ES2390360T3

ES2390360T3 - Moléculas de unión para el factor VIII humano y proteínas similares al factor VIII humano

Info

Publication number: ES2390360T3
Application number: ES09155033T
Authority: ES
Inventors: Jinan Yu; Daniel M. Potter; Brian D. Kelley; Jeffrey S. Deetz; James E. Booth
Original assignee: Dyax Corp
Current assignee: Dyax Corp
Priority date: 1999-01-04
Filing date: 2000-01-03
Publication date: 2012-11-12
Anticipated expiration: 2020-01-03
Also published as: ES2524965T3; DK2298791T3; JP2010254694A; JP4733272B2; HK1038756A1; ES2328722T3; EP2298791B8; PT2301953E; EP2301953B1; DE60042430D1; EP2090582B1; EP2298791B1; EP2301953A1; ATE433992T1; HK1155756A1; JP2013079272A; PT2298791E; EP1705183A1; EP2090582A2; ES2499040T3

Abstract

Un polipeptido que se une al factor VIII y/o a un polipeptido similar al factor VIII, caracterizado por que dicho polipeptido tiene una secuencia de aminoacidos: Phe-Cys-X18-Val-X19-X20-Phe-X21-His-Cys-X22 (SEQ ID NO: 3), en donde X18 es His o Trp; X19 es His o Phe; X20 es Ala, Asn, His o Pro; X21 es Ala, Asn, Asp, Gln, His, Leu, Ser, o Val; X22 es Ala, Asp, His, Leu, Phe o Ser.

Description

Moleculas de uni6n para el factor VIII humano y proteinas similares al factor VIII humano.

Campo de la invencian

La presente invenci6n se refiere al campo del aislamiento y purificaci6n de proteinas. Especificamente, la presente

5 invenci6n se refiere a la identificaci6n, aislamiento y sintesis de moleculas de uni6n que se unen al factor VIII y/o polipeptidos similares al factor VIII. Tales moleculas de uni6n son utiles para la detecci6n y purificaci6n del factor VIII y polipeptidos similares al factor VIII a partir de disoluciones que los contienen.

Antecedentes

La hemofilia A clasica es el resultado de una deficiencia ligada al cromosoma X del factor VIII de coagulaci6n del 10 plasma sanguineo, y afecta casi exclusivamente a varones, con una frecuencia de aproximadamente un caso por

10.000. El defecto del cromosoma X es transmitido por portadores femeninos, que en si mismos no tienen la enfermedad. El factor VIII es tambien conocido como factor antihemofilico (AHF, por sus siglas en ingles), factor hemofilico A, cofactor plaquetario, tromboplastin6geno, trombocitolisina, y globulina antihemofilica (AHG). La designaci6n "factor VIII:C" se usa para indicar que es el compuesto que afecta a la coagulaci6n. El factor VIII es una

15 proteina de alto peso molecular de 280 kDa y esta compuesto de dos cadenas polipeptidicas de 200 kDa y 80 kDa respectivamente. Andersson et al., Proc. Nat!. Acad. Sci. U.S.A., 83:2979-2973 (1986). Estas cadenas son mantenidas juntas por un puente de un i6n metalico.

El principal sintoma de la hemofilia A es el sangrado sin cuajadura o coagulaci6n. Antes del descubrimiento de que la administraci6n de concentrados del factor VIII podria aliviar los sintomas de un individuo diagnosticado con la

20 enfermedad, la esperanza de vida media de un enfermo era aproximadamente 20 anos.

