ES2389689T3

ES2389689T3 - Método para incrementar la resistencia frente a hongos biotrópicos en vegetales

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Publication number: ES2389689T3
Application number: ES07821799T
Authority: ES
Inventors: Holger Schultheiss; Markus Frank; Caroline HÖFLE
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2006-10-24
Filing date: 2007-10-24
Publication date: 2012-10-30
Anticipated expiration: 2027-10-24
Also published as: CA2660439A1; EP2081954B1; US8373022B2; BRPI0720192A2; WO2008049865A2; EP2081954A2; US20100088777A1; WO2008049865A3; CA2660439C

Abstract

Método para generar o elevar una resistencia frente a al menos un hongo biotrófico del género Phakopsora enuna planta o una parte de una planta, en cuyo caso la parte de una planta comprende un tejido o una célula, el cualcomprende los pasos:(a) elevar la cantidad o función de la proteína de al menos una proteína inhibidora - 1 Bax (BI1) en la planta o almenos una parte de una planta frente a la cantidad o función de proteína en la planta de partida o en sus partes, encuyo caso(i) se transforman células vegetales de manera estable con un casete de expresión recombinante que contiene unasecuencia de ácido nucleico, que codifica una proteína BI1, en conexión funcional con un promotor, en cuyo caso elpromotor es heterólogo respecto de la secuencia de ácido nucleico que codifica proteína BI1;(ii) se regenera la planta a partir de las células vegetales; y(iii) la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína BI1 se expresa en una cantidad, en al menos un tejido opor un tiempo, de manera suficiente para generar o elevar una resistencia a hongos en la planta en contra de unhongo biotrófico del género Phakopsora, y(b) selección de la planta o de una parte de una planta en la cual en comparación con la planta de partida o su partegenera o eleva una resistencia contra al menos un hongo biotrófico del género Phakopsora, en cuyo caso la proteínaBI1 se codifica por un polipéptido que comprende al menos una secuencia seleccionada del grupo que se componede:(a) las secuencias según SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, o, 38; y(b) secuencias que tienen una identidad de al menos 70% a una de las secuencias según SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10,12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, o 38, en cuyo caso la planta es soja.

Description

Método para incrementar la resistencia frente a hongos biotrópicos en vegetales

La presente invención se refiere a métodos para generar o incrementar resistencia frente a al menos un patógeno biotrópico del género Phakopsora en una planta de soja o una parte de una planta de soja incrementando la cantidad de proteína o función de al menos una proteína inhibidora 1 Bax (BI-1) en al menos una parte de la planta de soja.

El cultivo de plantas en la agricultura sirve en primer lugar para la producción de alimentos para los seres humanos y para la producción de piensos y forrajes para animales. En los últimos 25 años se han logrado aumentos ostensibles de las cosechas en la producción vegetal. Esto se consiguió mediante interacción de la tecnología de cultivos modificada, nuevos cultivos, abono y, no en último lugar, protección vegetal mejorada. Ante el hecho de una población siempre creciente, la seguridad alimentaria gana en importancia de manera creciente. Se estima que en el año 2017 van a vivir en el planeta 7 millardos de personas. Para alimentarlas sin que aumente la proporción de personas subalimentadas, la producción de alimentos debería crecer en 60 %. (Entrup N.L. et al., Lehrbuch des Pflanzenbaues (Libro de texto de la producción vegetal), editorial Thomas Mann Verlag, Gelsenkirchen, 2000). Para esto, una protección vegetal efectiva es un factor decisivo. Los monocultivos en particular, que son la regla hoy en día, son altamente susceptibles a una propagación de las enfermedades del tipo epidémico. La consecuencia son cosechas ostensiblemente reducidas. Hasta ahora los organismos patógenos han sido combatidos ante todo empleando pesticidas. Hoy en día, por contraste, el ser humano tiene la posibilidad abierta de modificar directamente la disposición genética de una planta frente a un patógeno.

Los hongos están difundidos a nivel mundial y forman un grupo heterogéneo con una gran diversidad de especies. Éstos son eucariotas, no poseen clorofila y son, por lo tanto, heterotróficos. Dependen de fuentes de carbono externas de las que se aprovechan como parásitos, saprófitos o simbiontes. Los saprófitos viven exclusivamente en material vegetal muerto. Los hongos parásitos se alimentan de tejidos vivos y deben haber concluido su desarrollo antes de la muerte de la planta. Los parásitos facultativos pueden alimentarse tanto de tejidos vivos como de tejidos muertos. Los simbiontes, como las micorrizas, viven en sociedad estrecha con las plantas. Los hongos poseen uno o más núcleos celulares por célula y son homo- o heterocarióticos. Los hongos tienen una pared celular sólida al menos en un estadio de vida. Esta pared se compone en su mayoría de quitina o en algunos casos como las oomycotas, de celulosa. El cuerpo vegetativo del hongo (talo) es usualmente haploide, en raros casos diploide. El talo de los hongos inferiores (entre otros myxomycotas) se compone de células amibioides o de plasmodios (protoplasma polinuclear desnudo). Los eumicotes tienen células germinadas, como las levaduras (por ejemplo Saccharomyces cerevisiae), o forman un micelio que se compone de hifas con forma de hebras. Mediante la agregación de hifas pueden formarse órganos especiales para la propagación (cuerpos de fruta) o para supervivencia ante condiciones ambientales desfavorables (esclerocios). La propagación y multiplicación se efectúan usualmente por medio de esporas; asexualmente, con conidias, uredosporas, esporangiosporas, clamidosporas y zoosporas, sexualmente cono oosporas, ascosporas, zigosporas y basidiosporas.

Hasta hoy se conocen aproximadamente 100 000 especies de hongos diferentes. Entre éstos, solo 5% son fitopatógenos. Los basidiomicotes son una división de los hongos auténticos que se caracterizan por el desarrollo de una estructura particular, el basidio, en el que las basidiosporas maduran. Los basidiomicotes también incluyen los hongos conocidos generalmente como setas y champiñones. Los basidiomicotes son de manera preponderante heterotálicos y auto-estériles. La copulación se efectúa por somatogamia. En tal caso se fusionan dos micelios o esporidios mononucleares, haploides, compatibles. El micelio dicariótico resultante constituye la fase principal del ciclo de vida por un tiempo prolongado. Los dos únicos géneros fitopatógenos de los basidiomicotes son los ustilagos y los uredinales (royas). Los ustilagos atacan solo angiospermas y poseían antes un gran significado económico. Hoy en día se combaten exitosamente mediante compuestos activos correspondientes y controles estrictos de las semillas. Una importancia más grande tienen hoy todavía los uredinales. Son biotróficos y pueden tener un ciclo de desarrollo complicado con hasta cinco estadios diferentes de esporas (espermacio, acidiosporas, uredosporas, teleutosporas y basidiosporas). Los uredinales que desarrollan todos los estadios de esporas se denominan como royas macrocíclicas. Si faltan algunos estadios se habla de royas microcíclicas. En el caso de "royas imperfectas" faltan las basidiosporas. Algunas royas cambian el huésped durante su desarrollo. Estos se denominan heteroicos. El cambio de huésped puede estar enlazado con un cambio de fase nuclear. Por contraste, las royas autoicas completan todo su desarrollo en un huésped. Un ejemplo clásico de una roya macrocíclica, heteroica es la roya negra de cereal Puccinia graminis. P. Graminis ataca ante todo trigo en su estadio dicariótico. El haplonte es patógeno para el agracejo (Börner H., Pflanzenkrankheiten und Pflanzenschutz (Enfermedades vegetales y protección vegetal), editorial Ulmer Verlag Stuttgart, 1997; Sitte P. et al., Strasburger - Lehrbuch der Botanik (Texto de botánica), editorial Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1998; Entrup N.L. et al., Lehrbuch des Pflanzenbaues (Texto de producción vegetal), editorial Thomas Mann Verlag, Gelsenkirchen, 2000).

Durante la infección de plantas con hongos patógenos se observan en general fases diferentes. Las primeras fases de la interacción entre los hongos fitopatógenos y sus huéspedes vegetales potenciales son decisivas para la colonización de la planta por parte del hongo. En el primer paso de la infección las esporas se adhieren a la

superficie de las plantas, germinan y el hongo penetra la planta. Para la adhesión de las esporas se requiere un metabolismo activo, que es el caso de Colletotrichum graminicola, o se efectúa de modo pasivo, como en el caso de Magnaporthe grisea. En este último caso, la humedad conduce a la secreción de "adhesivo de mucílago" con el cual se adhiere la espora (Howard R.J. et al., Annu. Rev. Microbiol. 50, 491 (1996)). La germinación de espora se induce por inductores no específicos como agua, nutrientes, etileno o, en raras ocasiones como en la Phyllosticta ampelicida, por medio de superficies hidrófugas (Kuo K. et al., Fungal Genet. Biol. 20, 18 (1996)). Algunos hongos desarrollan dos tubos de germen, como el mildiú de cereal Blumeria graminis, mientras que otros hongos desarrollan solo un tubo de germen (Green J.R. et al., The powdery mildrews, a comprehensive treatise; The formation and function of infection and feeding structures, APS Press, 2002). Los hongos pueden penetrar las plantas a través de aberturas ya presentes como estomas, lenticelas, hidátodos y heridas, o penetran la epidermis de la planta directamente mediante fuerza mecánica y con la ayuda de enzimas que digieren la pared celular. Para penetrar en la planta se forman estructuras de infección especiales. Estos órganos de presión se denominan apresorios y permiten que el hongo forme una presión alta sobre un punto discreto. Se estima que la M. Grisea alcanza presiones de 80 bares con su apresorio (Howard R.J. et al., Annu. Rev. Microbiol. 50, 491 (1996)). Por el contrario, la mayoría de royas penetran en la planta a través de las estomas. La roya de soja, Phakopsora pachyrhizi, penetra la epidermis de la planta directamente y de esta manera es similar en su conducta de penetración al mildiú de cereal B. graminis (Koch E. et al., Phytopath. páginas 106, 302 (1983); Tucker S.L. et al., Annu. Rev. Phytopathol. 39, 385 (2001); Green J.R. et al., The powdery mildews, a comprehensive treatise; The formation and function of infection and feeding structures, APS Press, 2002).

Los hongos fitopatógenos no siempre colonizan toda la planta sino solo determinadas zonas o determinados tejidos. Después de la invasión exitosa de la planta los hongos fitopatógenos siguen diferentes estrategias de alimentación. Los patógenos pertotróficos o necrotróficos matan las células del huésped mediante las enzimas o toxinas extracelulares y se alimentan por la descomposición de la células muertas. Algunos géneros son los fusarios sp., Alternaria sp. y Cochliobolus. La mayoría de los hongos sigue esta estrategia de alimentación. Los hongos fitopatógenos biotróficos, como el mildiú y muchos hongos de roya, dependen del metabolismo de células vivas para su alimentación. Una posición intermedia es ocupada por los hongos patógenos hemi-biotróficos, los cuales incluyen los géneros Phytophtora y Peronospora. La mayoría de estos son biotróficos al inicio de su desarrollo y solo se convierten a un modo de vida pertotrófico si su desarrollo es ampliamente avanzado (Prell H.H., Interaktionen von Pflanzen und phytopathogenen Pilzen (Interacciones de plantas y hongos patógenos), editorial Gustav Fischer Verlag, Jena, 1996). A fin de contrarrestar la infección, las plantas han desarrollados mecanismos complejos de defensa. Otra posición intermedia la asume, por ejemplo, la roya de soja, la cual penetra la epidermis directamente, después de lo cual la célula penetrada se necrotiza; después de la penetración se convierte en un modo de vida biotrófico obligatorio. El subgrupo de los hongos patógenos biotróficos que aplican esencialmente una estrategia de infección así se denomina, para propósitos de la presente invención "heminecrotrófico".

Es importante resaltar que las plantas durante su desarrollo se exponen al ataque permanente de numerosos organismos fitopatógenos. Sin embargo, la colonización de las plantas por organismos fitopatógenos es más la excepción que la regla. Antes que un patógeno pueda atacar la planta, debe superarse una serie de barreras. Con frecuencia el patógeno ha desarrollado factores de patogenicidad especiales, que se adaptan a la planta, los llamados factores de virulencia, a fin de superar estas barreras. En este caso, la planta de vuelve una planta huésped del patógeno, es decir éste es virulento en la planta. Existe una compatibilidad base entre la planta y el patógeno. Esto significa que los requisitos fisiológicos y bioquímicos para la colonización ya existen o se producen (Prell H.H., Interaktionen von Pflanzen und phytopathogenen Pilzen (Interacciones de plantas y hongos fitopatogenos), editorial Gustav Fischer Verlag, Jena, 1996). El patógeno se desarrolla en una interacción compatible a costa de la planta y de esta manera provoca la formación de síntomas de enfermedad como marchitamiento, necrosis y clorosis. Si existe una compatibilidad básica, la planta aún puede defenderse contra el patógeno si en la planta ha tenido lugar una mutación de resistencia. La resistencia de la planta, adquirida de esta forma, se denomina resistencia de huésped. Esta dirigida solo contra un patógeno individual determinado y puede ser superada fácilmente por éste. La mayoría de las veces, aunque no siempre, se trata de patógenos biotróficos. La resistencia de huésped puede subdividirse además en una resistencia horizontal, no específica para raza, en la que casi siempre participan varios genes, y en una resistencia vertical, específica para raza. Esta última es efectiva solamente frente a determinadas razas individuales de un patógeno mientras que la planta se defiende desde el principio contra la mayor parte de los patógenos. Este fenómeno se denomina incompatibilidad de base o resistencia que no es de huésped ("non-host resistence"). Por lo contrario a la resistencia de huésped, la resistencia que no es de huésped se basa en una serie de causas y no en genes individuales. Por una parte, al patógeno pueden faltarle los factores necesarios de patogenicidad o la planta está en capacidad de reconocer el patógeno y defenderse exitosamente. Otro término que es importante en particular para la agricultura es la tolerancia. Una planta es tolerante a un patógeno cuando puede verse atacada pero el ataque no conduce al desarrollo de síntomas de enfermedad y no conduce a una reducción de la cosecha (Prell H.H., Interaktionen von Pflanzen und phytopathogenen Pilzen (Interacciones de plantas y hongos fitopatógenos), editorial Gustav Fischer Verlag, Jena, 1996). Para los propósitos de la descripción de la presente invención, un incremento en la resistencia debe comprender tanto un incremento o generación de cualquier tipo de resistencia como también de tolerancia; es decir, principalmente todos los casos de tolerancia o resistencia incrementada que conduce a una reducción de las pérdidas de cosecha por la acción del patógeno.

En las reacciones de resistencia de las plantas, con el término factores de resistencia se agrupan las estructuras, las sustancias y los procesos que impiden o inhiben el ataque de la planta por parte de patógenos potenciales. Si los factores de resistencia ya están presentes en la planta de modo constitutivo, se denominan como factores de resistencia preformados. Los factores de resistencia inducidos solo se forman si ha tenido lugar una reacción de reconocimiento entre la planta y el patógeno potencial. El reconocimiento puede describirse como una reacción de señal / sensor (modelo elicitor-receptor, Keen N.T. et al., Phytopathology 62, 768 (1972)). La señal son sustancias que provienen del patógeno, los llamados elicitores que se unen a un sensor o receptor específicos para el elicitor respectivo. Esta unión provoca uno o varios efectores que pueden representar, por ejemplo, cadenas de transducción de señal e inducen una reacción de resistencia. Una serie completa de sustancias actúan como elicitores. Estos incluyen proteínas, glicoproteinas, glicanos y lípidos (Garcia Brugger et al., MPMI 19, 711 (2006)). Los productos de degradación de la pared celular vegetal que se liberan por las enzimas del patógeno o también por el uso de la planta pueden inducir una reacción de resistencia. En este contexto con frecuencia se menciona un factor de avirulencia del patógeno y el gen de resistencia correspondiente de la planta ("hipótesis de gen por gen", Flor, J. Agric. Res. 74, 241 (1947)). El patógeno puede impedir el reconocimiento por parte de la planta mediante modificaciones estructurales del elicitor, enmascaramiento de la secuencia de reconocimiento o por competencia con otra sustancia por los sitios de unión en el elicitor o en el receptor.

Los factores de resistencia preformados forman la primera defensa contra la colonización por los organismos patógenos. Estos factores pueden ser de naturaleza morfológica o representar sustancias del metabolismo vegetal secundario (fitoanticipina). Los factores morfológicos que impiden una colonización es la vellosidad del follaje, la densidad y la forma de los estomas así como la naturaleza, la densidad y la forma de los estomas así como la naturaleza de la cutícula y de la pared celular.

El reconocimiento del patógeno por la planta también puede conducir a la inducción de factores de resistencia, es decir a reacciones de resistencia morfológicas y fisiológicas. Muchas de estas reacciones son la consecuencia de una cascada de señal. Las moléculas de señal, como Ca2+, NO, compuestos de oxígeno reactivo y fitohormonas tales como etileno y jasmonato, participan en las cascadas y contribuyen al cruce de las vías de señal. Como reacciones de resistencia en los que cambian las estructuras morfológicas en la célula vegetal pueden mencionarse la formación de aposiciones de pared celular (papilas), capas de corcho y de abscisión, tílides y la impregnación de la pared celular. El inicio de la penetración por un hongo patógeno puede provocar la formación papilas. Opuesto al sitio de penetración potencial en la pared celular interior se depositan lignina, callosa, suberina y proteínas ricas en hidroxiprolina y se entrecruzan entre sí. La callosa puede teñirse por la intercalación de azul de anilina. Adicionalmente, en la papila formada se acumulan fenoles, compuestos de oxígeno reactivos e hidrolasas (Hückelhoven R. et al., Plant Physiol. 119, 1251 (1999); Assaad F.F. et al., Mol. Biol. of the Cell, 15, 5118 (2004)). La formación de papilas conduce a una pared celular considerablemente compactada y puede impedir la penetración del hongo patógeno. Los procesos fisiológicos que contribuyen a la resistencia inducida son la despolarización de la membrana celular, del 'oxidative burst' (respuesta al estrés por oxidación), la 'reacción hipersensible', la formación de fitoalexinas y la expresión de 'pathogenesis related proteins' (proteínas relacionadas a la patogénesis o proteínas PR). Una de las primeras reacciones al contacto con un elicitor es la despolarización de la membrana celular. En tal caso resulta un fuerte flujo de escape de iones de Cl- y de K+ ligado con una pérdida ostensible de agua. Se supone que la despolarización provoca un incremento de la concentración de Ca2+, de una molécula de señal importante. (Ward J.M. et al., Plant Cell 7, 833 (1995)) y desempeña un papel en la 'reacción hipersensible’ (RH) (Wendehenne

D. et al., Plant Cell 14, 1937 (2002)). La RH en las plantas es una forma de la muerte celular programada. Permite a la planta detener el hongo aún después de la penetración retirándole la base de de alimentación. El curso de la RH parece depender en tal caso de la combinación de planta y patógeno. Pero para la inducción de la RH parece no ser necesaria la biosíntesis de proteína, un citoesqueleto intacto y ácido salicílico. (Heath M., Plant Mol. Biol. 44, 321 (2000)).

Una reacción muy rápida al patógeno es el 'oxidative burst' (estallido de oxidación), la formación de compuestos de oxígenos reactivos como el anión de superóxido O2-, el radical hidroxilo OH· y peróxido de hidrógeno. Estos compuestos se forman mediante diferentes oxidasas. El radical hidroxilo actúa de modo local, mientras que H2O2 puede difundir a través de las membranas. Ambos oxidan ácidos grasos poliinsaturados y pueden destruir membranas de esta manera (Grant J.J. et al., Plant Physiol. 124, 21 (2000)). Para H2O2 también se sospecha una función en la regulación de gen. Además, los compuestos apoyan las reacciones de defensa mediante cruce de los componentes de pared celular, lignificación incrementada y tienen un efecto tóxico en los patógenos (Garcia-Brugger

A. et al., MPMI 19, 711 (2006)). No en último lugar, el ataque del patógeno conduce a la expresión de genes que codifican proteína PR y fitoalexinas. Las proteínas PR son un grupo heterogéneo de proteínas que actúan de modo tóxico en hongos que han penetrado. Fitoalexinas se denominan sustancias de bajo peso molecular con efecto antimicrobiano cuya síntesis es provocada por estrés biótico o abiótico (Prell H.H., Interaktionen von Pflanzen und phytopathogenen Pilzen (Interacciones de plantas y hongos fitopatógenos), editorial Gustav Fischer Verlag, Jena, 1996; van Loon L.C. et al., Physiol. Mol. Plant Physiol. 55, 85 (1999)). Las reacciones descritas transcurren en parte tanto durante la interacción del patógeno con un huésped como también con una planta no huésped. Para defenderse del patógeno es decisiva la calidad de reconocimiento y la cantidad y velocidad de la reacción de resistencia (Thordal-Christensen H., Current Opinion in Plant Biology 6, 351 (2003)).

Una enfermedad de las plantas que ha ganado importancia en los últimos tiempos es la roya de los granos de soja. La enfermedad es causada por los hongos de roya patógenos Phakopsora pachyrhizi (Sydow) y Phakopsora meibomiae (Arthur). Estos pertenecen a la clase de los basidiomycotes, al orden de uredinales y a la familia de las Phakopsoraceae. Ambas especies están muy estrechamente relacionadas entre sí. Las secuencias intergénicas de sus genes de ARNr muestran una similitud de 80 % (Frederick R.D. et al., Phytopathology 92, 217 (2002)). Las especies se diferencian por medio de características morfológicas de las teliosporas (Ono Y. et al., Mycol. Res. 96, 825 (1992)). Ambos hongos de roya infectan un amplio espectro de plantas huéspedes. P. pachyrhizi, que también se denomina roya de soja asiática es el patógeno más agresivo en granos de soja (Glycine max) y posee por lo tanto, al menos en la actualidad, una gran importancia para la agricultura. P. pachyrhizi puede infectar en condiciones naturales 31 especies de 17 familias de leguminosas y es capaz de crecer en condiciones controladas en otras 60 especies (Sinclair et al.(eds.), Proceedings of the soybean rust workshop (1995), National Soybean Research Laboratory, Publication No. 1 (1996); Rytter J.L. et al., Plant Dis. 87, 818 (1984)). P. meiboniae fue hallado en la región Caribe y en Puerto Rico y hasta ahora no ha causado mayor daño.

P. pachyrhizi se descubrió originalmente en 1902 en Japón. Dese allí P. pachyrhizi se expandió por amplias partesdel Asia así como por la India y Australia y finalmente alcanzó el África en 1996. El hongo llegó en 2001 a Suramérica y alcanzó Norteamérica por primera vez en el 2004 (Sconyers E.L. et al., www.ers.usda.gov/Features/SoyBeanRust/ (2005)). En Suramérica particularmente P. pachyrhizi ha causado grandes pérdidas de cosechas de hasta 80 %. Se estima que 1,5 millones de toneladas de la cosecha de soja brasileña del 2005/2006 han sucumbido a la infección con roya de soja. P. pachyrhizi es una roya hemicíclica que forma tres tipos de esporas. Una formación de teliosporas se observó al final del periodo de vegetación (Yeh C.C. et al., Phytopathology 71, 1111 (1981)). La formación de basidiosporas es conocido por el contrario solo en condiciones de laboratorio. La forma de esporas más importante son las uredosporas que se forman durante todo el periodo de vegetación y sirven para el contagio. Estas esporas se forman en grandes cantidades y pueden recorrer amplios trayectos con el viento y la lluvia. P. pachyrhizi es obligatoriamente biotrófico. Si una uredospora alcanza un huésped adecuado, ésta germina con un tubo de germen individual. En su extremo se genera un apresorio que alcanza rápidamente el tamaño de las esporas. Con el apresorio el hongo es capaz de generar una gran presión y puede penetrar directamente las células de la epidermis con una hifa de penetración. La hifa de penetración de P. pachyrhizi crece a través de las células de epidermis y una vez alcanza el espacio intercelular en la hoja, forma el primer septo. Sigue creciendo entonces como primera hifa en la hoja. Ya 24 - 48 h después de la infección se divide la primera célula madre haustorial por un septo y se forma un haustorio con forma de saco en una célula mesófila de la hoja. En tal caso es penetrada la pared de la célula de la célula mesófila pero el plasmalema solo se invagina de modo que la célula permanece viva y puede servir como fuente de nutriente. Los nutrientes viajan de la membrana de la célula huésped viva por la matriz extrahaustorial hacia el haustorio. La célula de epidermis penetrada al inicio se necrotiza al poco tiempo después de la penetración. Este tipo y modo de infección de un patógeno biotrófico como la lleva a cabo P. Pachyrhizi se denomina, por lo tanto, "heminecrotrófica". Solo 11 - 12 días después de la infección se forman las primeras uredosporas y el ciclo puede iniciar nuevamente (Koch E. et al., Phytopath. p. 106, 302 (1983)).

