KR19990077146A - 유방암의 치료 및 진단용 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유방암의 검출 및 치료용 조성물 및 방법에 관한 것이다. 제공되는 화합물로는 유방 종양 조직에서 우선적으로 발현되는 뉴클레오티드 서열 뿐만 아니라 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드가 있다. 상기와 같은 화합물을 포함하는 백신과 약제학적 조성물을 또한 제공하며, 예를 들어 유방암의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 또한 환자에서 유방암의 진단 및 유방암 진행을 모니터링하는데 유용한 항체의 생산에 사용할 수 있다.
Description
유방암은 미국을 비롯한 전세계의 여성에 있어서 중요한 건강 문제이다. 질환의 검출 및 치료 방법이 발달하였으나, 유방암은 미국에서 매년 180,000명 이상의 여성이 걸리는, 여성의 암-관련 사망의 원인 중 상위 2번째이다. 북미 여성의 경우, 유방암에 걸린 환자 중 생존할 가능성은 8명 중 1명이다.
유방암의 예방 또는 치료용 백신 또는 이외의 범용적으로 성공적인 방법이 현재까지는 없었다. 유방암의 관리는 현재 조기 진단(통상적인 유방 스크리닝 방법을 통하여) 및 적극적인 치료 방법의 연합에 따르며, 이러한 치료 방법으로는 수술, 방사선요법, 화학요법 및 호르몬 요법과 같은 여러가지 치료 방법을 1종 이상 포함할 수 있다. 특정 유방암에 대한 치료 과정은 종종 특이적인 종양 마커의 분석을 포함하는 여러가지 진단 파라미터를 기본으로 하여 선택한다[참조: Porter-Jordan 및 Lippman, Breast Cancer 8:73-100(1994)]. 그러나, 확립된 마커를 사용하면 종종 해석하기 어렵고, 유방암 환자에서 관찰되는 높은 사망률은 유방암의 치료, 진단 및 예방을 개량시킬 필요가 있음을 시사한다.
따라서, 당해 분야에서는 유방암의 치료 및 진단 방법을 개선할 필요성이 있다. 본 발명은 이들 필요성을 해결하였으며 또한 기타 관련된 이점을 제공한다.
발명의 요약
간략해서, 본 발명은 유방암의 진단 및 치료용 조성물 및 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, (a) 정상 조직에 비해 유방암 조직에서 우선적으로 발현되는 뉴클레오티드 서열; (b) 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 항원성 및/또는 면역원성이 유지되도록, 뉴클레오티드 위치의 20% 미만(바람직하게는 5% 미만)에서 뉴클레오티드 치환, 결실, 삽입 및/또는 개질 중 1개 이상을 포함하는 상기 서열의 변이체; 또는 (c) 상기 서열 중 1개 이상에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 에피토프를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 DNA 분자가 제공된다. 하나의 양태에서, 상기 단리된 DNA 분자는 서열 1로 표시되는 사람의 내인성 레트로바이러스 서열을 포함한다. 다른 양태로, 상기 단리된 DNA 분자는 서열 3 내지 서열 77 또는 서열 142, 143, 146-152, 154-166, 168-176, 178-192, 194-198, 200-204, 206, 207, 209-214, 216, 218, 219 및 221-227 중 하나로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
관련 양태에서, 상기 단리된 DNA 분자는 (a) 엄격한 조건하에서 서열 1 또는 서열 3 내지 서열 77 또는 서열 142, 143, 146-152, 154-166, 168-176, 178-192, 194-198, 200-204, 206, 207, 209-214, 216, 218, 219, 221-227 중 하나로 표시되는 서열에 하이브리드화되고; (b) 서열 1 또는 서열 3 내지 서열 77 또는 서열 142, 143, 146-152, 154-166, 168-176, 178-192, 194-198, 200-204, 206, 207, 209-214, 216, 218, 219 및 221-227 중 하나로 표시되는 서열과 80% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 폴리펩타이드가 암호화되며; 상기 뉴클레오티드 서열에 상응하는 RNA는 정상 유방 조직에서보다 사람의 유방 종양 조직에서 더 높은 수준으로 발현되는, 폴리펩타이드의 에피토프를 암호화한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열 141로부터 전사된 뉴클레오티드 서열; 또는 (b) 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 항원성 및/또는 면역원성이 유지되도록, 뉴클레오티드 위치 중 20% 미만에서 뉴클레오티드 치환, 결실, 삽입 및/또는 개질 중 1개 이상을 포함하는 상기 뉴클레오티드 서열의 변이체에 의해 암호화되는 폴리펩타이드의 에피토프를 암호화하는 단리된 DNA 분자를 제공한다. 상기한 바와 같은 DNA 분자에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 DNA 및 RNA 분자를 또한 제공한다.
관련 양태에서, 본 발명은 상기한 바와 같은 DNA 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 상기 발현 벡터로 형질전환시키거나 형질감염시킨 숙주 세포를 제공한다.
다른 양태에서, 상기한 바와 같은 DNA 분자에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 및 상기와 같은 폴리펩타이드에 결합하는 모노클로날 항체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 환자에 있어서 유방암 존재의 측정 방법이 제공된다. 하나의 양태에서, 상기 방법은 생물학적 샘플내에서, 상기한 바와 같은 폴리펩타이드를 검출함을 특징으로 한다. 다른 양태에서, 상기 방법은 생물학적 샘플내에서, 상기한 바와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 RNA 분자를 검출함을 특징으로 한다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 (a) 환자에게 상기한 바와 같은 폴리펩타이드를 피하내로 주사하고 (b) 환자의 피부상에서 면역 반응을 검출하여 이로부터 환자에 있어서 유방암의 존재를 검출함을 특징으로 한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 폴리펩타이드가 서열 78-86, 서열 144, 145, 153, 167, 177, 193, 199, 205, 208, 215, 217, 220으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 및 엄격한 조건하에서 이들에 하이브리드화되는 서열에 의해 암호화되는, 환자에서의 유방암의 존재를 측정하는 방법을 제공한다.
관련 양태에서, 유방암 측정에 유용한 진단 키트를 제공한다. 진단 키트는 일반적으로 상기한 바와 같은 모노클로날 항체 중 1개 이상, 또는 서열 78-86, 서열 144, 145, 153, 167, 177, 193, 199, 205, 208, 215, 217 및 220으로 제공되는 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드에 결합하는 모노클로날 항체 중 1개 이상, 및 검출제를 포함한다.
관련 양태내에서, 상기 진단 키트는 제1 폴리머라제 연쇄 반응 프라이머 및 제2 폴리머라제 연쇄 반응 프라이머, 및 각각 상기한 바와 같은 RNA 분자, 또는 서열 78-86 및 서열 144, 145, 153, 167, 177, 193, 199, 205, 208, 215, 217 및 220으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 암호화하는 RNA 분자의 인접하고 있는 뉴클레오티드 중 약 10개 이상을 포함하는 제1 및 제2 프라이머를 포함한다.
다른 관련 양태내에서, 진단 키트는 상기한 바와 같은 DNA 분자, 또는 서열 78-86 및 서열 144, 145, 153, 167, 177, 193, 199, 205, 208, 215, 217 및 220으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 DNA 분자의 인접하고 있는 뉴클레오티드 중 약 15개 이상을 포함하는 올리고뉴클레오티드 프로브를 1개 이상 포함한다.
다른 관련된 양태에서, 본 발명은 환자에 있어서 유방암의 진행을 모니터링하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 본 방법은 (a) 제1 시점에서 상기한 바와 같은 폴리펩타이드의 양을 생물학적 샘플 중에서 검출하고; (b) 후속 시점에서 단계 (a)를 반복하고; (c) 단계 (a) 및 (b)에서 검출한 폴리펩타이드의 양을 비교하여, 이로부터 환자에 있어서 유방암의 진행을 모니터링함을 특징으로 한다. 다른 양태에서, 본 방법은 (a) 제1 시점에서 상기한 바와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 RNA 분자의 양을 생물학적 샘플 중에서 검출하고; (b) 후속 시점에서 단계 (a)를 반복하고; (c) 단계 (a) 및 (b)에서 검출한 RNA 분자의 양을 비교하여, 이로부터 환자에서 유방암의 진행을 모니터링함을 특징으로 한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 서열 78-86, 서열 144, 145, 153, 167, 177, 193, 199, 208, 215, 217, 220으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 및 엄격한 조건하에서 이에 하이브리드화되는 서열에 의해 폴리펩타이드가 암호화되는, 상기한 바와 같은 환자에서의 유방암의 진행을 모니터링하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 상기한 바와 같은 폴리펩타이드를 생리학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 약제학적 조성물, 및 면역 반응 증강제 또는 애쥬번트와 함께 상기한 바와 같은 폴리펩타이드를 포함하는 백신을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 서열 78-86, 서열 144, 145, 153, 167, 177, 193, 199, 208, 215, 217 및 220으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 및 엄격한 조건하에서 이에 하이브리드화되는 서열에 의해 암호화되는 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물 및 백신을 제공한다.
관련 양태에서, 본 발명은 상기한 바와 같은 약제학적 조성물 또는 백신을 환자에게 투여함을 특징으로 하여, 환자에게서 유방암의 진행을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 이들 및 기타 양태는 하기 상세한 기술과 첨부되는 도면을 참고로 하여 명백해질 것이다. 본 명세서에서 기술되는 모든 문헌은 본 명세서에서 마치 각각이 개별적으로 인용되는 것처럼 전체 내용이 참고로 인용된다.
본 발명은 일반적으로 유방암의 검출 및 치료에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 유방 종양 조직에서 우선적으로 발현되는 뉴클레오티드 및 상기와 같은 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드에 관한 것이다. 상기 뉴클레오티드 서열과 폴리펩타이드는 유방암의 예방 및 치료용 백신 및 약제학적 조성물에 사용할 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 또한 환자에게서 유방암을 진단하고 질환의 진행을 모니터링하는데 유용한 항체와 같은 화합물을 제조하는데 사용할 수 있다.
도 1은 정상적인 유방 조직으로부터 제조된 cDNA(레인 1 및 2) 및 동일한 환자로부터의 유방 종양 조직으로부터 제조된 cDNA(레인 3 및 4)로부터 수득하여, 겔 전기영동법에 의해 분리된, 차동 디스플레이 PCR 생성물을 나타낸다. 화살표는 B18Ag1에 대응하는 밴드를 나타낸다.
도 2는 유방 종양 조직 중 B18Ag1 mRNA의 수준(레인 1)과 정상적인 유방 조직 중에서의 수준을 비교하는 노던 블롯이다.
도 3은 RNase아제 보호 검정법으로 측정한 바와 같은 여러가지 정상 조직 및 비-유방 종양 조직에서의 B18Ag1 mRNA의 수준과 비교한 유방 종양 조직에서의 수준을 나타낸다.
도 4는 B18Ag1에 대한 XbaI 제한 분해물의 말단으로부터 수득한 추가의 레트로바이러스 서열(서열 3-서열 10)의 위치를 나타내는 게놈성 클론이다.
도 5A 및 5B는 B18Ag1을 함유하는 레트로바이러스 요소에 대한 서열화 전략, 게놈성 조직화 및 예측되는 개방 판독 프레임을 나타낸다.
도 6은 대표적인 유방 종양-특이적 cDNA B18Ag1의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 7은 대표적인 유방 종양-특이적 cDNA B17Ag1의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 8은 대표적인 유방 종양-특이적 cDNA B17Ag2의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 9는 대표적인 유방 종양-특이적 cDNA B13Ag2a의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 10은 대표적인 유방 종양-특이적 cDNA B13Ag1b의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 11은 대표적인 유방 종양-특이적 cDNA B13Ag1a의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 12는 대표적인 유방 종양-특이적 cDNA B11Ag1의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 13은 대표적인 유방 종양-특이적 cDNA B3CA3c의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 14는 대표적인 유방 종양-특이적 cDNA B9CG1의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 15는 대표적인 유방 종양-특이적 cDNA B9CG3의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 16은 대표적인 유방 종양-특이적 cDNA B2CA2의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 17은 대표적인 유방 종양-특이적 cDNA B3CA1의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 18은 대표적인 유방 종양-특이적 cDNA B3CA2의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 19는 대표적인 유방 종양-특이적 cDNA B3CA3의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 20은 대표적인 유방 종양-특이적 cDNA B4CA1의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 21A는 유방암 조직(레인 1-8) 및 정상적인 유방 조직(레인 9-13) 및 H2O(레인 14)에서의 유방 종양 유전자의 RT-PCR 분석을 나타낸다.