Hasta estos ultimos anos, la principal fuente de factor VIII para fines terapeuticos era el plasma sanguineo normal; sin embargo, el factor VIII aislado por este metodo, aunque de algun uso, tiene varias desventajas importantes. Por ejemplo, el factor VIII aislado a partir de plasma sanguineo es bastante impuro, teniendo tipicamente una actividad especifica menor que 2 unidades de factor VIII/mg de proteina y un contenido global de factor VIII menor que 1%. 25 Adicionalmente, el procedimiento de purificaci6n es caro, porque el material de partida, es decir, plasma humano, es caro. Tambien se deben tomar muchas precauciones para disminuir el riesgo de transmisi6n de agentes infecciosos al paciente. Por ejemplo, comunmente se detecta en la sangre donada el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de la Hepatitis B, el virus de la Hepatitis C y otros agentes causantes de enfermedad. Otra desventaja de usar el factor VIII obtenido por este metodo es que aproximadamente una decima parte de los pacientes con

30 hemofilia A severa desarrollan anticuerpos contra el factor VIII, haciendo a la enfermedad dificil de tratar.

Los esfuerzos de investigaci6n se han centrado en el desarrollo de metodos para crear y aislar factor VIII biol6gicamente activo, altamente purificado, en longitud completa y formas derivadas. Las ventajas de una proteina altamente purificada incluyen niveles reducidos de proteinas extranas en la mezcla terapeutica, asi como una disminuci6n de la probabilidad de la presencia de agentes infecciosos. Una forma mas purificada de factor VIII

35 tambien se puede administrar en dosis mas pequenas, reduciendo posiblemente el riesgo de desarrollar anticuerpos anti-factor VIII, ya que dosis mas bajas serian menos retadoras para el sistema inmunitario.

Se han dado significativos pasos hacia la producci6n recombinante de factor VIII partiendo del aislamiento de fragmentos de factor VIII biol6gicamente activos. Vease, Andersson et al., patente de EE.UU. N° 4.749.780; Andersson et al., patente de EE.UU. N° 4.877.614. El gen que codifica la proteina del factor VIII humano de longitud

40 completa fue aislado aprovechando su homologia de secuencia con el factor VIII porcino. Vease, Toole et al., patente de EE.UU N° 4.757.006. Toole et al. tambien reportan la expresi6n de proteina humana y porcina que tiene actividad procoagulante de factor VIII:C.

La solicitud de patente internacional WO 92/17192 describe una secuencia polipeptidica basada en un fragmento del factor von Willebrand (vWF) y la patente de EE.UU. N° 5.661.008 describe una secuencia de ADN para un derivado

45 del factor VIII humano.

Sin embargo, aun existen efectos secundarios severos que implican la producci6n de anticuerpos anti-factor VIII con la administraci6n de la proteina aislada a partir de fuentes tanto humanas como no humanas. Tambien se sabe que los anticuerpos que reaccionan con el factor VIII:C humano reaccionan, hasta cierto punto, con factor VIII:C de otras especies, y el propio factor VIII porcino es antigenico en los seres humanos. Tambien, los no hemofilicos pueden

50 desarrollar o contraer la enfermedad cuando sus sistemas inmunitarios se hacen sensibles al factor VIII:C.

Como una posible soluci6n a este problema, se ha disenado una proteina truncada, de peso molecular mas bajo, que exhibe actividad procoagulante. Vease, Toole, patente de EE.UU. N° 4.868.112. Toole report6 un metodo alternativo de tratamiento con factor VIII porcino de peso molecular mas bajo de aproximadamente 2000 aminoacidos que exhibe una actividad procoagulante similar a la del factor VIII de longitud completa. Evidentemente, 55 la retirada de ciertos aminoacidos y hasta 19 de los 25 posibles sitios de glicosilaci6n redujo la antigenicidad de la proteina, y de este modo la probabilidad de desarrollar anticuerpos anti-factor VIII. Sin embargo, una dificultad con el

desarrollo de factor VIII recombinante es conseguir niveles de producci6n en rendimientos suficientemente altos.