Los granos de soja útiles en la agricultura Glycine max (L.) Merr. pertenece a la familia de las leguminosas, subfamilia papilionoideae, tribu phaseoleae, género Glycine Willd. y subgénero soja (Moench). Los granos de soja se cultivan en más de 35 países. Algunas de las principales zonas de cultivo se encuentran en los Estados Unidos de América, China, Corea, Argentina y Brasil. Se considera una de las plantas de cultivo más antiguas y se domesticó por primera vez en China entre los siglos 11 y 17 (Hymowitz T., Econ. Bot. 24, 408 (1970)). En el año 1765 se introdujo en los Estados Unidos de América, hoy en día una de las zonas más grande cultivo de soja. Pueden encontrarse variedades de soja silvestres en China, Corea, Japón, Taiwan y la antigua URSS. Los indicios morfológicos, citológicos y moleculares apuntan a G. soja como predecesor de la forma de cultivo G. max. La soja como planta subtropical prefiere una temperatura anual promedio de 5.9 - 27°C y no es resistente a la helada (OECD, Consensus document on the biology of Gycine max (L.) Merr. (Soybean); Series on harmonization of regulatory oversight in biotechnology No. 15, ENV/JM/MONO(2000)9). Hoy en día la soja es una fuente principal de aceite y de proteína. Este uso amplio de la soja en la producción de alimentos subraya el significado de un combate efectivo de la roya de soja.

La infección de las plantas de soja por P. pachyrhizi se efectúa mediante uredosporas difundidas por el viento. Como primeros síntomas en el lado superior de la hoja pueden reconocerse pequeñas lesiones amarillas a rojo-marrones que luego se extienden hasta que toda la hija finalmente se vuelve clorótica y muere. En el caso de una infección avanzada las lesiones aparecen en toda la planta. Las primeras uredias con un diámetro de 100-200 µm aparecen 10-14 días después de la infección sobre el lado inferior de la hoja y pueden producir esporas durante tres a seis semanas. Los telios se forman a nivel sub-epidérmico y aparecen casi siempre en la periferia de las lesiones. Las esporas son primero amarillas a marrones y más tarde se vuelven negras. Los primeros síntomas aparecen con frecuencia en las hojas más viejas. El rápido desarrollo de la enfermedad se correlaciona con el inicio de la floración (R1+) y destruye finalmente todo el follaje. La destrucción en gran parte del área activa de fotosíntesis y el retiro de agua y nutrientes por parte del hongo conducen a una productividad reducida de la planta (Sconyers E.L. et al., www.ers.usda.gov/Features/SoyBeanRust/ (2005)).

Para germinar P. pachyrhizi necesita humedad en forma de rocío o similar sobre la superficie de la hoja. El hongo es particularmente estimulado por lluvia frecuente y temperaturas entre 15 y 29 °C (Sconyers E.L. et al., www.ers.usda.gov/Features/SoyBeanRust/(2005)). La enfermedad inicia con frecuencia en sitios individuales y se difunde a continuación rápidamente por todo el campo. El hongo es autoico, es decir, no necesita alternar el huésped para su desarrollo y puede persistir fácilmente en sus numerosas plantas huésped alternativas. En los Estados Unidos de América kudzu (Pueraria lobata), proveniente de Japón, se considera una planta huésped potencial en la que P. Pachyrhizi puede invernar y proporcionar un inóculo nuevo en la siguiente primavera.

En la actualidad es posible combatir P. pachyrhizi en el campo solo con fungicidas. No hay disponibles plantas de soja con una resistencia contra todo el espectro del aislado. En la búsqueda de plantas resistentes se descubrieron cuatro genes dominantes Rpp1-4 que facilitan una resistencia de soja frente a P. pachyrhizi, pero esta resistencia solo es específica frente al aislado (Hartwig E.E. et al., Crop Science, 23, 237 (1983); Hartwig E.E., Crop Science 26, 1135 (1986)). Puesto que la resistencia se basa solo en genes individuales, ésta se perdió rápidamente.Únicamente la resistencia mediada por Rpp4 se ha quebrado hasta ahora en condiciones de invernadero (Posada-Buitrago M.L. et al., Fungal Genetics and Biology 42, 949 (2005). La utilización de fuentes de resistencia potencial de representantes de soja del subgénero perenne es restringida (Hartman G..I. et al., Plant Disease 76, 396 (1992)). Hasta ahora toda la descendencia fue estéril en todos los cruces (Singh R. et al., Wendl. Theor. Appl. Genet. 74, 391 (1987).

Para combatir efectivamente la roya de soja con fungicidas es importante una aplicación profunda en el follaje de la plantas porque la infección se presenta en primer lugar en las hojas inferiores. Ha demostrado ser bueno un tratamiento doble. Una desventaja de los fungicidas usados en tal caso es que debido a su mecanismo de acción específico pueden generarse fácilmente resistencias. Una alternativa potencia al empleo de fungicidas es el uso de plantas de soja resistentes a glifosato. En un ensayo de invernadero, después del tratamiento de las plantas de soja con el herbicida tres días antes de la inoculación se observó una reducción de las lesiones causadas por la roya en 46 - 70 %, (Feng C.C.P. et al., PNAS 102, 17290 (2005)). Sin embargo se debe esperar para ver si este efecto también permanece en los ensayos de campo.

P. pachyrhizi gana en los últimos años cada vez más una mayor importancia como peste en el cultivo de soja. Por lo tanto, en el estado de la técnica existe una necesidad de desarrollar métodos para combatir el hongo. En tal caso por el momento no se debe esperar un aporte del cultivo ya que las fuentes de resistencia presentes no son accesibles. El tratamiento con fungicidas tiene un efecto limitado y solo es efectivo si la enfermedad aún no se ha declarado. Por estas razones principalmente se propone el patosistema soja con P. pachyrhizi para un planteamiento transgénico. Para un planteamiento prometedor primero es importante conocer exactamente el curso de la infección y la reacción de la planta, particularmente en las primeras etapas de la infección. Los genes candidatos que facilitan la resistencia potencial deben identificarse y su efecto en la interacción entre la planta y el patógeno debe caracterizarse. La transformación estable de las plantas es muy intensa en tiempo y en costes, por lo tanto se prefiere una transformación transitoria que permite una caracterización de la interacción planta – patógeno al nivel de la célula individual. Como método se propone aquí la transformación balística transitoria de las hojas. La no resistencia del huésped es particularmente efectiva y duradera en las plantas y se basa en una cantidad y velocidad elevadas de la reacción de resistencia en comparación con la reacción compatible. Una caracterización de genes decisivos en la no resistencia del huésped puede servir de esta manera para la identificación de genes candidatos potenciales para la producción de plantas resistentes. Por lo tanto, con el fin de investigar también la reacción de una planta no huésped a la roya de soja, en los ejemplos se seleccionó el sistema cebada (Hordeum vulgare) con P. pachyrhizi ya que la cebada es una planta modelo bien descrita. Adicionalmente, el patosistema de cebada con Blumeria graminis f.sp. hordei (Bgh) y la incompatible Blumeria graminis f.sp. tritici (Bgt) están muy bien estudiadas. A pesar de que Bgh y P. pachyrhizi tienen diferencias en cierto respecto, tienen al menos algunos pasos en común de modo fenotípico al inicio del proceso de la infección. De esta manera el análisis en cebada puede dar información sobre los mecanismos de la no resistencia de huésped frente a P. pachyrhizi en comparación con la resistencia de huésped de cebada. En hojas de cebada transformadas transitoriamente se ensayaron por lo tanto los genes candidatos en sus efectos en la resistencia frente a P. pachyrhizi. Con la transformación balística transitoria está disponible un método para investigar una serie de genes involucrados potencialmente en la respuesta de resistencia en el patosistema de cebada con P. pachyrhizi.

La muerte celular programada ('programmed cell death' PCD) es un proceso importante en el desarrollo y en la respuesta al estrés de plantas y animales. Algunas modificaciones morfológicas y bioquímicas de la célula, como condensación de cromatina, el encogimiento del citoplasma y la fragmentación de ADN parecen ser comunes en este caso a plantas y animales (Lam E. et al., Nature 411, 848 (2001)). No es posible una clara separación del PCD y de la RH provocada por estrés biótico o abiótico (Heath M., Plant Mol. Biol. 44, 321 (2000)). Un activador del PCD en animales es BAX. BAX forma canales en la membrana mitocondrial externa y provoca la liberación de citocromo

c. Esto dispara una cascada de caspasa y de esta manera la proteólisis de proteínas que la célula necesita para sobrevivir (Green D.R. et al., Science 281, 1309 (1998). La sobreexpresión de BAX en tabaco (N. tabacum, Lacomme C. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 96, 7956 (1999)) y Arabidopsis thaliana (Kawai-Yamada M. et al., Plant Cell 16, 21 (2004)) provocan un PCD y de esta manera sugiere mecanismos similares en plantas y animales. Pero hasta ahora no han podido identificarse homólogos de BAX en plantas. Por el contrario, se conserva un

regulador antagonista a BAX del PCD en plantas, animales y otros organismos, como levaduras. Entretanto se identificaron proteínas similares en A. thaliana, H. vulgare, Brassica napus, Brassica oleracea, Oryza sativa y N. tabacum (Hückelhoven R., Apoptosis 9, 299 (2004)). En experimentos con proteínas de fusión BI-1-GFP se observó una localización de BI-1 en la membrana del retículo endoplasmático (RE) en la membrana nuclear (Eichmann R. Et al., Mol. Plant Microbe Interact. 17, 484 (2004)). La proteína tienen un tamaño de 25 - 27 kDa y posee 6 - 7 dominios de transmembranas. El término-C localizado probablemente en el citoplasma (Bolduc N. et al., Planta 216, 377 (2003)) es esencial para la función de BI-1 (Kawai-Yamada et al., Plant Cell 16, 21 (2004)). Los dominios de transmembranas forman posiblemente un canal de iones (Bolduc N. et al., Planta 216, 377 (2003)). De esta manera, debido a la función almacenadora del RE para Ca2+, BI-1 podría tener una función en la regulación del nivel citosólico de Ca2+ y/o del estado redox de la célula (Xu Q. et al., Mol. Cell 18, 1084 (1998); Balduc N. et al., FEBS Lett. 532, 111 (2003); Hückelhoven R. et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 29, 5555 (2003); Matsumura H. et al., Plant J. 33, 425 (2003)). En células animales no hay interacción física directa de BI-1 con Bax. Pero BI-1 interactúa con otros reguladores del PCD (Xu Q. et al., Mol. Cell 18, 1084 (1998)). Probablemente, BI-1 también interactúa en plantas con otros reguladores del PCD e influye de esta manera las reacciones de resistencia. En Arabidopsis, BI-1 puede reprimir el BAX y el PCD inducido por H2O2 (Baek D. et al., Plant Mol. Biol. 56, 15 (2004); Kawai-Yamada M.et al., Plant Cell 16, 21 (2004)). Por lo tanto regula probablemente los procesos en un nivel más profundo que la respuesta al estres por oxidación (Kawai-Yamada M. et al., Plant Cell 16, 21 (2004)). La expresión de BI-1 se induce por estrés biótico y abiótico como ataque de patógeno o herida, pero también en tejidos que envejecen (Balduc N. et al., FEBS Lett. 532, 111 (2003); Hückelhoven R., Apoptosis 9, 299 (2004)). En Arabidopsis se eleva el nivel de ARNm de BI-1 después del choque de calor (Watanabe N. et al., Plant J. 45, 884 (2006)). La expresión de BI-1 se induce en tomate (Lycopesicum esculentum) por H2O2 y en Arabidopsis por H2O2 y ácido salicílico (Hückelhoven R., Apoptosis 9, 299 (2004); Kawai-Yamada M.et al., Plant Cell 16, 21 (2004)). Esto sugiere una función de BI-1 en la defensa de patógeno porque ambas sustancias desempeñan en esta un papel importante (Prell H.H., Interaktionen von Pflanzen und phytopathogenen Pilzen (Interacciones de plantas y hongos fitopatógenos), editorial Gustav Fischer Verlag, Jena, 1996).

Por consiguiente, la infección de cebada con Bgh o Bgt provoca un incremento de la expresión de BI-1 (Hückelhoven

R. et al., Plant Mol. Biol. 47, 739 (2001); Eichmann R. et al., Mol. Plant Microbe Interact. 17, 484 (2004)). En arroz la expresión después de la infección con M. grisea sigue un curso bifásico. Primero se incrementa ligeramente pero 12 h después de la infección se reduce nuevamente para después incrementarse nuevamente (Matsumura H. et al., Plant J. 33, 425 (2003)). El incremento de expresión de BI-1 en células de Arabidopsis después del tratamiento con Fumonisin B1 (Watanabe N. et al., Plant J. 45, 884 (2006)) y la reducción de la expresión de BI-1 después del tratamiento de células de arroz con M. grisea extracto de elicitor muestra que el patrón de expresión dependiendo del factor inductor y de la planta pueden ser muy diferentes. El patrón de expresión sugiere un rol de Bl-1 en la regulación del PCD o RH inducido por estrés y en la reacción a resistencia frente a patógenos. La influencia del RH puede elevar la resistencia de una planta, ante todo si los patógenos son hongos perto- o hemibiotróficos. Una sobreexpresión de Bl-1 en zanahoria (Daucus carota ssp. sativa) conduce a una resistencia de las plantas frente a la Botrytis cinerea (Imani J. et al, Mol. Plant Physiol. in press). En tomates la expresión del inhibidor p35 de PCD protege contra Alternaria alternata, Colletotrichum coccodes y Pseudomonas syringae (Lincoln J.E. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99, 15217 (2002)).

Ante estos antecedentes, en el estado de la técnica existía una necesidad continua de plantas útiles en la agricultura, que tuvieran una resistencia elevada contra patógenos. Existen solo algunos enfoques que confieren a las plantas una resistencia frente a un amplio espectro de patógenos, ante todo hongos patógenos. La resistencia sistémica adquirida ("systemic acquired resistance"; SAR) – un mecanismo de defensa en diferentes interacciones planta-patógeno – puede conferirse mediante la aplicación de sustancias mensajeras endógenas como jasmonato (JA) o ácido salicílico (SA) (Ward J.M. et al., Plant Cell 3, 1085 (1991); Uknes et al., Plant Cell 4(6), 645 (1992)). Efectos similares también pueden producirse mediante compuestos sintéticos como ácido 2,6-dicloroisonicotínico (DCINA) o éster S-metílico de ácido benzo(1,2,3)tiadiazol-7-tiocarbonxílico (BTH; Bion®) (Friedrich et al., Plant J. 10(1), 61 (1996); Lawton et al., Plant J. 10, 71 (1996)). La expresión de las proteínas "pathogenesis related" (PR) (relacionadas con patogénesis) altamente reguladas en el contexto de una SAR puede producir en parte una resistencia a la patogénesis.

En cebada el Mlo-Locus se describe como regulador negativo de la defensa a patógenos. La pérdida o pérdida de función ("loss-of-function") del gen Mlo provoca una resistencia elevada no específica para raza frente a numerosos aislados de mildiú (Büschges R. et al., Cell 88, 695 1997); Jorgensen J.H., Euphytica 26, 55 (1977); Lyngkjaer M.F. et al. Plant Pathol 44, 786 (1995)).

El gen Mlo se ha descrito (Büschges R. et al., Cell 88, 695 (1997); WO 98/04586; Schulze-Lefert P. et al., Trends Plant Sci. 5, 343 (2000)). Se han aislado diversos homólogos de Mlo de otras especies de cereales. Han sido descrito métodos usando estos genes para lograr una resistencia a patógenos (WO 98/04586; WO 00/01722; WO 99/47552). Lo desventajoso es que las plantas deficientes en Mlo también pueden iniciar en ausencia de un patógeno el mecanismo de defensa arriba mencionado, lo cual se expresa en una muerte espontánea de células de hojas (Wolter M. et al., Mol. Gen. Genet. 239, 122 (1993)). De esta manera las plantas mlo-resistentes sufren una pérdida de cosecha de cerca de 5% (Jörgensen J.H., Euphytica 63, 141 (1992)). La muerte espontánea de las

células de hoja provoca además una hipersusceptibilidad desventajosa contra patógenos necrotróficos o hemibiotróficos como Magnaporthe grisea (M. grisea) o Cochliobolus sativus (Bipolaris sorokiniana) (Jarosch B. et al., Mol Plant Microbe Interact. 12, 508 (1999); Kumar J. et al., Phytopathology 91, 127 (2001)).

La apoptosis, también denominada muerte celular programada, es un mecanismo esencial para mantener la hemoestasis de tejido y de esta manera contrarresta la división celular como mecanismo regulador negativo. En el organismo multicelular la apoptosis es un componente natural de la ontogénesis y participa en el desarrollo de los órganos y en la eliminación de células envejecidas, infectadas o mutadas. Mediante la apoptosis se logra una eliminación eficiente de células indeseadas. Una perturbación o inhibición de la apoptosis contribuye a la patogénesis de diferentes enfermedades, entre otras a la carcinogénesis. Los efectores principales de la apoptosis son proteasas de cisteína específicas de aspartato, las llamadas caspasas. Su activación puede tener lugar en general mediante al menos dos vías de señal de apoptosis: primero por la activación de la familia receptora de TNF (Tumor Necrosis Factor); segundo, las mitocondrias desempeñan un rol central. La activación de la vía de señal de apopotosis mitocondrial se regula por proteínas de la familia Bcl-2. Esta familia de proteína consiste en proteínas antiapoptóticas y proapoptóticas tales como, por ejemplo, Bax. En el caso de un estímulo apoptótico, tiene lugar un cambio de conformación aloestérico de la proteína Bax, el cual conduce a anclar la proteína en la membrana externa mitocondrial y a su oligomerización. Mediante estos oligómeros se liberan moléculas pro-apoptóticas de las mitocondrias al citosol que provocan una cascada de señal apoptótica y en últimas la degradación de sustratos celulares específicos, lo cual tiene como consecuencia la muerte celular. El inhibidor-1 de Bax (BI1) se aisló por su propiedad de inhibir el efecto proapoptótico de BAX (Xu Q. et al., Mol Cell 1(3), 337 (1998)). BI1 representa una proteína altamente conservada. Se encuentra preponderantemente como componente integral de membranas intracelulares. BI1 interactúa con bcl-2 y bcl-xl. La sobreexpresión de BI1 en células de mamíferos suprime el efecto pro-apoptótico de BAX, etoposido y estaurosporina, pero no de antígeno Fas (Roth W. et al., Nat. Med. 8, 216 (2002)). La inhibición de BI1 por ARN antisense induce, por el contrario, apoptosis (Xu Q. et al. ,Mol Cell 1(3), 337 1998)). Los primeros homólogos vegetales de BI1 se aislaron de arroz y Arabidopsis (Kawai et al., FEBS Lett 464, 143 (1999); Sanchez et al., Plant J. 21, 393 (2000)). Estas proteína vegetales suprimen la muerte celular inducida por BAX en levaduras. La homología de secuencia del aminoácido con el BI1 humano es de aproximadamente 45%. En plantas recombinantes, el AtBI1 homólogo de Arabidopsis es capaz de suprimir el efecto proapoptótico de BAX de ratón (Kawai-Yamada M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98 (21), 12295 (2001)). El homólogo de BI1 de arroz (Oryza sativa) OsBl1 se expresa en todos los tejidos vegetales (Kawai et al., FEBS Lett 464, 143(1999)). También se han descrito genes Bl1 de cebada (Hordeum vulgare; GenBank Acc.-No.: AJ290421), Reis (GenBank Acc.-No.: AB025926), Arabidopsis (GenBank Acc.-No.: AB025927), tabaco (GenBank Acc.-No.: AF390556) y colza (GenBank Acc.-No.: AF390555, Bolduc N. et al., Planta 216, 377-386(2003)). La expresión de BI1 en cebada se inhibe como consecuencia de una infección con mildiú (Hückelhoven R. et al., Plant Mol. Biol. 47(6), 739 (2001)).

WO 00/26391 describe la sobreexpresión de los genes anti-apoptóticos Ced-9 de C. elegans, sflAP de Spodoptera frugiperda, bcl-2 de humanos y bcl-xl de fallo en plantas para incrementar la resistencia contra hongos necrotróficos

o hemibiotróficos. Los homólogos de BI1 vegetales no se divulgan. La expresión se efectúa bajo el control de promotores constitutivos. Se ha descrito además la expresión de una proteína BI1 de Arabidopsis bajo el fuerte promotor constitutivo de 35S CaMV en células de arroz y una resistencia inducida de esta manera contra sustancias que inducen muerte celular de Magnaporthe grisea (Matsumura H. et al., Plant J. 33, 425 (2003)).

En el estado de la técnica se describió originalmente que una expresión constitutiva de un inhibidor de la muerte celular programada en plantas puede provocar una resistencia contra hongos necrotróficos.

Al experto en la materia se planteó sin embargo principalmente la tarea de proporcionar métodos para la defensa ante patógenos en plantas y de hecho principalmente contra patógenos biotróficos.

El problema se resolvió sorprendentemente mediante el método de la invención definido en las reivindicaciones principales. Las reivindicaciones dependientes definen formas de realización particularmente preferidas de la presente invención.

El rol de BI-1 se ensayó en el sistema de transformación transitorio en tres experimentos independientes entre sí. En el control, 53 % (promedio de los ensayos) de las células transformadas que interactuaron con P. pachyrhizi fueron penetradas, mientras que solo 37 % de las células transformadas de BI-1 fueron penetradas (FIG. 8; Tabla FIG. 10). Los valores se basan en tres experimentos independientes. Como controles se transformaron hojas de cebada con el constructo de gene reportero pGY1-GFP y el vector vacío. La tasa de penetración en las células transformadas con BI-1 significativamente diferente de WT (P<0.05). después de la evaluación, las células transformadas transitoriamente con BI-1 muestran por lo tanto, de manera sorprendente, una resistencia significativamente elevada a la penetración contra P. pachyrhizi (P< 0.05; fig. 8; tabla FIG. 10). Fue llamativo al observar bajo el microscopio que las células que forman BI-1 actuaron de manera ostensiblemente más vital que las células que expresan GFP o ADF3.

Ya la sobreexpresión transitoria del inhibidor de muerte celular BI-1 en cebada permitió reconocer de manera sorprendente la tendencia a una resistencia elevada de las células vegetales frente a la penetración por parte de

roya de soja. Para confirmar esto se estudió microscópicamente la interacción entre plantas de cebada transgénicas de la variedad 'Golden Promise' (GP), que contienen un constructo de sobreexpresión GFP-BI-1 en comparación con el tipo silvestre (WT) de la variedad. Para la producción de plantas transgénicas se usó una fusión GFP-BI-1 bajo el control del promotor constitutivo CAMV 35S y de esta manera se garantiza una expresión suficiente de la proteína.

En un ensayo se inocularon hojas del WT de la variedad 'Golden Promise' y de la línea de cebada transgénica (variedad 'Golden Promise') #6(1)E8L1(T1)’ con P. pachyrhizi y 24 h después de la inoculación en solución de desteñido. Después de desteñir completamente las hojas se tiñeron con azul de anilina. El azul de anilina se intercala en la estructura de la callosa y tiñe preferiblemente de este modo las papilas en las que se llega a una acumulación y cruce de la callosa con otras sustancias poliméricas. Células que como resultado de una reacción hipersensible (RH) han pasado un proceso similar a la apoptosis en células de mamífero también muestran una fluorescencia clara después de teñirse con azul de anilina. En las hojas de cebada inoculadas se contó el número de las esporas, las esporas germinadas con tubos de germen que ya habían formado un apresorio y, como reacción celular, los apresorios con las papilas que se encuentran entre las mismas, así como la RH. No se contaron las aglomeraciones más grandes de esporas en las que ya no era posible una asignación de los apresorios a las esporas. En tanto fue posible se contaron por hoja al menos 100 esporas con apresorios. Ya en este experimento pudo observarse en la línea transgénica una formación de papilas significativamente incrementada y una RH de las células significativamente reducida (P<0.01; Tabla FIG. 11 A/B, FIG. 12).

