ES2388443T3 - Métodos y composiciones para inducir una respuesta inmune frente a VIH y modelos para ensayo - Google Patents

Abstract

Un polipéptido de la cubierta de VIH de clado C aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ IDNO:2.

Description

Métodos y composiciones para inducir una respuesta inmune frente a VIH y modelos para ensayo

ANTECEDENTES

El síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) es una amenaza sanitaria importante en todo el mundo. El VIH es la causa principal de SIDA. Hasta la fecha, no existen vacunas eficaces para el SIDA. Por estas razones, se están haciendo grandes esfuerzos para crear vacunas y modelos adecuados para ensayar las vacunas. Una diana de las vacunas terapéuticas es la proteína de la cubierta de VIH (gp160). Durante la infección, gp160 es escindida por las proteasas de la célula del huésped para formar gp120 y gp41. Barnett et al. (US2002/0146683) describe numerosos polipéptidos de la cubierta de VIH en los que al menos una de las configuraciones en lámina B nativas ha sido modificada. Se enseña que las construcciones se usan en las composiciones de vacuna. Vajdy et al. (US2005/0175631) enseña composiciones farmacéuticas para el tratamiento de SIDA en las que las composiciones tienen un antígeno de VIH y un adyuvante mucosal. WO 2005/028625 describe virus VIH de clado C y aplicaciones de éstos.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Se describen métodos y composiciones para incitar una respuesta inmune en un sujeto por la administración de un antígeno de VIH. Los antígenos de VIH incluyen polinucleótidos y polipéptidos de VIH de clado C, partículas virales VIH recombinantes y composiciones. Las partículas virales VIH recombinantes son particularmente útiles en modelos animales para estudiar VIH.

Los aspectos y realizaciones de la presente invención se presentan en las reivindicaciones adjuntas.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 representa un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la región consenso de la cubierta de VIH (SEQ ID NO:12) con las regiones de la cubierta de las cepas 1084i (SEQ ID NO:13), 1157ip de longitud completa (SEQ ID NO:2), 1157ip con deleciones en las regiones variables de la cubierta 1, 2 y 3 (SEQ ID NO:6) y 1157ip con deleciones en las regiones variables de la cubierta 1, 2, 3 y 4 (SEQ ID NO:8).

La Figura 2 representa un alineamiento de la secuencia de ácido nucleico de la región consenso de la cubierta de VIH (SEQ ID NO:14) con las regiones de la cubierta de las cepas 1084i (SEQ ID NO:15), 1157ip de longitud completa (SEQ ID NO:1), 1157ip con deleciones en las regiones variables de la cubierta 1, 2 y 3 (SEQ ID NO:5) y 1157ip con deleciones en las regiones variables de la cubierta 1, 2, 3 y 4 (SEQ ID NO:7).

La Figura 3 ilustra la actividad de anticuerpo neutralizante frente a SHIV-1157ip y SHIV89.6P.

La Figura 4 ilustra los recuentos de células T CD4+ y cargas de ARN viral en Monos Rhesus.

La Figura 5 ilustra la construcción de SHIV-1157ipd3.

La Figura 6 ilustra los niveles de expresión de luciferasa en construcciones con números crecientes de sitios NF-κB y replicación de SHIV-1157ipd3 frente a SHIV-1157ipd3N4.

La Figura 7a ilustra el uso de correceptor de SHIV-1157ipd3 y SHIV-1157ipd3N4.

Las Figuras 7b y c ilustran la neutralización del virus con varios nmAb humanos ampliamente reactivos: b12, 2G12, 2F5 y 4E10, y b12, 2G12, 2F5, 4E10 y 4X, respectivamente.

La Figura 8 representa la secuencia de nucleótidos de la región de la cubierta de la construcción designada 1157ip env (SEQ ID NO: 1).

La Figura 9 representa la secuencia de aminoácidos de la región de la cubierta de la construcción designada 1157ip env (SEQ ID NO: 2).

La Figura 10 representa la secuencia de nucleótidos de la región de la cubierta de la construcción designada 1157ipdv12 (SEQ ID NO: 3).

La Figura 11 representa la secuencia de aminoácidos de la región de la cubierta de la construcción designada 1157ipdv12 (SEQ ID NO: 4).

La Figura 12 representa la secuencia de nucleótidos de la región de la cubierta de la construcción designada 1157ipdv123 (SEQ ID NO: 5).

La Figura 13 representa la secuencia de aminoácidos de la región de la cubierta de la construcción designada 1157ipdv123 (SEQ ID NO: 6).

La Figura 14 representa la secuencia de nucleótidos de la región de la cubierta de la construcción designada 1157ipdv1234 (SEQ ID NO: 7).

La Figura 15 representa la secuencia de aminoácidos de la región de la cubierta de la construcción designada 1157ipdv1234 (SEQ ID NO: 8).

La Figura 16 representa la secuencia de nucleótidos de la región de la cubierta de la construcción designada 1157ipd3 (SEQ ID NO: 9).

La Figura 17 representa la secuencia de aminoácidos de la región de la cubierta de la construcción designada 1157ipd3 (SEQ ID NO: 10).

La Figura 18 representa la secuencia de aminoácidos de la región Nef de la construcción designada 1157ipd (SEQ ID NO: 11).

La Figura 19 es una ilustración de la estrategia de clonación para SHIV-1157i.

La Figura 20 es una ilustración de la viremia en macacos vacunados y control.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Definiciones

Tal y como se usa en la presente memoria, un “polinucleótido” se refiere a una secuencia de nucleótidos unida covalentemente (es decir, ribonucleótidos para ARN y desoxirribonucleótidos para ADN) en la que la posición 3’ de la pentosa de un nucleótido se une por un enlace fosfodiéster a la posición 5 de la pentosa del nucleótido siguiente. El término “polinucleótido” incluye polinucleótidos mono y bicatenarios. “Polinucleótido” también engloba un polinucleótido corto, referido frecuentemente como un oligonucleótido (por ejemplo, un cebador o una sonda). Un polinucleótido tiene un “extremo 5’” y un “extremo 3’” porque los enlaces fosfodiéster de los polinucleótidos se producen entre el carbono 5’ y el carbono 3’ del anillo de pentosa de los mononucleótidos sustituyentes. El extremo de un polinucleótido en el que una nueva unión sería en un carbono 5’ es su nucleótido 5’ terminal. El extremo de un polinucleótido en el que una nueva unión sería en su carbono 3’ es su nucleótido 3’ terminal. Tal y como se usa en la presente memoria, una secuencia de polinucleótido, incluso si es interna a un polinucleótido mayor (por ejemplo, una región de secuencia en un polinucleótido), también puede decirse que tiene extremos 5’ y 3’.

El término “polinucleótido” tal y como se emplea en la presente memoria engloba formas de un polinucleótido modificadas químicamente, enzimáticamente o metabólicamente. El término también captura secuencias que incluyen cualquiera de los análogos de base conocidos de ADN y ARN, e incluye modificaciones tales como deleciones, adiciones y sustituciones (generalmente de naturaleza conservativa) en la secuencia nativa, siempre que la molécula de ácido nucleico codifique una proteína terapéutica o antigénica. Las modificaciones de los polinucleótidos pueden tener varios efectos incluyendo, por ejemplo, facilitar la expresión del producto polipeptídico en una célula huésped.

Los polinucleótidos usados en la presente invención incluyen polinucleótidos que codifican un fragmento inmunogénico o derivado de éste. Dichos fragmentos inmunogénicos o derivados de éstos incluyen fragmentos que codifican un epítopo de célula B o un epítopo de célula T. Los polinucleótidos usados en la presente invención también incluyen polinucleótidos que codifican un gen env o partícula viral VIH recombinante.

Tal y como se usa en la presente memoria un “polipéptido” es una cadena molecular de aminoácidos y no se refiere a una longitud específica del producto. Así, los péptidos, dímeros de oligopéptidos, multímeros y semejantes están incluidos en la definición de polipéptido. Este término también se pretende que incluya polipéptido que ha sido sometido a modificaciones post-expresión tales como, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y semejantes. Además, para los propósitos de la presente invención, un “polipéptido” se refiere a una proteína que incluye modificaciones, tales como deleciones, adiciones y sustituciones (generalmente de naturaleza conservativa) en la secuencia nativa, siempre que la proteína mantenga la actividad deseada.

Tal y como se usa en la presente memoria, “aislado” quiere decir, cuando se refiere a un polinucleótido o un polipéptido, que la molécula indicada se separa y diferencia del organismo completo con el que la molécula se encuentra en la naturaleza o, cuando el polinucleótido o polipéptido no se encuentra en la naturaleza, está lo suficientemente libre de otras macromoléculas biológicas de manera que el polinucleótido o polipéptido puede usarse para su propósito pretendido.

Tal y como se usa en la presente memoria, “antígeno” se refiere a una molécula que contiene uno o más epítopos (bien lineales, conformacionales o ambos) que estimularán el sistema inmune de un huésped para obtener una respuesta específica de antígeno humoral y/o celular. El término se usa indistintamente con el término “inmunógeno”. Normalmente, un epítopo de célula B incluirá al menos aproximadamente 5 aminoácidos pero puede ser tan pequeño como 3-4 aminoácidos. Un epítopo de célula T, tal como un epítopo CTL, incluirá al menos aproximadamente 7-9 aminoácidos y un epítopo de célula T auxiliar al menos aproximadamente 12-20 aminoácidos. Normalmente, un epítopo incluirá entre aproximadamente 7 y 15 aminoácidos, tal como 9, 10, 12 ó 15 aminoácidos. El término “antígeno” indica tanto antígenos de subunidad (es decir, antígenos que están separados y diferenciados de un organismo completo con el que el antígeno está asociado en la naturaleza), así como bacterias, virus, hongos, parásitos muertos, atenuados o inactivados u otros microbios.

