ES2389849T3 - Ccomposiciones de péptidos HSP60 y antígenos víricos para vacunación y diagnóstico - Google Patents

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Abstract

Composición de vacuna que comprende un antígeno y un adyuvante de péptido sintéticoKKARVEDALHATRAAVEEGV (Ec27; SEC ID Nº: 76).

Description

Composiciones de péptidos hsp60 y antígenos víricos para vacunación y diagnóstico
Campo de la invención
La presente invención se refiere a vacunas que proporcionan inmunogenicidad potenciada que comprenden péptidos HSP60 conjugados con o mezclados con un antígeno vírico. La presente invención identifica adicionalmente un epítope novedoso y procedimiento de potenciación de la inmunogenidad de un antígeno.
Antecedentes de la invención
A pesar de los sorprendentes logros en el desarrollo de vacunas para ciertas infecciones víricas (es decir, poliomielitis y sarampión) y la erradicación de virus específicos de la población humana (por ejemplo, viruela), las enfermedades víricas siguen siendo problemas médicos y para la salud pública importantes. De hecho, los virus son responsables de varias enfermedades “emergentes” (o re-emergentes) (por ejemplo, encefalitis del Nilo occidental y fiebre del dengue), y la infección vírica es una causa de morbilidad y mortalidad significativa en el mundo.
La presencia de la ayuda de linfocitos T adecuados es importante para la construcción de potentes vacunas. Las vacunas que inducen tanto linfocitos T colaboradores como CTL pueden ser más eficaces que aquellas que sólo inducen CTL. De hecho, la importancia de la colaboración entre linfocitos T CD4+ y CD8+ se enfatiza en la vacunación terapéutica contra infección vírica crónica (Zajac y col., 1998; Matloubian y col., 1994).
Clásicamente, las vacunas se fabrican introduciendo organismos muertos o atenuados en el huésped junto con adyuvantes adecuados parar iniciar la respuesta inmunitaria normal a los organismos mientras que, deseablemente, se evitan los efectos patogénicos del organismo en el huésped. El enfoque padece las muy conocidas limitaciones porque raramente es posible evitar la respuesta patogénica debido a la complejidad de la vacuna que incluye no sólo el determinante antigénico de interés, sino muchos materiales perjudiciales relacionados y sin relacionar, cualquier número de los cuales puede, en algunos o todos los individuos, inducir una reacción no deseable en el huésped.
Por ejemplo, las vacunas producidas en la forma clásica pueden incluir antígenos competitivas que son perjudiciales para la respuesta inmunitaria deseada, antígenos que incluyen respuestas inmunitarias no relacionadas, ácidos nucleicos del organismo o cultivo, endotoxinas y constituyentes de composición y fuente desconocida. Estas vacunas, generadas a partir de materiales complejos, tienen inherentemente una probabilidad relativamente alta de inducir respuestas competitivas incluso del antígeno de interés.
HSP60 pertenece a una familia de moléculas de chaperonas altamente conservada a lo largo de la evolución; una molécula de HSP60 similar está presente en todas las células, procariotas y eucariotas. La molécula de HSP60 humana se designó anteriormente HSP65, pero ahora se ha designado HSP60 en vista de la información del peso molecular más precisa; por cualquier designación, la proteína es la misma. Aparentemente, no puede existir célula sin la capacidad para expresar HSP60. HSP60 de mamífero es altamente homóloga a los cognados bacterianos, que muestran aproximadamente el 50% de identidad de aminoácidos (Jindal y col., 1989). Por tanto, HSP60 es compartida por el huésped y sus parásitos, y es inmunogénico, de reactividad cruzada y se expresa universalmente en inflamación. Además, HSP60 es bien reconocida por el sistema inmunitario (Konen Waisman y col., 1999, Konen Waisman y col., 1995) y es una parte del conjunto de auto-moléculas para las que existe autoinmunidad naturalmente; HSP60 es miembro del homúnculo inmunológico (Cohen, 1992). Choque térmico, IFNy, infección bacteriana o vírica, e inflamación, todos producen la presentación de epítopes de HSP60 endógenos en moléculas de la clase II del MHC que conducen a la activación de linfocitos T específicos para HSP60, incluso en individuos sanos (Anderton y col., 1993; Hermann y col., 1991; Koga y col., 1989).
La patente europea EP 262 710 y la patente de EE.UU. nº 5.154.923 describen péptidos que tienen una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 171-240 y 172-192, respectivamente, de un polipéptido de 64 kD de Mycobacterium bovis BCG, que son útiles como inmunógenos que inducen resistencia a artritis autoinmunitaria y enfermedades autoinmunitarias similares.
La solicitud de patente PCT nº WO 90/10449 describe un péptido designado p277 que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 437-460 de la molécula de HSP65 humana que es útil como inmunógeno que induce resistencia a diabetes mellitus dependiente de insulina (DMDI). Un péptido de control, designado p278, correspondiente a las posiciones 458-474 de HSP65 humana, no indujo resistencia a DMDI.
Lussow y col. (1990) mostraron que la sensibilización de ratones con Mycobacterium tuberculosis var. bovis (BCG) vivo e inmunización con el péptido sintético de la malaria repetitivo (NANP)40 conjugado con derivado de proteína purificada (PPD) condujo a la inducción de altos títulos y de larga duración de anticuerpos IgG anti-péptido. Después, Lussow y col. (1991) mostraron que las proteínas de choque térmico (HSP) micobacterianas de 65 kDa (tipo GroEL) y 70 kDa (tipo ADNK) actuaron de moléculas de vehículo en ratones, previamente sensibilizadas con Mycobacterium tuberculosis var. boris (bacilo de Calmette-Guerin, BCG), para la inducción de altos títulos y de larga duración de IgG contra el péptido sintético de la malaria repetitivo (NANP)40. Los anticuerpos anti-péptido se indujeron cuando el péptido de la malaria, conjugado con la HSP micobacteriana, se administró en ausencia de cualquier adyuvante.
Barrios y col. (1992) han mostrado que ratones inmunizados con péptidos u oligosacáridos conjugados con la HSP de 70 kDa produjeron altos títulos de anticuerpos IgG en ausencia de cualquier sensibilización previa con BCG. La respuesta de anticuerpos anti-péptido persistió durante al menos 1 año. Este efecto de vehículo libre de adyuvante de la HSP de 70 kDa fue dependiente de linfocitos T, ya que no se indujeron ni anticuerpos IgG anti-péptido ni anti70 kDa en ratones nu/nu atímicos. La inmunización previa de ratones con la HSP de 65 kDa o 70 kDa no tuvo ningún efecto negativo sobre la inducción de anticuerpos IgG anti-péptido después de la inmunización con conjugados de HSP-péptido en ausencia de adyuvantes. Además, la preinmunización con la HSP de 65 kDa podría sustituir al BCG en proporcionar sensibilización eficaz para la inducción de anticuerpos anti(NANP)40. Finalmente, tanto HSP de 65 kDa como de 70 kDa actuaron de moléculas de vehículo para la inducción de anticuerpos IgG a oligosacáridos meningocócicos del grupo C, en ausencia de adyuvantes, sugiriendo que el uso de HSP como vehículos en construcciones conjugadas para la inducción de anticuerpos anti-péptido y anti-oligosacárido podría ser de valor en el diseño de nuevas vacunas para uso eventual en seres humanos.
La patente de EE.UU. nº 5.736.146 desvela conjugados de antígenos escasamente inmunogénicos con un vehículo de péptido sintético que comprende un epítope de linfocitos T derivado de la secuencia de la proteína de choque térmico humana HSP65, o un análogo de la misma, pudiendo dicho péptido o análogo aumentar sustancialmente la inmunogenicidad del antígeno escasamente inmunogénico. La patente 146 desvela conjugados de un péptido correspondiente a las posiciones 458-474 y 437-453 de HSP60 humana o de ratón y homólogos de la misma con una amplia variedad de antígenos que incluyen péptidos, proteínas y polisacáridos tales como polisacárido bacteriano (por ejemplo, polisacárido capsular (CPS) Vi de Salmonella typhi) y antígenos derivados del virus del VIH
o de antígeno de la malaria.
La patente de EE.UU. nº 5.869.058 desvela conjugados de antígenos escasamente inmunogénicos, por ejemplo, péptidos, proteínas y polisacáridos, con un vehículo de péptido sintético que comprende un epítope de linfocitos T derivado de la secuencia de HSP65 de E. coli (GroEL), o un análogo de la misma, pudiendo dicho péptido o análogo aumentar sustancialmente la inmunogenicidad del antígeno escasamente inmunogénico. Un péptido adecuado según la invención es Pep278e, que se corresponde con las posiciones 437-453 de la molécula de HSP65 de E. coli.
El citomegalovirus humano (HCMV) es un virus de ADN bicatenario ubicuo del grupo de los betaherpesvirus; es endémico en todas las poblaciones humanas. En América del Norte, el HCMV infecta a aproximadamente el 50% de la población fuera de los centros urbanos y hasta al 90% de la población dentro de ciudades. La enfermedad del HCMV presenta dos problemas médicos principales: primero, es la infección vírica congénita más común, causando anomalías congénitas que incluyen mal desarrollo del sistema nervioso central; hasta el 25% de lactantes infectados asintomáticos desarrollarán secuelas neurológicas. Segundo, el HCMV se re-activa en pacientes inmunodeprimidos.
Una fase aguda autolimitante de la infección vírica, fases persistentes y latentes normalmente caracterizan la patogénesis de la infección por HCMV en el huésped inmunodeprimido. El desenlace clínico de la infección por HCMV se determina por la capacidad de los individuos infectados para organizar respuestas inmunitarias humorales y mediadas por linfocitos T protectoras. En huéspedes inmunodeprimidos, que incluyen personas con infección por VIH, pacientes con cáncer y receptores de aloinjerto, la infección por HCMV primaria o reactivación de un virus latente produce enfermedad por HCMV multiorgánica asociada a altas tasas de morbilidad y mortalidad. Estas graves consecuencias clínicas enfatizan la necesidad de vacunas eficaces contra el HCMV para prevenir no sólo la infección primaria, sino también para limitar o prevenir la reactivación.
Actualmente no hay vacuna protectora disponible para el CMV. Los fármacos antivíricos actualmente disponibles que eligen como diana la replicación del ADN vírico son eficaces, pero presentan significativa toxicidad para el huésped y una alta tasa de resistencia espontánea.
El virus del Nilo occidental es un miembro de los Flaviviridae similares a alfa. El genoma del flavivirus es un ARN de sentido positivo monocatenario de aproximadamente 11 kb de longitud que contiene una región sin traducir en 5' (5'UTR); una región codificante que codifica las tres proteínas estructurales víricas; siete proteínas no estructurales, designada NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5; y una región sin traducir en 3' (3'UTR). Las proteínas estructurales víricas incluyen las proteínas de la cápside (C), premembrana/membrana (prM) y de la envuelta (E). Las proteínas estructurales y no estructurales se traducen como una única poliproteína. Entonces, la poliproteína se procesa por proteasas celulares y víricas.
El virus del Nilo occidental afecta a aves, además de a reptiles y mamíferos, junto con el hombre. El virus del Nilo occidental se transmite a aves y mamíferos por las picaduras de ciertos mosquitos (por ejemplo, Culex, Aedes, Anopheles). La transmisión directa puede producirse del sujeto infectado por VNO al sujeto sano por transmisión oral (presa y transmisión por calostro) y transmisión portada por sangre/órgano. Extendido en África, la zona geográfica del VNO también incluye ahora Australia, Europa, Oriente medio, Asia occidental y EE.UU. El virus del Nilo occidental puede producir una fuerte fiebre autolimitante, dolores corporales, hinchazón del cerebro, coma, parálisis y muerte.
No hay tratamiento eficaz para la enfermedad. Varias vacunas contra el VNO diferentes están ahora en diversas etapas de desarrollo y prueba (Monath, 2001; Pletnev y col., 2003; Tesh y col., 2002; Hall y col., 2003), pero presentemente no está disponible una vacuna humana autorizada para su prevención. La única forma actualmente eficaz para proporcionar resistencia inmediata al VNO es por administración pasiva de anticuerpos protectores (Casadevall, 2002). El control de mosquitos es considerado actualmente la estrategia práctica para combatir la extensión de la enfermedad, pero la pulverización eficaz es difícil de realizar en áreas urbanas. Claramente se necesita una vacuna eficaz para proteger a poblaciones en riesgo.
Sigue existiendo la necesidad de vacunas mejoradas que confieran protección contra infecciones víricas usando epítopes aislados. Además, se necesitan epítopes aislados para pruebas de diagnóstico mejoradas.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona composiciones adecuadas para vacunación contra infecciones víricas.
Según un aspecto, la presente invención proporciona una composición de vacuna que comprende un antígeno y un adyuvante de péptido sintético KKARVEDALHATRAAVEEGV (Ec27; SEC ID Nº: 76). Según otro aspecto, el antígeno está seleccionado del grupo que consiste en: un péptido, un derivado de péptido, una proteína, un polisacárido y un anticuerpo. Según otro aspecto más, el antígeno es un antígeno vírico. Según un aspecto, el antígeno está covalentemente unido a dicho adyuvante de péptido sintético. Según otro aspecto, la composición de vacuna comprende una mezcla del antígeno y dicho adyuvante de péptido sintético. Según otro aspecto más, dicho antígeno vírico tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEC ID Nº: 11-12, 21 y 25-44 y análogos, homólogos, derivados y sales del mismo. Según un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de potenciamiento de la inmunogenicidad de un antígeno que comprende conjugar covalentemente el antígeno con un vehículo de péptido sintético de SEC ID Nº: 76.
La inmunogenicidad potenciada de dicho antígeno vírico puede medirse por al menos uno de lo siguiente: título del suero de anticuerpos dirigidos a dicho antígeno vírico; proliferación de linfocitos T en presencia de dicho antígeno vírico; secreción de citocinas inducida por dicho antígeno vírico; lisis mediada por linfocitos T específicos de células infectadas por virus; y reducción de la carga vírica detectable.
La invención puede proporcionar conjugados que comprenden un antígeno vírico covalentemente unido a un vehículo de péptido sintético que comprende un epítope de linfocitos T de HSP60. El vehículo de péptido sintético puede ser el vehículo de péptido conocido p458, un péptido limitado a la clase II del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) derivado de HSP60 murina (aa 458-474, también designado previamente p278m), o un análogo o derivado del mismo. El vehículo de péptido sintético puede ser Ec27, un péptido novedoso derivado de HSP60 de E. coli (GroEL, aa 391-410).
Según la presente invención, ahora se ha desvelado que los conjugados que comprenden un vehículo de péptido sintético seleccionado de Ec27 covalentemente unido a un antígeno vírico son inesperadamente eficaces en conferir inmunidad contra infecciones víricas. Ahora se ha demostrado por primera vez que estos conjugados potencian significativamente inmunidad eficaz contra el virus de tanto ADN como ARN, infecciones latentes y agudas y, cuando se combinan, con epítopes víricos limitados a CTL, linfocitos B y MHC II.
Los principios de la invención se ejemplifican por dos sistemas de modelo para infecciones víricas. La infección por el citomegalovirus de ratón (MCMV) en ratones es un sistema de modelo establecido para examinar infección humana con citomegalovirus humano (HCMV), un virus de ADN que se caracteriza por una infección latente tras una fase aguda autolimitante de infección vírica. La infección por el virus del Nilo occidental (VNO) en ratones sirve de modelo para la infección vírica aguda del VNO en seres humanos.
Puede proporcionarse un conjugado que comprende un antígeno vírico covalentemente unido a un vehículo de péptido sintético que comprende un epítope de linfocitos T de HSP60 en el que dicho vehículo de péptido sintético está seleccionado del grupo de péptidos que consiste en:
(a)
NEDQKIGIEIIKRTLKI (p458h; SEC ID Nº: 1),
(b)
NEDQKIGIEIIKRALKI (p458; SEC ID Nº: 2),
(c)
EGDEATGANIVKVALEA (p458mt; SEC ID Nº: 3),
(d)
NEDQNVGIKVALRAMEA (p458e; SEC ID Nº: 4),
(e)
un análogo de p458h (SEC ID Nº: 1) que tiene al menos el 70% de la característica eléctrica y de hidrofilia/hidrofobia de HSP60 humana de la posición 458 a la posición 474, pudiendo dicho péptido o análogo aumentar sustancialmente la inmunogenicidad del antígeno vírico cuando el conjugado se administra in vivo, y derivados del mismo,
(f)
KKARVEDALHATRAAVEEGV (Ec27; SEC ID Nº: 76) y análogos, fragmentos y derivados del mismo.
El péptido sintético puede ser un análogo de p458h (SEC ID Nº: 1): 458NEDQKIGIEIIKRTLKI474 en el que el residuo E459 es tanto E como D; el residuo D460 es tanto D como E; el residuo K462 es tanto K como R u ornitina (Orn); el residuo I463 es tanto I como L, V, M, F, norleucina (Nle) o norvalina (Nva); el residuo I465 es tanto I como L, V, M, F, Nle o Nva; el residuo E466 es tanto E como D; el residuo I467 es tanto I como L, V, M, F, Nle o Nva; el residuo I468 es tanto I como L, V, M, F, Nle o Nva; el residuo K469 es tanto K como R como Orn; el residuo R470 es tanto R, K como Orn; el residuo L472 es tanto L como I, V, M, F, Nle o Nva; el residuo K473 es tanto K como R u Orn; y el residuo I474 es tanto I como L, V, M, F, Nle o Nva.
Un péptido adyuvante novedoso derivado de la proteína HSP60 de E. coli (GroEL) es útil para las composiciones y procedimientos de la invención. El péptido adyuvante novedoso, en el presente documento designado Ec27, tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 391-410 de GroEL (correspondientes al número de acceso gi:45686198 sin el primer residuo de metionina, SEC ID Nº: 83), del siguiente modo: KKARVEDALHATRAAVEEGV (SEC ID Nº: 76). El péptido humano correspondiente presenta el 80% de homología, que tiene la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 86, del siguiente modo: KKDRVTDALNATRAAVEEGI (Ec27h). También pueden contemplarse análogos, fragmentos, derivados, conjugados y sales de Ec27.