Recientemente, se han desarrollado moleculas de cDNA de factor VIII delecionadas que codifican derivados de factor VIII recombinante, que fueron proclives a dar rendimientos suficientemente altos de una proteina factor VIII recombinante biol6gicamente activa para uso en un proceso industrial para una preparaci6n farmaceutica. Vease, Almstedt et al., patente de EE.UU. N° 5.661.008. Almstedt et al. disenaron un factor VIII modificado derivado de un cDNA de factor VIII de longitud completa, que, cuando se expres6 en celulas animales, produjo altos niveles de una proteina similar al factor VIII con actividad de factor VIII. La proteina consisti6 esencialmente en dos cadenas polipeptidicas derivadas del factor VIII humano, teniendo las cadenas pesos moleculares de 90 kDa y 80 kDa, respectivamente.

Segun el procedimiento de Almstedt et al., los cDNAs de factor VIII se ensamblan en unidades de transcripci6n y se introducen en un sistema huesped adecuado para expresi6n. Las lineas celulares pueden ser cultivadas a gran escala en cultivo de suspensi6n o en soporte s6lido. La proteina producida en el medio de cultivo es despues concentrada y purificada. La proteina activa final esta constituida por los aminoacidos 1 a 743 y 1638 hasta 2332 del factor VIII humano. Esta secuencia polipeptidica es conocida en el mercado como rFVIII-SQ o REFACTO®. Vease tambien, Lind et al., Euro. J. Biochem., 232:19-27 (1995). Tambien se pueden construir otras formas de FVIII truncado en las que el dominio B es generalmente delecionado. En tales realizaciones, los aminoacidos de la cadena pesada, que consiste esencialmente en los aminoacidos 1 hasta 740 del Factor VIII humano y que tiene un peso molecular de aproximadamente 90 kD, estan conectados a los aminoacidos de la cadena ligera, que consiste esencialmente en los aminoacidos 1649 a 2332 del Factor VIII humano y que tiene un peso molecular de aproximadamente 80 kD. Las cadenas pesada y ligera pueden estar conectadas por un peptido enlazador de 2 a 15 aminoacidos, por ejemplo un enlazador que comprende residuos de lisina o arginina, o alternativamente, enlazadas por un enlace de i6n metalico.

Actualmente, hay una necesidad en este campo de metodos eficaces y rentables para obtener factor VIII activo, purificado, directamente a partir de diversas soluciones tales como sangre o sobrenadantes de cultivos celulares.

La presente invenci6n proporciona nuevos materiales y metodos para identificar, aislar y purificar factor VIII y proteinas similares al factor VIII, incluyendo REFACTO®, a partir de una soluci6n que contiene tales proteinas, en una forma activa. Las moleculas de uni6n al factor VIII de la presente invenci6n exhiben alta afinidad por el factor VIII y peptidos similares al factor VIII. La presente invenci6n proporciona por tanto un medio rentable para la purificaci6n rapida de cantidades comerciales de proteinas utiles en el tratamiento de la hemofilia A.

Compendio de la invencian

Por consiguiente, es un objeto de la presente invenci6n proporcionar nuevas moleculas de uni6n para el factor VIII y proteinas similares al factor VIII. Las moleculas de uni6n preferidas de la presente invenci6n exhiben no s6lo claras caracteristicas para la uni6n de los polipeptidos del factor VIII diana sino tambien especificas y deseables caracteristicas para la liberaci6n (eluci6n) de los polipeptidos diana. Las moleculas de uni6n especialmente preferidas segun la invenci6n son secuencias polipeptidicas cortas, caracterizadas por una estructura en bucle estable.

Se describe en la presente memoria un metodo preferido para el aislamiento de moleculas de uni6n acordes con la invenci6n empleando tecnologia de presentaci6n en fagos. El metodo de presentaci6n en fagos de la presente invenci6n es util para identificar familias de moleculas de uni6n a polipeptidos, y usando esta tecnica se han identificado y aislado varios peptidos de uni6n que exhiben alta afinidad por el factor VIII y peptidos similares al factor VIII. Tales peptidos de uni6n son utiles para identificar, aislar y purificar factor VIII y polipeptidos similares al factor VIII a partir de una soluci6n.