Tanto So Bgh (Hückelhoven R., FEMS Microbiol. Letters 245, 9 (2005)) como también P. pachyrhizi (Koch E. et al., Phytopath. Z. 106, 302 (1983)) son patógenos biotróficos. Una RH de las células atacadas puede detener, por lo tanto, el desarrollo de los hongos, puesto que les quita la base de nutrición. Si se impide la RH, las células pueden volverse más sensibles frente a una infección por patógenos biotróficos. No obstante, las células de cebada que han sido transformadas de modo transitorio con un constructo de sobre expresión BI-1 muestran sorprendentemente una resistencia incrementada a la penetración por P. pachyrhizi. Esto sorprende ya que se habría esperado una sensibilidad elevada frente al hongo biotrófico. Sin embargo, en la resistencia de cebada y trigo frente al patógeno incompatible P. Pachyrhizi, la RH no es la única reacción de resistencia y posiblemente no es la decisiva. De esta manera el trigo se defiende de P. pachyrhizi mediante la formación de papilas (Hoppe H.H. et al., Pro. Intern. Congress of SABRAO (Bangkok 1985) 1986). La cebada reacciona dependiendo de la variedad con formación de papilas y RH de las células infectadas. La cebada con el alelo mlo5 reacciona además con una formación de papilas incrementada. La cebada también se defiende de Bgt mediante la formación de papilas, pero ante todo mediante una RH de células infectadas (Hückelhoven R. et al., Mol. Plant Pathol. 2, 199 (2001). Pero en contraste con P. pachyrhizi la sobreexpresión transitoria de BI-1 en cebada conduce a una tasa de penetración elevada de las células mediante Bgt (Eichmann R. et al., Mol. Plant Microbe Interact. 17, 484 (2004)). Asimismo, en la sobreexpresión de BI-1 las plantas de cebada con el alelo mlo5 que facilita una amplia resistencia frente a Bgh muestra una sensibilidad mayor de las células frente a una penetración por Bgh (Hückelhoven R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 29, 5555 (2003). A pesar que la resistencia de cebada con el alelo mlo5 no se basa en una RH de las células infectadas sino en una acumulación más eficiente de compuestos antimicrobianoss, H2O2 y una formación de papilas incrementada, la inhibición de la RH también parece influenciar las otras reacciones de resistencia (Hückelhoven R. et al., Plant Physiol. 119, 1251 (1999)). Sin generar una restricción por la teoría, estas observaciones de una resistencia de penetración reducida por la inhibición de la RH sugiere una regulación cruzada de las reacciones de resistencia. La suposición de la regulación cruzada de reacciones de resistencia se apoya por el análisis microscópico de plantas de cebada transgénicas, inoculadas con P. pachyrhizi. Estas llevan un constructo de sobreexpresión y reaccionan a la infección con una formación incrementada de papilas. En las hojas de las plantas transgénicas solo el 16 - 26 % de las células infectadas mostraron un RH, por el contrario cerca de 50 % de las células atacadas mostraban en las hojas de WT una RH. En las variedades de cebada 'Golden Promise', la RH de las células también parece ser, por lo tanto, un mecanismo de resistencia importante contra el P. pachyrhizi biotrófico, a pesar que P. pachyrhizi en soja no utiliza las células de epidermis para su nutrición sino que forma primero haustorios en el mesófilo (Koch E. et al., Phytopath. Z. 106, 302 (1983). En general, sin embargo, el hongo no alcanza este estadio en la cebada que no es planta huésped. La inhibición de la RH permite que Bgt penetre las células y hace que el hongo pueda establecerse exitosamente (Eichmann R. et al., Mol. Plant Microbe Interact. 17, 484 (2004)). Para este proceso parecen ser necesarios otros factores específicos de hongos. Por lo visto estos factores especiales del Bgt suprimen o bien la respuesta de resistencia alternativa de la célula vegetal o el reconocimiento por parte de éstas. Estos factores están probablemente ausentes en P. pachyrhizi. De esta manera, la célula vegetal es posiblemente capaz de reconocer P. pachyrhizi y, puesto que BI-1 suprime la RH, es capaz de inducir una respuesta de resistencia alternativa, la formación de papilas. Un reconocimiento de P. pachyrhizi por parte de la planta se apoya mediante la observación de la formación incrementada de papilas en la cebada con el alelo mlo5. Sine embargo, la razón de por qué la planta es capaz de reconocer el patógeno P. Pachyrhizi que se especializa en plantas huéspedes de un orden totalmente diferente permanece abierta (Sinclair J. B. et al. (eds.), Proceedings of the soybean rust workshop (1995), National Soybean Research Laboratory, Publication No. 1 (1996)). La 'característica de reconocimiento' de P. pachyrhizi podría ser un elicitor no específico ('pathogenesisassociated molecular patterns’ PAMP) como el INF1 de P. infestans, que provoca en Nicotiana sp. una RH (Kamoun

S. et al., Plant Cell 10, 1413 (1998)). PAMPs se reconocen por la planta como moléculas extrañas y provocan una reacción de resistencia. No todas las hojas de las plantas transgénicas mostraron la formación de papilas incrementada, a pesar que el constructo de gen de BI-1 ha sido identificado en ella por medio de PCR. Esto podría

ser la consecuencia de un tipo de inserción desfavorable del constructo, que impide una expresión efectiva de BI-1 y/o conduce a efectos antagonísticos por otros genes. Puesto que la identificación se efectuó al nivel de ADN, no pueden hacerse declaraciones sobre la expresión de BI-1. Es de tener en cuenta que incluso un daño menor a las semilla o a las hojas pueden influir de modo decisivo, o impedir, el desarrollo de la planta. De esta manera, algunas semillas de la línea #6(2)E15L7P2 (T2) no germinan.

Por lo tanto, un objeto de la invención se refiere a un método para generar o incrementar una resistencia en una planta de soja o en una parte de una planta de soja, contra al menos un hongo biotrófico del género Phakopsora. El método comprende un paso en el que se incrementa una cantidad de una proteína inhibidora-1 Bax (BI1) o su función en la planta de soja o al menos en una parte de una planta de soja. Por una parte de una planta se quiere decir la planta entera o uno o varios órganos de ella, un tejido o al menos una célula. El método comprende además el paso de seleccionar una planta o una parte de una planta en las cuales se ha incrementado la proteína BI1 o su función, en tal sentido que presente una resistencia elevada contra al menos un hongo biotrófico del género Phakopsora en comparación con una planta de partida, en la que el incremento de la cantidad o de la función de la proteína BI1 sea más alta frente a una planta de partida o a su parte.

Según la presente invención el hongo biotrófico se selecciona del género Phakopsora. Modalidades particularmente preferidas son el patógeno Phakopsora pachyrhizi y/o P. meibomiae (también denominadas conjuntamente "roya de habas de soja" o "roya de soja"), en cuyo caso el primero es el más preferido.

El paso de incrementar la cantidad o función de la proteína BI1 se logra mediante métodos biotecnológicos. Métodos "biotecnológicos" comprenden, entre otros, la expresión recombinante de la proteína en una célula, preferentemente conectada funcionalmente con y activada por un promotor heterólogo. Pero el mencionado incremento también puede lograrse, por ejemplo, intercambiando solamente el promotor endógeno o por ejemplo silenciando factores que inhiben en general la expresión de la proteína BI-1 endógena. Por consiguiente, el término 'métodos biotecnológicos' comprende todos los métodos de la biología molecular moderna que son públicos, principalmente los de la ingeniería genética recombinante que son conocidos por el experto en la materia y de los cuales nos ocuparemos en mayor medida en el transcurso de la invención.

La planta se selecciona de las leguminosas que comprenden soja (Glycine max (L.) Merill)).

En cada una de las modalidades aquí divulgadas de la presente invención se prefiere particularmente que se incremente la cantidad o la función de la proteína BI1 al menos en la epidermis, de preferencia esencialmente de modo específico al tejido en la epidermis; principalmente se prefiere que la cantidad o la función de la proteína BI1 se eleve específicamente en la epidermis y/o no se eleve esencialmente en el mesófilo.

Por epidermis el experto en la materia entiende el tejido de cierre predominante de las partes de la planta aéreas primarias, por ejemplo de los retoños, de las hojas, las flores, los frutos y semillas. Las células de la epidermis secretan hacia fuera una capa repelente de agua, la cutícula. Las raíces están rodeadas por la rizodermis que en muchos casos se asemeja a la epidermis aunque también presenta diferencias pronunciadas. La epidermis se genera de la capa más externa del meristemo apical. La derivación de la rizodermis es por el contrario menos clara. Según la especie puede considerarse, en términos de la evolución, o bien parte de la caliptra, o bien parte de la corteza primaria. A la epidermis pueden atribuirse numerosas funciones: protege la planta contra el desecamiento y regula la tasa de transpiración. Protege la planta contra un rango amplio de influencias externas, químicas y físicas, contra ser devoradas por animales y contra el ataque de parásitos. Participa en el intercambio de gas, en la secreción de determinados metabolitos y en la absorción de agua. En ella se encuentran contenidos receptores para luz y estímulos mecánicos. De esta manera actúa como un transformador de señal entre el ambiente y la planta. De acuerdo con las diversas funciones, la epidermis comprende un número de células diferenciadas de manera diferente. A esto deben adicionarse variantes específicas para las especies y diferente organización de las epidermis en las partes individuales de una planta. Esencialmente se compone de tres categorías de células: las células de epidermis "verdaderas", las células de los estomas y los tricomas (griego: Trichoma, pelo), apéndices de la epidermis de diferente forma, estructura y función.

Las células de epidermis "verdaderas", es decir las menos especializadas constituyen la masa principal de las células del tejido de la epidermis. En la vista superior estas son poligonales (con forma de plancha o de plato) o alongadas. Las paredes formadas entre estas son muchas veces onduladas u ondeadas. No se sabe de qué manera esta forma se induce durante el desarrollo; las presentes hipótesis aclaran los hechos solo de forma insatisfactoria. Las células de epidermis alongadas pueden encontrarse en órganos o partes de órganos que se alongan ellos mismos, como por ejemplo los tallos, peciolos y venas de hoja y en las hojas de la mayoría de los monocotiledóneos. El lado superior e inferior de los limbos pueden cubrirse en las epidermis con diferentes estructuras en cuyo es posible que la forma de las células, el espesor de las paredes como también la distribución y número de células especializadas (estomas y/o tricomas) pueda variar por unidad de área. Grandes variaciones también se encuentran dentro de familias individuales como, por ejemplo, en las crassulaceas. En la mayoría de los casos la epidermis consiste de una capa individual aunque entre las especies de varias familias (Moraceae: aquí son la mayoría de especies de ficus, Piperaceae: Peperonia [Peperonie], Begoniaceae, Malvaceae, entre otros) han sido

identificadas epidermis de capas múltiples y almacenadoras de agua. Sin embargo las células de epidermis secretan una cutícula afuera la cual cubre esencialmente todas las superficies de la epidermis como una película esencialmente ininterrumpida. Esta puede estar estructurada lisa o mediante protuberancias, barras, pliegues y surcos. Sin embargo, el plegado de la cutícula que puede observarse al examinar la superficie no siempre se basa en la formación de las barras de cutícula. Existen casos en realidad cuando un plegado de cutícula es solo la expresión de las protuberancias de la pared celular que se encuentran debajo. Los anexos de la epidermis de diversa forma, estructura y función se denominan tricomas y aquí también se entienden por el término "epidermis". Ocurren en forma de pelos protectores, pelos de soporte y pelos de glándulas en forma de escamas, diferentes papillas y, en caso de raíces, como pelos absorbentes. En su formación intervienen solo células de epidermis. Con frecuencia se genera un tricoma a partir de solo una célula así, a veces participan varias en la generación.

Bajo el término "epidermis" también están comprendidas las papillas. Las papillas son protuberancias de la superficie de epidermis. El ejemplo del libro de texto para éstas son las papilas en las superficies de flores de pensamiento (Viola tricolor) así como las superficies de muchas especies en el bosque de lluvia tropical. Ellas confieren a la superficie una consistencia aterciopelada. Algunas células de la epidermis pueden formarse como almacenadoras de agua. Un ejemplo típico representan las células de vejiga en superficies de muchas especies de flores Mesembryanthemum y otras suculentas. En algunas plantas, por ejemplo en el caso de campánula (Campanula persicifolia) las paredes externas de la epidermis se compactan en forma de lentes.

La masa principal de todos los tejidos forma el tejido fundamental o parénquima. Los tejidos parenquimáticos incluyen el mesófilo que puede diferenciarse en las hojas en el parénquima de estaca y parénquima de esponja.

Por consiguiente, el experto en la materia entiende por mesófilo un tejido parenquimático. Las células parenquimáticas son vivas en su totalidad, la mayoría de las veces isodiamétricas, rara vez alongadas. La médula de los retoños, el tejido de almacenamiento de las frutas, las semillas, la raíz y otros órganos subterráneos también pueden considerarse en calidad de parénquimas como el mesófilo.

En las hojas de la mayoría de helechos y fanerógamas, de manera particularmente resaltada en las dicotiledóneas y muchas monocotiledóneas, el mesófilo se subdivide en parénquimas de palisada y de esponja. Una hoja "típica" es de organización dorsiventral. En la mayoría de los casos, el parénquima de palisada está en la superficie superior de la hoja inmediatamente debajo de la epidermis. El parénquima de la esponja llena el espacio que se encuentra debajo. Se entremezcla por un sistema intercelular voluminoso cuyo espacio de gas está en contacto directo con el espacio externo a través de estomas.

El parénquima de palisada se compone de células cilíndricas alongadas. En algunas especies las células son irregulares, ocasionalmente bifurcadas (en forma de Y: parénquima de palisada de árbol). Tales variantes se encuentran en helechos, coníferas y algunas pocas angiospermas (por ejemplo en algunas especies de ranunculaceas y caprifoliaceas [ejemplo: saúco]). Además de la forma de organización más difundida recién descrita, se han identificado las siguientes variantes:

-: Parénquima de palisada en el envés de la hoja. Particularmente notable en hojas escamosas. Ejemplo: tuya (Thuja), así como en las hojas de ajo silvestre (Allium ursinum).

-: Parénquima de palisada en ambos lados de la hoja (haz y envés). Con frecuencia en plantas de sitios secos (xerófitos). Ejemplo: lechuga espinaca (Lactuca serriola);

-: Parénquima de palisada cerrado con forma de anillo: en hojas organizadas como cilindros y en agujas de coníferas.

La variabilidad de las células de parénquima de esponja y la formación del parénquima de esponja mismo son aún más variados que las del parénquima de palisada. La mayoría de las veces se denomina tejido de aireación (aerénquima) porque contiene una gran cantidad de espacios intercelulares interconectados.

El mesófilo puede comprender lo que se conoce como el tejido de asimilación, pero los términos mesófilo y tejido de asimilación no deben usarse como sinónimos. Hay hojas libres de cloroplasto cuya organización difiere solo en menor grado de hojas verdes comparables. Como consecuencia, comprenden mesófilo pero no tiene lugar una asimilación; en sentido contrario, la asimilación también tiene lugar, por ejemplo, en sectores del brote.

En la presente descripción, la epidermis se caracteriza en términos bioquímicos. En una modalidad preferida, la epidermis puede caracterizarse por la actividad de uno o más de los siguientes promotores:

-: WIR5 (=GstA1), acc. X56012; Dudler & Schweizer,

-: GLP4, acc. AJ310534; Wei Y., Zhang Z., Andersen C.H., Schmelzer E., Gregersen P.L., Collinge D.B., Smedegaard-Petersen V. und Thordal-Christensen H., Plant Molecular Biology 36, 101 (1998),

-: GLP2a, acc. AJ237942, Schweizer P., Christoffel A. y Dudler R., Plant J. 20, 541 (1999).;

-: Prx7, acc. AJ003141, Kristensen B.K., Ammitzböll H., Rasmussen S.K. y Nielsen K.A., Molecular Plant Pathology, 2(6), 311 (2001);

-: GerA, acc. AF250933 ; Wu S., Druka A., Horvath H., Kleinhofs A., Kannangara G. y von Wettstein D., Plant Phys Biochem 38, 685 (2000);

-: OsROC1, acc. AP004656

-: RTBV, acc. AAV62708, AAV62707 ; Klöti A., Henrich C., Bieri S., He X., Chen G., Burkhardt P.K., Wünn J., Lucca P., Hohn T., Potrykus I. und Fütterer J,. PMB 40, 249 (1999);

-: Quitinasa ChtC2-Promotor de patata (Ancillo et al., Planta. 217(4), 566 (2003));

-: AtProT3 Promotor (Grallath et al., Plant Physiology. 137(1), 117 (2005))

-: SHN-Promotores de Arabidopsis (AP2/EREBP transcription factors involved in cutin and wax production) (Aarón et al., Plant Cell. 16(9), 2463 (2004));

-: GSTA1 de trigo (Dudler et al., WP2005306368 o Altpeter et al., Plant Molecular Biology. 57(2),271 (2005)).

En la presente descripción, la epidermis se caracteriza por el hecho de que todos los promotores arriba mencionados son activos en el tejido o en la célula. en la presente descripción, la epidermis se caracteriza porque solo una parte de los promotores es activa, por ejemplo preferiblemente 2, 3, 5 o lo más preferible 7 o más, aunque al menos uno de los arriba detallados.

En la presente descripción el mesófilo se caracteriza en términos bioquímicos. El mesófilo puede caracterizarse por la actividad de uno o más de los siguientes promotores:

-: PPCZm1 (=PEPC); Kausch A.P., Owen T.P., Zachwieja S.J., Flynn A.R. y Sheen J., Plant Mol. Biol. 45, 1 (2001);

-: OsrbcS, Kyozuka et al., PIaNT Phys 102, 991 (1993); Kyozuka J., McElroy D., Hayakawa T., Xie Y., Wu R. Y Shimamoto K., Plant Phys. 102, 991 (1993);

-: OsPPDK, acc. AC099041;

-: TaGF-2.8, acc. M63223; Schweizer P., Christoffel A. and Dudler R. , Plant J. 20, 541 (1999);

-: TaFBPase, acc. X53957;

-: TaWIS1, acc. AF467542; US 200220115849;

-: HvBIS1, acc. AF467539; US 200220115849;

-: ZmMIS1, acc. AF467514; US 200220115849;

-: HvPR1a, acc. X74939 ; Bryngelsson et al., Mol. Plant Microbe Interacti. 7(2), 267 (1994);

-: HvPR1b, acc. X74940; Bryngelsson et al., Mol. Plant Microbe Interact, 7(2), 267 (1994);

-: HvB1,3gluc; acc. AF479647;

-: HvPrx8, acc. AJ276227; Kristensen et al., Molecular Plant Pathology, 2(6), 311 (2001);

-: HvPAL, acc. X97313 ; Wei Y., Zhang Z., Andersen C.H., Schmelzer E., Gregersen P.L., Collinge D.B., Smedegaard-Petersen V. y Thordal-Christensen H. Plant Molecular Biology 36, 101 (1998).

En la presente descripción el mesófilo se caracteriza por el hecho que todos los promotores mencionados arriba son activos en el tejido o en la célula. En otra modalidad, el mesófilo se caracteriza porque solo una parte de los promotores es activa, por ejemplo preferiblemente 2, 3, 5 o particularmente preferible 7 o más, aunque al menos uno de los arriba enunciados.

En la presente descripción todos los promotores arriba mencionados son activos en una planta o producida o en una planta según la invención en la epidermis o en el mesófilo. En la presente descripción solo algunos de los promotores arriba mencionados son activos, por ejemplo preferiblemente 2, 5, o principalmente preferible 7 o más, aunque al menos uno de los promotores enunciados arriba es respectivamente activo.

En modalidades preferidas, el incremento de la cantidad de proteína o de la función de proteína BI1 se efectúa de manera constitutiva o específica del tejido. En modalidades particularmente preferidas se efectúa un incremento de la cantidad de proteína o de la función de proteína esencialmente específico del tejido, esencialmente específico para la epidermis, por ejemplo mediante expresión recombinantes de una secuencia de ácidos nucleicos que codifican la proteína BI1 bajo el control de un promotor específico para la epidermis. El incremento de la expresión o función de la proteína BI1 se efectúa principalmente preferible en la epidermis, en cuyo caso, sin embargo, la expresión de la proteína BI-1 permanece esencialmente no modificada en el mesófilo, o se reduce mientras que otros tejidos permanecen sin afectarse.

En una modalidad, tal como aquí se describe, la expresión o la función de la proteína según la invención o de la BI-1 caracterizada en el presente texto se incrementa al menos en la epidermis de una planta. Un incremento en la expresión puede lograrse tal como se describe de aquí en adelante. Por incremento de la expresión o función se entiende tanto la activación o aumento de la expresión o de la función de la proteína endógena incluida una expresión de novo como también un incremento o aumento mediante la expresión de una proteína o factor transgénicos.

En una modalidad particularmente preferida puede combinarse el incremento de la cantidad o función de la proteína de al menos una proteína BI1 vegetal con un fenotipo resistente mlo o con la inhibición o reducción en comparación con una planta de control de la expresión de MLO, RacB y/o NaOx en la planta o en una parte de la misma, por ejemplo en un tejido, aunque particularmente ventajoso al menos en la epidermis o una parte esencial de las células de la epidermis y/o con el incremento de la expresión o función de PEN2 y/o PEN1 en la planta, por ejemplo de manera constitutiva, o en una parte de la misma, por ejemplo en un tejido, aunque particularmente ventajoso al menos en la epidermis o en una parte esencial de las células de epidermis, con la condición de que la expresión de una proteína BI1 vegetal en la epidermis de la hoja permanece esencialmente no modificada o se reduce.

En cebada el Mlo-locus ha sido descrito como regulador negativo de la defensa de patógenos. La pérdida o la pérdida de función ("loss-of-function") del gen Mlo produce una resistencia elevada, no específica de la raza contra numerosos aislados de mildiú (Büschges R. et al., Cell 88, 695 (1997); Jorgensen J.H., Euphytica 26, 55 (1977); Lyngkjaer M.F. et al., Plant Pathol. 44, 786 (1995)). Un fenotipo resistente a mlo puede lograrse tal como se describe en el estado de la técnica. Métodos usando estos genes para lograr una resistencia a patógenos se describen entre otros en WO 98/04586; WO 00/01722; WO 99/47552.

En una modalidad de la presente invención la actividad, la expresión o la función de MLO, RacB y/o NaOx puede inhibirse ventajosamente en la planta o en una parte de la misma, por ejemplo en un tejido, aunque particularmente ventajoso al menos en la epidermis o en una parte esencial de las células de la epidermis o reducirse en comparación con una planta de control o una parte de la misma. Reduciendo la actividad o función de MLO, RacB y/o NaOx en la planta o en una parte de la misma, por ejemplo en un tejido, aunque particularmente ventajoso al menos en la epidermis o en una parte esencial de las células de epidermis se eleva preferentemente la resistencia o la fuerza de resistencia contra patógenos biotróficos en plantas preparadas según la invención. La actividad o la función de MLO, RacB y/o NaOx puede reducirse o inhibirse de manera análoga como para MLO en WO 98/04586; WO 00/01722; WO 99/47552 y en los otros documentos mencionados abajo, cuyo contenido se considera de esta manera expresamente incorporado, principalmente a fin de describir la actividad y la inhibición de MLO. La descripción de los documentos mencionados describe procesos, métodos y formas de realización particularmente preferidas para disminuir o inhibir la actividad o función de MLO, los ejemplos indican de manera concreta cómo puede realizarse esto.

La reducción de la actividad o de la función, opcionalmente de la expresión de RacB se describe detalladamente en la WO 2003/20939, la cual se considera incorporada de esta manera expresamente a la presente descripción.

La descripción del presente documento describe procesos y métodos para disminuir o inhibir la actividad o la función de proteínas, los ejemplos indican concretamente cómo puede realizarse esto. Particularmente se prefiere realizar la reducción o la inhibición de la actividad o de la función de RacB según las modalidades particularmente preferidas en la WO 2003/20939 y a los ejemplos y en los organismos allí descritos como particularmente preferidos, principalmente en una planta o en una parte de la misma, por ejemplo en un tejido, aunque particularmente preferible ventajoso en la epidermis o en una parte esencial de las células de epidermis. La reducción de la actividad

o de la función, opcionalmente de la expresión de RacB se describe detalladamente en la WO 2003/20939. El experto en la materia encuentra en la WO 2003/20939 las secuencias que codifican la proteína RacB y también puede identificar RacB con el método disponible en la WO 2003/20939.

La reducción de la actividad o de la función, opcionalmente de la expresión de NaOx se describe detalladamente en WO 2004/09820 (= PCT/EP/03/07589), la cual de esta manera se considera incorporada expresamente a la presente descripción. La descripción del documento mencionado describe procesos y métodos para disminuir o inhibir la actividad o la función de NaOx, los ejemplos indican concretamente como puede realizarse esto. Particularmente se prefiere realizar la reducción o inhibición de la actividad o de la función de NaOx según las modalidades particularmente preferidas en la WO 2004/09820 (= PCT/EP/03/07589) y en los ejemplos y en los organismos representados allí como particularmente preferidos, principalmente en una planta o una parte de la misma, por ejemplo en un tejido, aunque particularmente ventajoso al menos en la epidermis o en una parte esencial de las células de epidermis. El experto en la materia en cuenta en WO 2004/09820 (= PCT/EP/03/07589) las secuencias que codifican proteínas NaOx y también puede identificar NaOx con el método disponible en WO 2004/09820 (= PCT/EP/03/07589).

En una modalidad de la presente invención puede elevarse ventajosamente la actividad, la expresión o la función de PEN1, PEN2 y/o SNAP34 en la planta, por ejemplo de manera constitutiva, o en una parte de la misma, por ejemplo en un tejido, aunque particularmente preferible al menos en la epidermis o una parte esencial de las células de epidermis. El incremento de la actividad que también incluye una expresión de novo, de PEN1, PEN2 y/o SNAP 34 en la planta, por ejemplo de manera constitutiva, o en una parte de la misma, por ejemplo en un tejido, aunque particularmente ventajoso al menos en la epidermis o una parte esencial de las células de epidermis se eleva preferentemente la resistencia o la fuerza de resistencia frente a patógenos biotróficos en las plantas producidas según la invención. El incremento de la actividad o de la función opcionalmente de la expresión de PEN2 se describe detalladamente en la WO03/074688 y la cual se incorpora expresamente a la presente descripción. La descripción del documento mencionado describe procesos y métodos para reducir o inhibir la actividad o la función de PEN2, los ejemplos indican concretamente cómo puede realizarse esto. Particularmente se prefiere realizar la reducción o inhibición de la actividad o la función de PEN2 según las modalidades particularmente preferidas en la WO03/074688 y en los ejemplos y en los organismos presentados allí como particularmente preferidos, principalmente en plantas, por ejemplo de manera constitutiva o en una parte de la misma, por ejemplo en un tejido, aunque particularmente ventajoso en al menos la epidermis o en una parte esencial de las células de la epidermis. El experto en la materia encuentra en la WO03074688 las secuencias que codifican proteínas PEN2 y también puede identificar PEN2 con métodos disponibles en la WO03/074688.