También para los propósitos de la presente descripción, un “antígeno” se refiere a una proteína que incluye modificaciones, tales como deleciones, adiciones y sustituciones (generalmente de naturaleza conservativa), de la secuencia nativa, siempre que la proteína mantenga la capacidad de incitar una respuesta inmunológica, como se define en la presente memoria. Los antígenos incluyen los polipéptidos de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10 y 11 y variantes de éstos.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término “que induce una respuesta inmune” frente a un antígeno o composición es el desarrollo en un sujeto de una respuesta inmune humoral y/o celular frente a un antígeno presente en la composición de interés. Una “respuesta inmune humoral” se refiere a una respuesta inmune mediada por moléculas de anticuerpo, mientras que una “respuesta inmune celular” es una mediada por linfocitos T y/o otras células sanguíneas blancas El antígeno de interés también puede incitar una respuesta inmune mediada por anticuerpos. Por lo tanto, una respuesta inmunológica puede incluir uno o más de los efectos siguientes: la producción de anticuerpos por las células B; y/o la activación de células T supresoras, citotóxicas o auxiliares y/o células T dirigidas específicamente a un antígeno o antígenos presentes en la composición o vacuna de interés. Estas respuestas pueden servir para neutralizar la infectividad y/o mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo-complemento o anticuerpo (ADCC) para proporcionar protección a un huésped inmunizado. Dichas respuestas pueden determinarse usando inmunoensayos y ensayos de neutralización estándar, muy conocidos en la técnica.

Una respuesta inmune celular implica una respuesta específica de antígeno por células T citotóxicas (“CTL”). Las CTL tienen especificidad para antígenos peptídicos que se presentan en asociación con proteínas codificadas por el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y se expresan en las superficies de las células. Las CTL ayudan a inducir y estimular la destrucción de microbios intracelulares o la lisis de células infectadas con dichos microbios. Otro aspecto de la inmunidad celular implica una respuesta específica de antígeno por las células T auxiliares. Las células T auxiliares actúan para ayudar a estimular la función, y centrar la actividad de, células efectoras específicas, tales como células B y plasmáticas así como células T citotóxicas, frente a células que presentan antígenos peptídicos en asociación con moléculas de MHC en su superficie. Una “respuesta inmune celular” también se refiere a la producción de citoquinas, quimioquinas y otras moléculas como éstas producidas por células T activadas y/o otras células sanguíneas blancas, incluyendo las derivadas de células T CD4+ y CD8+. Además, una respuesta de quimioquinas también puede inducirse por varias células sanguíneas blancas o endoteliales en respuesta a un antígeno administrado.

Una composición o vacuna que incita una respuesta inmune celular puede servir para sensibilizar a un sujeto vertebrado por la presentación de un antígeno en asociación con moléculas de MHC en la superficie celular. La respuesta inmune mediada por células está dirigida a, o cerca de, células que presentan el antígeno en su superficie. Además, los linfocitos T específicos de antígeno pueden generarse para permitir la protección futura de un huésped inmunizado.

Una respuesta inmunológica mediada por células puede determinarse por varios ensayos conocidos en la técnica incluyendo, ensayos de linfoproliferación (activación de linfocitos), ensayos de células citotóxicas CTL, o ensayando para linfocitos T específicos para el antígeno en un sujeto sensibilizado. Dichos ensayos son muy conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Erickson et al., J. Immunol. (1993) 151: 4189-4199; Doe et al., Eur. J. Immunol. (1994)

24: 2369-2376. La respuesta inmune mediada por células también puede determinase por la medida de citoquinas intracelulares o secreción de citoquinas por poblaciones de células T (por ejemplo, por la técnica ELISPOT) o por la medida de células T específicas de epítopo (por ejemplo, por la técnica del tetrámero) (revisada por McMichael, A. J., y O’Callaghan, C. A., J. Exp. Med. 187(9): 1367-1371, 1998; Mcheyzer-Williams, M. G., et al., Immunol. Rev. 150: 5-21, 1996; Lalvani, A., et al., J. Exp. Med. 186: 859-865, 1997).

Tal y como se usan en la presente memoria, los términos “polipéptido Env” o “polipéptido de la cubierta” se refieren a una molécula derivada de una proteína de la cubierta, por ejemplo, de HIV Env (SEQ ID NO:2 o variantes de ésta). La proteína de la cubierta de VIH-1 es una glicoproteína de aproximadamente 160 kd (gp160). Durante la infección de la célula huésped por el virus, gp160 es escindida por las proteasas de la célula huésped para formar gp120 y la proteína de membrana integral, gp41. La parte gp41 están anclada en (y abarca) la bicapa de la membrana del virión, mientras que el segmento gp120 sobresale en el entorno circundante. Como no existe una unión covalente entre gp120 y gp41, gp120 libre se libera de la superficie de los viriones e infecta a las células. Los polipéptidos Env también pueden incluir polipéptidos gp140. Los polipéptidos Env pueden existir como monómeros, dímeros o multímeros.

Tal y como se usa en la presente memoria, un “polipéptido gp120” quiere decir una molécula derivada de una región gp120 del polipéptido Env. La secuencia primaria de aminoácidos de gp120 tiene aproximadamente 511 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos de gp120 contiene cinco dominios relativamente conservados interrumpidos por cinco dominios variables. Los dominios variables contienen sustituciones, inserciones y deleciones extensas de aminoácidos. Un “polipéptido gp120” incluye tanto subunidades únicas como multímeros.

Un “polipéptido Env” o “polipéptido gp120” como se define en la presente memoria no está limitado a un polipéptido que tiene la secuencia exacta descrita en la presente memoria, sino que incluye proteínas que tienen

Además, el término “polipéptido Env” (por ejemplo, “polipéptido gp120”) engloba proteínas que incluyen modificaciones adicionales en la secuencia nativa, tales como deleciones, adiciones y sustituciones internas adicionales. Estas modificaciones pueden ser intencionadas, como mediante mutagénesis dirigida a sitio, o pueden ser accidentales, tales como mediante eventos mutacionales naturales. Así, por ejemplo, el polipéptido Env que se va a usar en las composiciones de vacuna, las modificaciones deben ser tales que la actividad inmunológica (es decir, la capacidad de incitar una respuesta de anticuerpos frente al polipéptido) no se pierda.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término “polipéptido Env modificado” es un polipéptido Env (por ejemplo, gp120 como se ha definido anteriormente), que se ha manipulado para delecionar o reemplazar todo o una parte de las regiones variables V1, V1/V2, V1-V3 o V1-V4. Generalmente, los polipéptidos Env modificados (por ejemplo, gp120) tienen eliminado lo suficiente de las regiones variables como para exponer el sitio de unión CD4, pero dejan lo suficiente de la estructura como para permitir el plegamiento correcto. Aunque en la presente memoria no se han ejemplificado todas las modificaciones posibles de la región variable, debe entenderse que pueden considerarse otras modificaciones. El polipéptido Env modificado puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, 6, 8 ó 10. El polipéptido Env modificado está codificado por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3, 5, 7 ó 9 o una variante de ésta.

Una variante de un “polipéptido Env modificado” o “polipéptido Env” tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a una secuencia de aminoácidos que está alterada por uno o más aminoácidos. La variante puede tener cambios “conservativos”, en los que un aminoácido sustituido tiene propiedades estructurales o químicas similares, por ejemplo, el reemplazo de leucina con isoleucina. Más raramente, una variante puede tener cambios “no conservativos”, por ejemplo, el reemplazo de una glicina con un triptófano. Las variaciones menores similares también pueden incluir deleciones o inserciones de aminoácidos, o ambas siempre que la variante sea capaz de inducir una respuesta inmune. La guía para determinar qué residuos de aminoácidos pueden sustituirse, insertarse o delecionarse sin suprimir la actividad biológica o inmunológica puede encontrarse usando programas informáticos muy conocidos en la técnica, por ejemplo, software DNASTAR. Las variantes de la presente invención incluyen “polipéptidos Env modificados” o “polipéptidos Env” que son al menos 80%, preferiblemente 85%, más preferiblemente 90%, incluso más preferiblemente 95% y lo más preferiblemente 96%, 97%, 98% ó 99% homólogos a una secuencia de aminoácidos de referencia.

“VIH” es el Virus de la Inmunodeficiencia Humana, un virus que causa inmunodeficiencia atacando a las células CD4+ en el cuerpo. La presente invención está centrada principalmente en VIH clado C. VIH está organizado en grupos y subtipos (clados). La guía para la aplicación de la invención a diferentes clados también puede encontrarse en HIV Sequence Compendium 2002 Kuiken C, Foley B, Freed E, Hahn B, Marx P, McCutchan F, Mellors J, Wolinsky S, y Korber B, editores. Publicado por el Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, LA-UR número 03-364. En particular, los datos de la secuencia consenso para los clados de VIH-1 A, B, C y D y un número para los aislados puede encontrarse en las páginas 490 a 550; los datos de la secuencia consenso para los clados de VIH-2 A, B, C y D y un número de aislados puede encontrarse en las páginas 554 a

578.

