ES2386729T3 - Detección de metilación genica para el diagnostico de un trastorno proliferativo - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de diagnóstico de la presencia o predecir el curso de un trastorno proliferativo, que comprendedeterminar el estado de metilación de un marcador para GSTP1 en una muestra biológica usando una sonda de ácidonucleico y cebadores oligonucleotídicos, en el que la sonda oligonucleotídica está codificada por la SEC ID Nº 25 y loscebadores oligonucleotídicos están codificados por las SEC ID Nº 23 y 24.
Description
Detección de metilación génica para el diagnóstico de un trastorno proliferativo
Antecedentes de la invención
La presente invención se refiere a la interrogación de genes metilados en ensayos diagnósticos y pronósticos para trastornos proliferativos celulares tales como el cáncer. Los genes implicados incluyen el gen de la glutatión-Stransferasa (GSTP1) o porciones del mismo.
En los eucariotas de orden superior el ADN está metilado únicamente en las citosinas ubicadas en 5’ con respecto a guanosina en el dinucleótido CpG. Esta modificación tiene importantes efectos reguladores sobre la expresión génica, especialmente cuando implica áreas ricas en CpG (islas de CpG) ubicadas en las regiones promotoras de muchos genes. La metilación aberrante de islas de CpG normalmente no metiladas se ha descrito como un suceso frecuente en células inmortalizadas y transformadas, y se ha asociado con la inactivación de la transcripción de ciertos genes supresores de tumores o genes de otro modo asociados con la mejora de ciertos cánceres humanos
La glutatión-S-transferasa (GST) cataliza las reacciones de destoxificación intracelulares, incluida la inactivación de carcinógenos electrofílicos, mediante conjugación de electrófilos químicamente reactivos al glutatión (C. B. Pickett, y col., Annu. Rev. Biochem., 58:743, 1989; B. Coles, y col., CRC Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 25:47, 1990; T. H. Rushmore, y col., J. Biol. Chem. 268:11475, 1993). Las GST humanas codificadas por varios genes diferentes a loci diferentes se han clasificado en cuatro familias denominadas alfa, mu, pi y teta (B. Mannervik, y col., Biochem. J., 282:305, 1992). Muchos cánceres humanos, tales como los cánceres de próstata y hepáticos, exhiben disminución de la expresión de GSTP1 respecto a sus tejidos de origen.
Los documentos WO2004087957 y WO2004067777 divulgan procedimientos para predecir la evolución de un trastorno proliferativo en el que el estado de metilación del marcador GSTP1 se determina usando un reactivo que consiste en la secuencia gccccaatactaaatcacgacg. El documento WO2004113567 se refiere a procedimientos en los que parte de la GSTpI se amplifica para evaluar el estado de metilación.
En el caso del cáncer de próstata, en concreto, se ha demostrado que el diseño de cebadores y sondas para PCR específicos de metilación ("MSP") que discriminen entre la hiperplasia prostática benigna y el adenocarcinoma prostático es complejo. Los mejores conjuntos de cebador/sonda publicados normalmente muestran una sensibilidad de hasta aproximadamente un 75 % si se ajustan los ensayos a una especificidad del 100 % y una especificidad menor del 60 % si se ajustan los ensayos a una sensibilidad del 100 %. Se podría obtener un ensayo más sólido y consistente con nuevas combinaciones de cebador y sonda. La presente invención cumple dicha necesidad.
Sumario de la invención
En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento de diagnóstico de la presencia o predecir el curso de un trastorno proliferativo, que comprende determinar el estado de metilación de un marcador para GSTP1 en una muestra biológica con el uso de una sonda de ácido nucleico y cebadores codificados por las SEC ID Nº 23-25.
En un aspecto de la divulgación, un procedimiento para detectar un trastorno de proliferación celular en tejido prostático u otra muestra de un sujeto implica poner en contacto un componente celular con un reactivo útil en la amplificación y detección de regiones hipermetiladas de ciertos genes.
En otro aspecto de la divulgación, al menos uno de estos genes hipermetilados es GSTP1 I, que se puede analizar en combinación con uno o más de otros genes.
En otro aspecto de la divulgación se obtiene una muestra de ácido nucleico que se sospecha que tiene secuencias diana metiladas de una muestra biológica, tratar la muestra co un reactivo que puede cebar una porción de la diana, amplificar el ácido nucleico diana y comparar el grado de metilación de la muestra amplificada con el de una muestra normal conocida. En otro aspecto más, una secuencia que no es probable que esté metilada se amplifica y detecta por comparación con la secuencia metilada amplificada.
En otro aspecto más, la invención proporciona un procedimiento para detectar un trastorno proliferativo celular. Esto se realiza amplificando un gen cuyo estado de metilación es indicativo del trastorno proliferativo celular. El procedimiento de detección puede incluir poner en contacto una muestra o fluido biológico que contiene ácido nucleico con un agente que modifica la citosina no metilada, amplificar el ácido nucleico en la muestra con cebadores oligonucleotídicos o cebar las secuencias que distinguen entre ácido nucleico modificado metilado y no metilado, y detectar el ácido nucleico metilado en base a la presencia o ausencia de productos de amplificación producidos durante la amplificación.
Los procedimientos de la invención abarcan determinar una proporción de metilación en una muestra. La proporción de metilación es la proporción entre el nivel de metilación de un Marcador (o una región de un Marcador) que está hipermetilado en un estado de enfermedad con respecto al nivel de metilación de un Marcador que no está hipermetilado en la misma condición (o respecto a una región del mismo Marcador que no está hipermetilada en la misma condición). Cuando se determina la proporción de metilación mediante comparación de la metilación de un Marcador que está hipermetilado en un estado de enfermedad con otro marcador que no lo está, el segundo Marcador se puede denominar Marcador de referencia.
En otro aspecto de la divulgación, las proporciones de metilación se determinan mediante PCR cuantitativa en tiempo real.
En otro aspecto de la divulgación se proporcionan moléculas indicadoras para ensayos diagnósticos y/o pronósticos.
En otra realización, la divulgación proporciona un kit útil para realiza un ensayo de acuerdo con la reivindicación 1. El kit incluye uno o más contenedores; un primer contenedor que contiene un reactivo que modifica la citosina no metilada y un segundo contenedor que contiene un reactivo que ceba la amplificación de un ácido nucleico con contienen CpG, en el que el reactivo distingue entre ácido nucleico modificado metilado y no metilado.
En otro aspecto más, la secuencia de ácido nucleico que se detecta en los procedimientos de la invención o los kits para practicarlos incluye un promotor o una porción de un promotor.
En otro aspecto más de la invención, procedimientos y kits usados para detectar porciones metiladas de ciertos genes de acuerdo con las reivindicaciones también incluyen etapas y/o componentes para analizar la presencia de otro ácido nucleico. EL grado hasta el cual el gen metilado intencionadamente se ve afectado por el tratamiento (p. ej., amplificación) se compara con el de otro ácido nucleico para determinar la extensión de metilación del Marcador.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 es un gráfico de los resultados de ensayos MSPCR usando sondas y cebadores de la técnica anterior.
La Fig. 2 es un gráfico de los resultados de ensayos MSPCR usando sondas y cebadores de hidrólisis de acuerdo con la invención.
Descripción detallada de la invención
La hipermetilación de ciertos genes se correlaciona con la carcinogénesis prostática. Las secuencias de ácido nucleico que comprenden dichos genes o porciones de dichos genes se denominan Marcadores en esta memoria. Los Marcadores incluyen ácidos nucleicos que comprenden los genes siguientes o porciones de dichos genes: GSTP1 (SEC ID Nº 54), RARB2 (SEC ID Nº 57), RASSF1A (SEC ID Nº 64), TIMP3 (SEC ID Nº 58), APC (Promotor= SEC ID Nº 59, Gene= SEC ID Nº 60), beta-Actina (SEC ID Nº 55 y 56) , PTGS2 (Promotor SEC ID Nº 61, Gen= SEC ID Nº 62) y 14-3-3 sigma (SEC ID Nº 63).
Los ensayos para detectar dicha hipermetilación incluyen técnicas tales como MSP y análisis con endonucleasas de restricción. La región promotora es una diana particularmente importante para detectar dicho análisis de hipermetilación. El análisis de la secuencia de la región promotora de GSTP I muestra que casi el 72 % de los nucleótidos son CG y aproximadamente el 10 % son dinucleótidos de CpG.
