ES2386359T3 - Células huésped modificadas genéticamente y uso de las mismas para producir compuestos isoprenoides - Google Patents

Células huésped modificadas genéticamente y uso de las mismas para producir compuestos isoprenoides Download PDF

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Abstract

Célula huésped de Saccharomyces cerevisiae que produce un compuesto precursor de isoprenoide ocompuesto isoprenoide a través del mecanismo del mevalonato, en la que dicha célula es modificadagenéticamente para comprender:a) un ácido nucleico heterólogo integrado en el cromosoma de la célula huésped que codifica una 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima-A reductasa (HMGR) truncada que carece de un dominio que comprende la membrana yque mantiene su dominio catalítico C-terminal;b) una farnesil difosfato sintasa (FPPS) heteróloga integrada en el cromosoma de la célula huésped paraincrementar el nivel de actividad de dicha FPPS; yc) un ácido nucleico heterólogo integrado en el cromosoma de la célula huésped para disminuir el nivel deactividad de la escualeno sintasa;en la que la célula huésped comprende además una sesquiterpeno sintasa heteróloga y es capaz de producir unisoprenoide que deriva de la acción de dicha sesquiterpeno sintasa, yen la que las modificaciones genéticas proporcionan la producción del isoprenoide derivado de la acción de dichasesquiterpeno sintasa a un nivel que es por lo menos el 50% superior al nivel del isoprenoide en una célula decontrol que no comprende las modificaciones genéticas.

Description

CELULAS HUESPED MODIFICADAS GENETICAMENTE Y USO DE LAS MISMAS PARA PRODUCIR COMPUESTOS ISOPRENOIDES CAMPO DE LA INVENCION [0001] La presente invencion se encuentra en el campo de la produccion de compuestos isoprenoides y, en particular, celulas huesped que son modificadas geneticamente para producir compuestos isoprenoides. ANTECEDENTES DE LA INVENCION [0002] Los isoprenoides constituyen un grupo extremadamente amplio y diverso de productos naturales que tienen un origen biosintetico comun, es decir, un unico precursor metabolico, isopentenil difosfato (IPP). Los compuestos isoprenoides tambien se refieren como "terpenos" o "terpenoides". Se han descrito alrededor de
40.000 isoprenoides. Por definicion, los isoprenoides estan formados de las denominadas unidades de isopreno (C5). El numero de atomos de C presentes en los isoprenoides es normalmente divisible por cinco (C5, C10, C15, C20, C25, C30 y C40), aunque se han descrito isoprenoides irregulares y politerpenos. Los miembros importantes de los isoprenoides incluyen carotenoides, sesquiterpenoides, diterpenoides, y hemiterpenos. Los carotenoides incluyen, por ejemplo, licopeno, β-caroteno, y similares, muchos de los cuales actuan como antioxidantes. Los sesquiterpenoides incluyen, por ejemplo, artemisinina, un compuesto que tiene actividad contra la malaria. Los diterpenoides incluyen, por ejemplo, taxol, un agente quimioterapeutico contra el cancer. [0003] Los isoprenoides comprenden la familia mas numerosa y estructuralmente diversa de productos naturales. En esta familia, los terpenoides aislados de plantas y otras fuentes naturales se utilizan como compuestos de aromas y fragancias comerciales, asi como farmacos contra la malaria y el cancer. Una mayoria de los compuestos terpenoides que se utilizan actualmente son productos naturales o sus derivados. Los organismos de origen (por ejemplo, arboles, invertebrados marinos) de muchos de estos productos naturales no son susceptibles de un cultivo a gran escala necesario para producir cantidades comercialmente viables ni de manipulacion genetica para una mayor produccion o derivatizacion de estos compuestos. Por lo tanto, los productos naturales deben producirse semisinteticamente a partir de analogos o sinteticamente utilizando sintesis quimica convencional. Ademas, muchos productos naturales presentan estructuras complejas y, como resultado, son actualmente caros o imposibles de sintetizar. Dichos productos naturales deben extraerse de sus fuentes nativas, tales como arboles, esponjas, corales y microbios marinos; o producirse sinteticamente o semisinteticamente a partir de precursores abundantes. La extraccion de un producto natural a partir de una fuente nativa esta limitada por la disponibilidad de la fuente nativa; y la produccion sintetica o semisintetica de productos naturales puede sufrir un rendimiento bajo y/o un coste elevado. Dichos problemas de produccion y disponibilidad limitada de la fuente natural pueden limitar el desarrollo comercial y clinico de dichos productos. [0004] La biosintesis de productos naturales de isoprenoides en celulas huesped modificadas podria aprovechar el potencial comercial y terapeutico sin explotar de estos recursos naturales y producir productos de quimica fina y farmaceuticos menos caros y mas ampliamente disponibles. El obstaculo principal para la biosintesis de terpenoides a nivel elevado es la produccion de precursores de terpenos. En Saccharomyces cerevisiae, l mecanismo del mevalonato proporciona la produccion de isopentenil difosfato (IPP), que se puede isomerizar y polimerizar en isoprenoides y terpenos de valor comercial. Tambien se producen otros precursores valiosos, incluyendo farnesil difosfato (FPP) y geranilgeranil difosfato (GPP). Sin embargo, mucho del flujo de reaccion esta dirigido hacia las posteriores etapas no deseadas del mecanismo de esterol, dando lugar a la produccion de ergosterol. [0005] Existe la necesidad en la tecnica de celulas huesped mejoradas productoras de isoprenoides y precursoras de isoprenoides que proporcionen una produccion a nivel elevado de compuestos isoprenoides, asi como de los precursores de poliprenil difosfato de dichos compuestos. La presente invencion esta dirigida a esta necesidad y proporciona ventajas relacionadas. Literatura [0006] Publicacion de patente de Estados Unidos No. 2004/005678; Publicacion de patente de Estados Unidos No. 2003/0148479; Martin et al. (2003) Nat. Biotech. 21(7):796-802; Polakowski et al. (1998) Appl. Microbiol. Biotechnol. 49: 67-71; Wilding et al. (2000) J Bacteriol 182(15): 4319-27; Publicacion de patente de Estados Unidos No. 2004/0194162; Donald et al. (1997) Appl. Env. Microbiol. 63:3341-3344; Jackson et al (2003) Organ. Lett. 5:1629-1632; Publicacion de patente de Estados Unidos No. 2004/0072323; Publicacion de patente de Estados Unidos No. 2004/0029239; Publicacion de patente de Estados Unidos No. 2004/0110259; Publicacion de patente de Estados Unidos No. 2004/0063182; Patente de Estados Unidos No. 5,460,949; Publicacion de patente de Estados Unidos No. 2004/0077039; Patente de Estados Unidos No. 6,531,303; Patente de Estados Unidos No. 6,689,593; Hamano et al. (2001) Biosci. Biotechnol. Biochem. 65:1627-1635; T. Kuzuyama. (2004) Biosci. Biotechnol. 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DESCRIPCION RESUMIDA DE LA INVENCION
[0007] La presente invencion proporciona una celula huesped de Saccharomyces cerevisiae que produce un precursor de isoprenoide o compuesto isoprenoide a traves del mecanismo de mevalonato, en el que dicha celula es modificada geneticamente para comprender: (a) un acido nucleico heterologo integrado en el cromosoma de la celula huesped que codifica una 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima-A reductasa (HMGR) truncada que carece del dominio que abarca la membrana y que mantiene su dominio catalitico C-terminal; (b) una farnesil difosfato sintasa (FPPS) heterologa integrada en el cromosoma de la celula huesped para incrementar el nivel de actividad de dicha FPPS; y (c) un acido nucleico heterologo integrado en el cromosoma de la celula huesped para disminuir el nivel de actividad de escualeno sintasa; donde la celula huesped comprende ademas una sesquiterpeno sintasa heterologa yes capazde producir un isoprenoide que deriva de la accion de dicha sesquiterpeno sintasa, y donde las modificaciones geneticas proporcionan la produccion del isoprenoide derivado de la accion de dicha sesquiterpeno sintasa a un nivel que por lo menos aproximadamente el 50% superior al nivel del isoprenoide en una celula de control que no comprende las modificaciones geneticas. Se proporcionan metodos para la produccion de un compuesto isoprenoide o un compuesto precursor de isoprenoide en dicha celula huesped. Los metodos implican generalmente cultivar dicha celula huesped modificada geneticamente bajo condiciones que promueven la produccion de niveles elevados de un compuesto isoprenoide o compuesto precursor de isoprenoide y aislar el compuesto precursor de isoprenoide o compuesto isoprenoide del medio de cultivo. Se hace referencia aqui a continuacion a una "celula huesped" como una celula huesped de S. cerevisiae segun la reivindicacion 1.
BREVE DESRCIPCION DE LAS FIGURAS
[0008] La figura 1 es una representacion esquematica del mecanismo de mevalonato en Saccharomyces cerevisiae. Se muestran las estructuras de los intermedios y nombres de los genes que codifican varias enzimas en el mecanismo.
[0009] La figura 2 es una representacion esquematica de una parte del mecanismo de biosintesis de esterol en un organismo que expresa amorfadieno sintasa (ADS). Se muestran las estructuras de los intermedios y nombres de los genes que codifican varias enzimas en el mecanismo.
[0010] Las figuras 3A y 3B representan la produccion de amorfadieno por S. cerevisiae durante 96 horas de cultivo que expresa amorfadieno sintasa (ADS) (+); ADS y 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima-A reductasa (tHMGR) truncada (0); ADSyupc2-1 (.); yADSyecm22-1 (.). Los datos se muestran como la produccion total (3A) y normalizados para la densidad celular (3B). Los datos son las medias p desviacion estandar (n=3).
[0011] La figura 4 representa la produccion de amorfadieno en la cepa EPY212 de S. cerevisiae desarrollada en concentraciones de metionina de 0, 0,1, 0,3, 0,5 y 1 despues de 64 y 87 horas de cultivo. Los datos son los promedios de las medias de las dos muestras.
[0012] La figura5 representa la produccion de amorfadieno por S. cerevisiae por varias cepas de levadura durante 144 horas de cultivo expresante. Los datos son las medias p desviaciones estandar (n=3).
[0013] La figura 6 representa una secuencia de nucleotidos que codifica una HMGR truncada.
[0014] Las figuras 7A y 7B representan una secuencia de aminoacidos de una HMGR truncada.
DEFINICIONES
[0015] Los terminos "isoprenoide," "compuesto isoprenoide," "terpeno," "compuesto terpeno," "terpenoide," y "compuesto terpenoide" se utilizan indistintamente en la presente invencion. Los compuestos isoprenoides estan formados de varias cantidades de unidades los denominados isopreno (C5). El numero de atomos de C presentes en los isoprenoides es normalmente divisible uniformemente por cinco (por ejemplo, C5, C10, C15, C20, C25, C30 y C40). Se han descrito isoprenoides y politerpenos irregulares y tambien se incluyen en la definicion de "isoprenoide". Los compuestos Isoprenoides incluyen pero sin limitacion, monoterpenos, sesquiterpenos, triterpenos, politerpenos, y diterpenos.
[0016] Tal como se utiliza aqui, el termino "prenil difosfato" se utiliza indistintamente con "pernil pirofosfato" e incluye monoprenil disfosfatos que tiene un unico grupo prenilo (por ejemplo, IPP y DMAPP), asi como poliprenil difosfatos que incluyen 2 o mas grupos prenilo. Los monoprenil difosfatos incluyen isopentenil pirofosfato (IPP) y su isomero dimetilalil pirofosfato (DMAPP).
[0017] Tal como se utiliza aqui, el termino "terpeno sintasa" se refiere a cualquier enzima que modifica enzimaticamente IPP, DMAPP, o un poliprenil pirofosfato, se manera que se produce un compuesto terpenoide. El termino "terpeno sintasa" incluye enzimas que catalizan la conversion de un pernil difosfato en un isoprenoide.
[0018] La palabra "pirofosfato" se utiliza indistintamente aqui con "difosfato." De este modo, por ejemplo, los terminos "pernil difosfato" y "prenil pirofosfato" son intercambiables; los terminos "isopentenil pirofosfato" y "isopentenil difosfato" son intercambiables; los terminos farnesil difosfato" y farnesil pirofosfato" son intercambiables; etc.
[0019] El termino "mecanismo del mevalonato" o "mecanismo del MEV" se utiliza aqui para referirse al mecanismo biosintetico que convierte el acetil-CoA en IPP. La ruta del mevalonato comprende enzimas que catalizan las siguientes etapas: (a) condensar dos moleculas de acetil-CoA a acetoacetil-CoA; (b) condensar acetoacetil-CoA con acetil-CoA para formar HMG-CoA; (c) convertir HMG-CoA en mevalonato; (d) fosforilar mevalonato en mevalonato 5-fosfato; (e) convertir mevalonato 5-fosfato en mevalonato 5-pirofosfato; y (f) convertir mevalonato 5-pirofosfato en isopentenil pirofosfato. La ruta del mevalonato se ilustra esquematicamente en la figura 1.
[0020] Tal como se utiliza aqui, el termino "prenil transferasa" se utiliza indistintamente con los terminos "isoprenil difosfato sintasa" y "poliprenil sintasa" (por ejemplo, "GPP sintasa," "FPP sintasa," "OPP sintasa," etc.) para referirse a una enzima que cataliza la condensacion 1'-4 consecutiva de isopentenil difosfato con sustratos cebadores alilicos, dando lugar a la formacion de prenil difosfatos de varias longitudes de cadena.
[0021] Los terminos "polinucleotido" y "acido nucleico," utilizados indistintamente aqui, se refieren a una forma polimerica de nucleotidos de cualquier longitud, ya sean ribonucleotidos o desoxinucleotidos. De este modo, este termino incluye, pero sin limitacion, ADN o ARN de monocadena, doble cadena o multiples cadenas, ADN genomico, ADNc, hibridos ADN-ARN, o un polimero que comprende bases de purina y pirimidina u otras bases de nucleotidos naturales, modificados quimica o bioquimicamente, no naturales o derivadas.
[0022] Tal como se utiliza aqui, los terminos "operon" y "unidad de transcripcion individual" se utilizan indistintamente para referirse a dos o mas regiones codificantes contiguas (secuencias de nucleotidos que codifican un producto genico, tal como un ARN o una proteina) que son regulados de forma coordinada por uno o mas elementos de control (por ejemplo, un promotor). Tal como se utiliza aqui, el termino "producto genico" se refiere a ARN codificado por ADN (o viceversa) o proteina que es codificada por un ARN o ADN, donde un gen comprendera habitualmente una o mas secuencias de nucleotidos que codifican una proteina, y pueden incluir tambien intrones y otras secuencias de nucleotidos no codificantes.
[0023] Los terminos "peptido," "polipeptido," y "proteina" se utilizan indistintamente aqui yse refieren a una forma polimerica de aminoacidos de cualquier longitud, que pueden incluir aminoacidos codificados y no codificados, aminoacidos modificados o derivatizados quimica o bioquimicamente, y polipeptidos que tienen esqueletos peptidicos modificados.
[0024] El termino "natural" tal como se utiliza aqui aplicado a un acido nucleico, una celula, o un organismo, se refiere a un acido nucleico, celula, u organismo que se halla en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipeptido o polinucleotido que esta presente en un organismo (incluyendo virus) que se pueden aislar de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado intencionadamente por el ser humano es natural.