En una realización de la descripción, el polipéptido env del clado c de VIH está codificado por la secuencia de polinucleótido de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 ó 9 o una variante de ésta. En otras realizaciones de la descripción, el polipéptido env del clado C de VIH tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 ó 10 o una variante de ésta.

Se describen métodos y composiciones para incitar una respuesta inmune en un sujeto mediante la administración de un antígeno VIH. Los antígenos VIH incluyen los polinucleótidos y polipéptidos del clado C de VIH. También se describen métodos y composiciones para tratar o prevenir una infección por VIH.

Los términos “prevenir”, “que previene” y “prevención”, tal y como se usan en la presente memoria, se refieren a una disminución en la aparición de VIH en un animal. La prevención puede ser completa, por ejemplo, la ausencia total de VIH en un sujeto. La prevención también puede ser parcial, de manera que la aparición de VIH en un sujeto es menor de la que habría ocurrido sin la presente invención.

También se describe un método para inducir una respuesta inmune en un sujeto que comprende administrar un polipéptido de la cubierta del clado C de VIH en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmune en el sujeto. En una realización, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. El polipéptido de la cubierta del clado C de VIH puede estar modificado de manera que la región V1 está delecionada. El polipéptido de la cubierta del clado C de VIH puede estar modificado de manera que las regiones V1/V2 están delecionadas. En una posibilidad más adicional, el polipéptido puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. El polipéptido de la cubierta del clado C de VIH puede estar modificado de manera que las regiones V1, V2 y V3 están delecionadas. En una posibilidad más adicional, el polipéptido puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. El polipéptido de la cubierta del clado C de VIH puede estar modificado de manera que las regiones V1, V2, V3 y V4 están delecionadas. El polipéptido puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. El método puede incluir además la administración de un segundo antígeno VIH. El segundo antígeno VIH incluye gp120 y gp160.

También se describe un método para inducir una respuesta inmune en un sujeto que comprende administrar un polinucleótido que codifica un polipéptido de la cubierta del clado C de VIH en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmune en el sujeto. El polinucleótido puede comprender la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:

1. La región del polinucleótido que codifica la región V1 del polipéptido de la cubierta del clado C de VIH puede estar modificada de manera que la región V1 está delecionada. La región del polinucleótido que codifica las regiones V1/V2 del polipéptido de la cubierta del clado C de VIH puede estar modificada de manera que las regiones V1/V2 están delecionadas. El polinucleótido puede comprender la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3. Las regiones del polinucleótido que codifican las regiones V1, V2 y V3 del polipéptido de la cubierta del clado C de VIH pueden estar modificadas de manera que las regiones V1, V2 y V3 están delecionadas. El polinucleótido puede comprender la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5. La región del polinucleótido que codifica las regiones V1, V2, V3 y V4 del polipéptido de la cubierta del clado C de VIH puede estar modificada de manera que las regiones V1, V2, V3 y V4 están delecionadas. El polinucleótido puede comprender la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7. El método puede incluir además la administración de un segundo antígeno VIH. El segundo antígeno VIH incluye gp120 y gp160.

Se describen polipéptidos de la cubierta del clado C de VIH aislados y modificados. También se describe un polipéptido de la cubierta de VIH aislado. En una realización de la invención, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

Se describe un polipéptido de la cubierta del clado C de VIH modificado en el que la región V1 está delecionada y un polipéptido de la cubierta del clado C de VIH modificado en el que las regiones V1/V2 están delecionadas. En una realización de la invención, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. También se describe un polipéptido de la cubierta del clado C de VIH modificado en el que las regiones V1, V2 y V3 están delecionadas. En una realización de la invención, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Se describe un polipéptido de la cubierta del clado C de VIH modificado en el que las regiones V1, V2, V3 y V4 están delecionadas. En una realización de la invención, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

Se describen polinucleótidos aislados y modificados que codifican un polipéptido de la cubierta de VIH. También se describe un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de la cubierta del clado C de VIH. En una realización de la invención, el polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1. La región del polinucleótido que codifica la región V1 del polipéptido de la cubierta del clado C de VIH puede estar modificada de manera que la región V1 está delecionada. Las regiones del polinucleótido que codifican las regiones V1/V2 del polipéptido de la cubierta del clado C de VIH pueden estar modificadas de manera que las regiones V1/V2 están delecionadas. En una realización de la invención más adicional, el polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3. Las regiones del polinucleótido que codifican las regiones V1, V2 y V3 del polipéptido de la cubierta del clado C de VIH pueden estar modificadas de manera que las regiones V1, V2 y V3 están delecionadas. En una realización de la invención más adicional, el polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5. Las regiones del polinucleótido que codifican las regiones V1, V2, V3 y V4 del polipéptido de la cubierta del clado C de VIH pueden estar modificadas de manera que las regiones V1, V2, V3 y V4 están delecionadas. En una realización de la invención más adicional, el polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7.

La invención también proporciona vectores y composiciones que incluyen los polinucleótidos y polipéptidos de la cubierta del clado C de VIH de la invención.

En otro aspecto, la invención proporciona una partícula viral VIH recombinante que tiene una región de la cubierta 1157ipd que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 9. En otro aspecto, la invención proporciona una partícula viral VIH recombinante que incluye una región de la cubierta 1157 ipd3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. En cualquiera de los dos últimos aspectos, la partícula viral VIH recombinante puede incluir además la secuencia de aminoácidos de Nef de SEQ ID NO: 11. En realizaciones adicionales de la invención, la partícula viral recombinante tiene dos o más regiones NF-κB. Las partículas virales VIH recombinantes pueden estar incluidas en una composición y pueden usarse en un método para evaluar la eficacia de una vacuna de SIDA candidata en un sujeto. El método incluye las etapas de administrar una vacuna de SIDA candidata a un primate no humano, infectar al primate no humano con la partícula viral y detectar la progresión de la enfermedad.

Polipéptidos y polinucleótidos de la invención

Un polinucleótido de la presente invención puede emplearse para producir un polipéptido por técnicas recombinantes. Dicho polipéptido puede ser útil, por ejemplo, como un antígeno para la inducción de una respuesta inmune o como un reactivo para la purificación por afinidad de dicho anticuerpo.

En una realización, los polipéptidos se generan usando técnicas recombinantes, muy conocidas en la técnica. A este respecto, pueden considerarse sondas oligonucleotídicas basadas en las secuencias conocidas del genoma del polipéptido Env y usarse para sondar bibliotecas genómicas o de ADNc para genes Env. El gen puede aislarse además usando técnicas estándar y, por ejemplo, enzimas de restricción empleadas para truncar el gen en partes deseadas de la secuencia de longitud completa. De manera similar, el o los genes Env pueden aislarse directamente de las células y tejidos que contienen el mismo, usando técnicas conocidas, tales como extracción con fenol y la secuencia manipularse además para producir los truncamientos deseados. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., supra, para una descripción de las técnicas usadas para obtener y aislar ADN.

Los genes que codifican los polipéptidos Env (por ejemplo, longitud completa y deleción de la región variable) pueden producirse sintéticamente, tomando como base las secuencias conocidas, por ejemplo, secuencias descritas en la presente memoria. La secuencia de nucleótidos puede diseñarse con los codones apropiados para la secuencia de aminoácidos deseada particular. La secuencia completa se ensambla generalmente a partir de oligonucleótidos superpuestos preparados por métodos estándar y ensamblados en una secuencia codificadora completa. Véanse, por ejemplo, Edge (1981) Nature 292: 756; Nambair et al. (1984) Science 223: 1299; Jay et al. (1984) J. Biol. Chem. 259: 6311; Stemmer et al. (1995) Gene 164: 49-53.

Las técnicas recombinantes se usan fácilmente para clonar un gen que codifica un gen de polipéptido Env que puede mutagenizarse in vitro por el reemplazo del o de los pares de bases apropiados para resultar en el codón para el aminoácido deseado. Dicho cambio puede incluir tan poco como un par de bases, que produce un cambio en un único aminoácido, o puede englobar varios cambios de pares de bases. Alternativamente, las mutaciones pueden producirse usando un cebador con emparejamiento erróneo que hibrida con la secuencia de nucleótidos parental (generalmente ADNc correspondiente a la secuencia de ARN), a una temperatura por debajo de la temperatura de fusión del dúplex con emparejamiento erróneo. El cebador puede hacerse específico manteniendo la longitud del cebador y la composición de bases en límites relativamente estrechos y manteniendo la base mutante localizada de forma centrada. Véanse, por ejemplo, Innis et al, (1990) PCR Applications: Protocols for Functional Genomics; Zoller y Smith, Methods Enzymol. (1983) 100: 468. La extensión con cebador se produce usando ADN polimerasa, clonándose el producto y seleccionándose los clones que contienen el ADN mutado, derivado por segregación de la cadena extendida por cebador. La selección puede conseguirse usando el cebador mutante como una sonda de hibridación. La técnica también es aplicable para generar múltiples mutaciones puntuales. Véase, por ejemplo, Dalbie-McFarland et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79: 6409.

Una vez que las secuencias codificadoras para las proteínas deseadas se han aislado o sintetizado, pueden clonarse en cualquier vector o replicón adecuado para expresión. Puede generarse una amplia variedad de vectores que codifican polipéptidos modificados creando construcciones de expresión que unen de manera operativa los polinucleótidos de la invención. La construcción se introduce en una célula huésped para la expresión del polipéptido. Los ejemplos no limitativos de dichas combinaciones se discuten en los Ejemplos.