La divulgación proporciona un procedimiento para determinar el estado de metilación de ciertas regiones de los Marcadores en un tejido u otra muestra biológica de un sujeto en el que el ADN asociado con la enfermedad proliferativa se amplifica y detecta. Dado que un nivel menor de la proteína codificada por el Marcador (es decir, menos transcripción) a menudo es el resultado de la hipermetilación de una región concreta, tal como el promotor, es deseable determinar si dichas regiones están hipermetiladas. Esto se puede demostrar en el caso del gen de GSTP1. Las regiones hipermetiladas son aquéllas que están metiladas en un grado estadísticamente significativo mayor en muestras de tejido enfermo en comparación con el tejido normal.
Para los fines de la invención, una sonda de ácido nucleico o indicador específico para ciertas regiones Marcador se usa para detectar la presencia de regiones metiladas del gen del Marcador en fluidos o tejidos biológicos. Los cebadores oligonucleotídicos basados en ciertas porciones de la secuencia del Marcador son particularmente útiles para amplificar ADN mediante técnicas como la PCR. Se puede usar cualquier muestra que contenga una cantidad detectable del polinucleótido relevante. Una muestra preferida de la presente invención es tejido de origen urogenital, específicamente tejido de próstata. Preferentemente, la muestra contiene células epiteliales.
Algunos de los cebadores/sondas o reactivos indicadores de la divulgación se usan para detectar metilación del las secuencias de control de la expresión. Estas son secuencias de ácido nucleico que regulan la transcripción y, en algunos casos, la traducción de la secuencia de ácido nucleico. Por tanto, las secuencias de control de la expresión 3 5
pueden incluir secuencias implicadas con promotores, potenciadores, terminadores de la transcripción, codones de iniciación (es decir, ATG), señales de corte y empalme para intrones, mantenimiento del marco de lectura correcto del gen que permita la traducción adecuada del ARNm y codones de terminación.
El promotor de GSTP1 es un ejemplo de una secuencia de control de la expresión de un Marcador útil. Es una secuencia polinucleotídica que puede dirigir la transcripción del gen para producir una proteína de glutatión-Stransferasa. La región promotora se localiza cadena arriba, o 5’, del gen estructural. Puede incluir elementos que son suficientes para hacer controlable la expresión génica dependiente de promotor específica del tipo de célula, específica del tejido, o inducible por señales o agentes externos; dichos electos se pueden localizar en las regiones 5’ o 3’ de la secuencia polinucleotídica.
Un procedimiento de la divulgación incluye poner en contacto una célula diana que contiene un Marcador con un reactivo que se une al ácido nucleico. El componente de la célula diana es un ácido nucleico tal como ADN o ARN. Los reactivos pueden incluir sondas y cebadores tales como cebadores para PCR o MSP u otras moléculas configuradas para amplificar y detectar la secuencia diana. Por ejemplo, los reactivos pueden incluir secuencias de cebado combinadas o unidas a sus propios segmentos indicadores, tales como los denominados reactivos Escorpión o indicadores Escorpión y se describen en las patentes de EE.UU. 6.326.145 y 6.270.967 de Whitcombe y col. (incorporados en el presente documento por referencia en su totalidad). Aunque No es lo mismo, los términos “cebadores” y “secuencias de cebado” se pueden usar en la presente memoria para hacer referencia a moléculas o porciones de moléculas que ceban la amplificación de secuencias de ácido nucleico.
Un procedimiento sensible de detección de patrones de metilación implica combinar el uso de enzimas sensibles a la metilación y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Tras la digestión de ADN con la enzima, la PCR amplificará a partir de los cebadores que flanquean el sitio de restricción solo si la escisión del ADN se evitó mediante metilación. Ejemplos de regiones diana para los que están diseñados los cebadores de PCR de la invención incluyen cebadores que flanquean la región que se encuentra aproximadamente entre -71 y +59 pb de acuerdo con el número de posición genómica M24485 (Genbank) desde el sitio de inicio de la transcripción GSTP1.
El procedimiento de la divulgación puede también incluir poner en contacto una muestra que contiene ácido nucleico con un agente que modifica la citosina no metilada; amplificar el ácido nucleico que contiene CpG en la muestra por medio de cebadores oligonucleotídicos específicos de CpG; y detectar el ácido nucleico metilado. La modificación preferida es la conversión de citosinas no metiladas en otro nucleótido que distinguirá la citosina no metilada de la metilada. Preferentemente, el agente modifica la citosina no metilada en uracilo y es bisulfito sódico, no obstante, también se pueden usar otros agentes que modifican la citosina no metilada pero no la citosina metilada. La modificación con bisulfito sódico (NaHSO3) es la más preferida y reacciona con facilidad con el doble enlace en 5,6 de la citosina, pero mal con la citosina metilada. La citosina reacciona con el ion bisulfito para formar una reacción de citosina sulfonada intermedia susceptible de desaminación, lo que da lugar a un uracilo sulfonado. El grupo sulfota se puede eliminar en condiciones alcalinas, lo que da como resultado la formación de uracilo. El uracilo es reconocido como una timina por la Taq polimerasa y, por tanto, tras PCR, el producto resultante contiene citosina solo en la posición en la que hay 5-metilcitosina en el molde inicial. Los indicadores y reactivos Escorpión y otros sistemas de detección distinguen de forma similar las especies modificadas de las no modificadas tratadas de este modo.
Los cebadores usados en la invención para la amplificación de un ácido nucleico que contiene CpG en la muestra, tras codificación (p. ej., con bisulfito) distinguen específicamente entre ADN no tratado y ADN metilado y no metilado. En la PCR específica de metilación (MSPCR), los cebadores o secuencias de cebado para el ADN no metilado tienen, preferentemente, una T en el par CG en 3’ para distinguirlo del C conservado en el ADN metilado y el complementario está diseñado para el cebador antisentido. Los cebadores o secuencias de cebado de MSP para el ADN no metilado normalmente contienen relativamente pocas C o G en la secuencia, ya que las C estarán ausentes en el cebador sentido y las G están ausentes en el cebador antisentido (C se modifica a U (uracilo), que se amplifica como T (timidina) en el producto de amplificación).
Los cebadores de la invención son oligonucleótidos de suficiente longitud y secuencia adecuada para proporcionar un inicio específico de la polimerización sobre un número significativo de ácidos nucleicos en el locus polimórfico. Cuando se exponen a las sondas o indicadores de la invención, las secuencias que son amplificadas por los cebadores de la invención revelan el estado de metilación y, por tanto, información diagnóstica. Son más sensibles y específicos que los de la técnica anterior.
Los cebadores de la invención son, más preferentemente, ocho o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos capaces de iniciar la síntesis de un producto de extensión de un cebador, que es sustancialmente complementario a una hebra del locus polimórfico. Las condiciones ambientales que conducen a la síntesis incluyen la presencia de nucleósido trifosfatos y un agente para la polimerización, tal como ADN polimerasa, y una temperatura y un pH adecuados. El segmento de cebado del cebador o secuencia de cebado es, preferentemente, monocatenario para una máxima eficiencia en la amplificación, pero puede ser bicatenario. Si es bicatenario, el cebador se trata primero para
separar las hebras antes de usar para preparar productos de extensión. El cebador debe ser lo bastante largo como para cebar la síntesis de los productos de extensión en presencia del agente inductor de la polimerización. La longitud exacta del cebador dependerá de factores tales como la temperatura, el tampón y la composición nucleotídica. Los cebadores oligonucleotídicos contienen, más preferentemente, aproximadamente 12-20 nucleótidos, aunque pueden contener más o menos nucleótidos, preferentemente de acuerdo con guías o normas de diseño bien conocidas.
Los cebadores de la invención se han diseñado para que sean sustancialmente complementarios a cada hebra del locus genómico que se va a amplificar e incluyen los nucleótidos G o C adecuados como se ha tratado anteriormente. Esto significa que los cebadores deben ser suficientemente complementarios para hibridar con sus respectivas hebras en las condiciones que permitan el funcionamiento del agente de polimerización. En otras palabras, los cebadores deberán tener suficiente complementariedad como la(s) secuencias flanqueantes 5' y 3' para hibridar y permitir la amplificación del locus genómico.
