera de nitrogeno seco. Se agito la mezcla de reaccion a 200°C durante 2 horas y se enfrio subsecuentemente a la temperatura ambiente. Se disolvio el solido resultante en diclorometano y se precipito en eter de dietilo frio.
PASOS B al E
Los Pasos B a E son analogos a los pasos A al D en la preparacion de PEG de bis(benzoquinonas).
preparaci6n de poli(etilen-co-vinil alcohol-co-2-oxivinil-(2=,5=-benzoquinonas)acetamida)
PASOS A) al 0) Preparacion de poli(etilen-co-vinil alcohol-co-2-oxivinil-acido acetico)
Estas preparaciones son analogas a los PAS0S A al D en la preparacion de PEG de bis(benzoquinonas).
preparaci6n de pEG de bis(4-vinilpiridilo)
Se hicieron reaccionar 10 gramos (2.7 mmol) de triflato de 3400 PEG recientemente preparado, durante 24 horas a 0°C con 0.75 gramos (8 mmol) de piridina de 4-vinilo, en 30 ml de NMP seco. Se precipito la solucion en eter de dietilo frio, se volvio a disolver el solido en diclorometano y se precipito nuevamente en eter de dietilo frio.
Sintesis del peptido
Se sintetizaron los peptidos en un sintetizador de peptidos Pioneer de Perspective Biosystems (Framingham, Massachusetts, Estados Unidos), usando el esquema de proteccion Fmoc estandar. Se disociaron lo peptidos a partir de resina, usando 8.8 ml de acido trifluoroacetico (Perspective Biosystems), 0.5 ml de agua, 0.5 ml de fenol (Aldrich), y 0.2 ml de triisopropilsilano (Aldrich) por gramo de resina, durante 2 horas a la temperatura ambiente. Se precipito la solucion en eter, y se recupero el producto mediante filtracion, y se seco bajo vacio. Se purificaron los peptidos mediante cromatografia C18, y las fracciones que contenian el producto se identificaron mediante espectrometria de masa MALDI-T0F. Los peptidos se almacenaron bajo Ar a B20°C. Antes de la aplicacion, los peptidos que contenian cisteina se manipularon humedos en soluciones acidicas y/o soluciones degasificadas, o se secaron bajo vacio o bajo argon tanto como fue posible para evitar la oxidacion.
Ejemplo 2: Formaci6n de gel mediante reacciones de adici6n de conjugados
Geles que se forman mediante adici6n de conjugados con un tri-tiol de peso molecular bajo y una insaturaci6n enlazada por pEG: tris-(3-mercaptopropionato) de trimetilolpropano y diacrilato de pEG
Se disolvieron 50 mg de PEG-8000-2A a 0.1 g ml en 500 microlitros de 4:1 50 mM regulador del pH de bicarbonato (pH 8.4):acetonitrilo. Se agregaron 1.1 microlitros de tris-(3-mercaptopropionato) de trimetilolpropano (1.25 equivalentes que se basan en acrilatos) y se mezclo la solucion mediante someterla a remolino. El tris-(3-mercapto-propionato) de trimetilolpropano no se pudo mezclar perfectamente en la solucion, sino que
formo una suspension de gotitas pequeras en la fase acuosa. El material no se gelo en dos horas, sino que se dejo descansar durante toda la noche. Aproximadamente a las 12 horas despues de la adicion del tris-(3mercaptopropionato) de trimetilolpropano, se habia formado un material reticulado solido. Se agrego agua al material, el cual se hincho con el agua pero no se disolvio (escala de tiempo: semanas antes de que se desechara finalmente el gel debido a la contaminacion). De igual manera, se formo un gel de concentracion mas elevada de PEG y con propiedades mecanicas mas fuertes, por medio de disolver primero 0.2 gramos de PEG-8000-2A en 750 microlitros de agua sin regulacion de pH y 250 microlitros de acetona. Se agregaron 4.4 microlitros de tris(3-mercapto-propionato) de trimetilolpropano (1.25 equivalentes que se basan en grupos de acrilato). Mientras que el tris(3-mercaptopropionato) de trimetilolpropano es soluble en acetona a estas concentraciones (4.4 microlitros de tris(3mercapto-propionato) de trimetilolpropano/250 microlitros acetona), todavia formo una suspension visiblemente insoluble con la solucion de PEG despues de someterla a remolino. Despues de 24 horas, se habia formado un material insoluble en agua altamente reticulado.
Geles que se forman mediante la adici6n de conjugados con un nucle6filo enlazado con peptido y una insaturaci6n del conjugados enlazada con pEG
Se disero el peptido GCYKNRDCG (SEQ ID N0:58) para ser sensible a la hidrolisis mediante la plasmina de la enzima, para contener mas de un tiol (cisteina) para la reaccion de adicion con los grupos no saturados del conjugados, y para que sea muy soluble en agua. Se sintetizo el peptido de conformidad con los metodos que se describieron anteriormente. El peptido fue extremadamente soluble en agua, hasta cuando menos 120 mg/ml. Los geles se formaron a partir de PEG-2500-3A y GCYKNRDCG, asi como a partir de PEG-3500-3A y GCYKNRDCG. Los geles se habian formado a tres proporciones de acrilatos con sulfhidrilos (1:1, 1.1:1, y 1.25:1). Los geles se formaron en 10 mM de suero regulado con fosfato con trietanolamina para ajustar el pH a 8.0-9.0, como se probo mediante tiras de papel pH (las reacciones de formacion de gel se realizaron a 50 microlitros y escalas mas bajas). Los geles se habian estado haciendo mediante: disolver previamente el peptido y despues agregar la solucion del peptido al PEG-3A; por medio de disolver previamente el PEG-3A y agregar su solucion al peptido; y por medio de disolver previamente las dos soluciones y despues mezclarlas en las proporciones apropiadas. Se ha usado el siguiente protocolo para la formacion del gel a la escala de 40 microlitros. La cantidad de PEG2500-3A que se peso en un Eppendorf vario debido a las cualidades viscosas del material que lo hacen de alguna manera dificil de manejar. Sin embargo, el volumen del regulador del pH que se agrega al PEG-2500-3A se ajusta siempre para dar la misma concentracion final sobre una base de masa/volumen. Se pesaron 2.5 mg de GCYKNRDCG dentro de un tubo de Eppendorf. Se pesaron 7.0 mg de PEG-2500-3A dentro de un tubo de Eppendorf separado. Se agregaron 62 microlitros de suero regulado con fosfato (PBS)DTEA (10 mM PBS con 13 microlitros de trietanolamina/ml) al PEG-2500-3A para dar una solucion de 4.5 mg/40 microlitros. Se permitio que la solucion de PEG reposara hasta que se hubo disuelto el PEG-3A (menos de cinco minutos). Se agregaron 40 microlitros de la solucion de PEG-3A al peptido, el cual se disolvio de manera extremadamente rapida. La punta de la pipeta que se uso para la transferencia, se uso para agitar la mezcla durante aproximadamente 3 segundos. Se retiro una muestra de 1 microlitro para probar el pH mediante un tira de papel (rango de pH 1-11). El pH fue de aproximadamente 8.0. Despues de 20-30 minutos, se formo un gel.
Control de la velocidad de gelaci6n mediante la modulaci6n de la carga cercana a un nucle6filo (por ejemplo, tiol)
Se sintetizaron dos peptidos sensibles a la colagenasa (MMP-1): GCDDGPQGIWGQDDCG (SEQ ID N0: 59) y GCRDGPQGIWGQDRCG (SEQ ID N0: 60), usando las tecnicas Fmoc estandares que se describieron en el Ejemplo 1. En un peptido, el tiol (en cisteina, C) estuvo cerca de un residuo que llevaba la carga negativa (acido aspartico, D) cuando estuvo cerca del pH neutral, el pH de interes. En el otro peptido, el tiol estuvo cerca de un residuo que llevaba la carga positiva (arginina, R) cuando estuvo cerca del pH neutral. Se hizo reaccionar cada peptido de manera separada con acrilato que contenia los polimeros de PEG a un pH de 8. La velocidad de la adicion de conjugados fue seguida por el consumo de los tioles mediante el uso de DTNB, reactivo de Ellman. Los resultados se muestran en la Figura 1. El intercambio de D -> R (carga negativa -> carga positiva) cerca del tiol, incremento el velocidad de la reaccion de manera que la vida media del consumo del tiol durante la formacion del gel disminuyo casi 3 veces. Esto se consiguio mediante el disero a fin de incrementar la probabilidad de que el tiol exista en la forma S-, la cual participa en la adicion de conjugados y por tanto para incrementar la velocidad de la reaccion y la gelacion.
Dilataci6n (contenido de agua) de los geles que se fabrican mediante la adici6n de conjugados
Se hicieron los geles con 0.1 gramos/ml, 0.15 gramos/ml, y 0.2 gramos/ml de PEG-2500-3A a una escala de 20 microlitros. Los geles contenian 1.1 acrilatos por sulfhidrilo en el componente del peptido (nucleofilo), GCYKNRDCG. Para la formacion del gel, se ajustaron los reguladores de pH del suero regulado con fosfato para dar cuenta por la acidez agregada del peptido adicional en los geles de concentracion mas elevada y para
dar reacciones a un pH de 8.0-8.5. Se hicieron los geles por cuadruplicado.
Tabla 6. Geles de adici6n de conjugados para estudios de dilataci6n
pEG-2500-3A (mg)
GCYKNRDCG (mg) Trietanolamina (_l/ml) % agua en gel dilatado
10%
2.0 1.1 13.0 96.5%
15%
3.0 1.7 20.1 95.8%
20%
4.0 2.2 26.0 94.8%
Los geles se dilataron en 10 mM PBS, pH 7.3 durante 48 horas antes de que se hicieran las primeras mediciones de peso humedas. Se pesaron los geles en humedo cuatro veces durante tres dias consecutivos sin ningun incremento significativo en las masas humedas durante este tiempo. Despues se empaparon los geles en agua desionizada, con intercambios de la fase de solucion, durante cuatro dias despues de lo cual se liofilizaron los geles a fin de obtener las masas secas. Los contenidos de agua que se basaron en las masas secas maximas posibles (debido a la variabilidad en las masas secas reales), fueron todas de aproximadamente el 95 por ciento en masa de los geles dilatados.
Geles que se formaron mediante la mezcla de dos componentes en polvo
Los precursores del material tambien se pueden administrar en los tejidos en el estado seco. Por ejemplo, se puede formular el ditiol de PEG como un polvo, el tetraacrilato de PEG se puede formular como un polvo, uno o el otro, pero de preferencia los dos componentes que contienen componentes reguladores del pH de manera que cuando los componentes en polvo se mezclan y se disuelven en agua, solucion salina o fluidos fisiologicos, se forma una solucion a un pH tal que ocurre la reaccion de los dos componentes precursores, por ejemplo, pH
8. Estos componentes en polvo se pueden rociar sobre un superficie del tejido, ya sea junto con una corriente acuosa o sin una. En el caso de que los polvos se rocien con una corriente acuosa, los componentes del polimero se disuelven en la corriente acuosa junto con la capa de fluidos biologicos sobre la superficie del tejido, y despues reaccionan para formar el implante de biomaterial final. En el caso de la aplicacion de los componentes en polvo a la superficie del tejido, los precursores polimericos y los componentes reguladores del pH se disuelven en los fluidos biologicos y forman una solucion precursora, que puede reaccionar para formar el implante de biomaterial final. En el caso en donde los fluidos biologicos proporcionen la humedad para la disolucion de los componentes precursores polimericos, la concentracion de los componentes precursores polimericos puede ser elevada, dando como resultado un implante de biomaterial fuerte y buena adhesion al tejido. En la aplicacion de las corrientes de polvo, los polvos se pueden mezclar juntos y despues aplicarse como una sola mezcla en polvo a la superficie de tejido humeda, o se pueden mezclar en un rocio a partir de los dos componentes. Los componentes en polvo se pueden formar mediante los metodos conocidos para aquellos expertos en la tecnica de tecnologia de polvos, tal como precipitacion, esmerilado, fresado, liofilizacion, secado por rocio, y asi por el estilo. Las particulas pequeras llevaran a una disolucion mas efectiva y rapida, ya sea en una corriente acuosa o en la humedad en la superficie del tejido. Se deberan mezclar los dos componentes precursores polimericos juntos a una proporcion tal que los componentes de tiol y los componentes de acrilato sean aproximadamente equivalentes sobre una base de un mol de tiol por mol de acrilato. Ademas, la naturaleza del implante de biomaterial se puede controlar mediante la adicion de otros agentes a los polvos precursores, tal como particulas que sean lentas para disolverse en la solucion acuosa o formadores de gas, los cuales llevaran a la formacion de poros dentro del implante del material despues de la cura.
Ejemplo 3: protocolos generales para inmovilizar los peptidos y probar la actividad con las celulas en el cultivo
Inmovilizaci6n de peptidos en geles en los cuales se inmoviliza el peptido mediante la adici6n de conjugados y el gel se forma mediante la adici6n de conjugados
Se disolvieron 13.9 mg de PEG-2500-3A en 69.5 microlitros (5.0 mg/25 microlitros) de PBS-TEA (10 mM PBS que contenia 13 microlitros de trietanolamina/ml) que contenia GCGYGRGDSPG (SEQ ID N0: 61) a una concentracion de 3.2 mg de GCGYGRGDSPG/ml). Se disolvieron 7.0 mg de GCYKNRDCG en 65 microlitros de PBS-TEA (2.7 mg/25 microlitros). Se filtro el GCYKNRDCG a traves de un filtro de 0.22 micrones. Despues de 9 minutos de tiempo de reaccion, se filtro la solucion de PEG-2500-3A/GCGYGRGDSPG a traves de un filtro de
0.22 micrones. Tan pronto como la filtracion estuvo completa, se agregaron equivolumenes (25 microlitros) de las dos soluciones a las paredes de placas de 96 cavidades de poliestireno tratado de cultivo de tejido de fondo plano de Corning. A medida que se agregaba la segunda de las dos soluciones precursoras, se uso la punta de la pipeta para agitar la mezcla durante 2-3 segundos. Despues se permitio que los geles se asentaran a 37°C.
Resistencia de las celulas en los geles que se fabricaron mediante adici6n de conjugados que carecia de peptidos de adhesi6n incorporados
Los geles de adicion de conjugados se fabricaron con 0.1 gramos/ml de PEG-2500-3A y 1.1 acrilatos por sulfhidrilo en GCYKNRDCG. Se dilataron los geles durante 24 horas en medio de Eagle modificado de Dulbecco (algunos en condiciones libres de suero y algunos en suero bovino fetal al 10 por ciento) que contenia agentes antibioticos y anti-micoticos al 1 por ciento. Se sembraron fibroblastos de prepucio humano (pasaje 7; que se pasaron con tripsina/EDTA) sobre los geles. A partir de puntos de tiempo de dos horas a 48 horas, las celulas permanecieron redondas y no se extendieron. Las celulas se acumularon cada vez mas. El comportamiento celular fue independiente del suero en el medio. Las celulas de control se sembraron sobre el cultivo de tejido que se trato con poliestireno se extendio de manera normal.
Interacci6n de celulas con los geles que se fabricaron mediante adici6n de conjugados que contenia peptidos de adhesi6n incorporados.
Los geles de adicion de conjugados se fabricaron con PEG-2500-3A, GCYKNRDCG, asi como un peptido que contenia RGD (GCGYGRGDSPG) que se incorporo de una manera colgante. Los geles se fabricaron con 0.1 gramos de PEG-2500-3A/ml y 1.1 acrilatos por sulfhidrilo en GCYKNRDCG. Los geles se dilataron por mas de 36 horas en medio de Eagle modificado de Dulbecco (algunos en condiciones libres de suero y algunos en suero bovino fetal al 10 por ciento) que contenia agentes antibioticos y anti-micoticos al 1 por ciento. Cuando se incorporo el peptido RGD en uno de cada 12 acrilatos del PEG-2500-3A, fibroblastos de prepucio humano (pasaje 8, que se pasaron mediante tripsina/EDTA) se adhirieron a los geles (tanto aquellos que se dilataron en condiciones libres de suero, como aquellos en el medio que contenia suero). A las 6 horas despues de haberse sembrado, se distribuyeron las celulas de manera uniforme sobre la superficie del gel, y se extendio aproximadamente el 50 por ciento de las celulas sembradas (en las dos condiciones de medio).
Interacciones de las celulas con las redes de polietilenglicol
Se probaron las interacciones de las celulas con las redes de polietilenglicol por medio de sembrar celulas humanas sobre los geles usando metodos de cultivo de tejidos estandares. Se compraron los fibroblastos de prepucios humanos o las celulas endoteliales de la vena umbilical humana con Clonetics (San Diego, California, Estados Unidos). Se cultivaron los fibroblastos en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco que contenia suero bovino fetal al 10 por ciento y antibioticos al 1 por ciento (todos de GIBC0 BRL, Grand Island, New York, Estados Unidos) a 37°C y C02 al 5 por ciento. Se cultivaron las celulas endoteliales en medio M199 con suero bovino fetal al 10 por ciento y antibioticos al 1 por ciento (todos de GIBC0 BRL). Por cada 50 ml de medio, se agregaron 100 !g/ ml de heparina (Sigma, San Luis, Missouri, Estados Unidos) y 3 mg de complemento de crecimiento celular endotelial (Becton Dickinson Labware, Bedford, Massachusetts, Estados Unidos). Se removieron las celulas a partir de los sustratos del cultivo usando Tripsina/EDTA (GIBC0 BRL), se centrifugo en el medio de cultivo celular normal antes de sembrarlas sobre los geles de polietilenglicol.
Ejemplo 4: Analisis quimico de los productos de reacci6n
La cinetica de reacci6n se midi6 con reactivo de Ellman
Se uso reactivo de Ellman para medir la concentracion de tioles en una solucion. El ensayo utilizo una solucion de 40 mg de nitrobenceno de dinitrobistiol (Sigma) en 10 ml de 0.1 M regulador de pH de fosfato de pH 8 (reactivo de Ellman). Se probo una solucion por la presencia de tioles mediante la adicion de la solucion a 3 ml del regulador de pH de fosfato. Se agrego el reactivo de Ellman (100!l) y se mezclo. Despues de 15 minutos, se midio la absorbencia de la solucion en 412 nm. Se asumio un coeficiente de absorcion molar de 14150. Usando la cisteina del aminoacido, el reactivo de Ellman no revelo ninguna formacion del enlace de bisulfuro detectable a pH 10 por 30 minutos a la temperatura ambiente. Si se agrego cisteina a un exceso de diacrilato de PEG, peso molecular 8000, en las mismas condiciones, la concentracion de tioles cayo a 0.2 por ciento del valor original en segundos, y no disminuyo adicionalmente a los 30 minutos, lo que demuestra la desaparicion rapida de los tioles en la presencia del diacrilato de PEG. En la Figura 2 se muestra la reaccion de la adicion de conjugados entre el diacrilato de PEG y la cisteina del aminoacido. El peptido con la secuencia de aminoacidos Ac-GCGYGRGDSP-NH2 (SEQ ID N0: 62) se probo de manera similar. Se disolvio el diacrilato de PEG en el regulador de pH de fosfato a un pH de 8 a una concentracion de 25 !mol en 1 ml. Se agrego el peptido (1 !mol) a la solucion de diacrilato de PEG, y se monitoreo la desaparicion de los tioles usando el reactivo de Ellman (vea Figura 3). Se realizo la reaccion a diferentes pH y, adicionalmente, se evaluo la formacion de los enlaces del bisulfuro por medio de disolver el peptido a las mismas concentraciones pero en la ausencia del diacrilato de PEG. La vida media para la reaccion fue de aproximadamente 3 minutos a un pH de 7.4, y solamente unos pocos segundos a un pH de 8, a la temperatura ambiente. 0tro metodo para seguir en linea la reaccion entre los tioles y el diacrilato de PEG es monitorear la absorbencia de la mezcla de reaccion a 233 nm. A esta longitud de onda, la absorbencia se debe en principio a cuatro sustancias: los componentes del tiol, las impurezas del bisulfuro en el componente del tiol, el acrilato y el producto (el ester propionico de �-alquiltio). Los experimentos se condujeron en 10-2 M suero regulado con fosfato a diferentes temperaturas entre los 20°C y los 37°C. Al realizar los experimentos a diferentes proporciones de reactivos, pero manteniendo constante la
5 concentracion molar total de los grupos reactivos (Figura 4), se pueden calcular los coeficientes de extincion de todas las especies que se ajustan a los valores de absorcion, antes y despues de la reaccion. Este procedimiento permitio seguir de manera independiente la evolucion en tiempo de la concentracion de los reactivos y los productos: PEGDA y la cisteina mostraron un solo comportamiento exponencial, con las mismas constantes cineticas y esto probo que la reaccion fue de primer orden para cada reactivo. Se habian registrado
10 las veces de vida media entre 2 y 10 minutos, dependiendo de la temperatura y la concentracion de los reactivos. En la Tabla 7, se alistan las constantes cineticas.