Numerosos vectores de clonación son conocidos para los expertos en la técnica y la selección de un vector de clonación apropiado es un objeto de elección. Los ejemplos de vectores de ADN recombinantes para la clonación y las células huésped que puedan ser transformadas por éstos incluyen el bacteriófago lambda (E. coli), pBR322 (E. coli), pACYC177 (E. coli), pKT230 (bacterias gram-negativas), pGV1106 (bacterias gram-negativas), pLAFR1 (bacterias gram-negativas), pME290 (bacterias gram-negativas no E. coli), pHV14 (E. coli y Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptomyces), YIp5 (Saccharomyces), YCp19 (Saccharomyces) y virus del papiloma bovino (células de mamíferos). Véase, generalmente, DNA Cloning: Vols. I y II, supra; Sambrook et al., supra; B. Perbal, supra.

Los sistemas de expresión de células de insecto, tales como los sistemas de baculovirus, también pueden usarse y son conocidos para los expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Summers y Smith, Texas Agricultural Exeriment Station Bulletin No. 1555 (1987). Los materiales y métodos para los sistemas de expresión de baculovirus/células de insecto están disponibles comercialmente en forma de kit, entre otros, de Invitrogen, San Diego Calif. (kit “MaxBac”).

Los sistemas virales, tales como un sistema de infección/transfección basado en vaccinia, como se describe en Tomei et al., J. Virol. (1993) 67: 4017-4026 y Selby et al., J. Gen. Virol. (1993) 74: 1103-1113, encontrarán también uso con la presente invención. En este sistema, las células se transfectan en primer lugar in vitro con un virus vaccinia recombinante que codifica la ARN polimerasa del bacteriófago T7. Después de la infección, las células se transfectan con el ADN de interés, dirigido por un promotor T7. La polimerasa expresada en el citoplasma del virus vaccinia recombinante transcribe el ADN transfectado en ARN que se traduce en proteína por la maquinaria de traducción del huésped. El método proporciona un alto nivel de producción transitoria, citoplásmica de grandes cantidades de ARN y su o sus productos de traducción.

El gen puede ponerse bajo el control de un promotor, sitio de unión a ribosoma (para la expresión bacteriana) y, opcionalmente, un operador (referidos colectivamente en la presente memoria como elementos de “control”), de manera que la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de la cubierta del clado C de VIH deseado se transcribe en ARN en la célula huésped transformada por un vector que contiene esta construcción de expresión. La secuencia codificadora puede contener o no un péptido señal o secuencia líder. Con la presente invención, pueden usarse tanto los péptidos señal naturales como las secuencias heterólogas. Las secuencias líder pueden eliminarse por el huésped en el procesamiento post-traducción. Véase, por ejemplo, las Pat. U.S. Nos. 4.431.739; 4.425.437;

4.338.397. Dichas secuencias incluyen, pero no están limitadas a, el líder TPA, así como la secuencia señal de la melitina de abeja.

Otras secuencias reguladoras también pueden ser deseables para permitir la regulación de la expresión de las secuencias proteicas relativas al crecimiento de la célula huésped. Dichas secuencias reguladoras son conocidas para los expertos en la técnica y los ejemplos incluyen aquellas que causan que la expresión de un gen se active o inactive en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Otros tipos de elementos reguladores también pueden estar presentes en el vector, por ejemplo, secuencias amplificadoras.

Las secuencias control y otras secuencias reguladoras pueden ligarse a la secuencia codificadora antes de la inserción en un vector. Alternativamente, la secuencia codificadora puede clonarse directamente en un vector de expresión que ya contiene las secuencias control y un sitio de restricción apropiado.

En algunos casos puede ser necesario modificar la secuencia codificadora de manera que pueda unirse a las secuencias control con la orientación apropiada; es decir, para mantener el marco de lectura apropiado. Los mutantes o análogos pueden prepararse por la deleción de una parte de la secuencia que codifica la proteína, por inserción de una secuencia, y/o por sustitución de uno o más nucleótidos en la secuencia. Las técnicas para modificar las secuencias de nucleótidos, tales como mutagénesis dirigida a sitio, son muy conocidas para los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., supra; DNA Cloning, Vols. I y II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

El vector de expresión se usa entonces para transformar una célula huésped apropiada. Se conocen en la técnica varias líneas celulares de mamíferos e incluyen líneas celulares inmortalizadas de la American Type Culture Collection (ATCC), tales como, pero no limitadas a, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células Vero293, así como otras. De manera similar, los huésped bacterianos tales como E. coli, Bacillus subtilis y Streptococcus sp., encontrarán uso con las presentes construcciones de expresión. Los huésped de levadura útiles en la presente invención incluyen entre otros, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe y Yarrowia lipolytica. Las células de insecto para usarse con vectores de expresión baculovirus incluyen, entre otras, Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda y Trichoplusia ni.

Dependiendo del sistema de expresión y del huésped seleccionado, las proteínas de la presente invención se producen por células huésped que crecen transformadas por un vector de expresión descrito anteriormente bajo condiciones en las que la proteína de interés se expresa. La selección de las condiciones de crecimiento apropiadas está dentro de la experiencia en la técnica.

En una realización, las células transformadas secretan el producto polipeptídico en el medio circundante. Determinadas secuencias reguladoras pueden incluirse en el vector para aumentar la secreción del producto proteico, por ejemplo usando una secuencia líder del activador de plasminógeno tisular (TPA), una secuencia señal de interferón gamma u otras secuencias peptídicas señal de proteínas secretoras conocidas. El producto polipeptídico secretado puede aislarse por varias técnicas descritas en la presente memoria, por ejemplo, usando técnicas de purificación estándar tales como, pero no limitadas a, resinas de hidroxiapatito, cromatografía en columna, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño, electroforesis, HPLC, técnicas inmunoadsorbentes, cromatografía de afinidad, inmunoprecipitación y semejantes.

Alternativamente, las células transformadas se rompen usando medios químicos, físicos o mecánicos, que lisan las células manteniendo todavía el polipéptido de la cubierta del clado C de VIH sustancialmente intacto. Las proteínas intracelulares también pueden obtenerse eliminando componentes de la pared o membrana celular, por ejemplo, por el uso de detergentes o disolventes orgánicos, de manera que se produzca la salida de los polipéptidos Env. Dichos métodos son conocidos para los expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Protein Purification Applications: A Practical Approach, (E. L. V. Harris y S. Angal, Eds., 1990).

Por ejemplo, los métodos para romper células para usarse con la presente invención incluyen ero no están limitados

a: sonicación o ultrasonicación; agitación; extrusión líquida o sólida; tratamiento con calor; liofilización; desecado; decompresión explosiva; choque osmótico; tratamiento con enzimas líticas incluyendo proteasas tales como tripsina, neuraminidasa y lisozima; tratamiento con álcali; y el uso de detergentes y disolventes tales como sales biliares, dodecilsulfato de sodio, Tritón, NP40 y CHAPS. La técnica particular usada para romper las células es en gran medida un objeto de elección y dependerá del tipo de célula en la que se expresa el polipéptido, condiciones de cultivo y cualquier pre-tratamiento usado.

Después de la rotura de las células, se eliminan los restos celulares, generalmente por centrifugación, y los polipéptidos Env producidos intracelularmente se purifican mas, usando técnicas de purificación estándar tales como pero no limitadas a, cromatografía en columna, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño, electroforesis, HPLC, técnicas inmunoadsorbentes, cromatografía de afinidad, inmunoprecipitación y semejantes.

Por ejemplo, un método para obtener los polipéptidos de la cubierta del clado C de VIH intracelulares de la presente invención implica la purificación por afinidad, tal como por cromatografía de inmunoafinidad usando anticuerpos anti-Env específicos o por cromatografía de afinidad de lectina. Las resinas de lectina particularmente preferidas son aquellas que reconocen restos de manosa tales como pero no limitadas a resinas derivadas de la aglutinina de Galanthus nivalis (GNA), aglutinina de Lens culinaris (LCA o lectina de lenteja), aglutinina de Pisum sativum (PSA o lectina de guisante), aglutinina de Narcissus pseudonarcissus (NPA) y aglutinina de Allium ursinum (AUA). La elección de una resina de afinidad adecuada está dentro de la experiencia en la técnica. Después de la purificación por afinidad, los polipéptidos Env pueden purificarse más usando técnicas convencionales muy conocidas en la técnica, tales como por cualquiera de las técnicas descritas anteriormente.

Los polipéptidos relativamente pequeños, es decir, con una longitud de hasta aproximadamente 50 aminoácidos, pueden sintetizarse químicamente convenientemente, por ejemplo, por cualquiera de varias técnicas que son conocidas para los expertos en la técnica de péptidos. En general, estos métodos emplean la adición secuencial de uno o más aminoácidos a una cadena peptídica creciente. Normalmente, bien el grupo amino o carboxilo del primer aminoácido se protege con un grupo protector adecuado. El aminoácido protegido o derivatizado puede unirse a un soporte sólido inerte o utilizarse en disolución añadiendo el siguiente aminoácido en la secuencia que tiene el grupo complementario (amino o carboxilo) protegido adecuadamente, bajo condiciones que permiten la formación de una unión amida. El grupo protector se elimina del residuo de aminoácido recién añadido y se añade el siguiente aminoácido (protegido adecuadamente) y así sucesivamente. Después de que los aminoácidos deseados se han unido en la secuencia apropiada, se eliminan cualesquiera grupos protectores restantes (y cualquier soporte sólido, si se usan técnicas de síntesis en fase sólida) secuencialmente o simultáneamente, para rendir el polipéptido final. Por la modificación simple de este procedimiento general, es posible añadir más de un aminoácido a la vez a una cadena en crecimiento, por ejemplo, acoplando (bajo condiciones que no racemizan centros quirales) un tripéptido protegido con un dipéptido protegido apropiadamente para formar, después de desprotección, un pentapéptido. Véanse, por ejemplo, J. M. Stewart y J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce Chemical Co., Rockford,

III. 1984) y G. Barany y R. B. Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, editores E. Gross y J. Meienhofer, Vol. 2, (Academic Press, Nueva York, 1980), p. 3-254, para técnicas de síntesis de péptidos en fase sólida; y M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, (Springer-Verlag, Berlín 1984) y E. Gross y J. Meienhofer, Eds., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 1, para síntesis en disolución clásica.