Los cebadores de la invención se usan en el procedimiento de amplificación. Es decir, reacciones (preferentemente, una reacción de cadena enzimática) que producen cantidades mayores del locus diana respecto al número de etapas de reacción implicadas. En una realización más preferida, la reacción produce cantidades exponencialmente mayores del locus diana. Reacciones como estas incluyen la reacción de PCR. Normalmente, un cebador es complementario a la hebra negativa (-) del locus y el otro es complementario a la hebra positiva (+). La hibridación de los cebadores con el ácido nucleico desnaturalizado seguida de la extensión con una enzima, como el fragmento grande de la ADN polimerasa I (Klenow) y nucleótidos, tiene como resultado hebras + y – recién sintetizadas que contienen la secuencia del locus diana. El producto de la reacción en cadena es un pequeño dúplex de ácido nucleico en el que los extremos corresponden a los extremos de los cebadores específicos usados.
Los cebadores de la invención se pueden preparar usando cualquier procedimiento adecuado, tal como procedimientos de fosfotriéster y fosfodiéster convencionales, incluidos procedimientos automáticos. En una de estas realizaciones automáticas, se usan dietilfosforoamiditas como materiales de partida y pueden sintetizarse como han descrito Beaucage, y col. 22, 1859, -1862; 1981) Tetrahedron Lett. Un procedimiento para sintetizar oligonucleótidos sobre un soporte sólido codiciado se describe en la patente de EE.UU. Nº 4.458.066.
Cualquier muestra de ácido nucleico, en forma purificada o no purificada, se puede usar como ácido o ácidos nucleicos de partida, siempre que contenta, o se sospeche que contiene, la secuencia de ácido nucleico específica que contiene el locus diana (p. ej., CpG). Por tanto, el procedimiento puede usar, por ejemplo, ADN o ARN, incluido el ARN mensajero. El ADN o ARN puede ser bicatenario o monocatenario. En caso de que el ARN se vaya a usar como molde, se utilizarían enzimas y/o condiciones óptimas para la transcripción inversa del molde en ADN. Además, se puede usar un híbrido ADN-ARN que contiene una hebra de cada uno. También se puede usar una mezcla de ácidos nucleicos producida en la reacción de amplificación anterior en el presente documento, usando los mismos o diferentes cebadores. La secuencia de ácido nucleico específica que se va a amplificar, es decir el locus diana, puede ser una fracción de una molécula más grande o puede estar presente inicialmente como una molécula pequeña de modo que la secuencia específica constituye todo el ácido nucleido.
La muestra que contiene ácido nucleico usada para detección de CpG metilada puede proceder de cualquier fuente, tal como un tejido (en particular tejido de próstata y tejido linfático), sangre, linfa, orina y eyaculado, y se puede extraer mediante diversas técnicas, tales como las descritas por Maniatis y col. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., pp 280, 281, 1982).
Si la muestra extraída es impura, se puede tratar antes de la amplificación con una cantidad de un reactivo eficaz para abrir las células, fluidos, tejidos o membranas de células animales de la muestra y para exponer y/o separar la(s) hebra(s) del o los ácidos nucleicos. Esta etapa de lisado y desnaturalización de ácido nucleico para exponer y separar las hebras permitirá que se produzca la amplificación con mucha mayor facilidad.
Cuando la secuencia del ácido nucleico diana de la muestra contiene dos hebras, es necesario separar las hebras del ácido nucleico antes de que se pueda usar como molde. La separación de las hebras se puede realizar como una etapa aparte o simultáneamente a la síntesis de los productos de extensión del cebador. Esta separación de hebras se puede conseguir usando varias condiciones de desnaturalización adecuadas, incluidos medios físicos, químicos o enzimáticos. Un procedimiento físico de separar las hebras de ácido nucleico implica calentar el ácido nucleico hasta que se desnaturaliza. La típica desnaturalización térmica puede implicar temperaturas que varían desde aproximadamente 80 a 105 ºC durante hasta 10 minutos. La separación de las hebras también se puede inducir mediante una enzima de la clase de enzimas conocidas como helicasas o mediante la enzima RecA, que tiene actividad helicasa, y, en presencia de riboATP, se sabe que desnaturaliza el ADN. Las condiciones de reacción que son adecuadas para separar las hebras de ácidos nucleicos usando helicasas se describen en Kuhn Hoffmann-Berling (CSH-Quantitative Biology, 43:63, 1978). Las técnicas para usar RecA se revisan en C. Radding (Ann. Rev. Genetics, 16:405-437, 1982). También se conocen bien perfeccionamientos de estas técnicas.
Cuando se separan las hebras complementarias de los ácidos o ácido nucleico, con independencia de si el ácido nucleico era inicialmente bi o monocatenario, es fácil usar las hebras separadas como molde para la síntesis de hebras adicionales de ácido nucleico. Esta síntesis se realiza en condiciones que permitan la hibridación de los cebadores a los moldes. En general, la síntesis se produce en una solución acuosa tamponada, preferentemente a un pH de 7-9, más preferentemente de aproximadamente 8. Preferentemente, al tampón que contiene las hebras molde separadas se añade un exceso molar (para el ácido nucleico genómico, normalmente 108:1, cebador:molde) de los dos cebadores oligonucleotídicos. La cantidad de hebra complementaria puede no ser conocida si el procedimiento de la invención se usa para aplicaciones diagnósticas, de modo que la cantidad de cebador relativa a la cantidad de la hebra complementaria no siempre se puede determinar con certeza. No obstante, como materia práctica, la cantidad de cebador añadido estará, en general, en exceso molar sobre la cantidad de la hebra complementaria (molde), cuando la secuencia que se va a amplificar está contenida en una mezclad e hebras de ácido nucleicos de cadena larga complicadas. Se prefiere un exceso molar grande para mejorar la eficiencia del procedimiento.
Los desoxirribonucleósidos trifosfatos, dATP, dCTP, dGTP y dTTP, se añaden a la mezcla de síntesis, bien por separado o junto con los cebadores, en cantidades adecuados y la solución resultante se calienta hasta aproximadamente 90-100 ºC durante hasta 10 minutos, preferentemente de 1 a 4 minutos. Después de este periodo de calentamiento, se deja enfriar la solución hasta la temperatura ambiente, que es preferible para la hibridación del cebador. A la mezcla enfriada se añade un agente adecuado para efectuar la reacción de extensión del cebador (el “agente para polimerización”) y se deja que progrese la reacción en condiciones conocidas en la técnica. El agente para polimerización también se puede añadir con los otros reactivos si es termoestable. Esta reacción de síntesis (o amplificación) se puede producir a temperatura ambiente hasta una temperatura a la que el agente de polimerización ya no funciona.
El agente de polimerización puede ser cualquier compuesto o sistema que funcione para conseguir la síntesis de los productos de extensión del cebador, preferentemente enzimas. Enzimas adecuadas para este fin incluye, entre otros, ADN polimerasa 1 de E. coli, fragmento Klenow de la polimerasa 1 de E. coli, ADN polimerasa de T4, otras ADN polimerasas disponibles, muteínas de polimerasa, transcriptasa inversa y otras enzimas, incluidas enzimas termoestables (p. ej., las enzimas que realizan la extensión del cebador después de someterse a temperaturas suficientemente elevadas como para producir desnaturalización). Un agente preferido es la Taq polimerasa. Enzimas adecuadas facilitarán la combinación de los nucleótidos del modo adecuado para formar los productos de extensión del cebador complementarios de cada hebra del ácido nucleico del locus. En general, la síntesis se iniciará en el extremo 3’ de cada cebador y procederá en dirección 5’ a lo largo de la hebra molde, hasta que la síntesis termina, produciendo moléculas de diferentes longitudes. No obstante, puede haber agentes de polimerización que inicien la síntesis en el extremo 5’ y que procedan en la otra dirección, usando el mismo procedimiento que se ha descrito anteriormente.
Más preferentemente, el procedimiento de amplificación es mediante PCR. También se pueden usar procedimientos alternativos de amplificación, siempre que los loci meritados y no metilados amplificados mediante PCR usando los cebadores de la invención se amplifiquen de un modo similar mediante los medios alternativos.