Tabla �: Constantes cineticas de primer orden para la reacci6n de pEGDA-cisteina a diferentes contenidos de pEGDA, con un concentraci6n acumulativa total de 2.5x10-3 M
ramificaci6n equivalente de pEGDA
� (min-1)
0.18
0.14
0.33
0.12
0.46
0.06
0.57
0.10
0.75
0.28
0.82
0.32
0.88
0.42
0.95
0.59
Tambien se valoro la reaccion del diacrilato de PEG con las aminas primarias. El diacrilato de PEG se mezclo con un peptido con la secuencia de aminoacidos GDGSGYGRGDSPG (SEQ ID N0: 63), la cual contiene solamente una amina primaria en el termino amina del peptido. Se midio la presencia de aminas usando el
20 ensayo de fluorescamina. Se disolvio la fluorescamina (Sigma) en acetona seca a 1.5 mg/ml. Se agrego el peptido (1 mg) a 100 !l de 0.1 M regulador de pH de fosfato a pH de 8. El diacrilato de PEG, peso mol. 8000 (100 mg) se disolvio a 900 !l en 0.1 M regulador de pH de fosfato a un pH de 8 y se mezclo con la solucion del peptido. Se tomaron muestras de la reaccion y se agregaron 100 !l de 1.5 mg de fluorescamina en acetona seca, y se elevo a 1 ml con 50 mM de regulador de pH de borato a un pH de 9.
25 Se midio la intensidad de fluorescencia usando un espectrofluorimetro, y se calcularon las concentraciones mediante la comparacion con una curva estandar que se produjo usando la glicina del aminoacido. La vida media para la reaccion de la amina con un acrilato fue de aproximadamente 90 minutos a un pH de 8 y 37°C.
producci6n de aductores de pEG-peptido valorados usando cromatografia de exclusi6n de tamafo
30 Se realizo la cromatografia de exclusion de tamaro usando una columna Shodex 0Hpak SB-803 (Showa Denko, Tokio, Japon), usando deteccion de rayos ultravioleta, midiendo la absorbencia desde 200-400 nm. El levigante fue suero regulado con fosfato 810 mM fosfato de sodio, 140 mM NaCl, pH 7.4). El diacrilato de PEG tuvo una absorbencia maxima a 205 nm, mientras que el peptido que se uso, GCGYGRGDS (SEQ ID N0: 64)
35 tuvo una absorbencia maxima a 220 y 270 nm, debido a la presencia de enlaces de amida, y una tirosina. El diacrilato de PEG se disolvio en 0.1 M regulador del pH de fosfato a un pH de 8 a una concentracion de 25 !mol en 1 ml. Se separo una muestra de la solucion usando la cromatografia de exclusion de tamaro, y el polietilenglicol que se levigo como un solo pico con una absorbencia maxima a 205 nm, y sin absorbencia a 220
o 270 nm. Despues, se agrego el peptido (12.5 !mol) a la solucion de diacrilato de PEG, y se hizo reaccionar a
40 la temperatura ambiente durante 5 minutos. Despues se separo una muestra usando la cromatografia de exclusion de tamaro, y se detecto un solo pico, con absorbencia maxima a 205, 220, y 270 nm, con el mismo tiempo de retencion que el diacrilato de PEG. Esto indico que el peptido reacciono con el diacrilato de PEG. Se realizaron estudios similares usando cromatografia C18, usando un gradiente desde agua al 95 por ciento con acido trifluoroacetico al 0.1 por ciento, acetonitrilo al 5 por ciento hasta agua al 40 por ciento con acido
45 trifluoroacetico al 0,1 por ciento, acetonitrilo al 60 por ciento. El peptido Ac-GCGYGRGDSP-NH2, se levigo a aproximadamente acetonitrilo al 20 por ciento, mientras que el PEG o el diacrilato de PEG-3400 se levigo a aproximadamente acetonitrilo al 40 por ciento. La incubacion de 1 mol del peptido por 2 moles de diacrilato de
PEG-3400 en agua regulada por pH a un pH de 8 llevo a la desaparicion del pico relacionado con el peptido que se leviga a acetonitrilo al 20 por ciento, con la emergencia de bandas de absorbencia a 220 y 270 nm que se levigaron conjuntamente con el pico de PEG a acetonitrilo al 40 por ciento. La recoleccion de los picos y el analisis mediante la espectrometria de masa MALDI-T0F indico que el pico asociado con PEG contenia una mezcla de diacrilato de PEG-3400 sin modificar, y una especie nueva con el peso molecular que fue la suma del diacrilato de PEG-3400 y los pesos moleculares del peptido.
Analisis de la cinetica de reacci6n de pEGs terminados en acrilato, crotonilato y dimetilacrilato con la cisteina.
Se mezclo la cisteina del aminoacido en solucion (0.1M fosfato, pH 8) con PEGs funcionalizados (PEG-80002A, PEG-8000-2C, y PEG-8000-2DMA) de manera que los tioles y los grupos no saturados conjugados estaban inicialmente en concentraciones equimolares (20 micromolar). En la presencia de las funcionalidades del dimetacriloilo, la velocidad de consumo del tiol fue esencialmente cero durante la escala de tiempo que se siguio (10 minutos). En la presencia de las funcionalidades del crotonoilo menos obstructoras de manera espacial (una sustitucion de metilo en el enlace doble), se incremento la velocidad de consumo del tiol. En la presencia de los acrilato todavia menos obstructores, la concentracion de tioles disminuyo de manera mas rapida, pero no fue hacia la terminacion en el curso de tiempo que se siguio. Vea Figura 5. En un experimento similar en donde la concentracion de los grupos no saturados conjugados fue diez veces aquella de los grupos de tiol, el consumo de tioles por parte de los acrilatos fue extremadamente rapido. La reaccion se completo por medio de tomar la primera muestra en el tiempo de 1 minuto (no se muestran los datos).
Ejemplo 5: Demostraci6n de la hidr6lisis del enlace que se forma entre un peptido que contiene cisteina y los polimeros acrilatados
Hidr6lisis en la soluci6n
Se disolvio el peptido Ac-GCGYGRGDSP-NH2 en agua desionizada, y se disolvio el diacrilato de PEG-8000 en agua desionizada regulada por pH con 10 mM HEPES y 115 mM trietanolamina a un pH de 8. Despues de mezclar 1 mol del peptido por 2 moles del diacrilato de PEG-8000, la reaccion fue seguida por cromatografia C18, usando un gradiente desde agua al 95 por ciento con acido trifluoroacetico al 0.1 por ciento, acetonitrilo al 5 por ciento hasta agua al 40 por ciento con acido trifluoroacetico al 0.1 por ciento, acetonitrilo al 60 por ciento. El peptido Ac-GCGYGRGDSP-NH2, se levigo a aproximadamente acetonitrilo al 20 por ciento, mientras que el PEG o el diacrilato de PEG-3400 se levigo a aproximadamente acetonitrilo al 40 por ciento. Rapidamente, desaparecio el pico de peptido libre a acetonitrilo al 20 por ciento, y despues se levigo conjuntamente el peptido con el pico de PEG a acetonitrilo al 40 por ciento. Despues se incubo la solucion que contenia el aductor de PEG-peptido a 37°C, y se hicieron inyecciones cromatograficas C18 en puntos de tiempo tardios para detectar la hidrolisis del peptido a partir del polimero. Esta se midio por medio de conservar la disminucion en la seral a 273 nm que se levigo conjuntamente con el pico de PEG, y la reaparicion del pico de peptido libre a aproximadamente acetonitrilo al 20 por ciento. La espectrometria de masa MALDI-T0F del pico nuevo que se levigo a aproximadamente acetonitrilo al 20 por ciento, revelo un producto de peso molecular que correspondio con el peso molecular del peptido original mas 72 unidades de masa. Esto indico que el pico nuevo contenia peptido modificado con acido propionico, el cual fue el producto que se esperaria despues de la adicion de conjugados entre la cisteina sobre el peptido y un grupo de acrilato, seguido por la hidrolisis del ester del acrilato modificado. Se encontro que la vida media para la hidrolisis del ester entre el peptido y el PEG fue de
4.86 dias. Esto corresponde con la vida media de la hidrolisis de aproximadamente 3 semanas a un pH de 7.4.
Degradaci6n de los geles que se forman mediante la reacci6n de polimeros que contienen tioles y acrilatos
Se disolvio triacrilato de PEG-3400 en 50 mM solucion salina regulada por pH de HEPES, pH 8 a una concentracion del 20 por ciento (p/v). Se disolvio ditiol de PEG-3400 (Shearwater Polymers, Huntsville, Alabama, Estados Unidos) en 1 mM solucion salina regulada por pH de MES, pH 5.6 a una concentracion del 20 por ciento (p/v). Se mezclaron las soluciones a una proporcion de 1 acrilato: 1 tiol. Los geles se formaron despues de unos cuantos minutos a 37°C, y se transfirieron los geles a tubos que contenian 10 mM solucion salina regulada por pH de HEPES a un pH de 7.4, y se incubaron a 37°C. La solucion salina regulada por pH de HEPES se reemplazo diariamente durante la primera semana, y se evaluo diariamente la presencia de un gel restante en el tubo. Se encontro que los geles solidos se habian ido de los tubos despues de aproximadamente 3 semanas, con los geles solidos ausentes de los tubos entre 18 y 24 dias despues de la reticulacion. Esto se comparo con los geles que se formaron a partir del diacrilato de PEG-8000 mediante reticulacion de radicales libres (Pathak, supra), los cuales todavia estan presentes despues de 4 meses a un pH de 7.4, 37°C.
Degradaci6n de los geles que se formaron mediante la reacci6n de moleculas que contienen tioles y acrilatos
Se disolvieron 13.9 mg de PEG-2500-3A en 69.5 microlitros (50 mg/25 microlitros) de PBS-TEA (10 mM PBS que contenia 13 microlitros de trietanolamina/ml). Se disolvieron 7.0 mg de GCYKNRDCG en 65 microlitros de PBS-TEA (2.7 mg/25 microlitros). Se agregaron los equivolumenes (25 microlitros) de las dos soluciones a las cavidades de una placa de 96 cavidades de poliestireno tratado de cultivo de tejido de fondo plano de Corning. A medida que se agregaba la segunda de las dos soluciones precursoras, se uso la punta de la pipeta para agitar la mezcla durante 2-3 segundos. Despues se permitio que los geles se asentaran a 37°C. Despues se tranfiriero0nlos geles a tubos que contenian 10 mM solucion salina regulada por pH de HEPES, pH 7.4. Se incubaron los geles a 37°C, y se siguio visualmente la desaparicion de los geles solidos. Entre los dias 14 y 21, todos los geles solidos habian desaparecido, lo que indica que se habian degradado mediante la hidrolisis del enlace de ester entre el peptido y el PEG.
Control de la velocidad de la hidr6lisis por medio del cambio en el medio ambiente local
Se disolvieron 13.9 mg de PEG-2500-3A en 69.5 microlitros (5.0 mg/25 microlitros) de PBS-TEA (10 mM PBS que contenia 13 microlitros de trietanolamina/ml). Se disolvieron 7.0 mg de GKKKKGCYKNRDCG (SEQ ID N0: 65) en 65 microlitros de PBS-TEA (2.7 mg/25 microlitros). Se agregaron los equivolumenes (25 microlitros) de las dos soluciones a las cavidades de una placa de 96 cavidades de poliestireno tratado de cultivo de tejido de fondo plano de Corning. A medida que se agregaba la segunda de las dos soluciones precursoras, se uso la punta de la pipeta para agitar la mezcla durante 2-3 segundos. Despues se permitio que los geles se asentaran a 37°C. Despues se transfirieron los geles a tubos que contenian 10 mM solucion salina regulada por pH de HEPES, pH 7.4. Se incubaron los geles a 37°C, y se siguio visualmente la desaparicion de los geles solidos. Se agregaron las lisinas extras que se encontraron en el peptido ("AGKKKK...") a modo de proporcionar nucleofilos adicionales al medio ambiente local del enlace de ester. Adicionalmente, la naturaleza cationica de los grupos tambien podria llevar a una elevacion del pH local. Se espera que la combinacion de estos dos efectos mejore la velocidad de la hidrolisis del enlace de ester entre el peptido y el polimero.
Ejemplo 6: Demostraci6n de la hidr6lisis de la plasmina de los geles que se formaron mediante la adici6n de conjugados con un peptido que contiene dos residuos de cisteina con una secuencia de sustratos de plasmina en medio, y la carencia de hidr6lisis de un peptido sustituido
Sintesis de geles mediante adici6n de conjugados
Debido a que las enzimas y los peptidos son quirales, se altero la estereoquimica de GCYKNRDCG para hacer un nucleofilo estable a la plasmina para los geles formado mediante adicion de conjugados. Este peptido estable a la plasmina fue: GCY-DLys-N-DArg-DCG (SEQ ID N0: 66). La secuencia no se altero de otra manera a fin de mantener las propiedades de solubilidad al agua extremadamente buenas del GCYKNRDCG. Se uso el HPLC C18 analitico (gradiente de acetonitrilo lineal de mas de 0.1 por ciento TFA en agua) para confirmar la estabilidad a la plasmina relativa del GCY-DLys-N-DArg-DCG. Se ejecutaron los siguientes ejemplos: plasmina; GCYKNRDCG; plasmina � GCYKNRDCG; GCY-DLys-N-DArg-DCG; y plasmina + GCYDLys-N-DArg-DCG. La plasmina (micromolar) estuvo presente al 1/1000 la concentracion del peptido (milimolar) y por tanto no afecto los cromatogramas de absorbencia sobrepuestos. La sobre-posicion de los rastros (absorbencia a 220 nm o 278 nm) de las levigaciones del peptido contra aquellas del peptido B plasmina, demostraron que la mayoria del peptido GCYKNRDCG se degrado en aproximadamente 1 hora a 37°C. El peptido GCY-DLys-N-DArg-DCG sin embargo, no se vio afectado por la plasmina a las 24 horas, y permanecio sin afectacion durante el tiempo de vida de la plasmina en la muestra (muestra que se inyecto para C18 a las 2 semanas).
Demostraci6n de la sensibilidad a la plasmina y la resistencia a la plasmina
Se fabricaron los geles de conformidad con el protocolo de 40 microlitros que se dio anteriormente. Algunos contenian el peptido GCYKNRDCG con Lys y Arg en la configuracion en L. 0tros contenian el GCY-DLys-NDArg-DCG en su lugar. Todos se expusieron a 0.2 unidades de plasmina en 200 microlitros y se incubaron a 37°C. La configuracion L-lys, L-Arg del peptido se degrado rapidamente mediante la enzima. En un caso, despues de 6 horas no quedaba ningun gel. No se ha mostrado que el gel de configuracion GCY-DLys-N-DArg-DCG se degrade mediante plasminolisis.
Ejemplo �: Incorporaci6n de peptidos dentro de geles de polietilenglicol que se formaron mediante fotopolimerizaci6n
Sintesis del gel
Se permitio que el diacrilato de polietilenglicol de peso mol. 8000 (230 mg/ml) se disolviera en solucion salina regulada por pH de HEPES (10 mmol HEPES, Sigma, 8 gramos/ litro NaCl, pH 7.4) durante 1 hora. Se agrego trietanolamina (Aldrich, 15.3 !l/ml), y se ajusto el pH de la solucion a un pH de 8 con 6N HCl. Se disolvieron los peptidos que contenian cisteina en 116.5 !l de solucion salina regulada por pH de HEPES, y se agregaron a 870 !l de la solucion de PEG con remolino. Despues de 5 minutos, se agregaron 3.5 !l de pirrolidona de N
vinilo y 10 !l de una solucion de 10mM de Eosina Y, seguido por remolino. Se formaron los geles mediante la exposicion a la luz a 75 mW/cm2 durante 1 minuto (Cermax Xenon Lightsource, que transmite luz entre 470 y 520 nm; ILC Technology, Sunnyvale, California, Estados Unidos). Se permitio que los geles se dilataran en solucion salina regulada por pH Tris, pH 7.4 (4.36 gramos Tris HCl, 0.64 gramos base de Trizma, 8 gramos NaCl, 0.2 gramos KCl por 1 litro, todos de Sigma) durante 36 horas. La interaccion de las celulas con los geles de PEG que contenian los peptidos se incorporaron mediante la adicion de conjugados en los cuales se forma el gel mediante foto-polimerizacion. Se prepararon los geles de PEG como se describio anteriormente, usando el peptido GCGYGRGDSPG. La mayoria de las celulas tienen receptores que reconocen la secuencia GRGDSPG, y las celulas interactuaran con las superficies que despliegan peptidos que contienen RGD inmovilizados. Para probar las interacciones de las celulas con los geles de PEG que contienen los peptidos que se incorporaron mediante la adicion de conjugados, se formaron los geles y se sembraron celulas endoteliales de vena umbilical humana sobre los geles. Se observo el cambio en la forma de las celulas en la superficie, lo cual indica que las celulas estaban interactuando con los peptidos en la superficie. Se hace referencia al cambio en la forma como diseminacion, y hace referencia al cambio en la forma de las celulas de esfericas a planas y poligonales en la superficie. No ocurrio ninguna diseminacion celular en los geles de PEG sin el peptido, y se confirmo la especificidad del peptido GCGYGRGDSPG mediante la comparacion con los geles que contenian el peptido GCGYGRDGSPG, el cual contiene los mismos aminoacidos, pero en una secuencia diferente, y el cual no tiene actividad biologica. Se sembraron las celulas sobre los geles a una concentracion de 400 celulas por mm2, y se conto el numero de celulas diseminadas por area a diferentes tiempos (vea Figura 6). Los experimentos se realizaron usando el medio de cultivo celular normal. Las celulas solamente se pudieron diseminar sobre los geles que contenian el peptido GCGYGRGDSPG, el cual se incorporo dentro de los geles utilizando una reaccion de adicion de conjugados.
Ejemplo �: Formaci6n de geles sensibles al pH usando reacciones de adici6n de conjugados
Se sintetizo el peptido GCCGHHHHHGCCG (SEQ ID N0: 67) como se describio anteriormente. Se disolvio el peptido (10 mg) en 15 !l de 10 mM suero regulado con fosfato, pH 7.4 y 25 !l etanol. Se ajusto el pH de la solucion a un pH de 5.8 usando 1N Na0H, y despues se agrego diacrilato de PEG, peso mol. 400 (7.5 !l, Aldrich). Se incubo la mezcla a 37°C durante 5 minutos. Se formo un hidrogel, que demostro aproximadamente un incremento del 50 por ciento en diametro despues del cambio de un pH de 7.4 a un pH de 5.8. Se polimerizaron los geles como esferas por medio de agregar la solucion gelante de arriba de 1 ml de ciclohexano que contenia 94 mg de Hypermer B239 (ICI Surfactants, Wilmington, Delaware, Estados Unidos), con sometimiento a remolino a 37°C durante 10 minutos. Se produjeron esferas con diametros que fluctuaban de 2 !m a 20 !m, lo cual demostro aproximadamente un incremento del 50 por ciento en el diametro despues del cambio de un pH de 7.4 a un pH de 5.8.