La expresión de PEN1 y de SNAP34 puede elevarse de manera análoga a los métodos descritos en la WO03/074688. Gracias al conocimiento técnico general y al estado de la técnica conocido, el experto en la materia puede aislar y sobreexpresar secuencias de ácido nucleico y de proteína de PEN1 y SNAP34. SEQ ID NO. 39 describe la secuencia de ácido nucleico que codifica PEN1 de cebada, la secuencia de proteína se describe en la SEQ ID No.: 40.

SEQ ID NO.: 41 describe la secuencia de ácido nucleico que codifica PEN1 1 de Arabidopsis thaliana, la secuencia de proteína se describe en SEQ ID No. 42. PEN1 de Arabidopsis thaliana está publicada bajo los números de acceso N M 202559 y N M 112015. El homólogo de cebada se divulga como ROR2 en los números de acceso AY246907 y AY246906. Se trata de miembros de la familia de proteína sintaxina que es bastante grande. El experto en la materia puede de esta manera identificar otras proteínas de sintaxina mediante comparaciones de homología simples que se expresan como genes de resistencia potenciales en el método de la invención.

SEQ ID NO. 43 describe la secuencia de ácido nucleico que codifica SNAP34 de cebada, la secuencia de proteína se describe en SEQ ID No.: 44. El homólogo SNAP-34 de cebada también está publicado bajo el número AY 247208 (SNAP-34). Homólogos de la función desconocida que podrían desempeñar un rol en la resistencia se publican bajo el número AY 247209 (SNAP-28) y AY 247210 (SNAP-25). Los siguientes genes de Arabidopsis muestran una homología más alta con cebada SNAP34 que las cebadas SNAP-28 o SNAP-25 con SNAP-34 y de esta manera pueden co-sobreexpresarse ventajosamente como genes que facilitan la resistencia:

AAM 62553 - Arabidopsis SNAP25a

NP 200929 - Arabidopsis SNAP33b

NP 172842 - Arabidopsis SNAP30

NP 196405 - Arabidopsis SNAP29

Por consiguiente, la descripción también se refiere a una planta en la que al menos en la epidermis se sobreexpresa un polipéptido que se codifica por una molécula de ácido nucleico que comprende las secuencias mostradas en Seq.

ID No. 39, 41 o 43 o una de las secuencias mostradas en las publicaciones mencionadas del banco de datos o que comprende las secuencias de aminoácidos mostradas en Seq. ID No. 40, 42 o 44 o una de las secuencias de aminoácidos mostradas en las publicaciones de banco de datos mencionadas o que es un equivalente funcional de las mismas o que tiene una homología de al menos 50 %, preferible de 70 %, más preferida de 80 %, aún más preferida de 90 %, 95 % o más con las secuencias mencionadas al nivel de la molécula de ácido nucleico codificante

o preferible a nivel de aminoácido, o se refiere a una planta en la que de manera constitutiva, o en una parte, por ejemplo en un tejido, aunque particularmente ventajoso al menos en la epidermis o una parte esencial de las células de la epidermis, se activa el polipéptido caracterizado previamente o se eleva su actividad o función.

Una reducción o expresión o actividad de una proteína puede efectuarse mediante métodos corrientes para el experto en la materia, por ejemplo mutagénesis, por ejemplo EMS, opcionalmente Tilling, iRNA; ribozimas, silencing, knockout, etc. métodos para reducción se describen principalmente en WO 2003/20939, cuyos métodos pueden adaptarse fácilmente a las secuencias aquí descritas. Por lo tanto el contenido de la WO 2003/20939 se incorpora aquí de manera explícita.

La reducción o disminución de la expresión de una proteína, de la actividad o de la función puede realizarse de diferentes modos y maneras.

"Reducción", "reducir", "disminución" o "disminuir" deben interpretarse en el sentido más amplio y comprenden el impedimento o bloqueo parciales o esencialmente totales de la funcionalidad de una proteína, que se basan en mecanismos celulares-biológicos diferentes.

Una disminución comprende también una reducción cuantitativa de una proteína hasta una ausencia esencialmente completa de la proteína (es decir hasta que deje de detectarse actividad o función, o que deje de detectarse de modo inmunológico la proteína). En tal caso la expresión de una proteína determinada o la actividad o función en una célula o un organismo preferiblemente se reduce en más de 80 %, muy particularmente preferible en más de 90 % .

Los métodos del dsRNAi (por double-stranded RNA interference) de la cosupresión mediante ARN-sense y de "VIGS" ("virus induced gene silencing") también se denominan "post-transcriptional gene silencing" (PTGS). Los métodos de PTGS como también la disminución de la función o de la actividad con variantes dominantes-negativas son particularmente ventajosas porque los requerimientos para la homología entre el gen endógeno a suprimirse y la secuencia de ácido nucleico sense o dsRNA expresada transgénicamente (entre el gen endógeno y su variante dominante-negativa) son más bajos que, por ejemplo, en el caso de un enfoque antisense clásico. Los criterios de homología correspondientes se mencionan en la descripción del método de dsRNAI y en general pueden aplicarse a métodos PTGS o enfoques dominante-negativos.

"Introducción" comprende todos los métodos que son adecuados para introducir un compuesto, directa o indirectamente, en la epidermis o a una parte esencial de las células de la epidermis, a un compartimiento o tejido de la misma o para generarlo allí. Están comprendidos métodos directos o indirectos. La introducción puede conducir a una presencia transitoria de un compuesto (por ejemplo de un dsRNA) o, sin embargo, también a una duradera (estable). Introducir comprende, por ejemplo, métodos como transfección, transducción o transformación.

En constructos de expresión, una molécula de ácido nucleico divulgada aquí, cuya expresión (transcripción y opcionalmente traducción) se genera una molécula de aminoácido correspondientes, se encuentra preferiblemente en conexión funcional con al menos un elemento de control genético (por ejemplo un promotor), lo que garantiza una expresión en un organismo, preferible en plantas, preferentemente de modo específico para epidermis. Si el constructo de expresión debe introducirse directamente en la planta entonces se prefieren elementos de control genético específicos para vegetales (por ejemplo promotores), en cuyo caso, de lo dicho arriba, la actividad específica para epidermis que tiene el promotor es obligatoria en la mayoría de las modalidades, tal como se ha descrito arriba.

Por una conexión funcional se entiende, por ejemplo, la disposición secuencial de un promotor con la secuencia de ácido nucleico a expresar y opcionalmente otros elementos regulatorios como, por ejemplo, un terminador de tal modo que cada uno de los elementos regulatorios pueda cumplir su función en la expresión transgénica de la secuencia de ácido nucleico, según la disposición de las secuencias de ácido nucleico hacia ARN sense o antisense. Esto no requiere necesariamente un enlace directo en el sentido químico. Las secuencias de control genético tales como, por ejemplo, secuencias enhancer (de promotor) pueden ejercer su función en la secuencia diana desde posiciones alejadas o incluso desde otras moléculas de ADN (localización cis o trans). Se prefieren disposiciones en las que la secuencia de ácido nucleico a expresar transgénicamente se posiciona detrás de la secuencia que funge como promotor, de modo que ambas secuencias se enlazan entre sí de modo covalente. En tal caso se prefiere que la distancia entre la secuencia promotora y la secuencia de ácido nucleico a expresarse transgénicamente es menor que 200 pares de bases, particularmente preferible menor a 100 pares de bases, muy particularmente preferible menor que 50 bases de pares.

La producción de un enlace funcional como también la producción de un casete de expresión puede realizarse por medio de técnicas corrientes de recombinación y de clonación, tal como se describen, por ejemplo, en Maniatis T., Fritsch E.F. y Sambrook J., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY) (1989), en Silhavy T.J., Berman M.L. y Enquist L.W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY) (1984), en Ausubel F.M. et al.. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) y en el caso de Gelvin et al. in Plant Molecular Biology Manual (1990). Pero entre ambas secuencias también pueden posicionarse otras secuencias que tienen, por ejemplo, la función de un enlazador (linker) con determinados sitios de corte de enzima de restricción o de un péptido de señal. La inserción de secuencias también puede conducir a la expresión de proteínas de fusión. El casete de expresión que se compone de un enlace de promotor hacia la secuencia de ácido nucleico a expresar puede presentarse integrado en un vector e insertarse, por ejemplo, mediante transformación en un genoma vegetal. Los elementos de control facilitan preferiblemente una expresión específica para epidermis.

"Aproximadamente" significa en conexión con datos numéricos o de magnitudes un rango de números o de magnitud alrededor del valor numérico o de magnitud indicado. En general, el término aproximadamente significa un intervalo respectivamente de 10% del valor indicado hacia arriba o hacia abajo.

Incluidos bajo el término "planta" están las plantas maduras, semillas, retoños y gérmenes, así como las partes derivadas de las mismas, material de propagación, órganos vegetales, tejidos, protoplastos, callo y otros cultivos como, por ejemplo, cultivos celulares, así como todos los otros tipos de agrupaciones de células vegetales en unidades funcionales o estructurales. Plantas maduras significan plantas en cualquier estadio de su desarrollo más allá del germen. Germen significa una planta joven, inmadura en un estadio temprano de desarrollo.

"Planta" comprende todas las plantas anuales y perennes.

"Resistencia a patógeno" significa la reducción o el debilitamiento de síntomas de enfermedad de una planta a causa de un ataque por al menos un patógeno. Los síntomas pueden ser de tipo múltiple pero comprenden preferiblemente aquellos que directa o indirectamente conducen a perjudicar la calidad de la planta, la cantidad de las cosechas, la aptitud para usarse como forraje, pienso o nutriente o que, sin embargo, dificultan sembrar, plantar, cosechar o procesar el material cosechado. Principalmente, para los propósitos de la presente invención la tolerancia a patógeno puede considerarse incluida en la resistencia a patógeno.

"Conferir", "existir", "generar" o "incrementar" una resistencia significa que los mecanismos de defensa de una especie o variedad vegetal determinada aplicando el método de la invención en comparación con el tipo silvestre de la planta ("planta de partida"), a las que el método de la invención no se ha empleado, en condiciones por lo demás esencialmente iguales (como, por ejemplo, condiciones de clima o de cultivo, tipo de estrés o de patógeno, etc.) presentan una resistencia elevada frente a uno o varios patógenos. En tal caso se manifiesta la resistencia elevada preferiblemente en una manifestación reducida de los síntomas de la enfermedad, en cuyo caso los síntomas de enfermedad – además de las consideraciones arriba mencionadas – también comprenden, por ejemplo, la eficiencia de penetración de un patógeno en la planta o las células vegetales o la eficiencia de proliferación en o sobre las mismas. En tal caso los síntomas de enfermedad se reducen en al menos 5 %, 10 % o al menos 20 %, particularmente preferible en al menos 40 % o 60 %, muy particularmente preferible en al menos 70 % o 80 %, lo más preferible en al menos 90 % o 95 %.

"Selección" significa, respecto de las plantas en las que, a diferencia o en comparación con la planta de partida, existe o se incrementa la resistencia contra al menos un patógeno, todos los métodos que son adecuados para reconocer una resistencia a patógeno existente o aumentada. Estos pueden ser, por ejemplo, síntomas de la infección con patógeno (por ejemplo, formación de necrosis en la infección con hongos) pero también comprenden los síntomas arriba descritos que afectan la calidad de la planta, la cantidad de la cosecha, la aptitud para usarse como forraje, pienso o nutriente, etc.

"Patógeno" significa al menos un hongo biotrófico del género Phakopsora. Sin embargo puede suponerse que la expresión específica para mesófilo de una proteína BI-1 también produce una resistencia contra otros patógenos, puesto que en total se genera una resistencia contra factores de estrés.

Los siguientes patógenos pueden mencionarse, por ejemplo, aunque no de manera limitante:

1. Patógenos fúngicos o patógenos similares a los hongos:

Patógenos fúngicos o patógenos similares a los hongos (como por ejemplo chromista) provienen preferentemente del grupo que comprende plasmodioforamycotas, oomycotas, ascomycotas, chytridiomycotas, zygomycotas, basidiomycotas y deuteromycotas (Fungi imperfecti). A manera de ejemplo, aunque no limitante, pueden mencionarse los patógenos indicados en las tablas 1 a 4 y las enfermedades asociadas con ellos. Los siguientes términos ingleses y castellanos pueden usarse de modo alterno:

Podredumbre de espigas ear rot / head blight Podredumbre de tallo stalk rot Podredumbre de raíz root rot Roya u orín rust Falso mildiú downy mildew Tabla 1: Enfermedades provocadas por hongos biotróficos, fitopatógenos

Enfermedad: Patógeno

Roya u orín pardo: Puccinia recondita

Roya u orín amarillo: P. striiformis

Mildiú auténtico o mal blanco: Erysiphe graminis / Blumeria graminis

Roya u orín (maíz común): Puccinia sorghi

Roya u orín (maíz sureño): Puccinia polysora

Mancha foliar (cercospora) de tabaco: Cercospora nicotianae

Roya u orín (soja): Phakopsora pachyrhizi, P. meibomiae

Roya u orín (maíz tropical): Physopella pallescens, P. zeae = Angiopsora zeae

Tabla 2: Enfermedades provocadas por hongos necrotróficos y/o hemibiotróficos y oomycetos

Enfermedad: Patógeno

Mancha de gluma: Septoria (Stagonospora) nodorum

Cercospora o sequedad de hoja: Septoria tritici

Fusariosis de granzas: Fusarium spp.

Enfermedad ruptura de tallo: Pseudocercosporella herpotrichoides

Carbón en trigo y cebada: Ustilago spp.

Podredumbre de hierba y tubérculo: Phytohpthora infestans

Caries del trigo: Tilletia caries

Pie negro: Gaeumannomyces graminis

Anthrocnose leaf marchitez (marchitez de hoja por antracnosis) Anthracnose stalk rot (podredumbre de tallo por antracnosis): Colletotrichum graminicola (teleomorph: Glomerella graminicola Politis); Glomerella tucumanensis (anamorph: Glomerella falcatum Went)

Aspergillus ear and kernel rot (podredumbre de granza y grano por aspergilo): Aspergillus flavus

Banded leaf and sheath spot (mancha de hoja y vaina unida) ("mal vinoso"): Rhizoctonia solani Kuhn = Rhizoctonia microsclerotia J. Matz (telomorph: Thanatephorus cucumeris)

Black kernel rot (podredumbre de grano negra): Acremonium strictumW. Gams=alosporiumacremonium Auct. non Corda

Black kernel rot (podredumbre de grano negra): Lasiodiplodia theobromae = Botryodiplodia theobromae

Borde blanco: Marasmiellus sp.

Brown spot (black spot, stalk rot) Mancha parda (mancha negra, mancha de tallo): Physoderma maydis

Cephalosporium kernel rot (podredumbre de grano por cefalosporium: Acremonium strictum = Cephalosporium acremonium

Charcoal rot (podredumbre de carbonillo): Macrophomina phaseolina

Corticium ear rot (podredumbre de granza): Thanatephorus cucumeris = Corticium sasakii

(continuación)

Enfermedad: Patógeno

Curvularia leaf spot (mancha de hoja): Curvularia clavata, C. eragrostidis, = C. maculans (teleomorph: Cochliobolus eragrostidis), Curvularia inaequalis, C. intermedia (teleomorph: Cochliobolus intermedius), Curvularia lunata (teleomorph: Cochliobolus lunatus), Curvularia pallescens (teleomorph: Cochliobolus pallescens), Curvularia senegalensis, C. tuberculata (teleomorph: Cochliobolus tuberculatus)

Didymella leaf spot (mancha de hoja): Didymella exitalis

Podredumbre de granza y de tallo por Diplodia: Diplodia frumenti (teleomorph: Botryosphaeria festucae)

Podredumbre de granza y de tallo por Diplodia seed rot and seedling marchitez (podredumbre de semilla y marchitez de plántula): Diplodia maydis = Stenocarpella maydis

Diplodia leaf spot or streak (mancha de hoja o pica por diplodia): Stenocarpella macrospora = Diplodialeaf macrospora

Brown stripe downy mildew (raya parda por moho mildiú): Sclerophthora rayssiae var. zeae

Crazy top downy mildew (mildiú): Sclerophthora macrospora = Sclerospora macrospora

Green ear downy mildew (graminicola downy mildew) Granza verde por mildiú: Sclerospora graminicola

Dry ear rot (cob, kernel and stalk rot) (podredumbre de granza seca: mazorca, grano y tallo): Nigrospora oryzae (teleomorph: Khuskia oryzae)

Podredumbre de granza (minor): Alternaria altemata = A. tenuis, Aspergillus glaucus, A. niger, Aspergillus spp., Botrytis cinerea (teleomorph: Botryotinia fuckeliana), Cunninghamella sp., Curvularia pallescens, Doratomyces stemonitis = Cephalotrichum stemonitis, Fusarium culmorum, Gonatobotrys simplex, Pithomyces maydicus, Rhizopus microsporus Tiegh., R. stolonifer = R. nigricans, Scopulariopsis brumptii

Ergot (horse’s tooth) – cornezuelo (diente de caballo): Claviceps gigantea (anamorph: Sphacelia sp.)

Eyespot - cercoesporelosis o mal de pie de cereales: Aureobasidium zeae = Kabatiella zeae

Fusarium podredumbre de granzas y de tallo F.: Fusarium subglutinans = F. moniliforme var.subglutinans

Fusarium kernel, root and stalk rot, seed rot and seedling marchitez (podredumbre de grano, raíz y marchitez de plántula): Fusarium moniliforme (teleomorph: Gibberella fujikuroi)

Fusarium podredumbre de tallo, seedling root rot (podredumbre de raíz y plántula): Fusarium avenaceum (teleomorph: Gibberella avenacea)

Gibberella podredumbre de tallo y plántula: Gibberella zeae (anamorph: Fusarium graminearum)

Podredumbre gris de granzas: Botryosphaeria zeae = Physalospora zeae (anamorph: Macrophoma zeae)

Gray leaf spot (Cercospora leaf spot) Mancha gris de hoja (mancha de hoja): Cercospora sorghi = C. sorghi var. maydis, C. zeaemaydis

Helminthosporium root rot (podredumbre de raíz por Helminthosporium): Exserohilum pedicellatum = Helminthosporium pedicellatum (teleomorph: Setosphaeria pedicellata)

(continuación)

Enfermedad: Patógeno

Hormodendrum podredumbre de granzas (podredumbre por cladosporium): Cladosporium cladosporioides = Hormodendrum cladosporioides, C. herbarum (teleomorph: Mycosphaerella tassiana)

Leaf spots, minor (manchas en hojas): Alternaria alternata, Ascochyta maydis, A. tritici, A. zeicola, Bipolaris victoriae = Helminthosporium victoriae (teleomorph: Cochliobolus victoriae), C. sativus (anamorph: Bipolaris sorokiniana = H. sorokinianum = H. sativum), Epicoccum nigrum, Exserohilum prolatum = Drechslera prolata (teleomorph: Setosphaeria prolata) Graphium penicillioides, Leptosphaeria maydis, Leptothyrium zeae, Ophiosphaerella herpotricha, (anamorph: Scolecosporiella sp.), Paraphaeosphaeria michotii, Phoma sp., Septoria zeae, S. zeicola, S. zeina

Northern corn leaf blight (white blast, crown stalk rot, stripe) marchitez en hoja de maíz (ráfaga blanca, podredumbre de corona en tallo, raya): Setosphaeria turcica (anarnorph: Exserohilum turcicum = Helminthosporium turcicum)

Northern corn leaf spot Helminthosporium ear rot (race 1) mancha de hoja de maíz del norte, podredumbre de granza: Cochliobolus carbonum (anamorph: Bipolaris zeicola = Helminthosporium carbonum)

Penicillium podredumbre de granzas (blue eye, blue mold) (ojo azul, moho azul): Penicillium spp., P. chrysogenum, P. expansum, P. oxalicum

Podredumbre de tallo y raíces por Phaeocytostroma: Phaeocytostroma ambiguum, = Phaeocytosporella zeae

Phaeosphaeria leaf spot (mancha de hojas por Phaeosphaeria): Phaeosphaeria maydis = Sphaerulina maydis

Podredumbre de granzas por Physalospora (Podredumbre de granzas por Botryosphaeria): Botryosphaeria festucae = Physalospora zeicola (anamorph: Diplodia frumenti)

Purple leaf sheath (vaina hoja púrpura): Hemiparasitic bacteria and fungi

Podredumbre de tallo y raíz por Pyrenochaeta: Phoma terrestris = Pyrenochaeta terrestris

Podredumbre de raíz por Pythium: Pythium spp., P. arrhenomanes, P. graminicola

Podredumbre de tallo por Pythium: Pythium aphanidermatum = P. butleri L.

Red kernel disease (ear mold, leaf and seed rot) enfermedad de grano rojo (moho de granza, podredumbre de hoja y semilla): Epicoccum nigrum

Podredumbre de granzas por Rhizoctonia (sclerotial rot) (podredumbre esclerocial): Rhizoctonia zeae (teleomorph: Waitea circinata)

Podredumbre de tallo y raíz por Rhizoctonia: Rhizoctonia solani, Rhizoctonia zeae

Podredumbre de raíz (minor): Alternaria alternata, Cercospora sorghi, Dictochaeta fertilis, Fusarium acuminatum (teleomorph: Gibberella acuminata), F. equiseti (tele-omorph: G. intricans), F. oxysporum, F. pallidoroseum, F. poae, F. roseum, G. cyanogena, (anamorph: F. sulphureum), Microdochium bolleyi, Mucor sp., Periconia circinata, Phytophthora cactorum, P. drechsleri, P. nicotianae var. parasitica, Rhizopus arrhizus

Rostratum leaf spot (Helminthosporium leaf disease, ear and stalk rot) Mancha de hoja (enfermedad de hoja por Helminthosporium, podredumbre de granza y tallo): Setosphaeria rostrata, (anamorph: xserohilum rostratum = He/minthosporium rostratum)

Falscher Java Mehltau (Mildiú falso de Java): Peronosclerospora maydis = Sclerospora maydis

Falscher Philippinen Mehltau (mildiú falso de Filipinas): Peronosclerospora philippinensis = Sclerospora philippinensis

(continuación)

Enfermedad: Patógeno

Falscher Sorghum Mehltau (mildiú falso de sorgo): Peronosclerospora sorghi = Sclerospora sorghi

Spontaneum downy mildew (mildiú espontáneo): Peronosclerospora spontanea = Sclerospora spontanea

Falscher Zuckerrohr-Mehltau (mildiú falso de caña de azúcar): Peronosclerospora sacchari = Sclerospora sacchari

Podredumbre de granzas por Sclerotium (southern blight o marchitez del sur): Sclerotium rolfsii Sacc. (teleomorph: Athelia rolfsii)

Seed rot-seedling marchitez: Bipolaris sorokiniana, B. zeicola = Helminthosporium carbonum, Diplodia maydis, Exserohilum pedicillatum, Exserohilum turcicum = Helminthosporium turcicum, Fusarium avenaceum, F. culmorum, F. moniliforme, Gibberella zeae (anamorph: F. graminearum), Macrophomina phaseolina, Penicillium spp., Phomopsis sp., Pythium spp., Rhizoctonia solani, R. zeae, Sclerotium rolfsii, Spicaria sp.

Selenophoma Leaf spot (mancha de hoja por Selenophoma): Selenophoma sp.

Sheath rot (podredumbre de vaina): Gaeumannomyces graminis

Shuck rot (podredumbre de cáscara): Myrothecium gramineum

Silage mold (moho de silaje): Monascus purpureus, M ruber

Carbón de cebada (Smut, common) (carbón, común): Ustilago zeae = U. maydis

Smut, false (carbón, falso): Ustilaginoidea virens

Kolbenbrand (Smut, head): Sphacelotheca reiliana = Sporisorium holcisorghi

Southern corn leaf blight and stalk rot marchitez de hoja de maíz sureño y podredumbre de tallo: Cochliobolus heterostrophus (anamorph: Bipolaris maydis = Helminthosporium maydis)

Southern leaf spot: Stenocarpella macrospora = Diplodia macrospora

Podredumbre de tallo (minor): Cercospora sorghi, Fusarium episphaeria, F. merismoides, F. oxysporum Schlechtend, F. poae, F. roseum, F. solani (teleomorph: Nectria haematococca), F. tricinctum, Mariannaea elegans, Mucor sp., Rhopographus zeae, Spicaria sp.