Las moleculas de uni6n mas preferidas especificas para el factor VIII y peptidos similares al factor VIII aisladas por el metodo de presentaci6n en fagos de la presente invenci6n son polipeptidos caracterizados por una estructura en bucle formada como resultado de un enlace disulfuro entre dos residuos de cisteina situados en las posiciones descritas en la SEQ ID NO: 3. Las moleculas de uni6n a polipeptidos especificas acordes con la presente invenci6n incluyen polipeptidos que comprenden secuencias de aminoacidos de la siguiente f6rmula general:

Phe-Cys-X18-Val-X19-X20-Phe-X21-His-Cys-X22 (SEQ ID NO: 3),

en donde X18 es His o Trp; X19 es His o Phe; X20 es Ala, Asn, His o Pro; X21 es Ala, Asn, Asp, Gln, His, Leu, Ser, o Val; X22 es Ala, Asp, His, Leu, Phe o Ser.

Ademas, tambien esta previsto que el metodo de presentaci6n en fagos de la presente invenci6n tambien se pueda usar para aislar familias adicionales de moleculas de uni6n especificas para el factor VIII y polipeptidos similares al factor VIII.

Las moleculas de uni6n mas preferidas para el aislamiento y/o purificaci6n de factor VIII y polipeptidos similares al factor VIII, incluyendo especialmente REFACTO®, mencionado anteriormente, a partir de una soluci6n incluyen los siguientes polipeptidos:

Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Ala-Phe-Asp-His-Cys-His (SEQ ID NO: 22);

Phe-Cys-Trp-Val-His-Pro-Phe-Ala-His-Cys-Leu (SEQ ID NO: 23);

Phe-Cys-His-Val-Phe-His-Phe-Ser-His-Cys-Asp (SEQ ID NO: 24);

Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Ala-Phe-Asp-His-Cys-His (SEQ ID NO: 25);

Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Asn-Phe-Ser-His-Cys-Ser (SEQ ID NO: 26);

Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Pro-Phe-Asn-His-Cys-Asp (SEQ ID NO: 27);

Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Pro-Phe-Asn-His-Cys-Ser (SEQ ID NO: 28);

Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Pro-Phe-Gln-His-Cys-Ala (SEQ ID NO: 29);

Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Pro-Phe-His-His-Cys-Phe (SEQ ID NO: 30);

Phe-Cys-His-Val-Phe-Asn-Phe-Val-His-Cys-Ser (SEQ ID NO: 31);

Phe-Cys-His-Val-Phe-Pro-Phe-Leu-His-Cys-Asp (SEQ ID NO: 32);

Las soluciones a partir de las que se puede aislar y purificar factor VIII y polipeptidos similares al factor VIII incluyen, pero no se limitan a, sangre, fracciones de la sangre, y sobrenadantes de cultivos celulares recombinantes que contienen factor VIII o un polipeptido similar al factor VIII producido y secretado por la celula huesped recombinante.

La presente invenci6n se refiere a un metodo para identificar y aislar moleculas de uni6n al factor VIII por medio de tecnologia de presentaci6n en fagos. Mas especificamente, las moleculas de uni6n al factor VIII y peptidos similares al factor VIII que tienen caracteristicas de uni6n y eluci6n especificas y predeterminadas se pueden seleccionar de una libreria de moleculas de uni6n, tal como una libreria de presentaci6n en fagos, mediante un metodo que comprende:

(a): seleccionar una primera condici6n de soluci6n (es decir, las condiciones de uni6n) en la que se desea que una molecula de uni6n exhiba una afinidad por el factor VIII o un polipeptido similar al factor VIII, formando un complejo de afinidad;

(b): seleccionar una segunda condici6n de soluci6n (es decir, las condiciones de liberaci6n) en la que se desea que la molecula de uni6n se disocie del factor VIII o el polipeptido similar al factor VIII, en donde la segunda condici6n de soluci6n es diferente en algun aspecto (p.ej., temperatura, pH, concentraci6n de disolvente, etc.) de la primera condici6n de soluci6n;

