ES2388913T3 - Procedimiento de detección de un fragmento nucleico endógeno asociado a una enfermedad autoinmune - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de detección de un fragmento nucleico endógeno que pertenece al gen gag del retrovirus humanoendógeno HERV-W, en una muestra biológica, que comprende las etapas siguientes:- extraer el ADN celular de dicha muestra,- amplificar el ADN extraído con una sonda seleccionada de entre SEC ID nº: 4 a 9 y 12 a 17,- efectuar una etapa de transcripción/traducción in vitro del producto amplificado,- hacer reaccionar el producto procedente de la etapa de transcripción/traducción con un suero o un plasma deun paciente que presenta la esclerosis en placas, y- detectar por lo menos un producto de expresión seleccionado de entre un ARN mensajero cuya traducciónconduce a un polipéptido que consiste en SEC ID nº 31 y un polipéptido que consiste en SEC ID nº 31.
Description
Procedimiento de detección de un fragmento nucleico endógeno asociado a una enfermedad autoinmune.
La presente invención se refiere a un fragmento nucleico endógeno de tipo retroviral integrado al ADN del genoma humano.
Los retrovirus son unos virus de ARN que se replican mediante un proceso denominado de transcripción inversa, mediado por una ADN polimerasa dependiente de ARN denominada reverse transcriptasa (RT), codificada por el gen pol. El ARN retroviral comprende asimismo por lo menos dos genes adicionales que son los genes gag y env. El gen gag codifica para las proteínas del esqueleto, es decir para la matriz, la cápside y la nucleocápside. El gen env codifica para las proteínas de cubierta. La transcripción se regula mediante unas regiones promotoras situadas a nivel de los LTR (Long Terminal Repeat) que encuadra los extremos 5’ y 3’ terminales del genoma retroviral.
En el curso de la evolución, los humanos o sus ancestros han integrado en su genoma material de origen retroviral tras una infección. En efecto, durante la infección de una célula, la transcriptasa inversa hace una copia de ADN del ARN retroviral, pudiendo entonces esta copia de ADN integrarse eventualmente en el genoma humano. Los retrovirus pueden infectar las células germinales y transmitirse así a las generaciones futuras por transmisión Mendeliana vertical. Se habla entonces de retrovirus endógenos que están presentes en forma de ADN proviral integrado en el genoma de todas las células humanas. La mayoría de los retrovirus endógenos son silenciosos o defectivos. Sin embargo, algunos de ellos han podido conservar la totalidad o parte de sus propiedades iniciales y pueden ser activados en unas condiciones particulares. La expresión de los retrovirus endógenos puede ir desde la transcripción de genes víricos hasta la producción de partículas víricas.
Estos retrovirus endógenos pueden estar asociados directa o indirectamente al desarrollo de ciertas patologías.
Unas estructuras retrovirales endógenas pueden encontrarse en forma completa LTR-gag-pol-env-LTR o en formas truncadas.
Así, en una solicitud anterior de patente (PCT/FR98/01442), la solicitante ha cribado un banco de ADNc con la ayuda de una sonda Ppol-MSRV (SEC ID nº 18) y ha detectado unos clones solapantes que le han permitido reconstruir un ARN genómico putativo de 7582 nucleótidos. Este ARN genómico presenta una estructura R-U5-gagpol-env-U3-R. Una interrogación “blastn” sobre varias bases de datos con la ayuda del genoma reconstruido ha permitido demostrar que existe una cantidad importante de secuencias genómicas (ADN) parecidas en el genoma humano que se han encontrado sobre varios cromosomas. Así, la solicitante ha demostrado la existencia de estructuras parciales de tipo retroviral en el genoma humano y ha considerado su papel potencial en el desarrollo de enfermedades autoinmunes, en fracasos de embarazo o en estados de embarazo patológicos.
A título de ejemplo, se puede citar como enfermedad autoinmune, la esclerosis en placas, la poliartritis reumatoide, el lupus eritematoso diseminado, la diabetes insulino-dependiente y/o las patologías que les están asociadas.
El aislamiento y la secuenciación de fragmentos de ADNc solapantes y la identificación de clones genómicos (ADN) que corresponden a los clones de ADN aislados, descritos en la solicitud de patente PCT citada anteriormente de la Solicitante se incorporan a la presente memoria a título de referencia.
Aislamiento y secuenciación de fragmentos de ADNc solapantes:
Las informaciones que se refieren a la organización de la nueva familia de retrovirus endógenos denominada por la solicitante HERV-W se obtuvieron ensayando un banco de ADNc placentario (Clontech cat#HL5014a) con las sondas Ppol-MSRV (SEC ID nº 18) y Penv-C15 (SEC ID nº 19) y practicando a continuación una técnica de “gen walking” con la ayuda de las nuevas secuencias obtenidas. Los experimentos se realizaron refiriéndose a las preconizaciones del fabricante del banco. Unas amplificaciones PCR sobre ADN se han utilizado también para comprender esta organización.