Ejemplo �: Formaci6n de particulas para las aplicaciones de administraci6n de proteinas
Se disolvio triacrilato de PEG-3400 en 50 mM solucion salina regulada por pH de HEPES, pH 8 a una concentracion del 20 por ciento (p/v), con albumina al 2 por ciento (Sigma, St. Louis, Missouri, Estados Unidos). Se disolvio el ditiol de PEG-3400 (Shearwater Polymers, Huntsville, Alabama, Estados Unidos) en 1 mM solucion salina regulada por pH de MES, pH 5.6 a una concentracion del 20 por ciento (p/v). Se mezclaron las soluciones a una proporcion de 1 acrilato: 1 tiol. Se agrego rapidamente la solucion liquida (50 !l) a 1 ml de ciclohexano que contenia 100 mg Hypermer B239 (ICI Surfactants, Wilmington, Delaware, Estados Unidos), con agitacion rapida. Se calento la mezcla a 37°C durante 30 minutos. Despues se lavaron las esferas que contenian la proteina, polimerizadas, con ciclohexano adicional para remover los tensioactivos, seguido por secado al vacio para remover el ciclohexano. Despues se volvieron a suspender las particulas en solucion salina regulada por pH de HEPES, pH 7.4. Se midio la liberacion de la proteina a partir de las micro-esferas por medio de cambiar diariamente el medio en el que se volvieron a suspender, y se evaluo la proteina en el medio para volver a suspender usando la cromatografia de exclusion de tamaro combinada con la deteccion de rayos ultravioleta a 280 nm. Las concentraciones de proteina en el medio para volver a suspender se determinaron a partir de la curva estandar de concentracion para la albumina a 280 nm.
Ejemplo 10: Apuntando las micro-esferas de triacrilato de pEG a celulas y tejidos que usan los peptidos incorporados por medio de la adici6n de conjugados
Se formaron las micro-esferas por medio de la reticulacion de adicion de conjugados del triacrilato de PEG y el peptido GCYdKNdRDCG (SEQ ID N0: 68) como en el Ejemplo 7, pero adicionalmente tambien se incluye el peptido GCGYGRGDSPG en la mezcla de reaccion, a una proporcion de 1 GCGYGRGDSPG para 8 GCYdKNdRDCG. Se probo el peptido bio-activo para ver su capacidad para localizar las micro-esferas para las superficies de las celulas, en comparacion con las micro-esferas que no contenian ningun peptido bio-activo.
Ejemplo 11: Encapsulaci6n del farmaco y administraci6n mediante los geles que se fabricaron mediante la adici6n de conjugados
Debido a que las condiciones para formar los geles de PEG mediante la adicion de conjugados son bastante benignas (temperatura ambiente a 37°C, pH de aproximadamente 8.0, en solvente acuoso), se incorporan farmacos tales como farmacos de proteinas dentro de los geles para la administracion. Estas condiciones benignas no desnaturalizan a la mayoria de las proteinas. El farmaco se incorpora en un numero de maneras. En un metodo, la proteina u otro farmaco (soluble en agua, etanol, acetonitrilo u otro solvente tanto para el PEG como para el peptido sensible a la enzima y el cual se puede intercambiar por un regulador de pH acuoso) se entrampa en los espacios del poro del gel durante la formacion del gel. Debido a que las cisteinas libres son relativamente raras en la proteinas naturales, uno necesita preocuparse solamente por la minoria de casos en los que la proteina se reticulara al gel. Tambien, la selectividad de la reaccion es bastante buena debido a que la adicion de los compuestos no saturados conjugados a otros neutrofilos en las proteinas (hidroxilos y aminas) es extremadamente lenta en comparacion con los sulfhidrilos. Cuando el farmaco es mas grande que los espacios del poro en su estado dilatado, como lo controla el peso molecular y las concentraciones de los precursores, entonces el farmaco no se difunde hacia afuera del gel a una velocidad apreciable sino que mas bien se libera mediante la degradacion enzimatica superficial del gel.
Control difusivo y degradante de la liberaci6n de proteinas: Liberaci6n de mioglobina despues del entrampamiento en los espacios de poro del gel
Se libero mioglobina de la proteina (17,000 Da) a partir de los hidrogeles que se fabricaron mediante la adicion de conjugados entre los tioles y los acrilatos. Se mezclo PEG-3500-3A a 0.2 gramos/ml en PBS, pH 7.4 con una solucion del peptido sensible a la plasmina GCYKNRDCG, de manera que la concentracion de tioles y acrilatos fue la misma y la concentracion final de PEG-3500-3A fue del 10 por ciento (solucion precursora). A algo de la solucion precursora, se agrego mioglobina (5.2 !l de 9.8 mg/ ml solucion de mioglobina por 195 !l de solucion precursora). Se selecciono la mioglobina como una proteina modelo para los factores de crecimiento, tal como BMP-2, debido a su tamaro similar. Se hicieron 200 !l alicuotas de solucion precursora con y sin mioglobina sobre esponjas de colageno hemostatico. A algunas esponjas de control se agregaron 5.2 !l de los 9.8 mg/ml de solucion de mioglobina, sin precursores de gel. A algunas esponjas, se agrego PBS en lugar de mioglobina. Despues de que los geles se hubieron solidificado dentro de las esponjas, se incubo cada muestra en 4 ml de 10 mM PBS, pH 7.4, que contenia azida de sodio al 0.1 por ciento, para evitar la contaminacion bacteriana y fungal. A las 6 horas, 12 horas, 24 horas, 2 dias, 3 dias, 7 dias, y 13 dias, se removio la fase de solucion de cada muestra y se reemplazo con PBS fresco con azida de sodio al 0.1 por ciento. Despues del dia 13, se reemplazaron las soluciones con 0.08 unidades de plasmina en 4 ml de PBS, marcandose la discontinuidad mediante la linea vertical en la Figura 7. Se desarrollaron las soluciones usando el micro-ensayo de proteina Bradford de BI0RAD y se compararon con la curva estandar que se hizo a partir de las soluciones de mioglobina de concentracion conocida. Las muestras con la mioglobina dentro del material del hidrogel mostraron una liberacion retardada de la mioglobina (difusion limitada) pero liberaron, despues de la degradacion del hidrogel mediante la plasmina de la enzima, una cantidad total de proteina sin diferencia con el total que se libero a partir de las esponjas solas (sin hidrogel) (no se muestran los datos).
Liberaci6n empleando sitios de afinidad incorporados
En otro metodo, los farmacos tal como la heparina que fija los factores de crecimiento, se separan de manera electrostatica dentro del gel. Este metodo es efectivo para entrampar compuestos de peso molecular relativamente bajo que de otra manera se difunden afuera del gel a traves de sus poros, especialmente en el estado dilatado del gel. La separacion se consigue en una variedad de metodos. En un primer planteamiento, uno incluye durante la formacion del gel, mediante la adicion de conjugados, un peptido fijador de heparina que contienen una o mas cisteinas (es decir, el peptido puede ser colgante o servir como reticulante), heparina, y el factor de crecimiento fijador de heparina. En un segundo planteamiento, uno fabrica sus propias proteinas no naturales con tecnicas biologicas moleculares y disera regiones fijadoras de heparina en donde ninguna (o en donde solamente unas de poca afinidad) existia antes. En un tercer planteamiento, uno fabrica proteinas no naturales que contienen cisteinas sin impares. Despues uno acopla de manera covalente la proteina por medio de este enlazador de cisteina al gel durante el proceso de formacion del gel. En un cuarto planteamiento, uno disera tanto una cisteina impar, como una region sensible a la enzima dentro de una proteina no natural. Esta proteina tambien se incorpora de manera covalente dentro de los geles de adicion de conjugados en la formacion del gel, pero esta proteina se libera en la presencia de la proteasa apropiada, la cual puede ser la misma que degrada el volumen del gel o una enzima diferente. En un quinto caso, uno fabrica un mimico de la heparina que contiene un tiol, por ejemplo, un residuo cys, o una insaturacion conjugada y la incorpora de manera covalente dentro del material en la presencia de un factor de crecimiento fijador de heparina, de manera que el factor de crecimiento se separa de manera electroestatica.
Incorporaci6n de la afinidad del factor de crecimiento y separaci6n de los factores de crecimiento para la liberaci6n prolongada
Las proteinas fijadoras de heparina que incluyen los factores de crecimiento fijadores de heparina se fijan de manera no covalente al material en la formacion del material. Si la proteina que se va a fijar no contiene una secuencia fijadora de heparina nativa, se construye una proteina de fusion (usando tecnicas biologicas
moleculares e iniciando a partir del nivel del ADN), para contener la secuencia de la proteina nativa y un dominio de fijacion de heparina sintetico. Por ejemplo, el factor de crecimiento del nervio (NGF) se expresa como un proteina de fusion en la E. Coli de manera que la proteina contiene un dominio de fijacion de heparina en el termino N y la secuencia de NGF en el termino C de la proteina. Esto se consigue por medio de construir un gen sintetico que contiene el ADN que codifica para la proteina de fusion deseada. La secuencia de la proteina que se va a expresar es como sigue: MgSHHHHHHSSGLVPRGSHMKDpKRLYRSRKLpVELESSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEV MVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVC VLSRKAVRZ (SEQ ID N0: 69) en donde la region en cursivas es la etiqueta de la Histidina que se deriva a partir del vector de expresion, y la region subrayada es el sitio de disociacion de la trombina. Los aminoacidos que aparecen en negritas denotan la secuencia de fijacion de la heparina. El plasmido de clonacion que se usa para el ensamble del gen es el pUC18. La secuencia de ADN del gen es como sigue de 5= a 3=: GAATTCCCATGGCATATGAAAGACCCGAAACGTCTGTACCGTTCTCGTAAACTGCCCGTGGAACTCGAGAGC TCTTCCCACCCGATTTTCCATCGTGGCGAGTTCTCCGTGTGTGACTCTGTCTCTGTATGGGTAGGCGATAAA ACCACTGCCACTGATATCAAAGGCAAAGAGGTGATGGTGCTGGGAGAAGTAAACATTAACAACTCTGTATTCA AACAGTACTTCTTCGAAACTAAGTGCCGTGACCCGAACCCGGYTAGACTCTGGGTGTCGCGGCATCGATTCT AAACACTGGAACTCTTACTGCACCACTACTCACACTTTCGTTAAAGCGTTGACTATGGATGGTAAACAGGCTG CCTGGCGTTTCATCCGTATCGATACTGCATGCGTGTGTGTACTGTCCCGTAAAGCTGTTCGTTAAGGATCC (SEQ ID N0: 70). Este gen se inserto entre los sitios EcoRI y HindIII en la region de clonacion poli-enlazadora de pUC18. Despues del ensamble, se inserto este gen dentro del vector de expresion. Despues se realizo la expresion y la purificacion. Usando la sintesis de peptidos Fmoc estandar que se describio anteriormente en el Ejemplo 1, se sintetizo un peptido de fijacion de heparina, tal como el GCGK( �A)FAKLAARLYRKA (SEQ ID N0: 71; vea Tabla 5). Para la formacion del material, se incubo previamente el peptido con el precursor no saturado conjugado; la proteina de fusion se incubo previamente con la heparina; despues se agrego el complejo de proteina de fusion-heparina a la insaturacion del peptido de manera que el peptido se acoplo de manera covalente a la insaturacion conjugada y simultaneamente la heparina formo un puente no covalente entre el peptido y la proteina. Despues se agrego el precursor reticulante que contenia el tiol, y se formo el material con la proteina de fijacion de heparina en todo respecto.
Incorporaci6n covalente de las proteinas y potencial para la liberaci6n que se controla de manera enzimatica
Se construyo una proteina de fusion para que contuviera la proteina de interes y en un termino, una secuencia de peptidilo corta degradable mediante una enzima, tal como la plasmina, y una cisteina lejos del sitio para la proteolisis. La cisteina permite la incorporacion covalente de la proteina en el material en la formacion del material. El sitio para la proteolisis permite la liberacion de la proteina en su forma nativa a una velocidad que se determina mediante la actividad celular, por ejemplo, la activacion de las proteasas tales como la plasmina o la colagenasa que se usan en la migracion de las celulas. Se puede controlar la liberacion de la proteina mediante la misma o una enzima diferente que la que degrada el material mismo. Tambien existen casos en donde se desea la fijacion covalente de la proteina al material sin liberacion enzimatica. En estos casos, la proteina se disera iniciando a partir del nivel del ADN para contener una cisteina impar (por ejemplo, en uno de los terminos de la proteina), pero sin un sitio nuevo para la proteolisis. Por ejemplo, se modifico el ADN para el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) usando la mutagenesis dirigida al sitio para introducir una cisteina cerca del termino N de la proteina. Se usaron tecnicas biologicas moleculares para sintetizar, purificar y plegar la proteina. Se incubo la proteina con triacrilato de PEG con acrilatos en exceso de tioles en la proteina. Se agrego un peptido sensible a la plasmina que contenia dos tioles (GCYKNRDCG) para reticular el material con el factor de crecimiento que se incorporo todo a traves.
Ejemplo 12: Liberaci6n de farmacos (que incluyen farmacos sin proteina) a partir del material por medio de pro-farmacos enlazados de manera covalente, los cuales se pueden liberar como farmacos mediante la prote6lisis
Se describe otro metodo para la incorporacion covalente de pro-farmacos dentro de un material. Uno puede liberar un pro-farmaco a partir de un material en donde el material sea soluble. Se usan modificaciones de peso molecular grandes para modular el tiempo de circulacion, poner en objetivo el pro-farmaco, tolerancia inmune y modo de captacion celular. Se desea un enlace portador-farmaco estable para el transporte. Sin embargo, es de interes un enlace que se pueda disociar despues de la llegada a la ubicacion deseada. Es apropiado un enlace de amida en donde un constituyente del enlace sea un aminoacido en L que reconozca una enzima proteolitica. Kopecek y colaboradores (Pato. J., M. Azori, K. Ulbrich, y J. Kopecek, Makromol. Chem. 185:321237, 1984) han publicado mucho con respecto a estos portadores de farmaco macromoleculares solubles degradables de manera enzimatica. Sin embargo, aparece poco trabajo con respecto a la liberacion de farmacos controlada de manera enzimatica a partir de materiales solidos, tales como los hidrogeles. La
liberacion a partir de un material solido sirve para localizar la liberacion de farmacos a un sitio deseado, por ejemplo, el sitio de la formacion del material. La liberacion a partir de un material solido en donde la liberacion del farmaco se realiza mediante la actividad extra-celular, tal como la expresion de las enzimas proteoliticas, controla la velocidad de liberacion de manera que la actividad celular (por ejemplo, la migracion de las celulas) determina la velocidad de la liberacion. Los grupos funcionales de un farmaco (tal como los farmacos anti-cancer doxorrubicina o daunorrubicina) estan protegidos con la excepcion de los grupos funcionales de amina. Los grupos de amina en el farmaco se acoplan a un aminoacido o peptido mediante la formacion de un enlace de amida. El aminoacido o peptido se seleccionan para que sean de terminal amino degradable con el aminoacido (Y) o el peptido (XXXXY; SEQ ID N0: 72), debido a el enlace de amida que une el aminoacido o el peptido al farmaco, mediante una enzima proteolitica, tal como la plasmina que disocia la terminal amino a la lisina y la arginina. Ya sea que se incluya el tiol (por ejemplo, cisteina) en el peptido acoplado o se acopla despues al aminoacido o porcion del peptido del conjugado de peptido-farmaco. Se les quita la proteccion al farmaco y los grupos funcionales del peptido (para dar SH-XXXXY-farmaco). En la formacion del material, el conjugado tiol-peptido-farmaco se acopla de manera covalente al material a modo de adicion de conjugados del tiol sobre una insaturacion conjugada en el precursor del material. El farmaco se libera a partir del material mediante la actividad enzimatica, tal como la plasminolisis, que disocia el enlace de amida (Y-farmaco) que enlaza el farmaco al material. De manera alternativa, los grupos funcionales de un farmaco (tal como el diclofenaco antagonista de la prostaglandina) se protegen con la excepcion de los grupos funcionales de carboxilo. Se activan los grupos carboxilo y se acoplan a un peptido mediante la formacion de un enlace de amida en el termino amino del peptido. El peptido se disero para contener un tiol (por ejemplo, cisteina) y para que fuera de terminal carboxilo degradable para el peptido, en consecuencia en el enlace de amida que une el peptido al farmaco, mediante una enzima proteolitica que disocia la terminal carboxilo en los aminoacidos especificos (Y). Se quita la proteccion del farmaco y los grupos funcionales del peptido. En la formacion del material, el conjugado de tiolpeptido-farmaco (farmaco-YXXXX-SH se acopla de manera covalente al material a modo de adicion de conjugados del tiol sobre una insaturacion conjugada en el precursor del material. El farmaco se libera a partir del material mediante la actividad enzimatica que disocia el enlace de amida (farmaco-Y) que enlace el farmaco al material.
Ejemplo 13: Regeneraci6n de Tejidos
Formaci6n de hueso ect6pico (subcutaneo) en ratas
Se fabricaron los materiales esencialmente de conformidad con el Ejemplo 3, pero bajo condiciones esteriles y con el PEG-3500-3A, una proporcion molar de acrilatos: tioles de 1:1, y una proporcion molar de GCGYGRGDSPG: acrilatos de 2. Al tiempo de la formacion del gel, se agrego un factor de crecimiento humano recombinante, el BMP-2, el cual induce la formacion de hueso, a la solucion precursora a una concentracion de 250 !g/ml de solucion precursora. Se agrego la solucion precursora a las esponjas de colageno hemostatico (Helistat; 8 milimetros diametro, aproximadamente 3.5 milimetros altura). Se agrego la solucion precursora hasta que las esponjas no pudieron absorber mas solucion (aproximadamente 160 !l). Se permitio que los geles se solidificaran en las esponjas. Se lavaron brevemente los geles con PBS, despues se mantuvieron humedos de manera minima hasta la implantacion de manera subcutanea en ratas. Se removieron los implantes despues de dos semanas, se fijaron, y se mancharon con hematoxilina y eosina. Los materiales se infiltraron bien mediante celulas con muy poco material residual restante y formacion de hueso promovida (mineralizacion y formacion de medula osea) y vascularizacion. Esto indica que los materiales pueden liberar bio-moleculas activas (por ejemplo, factores de crecimiento) y se pueden infiltrar mediante celulas in vivo.
Regeneraci6n de hueso
Los materiales del hidrogel pueden ser utiles en la regeneracion de hueso en una variedad de situaciones de curacion, por ejemplo, despues de un trauma, remocion de tumores, o fusion espinal. En un ejemplo, el material de hidrogel, por ejemplo, como se describio anteriormente, se aplica en el espacio dentro de una jaula de fusion espinal, que contiene dentro de ese material una proteina morfogenetica de hueso, tal como una BMP-2, TGF, o BMP-7. Esta formulacion bio-activa es util para mejorar la probabilidad de la fusion espinal exitosa dentro de la jaula. El uso de un material asi puede circunvenir algunas de las dificultades con los metodos quirurgicos actuales, tales como el llenado del espacio dentro de la jaula con aloinjerto de hueso amorfo (que se asocia con la transmision de enfermedades y el costo elevado) y el llenado del espacio con auto-injerto de hueso, por ejemplo, que se obtuvo a partir de la cresta iliaca (que se asocia con mortalidad adicional y costos de hospital).
Regeneraci6n de piel
El material de hidrogel puede ser util en la curacion y regeneracion de la piel, por ejemplo, en el cierre de ulceras en el pie de diabeticos, llagas por presion, y ulceras por insuficiencia venosa. Un hidrogel, por ejemplo, como se describio anteriormente, se puede usar para liberar factores de crecimiento que mejoran el cierre de estas heridas, tales como factor de crecimiento de celulas endoteliales vasculares, un TGF �, activina, factor de crecimiento de queratinocito, factor de crecimiento que se deriva de la plaqueta, factor de crecimiento epidermico, o un numero de otros factores de crecimiento. Se pueden incorporar estos factores de crecimiento dentro del hidrogel ya sea mediante entrampamiento o mediante afinidad bio-especifica (por ejemplo, mediante afinidad por la heparina).