[0025] El termino "acido nucleico heterologo," tal como se utiliza aqui, se refiere a un acido nucleico en el que por lo menos una de las frases siguientes es cierta: (a) el acido nucleico es foraneo ("exogeno") a (es decir, no natural hallado en) un microorganismo huesped o celula huesped determinados; (b) el acido nucleico comprende una secuencia de nucleotidos que se halla de forma natural en (por ejemplo, es "endogena a") un microorganismo huesped o celula huesped determinados (por ejemplo, el acido nucleico comprende una secuencia de nucleotidos endogena al microorganismo huesped o celula huesped); sin embargo, en el contexto de un acido nucleico heterologo, la misma secuencia de nucleotidos que la hallada endogenamente se produce en una cantidad no natural (por ejemplo, mayor que la esperada o mayor que la hallada de forma natural) en la celula, o un acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que difiere en la secuencia de la secuencia de nucleotidos endogena, pero codifica la misma proteina (que tiene la misma o sustancialmente la misma secuencia de aminoacidos) que la hallada endogenamente se produce en una cantidad no natural (por ejemplo, mayor que la esperada o mayor que la hallada de forma natural) en la celula; (c) el acido nucleico comprende dos o mas secuencias de nucleotidos que no se hallan en la misma relacion entre si en la naturaleza, por ejemplo, el acido nucleico es recombinante. Un ejemplo de un acido nucleico heterologo es una secuencia de nucleotidos que codifica HMGR unida operativamente a un elemento de control de la transcripcion (por ejemplo, un promotor) a la que una secuencia codificante de HMGR endogena (natural) no esta normalmente unida operativamente. Otro ejemplo de un acido nucleico heterologos un plasmido con un elevado numero de copias que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica HMGR. Otro ejemplo de un acido nucleico heterologo es un acido nucleico que codifica HMGR, donde una celula huesped que no produce normalmente HMGR se modifica geneticamente con el acido nucleico que codifica HMGR; dado que los acidos nucleicos que codifican HMGR no se hallan de forma natural en la celula huesped, el acido nucleico es heterologo a la celula huesped modificada geneticamente.
[0026] "Recombinante," tal como se utiliza aqui, significa que un acido nucleico particular (ADN o ARN) es el producto de varias combinaciones de etapas de clonacion, restriccion, y/o union que dan lugar a un constructo que tiene una secuencia estructural codificante y no codificante diferenciable de los acidos nucleicos endogenos hallados en sistemas naturales. En general, las secuencias de ADN que codifican la secuencia codificante estructural se pueden ensamblar a partir de fragmentos de ADNc y enlazadores de oligonucleotidos cortos, o a partir de una serie de oligonucleotidos sinteticos, para proporcionar un acido nucleico sintetico que es capaz de expresarse a partir de una unidad transcripcional recombinante contenida en una celula o en un sistema de transcripcion y traduccion libre de celulas. Dichas secuencias se pueden proporcionar en forma de un marco de lectura abierto no interrumpido por secuencias no traducidas internas o intrones, que estan presentes normalmente en genes eucariotas. El ADN genomico que comprende las secuencias relevantes tambien se pueden utilizar en la formacion de un gen o unidad transcripcional recombinante. Las secuencias de ADN no traducidas pueden estar presentes en 5' o 3' con respecto al marco de lectura abierto, donde dichas secuencias no interfieren con la manipulacion o la expresion de las regiones codificantes, y pueden de hecho actuar para modular la produccion de un producto deseado mediante varios mecanismos (veanse las "secuencias reguladoras de ADN" a continuacion).
[0027] De este modo, por ejemplo, el termino polinucleotido o acido nucleico "recombinante" se refiere a aquel que no es natural, por ejemplo, se produce mediante la combinacion artificial de dos segmentos de secuencia separados a traves de la intervencion humana. Esta combinacion artificial se realiza a menudo mediante medios de sintesis quimica, o mediante la manipulacion artificial de segmentos aislados de acidos nucleicos, por ejemplo, mediante tecnicas de ingenieria genetica. Esto se realiza normalmente para sustituir un codon por un codon redundante que codifica el mismo aminoacido o un aminoacido conservativo, mientras que normalmente introduce o elimina un sitio de reconocimiento de secuencia. Alternativamente, se realiza para unir juntos segmentos de acidos nucleicos de funciones deseadas para generar una combinacion deseada de funciones. Esta combinacion artificial se realiza a menudo mediante medios de sintesis quimica, o mediante la manipulacion artificial de segmentos aislados de acidos nucleicos, por ejemplo, mediante tecnicas de ingenieria genetica
[0028] Por "constructo" se entiende un acido nucleico recombinante, generalmente ADN recombinante, que ha sido generado con el objetivo de expresar una secuencia o secuencias de nucleotidos especificas, o va a utilizarse en la construccion de otras secuencias de nucleotidos recombinantes.
[0029] Tal como se utiliza aqui, el termino "acido nucleico exogeno" se refiere a un acido nucleico que no esta normalmente o se halla de forma natural en y/o es producido por una bacteria, organismo o celula determinada en la naturaleza. Tal como se utiliza aqui, el termino "acido nucleico endogeno" se refiere a un acido nucleico que se halla normalmente en y/o es producido por una bacteria, organismo o celula determinada en la naturaleza. Un "acido nucleico endogeno" tambien se refiere como un "acido nucleico nativo" o un acido nucleico que es "nativo" a una bacteria, organismo o celula determinada. Por ejemplo, un ADNc generado a partir del ARNm aislado de una planta y que codifica una terpeno sintasa representa un acido nucleico exogeno para S. cerevisiae. En S. cerevisiae, las secuencias de nucleotidos que codifican HMGS, MK, y PMK en el cromosoma serian acidos nucleicos "endogenos".
[0030] Los terminos "secuencias reguladoras de ADN," "elementos de control," y "elementos reguladores," utilizados indistintamente aqui, se refieren a secuencias de control transcripcional y traduccional, tales como promotores, potenciadores, senales de poliadenilacion, terminadores, senales de degradacion de proteinas, y similares, que proporcionan y/o regulan la expresion de una secuencia codificante y/o produccion de un polipeptido codificado en una celula huesped.
[0031] El termino "transformacion" se utiliza indistintamente aqui con "modificacion genetica" y se refiere a un cambio genetico permanente o transitorio inducido en una celula despues de la introduccion nuevo acido nucleico (es decir, ADN exogeno a la celula). El cambio ("modificacion") genetica se puede llevar a cabo mediante la incorporacion del nuevo ADN en el genoma de la celula huesped o mediante el mantenimiento transitorio o estable del nuevo ADN como elemento episomal. Cuando la celula es una celula eucariota, en general se consigue un cambio genetico permanente mediante la introduccion del ADN en el genoma de la celula. En celulas procariotas, los cambios permanentes se pueden introducir en el cromosoma o a traves de elementos extracromosomicos, tales como plasmidos y vectores de expresion, que pueden contener uno o mas marcadores seleccionables para ayudar en su mantenimiento en la celula huesped recombinante.
[0032] "Unido operativamente" se refiere a una yuxtaposicion en la que los componentes descritos estan en una relacion que les permite actuar en su manera pretendida. Por ejemplo, un promotor esta unido operativamente a una secuencia codificante si el promotor afecta a su transcripcion o expresion. Tal como se utiliza aqui, los terminos "promotor heterologo" y "regiones de control heterologas" se refieren a promotores y otras regiones de control que no estan normalmente asociados con un acido nucleico concreto en la naturaleza. Por ejemplo, una "region de control de la transcripcion heterologa a una region codificante" es una region de control de la transcripcion que no esta normalmente asociada con la region codificante en la naturaleza.
[0033] Una "celula huesped,", tal como se utiliza aqui, indica una celula de S. Cerevisiae in vivo o in vitro que puede utilizarse o se ha utilizado como un receptor para un acido nucleico (por ejemplo, un vector de expresion que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica uno o mas productos genicos tal como se define en la reivindicacion 1), e incluye la progenie de la celula original que se ha modificado geneticamente por el acido nucleico. Se entiende que la progenie de una celula individual puede no ser necesariamente completamente identica en morfologia o en complemento de ADN genomico o total a la original, debido a una mutacion natural, accidental o deliberada. Una "celula huesped recombinante" (tambien referida como "celula huesped modificada geneticamente") es una celula huesped en que se ha introducido un acido nucleico heterologo, por ejemplo, un vector de expresion. Por ejemplo, una celula huesped de S. Cerevisiae en cuestion es una celula huesped modificada geneticamente debido a la introduccion en una celula huesped adecuada de un acido nucleico heterologo, por ejemplo, un acido nucleico exogeno que es foraneo a la celula huesped, o un acido nucleico recombinante que no se halla normalmente en la celula huesped.
[0034] Tal como se utiliza aqui, el termino "aislado" pretende describir un polinucleotido, un polipeptido, o una celula que esta en un medio diferente de aquel en que el polinucleotido, el polipeptido o la celula aparece de forma natural. Una celula huesped modificada geneticamente aislada puede estar presente en una poblacion mixta de celulas huesped modificadas geneticamente.
[0035] Se pueden preparar cassettes de expresion que comprenden una region o regiones de inicio de la transcripcion o de control de la transcripcion (por ejemplo, un promotor), la region codificante para la proteina de interes, y una region de terminacion de la transcripcion. Las regiones de control de la transcripcion incluyen aquellas que proporcionan la sobreexpresion de la proteina de interes en la celula huesped modificada geneticamente; aquellas que proporcionan una expresion inducible, de manera que cuando se anade un agente inductor al medio de cultivo, se induce o aumenta la transcripcion de la region codificante de la proteina de interes hasta un nivel superior al de antes de la induccion.
[0036] Un acido nucleico es "hibridable" a otro acido nucleico, tal como ADNc, ADN genomico, o ARN, cuando una forma de cadena unica del acido nucleico se puede hibridar a otro acido nucleico bajo las condiciones apropiadas de temperatura y fuerza ionica de la solucion. Las condiciones de hibridacion y lavado son conocidas y se ejemplifican en Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), particularmente el capitulo 11 y la Tabla 11.1 en la misma; y Sambrook, J. y Russell, W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (2001). Las condiciones de temperatura y fuerza ionica determinan la "rigurosidad" de la hibridacion. Las condiciones de rigurosidad se pueden ajustar para cribar fragmentos moderadamente similares, tales como secuencias homologas de organismos relacionados de forma distante, hasta fragmentos altamente similares, tales como genes que duplican enzimas funcionales de organismos estrechamente relacionados. Las condiciones de hibridacion y los lavados de post-hibridacion son utiles para obtener las condiciones de rigurosidad determinadas deseadas de la hibridacion. Un grupo de lavados post-hibridacion ilustrativos es una serie de lavados que empiezan con 6 x SSC (donde SSC es NaCl 0,15 M y tampon citrato 15 mM), SDS al 0,5% SDS a temperatura ambiente durante 15 minutos, a continuacion se repite con 2 x SSC, SDS al 0,5% a 45'C durante 30 minutos, y a continuacion se repite dos veces con 0,2 x SSC, SDS al 0,5% a 50'C durante 30 minutos. Otras condiciones de rigurosidad se obtienen utilizando temperaturas mas elevadas en las que los lavados son identicos a los anteriores a excepcion de la que la temperatura del final de dos lavados de 30 minutos en 0,2 x SSC, SDS al 0,5%, se incrementa hasta 60'C. Otro grupo de condiciones de rigurosidad elevada utiliza dos lavados finales en 0,1 x SSC, SDS al 0,1% a 65'C. Otro ejemplo de condiciones de hibridacion astringentes es la hibridacion a 50'C o superior y 0,1xSSC (cloruro sodico 15 mM/citrato sodico 1,5 mM). Otro ejemplo de condiciones de hibridacion rigurosas es incubacion durante la noche a 42'C en una solucion: formamida al 50%, 5 X SSC (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5 x solucion de Denhardt, sulfato de dextrano al 10%, y 20 μg/ml de ADN de esperma de salmon roto desnaturalizado, seguido del lavado de los filtros en 0,1 x SSC a aproximadamente 65'C. Las condiciones de hibridacion rigurosas y las condiciones de lavado post-hibridacion son condiciones de hibridacion y condiciones de lavado de post-hibridacion que son por lo menos tan rigurosas como las condiciones representativas anteriores.
[0037] La hibridacion requiere que los dos acidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque dependiendo de la rigurosidad de la hibridacion, son posibles desapareamientos entre bases. La rigurosidad apropiada para hibridar acidos nucleicos depende de la longitud de los acidos nucleicos y el grado de complementacion, variables conocidas en la tecnica. Cuanto mayor es el grado de similitud u homologia entre dos secuencias de nucleotidos, mayor es el valor de la temperatura de fusion (Tf) para hibridos de acidos nucleicos que tienen aquellas secuencias. La estabilidad relativa (correspondiente a una Tf superior) de hibridaciones de acido nucleico disminuye en el siguiente orden: ARN:ARN, ADN:ARN, ADN:ADN. Para hibridos superiores a 100 nucleotidos de longitud, se han derivado ecuaciones para calcular Tf (vease Sambrook et al., supra, 9.50-9.51). Para hibridaciones con acidos nucleicos mas cortos, es decir, oligonucleotidos, la posicion de los desapareamientos se vuelve mas importante, y la longitud de los oligonucleotidos determina su especificidad (vease Sambrook et al., supra, 11.7-11.8). Habitualmente, la longitud de un acido nucleico hibridable es por lo menos aproximadamente de 10 nucleotidos. Las longitudes minimas ilustrativas para un acido nucleico hibridable son: por lo menos aproximadamente de 15 nucleotidos; por lo menos aproximadamente de 20 nucleotidos; y por lo menos aproximadamente de 30 nucleotidos. Ademas, el experto en la materia reconocera que la temperatura y la concentracion de sal de la solucion de lavado se pueden ajustar segun sea necesario segun los factores, tales como la longitud de la sonda.
[0038] El termino "sustitucion conservativa de aminoacidos" se refiere a la intercambiabilidad de proteinas de residuos de aminoacidos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales alifaticas que consiste en glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales ahidroxil-alifaticas que consiste en serina y treonina; un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales que contienen amida que consisten en asparagina y glutamina; un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales aromaticas que consisten en fenilalanina, tirosina y triptofano; un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales basicas que consisten en lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre que consisten en cisteina y metionina. Los grupos de sustitucion conservativa de aminoacidos de ejemplo son valina-leucinaisoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, y asparagina-glutamina.
[0039] Los "acidos nucleicos sinteticos" se pueden ensamblar a partir de bloques de construccion de oligonucleotidos que se sintetizan quimicamente utilizando procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Estos bloques de construccion se ligan e hibridan para formar segmentos genicos que a continuacion se ensamblan enzimaticamente para construir el gen completo. "Sintetizado quimicamente", en relacion con una secuencia de ADN, significa que los nucleotidos del componente se ensamblaron in vitro. La sintesis quimica manual de ADN se puede realizar utilizando procedimientos bien establecidos, o se puede llevar a cabo una sintesis quimica automatizada utilizando uno de un conjunto de maquinas disponibles comercialmente. La secuencia de nucleotidos de los acidos nucleicos se puede modificar para una expresion optima en base a la optimizacion de la secuencia de nucleotidos para reflejar la tendencia del codon de la celula huesped. El experto en la materia valora la probabilidad de una expresion satisfactoria si la utilizacion de un codon es propensa a aquellos codones favorecidos por el huesped. La determinacion de codones preferidos se puede basar en un reconocimiento de genes derivados de la celula huesped en la que esta disponible la informacion de la secuencia.