Podredumbre de almacenamiento (storage rots): Aspergillus spp., Penicillium spp. y otros hongos

Tar spot (mancha de alquitrán): Phyllachora maydis

Trichoderma ear rot and root rot (podredumbre de granza y de raíz por Trichodema): Trichoderma viride = T. lignorum teleomorph: Hypocrea sp.

White ear rot, root and stalk rot (podredumbre de granza blanca, podredumbre de raíz y tallo): Stenocarpella maydis = Diplodia zeae

Yellow leaf blight (marchitez de hoja amarilla): Ascochyta ischaemi, Phyllosticta maydis (teleomorph: Mycosphaerella zeae-maydis)

Zonate leaf spot (mancha de hoja zonal): Gloeocercospora sorghi

Tabla 4: Enfermedades provocadas por hongos y oomycetos con clasificación no clara respecto del comportamiento biotrófico, hemibiotrófico o necrotrófico

Enfermedad: Patógeno

Hyalothyridium leaf spot (mancha de hoja por Hyalothyridium): Hyalothyridium maydis

Late wilt (marchitamiento tardío: Cephalosporium maydis

Particularmente se prefieren

-: Plasmodioforomycotas como Plasmodiophora brassicae (potra de la col), Spongospora subterranea, Polymyxa graminis,

-: Oomycetos tales como Bremia lactucae (falso mildiú en lechuga), Peronospora (falso mildiú) en boca de dragón (P. antirrhini), cebolla (P. destructor), espinaca (P. effusa), soja (P. manchurica), tabaco (moho azul; P. tabacina) alfalfa y trébol (P. trifolium), Pseudoperonospora humuli (falso mildiú en lúpulo), Plasmopara (falso mildiú en uvas) (P. viticola) y girasol (P. halstedii), Sclerophtohra macrospora (falso mildiú en cereales y gramináceas), Pythium (por ejemplo podredumbre del pie de beta-remolacha por P. debaryanum), Phytophthora infestans (podredumbre en hierbas y tubérculos, podredumbre marrón en tomate, etc.), Albugo spec.

-: Ascomycotas como Microdochium nivale (Moho de la nieve en centeno y trigo), Fusarium graminearum, Fusarium culmorum (podredumbre de espigas especialmente en trigo), Fusarium oxysporum (marchitamiento por Fusarium en tomate), Blumeria graminis (mal blanco en cebada (f.sp. hordei) y trigo (f.sp. tritici)), Erysiphe pisi (mildiú de guisantes), Nectria galligena (chancro del manzano), Unicnula necator (mal blanco de la vid), Pseudopeziza tracheiphila (enrojecimiento de las hojas de la vid), Claviceps purpurea (cornezuelo del centeno y de gramináceas, por ejemplo), Gaeumannomyces graminis (enfermedad del pie negro en trigo, centeno ente otras gramináceas), Magnaporthe grisea, Pyrenophora graminea (mancha listada en cebada), Pyrenophora teres (enfermedad de manchas de red en cebada), Pyrenophora tritici-repentis (mancha foliar (cercospora) en trigo), Venturia inaequalis (roña del manzano), Sclerotinia sclerotium (rotura de tallo, podredumbre de tallo), Pseudopeziza medicaginis (mancha foliar en alfalfa, trébol blanco y rojo).

-: Basidiomycetos como Typhula incamata (podredumbre de Typhula en cebada, centeno, trigo), Ustilago maydis (necrosis en ampollas en maíz), Ustilago nuda (carbón de la cebada), Ustilago tritici (carbón de trigo, espelta), Ustilago avenae (carbón de avena), Rhizoctonia solani (podredumbre de raíz en patatas), Sphacelotheca spp. (carbón de la espiga en sorgo), Melampsora lini (roya en lino), Puccinia graminis (roya negra en trigo, cebada, centeno, avena), Puccinia recondita (roya marrón en trigo), Puccinia dispersa (roya marrón en centeno), Puccinia hordei (roya marrón en cebada), Puccinia coronata (roya coronada en avena), Puccinia striiformis (roya amarilla en trigo, cebada, centeno así como numerosas gramíneas), Uromyces appendiculatus (roya de judías), Sclerotium rolfsii (podredumbre de raíz y tallo en numerosas plantas)

-: Deuteromycetos (Fungi imperfecti) como Septoria (Stagonospora) nodorum (mancha de gluma) en trigo (Septoria tritici), Pseudocercosporella herpotrichoides (cercosporelosis o encamado parasitario en trigo, cebada, centeno), Rynchosporium secalis (mancha foliar o cercospora en centeno y cebada), Alternaria solani (negrón de patata, tomate), Phoma betae (carbón en remolacha), Cercospora beticola (Cercospora-mancha foliar o cercospora en remolacha), (Alternaria brassicae (mancha negra en colza, repollo entre otras crucíferas), Verticillium dahliae (marchitamiento y podredumbre de tallo de colza), Colletotrichum lindemuthianum (antracnosis de las judías), Phoma lingam – enfermedad (pie negro de repollo; podredumbre de raíz y tallo en colza), Botrytis cinerea (moho gris en la vida, fresa, tomate, lúpulo, etc.).

Particularmente se prefieren patógenos biotróficos y entre éstos principalmente los patógenos heminecrotróficos, es decir Phakopsora pachyrhizi y/o aquellos que tienen esencialmente un mecanismo de infección similar como Phakopsora pachyrhizi, tal como se ha descrito aquí. Principalmente se prefieren patógenos del grupo de los uredinales (hongos de roya), y entre éstos particularmente las Melompsoraceas. Particularmente se prefieren Phakopsora pachyrhizi y/o Phakopsora meibomiae.

2. Patógenos bacterianos:

A manera de ejemplo, aunque no de manera restrictiva, pueden mencionarse los patógenos mencionados en la tabla 5 y las enfermedades asociados con ellos.

Tabla 5: enfermedades bacterianas

Enfermedad: Patógeno

Bacterial leaf blight and stalk rot (marchitez de hoja y podredumbre de tallo por bacterias): Pseudomonas avenae subsp. avenae

Bacterial leaf spot (mancha foliar bacteriana): Xanthomonas campestris pv. holcicola

Podredumbre de tallo por bacterias: Enterobacter dissolvens = Erwinia dissolvens

Pie negro ("Bacterial stalk and top rot" o podredumbre de tallo y de copa bacteriana): Erwinia carotovora subsp. carotovora, Erwinia chrysanthemi pv. zeae

Bacterial stripe (raya bacteriana): Pseudomonas andropogonis

(continuación)

Enfermedad: Patógeno

Chocolate spot (mancha chocolate): Pseudomonas syringae pv. coronafaciens

Goss’s bacterial wilt and blight (marchitamiento bacteriano de Goss( (leaf freckles and wilt) (pecas y marchitamiento foliar): Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis = Corynebacterium michiganense pv.andnebraskense

Holcus spot (mancha): Pseudomonas syringae pv. syringae

Purple leaf sheath (vaina de hoja púrpura): Hemiparasitic bacteria

Seed rot-seedling blight (podredumbre de semilla – marchitamiento de simiente): Bacillus subtilis

Stewart’s disease (enfermedad de Stewart) (bacterial wilt) (marchitamiento bacteriano: Pantoea stewartii = Erwinia stewartii

Corn stunt (achapparramiento,maize stunt, Mesa Central or Rio Grande maize stunt): Spiroplasma kunkelii

3. Patógenos virales:

"Patógenos virales" incluyen todos los virus vegetales como, por ejemplo, virus mosaico de tabaco o de pepinillo, virus de mancha anular, virus de necrosis, virus mosaico enano (dwarf-mosaic) de maíz, etc. A manera de enfermedad aunque no restrictiva pueden mencionarse los patógenos indicados en la Tabla 6 y las

enfermedades asociadas con ellos. Tabla 6: enfermedades virales

Enfermedad: Patógeno

American wheat striate (wheat striate mosaic) estriado de trigo americano (mosaico estriado de trigo): American wheat striate mosaic virus (AWSMV)

Barley stripe mosaic (mosaico de raya en cebada): Barley stripe mosaic virus (BSMV)

Barley yellow dwarf (enano amarillo de cebada): Barley yellow dwarf virus (BYDV)

Brome mosaic (mosaico de bromo): Brome mosaic virus (BMV)

Cereal chlorotic mottle (moteado clorótica en cereal): Cereal chlorotic mottle virus (CCMV)

Corn chlorotic vein banding (Braizilian maize mosaic) (rizadura clorótica de maíz, mosaico de maíz brasileño): Corn chlorotic vein banding virus (CCVBV)

Corn lethal necrosis (necrosis letal de maíz): Viruskomplex aus Maize chlorotic mottle virus (MCMV) y Maize dwarf mosaic virus (MDMV) A o B o Wheat streak mosaic virus(WSMV)

Cucumber mosaic (mosaico de pepinillo): Cucumber mosaic virus (CMV)

Cynodon chlorotic streak (veta clorótica de cynodon): Cynodon chlorotic streak virus (CCSV)

Johnsongrass mosaic (mosaico de sorgo de Alepo): Johnsongrass mosaic virus (JGMV)

Maize bushy stunt (achaparramiento de maíz): Mycoplasma-like organism (MLO) associated

Maize chlorotic dwarf (enano clorótico de maíz): Maize chlorotic dwarf virus (MCDV)

Maize chlorotic mottle (moteado clorótico de maíz): Maize chlorotic mottle virus (MCMV)

Maize dwarf mosaic (mosaico enano de maíz): Maize dwarf mosaic virus (MDMV) strains A, D, E and F

Maize leaf fleck (mancha foliar de maíz): Maize leaf fleck virus (MLFV)

Maize line (línea de maíz): Maize line virus (MLV)

Maize mosaic (corn leaf stripe, enanismo rayado): Maize mosaic virus (MMV)

Maize mottle and chlorotic stunt (moteado de maíz y achaparramiento clorótico): Maize mottle and chlorotic stunt virus

Maize pellucid ringspot (mancha anular pelúcida): Maize pellucid ringspot virus (MPRV)

Maize raya gruesa: Maize raya gruesa virus (MRGV)

maize rayado fino (fine striping disease): Maize rayado fino virus (MRFV)

Maize red leaf and red stripe (hoja roja y raya roja): Mollicute

Maize red stripe (raya roja): Maize red stripe virus (MRSV)

Maize ring mottle (moteado anular): Maize ring mottle virus (MRMV)

(continuación)

Enfermedad: Patógeno

Maize rio IV: Maize rio cuarto virus (MRCV)

Maize rough dwarf (enanismo ruvido): Maize rough dwarf virus (MRDV) (Cereal tillering disease virus)

Maize sterile stunt (achaparramiento estéril): Maize sterile stunt virus (strains of barley yellow striate virus)

Maize streak (veta de maíz): Maize streak virus (MSV)

Maize stripe (maize chlorotic stripe (raya clorótica), maíz hoja blanca): Maize stripe virus

Maize stunting (achaparramiento): Maize stunting virus

Maize tassel abortion (aborto de panícula): Maize tassel abortion virus (MTAV)

Maize vein enation: Maize vein enation virus (MVEV)

Maize wallaby ear (oreja de ualabí): Maize wallaby ear virus (MWEV)

Maize white leaf (hoja blanca): Maize white leaf virus

Maize white line mosaic (mosaico de línea blanca): Maize white line mosaic virus (MWLMV)

Millet red leaf (hoja roja): Millet red leaf virus (MRLV)

Northern cereal mosaic (mosaico de cereal): Northern cereal mosaic virus (NCMV)

Oat pseudorosette (zakuklivanie) (en avena): Oat pseudorosette virus

Oat sterile dwarf (enano estéril de avena): Oat sterile dwarf virus (OSDV)

Rice black-streaked dwarf (enano con vetas negras en arroz): Rice black-streaked dwarf virus (RBSDV)

Rice stripe (raya en arroz): Rice stripe virus (RSV)

Sorghum mosaic (mosaico de sorgo): Sorghum mosaic virus (SrMV) (también: sugarcane mosaic virus (SCMV) cepas H, I and M)

Sugarcane Fiji disease (enfermedad de Fiji en caña de azúcar): Sugarcane Fiji disease virus (FDV)

Sugarcane mosaic (mosaico de caña de azúcar): Sugarcane mosaic virus (SCMV) strains A, B, D, E, SC, BC, Sabi and MB (formerly MDMV-B)

Wheat spot mosaic (mosaico con manchas en trigo): Wheat spot mosaic virus (WSMV)

4. Plagas animales

5 4.1 Patógenos insectos:

A manera de ejemplo aunque no restrictiva pueden mencionarse insectos como, por ejemplo, escarabajo, orugas, piojos o ácaros.

Se prefieren insectos de los géneros coleópteros, dípteros, himenópteros, lepidópteros, malofagos, homópteros, hemípteros, ortópteros, tisanópteros. dermápteros, isópteros, anoplura, sifonápteros, tricópteros, etc.. 10 Particularmente se prefieren los insectos coleópteros y lepidópteros, como por ejemplo el barrenador de maíz (European Corn Borer), Diabrotica barberi, Diabrotica undecimpunctata, Diabrotica virgifera, Agrotis ipsilon, Crymodes devastator, Feltia ducens, Agrotis gladiaria, Melanotus spp., Aeolus mellillus, Aeolus mancus, Horistonotus uhlerii, Sphenophorus maidis, Sphenophorus zeae, Sphenophorus parvulus, Sphenophorus callosus, Phyllogphaga spp., Anuraphis maidiradicis, Delia platura, Colaspis brunnea, Stenolophus lecontei y Clivinia

15 impressifrons.

Además pueden mencionarse: el criocero de los cereales (Oulema melanopus), la mosca frit (Oscinella frit), gusanos de alambre u orovios (Agrotis lineatus) y pulgones (como, por ejemplo, pulgón de avena Rhopalosiphum padi, gran pulgón de cereal Sitobion avenae).

4.2 Nematodos:

20 A manera de ejemplo aunque no restrictiva pueden mencionarse los patógenos indicados en la tabla 7 y las enfermedades asociadas con ellos.

Tabla 7: nematodos parásitos

Plaga: Nematodo patógeno

Awl (punzón): Dolichodorus spp., D. heterocephalus

Anguílula del tallo, cebollino del centeno, anguilulosis: Ditylenchus dipsaci

Burrowing (excavador): Radopholus similis

Nematodo de la avena: Heterodera avenae, H. zeae, Punctodera chalcoensis

Dagger (daga): Xiphinema spp., X. americanum, X. mediterraneum

False root-knot (nematodos noduladores de la raíz): Nacobbus dorsalis

Lance, Columbia: Hoplolaimus columbus

Lance: Hoplolaimus spp., H. galeatus

Lesion: Pratylenchus spp., P. brachyurus, P. crenatus, P. hexincisus, P. neglectus, P. penetrans, P. scribneri, P. thornei, P. zeae

Needle: Longidorus spp., L. breviannulatus

Ring: Criconemella spp., C. ornata

Nematodos de agallas radiculares: Meloidogyne spp., M. chitwoodi, M. incognita, M. javanica

Spiral: Helicotylenchus spp.

Sting (picadura): Belonolaimus spp., B. longicaudatus

Stubby-root (raíz regordeta): Paratrichodorus spp., P. christiei, P. minor, Quinisulcius acutus, Trichodorus spp.

Stunt (enanismo): Tylenchorhynchus dubius

Muy particularmente se prefieren Globoa rostochiensis y G. pallida (nematodos de las raíces en patata, tomate, entre otras solanáceas), Heteroa schachtii (nematodos de remolacha en remolacha de azúcar y de pienso, colza, repollo,

5 etc.), Heteroa avenae (nematodos de avena en avena entre otras variedades de cereal), Ditylenchus dipsaci (nematodo del tallo o anguilula del tallo, nematodo de centeno, avena, maíz, trébol, tabaco, remolacha), Anguina tritici (nematodo de trigo, enfermedad de berberecho en trigo (espelta, centeno), Meloidogyne hapla (nematodos noduladores de la raíz en zanahoria, pepinillo, lechuga, tomate, patata, remolacha de azúcar, alfalfa).

Ejemplos de patógenos fúngicos o virales preferidos para las variedades individuales son:

10 1. Cebada:

Patógenos fúngicos, bacterianos y virales: Puccinia graminis f.sp. hordei, barley yellow dwarf virus (BYDV).

Insectos / nematodos patógenos: Ostrinia nubilalis (European corn borer); Agrotis ipsilon; Schizaphis graminum; Blissus leucopterus leucopterus; Acrosternum hilare; Euschistus servus; Deliaplatura; Mayetiola destructor; Petrobia latens.

15 2. Soja:

Patógenos fúngicos, bacterianos o virales: Phytophthora megasperma fsp.glycinea, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum, Diaporthe phaseolorum var. sojae (Phomopsis sojae), Diaporthe phaseolorum var. caulivora, Sclerotium rolfsii, Cercospora kikuchii, Cercospora sojina, Peronospora manshurica, Colletotrichum dematium (Colletotrichum truncatum), Corynespora cassiicola, Septoria 20 glycines, Phyllosticta sojicola, Alternaria alternata, Pseudomonas syringae p.v. glycinea, Xanthomonas campestris

p.v. phaseoli, Microsphaera diffussa, Fusarium semitectum, Phialophora gregata, virus mosaico de soja, roya de soja, Glomerella glycines, Tobacco Ring spot virus, Tobacco Streak virus, Phakopsorapachyrhizi, Pythium aphanidermatum, Pythium ultimum, Pythium debaryanum, Tomato spotted wilt virus, Heteroa glycines Fusarium solani; principalmente roya de soja.

25 Insectos / nematodos patógenos: Pseudoplusia includens; Anticarsia gemmatalis; Plathypena scabra; Ostrinia nubilalis; Agrotis ipsilon; Spodoptera exigua; Heliothis virescens; Helicoverpa zea; Epilachna varivestis; Myzus persicae; Empoasca fabae; Acrosternum hilare; Melanoplus femurrubrum; Melanoplus differentialis; Hylemya platura; Sericothrips variabilis; Thrips tabaci; Tetranychus turkestani; Tetranychus urticae.

3. Colza:

Patógenos fúngicos, bacterianos o virales: Albugo candida, Alternaria brassicae, Leptosphaeria maculans, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Mycosphaerella brassiccola, Pythium ultimum, Peronospora parasitica, Fusarium roseum, Alternaria alternata.

4.: Alfalfa:

Patógenos fúngicos, bacterianos o virales: Clavibater michiganese subsp. insidiosum, Pythium ultimum, Pythium irregulare, Pythium splendens, Pythium debaryanum, Pythium aphanidermatum, Phytophthora megasperma, Peronospora trifoliorum, Phoma medicaginis var. medicaginis, Cercospora medicaginis, Pseudopeziza medicaginis, Leptotrochila medicaginis, Fusarium, Xanthomonas campestris p.v. alfalfae, Aphanomyces euteiches, Stemphylium herbarum, Stemphylium alfalfae.

5.: Trigo:

Patógenos fúngicos, bacterianos o virales: Pseudomonas syringae p.v. atrofaciens, Urocystis agropyri, Xanthomonas campestris p.v. translucens, Pseudomonas syringae p.v. syringae, Alternaria alternata, Cladosporium herbarum, Fusarium graminearum, Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum, Ustilago tritici, Ascochyta tritici, Cephalosporium gramineum, Collotetrichum graminicola, Erysiphe graminis f.sp. tritici, Puccinia graminis f.sp. tritici, Puccinia recondita f.sp. tritici, Puccinia striiformis, Pyrenophora tritici-repentis, Septoria (Stagonospora) nodorum, Septoria tritici, Septoria avenae, Pseudocercosporella herpotrichoides, Rhizoctonia solani, Rhizoctonia cerealis, Gaeumannomyces graminis var. tritici, Pythium aphanidermatum, Pythium arrhenomanes, Pythium ultimum, Bipolaris sorokiniana, Barley Yellow Dwarf Virus, Brome Mosaic Virus, Soil Borne Wheat Mosaic Virus, Wheat Streak Mosaic Virus, Wheat Spindle Streak Virus, American Wheat Striate Virus, Claviceps purpurea, Tilletia tritici, Tilletia laevis, Ustilago tritici, Tilletia indica, Rhizoctonia solani, Pythium arrhenomannes, Pythium gramicola, Pythium aphanidermatum, High Plains Virus, European Wheat Striate Virus, Puccinia graminis f.sp. tritici (Wheat stem rust), Blumeria (Erysiphe) graminis f.sp. tritici (Wheat Powdery Mildew).

Insectos / nematodos patógenos: Pseudaletia unipunctata; Spodoptera,frugiperda; Elasmopalpus lignosellus; Agrotis orthogonia; Elasmopalpus Zignosellus; Oulema melanopus; Hypera punctata; Diabrotica undecimpunctata howardi; Russian wheat aphid; Schizaphis graminum; Macrosiphum avenae; Melanoplus femurrubrum; Melanoplus differentialis; Melanoplus sanguinipes; Mayetiola destructor; Sitodiplosis mosellana; Meromyza americana; Hylemya coarctata; Frankliniella fusca; Cephus cinctus; Aceria tulipae.

6. Girasol:

Patógenos fúngicos, bacterianos o virales: Plasmophora halstedii, Sclerotinia sclerotiorum, Aster Yellows, Septoria helianthi, Phomopsis helianthi, Alternaria helianthi, Alternaria zinniae, Botrytis cinerea, Phoma macdonaldii, Macrophomina phaseolina, Erysiphe cichoracearum, Rhizopus oryzae, Rhizopus arrhizus, Rhizopus stolonifer, Puccinia helianthi, Verticillium dahliae, Erwinia carotovorum p.v. Carotovora, Cephalosporium acremonium, Phytophthora cryptogea, Albugo tragopogonis.

Insectos / nematodos patógenos: Suleima helianthana; Homoeosoma electellum; zygogramma exclamationis; Bothyrus gibbosus; Neolasioptera murtfeldtiana.

7. Maíz:

Patógenos fúngicos, bacterianos o virales: Fusarium moniliforme var. subglutinans, Erwinia stewartii, Fusarium moniliforme, Gibberella zeae (Fusarium graminearum), Stenocarpella maydi (Diplodia maydis), Pythium irregulare, Pythium debaryanum, Pythium graminicola, Pythium splendens, Pythium ultimum, Pythium aphanidermatum, Aspergillus flavus, Bipolaris maydis 0, T (Cochliobolus heterostrophus), Helminthosporium carbonum I, II & III (Cochliobolus carbonum), Exserohilum turcicum I, II & III, Helminthosporium pedicellatum, Physoma maydis, Phyllosticta maydis, Kabatiella maydis, Cercospora sorghi, Ustilago maydis, Puccinia sorghi, Puccinia polysora, Macrophomina phaseolina, Penicillium oxalicum, Nigrospora oryzae, Cladosporium herbarum, Curvularia lunata, Curvularia inaequalis, Curvularia pallescens, Clavibacter michiganese subsp. nebraskense, Trichoma viride, Maize Dwarf Mosaic Virus A & B, Wheat Streak Mosaic Virus, Maize Chlorotic Dwarf Virus, Claviceps sorghi, Pseudonomas avenae, Erwinia chrysanthemi p.v. Zea, Erwinia corotovora, Cornstunt spiroplasma, Diplodia macrospora, Sclerophthora macrospora, Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora philippinesis, Peronosclerospora maydis, Peronosclerospora sacchari, Spacelotheca reiliana, Physopella zeae, Cephalosporium maydis, Caphalosporium acremonium, Maize Chlorotic Mottle Virus, High Plains Virus, Maize Mosaic Virus, Maize Rayado Fino Virus, Maize Streak Virus (MSV, virus de vetas de maíz), Maize Stripe Virus, Maize Rough Dwarf Virus.

Insectos / nematodos patógenos: Ostrinia nubilalis; Agrotis ipsilon; Helicoverpa zea; Spodoptera frugiperda; Diatraea grandiosella; Elasmopalpus lignosellus; Diatraea saccharalis; Diabrotica virgifera; Diabrotica longicornis barberi; Diabrotica undecimpunctata howardi; Melanotus spp.; Cyclocephala borealis; Cyclocephala immaculata; Popillia

japonica; Chaetocnema pulicaria; Sphenophorus maidis; Rhopalosiphum maidis; Anuraphis maidiradicis; Blissus leucopterus leucopterus; Melanoplus femurrubrum; Melanoplus sanguinipes; Hylemva platura; Agromyza parvicornis; Anaphothrips obscrurus; Solenopsis milesta; Tetranychus urticae.

8. Sorgo:

Patógenos fúngicos, bacterianos o virales: Exserohilum turcicum, Colletotrichum graminicola (Glomerella graminicola), Cercospora sorghi, Gloeocercospora sorghi, Ascochyta sorghina, Pseudomonas syringae p.v. syringae, Xanthomonas campestris p.v. holcicola, Pseudomonas andropogonis, Puccinia purpurea, Macrophomina phaseolina, Perconia circinata, Fusarium monilifonne, Alternaria alternate, Bipolaris sorghicola, Helminthosporium sorghicola, Curvularia lunata, Phoma insidiosa, Pseudomonas avenae (Pseudomonas alboprecipitans), Ramulispora sorghi, Ramulispora sorghicola, Phyllachara sacchari, Sporisorium reilianum (Sphacelotheca reiliana), Sphacelotheca cruenta, Sporisorium sorghi, Sugarcane mosaic H, Maize Dwarf Mosaic Virus A & B, Claviceps sorghi, Rhizoctonia solani, Acremonium strictum, Sclerophthona macrospora, Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora philippinensis, Sclerospora graminicola, Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum, Pythium arrhenomanes, Pythium graminicola.