Ahora se ha demostrado por primera vez que el péptido Ec27 aumenta significativamente la inmunogenicidad de una amplia matriz de antígenos que incluyen, pero no se limitan a, antígenos víricos, antígenos bacterianos y antígenos de mamífero, por ejemplo, antígenos de péptidos víricos, polisacáridos bacterianos y anticuerpos. Se encontró sorprendentemente que Ec27 aumenta la inmunogenicidad de antígenos cuando se conjuga covalentemente con el antígeno, además de cuando se mezcla con el antígeno. Inesperadamente, Ec27 podría incluso aumentar adicionalmente la inmunogenicidad de antígenos de la invención conjugados con los vehículos p458.
En otra realización, la invención proporciona además composiciones de vacuna que comprenden un antígeno y un adyuvante de péptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEC ID Nº: 76. En diversas realizaciones, el antígeno está seleccionado del grupo que consiste en: un péptido, un derivado de péptido, una proteína, un polisacárido (por ejemplo, un polisacárido bacteriano) y un anticuerpo. En una realización, la composición de vacuna comprende un conjugado del adyuvante de péptido y dicho antígeno. En realizaciones alternativas, dicha composición de vacuna comprende una mezcla de dicho adyuvante de péptido y dicho antígeno.
En otro aspecto, el antígeno vírico usado en los conjugados y composiciones comprende al menos un epítope seleccionado de: un epítope de CTL (un epítope de linfocitos T limitado a MHC I), un epítope de linfocitos B y un epítope de linfocitos T limitado a MHC II.
El antígeno vírico usado en los conjugados puede derivarse de cualquier virus de interés. En ciertas realizaciones, el virus pertenece a la familia herpesviridae. El virus puede pertenecer a la subfamilia de betaherpesvirus. El antígeno vírico puede derivarse de la proteína del gen temprano inmediato 1 (IE-1) de un virus que pertenece a herpesviridae. El antígeno vírico puede comprender un epítope de CTL. El virus puede ser CMV. El antígeno vírico puede derivarse de la proteína del gen temprano inmediato 1 (IE-1) del CMV. El antígeno vírico puede comprender un epítope de CTL.
El virus puede pertenecen a la familia Flaviviridae. El virus puede pertenecer al género flavivirus. El virus pueden seleccionarse del grupo que consiste en: virus del Nilo occidental (VNO), virus de la fiebre amarilla, virus de la encefalitis de san Luis, virus de la encefalitis del valle de Murray, virus de Kunjin, virus de la encefalitis japonesa, virus del dengue tipo 1, virus del dengue tipo 2, virus del dengue tipo 3 y virus del dengue tipo 4. El antígeno vírico puede derivarse del virus del Nilo occidental (VNO).
El antígeno vírico puede derivarse de la proteína de la envuelta (E) de un virus que pertenece a la familia flaviviridae. El antígeno vírico puede derivarse del dominio E3 de dicha proteína. Dicho antígeno vírico puede comprender un epítope de linfocitos B y un epítope limitado a MHC II. El antígeno vírico puede derivarse de la proteína de la envuelta (E) del VNO. El antígeno vírico puede derivarse del dominio E3 de dicha proteína. Dicho antígeno vírico puede comprender un epítope de linfocitos B y un epítope limitado a MHC II.
Otras realizaciones de la presente invención se refieren a antígenos de péptidos víricos aislados novedosos que se usan en conjugación con los vehículos de la invención para la vacunación antivírica como se especifica en el presente documento.
Puede proporcionarse un novedoso antígeno de péptido derivado del dominio E3 del VNO de la proteína E, designada por este documento p15, que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 355369 de la proteína E. Dependiendo de la cepa de VNO particular, este antígeno novedoso tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: LVTVNPFVSVATANS (SEC ID Nº: 11) y LVTVNPFVSVATANA (SEC ID Nº: 12); y análogos, homólogos, fragmentos y derivados de la misma. Pueden proporcionarse proteínas, péptidos y conjugados que comprenden dicho antígeno. El péptido puede tener una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEC ID Nº: 34-35 (véase la Tabla 1).
Puede proporcionarse un antígeno de péptido homólogo de p15 derivado del dominio E3 de la proteína de la envuelta de un flavivirus seleccionado del grupo que consiste en: el virus del Nilo occidental (VNO), virus de la fiebre amarilla, virus de la encefalitis de san Luis, virus de la encefalitis del valle de Murray, virus de Kunjin, virus de la encefalitis japonesa, virus del dengue tipo 1, virus del dengue tipo 2, virus del dengue tipo 3 y virus del dengue tipo
4. El antígeno homólogo de p15 puede tener una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEC ID Nº: 25-33 y 36-44 (véase la Tabla 1), y análogos, homólogos, fragmentos y derivados del mismo.
Puede proporcionarse un segundo antígeno de péptido del VNO novedoso derivado de la proteína E, denotada en el presente documento p17, que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: YIVVGRGEQQINHHWHK (SEC ID Nº: 21) y análogos, homólogos, fragmentos y derivados de la misma.
En otra realización se proporcionan conjugados que comprenden un vehículo de péptido sintético de la invención y un antígeno vírico que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEC ID Nº: 11-12 y 34-35 y análogos, homólogos, fragmentos y derivados del mismo covalentemente unido a un vehículo de péptido sintético de la invención. El conjugado puede tener una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEC ID Nº: 13-16, 65-66 y 77-78. En otras realizaciones, los conjugados de la invención comprenden un antígeno vírico que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEC ID Nº: 25-33 y 36-44 covalentemente unido a un vehículo de péptido sintético de la invención. El conjugado puede tener una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEC ID Nº: 56-64 y 67-75. En otras realizaciones, los conjugados de la invención comprenden un antígeno vírico que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEC ID Nº: 21 covalentemente unido a un vehículo de péptido sintético de la invención. El conjugado puede tener una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEC ID Nº: 23-24 y 79 (véase la Tabla 4).
En otro aspecto, la invención proporciona composiciones de vacuna que comprenden los conjugados de la invención y un vehículo, adyuvante, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto, la invención proporciona composiciones de vacuna que comprenden un antígeno vírico en mezcla con Ec27 y un vehículo, adyuvante, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto, la invención proporciona composiciones de vacuna que comprenden los novedosos antígenos de péptidos víricos aislados de la invención y un vehículo, adyuvante, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto más, la invención proporciona procedimientos para aumentar la inmunogenicidad de un antígeno vírico que comprende ligar el antígeno con un vehículo de péptido sintético de la invención.
Pueden proporcionarse procedimientos para inmunizar un sujeto en necesidad de los mismos contra una infección vírica que comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición de vacuna que comprende un conjugado de la invención y un vehículo, adyuvante, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.
La composición de vacuna puede administrarse a dicho sujeto antes de la exposición de dicho sujeto al virus o después de exposición de dicho sujeto a dicho virus.
Los procedimientos pueden comprender:
(a)
aislar un antígeno vírico que comprende al menos un epítope seleccionado de: un epítope de CTL, un epítope de linfocitos B y un epítope limitado a MHC II;
(b)
conjugar dicho antígeno vírico con un vehículo de péptido sintético de la invención para formar un conjugado de péptido-vehículo; y
(c)
administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición de vacuna que comprende el conjugado y un vehículo, adyuvante, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Las composiciones y procedimientos pueden ser adecuados para vacunar un sujeto seleccionado de un grupo que consiste en: seres humanos, mamíferos no humanos y animales no mamíferos.
Otros aspectos pueden referirse a kits y procedimientos de diagnóstico que utilizan los novedosos antígenos de péptidos víricos aislados para determinar la exposición de un sujeto a un flavivirus.
Puede proporcionarse un kit de diagnóstico que comprende al menos un antígeno de péptido vírico de la invención y medios para detectar si el antígeno de péptido está específicamente unido a una muestra biológica adecuada.
La invención puede proporcionar procedimientos para diagnosticar la exposición de un sujeto a un flavivirus y para diagnosticar una infección por flavivirus en un sujeto, que comprende las etapas de:
(a)
poner en contacto una muestra biológica adecuada con un antígeno vírico que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEC ID Nº: 11-12, 25-44 y 21 y análogos, homólogos, derivados y sales del mismo en condiciones tales que pueda producirse una reacción inmunitaria;
(b)
determinar el grado de unión de antígeno específica a la muestra biológica, en el que un nivel
significativamente superior al nivel obtenido para una muestra obtenida de un sujeto no infectado es indicativo de exposición del sujeto al flavivirus.
Los kits y procedimientos de diagnóstico pueden ser útiles para el diagnóstico diferencial de una infección por flavivirus.
Estas y otras realizaciones de la presente invención serán evidentes conjuntamente con las figuras, descripción y reivindicaciones que siguen.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Cinética de infección por MCMV en bazo y glándula salival (GS) de ratones BALB/c. Los ratones se expusieron i.p. a 5 x 104 ufc de MCMV. A. Se midieron los títulos de virus infeccioso en bazo y glándula salival en diferentes momentos de tiempo después de la infección (calculado como log10 ufc/0,1 g de tejido). Los datos representan el promedio de 5 experimentos. B. Amplificación por PCR del producto de 356 pb de ADN de gB del MCMV en bazo y glándula salival en diferentes momentos de tiempo después de la infección. Los resultados son de 1 experimento representativo de 3 realizados.
Figura 2. La eficacia de la vacuna de p458-89pep. A. El diseño experimental. B. Títulos de MCMV infecciosos en glándula salival 14, 21 y 28 días después de la exposición. Los datos representan el título promedio (±EE) de las glándulas salivales de 3 ratones individuales de cada grupo. En glándulas salivales de ratones inmunizados con p458-89pep, los títulos de virus en el día 28 (asteriscos) estuvieron por debajo de la detección (es decir, < 2 log10 ufc/0,1 g de tejido). C. Amplificación por PCR del producto de 356 pb de gB del MCMV. Se extrajo ADN mensajero de glándulas salivales de ratones inmunizados en el día 28 después de la exposición al MCMV. Inmunización con: a. IFA solo sin exposición; b. IFA solo; c. 89pep; d. p458-89pep; e. control-89pep; f. mezcla de PCR sin ADN mensajero (control de PCR negativo). Los resultados son de 1 experimento representativo de 2 realizados.
Figura 3. Secreción de IFN de cultivos de células del bazo y glándula salival (GS) de ratones infectados por MCMV. Se prepararon cultivos de células del bazo (Fig. 3A) y células mononucleares de la glándula salival fraccionada (Fig. 3B) en diferentes días después de la infección por el virus como se describe en los procedimientos. La secreción de IFNy en sobrenadante se midió por ELISA después de 3 días de cultivo con (cuadrados) o sin (círculos) estimulación de 89pep (10 µg/ml) in vitro. Los datos representan el promedio (±EE) de 3 experimentos.
Figura 4. Niveles de IFNy de cultivos de células del bazo después de la vacunación con p458-89pep.Se prepararon cultivos de células del bazo 10 días después de la vacunación con los diversos péptidos o después de la exposición de ratones sin tratamiento previo al MCMV. Un grupo de control recibió IFA sin ningún péptido. La secreción de IFNy en sobrenadantes se midió por ELISA después de 3 días de estimulación in vitro con p458, 89pep (10 µg/ml) o sin estimulación (Sin estim). Los datos representan el promedio de 6 experimentos (±EE). * p : 0,05 en comparaci6n con p458-89pep, prueba de la t bilateral.
Figura 5. Células del bazo positivas para IFNy después de la vacunación con p458-89pep. Se prepararon cultivos de células del bazo 7 días después de la vacunación con diversos péptidos, o después de la exposición de ratones sin tratamiento previo al MCMV. Después de 5 días de estimulación in vitro con 89pep o sin estimulación (Sin estim), las células se tiñeron para marcadores de CD4 (Fig. 5A) o CD8 (Fig. 5B) y para IFNy. Los números (27,43, 9,89 y 0,41) son el porcentaje de células IFNy+ en células CD8+ totales. Los resultados son de 1 experimento representativo de 2 realizados.
Figura 6. Actividad de CTL en cultivos de células del bazo después de la vacunación con p458-89pep.Se prepararon cultivos de células del bazo 7 días después de la inmunización con diversos péptidos o después de la exposición de ratones sin tratamiento previo al MCMV. Un grupo de control recibió IFA sin ningún péptido. La actividad de CTL se midió después de 6 días de estimulación in vitro con 89pep (10 µg/ml). Las células diana fueron P815 pulsadas con 89pep (1 µg/ml). La relación E:T es 25:1. Los datos representan el promedio (±EE) de 3 experimentos diferentes.
Figura 7. Células mononucleares de glándulas salivales positivas para IFNy 28 días después de la exposición al MCMV de ratones vacunados. Se vacunaron ratones y luego se expusieron al MCMV. Las células se tiñeron para CD8 y para IFNy. Sin estimulación (Sin estim) o estimulación con 89pep (89pep) se refiere a la presencia de 89pep durante la incubación de 8 h con etapa de parada de golgi en el protocolo de
ICCS para IFNy. Los resultados son de 1 experimento representativo de 2 realizados.
Figura 8. Reconocimiento de péptidos por IVIG-IL. Se recubrieron pocillos con los diferentes péptidos (1 µg/pocillo) o con Ag de VNO (dilución 1:700). Después de bloquear y lavar, IVIG-IL se añadió a dilución 1:40 y la unión se detectó como se describe en los procedimientos (ELISA). La referencia de ELISA (sin péptido en el pocillo, DO 0,078 a DO 0,120 en diferentes experimentos) se restó de cada punto experimental. Los resultados son el promedio de 4 experimentos de ELISA independientes. Barras, ±DE.
Figura 9. Reconocimiento de péptidos por suero de ratones infectados por VNO. Se recubrieron pocillos con los diferentes péptidos (1 µg/pocillo) o con Ag de VNO (dilución 1:700). Después de bloquear y lavar se añadieron sueros murinos sin tratamiento previo (columnas grises) o infectados por VNO (columnas blancas) a dilución 1:40 y la unión se detectó como se describe en los procedimientos (ELISA). Los resultados son de 1 experimento representativo de 3 realizados. Cada punto experimental se realizó por triplicado. Barras, ±DE.
Figura 10. Proliferación de esplenocitos de ratones infectados por VNO tras la estimulación in vitro con los diferentes péptidos. Se infectaron ratones con 66 ufc de VNO. Seis días después, los bazos se recogieron y los esplenocitos se cultivaron con los diferentes péptidos (10 µg/ml) o con ConA (5 µg/ml) durante 3 días. La proliferación de células derivadas de ratones sin tratamiento previo (columnas grises) o infectados por VNO (columnas blancas) se midió usando el procedimiento de WST-1. Los resultados son el promedio de 3 experimentos de proliferación independientes. Barras, ±DE.
Figura 11. Ab anti-VNO en los sueros de ratones inmunizados con diferentes péptidos o con Ag de VNO.
(A) Se inmunizaron ratones 3 veces con los diferentes péptidos o Ag de VNO a intervalos de 7 días. Siete días después de la 3ª inmunización, los ratones se sangraron y los sueros se probaron del siguiente modo. Los pocillos se recubrieron con Ag de VNO (dilución 1:700). Después de bloquear y lavar, los diferentes sueros se añadieron a dilución 1:40 y la unión se detectó como se describe en los procedimientos (ELISA). Los resultados son el promedio de 4 experimentos de ELISA independientes. Barras, ±DE. (B) Isotipos de anticuerpos anti-VNO.
Figura 12. Proliferación de esplenocitos de ratones inmunizados con p32 tras la estimulación in vitro con los diferentes péptidos. Se inmunizaron ratones 3 veces con p32 a intervalos de 7 días. Siete días después de la 3ª inmunización, los bazos se recogieron y los esplenocitos se cultivaron con los diferentes péptidos o Ag de VNO (10 µg/ml) o con ConA (5 µg/ml) durante 3 días. La proliferación celular se midió usando el procedimiento de WST-1. Los resultados son el promedio de 3 experimentos de proliferación independientes. Barras, ±DE.
Figura 13. Secreción de IFN en los bazos de ratones vacunados con p32 en el día 7 después de la inmunización. Se inmunizaron ratones 3 veces con p32 a intervalos de 7 días. Siete días después de la 3ª inmunización, los bazos se recogieron y los esplenocitos se cultivaron con los diferentes péptidos o Ag de VNO (10 µg/ml) o con ConA (5 µg/ml) durante 3 días. Los niveles de IFNy en los sobrenadantes se midieron como se describe en los procedimientos. Los resultados son el promedio de 4 experimentos de proliferación independientes. Barras, ±DE.
Figura 14. p458-89pep reduce la carga vírica de ratones infectados por MCMV. A. El diseño experimental.
B. Amplificación por PCR del producto de 363 pb del IE-1 del MCMV.
Figura 15. Cargas víricas tras la inmunización de p32 y la exposición a VNO.
Figura 16. Proliferación y secreción de IFN-y de esplenocitos de ratones inmunizados por conjugados Ec27-p15 tras la estimulación in vitro con p15.
Figura 17. Reconocimiento específico de p15 (A, B) y p17 (B) por sueros de pacientes humanos infectados por VNO.
Figura 18. Respuesta proliferativa de células del ganglio linfático de BALB/c a péptidos GroEL solapantes después de la inmunización con bacterias E. coli (A) o GroEL (B)
Figura 19. Respuesta proliferativa de células del ganglio linfático de BALB/c a inmunización con el péptido Ec27
Figura 20. Respuesta proliferativa de diferentes cepas de ratón a inmunización con el péptido Ec27.Se inmunizaron ratones BALB/c (A), BALB/k (B), y BALB/b (C) y SJL (D) s.c. con 20 mg del péptido Ec27 emulsionado en IFA. Diez días después, las células del ganglio linfático (2 x 105 células por pocillo) se evaluaron para la proliferación específica para el péptido Ec27 (círculos negros), el péptido Ec35 (círculos blancos), o el péptido de receptor acetilcolina 259-271 (triángulos blancos). Después de 96 horas de incubación, la incorporación de 3H-timidina se evaluó como una medida de la proliferación. Los resultados se muestran como cpm medias de pocillos cuádruples. Se indican las desviaciones estándar.