5 Ejemplo 14: Hidrogel y Materiales No de Hidrogel para Llevar Cargas Estructurales
Materiales estructurales que se forman mediante reacciones de adici6n de conjugados
Se combinaron tetraquis(3-mercaptopropionato)(QT) de pentaeritritol (424 mg) y 997 mg de diacrilato de
10 polietilenglicol 570 (PEGDA) puro y se mezclaron bien mediante someterlos a remolino. Se removieron las burbujas de aire mediante sonificacion. Se agrego solucion de PBS 0.01 M que se preparo a un pH de 9.0 (10 mM PBS ajustado a un pH de 9.0 con trietanolamina (Et0H3N) que se mezclo con un volumen igual de 10 mM PBS ajustado a un pH de 9.0 con 1N Na0H) (473 mg) a los precursores mezclados. Se volvio a someter a remolino la mezcla durante aproximadamente 2 minutos para mezclar bien y dispersar los precursores en la
15 solucion acuosa. Despues del remolino, se sonifico nuevamente la mezcla para remover las burbujas de aire. A la temperatura ambiente, el material se gelo en aproximadamente 20 a 30 minutos. El gel resultante demostro una resistencia final de aproximadamente 2 MPa y aguanto deformaciones de aproximadamente 35 por ciento en compresion (Figura 8).
20 Control de las propiedades mecanicas mediante hidrofobicidad (triacrilato de pentaeritritol)
Se mezclaron QT y el triacrilato de pentaeritritol a una proporcion de 489 mg para 596 mg (mezcla 1). Se mezclaron el QT y PEGDA 570 a la proporcion que se indico anteriormente (mezcla 2). Se combinaron 100 mg de la mezcla 1 con 650 mg de la solucion 2 y se agregaron 250 mg de PBS a un pH de 9.0 y la mezcla
25 completa se sometio a remolino para mezclarla. Se prepararon geles similares para 200, 300, y 400 mg de la mezcla 1. A estos se les agregaron 550, 450 y 350 mg de la mezcla 2, respectivamente. A todos estos se les agregaron 250 mg del regulador del pH activador. Los geles resultantes demostraron una modulacion de las propiedades mecanicas usando la adicion de un co-precursor hidrofobo. Un incremento en el contenido del TA hidrofobo incremento la rigidez del gel resultante (Figura 9).
�ariaci6n de la proporci6n de tioles con acrilatos
Se combinaron el QT y PEGDA 570 puros para conseguir proporciones de tiol para acrilato de 0.8, 0.9, 1.0, 1.1,
1.3 por medio de agregar la cantidad apropiada de QT para 1000 mg de PEGDA 570 y agregando PBS 9.0 en 35 una cantidad para hacer geles solidos al 75 por ciento en peso. Como un ejemplo, para la proporcion de tiol de
0.8 a acrilato, se agregaron 343 mg de QT a 1000 mg de PEGDA. Se mezclaron los dos componentes mediante remolino y despues se agregaron 448 mg de PBS 9.0. Nuevamente se sometio a remolino la mezcla y se permitio que se gelara. A las proporciones de tiol/acrilato desde 1, los geles resultantes exhibieron decrementos significativos en la resistencia final. A las proporciones desde 1.0 a 1.3, los geles fueron menos
40 sensibles a los cambios en la proporcion de tiol/acrilato. La tabla mas adelante (Tabla 8) presenta las resistencias finales que se obtuvieron en cada una de las proporciones de tiol/acrilato.
Tabla �: Resistencias finales de los geles con diferentes proporciones de tiol/acrilato
Tiol/Acrilato
Resistencia Final
.8
0.89 � 0.79
.9
0.64 � 0.07
1.0
2.21 � 0.12
1.1
2.29 � 0.13
1.2
1.93 � 0.24
1.3
1.82 � 0.23
Control de propiedades mecanicas mediante la adici6n de particulas
Se combinaron los precursores, QT y PEGDA 570 como se describio anteriormente. Antes de la adicion del regulador del pH activador (PBS a pH 9.0), se agregaron particulas de BaS04 al 10 por ciento en peso, fixe de 50 equilibrio (0.8 !g), a los precursores mezclados. Se agrego el regulador del pH activador y despues se sometieron a remolino las mezclas completas y despues se permitio que se gelaran. Se usaron las mismas
cantidades de precursores, como se anoto en el ejemplo anterior. Los geles que resultaron de la adicion del BaS04 mostraron algun incremento en la resistencia final e incremento sustancial en la rigidez (Figuras 10 y 11). Tambien se prepararon geles de QT y PEGDA 570 que se cargaron con particulas de silice ahumadas (14 nm). Se combinaron 424 mg de QT con 997 mg de PEGDA. Antes de la adicion del regulador del pH de PBS con un pH de 9.0, se cargo el regulador del pH con silice ahumado al 10 por ciento. Se agregaron 250 mg de la mezcla de PBS-silice ahumado a la mezcla de QT/PEGDA y despues se sometieron a remolino para mezclarlos. Los geles que resultaron a partir de la adicion del silice ahumado, mostraron incrementos significativos en la resistencia final. La Figura 12 presenta la curva de tension esfuerzo para los geles de silice ahumado en la compresion de sub falla. A 4 MPa en compresion, estos geles no habian fallado.
Mejoramiento de las propiedades mecanicas mediante el uso de emulsificantes
Se prepararon los geles mediante la adicion de monooleato de sorbitan al regulador del pH de PBS a un pH de
9.0 a 4 por ciento en peso antes de la adicion del regulador del pH a los precursores mezclados, QT y PEGDA
570. Despues se agrego la mezcla de tensioactivo/regulador del pH a un pH de 9.0 a los precursores mezclados. De otra manera se usaron las mismas cantidades y procedimientos, como se noto anteriormente. Los geles resultantes exhibieron un incremento similar en la resistencia final en comparacion con los geles con particulas inorganicas que se agregaron pero sin el incremento asociado en rigidez (Figuras 10 y 11).
preparaciones de materiales en solventes que incluyen solventes organicos
Se combinaron QY y PEGDA en las proporciones que se indicaron anteriormente. Estos precursores se disolvieron despues al 10 por ciento en peso en pirrolidona de N-metilo (NMP) y despues se permitio que se gelaran. Despues de que los geles se curaron durante 24 horas, se colocaron en agua desionizada para permitir el intercambio de solventes. Durante el intercambio de solventes, se redujo el volumen de los geles en 60 por ciento a un volumen de equilibrio nuevo. Los geles equilibrados resultantes mostraron una respuesta elastica suave a la compresion a cargas bajas y un incremento en la rigidez con alta deformacion en la compresion. La Figura 13 muestra un curva tipica de tension esfuerzo para este material.
Modulaci6n de las propiedades mecanicas mediante la adici6n de aditivos hidr6filos
Se combinaron el QT y PEGDA 570 en las proporciones que se indicaron anteriormente. Se disolvio poli(vinilpirrolidona) (40,000 MW) (PVP) en el regulador del pH del PBS con un pH de 9.0 al 1, 7, y 13 por ciento. Estas mismas cantidades de la mezcla precursora y la solucion de regulador del pH/PVP se combinaron como se indico anteriormente, Se sometio a remolino la mezcla y se permitio que se gelara. Estos geles demostraron la manipulacion de las propiedades mecanicas debido a la adicion del aditivo hidrofilico. La adicion del PVP incremento la dilatacion de equilibrio del gel y un incremento en el contenido de PVP incremento adicionalmente la dilatacion. Una adicion de PVP tambien dio como resultado un gel mas suave, mas debil.
Cinetica de la gelaci6n de QT y pEGDA 5�0
Se combinaron el Qt y PEGDA puros en las proporciones que se indicaron anteriormente. Despues de mezclar el QT y PEGDA 570 mediante remolino, no se agrego regulador del pH sino que en su lugar se colocaron 100 microlitros de la mezcla entre placas de 20 milimetros de un reometro CV0 120 con un intervalo de 100 um a la temperatura ambiente. Las mezclas se mantuvieron a la temperatura ambiente mientras que el modulo elastico, el modulo del complejo y la viscosidad se siguieron con el tiempo que usa el corte a 1 Hz con una amplitud de esfuerzo de 0.3. Con el progreso de la reaccion, los dos precursores combinados mostraron un punto de gel, que se define por el tiempo cuando el modulo elastico se hace mayor que el modulo del complejo, de aproximadamente 14 horas. La Figura 14 muestra estos dos modulos para los precursores que se combinan con el tiempo. Despues, se combinaron mas de dos precursores como se describio anteriormente y se agrego el regulador del pH de PBS a un pH de 9.0, como se describio anteriormente. Despues de mezclar los precursores y el regulador del pH, se coloco la mezcla entre las placas del reometro a 37°C. La frecuencia y la amplitud fueron las mismas que en el procedimiento anterior. Con la adicion del regulador del pH, la cinetica de la gelacion se incremento de manera dramatica. A los 37°C el punto de gelacion ocurrio en aproximadamente 11 minutos. La figura 15 presenta los modulos para los precursores que se activaron con el regulador del pH con pH de 9.0.
Bio-compatibilidad de los geles en los sitios del tejido
Los precursores, QT, PEGDA 570, los reguladores del pH, y el monooleato de sorbitan se filtraron esterilizados. Se esterilizaron las particulas Blanc Fixe mediante autoclave. Se prepararon espigas de gel usando los precursores, Blanc Fixe y monooleato de sorbitan. Se prepararon otras espigas usando solamente los dos precursores. Las espigas de gel que se prepararon con solamente los dos precursores, se prepararon usando el mismo procedimiento que se cito anteriormente, excepto que la mezcla activada y sometida a remolino se coloco en moldes para formar espigas antes de la gelacion y se prepararon las espigas de gel que contenian la particula inorganica y el tensioactivo por medio de combinar los procedimientos que se describieron anteriormente. Las espigas se implantaron dentro de los musculos dorsales derecho e izquierdo de conejos.
Tambien se usaron espigas de referencia de polietileno. Despues de 4 semanas se realizaron las secciones histologicas de los implantes y el tejido circundante. Con los dos tipos de geles que se probaron, no hubo diferencias significativas aparentes en comparacion con los materiales de referencia. Se asociaron macrofagos raros, fibroblastos y neovasos con las espigas de gel que se implantaron. No se indujo necrosis, degeneracion ni ninguna otra seral de intolerancia por parte de estas composiciones de gel. Se puede mejorar la toxicidad y la bio-compatibilidad de los precursores de peso molecular bajo por medio de hacer reaccionar previamente los precursores a cantidades que resultan en precursores de peso molecular mas elevado con los grupos funcionales restantes. El QT se habia funcionalizado 10 veces en exceso de PEG-DA
570. El resultado de este proceso es un acrilato tetra-funcional que consiste de cada tiol del QT que se cubre con un diacrilato que deja un acrilato terminal libre. Una reaccion similar con el QT en exceso da una clavija que se cubre en cada extremo con tres tioles libres que dan un tiol hexa-funcional. La combinacion de estos precursores con una proporcion 1:1 de tiol a acrilato, da geles similares como los que se obtuvieron mediante la aplicacion directa del QT y PEGDA 570 (refierase a las Figuras 10 y 11, que anotan los valores de HT y QA).
Control de las propiedades mecanicas mediante la preparaci6n de los materiales a partir de los precursores de peso molecular mezclado
Los sistemas reticulados de polimero funcional final han mostrado que las propiedades mecanicas se pueden manipular mediante el uso de distribuciones de peso molecular de multiples modos. Al incluir un contenido molar bajo de un precursor de peso molecular elevado en un sistema de peso molecular bajo, tiene un efecto sinergico que da propiedades mecanicas mejoradas que se pueden conseguir mediante cualesquiera de los pesos moleculares solos. Las redes que contienen solamente cadenas cortas son quebradizas y las redes que contienen solamente el componente mas grande tienen una resistencia final muy baja. Mientras tanto, los sistemas de modo doble que tienen predominantemente las cadenas pequeras con una proporcion molar pequera del componente mas grande, muestran redes con una resistencia final elevada en comparacion con el sistema de peso molecular mas grande y con extensibilidad mejorada en comparacion con el sistema de un solo modo de cadena corta (Pathak, supra, Llorente, M.A. y colaboradores, J. Polym. Sci. Polym. Phys. Ed., 19:621, 1981) El contenido molar bajo de un precursor de peso molecular mas grande (es decir, PEGDA 20,000 o PEVAL 20,000) puede reemplazar algo del PEGDA 570, lo que crea un sistema de dos modos. Se pueden combinar los tres sistemas precursores (es decir, QT, PEGDA 570 y PEGDA 20,000) en un sistema acuoso a un pH que proporciona suficiente cinetica de reaccion. Los resultados son geles mas fuertes. El equilibrio hidrofilo/hidrofobo de este tercero (precursor de peso molecular mas grande) tambien se puede aprovechar para propiedades moduladas adicionales.
Ejemplo 15: preparaci6n de Materiales que Responden a las Condiciones Ambientales
Sensibilidad a la temperatura de los precursores
Si los precursores son sensibles a la temperatura (es decir, solubles por debajo a la temperatura critica por debajo de los 37°C e insoluble por arriba de la misma temperatura) pero que todavia poseen grupos no saturados de tiol o conjugados, se pueden usar para preparar geles con manipulacion sencilla durante el mezclado, pero muestran las propiedades incrementadas que exhibieron los geles que se obtuvieron con los precursores hidrofobicos. Para este proposito, se pueden usar grupos funcionales ya sea telequelico o injertados sobre poli(N-isopropilacrilamida), poli(propilenglicol-co-etilenglicol), u otros polimeros sensibles a la temperatura. Los precursores se pueden disolver en agua a una temperatura por debajo de la temperatura critica. Las soluciones precursoras se pueden combinar y se permite que se gelen. Si el gel experimenta un incremento en la temperatura por arriba de la temperatura critica, entonces el gel experimentara una transicion a un estado mas hidrofobo. La transicion puede o no puede asociarse con la sineresis dependiendo del disero de los precursores sensibles a la temperatura y las concentraciones originales.
Sensibilidad al pH de los precursores
Si los precursores son sensibles al pH (es decir, solubles por arriba o por debajo de un pH critico) pero todavia poseen tiol o grupos no saturados conjugados, se pueden usar para preparar geles con manipulacion sencilla durante el mezclado pero muestran las propiedades mejoradas que exhibieron los geles que se obtuvieron con los precursores hidrofobicos. Para este proposito se pueden usar grupos funcionales ya sea telequelicos o injertados sobre poli(N-iso-propilacrilamida-co acido acri-lico), poli(N-isopropil-acrilamida-co dimetilaminometacrilato) o poli(acido acrilico), u otros polimeros sensibles al pH. Se puede alterar la solubilidad de estos materiales mediante el pH. Las soluciones precursoras se pueden combinar y se permite que se gelen. Un cambio de pH en el medio ambiente, cambia la hidrofobicidad del gel por medio de protonar o desprotonar el gel. La transicion se puede o no se puede asociar con la sineresis, dependiendo del disero de los precursores sensibles al pH y las concentraciones originales.
Ejemplo 16: formaci6n de un biomaterial reticulado que contiene la cadena lateral de paclitaxel acoplada a pEG mediante un enlazador que contiene tiol
Una molecula enlazadora que contiene tiol fue unida a un compuesto modelo, la cadena lateral de paclitaxel (figura 16). Este producto fue posteriormente unido a una insaturacion conjugada enlazada mediante PEG (figura 16) y los grupos insaturados conjugados enlazados mediante PEG remanentes fueron reticulados para formar un biomaterial. En terminos de quimicas de union, este compuesto modelo provee un modelo barato de paclitaxel, y los resultados obtenidos con este derivado son relevantes al trabajo con la molecula completa de paclitaxel, asi como otras moleculas organicas que contienen un grupo alcohol o amino.
preparaci6n de ester metilico de 2-O-(3-tio-propionato) de la cadena lateral de paclitaxel
PASO A) Preparacion de acido �-tritiltio-propionico
Una solucion de 0.87 ml (10 mmoles) de acido 3-mercapto-propionico y 2.86 g (11 mmoles) de trifenilmetanol en 40 ml de N,N-dimetilformamida (DMF) fue agitada por 30 minutos a 601C. Despues de que la solucion fue enfriada a temperatura ambiental, se aradieron 1.43 ml (11.4 mmoles) de eterato de borotrifluor y la mezcla de reaccion fue agitada a 601C por cuatro horas. La solucion fue concentrada al vacio y el residuo fue disuelto en 500 ml de NaHC03 al 5%. La solucion acuosa fue lavada con 250 ml de eter dietilico, acidulada a un pH de 3 usando KHS04 1M, y extraida dos veces con 500 ml de acetato de etilo. Las fracciones combinadas de acetato de etilo fueron lavadas con 250 ml de solucion salina y secadas sobre Na2S04. El producto fue obtenido como un solido blanco en un rendimiento del 90%. RMN-1H (CDCl3) � 2.23 (t, 2H, CH2S), 2.46 (t, 2H, CH2C00H), 7.23-7.43 (m, 15H, Trt)
PASO B) preparacion de (ester metflico de �-benzoil-(2R,�S)-2O-(�-tritiltio-propionato)-�-fenil-isoserina) de la cadena lateral de paclitaxel, modificada, protegida
Una solucion de 120 mg (0.4 mmoles) de ester metilico de N-benzoil-(2R,3S)-2-0-(3-tritiltio-propionato)-3-fenilisoserina y 280 mg (0.8 mmoles) de acido 3-tritiltio-propionico en 4 ml de diclorometano y 1 ml de DMF fue enfriada a 01C. Luego se aradieron 126 !l (0.8 mmoles) de diisopropilcarbodiimida y unos cuantos cristales de dimetilaminopiridina fueron aradidos y la reaccion fue agitada a 01C por dos horas. Despues de que estuvo completa la reaccion con base en el analisis TLC de la mezcla de reaccion, los solventes fueron removidos al vacio, y el producto crudo fue disuelto en 50 ml de diclorometano. La solucion organica fue lavada con KHS04 1M, 5% de NaHC03, y solucion salina, en forma consecutiva, y secada sobre Na2S04. Despues de purificacion por cromatografia de columna (silice, levigante: acetato de etilo/hexano 1:2 v/v), se obtuvo un solido blanco con un rendimiento del 74%. RMN-1H (CDCl3) � 2.00-2.55 (m, 4H, CH2S y CH2C00), 3.67 y 3.73 (s, 3H, 0CH3), 5.51 y 5.38 (d, 1H, CH0),
5.72 y 5.83 (d d, 1H, CHPh), 6.35 y 6.96 (d, 1H, NH), 7.15-7.59 (m, 23H, Ar Tax y Trt), 7.96 y 7.76 (d t, 2H, Ar Tax) RMN-13C (CDCl3) � 27.71 y 26,68 (CH2S), 35.67 y 33.46 (CH2C00), 52.78 y 52.88 (CHPh), 5.31 y 53.44 (HC0),
66.96 y 67.14 (C(Ph)3 Trt), 74.82 y 74.53 (0CH3), 126.58-144.66 (Ar Tax y Trt), 165.41 y 166.86 (C00Me),
168.19 (C00CH), 170.48 (C0NH)
PASO C) 0esproteccion para formar ester metflico de 2-�-(tio-propionato) de la cadena lateral de paclitaxel (ester metflico de �-benzoil-(2R,�S)-2-O-(�-tio-propionato)-�-fenil-isoserina)
Una solucion del compuesto tritil protegido en diclorometano fue aradida a una solucion de TFA triisopropilsilano, y agua (95:2.5:2.5), y la mezcla de reaccion fue agitada a temperatura de habitacion por una hora. Los solventes fueron removidos al vacio, y el producto fue obtenido despues de cromatografia en columna (silice, levigante: acetato de etilo/hexano 1:2 v/v). RMN-1H (CDCl3) � 1.59-1.64 (m, 1H, SH), 2.67-2.77 (m, 4H, CH2SH y CH2C00), 3.76 (s, 3H, 0CH3), 5.50 (d, 1H, CH0), 5.90 (d d, 1H, CHPh), 7.04 (d, 1H, NH), 7.26-7.80 (m, 8H, Ar Tax), 7.81 (d 5, 2H, Ar Tax) RMN-13C (CDCl3) � 19.56 (CH2SH), 38.15 (CH2C00), 52.94 (CHPh), 53.42 (CH0C0), 74.63 (0CH3), 126.56
137.39 (Ar Tax), 166.89 (C00Me), 168.28 (C00CH), 170.41 (C0NH)
preparaci6n de diacrilamida de pEG-3400
Se hizo reaccionar durante la noche polietilenglicol, peso molecular de 3,400 (100 g, 0.05882 moles -0H) con mesilcloruro (13.65 ml, 0.1764 moles, tres equivalentes (eq.)) en presencia de trietilamina (24.58 ml, 3 eq.) en 600 ml de tolueno/ 100 ml de diclorometano a temperatura de habitacion. El producto fue filtrado y recuperado por precipitacion en eter dietilico. El producto fue secado al vacio y fue luego disuelto en 400 ml de solucion de hidroxido de amoniaco al 25%. Esta solucion fue agitada por tres dias a temperatura de habitacion en una botella cerrada fuertemente. El amoniaco fue entonces evaporado agitando la solucion en un recipiente abierto por cinco dias a temperatura de habitacion. El producto fue recuperado por adicion de hidroxido de sodio 1M hasta que se alcanzo un pH de 13 y mediante tres extracciones con diclorometano. La fase en diclorometano fue concentrada al vacio, y el producto fue precipitado por goteo en eter dietilico. El rendimiento fue de 80 g. RMN-1H, PEG 3.6 ppm, CH2-CH2-NH2 2.85 ppm. La presencia de un grupo amina en el termino PEG fue detectada por RMN, con base en la presencia de un triplete a 2.85 ppm, correspondiente a los hidrogenos en el
carbono en la posicion alfa con relacion a la amina. Por comparacion con el pico de la columna de PEG (3.6 ppm), se calculo que el producto contenia 99.3% de diamina de PEG y 0.7% de Q-monoamina, w-monohidroxilo de PEG. La diamina de PEG-3400 (20 g, 11.765 mmoles -NH2) fue secada por destilacion azeotropa en 400 ml de tolueno y luego enfriada a temperatura de habitacion. Se aradio diclorometano (50 ml), y la mezcla fue enfriada en un baro de hielo. La mezcla fue reaccionada durante la noche con cloruro de acriloilo (1.43 ml,
17.647 mmoles, 1.5 eq.) En presencia de trietilamina (2.46 ml, 17.647 mmoles, 1.5 eq.). La solucion fue filtrada y precipitada en eter dietilico. El rendimiento de diacrilamida de PEG-3400 fue de 17 g. RMN-1H (CDCl3) � 3.6 (168 H, -CH2CH20-), 5.6 (dd, 1H, CH2-CH-C0N-), 6.1, 6.2 (dd, 2.27 H, CH2-CH-C0N-). El espectro infrarrojo contenia picos I y II de amida en 1.539.79 y 1,673.90 cm-1.