[0040] Un polinucleotido o polipeptido tiene un cierto porcentaje de "identidad en la secuencia" con otro polinucleotido o polipeptido, lo que significa que, cuando se alinean, ese porcentaje de bases o aminoacidos es el mismo, y en la misma posicion relativa, cuando se comparan las dos secuencias. La similitud de secuencias se puede determinar de diferentes maneras. Para determinar la identidad de secuencia, las secuencias se pueden alinear utilizando los metodos programas informaticos, incluyendo BLAST, disponibles en la pagina web ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. Vease, por ejemplo, Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403-10. Otro algoritmo de alineacion es FASTA, disponible en el paquete Genetics Computing Group (GCG), de Madison, Wisconsin, Estados Unidos, una subsidiaria totalmente propiedad de Oxford Molecular Group, Inc. Otras tecnicas para la alineacion se describen en Methods in Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., una division de Harcourt Brace & Co., San Diego, California, Estados Unidos. De particular interes son los programas de alineacion que permiten espacios en la secuencia. El algoritmo Smith-Waterman es un tipo de algoritmo que permite espacios en las alineaciones de secuencia. Vease Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997). Ademas, el programa GAP que utiliza el metodo de alineacion de Needleman y Wunsch se puede utilizar para alinear secuencias. Vease J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970).
[0041] Antes de describir la presente invencion con mas detalle, debe entenderse que la presente invencion no se limita a realizaciones particulares descritas, y, por tanto, naturalmente, puede variar. Debe entenderse tambien que la terminologia utilizada aqui es para el objetivo de describir realizaciones particulares unicamente y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente invencion se limitara solo por las reivindicaciones adjuntas.
[0042] Cuando se proporciona un intervalo de valores, debe entenderse que cada valor que interviene, hasta la decima parte de la unidad del limite inferior, a menos que el contexto dictamine claramente lo contrario, entre el limite superior y el limite inferior de ese intervalo y cualquier otro valor indicado o que interviene en este intervalo indicado, se encuentra comprendido en la invencion. Los limites superior e inferior de estos intervalos mas pequenos pueden estar incluidos independientemente en los intervalos mas pequenos y tambien estan comprendidos en la invencion, sujetos a cualquier limite especificamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos limites, los intervalos que excluyen alguno o ambos de esos limites incluidos tambien estan incluidos en la invencion.
[0043] A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientificos utilizados aqui tienen el mismo significado que el entendido habitualmente por un experto en la materia a la que pertenece la invencion. Aunque se puede utilizar en la practica o evaluacion de la presente invencion cualquier metodo y material similar a los descritos aqui, los metodos y materiales preferidos se describen a continuacion.
[0044] Debe indicarse que, tal como se utiliza aqui y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un/una" y "el/la" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto dictamine claramente lo contrario. De este modo, por ejemplo, la referencia a "una celula huesped modificada geneticamente" incluye una pluralidad de dichas celulas huesped y la referencia a "el compuesto isoprenoide" incluye la referencia a uno o mas compuestos isoprenoides y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la materia, y asi sucesivamente. Debe indicarse tambien que las reivindicaciones se pueden redactar para excluir cualquier elemento opcional. Por tanto, esta afirmacion pretende servir como base antecedente para utilizar dicha terminologia exclusiva como "solamente", "solo" y similares en relacion con la redaccion de los elementos de la reivindicacion o utilizacion de una limitacion "negativa".
[0045] Las publicaciones aqui descritas se proporcionan solamente para su divulgacion antes de la fecha de presentacion de la presente solicitud. Nada en el presente documento debe interpretarse como una admision de que la presente invencion no presenta el derecho de prefechar dicha publicacion debido a la invencion anterior. Ademas, las fechas de publicacion proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicacion reales que pueden ser necesarias de confirmar independientemente.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
[0046] La presente invencion proporciona celulas huesped de S. cerevisiae modificadas geneticamente que producen precursores de isoprenoides o compuestos isoprenoides segun la reivindicacion 1. Se proporcionan metodos para la produccion de un compuesto isoprenoide o un precursor isoprenoide en una celula huesped modificada geneticamente en cuestion segun la reivindicacion 3. Los metodos implican generalmente cultivar una celula huesped modificada geneticamente en cuestion bajo condiciones que promueven la produccion de niveles elevados de un compuesto isoprenoide o un compuesto precursor de isoprenoide.
[0047] Los mecanismos del mevalonato y esterol de S. cerevisiae se representan esquematicamente en la figura 1 y la figura 2 (cabe indicar que la amorfadieno sintasa (ADS) en la figura 2 no se expresa normalmente en S. cerevisiae no modificada geneticamente). Este mecanismo es tipico de una amplia variedad de celulas eucariotas. FPP se convierte en escualeno mediante la escualeno sintasa (ERG9). El escualeno se convierte en ergosterol en las etapas posteriores. En celulas no modificadas, mucho del flujo metabolico dirige FPP hacia la sintesis de esterol. En una celula huesped modificada geneticamente en cuestion, el flujo metabolico se redirige hacia una mayor produccion de los precursores de isoprenoide IPP y FPP.
CELULAS HUESPED MODIFICADAS GENETICAMENTE
[0048] La presente invencion proporciona celulas huesped de S. cerevisiae modificadas geneticamente segun la reivindicacion 1, modificadas segun la presente invencion, una celula huesped modificada geneticamente en cuestion muestra las siguientes caracteristicas: niveles de actividad incrementada de una o mas enzimas del mecanismo de mevalonato; niveles incrementados de la actividad de prenil transferasa; y niveles disminuidos de la actividad de escualeno sintasa.
[0049] Los niveles de actividad incrementados de una o mas enzimas del mecanismo de mevalonato, los niveles incrementados de la actividad de prenil transferasa, y los niveles disminuidos de actividad de escualeno sintasa incrementan la produccion de isoprenoides o precursores de isoprenoides por una celula huesped modificada geneticamente en cuestion. De este modo, se describe aqui una celula huesped modificada geneticamente que muestra incrementos en la produccion de isoprenoides o precursores de isoprenoides, donde la produccion de isoprenoides o precursores de isoprenoides se incrementa en por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 2 veces, por lo menos aproximadamente 2,5 veces, por lo menos aproximadamente 5 veces, por lo menos aproximadamente 10 veces, por lo menos aproximadamente 20 veces, por lo menos aproximadamente 30 veces, por lo menos aproximadamente 40 veces, por lo menos aproximadamente 50 veces, por lo menos aproximadamente 75 veces, por lo menos aproximadamente 100 veces, por lo menos aproximadamente 200 veces, por lo menos aproximadamente 300 veces, por lo menos aproximadamente 400 veces, por lo menos aproximadamente 500 veces, o por lo menos aproximadamente 103 veces, o mas, en la celula huesped modificada geneticamente, en comparacion con el nivel de compuesto precursor de isoprenoide o compuesto isoprenoide producido en una celula huesped de control que no esta modificada geneticamente tal como se describe aqui. La produccion de isoprenoides o precursores de isoprenoides se determina facilmente utilizando metodos conocidos, por ejemplo, cromatografia de gases-espectrometria de masas, cromatografia liquida-espectrometria de masas, cromatografia de ionesespectrometria de masas, deteccion amperometrica pulsada, espectrometria UV-VIS y similares.
[0050] Se describe aqui una celula huesped modificada geneticamente que proporciona una mayor produccion de isoprenoide o precursor de isoprenoide por celula, por ejemplo, la cantidad de compuesto isoprenoide o precursor de isoprenoide producida utilizando el metodo en cuestion es por lo menos aproximadamente 10%, por lo menos aproximadamente 15%, por lo menos aproximadamente 20%, por lo menos aproximadamente 25%, por lo menos aproximadamente 30%, por lo menos aproximadamente 35%, por lo menos aproximadamente 40%, por lo menos aproximadamente 45%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 2 veces, por lo menos aproximadamente 2,5 veces, por lo menos aproximadamente 5 veces, por lo menos aproximadamente 10 veces, por lo menos aproximadamente 20 veces, por lo menos aproximadamente 30 veces, por lo menos aproximadamente 40 veces, por lo menos aproximadamente 50 veces, por lo menos aproximadamente 75 veces, por lo menos aproximadamente 100 veces, por lo menos aproximadamente 200 veces, por lo menos aproximadamente 300 veces, por lo menos aproximadamente 400 veces, o por lo menos aproximadamente 500 veces, o 103 veces, o mas more, mas elevada que la cantidad de compuesto isoprenoide o precursor de isoprenoide producida por una celula huesped que no se ha modificado geneticamente por los metodos en cuestion, en base a una celula. La cantidad de celulas se mide midiendo el peso celular en seco o midiendo la densidad optica del cultivo celular.
[0051] Se describe aqui una celula huesped modificada geneticamente que proporciona una mayor produccion de isoprenoide o precursor de isoprenoide por volumen unitario del cultivo celular, por ejemplo, la cantidad de compuesto isoprenoide o precursor de isoprenoide producida utilizando una celula huesped modificada geneticamente en cuestion es, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 2 veces, por lo menos aproximadamente 2,5 veces, por lo menos aproximadamente 5 veces, por lo menos aproximadamente 10 veces, por lo menos aproximadamente 20 veces, por lo menos aproximadamente 30 veces, por lo menos aproximadamente 40 veces, por lo menos aproximadamente 50 veces, por lo menos aproximadamente 75 veces, por lo menos aproximadamente 100 veces, por lo menos aproximadamente 200 veces, por lo menos aproximadamente 300 veces, por lo menos aproximadamente 400 veces, o por lo menos aproximadamente 500 veces, o 103 veces, o mas, mas elevada que la cantidad de compuesto isoprenoide o precursor de isoprenoide producida por una celula huesped que no se ha modificado geneticamente por los metodos en cuestion, en base a un volumen unitario del cultivo celular.
[0052] En algunas realizaciones, un huesped modificado geneticamente en cuestion produce un compuesto isoprenoide o precursor de isoprenoide en una cantidad que varia desde 1 μg de compuesto isoprenoide/ml hasta 100.000 μg compuesto isoprenoide /ml, por ejemplo, desde aproximadamente 1 μg/ml hasta aproximadamente 10.000 μg/ml de compuesto isoprenoide, 1 μg/ml a 5000 μg/ml de compuesto isoprenoide, 1 μg/ml a 4500 μg/ml de compuesto isoprenoide, 1 μg/ml a 4000 μg/ml de compuesto isoprenoide, 1 μg/ml a 3500 μg/ml de compuesto isoprenoide, 1 μg/ml a 3000 μg/ml de compuesto isoprenoide, 1 μg/ml a 2500 μg/ml de compuesto isoprenoide, 1 μg/ml a 2000 μg/ml de compuesto isoprenoide, 1 μg/ml a 1500 μg/ml de compuesto isoprenoide, 1 μg/ml a 1000 μg/ml de compuesto isoprenoide, 5 μg/ml a 5000 μg/ml de compuesto isoprenoide, 10 μg/ml a 5000 μg/ml de compuesto isoprenoide, 20 μg/ml a 5000 μg/ml de compuesto isoprenoide, 30 μg/ml a 1000 μg/ml de compuesto isoprenoide, 40 μg/ml a 500 μg/ml de compuesto isoprenoide, 50 μg/ml a 300 μg/ml de compuesto isoprenoide, 60 μg/ml a 100 μg/ml de compuesto isoprenoide, 70 μg/ml a 80 μg/ml de compuesto isoprenoide, desde aproximadamente 1 μg/ml hasta aproximadamente 1.000 μg/ml, desde aproximadamente
1.000 μg/ml hasta aproximadamente 2.000 μg/ml, desde aproximadamente 2.000 μg/ml hasta aproximadamente
3.000 μg/ml, desde aproximadamente 3.000 μg/ml hasta aproximadamente 4.000 μg/ml, desde aproximadamente 4.000 μg/ml hasta aproximadamente 5.000 μg/ml, desde aproximadamente 5.000 μg/ml hasta aproximadamente 7.500 μg/ml, o desde aproximadamente 7.500 μg/ml hasta aproximadamente 10.000 μg/ml, o mas de 10.000 μg/ml de compuesto isoprenoide, por ejemplo, desde aproximadamente 10 mg de compuesto isoprenoide/ml hasta aproximadamente 20 mg de compuesto isoprenoide/ml, desde aproximadamente 20 mg de compuesto isoprenoide/ml hasta aproximadamente 50 mg de compuesto isoprenoide/ml, desde aproximadamente 50 mg de compuesto isoprenoide/ml hasta aproximadamente 100 mg de compuesto isoprenoide/ml, o mas.
[0053] En una realizacion de ejemplo, el mecanismo metabolico de Saccharomyces cerevisiae se modifica para producir sesquiterpenos a partir de farnesil difosfato. Uno de dichos sesquiterpenos, amorfadieno, es un precursor del farmaco contra la malaria artemisina. El amorfadieno, ciclado a partir de farnesil difosfato, se puede utilizar como un ensayo para niveles de precursores de isoprenoides.
[0054] En una realizacion de ejemplo, se incrementan los niveles de actividad de HMGR, una prenil transferasa, Ecm22p y Upc2p y se disminuyen los niveles de actividad de escualeno sintasa. La 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima-A reductasa (HMGR) y una prenil transferasa, por ejemplo, la farnesil difosfato sintasa (FPPS), catalizan reacciones de cuello de botella en un mecanismo de sintesis del amorfadieno. El incremento de la actividad de HMGR y una pernil transferasa, FPPS, superan estos cuellos de botella. En la regulacion de la sintesis de esterol son importantes dos factores de transcripcion, Ecm22p y Upc2p. Cada uno de estos dos factores se muta en un unico aminoacido proximo a sus extremos C-terminales, cuya mutacion incrementa la actividad de cada factor. La escualeno sintasa cataliza la reaccion de farnesil difosfato a escualeno en el mecanismo de sintesis de esterol no deseado. De este modo, para maximizar los grupos de precursores y evitar el flujo excesivo a esteroles, se ha limitado la transcripcion de ERG9.
Nivel de actividad incrementado de una o mas enzimas del mecanismo del mevalonato
[0055] El mecanismo del mevalonato comprende enzimas que catalizan las siguientes etapas: (a) condensar dos moleculas de acetil-CoA en acetoacetil-CoA, habitualmente mediante la accion de acetoacetil-CoA tiolasa; (b) condensar acetoacetil-CoA con acetil-CoA para formar HMGCoA, habitualmente mediante la accion de HMG sintasa (HMGS); (c) convertir HMG-CoA en mevalonato, habitualmente mediante la accion de HMGR; (d) fosforilar mevalonato en mevalonato 5-fosfato, habitualmente mediante la accion de mevalonato quinasa (MK);
(e) convertir mevalonato 5-fosfato en mevalonato 5-pirofosfato, habitualmente mediante la accion de fosfomevalonato quinasa (PMK); y (f) convertir mevalonato 5-pirofosfato en isopentenil pirofosfato, habitualmente mediante la accion de mevalonato pirofosfato descarboxilasa (MPD).
[0056] Tambien se describe aqui una celula huesped eucariota modificada geneticamente que comprende una o mas modificaciones geneticas que dan lugar a uno o mas de los siguientes: nivel incrementado de la actividad de HMGS; nivel incrementado de la actividad de HMGR; nivel incrementado de la actividad de MK; nivel incrementado de la actividad de PMK; y nivel incrementado de la actividad de MPD.