Los productos amplificados se identifican, preferentemente, como metilado o no metilado con una sonda o indicador específico del producto, como se describe en la patente de EE.UU. 4,683,195 de Mullis y col., incorporada en el presente documento por referencia en su totalidad. Avances en el campo de las sondas e indicadores para detectar polinucleótidos son bien conocidos para los expertos en la técnica. Opcionalmente, el patrón de metilación del ácido nucleico se puede confirmar mediante otras técnicas, tal como digestión con enzimas de restricción y análisis de transferencia Southern. Ejemplos de endonucleasas de restricción sensibles a metilación que se pueden usar para detectar metilación en 5’CpG incluyen Smal, SaclI, EagI, MspI, HpaII, BstUI y BssHII.
El procedimiento de la invención más preferido implica establecer una proporción de metilación de acuerdo con las reivindicaciones. Esto se puede realizar estableciendo una proporción entre la cantidad de especies metiladas amplificadas del Marcador obtenido y la cantidad del Marcador de referencia amplificado o una región Marcador no metilada amplificada. Esto se realiza mejor usando PCR cuantitativa en tiempo real. Las proporciones por encima de un valor de corte establecido o predeterminado se consideran hipermetiladas e indicativo de tener un trastorno proliferativo, tal como cáncer (cáncer de próstata en el caso de la GSTP1). Los valores de corte se establecen de acuerdo con procedimientos conocidos en los que dichos procedimientos se usan para al menos dos conjuntos de muestras: aquéllos con enfermedades conocidas y aquéllos con estados normales conocidos. Los Marcadores de referencia de la invención también se pueden usar como controles internos. El Marcador de referencia es, preferentemente, un gen que se expresa de forma constitutiva en las células de las muestras tales como B actina.
Los procedimientos y kits de la invención pueden incluir etapas y reactivos para multiplexación. Es decir, se puede analizar más de un Marcador a la vez.
Dado que un menor nivel de transcripción del gen asociado con el Marcador a menudo es el resultado de hipermetilación de la secuencia polinucleotídica y/o de elementos concretos de las secuencias de control de la expresión (p. ej., la secuencia promotora), se prepararon los cebadores preparados para corresponder con dichas secuencias. De acuerdo con esto, la invención proporciona procedimientos de detección o diagnóstico de un trastorno proliferativo celular detectando la metilación de áreas concretas dentro de la región de control de la expresión o promotora de los Marcadores, como se especifica en las reivindicaciones, Sondas útiles para detectar metilación de estas áreas son útiles en dichos procedimientos diagnósticos o pronósticos. Moléculas preferidas para la detección de Marcadores se muestran a continuación. El nombre corto para el gen Marcador se muestra entre paréntesis, junto con el tipo de sistema de detección usado. Antisentido solo se refiere a la orientación del cebador que está designado de este modo en relación con la secuencia de cebado del otro miembro del par con el que se asocia. No es necesariamente antisentido con respecto al ADN genómico.
SEC ID Nº I (GSTP1 ESCORPIÓN):
CCCCGAACGTCGACCGCTCGGGG-BHQ-HEG-CGATTTCGGGGATTTTAGGGCGT
SEC ID Nº 2 (GSTP1 ESCORPIÓN Cebador antisentido):
AAAATCCCGCGAACTCCCGCC
SEC ID Nº 3 (GSTP1 ESCORPIÓN):
CCCGAACGTCGACCGCTTTCGGG-BHQ-HEG-CGATTTCGGGGATTTTAGGGCGT
SEC ID Nº 4 (GSTP1 ESCORPIÓN Cebador antisentido):
AAAATCCCGCGAACTCCCGCC
SEC ID Nº 5(GSTP1 SCORPIONESCORPIÓN):
CCGCGGGAGTTCGCGGGCGCCG BHQ-HEG-ACTAAATCACGACGCCGACCGC
SEC ID Nº 6 (GSTP1 ESCORPIÓN Cebador antisentido):
CGGTTAGTTGCGCGGCGATTTC
SEC ID Nº 7 (GSTP1 ESCORPIÓN):
CGGGAGTTCGCGGGTCCCG-BHQ-HEG-ACTAAATCACGACGCCGACCGC
SEQ 10 NO. 8 (GSTP1 ESCORPIÓN Cebador antisentido):
CGGTTAGTTGCGCGGCGATTTC
SEC ID Nº 9(GSTP1 ESCORPIÓN):
GTGGTTGATGTTTGGGGTATCAACCAC-BHQ-HEG_AATCCCACAAACTCCCACCAACC
SEC ID Nº 10 (GSTPI ESCORPIÓN Cebador antisentido):
GTGGTGATTTTGGGGATTTTAGGGTGT
SEC ID Nº 11 (GSTP1 ESCORPIÓN):
ACCCCAGTGGTTGATGTTTGGGGT-BHQ-HEG-AATCCCACAAACTCCCACCAACC
SEC ID Nº 12 (GSTPI ESCORPIÓN Cebador antisentido):
GTGGTGATTTTGGGGATTTTAGGGTGT
SEC ID Nº 13 (GSTP1 ESCORPIÓN):
SEC ID Nº 14 (GSTP1 ESCORPIÓN Cebador antisentido):
TGGTTAGTTGTGTGGTGATTTTGGGGA
SEC ID Nº 15 (GSTP1 ESCORPIÓN):
CCCCGAACGTCGACCGCTCGGGG-BHQ-HEG- CGATTTCGGGGATTTTAGGGCGT
SEC ID Nº 16 (GSTP1 ESCORPIÓN Cebador antisentido):
AAAATCCCGCGAACTCCCGCC
SEC ID Nº 17 (GSTP1 ESCORPIÓN):
SEC ID Nº 18 (GSTP1 ESCORPIÓN Cebador antisentido):
AAAATCCCGCGAACTCCCGCC
SEC ID Nº 19 (GSTP1 ESCORPIÓN):
CGCACGGCGAACTCCCGCCGACGTGCG BHQ-HEG-TGTAGCGGTCGTCGGGGTTG
SEC ID Nº 20 (GSTP1 ESCORPIÓN Cebador antisentido):
GCCCCAATACTAAATCACGACG
SEC ID Nº 21 (GSTP1 ESCORPIÓN): SEC ID Nº 22 (GSTP1 ESCORPIÓN Cebador antisentido):
CACAACACCAACCACTCTTC
SEC ID Nº 23(GSTP1 CEBADOR TAQMAN):
CGTGATTTAGTATTGGGGCGGAGCGGGGC
SEC ID Nº 24 (GSTP1 CEBADOR TAQMAN):
ATCCCCGAAAAACGAACCGCGCGTA
SEC ID Nº 25 (GSTP1 SONDA TAQMAN):
TCGGAGGTCGCGAGGTTTTCGTTGGA
SEC ID Nº 26 (RARB2 ESCORPIÓN):
GCCGCCGTCGAGAACGCGAGCGGGCGGC-BHQ-HEG-TACCCCGACGATACCCAAAC
SEC ID Nº 27 (RARB2 ESCORPIÓN Cebador antisentido):
GGGATTAGAATTTTTTATGCGAGTTGT
SEC ID Nº 28 (RARB2 ESCORPIÓN):
CGGCAGGATTGGGATGTCGAGCTGCCG-B>-IQ-HEG-TACCCCGACGATACCCAAAC
SEC ID Nº 29 (RARB2 ESCORPIÓN Cebador antisentido):
GGCATTAGAATTTTTTATGCGAGTTGT
SEC ID Nº 30 (RASSF1A ESCORPIÓN):
GCCGCGGTTTCGTTCGGTTCGCGGC-BHQ-HEG-CCCGTACTTCGCTAACTTTAAACG
SEC ID Nº 31 (RASSF1A ESCORPIÓN Cebador antisentido):
GCGTTGAAGTCGGGGTTC
SEC ID Nº 32 (TIMP3 ESCORPIÓN):
GCGGCGAGTTCGGGTTGTAGCGCCGC-BHQ-HEG-CGCCTCTCCAAAATTACCGTAC
SEC ID Nº 33 (TIMP3 ESCORPIÓN Cebador antisentido):
GCGTCGGAGGTTAAGGTTGTT
SEC ID Nº 34 (APC ESCORPIÓN):
GCCGGCGGGTTTTCGACGGGCCGGC-BHQ-HEG-CGAACCAAAACGCTCCCCA
SEC ID Nº 35 (APC ESCORPIÓN Cebador antisentido):
GTCGGTTACGTGCGTTTATATTTAG
SEC ID Nº 36 (ACTINA ESCORPIÓN):
GCGCCCAACCGCACAAGGGCGC-BHQ-HEG-GGGTATATTTTCGAGGGGTACG
SEC ID Nº 37 (ACTINA ESCORPIÓN Cebador antisentido):
CGACCCGCACTCCGCAAT