Reacci6n de adici6n conjugada entre ester metilico de 2-O-(3-tio-propionato) de la cadena lateral de paclitaxel y una insaturaci6n conjugada enlazada mediante pEG
A una solucion de 10 mg (25 !moles) de ester metilico de 2-0-(3-tio-propionato) de la cadena lateral de paclitaxel conteniendo un enlazador de 3-tio-propionato y 361 mg (100 !moles) de diacrilamida de PEG-3400 en 1 ml de metanol seco se aradieron 3.3 !l (25 !moles) de trietanolamina. La solucion fue agitada en la oscuridad bajo una atmosfera de argon a temperatura de habitacion por cuatro horas. El solvente fue removido mediante un flujo de nitrogeno gaseoso, y luego el residuo disuelto en 1 ml de acido acetico acuoso 50 mM y purificado usando una columna PD10 (Pharmacia). Las fracciones conteniendo PEG fueron recolectadas y liofilizadas. El producto fue obtenido en un rendimiento de 91% (con base en diacrilamida de PEG-3400).
Formaci6n de biomaterial de pEG reticulado conteniendo ester metilico de la cadena lateral de paclitaxel ligado de manera covalente
A 1 ml de la mezcla de diacrilamida de PEG-3400 y Q-monoacrilamida, w-mono(ester metilico de la cadena lateral de paclitaxel) se aradio N-vinil pirrolidona (3.5 !l) y Eosin Y (10 !l de una solucion 10 mM en solucion salina amortiguada con HEPES, pH de 7.4). Esta solucion fue expuesta a la luz visible a alrededor de 500 nm (75 mW/cm2) por un minuto, produciendo una red reticulada.
De manera alternativa, a 1 ml de la mezcla de diacrilamida de PEG-3400 y Q-monoacrilamida, w-mono(ester metilico de la cadena lateral de paclitaxel) se arade el peptido GCCNNNNNCCG (15.4 mg, 13.8 moles, la secuencia de este peptido esta diserada para proveer solubilidad en agua) de modo de producir una relacion de un tiol a una acrilamida. Esta solucion es incubada a 37°C por una hora para produccion de una red reticulada. Los geles pueden ser polimerizados como esferas aradiendo 50 !l de la solucion de gelacion conteniendo una relacion 3.5:10 de N-vinil pirrolidona a Eosin Y, como se describio antes, a 1 ml de ciclohexano conteniendo 94 mg de Hypermer B239 (ICI Surfactants, de Wilmington, Delaware, Estados Unidos), con aplicacion de vortice a 37°C por una hora. Se espera que se produzcan esferas con diametros que varian de 2 a 20 !m.
Ejemplo 1�: formaci6n de un biomaterial reticulado conteniendo una versi6n modificada de la cadena lateral de paclitaxel acoplada a pEG mediante un enlazador peptido
Se unio un grupo acrilato al grupo hidroxilo en la cadena lateral de paclitaxel (figura 17). Un enlazador peptido soluble en agua puede entonces aradirse. Si un enlazador conteniendo un residuo lisina fuera usado en este metodo, entonces la lisina nucleofila incrementaria la tasa de hidrolisis del farmaco a partir del biomaterial, o si se usara un enlazador conteniendo un residuo hidrofobo, entonces la tasa de hidrolisis seria reducida por la remocion de agua desde el lugar del enlace ester.
preparaci6n del ester metilico de acrilato de la cadena lateral de paclitaxel (ester metilico de N-benzoil(2R,3S)-2-O-acrilato-3-fenil-isoserina)
Una solucion de 120 mg (0.4 mmoles) de ester metilico de N-benzoil-(2R,3S)-3-fenil-isoserina y 55 !l (0.8 mmoles) de acido acrilico en 4 ml de diclorometano y 1 ml de DMF fue enfriada a 01C. Luego se aradieron 126 !l (0.8 mmoles) de diisopropilcarbodiimida y unos cuantos cristales de dimetilaminopiridina y la mezcla de reaccion fue agitada a 01C por dos horas. Los solventes fueron removidos al vacio y el producto crudo disuelto en 50 ml de diclorometano. La solucion organica fue lavada con KHS04 1M, NaHC03 al 5%, y solucion salina, y secada sobre Na2S04. El producto puro fue obtenido despues de cromatografia en columna (silice, levigante: acetato de etilo/hexano 1:2 v/v). RMN-1H (CDCl3) � 3.76 (s, 3H, 0CH3), 5.53 (d, 1H, CH0), 5.90 (d d, 1H, CHPh), 5.91 (d d, 1H, CHCH2), 6.18 (d d, 1H, CHCH2), 6.45 (d d, 1H, CHCH2), 7.06 (d, 1H, NH), 7.29-7.55 (m, 8H, Ar Tax), 7.80 (d t, 2H, Ar Tax) RMN-13C (CDCl3) � 52.87 (CH0H), 53.56 (CHPh), 74.44 (0CH3), 126.63-137.44 (ArTax), 126.97 (CHCH2),
132.78 (CHCH2), 164.82 (C00 acrilato), 166.84 (C00Me), 168.38 (C0NH)
preparaci6n de enlazador peptido
Se sintetiza un peptido usando tecnicas de fase solida a base de Fmoc de modo de contener un solo residuo cisteina desprotegido, con la secuencia Acetil-Gly-Cys-Gly-Tyr-Gly-Arg-Gly-Asn-Gln-Cys(tbutio)-NH2. El grupo Cys(tbutio) es introducido usando Fmoc-Cys(tbutio)-0H (Novabiochem). Despues del corte de laresina con
88:5:5:2 de acido trifluoroacetico:agua:fenol: triisopropilsilano, el peptido es precipitado en eter dietilico y recolectado por filtracion. El peptido crudo es purificado por cromatografia C18 de escala semi-preparativa, y la identidad del pico aislado es verificada por espectrometria de masa MALDI-T0F.
Reacci6n de adici6n conjugada entre ester metilico de acrilato de cadena lateral de paclitaxel y el enlazador peptido
El ester metilico del acrilato de cadena lateral de paclitaxel (1.25 mg, 3.68 !moles) es dispersado en 1 ml de solucion salina amortiguada con HEPES, conteniendo trietanolamina 115 mM, pH de 8, y reaccionado con el peptido anterior (8.4 mg, 7.36 !moles) por una hora a 37°C. El acoplamiento del derivado de paclitaxel al peptido es monitoreado usando cromatografia C18 y deteccion UV. Siguiendo la reaccion completa del peptido con el ester metilico de acrilato de cadena lateral de paclitaxel via una reaccion de adicion conjugada, se arade ditiotreitol (2.27 mg, 14.72 !moles) a la mezcla por una hora a temperatura de habitacion para desproteger el grupo tbutio en el residuo cisteina del peptido. La purificacion del producto de cadena lateral de paclitaxel enlazado con peptido es lograda usando cromatografia C18 de escala semi-preparativa.
Reacci6n de adici6n conjugada entre enlazador peptido en la cadena lateral de paclitaxel modificada y una insaturaci6n conjugada enlazada mediante pEG
El producto de cadena lateral de paclitaxel enlazado a peptido anterior (5.45 mg, 3.68 !moles) es dispersado en 1 ml de solucion salina amortiguada con HEPES 10 mM, conteniendo trietanolamina 115 mM, pH de 8, y reaccionado con diacrilamida de PEG-3400 del Ejemplo 16 (100 mg, 29.4 !moles) por una hora a 37°C. El producto puede entonces ser reticulado como se describe en el Ejemplo 16.
Ejemplo 1�: formaci6n de un biomaterial reticulado conteniendo la cadena lateral de paclitaxel acoplada a pEG mediante un enlazador que contiene amina
Este ejemplo describe la estrategia de sintesis para el ester metilico de 2-0-(3-amino-propionato) de la cadena lateral de paclitaxel. El acoplamiento de esta cadena lateral de paclitaxel modificada a una insaturacion conjugada enlazada por medio de PEG y la reticulacion de este producto para formar un biomaterial pueden llevarse a cabo como se describe en el Ejemplo 16 para los compuestos que contienen tiol correspondientes.
preparaci6n de ester metilico de 2-O-(3-amino-propionato) de cadena lateral de paclitaxel
PASO A) Preparacion de una cadena lateral de paclitaxel, modificada, protegida (ester metflico de �-benzoil(2R,�S)-2-O-(�-boc-amino-propionato)�-fenil-isoserina)
Esta reaccion del ester metilico de N-benzoil-(2R,3S)-3-fenil-isoserina (0.4 mmoles) y acido 3-Boc-aminopropionico (0.8 mmoles) en 4 ml de diclorometano puede ser llevada a cabo como se describe para la reaccion analoga en el Ejemplo 16 para la preparacion del ester metilico de 2-0-(3-tio-propionato) de cadena lateral de paclitaxel.
PASO B) 0esproteccion para formar ester metflico de 2-(�-amino-propionato) de cadena lateral de paclitaxel (ester metflico de �-benzoil-(2R,�S)-2-O-(�-amino-propionato)-�-fenil-isoserina
Una solucion saturada de HCl en eter dietilico es aradida a una solucion del compuesto Boc-protegido en diclorometano, y la mezcla de reaccion es agitada a temperatura de habitacion por una hora. Los solventes son removidos al vacio, y el producto es obtenido como su sal HCl.
Ejemplo 1�: formaci6n de un biomaterial reticulado que contiene paclitaxel acoplado a pEG mediante un enlazador que contiene tiol
Puede unirse 3-mercaptopropionato al alcohol 2� en paclitaxel (figura 16). Este producto puede entonces ser unido a una insaturacion conjugada enlazada mediante PEG (figura 16) y reticulado para formar un biomaterial como se describe en el Ejemplo 16 para la reaccion analoga usando compuestos que tienen la cadena lateral de paclitaxel.
preparaci6n de 2�-O-3-tio-propionato de paclitaxel
PASO A) Preparacion de 2�-O-�-tritiltio-propionato de paclitaxel protegido
Una solucion de 87 mg (0.1 mmoles) de paclitaxel y 35 mg (0.1 mmoles) de acido 3-tritiltio-propionico en 4 ml de diclorometano fue enfriada a 01C. Luego se aradieron 16 !l (0.1 mmoles) de diisopropilcarbodiimida y unos
cuantos cristales de dimetilaminopiridina y la mezcla de reaccion fue agitada a 01C por una hora y otras dos horas a temperatura de habitacion. El solvente fue removido al vacio y el producto crudo disuelto en 25 ml de diclorometano. La solucion organica fue lavada con KHS04 1M, NaHC03 al 5%, solucion salina, y secada sobre Na2S04. El producto puro fue obtenido despues de cromatografia en columna (silice, levigante: acetato de etilo/hexano 1:1).
PASO B) 0esproteccion para formar 2�-O-�-tio-propionato de paclitaxel
El paso de desproteccion fue llevado a cabo aradiendo una solucion de TFA, triisopropilsilano, y agua
(95:2.5:2.5) al compuesto tritil protegido en diclorometano. La mezcla de reaccion fue agitada a temperatura de habitacion por una hora. Los solventes fueron removidos al vacio, y el producto fue obtenido despues de cromatografia en columna (silice, levigante: acetato de etilo/hexano 1:1).
Ejemplo 20: formaci6n de un biomaterial reticulado que contiene una versi6n modificada de paclitaxel acoplado a pEG mediante un enlazador peptido
Un grupo acrilato puede ser unido al alcohol 2� en paclitaxel (figura 17). Un enlazador peptido soluble en agua puede entonces ser aradido mediante una reaccion de adicion conjugada, y este producto puede ser acoplado a una insaturacion conjugada enlazada mediante PEG, como se describe en el Ejemplo 16, y reticulado como se describe en el Ejemplo 16.
preparaci6n de 2�-O-acrilato de paclitaxel
Una solucion de 85 mg (0.1 mmoles) de paclitaxel y 70 mg (0.2 mmoles) de acido acrilico en 4 ml de diclorometano es enfriada a 01C. Luego, se aradieron 32 !l (0.2 mmoles) de diisopropilcarbodiimida y unos cuantos cristales de dimetilaminopiridina, y la mezcla de reaccion es agitada a 01C por dos horas. El solvente es removido al vacio, y el producto crudo es disuelto en 50 ml de diclorometano. La solucion organica es lavada con KHS04 1M, NaHC03 al 5%, solucion salina y secada sobre Na2S04. El producto puro es obtenido despues de cromatografia en columna.
Ejemplo 21: formaci6n de un biomaterial reticulado que contiene doxorrubicina acoplado a pEG mediante un enlazador que contiene tiol
Como se describio para paclitaxel, el farmaco doxorrubicina puede ser modificado con un enlazador que contiene tiol. La union de este producto a una insaturacion conjugada enlazada mediante PEG y la reticulacion de los grupos insaturados conjugados remanentes para formar un biomaterial puede ser llevada a cabo como se describe en el Ejemplo 19 para el derivado de paclitaxel.
preparaci6n de doxorrubicina-O-3-tio-propionato
PASO A) Preparacion de �-Boc-doxorrubicina
Una solucion de 116 mg (0.2 mmoles) de doxorrubicina HCl en Na0H 1M es agitada y enfriada en un baro de hielo. Se arade una solucion de 48 mg (0.22 mmoles) de dicarbonato de di-tert-butilo en dioxano, y la mezcla de reaccion es agitada por dos horas a temperatura de habitacion. El dioxano es removido al vacio, y la solucion acuosa es acidulada con KHS04 1M a un pH de 2-3. La solucion acuosa es extraida con acetato de etilo. La fase organica es lavada con solucion salina, secada sobre Na2S04, y concentrada al vacio.
PASO B) Preparacion de �-Boc-doxorrubicina-O-�-tritiltio-propionato
La reaccion de N-Boc-doxorrubicina (0.2 mmoles) y acido 3-tritiltio-propionico (0.1 mmoles) en diclorometano usando diisopropilcarbodiimida (0.1 mmoles) y dimetilaminopiridina puede ser llevada a cabo como se describio en el Paso A del Ejemplo 19 para paclitaxel en vez de N-Boc-doxorrubicina.
PASO C) 0esproteccion para formar doxorrubicina-O-�-tio-propionato
La desproteccion del compuesto N-Boc protegido es analoga al Paso B del Ejemplo 19 para la desproteccion del derivado de paclitaxel tritil protegido.
Ejemplo 22: formaci6n de un biomaterial reticulado que contiene metoxiestradiol acoplado a pEG mediante un enlazador que contiene tiol
2-metoxiestradiol tiolado puede ser sintetizado como se describe mas adelante. Este compuesto puede entonces ser incorporado en un biomaterial como se describe en los Ejemplos 19 y 21 para paclitaxel y doxorrubicina.
preparaci6n de 2-metoxiestradiol tiolado
La reaccion de 2-metoxiestradiol (0.5 mmoles) y acido 3-tritiltio-propionico (0.25 mmoles) en diclorometano usando diisopropilcarbodiimida (0.25 mmoles) y dimetilaminopiridina puede ser llevada a cabo como se describe en el Paso A en el Ejemplo 19 para paclitaxel. La desproteccion de este compuesto tritil protegido es analoga al Paso B en el Ejemplo 19 para la desproteccion del derivado de paclitaxel tritil protegido.
Ejemplo 23: incorporaci6n de un peptido que contiene tiol en un biomaterial y la cinetica de liberaci6n del peptido modificado del biomaterial (sin enlazador� ejemplo de referencia)
Un peptido terapeutico que se sabe afecta la adhesion celular a la membrana de basamento fue acoplado a una insaturacion conjugada enlazada por medio de PEG. El acoplamiento ocurrio debido a la adicion de un solo residuo de cisteina a la secuencia del peptido activo. Al liberarse el peptido del biomaterial reticulado, el peptido original no fue regenerado, debido a que el tiol del residuo cisteina fue modificado con acido propionico. Sin embargo, la naturaleza de este y otros peptidos terapeuticos es tal que la actividad del peptido no debe verse afectada por la presencia de esta cisteina modificada en el extremo del peptido.
preparaci6n de peptido
Un peptido, que contiene un solo residuo cisteina, fue sintetizado usando tecnicas en fase solida a base de Fmoc, con la secuencia Acetil-Gly-Cys-Gly-Tyr-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-NH2. Despues del corte de la resina con 88:5:5:2 acido trifluoroacetico:agua:fenol:triisopripilsilano, el peptido fue precipitado en eter dietilico y recolectado por filtracion. El peptido crudo fue purificado mediante cromatografia C18 en escala semipreparativa, y la identidad del pico aislado fue verificada por espectrometria de masa MALDI-T0F.
preparaci6n de diacrilato de polietilenglicol
Polietilenglicol, peso molecular de 3,400 (PEG-3400, 20 g, 11.765 mmoles -0H) fue secado por destilacion azeotropa en tolueno y enfriado a temperatura de habitacion. Se aradio diclorometano para producir una solucion clara a 01C. La mezcla fue enfriada en un baro de hielo y reaccionada durante la noche con cloruro de acriloilo (1.43 ml, 17.647 mmoles, 1.5 eq.) en presencia de trietilamina (2.46 ml, 17.647 mmoles, 1.5 eq.). La solucion fue filtrada y precipitada en eter dietilico. Diacrilato de polietilenglicol-3400 fue obtenido con un rendimiento de 17 g.
Reacci6n de adici6n conjugada entre un peptido y una insaturaci6n conjugada enlazada mediante pEG
El peptido (3.92 mg, 3.68 !moles) fue disuelto en 115 !l de solucion salina amortiguada con MES 1 mM, pH de 5.8, y mezclado con 870 !l de diacrilamida de PEG-3400 (100 mg, 29.4 !moles, del Ejemplo 16) disuelta en solucion salina amortiguada con HEPES 10 mM, pH de 8, conteniendo trietanolamina 115 mM, y dejado asentar por 10 minutos a 37°C. El acoplamiento completo del peptido al PEG modificado fue verificado usando reactivo de Ellman.