[0057] Tambien se describe aqui una celula huesped modificada geneticamente que es modificada geneticamente de manera que se incrementa el nivel de actividad de una o mas de las enzimas del mecanismo de mevalonato. El nivel de actividad de una o mas enzimas del mecanismo de mevalonato en una celula huesped modificada geneticamente en cuestion se puede incrementar de varias maneras, que incluyen, pero sin limitacion, 1) incrementar la fuerza del promotor del promotor al que esta unido operativamente la region codificante de la enzima del mecanismo del mevalonato; 2) incrementar el numero de copias del plasmido que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica la enzima del mecanismo del mevalonato; 3) incrementar la estabilidad de un ARNm de la enzima del mecanismo del mevalonato (donde un "ARNm de la enzima del mecanismo del mevalonato" es un ARNm que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica la enzima del mecanismo del mevalonato); 4) modificar la secuencia del sitio de union a ribosoma de un ARN de la enzima del mecanismo de mevalonato, de manera que se incrementa el nivel de traduccion del ARNm de la enzima del mecanismo del mevalonato; 5) modificar la secuencia entre el sitio de union a ribosoma de un ARNm de la enzima del mecanismo del mevalonato y el codon de inicio de la secuencia codificante de la enzima del mecanismo del mevalonato, de manera que se incrementa el nivel de traduccion del ARNm de la enzima del mecanismo del mevalonato; 6) modificar la region 5' intercistronica completa del codon de inicio de la region codificante de la enzima del mecanismo del mevalonato, de manera que se incrementa la traduccion del ARNm de la enzima del mecanismo del mevalonato; 7) modificar la utilizacion de codones de la enzima del mecanismo de mevalonato, de manera que se incrementa el nivel de traduccion del ARNm de la enzima del mecanismo del mevalonato, 8) expresar ARNt de codones raros utilizados en la enzima del mecanismo del mevalonato, de manera que se incrementa el nivel de traduccion del ARNm de la enzima del mecanismo del mevalonato; 9) incrementar la estabilidad enzimatica de la enzima del mecanismo del mevalonato; 10) incrementar la actividad especifica (unidades de actividad por unidad de proteina) de la enzima del mecanismo del mevalonato; 11) expresar una forma modificada de una enzima del mecanismo del mevalonato, se manera que la enzima modificada muestra una solubilidad incrementada en la celula huesped; o 12) expresar una forma modificada de una enzima del mecanismo del mevalonato, de manera que la enzima modificada carece de una dominio a traves del cual tiene lugar la regulacion. Las modificaciones anteriores se pueden realizar individualmente o combinadas; por ejemplo, se pueden realizar dos o mas de las modificaciones anteriores para proporcionar un nivel incrementado de la actividad de la enzima del mecanismo del mevalonato.
[0058] La enzima HMG-CoA reductasa (HMGR) cataliza una reaccion irreversible que reduce la 3-hidroxi-3metilglutaril Coenzima A (HMG-CoA) en mevalonato. Esta etapa es la etapa comprometida en el mecanismo de la biosintesis de esterol. De este modo, la HMGR es un punto principal de regulacion en organismos que utilizan de forma natural el mecanismo del mevalonato para producir isoprenoides.
[0059] Tambien se describe aqui una celula huesped modificada geneticamente en cuestion que es modificada geneticamente de manera que se incrementa el nivel de actividad de HMGR. El nivel de actividad de HMGR en la celula huesped modificada geneticamente se puede incrementar de varias maneras, que incluyen, pero sin limitacion, 1) incrementar la fuerza del promotor del promotor al que esta unido operativamente la region codificante de HMGR; 2) incrementar el numero de copias del plasmido que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica HMGR; 3) incrementar la estabilidad de un ARNm de HMGR (donde un "ARNm de HMGR" es un ARNm que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica HMGR); 4) modificar la secuencia del sitio de union a ribosoma de un ARNm de HMGR, de manera que se incrementa el nivel de traduccion del ARNm de HMGR; 5) modificar la secuencia entre el sitio de union a ribosoma de un ARNm de HMGR y el codon de inicio de la secuencia codificante de HMGR, de manera que se incrementa el nivel de traduccion del ARNm de HMGR; 6) modificar la region 5' intercistronica completa del codon de inicio de la region codificante de HMGR, de manera que se incrementa la traduccion del ARNm de HMGR; 7) modificar la utilizacion de codones de HMGR, de manera que se incrementa el nivel de traduccion del ARNm de HMGR, 8) expresar ARNt de codones raros utilizados en HMGR, de manera que se incrementa el nivel de traduccion del ARNm de HMGR; 9) incrementar la estabilidad enzimatica de HMGR; 10) incrementar la actividad especifica (unidades de actividad por unidad de proteina) de HMGR; u 11) truncar la HMGR para eliminar un elemento regulador negativo. Las modificaciones anteriores se pueden realizar individualmente o combinadas; por ejemplo, se pueden realizar dos o mas de las modificaciones anteriores para proporcionar un nivel incrementado de la actividad de HMGR.
[0060] El nivel de HMGR se incrementa mediante la modificacion genetica de una celula huesped, de manera que produce una forma truncada de HMGR (tHMGR), cuya forma truncada presenta una actividad enzimatica incrementada en relacion a HMGR de tipo salvaje. tHMGR carece de una dominio que comprende la membrana y, por tanto, es soluble y carece de la retroinhibicion de HMGR. tHMGR mantiene su region C-terminal catalitica y, de este modo, mantiene la actividad de HMGR. En algunas realizaciones, la HMGR truncada presenta la secuencia de aminoacidos representada en las figuras 7A y 7B (SEQ ID NO:2). En algunas realizaciones, la HMGR truncada es codificada por un acido nucleico que comprende la secuencia de nucleotidos representada en la figura 6 (SEQ ID NO:1).
[0061] En algunas celulas huesped aqui descritas, se incrementa el nivel de actividad de una o mas de HMGS, MK, y PMK. En S. cerevisiae, los genes que codifican HMGS (ERG13), MK (ERG12), y PMK (ERG8) comprende un elemento regulador de esterol que se une a los factores de transcripcion Ecm22p y Upc2p, donde, tras la union de Ecm22p y Upc2p, se activa la transcripcion. En algunas realizaciones, el nivel de actividad de una o mas de HMGS, MK, y PMK se incrementa aumentando la actividad de Ecm22p y Upc2p. Vik et al. (2001) Mol. Cell. Biol. 19:6395-405.
[0062] Normalmente, S. cerevisiae no capta esteroles del medio bajo condiciones aerobicas. Lewis et al. ((1988) Yeast 4:93-106) aislaron un mutante de levadura, upc2-1 (captacion de control), que dio lugar a una captacion aerobica de esterol. El alelo upc2-1 comprende una transicion de guanina a adenina en el marco de lectura abierto designado como YDR213 W en el cromosoma IV. Crowley et al. (1998) J. Bacteriol. 16: 4177-4183. La secuencia de acidos nucleicos de UPC2 de tipo salvaje es conocida y se puede obtener a traves del GenBank No. de acceso Z68194. Este alelo de tipo salvaje esta indicado como las coordenadas 889746-892487 en el cromosoma de S. cerevisiae. Tal como fue descubierto previamente por Lewis et al., bajo condiciones nativas, el nivel de captacion de esterol fue de 10 a 20 veces mayor que con el tipo salvaje isogenico. El mutante dio lugar a una produccion incrementada de ergosterol.
[0063] Se ha observado que un unico cambio de aminoacido proximo al extremo c-terminal de los factores de transcripcion Upc2p y Ecm22p incrementa su actividad. En muchas realizaciones, una celula huesped modificada geneticamente en cuestion es modificada geneticamente de manera que Upc2p comprende una sustitucion de glicina a acido aspartico en el aminoacido 888; y Ecm22p comprende una sustitucion de glicina en acido aspartico en el aminoacido 790.
Nivel incrementado de la actividad de preniltransferasa
[0064] Tambien se describe aqui una celula huesped eucariota modificada geneticamente que es modificada geneticamente, de manera que se incrementa el nivel de actividad de geranil difosfato sintasa (GPPS) y/o farnesil difosfato sintasa (FPPS).
[0065] La enzima farnesil difosfato sintasa (FPPS) cataliza una reaccion que convierte el geranil difosfato (GPP) en farnesil difosfato (FPP). Tambien se ha observado que esta etapa es limitante de la velocidad en el mecanismo del mevalonato. De este modo, la FPPS es un punto de regulacion en organismos que utilizan de manera natural el mecanismo del mevalonato para producir isoprenoides. Por tanto, y para facilitar la descripcion posterior, la modulacion de los niveles de actividad de una prenil transferasa se discute en terminos de modulacion del nivel de actividad de una FPPS.
[0066] El nivel de actividad de FPPS en una celula huesped modificada geneticamente se puede incrementar de varias maneras, que incluyen, pero sin limitacion, 1) incrementar la fuerza del promotor del promotor al que esta unido operativamente la region codificante de FPPS; 2) incrementar el numero de copias del plasmido que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica FPPS; 3) incrementar la estabilidad de un ARNm de FPPS (donde un "ARNm de FPPS" es un ARNm que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica FPPS); 4) modificar la secuencia del sitio de union a ribosoma de un ARNm de FPPS, de manera que se incrementa el nivel de traduccion del ARNm de FPPS; 5) modificar la secuencia entre el sitio de union a ribosoma de un ARNm de FPPS y el codon de inicio de la secuencia codificante de FPPS, de manera que se incrementa el nivel de traduccion del ARNm de FPPS; 6) modificar la region 5' intercistronica completa del codon de inicio de la region codificante de FPPS, de manera que se incrementa la traduccion del ARNm de FPPS; 7) modificar la utilizacion de codones de FPPS, de manera que se incrementa el nivel de traduccion del ARNm de FPPS, 8) expresar ARNt de codones raros utilizados en FPPS, de manera que se incrementa el nivel de traduccion del ARNm de FPPS; 9) incrementar la estabilidad enzimatica de FPPS; o 10) incrementar la actividad especifica (unidades de actividad por unidad de proteina) de FPPS. Las modificaciones anteriores se pueden realizar individualmente o combinadas; por ejemplo, se pueden realizar dos o mas de las modificaciones anteriores para proporcionar un nivel incrementado de la actividad de FPPS.
Nivel disminuido de actividad de escualeno sintasa
[0067] La enzima escualeno sintasa cataliza una reaccion que convierte farnesil difosfato en escualeno. Esta etapa es la primera etapa en el mecanismo que lleva de farnesil difosfato a ergosterol. De este modo, al limitar la accion de esta enzima, el FPP se desvia hacia mecanismos de produccion de terpenoides utilizando, por ejemplo, terpeno sintasas o GGPP sintasa y posteriores terpeno sintasas.
[0068] Una celula huesped modificada geneticamente en cuestion es modificada geneticamente, de manera que se disminuye el nivel de actividad de escualeno sintasa. El nivel de actividad de escualeno sintasa en la celula huesped modificada geneticamente se puede disminuir de varias maneras, que incluyen, pero sin limitacion, 1) disminuir la fuerza del promotor del promotor al que esta unido operativamente la region codificante de escualeno sintasa; 2) disminuir la estabilidad de un ARNm de escualeno sintasa (donde un "ARNm de escualeno sintasa" es un ARNm que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica escualeno sintasa); 3) modificar la secuencia del sitio de union a ribosoma de un ARNm de escualeno sintasa, de manera que se disminuye el nivel de traduccion del ARNm de escualeno sintasa; 4) modificar la secuencia entre el sitio de union a ribosoma de un ARNm de escualeno sintasa y el codon de inicio de la secuencia codificante de escualeno sintasa, de manera que se disminuye el nivel de traduccion del ARNm de escualeno sintasa; 5) modificar la region 5' intercistronica completa del codon de inicio de la region codificante de escualeno sintasa, de manera que se disminuye la traduccion del ARNm de escualeno sintasa; 6) modificar la utilizacion de codones de escualeno sintasa, de manera que se disminuye el nivel de traduccion del ARNm de escualeno sintasa, 7) disminuir la estabilidad enzimatica de escualeno sintasa; 8) disminuir la actividad especifica (unidades de actividad por unidad de proteina) de escuelano sintasa, o 9) utilizar un promotor reprimible quimicamente y reprimir el promotor reprimible quimicamente mediante la adicion de un producto quimico a un medio de crecimiento. Las modificaciones anteriores se pueden realizar individualmente o combinadas; por ejemplo, se pueden realizar dos
o mas de las modificaciones anteriores para proporcionar un nivel disminuido de la actividad de escualeno sintasa.
[0069] En una realizacion de ejemplo, la actividad de la escualeno sintasa en S. cerevisiae se ha reducido o eliminado. Se han producido mutantes de ERG9 de levadura que no son capaces de convertir el mevalonato en escualeno. Vease, por ejemplo, Karst et al. (1977) Molec. Gen. Genet. 154:269-277; patente de Estados Unidos No. 5,589,372; y publicacion de la patente de Estados Unidos No. 2004/0110257. Las modificaciones geneticas incluyen la disminucion de la actividad de la escualeno sintasa mediante el bloqueo o la reduccion de la produccion de escualeno sintasa, reduciendo la actividad de la escualeno sintasa o mediante la inhibicion de la actividad de escualeno sintasa. El bloqueo o la reduccion de la produccion de escualeno sintasa pueden incluir situar el gen de escualeno sintasa bajo el control de un promotor que requiere la presencia de un compuesto inductor en el medio de crecimiento. Mediante el establecimiento de condiciones tales que el inductor se agota en el medio, se puede desactivar la expresion de escualeno sintasa. Algunos promotores se desactivan mediante la presencia de un compuesto represor. Por ejemplo, los promotores de los genes de CTR3 o CTR1 de levadura se pueden reprimir mediante la adicion de cobre. El bloqueo o la reduccion de la actividad de la escualeno sintasa puede incluir tecnologia de escision similar a la descrita en la patente de Estados Unidos No. 4,743,546. En esta estrategia, el gen ERG9 se clona entre secuencias geneticas especificas que permiten la escision controlada especifica del gen ERG9 del genoma. La escision podria estar provocada por, por ejemplo, un desplazamiento en la temperatura de cultivo del cultivo, como en la patente de Estados Unidos No. 4,743,546, o por alguna otra senal fisica o nutricional. Dicha modificacion genetica incluye cualquier tipo de modificacion y especificamente incluye modificaciones realizadas mediante tecnologia recombinante y mediante mutagenesis clasica. Los inhibidores de escualeno sintasa son conocidos (vease la patente de Estados Unidos No. 4,871,721 y las referencias citadas en la patente de Estados Unidos No. 5,475,029) y se pueden anadir a los cultivos celulares.
[0070] En algunas realizaciones, se modifica el uso de codones de una secuencia codificante de escualeno sintasa, de manera que se disminuye el nivel de traduccion del ARNm de ERG9. La reduccion del nivel de traduccion de ARNm de ERG9 por modificacion del uso de codones se consigue mediante la modificacion de la secuencia para incluir codones que son raros o que no son comunmente utilizados por la celula huesped. Estan disponibles tablas de uso de codones para muchos organismos que resumen el porcentaje de tiempo que un organismo especifico utiliza un codon especifico para codificar un aminoacido. Ciertos codones se utilizan mas frecuentemente que otros, los codones "raros". El uso de codones "raros" en una secuencia disminuye generalmente su indice de traduccion. De este modo, por ejemplo, se modifica la secuencia codificante mediante la introduccion de uno o mas codones raros, que afectan el indice de traduccion, pero no la secuencia de aminoacidos de la enzima traducida. Por ejemplo, hay 6 codones que codifican para arginina: CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, and AGG. En E. coli se utilizan los codones CGT y CGC mucho mas frecuentemente (codificando aproximadamente el 40% de las argininas en E. coli cada uno) que el codon AGG (que codifica aproximadamente el 2% de las argininas en E. coli). Modificando un codon CGT en la secuencia de un gen en un codon AGG no cambiaria la secuencia de la enzima, pero probablemente disminuiria el indice de traduccion del gen.