Los polipéptidos de la presente invención también pueden prepararse químicamente por otros métodos tales como por el método de síntesis peptídica múltiple simultánea. Véanse, por ejemplo, Houghten Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: 5131-5135; Pat. U.S. No. 4.631.211.

Preparaciones farmacéuticas

En una realización, los antígenos de la invención están presentes en preparaciones farmacéuticas. Generalmente, están en la forma de un polipéptido que puede prepararse por los distintos métodos descritos en la presente memoria y conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, los antígenos se proporcionan como polinucleótidos que codifican el antígeno.

Los polipéptidos de la cubierta del clado C de VIH y los polinucleótidos que los codifican son útiles, por ejemplo, como composiciones de vacuna. Las composiciones de la invención pueden usarse como composiciones de vacuna, por ejemplo, para aumentar o inducir una respuesta inmune de un sujeto frente a un VIH. Las respuestas inmunes que pueden aumentarse o inducirse incluyen tanto respuestas humorales como mediadas por células. Las composiciones que comprenden preparaciones particulares de moléculas de la cubierta del clado C de VIH pueden ensayarse para la capacidad de inducir una respuesta inmune usando ensayos muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, una composición puede inyectarse en un animal de laboratorio, tal como una rata o ratón, y el animal puede monitorizarse para la aparición de reactantes inmunes, tales como anticuerpos, dirigidos frente al polipéptido Env. Alternativamente, pueden realizarse ensayos tales como ensayos de linfocitos T citotóxicos para determinar si una composición particular de molécula Env es inmunogénica.

Para usarse como una vacuna, una composición de la invención comprende un polipéptido de la cubierta del clado C de VIH o un polipéptido de la cubierta del clado C de VIH como se define en las reivindicaciones. Las composiciones de vacuna de la invención comprenden típicamente un vehículo fisiológicamente compatible. Los vehículos fisiológicamente compatibles son muy conocidos para los expertos en la técnica. Dichos vehículos incluyen, pero no están limitados a, una disolución simple con bajo contenido en sal que permite la conservación de la integridad del polipéptido Env, por ejemplo, 10 mM NaCl, 0,1 mM EDTA o macromoléculas grandes que se metabolizan lentamente tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas de virus inactivas. Las sales farmacéuticamente aceptables también pueden usarse en las composiciones de Env, por ejemplo, sales minerales tales como hidrocloruros, hidrobromuros, fosfatos, o sulfatos, así como sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos o benzoatos. Las composiciones de la invención también pueden contener líquidos, tales como agua, disolución salina, glicerol, y etanol, así como sustancias tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes o agentes tamponadores del pH.

Pueden usarse varios métodos para administrar una composición de vacuna de molécula de la cubierta del clado C de VIH a un ser humano, incluyendo inyección intravenosa, intramuscular o subcutánea. Las composiciones de vacuna de la invención se administran a una dosis eficaz para inducir una respuesta inmune frente al polipéptido Env. Las dosificaciones particulares de la composición usadas para aumentar una respuesta inmune variarán, por ejemplo, según las composiciones de Env que se están usando y del mamífero al que se administra la composición. Generalmente, aproximadamente 5ug a aproximadamente 50 ug de polipéptido Env por kg de peso corporal del paciente, aproximadamente 50ug a aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 100ug a aproximadamente 500ug/kg o aproximadamente 200 a aproximadamente 250ug/kg se administrarán a un adulto humano. Dichos intervalos no evitan de ninguna manera el uso de una cantidad más alta o más baja de un componente, como podría garantizarse en una aplicación particular. Por ejemplo, la dosis y esquema real puede variar dependiendo de si las composiciones se administran en combinación con otras composiciones farmacéuticas, o dependiendo de diferencias individuales en farmacocinética, disposición del fármaco y metabolismo.

Los antígenos y/o adyuvantes de la invención también pueden administrarse usando uno o más vectores génicos, administrados mediante la inmunización con ácidos nucleicos o semejantes usando protocolos de administración génica estándar. Los métodos para la administración génica son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las Pat. U.S. Nos. 5.399.346, 5.580.859, 5.589.466. Las construcciones pueden administrarse bien por vía subcutánea, epidérmica, intradérmica, intramuscular, intravenosa, mucosal (tal como nasal, rectal y vaginal), intraperitoneal, oral

o combinación de éstas.

Un vehículo de administración génica deficiente en replicación ejemplar que puede usarse en la práctica de la presente invención es cualquiera de los vectores alfavirus, descritos, por ejemplo, en las Pat. U.S. Nos. 6.342.372;

6.329.201 y en la Publicación Internacional WO 01/92552.

Se han desarrollado varios sistemas basados en virus para la transferencia génica en células de mamíferos. Por ejemplo, los retrovirus proporcionan una plataforma conveniente para los sistemas de administración génica. Las secuencias seleccionadas pueden insertarse en un vector y empaquetarse en partículas retrovirales usando técnicas conocidas en la técnica. Los virus recombinantes pueden aislarse y administrarse a células del sujeto bien in vivo o ex vivo. Se han descrito varios sistemas retrovirales (Pat. U.S. No. 5.219.740; Miller y Rosman, BioTechniques (1989) 7: 980-990; Miller, A. D., Human Gene Therapy (1990) 1: 5-14; Scarpa et al., Virology (1991) 180: 849-852; Burns et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 8033-8037; y Boris-Lawrie y Temin, Cur. Opin. Genet. Develop. (1993) 3: 102-109.

También se han descrito varios vectores de adenovirus. A diferencia de los retrovirus que se integran en el genoma del huésped, los adenovirus persisten extracromosómicamente minimizando así los riesgos asociados con la mutagénesis insercional (Haj-Ahmad y Graham, J. Virol. (1986) 57: 267-274; Bett et al., J. Virol. (1993) 67: 59115921; Mittereder et al., Human Gene Therapy (1994) 5: 717-729; Seth et al., J. Virol. (1994) 68: 933-940; Barr et al., Gene Therapy (1994) 1: 51-58; Berkner, K. L. BioTechniques (1988) 6: 616-629; y Rich et al., Human Gene Therapy (1993) 4: 461-476).

Además, se han desarrollado varios sistemas de vectores de virus adeno-asociados (AAV) para la administración génica. Los vectores AAV pueden construirse fácilmente usando técnicas muy conocidas en la técnica. Véanse, por ejemplo, las Pat. U.S. Nos. 5.173.414 y 5.139.941; las Publicaciones Internacionales Nos. WO 92/01070 (publicada el 23 de enero, 1992) y WO 93/03769 (publicada el 4 de marzo, 1993); Lebkowski et al., Molec. Cell. Biol. (1988) 8: 3988-3996; Vincent et al., Vaccines 90 (1990) (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B. J. Current Opinion in Biotechnology (1992) 3: 533-539; Muzyczka, N. Current Topics in MIcrobiol. and Immunol. (1992) 158: 97-129; Kotin, R. M. Human Gene Therapy (1994) 5: 793-801; Shelling y Smith, Gene Therapy (1994) 1: 165-169; y Zhou et al., J. Exp. Med. (1994) 179: 1867-1875.

Otro sistema de vector útil para administrar polinucleótidos, por vía mucosal y de otra manera, es las vacunas de poxvirus recombinantes administradas por vía entérica descritas por Small, Jr., P. A. et al. (Pat. U.S. No. 5.676.950, presentada el 14 de octubre, 1997) así como el virus vaccinia y los poxvirus aviares. Como ejemplo, el virus vaccinia recombinante que expresa los genes puede construirse como sigue. El ADN que codifica los antígenos y/o los adyuvantes de la invención se inserta en primer lugar en un vector apropiado de manera que está adyacente a un promotor de vaccinia y secuencias de ADN de vaccinia flanqueantes, como la secuencia que codifica la timidina quinasa (TK). Este vector se usa para transfectar células que se infectan simultáneamente con vaccinia. La recombinación homóloga sirve para insertar el promotor de vaccinia más el gen que codifica las secuencias codificadoras de interés en el genoma viral. El recombinante TK resultante puede seleccionarse cultivando las células en presencia de 5-bromodesoxiuridina y eligiendo las placas virales resistentes a ésta.