Formaci6n de biomaterial de pEG reticulado conteniendo peptido ligado de manera covalente
Para facilitar la foto-polimerizacion/foto-reticulacion de la solucion anterior del peptido y diacrilamida de PEG, se aradieron N-vinil pirrolidona (3.5 !l) y Eosin Y (10 !l de una solucion 10 mM en solucion salina amortiguada con HEPES, pH de 7.4). La solucion fue expuesta a la luz visible a alrededor de 500 nm (75 mW/cm2) por un minuto, produciendo una red reticulada conteniendo peptido hidrolizable. La liberacion del peptido del material fue monitoreada usando cromatografia C18. Despues de 10 dias a un pH de 7.4, 37°C, alrededor de una tercera parte del peptido habia sido liberada del material.
Cinetica de liberaci6n del peptido modificado del biomaterial
Para estudiar la liberacion hidrolitica del peptido del polimero, el peptido (15.7 mg, 14.71 !moles) fue disuelto en 115 !l de solucion salina amortiguada con MES 1 mM, pH de 5.8, y la presencia de un tiol libre en el peptido fue verificada por reactivo de Ellman. Se disolvio diacrilato de PEG-3400 (100 mg, 29.41 !moles) en 885 !l de solucion salina amortiguada con HEPES 10 mM, pH de 8, conteniendo trietanolamina 115 mM. La union del peptido al PEG fue seguida usando cromatografia C18. Se uso un gradiente de 95% de agua con 0.1% de TFA/5% de acetonitrilo a 40% de agua con 0.1% de TFA/60% de acetonitrilo. El peptido libre levigo a alrededor de 20% de acetonitrilo, y el diacrilato de PEG levigo a alrededor de 40% de acetonitrilo. Dentro de 10 minutos del mezclado del peptido y el diacrilato de PEG, el pico del peptido ya no fue observado, y la absorbencia relacionada con el peptido a 273 nm se encontro co-levigar con el diacrilato de PEG. Espectrometria de masa MALDI-T0F verifico que el peptido estuviera acoplado al PEG. La mezcla fue entonces incubada a un pH de 8, 37°C, y la liberacion del peptido del PEG fue seguida por la aparicion de un pico que levigo a 20% de acetonitrilo. El analisis de espectrometria de masa MALDI-T0F de este pico mostro que contenia un compuesto con un peso molecular igual al del peptido original mas 72 unidades de masa, indicando que el peptido fue ahora modificado con acido propionico. Este resultado indica que el tiol en el peptido que contiene cisteina habia reaccionado con el grupo acrilato en el PEG mediante una reaccion de adicion conjugada y que el peptido modificado fue liberado debido a la hidrolisis del enlace ester entre el peptido modificado y el PEG. La tasa de liberacion del peptido modificado fue medida, dando una vida media de 4.86 dias para la liberacion del peptido modificado a 37°C, pH de 8. Con base en la dependencia de pH predicha de esta hidrolisis, la vida media para liberacion a 37°C es de alrededor de tres semanas a un pH de 7.4. La tasa de hidrolisis de diacrilato de PEG-3400 en solucion salina amortiguada con HEPES 10 mM, pH de 8, conteniendo trietanolamina 115 mM, tambien fue medida. Se encontro que el acido acrilico hidrolizaba a partir del diacrilato de PEG-3400 con una vida media de 24 dias a 37°C, pH de 8, indicando una vida media para liberacion de alrededor de tres meses a 37°C, pH de 7.4.
Ejemplo 24: incorporaci6n de un oligonucle6tido tiolado en un biomaterial y la cinetica de liberaci6n de oligonucleotido tiolado del biomaterial (sin enlazador� ejemplo de referencia)
Este ejemplo describe un metodo para la incorporacion de un oligonucleotido tiolado en un biomaterial y medir la tasa de liberacion del oligonucleotido debido a la hidrolisis del biomaterial. Un oligonucleotido conteniendo un solo grupo tiol es sintetizado a la medida (Synthegen, LLC, de Houston, Texas, Estados Unidos). El oligonucleotido (3.675 !moles) es aradido a 100 mg de diacrilato de PEG del Ejemplo 23 (29.4 !moles) en 1 ml de solucion salina amortiguada con HEPES 10 mM con trietanolamina 115 mM, pH de 8. Despues de 15 minutos, se araden a la solucion N-vinil pirrolidona (3.5 !l) y Eosin Y (10 !l de una solucion 10 mM en solucion salina amortiguada con HEPES, pH de 7.4). Esta solucion es expuesta a la luz visible a alrededor de 500 nm (75 mW/cm2) por un minuto para produccion de una red reticulada conteniendo el oligonucleotido. La hidrolisis de la liberacion del oligonucleotido tiolado con acido propionico al agua amortiguada que rodea el material puede ser monitoreada mediante adsorcion de UV a 260 nm.
Ejemplo 25: formaci6n de biomateriales coloidales
Este ejemplo describe un metodo de producir un biomaterial coloidal via reacciones de adicion conjugada. Un biomaterial coloidal se refiere a un gran copolimero de dimensiones mayores de 5 nm y menores de 1 !m. El biomaterial coloidal puede contener moleculas, tales como peptidos, que objetivan el coloide a las celulas. Una mezcla (1 ml) de diacrilamida de PEG-3400 y Q-monoacrilamida de PEG-3400, w-mono(ester metilico de cadena lateral de paclitaxel) (Ejemplo 16) es incubada a 37°C por una hora. El peptido GCNNRGDNNCG (31.0 mg, 27.6 !moles), que contiene una secuencia RGD para objetivacion a las celulas, puede tambien ser incluido en esta mezcla en una relacion de un tiol a una acrilamida. Se espera que este metodo produzca un copolimero lineal de alto peso molecular de PEG-3400 y peptido, que es rematado en los extremos con mono(ester metilico de cadena lateral de paclitaxel) de PEG-3400 que puede formularse como una composicion inyectable.
Ejemplo 26: formaci6n de un biomaterial reticulado que contiene la cadena lateral de paclitaxel acoplada a pEG mediante un enlazador que contiene tiol
El Ejemplo 16 describe la formacion de un biomaterial que contiene la cadena lateral de paclitaxel enlazada a un polimero. Este biomaterial fue formado usando un componente precursor teniendo la formula D-0C(0) (CH2)2-S-(CH2)2C(0)NH-P, donde D es una ramificacion farmaceuticamente activa (v.gr., paclitaxel -en este ejemplo se esta usando el ester metilico de la cadena lateral de paclitaxel por razones economicas) y P es un polimero (v.gr., PEG). La cadena lateral de paclitaxel es usada como un modelo para toda la molecula de paclitaxel debido a que es mas barata y debe tener una cinetica de liberacion similar al paclitaxel entero pues el paclitaxel entero es acoplado mediante su cadena lateral. Para generar otros biomateriales que liberan un farmaco tal como paclitaxel mas lentamente, puede usarse un enlazador conteniendo grupos metileno (CH2) adicionales entre el farmaco y el grupo tiol en el enlazador. La sintesis de tal biomaterial formado usando un componente precursor teniendo la formula D-0C(0)(CH2)3-S-(CH2)2C(0)NH-P es descrita mas adelante y se ilustra en la figura 18.
preparaci6n de ester metilico de 2-O-(4-tio-butirato) de la cadena lateral de paclitaxel
PASO A) Preparacion de acido �-tritiltio-butfrico
Una solucion de 0.48 g (2 mmoles) de acido 4,4-ditiodibutirico en dioxano recien destilado (20 ml) fue agitada bajo una atmosfera de nitrogeno. Luego se aradieron 0.52 ml (2.1 mmoles) de tributilfosfina y 50 !l de agua, y la mezcla de reaccion fue agitada por cuatro horas a temperatura de habitacion. Despues de remover los solventes al vacio, el producto crudo fue destilado en 25 ml de DMF junto con 1.15 g (4.4 mmoles) de trifenilmetanol, y la solucion fue agitada por 30 minutos a 601C. Despues de que la solucion fue enfriada a temperatura ambiental, se aradieron 580 !l (4.6 mmoles) de eterato de borotrifluor y la mezcla de reaccion fue agitada durante la noche a 801C. La solucion fue concentrada al vacio y el producto purificado por cromatografia en columna (silice, levigante: acetato de etilo/hexano 1:1 v/v). Despues de re-cristalizacion a partir de acetato de etilo/hexano, el producto fue obtenido como agujas blancas con un rendimiento del 50%. RMN-1H (CDCl3) � 1.67 (m, 2H, CH2CH2CH2), 2.27 (m, 4H, CH2S y CH2C00H), 7.15-7.48 (m, 15H, Trt), 10.49
(br s, 1H, C00H) RMN-13C (CDCl3) � 23.76 (CH2CH2CH2), 31.1 (CH2S), 32.9 (CH2C00H), 66.7 (C(Ph)3Trt), 126.6-144.8 (Ar Trt),
179.0 (C00H)
PASO B) Preparacion de cadena lateral de paclitaxel modificada, protegida (ester metflico de �-benzoil(2R,�S)-2-O-(�-tritiltiobutirato)-�-fenil-isoserina)
Esta reaccion de 133 mg (0.44 mmoles) de ester metilico de N-benzoil-(2R,3S)-3-fenil-isoserina y 177 mg (0.49 mmoles) de acido 4-tritiltio-butirico con 76 !l (0.49 mmoles) diisopropilcarbodiimido y unos cuantos cristales de dimetilaminopiridina fue llevada a cabo como se describe en el Ejemplo 16, Paso B. El producto fue obtenido como un solido blanco en rendimiento del 77% despues de cromatografia en columna (silice, levigante: acetato de etilo/hexano 1:3 a 1:2 v/v). RMN-1H (CDCl3) � 1.60 (m, 2H, CH2CH2CH2), 2.20 (m, 2H, CH2C00H), 2.33 (m, 2H, CH2S), 3.74 (s, 3H, 0CH3),
5.40 (d, 1H, CH0), 5.84 (d d, 1H, CHPh), 6.96 (br d, 1H, NH), 7.16-7.54 (m, 23H, Ar Tax y Trt), 7.79 (d t, 2H, Ar Tax) RMN-13C (CDCl3) � 23.7 (CH2CH2CH2), 31.1 (CH2S), 32.7 (CH2C00H), 52.8 (CHPh), 53.4 (HC0C0), 66.7 (C(Ph)3 Trt), 74.3 (0CH3), 126.5-144.8 (Ar Tax y Trt), 166.8 (C00Me), 168.4 (C00CH), 171.7 (C0NH)
PASO C) 0esproteccion para formar ester metflico de 2-O-(�-tio-butirato) de cadena lateral de paclitaxel (ester metflico de �-benzoil-(2R,�S)-2-O-(�-tio-butirato)-�-fenil-isoserina)
La remocion del grupo tritilo del tiol fue llevada a cabo como se describe en el Ejemplo 16, Paso C. Despues de cromatografia en columna (silice, levigante: acetato de etilo/ hexano 1:3 a 1:2 v/v), el producto fue obtenido como un solido blanco. RMN-1H (CDCl3) � 1.29 (t, 1H, SH), 1.89 (m, 2H, CH2CH2CH2), 2.53 (m, 4H, CH2SH y CH2C00), 3.77 (s, 3H, 0CH3), 5.47 (d, 1H, CH0), 5.89 (d d, 1H, CHPh), 6.99 (d, 1H, NH), 7.28-7.57 (m, 8H, Ar Tax), 7.80 (m, 2H, Ar Tax) RMN-13C (CDCl3) � 23.6 (CH2CH2CH2), 28.7 (CH2SH), 32.1 (CH2C00), 52.9 (CHPh), 53.4 (CH0C0), 74.4 (0CH3), 126.5-137.5 (Ar Tax), 166.9 (C00Me), 168.4 (C00CH), 171.7 (C0NH)
Reacci6n de adici6n conjugada entre el ester metilico de 2-O-(4-tio-butirato) de cadena lateral de paclitaxel y una insaturaci6n conjugada enlazada mediante pEG
La conjugacion de 11 mg (25 !moles) de ester metilico de la cadena lateral de paclitaxel conteniendo un enlazador de 4-tio-butirato con 361 mg (100 !moles) de diacrilamida de PEG-3400 fue llevada a cabo analoga a la reaccion de conjugacion descrita en el Ejemplo 16.
Ejemplo 2�: cinetica para la liberaci6n de la cadena lateral de paclitaxel a partir de conjugados enlazados por pEG y a partir de hidrogeles
Los Ejemplos 16 y 26 describen la formacion de formas de liberacion sostenida de paclitaxel, usando la cadena lateral de paclitaxel por economia en la sintesis. Este ejemplo describe las caracteristicas de liberacion que son obtenidas con estas dos formas, en las cuales hay ya sea tres o cuatro atomos de carbono entre la cadena lateral de paclitaxel y el azufre en el enlazador que conecta la cadena lateral de paclitaxel con el polimero, i.e., n es 2 o 3 respectivamente.
Liberaci6n de conjugados enlazados por pEG en soluci6n
Una solucion de 50 mg de conjugado enlazado con PEG (del Ejemplo 16 o 26) en 1 ml de PBS, pH de 7.4, fue incubada a 37°C. De manera periodica, muestras de 50 !l fueron retiradas y se aradio 1 !l de HCl 1M para ajustar el pH a 4. Las muestras fueron almacenadas a -301C hasta analizarse. La cantidad de compuesto liberado fue medida con HPLC usando una columna C18 en fase invertida (Nova-Pak� C18, 3.9 x 150 mm, Waters Associates Inc.), un modulo de separacion Waters 2690 (Waters Associates Inc.)., y un arreglo detector de foto-diodo Waters 996 (Waters Associates Inc.). Se uso como sistema de levigacion un gradiente lineal de 0.1% de TFA en agua/acetonitrilo 75:25 v/v a 25:75 v/v en 17.5 minutos a una tasa de flujo de 1 ml/min. Los cromatogramas fueron analizados con software Waters Millennium� 32 (version 3.05.01). Los resultados son ilustrados en la figura 19A. Un hidrogel foto-polimerizado al 10% peso/volumen de 10 mg de conjugado enlazado por medio de PEG (preparado como se describio en el Ejemplo 16) fue incubado a 37°C en 1 ml de PBS, pH de 7.4. De manera periodica, se retiraron muestras de 50 !l y se reemplazaron con amortiguador fresco. La cantidad de compuesto liberado fue medida con HPLC como se describio antes (figura 19B). Como se ilustra en las figuras 19A y 19B, la tasa de liberacion de farmaco por hidrolisis del enlazador en un conjugado enlazado por PEG o hidrogel puede ser modulada variando la longitud de la cadena entre el farmaco y el atomo de azufre (o nitrogeno) en el enlazador. El conjugado enlazado por PEG y el hidrogel que contiene tres atomos de carbono entre el farmaco (es decir, la cadena lateral de paclitaxel) y el atomo de azufre en el enlazador liberaron el farmaco mas rapidamente que el conjugado enlazado por PEG correspondiente y el hidrogel conteniendo un grupo metileno (CH2) adicional separando el farmaco y el atomo de azufre en el enlazador. Si se desea, dos o mas conjugados enlazados mediante PEG con enlazadores que contienen diferentes numeros de grupos separando el farmaco del atomo de azufre (o nitrogeno) en el enlazador pueden combinarse para formar un hidrogel con una tasa de liberacion global mas farmacologicamente favorable.
Ejemplo 2�: incorporaci6n de fracciones de enlace en biomaterial
Los enfoques de afinidad pueden ser empleados para obtener liberacion sostenida tanto de proteinas como de moleculas pequeras. La incorporacion de heparina ligada o sitios de afinidad a la heparina en biomateriales para facilitar la enlace de proteinas de enlace de heparina, tales como factores de crecimiento de enlace de heparina, al biomaterial, es descrita anteriormente. Por ejemplo, biomateriales conteniendo sitios de afinidad a la heparina pueden ser formados en presencia de proteinas de enlace de heparina para incrementar la cantidad de proteinas de enlace de heparina que estan acopladas indirectamente al biomaterial via afinidad a la ramificacion de enlace de heparina o mediante la enlace de heparina a la ramificacion de enlace del peptido de enlace de heparina. Al degradar el biomaterial, las proteinas encapsuladas son liberadas. Este ejemplo describe la incorporacion de otras fracciones de enlace en biomateriales. Muchas proteinas contienen sitios de enlace para iones de metal divalentes, tales como Cu2+, Co2+, y Zn2+. Esta afinidad puede ser explotada para la liberacion sostenida de proteinas de enlace de ion de metal. Un ligando sintetico de enlace de ion de metal, tal como un acido iminodiacetico, residuo His, peptido His-Gly-Gly-His, u oligomero de residuos His, puede ser incorporado en geles para servir como fracciones de enlace, que entonces estan disponibles para ligar las proteinas de enlace de ion de metal, tales como la hormona del crecimiento humana. Estos sitios de enlace pueden ser incorporados mediante un enlazador hidrolizable para proveer una retencion y una liberacion mas controladas. La preparacion de un ligando de enlace de ion de metal de acido iminodiacetico es descrita mas adelante (figura 20).
preparaci6n de un ligando de enlace de ion de metal de 2-tio-etilimina diacetato
PASO A) Preparacion de 2-tritiltio-etilamina
Una solucion de hidrocloruro de cisteamina (2-tio-etilamina hidrocloruro) y trifenilmetanol en DMF fue agitada a 601C por 30 minutos. Despues de enfriar la solucion a temperatura ambiental, se aradio eterato de borotrifluor y la mezcla de reaccion fue agitada a 801C. La mezcla de reaccion fue concentrada al vacio y el residuo fue dispersado en NaHC03 acuoso al 5% y extraida con acetato de etilo hasta que ya no hubo solido presente en la capa de agua. La solucion organica fue lavada con solucion salina, secada sobre Na2S04, y concentrada al vacio, dando como resultado un 87% de producto crudo. El producto fue disuelto en agua, ligeramente acidulado con KHS04 1M, dando como resultado un precipitado que fue re-cristalizado en acetato de etilo/metanol, obteniendo agujas blancas en un rendimiento del 75%. RMN-1H (CDCl3) � 2.32 (t, 2H, CH2S), 2.53 (t, 2H, CH2N), 7.06-7.24 (m, 15H, Trt), 7.84 (br s, 2H, NH2) RMN-13C (CDCl3) � 29l8 (CH2S), 38.8 (NCH2),67.3 (C(Ph)3 Trt), 126.8-129.6 y 144.5 (Ar Trt)
PASO B) Preparacion de ester dietflico de diacetato de 2-tritiltio-etilimina
A una solucion de 1.78 g (5 mmoles) de 2-tritiltio-etilamina y 1.67 ml (15 mmoles) de bromoacetato de etilo en 100 ml de THF se aradieron 2.09 ml (15 mmoles) de trietilamina. Despues de agitacion por tres dias a temperatura de habitacion, se aradieron otros 15 mmoles de bromoacetato de etilo y 15 mmoles de trietilamina. Despues de un tiempo total de reaccion de seis dias, la mezcla de reaccion fue concentrada al vacio y el producto fue purificado por cromatografia en columna (silice, levigante: acetato de etilo/hexano 1:2 v/v). El producto fue obtenido como un aceite en un rendimiento del 88%. RMN-1H (CDCl3) � 1.23 (t, 6H, 0CH2CH3), 2.34 (5, 2H, CH2S), 2.62 (t, 2H, CH2N), 3.36 (s, 4H, NCH2C00H),
4.11 (q, 6H, 0CH2CH3), 7.18-7.41 (m, 15H, Trt) RMN-13C (CDCl3) � 14.2 (0CH2CH3), 30.3 (CH2S), 53.7 (NCH2), 54.9 (NCH2C00H), 60.5 (0CH2CH3), 66.7 (C(Ph)3 Trt), 126.6-129.6 y 144.9 (Ar Trt), 171.0 (C00Et)
PASO C) Preparacion de acido 2-tritiltio-etilimina diacetico
A una solucion de ester dietilico de 2-tritiltio-etilimina diacetato en 20 ml de dioxano y 7.5 ml de metanol se aradieron 7.5 ml de Na0H acuoso 4M. Despues de agitacion por una hora a temperatura de habitacion, la mezcla de reaccion fue concentrada al vacio y el residuo fue suspendido en agua. La solucion acuosa fue acidulada con KHS04 1M y extraida con acetato de etilo. La solucion de acetato de etilo fue lavada con solucion salina, secada sobre Na2S04, y concentrada al vacio. El producto fue obtenido como un solido blanco en un rendimiento cuantitativo. RMN-1H (CDCl3) � 2.52 (t, 2H, CH2S), 2.63 (t, 2H, CH2N), 3.38 (s, 4H, NCH2C00H), 7.17-7.39 (m, 15H, Trt),
9.55 (br s, 2H, C00H) RMN-13C (CDCl3) � 26.8 (CH2S), 54.5 (NCH2), 55.6 (NCH2C00H), 67.6 (C(Ph)3 Trt), 127.1-129-5 y 144.1 (Ar Trt), 169.6 (C00H)
PASO 0) Preparacion de diacetato de 2-tio-etilimina
Una solucion de acido 2-tritiltio-etilimina en diclorometano fue aradida a una solucion de TFA, triisopropilsilano y agua (95:2.5:2.5 v/v/v). Despues de agitar por una hora a temperatura de habitacion, los solventes fueron removidos al vacio y el residuo fue dispersado en una solucion de NaHC03 al 5%, libre de oxigeno. La solucion acuosa fue lavada con eter dietilico, acidulada con KHS04 1M y extraida con acetato de etilo. La solucion organica fue lavada con solucion salina, secada sobre Na2S04 y concentrada al vacio. Muchas glico-proteinas contienen dioles vecinales en los residuos de azucar unidos a la proteina. Estas pueden ser explotadas para liberacion sostenida. Fracciones acido boronico, tales como grupos acido fenilboronico, pueden ser incorporadas en biomateriales para uso en interaccion por afinidad mediante formacion reversible de complejos con los dioles vecinales. Se ha demostrado que las fracciones fenil boronato de la forma -NH-(C6H4)-B(0H)2 tienen un pKa que es particularmente favorable (es decir, valores cercanos al pH fisiologico) (Winblade y colaboradores, Biomacromolecules 1:523-533, 2000). La sintesis de un ligando de acido fenilboronico para incorporacion en biomateriales para servir como fracciones de enlace para glico-proteinas a los biomateriales es descrita mas adelante (figura 21).