Figura 21. Efecto adyuvante del péptido Ec27. (A) reactividad anti-PAb-246; (B) reactividad anti-p53.
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona novedosos conjugados que comprenden un antígeno vírico ligado covalentemente a un vehículo de péptido sintético que comprende un epítope de linfocitos T de HSP60. El vehículo es Ec27, un péptido novedoso derivado de E. coli GroEL (aa 391-410). La invención proporciona composiciones de vacuna que comprenden los conjugados de la invención.
La presente invención desvela inesperadamente que una composición de vacuna que comprende un conjugado de un antígeno vírico y un vehículo de péptido derivado de Ec27 es altamente eficaz en conferir inmunidad protectora contra una infección vírica in vivo. Ahora se ha demostrado por primera vez que Ec27 potencia la inmunidad eficaz incluso para conjugados que comprenden antígenos que no son escasamente inmunogénicos. Se encontró que el vehículo de péptidos de la invención potenciaba la inmunogenicidad del antígeno vírico al menos dos veces en comparación con el péptido sin el péptido HSP60.
La presente invención se basa, en parte, en estudios de la vacunación con el conjugado de p458-antígeno vírico para el tratamiento de una infección por citomegalovirus (CMV) crónica (latente) asociada a persistencia del virus en las glándulas salivales. Un conjugado que comprende 89pep, un antígeno derivado de la proteína del gen 1 temprano inmediato (IE-1) del CMV murino (MCMV), fusionado con p458, fue más eficaz que 89pep en inducir secreción de IFNy específica para 89pep y actividad de CTL específica. El péptido quimérico p458-89pep indujo secreción de IFNy sostenida en la glándula salival específica para 89pep y solo esta inmunización se asoció a la eliminación del virus de la glándula salival. La presente invención también se basa, en parte, en estudios de la vacunación con el conjugado de p458-antígeno vírico y Ec27-antígeno vírico contra una infección vírica aguda por el virus del Nilo occidental (VNO). Un conjugado que comprende p15, un antígeno novedoso derivado de la proteína de la envuelta (E) del VNO, fusionado con p458 pudo, tras la inmunización, reducir significativamente la mortalidad asociada a la infección, mientras que la inmunización con p15 solo sólo pudo afectar moderadamente la tasa de mortalidad. El conjugado fue más eficaz que el antígeno vírico solo en inducir anticuerpos neutralizantes específicos para VNO, además de la proliferación de linfocitos T específica para VNO y la secreción de IFNy. El conjugado de Ec27-p15 también fue más eficaz que p15 solo en inducir la proliferación de linfocitos T específica para p15 y secreción de IFNy.
Por tanto, los conjugados de la invención demuestran en el presente documento que son eficaces contra tanto virus de ADN como de ARN, infecciones latentes y agudas y, cuando se combinan, con epítopes víricos limitados a CTL, linfocitos B y MHC II.
Se encontró que Ec27, un péptido adyuvante novedoso derivado de la proteína HSP60 de E. coli (GroEL), aumentaba significativamente la inmunogenicidad de una amplia matriz de antígenos que incluye, pero no se limita a, antígenos víricos, antígenos bacterianos y antígenos de mamífero, por ejemplo, antígenos de péptidos víricos, polisacáridos bacterianos y anticuerpos. Se encontró sorprendentemente que Ec27 aumentaba la inmunogenicidad de antígenos cuando se conjugaron covalentemente con el antígeno, además de cuando se mezclaron con el antígeno. Inesperadamente, Ec27 podría incluso aumentar adicionalmente la inmunogenicidad de antígenos conjugados con los vehículos de p458. Ec27 tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 391-410 de GroEL (correspondiente al número de acceso gi:45686198 sin el primer residuo de metionina, SEC ID Nº: 83), del siguiente modo: KKARVEDALHATRAAVEEGV (SEC ID Nº: 76).
Puede proporcionarse un conjugado que comprende un antígeno vírico covalentemente unido a un vehículo de péptido sintético que comprende un epítope de linfocitos T de HSP60 en el que dicho vehículo de péptido sintético está seleccionado del grupo de péptidos que consiste en:
(a)
NEDQKIGIEIIKRTLKI (p458h, derivado de HSP60 humana; SEC ID Nº: 1),
(b)
NEDQKIGIEIIKRALKI (p458, derivado de HSP60 de ratón; SEC ID Nº: 2),
(c)
EGDEATGANIVKVALEA (p458mt, derivado de HSP60 de M. tuberculosis; SEC ID Nº: 3),
(d)
NEDQNVGIKVALRAMEA (p458e, derivado de HSP60 de E. coli; SEC ID Nº: 4. Debe observarse que la secuencia de aminoácidos de p458e se corresponde con las posiciones 432-448 de SEC ID Nº: 83)
(e)
un análogo de p458h (SEC ID Nº: 1) que tiene al menos el 70% de la característica eléctrica y de hidrofilia/hidrofobia de HSP60 humana de la posición 458 a la posición 474, pudiendo dicho péptido o análogo aumentar sustancialmente la inmunogenicidad del antígeno vírico cuando el conjugado se administra in vivo,
(f)
KKARVEDALHATRAAVEEGV (Ec27, derivado de HSP60 de E. coli; SEC ID Nº: 76).
Los vehículos de péptido activos se caracterizan por estar altamente cargados, es decir, de propiedades eléctricas fuertes (7 de los 17 residuos de aminoácidos constituyentes de p458 están tanto negativamente como positivamente cargados) y ser altamente hidrófobos (6 residuos de aminoácidos). El péptido p458h se caracteriza adicionalmente por poseer un dominio del extremo N negativamente cargado polar, un dominio del extremo C positivamente cargado polar y un núcleo altamente hidrófobo. Estas características globales deben mantenerse con el fin de preservar la eficacia. Por tanto, siguiendo el esquema general anterior, cierta sustitución de aminoácidos conducirá a péptidos activos. Más específicamente, las posiciones 6, 8, 10, 11, 15 y 17 en la cadena de péptidos p458 (correspondiente a las posiciones 463, 465, 467, 468, 472 y 474 de la molécula de HSP60 humana) pueden acoplarse por tanto I o L como por otros aminoácidos hidrófobos, naturales, tales como V, M, o F, o aminoácidos no naturales, tales como norleucina (Nle) o norvalina (Nva). Las posiciones 5, 12, 13 y 16 en la cadena de p458h (correspondientes a las posiciones 462, 469, 470 y 473 de la molécula de HSP60 humana) pueden ocuparse por tanto K o R como por aminoácidos positivamente cargados no naturales, tales como ornitina (Orn). El intercambio de E y D también puede conducir a derivados activos.
Con respecto al vehículo de péptidos, el término “análogos” se refiere a péptidos obtenidos por sustitución, deleción
o adición de residuos de aminoácidos a la secuencia, que opcionalmente incluye el uso de un residuo químicamente derivatizado en lugar de un residuo no derivatizado, en tanto que tengan la capacidad de potenciar sustancialmente la inmunogenicidad de moléculas de antígeno vírico. Análogos, en el caso de p458, son péptidos de forma que se conserve al menos el 70%, preferentemente el 90-100%, de las propiedades eléctricas y de la hidrofobia de la molécula de péptido. Estos péptidos pueden obtenerse, sin limitación, según las instrucciones en el párrafo anterior en este documento. Los análogos de Ec27 pueden tener al menos aproximadamente el 70%, o al menos aproximadamente el 80-90%, de similitud en su secuencia de aminoácidos de Ec27. Por ejemplo, el péptido humano correspondiente, que tiene la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 86 (KKDRVTDALNATRAAVEEGI, Ec27h), presenta el 80% de identidad de aminoácidos con Ec27.
Los términos “covalentemente unido” y “conjugado” como se usan en el presente documento se refieren a un conjugado que comprende un antígeno y un vehículo de péptido sintético ligado tanto como un péptido de fusión continuo como por medio de conjugación química (tanto directamente como por un espaciador), usando procedimientos muy conocidos en la técnica.
Por “sustancialmente creciente”, la inmunogenicidad de una molécula de antígeno vírico indica que comprende tanto la inducción de un aumento en el nivel de anticuerpos (Ab) contra dicho antígeno, además de la presentación de dichos anticuerpos como principalmente del isotipo IgG. Alternativamente, el término puede representar un aumento en la respuesta de linfocitos T específica para antígeno, como se mide tanto como el aumento de la actividad de CTL (lisis dependiente de antígeno) como por el aumento de la proliferación de linfocitos T específica para antígeno
o secreción de citocinas (por ejemplo, citocinas Th1 tales como IFNy). Ejemplos no limitantes para medir el nivel de Ab específico y respuesta de linfocitos T específica para antígeno se presentan en los ejemplos en el presente documento más adelante.
El antígeno vírico puede comprender al menos un epítope seleccionado de: un epítope de CTL (un epítope de linfocitos T limitado a MHC I), un epítope de linfocitos B y un epítope de linfocitos T limitado a MHC II. Los procedimientos para identificar epítopes candidatos adecuados están dentro de las capacidades de aquellos expertos en la materia (por ejemplo, sin limitación, usando software de predicción de epítopes).
El antígeno vírico usado en los conjugados puede derivarse de cualquier virus de interés. En ciertas realizaciones, el virus pertenece a la familia herpesviridae. Esta familia incluye, pero no se limita a, virus humanos tales como virus del herpes 1 humano (VHH-1, también conocido como virus del herpes simple 1, VHS1), VHH-2 (VHS2), VHH-3 (virus de la varicela zóster, VVZ), VHH-4 (virus de Epstein-Barr, VEB), VHH-5 (citomegalovirus, CMV), VHH-6, VHH7 y VHH-8.
El virus puede pertenecen a la subfamilia de betaherpesvirus (por ejemplo, CMV y VEB). El virus puede ser CMV. El antígeno vírico puede derivarse de la proteína del gen 1 temprano inmediato (IE-1) de un virus del herpes. El antígeno vírico puede derivarse de la proteína del gen 1 temprano inmediato (IE-1) de un CMV. El antígeno vírico puede derivarse de la proteína de IE-1 que comprende un epítope de CTL.
El virus puede pertenecen a la familia Flaviviridae. Esta familia contiene actualmente tres géneros, los flavivirus (por ejemplo, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, virus de la encefalitis japonesa, dengue, fiebre amarilla y virus tales como virus Modoc y de Uganda), los pestivirus (por ejemplo, diarrea vírica bovina, enfermedad de Border) y los virus de la hepatitis C (por ejemplo, virus de la hepatitis C, VHC).
El virus puede seleccionarse del grupo que consiste en: el virus del Nilo occidental (VNO), virus de la fiebre amarilla, virus de la encefalitis de san Luis, virus de la encefalitis del valle de Murray, virus de Kunjin, virus de la encefalitis japonesa, virus del dengue tipo 1, virus del dengue tipo 2, virus del dengue tipo 3 y virus del dengue tipo 4. El antígeno vírico puede derivarse del virus del Nilo occidental (VNO). El antígeno vírico puede derivarse de la proteína de la envuelta (E) del VNO. El antígeno vírico puede derivarse del dominio E3 de dicha proteína. Dicho antígeno vírico puede comprender un epítope de linfocitos B y un epítope limitado a MHC II.
Puede proporcionarse un antígeno novedoso derivado del dominio E3 del VNO de proteína E, designado por este documento p15, correspondiente a los aa 355-369 de la proteína E. El antígeno tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEC ID Nº: 11 y 12 (LVTVNPFVSVATANS y LVTVNPFVSVATANA, respectivamente). En otras realizaciones, la invención puede proporcionar proteínas, péptidos y conjugados que comprenden dicho antígeno. Por ejemplo, dicho antígeno puede conjugarse con un vehículo o adyuvante de péptido
o de lípido.
En otra realización, los conjugados de la invención comprenden un antígeno vírico que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEC ID Nº: 11 y 12 covalentemente unido a un vehículo de péptido sintético de la invención. El conjugado puede tener una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEC ID Nº: 13 (NEDQKIGIEIIKRALKILVTVNPFVSVATANS), 14 (NEDQKIGIEHKRALKILVTVNPFVSVATANA), 15 (NEDQKIGIEIIKRTLKILVTVNPFVSVATANS), 16 (NEDQKIGIEIIKRTLKILVTVNPFVSVATANA), 77 (KKARVEDALHATRAAVEEGVLVTVNPFVSVATANS), y 78 (KKARVEDALHATRAAVEEGVLVTVNPFVSVATANA).
También pueden proporcionarse homólogos, análogos, fragmentos y derivados de p15, como se detalla en el presente documento más adelante.
La invención puede proporcionar homólogos de p15 derivados de un flavivirus, y fragmentos activos y extensiones de los mismos, como se detalla en la Tabla 1:
Tabla 1: Epítopes homólogos de p15 de diversos flavivirus, fragmentos activos y extensiones de los mismos, y secuencias de nucleótidos que los codifican.
Virus
Secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº) Secuencia de ácidos nucleicos (SEC ID Nº)
Virus del Nilo occidental
LVTVNPFVSVATANS (11) LVTVNPFVSVATANA (12) GRLVTVNPFVSVATANS (34) GRLVTVNPFVSVATANA (35) 19 20 54 55
Virus de la fiebre amarilla
LVTVNPIASTNDDEVLIE (25) GILVTVNPIASTNDDEVLIE (36) 45
Virus de la encefalitis de san Luis
LVTVNPFISTGGANNKVM (26) GRLVTVNPFISTGGANNKVM (37) 46
Virus de la encefalitis del valle de Murray
MVTANPYVASSTANAKVL (27) GRMVTANPYVASSTANAKVL (38) 47
Virus de Kunjin
LVTVNPFVVZSTANAKVL (28) GRLVTVNPFVVZSTANAKVL (39) 48
Virus de la encefalitis japonesa
LVTVNPFVATSSANSKVL (29) GRLVTVNPFVATSSANSKVL (40) 49
Virus del dengue tipo 1
LITANPIVTDKEKPVNIE (30) GRLITANPIVTDKEKPVNIE (41) 50
Virus del dengue tipo 2
LITVNPIVTEKDSPVNIE (31) GRLITVNPIVTEKDSPVNIE (42) 51
Virus del dengue tipo 3
LITANPVVTKKEEPVNIE (32) GRLITANPVVTKKEEPVNIE (43) 52
Virus del dengue tipo 4
IISSTPLAENTNSVTNIE (33) GRIISSTPLAENTNSVTNIE (44) 53
Sin embargo, debe entenderse que la secuencia de aminoácidos de estos epítopes homólogos puede alterarse en diferentes variantes y cepas de estos virus. Pueden proporcionarse adicionalmente péptidos homólogos de diferentes variantes y cepas de estos virus.
Con respecto a los novedosos antígenos de péptidos víricos, el término “análogos” se refiere a péptidos obtenidos por sustitución, deleción o adición de residuos de aminoácidos a la secuencia, que opcionalmente incluye el uso de un residuo químicamente derivatizado en lugar de un residuo no derivatizado, en tanto que se retenga su capacidad para conferir inmunidad contra una infección vírica cuando se conjuga con los vehículos de la invención. El término también incluye homólogos correspondientes a secuencias de aminoácidos que están significativamente relacionadas debido a una relación evolutiva, tanto entre especies (ortóloga) como dentro de una especie (paráloga). Las secuencias de péptidos que tienen dominios de secuencia de aminoácidos conservados son ejemplos de homólogos. Con respecto a los novedosos antígenos de péptidos víricos, los homólogos de péptidos pueden tener al menos aproximadamente el 40% de identidad en sus secuencias de aminoácidos, preferentemente al menos el 50%, más preferentemente al menos aproximadamente el 70% y lo más preferentemente al menos aproximadamente el 90% de identidad. Estos valores reflejan la corta longitud de los péptidos.
En otro aspecto puede proporcionarse un segundo epítope de VNO novedoso derivado de la proteína E, denotado en el presente documento p17, que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: YIVVGRGEQQINHHWHK (SEC ID Nº: 21). También pueden proporcionarse análogos, homólogos, fragmentos y derivados de los mismos.
Estos péptidos y homólogos pueden usarse en conjugación con los vehículos de la invención. El conjugado puede tener la secuencia de aminoácidos que se expone en una cualquiera de SEC ID Nº: 23-24 y 56-75.
Síntesis de péptidos y derivados
Los polipéptidos y péptidos de la invención pueden sintetizarse usando cualquier procedimiento recombinante o sintético conocido en la técnica que incluye, pero no se limita a, procedimientos de síntesis en fase sólida (por ejemplo, química de Boc o f-Moc) y en fase de disolución. Para la síntesis de péptidos en fase sólida, un resumen de las muchas técnicas puede encontrarse en: Stewart y Young, 1963; y Meienhofer, 1973. Para una revisión de síntesis en disolución clásica véase Schroder y Lupke, 1965.
Se prefiere que los residuos de aminoácidos descritos en el presente documento estén en la forma isomérica “L”. Sin embargo, los residuos en la forma isomérica “D” pueden estar sustituidos por algún residuo de L-aminoácido, en tanto que el péptido retenga sustancialmente la propiedad funcional deseada. El uso de aminoácidos “D” puede usarse como se conoce en la técnica para aumentar la estabilidad o semivida del péptido resultante.
Siempre que se mencionen los conjugados de p458 y Ec27 en la invención, también se contemplan sales y derivados funcionales de los mismos, en tanto que puedan potenciar sustancialmente la inmunogenicidad de las moléculas de antígeno. Por tanto, pueden englobarse polipéptidos o péptidos que contienen derivados de aminoácidos no naturales o cadenas laterales de no proteína.