Se han seleccionado y secuenciado los clones siguientes:
- -
- Clon c1.6A2 (SEC ID nº 20): región 5’ no traducida de HERV-W y una parte de gag
- -
- Clon c1.6A1 (SEC ID nº 21): gag y una parte de pol
- -
- Clon cl.7A16 (SEC ID nº 22): región 3’ de pol
- -
- Clon cl.Pi22 (SEC ID nº 23): región 3’ de pol y principio de env
- -
- Clon c1.24.4 (SEC ID n1 24): ARN empalmado que comprende una parte de la región 5’ no traducida de HERV-W, el final de pol y la región 5’ de env
- -
- Clon cl.C4C5. (SEC ID nº 25): final de env y región 3’ no traducida de HERV-W
- -
- Clon cl.PH74 (SEC ID nº 26): ARN sub-genómico: región 5’ no traducida de HERV-W, final de pol, env, y región 3’ no traducida de HERV-W
- -
- Clon cl.PH7 (SEC ID nº 27): ARN multi-empalmado: región 5’ no traducida de HERV-W, final de env y región 3’ no traducida de HERV-W
- -
- Clon cl.Pi5T (SEC ID nº 28): gen pol parcial y región U3-R
- -
- Clon c1.44.4 (SEC ID nº 29): región R-U5, gen gag y gen pol parcial.
Con la ayuda de estos clones, procediendo a unas alineaciones de secuencias, se ha elaborado un modelo de
secuencia total de HERV-W. Los ARN empalmados se pusieron en evidencia así como los sitios potenciales
donantes y receptores de empalme. Mediante el estudio de la similitud con unos retrovirus existentes, se han
definido las entidades LTR, gag, pol y env.
La organización genética putativa de HERV-W en forma ARN es la siguiente (SEC ID nº 30):
gen 1..7582
Localización de los clones en la secuencia de ARN genómica reconstruida
cl.6A2 (1321 pb) 1-1325 ;
cl.PH74 (535+2229= 2764 pb) 72-606 y 5353-7582;
cl.24.4 (491 + 1457= 1948 pb); 115-606 y 5353-6810;
cl.44.4 (2372 pb) 115-2496;
cl.PH7 (369+297= 666pb) 237-606 y 7017-7313; c1.6A1 (2938 pb) 586-3559.;
cl.Pi5T (2785+566= 3351 pb) 2747-5557 y 7017-7582;
c1.7A16 (1422 pb) 2908-4337;
cl.Pi22 (317+1689 = 2006 pb) 3957-4273 y 4476-6168;
c1.C4C5 (1116 pb) 6467-7582
5'LTR 1..120 /nota="R of 5'LTR (extremo 5' inciertao" 121..575 /nota="U5 of 5'LTR"
diverso 579..596 /nota="PBS primer binding site para RNAt-W"
diverso 606 /nota="unión de empalme (sitio donante de empalme ATCCAAAGTG-GTGAGTAATA y sitio receptor de empalme CTTTTTTCAG-ATGGGAAACG clon RG083M05, GenBank accession AC000064)"
diverso 5353 /nota="sitio receptor de empalme para el ORF1 (env)" diverso 5560 /nota="sitio donante de empalme" ORF 5581..7194 /nota="ORF1 env 538 AA" /producto-="cubierta" diverso 7017 /nota="sitio receptor de empalme para ORF2 y ORF3" ORF 7039..7194 /nota="ORF2 52 AA" ORF 7112..7255 /nota="ORF3 48 AA" diverso 7244..7254 /nota="PPT polypurine tract" 3'LTR 7256..7582 /nota="U3-R of 3' LTR (unión U3-R indeterminada) diverso 7563..7569 señal de poliadenilación
Identificación de clones genómicos (ADN) que corresponden a los clones de ADN aislados:
Una interrogación “blastn” sobre varias bases de datos, con la ayuda del genoma reconstruido, ha mostrado que existe una cantidad importante de secuencias parecidas en el genoma humano. Se han identificado
aproximadamente 400 secuencias en GenBank y más de 200 secuencias en el banco EST, la mayoría en antisentido. Las 4 secuencias más significativas en tamaño y en similitud son las secuencias de los clones genómicos (ADN) siguientes:
el clon humano RG083M05 (gb AC000064) cuya localización cromosómica es 7q21-7q22,
el clon humano BAC378 (gb U85196, gb AE000660) que corresponde al locus alfa delta del receptor de las células T, localizado en 14q11-12,
el cósmido humano Q11M15 (gb: AF045450) que corresponde a la región 21q22.3 del cromosoma 21,
el cósmido U134E6 (embl Z83850) sobre el cromosoma Zq22.