Sintesis de un ligando de acido fenilbor6nico
PASO A) Preparacion de acido �-((�-2-tritiltioetil)aminometil) bencenoboronico
Se sintetiza acido 4-((N-2-tritiltioetil)aminometil) bencenoboronico via una aminacion reductiva de acido 4-formil fenilboronico y 2-tritiltio-etilamina (del Ejemplo 27) con triacetoxiborohidruro de acuerdo con los procedimientos de Abdel-Magid y colaboradores (J. 0rg. Chem. 61:3849-3862, 1996).
PASO B) Preparacion de acido �-(�-2-tioetil)aminometil) bencenoboronico
La desproteccion del tiol es llevada a cabo como se describe en el Ejemplo 27, Paso D. Es particularmente util la incorporacion de las fracciones de enlace usando ya sea enlazadores que son hidrolizables o enlazadores que contienen sitios de corte de proteasa. Adicionalmente, tambien son utiles los geles que contienen sitios de enlace por afinidad sin tales enlazadoers. De acuerdo con la inevencion se adicional enlazadores. Al liberarse el farmaco del portador de matriz polimerica, el gradiente de concentracion entre la matriz de liberacion sostenida y el ambiente se reduce, llevando a una liberacion mas lenta. Esto puede ser compensado usando el presente metodo. Al proseguir el tiempo, tanto el gradiente de concentracion como el numero de sitios de afinidad se reducen, llevando a una liberacion que es mas lenta por una parte por un menor gradiente de concentracion pero acelerada por otra parte por un menor numero de sitios de enlace por afinidad. Estas dos interacciones pueden oponerse entre si, llevando a un perfil de liberacion que es mas cercano al lineal. Mas aun, puede usarse mas de un enlazador, llevando a algunos sitios que son liberados rapidamente y otros que son liberados mas lentamente, para obtener un perfil de liberacion mas deseable. Pueden usarse fracciones de enlace por afinidad de varias caracteristicas. Estas pueden ser, por ejemplo, anticuerpos, o incluso fracciones peptidas, nucleotidas u organicas que son seleccionadas de manera combinatorial en cuanto a la afinidad apropiada al farmaco. Para farmacos organicos hidrofobos, puede ser particularmente util la incorporacion de ciclodextrinas, para proveer afinidad a traves de las interacciones anfitrion (ciclodextrina)-huesped (farmaco) asociadas con este par.
Ejemplo 2�: liberaci6n de compuestos farmaceuticamente ctivos encapsulados por atrapamiento en biomateriales (ejmplo de referencia)
La red polimerica formada alrededor de un farmaco incorporado (particularmente un farmaco macro-molecular tal como ADN, ARN, polisacarido o proteina) puede dar como resultado liberacion sostenida. La red polimerica puede estar diserada para tener una permeabilidad y un grado de degradacion que son apropiados para lograr la liberacion que precede a la degradacion (alta permeabilidad inicial, baja tasa de degradacion) o se controla por degradacion (baja permeabilidad inicial, alta tasa de degradacion). Los enlazadores enserados en la presente pueden ser usados para obtener tasas de degradacion preferentes. Los siguientes ejemplos describen tasas de liberacion obtenidas usando hidrogeles polimericos degradables obtenidos haciendo reaccionar multi-acrilatos de PEG lineales o de brazos multiples con di-tioles de PEG lineales. El enlazador formado de esta manera es P-0C(0)-(CH2)2-S-(CH2)2-P
Sintesis de pEGs Acrilatados
Se preparo tetra-acrilato de PEG a partir de PEG de cuatro brazos, peso molecular de 14,800 (10 g, 0.676 mmoles, Shearwater Polymers, Huntsville, Alabama, Estados Unidos, MN = 11,880, Mw = 15,460 por GPC en THF con deteccion de indice refractivo). El PEG de cuatro brazos fue secado por destilacion azeotropica en 300 ml de tolueno por una hora usando una trampa de Dean-Stark. Despues de enfriamiento a menos de 501C bajo argon, se aradieron 50 ml de diclorometano y trietilamina (0.75 ml, 2.0 equivalentes, Aldrich, de Milwaukee, Wisconsin, Estados Unidos). La reaccion fue iniciada por la adicion por goteo de cloruro de acriloilo
(0.33 ml, 1.5 equivalentes, Aldrich). La reaccion prosiguio con agitacion durante la noche en la oscuridad a
temperatura de habitacion bajo argon. La solucion amarillo palido resultante fue filtrada a traves de un lecho de alumina neutro. Se aradio carbonato de sodio a la solucion de tolueno-diclorometano y se agito por dos horas. El carbonato de sodio fue removido por filtracion, y el volumen de la solucion fue reducido por evaporacion rotatoria. El PEG fue precipitado del tolueno por adicion de eter dietilico en un baro de hielo y fue recuperado por filtracion. El precipitado fue lavado con eter dietilico y secado al vacio. Rendimiento: 8.7 g, RMN 1H (CDCl3)
�
3.6 ppm (340.74 H, PEG), 4.3 ppm (t, 2.12 H, -CH2-CH2-0-C0-CH=CH2), 5.8 ppm (dd, 1.00 H, CH2=CH- C00-), 6.1 ppm, 6.4 ppm (dd, 2.00 H, CH2=CH-C00-). Se preparo octa-acrilato de PEG de manera similar a PEG de ocho brazos, peso molecular de 20,000 (Shearwater Polymers, Mn = 18,140, Mw = 19,210 por GPC en THF con deteccion de dispersion de luz de laser). RMN 1H (CDCl3) � 3.6 ppm (209.96 H, PEG), 4.3 ppm (t, 2.00 H, -CH2-CH2-0-C0-CH=CH2), 5.8 ppm (dd, 1.00 H, CH2=CH-C00-), 6.1 ppm, 6.4 ppm (dd, 2.01 H, CH2=CH-C00-). Triacrilato de PEG, peso molecular de 2,800, fue preparado de manera similar a partir de PEG de tres brazos, peso molecular de 2,000 (un regalo de Neocrin Company, de Irvine, California, Estados Unidos, Mn = 2,768, Mw = 2,856 por GPC en THF con deteccion de indice refractivo). RMN 1H (CDCl3) � 3.6 ppm (83.97 H, PEG), 4.3 ppm (t, 2.04 H, -CH2-CH2-0-C0-CH=CH2), 5.8 ppm (dd, 1.04 H, CH2=CH-C00-), 6.1 ppm, 6.4 ppm (dd, 1.95 H, CH2=CH-C00-). Diacrilato de PEG, peso molecular de 3,400, fue preparado de manera similar al PEG con peso molecular de 3,400 (Aldrich, Mn de aproximadamente 3,400 de acuerdo con el fabricante). RMN 1H (CDCl3) � 3.6 ppm (156.34 H, PEG), 4.3 ppm (t, 2.26 H, -CH2-CH2-0-C0-CH=CH2), 5.8 ppm (dd, 1.0 H, CH2=CH-C00-), 6.1 ppm, 6.4 ppm (dd, 2.0 H, CH2=CH-C00-). Se preparo mono-acrilato de PEG de manera similar a partir de mono-eter metilico de PEG, peso molecular de 5,000 (Fluka, de Buchs, Suiza, Mn de aproximadamente 5,000, de acuerdo con el fabricante). RMN 1H (CDCl3)
�
3.6 ppm (94.38 H, PEG), 4.3 ppm (t, 1.93 H, -CH2-CH2-0-C0-CH=CH2), 5.8 ppm (dd, 1.00 H, CH2=CH-C00-),
6.1 ppm, 6.4 ppm (dd, 2.08 H, CH2=CH-C00-). Los polietilenglicoles de brazos multiples fueron hechos por los diversos fabricantes iniciando la polimerizacion de etilenglicol con los alcoxidos de multi-alcoholes de bajo peso molecular. De esta manera, el eslabon al nucleo del PEG de brazos multiples fue a traves de un enlace eter.
Formaci6n de gel
Para producir geles reticulados de un porcentaje dado de PEG, se hicieron dos soluciones, una conteniendo acrilato de PEG al porcentaje final deseado de PEG, y otra conteniendo ditiol de PEG al porcentaje final deseado de PEG. Para producir geles de PEG al 40%, se disolvio multi-acrilato de PEG a una concentracion nominal de 40% peso/volumen en PBS 50 mM, pH de 7.4 (10.85 g/l Na2HP04�7 H20), 0.88 g/l de NaH2P04 anhidro, y 4.8 g/l de NaCl). Justo antes de uso, ditiol de PEG, de peso molecular a 3,400 (Shearwater Polymers), fue disuelto por separado a una concentracion nominal de 40% peso/volumen en PBS 50 mM, pH de 7.4. Debido a los volumenes sumamente pequeros usados, el cambio de volumen de una solucion amortiguadora al ocurrir disolucion de PEG fue asumido ser igual a 1 ml por g de PEG. De esta manera, se aradieron 60 !l a 40 mg de PEG para producir una solucion de PEG al 40% peso/volumen nominal. De manera similar, soluciones de PEG al 30% peso/volumen fueron formadas por adicion de 70 !l de PBS a 30 mg de PEG. Para producir geles de PEG al 30%, se disolvio multi-acrilato de PEG a una concentracion nominal de 30% peso/volumen en PBS 50 mM, pH de 7.4, y se disolvio por separado ditiol de PEG a una concentracion nominal de 30% peso/volumen en PBS 50 mM, pH de 7.4. La disolucion del PEG requirio de entre 3 y 10 minutos. Las soluciones de multi-acrilato de PEG y ditiol de PEG fueron combinadas en las relaciones definidas en la Tabla 9, tal que la relacion de los grupos tiol a los grupos acrilato fuera siempre de 1:1.
Tabla �. Formulaciones de geles de pEG reticulados usados en los presentes estudios
Tipo de gel
Solucion de multiacrilato de PEG, !l Solucion de ditiol de PEG, peso mol. 3,400, !l
0cta-acrilato de PEG, peso mol. 20,000
59.5 40.5
Tetra-acrilato de PEG, peso mol. 14,800
68.5 31.5
Triacrilato de PEG, peso mol. 2,800
33.8 66.2
Liberaci6n de proteina
Para estudios de liberacion de proteina, se aradieron particulas solidas de albumina de suero de bovino (Cohn,
ramificacion V, Sigma, de St. Louis, Missouri, Estados Unidos, usadas tal como se recibieron y caracterizadas por microscopia de contraste de fases a una amplificacion de 2.5 x) a la solucion de multi-acrilato de PEG y se mezclaron con una punta de pipeta. La solucion de ditiol de PEG fue arada, y la solucion fue mezclada con una punta de pipeta y luego transferida al centro de una diapositiva de microscopio de vidrio, hidrofoba (7.5 x
2.5 cm, revestida de acuerdo con las instrucciones del proveedor con SigmaCote, de Sigma). Separadores cuadrados de Teflon (2 x 20 cm, 700 !m de grosor) fueron colocados en los extremos de la diapositiva de vidrio, y se coloco sobre ella una segunda diapositiva hidrofoba. Las dos diapositivas fueron sujetadas por pasadores de amarre. La gota de la solucion de PEG hizo contacto solamente con el vidrio hidrofobo y se esparcio para formar un disco circular con un grosor de 700 !m. Se curaron los geles por dos horas a 37°C en una incubadora humidificada.
Hinchamiento y degradaci6n del gel
Se caracterizaron el hinchamiento y la degradacion de los geles fueron caracterizados. Se formaron los geles como antes en jeringas de plastico de 1 ml, con un volumen total de 100 !l (la punta de la jeringa habia sido removida con una navaja de rasurar). Los geles fueron curados por dos horas a 37°C en una incubadora humidificada. Despues del curado, los geles fueron expulsados de las jeringas, y las dimensiones iniciales fueron medidas con calibradores digitales. Los geles fueron entonces aradidos a 5 ml de PBs 50 mM, pH de 7.4, y almacenados a 37°C. Las dimensiones de los geles fueron medidas con calibradores durante el tiempo hasta que se disolvieron plenamente los geles. De manera adicional, la cantidad de PEG liberada al PBS fue medida despues de 24 horas por cromatografia de exclusion de tamaros (Shodex 0Hpak SB-802-5HQ o SB803HQ, 8 x 300 mm, levigante: fosfato 10 mM, NaCl 0.3 M, pH de 7.4, 0.3 ml/min, con deteccion de indice refractivo). Para medir de manera mas precisa la ramificacion de volumen del polimero en los geles, la flotabilidad de los geles fue medida con un kit de determinacion de densidad en etanol en una bascula Mettler-Toledo AG (Mettler-Toledo, de Greifensee, Suiza). La densidad del gel fue medida despues de 24 horas de hinchamiento es agua desionizada. El gel fue entonce secado por congelacion, y el peso de PEG en cada gel fue determinado. El volumen del gel hinchado fue calculado a partir de la ecuacion Vs = (Wa -Wn)/�n, donde Vs es el volumen del gel hinchado, Wa es el peso del gel hinchado en aire, Wn es el peso en etanol, Vp fue calculado a partir del peso despues de secado por congelacion y la densidad de polimero seco, tomada como 1.1198 g/ml. La ramificacion de volumen del polimero en el gel hinchado fue entonces calculada como v2 = Vp/Vs. Para estudios de hinchamiento y degradacion, los volumenes de geles cilindricos fueron medidos como una funcion del tiempo hasta que habian disuelto completamente los geles. La relacion de hinchamiento, Q, fue calculada como: Q = Vt/Vo, donde Vt es el volumen al tiempo t y Vo es el volumen inicial del gel. La ramificacion de volumen de PEG en el gel fue estimada de vPEG = mPEG/(�PEG�Vt), donde mPEG es la masa inicial de PEG en el gel, y �PEG es la densidad de PEG solido, 1.1198 g/ml. Despues de las primeras 24 horas de hinchamiento, se intercambiaron los 5 ml de solucion amortiguadora sobre el gel, y el amortiguador removido fue analizado usando HPLC por exclusion de tamaros para determinar la cantidad de PEG liberada de los geles. El PEG liberado fue asumido no haberse incorporado dentro del gel durante el proceso de gelacion, y un valor corregido para la masa inicial de PEG fue entonces usado para calculos subsecuentes para mejor aproximar la masa de PEG en realidad reticulada en el material. La Tabla 10 muestra la cantidad de PEG liberada al amortiguador dentro de las 24 horas del hinchamiento y la masa inicial corregida de PEG en los geles.

Tabla 10. Cantidad de pEG incorporado dentro de la fase del gel durante la reticulaci6n
Gel
Cantidad PEG liberada de gel, primeras 24 horas (mg/ 100 !l gel) Masa inicial corregida de PEG (mg/ 100 !l gel) Moles de reticulaciones gel perfectamente reticulado (!moles) usando masa no corregida/ masa corregida
0cta-acrilato de PEG, peso molecular 20,000, 40% PEG
7 33 4.76/3.93
Tetra-acrilato de PEG, peso molecular 14,800, 40% PEG
7 33 3.70/3.05
Tetra-acrilato de PEG, peso molecular 14,800, 30% PEG
7 23 2.77/2.12
Triacrilato de PEG, peso molecular 2,800,
16 24 6.97/4.19
El hinchamiento de los geles es desplegado en las figuras 22A y 22B, ilustrando que los geles habian alcanzado un volumen inicial de equilibrio despues de unas cuantas horas. Para geles perfectamente reticulados, el valor de Q que se observa despues de las primera cuantas horas de hinchamiento debe ser determinado principalmente por el peso molecular de PEG entre reticulaciones y la concentracion de PEG durante reticulacion, con una pequera dependencia en la funcionalidad de la reticulacion. Para geles hechos a partir de octa-acrilato de PEG, tetra-acrilato de PEG, o triacrilato de PEG, el peso molecular entre las reticulaciones en un gel perfecto seria de 8,400, 10,800 y 5,267, respectivamente. Para geles formados a una concentracion inicial de PEG de 40% peso/volumen, no se encontro correlacion entre el valor de planicie inicial de Q y el peso molecular entre reticulaciones, indicando que el grado de terminacion de la reaccion de reticulacion puede ser sumamente importante con este sistema. Despues de reticulacion, los geles fueron colocados en un gran volumen de agua amortiguada. Dentro de las primeras pocas horas siguientes, los geles se hincharon de manera considerable pero alcanzaron un volumen de equilibrio dentro de 24 horas. La relacion de hinchamiento Q describe el volumen del gel con relacion a su volumen bajo las condiciones de reticulacion (figura 22A). La figura 22B muestra la ramificacion de volumen calculada de PEG en el gel durante el primer dia de hinchamiento. En punto de tiempo posteriores, los geles continuaron hinchandose debido a la hidrolisis de los enlaces dentro del gel. Se ha demostrado previamente que enlaces ester similares a los encontrados dentro de estos geles tienen una vida media de primer orden de alrededor de 11 dias a un pH de 7.4 y 37°C en solucion salina amortiguada. El comportamiento de hinchamiento y la eventual degradacion de los geles debido a la hidrolisis de los enlaces ester dependeria de la manera mas intensa en la funcionalidad de la reticulacion; al incrementarse la funcionalidad, deben romperse mas enlaces antes de que comience a reducir el numero de reticulaciones en el gel. De las figuras 23A y 23B puede observarse que un incremento en la funcionalidad del multi-acrilato de PEG llevo a un incremento en el tiempo requerido para completar la degradacion del gel.