El término derivado incluye cualquier derivado químico de los polipéptidos o péptidos que tienen uno o más residuos químicamente derivatizados haciendo reaccionar cadenas laterales o grupos funcionales. Tales moléculas derivatizadas incluyen, por ejemplo, aquellas moléculas en las que grupos amino libres han sido derivatizados para formar clorhidratos de amina, grupos p-toluenosulfonilo, grupos carbobenzoxi, grupos t-butiloxicarbonilo, grupos cloroacetilo o grupos formilo. Los grupos carboxilo libres pueden derivatizarse para formar sales, ésteres metílicos y etílicos u otros tipos de ésteres o hidrazidas. Los grupos hidroxilo libres pueden derivatizarse para formar derivados de O-acilo u O-alquilo. El nitrógeno de imidazol de la histidina puede derivatizarse para formar N-im-bencilhistidina. Como derivados químicos también se incluyen aquellos péptidos que contienen uno o más derivados de aminoácidos que se producen naturalmente de los veinte residuos de aminoácidos convencionales. Por ejemplo: 4hidroxiprolina puede estar sustituida con prolina; 5-hidroxilisina puede estar sustituida con lisina; 3-metilhistidina puede estar sustituida con histidina; homoserina puede estar sustituida con serina; y ornitina puede estar sustituida con lisina.
Además, un péptido o conjugado puede diferenciarse de la secuencia natural de los polipéptidos o péptidos de la invención por modificaciones químicas que incluyen, pero no se limitan a, acilación del NH2 terminal, acetilación o amidación de ácido tioglicólico, y por carboxilamidación terminal, por ejemplo, con amoniaco, metilamina y similares. Los péptidos pueden ser tanto lineales, cíclicos como ramificados y similares, conformaciones que pueden lograrse usando procedimientos muy conocidos en la técnica.
Se desvelan tanto fragmentos activos más cortos derivados de los antígenos víricos denotados como SEC ID Nº: 1112, 21 y 25-33 como péptidos más largos que comprenden estas secuencias. Tales fragmentos o péptidos pueden comprender, por ejemplo, péptidos que tienen 1-3 aminoácidos delecionados en cualquier extremo, o adición de 1-3 residuos de aminoácidos o más de las secuencias flanqueantes de la proteína vírica a cualquier extremo, en tanto que se retenga su capacidad para conferir inmunidad contra una infección vírica cuando se conjugan con los vehículos de la invención. Debe entenderse que también pueden usarse péptidos más largos, por ejemplo, hasta 50 aminoácidos de longitud, para la vacunación. Sin embargo, se prefieren péptidos más cortos por ser más fáciles de fabricar. Tales extensiones de los novedosos antígenos de péptido no pretenden incluir ninguna proteína conocida de fragmento, tal como el dominio E3 de longitud completa de un flavivirus. Los antígenos víricos tienen preferentemente 5-50 aminoácidos de longitud, más preferentemente 8-20 aminoácidos de longitud. Fragmentos y extensiones a modo de ejemplo de p15 y homólogos de los mismos según la invención se presentan en la Tabla 1.
La adición de residuos de aminoácidos puede realizarse en cualquier extremo de los polipéptidos o péptidos de la invención con el fin de proporcionar un “ligador” por el que los péptidos puedan unirse convenientemente a un vehículo. Tales ligadores son normalmente de al menos un residuo de aminoácido y pueden tener 40 o más residuos, más frecuentemente de 1 a 10 residuos. Residuos de aminoácidos típicos usados para la ligación son tirosina, cisteína, lisina, ácido glutámico y aspártico, o similares.
Los conjugados de la invención también pueden crearse por medio de conjugar químicamente un antígeno vírico con un péptido vehículo sintético de Ec27, usando procedimientos muy conocidos en la técnica.
Ácidos nucleicos
En otro aspecto pueden proporcionarse moléculas de ácidos nucleicos que codifican los antígenos de péptido.
Las moléculas de ácidos nucleicos pueden incluir ADN, ARN, o derivados de tanto ADN como ARN. Una secuencia de ácidos nucleicos aislada que codifica un antígeno vírico o un péptido HSP60 puede obtenerse a partir de su fuente natural, tanto como un gen entero (es decir, completo) como una parte del mismo. También puede producirse una molécula de ácido nucleico usando tecnología de ADN recombinante (por ejemplo, amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), clonación) o síntesis química. Secuencias de ácidos nucleicos incluyen secuencias de ácidos nucleicos naturales y homólogos de las mismas que incluyen, pero no se limitan a, variantes alélicas naturales y secuencias de ácidos nucleicos modificadas en las que se han insertado, delecionado, sustituido y/o invertido nucleótidos de tal forma que tales modificaciones no interfieran sustancialmente con la capacidad de la molécula de ácido nucleico para codificar un péptido funcional.
Un homólogo de molécula de ácido nucleico puede producirse usando varios procedimientos conocidos para aquellos expertos en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook y col., 1989). Por ejemplo, pueden modificarse moléculas de ácidos nucleicos usando una variedad de técnicas que incluyen, pero no se limitan a, técnicas de mutagénesis clásica y técnicas de ADN recombinante, tal como mutagénesis dirigida a sitio, tratamiento químico de una molécula de ácido nucleico para inducir mutaciones, escisión por enzima de restricción de un fragmento de ácido nucleico, ligación de fragmentos de ácido nucleico, amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y/o mutagénesis de regiones seleccionadas de una secuencia de ácidos nucleicos, síntesis de mezclas de oligonucleótidos y ligación de grupos de mezcla para “formar” una mezcla de moléculas de ácidos nucleicos y combinaciones de las mismas. Los homólogos de moléculas de ácido nucleico pueden seleccionarse de una mezcla de ácidos nucleicos modificados cribando la función de la proteína codificada por el ácido nucleico con respecto a la inducción de una respuesta antivírica, por ejemplo, mediante los procedimientos descritos en el presente documento.
Una secuencia de polinucleótidos u oligonucleótidos puede deducirse del código genético de una proteína; sin embargo, debe tenerse en cuenta la degeneración del código. Por ejemplo, un oligonucleótido que tiene una secuencia de ácidos nucleicos: ctggtgaccgtgaatccatttgtgtctgtggccacagccaactcg (SEC ID Nº: 19) codifica un antígeno p15 derivado de la proteína E del virus del Nilo occidental: LVTVNPFVSVATANS (SEC ID Nº: 11). Sin embargo, las secuencias de ácidos nucleicos también incluyen secuencias, que están degeneradas como resultado del código genético, secuencias que pueden ser fácilmente determinadas por aquellos expertos habituales en la materia. En otras realizaciones particulares, los antígenos víricos están codificados por oligonucleótidos que tienen una secuencia de ácidos nucleicos como se expone en una cualquiera de SEC ID Nº: 20, 22 y 45-55 (véase la Tabla 1).
Los oligonucleótidos o polinucleótidos pueden contener un esqueleto de fosfato internucleosídico modificado para mejorar las propiedades de biodisponibilidad e hibridación del oligonucleótido o polinucleótido. Los enlaces están seleccionados del grupo que consiste en fosfodiéster, fosfotriéster, metilfosfonato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforoanilidato, fosforamidato, fosforotioato, fosforoditioato o combinaciones de los mismos.
Enlaces de nucleasas adicionales incluyen alquilfosfotriéster tal como metil-y etilfosfotriéster, carbonato tal como éster carboximetílico, carbamato, morfolinocarbamato, 3'-tioformacetal, sililo tal como dialquil (C1-C6)-o difenilsililo, éster de sulfamato y similares. Tales enlaces y procedimientos para introducirlos en los oligonucleótidos se describen en muchas referencias, por ejemplo, revisadas generalmente por Peyman y Ulmann, (1990).
Una secuencia de ácidos nucleicos puede incluirse operativamente ligada a una o más secuencias de control de la transcripción para formar una molécula recombinante. La frase “operativamente ligado” se refiere al enlace de una secuencia de ácidos nucleicos con una secuencia de control de la transcripción de un modo tal que la molécula pueda expresarse cuando se transfecta (es decir, transforma, transduce o transfecta) en una célula huésped. Las secuencias de control de la transcripción son secuencias que controlan la iniciación, alargamiento y terminación de la transcripción. Secuencias de control de la transcripción particularmente importantes son aquellas que controlan la iniciación de la transcripción, tal como secuencias promotoras, potenciadoras, operadoras y represoras. Secuencias de control de la transcripción adecuadas incluyen cualquier secuencia de control de la transcripción que pueda funcionar en al menos una de las células recombinantes. Una variedad de tales secuencias de control de la transcripción son conocidas para aquellos expertos en la materia. Las secuencias de control de la transcripción preferidas incluyen aquellas que funcionan en animal, bacterias, helminto, células de insecto y células animales.
Una molécula de ácido nucleico puede insertarse en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada.
Los vectores pueden introducirse en células o tejidos por uno cualquiera de una variedad de procedimientos conocidos dentro de la materia, que incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. Tales procedimientos se describen generalmente en Sambrook y col., (1989, 1992), en Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. 1989.
Una célula recombinante puede comprender una célula transfectada con una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno vírico. Pueden utilizarse una variedad de sistemas de vector de expresión/huésped para contener y expresar secuencias que codifican los antígenos víricos. Éstos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias transformadas con vectores de expresión de bacteriófago recombinante, plásmido o ADN de cósmido; levadura transformada con vectores de expresión de levadura; sistemas de células de insecto infectados por vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus); sistemas de células vegetales transformados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, plásmidos Ti o pBR322); o sistemas de células animales. La expresión de la construcción dentro de la célula huésped puede ser transitoria o puede integrarse establemente en el genoma de la misma.
Composiciones de vacuna y procedimientos de uso
Puede proporcionarse una vacuna que comprende un péptido antigénico vírico aislado y un péptido que comprende un epítope de linfocitos T de HSP60, en la que el péptido HSP60 potencia la inmunogenicidad del péptido antigénico vírico al menos dos veces en comparación con el péptido sin el péptido HSP60. La inmunogenicidad puede potenciarse al menos 4-5 veces.
Las composiciones de vacuna pueden comprender un epítope de linfocitos T de HSP60 adecuado para potenciar la inmunogenicidad cuando se usa como un péptido adyuvante que se mezcla con el antígeno vírico. El péptido adyuvante puede seleccionarse de Ec27 y análogos y derivados del mismo. La vacuna puede comprender un epítope de linfocitos T de HSP60 adecuado para potenciar la inmunogenicidad del péptido antigénico vírico cuando se usa en conjugados en los que el péptido HSP60 está ligado covalentemente al péptido antigénico vírico. El vehículo de péptido puede seleccionarse de p458, Ec27 y análogos y derivados de los mismos. La inmunogenicidad potenciada de dicho antígeno vírico se mide por al menos uno de los siguientes: título del suero de anticuerpos dirigidos a dicho antígeno vírico; proliferación de linfocitos T en presencia de dicho antígeno vírico; secreción de citocinas inducida por dicho antígeno vírico; lisis mediada por linfocitos T específicos de células infectadas por virus; y reducción de la carga vírica detectable.
En otro aspecto, la invención proporciona composiciones de vacuna que comprenden los conjugados de la invención y un vehículo, adyuvante, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la invención proporciona composiciones de vacuna que comprenden un polipéptido o péptido, comprendiendo dicho polipéptido o péptido una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEC ID Nº: 11-12, 21 y 25-44, y un vehículo, adyuvante, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.
La composición puede ser útil para tratar o prevenir una infección vírica en un sujeto en necesidad de la misma, como se describe en el presente documento.
La composición de vacuna de la invención se administra a un sujeto en necesidad de la misma en una cantidad eficaz. Según la presente invención, una “cantidad eficaz” es una cantidad que cuando se administra a un sujeto produce un aumento sustancial en la respuesta inmunitaria del sujeto a dicho antígeno vírico, como se describe en el presente documento.
El sujeto puede seleccionarse del grupo que consiste en seres humanos, mamíferos no humanos y animales no mamíferos (por ejemplo, aves).
Las composiciones farmacéuticas y veterinarias para su uso según estas realizaciones pueden formularse de manera convencional usando uno o más soportes o excipientes (vehículos) fisiológicamente aceptables. El (Los) vehículo(s) son “aceptables” en el sentido de que son compatibles con los otros componentes de la composición y no perjudiciales para el receptor de la misma. La composición de vacuna puede administrarse opcionalmente en un vehículo farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable, tal como solución salina fisiológica o polioles de etanol tales como glicerol o propilenglicol.
Los polipéptidos y el péptido pueden formularse en la vacuna como formas neutras o de sal. Sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con grupos amino libres del péptido) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o tales ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico y maleico. Sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivarse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férricos, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina y procaína.
La composición de vacuna puede comprender opcionalmente adyuvantes adicionales tales como aceites vegetales o emulsiones de los mismos, sustancias tensioactivas, por ejemplo, hexadecilamina, ésteres de aminoácidos de octadecilo, octadecilamina, lisolecitina, bromuro de dimetil-dioctadecilamonio, N,N-dioctadecil-N'-N'-bis(2-hidroxietilpropanodiamina), metoxihexadecilglicerol y polioles plurónicos; poliaminas, por ejemplo, pirano, sulfato de dextrano, poli IC, carbopol; péptidos, por ejemplo, muramildipéptido, dimetilglicina, tuftsina; complejos inmunoestimulantes; emulsiones de aceite (que incluyen, pero no se limitan a, emulsiones de aceite en agua que tienen gotitas de aceite en el intervalo submicrométrico tal como las desvelados por las patentes de EE.UU. nº 5.961.970, 4.073.943 y 4.168.308); liposacáridos tales como MPL® y geles minerales. Los antígenos de la presente invención también pueden incorporarse en liposomas, cocleatos, polímeros biodegradables tales como poli-lactida, poli-glicolida y polilactida-co-glicolidas, o ISCOMS (complejos inmunoestimulantes) y también pueden emplearse principios activos complementarios. Los antígenos de proteína y péptido pueden acoplarse a albúmina o a otra molécula vehículo con el fin de modular o potenciar la respuesta inmunitaria, ya que todas son muy conocidas para aquellos expertos habituales en la técnica de las vacunas.
Las vacunas pueden administrarse a un humano o animal mediante una variedad de vías que incluyen, pero no se limitan a, vías de administración parenteral, intradérmica, transdérmica (tal como por el uso de polímeros de liberación lenta), intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, oral y intranasal, según protocolos muy conocidos en la técnica. La dosificación particular del antígeno conjugado dependerá de la edad, peso y afección médica del sujeto que va a tratarse, además de la identidad del antígeno y el procedimiento de administración. Dosis adecuadas serán fácilmente determinadas por el experto. Una dosis preferida para vacunación intramuscular, subcutánea y oral humana es entre aproximadamente 6 µg y aproximadamente 70 mg por kg de peso corporal, preferentemente entre aproximadamente 5 µg y aproximadamente 28 mg por kg de peso corporal, y más preferentemente entre aproximadamente 40 µg y aproximadamente 7 mg por kg de peso corporal. El ajuste y la manipulación de intervalos de dosificación establecidos usado con antígenos portadores tradicionales para la adaptación a la presente vacuna está perfectamente dentro de la capacidad de aquellos expertos en la materia.
Las composiciones de vacuna de la invención pueden usarse en combinación con otros tratamientos y medicamentos, por ejemplo, fármacos antivíricos. Por ejemplo, un conjugado que comprende un epítope de CTL derivado de la proteína IE-1 del HCMV y un vehículo de péptido de la invención puede administrarse a sujetos infectados por HCMV en combinación con terapia con ganciclovir. Las pautas de dosis y administración de ganciclovir se conocen en la técnica.
La presente invención puede referirse al uso de un conjugado de la invención para la preparación de una composición de vacuna útil para conferir inmunidad antivírica.
En otro aspecto más, la invención proporciona procedimientos para aumentar la inmunogenicidad de un antígeno vírico que comprende ligar el antígeno a un vehículo de péptido sintético de la invención.
Pueden proporcionarse procedimientos para inmunizar un sujeto en necesidad de los mismos contra una infección vírica, que comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición de vacuna que comprende un conjugado y un vehículo, adyuvante, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.
La composición de vacuna puede administrarse a dicho sujeto antes de la exposición de dicho sujeto al virus o después de exposición de dicho sujeto a dicho virus.
En otro aspecto, la invención puede proporcionar procedimientos que comprenden:
(a)
aislar un antígeno vírico que comprende al menos un epítope seleccionado de: un epítope de CTL, un epítope de linfocitos B y un epítope limitado a MHC II;
(b)
conjugar dicho antígeno vírico con un vehículo de péptido sintético de la invención; y
(c)
administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición de vacuna que comprende un conjugado de la invención y un vehículo, adyuvante, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Kits de diagnóstico y procedimientos de los mismos
Se desvelan composiciones de diagnóstico y los kits y usos de los mismos para el diagnóstico de infección por flavivirus.
Puede proporcionarse un procedimiento para diagnosticar la presencia de, o exposición a, un flavivirus en un paciente que comprende probar dicho paciente para la presencia de anticuerpos anti-flavivirus o de linfocitos T que inmunorreaccionan con epítopes de flavivirus usando un péptido según la Tabla 1 o análogos, derivados y sales de los mismos como antígeno.
El procedimiento puede comprender las etapas de:
(a)
poner en contacto un espécimen biológico adecuado con un antígeno vírico que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEC ID Nº: 11-12, 21 y 25-44 y análogos, homólogos, derivados y sales del mismo en condiciones tales que pueda producirse una reacción inmunitaria;
(b)
cuantificar la reacción inmunitaria entre el antígeno de péptido y el espécimen biológico,
en el que una reacción inmunitaria significativamente superior a una reacción inmunitaria obtenida para una muestra obtenida de un sujeto no infectado es indicativa de exposición a, o, en otras realizaciones, infección del sujeto con un flavivirus.