Generacion de una celula huesped modificada geneticamente
[0071] Una celula huesped modificada geneticamente en cuestion se genera utilizando metodos estandar bien conocidos para los expertos en la materia. En algunos metodos aqui descritos, se introduce un acido nucleico heterologo que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una variante de una enzima del mecanismo del mevalonato y/o un acido nucleico heterologo que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una variante del factor de transcripcion que controla la transcripcion de una enzima o enzimas del mecanismo del mevalonato en una celula huesped y sustituye todo o parte de un gen endogeno, por ejemplo, a traves de recombinacion homologa. En algunos metodos aqui descritos, se introduce un acido nucleico heterologo en una celula huesped parental y el acido nucleico heterologo se recombina con un acido nucleico endogeno que codifica una enzima del mecanismo del mevalonato, una preniltransferasa, un factor de transcripcion que controla la transcripcion de una o mas enzimas del mecanismo del mevalonato, o una escualeno sintasa, modificando geneticamente de este modo la celula huesped parental. En algunos metodos aqui descritos, el acido nucleico heterologo comprende un promotor que ha incrementado la fuerza del promotor en comparacion con el promotor endogeno que controla la transcripcion de la preniltransfersa endogena, y la recombinacion da lugar a la sustitucion del promotor endogeno con el promotor heterologo. En otros metodos aqui descritos, el acido nucleico heterologo comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una HMGR truncada que muestra una actividad enzimatica incrementada en comparacion con la HMGR endogena y la recombinacion da lugar a la sustitucion de la secuencia codificante de HMGR endogena por la secuencia codificante de la HMGR heterologa. En algunos metodos aqui descritos, el acido nucleico heterologo comprende un promotor que proporciona una transcripcion regulada de una secuencia codificante de la escualeno sintasa unida operativamente y la recombinacion da lugar a la sustitucion del promotor de escualeno sintasa endogeno por el promotor heterologo.
Modificaciones geneticas adicionales
[0072] Se describe aqui una celula huesped modificada geneticamente en cuestion que comprende una o mas modificaciones geneticas ademas de las descritas anteriormente. Por ejemplo, una celula huesped modificada geneticamente en cuestion se modifica geneticamente de forma adicional con una o mas secuencias de nucleotidos que comprenden uno o mas acidos nucleicos que codifican una o mas de una preniltransferasa (por ejemplo, una preniltransferasa diferente de FPP y GPP); una terpeno sintasa; y similares.
Uso de codones
[0073] En algunas realizaciones, se modifica la secuencia de nucleotidos que codifica un producto genico (por ejemplo, una preniltransferasa, una terpeno sintasa, etc.) de manera que la secuencia de nucleotidos refleja la preferencia de codon para la celula huesped concreta. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se modificara la secuencia de nucleotidos para la preferencia del codon de levadura. Ver, por ejemplo, Bennetzen y Hall (1982) J. Biol. Chem. 257(6): 3026-3031.
[0074] Tal y como se indica anteriormente, en algunas realizaciones, se modifica el uso de codones de una secuencia codificante de escualeno sintasa, de manera que se disminuye el nivel de traduccion del ARNm de ERG9. La reduccion del nivel de traduccion de ARNm de ERG9 por modificacion del uso de codones se consigue mediante la modificacion de la secuencia para incluir codones que son raros o que no son comunmente utilizados por la celula huesped. Estan disponibles tablas de uso de codones para muchos organismos que resumen el porcentaje de tiempo que un organismo especifico utiliza un codon especifico para codificar un aminoacido. Ciertos codones se utilizan mas frecuentemente que otros, los codones "raros". El uso de codones "raros" en una secuencia disminuye generalmente su indice de traduccion. De este modo, por ejemplo, se modifica la secuencia codificante mediante la introduccion de uno o mas codones raros, que afectan el indice de traduccion, pero no la secuencia de aminoacidos de la enzima traducida. Por ejemplo, hay 6 codones que codifican para arginina: CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, and AGG. En E. coli se utilizan los codones CGT y CGC mucho mas frecuentemente (codificando aproximadamente el 40% de las argininas en E. coli cada uno) que el codon AGG (que codifica aproximadamente el 2% de las argininas en E. coli). Modificando un codon CGT en la secuencia de un gen en un codon AGG no cambiaria la secuencia de la enzima, pero probablemente disminuiria el indice de traduccion del gen.
Suministro de acetil-CoA incrementado
[0075] Dado que la acetil-CoA es un reactivo utilizado por acetoacetil-CoA tiolasa y HMGS en el mecanismo de MEV, en algunas celulas huesped, aumentos en la zona intracelular de acetil-CoA podria conducir a incrementos en isoprenoide y precursores de isoprenoide. Las modificaciones que incrementarian los niveles de acetil-CoA intracelular incluyen, pero sin limitacion, modificaciones que disminuirian la actividad total de la lactato deshidrogenasa en la celula, modificaciones que disminuirian la actividad total de acetato quinasa en la celula, modificaciones que disminuirian la actividad total de alcohol deshidrogenasa en la celula, modificaciones que interrumpirian el ciclo del acido tricarboxilico, tales como aquellas que disminuirian la actividad total de 2cetoglutarato deshidrogenasa, o modificaciones que interrumpirian la fosforilacion oxidativa, tales como aquellas que disminuirian la actividad total de la (F1F0)H+-ATP sintasa, o combinaciones de las mismas.
Preniltransferasas
[0076] Las preniltransferasas constituyen un amplio grupo de enzimas que catalizan la condensacion consecutiva de IPP que da lugar a la formacion de prenil difosfatos de varias longitudes de cadena. Las preniltransferasas adecuadas incluyen enzimas que catalizan la condensacion de IPP con sustratos de cebadores alilicos para formar compuestos isoprenoides con aproximadamente 5 unidades de isopreno a aproximadamente 6000 unidades de isopreno o mas, por ejemplo, 5 unidades de isopreno a aproximadamente 10 unidades de isopreno, de aproximadamente 10 unidades de isopreno a aproximadamente 15 unidades de isopreno, de aproximadamente 15 unidades de isopreno a aproximadamente 20 unidades de isopreno, de aproximadamente 20 unidades de isopreno a aproximadamente 25 unidades de isopreno, de aproximadamente 25 unidades de isopreno a aproximadamente 30 unidades de isopreno, de aproximadamente 30 unidades de isopreno a aproximadamente 40 unidades de isopreno, de aproximadamente 40 unidades de isopreno a aproximadamente 50 unidades de isopreno, de aproximadamente 50 unidades de isopreno a aproximadamente 100 unidades de isopreno, de aproximadamente 100 unidades de isopreno a aproximadamente 250 unidades de isopreno, de aproximadamente 250 unidades de isopreno a aproximadamente 500 unidades de isopreno, de aproximadamente 500 unidades de isopreno a aproximadamente 1000 unidades de isopreno, de aproximadamente 1000 unidades de isopreno a aproximadamente 2000 unidades de isopreno, de aproximadamente 2000 unidades de isopreno a aproximadamente 3000 unidades de isopreno, de aproximadamente 3000 unidades de isopreno a aproximadamente 4000 unidades de isopreno, de aproximadamente 4000 unidades de isopreno a aproximadamente 5000 unidades de isopreno, o de aproximadamente 5000 unidades de isopreno a aproximadamente 6000 unidades de isopreno o mas.
[0077] Las preniltransferasas adecuadas incluyen, pero sin limitacion, una E-isoprenil difosfato sintasa, incluyendo, pero sin limitacion, geranilgeranil difosfato (GGPP) sintasa, hexaprenil difosfato (HexPP) sintasa, heptaprenil difosfato (HepPP) sintasa, octaprenil (OPP) difosfato sintasa, solanesil difosfato (SPP) sintasa, decaprenil difosfato (DPP) sintasa, chicle sintasa, y gutapercha sintasa; y una Z-isoprenil difosfato sintasa, incluyendo, pero sin limitacion, nonaprenil difosfato (NPP) sintasa, undecaprenil difosfato (UPP) sintasa, deshidrodoliquil difosfato sintasa, eicosaprenil difosfato sintasa, caucho natural sintasa, y otras Z-isoprenil difosfato sintasas.
[0078] Las secuencias de nucleotidos de numerosas preniltransferasas de una variedad de especies son conocidas y se pueden utilizar o modificar para utilizar en la generacion de una celula huesped eucariota modificada geneticamente. Las secuencias de nucleotidos que codifican prenil transferasas son conocidas en la tecnica. Vease, por ejemplo, el ARNm de farnesil pirofosfato sintetasa humano (GenBank Acceso No. J05262; Homo sapiens); gen de farnesil difosfato sintetasa (FPP) (GenBank Acceso No. J05091; Saccharomyces cerevisiae); gen de isopentenil difosfato:dimetilalil difosfato isomerasa (J05090; Saccharomyces cerevisiae); Wang y Ohnuma (2000) Biochim. Biophys. Acta 1529:33-48; patente de Estados Unidos No. 6,645,747; ARNm de farnesil pirofosfato sintetasa 2 (FPS2) / FPP sintetasa 2 / farnesil difosfato sintasa 2 (At4g17190) de Arabidopsis thaliana (GenBank Acceso No. NM 202836); ARNm de geranilgeranil difosfato sintasa (ggpps) de Ginkgo biloba (GenBank Acceso No. AY371321); ARNm de geranilgeranil pirofosfato sintasa (GGPP1) / GGPP sintetasa/ farnesiltranstransferasa (At4g36810) de Arabidopsis thaliana (GenBank Acceso No. NM 119845); gen de Synechococcus elongatus para farnesil, geranilgeranil, geranilfarnesil, hexaprenil, heptaprenil difosfato sintasa (SelF-HepPS) (GenBank Acceso No. AB016095); etc.
[0079] Tambien se describe aqui una celula huesped que esta modificada geneticamente con un acido nucleico que comprende una preniltransferasa. Por ejemplo, una celula huesped se puede modificar geneticamente con un acido nucleico que comprende secuencias de nucleotidos que codifican una preniltransferasa seleccionada entre una GGPP sintasa, una GFPP sintasa, una HexPP sintasa, una HepPP sintasa, una OPP sintasa, una SPP sintasa, una DPP sintasa, una NPP sintasa, y una UPP sintasa.
Terpeno Sintasas
[0080] Las terpeno sintasas catalizan la produccion de compuestos isoprenoides a traves de una de las reacciones mas complejas conocidas en quimica o biologia. En general, las terpeno sintasas son enzimas de tamano moderado que tienen pesos moleculares de aproximadamente 40 a 100 kD. Como enzima, las terpeno sintasas se pueden clasificar por tener velocidades de recambio de bajas a moderadas acopladas con una especificidad de reaccion exquisita y conservacion de la quiralidad. El recambio comprende la union de sustrato a la enzima, el establecimiento de la conformacion del sustrato, la conversion del sustrato en producto y la liberacion del producto. Las reacciones se pueden realizar in vitro en disolventes acuosos, habitualmente requieren iones magnesio como cofactores y los productos resultantes, que a menudo son altamente hidrofobicos, se pueden recuperar mediante la separacion en un disolvente organico. Patente de Estados Unidos No. 6.890.752.
[0081] Tambien se describe aqui una celula huesped modificada geneticamente que es modificada geneticamente adicionalmente con un acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifican una terpeno sintasa. Un acido nucleico con el que una celula huesped es modificada geneticamente puede comprender una secuencia de nucleotidos que codifica una terpeno sintasa que difiere en la secuencia de aminoacidos en uno o mas aminoacidos de una terpeno sintasa natural u otra terpeno sintasa original, por ejemplo, una variante de terpeno sintasa. Una "terpeno sintasa original" es una terpeno sintasa que sirve como punto de referencia para la comparacion. Las variantes de terpeno sintasas incluyen terpeno sintasas consenso y terpeno sintasas hibridas. El acido nucleico sintetico puede comprender una secuencia de nucleotidos que codifica una terpeno sintasa consenso. El acido nucleico puede comprender una secuencia de nucleotidos que codifica una terpeno sintasa hibrida.
[0082] Se puede utilizar un acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica cualquier terpeno sintasa conocida. Entre las terpeno sintasas adecuadas se incluyen, pero sin limitacion, amorfa-4,11dieno sintasa (ADS), beta-cariofileno sintasa, germacreno A sintasa, 8-epicedrol sintasa, valenceno sintasa, (+)delta-cadineno sintasa, germacreno C sintasa, (E)-beta-farneseno sintasa, Casbeno sintasa, vetispiradieno sintasa, 5-epi-aristoloqueno sintasa, Aristolqueno sintasa, beta-cariofileno, alfa-humuleno, (E,E)-alfa-farneseno sintasa, (-)-beta-pineno sintasa, Gamma-terpineno sintasa, limoneno ciclasa, Linalool sintasa, 1,8-cineol sintasa, (+)-sabineno sintasa, E-alfabisaboleno sintasa, (+)-bornil difosfato sintasa, levopimaradieno sintasa, Abietadieno sintasa, isopimaradieno sintasa,(E)-gamma-bisaboleno sintasa, taxadieno sintasa, copalil pirofosfato sintasa, caureno sintasa, longifoleno sintasa, gamma-humuleno sintasa, Delta-selineno sintasa, beta-felandreno sintasa, limoneno sintasa, mirceno sintasa, terpinoleno sintasa, (-)-camfeno sintasa, (+)-3-careno sintasa, sin-copalil difosfato sintasa, alfa-terpineol sintasa, sin-pimara-7,15-dieno sintasa, ent-sandaaracopimaradieno sintasa, estemero-13-eno sintasa, E-beta-ocimeno, S-linalool sintasa, geraniol sintasa, gamma-terpineno sintasa, linalool sintasa, E-beta-ocimeno sintasa, epi-cedrol sintasa, alfa-zingibereno sintasa, guaiadieno sintasa, cascariladieno sintasa, cis-muuroladieno sintasa, afidicolan-16b-ol sintasa, elizabetatrieno sintasa, sandalol sintasa, pachulol sintasa, Zinzanol sintasa, cedrol sintasa, escareol sintasa, copalol sintasa, manool sintasa, y similares.
[0083] Las secuencias de nucleotidos que codifican terpeno sintasas son conocidas en la tecnica y se puede utilizar cualquier secuencia de nucleotidos que codifique terpeno sintasas para modificar geneticamente una celula huesped. Por ejemplo, las siguientes secuencias de nucleotidos que codifican terpeno sintasas, seguidas de sus numeros de acceso a Gen Bank y los organismos en que se identificaron, son conocidas y se pueden utilizar: ARNm de (-)-germacreno D sintasa (AY438099; Populus balsamifera subsp. trichocarpa x Populus deltoids); ARNm de E,E-alfa-farneseno sintasa (AY640154; Cucumis sativus); ARNm de 1,8-cineolo sintasa (AY691947; Arabidopsis thaliana); ARNm de terpeno sintasa 5 (TPS5) (AY518314; Zea mays); ARNm de terpeno sintasa 4 (TPS4) (AY518312; Zea mays); ARNm de mirceno/ocimeno sintasa (TPS10) (At2g24210) (NM 127982; Arabidopsis thaliana); ARNm de geraniol sintasa (GES) (AY362553; Ocimum basilicum); ARNm de pineno sintasa (AY237645; Picea sitchensis); ARNm de mirceno sintasa 1e20 (AY195609; Antirrhinum majus); ARNm de (E)-�-ocimeno sintasa (0e23) (AY195607; Antirrhinum majus); ARNm de E-�-ocimeno sintasa (AY151086; Antirrhinum majus); ARNm de terpeno sintasa (AF497492; Arabidopsis thaliana); ARNm de (-)-canfeno sintasa (AG6.5) (U87910; Abies grandis); gen (por ejemplo, secuencia genomica) de (-)-4S-limoneno sintasa (AF326518; Abies grandis); gen de delta-selineno sintasa (AF326513; Abies grandis); ARNm de amorfa-4,11-dieno sintasa (AJ251751; Artemisia annua); ARNm de E-a,-bisaboleno sintasa (AF006195; Abies grandis); LARN de gammahumuleno sintasa (U92267; Abies grandis); ARNm de o-selineno sintasa (U92266; Abies grandis); ARNm de pineno sintasa (AG3.18) (U87909; Abies grandis); ARNm de mirceno sintasa (AG2.2) (U87908; Abies grandis); etc.