Se indica la localización de las regiones alineadas para cada uno de los clones, y la pertenencia a un cromosoma se indica entre corchetes (figura 6). Se indica el porcentaje de similitud (sin las amplias deleciones) entre las 4 secuencias y el ARN genómico reconstruido, así como la presencia de secuencias repetidas en cada extremo del genoma y el tamaño de los tramos de lectura (ORF) más grandes. Se han encontrado secuencias repetidas en los extremos de 3 de estos clones. La secuencia reconstruida está contenida íntegramente en el interior del clon RG083M05 (9,6 kb) y presenta una similitud de 96%. Sin embargo, el clon RG083M05 presenta una inserción de 2 Fb situada inmediatamente aguas abajo de la región 5’ no traducida (5’ UTR). Esta inserción se encuentra también en otros dos clones genómicos que presentan una deleción de 2,3 kb inmediatamente aguas arriba de la región 3’ no traducida (3’ UTR). Ningún clon contenía los tres tramos de lectura (ORF) gag, pol y env funcionales. El clon RG083M05 muestra un ORF de 538 aminoácidos (AA) que corresponde a una cubierta entera. El cósmido Q11M15 contiene dos grandes ORF contiguos de 413 AA (tramo 0) y 305 AA (tramo + 1) que corresponden a una poliproteína pol truncada.
Se ha descubierto y aislado ahora un fragmento nucleico endógeno, integrado al ADN del genoma humano, que comprende o consiste en por lo menos una parte del gen gag de un retrovirus endógeno asociado a una enfermedad autoinmune, o a fracasos de embarazo o a patologías del embarazo, codificando esta parte por lo menos, directa o indirectamente, para un producto de expresión.
Ventajosamente, el fragmento definido anteriormente responde además a por lo menos cualquiera de las características siguientes:
comprende, o consiste en, dicho gen gag entero;
dicha parte del fragmento codifica por lo menos para la matriz y la cápside;
comprende, o consiste en, SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 3, o el complementario de cualquiera de dichas secuencias;
está localizado sobre por lo menos uno de los cromosomas humanos 1, 3, 6, 7 y 16, preferentemente está localizado por lo menos en el cromosoma 3;
el producto de expresión de dicha parte es ARN mensajero;
el producto de expresión de dicha parte está inmunológicamente reconocida por unos anticuerpos presentes en una muestra biológica de un paciente que padece una enfermedad autoinmune, tal como la esclerosis en placas; preferentemente, el fluido biológico se selecciona de entre el suero, el plasma, el líquido sinovial y la orina.
Se describe asimismo un producto de transcripción endógeno, en el estado aislado, susceptible de ser obtenido mediante transcripción de por lo menos dicha parte del gen gag de un fragmento citado anteriormente.
La invención se refiere asimismo a un procedimiento de detección de un fragmento nucleico endógeno que pertenece al gen gag del retrovirus humano endógeno HERV-W, en una muestra de retrovirus humano endógeno HERV-W, en una muestra biológica, que comprende las etapas siguientes:
se efectúa previamente una etapa de extracción del ADN celular de dicha muestra, se realiza por lo menos un ciclo de amplificación del ADN celular, tal como mediante PCR, por medio de cebadores seleccionados de entre SEC ID nº 4 a SEC ID nº 9, y SEC ID nº 12 a SEC ID nº 17,
se efectúa una etapa de transcripción/traducción in vitro del producto amplificado,
se hace reaccionar el producto procedente de la etapa de transcripción/traducción con un suero o plasma de un paciente que presenta la esclerosis en placas, y
se detecta por lo menos un producto de expresión seleccionado de entre un ARN mensajero cuya traducción conduce a un polipéptido que consiste en SEC ID nº 31, y a un polipéptido que consiste en SEC ID nº 31.
La invención se refiere asimismo a un procedimiento para el estudio y/o el seguimiento de una proliferación celular seguida de una proliferación celular de las células T in vitro según la cual se ponen en contacto las células T de un paciente con o bien unos productos de transcripción/traducción (SEC ID nº 31), tales como los obtenidos según el procedimiento anterior, o bien unos péptidos de síntesis derivados de, o que pertenecen a, SEC ID nº 31.
Ventajosamente, la sonda está marcada por un trazador, tal como, por ejemplo, un trazador radioactivo o una enzima.
El fragmento citado anteriormente encuentra las aplicaciones siguientes:
Una proteína recombinante obtenida a partir de un casete de expresión en un hospedante bacteriano, caracterizada porque la secuencia proteica consiste en SEC ID nº 31; en particular el hospedante bacteriano es
E. coli.
Un agente reactivo para la detección de una enfermedad autoinmune o un seguimiento de embarazo que comprende por lo menos un fragmento o una proteína descrita anteriormente;
La utilización de un fragmento o de una proteína descrita anteriormente para detectar, en una muestra biológica, una susceptibilidad a una enfermedad autoinmune o un seguimiento de embarazo; en particular, la enfermedad autoinmune es la esclerosis en placas.