Un espécimen o muestra biológica que puede ensayarse para infección por flavivirus puede incluir, por ejemplo, fluidos corporales de mamíferos (por ejemplo, suero, extractos de tejido, líquidos de tejido, secreciones mucosas), sobrenadantes de cultivo celular in vitro, lisados celulares y células o tejido del sujeto que se han cultivado en cultivo celular (por ejemplo, muestras de leucocitos tales como células mononucleares de sangre periférica). Los procedimientos de obtención de una muestra biológica adecuada de un sujeto son conocidos para aquellos expertos en la materia.
Pueden usarse péptidos y composiciones de péptidos para detectar anticuerpos anti-flavivirus y diagnosticar infección por flavivirus usándolos como reactivo de prueba en un enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), un ensayo enzimático de inmunotransferencia puntual, un ensayo de hemaglutinación pasiva (por ejemplo, prueba de PHA), un ensayo de tipo sándwich de anticuerpo-péptido-anticuerpo, un ensayo de tipo sándwich de péptidoanticuerpo-péptido, u otros inmunoensayos muy conocidos. Cualquier inmunoensayo adecuado puede usarse con los péptidos objeto. Tales técnicas son muy conocidas para el experto en la materia y se han descrito en muchos manuales y textos de inmunología convencionales. En una realización particular, el inmunoensayo es un ELISA usando una fase sólida recubierta con las composiciones de péptido de la presente invención. Por ejemplo, un kit tal para determinar la presencia de anticuerpos anti-flavivirus pueden contener un péptido inmovilizado en fase sólida de la invención y un anticuerpo marcado que puede reconocer la región no variable del anticuerpo anti-flavivirus que va a detectarse, tal como Fab anti-humano marcado. El kit también puede contener instrucciones para usar el kit y recipientes para contener los materiales del kit. Puede usarse cualquier marca convencional, tal como un radioisótopo, una enzima, un cromóforo o un fluoróforo. Un radioisótopo típico es yodo-125 o azufre-35. Enzimas típicas para este fin incluyen peroxidasa de rábano picante, galactosidasa de rábano picante y fosfatasa alcalina.
La presencia de linfocitos T inmunorreactivos con epítopes de flavivirus puede determinarse, por ejemplo, determinando la proliferación de linfocitos T o la secreción de citocinas inducida por los novedosos epítopes de péptidos víricos de la invención, usando procedimientos muy conocidos en la técnica. Varios ejemplos no limitantes de determinación de la reactividad de linfocitos T con antígenos de péptido se presentan en los ejemplos en el presente documento. Por ejemplo, un kit para diagnosticar la exposición a o infección por flavivirus probando la presencia de un linfocito T que inmunorreacciona con epítopes flavivíricos puede comprender: un antígeno seleccionado de los péptidos de la invención; un medio adecuado para el cultivo de linfocitos (linfocitos T); y tanto un nucleótido marcado para la prueba de proliferación de linfocitos T como una citocina, por ejemplo, interferón-gamma, kit de ensayo, para la prueba de citocinas.
El procedimiento puede comprender las etapas de:
(a)
poner en contacto una muestra biológica adecuada con un antígeno vírico que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEC ID Nº: 11-12, 21 y 25-44 y análogos, homólogos, derivados y sales del mismo en condiciones tales que pueda producirse una reacción inmunitaria;
(b)
determinar si el antígeno de péptido se une específicamente a la muestra biológica.
El término “se une específicamente a la muestra biológica” como se usa en el presente documento se refiere a la manifestación de una reacción inmunitaria entre un componente del espécimen biológico o muestra (por ejemplo anticuerpos y linfocitos T) y el antígeno de péptido vírico que tiene mayor afinidad o grado que por otro antígeno. Por ejemplo, la unión específica puede medirse determinando el grado de formación de complejos antígeno-anticuerpo, proliferación de linfocitos T o secreción de citocinas. Por tanto, por ejemplo, la etapa (b) puede incluir determinar el grado de formación de complejos antígeno-anticuerpo, en el que un nivel de formación de complejos antígenoanticuerpo significativamente superior al nivel obtenido para una muestra obtenida de un sujeto no previamente expuesto a o infectado por un flavivirus es indicativo de la exposición del sujeto al flavivirus.
Los kits y procedimientos pueden usarse para el diagnóstico diferencial de una infección por flavivirus, permitiendo la identificación de la cepa de flavivirus particular que infecta al sujeto o a la que se expuso el sujeto. Por ejemplo, un espécimen biológico puede ensayarse para la presencia de anticuerpos anti-dengue usando los péptidos que tienen una secuencia de aminoácidos como se expone en SEC ID Nº: 30-33 para determinar la cepa de virus del dengue que infecta el sujeto (por ejemplo, para distinguir entre infección por dengue 1, 2, 3 ó 4).
Los siguientes ejemplos se presentan con el fin de ilustrar más completamente algunas realizaciones de la invención. Sin embargo, de ninguna forma deben interpretarse como limitantes del amplio alcance de la invención.
Ejemplos
A. VACUNACIÓN CONTRA EL CMV
Materiales y procedimientos
Ratones
Se compraron ratones hembra BALB/c de Harlan Olac (Bicester, RU). Los ratones se mantuvieron bajo condiciones libres de patógenos específicas y se dejó que se ajustaran al animalario durante 1 semana antes de realizar cualquier experimento. Para los experimentos de patogénesis se usaron ratones de 6 a 8 semanas de edad y para los experimentos de inmunización se usaron ratones de 3 semanas de edad. Los experimentos con ratones fueron autorizados y realizados según las pautas de la Universidad Ben Gurion, Facultad de Ciencias de la salud, Comité de seguridad animal.
MCMV
La cepa Smith del MCMV se obtuvo de la Colección americana de cultivos tipo (ATCC) (Rockville, MD). Se prepararon caldos del MCMV sometidos a pases a través de la glándula salival altamente virulentos como un homogeneizado del 10% (peso/vol) de glándula salival de BALB/c infectados en el día 14 en DMEM-10% de SBF. Los homogeneizados se clarificaron por centrifugación a baja velocidad, se añadió DMSO a una concentración final del 10% y los caldos de virus se almacenaron en alícuotas a -70ºC hasta uso (Palmon y col., 1996).
Los títulos de MCMV en estos caldos en suspensión de glándula salival (SGS) se determinaron por un ensayo en placa cuantitativo (Rager Zismany col., 1973). Brevemente, se prepararon monocapas confluentes de fibroblastos de embrión de ratón (MEF) secundarios en placas de 24 pocillos. Se prepararon diluciones 10 veces seriadas de SGS que contenía el MCMV en DMEM complementado con 2% de SBF. Se aspiró el medio de crecimiento de cada pocillo en placas de MEF, y los pocillos por duplicado se inocularon con 0,2 ml de SGS diluida. Después de un periodo de adsorción de 1 hora a 37ºC, las monocapas se recubrieron con 0,8 ml de medio de crecimiento que contenía 0,75% de carboximetilcelulosa (CMC), se incubaron durante 5 días a 37ºC en una estufa de incubación con 5% de CO2 humidificada, se fijaron en PBS-10% de formaldehído y se tiñeron con violeta cristal para visualizar las placas de virus. Los títulos se expresaron como log10 ufc/0,1 g de tejido. En todo este estudio se usaron caldos de virus que contenían 1,75 x 108 ufc/0,1 g de tejido.
Infección por MCMV y títulos de virus en órganos diana
Para estudiar la evolución de la infección por MCMV en ratones BALB/c sin tratamiento previo o inmunizados, los ratones se inocularon intraperitonealmente (i.p.) con 5 x 104 ufc de virus de partida en 0,2 ml de PBS. Los ratones se sacrificaron en diferentes momentos de tiempo, se extirparon los bazos y la glándulas salivales (se reunieron 3 ratones por grupo en cada momento de tiempo) y se prepararon homogeneizados al 10% (peso/vol) como se describe previamente (Palmon y col., 1996). Las muestras se almacenaron a -70ºC hasta que se realizaron las valoraciones de virus infecciosos en cultivos primarios de MEF.
Preparación de ADN y amplificación por PCR
Se extrajo ADN de bazos y glándula salival sin tratamiento previo e infectados usando el kit QiAmp Tissue (QIAGEN Inc. Chatsworth, CA, EE.UU.) según protocolos de QiAmp apropiados. Se sintetizaron cebadores de oligonucleótidos de ADN según la secuencia publicada del gen gB del MCMV (Rapp y col., 1992). La secuencia del cebador de la cadena codificante de gB se basó en la secuencia de ADNc nº 2416-2443 (5'-AAG-CAG-CAC-ATC-CGC-ACC-CTG-AGC-GCC-3' SEC ID Nº: 17) y la no codificante nº 2745-2772 (5'-CCA-GGC-GCT-CCC-GGC-GGC-CCG-CTC-TCG3' SEC ID Nº: 18). Se encontró que este par de cebadores del gen gB que amplificaba un segmento de 356 pb era el más sensible en los estudios previos (Palmon y col., 1996). Para la amplificación génica, 1 µg de muestra de ADN se añadió a la mezcla de reacción que contenía 200 µM de cada dNTP, 100 pmoles de cada cebador, MgSO4 1,0 mM, KCI 10 mM, (NH4)2SO4 10 mM, Tris-HCI 20 mM (pH 8,8), 0,1% de Triton X-100 y 2 U de polimerasa vent (Biolabs) en un volumen de reacción total de 50 µl cada uno. Las muestras se amplificaron durante 30 ciclos en un ciclador térmico automatizado (Perkin Elmer Cetus, EE.UU.). Cada ciclo implicó desnaturalización a 94ºC durante 60 s, hibridación a 68ºC durante 90 s y extensión del cebador a 72ºC durante 120 s. Los productos de PCR se separaron electroforéticamente sobre 1,5% de gel de agarosa, se tiñeron con bromuro de etidio y se fotografiaron. El límite inferior de detección para este procedimiento bajo las condiciones experimentales fue 5 femtogramos de ADN vírico correspondiente a aproximadamente 20 copias del genoma del MCMV (Palmon y col., 1996).
Péptidos
Los péptidos se prepararon en el Instituto de ciencias Weizmann (Rehovot, Israel) y en el Colegio de medicina Albert Einstein (Nueva York, EE.UU.). La pureza de los péptidos se determinó por HPLC analítica en fase inversa y análisis de aminoácidos (aa). Las secuencias de los seis péptidos sintetizados son: 89pep (epítope CTL de IE1 de pp89 del MCMV, Reddehase y col., 1989)-YPHFHPTNL (SEC ID Nº: 5); p458 (el péptido activo derivado de HSP60 de ratón, Konen Waisman y col., 1999)-NEDQKIGIEIIKRALKI (SEC ID Nº: 2); p458-89pep (combinado)-NEDQKIGIEIIKRALKIYPHFHPTNL (SEC ID Nº: 6); control negativo para p458 (el péptido p431 de la HSP60 micobacteriana, delecionado en 442val)-EGDEATGANIKVALEA (SEC ID Nº: 7); control-89pep (combinado)-EGDEATGANIKVALEAYPHFHPTNL (SEC ID Nº: 8); y TTp30-89pep (combinado)-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLEYPHFMPTNL (SEC ID Nº: 9). El p30 de TT (aa 947-967) (Panina-Bordignon y col., 1989) (SEC ID Nº: 10) está siendo ahora usado como péptido vehículo en diversas vacunas (Brander y col., 1996; Keitel y col., 1999). El péptido p431 micobacteriano (delecionado en 442val) se usó como péptido de control negativo ya que es homólogo en secuencia a p458 de mamífero, pero no provocó una respuesta inmunitaria dependiente de CD4+ contra sigo mismo o p458.
Inmunización y exposición de ratones al MCMV
La dosis de inmunización de cada péptido fue equimolar a 15 µg de p458 (Konen Waisman y col., 1999). Todos los péptidos se emulsionaron en adyuvante incompleto de Freund (IFA), y los volúmenes para las inyecciones intraalmohadilla plantar (i.a.p.) y subcutáneas (s.c.) fueron 50 µl y 100 µl, respectivamente. Se usaron dos protocolos diferentes. Para estudiar la respuesta inmunitaria de ratones al péptido quimérico (p458-89pep), grupos de ratones de 6 semanas de edad a 8 semanas de edad se inmunizaron una vez en la almohadilla plantar trasera con péptidos emulsionados en IFA. Diez días después se sacrificaron varios ratones, y se recogieron órganos para ensayos de IFNy y IL-4. Para estudiar la eficacia protectora del péptido combinado, grupos de ratones de 3 semanas de edad se inmunizaron y se reforzaron según el siguiente protocolo: los ratones se inmunizaron i.a.p., en el día (-24), y se reforzaron s.c. dos semanas después en el día (-10). Diez días después (día 0), los ratones se expusieron IP a 5 x 104 ufc de MCMV. Los ratones se sacrificaron en los días 14, 21 y 28 después de la exposición, y los órganos se recogieron para valoraciones de virus, PCR, ensayos de linfocitos T citotóxicos y de citocinas.
Preparación de cultivos de células mononucleares del bazo y la glándula salival
Se extruyó pulpa del bazo de la cápsula en una placa de Petri de cultivo de no tejido en medio RPMI 1640 complementado con 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, glutamina 2 mM, HEPES 10 mM y 5% de SBF (RPMI de base). Las suspensiones de células del bazo se pasaron a través de un filtro celular, se lavaron una vez, se trataron 2 min con tampón de lisis ACK (NH4Cl 0,15 M, KHCO3 0,01; 2 ml/bazo) para la eliminación de eritrocitos y se lavaron dos veces en medio de base. Los esplenocitos se resuspendieron en medio RPMI 1640 complementado con 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, glutamina 2 mM, HEPES 10 mM, �mercaptoetanol 5 x 10-5 M y 10% de SBF (RPMI completo) en una concentración final de 5 x 106 células/ml.
Se prepararon suspensiones de células de la glándula salival cortando inicialmente las glándulas salivales en pequeños fragmentos (<2 mm) en una placa de Petri de cultivo de no tejido. Los fragmentos se trataron con medio de base que contenía 1 mg de colagenasa-dispasa (Roche Diagnostics, Alemania)/ml y 50 µg de ADNsa I (Boehringer Mannheim, Alemania)/ml. Después de 1 h de incubación a 37ºC, las células se resuspendieron en 45% de Percoll (Sigma Chemical Co., Israel), se recubrieron sobre 66% de Percoll y se centrifugaron a 800 g durante 25 min. Las células mononucleares se recogieron en la interfase, se contaron y se resuspendieron en RPMI completo a una concentración final de 5 x 106 células/ml.
Ensayos de ELISA para IFN y IL-4
Se prepararon cultivos de células mononucleares de bazos y glándula salival como se ha descrito anteriormente. Las suspensiones de células se dividieron en placas de 24 pocillos (5 x 106 células/pocillo) y se estimularon in vitro con tanto 10 µg/ml de 89pep o p458 como con 5 µg/ml de concanavalina-A (Con-A). Las células se incubaron durante 72 h (con o sin estimulación) a 37ºC en una estufa de incubación con 5% de CO2 humidificada. Después de la incubación se recogieron los sobrenadantes y se midieron los niveles de IFNy y IL-4 usando ELISA indirecto según el protocolo de ELISA para citocinas de Pharmingen (Pharmingen, San Diego, CA).
Análisis de FACS de fenotipos de células e IFNy intracelular
Para el análisis fenotípico, células mononucleares del bazo y de glándula salival de ratones infectados por MCMV y sin tratamiento previo se cultivaron como se ha descrito anteriormente y se tiñeron para CD8 y CD4, IFNy e IL-5 usando anticuerpos directamente marcados (PharMingen, San Diego, CA). La tinción intracelular de células (ICCS) para IFNy, IL-4 e IL-5 se realizó usando el kit PharMingen's Cytofix/Cytoperm Plus con GolgiPlug (que contenía brefeldina A) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, se añadió GolgiPlug a los cultivos de células inmunitarias incubados 8 h (establecidos como se ha descrito anteriormente, con o sin estimulación de péptido). Después de las 6 h adicionales de incubación en la estufa de incubación, las células (mínimo de 106 por muestra) se recogieron, se lavaron en PBS complementado con 2% de SBF y 0,09% de azida de sodio y se incubaron en 50 µl de bloqueante FC, marcado con marcadores de superficie anti-CD4 y anti-CD8. Entonces, las células se fijaron, se permeabilizaron y se trataron con anticuerpos anti-IFNy, anti-IL-4 o anti-IL-5 para la detección intracelular de citocinas. Las células teñidas se analizaron inmediatamente sobre un citómetro de flujo FACSCalibur (Becton-Dickinson, Mansfield, MA) y se adquirieron
50.000 a 100.000 eventos/muestra y se analizaron con el software CellQuest.
Ensayo de linfocitos T citotóxicos
La actividad citotóxica contra 89pep del MCMV se evaluó en un ensayo citotóxico de 4 h usando el kit basado en colorimetría no radiactivo CytoTox 96 (Promega, Madison, WI), según instrucciones del fabricante. Este ensayo se basa en la medición cuantitativa de lactato deshidrogenasa, una enzima citosólica estable que es liberada tras la lisis celular. Se re-estimularon suspensiones de células del bazo de ratones inmunizados, preparadas como se ha descrito anteriormente, in vitro durante 6 días con 89pep (10 µg/ml) y rhIL-2 (25 UI/ml) a partir del día 2. Las células diana para el ensayo de lisis fueron células P815 (mastocitoma, H-2d). P815 fueron tanto no pulsadas como pulsadas con 89pep (1 µg/ml) durante 2 h y luego se lavaron antes de la incubación con células efectoras. En todos los experimentos mostrados, la liberación espontánea fue inferior al 25% de la liberación máxima. Cada punto en un ensayo de lisis representa el promedio de valores por triplicado. El intervalo de los triplicados estuvo dentro del 5% de su media.
Ejemplo 1. Historia natural de la diseminación de MCMV en bazo y glándula salival.