(c): proporcionar una libreria de analogos de un dominio de uni6n al factor VIII parental, en donde cada analogo difiere de dicho dominio de uni6n parental por variaci6n de la secuencia de aminoacidos en una o mas posiciones de aminoacido dentro del dominio;

(d): poner en contacto dicha libreria de analogos con factor VIII o un polipeptido similar al factor VIII en la primera condici6n de soluci6n bajo condiciones adecuadas para formar un complejo entre la molecula de uni6n y el factor VIII o polipeptido similar al factor VIII;

(e): retirar de la soluci6n los miembros no unidos (analogos) de la libreria del dominio de uni6n;

(f): someter los complejos del factor VIII o polipeptido similar al factor VIII que quedan de la etapa (e) a la segunda condici6n de soluci6n para la disociaci6n de algunos de los complejos molecula de uni6n/factor VIII (o polipeptido similar al factor VIII);

(g): recuperar los analogos de uni6n liberados bajo la segunda condici6n de soluci6n, en donde los analogos recuperados identifican moleculas de uni6n al factor VIII o similar al factor VIII aisladas.

Opcionalmente, el procedimiento anterior puede incluir etapas de condiciones de liberaci6n adicionales, es decir, someter opcionalmente los complejos de factor VIII o polipeptido similar al factor VIII que quedan de la etapa (f) a una tercera condici6n de soluci6n para disociar otros complejos remanentes, que pueden ser recogidos en una fracci6n independiente de las moleculas de uni6n al factor VIII liberadas bajo las segundas condiciones de soluci6n. Tal etapa, si las condiciones son lo suficientemente rigurosas para disociar todos los complejos formados en la etapa (d), identificara las condiciones de soluci6n adecuadas para la regeneraci6n de las matrices de uni6n que utilizan las moleculas de uni6n aisladas segun este procedimiento.

La presente invenci6n tambien se refiere a moleculas de uni6n no peptidicas y polipeptidos modificados que se unen al factor VIII y/o polipeptidos similares al factor VIII. Un ejemplo de estas modificaciones es un peptido en bucle constrenido que tiene residuos de cisteina emparejados que forman enlaces disulfuro, modificado en los residuos de cisteina por sustituci6n de una de las cisteinas por aminoacidos no naturales capaces de condensarse con la otra

cadena lateral de cisteina para formar un puente de tioeter estable. Tales analogos de tioeter ciclico de peptidos sinteticos se describen en la publicaci6n PCT WO 97/46251, incorporada en la presente memoria por referencia. Otras modificaciones contempladas especificamente incluyen sustituciones de aminoacidos especificas para dar estabilidad u otras propiedades sin afectar significativamente a la uni6n al factor VIII, p.ej., la sustituci6n de Glu-Pro por Asp-Pro para reducir la labilidad en acidos; modificaciones N-terminales o C-terminales para incorporar enlazadores tales como segmentos de poli-glicina y alteraciones para incluir grupos funcionales, notablemente funcionalidades hidrazida (-NH-NH2), p.ej., para ayudar a la inmovilizaci6n de los polipeptidos de uni6n acordes con esta invenci6n sobre soportes s6lidos.

En una realizaci6n adicional, la presente invenci6n se refiere a una composici6n de materia que comprende acidos nucleicos aislados, preferiblemente ADN, que codifican moleculas de uni6n de la presente invenci6n.

En otra realizaci6n, la presente invenci6n proporciona un metodo para detectar un factor VIII o un peptido similar al factor VIII en una soluci6n sospechosa de contenerlo, que comprende poner en contacto la soluci6n con una molecula de uni6n acorde con la presente invenci6n y determinar si se ha formado un complejo de uni6n.