SEC ID Nº 38(ACTINA ESCORPIÓN):
CCGCGCATCACCACCCCACACGCGCGG-BHQ-HEG-GGAGTATATAGGTTGGGGAAGTTTG
SEC ID Nº 39 (ACTINA ESCORPIÓN Cebador antisentido):
AACACACAATAACAAACACAAATTCAC
SEC ID Nº 40 (ACTINA ESCORPIÓN):
CCCGGCTAAACCCACCATCCAGCCGGG-BHQ-HEG-GGGAGGGTAGTTTAGTTGTGGTT
SEC ID Nº 41 (ACTINA ESCORPIÓN Cebador antisentido):
CAAAACAAAAAAACTAAATCTACACAACC
SEC ID Nº 42 (ACTINA ESCORPIÓN):
CCGCGGAACA lTCAACTCAACCGCGG-BHQ-HEG-GGAGGAGGAAGGTAGGTTTTT
SEQ 10 NO. 43 (ACTINA ESCORPIÓN Cebador antisentido):
ACATACAACAATCAATAACATAAAACCAC
SEQ 10 NO. 44 (PTGS2/COX2 ESCORPIÓN):
CACGCCGCCGTATCTAGGCGTG-BHQ-HEG-GTTTGTTTCGACGTGATTTTTCGA
SEQ 10 NO. 45 (PTGS2/COX2 Cebador antisentido):
GCAAAAAATCCCCTCTCCCGC
5
SEC ID Nº 46 (PTGS2/COX2 ESCORPIÓN):
GCCGCGCACAAATTTCCGCGGC-BHQ-HEG-GAATTGGTTTTCGGAAGCGTTCG
SEC ID Nº 47 (PTGS2/COX2 Cebador antisentido):
SEC ID Nº 48 (PTGS2/COX2 ESCORPIÓN):
GGCGGAACGCACAAATTTCCGCC-BHQ-HEG-GAATTCCTTTTCGCAAGCGTTCG
SEC ID Nº 50 (PTGS2/COX2 ESCORPIÓN):
TGCCGCCGCCGTATCTAATGGCGGCA-BHQ-HEG-GTTTGTTTCGACGTGATTTTTTCGA 20
SEC ID Nº 51 (PTGS2/COX2 Cebador antisentido):
GCAAAAAATCCCCTCTCCCGC
SEC ID Nº 52 (14-3-3 ESCORPIÓN):
SEC ID Nº 53 (14-3-3 Cebador antisentido):
CTAACCGCCCACCACGT
30 BHQ= Inactivador de agujero negro (BioSearch Technologies, San Fransisco, CA)
HEG= Hexaetilenglicol
Los kits de la divulgación se pueden configurar con diversos componentes, siempre que todos contengan al menos un cebador o sonda de la invención o una molécula de detección (p. ej., indicador Escorpión). En una realización, el kit incluye reactivos para amplificar y detectar segmentos Marcadores hipermetilados. Opcionalmente, el kit incluye
35 reactivos de preparación de muestras y/o artículos (p. ej., tubos) para extraer ácidos nucleicos de las muestras.
En un kit preferido se incluyen los reactivos necesarios para MSP en un tubo tal como, un conjunto de cebadores para PCR, una ADN polimerasa termoestable, tal como la Taq polimerasa, y un(os) reactivo(s) de detección adecuados tales como una sonda de hidrólisis o una baliza molecular. En kits opcionalmente preferidos, los reactivos de detección son indicadores o reactivos Escorpión. También se puede usar un único cebador pigmento o un pigmento fluorescente específico del ADN bicatenario, tal como bromuro de etidio. Los cebadores están, preferentemente, en cantidades que dan concentraciones altas. Materiales adicionales en el kit pueden incluir: Tubos o viales de reacción adecuados, una composición de barrera, normalmente una perla de cera que opcionalmente incluye magnesio; tampones y reactivos necesarios, tales como dNNTP; ácido(s) nucleico(s) control y/o tampones adicionales, compuestos, cofactores, constituyentes iónicos, proteínas y enzimas, polímeros y similares, que se pueden usa en las reacciones de MSP. Opcionalmente, los kits incluyen reactivos y materiales de extracción de ácido nucleico.
Ejemplos
Ejemplo 1: Comparativo
Se diseñó un ensayo de sonda para hidrólisis basado en los cebadores y sondas de la literatura y dirigidos al ensayo cuantitativo para detectar cáncer de próstata en pacientes con enfermedad clínicamente localizada. Este ensayo incluye una región promotora central de CpG usada para discriminar entre tejido de próstata neoplásico o no neoplásico.
Las secuencias del cebador y de la sonda para hidrólisis con marcaje doble analizadas para este diseño fueron las siguientes:
Cebador directo -GSTP1;(-192)MU17 AGTTGCGCGGCGATTTC (SEC ID Nº 65)
Cebador inverso GSTP1;(-74)ML22 GCCCCAATACTAAATCACGACG (SEC ID Nº 20)
Sonda (5’FAM/3’TAMRA)GSTP1;(-152)MP23 CGGTCGACGTTCGGGGTGTAGCG (SEC ID Nº 66)
Los niveles de metilación de GSTP1 se analizaron en 12 muestras de hiperplasia prostática benigna (HPB), 12 muestras de adenocarcinoma de próstata clínicamente localizado (Tumor) y 2 muestras normales. Los datos se presentan en copias totales de GSTP1 detectada y se muestran en la Fig. 1. Se encontró que el ensayo mostrará u 75 % de sensibilidad para detectar adenocarcinoma de próstata cuando se estableció un valor de corte en el número de copias más alto exhibido por una muestra benigna. La distribución moderada de los niveles de metilación con GSTP1 e tejidos de próstata que muestran hiperplasia prostática benigna y adenocarcinoma de próstata clínicamente localizado sugiere un ensayo que no sería clínicamente relevante sin estar complementado con otro marcador.
Ejemplo 2 (Ensayo de sonda de hidrólisis de acuerdo con la invención)
Los cebadores y la sonda para MSP se diseñaron para mejorar adicionalmente la sensibilidad y la especificidad para el ensayo con GSTP1 y se analizaron en el mismo grupo de muestras que en el Ejemplo 1. Este diseño se localizó cadena debajo de la isla de CpG y abarcó parte del promotor central y del exón 1. Las secuencias del cebador y de la sonda para hidrólisis con marcaje doble analizadas para este ejemplo son las siguientes:
Cebador directo: (-71)MU29 CGTGATTTAGTATTGGGGCGGAGCGGGGC (SEC. ID Nº 23)
Cebador inverso: (+59)ML25 ATCCCCGAAAAACGAACCGCGCGTA (SEC ID Nº 24)
Sonda (5’FAM/3’TAMRA)GSTP1;(-23)MP26 TCGGAGGTCGCGAGGTTTTCGTTGGA) (SEC ID Nº 25)
Los datos se presentan en copias totales de GSTP1 detectada y se muestran en la Fig. 2. Se encontró que el ensayo mostrará un 100% de sensibilidad y un 100 % de especificidad para detectar adenocarcinoma de próstata cuando se estableció un valor de corte en el número de copias más alto exhibido por una muestra benigna.
La isla de CpG de 1,5 kb de GSTP1 abarca desde el promotor hasta el exón 3 y se ha demostrado que está extensamente metilada. Dos sitios de unión para la transcripción, AP I y Sp1, se localizan justo cadena arriba del exón 1 y fueron el cetro del diseño de las sondas y cebadores usados en este ejemplo debido al elevado contenido de CpG dentro de SP1. Se ha demostrado que esta es una buena región para el diseño del ensayo debido a la competición entre los factores de trascripción y las proteínas de unión a metil-CpG que se unen a los sitios AP1 y Sp1 con el fin de inducir la condensación de la cromatina y la silenciación génica.