La infección por MCMV se caracteriza por diferentes cinéticas y cargas víricas en diferentes órganos (Mercer y Spector, 1986). Ratones BALB/c, 6-8 semanas de edad, se inyectaron i.p. con 5 x 104 ufc de MCMV. Los ratones se sacrificaron en los días 1, 3, 7, 14 y 28 después de la infección, y los bazos y glándulas salivales se ensayaron para virus infeccioso y ADN del MCMV. La Figura 1 muestra un patrón típico de replicación del MCMV en bazo (diamantes blancos) y glándula salival (cuadrados negros). La replicación del virus alcanzó el pico en el bazo en el día 3 después de la infección, y disminuyó lentamente después (Fig. 1A). En el día 14 no pudo recuperarse virus infeccioso de este órgano. Para detectar ADN de MCMV en órganos infectados los inventores usaron una PCR sensible usando un par de cebadores del gen gB que amplifica un segmento de 356 pb (Palmon y col., 1996). El ADN vírico ya se detectó en el bazo 1 día después de la infección, alcanzó el pico en el día 3 y en el día 14 no pudo detectarse ADN (Fig. 1B).
En la glándula salival el virus apareció en el día 7. La replicación del virus en este órgano aumentó regularmente, alcanzando el máximo en el día 14 (3 x 108 ufc/0,1 g de tejido, Fig. 1A). Siguió una disminución moderada en títulos del virus, y en el día 28 todavía pudieron recuperarse 1,5 x 106 ufc/0,1 g de tejido de la glándula salival. No pudo detectarse virus infeccioso en la GS (y en ningún otro órgano) en el día 42 después de la exposición (datos no mostrados y Keitel y col., 1999) La detección de ADN vírico se asoció a la presencia de virus infeccioso. El ADN aumentó del día 7 a 14. Todavía pudieron detectarse grandes cantidades de ADN vírico en el día 28 después de la infección (Fig. 1B). En este contexto de diseminación vírica, replicación, eliminación esplénica y persistencia de glándula salival, los inventores evaluaron la eficacia de la inmunización con el péptido quimérico p458-89pep. Los inventores también estudiaron la carga de MCMV en pulmones después de la exposición de ratones de 6-8 semanas de edad sin tratamiento previo; la carga de MCMV (ufc) fue máxima en el día 7 y desapareció en el día 14 (datos no mostrados). Por tanto, en el modelo de los inventores, los inventores se concentraron en la glándula salival debido a que se considera el principal sitio para persistencia vírica del MCMV en ratones (Fig. 1 y Ho, 1991; Koszinowski y col., 1990, Kirchner, 1983; Mercer y Spector, 1986).
Ejemplo 2. La inmunización con p458-89pep suprime la persistencia del MCMV en la glándula salival.
89pep es el epítope YPHFMPTNL limitado a H-2Ld de MCMV-pp89 (Reddehase y col., 1989). Los inventores sintetizaron p458-89pep quimérico y compararon su eficacia protectora contra MCMV con la inducida por 89pep solo
o por control negativo-89pep. p458 es un péptido limitado a la clase II de MHC derivado de HSP60 murina (aa 458474) y que puede inducir respuestas de CD4+ T en ratones BALB/c (Amir-Kroll y col., 2003). El péptido de 431-447 aa de HSP60 micobacteriana (con una deleción de val en la posición 442) no provocó una respuesta inmunitaria a sí mismo o a p458 y, por tanto, sirvió de péptido de control negativo para la inmunización; control-89pep
Para investigar si la inmunización con los diferentes péptidos disminuiría la replicación de MCMV en glándulas salivales, ratones BALB/c de 3 semanas de edad se inmunizaron dos veces con IFA solo, 89pep, p458-89pep o control-89pep (Fig. 2). Ratones BALB/c hembra de tres semanas de edad se inmunizaron (i.a.p.) con diversos péptidos, y se reforzaron (s.c.). Dos semanas después, los ratones se expusieron (i.p.) a 5 x 104 ufc de MCMV, día
0. Tres ratones de cada grupo se sacrificaron en los días 14, 21 y 28 después de la exposición.
Los péptidos para la vacunación se emulsionaron en IFA. Diez días después de la última inmunización, los ratones se expusieron i.p. a 5 x 104 ufc de MCMV (día 0). Los ratones se sacrificaron en los días 14, 21 y 28 después de la exposición, y se midieron títulos de virus infecciosos y MCMV-ADN por ensayos en placa y de PCR en las glándulas salivales. Como se muestra en la Figura 2B, no pudo demostrarse ningún efecto de inmunización con ninguno de los péptidos en los días 14 y 21 después de la exposición al virus; en el día 14, los títulos de virus oscilaron de 8,1 a 8,8 log10 ufc / 0,1 g, y en el día 21 oscilaron de 7,1 a 8,0 log10 ufc / 0,1 g.
Sin embargo, en el día 28, el MCMV no fue detectable en las glándulas salivales de los ratones inmunizados con p458-89pep (< 2 log10 ufc / 0,1 g). La inmunización con 89pep solo mostró una ventaja marginal en comparación con ratones inmunizados con IFA (Fig. 2B); la carga vírica fue 4,5 y 5,1 log10 ufc / 0,1 g, respectivamente. La inmunización con control-89pep no afectó la carga vírica. Se realizaron otros experimentos con el mismo diseño experimental en los que se usó TTp30-89pep; la inmunización con TTp30-89pep no afectó la carga vírica en los días 14 y 21, redujo la carga vírica en el día 28 dos veces, en promedio, pero fracasó en eliminar virus infecciosos en el día 28. Para evaluar adicionalmente la supresión del virus inducida por la inmunización con p458-89pep, los inventores usaron una PCR de gB vírica sensible para detectar ADN vírico. Los inventores mostraron previamente que 1 ufc es el equivalente de aproximadamente 1500 genomas víricos (Palmon y col., 2000). Todavía, en el día 28, incluso este ensayo fracasó en revelar cualquier producto de PCR de gB en glándulas salivales de ratones inmunizados con p458-89pep (Fig. 2C, carril d). Por tanto, sólo la inmunización con p458-89pep condujo a la eliminación del MCMV detectable de la glándula salival, en el día 28.
Ejemplo 3. Secreción de IFN por linfocitos T específicos para 89pep tras la infección y vacunación.
Está muy establecido que la eliminación del MCMV durante la infección aguda depende principalmente de la secreción de Th1 IFNy y respuestas de CTL protectoras (Mercer y Spector, 1986; Reddehase y col., 1989). Los inventores probaron si la secreción de IFNy se estimuló por 89pep de cultivos celulares de bazo (Fig. 3A) y glándulas salivales (Fig. 3B) de ratones expuestos al MCMV. Se prepararon cultivos celulares en los días 1, 3, 7, 14, 21 y 28 después de la infección, se sembraron durante 3 d con o sin 89pep y se midió la secreción de IFNy. En ausencia de estimulación con 89pep, la secreción de IFNy se detectó sólo en cultivos de bazo de los días 1 y 3 después de la infección. Este resultado refleja probablemente actividad de NK en las fases tempranas de la infección. Cuando 89pep se añadió a los cultivos, la secreción de IFNy en bazo y glándulas salivales guardó relación con la cinética de replicación vírica en estos órganos (Fig. 1A y 3). Es de notar que no se detectó secreción de IL-4 significativa en los sobrenadantes de cultivo; sin embargo, las células pudieron secretar IL-4 junto con otras citocinas en respuesta a la estimulación con Con-A (datos no mostrados).
Los inventores investigaron si la inmunización con p458-89pep indujo secreción de IFNy específica para 89pep. Los ratones recibieron una única inmunización con los siguientes péptidos: p458-89pep, 89pep, p458, control-89pep o TTp30-89pep. TTp30 es un péptido limitado a la clase II de MHC que puede inducir respuestas de CD4+ T vigorosas y producción de IFNy en ratones BALB/c y usarse como adyuvante universal (Panina-Bordignon y col., 1989, Amir-Kroll y col., 2003). Además, un grupo no vacunado se infectó con MCMV. Diez días después de la inmunización con los diferentes péptidos o infección, los ratones se sacrificaron, y se prepararon cultivos de células del bazo y glándulas salivales y se estimularon in vitro durante 3 d con 89pep o p458. La Figura 4 muestra que las células del bazo derivadas de ratones inmunizados con p458-89pep y re-estimulados in vitro con 89pep secretaron niveles significativamente mayores (p<0,05) de IFNy en comparación con ratones inmunizados con 89pep, p458, control89pep o IFA solo. Los esplenocitos re-estimulados con 89pep de ratones inmunizados con p458-89pep secretaron niveles significativamente mayores (p<0,05) de IFNy en comparación con los mismos esplenocitos, pero no reestimulados (Fig. 4). Por tanto, la inmunización con p458-89pep indujo secreción de IFNy específica y significativamente potenciada. En estos experimentos, los inventores también probaron TTp30-89pep. La inmunización con TTp30-89pep seguida de re-estimulación con 89pep indujo niveles de IFNy similares a aquellos de ratones inmunizados con p458-89pep (Fig. 4). Los mayores niveles de secreción de IFNy específica para 89pep se obtuvieron en cultivos de células del bazo de ratones infectados por virus (Fig. 4). Esta alta secreción de IFNy por células del bazo de ratones infectados por MCMV, después de la estimulación in vitro con 89pep, indica la dominancia de este epítope en la respuesta a MCMV. No se detectó IFNy específico para 89pep en cultivos de células de las glándulas salivales después de la inmunización con los diferentes péptidos (datos no mostrados). Por tanto, la infección de la glándula salival con MCMV pareció ser necesaria para el reclutamiento al órgano de células productoras de IFNy específico para 89pep (Fig. 1A y 3).
La respuesta de cultivos de células del bazo a la estimulación con p458 indujo altos niveles de IFNy en ratones inmunizados con p458 o p458-89pep, pero no en otros grupos; esto indica que las respuestas fueron inmunológicamente específicas (Fig. 4). No se detectó secreción de IL-4 significativa después de cualquier inmunización; sin embargo, las células pudieron secretar IL-4 después de la estimulación con Con-A. Los niveles de IL-4 medidos después de la estimulación con Con-A in vitro fueron 242 pg/ml, 146 pg/ml, 184 pg/ml y 317 pg/ml para IFA solo, 89pep, p458 y p458-89pep, respectivamente. Tomados conjuntamente, estos resultados implican que la protección inducida por p458-89pep se asoció a la elevación en la producción de IFNy específica para MCMV.
Ejemplo 4. La inmunización con p458-89pep induce linfocitos T IFNy+CD8+ específicos para 89pep y actividad de CTL.
Los inventores caracterizaron la naturaleza de células que secretaban IFNy por citometría de flujo. Se inmunizaron ratones una vez con los diferentes péptidos y un grupo adicional se infectó con MCMV. Siete días después, los bazos se extirparon y las suspensiones de células se cultivaron durante 5 días con o sin 89pep. La inmunización con p458-89pep seguida de 5 días de re-estimulación con 89pep indujo linfocitos T IFNy+D8+ y no linfocitos T IFNy+CD4+ (Fig. 5); se detectaron muy pocos linfocitos T IFNy+CD8+ después de la inmunización y re-estimulación con 89pep solo (Fig. 5B). La infección con MCMV y re-estimulación con 89pep indujo el mayor porcentaje de linfocitos T IFNy+CD8+ (Fig. 5B). La tinción fue específica para IFNy, ya que no se observaron células CD8+IL-4+ o CD8+IL-5+.
Los inventores también investigaron si las células CD8+IFNy+ inducidas por p458-89pep pudieron lisar o no específicamente células diana cargadas con 89pep. Los ratones se inmunizaron una vez y 7 d después se recogieron los bazos y se re-estimularon con 89pep. Seis días después se ensayó la actividad lítica en P815 (H-2d) cargadas con 89pep. No se observó actividad lítica de los cultivos de ratones inmunizados con 89pep, pero la CTL inducida por p458-89pep lisó las células diana (Fig. 6). Similar a los resultados de los inventores con la producción de IFNy por linfocitos T CD8+, la actividad lítica específica para 89pep inducida por infección por MCMV fue superior a la inducida por inmunización con p458-89pep.
Ejemplo 5. Respuesta específica para glándulas salivales después de la inmunización y la exposición alvirus.
Los inventores encontraron, arriba, que la secreción de IFNy en la glándula salival fue específica para virus y dependió de la infección por MCMV (Fig. 1 y 3). En el presente experimento, los inventores monitorizaron la producción de IFNy en ratones inmunizados 28 días después de la exposición al virus. La tinción de células mononucleares para la producción de IFNy se realizó inmediatamente después de la escisión de la glándula salival, y estimulación con 89pep durante 8 h. Las glándulas salivales de ratones inmunizados con IFA, 89pep o TTp3089pep y expuestos al virus contuvieron virus infecciosos en el día 28 después de la exposición (Fig. 2). Asimismo, se observaron células CD8+IFNy+ en estas glándulas salivales infectadas en el día 28. A diferencia, los ratones inmunizados con p458-89pep no mostraron MCMV infeccioso en la glándula salival 28 días después de la infección (Fig. 2). Sin embargo, el número de células CD8+IFNy+ fue mayor que el de los otros grupos (Fig. 7). Esto indica que la vacunación con p458-89pep indujo un mayor depósito de linfocitos T CD8+ específicos para 89pep junto con la terminación de la infección de la glándula salival.
Ejemplo 6. p458-89pen reduce la carga vírica de ratones infectados por MCMV
Ratones BALB/c de 3 semanas de edad se expusieron i.p. a 5 x 104 ufc de MCMV (día 0). En el día 6, los ratones se inmunizaron una vez con IFA solo, 89pep o p458-89pep emulsionado en IFA, como se ha descrito anteriormente. Los ratones se trataron con 100 µg de la medicación anti-vírica ganciclovir (GCV, Roche, Basilea, Suiza) i.p. en los días 1, 2, 3, 4, 8, 9, 10 y 11 después de la exposición. Los ratones se sacrificaron en el día 30 después de la exposición y se midió el ADN de MCMV por un ensayo de PCR en las glándulas salivales, como se ha especificado anteriormente (Figura 14A).
Como puede apreciarse en la Figura 14B, la inmunización con p458-89pep pudo suprimir la carga del CMV en la glándula salival incluso cuando se aplicó después de la exposición al CMV y en combinación con GCV. El tratamiento con GCV solo no fue suficiente para terapia; es decir, el tratamiento con GCV combinado con una inmunización con 89pep no conjugado no afectó la carga de CMV. Solo el tratamiento de GCV combinado con una inmunización de p458-89pep redujo la carga vírica a niveles indetectables.
B. VACUNACIÓN CON VNO
Materiales y procedimientos
Ratones
Se compraron ratones hembra BALB/c de Harlan Olac (Jerusalén, IL) a la edad de 14 días (10-12 g de peso corporal). Los ratones se mantuvieron bajo condiciones libres de patógenos específicas y se dejó que se ajustaran al animalario durante 1 semana antes de realizar los experimentos. Se usaron ratones a la edad de 3-6 semanas, a menos que se estableciera de otro modo. Como controles se usaron animales de la misma edad y sexo. Los ratones se mantuvieron en jaulas de aislamiento y se alimentaron y bebieron agua a voluntad. Los experimentos con ratones fueron autorizados y realizados según las pautas de la Universidad Ben Gurion, Facultad de Ciencias de la salud, Comité de seguridad animal.
Cultivos celulares
La línea celular Vero se derivó del mono verde africano (número ATCC®: CCL-81). Las células se cultivaron en DMEM complementado con 10% de SBF, 1% de aminoácidos no esenciales y antibióticos. Las células se mantuvieron en una atmósfera humidificada a 37ºC en 5% de CO2 y se usaron para el cultivo de caldos de virus, valoración de virus y ensayos de neutralización.
Virus, valoraciones de virus y antígeno de VNO
La cepa de virus del Nilo occidental (VNO) se aisló de un caso humano de infección por VNO (Goldblum y col., 1954). Los motivos de aminoácidos distintivos indican que esta cepa pertenece al linaje I. Los ensayos en placa del virus se realizaron en monocapas de células Vero en placas de 24 pocillos como se describe previamente (Ben-Nathan y col., 1996). Los títulos del caldo de virus se expresaron como unidades formadoras de placa (ufc) por ml. Se preparó un único caldo de virus que contenía 5 x 107 ufc / ml en células Vero, se guardó en alícuotas a -70ºC y se usó durante todo este estudio. El antígeno de VNO (Ag de VNO) se preparó como se describe previamente (Ben-Nathan y col., 2003).
Péptidos
Los péptidos se sintetizaron en Sigma-Aldrich (Rehovot, Israel). La pureza de los péptidos se determinó por HPLC de fase inversa analítica y análisis de aminoácidos (aa) y se evaluó en >95% de pureza. Las secuencias de los seis péptidos sintetizados son: Ep15 (derivado del dominio E3 de VNO)-LVTVNPFVSVATANS, SEC ID Nº: 11; p458 (el péptido activo derivado de HSP60 de ratón)-NEDQKIGIEIIKRALKI, SEC ID Nº: 2; p32 (p458-Ep15 combinado)-NEDQKIGIEIIKRALKILVTVNPFVSVATANS, SEC ID Nº: 13; pvacío, un control negativo para p458 (el péptido p431 de la HSP60 micobacteriana, delecionado en 442val)-EGDEATGANIKVALEA, SEC ID Nº: 7; p458-89pep (p458 y 89pep combinados, 89pep es un nonapéptido, YPHFHPTNL SEC ID Nº: 5, que consiste en un epítope CTL de IE1 de pp89 del MCMV)-NEDQKIGIEIIKRALKIYPHFHPTNL, SEC ID Nº: 6. El péptido p431 micobacteriano (delecionado en 442val) se usó como péptido de control negativo ya que es homólogo en secuencia a p458 de mamífero, pero no provocó una respuesta inmunitaria dependiente de CD4+ o anticuerpos contra sigo mismo o p458.