[0084] Las secuencias de aminoacidos de las siguientes terpeno sintasas se encuentra bajo los numeros de acceso del GenBank mostrados en parentesis, junto con el organismo en que se identificaron, despues de cada terpeno sintasa: (-)-germacreno D sintasa (AAR99061; Populus balsamifera subsp. trichocarpa x Populus deltoids); D-cadineno sintasa (P93665; Gossypium hirsutum); 5-epi-aristoloqueno sintasa (Q40577; Nicotiana tabacum); E,E-alfa-farneseno sintasa (AAU05951; Cucumis sativus); 1,8-cineolo sintasa (AAU01970; Arabidopsis thaliana); (R)-limoneno sintasa 1 (Q8L5K3; Citrus limon); sin-copalil difosfato sintasa (AAS98158; Oryza sativa); una taxadieno sintasa (Q9FT37; Taxus chinensis; Q93YA3; Taxus bacca; Q41594; Taxus brevifolia); una Dcadineno sintasa (Q43714; Gossypium arboretum); terpeno sintasa 5 (AAS88575; Zea mays); terpeno sintasa 4 (AAS88573; Zea mays); terpenoide sintasa (AAS79352; Vitis vinifera); geraniol sintasa (AAR11765; Ocimum basilicum); mirceno sintasa le20 (AA041727; Antirrhinum majus); 5-epi-aristoloqueno sintasa 37 (AAP05762; Nicotiana attenuata); (+)-3-careno sintasa (AA073863; Picea abies); (-)-canfeno sintasa (AAB70707; Abies grandis); abietadieno sintasa (AAK83563; Abies grandis); amorfa-4,11-dieno sintasa (CAB94691; Artemisia annua); tricodieno sintasa (AAC49957; Myrothecium roridum); gamma-humuleno sintasa (AAC05728; Abies grandis); o-selineno sintasa (AAC05727; Abies grandis); etc.
Acidos nucleicos, vectores, promotores [0085] Para generar una celula huesped modificada geneticamente, se introducen en una celula huesped de forma estable o transitoria uno o mas acidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleotidos que codifican uno o mas productos genicos utilizando tecnicas establecidas, incluyendo, pero sin limitacion, la electroporacion, precipitacion de fosfato de calcio, transfeccion mediada por DEAE-dextrano, transfeccion mediada por liposoma, choque termico en presencia de acetato de litio, y similares. Para una transformacion estable, un acido nucleico incluira generalmente ademas un marcador seleccionable, por ejemplo, cualquiera de varios marcadores seleccionables conocidos, tales como resistencia a neomicina, resistencia a ampicilina, resistencia a tetraciclina, resistencia a cloramfenicol, resistencia a kanamicina, y similares.
[0086] En muchas realizaciones, el acido nucleico con el que la celula huesped es modificada geneticamente es un vector de expresion que incluye un acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un producto genico, por ejemplo, una enzima del mecanismo del mevalonato, un factor de transcripcion, una preniltransferasa, una terpeno sintasa, etc. Los vectores de expresion adecuados incluyen, pero sin limitacion, vectores de baculovirus, vectores de bacteriofagos, plasmidos, fagemidos, cosmidos, fosmidos, cromosomas artificiales bacterianos, vectores virales (por ejemplo, vectores virales basados en virus de vacuna, poliovirus, adenovirus, virus adeno-asociados, SV40, virus de herpes simplex, y similares), cromosomas artificiales basados en P1, plasmidos de levadura, cromosomas artificiales de levadura, y cualquier otro vector especifico para huespedes especificos de interes (tales como levadura). De este modo, por ejemplo, un acido nucleico que codifica un producto o productos genicos esta incluido en cualquiera de un grupo de vectores de expresion para expresar el producto o productos genicos. Dichos vectores incluyen secuencias de ADN cromosomico, no cromosomico y sintetico.
[0087] Se conocen numerosos vectores de expresion adecuados por los expertos en la materia, y muchos estan disponibles comercialmente. Se proporcionan los siguientes vectores a modo de ejemplo; para celulas huesped eucariotas: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, y pSVLSV40 (Pharmacia). Sin embargo, se puede utilizar cualquier otro plasmido o vector siempre que sea compatible con la celula huesped.
[0088] La secuencia de nucleotidos en el vector de expresion esta unida operativamente a una secuencia o secuencias de control de la expresion apropiadas (promotores) para dirigir la sintesis del producto genico codificado. Dependiendo del sistema huesped/vector utilizado, se pueden utilizar en el vector de expresion cualquiera de un conjunto de elementos de control adecuados de la transcripcion y traduccion, incluyendo promotores constitutivos e inducibles, elementos potenciadores de la transcripcion, terminadores de la transcripcion (vease, por ejemplo, Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544).
[0089] Ejemplos no limitantes de promotores eucariotas adecuados (promotores que son funcionales en celulas eucariotas) incluyen CMV inmediatamente temprano, HSV timidina quinasa, SV40 temprano y tardio, LTR de retrovirus y metalotioneina-I de raton. La seleccion del vector y promotor adecuados se encuentra en la rutina del experto en la materia. El vector de expresion tambien puede contener un sitio de union a ribosoma para el inicio de la traduccion y un terminador de la transcripcion. El vector de expresion tambien puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresion.
[0090] Ademas, los vectores de expresion contendran en muchas realizaciones uno o mas genes marcadores seleccionables para proporcionar una caracteristica fenotipica para la seleccion de celulas huesped transformadas, tales como resistencia a dihidrofolato reductasa o neomicina para un cultivo de celulas eucariotas.
[0091] En general, los vectores de expresion recombinante incluiran origenes de replicacion y marcadores seleccionables que permiten la transformacion de la celula huesped, por ejemplo, el gen TRP1 de S. cerevisiae; y un promotor derivado de un gen altamente expresado para dirigir la transcripcion de la secuencia codificante del producto genico. Dichos promotores pueden derivar de operones que codifican enzimas glicoliticos, tales como 3-fosfoglicerato quinasa (PGK), factor α, fosfatasa acida, o proteinas de choque termico, entre otros.
[0092] En muchas realizaciones, una celula huesped modificada geneticamente se modifica geneticamente con un acido nucleico que incluye una secuencia de nucleotidos que codifica un producto genico, donde la secuencia de nucleotidos que codifica el producto genico esta unido operativamente a un promotor inducible. Los promotores inducibles son conocidos en la tecnica. Los promotores inducibles adecuados incluyen, pero sin limitacion, el pL de bacteriofago λ; Plac; Ptrp; Ptac (promotor hibrido Ptrp-lac); un promotor inducible por isopropil-beta-D-tiogalactopiranosido (IPTG), por ejemplo, un promotor lacZ; un promotor inducible por tetraciclina; un promotor inducible por arabinosa, por ejemplo, PBAD (vease, por ejemplo, Guzman et al. (1995) J. Bacteriol. 177:4121-4130); un promotor inducible por xilosa, por ejemplo, Pxyl (vease, por ejemplo, Kim et al. (1996) Gene 181: 71-76); un promotor GAL1; un promotor de triptofano; un promotor lac; un promotor inducible por alcohol, por ejemplo, un promotor inducible por metanol, un promotor inducible por etanol; un promotor inducible por rafinosa; un promotor inducible por el calor, por ejemplo, un promotor PL lambda inducible por el calor, un promotor controlado por un represor sensble al calor (por ejemplo, vectores de expresion basados en lambda reprimidos por CI857; vease, por ejemplo, Hoffmann et al. (1999) FEMS Microbiol Lett. 177(2):327-34); y similares.
[0093] En muchas realizaciones, una celula huesped modificada geneticamente es modificada geneticamente con un acido nucleico que incluye una secuencia de nucleotidos que codifica un producto genico, donde la secuencia de nucleotidos que codifica el producto genico esta unida operativamente a un promotor constitutivo. En levadura, se pueden utilizar un conjunto de vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles. Para una revision, vease, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, 1988, Ed. Ausubel, et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13; Grant, et al., 1987, Expression and Secretion Vectors for Yeast, en Methods in Enzymology, Eds. Wu & Grossman, 31987, Acad. Press, N.Y., Vol. 153, pp.516-544; Glover, 1986, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C., Ch. 3; Bitter, 1987, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y., Vol. 152, pp. 673-684; y The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1982, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols. I y II. Se puede utilizar un promotor de levadura constitutivo, tal como ADH o LEU2 o un promotor inducible, tal como GAL (Cloning in Yeast, Ch. 3, R. Rothstein in: DNA Cloning Vol. 11, A Practical Approach, Ed. DM Glover, 1986, IRL Press, Wash., D.C.). Alternativamente, se pueden utilizar vectores que inducen la integracion de secuencias de ADN exogenas en el cromosoma de la levadura.
Composiciones que comprenden una celula huesped eucariota modificada geneticamente en cuesti6n
[0094] La presente invencion proporciona adicionalmente composiciones que comprenden una celula huesped eucariota modificada geneticamente en cuestion. Una composicion en cuestion comprende una celula huesped eucariota modificada geneticamente en cuestion; y en algunas realizaciones comprendera uno o mas componentes adicionales, cuyos componentes se seleccionan basandose en parte en el uso pretendido de las celulas huesped eucariotas modificadas geneticamente. Los componentes adecuados incluyen, pero sin limitacion, sales; tampones, estabilizadores; agentes inhibidores de proteasas; compuestos conservantes de la membrana celular y/o de la pared celular, por ejemplo, glicerol, dimetilsulfoxido, etc.; medios nutricionales apropiados para la celula; y similares.
METODOS�PARA �A� PRODUCCION�DE�COMPUESTOS�ISOPRENOIDES
[0095] La presente invencion proporciona metodos de produccion de un compuesto isoprenoide o un precursor de isoprenoide segun la reivindicacion 3. Los metodos implican, en general, cultivar una celula huesped modificada geneticamente en cuestion de la reivindicacion 1 en un medio adecuado.
[0096] Los sesquiterpenos incluyen periplanona B, gingkolide B, amorfadieno, artemisinina, acido artemisinico, valenceno, nootkatona, epi-cedrol, epi-aristoloqueno, farnesol, gosipol, sanonina, periplanona, y forskolina.
[0097] En algunas realizaciones, un metodo en cuestion comprende ademas aislar el compuesto isoprenoide de la celula y/o del medio de cultivo.
[0098] En general, una celula huesped modificada geneticamente en cuestion se cultiva en un medio adecuado (por ejemplo, caldo Luria-Bertoni, opcionalmente suplementado con uno o mas agentes adicionales, tales como un inductor (por ejemplo, donde una o mas secuencias de nucleotidos que codifican un producto genico estan bajo el control de un promotor inducible), etc.). En algunas realizaciones, una celula huesped modificada geneticamente en cuestion se cultiva en un medio adecuado; y el medio de cultivo se recubre con un disolvente organico, por ejemplo, dodecano, que forma una capa organica. El compuesto isoprenoide producido por la celula huesped modificada geneticamente se separa en la fase organica, de la cual se puede purificar. En algunas realizaciones, donde una o mas de las secuencias de nucleotidos que codifican productos genicos estan unidas operativamente a un promotor inducible, se anade un inductor al medio de cultivo; y, despues de un tiempo adecuado, el compuesto isoprenoide se aisla de la fase organica que recubre el medio de cultivo.
[0099] En algunas realizaciones, el compuesto isoprenoide se separara de otros productos que pueden estar presentes en la fase organica. La separacion del compuesto isoprenoide de otros productos que pueden estar presentes en la fase organica se consigue facilmente utilizando, por ejemplo, tecnicas cromatograficas estandar.
[0100] En algunas realizaciones, el compuesto isoprenoide es puro, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 40% puro, por lo menos aproximadamente 50% puro, por lo menos aproximadamente 60% puro, por lo menos aproximadamente 70% puro, por lo menos aproximadamente 80% puro, por lo menos aproximadamente 90% puro, por lo menos aproximadamente 95% puro, por lo menos aproximadamente 98% puro, o mas del 98% puro, donde "puro" en el contexto de un compuesto isoprenoide se refiere a un compuesto isoprenoide que esta libre de otros compuestos isoprenoides, contaminantes, etc.
EJEMPAOS
[0101] Los siguientes ejemplos se presentan con el fin de proporcionar a los expertos en la materia una informacion y descripcion completas de como realizar y utilizar la presente invencion, y no estan destinados a limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invencion ni pretenden representar que los experimentos que siguen son todos o los unicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para asegurar la precision con respecto a los numeros utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc), pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, peso molecular es peso molecular promedio en peso, la temperatura es en grados Celsius, y la
5 presion esta en o cerca de la atmosferica. Se pueden utilizar abreviaturas estandar, por ejemplo, pb, pares de bases; kb, kilobases; pl, picolitros; s o seg, segundos; min, minutos; h, horas; aa, aminoacidos; kb, kilobases; pb, pares de bases; nt, nucleotidos;. i.m., intramuscular(mente); i.p., intraperitoneal(mente); s.c., subcutanea(mente); y similares.
10 Ejemplo 1: Produccion de niveles elevados de un compuesto isoprenoide en una celula de levadura modificada geneticamente
MATERIAAES�M�METODOS
15 [0102]Productos�uummicos. El dodecano y cariofileno se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). El acido 5-fluoortico (5-FOA) se adquirio de Zymo Research (Orange, CA). Las Mezclas de Suplemento Completas para la formulacion de medios Definidos Sinteticos se adquirieron de Qbiogene (Irvine, CA). Todos los otros componentes del medio se adquirieron de Sigma-Aldrich o Becton, Dickinson (Franklin Lakes, NJ).
20 [0103] Cepas y medios. Se utilizaron las cepas de Escherichia coli DH10B y DH5a para la transformacion bacteriana y la amplificacion de plasmidos en la construccion de los plasmidos de expresion utilizados en este estudio. Las cepas se cultivaron a 37'C en medio Luria-Bertani con 100 mg/litro de ampicilina con la excepcion de plasmidos de base po-UB que se cultivaron con 50 mg/litro de ampicilina.
25 [0104] Se utilizo la cepa de Saccharomyces cerevisiae BY4742 (Baker Brachmann et al. (1998) Yeast 14(2):115132), un derivado de S288C, como la cepa original para todas las cepas de levadura. Esta cepa se desarrollo en medio rico en YPD. Burke et al. Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor laboratory course manual. 2000, Plainview, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Las cepas de levadura modificadas se desarrollaron en medio Definido Sintetico (SD) (Burke et al. (2000) supra) con leucina, uracilo, histidina y/o metionina anadidos
30 segun fuera apropiado. Para la induccion de genes expresados a partir del promotor GAL1, se desarrollaron cepas de S. cerevisiae en galactosa al 2% como la unica fuente de carbono.