도 21B는 전립선 종양(레인 1,2), 결장 종양(레인 3), 폐 종양(레인 4), 정상적인 전립선(레인 5), 정상적인 결장(레인 6), 정상적인 신장(레인 7), 정상적인 간(레인 8), 정상적인 폐(레인 9), 정상적인 난소(레인 10, 18), 정상적인 췌장(레인 11, 12), 정상적인 골격근(레인 13), 정상적인 피부(레인 14), 정상적인 위(레인 15), 정상적인 고환(레인 16), 정상적인 소장(레인 17), HBL-100(레인 19), MCF-12A(레인 20), 유방 종양(레인 21-23), H2O(레인 24), 및 결장 종양(레인 25) 중에서 유방 종양 유전자의 RT-PCR 분석을 나타낸다.
상기한 바와 같이, 본 발명은 일반적으로 유방암의 진단, 모니터링 및 치료용 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 명세서에 기술된 조성물은 폴리펩타이드, 핵산 서열 및 항체를 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드는 일반적으로 정상적인 유방 조직에서보다 사람의 유방 종양 조직 중에서 더 높은 수준(즉, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 RNA의 수준이 정상 조직에서보다 적어도 2배 더 높음)으로 발현되는 단백질의 적어도 일부 영역을 포함한다. 상기와 같은 폴리펩타이드를 본 명세서에서는 유방 종양-특이적 폴리펩타이드로 언급하며, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA를 유방 종양-특이적 cDNA로 언급한다. 본 발명의 핵산 서열은 일반적으로 상기한 바와 같은 폴리펩타이드의 전체 또는 일부 영역을 암호화하는 DNA 또는 RNA 서열, 또는 상기와 같은 서열에 대해 상보적인 서열을 포함한다. 항체는 일반적으로 상기한 바와 같은 폴리펩타이드의 영역에 결합할 수 있는 면역 시스템 단백질, 또는 이의 단편이다. 항체는 본 명세서에 기술된 바와 같은 모노클로날 항체의 생성을 포함하는 세포 배양 기술에 의해, 또는 재조합 항체가 생산되도록, 적합한 세균 또는 포유류 세포 숙주에게 항체 유전자를 형질감염시킴으로써 생산할 수 있다.
본 발명의 범주내의 폴리펩타이드는 비제한적으로, B18Ag1로 표시되는 서열과 같은, 사람의 내인성 레트로바이러스 서열(도 5 및 서열 1)에 의해 암호화되는 폴리펩타이드(및 이의 에피토프)를 포함한다. 또한, B18Ag1을 함유하는 레트로바이러스 게놈내의 다른 서열(서열 141)에 의해 암호화되는 폴리펩타이드가 본 발명의 범주내에 포함된다. 상기와 같은 서열은 비제한적으로, 서열 3 내지 서열 10으로 표시되는 서열을 포함한다. B18Ag1은 문헌[참조: Werner et al., Virology 174: 225-238(1990)]에 기술된 바와 같은 내인성 사람 레트로바이러스 성분 S71의 gag p30 유전자와 상동성을 가지며, 또한 약 30개의 다른 레트로바이러스의 gag 유전자와 상동성을 나타낸다. 이후 더욱 상세히 논의되는 바와 같이, 본 발명은 또한 서열 11 내지 서열 77 및 서열 142, 143, 146-152, 154-166, 168-176, 178-192, 194-198, 200-204, 206, 207, 209-214, 216, 218, 219 및 221-227로 표시되는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩타이드와 같은, 수개의 추가 유방 종양-특이적 폴리펩타이드를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "폴리펩타이드"는 본 명세서에 나타낸 서열을 함유하는 완전한 길이의 단백질을 포함하여, 일정 길이의 아미노산 쇄를 포함한다. 본 명세서에 기술한 바와 같은 서열을 함유하는 단백질의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드는 전체적으로 에피토프로 이루어질 수 있거나, 추가의 서열을 함유할 수 있다. 추가의 서열은 천연 단백질로부터 유래될 수 있거나 이종성일 수 있으며, 상기와 같은 서열은 면역원성 또는 항원성을 가질 수 있다(그러나 가질 필요가 없을 수도 있다).
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "에피토프"는 B-세포 및/또는 T-세포 표면 항원 수용체에 의해 인식되는(즉, 특이적으로 결합되는) 폴리펩타이드의 영역이다. 에피토프는 일반적으로 문헌[참조: Paul, Fundamental Immunology, 3rd ed., 243-247(Raven Press, 1993)] 및 본 명세서에서 인용되는 문헌에 요약되어 있는 바와 같이 숙지되어 있는 기술을 이용하여 확인할 수 있다. 상기와 같은 기술은 항원-특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과의 반응 능력에 대해 천연 폴리펩타이드로부터 유도된 폴리펩타이드를 선별하는 것이다. 폴리펩타이드의 에피토프는 (예를 들어, ELISA 및/또는 T-세포 반응성 검정법에서) 완전한 길이의 폴리펩타이드의 반응성과 유사한 수준으로 상기와 같은 항혈청 및/또는 T-세포와 반응하는 분획이다. 상기와 같은 선별은 일반적으로 문헌[참조: Harlow 및 Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]에 기술된 바와 같은, 당해 분야의 숙련가에게 숙지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다. B-세포 및 T-세포 에피토프는 또한 컴퓨터 분석을 통하여 예측할 수 있다. 정상 조직에서 우선적으로 발현되는 (추가의 아미노산 서열을 갖거나 갖지 않는) 폴리펩타이드의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드가 본 발명의 범주내에 포함된다.
본 발명의 조성물 및 방법은 또한 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 폴리펩타이드 및 핵산 서열의 변이체를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 폴리펩타이드 "변이체"는 상기 폴리펩타이드의 항원성 및/또는 면역원성이 보유되면서, 치환 및/또는 개질에 있어서 천연 폴리펩타이드와 구별되는 폴리펩타이드이다. 상기와 같은 변이체는 일반적으로 상기 폴리펩타이드 서열 중 하나를 개질시키고 이렇게 개질된 폴리펩타이드의 항혈청 및/또는 T-세포와의 반응성을 상기한 바와 같이 평가하여 확인할 수 있다. 본 명세서에 기술된 폴리펩타이드의 바람직한 변이체 중 하나는 뉴클레오티드 위치의 20% 미만에서 뉴클레오티드 치환, 결실, 삽입 및/또는 개질을 함유하는 변이체이다.
변이체가 보존적인 치환을 함유하는 것이 바람직하다. "보존적인 치환"은 펩타이드 화학 분야에서의 숙련가들이 폴리펩타이드의 2차 구조 및 수치 특성(hydropathic nature)이 실질적으로 변화되지 않았다고 예측할 수 있을 정도로, 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로 아미노산이 치환되는 것이다. 일반적으로, 다음 그룹의 아미노산은 보존적 변화를 나타낸다: (1) ala, pro, gly, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; 및 (5) phe, tyr, trp, his.
변이체는 또한(또는 달리), 예를 들어, 폴리펩타이드의 면역원성 또는 항원성, 2차 구조 및 수치 특성에 최소의 영향을 주는 아미노산의 결실 또는 첨가에 의해 개질될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드를 단백질의 전달을 동시-해독식으로 또는 후-해독식으로 지시하는 단백질의 N-말단에서 시그날(또는 리더) 서열에 접합시킬 수 있다. 폴리펩타이드를 또한 폴리펩타이드(예를 들어, 폴리-His)의 합성, 정제 또는 확인의 용이성을 위하여 또는 고체 지지체에 대한 폴리펩타이드의 결합을 향상시키기 위하여 링커 또는 다른 서열에 접합시킬 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드를 면역글로불린 Fc 영역에 접합시킬 수 있다.
일반적으로, 본 명세서에 기술된 폴리펩타이드의 전체 또는 일부를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 여러가지 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA 분자는 차동 디스플레이 PCR을 사용하여, 대응하는 mRNA의 유방 종양-특이적 발현을 기초로 하여 클로닝할 수 있다. 이 방법은 정상 및 유방 종양 조직으로부터 제조된 RNA 주형으로부터 증폭된 생성물을 비교한다. cDNA는 (dT)12AG 프라이머를 사용하여 RNA의 역전사법으로 제조할 수 있다. 랜덤 프라이머를 사용하여 cDNA를 증폭시킨 다음, 종양 RNA에 특이적인 증폭된 생성물에 대응하는 밴드를 은 착색된 겔로부터 절단하여 적합한 벡터(예를 들어, T-벡터, Novagen, Madison, WI)내로 서브클로닝할 수 있다. 본 명세서에 기술된 유방 종양-특이적 폴리펩타이드의 전체 또는 일부를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열 87-125에서 나타나는 랜덤 프라이머를 사용하여 상기한 바와 같이 제조된 cDNA로부터 증폭시킬 수 있다.
별법으로, 본 명세서에 기술된 바와 같은 폴리펩타이드(또는 이의 일부 영역)를 암호화하는 유전자는 사람의 게놈성 DNA, 또는 유방암 cDNA로부터, 폴리머라제 연쇄 반응을 통하여 증폭시킬 수 있다. 이 방법의 경우, B18Ag1 서열-특이적 프라이머는 서열 1로 제공되는 서열을 기준으로 하여 디자인할 수 있으며, 상업적으로 입수하거나 합성할 수 있다. 유방 종양 cDNA로부터 증폭시키기에 적합한 프라이머쌍은 (5'ATG GCT ATT TTC GGG GGC TGA CA)(서열 126)과 (5' CCG GTA TCT CCT CGT GGG TAT T(서열 127)이다. 이어서, B18Ag1의 증폭된 분획을 사용하여 사람의 게놈성 DNA 라이브러리 또는 유방 종양 cDNA 라이브러리로부터, 문헌[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY(1989)]에 기술된 바와 같은, 숙지된 기술을 이용하여 완전한 길이의 유전자를 단리시킬 수 있다. B18Ag1이 일부인 레트로바이러스 게놈내의 다른 서열은 프로브로서 B18Ag1-특이적 서열을 사용하여 사람의 게놈성 라이브러리를 선별하여 유사하게 제조할 수 있다. 이어서, 서열 141에서 나타나는 레트로바이러스성 게놈으로부터 단백질로 해독된 뉴클레오티드는 상응하는 cDNA를 클로닝시키고, 개방 판독 프레임을 예측하고 T7과 같은 바이러스성 프로모터를 함유하는 벡터내로 적합한 cDNA를 클로닝시킴으로써 측정할 수 있다. 생성된 작제물은 단백질을 발현시키는 뉴클레오티드 서열을 확인하기 위해 당해 분야의 숙련가에게 공지된 기술을 이용하여 해독 반응에 사용할 수 있다. 유사하게, 본 명세서에 기술된 나머지 유방 종양-특이적 폴리펩타이드에 대해 특이적인 프라이머는 서열 11 내지 서열 86 및 서열 142 내지 서열 226으로 제공되는 뉴클레오티드 서열을 기본으로 하여 디자인할 수 있다.
상기한 DNA 서열에 의해 암호화된 재조합 폴리펩타이드는 DNA 서열로부터 용이하게 제조할 수 있다. 예를 들어, 배양 배지로 재조합 단백질 또는 폴리펩타이드를 분비하는 적합한 숙주/벡터 시스템으로부터의 상등액을 시판되고 있는 필터를 사용하여 우선 농축시킬 수 있다. 농축 후, 농축물을 친화성 매트릭스 또는 이온 교환 수지와 같은 적합한 정제 매트릭스에 적용시킬 수 있다. 최종적으로, 1개 이상의 역상 HPLC 단계를 사용하여 재조합 폴리펩타이드를 추가로 정제할 수 있다.