Antes de exponer la presente invención con mayor detalle, se proporciona la definición de ciertos términos utilizados en la descripción y en las reivindicaciones.
La expresión “producto de expresión” significa cualquier producto derivado del ADN retroviral integrado en el genoma humano que incluye los productos de la transcripción (ARN mensajero) y los productos procedentes de la traducción del ARN mensajero obtenido. En este último caso, y a título de ejemplo, el producto puede ser un péptido, una proteína funcional o funcionalizable, es decir susceptible de volverse funcional.
Por parte que codifica, directa o indirectamente, para un producto de expresión, se entiende una parte que por sí misma comprende por lo menos la totalidad o parte de un marco de lectura abierto del cual se puede deducir una secuencia de aminoácidos, y cuya capacidad codificante puede ser inducida por unos elementos tales como, por ejemplo, los susceptibles de tener una actividad promotora. Esta definición incluye la variabilidad que se puede encontrar en la secuencia nucleica codificante, con la condición de que se respeten las condiciones anteriores.
Ejemplo 1: Localización del gen gag de la familia HERV-W sobre los cromosomas humanos mediante la técnica de transferencia Southern.
Con el fin de localizar el gen gag de la familia HERC-W, se ha hibridado una sonda que corresponde a este gen de MSRV sobre una membrana de nylon (Hybond® N+, Amersham) que contiene 5 μg de ADN de 24 híbridos somáticos de células [humana x roedores] (ADN genómico humano aislado: 22 cromosomas autosómicos y 2 cromosomas sexuales) y 3 ADN control (humano, ratón y hámster) digeridos por la enzima de restricción EcoRI.
La sonda utilizada es la siguiente: Pgag-Cl2 identificada por SEC ID nº 3, que corresponde a la región codificante (de 1056 pb) del clon MSRV gag Cl2.
1.1- Obtención del clon 2, C12, que contiene en 3’ una parte homóloga al gen pol, que corresponde al gen proteasa, y una parte homóloga al gen gag que corresponde a la nucleocápside y una región 5’ codificante, que corresponde al gen gag, más específicamente la matriz y la cápside de MSRV-1.
Se ha efectuado una amplificación mediante PCR sobre ARN total extraído a partir de 100 μl de plasma de un paciente que padece SEP. Se ha utilizado como control negativo, un control agua, tratado en las mismas condiciones. La síntesis de ADNc se realizó con 300 pmoles de un cebador aleatorio (ibco-BRL, Francia) y la transcriptasa inversa “Expand RT” (Boehringer Mannheim, Francia) según las condiciones preconizadas por la compañía. Se efectuó una amplificación por PCR (polymerase chain reaction) con la enzima Taq polimerasa (Perkin Elmer, Francia) utilizando 10 μl de ADNc en las condiciones siguientes: 94ºC durante 2 min., 55ºC durante 1 min., 72ºC durante 2 min. y después 94ºC durante 1 min., 55ºC durante 1 min., 72ºC durante 2 min. durante 30 ciclos y 72ºC durante 7 min. y con un volumen de reacción final de 50 μl.
Los cebadores utilizados para la amplificación por PCR son los siguientes:
- -
- cebador 5', identificado por SEC ID nº 4 5' CGG ACA TCC AAA GTG ATG GGA AAC G 3';
- -
- cebador 3', identificado por SEC ID nº 5 5' GGA CAG GAA AGT AAG ACT GAG AAG GC 3'
Se ha realizado una segunda amplificación por PCR denominada “anidada” con unos cebadores 3’ y 5’ situados en el interior de la región ya amplificada. Esta segunda PCR se efectuó en las mismas condiciones experimentales que las utilizadas durante la primera PCR, utilizando 10 μl del producto de amplificación procedente de la primera PCR.
Los cebadores utilizados para la amplificación por PCR anidada son los siguientes:
- -
- cebador 5', identificado por SEC ID nº 6 5' CCT AGA ACG TAT TCT GGA GAA TTG GG 3';
- -
- cebador 3', identificado por SEC ID nº 7 5' TGG CTC TCA ATG GTC AAA CAT ACC CG 3'
Se ha obtenido un producto de amplificación de 1511 pb a partir del ARN extraído del plasma de paciente SEP. No se ha observado el fragmento correspondiente para el control agua. Este producto de amplificación se ha clonado de la manera siguiente.