Liberaci6n de proteinas
Para estudiar la liberacion de proteinas de los geles, se aradio albumina solida de suero de bovino a la solucion precursora del gel, como se describio antes, para producir geles de un total de 100 !l de solucion precursora liquida. Despues de curar a dos horas a 37°C en un ambiente humidificado, los geles fueron aradidos a 5 ml de PBs 50 mM, pH de 7.4. Las muestras fueron mantenidas a 37°C en un baro de agua agitado. Cada 24 horas, los 5 ml de solucion amortiguada fueron reemplazados y su absorbencia medida en un espetrofotometro a 280 nm. La concentracion de proteina en la solucion de PBS fue determinada a partir de una curva estandard. No hubo componentes de los geles distintos de la albumina que absorbieran luz a 280 nm. El limite de deteccion por esta tecnica fue de aproximadamente 2.3% de la proteina total por dia (es decir, se requirio una liberacion de alrededor de 178 !g de albumina por dia para deteccion). La cantidad acumulada de proteina liberada del gel no fue normalizada a 100%, sino que mas bien todas las cantidades de proteina son valores absolutas, y los porcentajes estan basados en la cantidad de proteina aradida a cada gel (7.5 mg de albumina). Los hidrogeles formados por la reaccion de adicion conjugada fueron investigados como vehiculos de entrega potenciales para farmacos de proteina. La liberacion de albumina de suero de bovino de los geles fue medida cada 24 horas hasta que casi toda la proteina hubiera sido liberada. La liberacion controlada de proteina fue observada de geles hechos con tetra-acrilato de PEG y octa-acrilato de PEG que fueron reticulados a una concentracion de PEG del 40% (figura 24). Para geles hechos con tetra-acrilato de PEG, se observo liberacion casi lineal por los primeros cuatro dias, con la liberacion de alrededor de 20% de proteina por dia. Para geles hechos con octa-acrilato de PEG, se observaron cuatro regimenes distintos. Despues de una liberacion inicial de alrededor de 10% de la proteina en el primer dia, se requirieron otros cuatro dias para la liberacion del siguiente 15% de proteina. Esto fue seguido por la liberacion del orden cero del siguiente 65% de la proteina durante cinco dias, con liberacion de 10 a 15% de proteina cada dia. En contraste, la proteina fue liberada rapidamente de geles hechos con triacrilato de PEG, y geles hechos con tetra-acrilato de PEG que fueron reticulados a una concentracion de PEG del 30%. Antes de la incorporacion al hidrogel, las particulas de albumina de suero de bovino fueron primero caracterizadas por microscopia optica y se encontraron consistir en plaquetas con diametros de 118 !m � 47 !m. La influencia del tamaro de las particulas de albumina de suero de bovino fue tambien probada moliendo el polvo solido al recibirse del proveedor usando mortero y pestillo bajo nitrogeno liquido. Las particulas mas pequeras fueron entonces incorporadas en geles de tetraacrilato de PEG al 40%. El perfil de liberacion de la proteina no fue afectado por el uso de las particulas mas pequeras. Para geles en los cuales se observo liberacion controlada, las particulas de proteina pueden verse dentro de los geles por todo el periodo de liberacion. Para todos los geles, la desaparicion de las particulas de proteina del gel fue coincidente con la consumacion de la entrega de mas de 90% de la proteina en el gel. De esta manera, la solubilidad de la albumina de suero de bovino en soluciones que contiene PEG fue factiblemente el factor mas importante para lograr liberacion controlada de la proteina. Cuando una solucion que contiene albumina disuelta fue mezclada con una solucion que contiene PEG disuelto, la albumina se precipito, dependiendo de las concentraciones y el peso molecular del PEG. De manera similar, cuando las particulas de albumina de suero de bovino fueron aradidas a una solucion de PEG, la cinetica de la disolucion de la albumina fue fuertemente afectada por la presencia de PEG. Los solidos de albumina se disolvieron por completo en amortiguador PBS 50 mM, pH de 7.4, en tres minutos, en ausencia de PEG. Con PEG al 10%, peso molecular de 8,000, en solucion, el tiempo a la disolucion de las particulas de albumina se incremento a seis minutos. Con PEG al 30 o 40%, peso molecular de 8,000, la proteina no se disolvio despues de siete dias. Con PEG al 20%, peso molecular de 8,000, las particulas de proteina se disolvieron para formar una segunda fase liquida dentro de una hora. Este fue presumiblemente un verdadero co-acervado con una fase rica en proteina, pobre en polimero, y una fase rica en polimero, pobre en proteina.
Calidad de la proteina liberada
Se uso electroforesis en gel de poliacrilamida de sulfato dodecilico de sodio (SDS-PAGE) para demostrar que la albumina permanecia sin modificar por tiol de PEG y acrilato de PEG durante la formacion de hidrogel. La albumina de suero de bovino fue disuelta en solucion salina amortiguada con HEPES 50 mM, pH de 7.4, a una concentracion de 1.5 mg/ml. Para reducir los enlaces bisulfuro en albumina antes de reaccionar con los derivados de PEG, se aradieron 10 !l de hidrocloruro de tris(2-carboxietil) fosfina (11.1 mg/ml en agua desionizada, Pierce Chemicals) a 500 !l de la solucion de albumina. Los siguientes derivados de PEG fueron aradidos a alicuotas de la solucion de albumina en relaciones estequiometricas especificadas: ditiol de PEG con peso molecular de 3,400, mono-acrilato de PEG, ester mono-NHS, peso molecular de 3,400 (Shearwater Polymers), o diacrilato de PEG, peso molecular de 3,400. En adicion, se aradio acido acrilico (anhidro, Aldrich) a soluciones de albumina selectas a fin de enfriar subitamente los grupos tiol libres en ditiol de PEG e impedir el intercambio de tiol con albumina durante la preparacion de la muestra para SDS-PAGE. Para preparacion de la muestra, se combinaron 10 !l de cualquier mezcla de reaccion dada con 6 !l de agua desionizada y 4 !l de amortiguador corriente de SDS-PAGE 5x conteniendo ditiotreitol (DTT) 1 M a menos que se serale lo contrario. Las muestras fueron entonces ebullidas por alrededor de tres minutos. Se usaron como estandares marcadores de peso molecular (Bio-Rad, de Hercules, California, Estados Unidos) de 31, 45, 66.2, 116 y 200 kDa. El analisis por SDS-PAGE mostro que bajo condiciones fisiologicas casi no hubo reaccion aparente entre albumina y diacrilato de PEG, peso molecular de 3,400, o entre albumina y ditiol de PEG, peso molecular de 3,400 (figuras 22A y 22B). En particular, la figura 25A muestra que la albumina incubada con diacrilato de PEG por una hora permanecio casi totalmente no modificada y de esta manera corrio virtualmente de manera identica a albumina nativa durante SDS-PAGE (carril 2 vs. carril 2). La reaccion de albumina reducida con acido acrilico tampoco cambio la migracion de la proteina (carril 4). La pequera mancha sobre la banda de albumina en la figura 25A, carril 3, puede indicar que un pequero porcentaje de la proteina fue modificado por diacrilato de PEG. Esta observacion esta en gran contraste con la reaccion obvia y abundante del ester de PEG-NHS con albumina bajo condiciones fisiologicas (figura 25A, carril 4), o entre diacrilato de PEG y albumina cuando la albumina fue previamente reducida y mantenida bajo condiciones de desnaturalizacion (figura 25A, carril 5). Aunque la albumina reacciono claramente con ditiol de PEG por intercambio de tiol cuando ebulle la mezcla de reaccion para SDS-PAGE (figura 25A, carril 9; no hubo DTT en la muestra), la albumina de hecho no fue modificada cuando los tioles libres de PEG fueron enfriados subitamente con acido acrilico antes de la preparacion de la muestra para SDS-PAGE (figuras 25B, carril 7). Esto muestra que la reaccion de albumina con ditiol de PEG no ocurre bajo condiciones fisiologicas sino que ocurre durante el paso de ebullicion requerido para preparacion de la muestra para electroforesis en gel. La falta de reactividad entre albumina y diacrilato de PEG o ditiol de PEG fue tambien evidente a partir de una observacion adicional: la albumina que habia sido incorporada en un gel de tetra-acrilato de PEG/ditiol de PEG y liberada del gel el sexto dia de la incubacion con amortiguador no fue modificada ni con tetra-acrilato de PEG ni ditiol de PEG (figura 25B, carril 3).
Otras modalidades
A partir de la descripcion precedente, sera aparente que se pueden hacer variaciones y modificaciones a la invencion en la presente para adaptarla para diferentes usos y condiciones. Estas modalidades tambien estan dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones. Ademas, el uso de una amina como un componente precursor del biomaterial es una modalidad que cae dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones. Todas las publicaciones y patentes que se mencionan en esta especificacion se incorporan a la presente como referencia, hasta el mismo grado que si se hubiera indicado de manera especifica e individual que cada publicacion o patente individual se incorpora como referencia.

Claims (26)

  1. REIvINDICACIONES
    1. Un biomaterial formado de la reticulacion de al menos un primer y un segundo componente precursor, en dicho primer componente precursor se selecciona del grupo que consiste de:
    D-Y-C(0)-(CH2)n-S-(CH2)2-C0X-P,
    D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-(CH2)2-C0X-P,
    D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-U-P,
    D-Y-C(0)-(CH2)n-S-U-P,
    D-Y-C(0)-(CH2)n-S-L-S-CH2-CH2-C0-X-P;
    D-Y-C(0)-(CH2)n-S-L-U-P;
    D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-L-S-CH2-CH2-C0-X-P;
    D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-L-S-U-P;
    D-Y-C(0)-(CH2)n-S-L-NH-CH2-CH2-C0-X-P;
    D-Y-C(0)-(CH2)n-S-L-NH-U-P;
    D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-L-NH-CH2-CH2-C0-X-P; o
    D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-L-NH-U-P,
    donde D es una ramificacion farmaceuticamente activa o una ramificacion de enlace; n es 1, 2 o 3; Y es 0, NH
    o N; L es un enlazador lineal o ramificado; X es 0 o N; P es un polimero soluble en agua o un polimero hinchable en agua que tiene uno o mas grupos insaturados conjugados; y U es el producto de adicion de un nucleofilo a un grupo electrofilo que esta unido al polimero.
  2. 2.
    El biomaterial de la reivindicacion 1, en donde la vida media del enlace ester o amida en dicha ramificacion farmaceuticamente activa es de entre un dia y nueve meses en una solucion acuosa a un pH de 7.4 y 37°C.
  3. 3.
    El biomaterial de la reivindicacion 1, en donde dicha ramificacion de enlace es heparina, una ramificacion de enlace de heparina, una ramificacion de enlace de ion de metal, una ramificacion de carbohidratos, una ramificacion de enlace de carbohidratos, o una ramificacion que enlaza grupos hidrofibicos.
  4. 4.
    El biomaterial de la reivindicacion 3, donde dicho ramificacion de enlace de ion de metal es una ramificacion de enlace de Cu2+, una ramificacion de enlace de Co2+, o una ramificacion de enlace de Zn2+.
    5 (11). El biomaterial de la reivindicacion 3, en donde dicha ramificacion de enlace de carbohidratos es un acido fenilboronico.
  5. 6.
    El biomaterial de la reivindicacion 5, en donde dicho acido fenilboronico esta enlazado a dicho biomaterial por medio de un amino secundario sobre el aro de fenil de dicho acido fenilboronico.
  6. 7.
    El biomaterial de la reivindicacion 3, en donde dicha ramificacion que enlaza grupo hidrofobicos es ciclodextrina.
  7. 8.
    El biomaterial de la reivindicacion 1, en donde dicho compuesto o ramificacion farmaceuticamente activo es derivado o seleccionado del grupo que consiste en moleculas organicas sinteticas, moleculas organicas que ocurren naturalmente, moleculas de acido nucleico, peptidos o proteinas bio-sinteticos, peptidos o proteinas que ocurren naturalmente, y peptidos o proteinas que ocurren naturalmente, modificados.
  8. 9.
    El biomaterial de la reivindicacion 8, en donde dicha molecula que ocurre naturalmente organica o sintetica es paclitaxel, doxorrubicina, camptotecina, 5-fluorodesoxiuridina, estradiol, 2-metoxiestradiol, o un derivado de estos.
  9. 10.
    El biomaterial de la reivindicacion 8, en donde dicha proteina o petido biosintetico que ocurre naturalmente
    o que ocurre modificado naturalmente se selecciona del grupo que consiste en factores de crecimiento, hormonas de crecimiento humano y sus derivados.
  10. 11.
    El biomaterial de la reivindicacion 1, en donde dicho segundo componente precursor es diferente de dicho primer componente precursor y comprende al menos dos enlaces conjugados insaturados o grupos nucleofilos.
  11. 12.
    El biomaterial de la reivindicacion 11, en donde dicho segundo componente precursor no comprende una
    ramificacion de enlace farmaceuticamente activa o una ramificacion de enlace.
  12. 13.
    El biomaterial de la reivindicacion 1, en donde dicho biomaterial comprende comprende una ramificacion de enlace o un compuesto farmaceuticamente activa o una ramificacion de enlace.
  13. 14.
    El biomaterial de la reivindicacion 1, en donde dicho polimero soluble en agua o polimero hinchable en agua es seleccionado del grupo que consiste en poli(etilenglicol), poli (oxido de etileno), poli(alcohol vinilico), poli(acido acrilico), poli(etileno-co-alcohol vinilico), poli(hidroxipropil metacrilamida), poli(N-isopropilacrilamida), poli(dimetil acrilamida), poli(vinil pirrolidona), poli(acido acrilico), poli (etiloxazolina), copolimeros de bloques de
    10 poli(oxido de etileno)-co-poli (oxido de propileno), o copolimeros solubles en agua o hinchables en agua que comprenden estos polimeros, y sus derivados que comprenden grupos insaturados conjugados.
  14. 15. El biomaterial de la reivindicacion 1, en donde dichos grupos insaturados conjugados son seleccionados del
    grupo que consiste en acrilatos, metacrilatos, acrilamidas, metacrilamidas, acrilonitrilos, vinilsulfonas y 15 quinonas.
  15. 16. El biomaterial de la reivindicacion 11, en donde dicho polimero soluble en agua o polimero hinchable en agua es seleccionado del grupo que consiste en poli(etilenglicol), poli (oxido de etileno), poli(alcohol vinilico), poli(acido acrilico), poli(etileno-co-alcohol vinilico), poli(hidroxipropil metacrilamida), poli(N-isopropilacrilamida),
    20 poli(dimetil acrilamida), poli(vinil pirrolidona), poli(acido acrilico), poli (etiloxazolina), copolimeros de bloques de poli(oxido de etileno)-co-poli (oxido de propileno), o copolimeros solubles en agua o hinchables en agua que comprenden estos polimeros, y sus derivados que comprenden grupos insaturados conjugados.
  16. 17. El biomaterial de la reivindicacion 11, en donde dichos grupos insaturados conjugados de dicho segundo
    25 precursor son seleccionados del grupo que consiste en acrilatos, metacrilatos, acrilamidas, metacrilamidas, acrilonitrilos, vinilsolfonas y quinonas.
  17. 18.
    El biomaterial de la reivindicacion 11, en donde dichos grupos nucleofilos de dicho segundo componente precursor se seleccionan del grupo que consiste de tioles y aminas.
  18. 19.
    El biomaterial de la reivindicacion 1, en donde la vida media del enlace ester o amida en dicha ramificacion de enlace farmaceuticamente activa es entre 1 hora y 1 aro en una solucion acuosa a pH 7,4 y 37°C.
  19. 20. El biomaterial de la reivindicacion 1, en donde dicho segundo componente 35 constituido por:
    D-Y-C(0)-(CH2)n-S-(CH2)2-C0X-P,
    D-Y-C(0)-(CH2)n -NH-(CH2)2-C0X-P, D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-U-P,
    40 D-Y-C(0)-(CH2)n-S-U-P, D-Y-C(0)-(CH2)n-S-L-S-CH2CH2-C0-X-P, D-Y-C(0)-(CH2)n-S-L-S-U-P, D-Y-C(0)-(CH2)n NH-L-S-CH2-CH2-C0-X-P, D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-L-S-U-P,
    45 D-Y-C(0)-(CH-2)n-S-L-NH-CH2-CH2-C0-X-P, D-Y-C(0)-(CH2),-S-L-NH-U-P, D-Y-C(0)-(CH2)r ,-NH-L-NH-CH2-CH2-C0-X-P, or D-Y-C(0)-(CH-2)n -NH-L-NH-U-P,
    se selecciona del grupo
    50 en donde D es una ramificacion de enlace farmaceuticamente activa una una ramificacion de enlace; n es 1, 2,
    o 3; Y es 0, NH o N; L es un grupo lineal o ramificada; X es 0 o N; P es un polimero soluble en agua o un polimero hinchable en agua que comprenden uno o mas grupos insaturados conjugados; y U es el producto de la adicion de un nucleofilo a un grupo electrofilo que esta adherido a dicho polimero.
    55 21. El biomaterial de la reivindicacion 1, en donde dicha reticulacion comprende una reaccion de adicion conjugada entre dichos primero y segundo componentes precursores.
  20. 22. El biomaterial de la reivindicacion 1, en donde dicha reticulacion comprende una polimerizacion por radicales libres entre dichos dichos primero y segundo componentes precursores.
  21. 23.
    El biomaterial de la reivindicacion 1 para su uso en un metodo de tratamiento o prevencion de una enfermedad, trastorno o infeccion en un mamifero.
  22. 24.
    Un compuesto farmaceuticamente activo de la formula D-02C-(CH2)n-SH, D-N(0)C-(CH2)n-SH, D-02C-(CH2) n-NH2 o D-N(0)C-(CH2)n-NH2 en donde n es 1, 2, o 3, y D es un resto farmaceuticamente activo.
  23. 25.
    El compuesto farmaceuticamente activo de la reivindicacion 24, en donde ramificacion de enlace farmaceuticamente activa es un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8, 9 o 10.
  24. 26.
    El compuesto farmaceuticamente activo de la reivindicacion 24 o 25, que comprende ademas al menos un polimero reticulado en el compuesto farmaceuticamente activo por una reaccion de adicion conjugada entre un grupo tiol o un grupo amino del compuesto farmaceuticamente activo y un grupo insaturado conjugado del polimero .
  25. 27.
    Un componente precursor apropiado para su uso en la formacion de un biomaterial, en donde dicho componente precursor se seleciona del grupo constituido por:
    D-Y-C(0)-(CH2)n-S-(CH2)2-C0X-P,
    D-Y-C(0)-(CH2)n -NH-(CH2)2-C0X-P,
    D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-U-P,
    D-Y-C(0)-(CH2)n-S-U-P,
    D-Y-C(0)-(CH2)n-S-L-S-CH2CH2-C0-X-P,
    D-Y-C(0)-(CH2)n-S-L-S-U-P,
    D-Y-C(0)-(CH2)n NH-L-S-CH2-CH2-C0-X-P,
    D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-L-S-U-P,
    D-Y-C(0)-(CH2)n-S-L-NH-CH2-CH2-C0-X-P,
    D-Y-C(0)-(CH2)n-S-L-NH-U-P,
    D-Y-C(0)-(CH2)n-NH-L-NH-CH2-CH2-C0-X-P, or
    D-Y-C(0)-(CH2)n -NH-L-NH-U-P,
    en donde D es una ramificacion de enlace farmaceuticamente activa una una ramificacion de enlace; n es 1, 2,
    o 3; Y es 0, NH o N; L es un grupo lineal o ramificada; X es 0 o N; P es un polimero soluble en agua o un polimero hinchable en agua que comprenden uno o mas grupos insaturados conjugados; y U es el producto de la adicion de un nucleofilo a un grupo electrofilo que esta adherido a dicho polimero.
  26. 28. Los componentes precursores de la reivindicacion 27 que ademas tienen al menos una de las siguientes caracteristicas:
    -La vida media del enlace ester o amida en dicha ramificacion de enlace farmaceuticamente activo es como se define en la reivindicacion 2, -Dicha dicha ramificacion de enlace o resto de enlace es como se define en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7,
    -
    Dicha dicha ramificacion de enlace o resto farmaceuticamente activo es como se define en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, -Dicho componente precursor comprende al menos dos enlaces conjugados insaturados o grupos nucleofilos,
    -
    Dichos grupos conjugados insaturados son como se definen en la reivindicacion 15, y
    -
    Dichos grupos nucleofilos son como se definen en la reivindicacion 18.
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