일반적으로, 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 여러가지 발현 벡터를 사용하여 본 발명의 재조합 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다. 발현은 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 분자를 함유하는 발현 벡터로 형질전환시키거나 형질감염시킨 적합한 숙주 세포 중에서 수행할 수 있다. 적합한 숙주 세포로는 원핵세포, 효모 및 고등 진핵 세포가 있다. 숙주 세포로서 이. 콜라이(E. coli), 효모 또는 COS 또는 CHO와 같은 포유동물 세포주를 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기와 같은 기술을 사용하여 천연 폴리펩타이드의 에피토프 또는 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 제조할 수 있다. 예를 들어, 천연 폴리펩타이드의 변이체는 일반적으로 올리고뉴클레오티드-지시된 부위-특이적 돌연변이유발과 같은, 표준 돌연변이유발 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, DNA 서열 부분을 회수하여 절단된 폴리펩타이드를 제조할 수 있다. 약 100개 미만, 일반적으로는 약 50개 미만의 아미노산을 갖는 분획 및 기타 변이체는 또한 당해 분야의 숙련가들에게 숙지된 기술을 이용하는 합성 방법으로 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 상기와 같은 폴리펩타이드는 메리필드(Merrifield) 고체상 합성법(여기서는 아미노산을 성장하는 아미노산 쇄에 연속해서 가함)과 같은 시판되는 고체상 기술을 이용하여 합성할 수 있다[참조: Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146(1963)]. 폴리펩타이드의 자동화 합성용 장치는 공급처(예: Applied BioSystems, Inc., Foster City, CA)로부터 상업적으로 입수가능하며, 제조업자의 지침에 따라서 작동시킬 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열 1, 서열 3 내지 서열 77 또는 서열 142, 143, 146-152, 154-166, 168-176, 178-192, 194-198, 200-204, 206, 207, 209-214, 216, 218, 219, 221-227 중 하나로 나타내는 서열을 갖는 DNA 분자에 의해 암호화된 아미노산 서열, 뉴클레오티드 위치 중 20% 미만의 위치에서 뉴클레오티드 치환, 결실, 삽입 및/또는 개질 중 1개 이상을 함유하는 DNA 분자에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 변이체, 및 상기 폴리펩타이드의 에피토프를 포함한다. 본 발명의 범주내의 폴리펩타이드는 또한 엄격한 조건하에서 서열 1, 서열 3 내지 서열 77 또는 서열 142, 143, 146-152, 154-166, 168-176, 178-192, 194-198, 200-204, 206, 207, 209-214, 216, 218, 219, 221-227 중 하나로 나타내는 서열을 갖는 DNA 분자에 하이브리드화되는 DNA 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드(및 이의 에피토프)를 포함한다(여기서, DNA 서열은 전체 서열에서 80% 이상이 제시된 서열과 동일하며 뉴클레오티드 서열에 상응하는 RNA는 정상적인 유방 조직에서보다 사람의 유방 종양 조직에서 더 높은 수준으로 발현됨). 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "엄격한 조건"이란 6X SSC, 0.2% SDS 용액으로의 예비세척; 65℃, 6X SSC, 0.2% SDS에서 밤새 하이브리드화; 이어서 1X SSC, 0.1% SDS로 65℃에서 각각 30분간의 세척 2회 및 1X SSC, 0.1% SDS로 65℃에서 각각 30분간의 세척 2회를 언급하는 것이다. 본 발명에 따르는 DNA 분자는 상기 폴리펩타이드 중 하나를 암호화하는 분자를 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서, 항체를 제공한다. 항체는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 기술을 변형시켜 제조할 수 있다[참조: Harlow 및 Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]. 상기와 같은 기술에서는, 폴리펩타이드를 포함하는 면역원을 먼저 여러가지 포유류(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 양 또는 염소)에게 주사한다. 이 단계에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 개질시키지 않고 면역원으로 제공할 수 있다. 별법으로, 상대적으로 짧은 폴리펩타이드의 경우 특히, 폴리펩타이드를 소 혈청 알부민 또는 키홀 림펫 헤모시아닌과 같은 담체 단백질에 결합시킬 경우 탁월한 면역 반응이 도출될 수 있다. 면역원을 동물 숙주에게, 바람직하게는 1개 이상의 부스터 면역화를 포함하는 설정된 스케쥴에 따라서 주사하고 동물로부터 주기적으로 채혈한다. 이어서, 폴리펩타이드에 대해 특이적인 폴리클로날 항체를 상기와 같은 항혈청으로부터, 예를 들어, 적합한 고체 지지체에 커플링된 폴리펩타이드를 사용하는 친화성 크로마토그래피로 정제할 수 있다.
당해 항원성 폴리펩타이드에 대해 특이적인 모노클로날 항체는, 예를 들어, 문헌[참조: Kohler 및 Milstein, Eur. J. Immulon. 6:511-519(1976)]에 기술된 방법, 및 이 방법의 개량법을 이용하여 제조할 수 있다. 간략하게, 이들 방법은 목적하는 특이성(즉, 당해 폴리펩타이드와의 반응성)을 갖는 항체를 생산할 수 있는 불멸 세포주를 제조하는 것이다. 상기와 같은 세포주는, 예를 들어, 상기한 바와 같이 면역화시킨 동물로부터 수득한 비장 세포로부터 생성시킬 수 있다. 이어서, 상기 비장 세포를, 예를 들어, 골수종 세포 융합 파트너, 바람직하게는 면역시킨 동물과 동일 기원의 것과 융합시켜 불멸화시킨다. 여러가지 융합 기술을 이용할 수 있다. 예를 들어, 비장 세포와 골수종 세포를 수분간 비이온성 세제와 결합시킨 다음, 하이브리드 세포는 성장시키나, 골수종 세포는 성장시키지 않는 선택적인 배지상에 저밀도로 플레이팅시킬 수 있다. 바람직한 선택 기술은 HAT(하이포크산틴, 아미노프테린, 티미딘) 선택법을 이용한다. 충분한 시간, 통상적으로 약 1 내지 2주 후, 하이브리드의 콜로니가 관찰된다. 단일 콜로니를 선택하여 이의 배양 상등액을 폴리펩타이드에 대한 결합 활성에 대해 시험한다. 반응성과 특이성이 높은 하이브리도마가 바람직하다.
모노클로날 항체는 성장하는 하이브리도마 콜로니의 상등액으로부터 단리할 수 있다. 또한, 마우스와 같은 적합한 척추동물 숙주의 복강내로 하이브리도마 세포주를 주사하는 것과 같은, 여러가지 기술을 이용하여 수율을 향상시킬 수 있다. 이어서, 모노클로날 항체를 복수 유체 또는 혈액으로부터 수거할 수 있다. 크로마토그래피, 겔 여과, 침전 및 추출과 같은 통상의 기술로 항체로부터 오염물질을 제거할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드는 정제 공정에서, 예를 들어, 친화성 크로마토그래피 단계에서 사용할 수 있다.
예를 들어, 환자에서의 유방암의 검출 방법에 항체를 사용할 수 있다. 상기와 같은 방법은 적합한 생물학적 샘플 중에서 본 명세서에 기술된 바와 같은 유방 종양-특이적 폴리펩타이드의 존재 또는 부재를 검출하기 위하여 항체를 사용하는 것을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 적합한 생물학적 샘플로는 종양 또는 정상 조직 생검체, 유방절제물, 혈액, 임파선종, 혈청 또는 뇨 샘플, 또는 기타 조직, 균질물, 또는 환자로부터 수득한 이들의 추출물이 있다.
항체를 사용하여 샘플 중의 폴리펩타이드 마커를 검출하는, 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 여러가지 검정 방식이 있다. 참조: Harlow 및 Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. 예를 들어, 웨스턴 블롯 포맷으로 검정을 수행할 수 있는데, 이 방식은 생물학적 샘플로부터의 단백질 제제를 겔 전기영동시켜 적합한 막으로 옮긴 다음, 항체와 반응시키는 것이다. 이어서, 이후 기술되는 바와 같은 적합한 검출 반응제를 사용하여 막상의 항체 존재를 검출할 수 있다.
다른 양태에서, 상기 검정법은 폴리펩타이드를 지지시키고 샘플의 나머지 부분으로부터 이를 회수하기 위하여 고체 지지체상에 고정화시킨 항체를 사용한다. 이후, 결합된 폴리펩타이드는 리포터 그룹을 함유하는 제2의 항체 또는 시약을 사용하여 검출할 수 있다. 별법으로, 폴리펩타이드를 리포터 그룹으로 표지화시키고 항체와 샘플을 배양시킨 후, 고정화된 항체에 결합되도록 하는 경쟁적 검정법을 이용할 수 있다. 표지된 폴리펩타이드가 항체에 결합하는 것을 억제하는 샘플 성분의 억제 정도가 샘플의 고정화된 항체와의 반응성의 지표가 되며, 결과, 샘플 중 폴리펩타이드의 농도의 지표가 된다.
고체 지지체는 항체가 부착될 수 있는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 물질이다. 예를 들어, 고체 지지체는 미세역가판 또는 니트로셀룰로즈 필터 또는 기타 적합한 막 중의 시험 벽일 수 있다. 또한, 지지체는 유리, 유리섬유, 라텍스와 같은 비드 또는 디스크 또는 폴리스티렌 또는 폴리비닐클로라이드와 같은 플라스틱 물질일 수 있다. 또한, 지지체는, 예를 들어, 미국 특허 제5,359,681호에 기술된 바와 같은 자기 입자 또는 섬유 광학 센서일 수 있다.
항체는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 여러가지 방법을 사용하여 고체 지지체상에 고정화시킬 수 있으며, 이는 상기 특허 및 과학 논문에 충분히 기술되어 있다. 본 발명의 내용 중, 용어 "고정화"란 흡착과 같은 비공유결합성 결합, 및 공유결합성 부착(이는 항원과 지지체상의 작용기간의 직접적인 결합할 수 있거나 가교결합제를 사용한 결합일 수 있음) 둘다를 언급한다. 미세역가판 중의 벽 또는 막에 흡착시켜 고정화시키는 것이 바람직하다. 그러한 경우, 항체를 적합한 완충액 중에서 고체 지지체와 충분한 시간 동안 접촉시킴으로써 흡착을 수행할 수 있다. 접촉 시간은 온도에 따라 변화되지만 전형적으로 약 1시간 내지 1일이다. 일반적으로, 플라스틱 미세역가판(예; 폴리스티렌 또는 폴리비닐클로라이드)의 벽과 약 10ng 내지 약 1㎍, 바람직하게는 약 100 내지 200ng 범위의 양의 항체를 접촉시키는 것이 적합한 양의 폴리펩타이드를 고정화시키기에 충분하다.
또한, 고체 지지체에 항체를 공유결합식으로 부착시키는 것은 일반적으로 지지체와 항체상의 하이드록실 또는 아미노 그룹과 같은 작용 그룹 모두와 반응하는 이작용성 시약을 먼저 지지체와 반응시킴으로써 수행할 수 있다. 예를 들어, 벤조퀴논을 사용하거나 지지체상의 알데히드기를 결합 파트너상의 아민 및 활성 수소로 축합시킴으로써 적합한 중합체 피복물을 갖는 지지체에 항체를 공유결합식으로 부착시킬 수 있다[참조: Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook(1991) at A12-A13].
특정 양태에서, 샘플 중 폴리펩타이드의 검출용 검정법은 2개-항체 샌드위치 검정법이다. 이 검정법은 먼저 고체 지지체, 통상적으로 미세역가판의 벽상에 고정화시킨 항체를 샘플내의 폴리펩타이드와 같은 생물학적 샘플과 접촉시켜 고정화된 항체에 결합시킴으로써 수행할 수 있다. 이후, 비결합 샘플을 고정화된 폴리펩타이드-항체 복합체로부터 제거하고 폴리펩타이드상의 상이한 부위에 결합할 수 있는 2차 항체(리포터 그룹을 함유함)를 가한다. 이어서, 고체 지지체에 결합된 상태로 남아있는 2차 항체의 양을 특정 리포터 그룹에 대해 적합한 방법을 사용하여 측정한다.