[0105] Construcci6n de plasmidos. Para crear el plasmido pRS425ADS para la expresion de ADS con el promotor GAL1, se amplifico ADS mediante reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de pADS (Martin 35 et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21(7): p. 796-802) utilizando la pareja de cebadores ADS-SpeI-F/ADS-HindIII-R (Tabla 1). Utilizando estos cebadores, la secuencia de nucleotidos 5'-AAAACA-3' se clono inmediatamente en direccion 5' del codon de inicio de ADS. Esta secuencia consenso se utilizo para la traduccion eficaz (Looman et al. (1993) Nucleic Acids Research. 21(18):4268-71; Yun et al. (1996) Molecular Microbiol. 19(6):1225-39.) de ADS y otros genes inducibles por galactosa utilizados en esta estudio. El producto amplificado se separo con
40 SpeI y HindIII y se clono en pRS425GAL1 diferido con SpeI y HindIII (Mumberg et al. (1995) Gene 156(1):119122).
Tabla 1
Cebador
Secuencia (5' a 3')
ADS-SpeI-F
GGACTAGTAAAACAATGGCCCTGACCGAAGAG (SEQ ID NO:3)
ADS-HindIII-R
CCAAGCTTTCAGATGGACATCGGGTAAAC (SEQ ID NO:4)
HMGR-BamHI-F
CGGGATCCAAAACAATGGCTGCAGACCAATTGGTG (SEQ ID NO:5)
HMGR-SaII-R
GCGTCGACTTAGGATTTAATGCAGGTGACG (SEQ ID NO:6)
pRS42X-PvuIISacII-F
CTGCCGCGGGGCCGCAAATTAAAGCCTTC (SEQ ID NO:7)
pRS42X-PvuIISacII-R
CTCCCGCGGTAGTACGGATTAGAAGCCGC (SEQ ID NO:8)
UPC2-BamHI-F
CGGGATCCAAAACAATGAGCGAAGTCGGTATACAG (SEQ ID NO:9)
UPC2-SalI-R
GCGTCGACTCATAACGAAAAATCAGAGAAATTTG (SEQ ID NO:10)
ECM22-BamHI-R
CGGGATCCAAAACAATGACATCCGATGATGGGAATG (SEQ ID NO:11)
ECM22-SalI-R
GCGTCGACTTACATAAAAGCTGAAAAGTTTGTAG (SEQ ID NO:12)
Los sitios de restriccion estan subrayados y la negrita indica un codon de inicio o parada
45 [0106] Para la expresion de tHMGR, se construyo el plasmido pRS-HMGR. En primer lugar, se introdujeron sitios de restriccion SacII en pRS426GAL1 (Mumberg et al. (1995) Gene 156(1):119-122) en el extremo 5' del promotor GAL1 y el extremo 3' del terminador CYC1. El cassette promotor-sitio de clonacion multiple-terminador de pRS426GAL1 se amplifico por PCR utilizando la pareja de cebadores pRS42X-PvuIISacII-F/pRS42X-PvuIISacII
50 R (Tabla 1). El producto amplificado se clono directamente en pRS426GAL1 digerido con PvuII para construir el vector pRS426-SacII. El dominio catalitico de HMG1 se amplifico por PCR a partir del plasmido pRH127-3 (Donald et al. (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63(9):3341-44) con la pareja de cebadores HMGR-BamHIF/HMGR-SalI-R. El producto amplificado se separo con BamHI y SalI y se clono en pRS426-SacII digerido con BamHI y XhoI.
[0107] El alelo upc2-1 de UPC2 se amplifico por PCR a partir del plasmido pBD33 utilizando la pareja de
5 cebadores UPC2-BamHI-F/UPC2-SalI-R. El producto amplificado se separo con BamHI y SalI se clono en pRS426-SacII digerido con BamHI y XhoI para crear el plasmido pRS-UPC2. Asi mismo, el gen ECM22 que contenia la mutacion del tipo upc2-1 (glicina a aspartato en el residuo 790) se amplifico por PCR a partir del plasmido pBD36 utilizando la pareja de cebadores ECM22-BamHI-F/UPC2-SalI-R. El producto amplificado se separo con BamHI y SalI y se clono en pRS426-SacII digerido con BamHI y XhoI para crear el plasmido pRS
10 ECM22.
[0108] Se construyo un plasmido para la integracion del cassette de expresion tHMGR de pRS-HMGR en el genoma de la levadura utilizando el plasmido po-UB (Lee et al. (1997) Biotechnol Prog. 13(4):368-373). Se separo pRS-HMGR con Sac/I y el fragmento del cassette de expresion se extrajo con gel y se clono en po-UB
15 digerido con Sac/I. Para la integracion de upc2-1, se creo po-UPC2 de una manera identica mediante la digestion de pRS-UPC2 con SacII y trasladando el fragmento apropiado a po-UB.
[0109] Para sustituir el promotor ERG9 por el promotor MET3, se construyo el plasmido pRS-ERG9. El plasmido pRH973 (Gardner et al. (1999) J. Biol. Chem. 274(44):31671-31678) contenia un segmento 5' truncado de ERG9
20 colocado detras del promotor MET3. El pRH973 se separo con ApaI y ClaI y se clono en pRS403 digerido con ApaI y ClaI (Sikorski et al. (1989) Genetics, 122(1):19-27).
[0110] Para la expresion de ERG20, se construyo el plasmido pRS-ERG20. Se digirio en primer lugar el plasmido pRS-SacII con SalI y XhoI que crearon extremos cohesivos compatibles. A continuacion, el plasmido se autoligo,
25 eliminando los sitios SalI y XhoI para crear el plasmido pRS-SacII-DX. Se amplifico ERG20 por PCR a partir del ADN genomico de BY4742 utilizando la pareja de cebadores ERG20-SpeI-F/ERG20-SmaI-R. El producto amplificado se separo con SpeI y SmaI y se clono en pRS-SacII-DX digerido con SpeI y SmaI. Para la integracion del cassette de expresion de ERG20, se separo pRS-ERG20 con Sac/I y el fragmento del cassette de expresion se extrajo con gel y se clono en po-UB digerido con Sac/I.
30 [0111] En la tabla 2 se proporciona una descripcion de los plasmidos utilizados en este estudio.
Tabla 2
Nombre
Gen�eppresado Estado�del�plasmido Marcador
pRS425ADS
ADS Replicon 2-micras LEU2
pRS-HMGR
tHMGR Replicon 2-micras URA3
pRS-UPC2
upc2-1 Replicon 2-micras URA3
pRS-ECM22
ECM22 (mutante upc2-1) Replicon 2-micras URA3
po-HMGR
tHMGR Integracion URA3
po-UPC2
upc2-1 Integracion URA3
pRS-ERG9
PMET3-ERG9 Integracion H/S3
po-ERG20
ERG20 Integracion URA3
35
[0112] En la tabla 3 se proporciona una lista de cepas de levadura utilizadas en este estudio y los genotipos
relevantes de las cepas.
Tabla 3
40
BY4742
MATa his3L1 leu2L0 lys2L0 ura3L0
EPY201
BY4742 pRS425ADS
EPY203
BY4742 pRS425ADS pRS-HMGR
EPY204
BY4742 pRS425ADS pRS-UPC2
EPY205
BY4742 pRS425ADS pRS-ECM22
EPY206
BY4742 pRS425ADS pRS-ERG20
EPY207
BY4742 pRS425ADS tHMGR (ura+)
EPY209
BY4742 pRS425ADS tHMGR upc2-1 (ura+)
EPY212
BY4742 pRS425ADS tHMGR upc2-1 erg9::PMT3-ERG9 (ura+)
EPY214
BY4742 pRS425ADS tHMGR upc2-1 erg9::PMET3-ERG9 ERG20 (ura+)
[0113] Transformaci6n y construcci6n de cepas de levadura. Se utilizo la cepa BY4742 de S. cerevisiae (Carrie Baker Brachmann et al. (1998) "Yeast" 14(2):115-132), un derivado de S288C, como la cepa original para todas las cepas de S. cerevisiae. La transformacion de todas las cepas de S. cerevisiae se realizo mediante el 45 metodo estandar del acetato de litio (Gietz et al. (2002) Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Pt B., Academic Press Inc: San Diego. 87-96). Se cribaron de tres a diez colonias de cada transformacion para la
seleccion del mayor transformante productor de amorfadieno. La cepa EPY201 se construyo mediante la transformacion de la cepa BY4742 con el plasmido pRS425ADS y la seleccion en placas SD-LEU. Se construyeron las cepas EPY203, EPY204, EPY205, y EPY206 mediante la transformacion de la cepa EPY201 con el plasmido pRS-HMGR, pRS-UPC2, pRS-ECM22, y pRS-ERG20, respectivamente. Los transformantes se seleccionaron en placas SDLEU-URA. El plasmido po-HMGR se digirio con XhoI antes de la transformacion del ADN en la cepa EPY201 para la construccion de EPY207. La cepa EPY207 se cultivo y puso en placas SD-LEU que incluian 1 g/L de seleccion 5-FOA de la perdida del marcador URA3. El auxotrofo de uracilo resultante se transformo a continuacion con ADN plasmidico po-UPC2 digerido con XhoI para la construccion de EPY209, que se selecciono en placas SD-LEU-URA. El plasmido pRS-ERG9 se separo con HindII para la integracion de la fusion PMET3-ERG9 en los locus de ERG9 de EPY209 para la construccion de EPY212. Esta cepa se selecciono en placas SD-LEU-URA-HIS-MET. Se cultivo EPY212 y se puso en placas SD-LEU-HIS-MET que contenian 5-FOA para la seleccion de la perdida del marcador URA3. El auxotrofo de uracilo resultante se transformo a continuacion con ADN plasmidico po-ERG20 digerido con XhoI para la construccion de EPY214, que se selecciono en placas SD-LEU-URA-HISMAT.
[0114] Cultivo�de�levadura. Para los experimentos con evolucion en el tiempo para la medicion de la produccion de amorfadieno, se inocularon tubos de cultivo que contenian 5 mL de medio SD (galactosa al 2%) (con omisiones apropiadas de aminoacidos tal como se ha descrito anteriormente) con las cepas de interes. Estas inoculaciones se hicieron crecer a 30'C hasta una densidad optica a 600 nm (DO600) de aproximadamente 1. Se inocularon matraces aireadores de 250 mL que contenian 50 mL de medio SD hasta una DO600 de 0,05 con estos cultivos de siembra. La figura 4 representa cepas desarrolladas en SD-URA-LEU-HIS con metionina al nivel indicada. Los medios para cepas mostradas en la figura 5 contenia SD-URA complementado con metionina hasta una concentracion final de 1 mM. Todos los otros experimentos de produccion utilizaron SD-URA o SD-URA-LEU cuando era apropiado.
[0115] Todos los matraces contenian 5 ml de dodecano. Se tomo una muestra de esta capa de dodecano y se diluyo en acetato de etilo para la determinacion de la produccion de amorfadieno mediante GC-MS.
[0116] Analisis GC-MS de amorfadieno. Se midio la produccion de amorfadieno por las diversas cepas mediante GCMS tal como se ha descrito previamente (Martin et al. (2001) Biotechnology and Bioengineering, 75(5):497-503) mediante rastreo solo para dos iones, el ion molecular (204 mlz) y el ion 189 mlz. Las concentraciones de amorfadieno se convirtieron en equivalentes de cariofileno utilizando una curva estandar de cariofileno y la abundancia relativa de los iones 189 y 204 mlz a sus iones totales.
RESUATADOS
[0117] Para maximizar la produccion de amorfadieno, se realizo una estrategia por etapas con la sucesiva integracion de constructos en el genoma de S. cerevisiae.
[0118] Producci6n de amorfadieno. Se modifico una celula huesped plataforma, S. cerevisiae, para una produccion a nivel elevado de isoprenoides. S. cerevisiae dirige toda su produccion de isoprenoides a traves de isopentenil difosfato (IPP), y la mayoria de esta a traves entonces de farnesil difosfato (FPP). Los niveles de IPP y FPP se incrementaron en la cepa huesped. IPP y FPP se metabolizan hasta una variedad de productos nativos. En lugar de medir los niveles de FPP, se midio el nivel de amorfadieno, un producto directo de FPP que no se metabolizara o degradara durante la evolucion con el tiempo del crecimiento. Se expreso la amorfadieno sintasa (ADS) en S. cerevisiae para la ciclacion enzimatica de FPP en el sesquiterpeno amorfadieno. El amorfadieno tambien se cuantifica facilmente mediante GCMS.
[0119] Se expreso ADS en plasmidos de 2 micras pRS425ADS bajo el control inducible del promotor GAL1. Los cultivos de S. cerevisiae se desarrollaron durante seis dias en galactosa para la expresion de ADS, y se midieron los niveles de amorfadieno cada 24 horas. S. cerevisiae se modifico unicamente mediante la introduccion de pRS425ADS alcanzando una produccion maxima de amorfadieno de 4,6 μg de amorfadieno por ml despues de cuatro dias (figura 3A).
[0120] Los experimentos de control previos que consistian en medio adicionado con amorfadieno puro mostraron la perdida rapida del sesquiterpeno de la fase liquida. Se anadio una fase de dodecano equivalente al 10% del volumen del medio a cada matraz de agitacion para secuestrar el amorfadieno del cultivo. La adicion de esta fase organica asegura una medicion precisa de la cantidad total de amorfadieno producido evitando la perdida en el aire. La volatilizacion de amorfadieno es un problema particular durante las evoluciones extendidas de varios dias como los utilizados en este estudio.
[0121] Sobreeppresi6n de HMG-CoA reductasa. La importancia medica de la biosintesis del colesterol y la facilidad experimental del analisis en S. cerevisiae lo ha convertido en un organismo ideal para el estudio de la regulacion del mecanismo del mevalonato durante las ultimas decadas (Szkopinska et al. (2000) Biochemical and Biophysical Research Communications, 267 (1):473-477; Dimster-Denk et al. (1999) J. Lipid Res., 40(5):850860).
[0122] Estos estudios han elucidado un sistema complejo de regulacion, con 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A reductasa (HNIGR) como el principal punto de control regulador del mecanismo. Dos isozimas de HMGR, Hmg1p y Hmg2p, estan presentes en la levadura, siendo Hmg1p la mas estable de las dos (Hampton et al. (1996) Trends in Biochemical Sciences, 21(4):140-145). Hmg1p es una proteina integral unida a membrana que contiene una region N-terminal responsable del anclaje de la proteina a la membrana del ER (Liscum et al. (1985) J. Biol. Chem. 260(1):522-530). Para la expresion de una forma soluble de la enzima (Donald et al. (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63(9):3341-44) se extrajo el extremo N-terminal unido a membrana de Hmg1p y se expreo solo el dominio catalitico. En nuestro estudio, esta forma truncada de HMGR (tHMGR) en un plasmido de 2 micras se expreso bajo el control del promotor GAL1. Cuando se expreso conjuntamente con ADS, S. cerevisiae alcanzo una produccion maxima de 11,2 μg de amorfadieno por ml despues de cuatro dias (figura 3A.).
[0123] Sobreeppresi6n de factores de transcripci6n implicados en esterol. En otra estrategia para incrementar el amorfadieno, se utilizaron dos factores de transcripcion de S. cerevisiae identificados previamente por su importancia en la regulacion de la biosintesis de esterol. Los mutantes upc2-1 de S. cerevisiae se identificaron originalmente por su capacidad unica de captar esteroles bajo condiciones aerobicas (Lewis et al. (1988) Yeast, 4(2):93-106). La caracterizacion posterior mostro que estos mutantes habian incrementado las capacidades de sintesis del esterol (Lewis et al. (1988) Yeast, 4(2):93-106). La mutacion responsable para estas caracteristicas es una unica transicion de guanina a adenina en el gen UPC2; esta mutacion puntual da lugar a un cambio de residuos de glicina a aspartato en el aminoacido 888 proximo al extremo carboxilo (Crowley et al. (1998) J. Bacteriol., 180(16):4177-83). Se identifico posteriormente un homologo a este gen, ECM22, con una identidad en la secuencia de aminoacidos del 45% (Shianna et al. (2001) J. Bacteriol., 183(3):830-834). Se conservan completamente 36 aminoacidos entre UPC2 y ECM22 en el locus de la mutacion puntual upc2-1 (Shianna et al. (2001) J. Bacteriol., 183(3):830-834). La mutacion puntual upc2-1 se introdujo en el alelo ECM22 +de tipo salvaje dando lugar a una cepa con un fenotipo similar al del mutante upc2-1 (Shianna et al. (2001) J. Bacteriol., 183(3):830-834).