Tambien esta previsto por la presente invenci6n un metodo para aislar el factor VIII y peptidos similares al factor VIII, que comprende:

(a): inmovilizar una molecula de uni6n acorde con la invenci6n sobre un soporte s6lido,

(b): poner en contacto una soluci6n que contiene factor VIII o una soluci6n que contiene un polipeptido similar al factor VIII con el soporte s6lido,

(c): retirar los componentes que no se unen de la soluci6n, y

(d): eluir el factor VIII o polipeptido similar al factor VIII del soporte s6lido.

Definiciones

Tal como se emplea en la presente memoria, el termino "recombinante" se usa para describir acidos nucleicos alterados o manipulados no naturalmente, celulas huesped transfectadas con acidos nucleicos ex6genos, o polipeptidos expresados no naturalmente, mediante la manipulaci6n de ADN aislado y transformaci6n de celulas huesped. Recombinante es un termino que abarca especificamente moleculas de ADN que han sido construidas in vitro usando tecnicas de ingenieria genetica, y el uso del termino "recombinante" como adjetivo para describir una molecula, construcci6n, vector, celula, polipeptido o polinucle6tido excluye especificamente tales moleculas, construcciones, vectores, celulas, polipeptidos o polinucle6tidos existentes en la naturaleza.

El termino "bacteri6fago" se define como un virus bacteriano que contiene un nucleo de ADN y una corteza protectora construida por la agregaci6n de varias moleculas proteicas diferentes. Los terminos "bacteri6fago" y "fago" se usan en la presente memoria de manera intercambiable.

El termino "polipeptido similar al factor VIII" se usa para hacer referencia a una forma modificada o truncada de factor VIII natural o factor VIII recombinante de longitud completa, en donde el polipeptido similar al factor VIII conserva las propiedades procoagulantes del factor VIII. Ejemplos de polipeptidos similares al factor VIII son los fragmentos de factor VIII activos y derivados del factor VIII descritos en las patentes de Andersson et al., Toole, y Almstedt et al. citadas anteriormente, todas las cuales se incorporan en la presente memoria por referencia. El termino "factor VIII diana" se usa a veces mas adelante para hacer referencia colectivamente al factor VIII y/o polipeptidos similares al factor VIII contenidos en una soluci6n o corriente de alimentaci6n de producci6n.

El termino "molecula de uni6n", tal como se emplea en esta memoria, se refiere a cualquier molecula, polipeptido, peptidomimetico o celulas transformada ("transformante") capaz de formar un complejo de uni6n con otra molecula, polipeptido, peptidomimetico o transformante. Una "molecula de uni6n al factor VIII" es una molecula de uni6n que forma un complejo con el factor VIII. Ejemplos especificos de moleculas de uni6n al factor VIII son los polipeptidos descritos en la presente memoria (p.ej., SEQ ID NOs: 1-32) y la presentaci6n en fagos de cualquiera de tales polipeptidos. Tambien se incluyen dentro de la definici6n de moleculas de uni6n al factor VIII polipeptidos derivados de o que incluyen un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos acorde con la f6rmula anterior, y tales polipeptidos que han sido modificados para resultados particulares. Los ejemplos especificos de modificaciones contempladas son sustituciones de aminoacidos C-terminales o N-terminales o elongaciones de cadenas polipeptidicas a fin de enlazar el resto de uni6n a un soporte cromatografico u otro sustrato, y sustituciones de pares de residuos de cisteina que forman normalmente enlaces disulfuro, por ejemplo por residuos de aminoacidos no existentes en la naturaleza que tienen cadenas laterales reactivas, a fin de formar una uni6n mas estable entre esas posiciones de aminoacido que el enlace disulfuro antiguo. Todas las tales moleculas de uni6n modificadas estan consideradas tambien moleculas de uni6n segun esta invenci6n, siempre y cuando conserven la capacidad de unirse al factor VIII y/o polipeptidos similares al factor VIII.

Descripcian detallada de las realizaciones preferidas

La presente invenci6n hace posible la detecci6n o purificaci6n altamente selectiva de factor VIII y/o polipeptidos similares al factor VIII en o de soluciones que los contienen.