더욱 상세하게 기술하면, 일단 항체를 상기한 바와 같은 지지체상에 고정화시키고, 지지체상의 나머지 단백질 결합 부위는 전형적으로 차단시킨다. 적합한 차단제는 소 혈청 알부민 또는 Tween 20TM(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)과 같은, 당해 분야의 숙련가에게 숙지되어 있는 것이다. 다음, 고정화된 항체를 샘플과 함께 배양시키고, 폴리펩타이드를 항체에 결합시킨다. 샘플은 배양시키기 전에 인산염-완충된 염수(PBS)와 같은 적합한 희석제로 희석시킬 수 있다. 일반적으로, 적합한 접촉 시간(즉, 배양 시간)은 유방암 환자로부터 입수한 샘플내의 폴리펩타이드의 존재를 검출하기에 충분한 기간이다. 접촉 시간은 결합된 폴리펩타이드와 결합되지 않은 폴리펩타이드간의 평형 상태에서 수행된 결합 수준이 95% 이상이 되기에 충분한 것이 바람직하다. 당해 분야의 숙련가들은 평형을 이루기에 필요한 시간이 기간 중에 일어나는 결합 수준을 검정함으로써 용이하게 측정할 수 있음을 인지하고 있다. 실온에서, 약 30분의 배양 시간이 일반적으로 충분하다.
결합되지 않은 샘플은 고체 지지체를 0.1% Tween 20TM을 함유하는 PBS와 같은 적합한 완충액으로 세척함으로써 제거할 수 있다. 이어서, 리포터 그룹을 함유하는 2차 항체를 고체 지지체에 가할 수 있다. 바람직한 리포터 그룹으로서는 효소(서양고추냉이 퍼옥시다제), 기질, 보조인자, 억제제, 염료, 방사선핵종, 발광성기, 형광성기 및 비오틴이 있다. 항체의 리포터 그룹으로의 접합은 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 표준 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
이어서, 2차 항체는 결합된 폴리펩타이드를 검출하기에 충분한 시간 동안 고정화된 항체-폴리펩타이드 복합체와 함께 배양시킨다. 적합한 시간은 일반적으로 기간에 걸쳐 일어나는 결합 수준을 검정함으로써 측정할 수 있다. 이어서, 결합되지 않은 2차 항체를 제거하고 리포터 그룹을 사용하여 결합된 2차 항체를 검출한다. 리포터 그룹을 검출하기 위하여 사용되는 방법은 리포터 그룹의 특성에 따른다. 방사성 그룹의 경우, 섬광 계수법 또는 방사선 사진법이 일반적으로 적합하다. 분광법을 사용하여 염료, 발광성기 및 형광성기를 검출할 수 있다. 비오틴은 상이한 리포터 그룹(통상적으로 방사성 또는 형광성기 또는 효소)에 커플링된 아미딘을 사용하여 검출할 수 있다. 효소 리포터 그룹은 일반적으로 기질을 (일반적으로 특정 기간 동안) 첨가한 다음, 반응 생성물의 분광 또는 기타 분석법으로 검출할 수 있다.
유방암의 존재 또는 부재를 측정하기 위하여, 고체 지지체에 결합된 상태로 존재하는 리포터 그룹으로부터 검출된 시그날은 일반적으로 비-종양 조직으로부터 확립된 예정된 절단 수치에 대응하는 시그날과 비교한다. 바람직한 양태에서, 절단 수치는 고정화된 항체를 유방암을 갖지 않은 환자로부터의 샘플과 배양시킬 경우 수득한 평균 시그날이다. 일반적으로, 설정한 절단 수치 이상에서 3개의 표준 편차인 시그날을 발생시키는 샘플을 유방암에 대해 포지티브인 것으로 간주할 수 있다. 또 다른 바람직한 양태에서, 절단 수치는 문헌[참조: Sackett et al., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, p. 106-7(Little Brown and Co., 1985)]의 방법에 따라서, 리시버 오퍼레이터 커브(Receiver Operator Curve)을 사용하여 측정한다. 간략하면, 상기 양태에서, 절단 수치는 진단 시험 결과에 대한 각각의 가능한 절단 수치에 대응하는 진짜 포지티브 비율(즉, 감응성) 및 가짜 포지티브 비율(100%-특이성) 쌍의 플롯으로부터 측정할 수 있다. 좌측 코너 상부에 가장 접하는 플롯상의 절단 수치(즉, 최대 면적을 감싸는 수치)가 가장 정확한 절단 수치이고, 상기 방법으로 측정한 절단 수치보다 더 높은 시그날을 발생시키는 샘플은 포지티브인 것으로 간주할 수 있다. 또한, 절단 수치를 플롯을 따라 좌측으로 이동시켜 가짜 포지티브 비율을 최소화시키거나, 우측으로 이동시켜, 가짜 네가티브 비율을 최소화시킬 수 있다. 일반적으로, 상기 방법으로 측정한 절단 수치보다 더 높은 시그날을 발생시키는 샘플을 유방암에 대해 포지티브인 것으로 간주한다.
관련 양태에서, 상기 검정을 항체가 니트로셀룰로즈와 같은 막상에 고정화되어 있는 유동식(flow-through) 또는 스트립 시험 방식으로 수행한다. 유동식 시험에서는, 샘플내의 폴리펩타이드가 샘플이 막을 통과함에 따라 고정화된 항체에 결합한다. 이어서, 표지된 2차 항체가 2차 항체를 함유하는 용액이 막을 통하여 유동함에 따라 항체-폴리펩타이드 복합체에 결합한다. 이후, 결합된 2차 항체의 검출은 상기한 바와 같이 수행할 수 있다. 스트립 시험 방식에서는, 항체가 결합하는 막의 한쪽 말단을 샘플을 함유하는 용액에 침지시킨다. 샘플은 2차 항체를 함유하는 영역을 통하여 막을 따라 고정화된 항체 영역으로 이동한다. 고정화된 항체 영역에서 2차 항체를 농축시켜 유방암의 존재를 나타낸다. 전형적으로, 상기 부위에서 2차 항체를 농축시키면 육안으로 판독할 수 있는 선과 같은 패턴이 발생된다. 그러한 패턴이 없으면 네가티브 결과를 나타내는 것이다. 일반적으로, 막상에 고정화된 항체의 양을 선택하여 생물학적 샘플이 상기한 바와 같은 방식으로, 2개-항체 샌드위치 검정법에서 포지티브 시그날을 발생시키기에 충분한 수준의 폴리펩타이드를 함유하는 경우 육안으로 식별가능한 패턴을 발생시킨다. 막상에 고정화된 항체의 양의 범위가 약 25ng 내지 약 1㎍인 것이 바람직하고, 약 50ng 내지 약 1㎍인 것이 더욱 바람직하다. 상기와 같은 시험은 전형적으로 매우 소량의 생물학적 샘플을 사용하여 수행할 수 있다.
환자에 있어서 유방암의 존재 또는 부재는 또한 생물학적 샘플(예를 들어, 환자로부터의 생검체, 유방절제물 및/또는 혈액 샘플)내에서 본 명세서에 기술된 바와 같은 유방암-특이적 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA의 수준을 설정된 절단 수치에 대하여 평가함으로써 측정할 수 있다. 상기와 같은 평가는, 예를 들어, 동일반응계 내에서 하이브리드화 및 폴리머라제 연쇄 반응에 의한 증폭과 같은, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 여러가지 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여 상기 생물학적 샘플 중 하나로부터 단리된 RNA로부터 제조된 cDNA로부터 서열을 증폭시킬 수 있다. 상기와 같은 증폭에 사용하기 위한 서열-특이적 프라이머는 서열 1 또는 서열 11 내지 서열 86 및 서열 142 내지 서열 226 중 하나로 제공되는 서열을 기본으로 하여 디자인할 수 있으며, 매입하거나 합성할 수 있다. 본 명세서에 논의된 바와 같은 B18Ag1의 경우, 적합한 프라이머쌍 중 하나가 B18Ag1-2(5' ATG GCT ATT TTC GGG GGC TGA CA)(서열 126)과 B18Ag1-3(5' CCG GTA TCT CCT CGT GGG TAT T)(서열 127)이다. 이후, PCR 반응 생성물을 겔 전기영동법으로 분리하고 당해 분야의 숙련가들에게 숙지된 방법에 따라서 가시화시킨다. 증폭은 전형적으로 부합되는 쌍의 조직(동일 개체로부터의 종양과 비-종양 조직) 또는 부합되지 않는 쌍의 조직(상이한 개체로부터의 종양 및 비-종양 조직)으로부터 수득한 샘플에 대하여 수행한다. 증폭 반응을 2배씩 스패닝시키는 cDNA의 수개의 희석물에 대해 수행하는 것이 바람직하다. 비-종양 샘플의 동일한 희석물과 비교하여 종양 샘플의 수개의 희석물에서의 발현이 2배 이상인 것을 포지티브로 간주한다.
유전자 특이성을 정의하는데 있어서 중요한 아가로즈 및 에티듐 브로마이드 착색법을 사용하는 통상의 RT-PCR 프로토콜은 이들을 정량적으로(즉, 포화 및/또는 적정 곡선의 작도) 만드는데 필요한 시간과 노력, 이들의 샘플 산출물 때문에 이들 자체를 진단 키트로 개발할 수 없었다. 이 문제는 단일 튜브에서 검정을 수행할 수 있도록 하고, 또한 96개 웰 플레이트 방식으로 사용할 수 있도록 개질시킬 수 있는 실제 시간 RT-PCR 과 같은 방법을 개발함으로써 해결되었다. 상기와 같은 방법을 수행하기 위한 장치는 ABI/Perkin Elmer로부터 입수할 수 있다. 또한, 표지시킨 프로브(예를 들어, 디곡시제닌)를 프로브에 대한 표지시킨(예를 들어, 효소 형광성, 방사성) 항체와 함께 사용하는 다른 고 수율 검정법을 96개 웰 플레이트 검정법의 개발에 사용할 수 있다.
환자에 있어서 유방암의 존재 또는 부재를 측정하기 위한 다른 방법에서, 기술된 유방암-특이적 폴리펩타이드 중 1종 이상을 피부 시험에 사용할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "피부 시험"은 상기한 바와 같은 폴리펩타이드 중 1종 이상을 피부내로 주사한 후 지연된 타입의 과민성(DTH) 반응(팽윤, 발적 또는 피부염)을 측정하는, 환자에게서 직접 수행하는 검정법이다. 상기와 같은 주사는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들을 환자의 피부 세포와 접촉시키기에 충분히 적합한 기구, 예를 들어 튜버큘린 주사기 또는 1㎖ 주사기를 사용하여 수행할 수 있다. 바람직하게는, 상기 반응을 주사 후 48시간, 더욱 바람직하게는 48 내지 72시간 경과 후 측정한다.
DTH 반응은 세포-매개된 면역 반응으로, 이는 미리 시험 항원(즉, 사용되는 폴리펩타이드의 면역원성 분획, 또는 이들의 변이체)에 노출시킨 환자에게서 더 크게 나타난다. 상기 반응은 자를 사용하여 육안으로 측정한다. 일반적으로, 직경이 약 0.5㎝ 이상, 바람직하게는 약 5.0㎝ 이상인 반응이 포지티브 반응으로, 유방암의 지표가 된다.
본 명세서에 기술된 유방 종양-특이적 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 1종 이상과 물, 염수, 알코올 또는 완충액과 같은 생리학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 조성물로서, 피부 시험에 사용하기 위한 형태로 제형화시키는 것이 바람직하다. 상기와 같은 조성물을 전형적으로 상기 폴리펩타이드 중 1종 이상을 0.1㎖ 용적 중에 약 1㎍ 내지 100㎍, 바람직하게는 약 10㎍ 내지 50㎍ 범위의 양으로 함유한다. 바람직하게는, 상기와 같은 약제학적 조성물에 사용되는 담체는 페놀 및/또는 Tween80TM과 같은 적합한 방부제를 함유하는 염수 용액이다.