[0124] Vik y Rine identificaron ERG2 y ERG3 como dianas para la regulacion genica por Ecm22p y Upc2p. Se identifico un elemento regulador de esterol de 7 pares de bases como la localizacion de union necesaria para estos factores de transcripcion. Este elemento de secuencia de 7 pares de bases se halla en los promotores de muchos otros genes del mecanismo del esterol, incluyendo ERGB, ERG12, y ERG13 (Vik et al. (2001) Mol. Cell. Biol., 21(19):6395-6405.). Los productos enzimaticos para cada uno de estos tres genes estan implicados en la sintesis de isoprenoides cadena arriba de FPP (vease la figura 1).
[0125] Se realizo la hipotesis de que la coexpresion de los alelos mutantes para UPC2 y ECM22 con ADS incrementaria la produccion de amorfadieno al incrementar el flujo metabolico a traves del mecanismo del mevalonato. Los alelos mutantes upc2-1 de UPC2 y EMC22 se expresaron cada uno bajo el control del promotor GAL1 en un plasmido de 2 micras en una cepa que ya albergaba pRS425ADS. La produccion absoluta de amorfadieno en los cultivos se incremento unicamente de forma minima para la expresion de UPC2 y EMC22, en parte debido a la disminucion de las densidades celulares. Sin embargo, la produccion normalizada para la densidad celular aumento un 76% y un 53% para la expresion de UPC2 y EMC22, respectivamente (figura 3B).
[0126] Este incremento relativamente pequeno en la produccion de amorfadieno en comparacion con la sobreexpresion de tHMGR apoya el hecho de que la actividad de HMGR es el principal cuello de botella limitante del mecanismo del mevalonato. Incluso es improbable que una expresion a nivel elevado de ERG 8, ERG12, y ERG13 aumente considerablemente el flujo a traves del mecanismo si la HMGR permanece en un nivel de expresion basal. La menor densidad celular observada para la sobreexpresion de UPC2 y ECM22 es improbable que sea debida al incremento del flujo a traves del mecanismo del mevalonato hacia FPP. En cambio, es probable que este causada por un cambio desfavorable en la regulacion transcripcional para otro u otros genes controlados por UPC2 y ECM22.
[0127] Coeppresi6n de tHMGR y upc2-1. La sobreexpresion de tHMGR y upc2-1 aumento cada uno el rendimiento final de amorfadieno en los cultivos celulares. Para analizar la posibilidad de un efecto sinergico de la sobreexpresion de estos genes juntos, se integraron los cassettes de expresion de manera secuencial en el genoma de S. cerevisiae. Se utilizo el plasmido po-UB (Lee et al. (1997) Biotechnol Prog., 13(4):368-373) para la construccion de los plasmidos de integracion. Este plasmido contiene un Cassette Blaster URA3 reutilizable que permite reciclar el marcador URA3. Adicionalmente, se integra en una secuencia o (hallada en las repeticiones largas terminales de los sitios de Tytransposon), de la cual existen aproximadamente 425 dispersadas a lo largo del genoma (Dujon (1996) Trends in Genetics, 12(7):263-270).
[0128] Se integro tHMGR en el cromosoma de una cepa que albergaba pRS425ADS utilizando po-HMGR. El nivel de produccion de amorfadieno de 13,8 μg de amorfadieno por ml era comparable en esta cepa con la cepa EP203 que contenia tHMGR en un plasmido de copia elevada (figura 5). Despues de reciclar el marcador URA3 mediante el emplacado en 5-FOA, se integro upc2-1 en el cromosoma utilizando el plasmido po-UPC2. Se combinaron los efectos de la sobreexpresion de tHMGR y upc2-1 para aumentar la produccion de amorfadieno hasta 16,2 μg de amorfadieno por ml (figura 5). Aunque la expresion de upc2-1 en combinacion con tHMGR aumento la produccion absoluta de amorfadieno en un 17%, este incremento solo es comparable con el observado cuando upc2-1 se expresa con ADS solo. Con la eliminacion del cuello de botella de HMGR, se espero un impacto mas significativo de la expresion de upc2-1. Los aumentos potenciales en la produccion de amorfadieno se podrian evitar debido al direccionamiento de FPP a otros metabolitos.
[0129] Regulaci6n por descenso de escualeno sintasa. Los incrementos observados en la produccion de amorfadieno sugirieron un aumento del grupo de precursores de FPP. FPP es fundamental en la sintesis de un conjunto de compuestos de S. cerevisiae incluyendo esteroles, dolicoles y poliprenoles y proteinas preniladas. Aunque un incremento del flujo a traves del mecanismo del mevalonato, conducia a una mayor produccion de amorfadieno, un grupo de otras enzimas tambien competian por incremento del grupo de FPP, de manera mas destacada la escualeno sintasa codificada por ERG9. La sintesis de escualeno es el punto de ramificacion de la FPP que conduce a ergosterol. En una cepa que expresaba el dominio catalitico de HMGR y que contenia una delecion de ERG9, se observo que se acumulaba FPP (Song (2003) Analytical Biochemistry, 317(2):180-185). Con el objetivo de direccionar el FPP fuera de la produccion de esterol y hacia la produccion de amorfadieno, la reduccion en la actividad de escualeno sintasa seria util. Sin embargo, una delecion de ERG9 es letal sin la suplementacion exogena de esteroles.
[0130] Utilizando una estrategia alternativa, se regulo ERG9 por descenso de manera transcripcional mediante la sustitucion de su promotor nativo por un promotor reprimible de metionina, PMET3 (Cherest et al. (1985) Gene, 34(2-3):269-281). Gardner et al. utilizaron previamente dicho constructo de fusion PMET3-ERG9 para el estudio de las senales de degradacion de HMGR (Gardner et a.. (1999) J. Biol. Chem. 274(44):31671-31678; Gardner et al. (2001) J. Biol. Chem., 276(12):8681-8694). Se construyo el plasmido pRS-ERG9 para utilizar la misma estrategia que Gardner en la sustitucion del promotor nativo ERG9 por el promotor MET3. La utilidad de la fusion PMET3-ERG9 se destaca por el estrecho control regulador entre 0 y 100 μM de concentraciones extracelulares de metionina (Mao et al. (2002) Current Microbiology, 45(1):37-40). En presencia de concentraciones extracelulares elevadas de metionina, la expresion a partir del promotor MET3 es muy baja. Despues de la integracion de pRS-ERG9 en el locus de ERG9, se pudo ajustar la expresion de escualeno sintasa en base a la suplementacion de metionina al medio.
[0131] Se integro pRS-ERG9 en la cepa EPY209, y se midio la produccion de amorfadieno con un intervalo de 0 a 1 mM en el medio. Se muestran los puntos de tiempo de 64 y 87 horas despues de la inoculacion (figura 4). Los datos sugieren que la expresion minima de ERG9 (concentraciones de metionina por encima de 0,5 mM) maximiza la produccion de amorfadieno. A medida que se incrementa la densidad celular en los cultivos de S. cerevisiae y se metabolizan los nutrientes en el medio, la concentracion de metionina probablemente desciende, explicando el porque los cultivos proporcionados con metionina 0,1 mM en medio presentan rendimientos menores de amorfadieno. Se selecciono metionina 1 mM para futuros experimentos para asegurar concentraciones extracelulares elevadas a lo largo de las evoluciones extendidas con el tiempo.
[0132] Se desarrollo en cultivo la cepa EPU212 que contenia una copia integrada de tHMGR y upc2-1, asi como el alelo reprimible de metionina de ERG9, y se midio la produccion de amorfadieno durante seis dias (figura 5). La limitacion del FPP incorporado en escualeno tenia un gran impacto en la produccion de amorfadieno, incrementandolo cuatro veces hasta 61 μg de amorfadieno por ml sobre la cepa EPY209 que contenia el alelo ERG9 de tipo salvaje. Aunque limitada en su capacidad de producir ergosterol, la EPY212 aun crecia hasta una DO final de ∼75% de la de EPY209.
[0133] Sobreeppresi6n de FPP Sintasa. La FPP Sintasa (FPPS), codificada por ERG20, fue reconocida como la proxima diana para la sobreexpresion con la esperanza de incrementar mas las producciones de sesquiterpenos. Un incremento de seis veces en la actividad de FPPS se ha correlacionado con un incremento del 80% y el 32% en dolicol y ergosterol, respectivamente (Szkopinska et al. (2000) Biochemical and Biophysical Research Communications, 267(1):473-477). De forma similar a los estudios que sobreexpresan HMGR y upc21, se clono primero ERG20 detras del promotor GAL1 en un plasmido de copias elevadas para crear pRS-ERG20. La coexpresion de ERG20 en este plasmido con pRS425ADS en realidad disminuyo la productividad absoluta de amorfadieno en un 60%. Es posible que un incremento en la actividad de FPPS incremente solo el contenido de otros productos derivados de FPP, tales como ergosterol. Otra posibilidad es que la sobreexpresion de FPPS incremente la concentracion intracelular de FPP, la principal senal para la degradacion de HMGR (Gardner et al. (1999) J. Biol. Chem. 274(44):31671-31678). Sin la sobreexpresion de una forma no regulada de la reductasa, las concentraciones de FPP incrementadas podrian actuar para limitar el flujo a traves del mecanismo del mevalonato y disminuir la produccion de amorfadieno.
[0134] A continuacion, se construyo po-ERG20 para la integracion y expresion de ERG20 en nuestro mayor productor de amorfadieno. Se reciclo el marcador URA3 y se integro po-ERG20 en el cromosoma para crear la cepa EPY214. Esta cepa que sobreexpresaba FPPS, incremento adicionalmente la produccion de amorfadieno hasta 73 μg de amorfadieno por ml (figura 5). Anteriormente se habia observado un descenso del 60% en la produccion de amorfadieno en la cepa EPY206 que sobreexpresaba ERG20 con ADS. Sin embargo, ahora en una cepa que expresaba tHMGR y upc2-1 y con una escualeno sintasa regulada, la produccion de amorfadieno se incremento en un 20% con la sobreexpresion de ERG20.
[0135] En las cepas EPY206 y EPY214 que expresaban cada una ERG20, se observo una disminucion de la densidad celular. Este descenso en el crecimiento celular se podria explicar por la toxicidad causada directamente por ERG20p. Alternativamente, pudo surgir un efecto a partir de una acumulacion o agotamiento de un intermedio del mecanismo debido al flujo modificado a traves de la FPP sintasa.
LISTADO DE SECUENCIAS
[0136] �110� THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA �120� CELULAS HUESPED MODIFICADAS GENETICAMENTE Y USO DE LAS MISMAS PARA PRODUCIR COMPUESTOS ISOPRENOIDES �130� AHB/FP6424808 �140� 05775484.82005-07-21 �150� PCT/US2005/026190 �151� 2005-07-21 �150� 60/592,009 �151� 2004-07-27 �160� 12 �170� FastSEQ for Windows Version 4.0 �210� 1 �211� 1509 �212� ADN �213� Saccharomyces cerevisiae �220� �221� CDS �222� (1)...(1509) �400� 1
�210� 2 �211� 502 �212� PRT �213� Saccharomyces cerevisiae �400� 2
�210� 3 �211� 32 �212� ADN �213� Secuencia artificial �220� �223� cebador �400� 3 ggactagtaa aacaatggcc ctgaccgaag ag 32 �210� 4 �211� 29 �212� ADN �213� Secuencia artificial �220� �223� cebador �400� 4 ccaagctttc agatggacat cgggtaaac 29 �210� 5 �211� 35 �212� ADN �213� Secuencia artificial �220� �223� cebador �400� 5 cgggatccaa aacaatggct gcagaccaat tggtg 35 �210� 6 �211� 30 �212� ADN �213� Secuencia artificial �220� �223� cebador �400� 6 gcgtcgactt aggatttaat gcaggtgacg 30 �210� 7 �211� 29 �212� ADN �213� Secuencia artificial �220� �223� cebador �400� 7 ctgccgcggg gccgcaaatt aaagccttc 29 �210� 8 �211� 29 �212� ADN �213� Secuencia artificial �220� �223� cebador �400� 8 ctgccgcggt agtacggatt agaagccgc 29 �210� 9 �211� 35 �212� ADN �213� Secuencia artificial �220� �223� cebador �400� 9 cgggatccaa aacaatgagc gaagtcggta tacag 35 �210� 10 �211� 34 �212� ADN �213� Secuencia artificial �220� �223� cebador �400� 10 gcgtcgactc ataacgaaaa atcagagaaa tttg 34 �210� 11 �211� 36
�212� ADN �213� Secuencia artificial �220� �223� cebador 5 �400� 11 cgggatccaa aacaatgaca tccgatgatg ggaatg 36 �210� 12 �211� 34 �212� ADN 10 �213� Secuencia artificial �220� �223� cebador �400� 12 gcgtcgactt acataaaagc tgaaaagttt gtag 34 15

Claims (3)

  1. REIvINDICACIONES
    1.
    Celula huesped de Saccharomyces cerevisiae que produce un compuesto precursor de isoprenoide o compuesto isoprenoide a traves del mecanismo del mevalonato, en la que dicha celula es modificada geneticamente para comprender: a) un acido nucleico heterologo integrado en el cromosoma de la celula huesped que codifica una 3-hidroxi-3metilglutaril coenzima-A reductasa (HMGR) truncada que carece de un dominio que comprende la membrana y que mantiene su dominio catalitico C-terminal; b) una farnesil difosfato sintasa (FPPS) heterologa integrada en el cromosoma de la celula huesped para incrementar el nivel de actividad de dicha FPPS; y c) un acido nucleico heterologo integrado en el cromosoma de la celula huesped para disminuir el nivel de actividad de la escualeno sintasa; en la que la celula huesped comprende ademas una sesquiterpeno sintasa heterologa y es capaz de producir un isoprenoide que deriva de la accion de dicha sesquiterpeno sintasa, y en la que las modificaciones geneticas proporcionan la produccion del isoprenoide derivado de la accion de dicha sesquiterpeno sintasa a un nivel que es por lo menos el 50% superior al nivel del isoprenoide en una celula de control que no comprende las modificaciones geneticas.
  2. 2.
    Celula huesped segun la reivindicacion 1, en la que la terpeno sintasa se selecciona entre amorfa-4,11-dieno sintasa; betacariofileno sintasa; germacreno A sintasa; 8-epicedrol sintasa; valenceno sintasa; (+)-delta-cadineno sintasa; germacreno C sintasa; (E) beta-farneseno sintasa; vetispiradieno sintasa; 5-epiaristoloqueno sintasa; aristolqueno sintasa; alfa-humuleno sintasa; (E,E)-alfa-farneseno sintasa; E-alfa-bisaboleno sintasa; (E)-gammabisaboleno sintasa; longifoleno sintasa, gamma-humuleno sintasa, Delta-selineno sintasa, epi-cedrol sintasa; alfa-zingibereno sintasa; guaiadieno sintasa; cascariladieno sintasa; cis-muuroladieno sintasa; pachulol sintasa.
  3. 3.
    Metodo de produccion de un compuesto precursor de isoprenoide o compuesto isoprenoide, cuyo metodo comprende cultivar una celula huesped, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y aislar el compuesto precursor de isoprenoide o compuesto isoprenoide del medio de cultivo.
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