Ejemplo 3: MSP Escorpión
Los reactivos Escorpión se diseñaron para los Marcadores siguientes y los Marcadores de referencia:
SEC ID Nº 19, 20 (GSTP1)
SEC ID Nº 38, 39 (Actin)
SEC ID Nº 28, 29 (RARB2)
SEC ID Nº 30, 31 (RASSF I A)
SEC ID Nº 32, 33 (TIMP3)
SEC ID Nº 34, 35 (APC)
SEC ID Nº 50, 51 (PTGS2)
SEC ID Nº 52, 53 (14-3-3 sigma)
Los diseños se analizaron para observar sus estructuras secundarias y las dimerizaciones inadecuadas usando el software de diseño de cebadores Oligo6 (Molecular Biology Insights, Cascade, CO, EE.UU.) y Visual OMP (DNA Software, Inc., 120‘ West Washington Street Ann Arbor, MI, EE.UU.). Los diseños se analizaron para observar sus estructuras secundarias y las dimerizaciones inadecuadas usando el software de diseño de cebadores Oligo6 (Molecular Biology Insights, Cascade, CO, EE.UU.) y Visual OMP (DNA Software, Inc., 120‘ West Washington Street Ann Arbor, MI, EE.UU.). Los reactivos y cebadores Escorpión se sintetizaron en un sintetizador de ADN automático usando química de fosforoamidita estándar (Scandinavian Gene Synthesis AB, Koping, Suecia) y Biosearch Technologies (Novato, CA, EE.UU.).
Ejemplo 3 Análisis con el reactivo Escorpión:
Los reactivos descritos en el Ejemplo 2 se analizaron en varias muestras de ADN humano. Estas muestras incluyeron ADN genómico humano metilado (todas las citosinas precedentes a la guanina están metiladas en la posición 5) y no metilado disponible comercialmente (Chemicon, Temecula, CA, USA) como molde positivo y negativo, respectivamente. El ADN genómico de la línea de células de cáncer de mama humano, MCF-7 y línea celular de cáncer colorrectal, HCTI 16, como controles positivos y negativos para la metilación de GSTP1 (Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, VA, EE.UU.).
El ADN genómico se modificó usando un kit de reactivos de conversión con bisulfito sódico disponible comercialmente (Zymo Research, Orange, CA, EE.UU.). Este tratamiento convirtió todas las citosinas en el ADN no metilado en Uracilo, mientras que en el ADN metilado solo las citosinas que no preceden a la guanina se convirtieron en Uracilo. Todas las citosinas precedentes a la guanina (en un dinucleótido CpG) siguió siento citosina.
El ADN genómico modificado con bisulfito sódico (100-150 ng) se amplificó en una reacción de 25 μl que contiene los componentes siguientes: Tris 67mM pH 8,8, (NH4)2SO4 16,6mM, MgCl2 6,7mM, beta mercaptoetanol 10mM, 1,25mM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 1 U de ADN polimerasa Hot start de Taq, sonda Escorpión 250 nM, cebador inverso o directo 250 nM (en función del diseño escorpión), 625 nM de pigmento de referencia pasivo, ROX (solo para ciclos ABI7900).
Después se analizaron las muestras en un ensayo de PCR cuantitativa en tiempo real en un sistema de detección de secuencia ABI 7900HT y/o instrumento Cepheid SmartCycler® PCR-
Las condiciones de PCR usadas fueron:
Para los ciclos en ABI 7900:
95 ºC durante 5 minutos; después, 40 ciclos de 95 ºC durante 30 segundos, 59 ºC durante 30 segundos y 72 ºC durante 30 segundos y una extensión final
A 72 ºC durante 5 minutos Los datos ópticos se recogieron a 59 ºC para cada ciclo.
Para los ciclos en Cepheid smart cycler:
95 ºC durante 60 segundos; después, 40 ciclos de 95 ºC durante 30 segundos, 59 ºC durante 30 segundos y una extensión final a 72 ºC durante 5 minutos.
Los datos ópticos se recogieron a 59 ºC para cada ciclo.
Los reactivos Escorpión mostraron una eficiencia de PCR de 91,2 % en el caso de los reactivos de GSTP1 y 95,2 % en el caso de los reactivos de Actina. Los valores medios de Ct fueron:
- GSTP1
- 28
- B Actina
- 30
- APC
- 29
- TIMP3
- 30
- RASSF1A
- 29
- RARB2
- 29
- PTGS2
- 33
- 14-3-3S
- 32
Ejemplo 4: Comparación con balizas moleculares.
Se obtuvieron balizas moleculares para detectar hipermetilación de GSTP1 a lo largo de la porción del gen descrito en el Ejemplo 1. Las balizas se aplicaron a reacciones de PCR con muestras como se describe en el ejemplo 2. En cada
5 caso, se coamplificó la B Actina de modo que se pudieron obtener las proporciones de metilación. Los conjuntos de sonda-cebador de GSTP1 y B-actina Escorpión mostraron un mejor rendimiento en la detección del ADN metilado de GSTP1 y el ADN no metilado de B actina. Los valores umbral de Ct para los conjuntos Escorpión diseñados fueron más de 1,5 Ct mejores que para las sondas de balizas moleculares (Ct medio de 28,82 para las balizas frente a 27,30 para los indicadores Escorpión).
10 Los resultados fueron los siguientes.
- ADN metilado universal, ng
- 500 250 100 50 10 5
- Escorpión (proporción nº de copias GSTP1/B-actina)
- 272 310 285 296 339 288
- Baliza Molecular (proporción nº de copias GSTP1/B-actina)
- 759 735 758 767 797 814
Ejemplo 5 Valores de corte de las proporciones de metilación
Muestras de tejido prostático de pacientes con afecciones clínicas conocidas se sometieron a PCR como se ha descrito en el Ejemplo 2. Las proporciones de metilación se calcularon y se muestran a continuación. Los datos se analizaron
15 usando el siguiente procedimiento. Antes de usar un algoritmo, se siguieron los siguientes requisitos previos. Para Actina: Valores CT < 40 para ambos duplicados (como se ha definido mediante el equipo de PCR en tiempo real. Para el resultado de GSTP1 "metilado": Valores CT < 40 para ambos duplicados (como se ha definido mediante el equipo de PCR. La pendiente de ambas curvas estándar superiores a -4 (eficiencia de la PCR > 80 %)
R2: 0,99, 4 puntos de datos relevantes sobre la curva estándar
20 El control de ensayo positivo tiene que generar un resultado positivo
Los controles que no son molde incluidos de forma rutinaria (curvas estándar) tienen que ser negativos sin se han cumplido los requisitos previos. Se calcularon los números de copias APRA cada uno de los genes (GSTP1 y Actina) en base a las curvas estándar y se calculó una proporción para cada muestra (incluido el control positivo) usando la siguiente formula: (Número de copia de GSTP1/Número de copia de �-Actina) * 1000. Después se estableció un corte
25 usando una proporción que generó una especificidad alta y una sensibilidad alta. El corte fue 10 para GSTP1 para proporcionar una sensibilidad del 87 % y una especificidad del 100 % para 142 tejidos prostáticos incluidos en parafina fijada en formalina. Las proporciones generadas se usaron para determinar el estado de metilación de una muestra dada usando los criterios siguientes:
- Resultados
- Nº de copia (mGSTP1) Nº de copia (B-actina) Proporción x 1000
- GSTP1 Metilada
- >2 >2 >10
- GSTP1 No Metilada
- cualquiera >200 <10
- Sin determinar
- <2 <200
Un experto en la técnica reconocerá que se puede ajustar el corte, preferentemente para fijar los valores de sensibilidad y especificidad a los adecuados para el objetivo para el cual se usarán (p. ej., detección selectiva, monitorización de la terapia, ensayos de reflejo de diagnósticos ambiguos).
5 Ejemplo 6- Marcadores de combinación (Profético)
Los reactivos escorpión para las siguientes combinaciones se preparan como se ha descrito en el Ejemplo 1: Marcador GSTP1 y RAR 2, GSTP1 y APC, y GSTP1 y PTGS2 Los Marcadores funcionan en combinación como PCR multiplexada de acuerdo con el Ejemplo 2 usando ciclos repetidos de 50 muestras de tejido prostático con condiciones conocidas (es decir, normal, hiperplasia benigna, cáncer de próstata). Los resultados esperados se muestran a
10 continuación.