Anticuerpos y sueros
Inmunoglobulina intravenosa humana-IL (IVIG-IL): la preparación de IgG de donantes israelíes (IVIG-IL; OMRIGAM 5% de IgG intravenosa) que contiene 50 mg/ml de IgG (proteína total 5% en peso/volumen) fue una donación de Omrix Biopharmaceuticals Ltd, Israel. Este producto tiene un título de anticuerpos anti-VNO de 1:1600 por ELISA y de >1:80 por la prueba de neutralización por reducción de placas (PRNT) (Ben-Nathan y col., 2003). El antisuero para VNO de ratón se preparó por inyección intraperitoneal (IP) de ratones BALB/c de 5 semanas de edad con 1 x 104 ufc de VNO por ratón. Dos semanas después, los ratones supervivientes se reforzaron con 1 x 104 ufc y se sangraron 7 días después. La sangre se centrifugó (4000 rpm durante 7 min) y el suero se recogió y se guardó a 20ºC. El título de anticuerpos, medido por ELISA, fue 1:2400. El suero de ratones sin tratamiento previo inyectados con vacío se usó como control negativo.
Reconocimiento de Ag de VNO y péptidos por IVIG y sueros de ratón
Se realizaron pruebas de ELISA según el procedimiento descrito por Martin y col. (Martin y col., 2000) con ligeras modificaciones. Brevemente, placas de microtitulación se recubrieron y se incubaron durante la noche a 4ºC con 100 µl de los diferentes péptidos (1 µg/pocillo) o antígeno de VNO diluido 1:700 en tampón de recubrimiento (NaHCO3, pH=9,6). Después de la incubación, el tampón de recubrimiento se decantó y las placas se lavaron dos veces en PBS que contenía 0,05% de Tween 20 y 0,2% de azida de sodio (tampón de lavado). Después de bloquear durante 1 h con 200 µl/pocillo de PBS que contenía 0,05% de Tween 20 y 2,5% de leche desnatada en polvo, las placas se lavaron 4 veces en tampón de lavado y se añadieron 100 µl de IVIG-IL o sueros de ratón a dilución 1:40 a cada pocillo (2-4 pocillos por muestra). Los controles negativos y positivos de sueros humanos o de ratón se probaron en cada placa. Después de la incubación durante 1 h a 37ºC en una atmósfera humidificada, las placas se lavaron 5 veces, y a cada pocillo se añadieron 100 µl de IgG antihumana conjugada con HRP-estreptavidina diluida 1:1400 (Sigma-Aldrich) o IgG antiratón conjugada con HRP-estreptavidina diluida 1:1000 (SouthernBiotech, Birmingham, Alabama), respectivamente. Después de la incubación a 37ºC durante 1 h, las placas se lavaron 5 veces y se añadieron 100 µl de sustrato TMB (DAKO Carpinteria, CA) a cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min. La intensidad de color se midió por lector de ELISA (Dynatec MR 5000) a la absorbancia de 405 nm.
Ensayo de proliferación de linfocitos
Esplenocitos de ratones inmunizados o sin tratamiento previo se prepararon como se ha descrito anteriormente, se resuspendieron en RPMI completo en una concentración final de 2 x 105 células por pocillo en placas de 96 pocillos y se estimularon in vitro con tanto 10 µg/ml de diferentes péptidos, 10 µl/ml de Ag de VNO como 5 µg/ml de concanavalina-A (Con-A). Los cultivos celulares se incubaron a 37ºC en 5% de CO2 durante 5 días. Al final de la incubación se añadió 1 µCi de 3H-timidina (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Inglaterra) a cada pocillo durante 12 h. El recuento radiactivo se realizó en un contador� W�ALLAC 1409).
Inmunización de ratones con péptidos y exposición a VNO
La dosis de inmunización de cada péptido fue equimolar a 15 µg de p458 (Konen Waisman y col., 1999). Todos los péptidos se emulsionaron en adyuvante incompleto de Freund (IFA) y se inyectaron a 50 µl/ratón intra-almohadilla plantar (i.a.p.). Los ratones se inmunizaron con los diferentes péptidos 2-3 veces según el protocolo experimental. Una semana después de la última inmunización, los ratones se sangraron y se sacrificaron. Se recogieron los bazos, se prepararon cultivos de esplenocitos y se probaron para la proliferación de linfocitos T y secreción de citocinas. Se centrifugaron las muestras de sangre (4000 rpm durante 7 min) y luego se recogieron los sueros y se probaron para anticuerpos anti-VNO por ensayos de ELISA y de neutralización.
Para estudiar la inmunogenicidad y eficacia protectora de los péptidos, grupos de ratones de 3 semanas de edad se inmunizaron y se reforzaron según el siguiente protocolo: los ratones se inmunizaron i.a.p. y se reforzaron una vez o dos veces, separados 1 semana. Una semana después del último refuerzo, los ratones se expusieron IP a 1 x 106 ufc de VNO. La mortalidad se registró durante los siguientes 21 días. Para estudios de virología, ratones supervivientes y moribundos se sacrificaron en el día 7 después de la exposición, y los órganos se recogieron para valoraciones de virus y RT-PCR.
Carga de virus en tejido de cerebro de ratones infectados
Se extirparon tejidos de cerebro de ratones infectados o inmunizados y expuestos y se prepararon homogeneizados de 10% (peso/volumen) en DMEM-10% de DMSO. Entonces, los homogeneizados se tomaron en alícuotas y se guardaron a -70ºC hasta el posterior análisis. Los niveles de virus se determinaron por valoración de placas sobre monocapas de células Vero como se ha descrito previamente (Ben-Nathan y col., 1996), y se expresaron como ufc / 0,1 g de tejido de cerebro.
Extracción de ARN y RT-PCR
El ARN se extrajo de tejidos de cerebro de ratones usando el kit RNEasy Midi (QIAGEN, Hilden, Alemania) y se realizó RT-PCR en extractos de ARN usando transcriptasa inversa libre de endo (Ambion, Huntingdon, RU) y Biomix-Red (Bioline, Londres, RU). Los cebadores de proteína E para VNO (5'-ACGAAGTGGCCATTTTTGTC-3', SEC ID Nº: 81 / 5'-TTGATGCAGAGCTCCCTCTT-3', SEC ID Nº: 82) se eligieron usando el programa Primer3 (Whitehead Institute for Biomedical Research). Los productos de PCR se separaron electroforéticamente sobre 1,5% de gel de agarosa, se tiñeron con bromuro de etidio y se obtuvieron imágenes usando una cámara CCD (Imagechem 5500).
Preparación de cultivos de células del bazo y análisis de citocinas
Se recogieron bazos de ratones inmunizados y la pulpa del bazo se extruyó de la cápsula en medio RPMI 1640 complementado con 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, glutamina 2 mM, HEPES 10 mM y 5% de SBF (RPMI de base). Las suspensiones de células del bazo se pasaron a través de un filtro celular, se lavaron, se trataron durante 2 min con tampón de lisis ACK (NH4Cl 0,15 M, KHCO3 0,01) para la eliminación de eritrocitos y se lavaron dos veces en medio de base. Los esplenocitos se resuspendieron en medio RPMI 1640 complementado con 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, glutamina 2 mM, HEPES 10 mM, -mercaptoetanol 5 x 10-5 M y 10% de SBF (RPMI completo) en una concentración final de 5 x 106 células/ml en una placa de 24 pocillos. Las suspensiones de células se estimularon in vitro con tanto 10 µg/ml de diferentes péptidos, 10 µl/ml de Ag de VNO como 5 µg/ml de Con-A. Entonces, las células se incubaron a 37ºC en 5% de CO2 durante 72 h. Los sobrenadantes se recogieron, se diluyeron por 2 y se midieron las concentraciones de IFNy e IL-4 por procedimiento de ELISA indirecto usando kits comerciales (PharMingen, San Diego, CA) según instrucciones del fabricante.
Prueba de neutralización por reducción de placas (PRNT) de virus
El título de anticuerpos neutralizantes se determinó usando una prueba por reducción de placas (PRNT) modificada. Brevemente, las diluciones de 2 veces seriadas (1:4 a 1:512) de sueros de ratón se prepararon en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos y se añadieron 104 ufc de VNO en volúmenes iguales a pocillos duplicados de cada dilución. Después de 30 min de incubación a temperatura ambiente se añadieron 5 x 104 células Vero a cada pocillo de las mezclas de sueros-virus. Las placas se incubaron durante 72 h en una atmósfera humidificada a 37ºC y 5% de CO2 y se contaron las placas. Los títulos de anticuerpos neutralizantes por reducción de placas se expresaron como el recíproco de la mayor dilución que dio el 50% de la reducción de placas (PRNT50).
Isotipos de anticuerpos anti-VNO
Las placas se recubrieron con el Ag de VNO diluido 1:700 en tampón de recubrimiento. Después de la incubación durante la noche a 4ºC, bloqueo y lavado se añadieron diversas diluciones de sueros de ratón por triplicado. Los controles negativos y positivos de sueros de ratón se probaron en cada placa. La evaluación de IgG total se realizó usando IgG antiratón conjugada con HRP-estreptavidina (SouthernBiotech). Para la identificación de isotipos de anticuerpos, la incubación con anticuerpos anti-IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA e IgM de ratón conjugada con biotina (PharMingen, San Diego, CA) fue seguida por incubación con HRP-estreptavidina diluida 1:1000 (Jackson Laboratories, West Grove, Pensilvania). Después de la adición de sustrato, la intensidad de color se midió por lector de ELISA a 405 nm.
Ejemplo 7: Identificación de un epítope de VNO.
Basándose en el procedimiento de propensión antigénica (Kolaskar y col., 1990), calculado usando un programa de epítopes de linfocitos B gratuito (servidor BcePred, http://www.imtech.res.in/raghava/bcepred/index.html) y basándose en un programa de epítopes de MHC gratuito (servidor ProPred, http://www.imtech.res.in/raghavalpropred), los inventores han identificado un péptido p15 de diferentes proteínas E del VNO (del dominio E3 inmunogénico, aa LVTVNPFVSVATANS o aa LVTVNPFVSVATANA; SEC ID Nº: 11 y 12, respectivamente) como un epítope continuo de linfocitos B candidatos y epítope limitado a MHC-II del VNO (reconocido por diferentes moléculas de MHC-II humanas y murinas).
A continuación se examinó si el epítope candidato era reconocido por un conjunto de inmunoglobulinas del suero tomadas de donantes israelíes (IVIG-IL) que contenían Ab anti-VNO. Los pocillos se recubrieron con los diferentes péptidos (1 µg/pocillo) o con el Ag de VNO (dilución 1:700). Después de bloquear y lavar, la IVIG-IL se añadió a dilución 1:40 y la unión se detectó. Los resultados demuestran por primera vez que el péptido p15 es reconocido por IVIG-IL (Figura 8). Posteriormente, ratones se expusieron IP a una dosis subletal de VNO (104 ufc) y 14 días después los ratones supervivientes se re-infectaron con la misma dosis de VNO. Los sueros se recogieron 7 días después de la segunda exposición, y se realizaron ensayos de ELISA. Como puede apreciarse en la Figura 9, el suero de ratones infectados por VNO reconoció específicamente p15, y, a un mayor grado, el conjugado de p15 p32. Además, los linfocitos T de estos ratones proliferaron en respuesta a estimulación in vitro con el conjugado de p15 p32 (Figura 10). Por tanto, por este documento se demostró el fenotipo de p15 como epítope de linfocitos B del VNO y péptido limitado a VNO-MHC II.
Ejemplo 8: La inmunización con p458-p15 provoca protección contra el VNO.
Los inventores mostraron que HSP60-p458 (NEDQKIGIEIIKRALKI SEC ID Nº: 2) usado como péptido de vehículo para un epítope de MHC-1 del CMV potenció la respuesta inmunitaria al CMV y la inmunización con el péptido quimérico, epítope de p458-CMV, eliminó MCMV de glándulas salivales de ratones expuestos al virus. En consecuencia, los inventores probaron la eficacia protectora del VNO del péptido quimérico p458-p15 (NEDQKIGIEIIKRALKILVTVNPFVSVATANS) (llamado p32, SEC ID Nº: 13). La Tabla 2 resume 5 experimentos diferentes; la inmunización con p15 solo mostró una ligera eficacia protectora, mientras que la inmunización con una mezcla de p15 y p458 no protegió ratones. Sin embargo, cuando los ratones se inmunizaron con p32, el péptido p458-p15 quimérico, se logró un alto grado de protección contra una exposición mortal al VNO virulento.
Tabla 2. Eficacia protectora in vivo de la inmunización con p32 contra la exposición a VNO
Tratamiento -Muertes / Total (% de muertes)
Sin tratamiento
p15 (x3) p32 (x3) p458 (x3) p15 + p458 (x3)
Mortalidad (muertes del total)
22/32 (69%) 8/15 (53%) 2/21 (10%) 4/7 (57%) 5/7 (71%)
Los ratones se inmunizaron 3 veces con los diferentes péptidos o una mezcla de péptidos a intervalos de 7 días. Siete días después de la 3ª inmunización, los ratones se expusieron a 106 ufc de VNO y se monitorizó la supervivencia durante 21 días después de la exposición. Los resultados son el resumen de 5 experimentos diferentes, realizados en las mismas condiciones.
Para investigar si la inmunización con p32 produjo la eliminación de VNO o no se examinaron los niveles de virus en el cerebro, que es el principal órgano diana de este virus neurotrópico.
Los ratones se inmunizaron 3 veces con p32 a intervalos de 7 días. Siete días después de la última inmunización, los ratones inmunizados y no inmunizados se expusieron IP a 106 ufc de VNO. Siete días después de la exposición, los ratones se sacrificaron y se extrajeron diferentes órganos (cerebro, pulmones, corazón, hígado y bazo). También se tomaron los órganos de ratones sin tratamiento previo de control (ratones iguales no inmunizados y no infectados). Las cargas víricas se determinaron por RT-PCR para el genoma vírico y el ensayo en placas para títulos de virus infecciosos (ufc / 0,1 g de tejido). Los resultados de RT-PCR son representativos de un ratón experimental, mientras que los virus infecciosos son el promedio de todos los grupos experimentales. * El nivel de detección del ensayo en placas es <101.
Se determinaron los niveles de virus en el cerebro por RT-PCR y el ensayo en placas en el día 7 después de la exposición (Figura 15). Los títulos de virus fueron hasta 4 x 108 ufc/ml en los ratones no inmunizados y expuestos, mientras que en el grupo sin tratamiento previo y en el inmunizado y expuesto no se detectó virus (Figura 15). Estos hallazgos confirman que la vacunación de ratones con el péptido p32 los protege contra una infección por VNO de otro modo mortal.
Ejemplo 9: La inmunización con p458-p15 induce Ab neutralizantes para VNO.
Los inventores investigaron a continuación las respuestas inmunitarias provocadas tras la inmunización con p32. La inmunización con p32 indujo un alto título de Ab específicos para VNO con respecto a la inmunización con p15 solo (Figura 11A). El Ab generado tras la inmunización con p32 proporcionó capacidad neutralizante para VNO, esencial para el efecto protector de la vacuna de p32 (Tabla 3).
Tabla 3. Títulos de Ab neutralizantes anti-VNO en los sueros de ratones inmunizados con p32 o infectados por VNO en el día 7 después de tratamiento
Tratamiento -Muertes / Total (% de muertes)
Sin tratamiento
p15 (x3) p32 (x3) p458 (x3) p15 + p458 (x3)
Mortalidad (muertes del total)
22/32 (69%) 8/15 (53%) 2/21 (10%) 4/7 (57%) 5/7 (71%)
Los ratones fueron tanto inmunizados 3 veces con p32 como expuestos a VNO. Siete días después de la 3ª inmunización o exposición al VNO, respectivamente, los ratones se sangraron y se probaron los títulos de Ab neutralizantes para VNO en sueros (PRNT50). Los resultados son el promedio de 4 experimentos de ELISA independientes.
A continuación se examinó si la inmunización con p32 y la infección subletal por VNO inducen isotipos similares de anticuerpos anti-VNO o no. El Ag de VNO se usó como antígeno en las placas de ELISA. La Figura 1B muestra que niveles de isotipos IgG1 y IgG2a anti-VNO fueron similarmente altos en sueros de ratones inmunizados con p32 e infectados por el VNO. Los niveles de IgG2b específica para VNO fueron mayores en sueros de ratones infectados por el VNO, mientras que las IgM específicas para VNO fueron mayores en ratones inmunizados con p32. No se detectaron ni IgA ni IgG3 específica para VNO en ambos tipos de sueros (Fig. 11B).
Ejemplo 10: La inmunización con p458-p15 induce respuesta de linfocitos T específicos para VNO y secreción de IFN- .
Las respuestas de linfocitos T específicos para VNO se examinaron del siguiente modo: ratones BALB/c de seis semanas de edad se infectaron con una dosis subletal de VNO (0,66 x 102 ufc), y los bazos se recogieron 6 días después. Se prepararon suspensiones de células del bazo, se cultivaron en placas de 96 pocillos y se incubaron durante 3 días con 10 µg/ml de EP15, p32, p458 o Con-A (5 µg/ml) durante 3 días. La proliferación celular se midió por el procedimiento de WST-1 y los resultados son el promedio de 3 experimentos independientes. Como se muestra en la Figura 12, los esplenocitos de ratones inmunizados con p32 proliferaron en respuesta a estimulación in vitro con antígeno de VNO. Esta estimulación también indujo la secreción de altos niveles de IFNy, esencial para la respuesta de TH1 que caracteriza respuestas inmunitarias protectoras para virus (Figura 13).
Los conjugados de p458 y Ec27 con los novedosos antígenos víricos que tienen secuencias de aminoácidos como se exponen en SEC ID Nº: 13-14, 23, 56-75 y 77-79 (véase la Tabla 4 a continuación) se sintetizan como se ha descrito anteriormente.

Ejemplo 11: Inmunización con conjugados de p458 y Ec27 con antígenos víricos.