Insectos / nematodos patógenos: Chilo partellus; Spodoptera frugiperda; Helicoverpa zea; Elasmopalpus lignosellus; Feltia subterranea; Phvllophaga crinita ; Eleodes, Conous y Aeolus spp.; Oulema melanopus; Chaetocnema pulicaria; Sphenophorus maidis; Rhopalosiphum maidis; Siphaflava; Blissus leucopterus leucopterus; Contarinia sorghicola; Tetranychus cinnabarinus; Tetranychus urticae.

9.: Algodón:

Insectos / nematodos patógenos: Heliothis virescens; Helicoverpa zea; Spodoptera exigua; Pectinophora gossypiella; Anthonomus grandis grandis; Aphis gossypii; Pseudatomoscelis seriatus; Trialeurodes abutilonea; Lygus lineolaris; Melanoplus femurrubrum; Melanoplus differentialis; Thrips tabaci (onion thrips); Franklinkiella fusca; Tetranychus cinnabarinus; Tetranychus urticae.

10.: Arroz:

Insectos / nematodos patógenos: Diatraea saccharalis; Spodoptera frugiperda; Helicoverpa zea; Colaspis brunnea; Lissorhoptrus oryzophilus; Sitophilus oryzae; Nephotettix nigropictus; Blissus leucopterus leucopterus; Acrosternum hilare.

11.: Colza:

Insectos / nematodos patógenos: Brevicoryne brassicae; Phyilotreta cruciferae; Mamestra conjgurata; Plutella xylostella; Delia ssp..

"Proteína BI1" significa en el contexto de la invención polipéptidos que tienen al menos una secuencia con una homología preferida de al menos 80%, particularmente preferida de al menos 90%, muy particularmente preferida de al menos 95 %, y principalmente 100% con un motivo de consenso BI1 seleccionado del grupo que se compone de

a) H(L/I)KXVY

b) AXGA(Y/F)XH

c) NIGG

d) P(V/P)(Y/F)E(E/Q)(R/Q)KR

e) (E/Q)G(A/S)S(V/I)GPL

f) DP(S/G)(L/I)(I/L)

g) V(G/A)T(A/S)(L/I)AF(A/G)CF(S/T)

h) YL(Y/F)LGG, preferible EYLYLGG

i) L(L/V)SS(G/W)L(S/T)(I/M)L(L/M)W

j) DTGX(I/V)(I/V)E

En tal caso particularmente se prefiere el motivo de consenso BI h) YL(Y/F)LGG, muy particularmente preferido (EYLYLGG). Este motivo se caracteriza por proteínas vegetales BI1. Particularmente ocurren secuencias con homología hacia al menos 2 o 3 de estos motivos (a a j) en una proteína BI1, muy particularmente preferible al menos 4 o 5, lo más preferible todos los motivos a hasta j. Otros motivos de secuencia típicos BI1 pueden ser derivados por el experto en la materia de manera fácil a partir de la comparación de secuencias de proteínas BI1 – tal como se representa en las FIG. 1 o 6.

Principalmente preferidas para el uso en los métodos aquí divulgados son las proteínas BI1 que se codifican por un polipéptido que comprende al menos una secuencia seleccionada del grupo que se compone de:

(a): las secuencias según SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, o 38; y

(b): Secuencias que tienen una identidad de al menos 70%, más preferida de 80%, 85% o 90%, principalmente preferida de 95, 97 o 99% o más hacia una de las secuencias según SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, o 38.

Comprendidas por el término proteína BI están principalmente mutaciones naturales o artificiales de los polipéptidos BI1 según SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, y principalmente 38 así como polipéptidos homólogos o similares de otros organismos, preferiblemente plantas, que tienen además propiedades esencialmente iguales. Las mutaciones comprenden sustituciones, adiciones, deleciones, inversiones o inserciones de uno o varios residuos de aminoácido.

También están comprendidas formas de realización usando proteínas BI1 para organismos no vegetales como, por ejemplo, el ser humano (GenBank Acc.-No.: P55061), ratas (GenBank Acc.-No.: P55062) o drosófilas (GenBank Acc.-No.: Q9VSH3). Entre las proteínas BI1 vegetales y no vegetales los motivos conservados pueden identificarse fácilmente mediante comparaciones de secuencia (véase Alignment in Bolduc N. et al., Planta 216, 377 (2003); Fig. 1 y 6).

De esta manera, la presente invención también comprende, por ejemplo, aquellos polipéptidos que se obtienen por modificación de un polipéptido tal como se muestra en SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10 y 38.

Las secuencias de otras plantas que son homólogas a las secuencias BI1 divulgadas pueden encontrarse, por ejemplo, mediante

(a): búsqueda en banco de datos de organismos cuya secuencia genómica o de ADNc es conocida total o parcialmente, usando las secuencias BI1 proporcionadas como secuencia de búsqueda, o

(b): investigación de bibliotecas genómicas o de ADNc usando secuencias BI1 proporcionadas como sonda.

La investigación de bibliotecas de o de bibliotecas genómicas (usando por ejemplo una de las secuencias de ácido nucleico descritas en SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 , 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, y 37 o partes de las mismas como sonda), es un método corriente para el experto en la materia con el fin de identificar secuencias homólogas y similares o idénticas. En tal caso, las sondas derivadas de las secuencias de ácido nucleico según SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, y 37 tienen una longitud de al menos 20 bp, preferible de al menos 50 bp, particularmente preferible de al menos 100 bp, muy particularmente preferible de al menos 200 bp, lo más preferido de al menos 400 bp. Para la investigación de las bibliotecas también puede emplearse una cadena de ADN complementaria a las secuencias descritas en SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, y 37.

Por homología entre dos secuencias de ácido nucleico se entiende aquí la identidad de la secuencia de ácido nucleico a través de toda la longitud de la secuencia, la cual se calcula a su vez comparando con ayuda del algoritmo de programa GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Estados Unidos de América; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25, 3389 (1997)) ajustando los siguientes parámetros:

Gap Weight: 50 Length Weight: 3

Average Match: 10 Average Mismatch: 0

A manera de ejemplo, por una secuencia que tiene una homología de al menos 80 % a nivel de ácido nucleico con la secuencia SEQ ID NO 1, se entiende una secuencia SEQ ID NO 1 que según el algoritmo de programa de arriba con el conjunto de parámetros de arriba tiene una homología de al menos 80 %.

Por homología entre dos polipéptidos se entiende la identidad de la secuencia de aminoácidos a través de toda la longitud de secuencia que se calcula por comparación con ayuda del algoritmo de programa GAP (Wisconsin

Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Estados Unidos de América) ajustando los siguientes parámetros:

Gap Weight: 8 Length Weight: 2

Average Match: 2,912 Average Mismatch:-2,003

A manera de ejemplo, por una secuencia que tiene una homología de al menos 80 % a nivel de proteína con la secuencia SEQ ID NO 2, se entiende una secuencia que al comparar con la secuencia SEQ ID NO 2 según el algoritmo de programa de arriba con el conjunto de parámetros de arriba tiene una homología de al menos 80 %.

Las proteínas BI1 también comprenden aquellos polipéptidos que se codifican por secuencias de ácido nucleico que en condiciones estándar con una de las secuencias BI1 descritas por las SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 , 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, y 37, que hibridan una secuencia de ácido nucleico complementaria a la misma, o partes de las arriba mencionadas y que tienen propiedades esenciales iguales como las proteínas descritas bajo las SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, y 38.

La expresión "condiciones de hibridación estándar" debe entenderse de manera amplia y significa condiciones de hibridación estrictas como también menos estrictas. Tales condiciones de hibridación se describen, entre otras, en Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. et al., in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, páginas 9.31-9.57 o en Current Protocols en Molecular Biology, John Wiley & Sons,

N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. A manera de ejemplo, las condiciones durante el paso de lavado pueden seleccionarse del rango de condiciones restringido por aquellas con menos rigurosidad (con aproximadamente 2X SSC a 50°C) y aquellas con mayor rigurosidad (con aproximadamente 0.2X SSC a 50°C, preferible a 65°C) (20X SSC: citrato de calcio de 0,3M, Naci de 3M, pH 7.0). Además, la temperatura durante el paso de lavado puede incrementarse desde condiciones de menor rigurosidad a temperatura ambiente, aproximadamente 22 °C, a condiciones de mayor rigurosidad a aproximadamente 65°C. Ambos parámetros de concentración de sal y temperatura pueden variar simultáneamente o sino uno de los dos parámetros puede mantenerse constante mientras solo el otro varía. Durante la hibridación también pueden emplearse desnaturalizantes como, por ejemplo, formamida o SDS. En presencia de formamida al 50 %, la hibridación se efectúa preferiblemente a 42 °C.

"Propiedades esenciales" significa respecto de una proteína BI una o más de las siguientes propiedades:

(a): conferir o incrementar la resistencia a patógeno contra al menos un patógeno al elevar la cantidad o función de proteína de la dicha proteína BI en al menos un tejido de la planta, preferentemente al menos en la epidermis de la planta.

(b): no presentar una muerte celular inducida espontáneamente al aumentar la cantidad o función de la proteína de la dicha proteína BI.

(c): la propiedad en la co-transfección transitoria de Bax con dicha proteína BI1, por ejemplo en células HEK293, de inhibir significativamente la apoptosis inducida por BAX. Métodos correspondientes se han descrito (Bolduc N. et al., Planta 216, 377 (2003)).

(d): presentar cinco a siete dominios de transmembrana putativos dentro de la dicha proteína BI1.

(e): una localización preferencial en membranas celulares, en particular la membrana nuclear, la membrana ER y/o la membrana tilacoide.

En tal caso la manifestación cuantitativa de dichas propiedades de una proteína BI1 puede desviarse hacia arriba o hacia abajo en comparación con el valor obtenido para la proteína BI1 tal como se muestra en SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, o 38.

El término "incremento de la cantidad o función de la proteína BI1" debe entenderse en el sentido amplio y puede basarse en diferentes mecanismos celulares-biológicos.

"Cantidad de proteína" significa la cantidad de una proteína BI1 en el respectivo organismo, tejido, célula o compartimiento celular indicados.

"Incremento de la cantidad de proteína" significa el incremento cuantitativo de la cantidad de una proteína BI1 en el respectivo organismo, tejido, célula o compartimiento celular indicado - por ejemplo, por medio de uno de los métodos descritos abajo – en comparación con el tipo silvestre del mismo género y especie al cual este método no se ha aplicado, pero en condiciones por lo demás esencialmente iguales (como, por ejemplo, condiciones de cultivo,

edad de las plantas, etc.). El incremento es en este caso de al menos 10 %, preferible de al menos 30 % o de al menos 50 %, particularmente preferible de al menos 70 % o 100 %, muy particularmente preferible en al menos 200 % o 500 %, lo más preferible en al menos 1000 %. La determinación de la cantidad de proteína puede efectuarse mediante diferentes métodos corrientes para el experto en la materia. A manera de ejemplo, aunque no de manera restrictiva, pueden mencionarse: el método micro-Biuret (Goa J., Scand J. Clin. Lab. Invest. 5, 218 (1953)), el método Folin-Ciocalteu (Lowry O.H. et al., J Biol Chem 193, 265 (1951)) o la medición de la adsorción de CBB G250 (Bradford M.M., Analyt.Biochem. 72, 248 (1976)). También puede efectuarse una cuantificación mediante métodos inmunológicos como, por ejemplo, Western-Blot. Se ha descrito la preparación de anticuerpos BI1 correspondientes así como la realización de Western-Blot de BI1 (Bolduc N.et al., FEBS Lett 532, 111 (2002)). Una cuantificación indirecta puede realizarse mediante Northern-Blot, en cuyo caso la cantidad de ARNm por lo regular se correlaciona bien con la cantidad resultante de proteína. Se han descrito métodos correspondientes (entre otros Bolduc N. et al., Planta 216, 377 (2003); Matsumura H. et al., Plant J. 33,425 (2003)).

"Función" significa preferiblemente la propiedad de una proteína BI1 de reducir la muerte celular inducida espontáneamente y/o la propiedad de inhibir el efecto inductor de apoptosis de bax. Las funciones correspondientes se encuentran entre las propiedades esenciales de una proteína BI1.

"Incremento" de la función significa, por ejemplo, el aumento cuantitativo del efecto inhibidor de la muerte celular apoptótica inducida por Bax, el cual puede cuantificarse por medio de métodos corrientes para el experto en la materia (véase arriba). El incremento es en tal caso de al menos 10 %, preferible de al menos 30 % o al menos 50 %, particularmente preferible de al menos 70 % o 100 %, muy particularmente preferible en al menos 200 % o 500 %, lo más preferible en al menos 1000 %. Los métodos para incrementar la función comprenden además de los métodos arriba descritos para incrementar la cantidad de proteína (que por lo regular también aumentan la función) también comprenden a manera de ejemplo – aunque no de manera restrictiva - principalmente la introducción de mutaciones a una proteína BI1 o la inhibición de un inhibidor putativo de BI1, etc.

La cantidad de proteína BI1 puede elevarse, por ejemplo, aunque no de manera restrictiva, mediante los siguientes métodos:

Expresión recombinante o sobre-expresión de una proteína de BI1 introduciendo un casete de expresión recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína BI1 bajo el control de un promotor específico para el tejido, en cuyo caso el dicho promotor tiene actividad preferiblemente, esencialmente específico en la epidermis de la hoja, y/o no presenta actividad en el mesófilo.

El término "introducir" comprende todos los métodos que son adecuados para introducir el compuesto a introducir directa o indirectamente en una planta o en una célula, compartimiento, tejido, órgano o semillas de la misma, o para generarlo allí. Están comprendidos los métodos directos e indirectos. La introducción puede conducir a una presencia transitoria de dicho compuesto o sino también a una introducción duradera (estable) o inducible. Introducir comprende, por ejemplo, métodos como transfección, transducción o transformación.

En los casetes de expresión que se emplean se encuentra una molécula de ácido nucleico (por ejemplo que codifica una proteína BI1) en conexión funcional con al menos un promotor específico para el tejido, en cuyo caso dicho promotor tiene actividad preferida en esencia de manera específica en la epidermis de la hoja, y/o no presenta actividad en el mesófilo y en cuyo caso el promotor es heterólogo respecto de la secuencia de ácido nucleico a expresar, es decir no ocurre de manera natural combinado con la misma. Los casetes de expresión recombinantes pueden comprender opcionalmente otros elementos de control genéticos.

Por una conexión funcional se entiende, por ejemplo, la disposición secuencial de dicho promotor con la secuencia de ácido nucleico a expresar y opcionalmente otros elementos reguladores como, por ejemplo, un terminador, de tal modo que cada uno de los elementos regulatorios puede ejercer su función en la expresión recombinante de la secuencia de ácido nucleico. Para esto no es obligatoria una conexión directa en el sentido químico. Secuencias genéticas de control, como por ejemplo secuencias enhancer (promotoras), también pueden ejercer su función desde posiciones más alejadas o incluso desde otras moléculas de ADN sobre la secuencia diana. Se prefieren disposiciones en las que la secuencia de ácido nucleico a expresar de modo recombinante se posiciona detrás de la secuencia que funge como promotor, de modo que ambas secuencias se enlazan de manera covalente. En tal caso la distancia entre la secuencia promotora y la secuencia de ácido nucleico a expresar de manera recombinante es preferiblemente menor a 100 pares de bases, muy particularmente preferible menor a 50 pares de bases. La producción de una conexión funcional como también la producción de un casete de expresión recombinante pueden realizarse por medio técnicas corrientes de recombinación y de clonación tal como se han descrito arriba. Pero entre ambas secuencias también pueden posicionarse otras secuencias que tienen, por ejemplo, la función de un linker (enlazador) con determinados sitios de corte de enzima de restricción o de un péptido de señal. La inserción de secuencias también puede conducir a la expresión de proteínas de fusión.

El casete de expresión recombinante que se compone de una conexión de promotor y de secuencia de ácido nucleico a expresar también puede estar preferiblemente integrado en un vector e insertarse, por ejemplo, mediante transformación en un genoma vegetal.

Pero por un casete de expresión recombinante también pueden entenderse aquellas construcciones en las que el promotor se coloca antes de un gen BI1 endógeno, por ejemplo mediante una recombinación homóloga y de esta manera controla la expresión de la proteína BI1. De manera análoga la secuencia de ácido nucleico a expresar (por ejemplo que codifica una proteína BI1) se coloca de tal modo detrás de un promotor endógeno que presenta el mismo efecto. Ambos enfoques conducen a casetes de expresión recombinantes en el sentido de la invención.

Por un "promotor específico para tejido que tiene actividad esencialmente específica en la epidermis de la hoja" deben entenderse aquellos promotores que son adecuados para garantizar o para incrementar una expresión recombinante de una secuencia de ácido nucleico al menos en un tejido vegetal, con la condición que

(a): la expresión tiene lugar al menos en la epidermis y preferible no en el mesófilo o se mantiene no modificado esencialmente en el mesófilo, en cuyo caso otros tejidos diferentes de estos dos quedan fuera de consideración, y

(b): la expresión recombinante bajo control del promotor dicho en el tejido vegetal dicho es de al menos cinco veces, preferible de al menos diez veces, particularmente preferible de al menos cien veces la expresión frente a una planta de comparación.

Las secuencias de control genético también comprenden las regiones no traducidas 5’, intrones o la región 3’ no codificante de genes como, por ejemplo, el actin-1 intron, o los Adh1-S intrones 1, 2 y 6 (en general: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994)). Se ha demostrado que pueden desempeñar un rol significativo en la regulación de la expresión de genes. De esta manera se ha demostrado que las secuencias no traducidas 5’ pueden reforzar la expresión transitoria de genes heterólogos. A manera de ejemplo de reforzadores de traducción puede mencionarse la secuencia líder 5’ del virus mosaico de tabaco (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15, 8693 (1987)) y similares. También pueden promover la especificidad de tejido (Rouster J. et al., Plant J 15, 435 (1998)).

El casete de expresión recombinante puede comprender ventajosamente una o varias de las llamadas "secuencias enhancer" funcionalmente conectadas con el promotor, las cuales permite una alta expresión recombinante de la secuencia de ácido nucleico. Incluso en el extremo 3’ de las secuencias de ácido nucleico a expresar de modo recombinante pueden insertarse secuencias adicionales ventajosas, como otros elementos regulatorios o terminadores. Las secuencias de ácido nucleico a expresar de modo recombinante pueden estar contenidas en una

o varias copias en el constructo génico.

Señales de poliadenilación adecuadas como secuencias de control son señales de poliadenilación vegetales, preferentemente aquellas que corresponden esencialmente a señales de poliadenilación ADN-T de Agrobacterium tumefaciens, principalmente de terminador OCS (sintasa octopina) y el terminador NOS (nopalina-sintasa).

Como secuencias de control deben entenderse además aquellas que permiten una recombinación o inserción homóloga en el genoma de un organismo huésped o permiten el retiro del genoma. En la recombinación homóloga puede intercambiarse, por ejemplo, el promotor natural de un gen BI1 frente a un promotor preferido específico para tejido. Métodos como la tecnología cre/lox permiten un retiro del casete de expresión recombinante, específico para tejido, inducible en ciertas circunstancias, del genoma del organismo huésped (Sauer B., Methods. 14(4), 381(1998)). Aquí se insertan al gen diana determinadas secuencias que flanquean (secuencias lox), las cuales permiten un retiro por medio de la cre-recombinasa.

Un casete de expresión recombinante y los vectores derivados del mismo pueden contener otros elementos de función. El término elemento de función debe entenderse de una manera amplia y significa todos aquellos elementos que tienen una influencia en la producción, amplificación o función de los casetes de expresión recombinantes de la invención, vectores u organismos recombinantes. A manera de ejemplo pero no restrictiva pueden mencionarse:

(a) marcadores de selección que confieren una resistencia a un inhibidor de metabolismo tal como 2-desoxiglucosa-6-fosfato (WO 98/45456), antibióticos o biocidas, preferiblemente herbicidas tales como, por ejemplo, canamicina, G 418, bleomicina, higromicina, o fosfinotricina, etc.. Marcadores de selección particularmente preferidos son aquellos que confieren una resistencia contra herbicidas. A manera de ejemplo pueden mencionarse: secuencias de ADN que codifican fosfinotricinacetiltransferasas (PAT) e inactivan inhibidores de glutaminsintasa (genes bar y pat), 5-enolpiruvilshikimat-3-fosfatsyntasa (genes EPSP sintasa), que confieren una resistencia contra Glyfosat® (N-(fosfonometil)glicina), el gen gox que codifica enzimas que degradan Glyfosat® (glifosatoxidoreductasa), el gen deh (que codifica una dehalogenasa, que desactiva Dalapon®) así como genes bxn que codifican enzimas nitrilasa que degradan Bromoxynil, el gen aasa que confiere una resistencia contra el antibiótico apectinomicina, el gen de estreptomicinfosfotransferasa (SPT) que otorga una resistencia contra

estreptomicins, el gen de neomicinfosfotransferasa (NPTII) que confiere una resistencia contra canamicina o geneticidina, el gen de higromicinfosfotransferasa (HPT) que facilita una resistencia contra higromicina, el gen de acetolactatsintasa (ALS) que confiere una resistencia contra herbicidas de sulfonilurea (por ejemplo, variantes de ALS mutadas con, por ejemplo, la mutación S4 y/o Hra), así como el gen de acetolactatsintasa (ALS) que confiere una resistencia contra el herbicida imidazolinona.

(b): genes reporteros que codifican proteínas fácilmente cuantificables y garantizan a través de color propio o actividad enzimática una valoración de la eficiencia de transformación o del sitio o el momento de la expresión. Muy particularmente se prefieren en tal caso proteínas reporteras (Schenborn E., Groskreutz D., Mol, Biotechnol. 13(1), 29(1999)) como la "green fluorescent protein" (GFP) (Sheen et al., Plant Journal 8(5), 777 (1995); Haseloff et al., Proc. Natl. Acad.Sci.USA 94(6), 2122 (1997); Reichel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(12), 5888 (1996); Tian et al., Plant Cell Rep. 16, 267 (1997); WO 97/41228; Chui W.L. et al., Curr. Biol. 6, 325 (1996); Leffel S.M. et al., Biotechniques 23(5), 912 (1997)), la cloroamfenicoltransferasa, una luciferasa (Ow et al., Science 234, 856 (1986); Millar et al., Plant Mol. Biol. Rep. 10, 324 (1992)), el gen de aequorina (Prasher et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 126 (3), 1259 (1985)), la �-galactosidasa, el gen de R-locus (codifican una proteína la cual regula la producción de pigmentos de antocianina (coloración roja) en tejidos vegetales y de esta manera permite un análisis directo de la actividad promotora sin adición de adyuvantes adicionales o sustratos cromogénicos; Dellaporta et al. in Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium, 11 (1988)), muy particularmente preferida es la �-glucuronidasa (Jefferson et al., EMBO J. 6, 3901 (1987)).

(c): orígenes de replicación que aseguran la amplificación de los casetes de expresión recombinantes o de vectores de acuerdo con la invención en, por ejemplo, E. coli. A manera de ejemplo pueden mencionarse ORI (origin of DNA replication), el pBR322 ori o el P15A ori (Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

(d): Elementos que son necesarios para transformación de plantas mediadas por una agrobacteria como, por ejemplo el límite derecho o izquierdo del ADN-T o la región vir.

Para seleccionar células recombinadas de manera homóloga con éxito o también transformadas, por lo regular se requiere introducir adicionalmente un marcador que confiere a las células recombinadas con éxito una resistencia contra un biocida (por ejemplo un herbicida), un inhibidor de metabolismo como 2-desoxiglucosa-6-fosfato (WO98/45456) o un antibiótico. El marcador de selección permite la selección de las células transformadas de las no transformadas (McCormick et al., Plant Cell Reports 5, 81 (1986)).

La introducción de un casete de expresión recombinante en un organismo o en células, tejidos, órganos, partes o semillas del mismo (preferible en plantas o células vegetales, tejidos, órganos, partes o semillas), puede realizarse ventajosamente usando vectores en los que están contenidos los casetes de expresión recombinantes. El casete de expresión recombinante puede introducirse en el vector (por ejemplo un plásmido) por medio de sitios de corte de restricción adecuados. El plásmido generado se introduce primero a E.coli. E.coli transformadas correctamente se seleccionan, se cultivan y el plásmido recombinante se obtiene mediante métodos corrientes para el experto en la materia. El análisis de restricción y la secuenciación pueden servir para verificar el paso de clonación.

Los vectores pueden ser, a manera de ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagos, virus o también agrobacterias. La introducción del casete de expresión recombinante se describe por medio de vectores de plásmido. Se prefieren aquellos vectores que permiten una integración estable del casete de expresión recombinante en el genoma huésped.