Alternativamente, los poxvirus aviares, tales como los virus de la viruela aviar y viruela del canario, también pueden usarse para administrar genes que codifican los antígenos y/o adyuvantes de la invención. Los virus avipox recombinantes, que expresan inmunógenos de patógenos de mamíferos, se sabe que confieren una inmunidad protectora cuando se administran a especies no aviares; El uso de un vector avipox es particularmente deseable en el ser humano y otras especies de mamíferos ya que los miembros del género avipox sólo pueden replicarse productivamente en especies aviares susceptibles y por lo tanto no son infectivos en células de mamífero. Los métodos para producir virus avipox recombinantes son conocidos en la técnica y emplean la recombinación genética, como se ha descrito anteriormente respecto a la producción de virus vaccinia. Véanse, por ejemplo, WO 91/12882; WO 89/03429; y WO 92/03545. Los vectores derivados de picornavirus también pueden usarse (Véanse, por ejemplo, las Pat. U.S. Nos. 5.614.413 y 6.063.384). Los vectores de conjugados moleculares, tales como los vectores quiméricos de adenovirus descritos en Michael et al., J. Biol. Chem. (1993) 268: 6866-6869 y Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 6099-6103, también pueden usarse para la administración génica.

Un sistema de infección/transfección basado en vaccinia puede usarse convenientemente para proporcionar una expresión inducible, transitoria de las secuencias codificadoras de interés (por ejemplo, secuencias que codifican los antígenos o adyuvantes de la invención) en una célula huésped. En este sistema, las células se infectan en primer lugar in vitro con un virus vaccinia recombinante que codifica la ARN polimerasa del bacteriófago T7. Esta polimerasa presenta una especificidad exquisita ya que sólo transcribe moldes que presentan promotores T7. Después de la infección, las células se transfectan con el polinucleótido de interés, dirigido por un promotor T7. La polimerasa expresada en el citoplasma del virus vaccinia recombinante transcribe el ADN transfectado en ARN que se traduce en proteína por la maquinaria de traducción del huésped. El método proporciona un alto nivel de producción transitoria, citoplasmática de grandes cantidades de ARN y sus productos de traducción. Véanse, por ejemplo, Elroy-Stein y Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87: 6743-6747; Fuerst et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83: 8122-8126.

Como una estrategia alternativa a la infección con virus recombinantes vaccinia o avipox o a la administración de genes usando otros vectores virales, puede usarse un sistema de amplificación que dará lugar a un alto nivel de expresión después de la introducción en las células huésped. Específicamente, un promotor de la ARN polimerasa T7 que precede la región codificadora para la ARN polimerasa T7 puede prepararse por ingeniería. La traducción del ARN derivado de este molde generará ARN polimerasa T7 que a su vez transcribirá más molde. Simultáneamente, habrá un ADNc cuya expresión está bajo el control del promotor T7. Así, parte de la ARN polimerasa T7 generada a partir de la traducción del ARN molde amplificado dará lugar a la transcripción del gen deseado. Como parte de la ARN polimerasa T7 se requiere para iniciar la amplificación, la ARN polimerasa T7 puede introducirse en las células junto con el o los moldes para cebar la reacción de transcripción. La polimerasa puede introducirse como una proteína o en un plásmido que codifica la ARN polimerasa. Para una discusión adicional de los sistemas de T7 y su uso para transformar células, véanse, por ejemplo, la Publicación Internacional No. WO 94/26911; Studier y Moffart,

J. Mol. Biol. (1986) 189: 113-130; Deng y Wolff, Gene (1994) 143: 245-249; Gao et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1994) 200: 1201-1206; Gao y Huang, Nuc. Acids Res. (1993) 21: 2867-2872; Chen et al., Nuc. Acids Res. (1994) 22: 2114-2120; y Pat. U.S. No. 5.135.855.

Uno o más antígenos VIH adicionales pueden usarse en la composición de esta invención. Por ejemplo, los antígenos env del clado C de VIH pueden usarse con antígenos VIH adicionales. Los antígenos VIH adicionales pueden administrarse simultáneamente, antes o después de la administración del antígeno env del clado C de VIH.

Además, puede añadirse un factor inmunomodulador a la composición farmacéutica. Un “factor inmunomodulador” se refiere a una molécula, por ejemplo una proteína, que es capaz de modular una respuesta inmune o a vectores de ADN que codifican un factor inmunomodulador dado. Los ejemplos no limitativos de factores inmunomoduladores incluyen linfoquinas (también conocidas como citoquinas) tales como IL-6, TGF-beta, IL-1, IL-2, IL-3, etc.); y quimioquinas (por ejemplo, proteínas secretadas tales como el factor inhibidor de macrófagos). Determinadas citoquinas, por ejemplo TRANCE, flt-3L y una forma secretada de CD40L, son capaces de aumentar la capacidad inmunoestimuladora de las APC. Los ejemplos no limitativos de citoquinas que pueden usarse solas o en combinación en la práctica de la presente invención incluyen, interleuquina-2 (IL-2), factor de células madre (SCF), interleuquina 3 (IL-3), interleuquina 6 (IL-6), interleuquina 12 (IL-12), G-CSF, factor estimulador de colonias de granulocitos macrófagos (GM-CSF), interleuquina-1 alfa (IL-1.alfa), interleuquina-11 (IL-11), MIP-1.gamma, factor inhibidor de leucemia (LIF), ligando c-kit, trombopoyetina (TPO), ligando CD40 (CD40L), citoquina que induce la activación relacionada con el factor de necrosis tumoral (TRANCE) y ligando flt3 (flt-3L). Las citoquinas están disponibles comercialmente de varios vendedores tales como, por ejemplo, Genzyme (Framingham, Mass.), Amgen (Thousand Oaks, Calif.), R&D Systems e Immunex (Seattle, Wash.). Las secuencias de muchas de estas moléculas también están disponibles, por ejemplo, en la base de datos GenBank. Se pretende, aunque no siempre se indica explícitamente, que las moléculas que tienen una actividad biológica similar como citoquinas de tipo salvaje o purificadas (por ejemplo, producidas de manera recombinante o mutantes de éstas) y los ácidos nucleicos que codifican estas moléculas se pretende que se usen.

Las composiciones de la invención se formularán típicamente con vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Tal y como se usa en la presente memoria, el término “vehículo farmacéuticamente aceptable” se refiere a un vehículo para la administración de los antígenos que por sí mismo no induce la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición, y que puede administrarse sin toxicidad excesiva. Los vehículos adecuados pueden ser macromoléculas grandes, que se metabolizan lentamente tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas de virus inactivas. Los ejemplos de vehículos en partículas incluyen aquellos derivados de polímeros de polimetil metacrilato, así como micropartículas derivadas de poli(láctidos) y poli(láctido-co-glicólidos), conocidos como PLG. Véanse, por ejemplo, Jeffery et al., Pharm. Res. (1993) 10: 362-368; McGee et al. (1997) J. Microencapsul. 14(2): 197-210; O’Hagan et al. (1993) Vaccine 1(2): 149-54. Dichos vehículos son muy conocidos para los expertos en la técnica. Además, estos vehículos pueden funcionar como agentes inmunoestimulantes (“adyuvantes”). Además, el antígeno puede conjugarse con un toxoide bacteriano, tal como toxoide de difteria, tétanos, cólera, etc., así como toxinas derivadas de E. coli.

En la presente memoria pueden usarse sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo sales de ácidos minerales tales como hidrocloruros, hidrobromuros, fosfatos, sulfatos y semejantes; y las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y semejantes. Una discusión en profundidad de los excipientes aceptables está disponible en la muy conocida Remington’s Pharmaceutical Sciences.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables en composiciones terapéuticas pueden contener líquidos tales como agua, disolución salina, glicerol y etanol. Además, pueden estar presentes en dichos vehículos sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponadoras del pH y semejantes.

Por “farmacéuticamente aceptable” o “farmacológicamente aceptable” se quiere decir un material que no es biológicamente o de otra manera indeseable, es decir, el material puede administrarse a un individuo en una formulación o composición sin causar ningún efecto biológico indeseable o interaccionar de una manera perjudicial con ninguno de los componentes de la composición en la que está contenido.

Administración

Las composiciones descritas en la presente memoria pueden administrarse a un sujeto para generar una respuesta inmune. Preferiblemente, la composición puede usarse como una vacuna para tratar o prevenir una infección por VIH.

Tal y como se usa en la presente memoria, “sujeto” quiere decir cualquier miembro de cordata subphylum, incluyendo, sin limitación, seres humanos y otros primates, incluyendo primates no humanos, tales como chimpancés y otros monos y especies de monos; animales de granja tales como ganado, ovejas, cerdos, cabras y caballos; mamíferos domésticos tales como perros y gatos; animales de laboratorio incluyendo roedores tales como ratones, ratas y cobayas; pájaros, incluyendo pájaros domésticos, salvajes y de caza, tales como pollos, pavos y otros pájaros gallináceos, patos, gansos y semejantes. El término no indica una edad particular. Así, se pretende que estén cubiertos tanto los individuos adultos como recién nacidos. El sistema descrito anteriormente se pretende para uso en cualquiera de las especies de vertebrados anteriores, ya que los sistemas inmunes de todos estos vertebrados operan de manera similar.

Las composiciones incluirán “cantidades inmunológicamente eficaces” de antígeno VIH, es decir, cantidades suficientes para incitar una respuesta inmune específica o, más preferiblemente, para tratar, reducir o prevenir una infección por VIH. Una respuesta inmune puede detectarse buscando anticuerpos frente al antígeno VIH usado (por ejemplo, IgG o IgA) en muestras de pacientes (por ejemplo, en sangre o suero, en ganglios linfáticos mesentéricos, en bazo, en mucosa gástrica y/o en heces). La cantidad eficaz precisa para un paciente dado dependerá de la edad, tamaño, salud del paciente, la naturaleza y gravedad de la afección, la composición precisa seleccionada para administración, el grupo taxonómico del paciente, la capacidad del sistema inmune del paciente para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación del médico que trata la situación médica y otros factores relevantes. Así, no es útil especificar una cantidad eficaz exacta con antelación, sino que la cantidad estará en un intervalo relativamente amplio que puede determinarse mediante ensayos rutinarios y estará dentro del criterio del médico. Una dosis eficaz será típicamente de aproximadamente 0,01 mg/kg a 50 mg/kg en el individuo al que se administra.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. SHIVenvC con el bucle V delecionado induce respuestas de nAb cruzadas entre clados en ratones.