El ADN amplificado se insertó en un plásmido con la ayuda del kit TA Cloning. Los 2 μl de disolución de ADN se han mezclado con 5 μl de agua destilada estéril, 1 μl de un tampón de ligación concentrado 10 veces “10X Ligation Buffer”, 2 μl de “PCR® Vector” (25 ng/ml) y 1 μl de “T4 DNA ligase”. Esta mezcla se incubó durante una noche a 14ºC. Las etapas siguientes se realizaron de acuerdo con las instrucciones del kit TA cloning® (Invitrogen). La mezcla de ligación se esparció después de la transformación de la ligación en unas bacterias E. coli. Al final del procedimiento, las colonias blancas de bacterias recombinantes se transplantaron para ser cultivadas y permitir la extracción de los plásmidos incorporados según el procedimiento denominado de “mini preparación de ADN” (J. Sambrook, E.F. Fritsch y T. Maniatis, Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989). La preparación de plásmido de cada colonia recombinante se cortó mediante la enzima de restricción Eco RI y se analizó sobre gel de agarosa. Se seleccionaron los plásmidos que poseen un inserto detectado bajo luz UV después del marcado del gel con bromuro de etidio, para la secuenciación del inserto, después de la hibridación con un cebador complementario del promotor T7 presente en el plásmido de clonación del TA Cloning kit®. La reacción previa a la secuenciación se efectuó a continuación según el método preconizado para la utilización del kit de secuenciación “Prism® Ready Reaction Amplitaq® FS, DyeDeoxiTM Terminator” (Applied Biosystems, ref. 402119) y la secuenciación automática se realizó en los aparatos 373 A y 377 de Applied Biosystems, según las instrucciones del fabricante.
El clon obtenido, denominado C12, permite definir una región de 1511 pb que presenta una fase abierta de lectura en la región N-terminal de 1089 pb (fragmento 434-1521 de SEC ID nº 2) codificante para 363 aminoácidos (SEC ID nº 31) que corresponde a las regiones matriz y cápside del gen gag.
La secuencia nucleotídica de C12 está identificada por SEC ID nº 1. Se representa en la figura 2 con los tramos de lectura potenciales en aminoácidos.
1.2- obtención de la sonda gag cl2 MSRV
La sonda se ha obtenido después de la amplificación mediante PCR, a partir del plásmido pCRTM vector (kit TA Cloning®, Invitrogen) que contiene el inserto del clon: gag c12 de MSRV, con la Taq polimerasa (Perkin Elmer, Francia) en las condiciones siguientes: 94ºC durante 1 min., 55ºc durante 1 min., 72ºC durante 2 min. durante 35 ciclos y 72ºC durante 7 min. y con un volumen de reacción final de 100 μl.
Los cebadores utilizados para la amplificación por PCR son los siguientes:
- -
- cebador 5', identificado por SEC ID nº 12 5'-CTA GAA CGT ATT CTG GAG AAT TGG GA-3'
- -
- cebador 3', identificado por SEC ID nº 13 5'-CCT AAG GCA GAC TTT TGA AG -3'
Se obtuvo un producto de amplificación de 1056 pb para gag cl2 de MSRV.
Después de la amplificación por PCR, el fragmento se analizó en gel de agarosa 1%. El fragmento detectado bajo luz UV, después del marcado con el gel, con bromuro de etidio, se cortó y se marcó con [a-P32] con la ayuda de los cebadores aleatorios (Gibco-BRL, Francia) de acuerdo con las instrucciones del kit “Ready to go DNA labelling” (Pharmacia Biotech). Los nucleótidos no incorporados se han eliminado con una columna G-50 Quick Spin (Boehringer, Mannheim).
1.3- Transferencia southern
Las condiciones de hibridación son las siguientes:
5 Después de 4 horas de pre-hibridación (en 5x SSC, 1X Denhardt, 0,1% SDS, 50% formamida, 20 mM Tris-HCl pH = 7,5, 0,1 mg/ml de ADN de esperma de arenque), se hibridó la membrana de Nylon que contiene los cromosomas humanos (en 5x SSC, 1x Denhardt, 0,1% SDS, 50% formamida, 20 mM Tris-HCl pH = 7,5, 0,1 mg/ml de ADN de esperma de arenque, 5% de sulfato de dextrano) durante 18 horas a 42°C, con la sonda de ADN de 1056 pb (SEC ID nº 3) de gag cl2 marcada con 32P. Después de la hibridación, se lavó la membrana
10 (The BIOS Monochromosomal Somatic Cell Hybrid blot, de Quantum Bioprobe) hibridada con la sonda gag en disolución 2x SSC, 0,2% SDS 2 veces durante 15 min., a temperatura ambiente, y (en 0,2x SSC = 0,2% SDS) 2 veces durante 15 min., a 45°C. Después del lavado, la membrana se expuso a la película de rayos X, a -80ºC en presencia de una pantalla amplificadora.
15 Los resultados se representan en la tabla 1 siguiente.
En esta tabla:
m significa ratón (“mouse”) y h significa hámster y corresponden a las células receptoras del ADN de 20 cromosomas humanos.
la cifra indicada bajo cada cromosoma corresponde al número de bandas encontradas.
El número total de copias del gen gag es de 66.