La producción de un organismo transformado (o de una célula o tejido transformados) requiere que el ADN, ARN o la proteína correspondientes se introduzca a la célula huésped correspondiente.

Para esta operación que se denomina transformación (o transducción o transfección) se encuentra disponible una gran cantidad de métodos (Keown et al., Methods Enzymol. 185, 527 (1990); Jenes B. et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, editado por Kung S.D. y Wu R., Academic Press,

S. 128-143 (1993), así como en Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42, 205 (1991)).

De esta manera el ADN o ARN pueden introducirse a manera de ejemplo directamente por microinyección o por bombardeo con micropartículas recubiertas de ADN. La célula también puede permeabilizarse químicamente, por ejemplo con polietilenglicol, de tal modo que el ADN puede llegar a la célula mediante difusión. El ADN también puede introducirse mediante fusión de protoplastos con otras unidades que contienen ADN como minicélulas, células, lisosomas o liposomas. La electroporación es otro método adecuado para introducir ADN en el que las células se permeabilizan de modo reversible mediante un impulso eléctrico. Se han descrito métodos correspondientes (por ejemplo por Bilang et al., Gene 100, 247 (1991); Scheid et al., Mol. Gen. Genet. 228, 104 (1991); Guerche et al., Plant Science 52, 111 (1987); Neuhause et al., Theor. Appl. Genet. 75, 30 (1987); Klein et al.,

Nature 327, 70 (1987); Howell et al., Science 208, 1265 (1980); Horsch et al., Science 227, 1229 (1985); DeBlock et al., Plant Physiol 91, 694 (1989)).

En las plantas se utilizan los métodos descritos para la transformación y regeneración de plantas a partir de tejidos vegetales o células vegetales para la transformación estable. Métodos adecuados son, ante todo, la transformación de protoplastos mediante toma de ADN inducida por polietilenglicol, el método biolístico con el cañón de genes, el llamado método de "particle bombardment", la electroporación, la incubación de embriones secos en solución que contiene ADN y la microinyección.

Además de estas técnicas de transformación "directas", también puede realizarse una transformación mediante infección bacteriana por medio de Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes. La transformación mediada por agrobacteria es adecuada de la mejor manera para células de plantas dicotiledóneas. Los métodos se describen, por ejemplo, por Horsch R.B. et al., Science 225, 1229 (1985)).

Si se usan agrobacterias entonces el casete de expresión recombinante puede integrarse en plásmidos especiales ya sea en un vector intermedio (en inglés: shuttle or intermediate vector) o en un vector binario. Si se debe usar un plásmido Ti o Ri para la transformación, al menos el límite derecho, aunque la mayoría de las veces el límite derecho y el izquierdo, del ADN-T de plásmido Ti o Ri se conecta como región flanqueante con el casete de expresión recombinante a introducir.

Se prefiere usar preferiblemente vectores binarios. Los vectores binarios pueden replicar tanto en E.coli como también en agrobacteria. Por lo regular contienen un gen de marcador de selección y un enlazador (linker) o polienlazador (polilinker) flanqueado por la secuencia límite derecha e izquierda de ADN-T. Pueden transformarse directamente en agrobacteria (Holsters et al., Mol. Gen. Genet. 163, 181 (1978)). El gen marcador de selección permite una selección de agrobacterias transformadas y es, por ejemplo, el gen nptll, el cual confiere una resistencia contra canamicina. La agrobacteria que funge en este caso como organismo huésped debe contener ya un plásmido con la región vir. Este se requiere para transferir el ADN-T a la célula vegetal. Una agrobacteria transformada de esta manera puede usarse para transformar células vegetales. El uso de ADN-T para transformar células vegetales es investigado intensamente y se ha descrito (EP 120 516; Hoekemain: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, Chapter V; An et al., EMBO J. 4, 277 (1985)). Se conocen diferentes vectores binarios y se encuentran disponibles comercialmente de manera parcial, como por ejemplo pBI101.2 o pBIN19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12, 8711(1984) ; Clontech Laboratories, Inc. USA). Otros promotores adecuados para la expresión en plantas se han descrito (Rogers et al., Methods Enzymol. 153, 253 (1987); Schardl et al., Gene 61, 1 (1987); Berger et al., Proc. Natl. A-cad. Sci. USA 86, 8402 (1989)).

Las técnicas de transformación directas son adecuadas en principio para cada organismo y tipo de célula. En el caso de inyección o electroporación de ADN o ARN en células vegetales no se han puesto requisitos particulares al plásmido usado. Pueden usarse plásmidos sencillos como los de la serie pUC. Si deben regenerarse plantas completas de las células transformadas entonces se requiere que en el plásmido se encuentre un gen marcador seleccionable adicional.

Células transformadas de manera estable, es decir aquellas que contienen el ADN introducido integrado al ADN de la célula huésped, pueden seleccionarse de las no transformadas, por ejemplo si un marcador seleccionable es componente del ADN introducido. A manera de ejemplo, como marcador puede fungir cada gen que sea capaz de conferir una resistencia contra antibióticos o herbicidas (como canamicina, G 418, bleomicina, higromicina o fosfinotricina, etc.) (véase arriba). Células transformadas que expresan un gen de marcador tal están en capacidad de sobrevivir en presencia de concentraciones de un antibiótico o herbicida correspondientes que matan un tipo silvestre no transformado. Ejemplos de marcador de selección adecuado son los mencionados arriba. Tan pronto una célula vegetal transformada se hubo producido, puede obtenerse una planta completa usando métodos conocidos por el experto en la materia. En tal caso se parte de cultivos de callo a manera de ejemplo. De estas masas celulares no diferenciadas puede inducirse la formación de brotes y raíces de una manera conocida. Los retoños obtenidos pueden los retoños obtenidos pueden trasplantarse y cultivarse. El experto en la materia conoce métodos para regenerar partes de plantas y plantas enteras a partir de células vegetales. Para esto se usan métodos descritos, por ejemplo, por Fennell et al., Plant Cell Rep. 11, 567 (1992); Stoeger et al., Plant Cell Rep. 14, 273 (1995); Jahne et al., Theor. Appl. Genet. 89, 525 (1994). Las plantas obtenidas pueden cultivarse y/o cruzarse de manera usual. Deben cultivarse dos o más generaciones para asegurar que la integración genómica es estable y transmisible por herencia.

El método descrito puede combinarse ventajosamente con otros métodos que provocan una resistencia a patógeno (por ejemplo, contra insectos, hongos, bacterias, nematodos, etc.), resistencia al estrés u otro mejoramiento de las propiedades vegetales. Se mencionan ejemplos, entre otros, por Dunwell J.M., J. Exp. Bot. 51 (Spec No), 487 (2000).

"Recombinante" significa respecto de una secuencia de acido nucleico, de un casete de expresión o de un vector que contiene dicha secuencia de ácido nucleico o de un organismo transformado con dicha secuencia de ácido

nucleico, casete de expresión o vector, todas aquellas construcciones realizadas mediante métodos de ingeniería genética, en las que o bien

(a): la secuencia de ácido nucleico B11, o bien

(b): una secuencia de control genética conectada funcionalmente con la secuencia de ácido nucleico BI1, por ejemplo un promotor, o bien

(c): (a) y (b)

no se encuentran en su ambiente genético natural o se han modificado mediante métodos de ingeniería genética, en cuyo caso la modificación puede ser, a manera de ejemplo, una sustitución, adición, deleción, inversión o inserción de uno o varios residuos de nucleótidos. Ambiente genético natural significa el locus cromosómico natural en el organismo de origen o la presencia en una biblioteca genómica. En el caso de una biblioteca genómica, el ambiente genético natural de la secuencia de ácido nucleico se retiene preferiblemente aún al menos en parte. El ambiente flanquea la secuencia de ácido nucleico al menos en un lado y tiene una longitud de secuencia de al menos 50 bp, preferible de al menos 500 bp, particularmente preferible de al menos 1000 bp, muy particularmente preferible de al menos 5000 bp. Un casete de expresión de ocurrencia natural - por ejemplo la combinación de ocurrencia natural del promotor BI1 con el gen BI1 correspondiente – se vuelve un casete de expresión recombinante cuando éste se modifica mediante métodos no naturales, sintéticos ("artificiales") como, por ejemplo, una mutagenización. Se han descrito métodos correspondientes (US 5,565,350; WO 00/15815; también véase arriba).

Otro objeto se refiere a organismos recombinantes transformados con al menos una secuencia de ácido nucleico, casete de expresión o un vector, así como a células, cultivos celulares, tejidos, partes como, por ejemplo, hojas, raíces, etc. en organismos vegetales, o material de reproducción derivado de tales organismos. Organismo debe entenderse en el sentido amplio y significa organismos procariotas y eucariotas, preferible bacterias, levaduras, hongos, organismos animales y vegetales. Como organismos recombinantes, huéspedes o de partida, se prefieren ante todo vegetales según la definición arriba mencionada.

Otro objeto se refiere al uso de los organismos recombinantes de la invención y de las células, cultivos celulares derivados de éstos, partes como, por ejemplo, raíces, hojas, etc. en organismos vegetales recombinantes, y material de reproducción recombinante como semillas o frutas, para la producción de productos alimenticios o de forraje, farmacéuticos o productos químicos finos.

Además, una molécula de ácido nucleico que es antisense al ácido nucleico, un anticuerpo monoclonal que se enlaza específicamente con el polipéptido y un fungicida que contiene en una forma aplicada para su aplicación sobre plantas el ácido nucleico, el vector, principalmente un vector infeccioso, por ejemplo viral, el polipéptido de la invención, por ejemplo encapsulado o en un organismo infeccioso, preferentemente adecuado para transferir ácidos nucleico o para expresar genes en una célula, como una agrobacteria o un virus.

Además se ha descrito el uso de una molécula de ácido nucleico que codifica BI-1 o de una proteína BI-1 para producir una planta resistente a patógeno, preferentemente para producir una planta resistente a hongos o para producir un fungicida que la genere o para combatir o tratar plantas atacadas por patógenos o amenazadas por patógenos.

Secuencias

1.: SEQ ID NO: 1 : Secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína BI1 de cebada (Hordeum vulgare).

2.: SEQ ID NO: 2 : Secuencia de aminoácido que codifica una proteína BI1 de Cebada (Hordeum vulgare).

3.: SEQ ID NO: 3 : Secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína BI1 de Arabidopsis thaliana.

4.: SEQ ID NO: 4 : Secuencia de aminoácido que codifica una proteína BI1 de Arabidopsis thaliana.

5.: SEQ ID NO: 5 : Secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína BI1 de tabaco.

6.: SEQ ID NO: 6 : Secuencia de aminoácido que codifica una proteína BI1 de tabaco.

7.: SEQ ID NO: 7 : Secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína BI1 de arroz.

8.: SEQ ID NO: 8: Secuencia de aminoácido que codifica una proteína BI1 de arroz.

9.: SEQ ID NO: 9 : Secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína BI1 de colza.

10.: SEQ ID NO: 10 : Secuencia de aminoácido que codifica una proteína BI1 de colza.

11.: SEQ ID NO: 11 : Secuencia de ácido nucleico que codifica parte de una proteína BI1 de soja.

12.: SEQ ID NO: 12: Secuencia de aminoácido que codifica parte de una proteína BI1 de soja.

13.: SEQ ID NO: 13 : Secuencia de ácido nucleico que codifica parte de una proteína BI1 de soja.

14.: SEQ ID NO: 14: Secuencia de aminoácido que codifica parte de una proteína BI1 de soja.

15.: SEQ ID NO: 15 : Secuencia de ácido nucleico que codifica parte de una proteína BI1 de trigo.

16.: SEQ ID NO: 16 : Secuencia de aminoácido que codifica parte de una proteína BI1 de trigo.

17.: SEQ ID NO: 17 : Secuencia de ácido nucleico que codifica parte de una proteína BI1 de maíz.

18.: SEQ ID NO: 18 : Secuencia de aminoácido que codifica parte de una proteína BI1 de maíz.

19.: SEQ ID NO: 19 : Secuencia de ácido nucleico que codifica parte de una Proteína BI1 de trigo.

20.: SEQ ID NO: 20 : Secuencia de aminoácido que codifica parte de una proteína BI1 de trigo.

21.: SEQ ID NO: 21 : Secuencia de ácido nucleico que codifica parte de una proteína BI1 de maíz.

22.: SEQ ID NO: 22 : Secuencia de aminoácido que codifica parte de una proteína BI1 de maíz.

23.: SEQ ID NO: 23 : Secuencia de ácido nucleico que codifica parte de una proteína BI1 de maíz.

24.: SEQ ID NO: 24 : Secuencia de aminoácido que codifica parte de una proteína BI1 de maíz.

25.: SEQ ID NO: 25 : Secuencia de ácido nucleico que codifica parte de una Proteína BI1 de trigo.

26.: SEQ ID NO: 26 : Secuencia de aminoácido que codifica parte de una proteína BI1 de trigo.

27.: SEQ ID NO: 27 : Secuencia de ácido nucleico que codifica parte de una proteína BI1 de maíz.

28.: SEQ ID NO: 28 : Secuencia de aminoácido que codifica parte de una proteína BI1 de maíz.

29.: SEQ ID NO: 29 : Secuencia de ácido nucleico que codifica el promotor Patatin de patata.

30.: SEQ ID NO: 30 : Secuencia de ácido nucleico que codifica el promotor Germin 9f-3.8 de trigo.

31.: SEQ ID NO: 31 : Secuencia de ácido nucleico que codifica el promotor de Arabidopsis CAB-2.

32.: SEQ ID NO: 32 : Secuencia de ácido nucleico que codifica el promotor PPCZm1 de maíz.

33.: SEQ ID NO: 33 : Secuencia de ácido nucleico que codifica vector de expresión recombinante pUbiBI-1.

34.: SEQ ID NO: 34 : Secuencia de ácido nucleico que codifica vector de expresión recombinante pLo114UbiBI-1.

35.: SEQ ID NO: 35 : Secuencia de ácido nucleico que codifica vector de expresión recombinante pOXoBI-1.

36.: SEQ ID NO: 36 : Secuencia de ácido nucleico que codifica vector de expresión recombinante pLo114OXoBI-1.

37.: SEQ ID NO: 37: Secuencia de ácido nucleico que codifica proteína BI-1 de trigo.

38.: SEQ ID NO: 38: Secuencia de aminoácido que codifica proteína BI-1 de trigo.

39.: SEQ ID NO: 39: Secuencia de ácido nucleico que codifica PEN1 (= ROR2) de cebada.

40.: SEQ ID NO: 40: Secuencia de aminoácido que codifica PEN1 (= ROR2) de cebada.

41.: SEQ ID NO: 41: Secuencia de ácido nucleico que codifica PEN1 (= ROR2) de Arabidopsis thaliana.

42.: SEQ ID NO: 42: Secuencia de aminoácido que codifica PEN1 (= ROR2) de Arabidopsis thaliana.

43.: SEQ ID NO: 43: Secuencia de ácido nucleico que codifica SNAP34 de cebada.

44.: SEQ ID NO: 44: Secuencia de aminoácido que codifica SNAP34 de cebada.

45.: SEQ ID NO: 45: Secuencia de ácido nucleico que codifica BI-1 de soja.

46.: SEQ ID NO: 46: Secuencia de aminoácido que codifica BI-1 de soja.

47.: SEQ ID NO: 47: GFP- Primer 1 (véase abajo).

48.: SEQ ID NO: 48: GFP- Primer 2 (véase abajo).

Gráficos:

1. Fig. 1 a-d: Comparación de secuencias de proteína de diferentes proteínas BI-1e de plantas. AtBI-1: Arabidopsis; BnBI- 1: Brassica napus (colza); GmBI2: Glycine max (soja; variante 1); GmBI3: Glicina max (soja; variante 2); HVBI

1: Hordeum vulgare (cebada); NtBI-1: Nicotiana tabacum (tabaco); OsBI-1: Oryza sativa (arroz); TaBI11: Triticum aestivum (trigo, variante 1); TaBI18: Triticum aestivum (trigo, variante 2); TaBI5 nuevo: Triticum aestivum (trigo, variante 3); ZmBI14: Zea mays (maíz; variante 1); ZmBI16: Zea mays (maíz; variante 2); ZmBI33: Zea mays (maíz; variante 3); ZmBI8: Zea mays (maíz; variante 4); Consenso: secuencia consenso derivada del alineamiento.

2.: Fig. 2: mapa de vector para el vector pUbiBI-1 (Ubi: promotor ubiquitina; secuencia de ácido nucleico BI-1 que codifica proteína BI1 de cebada; ter: terminador de transcripción). Se indica además la localización de los sitios de corte de diferentes enzimas de restricción.

3.: Fig. 3: Mapa de vector para el vector pLO114UbiBI-1 (Ubi: Promotor-ubiquitina; secuencia de ácido nucleico BI-1 que codifica proteína BI1 de cebada; ter: terminador de transcripción). Se indica además la localización de sitios de corte de diferentes enzimas de restricción.

4.: Fig. 4: Mapa de vector para vector pOxoBI-1 (Oxo: promotor; BI-1 Secuencia de ácido nucleico que codifica proteína BI1 de cebada; ter: terminador de transcripción). Se indica además la localización de los sitios de corte de diferentes enzimas de restricción.

5.: Fig. 5: Mapa de vector para vector pLO114OxoBI-1 (Oxo: promotor de TaGermin 9f-2.8; secuencia de ácido nucleico BI-1 que codifica proteína BI1 de cebada; ter: terminador de transcripción). Se indica además la localización de los sitios de corte de diferentes enzimas de restricción.

6.: Fig. 6: Comparación de las secuencias de proteína de proteínas BI-1 de cebada (Hordeum vulgare, GenBank Acc.-No.: CAC37797), arroz (Oryza sativa, GenBank Acc.-No.: Q9MBD8), Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No.: Q9LD45) el ser humano (Homo sapiens, GenBank Acc.-No.: AAB87479). Aminoácidos mostrados en fondo negro son idénticos en todas las especies. Los aminoácidos mostrados en gris son idénticos solo en vegetales. Las barras muestran los siete dominios de transmembrana en HvBI-1.

7.: Fig. 7: Representación gráfica de la tasa de transformación dependiendo de las condiciones en la transformación balística de hojas de soja (A) y hojas de cebada (B). Para la determinación se usaron respectivamente 1.6 µg de ADN por disparo y para cada hoja de cebada partículas con diámetro de 0.6 µm y para soja con diámetro de 1 µm. El número de células transformadas se determinó 24 h después de la transformación.

8.: Fig. 8: Representación gráfica de la tasa de penetración de P. pachyrhizi en células de cebada transformadas transitoriamente con un constructo de sobreexpresión BI-1 en comparación con el control. Tres experimentos independientes entre sí son el fundamento de los valores. Como control se transformaron hojas de cebada con el constructo de gen reportero pGY1-GFP y el vector vacío. La tasa de penetración en las células transformadas con BI-1 es significativamente diferente de WT (P<0.05).

9.: Fig. 9: PCR para detectar el constructo GFP-BI-1 en las líneas de cebada transgénicas #6(1)E4L3P5 (T2), 1#6(2) E15L7P1 (T2), #6(2)E15L7P2 (T2) y #6(1)E8L1(T1) (variedad 'Golden Promise'). El PCR se realizó con ADN genómico de las plantas con los cebadores (primer) específicos de GFP. En plantas transgénicas positivas se

amplifica el GFP completo con 740 bp. Como control negativo sirvió ADN genómico del WT 'Golden Promise' (WT por Wild Type o tipo silvestre) o agua (NTC). Como control positivo (PK) se amplificó el GFP del plásmido pGY1-GFP.

10.: Fig. 10: Los datos obtenidos para la tasa de penetración de P. pachyrhizi en células de cebada transformadas transitoriamente con un constructo de sobreexpresión BI-1. Se muestran los datos fundamentales de la Fig. 8 (véanse también ejemplos de abajo).

11.: Fig. 11 A/B: esporas contadas y reacciones de célula en la interacción entre roya de soja y líneas de cebada transgénicas con el constructo de sobreexpresión GFP-BI-1 #6(1)E4L3P5(T2), 1#6(2)E15L7P1(T2), #6(2)E15L7P2 (T2) y #6(1)E8L1(T1) de la variedad 'Golden Promise‘. Como control sirvió el WT. Se inocularon hojas de plantas de 7 días con roya de soja, se fijó después de 24 h y se tinturó con azul de anilina para el conteo.

12.: Fig. 12: fracción relativa de la formación de papilas y de la RH después de la inoculación con P. pachyrhizi en hojas de cebada de las líneas transgénicas (variedad 'Golden Promise') #6(1)E4L3P5 (T2), 1#6(2)E15L7P1 (T2), #6(2)E15L7P2 (T2) y #6(1)E8L1(T1) en comparación con WT. Las hojas primarias se retiraron siete días después de sembrar las semillas de cebada inoculadas con P. pachyrhizi y se evaluaron 24 h después de la inoculación. Se representan los valores promedio del WT y de las líneas individuales. Las barras de error representan la desviación estándar. La formación de papilas relativa y la RH en las líneas transgénicas son significativamente diferentes del WT según prueba de Student, P < 0.001.

Ejemplos

Métodos generales:

La síntesis química de los oligonucleótidos puede efectuarse de manera conocida, por ejemplo, según el método de fosfoamidita (Voet, Voet, 2. Edición, Wiley Press New York, páginas 896-897). Los pasos de clonación realizados en el contexto de la presente invención como, por ejemplo, escisiones (clivajes) de restricción, electroforesis en gel de agarosa, purificación de fragmentos de ADN, transferencia de ácidos nucleicos en nitrocelulosa y membranas de nailon, conexión de fragmentos de ADN, transformación de células de E. coli, cultivo de bacterias, multiplicación de fagos y análisis secuencial de ADN recombinante, se describen por Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), ISBN 0-87969-309-6. La secuenciación de moléculas de ADN recombinante se efectúa con secuenciador de ADN por fluorescencia de láser de la empresa MWG-Licor según el método de Sanger (Sanger et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977)).

Ejemplo 1: Inoculación con P. pachyrhizi

Material de esporas adecuado (uredosporas) del germen patógeno Phakopsora pachyrhizi proviene de BASF Aktiengesellschaft. Para esto se usaron directamente esporas de plantas de soja de 2-3 semanas previamente inoculadas o sacudidas sobre lámina de aluminio y almacenadas sobre material secante (TROPAGel, Tropack, Lahnau) en la oscuridad a temperatura ambiente.

Para la preparación de una suspensión de esporas se lavaron las esporas de las hojas en Tween-H2O (0,1 %). El conteo de las esporas se efectuó por medio de una cámara de conteo de Thoma bajo el microscopio de luz. Para la inoculación se fijaron las hojas en H2O-Agar al 1 % con un anillo metálico. Para inoculación se usaron finalmente diferentes métodos: para la inoculación por aspersión se vertió la suspensión de esporas a una botella de aspersión operada con aire comprimido y se distribuyó de manera uniforme hasta que la superficie de la hoja estuvo bien humedecida. A fin de lograr una densidad de esporas superior, después que las hojas habían sido aspergidas con Tween-H2O se inocularon en seco en una 'columna de precipitación'. Para esto se coloca la columna sobre las placas con las hojas humedecidas. Las esporas jóvenes de las plantas de soja infectadas se soplan a la columna a través de una tapa de abertura. mediante la corriente de aire se fluidizan las esporas, se distribuyen finamente y se depositan sobre las hojas.

Con el fin de lograr densidades de inoculación superiores son agregación de las esporas, las hojas se recubrieron alternadamente con una suspensión de esporas y se retiraron después de 15 minutos de la suspensión (método de recubrimiento). Después de este tiempo había una adhesión suficiente de las esporas precipitadas. La inoculación de las hojas inoculadas se efectuó en una cámara con 25 °C y 71,2 % de humedad de aire, en promedio.

Con el fin de evaluar el curso de la infección microscópicamente, se tomaron muestras de hojas a las 0 horas post inoculación (hpi), 6 hpi, 24 hpi y 48 hpi y se tinturaron con diferentes métodos.

a) Tinturado de Coomassie

Para tinturar de Coomassie el material foliar infectado se recolectó y se dejó descolorando por una noche a temperatura ambiente. Para la microscopía se cubrió el material foliar con solución de Coomassie y después de 5 min se enjuagó la solución con un poco de agua. Inmediatamente después se evaluó la muestra al microscopio.

b) Tinturado de calcoflúor

Para la preparación de solución de tintura de calcoflúor se disolvieron 0,03% de calcoflúor White (blanco) (Sigma-Aldrich) en Tris/HCI de 50mM, pH 8,0 y Tween 20 al 0,01 %. Para tinturar las estructuras fúngicas extracelulares la hoja infectada se sumergió en la solución colorante por 30 segundos y a continuación se lavó con agua por 10 segundos. Las estructuras fúngicas tinturadas son fluorescentes por estímulo de UV azul claro.

c) Tinción de azul anilina

El material foliar se transfirió a tubos o tapas Falcon con solución decolorante y se incubó por una noche a temperatura ambiente. Después, la solución decolorante se retiró y las hojas se lavaron 2 x con agua. Para tinturar, las hojas se cubrieron por 1,5 – 2 horas en solución de tintura de azul de anilina y a continuación se vio directamente bajo el microscopio.

d) Tinturado de germen de trigo de Agglutinin-Alexa Fluor 488 (tinturado de WGA)

Para el tinturado de WGA de P. Pachyrhizi se pusieron las hojas de cebada inoculadas por 30 - 45 min a temperatura ambiente en KOH de 10 % (p/v). Las hojas de soja inoculadas se cortaron en piezas de 1 cm2 y se cocieron por 5 min en KOH de 10 % (p/v). A continuación se lavaron las hojas de cebada y de soja 5 x 3 - 5 min con amortiguador de pH (búfer) 1 x PBS. Para tinturar se puso el material foliar en solución de tintura WGA y por 10 min se infiltró a 100 mbar de presión residual. Después, el material se observó directamente bajo el microscopio o se almacenó en la solución de tintura a 4 °C en la osc uridad.