본 발명의 다른 양태에서, 유방암의 진행 및/또는 치료 반응을 일정 기간에 걸쳐 상기 검정법을 수행하여, 반응 수준(즉, 검출되는 폴리펩타이드 또는 mRNA의 양, 또는 피부 시험의 경우, 검출되는 면역 반응 정도)에서의 변화를 평가함으로써 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 1 내지 2년 동안 매달 내지 2달마다 상기 검정법을 수행할 수 있다. 일반적으로, 유방암은 시간이 경과됨에 따라 반응 수준이 증가하는 환자에게서 진행된다. 대조적으로, 유방암은 검출된 시그날이 일정하거나 시간이 경과됨에 따라 감소하는 경우 진행되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 명세서에 기술된 화합물은 유방암의 면역요법에 사용할 수 있다. 이들 양태에서, 화합물(이는 폴리펩타이드, 항체 또는 핵산 분자일 수 있음)을 약제학적 조성물 또는 백신 중에 혼입시키는 것이 바람직하다. 약제학적 조성물은 상기와 같은 화합물 1종 이상과 생리학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 백신은 폴리펩타이드 1종 이상과 애쥬번트 또는 리포좀(화합물을 이들 내로 혼입시킴)과 같은 면역 반응 증강제를 포함한다. 약제학적 조성물 및 백신은 추가로 미국 특허 제4,897,268호 및 제5,075,109호에 기술된 생분해성 미세구와 같은 전달 시스템을 함유할 수 있다. 본 발명의 범주내의 약제학적 조성물 및 백신은 또한 별개의 폴리펩타이드 1종 이상을 포함하여, 다른 화합물을 함유할 수 있다.
또한, 백신은 폴리펩타이드가 동일반응계 내에서 발생되도록, 상기한 바와 같은 폴리펩타이드 1종 이상을 암호화하는 DNA를 함유할 수 있다. 상기와 같은 백신에서, DNA는 핵산 발현 시스템, 세균 및 바이러스 발현 시스템을 포함하여, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 여러가지 전달 시스템내에 존재할 수 있다. 적합한 핵산 발현 시스템은 환자에서의 발현에 필수적인 DNA 서열(예를 들어, 적합한 프로모터 및 종결 시그날)을 함유한다. 세균 전달 시스템은 세포 표면상에서 폴리펩타이드의 면역원성 분획을 발현시키는 세균[예: 바실러스-칼메테-구에린(Bacillus-Calmette-Guerrin)]을 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 양태에서, 비-병원성(감염성), 복제 경쟁적 바이러스를 사용할 수 있는 바이러스 발현 시스템(예를 들어, 바시니아 또는 기타 두진 바이러스, 레트로바이러스, 또는 아데노바이러스)을 사용하여 DNA를 도입시킬 수 있다. 상기와 같은 발현 시스템 중으로 DNA를 혼입시키는 기술은 당해 분야의 숙련가들에게 숙지되어 있다. DNA는 또한 문헌[참조: Ulmer et al., Science 259: 1745-1749(1993)]에 기술되어 있으며, 문헌[참조: Cohen, Science 259:1691-1692(1993)]에서 고찰된 바와 같이, "노출된(naked)" 것일 수 있다. 노출된 DNA의 흡수는 세포 중으로 효율적으로 운반하는 생분해성 비드상에 DNA를 코팅시킴으로써 증가시킬 수 있다.
당해 분야의 숙련가들에게 공지된 적합한 담체를 본 발명의 약제학적 조성물에 사용할 수 있는데, 담체의 종류는 투여 방식에 따라 변화시킬 수 있다. 피하 주사와 같은 비경구 투여의 경우, 담체로는 물, 염수, 알코올, 지방, 왁스 또는 완충액이 바람직하다. 경구 투여의 경우, 상기 담체, 또는 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 활석, 셀룰로즈, 글루코즈, 슈크로즈 및 탄산마그네슘과 같은 고체 담체를 사용할 수 있다. 생분해성 미세구(예, 폴리락테이트 폴리글리콜레이트)를 또한 본 발명의 약제학적 조성물용 담체로 사용할 수 있다.
여러가지 애쥬번트를 본 발명의 백신에 사용하여 면역 반응을 비특이적으로 증강시킬 수 있다. 대부분의 애쥬번트는 수산화알루미늄 또는 미네랄 오일과 같이 신속한 이화작용으로부터 항원을 보호하기 위하여 디자인된 물질, 및 지질 A, 보르타델라 페르투시스(Bortadella pertussis) 또는 미코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 유도된 단백질과 같은, 면역 반응의 자극제를 함유한다. 적합한 애쥬번트는, 예를 들어, 프로인트의 불완전 애쥬번트(Freund's Incomplete Adjuvant) 및 완전 애쥬번트(Complete Adjuvant)(Difco Laboratories, Detroit, MI), 머크 애쥬번트 65(Merck Adjuvant 65)(Merck and Company, Inc., Rahway, NJ), 알룸, 생분해성 미세구, 모노포스포릴 지방 A 및 퀼 A와 같이 상업적으로 시판된다. GM-CSF 또는 인터류킨-2, -7 또는 -12와 같은 사이토킨을 또한 애쥬번트로 사용할 수 있다.
상기 약제학적 조성물 및 백신은, 예를 들어 환자에서 유방암의 치료용으로 사용할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "환자"란 온혈 동물, 바람직하게는 사람을 의미한다. 환자는 유방암에 걸릴 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 따라서, 상기 약제학적 조성물 및 백신을 사용하여 유방암의 진행을 방지하거나 유방암에 걸린 환자를 치료할 수 있다. 유방암의 진행을 방지하기 위하여, 본 명세서에 기술된 바와 같은 폴리펩타이드 1종 이상을 포함하는 약제학적 조성물 또는 백신을 환자에게 투여할 수 있다. 또한, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 노출된 DNA 또는 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 투여할 수 있다. 유방암 환자의 치료의 경우, 약제학적 조성물 또는 백신은 본 명세서에 기술된 바와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA에 상보적인 폴리펩타이드, 항체 또는 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 항감작 RNA 또는 항감작 데옥시리보뉴클레오티드 올리고뉴클레오티드) 1종 이상을 포함할 수 있다.
투여 경로 및 빈도 뿐만 아니라 투여량은 개인에 따라 변화시킬 수 있다. 일반적으로, 약제학적 조성물 및 백신은 주사로(예, 피내, 근육내, 정맥내 또는 피하), 비강내로(예, 흡인에 의해) 또는 경구적으로 투여할 수 있다. 52주 동안 1 내지 10회 투여량을 투여할 수 있다. 바람직하게는, 1개월 간격으로 6회의 투여량을 투여하고, 이후 주기적으로 부스터 백신화를 제공할 수 있다. 선택적인 프로토콜이 각각의 환자에 대해 적합할 수 있다. 적합한 투여량은 상기한 바와 같이 투여시, 항-종양 면역 반응을 촉진시킬 수 있는 화합물의 양이다. 상기와 같은 반응은 환자에서 항-종양 항체를 측정함으로써 또는 시험관내에서 환자의 종양 세포를 사멸시킬 수 있는 세포질 분해 효과기 세포의 백신-의존성 발생에 의해 모니터링할 수 있다. 상기와 같은 백신은 또한 비백신화 환자와 비교하여 백신화 환자에서 개선된 임상적인 결과(예를 들어, 더욱 빈번한 차도, 완전한 또는 부분적인 또는 더욱 장기간의 질환이 없는 생존)를 가져오게 하는 면역 반응을 일으킬 수 있어야 한다. 일반적으로, 폴리펩타이드 1종 이상을 포함하는 약제학적 조성물 및 백신의 경우, 투여량 중에 존재하는 각각의 폴리펩타이드의 양의 범위는 약 100㎍ 내지 5㎎이다. 적합한 투여량 크기는 환자의 사이즈에 따라 변화시킬 수 있지만, 전형적으로 약 0.1㎖ 내지 약 5㎖ 범위이다.
다음 실시예는 설명하기 위하여 제공되며 제한하는 것은 아니다.
실시예 1
차동 디스플레이 RT-PCR을 사용한 유방 종양-특이적 cDNA의 제조
본 실시예는 차동 디스플레이 스크린을 사용한 유방 종양-특이적 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA 분자의 제조를 설명한다.
A. B18Ag1 cDNA의 제조 및 mRNA 발현의 특성화
환자로부터 제거한 후 병원론에 의해 확인된 유방암 환자의 유방 종양과 정상 조직으로부터 조직 샘플을 제조한다. 정상 RNA와 종양 RNA를 상기 샘플로부터 추출하여 mRNA를 단리하고 (dT)12AG 고정된 3' 프라이머를 사용하여 cDNA(서열 130)로 전환시킨다. 이어서, 랜덤하게 선택된 프라이머 (CTTCAACCTC)(서열 103)를 사용하여 차동 디스플레이 PCR을 수행한다. 증폭 조건은 1.5mM MgCl2, 프라이머 20pmol, dNTP 500pmol, 및 Taq DNA 폴리머라제(Perkon-Elmer, Branchburg, NJ) 1 단위를 함유하는 표준 완충액이다. 94℃에서 30초간의 변성 단계, 42℃에서 1분간의 어닐링, 및 72℃에서 30초간의 연장 단계를 사용하여 40회전의 증폭을 수행한다. 증폭시킨 생성물 76개를 함유하는 RNA 핑거프린트(fingerprint)를 수득한다. 유방 종양 조직의 RNA 핑거프린트가 정상적인 유방 조직의 것과 98% 이상 동일하더라도, 종양의 RNA 핑거프린트 패턴에 대해 특이적인 밴드를 반복적으로 관찰한다. 이 밴드를 은 착색된 겔로부터 절단하여, T-벡터(Novagen, Madison, WI) 내로 서브클로닝시켜 서열화한다.
B18Ag1로 언급되는 cDNA의 서열을 서열 1로 제공한다. GENBANK와 EMBL의 데이타베이스를 탐색한 결과 초기에 클로닝된 B18Ag1 단편은 원숭이 육종 바이러스(SSV)와 동족성인 절단된 레트로바이러스 인자인, 내인성 사람 레트로바이러스 인자 S71과 77% 동일한 것으로 밝혀졌다. S71은 불완전한 gag 유전자, pol 유전자의 일부 및 3' 말단에서 LTR-유사 구조를 함유한다[참조: Werner et al., Virology 174: 225-238(1990)]. B18Ag1은 또한 P30(gag) 위치에 대응하는 영역에서 SSV와 64% 동일하다. B18Ag1은 포유류를 감염시키는 레트로바이러스의 여러가지 gag 단백질과 상당한 상동성을 공유하는 영역을 포괄하는 3개의 분리된 불완전한 판독 프레임을 함유한다. 또한, S71에 대한 상동성이 gag 유전자내에 있는 것은 아니나, LTR을 포함하여 수 kb의 서열을 스패닝시킨다.
B18Ag1-특이적인 PCR 프라이머는 컴퓨터 분석 가이드라인을 사용하여 합성한다. RT-PCR 증폭(40회전 동안 94℃, 30초; 60℃→42℃, 30초; 72℃, 30초)으로 B18Ag1이 환자의 유방 종양 조직 중에 상대적으로 높은 수준으로 존재하는 실제적인 mRNA 서열을 나타내는지 확인한다. 증폭에 사용되는 프라이머는 3.5mM 마그네슘 농도 및 pH 8.5에서 B18Ag1-1(CTG CCT GAG CCA CAA ATG)(서열 128) 및 B18Ag1-4(CCG GAG GAG GAA GCT AGA GGA ATA)(서열 129), 및 2mM 마그네슘 농도 및 pH 9.5에서 B18Ag1-2(ATG GCT ATT TTC GGG GCC TGA CA)(서열 126) 및 B18Ag1-3(CCG GTA TCT CCT CGT GGT TATT)(서열 127)이다. 동일한 실험으로 상기 환자의 정상적인 유방 조직 중에서의 발현이 존재하지 않을 수준으로 과도하게 낮은 것으로 밝혀졌다(참조: 도 1). 이어서, RT-PCR 실험을 이용하여 B18Ag1 mRNA가 9개의 다른 유방 종양 샘플(브라질인과 미국인 환자로부터) 중에 존재하지만, 각각의 암 환자에 대응하는 정상적인 유방 조직 중에서는 부재하거나 아주 낮은 수준으로 존재하는 것으로 밝혀졌다. RT-PCR 분석으로 B18Ag1 전사물이 여러가지 정상 조직(임파선, 심근층 및 간을 포함) 중에는 존재하지 않으며 PBMC 및 폐 조직 중에는 상대적으로 낮은 수준으로 존재하는 것으로 밝혀졌다. 유방암 샘플 중의 B18Ag1 mRNA의 존재 및 정상적인 유방 조직으로부터의 이의 부재는 도 2에 나타낸 바와 같이, 노던 블롯 분석법으로 확인한다.