El factor VIII y/o peptidos similares al factor VIII se pueden producir de cualquier manera conocida, incluyendo sintesis quimica; producci6n en celulas huesped transformadas; secreci6n en medio de cultivo por celulas existentes en la naturaleza o bacterias, levaduras, hongos, celulas de insectos y celulas de mamiferos transformadas de manera recombinante; secreci6n de organismos manipulados geneticamente (p.ej., mamiferos transgenicos); o en fluidos o tejidos biol6gicos tales como sangre, plasma, etc. La soluci6n que contiene el factor VIII bruto como es producido inicialmente (es decir, la soluci6n de producci6n) se denominara a veces la "corriente de alimentaci6n".

Cada metodo de producci6n del factor VIII (o un polipeptido similar al factor VIII) proporciona factor VIII en una corriente de alimentaci6n que contiene adicionalmente varias impurezas (con respecto al factor VIII). Un prop6sito de la presente invenci6n es producir ligandos de afinidad y preparaciones (tales como medios de cromatografia) que comprenden tales ligandos, que permiten la rapida y altamente especifica purificaci6n de factor VIII a partir de una corriente de alimentaci6n particular. Los ligandos de afinidad del factor VIII obtenidos en la presente memoria pueden ser adaptados para el aislamiento de factor VIII a partir de una corriente de alimentaci6n particular, bajo condiciones preseleccionadas especificas. Si se usa un metodo de producci6n alternativo para el factor VIII, que produce una corriente de alimentaci6n diferente, puede ser necesario un conjunto diferente de ligandos de afinidad para conseguir el mismo nivel de purificaci6n. El nuevo conjunto de ligandos se puede obtener facilmente siguiendo los procedimientos bosquejados en la presente memoria.

Las moleculas de uni6n al factor VIII de la invenci6n se unen al factor VIII con alta afinidad, comparable a o superior a otras proteinas, tales como anticuerpos conocidos por unirse al factor VIII. Ademas, los ligandos de afinidad preferidos descritos en la presente memoria liberan el factor VIII intacto y en forma activa bajo condiciones de liberaci6n especificas.

Selecci6n de condiciones de uni6n y liberaci6n

Se aislaron moleculas de uni6n a polipeptidos acordes con la presente invenci6n usando tecnologia de presentaci6n a fagos, de una manera que identifica peptidos de uni6n al factor VIII que exhiben propiedades particulares preseleccionadas de uni6n y liberaci6n. Segun esta metodologia, se pueden preseleccionar dos condiciones de soluci6n, es decir, condiciones de uni6n y condiciones de liberaci6n. Las condiciones de uni6n son un conjunto de condiciones de soluci6n bajo las que se desea que un polipeptido de uni6n descubierto se una al factor VIII diana (o polipeptido similar al factor VIII); las condiciones de liberaci6n son un conjunto de condiciones de soluci6n bajo las que se desea que un polipeptido de uni6n descubierto no se una al factor VIII (es decir, se disocie del factor VIII). Las dos condiciones se pueden seleccionar para satisfacer cualquier criterio del profesional, tal como facilidad de alcanzar las condiciones, compatibilidad con otras etapas de purificaci6n, coste disminuido del cambio entre condiciones comparado con otros medios de afinidad, etc. Preferiblemente, las dos condiciones de soluci6n se seleccionan para no afectar de manera adversa a la estabilidad o actividad de la proteina diana (factor VIII o peptido similar al factor VIII) y para diferir significativamente con respecto al menos a un parametro de soluci6n. Por ejemplo, al realizar el cribado para peptidos de uni6n adecuados descritos en la presente memoria, se seleccionaron ligantes que se disociaban de la diana en presencia de un tamp6n que contenia etilenglicol, o condiciones de pH disminuido (es decir, pH 2), o combinaciones de esas condiciones, que diferian de las condiciones empleadas para la uni6n. Otro parametro que podria ser variado ventajosamente es la concentraci6n de una sal, por ejemplo NaCl, en los tampones de uni6n y eluci6n.