Ejemplo 2 Transformación balística de células vegetales

Para la sobreexpresión transitoria del inhibidor de Bax (para constructos y otros métodos véase la patente WO2004/081217) por transformación balística se pesaron 30 - 100 mg de partículas de oro, se re-suspendieron en 1 ml de EtOH al 70 % y se sacudieron por 3-5 min. Después de una incubación de 1 h a temperatura ambiente se efectuó una peletización mediante centrifugación (1 min a 10,000 rpm, microcentrífuga Eppendorf). Después se lavaron las partículas 3 x con agua estéril y a continuación se recogió en glicerina estéril 50 % (v/v) y se almacenó a 4 °C. La solución contenía al pesar 30 mg de partíc ulas de oro cerca de 25 mg/ml de oro. Antes del uso se sacudieron las partículas una vez más hasta una completa distribución y se sonificó por 15 segundos en baño de ultrasonido.

En general se preparó una cantidad de partículas de oro para al menos tres disparos. Hasta el paso de precipitación, la mezcla se sacudió vigorosamente con el mezclador vortex por algunos segundos. Para la precipitación de ADN sobre partículas de oro para 3 disparos, se tomaron 12.5 µl de la solución de partículas de oro – glicerina bien sacudidas y se mezclaron el ADN deseado (pGY1-BI-1, pGY1-GFP, pGY1, véase WO2004/081217). En tal caso por disparo y plásmido se emplearon 1.6 µg/µl de ADN. A continuación se efectuó la adición de 12.5 µl de solución de CaCl2 de 2.5 M y 5 µl de solución de espermidina de 0.1 M. La mezcla se sacudió por 3 minutos, se mezcló con 70 µl de etanol al 70% (v/v) y se invirtió con cuidado. Después de adicionar 70 µl de etanol al 100% se mezcló minuciosamente una vez más la mezcla mediante inversión y hasta 1 h se incubó a -20 °C. La partículas se peletizaron mediante centrifugación (1 min, 11000 rpm, microcentrífuga Eppendorf, Wesseling-Berzdort), se resuspendieron en 18 µl de etanol al 100 % y se distribuyeron tan uniformemente como fuera posible en un radio de cerca de 1 cm sobre los macro-portadores (Bio-Rad, Munich), que previamente habían sido lavados con etanol al 100 % y secados. Los macro-portadores se incubaron entonces a temperatura ambiente hasta que el etanol se evaporó completamente.

La transformación balística transitoria de hojas de cebada y soja se efectuó con el sistema Biolistic Particle Delivery System PDS-1000/He (Bio-Rad, Munich). Para la transformación se prefirió usar hojas de cebada de plantas de cebada de 7 días de edad (variedad 'Hanna') o las primeras hojas vegetativas o caducas (estadio de dos hojas) de plantas de soja (variedad 'Oxford'). Las hojas a transformar se pusieron en agua-agar al 1 % (p/v) y se fija con un anillo metálico.

Con el fin de determinar la proporción óptima entre la presión aplicada y la presión residual en la cámara de vacío para la transformación, se probaron diversas combinaciones presión/presión residual. En tal caso se usaron presiones residuales de 15-27 pulgadas de Hg y 'Rupture Disks' de 650 - 1800 psi de fuerza de ruptura teórica. Después del disparo la cámara volvió a ventilarse, se retiró la placa con las hojas y estas se incubaron al menos a 24 h antes de la microscopía o el tinturado.

Para la transformación balística de las hojas se usaron partículas de oro. En tal caso resultó que para cebada el disparo con partículas de 0,6 µm de diámetro era el más adecuado puesto que provocaban menos lesiones al tejido. En la transformación transitoria de soja se logró la más alta rata de transformación con las partículas de 1 µm.

Para la transformación transitoria exitosa las proporciones entre la presión a la aceleración de las partículas, la presión residual en la cámara de vacío y la distancia de la muestra a las partículas deben ajustarse entre sí. Con el fin de lograr esto, para hojas de cebada y de soja se ensayaron diferentes condiciones. En el caso de la soja demostró ser buena una presión de 900 psi con presión residual de 25 pulgadas de Hg en la cámara de vacío y una distancia de la muestra de 9 cm (FIG. 7A). En hojas de cebada se lograron los números de célula más altos con una presión de 1100 psi, presión residual de 25 pulgadas de Hg en la cámara de vacío y una distancia de las hojas a las partículas de 9 cm (FIG. 7B).

Para investigar los efectos de BI-1 sobre la interacción entre P. pachyrhizi y cebada se aplicó la transformación balística transitoria. Las hojas primarias de las plantas de cebada de 7 días de edad (variedad 'Hanna') se dispararon con constructos de sobreexpresión de BI-1 (pGY1-BI-1, Hückelhoven R.et al., 2001). Estos plásmidos tienen un promotor CAMV 35S que garantiza una expresión constitutiva de los genes. Como gen reportero fue bombardeado un constructo CAMV 35S-GFP junto con los plásmidos de expresión en las células (Schweizer P. Et al., MPMI 12, 647 (1999)). Para el control se usó el vector vacío pGY-1 junto con el constructo de gen reportero GFP. La inoculación con P. pachyrhizi se efectuó 24 h después de la transformación mediante precipitación a partir de una suspensión de esporas (método de recubrimiento 2-3 x 104 esporas/ml). Después de incubar por 18 h se evaluaron las interacciones después de tinturar con calcoflúor las estructuras fúngicas extracelulares. Se contaron las células que forman GFP que fueron penetradas por el hongo y células que forman GFP que fueron atacadas por el hongo, pero pudieron defenderse exitosamente de éste (o donde el hongo muere antes de una penetración). Adicionalmente se contaron todas las células que forman GFP. Para la evaluación se calcularon las tasas relativas de penetración respecto de las células transformadas totalmente que interactúan con roya de soja.

En el control fueron penetradas 53 % de las células transformadas que interactuaron con P. Pachyrhizi, lo cual se determinó mediante los ensayos, mientras que solo el 37 % de las células transformadas con BI-1 fueron penetrados (véase Tabla FIG. 10 y FIG. 8). Después de la evaluación, las células transformadas con BI-1 muestran una resistencia a la penetración significativamente elevada frente a P. pachyrhizi. Llamó la atención la observar bajo el microscopio que las células que forman BI-1 actuaban ostensiblemente más vital que las células que solo expresaban GFP.

Ejemplo 3 Transformación estable de cebada y detección del transgen GFP:BI-1

Para investigar más exactamente el influjo de BI-1 en la interacción de cebada con Phakopsora pachyrhizi se produjeron plantas de cebada establemente transformadas que sobreexpresaron una proteína de fusión GFP:BI-1. La transformación estable, usada para esto, mediada por agrobacteria es una técnica establecida desde hace años, sus métodos se publicaron ya en muchos artículos de reseñas (Cheng Z. et al., Plant Mol. Biol. 60, 583 (2004);Taylor et al., DNA & Cell Biology. 21(12), 963 (2002); Rakoczy-Trojanowska, Cellular & Molecular Biology Letters. 7(3), 849 (2002); Grabowska A., Acta Physiologiae Plantarum. 26(4), 451 (2004); Chesnokov V., Sel’skokhozyaistvennaya Biologiya. 1, 26 (2004). La transformación de especies monocotiledóneas como, por ejemplo, cebada, que era aún difícil en los años 1990s, se ha transformado entre tanto en una técnica estándar (Travella S. et al., Plant Cell Reports 23(12), 780 (2005); Murray F. et al., Plant Cell Reports 22(6), 397 (2004)).

Puesto que no se conocía de las plantas transgénicas resultantes si eran líneas homozigóticas, la presencia del constructo de sobre-expresión tenía que detectarse primero. Para este fin, el ADN genómico se aisló de una hoja de todas las plantas. Esto se hizo usando el kit DNeasy 96 Plant Kit (Quiagen, Hilden; según datos del fabricante).

La detección del constructo de sobre-expresión GFP-BI-1 se efectuó con cebadores específicos de GFP, se verificó por medio de PCR para la presencia del constructo. En la amplificación in vitro de DNA por PCR (Mullis & Faloona, 1987) se usó la fusión Hot Start (Finnzymes, Espoo).

Primer (cebador) 1: 5’-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’ (SEQ ID NO: 47)

Primer 2: 5’-TTGAACAACGATGTGCAAGACTCCTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’) (SEQ ID NO: 48)

Mezcla de PCR para detectar el transgen GFP:BI-1:

DMSO 0,6 µl

Amortiguador de pH (5x) (F-519 GC) 4 µl

ADN 3 µl dNTP-Mix (10mM cada uno) 0.4 µl Primer (cebador) 1 (20 pmol) 1 µl Primer 2 (20 pmol) 1 µl Hot Start Phusion F 540L 0,2 µl Agua 9.8 µl Se realizó PCR en un termociclador con cubierta calentable (Tgradient; Biometra, Göttingen).

Programa de PCR:

1 Initiale Denaturation: 98°C 30 sec

2. Denaturation: 98°C 10 sec 35 ciclos de los pa sos 2-4

3. Annealing: 58°C 30 sec

4. Elongation: 72°C 30 sec

5. Elongation: 72°C 5 min

6. Storage: 4°C

Usando métodos estándar, el ADN se separó y se analizó mediante electroforesis en gel en un gel de agarosa al 1% ([p/v], INVITROGEN, Karlsruhe; en 1 x TAE búfer) (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY) 1989).

En total seis plantas de las líneas transgénicas #6(2)E15L7P2 (T2) y #6(1)E8L1(T1) el fragmento de GFP de 740 bp y de esta manera el constructo no pudo detectarse. Los valores de estas plantas [planta 5, 10 y 19 de la línea #6(1)E8L1(T1) así como plantas 3, 11 y 12 de la línea #6(2)E15L7P2 (T2)] no se tomaron en consideración por lo tanto en los siguientes cálculos. (véase FIG. 9).

Ejemplo 4: Interacción de P. pachyrhizi con cebada transgénica que sobre-expresa inhibidor-1 Bax

Con el fin de verificar el efecto que incrementa la resistencia mediante sobre-expresión transitoria de BI-1, se estudió al microscopio la interacción entre P. pachyrhizi y plantas de cebada transgénicas de la variedad 'Golden Promise' (GP), que contienen un constructo de sobre-expresión GFP-BI-1 en comparación con el tipo silvestre (WT) de la variedad. Para la producción de las plantas transgénicas se usó una fusión GFP-BI-1 bajo el control del promotor constitutivo CAMV 35S y de esta manera se garantiza una expresión suficiente de la proteína.

Se cultivaron respectivamente 20 plantas del tipo silvestre y de cuatro líneas transgénicas #6(1)E4L3P5 (T2), 1#6(2)E15L7P1 (T2), #6(2)E15L7P2 (T2) y #6(1)E8L1(T1). De la línea #6(2)E15L7P2 (T2) solo germinaron 14 plantas de las semillas. Puesto que solo se encontraba disponible un material reproductivo limitado, los ensayos se realizaron con un número bajo de plantas de esta línea. Siete días después de sembrar se retiró la hoja primaria, se inoculó con P. Pachyrhizi con la ayuda de la columna de precipitación y se fijó en solución de descoloración por 24 horas después de la inoculación. Después de descolorar las hojas completamente, se tinturaron con azul de anilina. El azul de anilina se almacena en la estructura de callosa y tiñe de esta manera preferiblemente las papilas en las que la callosa se acumula y se entrecruza con otras sustancias poliméricas. Las células que han pasado por proceso similar a la apoptosis en células de mamíferos por medio de una reacción hipersensible (RH) después del tinturado con anilina también muestran una fluorescencia clara. En las hojas inoculadas de cebada se contó el número de las esporas, las esporas germinadas con tubos de germen que ya habían formado un apresorio y, como reacción celular, los apresorios con papilas que se encuentran abajo así como la RH. Grandes acumulaciones de esporas en las que ya no era posible una filiación de los apresorios a las esporas, no fueron contadas. En lo posible se contaron por hoja al menos 100 esporas con apresorios (véase Tabla in FIG. 11)

En el análisis microscópico de las hojas podía reconocerse una formación de papilas que estaba reforzada con frecuencia ostensiblemente en las líneas transgénicas. Por el contrario, en las plantas transgénicas la generación de

la RH en las células infectadas podía observarse rara vez. En el tipo silvestre en promedio 36 % de las células atacadas se formaron papilas como reacción de defensa, 45 % de las células reaccionaron con una RH. Por el contrario, la fracción de formación de papilas en las líneas transgénicas estuvo entre 50-60 %. También estaba ostensiblemente más bajo en comparación con el tipo silvestre la fracción de RH con 16-26 % (FIG. 12). Después de verificar con el llamado "Student Test" (t-Test) se elevó significativamente la formación de papilas en las líneas transgénicas frente al WT y la RH se redujo significativamente (P< 0.001). Según las observaciones en estos experimentos, BI-1 impide la muerte celular programada y promueve la formación de papilas de las células como defensa alternativa.

Ejemplo 5: Interacción de P. pachyrhizi con soja transgénica que sobre-expresa inhibidor -1 Bax

Se produjeron plantas de soja que sobreexpresan NtBI-1 de acuerdo con métodos conocidos per se y se inocularon con P. Pachyrhizi tal como se describió previamente. Las plantas de soja transformadas con NtBI-1 en comparación con las plantas de soja de tipo silvestre muestran una reducción ostensible de ataque con roya de soja. La reducción se encuentra en promedio en el rango de más de 30%.

Igualmente se suministraron planas de soja que se transformaron con NTBI-1 y con SELDA ty se inocularon con P. pachyrhizi tal como se describió previamente. Las plantas de soja transformadas con NtBI-1 + SELDA en comparación con las plantas de soja de tipo silvestre también muestran una reducción significativa de ataque con roya de soja. La reducción se encuentra aquí en promedio en el rango de más de 15 %.

PROTOCOLO DE SECUENCIAS

<110> BASF Plant Science GmbH

<120> método para incrementar la resistencia frente a hongos en plantas

<130> PF 58494

<150> EP 06122870.6

<141> 2006-10-24

<160> 48

<170> PatentIn Ver. 2.1

<210> 1

<211> 744

<212> ADN

<213> Hordeum vulgare

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(741)

<223> codificación para Proteína BI1

<400> 1

<210> 2

<211> 247

<212> PRT

<213> Hordeum vulgare

<400> 2

<210> 3

<211> 1067

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(741)

<223> codificación para Proteína BI1

<400> 3

<210> 4

<211> 247

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 4

<210> 5

<211> 1160

<212> ADN

<213> Nicotiana tabacum

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(747)

<223> codificación para Proteína BI1

<400> 5

<210> 6

<211> 249

<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum

<400> 6

<210> 7

<211> 1056

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(747)

<223> codificación para Proteína BI1

<400> 7

<210> 8

<211> 249

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 8

<210> 9

<211> 973

<212> ADN

<213> Brassica napus

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(741)

<223> codificación para Proteína BI1

<400> 9

<210> 10

<211> 247

<212> PRT

<213> Brassica napus

<400> 10

<210> 11

<211> 747

<212> ADN

<213> Glycine max

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(744)

<223> codificación para Proteína BI1

<400> 11

<210> 12

<211> 248

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 12

<210> 13

<211> 1510

<212> ADN

<213> Glycine max

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(777)

<223> codificación para Proteína BI-1

<400> 13

<210> 14

<211> 259

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 14

<210> 15

<211> 651

<212> ADN

<213> Triticum aestivum

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(651)

<223> codificación para Proteína BI-1

<400> 15

<210> 16

<211> 217

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

<400> 16

<210> 17

<211> 412 5 <212> ADN

<213> Zea mays

<220>

<221> CDS

<222> (3)..(410) 10 <223> codificación para Proteína BI1

<400> 17

<210> 18

<211> 136

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 18

<210> 19

<211> 345

<212> ADN

<213> Triticum aestivum

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(342)

<400> 19

<210> 20

<211> 114

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

<400> 20

<210> 21

<211> 403

<212> ADN 5 <213> Zea mays

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(402)

<223> codificación para Proteína BI1 10 <400> 21

<210> 22

<211> 134

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 22

<210> 23

<211> 410

<212> ADN 5 <213> Zea mays

<220>

<221> CDS

<222> (3)..(410)

<223> codificación para Proteína BI1 10 <400> 23

<210> 24

<211> 136

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 24

<210> 25

<211> 463

<212> ADN 5 <213> Triticum aestivum

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(462)

<223> codificación para Proteína BI1 10 <400> 25

<210> 26

<211> 154

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

<400> 26

<210> 27

<211> 388 5 <212> ADN

<213> Zea mays

<220>

<221> CDS

<222> (3)..(386) 10 <223> codificación para Proteína BI1

<400> 27

<210> 28

<211> 128

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 28

<210> 29

<211> 1737

<212> ADN 5 <213> Solanum tuberosum

<220>

<221> promotor

<222> (1)..(1737)

<223> promotor de patatina 10 <400> 29

<210> 30

<211> 1317 5 <212> ADN

<213> Triticum aestivum

<220>

<221> promotor

<222> (1)..(1317) 10 <223> promotor del gen germin 9f-3.8

<400> 30 <210> 31

<211> 959 5 <212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> promotor

<222> (1)..(959) 10 <223> promotor de CAB-2

<400> 31 <210> 32

<211> 445

<212> ADN 5 <213> Zea mays

<220>

<221> promotor

<222> (1)..(445)

<223> promotor de PPCZm1 10 <400> 32

<210> 33

<211> 5455

<212> ADN 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: vector de expresión recombinante pUbiBI-1

<400> 33

<210> 34

<211> 12633 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: vector de expresión recombinante pLo114ubiBI-1

<400> 34

<210> 35

<211> 5598

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: vector de expresión recombinante pOXoBI-1

<400> 35

<210> 36

<211> 12776

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: vector de expresión recombinante pLo114OxoBI-1

<400> 36

<210> 37

<211> 744

<212> ADN

<213> Triticum aestivum

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(741)

<223> codificación para TaBI-1

<400> 37

<210> 38

<211> 247

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

<400> 38

<210> 39

<211> 1293

<212> ADN

<213> Hordeum vulgare <220>

<221> CDS

<222> (173)..(1126)

<223> codificación para sintaxina de Hordeum vulgare subsp. vulgare (Ror2)

<400> 39

<210> 40

<211> 318

<212> PRT

<213> Hordeum vulgare

<400> 40

<210> 41

<211> 948 5 <212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(945)

10 <223> codificación para Arabidopsis thaliana syntaxin 121 (SYP121) / proteína relacionada con sintaxina (SYR1) (At3g11820)

<400> 41

<210> 42

<211> 315

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 42

<210> 43

<211> 1275

<212> ADN

<213> Hordeum vulgare

<220>

<221> CDS

<222> (80)..(1006)

<223> codificación para Hordeum vulgare subsp. vulgare SNAP-34

<400> 43

<210> 44

<211> 309

<212> PRT

<213> Hordeum vulgare

<400> 44

<210> 45

<211> 1398

<212> ADN

<213> Glycine max

<220>

<221> CDS

<222> (212)..(946)

<220>

<221> misc_feature

<222> <1367>..<1367>

<223> n es a, c, g, o t

<220>

<221> misc_feature

<222> <1368>..<1368>

<223> n es a, c, g, o t

<220>

<221> misc_feature

<222> <1369>..<1369>

<223> n es a, c, g, o t

<220>

<221> misc_feature

<222> <1370>..<1370>

<223> n es a, c, g, o t

<220>

<221> misc_feature

<222> <1371>..<1371>

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> <1372>..<1372>

<223> n es a, c, g, o t

<220>

<221> misc_feature

<222> <1373>..<1373>

<223> n es a, c, g, o t

<220>

<221> misc_feature

<222> <1374>..<1374>

<223> n es a, c, g, o t

<220>

<221> misc_feature

<222> <1375>..<1375>

<223> n es a, c, g, o t

<220>

<221> misc_feature

<222> <1376>..<1376>

<223> n es a, c, g, o t

<220>

<221> misc_feature

<222> <1377>..<1377>

<223> n es a, c, g, o t

<220>

<221> misc_feature

<222> <1378>..<1378>

<223> n es a, c, g, o t

<220> <221> misc_feature

<222> <1379>..<1379>

<223> n es a, c, g, o t

<220> 5 <221> misc_feature

<222> <1380>..<1380>

<223> n es a, c, g, o t

<220>

<221> misc_feature 10 <222> <1381>..<1381>

<223> n es a, c, g, o t

<220>

<221> misc_feature

<222> <1382>..<1382> 15 <223> n es a, c, g, o t

<220>

<221> misc_feature

<222> <1383>..<1383>

<223> n es a, c, g, o t 20 <220>

<221> misc_feature

<222> <1384>..<1384>

<223> n es a, c, g, o t

<400> 45

<210> 46

<211> 244

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 46

<210> 47

<211> 20 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> GFP-Cebador 1

<400> 47 10 atggtgagca agggcgagga 20

<210> 48

<211> 43

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 15 <220> <223> GFP-Cebador 2

<400> 48 ttgaacaacg atgtgcaaga ctccttgtac agctcgtcca tgc PF 58494

5 92

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para generar o elevar una resistencia frente a al menos un hongo biotrófico del género Phakopsora en una planta o una parte de una planta, en cuyo caso la parte de una planta comprende un tejido o una célula, el cual comprende los pasos:

(a)

elevar la cantidad o función de la proteína de al menos una proteína inhibidora – 1 Bax (BI1) en la planta o al menos una parte de una planta frente a la cantidad o función de proteína en la planta de partida o en sus partes, en cuyo caso

(i)

se transforman células vegetales de manera estable con un casete de expresión recombinante que contiene una secuencia de ácido nucleico, que codifica una proteína BI1, en conexión funcional con un promotor, en cuyo caso el promotor es heterólogo respecto de la secuencia de ácido nucleico que codifica proteína BI1;

(ii)

se regenera la planta a partir de las células vegetales; y

(iii) la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína BI1 se expresa en una cantidad, en al menos un tejido o por un tiempo, de manera suficiente para generar o elevar una resistencia a hongos en la planta en contra de un hongo biotrófico del género Phakopsora, y

(b)

selección de la planta o de una parte de una planta en la cual en comparación con la planta de partida o su parte genera o eleva una resistencia contra al menos un hongo biotrófico del género Phakopsora, en cuyo caso la proteína BI1 se codifica por un polipéptido que comprende al menos una secuencia seleccionada del grupo que se compone de:

(a)

las secuencias según SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, o, 38; y

(b)

secuencias que tienen una identidad de al menos 70% a una de las secuencias según SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, o 38, en cuyo caso la planta es soja.
2. Método según la reivindicación 1, en cuyo caso la proteína BI1 comprende al menos una secuencia que tiene una identidad de al menos 80% con al menos un motivo de consenso BI1 seleccionado del grupo que se compone de

(a)

H(L/I)KXVY,

(b)

AXGA(Y/F)XH,

(c)

NIGG,

(d)

P(V/P)(Y/F)E(E/Q)(R/Q)KR,

(e)

(E/Q)G(A/S)S(V/I)GPL,

(f)

DP(S/G)(L/I)(I/L),

(g)

V(G/A)T(A/S)(L/I)AF(A/G)CF(S/T),

(h)

YL(Y/F)LGG,

(i)

L(L/V)SS(G/W)L(S/T)(I/M)L(L/M)W, y

(j)

DTGX(I/V)(I/V)E.
3.

Método según una de las reivindicaciones precedentes, en cuyo caso el promotor heterólogo es un promotor específico para tejido.
4.

Método según una de las reivindicaciones precedentes, en cuyo caso la expresión de la proteína BI1 se incrementa en una planta al menos en la epidermis, preferible esencialmente de modo específico para el tejido en la epidermis y/o esencialmente no se incrementa en el mesófilo.
5.

Método según una de las reivindicaciones precedentes, en cuyo caso la planta tiene además un fenotipo resistente mlo, o la expresión o la función de MLO, RacB y/o NaOx se inhibe al menos en la epidermis o se reduce

en comparación con una planta de control y/o la expresión o función de PEN2, SNAP34 y/o PEN1 se eleva al menos en la epidermis, en comparación con una planta de control.

Figura 5

Figura 7 Figura 8 Figura 9 Figura 10