유방 종양 조직에서 B18Ag1의 차동 발현은 또한 RNase 보호 검정법으로 확인한다. 도 3은 4개의 상이한 RNase 보호 검정법으로 측정한 바와 같은 여러가지 종류의 조직에서 B18Ag1 mRNA의 수준을 나타낸다. 레인 1 내지 12는 여러가지 정상적인 유방 조직 샘플을 나타내고, 레인 13 내지 25는 여러가지 유방 종양 샘플을 나타내며; 레인 26 및 27은 정상적인 전립선 샘플을 나타내고; 레인 28 및 29는 전립선 종양 샘플을 나타내며; 레인 30 내지 32는 결장 종양 샘플을 나타내고; 레인 33은 정상적인 대동맥을 나타내며; 레인 34는 정상적인 소장을 나타내고; 레인 35는 정상적인 피부를 나타내며; 레인 36은 정상적인 임파선을 나타내고; 레인 37은 정상적인 난소를 나타내며; 레인 38은 정상적인 간을 나타내고; 레인 39는 정상적인 골격근을 나타내며; 레인 40은 정상적인 제1의 위 샘플을, 레인 41은 정상적인 제2의 위 샘플을 나타내고; 레인 42는 정상적인 폐를 나타내며; 레인 43은 정상적인 신장을 나타내고; 레인 44는 정상적인 췌장을 나타낸다. 각각의 검정에서 공지된 B-액틴 메시지 존재비의 포지티브 대조군 RNA를 포함시키고 상기 포지티브 대조군에 대하여 상이한 검정 결과를 정규화시켜 실험간 비교를 용이하게 한다.
RT-PCR 및 서던 블롯 분석은 사람의 게놈 DNA 중에 단일 복제 내인성 레트로바이러스 인자로 존재할 B18Ag1 위치를 나타낸다. 프로브로서 초기 B18Ag1 서열을 사용하여 대략 12 내지 18kb의 게놈성 클론을 단리한다. XbaI 분해법으로 4개의 추가 서브클론을 또한 단리한다. 이들 클론(도 4에 나타낸 바와 같이 위치함)의 XbaI 분해물의 말단으로부터 수득한 추가의 레트로바이러스 서열을 서열 3 내지 10으로 나타내는데, 여기서 서열 3은 도 4에서 표지된 서열 10의 위치를 나타내고, 서열 4는 표지된 11-29의 서열의 위치를 나타내며, 서열 5는 표지된 3의 서열 위치를 나타내고, 서열 6은 표지된 6의 서열 위치를 나타내며, 서열 7은 표지된 12의 서열 위치를 나타내고, 서열 8은 표지된 13의 서열 위치를 나타내며, 서열 9는 표지된 14의 위치를 나타내고, 서열 10은 표지된 11-22의 서열 위치를 나타낸다.
후속되는 연구로 도 5A 및 도 5B에 나타낸 바와 같이, 12-18kb 게놈성 클론이 약 7.75kb의 레트로바이러스 인자를 함유함이 증명되었다. 상기 레트로바이러스 인자의 서열은 서열 141에 나타나 있다. 도 5A의 상부에서 번호로 표시된 라인은 레트로바이러스 게놈성 클론의 센스 스트랜드 서열을 나타낸다. 상기 라인 아래의 박스는 선택된 제한 부위의 위치를 나타낸다. 화살표는 레트로바이러스 인자를 서열화시키는데 사용되는 상이한 중복 클론을 나타낸다. 화살표의 방향은 단일-통과 서브클론 서열이 센스 또는 안티센스 스트랜드에 상응하는지의 여부를 나타낸다. 도 5B는 상기 인자내의 바이러스 유전자의 조직화를 나타내는 B18Ag1을 함유하는 레트로바이러스 인자의 도식적 다이아그램이다. 개방 박스는 상기 인자를 통하여 발견되는, 메티오닌으로 개시되는 예측되는 판독 프레임에 상응한다. 6개의 유사한 판독 프레임 각각은 박스의 좌측에 나타낸 바와 같이, 감작 스트랜드상에서 발견되는 것에 대응하는 프레임 1 내지 3으로 나타낸다.
프로브로서 서열 1의 cDNA를 사용하여, 서열 141에 나타낸 게놈성 서열과 비교하여, 뉴클레오티드 차가 최소인 (1% 미만) 더 긴 cDNA(서열 227)를 수득한다.
B. 다른 유방 조직-특이적 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA 분자의 제조
정상적인 RNA와 종양 RNA를 제조하고 mRNA를 단리하여 상기한 바와 같이, (dT)12AG 고정된 3' 프라이머를 사용하여 cDNA로 전환시킨다. 이어서, 랜덤하게 선택된 프라이머 서열 87 내지 125를 사용하여 차동 디스플레이 PCR을 수행한다. 증폭 조건은 상기한 바와 같으며, 종양의 RNA 핑거프린트 패턴에 특이적인 것으로 관찰된 밴드를 은 착색된 겔로부터 절단하여, T-벡터(Novagen, Madison, WI) 또는 pCRII 벡터(Invitrogen, San Diego, CA) 중으로 서브클로닝시켜 서열화한다. 상기 서열은 서열 11 내지 서열 86으로 제공된다. 단리된 79개의 서열 중에서, 67개가 신규한 것으로 밝혀졌다(서열 11 내지 77)(참조: 도 6 내지 도 20). 계속적인 연구로 추가로 84개의 서열(서열 142 내지 226)이 확인되었으며, 이 중에서 72개가 신규한 것으로 나타났다(서열 142, 143, 146-152, 154-166, 168-176, 178-192, 194-198, 200-204, 206, 207, 209-214, 216, 218, 219, 221-227). 본 발명자가 알고 있는 한, 지금까지 이전에 확인된 서열 중에서 어느 것도 정상적인 유방 조직에서보다 사람의 유방 종양 조직에서 더 큰 수준으로 발현되는 것으로 밝혀진 것은 없다.
표 1은 RT-PCR 분석법으로 측정한, 정상적인 유방 조직(컬럼 BN1-BN7), 유방종양 샘플(컬럼 BT1-BT12) 및 정상적인 전립선, 신장, 간, 폐, 피부, 소장, 위, 심근, 임파선, 췌장, 골격근, 난소 및 대동맥 중에 존재하는 대표적인 유방 종양-특이적 전사물의 수준을 나타낸다. 메시지 존재비에 대해 0 내지 3 등급 스케일을 사용하는데, 0은 검출가능한 메시지가 없음을 나타내는 것이고 3은 대조 메시지(글리세르알데히드 3-포스페이트 데하이드로게나제)에 필적하는 메시지 수준을 나타낸다. 제시된 박스 중의 데이타가 없는 것은 특이적 항원의 존재 또는 부재에 대해 조직을 시험하지 않았음을 나타내는 것이다.
실시예 2
사람의 게놈성 DNA로부터 B18Ag1 DNA의 제조
본 실시예는 사람의 게놈성 DNA를 증폭시킴으로써 B18Ag1 DNA를 제조하는 것을 설명한다.
B18Ag1 특이적 프라이머 20pmol, dNTPS 500pmol 및 Taq DNA 폴리머라제(Perkin Elmer, Branchburg, NJ) 1 단위를 사용하여 다음과 같은 증폭 인자를 사용하여 사람의 게놈성 DNA 250ng으로부터 B18Ag1 DNA를 제조할 수 있다: 94℃에서 30초간의 변성, 30초간 60℃에서 42℃로 2회전마다 2℃씩 강하시키는 어닐링 및 72℃에서 30초간의 연장. 최종 단계(42℃ 어닐링 온도)는 25회 회전시켜야 한다. 프라이머는 컴퓨터 분석법을 이용하여 선택한다. 합성한 프라이머는 B18Ag1-1, B18Ag1-2, B18Ag1-3, 및 B18Ag1-4이다. 사용할 수 있는 프라이머쌍은 1+3, 1+4, 2+3, 및 2+4이다.
겔 전기영동시킨 다음, B18Ag1 DNA에 대응하는 밴드를 절단하여 적합한 벡터 중으로 클로닝시킨다.
실시예 3
유방 종양 cDNA로부터 B18Ag1 DNA의 제조
본 실시예는 사람의 유방 종양 cDNA로부터 증폭시킴으로써 B18Ag1 DNA를 제조하는 것을 설명한다.
제1 스트랜드 cDNA는 500ng poly A+RNA, 프라이머 (T)12AG(즉, TTT TTT TTT TTT AG)(서열 130) 200pmol, 제1 스트랜드 역전사효소 완충액 1X, 6.7mM DTT, dNTP 500mmol, 및 AMV 또는 MMLV 역전사효소 1 단위(Gibco-BRL(Grand Island, NY)와 같은 공급자로부터)를 최종 용적 30㎕ 중에 함유하는 반응 혼합물 중에서 사람의 유방 종양 조직으로부터 제조한 RNA로부터 합성한다. 제1 스트랜드 합성 후, cDNA를 대략 25배 희석시키고 실시예 2에 기술된 바와 같은 증폭용으로 1㎕를 사용한다. 일부 프라이머쌍이 전사물의 이종성 집단이 될 수 있지만, 프라이머 B18Ag1-2(5' ATG GCT ATT TTC GGG GGG TGA CA)(서열 126) 및 B18Ag1-3(5' CCG GTA TCT CCT CGT GGG TAT T)(서열 127)은 단일 151bp 증폭 생성물을 산출시킨다.
실시예 4
B18Ag1의 B-세포 및 T-세포의 확인
본 실시예는 B18Ag1 에피토프의 확인을 설명한다.
B18Ag1 서열은 여러가지 컴퓨터 알고리듬을 사용하여 선별할 수 있다. B-에피토프를 측정하기 위하여, 문헌[참조: Hopp, Prog. Clin. Biol. Res. 172B:367-77(1985)] 또는, 달리, 문헌[참조: Cease et al., J. Exp. Med. 164: 1779-84(1986)] 또는 문헌[참조: Spouge et al., J. Immunol. 138:204-12(1987)]의 방법을 사용하여 소수성 및 친수성 수치에 대해 서열을 선별할 수 있다. 추가의 부류 II MHC(항체 또는 B-세포) 에피토프는 AMPHI(예를 들어, Margalit et al., J. Immunol. 138:2213(1987)) 또는 로트바드와 테일러의 방법(Rothbard 및 Taylor; EMBO J. 7:93(1988))과 같은 프로그램을 사용하여 예측할 수 있다.
이들 방법을 사용하여 일단 펩타이드(길이: 15 내지 20개 아미노산)를 확인한 다음, 자동화된 펩타이드 합성 장비(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA와 같은 제조업자로부터 입수가능)와 메리필드 합성법과 같은 기술을 이용하여 각각의 펩타이드를 합성할 수 있다. 합성한 다음, 상기 펩타이드를 사용하여 정상 또는 유방암 환자로부터 수거한 혈청을 선별하여 유방암 환자가 상기 펩타이드와 반응성인 항체를 갖고 있는지 측정한다. 유방암 환자 중 상기와 같은 항체의 존재는 당해 특이적인 B-세포 에피토프의 면역원성을 확인시키는 것이다. 상기 펩타이드는 또한 생체내 면역시킨 다음, 동물(마우스, 래트, 토끼, 침팬지 등) 중에서 혈청학적 또는 액소성 면역을 발생시키는 이들의 능력에 대해 시험할 수 있다. 상기와 같은 면역 후 펩타이드-특이적 항혈청의 발생은 또한 당해 특이적인 B-세포 에피토프의 면역원성을 확인시키는 것이다.