Virus
P458 conjugado (SEC ID Nº): Conjugado de Ec27 (SEC ID Nº):
VNO
NEDQKIGIEIIKRALKILVTVNPFVSVATANS (13) NEDQKIGIEIIKRALKILVTVNPFVSVATANA (14) NEDQKIGIEIIKRALKIYIVVGRGEQQINHWHK (23) NEDQKIGIEIIKRALKIGRLVTVNPFVSVATANS (65) NEDQKIGIEIIKRALKIGRLVTVNPFVSVATANA (66)
Virus de la fiebre amarilla
NEDQKIGIEIIKRALKIGILVTVNPIASTNDDEVLIE (56)
Virus de la encefalitis de san Luis
NEDQKIGIEIIKRALKIGRLVTVNPFISTGGANNKVM (57)
Virus de la encefalitis del valle de Murray
NEDQKIGIEIIKRALKIGRMVTANPYVASSTANAKVL (58)
Virus
P458 conjugado (SEC ID Nº): Conjugado de Ec27 (SEC ID Nº):
Virus de Kunjin
NEDQKIGIEIIKRALKIGRLVTVNPFVVZSTANAKVL (59)
Virus de la encefalitis japonesa
NEDQKIGIEIIKRALKIGRLVTVNPFVATSSANSKVL (60)
Virus del dengue tipo 1
NEDQKIGIEIIKRALKIGRLITANPIVTDKEKPVNIE (61)
Virus del dengue tipo 2
NEDQKIGIEIIKRALKIGRLITVNPIVTEKDSPVNIE (62)
Virus del dengue tipo 3
NEDQKIGIEIIKRALKIGRLITANPWTKKEEPVNIE (63)
Virus del dengue tipo 4
NEDQKIGIEIIKRALKIGRIISSTPLAENTNSVTNIE (64)
Se inmunizan ratones 3 veces con los diferentes péptidos o con péptidos de control (antígenos víricos no conjugados correspondientes y con los péptidos vehículo solos) a intervalos de 7 días, como se ha descrito anteriormente. Siete días después de la 3ª inmunización, los ratones se exponen a 106 ufc del flavivirus correspondiente y la supervivencia se monitoriza durante 21 días después de la exposición.
En otros experimentos, la inmunogenicidad de los conjugados se determina por los siguientes ensayos: en algunos experimentos, los ratones se inmunizan y ensayan para títulos del suero de anticuerpos específicos para virus y específicos para péptidos víricos por ensayos de ELISA, como se ha descrito anteriormente. En otros experimentos, LNC de ratones inmunizados se examinan en presencia del antígeno vírico correspondiente en ensayos de proliferación y ensayos de secreción de IFN-y, como se ha descrito anteriormente.
Ejemplo 12: Uso de conjugados de Ec27-antígeno para aumentar la inmunogenicidad de un antígeno vírico.
Se inmunizaron ratones con los siguientes péptidos, como se describe en el Ejemplo 8 usando los siguientes péptidos: p15 (SEC ID Nº: 11), p32 (SEC ID Nº: 13), Ec27-p15 (KKARVEDALHATRAAVEEGVLVTVNPFVSVATANS, SEC ID Nº: 77) y vacío-p15 5 (EGDEATGANIKVALEALVTVNPFVSVATANS, SEC ID Nº: 80 -el péptido p431 fusionado con p15).
Los bazos se recogieron 10 días después de la inmunización y los esplenocitos se cultivaron con p15 (25 µg/ml) durante 3 días. Se midieron la proliferación celular y los niveles de IFNy en los sobrenadantes de cultivos de células del bazo. Los resultados son el promedio de 3 experimentos de proliferación independientes. Ec27-Ep15* y Ec27-Ep15** son dos grupos idénticos, pero independientes, en el mismo experimento.
Como se muestra en la Figura 16, p458 y Ec27 pudieron ambos aumentar la inmunogenicidad de p15. La vacunación con conjugados que comprenden tanto p458 como Ec27 fusionados con el extremo N de p15 produjo la potenciada proliferación y secreción de IFN-y de células del bazo en presencia de p15, en comparación con aquellas de células del bazo derivadas de animales vacunados con p15 conjugado con el control péptido. Las células del bazo de ratones inmunizados con IFA solo o Ec27 sin conjugar no indujeron proliferación significativa y secreción de IFN-y cuando se incubaron con p15.
Ejemplo 13. Reconocimiento específico de los péptidos de VNO por sueros derivados de sujetos expuestos al VNO.
Se ensayaron sueros de sujetos humanos expuestos al VNO y no expuestos para anticuerpos que reconocen los novedosos antígenos de péptido del VNO, p15 (SEC ID Nº: 11) y p17 (SEC ID Nº: 21). La Figura 17 presenta los resultados de una prueba de ELISA en la que p15 y p17 sirvieron de antígeno, se usaron sueros humanos como anticuerpo primario y se usaron Ab antihumanos conjugados con HRP como anticuerpo secundario. URL son las unidades relativas de luminiscencia producidas por la actividad de HRP sobre el sustrato luminal.
Los sueros S2 y S6 son de humano que no se infectaron por VNO, mientras que los sueros S1, S3-S5 y S7 son de humano que tenía una historia de infección por VNO. IVIG es el conjunto de plasmas de ciudadanos israelíes que se mostró que contenía anticuerpos contra VNO.
Como puede observarse, tanto p15 como p17 fueron específicamente reconocidos por sueros expuestos al VNO y no por sueros de sujetos sin exponer. Los sueros humanos de seres humanos infectados por el dengue tampoco reconocieron p15 (datos no mostrados). Por tanto, p15 y p17 son péptidos de diagnóstico adecuados útiles para determinar la exposición a o infección por VNO.
Ejemplo 14. Identificación de Ec27, un péptido inmunodominante derivado de GroEL de E. coli.
Para encontrar epítopes de linfocitos T colaboradores dominantes de la secuencia de la variante de E. coli de HSP60 (GroEL), ratones BALB/c se inocularon con bacterias E. coli inactivadas por calor y se analizaron las respuestas proliferativas de drenar LNC para un conjunto de péptidos GroEL solapantes (Tabla 5), y la molécula de GroEL completa (comprada de Sigma).
Tabla 5 Péptidos solapantes de la molécula HSP60 de E. coli (GroEL); la designación de aminoácidos es correspondiente al número de acceso gi:45686198 sin el primer residuo de metionina, SEC ID Nº: 83.
Número de péptidos
Posición
1
1-20
2
16-35
3
31-50
4
46-65
5
61-80
6
76-95
7
91-110
8
106-125
9
121-140
10
136-155
11
151-170
12
166-185
13
181-200
14
196-215
15
211-230
16
226-245
17
241-260
18
256-275
19
271-290
20
286-305
21
301-320
22
316-335
23
331-350
24
346-365
25
361-380
26
376-395
27 (Ec27)
391-410
28
406-425
29
421-440
30
436-455
31
451-470
32
466-485
Número de péptidos
Posición
32
466-485
33
481-500
34
496-515
35
511-530
36
526-545
37
526-547
Se inmunizaron ratones BALB/c s.c. con 107 bacterias de E. coli atenuadas con glutaraldehído (Figura 18A) en PBS,
o con 30 µg de GroEL en PBS (Figura 18B). Diez días después las células del ganglio linfático (2 x 105 células por pocillo) se evaluaron para la proliferación específica para los péptidos GroEL solapantes indicados (20 µg/ml). Después de 96 horas de incubación, la incorporación de 3H-timidina se evaluó como una medida de la proliferación. Los resultados se muestran como cpm medias de pocillos por cuadruplicado. Se indican las desviaciones estándar.
Los ensayos de proliferación de linfocitos T se realizaron del siguiente modo: células del ganglio linfático (LNC) drenante de ratones inmunizados se cultivaron (2 x 105/pocillo) en 200 µl de medio RPMI 1640 complementado con glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio 1 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina (BioLab, Jerusalén, Israel), -mercaptoetanol 5 x 10-5 M (Fluka AG, Buchs, Suiza), tampón HEPES 10 mM (Sigma) y 1% de suero de ratón normal singénico. Después de cuatro días de incubación se añadió [3H]-timidina (0,5 µCi de 5 Ci/mmol, Nuclear Research Center, Negev, Israel) durante dieciséis horas adicionales, y se midió la incorporación de timidina. Los resultados se expresan como cpm medias, o el índice de estimulación (IE), es decir, cpm medias de cultivos de prueba (con antígeno) divididas entre cpm medias de cultivos de control (sin antígeno).
Como puede observarse en la Figura 18A, un péptido correspondiente a los residuos de aminoácidos 391-410 de GroEL fue altamente inmunogénico. La inmunización de ratones BALB/c con la molécula GroEL en lugar de las bacterias de E. coli completas condujo a una respuesta proliferativa similar de LNC drenantes (Figura 18B) a los mismos péptidos GroEL y la molécula GroEL completa como se usa para la Figura 18A: ambos inmunogenes dieron lugar a una respuesta inmunitaria a la molécula GroEL y, predominantemente, al péptido Ec27 de GroEL.
También se probó si el propio péptido Ec27 era inmunogénico por la inmunización de ratones BALB/c con 20 µg del péptido Ec27 en IFA.
Se inmunizaron ratones BALB/c s.c. con 20 µg del péptido Ec27 emulsionado en IFA. Diez días después se tomaron células del ganglio linfático y se evaluaron para la proliferación específica de 2 x 105 células en presencia del péptido Ec27, el péptido 259-271 del receptor de acetilcolina (AcR 259-271, VIVELIPSTSSAV SEC ID Nº: 84), o GroEL a las concentraciones 10 µg/ml, 2 µg/ml, o sin antígeno (BG). Los resultados se muestran como cpm medias de pocillos cuadruplicados. Se indican las desviaciones estándar.
La Figura 19 muestra que las células del ganglio linfático de ratones inmunizados respondieron al péptido Ec27 y a la molécula GroEL completa, pero no al péptido de control AcR 259-271.
Para aprender si la inmunogenicidad del péptido Ec27 está limitada a un haplotipo de MHC, los inventores compararon cuatro cepas de ratones con diferentes haplotipos de MHC en su respuesta al péptido Ec27. Los ratones inmunizados fueron de la cepa BALB/c (H-2d), BALB/k (H-2k), BALB/b (H-2b) o SJL (H-2S). Como puede apreciarse en la Figura 20, las cuatro cepas de ratón diferentes respondieron específicamente al péptido de inmunogén Ec27. Por tanto, el péptido Ec27 podría sustituir GroEL, o la bacteria completa, en la sensibilización para una respuesta inmunitaria específica para GroEL, debido a su inmuno-dominancia.
Ejemplo 15: Uso del péptido Ec27 como adyuvante para respuestas de anticuerpos
Debido a que se encontró que el péptido Ec27 era un péptido inmunodominante de la molécula GroEL, que es el principal inmunogén de bacterias, fue interesante aprender si el péptido Ec27 podía usarse como adyuvante, como pueden las bacterias. Por tanto, ratones BALB/c y C57BL/6 se inmunizaron subcutáneamente con 20 µg del anticuerpo anti-p53 monoclonal PAb-246 (descrito en Yewdell y col., 1986) en diferentes composiciones inmunogénicas: el anticuerpo fue tanto emulsionado en adyuvante completo de Freund (246 en CFA), en adyuvante incompleto de Freund (246 en IFA) como junto con 50 µg del péptido Ec27 (como una mezcla) en IFA (246 en Ec27). Tres semanas después, todos los ratones recibieron un refuerzo del anticuerpo PAb-246 subcutáneamente en IFA. Diez días después del refuerzo, los ratones se sangraron y sus respuestas de anticuerpos al inmunogén PAb-246 se compararon por ELISA (Figura 21A). La inmunización del anticuerpo PAb-246 en IFA solo no produjo una respuesta significativa de anticuerpos. A diferencia, la inmunización con el anticuerpo en IFA mezclado con el péptido Ec27 produjo una respuesta de anticuerpos eficaz en ambas cepas. El efecto adyuvante del péptido Ec27 fue comparable al efecto de CFA, que es uno de los materiales adyuvantes más potentes conocidos. La Figura 21B muestra la inducción de anticuerpos anti-p53 en los ratones inmunizados por medio de una red idiotípica, es decir, estos anticuerpos anti-p53 son anti-idiotípicos para los anticuerpos anti-PAb-246. De nuevo, el uso del péptido Ec27 como adyuvante fue al menos tan eficaz como el uso de CFA.
Los puntos representan sueros individuales, las barras indican la mediana de cada grupo.
Ejemplo 16: Uso del péptido Ec27 como adyuvante para conjugados de p458-polisacárido
Se obtuvo polisacárido capsular del serotipo 4 de S. pneumoniae (PnTy4) de la Colección americana de cultivos tipo (ATCC; Rockville, Md, EE.UU.). PnTy4 se acopló a péptidos vehículo usando clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)3-etilcarbodiimida (CDI; Aldrich, WI, EE.UU.) usando procedimiento convencional.
Los vehículos de péptido usados en este ejemplo son: p458 (SEC ID Nº: 2), p458s (SEC ID Nº: 87, EGDIETGVNIVLKALTA), MOG (SEC ID Nº: 85, MEVGWYRSPFSRWHLYRNGK).
Se inmunizaron ratones BALB/c con el conjugado de péptido-polisacárido indicado en IFA o IFA mezclado con 50 µg de Ec27 como se ha descrito anteriormente, en el ejemplo de vacunación con VNO. Se recogieron LNC y se ensayaron para la producción y proliferación de óxido nítrico (NO).
La Tabla 6 muestra los niveles de producción (nM) de óxido nítrico (NO) en células del ganglio linfático (LNC) derivadas de ratones inmunizados con conjugados de péptido-azúcar en IFA o en IFA + Ec27. Las células se cultivaron durante 72 h con tanto concanavalina A (Con A) como el inmunogén del péptido-azúcar en presencia o ausencia de una línea celular de macrófagos (J774). La producción de NO se ensayó usando un ensayo colorimétrico de nitrato/nitrilo según las instrucciones del fabricante.
LNC
LNC + J774
Inmunogén
VNI Con A P458-Ty4 VNI Con A P458-Ty4
P458-Ty4 / IFA
0,13 4,73 0,21 0,55 6,24 10,29
P458-Ty4 / Ec27
0,18 3,32 2,36 0,66 4,33 34,97
LNC
LNC + J774
Inmunogén
VNI Con A P458s-Ty4 VNI Con A P458s-Ty4
P458S-Ty4 / IFA
0,13 9,91 0,55 0,93 6,35 0,66
P458S-Ty4 / Ec27
0,18 8,53 2,41 0,45 5,23 27,73
La proliferación de células del ganglio linfático en respuesta a inmunogén se realizó como se ha descrito anteriormente (Ejemplo 14).
La Tabla 7 muestra la proliferación de LNC derivadas de ratones inmunizados con conjugados de péptido-azúcar en IFA o en IFA + Ec27. Las células se cultivaron durante 72 h con concanavalina A (Con A), el inmunogén de péptidoazúcar (Ty4), el inmunogén de péptido sin el azúcar, o el azúcar conjugado con un péptido de control (MOG-Ty4). La respuesta proliferativa se facilita como el índice de estimulación (IE).
Tabla 7 Proliferación de LNC derivadas de ratones inmunizados con conjugados de péptido-azúcar en IFA o en IFA
+ Ec27.
Inmunogén
VNI Con A P458-Ty4 P458 MOG-Ty4
P458-Ty4 / IFA
1,0 2,3 4,7 2,9 2,7
P458-Ty4 / Ec27
1,0 6,5 15,4 3,1 4,0
Inmunogén
VNI Con A P458S-Ty4 P458S MOG-Ty4
P458S-Ty4 / IFA
1,0 12,8 2,9 2,2 1,3
P458S-Ty4 / Ec27
1,0 15,3 8,7 2,1 6,5
En las tablas, VNI se refiere a valores del nivel inicial; ConA se refiere a concanavalina A; P458-Ty4 es un conjugado entre el péptido p458 y el polisacárido capsular del serotipo 4 de S. pneumoniae; P458s-Ty4 es un conjugado entre el péptido p458s y el polisacárido capsular del serotipo 4 de S. pneumoniae.
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<210> 54
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<212> ADN
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> PÉPTIDO SINTÉTICO
<400> 54 ggcagactgg tgaccgtgaa tccatttgtg tctgtggcca cagccaactc g 51
<210> 55
<211> 51
<212> ADN
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> PÉPTIDO SINTÉTICO
<400> 55 ggcagattgg tcactgtcaa cccttttgtt tcagtggcca cggccaacgc t 51
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<212> PRT
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<223> PÉPTIDO SINTÉTICO
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<223> PÉPTIDO SINTÉTICO
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<212> PRT
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<213> ARTIFICIAL
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<212> PRT
<213> Escherichia coli
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<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> PÉPTIDO SINTÉTICO
<400> 87

Claims (5)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Composición de vacuna que comprende un antígeno y un adyuvante de péptido sintético KKARVEDALHATRAAVEEGV (Ec27; SEC ID Nº: 76).
    5 2. La composición de la reivindicación 1, en la que el antígeno está seleccionado del grupo que consiste en: un péptido, un derivado de péptido, una proteína, un polisacárido y un anticuerpo.
  2. 3. La composición de la reivindicación 1, en la que el antígeno es un antígeno vírico.
    10 4. La composición de la reivindicación 1, en la que el antígeno está covalentemente unido a dicho adyuvante de péptido sintético.
  3. 5. La composición de la reivindicación 1 que comprende una mezcla del antígeno y dicho adyuvante de péptido
    sintético. 15
  4. 6. La composición de la reivindicación 3, en la que dicho antígeno vírico tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEC ID Nº: 11-12, 21 y 25-44 y análogos, homólogos, derivados y sales del mismo.
  5. 7. Un procedimiento de potenciación de la inmunogenicidad de un antígeno que comprende conjugar 20 covalentemente el antígeno con un vehículo de péptido sintético de SEC ID Nº: 76.
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