Tabla 1
- nº de cromo
- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 x y ratón hámster
- rodent parent
- m h h h h h h h h h h h h h h m m h h m m h h h
- sonda gag
- 5 0 6 6 5 3 2 3 2 4 3 6 3 1 3 0 3 2 1 0 4 0 4 0 0 0
Ejemplo 2: Amplificación por PCR del gen gag de la familia HERV-W sobre cada uno de los cromosomas humanos aislados; verificación de la especificidad de las amplificaciones por transferencia southern; ensayo de transcripción-traducción “in vitro” (PTT) a partir de los productos de PCR, con el fin de verificar la capacidad codificante, localizar cuáles son los cromosomas humanos que presentan unos marcos de lectura abiertos para el gen gag de la familia HERV-W.
2.1- Amplificación por PCR
Para la amplificación del gen gag HERV-W, se ha efectuado una PCR sobre cada cromosoma humano aislado [NIGMS human/rodent somatic cell hybrid panel #2. The human monochromosomal NIGMS somatic hybrid mapping panel #2, descrito por H.L. Drwinga et al. y B.L. Dubois et al.) obtenido de Coriell Institute (Camden, NJ)] con la enzima Taq polimerasa (Perkin Elmer, Francia) utilizando: 40 pmol de cada cebador, 25 mM de cada dNTP (Pharmacia), 2,5 mM MgCl2, 2,5 U de Taq polimerasa en el tampón PCR estándar (Perkin Elmer), y 300 ng ADN de cromosoma aislado en un volumen final de 100 μl. Las condiciones de PCR para amplificar la región gag son las siguientes: 3 min. a 94°C; después 1 min. a 94°C, 1 min. a 55°C, 3 min. a 72°C, durante 30 ciclos y 7 min. a 72°C.
Los cebadores utilizados para la amplificación por PCR del gen gag a partir de un ATG introducido en la secuencia gag HERV-W sobre cada cromosoma humano aislado son los siguientes:
- -
- cebador 5’, identificado por SEC ID nº 14
El cebador contiene la secuencia del promotor T7 RNA polimerasa, un "spacer", la secuencia Kozak (sitio de iniciación a la traducción en las eucariotas) y la secuencia 5’ gag a partir de ATG de HERV-W.
- cebador 3’, identificado mediante SEC ID nº 15
5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGGCTGCGCCAGTGTCCAGGAGAC-3'
El cebador contiene una cola de poli-A (para estabilizar a transcripción del ARN, representada por 18 bases T), un codón stop (representado por TCA) y la secuencia del gen proteasa (G+E+A) de MSRV-1.
Para la amplificación del gen gag HERV-W utilizando unos oligonucleótidos definidos en las regiones LTR y proteasa de HERV-W con la enzima Taqpolimerasa (Perkin Elmer, Francia), las condiciones de PCR fueron las siguientes: 3 min. a 94°C; después 1 min. a 94°C, 1 min. a 60°C, 2 min. a 72°C, 35 ciclos; seguido de 7 min. a 72°C, con 50 ng de cada ADN monocromosómico.
Los cebadores utilizados para la amplificación, mediante PCR, del gen gag con la ayuda del oligonucleótido definido en la secuencia LTR HERV-W sobre cada cromosoma humano aislado, son los siguientes:
- -
- cebador 5', identificado por SEC ID nº 16 5'-TGTCCGCTGTGCTCCTGATC-3'
- -
- cebador 3', identificado por SEC ID nº 17 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGGCTGCGCCAGTGTCCAGGAGAC-3'
El cebador contiene una cola de poli-A (para estabilizar la transcripción del ARN, representado por 18 bases T), un codón stop (representado por TCA) y la secuencia del gen proteasa de G+E+A de MSRV-1.
Las amplificaciones por PCR se efectuaron en el aparato MJ Research PTC200, Peltier Thermal cycler. Los productos de PCR (10 μl de cada producto PCR) se analizaron en un gel de agarosa al 1% en TBE 1X(Tris-HCl, borato, EDTA). Con el fin de verificar la especificidad de los productos de amplificación, se han analizado 3 μl de cada producto PCR en gel de agarosa y después se han transferido sobre una membrana de Nylon (Hybond®-N+, Amersham) (transferencia southern) con la ayuda de NaOH 0,4N. La hibridación con la sonda gag cl2 (1056 pb) (J. Sambrook et al., 1989) se efectuó en las condiciones siguientes: después de 4 horas de pre-hibridación, (en 5x SSC, 1X Denhardt, 0,1% SDS, 50% formamida, 20 mM Tris-HCl pH = 7,5, 0,1 mg/ml de ADN de esperma de arenque), la membrana de Nylon se hibridó (en 5x SSC, 1x Denhardt, 0,1% SDS, 50% formamida, 20 mMTris-HCl pH = 7,5, 0,1 mg/ml de ADN de esperma de arenque, 5% de sulfato de dextrano) durante 18 horas a 42°C, con la sonda de ADN gag marcada con 32P. Los productos de PCR gag de cada cromosoma humano aislado se lavaron en disolución de 2x SSC, 0,2% SDS 1 vez, durante 15 min. a temperatura ambiente; 0,2x SSC, 0,1% SDS 2 veces durante 15 min. cada lavado a 65°C, en 0,1x SSC, 0,1% SDS 2 veces durante 15 min. cada uno a 65°C, y en 0,1x SSC, 0,1% SDS 2 veces durante 30 min. cada uno a temperatura ambiente.