T-세포 에피토프를 확인하기 위하여, HLA I 부류 MHC 분자에 결합할 수 있는 B18Ag1 서열내의 8-10번 아미노산 모티프를 확인하는데 사용되는 상이한 컴퓨터 알고리즘을 사용하여 B18Ag1 서열을 선별할 수 있다[참조: Rammensee et al., Immunogenetics 41: 178-228(1995)]. 상기와 같은 펩타이드를 합성한 다음 표준 결합 검정법[참조: Sette et al., J. Immunol. 153:5586-92(1994)]을 사용하여 I 부류 MHC에 대한 이들의 결합능을 시험할 수 있으며, 더욱 중요하게는, 예를 들어, 하기 문헌[참조: Bakker et al., Cancer Res. 55:5330-34(1995); Visseren et al., J. Immunol. 154:3991-98(1995); Kawakami et al., J. Immunol. 154:3961-68(1995); 및 Kast et al., J. Immunol. 152:3904-12(1994)]의 방법을 이용하여 환자 또는 정상적인 모세혈관 단핵세포를 시험관내에서 자극한 다음 항원 반응성 세포독성 T-세포를 발생시킬 수 있는 이들의 능력에 대해 시험할 수 있다. 시험관내에서 펩타이드를 자극시킨 다음 자가(동일한 I 부류 MHC 분자를 포함함) 종양 세포를 사멸시킬 수 있는 T-세포의 성공적인 시험관내 발생은 또한 B18Ag1 항원의 면역원성을 확실하게 하는 것이다. 또한, 특별한 사람의 MHC I 부류 동종항원쌍의 발현을 위하여 유전자전이시킨 마우스에서 생체내 면역시킨 다음 상기와 같은 펩타이드를 사용하여 주의 펩타이드와 B18Ag1 반응성 세포독성 T-세포를 발생시킬 수 있다[참조: Vitiello et al., J. Exp. Med. 173:1007-15(1991)].
예측되는 HLA I 부류 MHC 결합 항원에 따라서 절단된, 예측 B18Ag1 B-세포 및 T-세포 에피토프를 하기에 나타낸다:
예측되는 Th 모티프(B-세포 에피토프)(서열 131 내지 133)
SSGGRTFDDFHRYLLVGI
QGAAQKPINLSKXIEVVQGHDE
SPGVFLEHLQEAYRIYTPFDLSA
예측되는 HLA A2.1 모티프(T-세포 에피토프)(서열 134 내지 140)
YLLVGIQGA
GAAQKPINL
LNSKXIEVV
EVVQGHDES
HLQEAYRIY
NLAFVAQAA
FVAQAAPDS
실시예 5
차동 디스플레이 PCR에 의해 밝혀진 유방 종양 유전자의 특성화
차동 디스플레이 PCR에 의해 밝혀진 유방 종양 유전자의 특이성 및 감응성은 RT-PCR을 이용하여 측정한다. 이 방법은 다량의 RNA를 사용하지 않고 반정량적으로 유방 종양 유전자 mRNA 발현을 신속하게 평가할 수 있도록 한다. 유전자 특이적 프라이머를 사용하여, 8개의 유방 종양, 5개의 정상 유방, 2개의 전립선 종양, 2개의 결장 종양, 1개의 폐 종양, 및 정상적인 전립선, 결장, 신장, 간, 폐, 난소, 췌장, 골격근, 피부, 위 및 고환을 포함한 14개의 기타 정상적인 성인의 조직을 포함한, 여러가지 조직에서 mRNA 발현 수준을 조사한다.
RT-PCR의 반정량적 특성을 확실하게 하기 위하여, 조사되는 각 조직에 대한 내부 대조물로서 β-액틴을 사용한다. 제1 스트랜드 cDNA의 일련의 희석액을 제조하고 β-액틴 특이적 프라이머를 사용하여 RT-PCR 분석을 수행한다. 이어서, β-액틴 주형을 직선 범위내에서 증폭시킬 수 있으며, 초기 복제수에서의 차이를 반영시키기에 충분히 감응성인 희석액을 선택한다. 이런 조건을 사용하여, 각각의 조직으로부터 역전사 반응에 대한 β-액틴 수준을 측정한다. DNase 처리에 의해서 및 역전사효소를 가하지 않고 제조한 제1 스트랜드 cDNA를 사용할 때 네가티브 결과가 되도록 함으로써 DNA 오염을 최소화한다.
유전자 특이적 프라이머를 사용하여, 여러가지 조직에서 mRNA 발현 수준을 측정한다. 지금까지 RT-PCR에 의해 32개의 유전자가 성공적으로 조사되었으며, 이들 중에서 3개가 유방 종양에 대해 우수한 특이성과 감응성을 나타낸다. 도 21A 및 도 21B는 이들 3개의 유전자에 대한 결과를 나타낸다: B15AG-1(서열 27), B31GA1b(서열 148) 및 B38GA2a(서열 157).
전술한 내용으로부터, 본 발명의 특정 양태가 설명을 목적으로 명세서 중에 기술되어 있으나, 본 발명의 정신 및 범주로부터 벗어나지 않고 다양하게 변형시킬 수 있음이 명백하다.
서열 목록
(1) 일반적 정보:
(i) 출원인: 코릭사 코포레이션
(ii) 발명의 명칭: 유방암의 치료 및 진단용 조성물 및 방법
(iii) 서열수: 227
(iv) 서신 주소:
(A) 수신인: 시드 앤드 베리 엘엘피
(B) 거리: 5번가 701 콜럼비아 센터 6300
(C) 시: 시애틀
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(v) 컴퓨터 판독형:
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(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종
(C) 운영 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, 버젼 #1.30
(vi) 현 출원 데이터:
(A) 출원번호:
(B) 출원일: 1997년 1월 10일
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(viii) 변호사/대리인 정보:
(A) 성명: 데이비드 제이 마키
(B) 등록번호: 31.392
(C) 조회/도켓번호: 210121.419PC
(ix) 통신 정보
(A) 전화번호: (206) 622-4900
(B) 텔레팩스번호: (206) 682-6031
(2) 서열 1에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 363개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
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(D) 형태: 선형
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(A) 명칭/키(key): CDS
(B) 존재 위치: 1..363
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(2) 서열 2에 대한 정보:
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(B) 유형: 아미노산
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(ii) 분자 유형: 단백질
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(2) 서열 3에 대한 정보:
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(A) 길이: 1101개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 4에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 1087개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 5에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 1010개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
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(2) 서열 6에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 950개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
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(D) 형태: 선형
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(2) 서열 7에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 1086개 염기쌍
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(2) 서열 8에 대한 정보:
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(A) 길이: 1177개 염기쌍
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(2) 서열 9에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 1146개 염기쌍
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(2) 서열 10에 대한 정보:
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(A) 길이: 545개 염기쌍
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(2) 서열 11에 대한 정보:
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(A) 길이: 196개 염기쌍
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(2) 서열 12에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 388개 염기쌍
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(2) 서열 13에 대한 정보:
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(A) 길이: 337개 염기쌍
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(C) 쇄: 일본쇄
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(2) 서열 14에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 571개 염기쌍
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(D) 형태: 선형
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(2) 서열 15에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 548개 염기쌍
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(2) 서열 16에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 638개 염기쌍
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(2) 서열 17에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 286개 염기쌍
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(2) 서열 18에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 262개 염기쌍
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(C) 쇄: 일본쇄
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(2) 서열 19에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 261개 염기쌍
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(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 20에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 294개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 21에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 208개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
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(2) 서열 22에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 287개 염기쌍
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(2) 서열 23에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 204개 염기쌍
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(2) 서열 24에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 264개 염기쌍
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(2) 서열 25에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 376개 염기쌍
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(2) 서열 26에 대한 정보:
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(A) 길이: 372개 염기쌍
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(2) 서열 27에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 477개 염기쌍
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(2) 서열 28에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 438개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
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(2) 서열 29에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 620개 염기쌍
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(2) 서열 30에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 100개 염기쌍
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(2) 서열 31에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 762개 염기쌍
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(2) 서열 32에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 276개 염기쌍
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(2) 서열 33에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 477개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
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(2) 서열 34에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 631개 염기쌍
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(2) 서열 35에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 578개 염기쌍
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(2) 서열 36에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 583개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 37에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 716개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 38에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 688개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 39에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 585개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 40에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 475개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 41에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 423개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 42에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 527개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 43에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 331개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 44에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 592개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 45에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 567개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 46에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 908개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 47에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 480개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 48에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 591개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 49에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 454개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 50에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 463개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 51에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 399개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 52에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 392개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 53에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 179개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 54에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 112개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 55에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 225개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 56에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 175개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 57에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 223개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 58에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 211개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 59에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 208개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 60에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 171개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 61에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 134개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 62에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 145개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 63에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 297개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 64에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 300개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 65에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 203개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 66에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 344개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 67에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 157개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 68에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 137개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 69에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 137개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 70에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 220개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 71에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 353개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 72에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 343개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 73에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 321개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 74에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 321개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 75에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 317개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 76에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 244개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 77에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 254개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 78에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 355개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 79에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 406개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 80에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 327개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 81에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 318개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 82에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 338개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 83에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 111개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 84에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 224개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 85에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 348개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 86에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 293개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 87에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 10개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 88에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 10개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 89에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 11개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 90에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 10개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 91에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 10개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 92에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 10개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 93에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 10개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 94에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 10개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 95에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 10개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 96에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 10개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 97에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 10개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 98에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 10개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 99에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 10개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 100에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 10개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 101에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 10개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 102에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 10개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 103에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 10개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 104에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 20개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 105에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 20개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 106에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 20개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 107에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 20개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 108에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 20개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 109에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 20개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 110에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 20개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 111에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 20개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 112에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 20개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 113에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 20개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 114에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 20개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 115에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 20개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 116에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 20개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 117에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 20개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 118에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 20개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 119에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 20개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 120에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 20개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 121에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 20개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 122에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 20개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 123에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 20개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 124에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 20개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 125에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 20개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 126에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 23개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 127에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 22개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 128에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 18개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 129에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 24개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 130에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 14개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 131에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 18개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 132에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 22개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 133에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 23개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 134에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 9개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 135에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 9개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 136에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 9개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 137에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 9개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 138에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 9개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 139에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 9개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 140에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 9개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 141에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 9388개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 142에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 419개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 143에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 402개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 144에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 224개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 145에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 111개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 146에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 585개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 147에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 579개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 148에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 249개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 149에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 255개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 150에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 318개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 151에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 323개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 152에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 311개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 153에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 332개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 154에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 345개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 155에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 295개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 156에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 406개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 157에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 208개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 158에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 547개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 159에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 203개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 160에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 402개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 161에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 193개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 162에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 147개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 163에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 294개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 164에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 412개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 165에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 361개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 166에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 427개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 167에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 500개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 168에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 358개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 169에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 1265개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 170에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 383개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 171에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 383개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 172에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 699개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 173에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 701개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 174에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 700개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 175에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 484개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 176에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 432개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 177에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 788개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 178에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 786개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 179에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 796개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 180에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 488개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 181에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 317개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 182에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 507개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 183에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 227개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 184에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 225개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 185에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 597개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 186에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 597개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 187에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 324개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 188에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 178개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 189에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 367개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 190에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 369개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 191에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 369개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 192에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 449개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 193에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 372개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 194에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 309개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 195에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 312개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 196에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 288개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 197에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 289개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 198에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 288개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 199에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 1027개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 200에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 207개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 201에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 209개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 202에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 349개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 203에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 241개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 204에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 248개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 205에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 505개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 206에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 179개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 207에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 176개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 208에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 196개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 209에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 345개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 210에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 178개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 211에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 454개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 212에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 337개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 213에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 715개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 214에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 345개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 215에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 429개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 216에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 593개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 217에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 335개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 218에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 248개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 219에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 530개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 220에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 531개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 221에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 530개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 222에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 578개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 223에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 578개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 224에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 345개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 225에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 347개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 226에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 281개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 227에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 3646개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
Claims (43)
- (a) 서열 1, 서열 3 내지 서열 77 및 서열 142, 143, 146-152, 154-166, 168-176, 178-192, 194-198, 200-204, 206, 207, 209-214, 216, 218, 219, 221-227로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열; (b) 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 항원성 및/또는 면역원성이 유지되도록, 뉴클레오티드 위치 중 20% 미만의 위치에서 뉴클레오티드 치환, 결실, 삽입 및/또는 개질 중 1개 이상을 포함하는 상기 뉴클레오티드 서열의 변이체; 또는 (c) 서열 1, 서열 3 내지 서열 77 및 서열 142, 143, 146-152, 154-166, 168-176, 178-192, 194-198, 200-204, 206, 207, 209-214, 216, 218, 219, 221-227로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 중 1개 이상에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 에피토프를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 DNA 분자.