Se preparó un vector de expresión SHIV-1157ipenv con el bucle V delecionado como sigue: la secuencia completa de gp160 SHIV-1157ip se optimizó en codones y se clonó en el vector de mutagénesis pTPS (Xu et al., 2002). Se usaron cebadores mutagénicos para delecionar separadamente los bucles V1/V2 y el bucle V3. Los cebadores mutagénicos se sintetizaron e incluyeron secuencias conectoras GAG para mantener la estructura de núcleo de Env (Johnson et al., 2002). La mutagénesis se confirmó por secuenciación de ADN y el gen mutante gp160 se clonó en el vector de expresión pJW4303. El plásmido resultante, pJW1157ipenv∆123 se ensayó para pureza por digestión de restricción/electroforesis en gel y para expresión in vitro por transfección en células 293T seguido de análisis por transferencia Western. El análisis por transferencia Western mostró un banda de proteína de aproximadamente 135 kb.

Se preparó un virus vaccinia recombinante expresando 1157ipenv∆123 y se usó para infectar la línea celular de osteosarcoma humano, 143 B. Se preparó SHIV-1157ip∆123 Env a partir de lisados celulares por exclusión por tamaño y cromatografía de lectina de lenteja (Earl et al., 1994).

Cinco ratones BALB/c se inocularon por vía subcutánea 2x con 20 ug de SHIV-1157ip∆123 Env formulado en emulsión MPL + TDM. Los sueros de ratones inmunizados se ensayaron para actividad de anticuerpo neutralizante frente a SHIV-1157ip homólogo y frente a SHIV89.6P heterólogo (Fig 3). Tres de 5 ratones mostraron actividad de anticuerpo neutralizante frente a SHIV-1157ip y 4 de los 5 ratones mostraron actividad de anticuerpo neutralizante frente a SHIV89.6P clado B heterólogo.

Los resultados demuestran que la inmunización con una Env clado C con bucle V delecionado, preparada a partir del genoma de gp160 de longitud completa por metodología que mantiene la integridad estructural de la forma multimérica de la glicoproteína Env, es inmunogénica y puede inducir respuestas de nAb cruzadas entre clados.

Ejemplo 2. Construcción y Adaptación de SHIV-1157i a Macacos Rhesus

Un virus de ensayo biológicamente relevante se creó para evaluar profilaxis inmune anti-VIH clado C.

Construcción SHIV-1157i

SHIV-1157i se construyó sobre el núcleo de SHIV-vpu+ (Li et al., J. Virol. (1995), 69: 7061-67) (Fig. 19a) y contenía la mayor parte de gp120 así como el dominio extracelular y región transmembrana completos de gp41 del aislado primario, original HIV1157i. El aislado HIV1157i es un aislado VIH clado C pediátrico recientemente transmitido de un niño de Zambia de seis meses.

La preparación madre inicial sin células SHIV-1157i se generó transfectando células 293T con ADN proviral y recogiendo los sobrenadantes. El virus se replicó en PBMC humanos y de mono rhesus y en células Ghost.CD4.CCR5.GFP pero no infectaron células CEMx174 o CEMx174.GFP, que no expresan CCR5, lo que indica que SHIV-1157i, como el HIV1157i original, usa CCR5 como correceptor.

Adaptación de SHIV-1157i a macacos rhesus

Para adaptar SHIV-1157i a macacos rhesus, una cría de mono rhesus RPn-8 se inoculó por vía intravenosa (i.v.) con 6 ml de virus. La RT-PCR en tiempo real reveló que SHIV-1157i se replicaba en este animal; el pico de viremia alcanzó 6 x 104 copias de ARN/ml en la semana 4 después de la inoculación (p.i.). Este primer animal nunca aclaró el virus y permaneció virémico desde el principio hasta el fin. Cuatro animales adicionales se sometieron a transferencia sanguínea seriada (Fig. 19b), mediante las cuales 1 ml de sangre completa recogido en el pico de la viremia (semana 2 p.i.) se transfirió directamente a los monos receptores siguientes: RAo-8 y RII-8 neonatos, RTs-7 juveniles y RKI-8 infantiles. Comparado con el primer receptor del virus RPn-8, las cargas de ARN viral en el pico se incrementaron entre 1 a 2 logs en receptores posteriores (Fig. 19c). Los cinco monos en esta cohorte se seroconvirtieron en la semana 4. En la semana 6 p.i., el virus pasado, denominado SHIV-1157ip, se aisló de PBMC del último receptor, RKI-8 y se creció una gran preparación madre en PBMC de monos rhesus. Los virus de esta preparación madre eran competentes para la replicación en PBMC de otros monos rhesus donantes sin tratar.

SHIV-1157ip no se replicó en células CEMx174 ni CEMx174-GFP ni en células U87.CD4 o U87.CD4 que expresan CCR1, CCR2, CCR3, o CXCR4. SHIV-1157ip tampoco se replicó en células Ghost-BOB y Ghost-Bonzo. Sólo se observó infección productiva en células U87.CD4.CCR5, lo que indica que SHIV-1157ip usaba exclusivamente CCR5 como correceptor, incluso después de varios pasos en una especie diferente.

Ejemplo 3. Patogenicidad de SHIV-1157ip.

Se observaron signos de enfermedad temprana (depleción de células T de memoria en sangre periférica y proporciones persistentemente bajas de CD4+/CD8+) en dos monos, RPn-8 y RKI-8, en el primer año después de la inoculación. Esto se siguió por depleción de células T CD4+ absolutas en sangre periférica. En el animal RPn-8, se desarrolló SIDA, como se define por células T CD4+ persistentemente <200 células/µl, en la semana 135 p.1.; en los otros dos animales, RKI-8 y RTs-7, los recuentos absolutos de células T CD4+ fueron persistentemente <500 células/µl (Fig. 4). Como un signo adicional de enfermedad inducida por lentivirus, se desarrolló una trombocitopenia grave, persistente en el animal RPn-8, aunque hasta la fecha no se ha observado hemorragia.

Con el fin de determinar si ha surgido un virus más agresivo en el animal RPn-8 después de desarrollar SIDA, 10 ml de sangre se transfundieron en un receptor sin tratar, RBg-9. Tres meses después, este animal receptor desarrolló trombocitopenia y depleción de células T de memoria en sangre periférica. Estas dos anormalidades han persistido después de los 18 meses siguientes. Tanto el donante como el receptor han permanecido persistentemente virémicos.

Ejemplo 4. Construcción y Transmisión Mucosal de SHIV-1157ipd3N4.

Después de que el primer mono (RPn-8) infectado con SHIV-1157i hubo progresado a SIDA, el virus se re-aisló con el fin de generar otro clon molecular. El virus re-aislado, denominado SHIV-1157ipd, se aisló cuatro semanas después de que el recuento absoluto de células T CD4+ del animal RPn-8 cayera hasta <200 células/µl. El clon 3 dio lugar al nivel más alto de virus infecciosos y se seleccionó para estudios adicionales (Figs. 4, 5). El análisis genético de las secuencias env de SHIV-1157ipd reveló varias mutaciones que resultaron en sustituciones de un único aminoácido en gp120, especialmente en V1, V2 y V4. También se observaron mutaciones en gp41. Cinco de los cinco clones secuenciados contenían una deleción de 118 pb en el extremo 3’ de env. Esta deleción de 118 pb estaba localizada en el dominio intracelular de gp41 y dio lugar a una pérdida de 35 de los aminoácidos (aa) originales y, debido a un desplazamiento del marco, a una ganancia de 57 aa. La cubierta permaneció infecciosa.

Con el fin de maximizar la capacidad replicativa y aumentar las cargas virales in vivo, se añadieron elementos de control de la transcripción en el LTR lentiviral. Así, el LTR de SHIV-1157ipd3 se modificó para incrementar el número de sitios NF-κB. En un conjunto de construcciones solo-LTR unidas al gen informador lucíferasa, se demostró una correlación directa entre la expresión génica mediada por LTR y el número de sitios NF-κB en ensayos de transfección transitoria (Fig. 6a). El efecto fue especialmente pronunciado cuando un plásmido de expresión tat se cotransfectó y se añadió TNF-α al medio, consistente con la cascada de transducción de la señal activada por esta citoquina. Después de la transfección y liberación del virus infeccioso, las modificaciones introducidas por ingeniería en el LTR 3‘ se copiarán en el LTR 5’ en el ciclo de replicación viral posterior. Las cinéticas de replicación de los virus de estadio tardío que codifican dos sitos NF-κB produjeron niveles de producción mayores de p27 Gag y/o picos más tempranos para la estimulación con TNF-α que los virus que sólo contienen un sito (Fig. 6b).