Se utilizó una parte del volumen restante (4 μl) de los productos de amplificación por PCR para el ensayo de transcripción-traducción in vitro PTT, (Roest PAM et al., 1993) (Promega, Francia). Se utilizó el volumen restante
para la clonación en el vector pCR® 2.1-TOPO (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del kit, y para la secuenciación con el método preconizado para la utilización del kit de secuenciación “PRISM™ Ready Reaction Amplitaq® FS, DyeDeoxy™ Terminator” (Applied Biosystems, ref. 402119) y se realizó la secuenciación automática en los aparatos 373A y 377 de Applied Biosystems, según las instrucciones del fabricante.
La parte codificada (SEC ID nº 31) por el fragmento de 2009 pb (SEC ID nº 2) se amplificó mediante PCR con la enzima Pwo (5U/!l) (Boehringer Mannheim, Francia) utilizando 1 μl de la mini-preparación del ADN del clon gag (SEC ID nº 3) bajo las condiciones siguientes: 95°C durante 1 min., 60°C durante 1 min., 72°C durante 2 min. durante 25 ciclos y con un volumen de reacción final de 50 μl con la ayuda de los cebadores:
- -
- cebador 5' (Bam HI) (SEC ID nº 8): 5' ATG GGA AAC GTT CCC CCC GAG 3' (21 meros), y
- -
- cebador 3' (Hind III), identificado por SEC ID nº 9 5 GGC CTA AGG CAG ACT TTT GAA 3' (21 meros)
El fragmento obtenido después de PCR se linealizó mediante Bam HI e Hind III y se subclonó en los vectores de expresión pET28C y pET21C (NOVAGEN) linealizado por Bam HI e Hind III. La secuenciación del ADN del fragmento de 1089 pb en los dos vectores de expresión se realizó según el método preconizado para la utilización del kit de secuenciación "PRISMT™ Ready Reaction Amplitaq® FS, DyeDeoxy™ Terminator" (Applied Biosystems, ref. 402119) y la secuenciación automática se realizó en los aparatos 373 A y 377 de Applied Biosystems, según las instrucciones del fabricante.
La expresión de la secuencia nucleotídica del fragmento de 1089 pb del clon gag por los vectores de expresión pET28C y pET21C está identificada mediante respectivamente SEC ID nº 10 y SEC ID nº 11.
2.2- Ensayo de transcripción-traducción in vitro (PTT, Promega)
Este ensayo se efectuó para localizar los cromosomas humanos que presentan unos marcos de lectura abiertos para el gen gag de la familia HERV-W.
En un volumen de reacción de 25 μl, se realizó la mezcla que contenía 12,5 μl de lisado de retocilocito de conejo TNT® (Promega), 1 μl de tampón de reacción TNT® (Promega), 0,5 μl de ARN polimerasa TNT® (Promega), 0,5 μl de mezcla con 1 mM de los aminoácidos menos metionina, 2 μl de 35S-metionina (1.000 Ci/mmol) con 10 mCi/!l (Amersham), 0,5 μl de inhibidor de ribonucleasa RNasin® con 40 U/μl, 4 μl de productos de amplificación por PCR (equivalente a 1 μg) de cada cromosoma humano y 4 μl de agua. Esta mezcla se incubó a 30ºC durante 90 minutos.
Las proteínas gag que corresponden a los productos de transcripción/traducción del gen gag de la familia HERV-W de cada cromosoma humano, amplificado por OCR, se pusieron en evidencia mediante electroforesis sobre gel de poliacrilamida al 10% en presencia de dodecil-sulfato de sodio (SDS)-PAGE después de la exposición del gel a la película de rayos X a temperatura ambiente en presencia de pantalla amplificadora.
Los resultados se presentan en la tabla 2 siguiente.
En esta tabla, la cifra indicada bajo cada cromosoma corresponde a la masa molecular (kDa) de las proteínas visualizadas en gel de poliacrilamida en presencia de SDS.