- (a) 엄격한 조건하에서 서열 1, 서열 3 내지 서열 77 및 서열 142, 143, 146-152, 154-166, 168-176, 178-192, 194-198, 200-204, 206, 207, 209-214, 216, 218, 219, 221-227로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열에 하이브리드화되고;(b) 서열 1, 서열 3 내지 서열 77 및 서열 142, 143, 146-152, 154-166, 168-176, 178-192, 194-198, 200-204, 206, 207, 209-214, 216, 218, 219, 221-227로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 80% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 폴리펩타이드가 암호화되며;상기 뉴클레오티드 서열에 상응하는 RNA는 정상 유방 조직에서보다 사람의 유방 종양 조직에서 더 높은 수준으로 발현되는, 폴리펩타이드의 에피토프를 암호화하는 단리된 DNA 분자.
- (a) 서열 141로부터 전사된 뉴클레오티드 서열; 또는(b) 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 항원성 및/또는 면역원성이 유지되도록, 뉴클레오티드 위치 중 20% 미만의 위치에서 뉴클레오티드 치환, 결실, 삽입 및/또는 개질 중 1개 이상을 포함하는 상기 뉴클레오티드 서열의 변이체에 의해 암호화되는 폴리펩타이드의 에피토프를 암호화하는 단리된 DNA 분자.
- 제1항 내지 3항 중의 어느 한 항에 따르는 DNA 분자에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 DNA 또는 RNA 분자.
- 제1항 내지 3항 중의 어느 한 항에 따르는 DNA 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
- 제5항에 따르는 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포.
- 제1항 내지 3항 중의 어느 한 항에 따르는 DNA 분자에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
- 제7항에 있어서, 서열 1, 서열 3 내지 서열 77 및 서열 142, 143, 146-152, 154-166, 168-176, 178-192, 194-198, 200-204, 206, 207, 209-214, 216, 218, 219, 221-227로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 1개 이상에 의해 암호화된 아미노산 서열의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드.
- 제7항에 따르는 폴리펩타이드에 결합하는 모노클로날 항체.
- 생물학적 샘플내에서, 제7항에 따르는 폴리펩타이드 1개 이상을 검출하여, 이로부터 환자에서 유방암의 존재를 측정함을 특징으로 하는, 환자에서 유방암 존재의 측정 방법.
- 생물학적 샘플내에서, 서열 78-86 및 서열 144, 145, 153, 167, 177, 193, 199, 205, 208, 215, 217, 220으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 및 엄격한 조건하에서 이에 하이브리드화되는 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드 1개 이상을 검출함을 특징으로 하는, 환자에서 유방암 존재의 측정 방법.
- 제10항 또는 11항에 있어서, 생물학적 샘플이 유방 종양의 일부인 방법.
- 제10항에 있어서, 검출 단계가 생물학적 샘플을 제9항에 따르는 모노클로날 항체와 접촉시킴을 포함하는 방법.
- 제11항에 있어서, 검출 단계가 생물학적 샘플을 서열 78-86 및 서열 144, 145, 153, 167, 177, 193, 199, 205, 208, 215, 217, 220으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 및 엄격한 조건하에서 이에 하이브리드화되는 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드에 결합하는 모노클로날 항체와 접촉시킴을 포함하는 방법.
- 생물학적 샘플내에서, 제7항에 따르는 폴리펩타이드 1개 이상을 암호화하는 RNA 분자를 검출하고, 이로부터 환자에서 유방암의 존재를 측정함을 특징으로 하는, 환자에서 유방암 존재의 측정 방법.
- 생물학적 샘플내에서, 서열 78-86 및 서열 144, 145, 153, 167, 177, 193, 199, 205, 208, 215, 217, 220으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 및 엄격한 조건하에서 이에 하이브리드화되는 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 암호화하는 RNA 분자 1개 이상을 검출하고, 이로부터 환자에서 유방암의 존재를 측정함을 특징으로 하는, 환자에서 유방암 존재의 측정 방법.
- 제15항 또는 16항에 있어서, 생물학적 샘플이 유방 종양의 일부인 방법.
- 제15항에 있어서, 검출 단계가(a) 생물학적 샘플내의 RNA 분자로부터 cDNA를 제조하고;(b) 제7항에 따르는 폴리펩타이드의 적어도 일부를 암호화할 수 있는 cDNA 분자를 특이적으로 증폭시키고, 이로부터 환자에서 유방암의 존재를 측정함을 특징으로 하는 방법.
- 제16항에 있어서, 검출 단계가(a) 생물학적 샘플내의 RNA 분자로부터 cDNA를 제조하고;(b) 서열 78-86 및 서열 144, 145, 153, 167, 177, 193, 199, 205, 208, 215, 217, 220으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 및 엄격한 조건하에서 이에 하이브리드화되는 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 적어도 일부를 암호화할 수 있는 cDNA 분자를 특이적으로 증폭시키고, 이로부터 환자에서 유방암의 존재를 측정함을 특징으로 하는 방법.
- 제7항에 있어서, 환자에서 유방암 존재의 측정 방법에 사용하기 위한 폴리펩타이드.
- 환자에서의 유방암 존재의 측정 방법에 사용하기 위한, 서열 78-86 및 서열 144, 145, 153, 167, 177, 193, 199, 205, 208, 215, 217, 220으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 및 엄격한 조건하에서 이에 하이브리드화되는 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드.
- (a) 생물학적 샘플 중에서, 제7항에 따르는 폴리펩타이드 1개 이상을 제1 시점에서 검출하고;(b) 후속 시점에서 단계 (a)를 반복하며;(c) 단계 (a) 및 (b)에서 검출한 폴리펩타이드의 양을 비교하여, 이로부터 환자에서 유방암의 진행을 모니터링함을 특징으로 하는, 환자에서 유방암의 진행을 모니터링하는 방법.
- (a) 생물학적 샘플 중에서, 서열 78-86 및 서열 144, 145, 153, 167, 177, 193, 199, 205, 208, 215, 217, 220으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 및 엄격한 조건하에서 이에 하이브리드화되는 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드 1개 이상을 제1 시점에서 검출하고;(b) 후속 시점에서 단계 (a)를 반복하며;(c) 단계 (a) 및 (b)에서 검출한 폴리펩타이드의 양을 비교하여, 이로부터 환자에서 유방암의 진행을 모니터링함을 특징으로 하는, 환자에서 유방암의 진행을 모니터링하는 방법.
- 제22항 또는 23항에 있어서, 생물학적 샘플이 유방 종양의 일부인 방법.
- 제22항에 있어서, 검출 단계가 생물학적 샘플의 일부를 제9항에 따르는 모노클로날 항체와 접촉시킴을 포함하는 방법.
- 제23항에 있어서, 검출 단계가 서열 78-86 및 서열 144, 145, 153, 167, 177, 193, 199, 205, 208, 215, 217, 220으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 및 엄격한 조건하에서 이에 하이브리드화되는 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드에 결합하는 모노클로날 항체와 접촉시킴을 포함하는 방법.
- 제20항 또는 22항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열 1, 서열 3 내지 서열 77 및 서열 142, 143, 146-152, 154-166, 168-176, 178-192, 194-198, 200-204, 206, 207, 209-214, 216, 218, 219, 221-227로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 1개 이상에 의해 암호화된 아미노산 서열의 에피토프를 포함하는 방법.
- (a) 생물학적 샘플내에서, 제7항에 따르는 폴리펩타이드를 암호화하는 RNA 분자 1개 이상의 양을 제1 시점에서 검출하고;(b) 후속 시점에서 단계 (a)를 반복하며;(c) 단계 (a) 및 (b)에서 검출한 RNA 분자의 양을 비교하여, 이로부터 환자에서 유방암의 진행을 모니터링함을 특징으로 하는, 환자에서 유방암의 진행을 모니터링하는 방법.
- 제28항에 있어서, 검출 단계가(a) 생물학적 샘플내의 RNA 분자로부터 cDNA를 제조하고;(b) 제7항에 따르는 폴리펩타이드의 적어도 일부를 암호화할 수 있는 cDNA 분자를 특이적으로 증폭시킴을 특징으로 하는 방법.
- (a) 생물학적 샘플내에서, 서열 78-86 및 서열 144, 145, 153, 167, 177, 193, 199, 205, 208, 215, 217, 220으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 및 엄격한 조건하에서 이에 하이브리드화되는 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 암호화하는 RNA 분자를 제1 시점에서 검출하고;(b) 후속 시점에서 단계 (a)를 반복하며;(c) 단계 (a) 및 (b)에서 검출한 RNA 분자의 양을 비교하여, 이로부터 환자에서 유방암의 진행을 모니터링함을 특징으로 하는, 환자에서 유방암의 진행을 모니터링하는 방법.
- 제7항에 따르는 폴리펩타이드 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함함을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 서열 78-86 및 서열 144, 145, 153, 167, 177, 193, 199, 205, 208, 215, 217, 220으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 및 엄격한 조건하에서 이에 하이브리드화되는 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함함을 특징으로 하는, 유방암 진행 억제용 약제학적 조성물.
- 제7항에 따르는 폴리펩타이드 및 면역 반응 증강제를 포함함을 특징으로 하는 백신.
- 제1항 내지 3항 중의 어느 한 항에 따르는 DNA 분자를 포함함을 특징으로 하는 백신.
- 제1항 내지 3항 중의 어느 한 항에 따르는 DNA 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함함을 특징으로 하는 백신.
- 서열 78-86 및 서열 144, 145, 153, 167, 177, 193, 199, 205, 208, 215, 217, 220으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 및 엄격한 조건하에서 이에 하이브리드화되는 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드와 면역 반응 증강제를 포함함을 특징으로 하는, 유방암 진행 억제용 백신.
- (a) 제9항에 따르는 모노클로날 항체 1개 이상; 및(b) 검출제를 포함하는 진단용 키트.
- (a) 서열 78-86 및 서열 144, 145, 153, 167, 177, 193, 199, 205, 208, 215, 217, 220으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드에 결합하는 모노클로날 항체 1개 이상; 및(b) 검출제를 포함하는 진단용 키트.
- 제37항 또는 38항에 있어서, 모노클로날 항체(들)를 고체 지지체상에 고정화시킨 키트.
- 각각, 제4항에 따르는 RNA 분자의 인접하는 뉴클레오티드 중 약 10개 이상을 포함하는, 제1 폴리머라제 연쇄 반응 프라이머 및 제2 폴리머라제 연쇄 반응 프라이머를 포함함을 특징으로 하는 진단용 키트.
- 각각 서열 78-86 및 서열 144, 145, 153, 167, 177, 193, 199, 205, 208, 215, 217, 220으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 암호화하는 RNA 분자의 인접하는 뉴클레오티드 중 약 10개 이상을 포함하는, 제1 폴리머라제 연쇄 반응 프라이머 및 제2 폴리머라제 연쇄 반응 프라이머를 포함함을 특징으로 하는 진단용 키트.
- 제4항에 따르는 DNA 분자의 인접하는 뉴클레오티드 중 약 15개 이상을 함유하는 올리고뉴클레오티드 프로브를 1개 이상 포함함을 특징으로 하는 진단용 키트.
- 각각 서열 78-86 및 서열 144, 145, 153, 167, 177, 193, 199, 205, 208, 215, 217, 220으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 DNA 서열의 인접하는 뉴클레오티드 중 약 15개 이상을 포함하는 올리고뉴클레오티드 프로브를 1개 이상 포함함을 특징으로 하는 진단용 키트.
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