El virus SHIV-1157ipd3 no se replicó en células CEMx174 ni CEMx174-GFP ni en células U87.CD4, U87.CD4.CCR1, U87.CD4.CCR2, U87.CD4.CCR3, U87.CD4.CXCR4, GHOST-BOB y GHOST-BONZO. Sólo ocurrió infección productiva en células U87.CD4.CCR5 (Fig. 7a), lo que indica que SHIV-1157ipd3 de estadio tardío y su equivalente de 2 sitios NF-κB, SHIV-1157ipd3N4, todavía usan CCR5 como correceptor exclusivamente.

Con el fin de determinar si el virus tardío era susceptible de neutralización por los nmAb humanos ampliamente reactivos b12, 2G12, 2F5 y 4E10 (Fig. 7b) se realizaron ensayos en PBMC humanas. El virus tardío había perdido su sensibilidad a 2G12 que estaba correlacionado con la pérdida de un sitio clave de glicosilación unido a N en la posición de aa 295 que se requiere para formar el complejo de epítopo 2G12 (Scanlan et al., 2002); el nmAb 2G12 es único porque está dirigido a una estructura de carbohidrato pura que consiste en varios residuos de manano. Sin embargo, SHIV-1157ipd3N4 tardío no ha desarrollado resistencia global a la neutralización.

Así, se prepararon varias cepas SHIVenvC que codifican una de varias formas del gen env que se clonó originalmente a partir de R5 HIV1157i, una cepa de clado C. El virus se aisló a partir de un niño de Zambia que se descubrió que no tenía progresión a largo plazo (LTNP) durante el seguimiento prospectivo. Las construcciones SHIV y sus designaciones son como sigue:

•

SHIV-1157i clon molecular infeccioso, todavía no adaptado a monos rhesus; “i” designa una cepa del virus (o gen env) aislada de un niño

•

SHIV-1157ip aislado biológico obtenido después de paso a través de varios monos rhesus; “p” designa un virus pasado, adaptado a mono

•

SHIV-1157ipd aislado biológico, “d” indica que el virus se re-aisló de un mono infectado con la enfermedad

•

SHIV-1157ipd3 clon molecular infeccioso #3. La mitad 3’ del provirus se derivó de un mono con enfermedad inducida por el virus

•

SHIV-1157ipd3N4 idéntico a SHIV-1157ipd3 excepto en que cada LTR tiene 2 en lugar del 1 sito NF-κB habitual.

Ejemplo 5. Ensayo de vacunación en animales expuestos a SHIV-1157ipd3N4.

Dos grupos de macacos recién nacidos se vacunaron (Grupo 1 y Grupo 3). A los animales del Grupo 1 se les proporcionó una combinación de plásmidos de expresión de ADN que codifican SIVgag-proteasal, HIVtat y HIV1084ienv. A los animales del Grupo 3 (controles) se les proporcionó vector de ADN vacío. El ADN se proporcionó en 2 puntos de tiempo – en el nacimiento y a las 6 semanas. Los animales descansaron y se les proporcionó refuerzos de proteína solubles que consisten en partículas SIV Gag-Pol derivadas de células infectadas con virus vaccinia recombinantes, HIV Tat y HIV1084i gp160. A los animales del Grupo 2 con edad equivalente se les proporcionó proteínas solubles sin sensibilización con ADN. Las proteínas se proporcionaron en el mes 9, mes 11 y en el mes 24. Se evaluaron la inmunidad celular y humoral 2 semanas después de cada punto de tiempo de vacunación. Los animales se expusieron oralmente con SHIV-1157ip (Fig. 20, paneles A, B y C). Todos los RM recibieron una dosis relativamente baja de 3,7 AID50 que podría ser responsable de menos del 100% de infección entre los controles. In vitro, PBMC deplecionadas de células T CD8+ de RM que habían permanecido sin infectar después de la exposición oral, fueron completamente susceptibles a infección por SHIV-1157i y SHIV-1157ipd3N4, descartando así la resistencia inherente a estos virus.

Como algunos vacunados parecen haber contenido SHIV-1157ip, se re-expusieron i.r. con 20 AID50 de SHIV1157ipd3N4. Los animales reexpuestos incluyeron un animal del Grupo 1 (sensibilización con ADN/refuerzo de proteína), 3 animales el Grupo 2 (inmunización de proteínas solo) y un animal del grupo control, RAr-9. Se muestran los niveles plasmáticos de vARN para RAr-9 después de la reexposición (Fig. 20E, rojo) y para un grupo de 8 animales control no vacunados adicionales expuestos de manera idéntica a SHIV-1157ipd3N4. En la semana 1, todos los animales control estaban infectados y los niveles de los picos de viremia variaron de 1,3 – 7,7 x 107 copias de vARN/ml. Por el contrario, sólo 1 de 4 RM vacunados previamente tuvo virus detectable en la semana 1 (Fig. 20D). De los que estaban infectados, los niveles de los picos de viremia fueron un log menores que en controles (p=0,003). De manera importante, uno de los animales vacunados sólo con proteína, RAt-9, todavía no tenía evidencia de infección después de la reexposición a SHIV-1157ipd3N4. En el momento de la reexposición, este RM tenía una inmunidad celular fuerte frente a SIV Gag y HIV Tat.

Para conservar RM, la reexposición descrita fue paralela a una exposición i.r. de SHIV-1157ipd3N4 de los vacunados. Todos los RM en los 3 grupos de vacunas estuvieron infectados pero los niveles medios de los picos de viremia para los animales de los 3 grupos de vacuna combinados fueron significativamente menores que los controles (2,4 x 107 frente a 4, x 107 copias de vARN/ml; p= 0,006). Los niveles plasmáticos medios de viremia para el Grupo 3 RM solo que se sensibilizaron con ADN con clado C env y se reforzaron con clado B gp160 heterólogo fueron los menores a 1,5 x 107 copias de ARN/ml (p= 0,014).

LISTA DE SECUENCIAS

<110> DANA FARBER CANCER INSTITUTE, INC.

<120> Métodos y composiciones para inducir una respuesta inmune frente a VIH y modelos para ensayo

<130> 207032-67925

10 <140>

<141>

<150> 60/787.270

<151>

<160> 16

<170> PatentIn Ver. 3.3

<210> 1

<211> 2547

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: constructo de nucleotido sintético

<400> 1 <210> 2

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: constructo de proteína sintético

<400> 2

<210> 3

<211> 2313 5 <212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: constructo de nucleotido sintético

<400> 3 <210> 4

<211> 770

<212>

PRT 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: constructo de proteína sintético

<210> 5

<211> 2232

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: constructo de nucleotido sintético

<210> 6

<211> 743

<212>

PRT 10 <213> Secuencia Artificial

10 <400> 4

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: constructo de proteína sintético

15 <400> 6

<210> 7

<211>

2169 5 <212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: constructo de nucleotido sintético

<400> 7

<210> 8

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: constructo de proteína sintético

<400> 8

<210> 9

<211>

3925 5 <212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: constructo de nucleotido sintético

<400> 9

<210> 10

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: constructo de proteína sintético

<400> 10

<210> 11

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: constructo de proteína sintético

<400> 11

<210> 12

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: proteína consenso sintética

<400> 12

<210> 13

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: constructo sintético

<400> 13

<210> 14

<211>

1727 5 <212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: nucleótido consenso sintético

<400> 14

<210> 15

<211>

2520 5 <212> DNA

10 10

10 10

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: constructo de nucleótido sintético

<400> 15 <210> 16

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: constructo de proteína sintético

<400> 16

Claims (19)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un polipéptido de la cubierta de VIH de clado C aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2.

2. 2.

   Un polipéptido de la cubierta de VIH de clado C modificado en el que la región V1/V2 ha sido delecionada, comprendiendo dicho polipéptido modificado la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4.

3. 3.

   Un polipéptido de la cubierta de VIH de clado C modificado en el que las regiones V1/V2 y V3 han sido delecionadas, comprendiendo dicho polipéptido modificado la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6.

4. 4.

   Un polipéptido de la cubierta de VIH de clado C modificado en el que las regiones V1/V2, V3 y V4 han sido delecionadas, comprendiendo dicho polipéptido modificado la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8.

5. 5.

   Un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1, que codifica el polipéptido de la reivindicación 1.

6. 6.

   Un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3, que codifica el polipéptido de la reivindicación 2.

7. 7.

   Un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:5, que codifica el polipéptido de la reivindicación 3.

8. 8.

   Un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:7, que codifica el polipéptido de la reivindicación 4.

9. 9.

   Una construcción que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 5-8.

10. 10.

    Una composición que comprende el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 5-8, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

11. 11.

    Una composición según la reivindicación 10 para inducir una respuesta inmune en un sujeto.

12. 12.

    Una composición según la reivindicación 10 para la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta inmune en un sujeto.

13. 13.

    Una composición para usarse como se define en la reivindicación 11 o reivindicación 12, en la que la composición o medicamento es para administrarse con un segundo antígeno VIH.

14. 14.

    Una composición para usarse como se define en la reivindicación 13, en la que dicho segundo antígeno VIH es gp120 o gp160.

15. 15.

    Una partícula viral VIH recombinante que comprende una región de la cubierta que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10 o está codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:9.

16. 16.

    La partícula viral recombinante de la reivindicación 15, en la que la partícula viral comprende además la secuencia de aminoácidos Nef de SEQ ID NO:11.

17. 17.

    La partícula viral recombinante de la reivindicación 15 o reivindicación 16, que comprende dos o más regiones NF-κB.

18. 18.

    La partícula viral recombinante de la reivindicación 17, que comprende tres o más regiones NF-κB.

19. 19.

    Una composición que comprende la partícula viral recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 15-18.