Tabla 2
- nº de cromo
- nº de cromo
- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 x y agua
- rodent parent
- rodent parent
- m h h h h h h h h h h h h h h m m h h m m h h h
- PCR gag
- gag 282318 45252017 - 231817 22 - - - - - 14 - - -
Ejemplo 3: expresión del clon gag en Escherichia coli, y reacción con sueros humanos
Se expresó la parte codificante SEC ID nº 2 en Escherichia coli y después se ensayaron los productos así 5 expresados con respecto al suero de pacientes que padecen SEP, así como al suero de pacientes sanos.
Las construcciones pET28c-clon gag (1089 pb) y pET21C-clon gag (1089 pb) se sintetizan, en la cepa bacteriana BL21 (DE3), una proteína en fusión N y C terminal para el vector pET28C y C Terminal para el vector pET21C con 6 residuos de histidina, de masa molecular parecida de aproximadamente 45 kDa, puesta en evidencia mediante electroforesis sobre gel de poliacrilamida SDS-PAGE (U.K. Laemmli, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 1970, 227:680-685).
La reactividad de la proteína se demostró con respecto a un anticuerpo monoclonal anti-histidina (DIANOVA) mediante la técnica de transferencia western (H. Towbin et al., Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamid
15 gels to nitrocellulose skeets: procedure and some applications, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1979, 76:4350-4354).
Las proteínas recombinantes pET28c-clon gag (1089 pb) y pET21C-clon gag (1089 pb) se visualizaron en SDS-PAGE en la fracción insoluble después de la digestión enzimática de los extractos bacterianos con 50 μl de lisozima (10 mg/ml) y lisis por ultrasonidos.
Las propiedades antigénicas de los antígenos recombinantes pET28C-clon gag (1089 pb) y pET21C-clon gag (1089 pb) se ensayaron mediante transferencia western después de la solubilización del resto bacteriano con 2% de SDS y 50 mM de 1-mercaptoetanol. Después de la incubación con los sueros de pacientes que padecen esclerosis en placas, los sueros de los controles neurológicos y los sueros de los controles de centro de transfusión sanguínea
25 (CTS), se detectaron los inmunocomplejos con la ayuda de un suero de cabra anti-IgG y anti-IgM humano, acoplado a la fosfatasa alcalina.
Los resultados se presentan en la tabla 3 siguiente.
Tabla 3
Reactividad de sueros de pacientes que padecen esclerosis en placas y controles con la proteína recombinante de gag producida en E. colia
ENFERMEDAD NÚMERO DE INDIVIDUOS NÚMERO DE INDIVIDUOS ENSAYADOS POSITIVOS
SEP 15 6 2 (+++), 2 (++), 2 (+) CONTROLES NEUROLÓGICOS 2 1(+++) CONTROLES SANOS (CTS) 22 1(+/-)
(a) Las bandas pequeñas que contienen 1,5 μg de antígeno recombinante gag presentan una reactividad contra sueros diluidos al 1/100. La interpretación de transferencia western se basa en la presencia o la ausencia de una banda gag específica sobre las bandas pequeñas. Unos controles positivos y negativos están incluidos en cada experimento.
Estos resultados de muestran que, en las condiciones técnicas utilizadas, aproximadamente 40% de los sueros humanos afectados de esclerosis en placas ensayados reaccionan con la proteína recombinante gag.
Listado de secuencias
<110> BIO MERIEUX
<120> Fragmento nucleico endógeno asociado a una enfermedad autoinmune, procedimiento de marcado y reactivo
<130> SEP19-endógeno
<140>
<141> 55 <150> FR 9900888
<151>
<160>31
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1 <211>1511
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 1
<210>2 10 <211> 2009
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 2
<210>3 <211>1056
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 3
<210> 4
<211> 25
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 4
cggacatcca aagtgatggg aaacg
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<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 5
ggacaggaaa gtaagactga gaaggc
<210> 6
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<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 6
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<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 7
tggctctcaa tggtcaaaca tacccg
<210> 8
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atgggaaacg ttccccccga g
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- 5
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- ctagaacgta ttctggagaa ttggga 26
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- 20
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- 54
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- 44
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- <210> 18 <211> 678 <212> ADN <213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
<400> 31
Claims (1)
- REIVINDICACIONES1. Procedimiento de detección de un fragmento nucleico endógeno que pertenece al gen gag del retrovirus humano endógeno HERV-W, en una muestra biológica, que comprende las etapas siguientes:5 -extraer el ADN celular de dicha muestra,
- -
- amplificar el ADN extraído con una sonda seleccionada de entre SEC ID nº: 4 a 9 y 12 a 17,
- -
- efectuar una etapa de transcripción/traducción in vitro del producto amplificado, 10
- -
- hacer reaccionar el producto procedente de la etapa de transcripción/traducción con un suero o un plasma de un paciente que presenta la esclerosis en placas, y
- -
- detectar por lo menos un producto de expresión seleccionado de entre un ARN mensajero cuya traducción 15 conduce a un polipéptido que consiste en SEC ID nº 31 y un polipéptido que consiste en SEC ID nº 31.
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