- Marcador(es)
- SEC ID Nº Sensibilidad Especifidad
- GSTP1 + RARβ2
- 90% 100%
- GSTP1 + APC
- 96,2% 92,9
- GSTP1 + PTGS2
- 96,2 100
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> VENER, Tatiana
MEHROTRA, Jyoti
15 VARDE, Shobha MAZUMDER, Abhijit BADEN, Jon BACKUS, John
20 <120> DETECCIÓN DE METILACIÓN GÉNICA
<130> VDX5027USNP
<140> 60/717790 25 <141> > 2005-09-15
<160> 66
<170> PatentIn versión 3.3
<210> 1
<211> 46
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> GSTP1 Escorpión
<220>
<221 > base modificada
<222> (23)..(23)
<223> -BHQ-HEG-
<220>
<221> base modificada
<222> (23)..(23)
<223> -BHQ (Inactivador de agujero negro) -HEG (Hexaetilglicol) -
<400> 1 ccccgaacgt cgaccgctcg gggcgatttc ggggatttta gggcgt 46
<210> 2
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> GSTP1 Escorpión Cebador Antisentido
<400> 2 aaaatcccgc gaactcccgc c 21
<210> 3
<211> 46
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> GSTP1 Scorpion
<220>
<221> base modificada
<222> (23)..(23)
<223> -BHQ-HEG-
<400> 3 cccgaacgtc gaccgctttc gggcgatttc ggggatttta gggcgt 46
<210> 4
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> GSTP1 Escorpión Cebador Antisentido
<400> 4 aaaatcccgc gaactcccgc c 21
<210> 5
<211> 44
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> GSTP1 Scorpion
<220>
<221 > base modificada
<222> (22)..(22)
<223> -BHQ-HEG-
<400> 5 cggcgggagt tcgcgggcgc cgactaaatc acgacgccga ccgc 44
<210> 6
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> GSTP1 Escorpión Cebador Antisentido
<400> 6 cggttagttg cgcggcgatt tc 22
<210> 7
<211> 41
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> GSTP1 Scorpion
<220>
<221> base modificada
<222> (19)..(19)
<223> -BHQ-HEG-
<220>
<221> base modificada
<222> (25)..(25)
<223> -BHQ-HEG-
<400> 7 cgggagttcg cgggtcccga ctaaatcacg acgccgaccg c 41
<210> 8
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> GSTP1 Escorpión Cebador Antisentido
<400> 8 cggttagttg cgcggcgatt tc 22
<210> 9
<211> 50
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> GSTP1 Scorpion
<220>
<221> base modificada
<222> (27)..(27)
<223> -BHQ-HEG-
<400> 9 gtggttgatg tttggggtat caaccacaat cccacaaact cccaccaacc 50
<210> 10
<211> 27
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> GSTP1 Escorpión Cebador Antisentido
<400> 10 gtggtgattt tggggatttt agggtgt 27
<210> 11
<211> 47
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> GSTP1 Scorpion
<220>
<221> base modificada
<222> (24)..(24)
<223> -BHQ-HEG-
<400> 11 accccagtgg ttgatgtttg gggtaatccc acaaactccc accaacc 47
<210> 12
<211> 27
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> GSTP1 Scorpion
<400> 12 gtggtgattt tggggatttt agggtgt 27
<210> 13
<211> 56
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> GSTP1 Scorpion
<220>
<221> base modificada
<222> (28)..(28)
<223> -BHQ-HEGEP
<400> 13 ccccacaggt tggtgggagt ttgtggggcc caatactaaa tcacaacacc aaccac 56
<210> 14
<211> 27
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> GSTP1 Escorpión Cebador Antisentido
<400> 14 tggttagttg tgtggtgatt ttgggga 27
<210> 15
<211> 46
<212> ADN
<213> Artificial
<220> <223> GSTP1 Scorpion
<220>
<221> base modificada
<222> (23)..(23)
<223> -BHQ-HEG-
<400> 15
ccccgaacgt cgaccgctcg gggcgatttc ggggatttta gggcgt 46
<210> 16
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> GSTP1 Escorpión Cebador Antisentido
<400> 16
aaaatcccgc gaactcccgc c 21
<210> 17
<211> 53
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> GSTP1 Scorpion
<220>
<221 base modificada
<222> (30)..(30)
<223> -BHQ-HEG-
<400> 17 cgcacgccga acgtcgaccg caaacgtgcg cgatttcggg gattttaggg cgt 53
<210> 18
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> GSTP1 Escorpión Cebador Antisentido
<400> 18 aaaatcccgc gaactcccgc c 21
<210> 19
<211> 47
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> GSTP1 Scorpion
<220>
<221> base modificada
<222> (27)..(27)
<223> -BHQ-HEG-
<400> 19 cgcacggcga actcccgccg acgtgcgtgt agcggtcgtc ggggttg 47
<210> 20
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial <220>
<223> GSTP1 Escorpión Cebador Antisentido
<400> 20 gccccaatac taaatcacga cg 22
<210> 21
<211> 55
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> GSTP1 Scorpion
<220>
<221> base modificada
<222> (34)..(34)
<223> -BHQ-HEG-
<400> 21 ccgacgcaca aaaaaacacc ctaaaatccg tcggggttag ttgtgtggtg atttt 55
<210> 22
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> GSTP1 Escorpión Cebador Antisentido
<400> 22 cacaacacca accactcttc 20 <210> 23
<211> 29
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> GSTP1 Cebador de Taqman
<400> 23 cgtgatttag tattggggcg gagcggggc 29
<210> 24
<211> 25
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> GSTP1 Cebador de Taqman
<400> 24 atccccgaaa aacgaaccgc gcgta 25
<210> 25
<211> 26
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> GSTP1 Sonda de Taqman
<400> 25 tcggaggtcg cgaggttttc gttgga 26
<210> 26 <211> 48
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> RARB2 Scorpion
<220>
<221> base modificada
<222> (28)..(28)
<223> -BHQ-HEG-
<400> 26 gccgccgtcg agaacgcgag cgggcggcta ccccgacgat acccaaac 48
<210> 27
<211> 27
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> RARB2 Escorpión Cebador Antisentido
<400> 27 gggattagaa ttttttatgc gagttgt 27
<210> 28
<211> 47
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> RARB2 Scorpion <220>
<221> base modificada
<222> (27)..(27)
<223> -BHQ-HEG-
<400> 28 cggcaggatt gggatgtcga gctgccgtac cccgacgata cccaaac 47
<210> 29
<211> 27
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> RARB2 Escorpión Cebador Antisentido
<400> 29 gggattagaa ttttttatgc gagttgt 27
<210> 30
<211> 49
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> RASSFIA Scorpion
<220>
<221> base modificada
<222> (25)..(25)
<223> -BHQ-HEG-
<400> 30 gccgcggttt cgttcggttc gcggccccgt acttcgctaa ctttaaacg 49
<210> 31
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> RASSFIA Escorpión Cebador Antisentido
<400> 31 gcgttgaagt cggggttc 18
<210> 32
<211> 48
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> TIMP3 Scorpion
<220>
<221> base modificada
<222> (26)..(26)
<223> -BHQ-HEG-
<400> 32 gcggcgagtt cgggttgtag cgccgccgcc tctccaaaat taccgtac 48
<210> 33
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> TIMP3 Escorpión Cebador Antisentido
<400> 33 gcgtcggagg ttaaggttgt t 21
<210> 34
<211> 44
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> APC Scorpion
<220>
<221> base modificada
<222> (25)..(25)
<223> -BHQ-HEG-
<400> 34 gccggcgggt tttcgacggg ccggccgaac caaaacgctc ccca 44
<210> 35
<211> 25
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> APC Escorpión Cebador Antisentido
<400> 35 gtcggttacg tgcgtttata tttag 25
<210> 36
<211> 44
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Actina Scorpion
<220>
<221> base modificada
<222> (22)..(22)
<223> -BHQ-HEG-
<400> 36 gcgcccaacc gcacaagggc gcgggtatat tttcgagggg tacg 44
<210> 37
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ACTINA Escorpión Cebador Antisentido
<400> 37 cgacccgcac tccgcaat 18
<210> 38
<211> 52
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ACTINA Scorpion
<220>
<221> base modificada
<222> (27)..(27)
<223> -BHQ-HEG-
<400> 38 ccgcgcatca ccaccccaca cgcgcgggga gtatataggt tggggaagtt tg 52
<210> 39
<211> 27
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ACTIN Escorpión Cebador Antisentido
<400> 39 aacacacaat aacaaacaca aattcac 27
<210> 40
<211> 50
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ACTINA Scorpion
<220>
<221> base modificada
<222> (27)..(27)
<223> -BHQ-HEG-
<400> 40 cccggctaaa cccaccatcc agccgggggg agggtagttt agttgtggtt 50
<210> 41
<211> 29
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ACTIN Escorpión Cebador Antisentido
<400> 41 caaaacaaaa aaactaaatc tacacaacc 29
<210> 42
<211> 47
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ACTINA Scorpion
<220>
<221> base modificada
<222> (26)..(26)
<223> -BHQ-HEG-
<400> 42 ccgcggaaca ttcaactcaa ccgcggggag gaggaaggta ggttttt 47
<210> 43
<211> 29
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ACTINA Escorpión Cebador Antisentido <400> 43 acatacaaca atcaataaca taaaaccac 29
<210> 44
<211> 47
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> PTGS2/COX2 Scorpion
<220>
<221> base modificada
<222> (22)..(22)
<223> -BHQ-HEG-
<400> 44 cacgccgccg tatctaggcg tggtttgttt cgacgtgatt ttttcga 47
<210> 45
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> PTGS2/COX2 Antisense Primer
<400> 45 gcaaaaaatc ccctctcccg c 21
<210> 46
<211> 45
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> PTGS2/COX2 Scorpion
<220>
<221> base modificada
<222> (22)..(22)
<223> -BHQ-HEG-
<400> 46 gccgcgcaca aatttccgcg gcgaattggt tttcggaagc gttcg 45
<210> 47
<211> 16
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> PTGS2/COX2 Cebador Antisentido
<400> 47 cccgaattcc accgcc 16
<210> 48
<211> 46
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> PTGS2/COX2 Scorpion
<220>
<221> base modificada
<222> (23)..(23)
<223> -BHQ-HEG
<400> 48 ggcggaacgc acaaatttcc gccgaattgg ttttcggaag cgttcg 46
<210> 49
<211> 16
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> PTGS2/COX2 Cebador Antisentido
<400> 49 cccgaattcc accgcc 16
<210> 50
<211> 51
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> PTGS2/COX2 Scorpion
<220>
<221> base modificada
<222> (26)..(26)
<223> -BHQ-HEG-
<400> 50 tgccgccgcc gtatctaatg gcggcagttt gtttcgacgt gattttttcg a 51
<210> 51
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> PTGS2/COX2 Cebador Antisentido
<400> 51 gcaaaaaatc ccctctcccg c 21
<210> 52
<211> 51
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> 14-3-3 Scorpion
<220>
<221> base modificada
<222> (26)..(26)
<223> -BHQ-HEG-
<400> 52 cggccttcgc tcttcgcaaa aggccgggta gtttttatga aaggcgtcgt 51
<210> 53
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> 14-3-3 Cebador Antisentido
<400> 53
ctaaccgccc accacgtt 18
<210> 54
5 <211> 4260
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220> 10 <221> misc_feature
<223> >gi|341173|gb|M24485.1|HUMGSTP1G Homo sapiens (clon pHGST-pi) glutatión S-transferasa pi (GSTP1) gen, cds completa
<400> 54
<210> 55
<211> 2011
<212> ADN
5 <213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> B-Actin
10 >gi|28337|emb|Y00474.1|HSACTBPR región flanqueante en 5’ del gen de la beta-actina humana, Isla de CpG 1656 a 1955
<400> 55
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<211> 1792
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> >gi|5016088|ref|NM_001101.2| beta-actina de Homo sapiens (ACTB), ARNm
<400> 56
<210> 57
<211> 2762
<212> ADN
5 <213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> RARB2
10 >gi|14916495|ref|NM_016152.2| receptor beta del ácido retinoico de Homo sapiens, (RARB),variante de transcripción 2, ARNm
<400> 57
- 5
- <210> 58 <211> 5487 <212> ADN <213> Homo sapiens
- 10
- <220> <221> misc_feature <223> TIMP3 >gi|21536431|ref|NM_000362.3| inhibidor tisular de pseudoinflamatoria del fondo de Sorsby,) (TIMP3), ARNm la metaloproteinasa 3 de Homo sapiens (distrofia
- <400> 58
<210> 59
<211> 866
5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature 10
<223> APC >gi|551463|gb|U02509.1|HSU02509 Gen de la poliposis adenomatosa del colon humao (APC), secuencia del promotor
<220>
<221> misc_feature
<222> (315)..(315)
<223> n es a, c, g, o t
<400> 59
<210> 60
<211> 10386
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> >gi|21626462|ref|NM_000038.2| Poloposis adenomatosa del colon de Homo sapiens (APC), ARNm
<221> misc_feature
<222> (9521)..(9521)
<223> n es a, c, g, o t
10 <400> 60
<210> 61
<211> 7273
<212> ADN
5 <213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> PTGS2 10 >gi|3282785|gb|AF044206.1| gen de la ciclooxigenasa de Homo sapiens (COX-2), promotor y exón 1
<400> 61
<210> 62
<211> 4465
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> >gi|4506264|ref|NM_000963.1| Prostaglandina-endoperoxida sintasa 2 (prostaglandina G/H sintasa y ciclooxigenasa) (PTGS2) de Homo sapiens, ARNm
<400> 62
<210> 63
<211> 1336
<212> ADN
5 <213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> 14-3-3-Sigma 10 >gi|45238846|ref|NM-006142.3| Estratifina (SFN) de Homo sapiens, ARNm
<400> 63
<210> 64
<211> 1968
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> RASSF1A
>gi|25777678|ref|NM_007182.4| Dominio de la familia 1 de asociación con Ras (RaIGDS/AF-6) (RASSF1) de Homo sapiens, variante de transcripción A, ARNm
<400> 64
<210> 65
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> GSTP1 Cebador
<400> 65 agttgcgcgg cgatttc 17
<210> 66
<211> 23
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sonda (5’FAM/3’TAMRA) GSTP1
<400> 66 cggtcgacgt tcggggtgta gcg 23
Claims (18)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Un procedimiento de diagnóstico de la presencia o predecir el curso de un trastorno proliferativo, que comprende determinar el estado de metilación de un marcador para GSTP1 en una muestra biológica usando una sonda de ácido nucleico y cebadores oligonucleotídicos, en el que la sonda oligonucleotídica está codificada por la SEC ID Nº 25 y los cebadores oligonucleotídicos están codificados por las SEC ID Nº 23 y 24.
-
- 2.
- El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende medir la presencia de un Marcador de referencia.
-
- 3.
- El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el Marcador de referencia está seleccionado del grupo que consiste en B Actina.
-
- 4.
- El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se usan uno o más Marcadores.
-
- 5.
- El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el uno o más Marcadores adicionales incluye un Marcador por APC, TIMP, RASSF1A, RARB2, PTGS2 o 14-3-3.
-
- 6.
- El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que los reactivos para el uno o más Marcadores adicionales incluyen un miembro del grupo que consiste en las SEC ID Nº 26-35 y 44-53.
-
- 7.
- El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la muestra es tejido prostático.
-
- 8.
- El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la muestra es de orina, suero, plasma o células circulantes.
-
- 9.
- Una composición que comprende todos los miembros del grupo que consiste en SEC ID Nº 23-25.
-
- 10.
- Un kit para realizar un ensayo de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende: amplificación de ácido nucleico y que comprenden todos los miembros del grupo que consiste en por las SEC ID Nº 23-25.
-
- 11.
- El Kit de acuerdo con la reivindicación 10, en el que los reactivos de amplificación y detección son las SEC ID º 2325 junto con los reactivos seleccionados del grupo que consiste en las SEC ID Nº 36-43.
-
- 12.
- El Kit de acuerdo con la reivindicación 10, en el que los reactivos detectan la hipermetilación de GSTP1.
-
- 13.
- El Kit de acuerdo con la reivindicación 10, que además comprende reactivos para amplificar y detectar la presencia de un gen expresado de forma constitutiva.
-
- 14.
- El Kit de acuerdo con la reivindicación 10, que además comprende reactivos para amplificar y detectar la presencia de genes expresados de forma constitutiva.
-
- 15.
- El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende establecer una proporción de metilación y determinar si la proporción de metilación supera un valor de corte.
-
- 16.
- El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en monitorización de terapia.
-
- 17.
- El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en detección selectiva.
-
- 18.
- El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en resolver resultados ambiguos o indeterminados de ensayos de cáncer obtenidos usando procedimientos diferentes a los de la reivindicación 1.
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-
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