Selecci6n de un dominio de uni6n parental

Junto con la selecci6n de condiciones de soluci6n especificas para la uni6n y liberaci6n deseadas del factor VIII, se selecciona un dominio de uni6n parental para servir como una plantilla estructural para las moleculas de uni6n manipuladas que exhibiran las capacidades de uni6n y liberaci6n deseadas. El dominio de uni6n puede ser una proteina existente en la naturaleza o sintetica, o una regi6n o dominio de una proteina. El dominio de uni6n parental se puede seleccionar en base al conocimiento de una interacci6n conocida entre el dominio de uni6n parental y el factor VIII, pero esto no es critico. De hecho, no es esencial que el dominio de uni6n parental tenga alguna afinidad por el factor VIII en absoluto: su prop6sito es proporcionar una estructura a partir de la cual se pueda generar una multiplicidad de analogos (una "libreria"), multiplicidad de analogos que incluira uno o mas analogos que exhiban las propiedades de uni6n y liberaci6n deseadas (y cualesquiera otras propiedades para las que se seleccionan). Las condiciones de uni6n y las condiciones de liberaci6n discutidas antes se pueden seleccionar con conocimiento del polipeptido exacto que servira como dominio de uni6n parental, o con conocimiento de una clase de proteinas o dominios a los que pertenece el dominio de uni6n parental, o independientemente por completo de la elecci6n del dominio de uni6n parental. De manera similar, las condiciones de uni6n y/o liberaci6n se pueden seleccionar con respecto a interacciones conocidas entre un dominio de uni6n y el factor VIII, p.ej., para favorecer la interacci6n bajo una o ambas de las condiciones de soluci6n, o se pueden seleccionar sin tener en cuenta tales interacciones conocidas. Asimismo, el dominio de uni6n parental se puede seleccionar teniendo en cuenta las condiciones de uni6n y/o liberaci6n o no, aunque debe ser reconocido que si los analogos de dominio de uni6n son inestables bajo

las condiciones de uni6n o liberaci6n, no se pueden obtener moleculas de uni6n utiles.

La naturaleza del dominio de uni6n parental influye en gran medida en las propiedades de los peptidos derivados (analogos) que seran ensayados frente a la molecula del factor VIII. Al seleccionar el dominio de uni6n parental, la consideraci6n mas importante es c6mo seran presentados los dominios de los analogos al factor VIII, es decir, en que conformaci6n el factor VIII y los analogos entraran en contacto. En realizaciones preferidas, por ejemplo, los analogos seran generados por inserci6n de ADN sintetico que codifica el analogo en un paquete genetico replicable, dando como resultado la presentaci6n del dominio sobre la superficie de un microorganismo, tal como el fago M13, usando tecnicas como las que se describen, p.ej., en Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins: A laboratory Manual, (Academic Press, Inc.; San Diego 1996) y la patente de EE.UU. N° 5.223.409 (Ladner et al.).

Para la formaci6n de librerias de presentaci6n en fagos, se prefiere usar polipeptidos estructurados como dominio de uni6n plantilla, en lugar de peptidos lineales, no estructurados. La mutaci6n de residuos superficiales en una proteina tendra usualmente poco efecto sobre la estructura global o las propiedades generales (tales como tamano, estabilidad y temperatura de desnaturalizaci6n) de la proteina; mientras que, al mismo tiempo, la mutaci6n de residuos superficiales puede afectar profundamente a las propiedades de uni6n de la proteina. Cuanto mas fuertemente esta constrenido un segmento peptidico, menos probable es que se una a alguna diana particular. Si si se une, sin embargo, la uni6n es proclive a ser mas fuerte y mas especifica. Por tanto, se prefiere seleccionar un dominio de uni6n parental y, a su vez, una estructura para los analogos polipeptidicos, que este constrenida dentro de un armaz6n que tenga algun grado de rigidez.

Preferiblemente, el dominio proteico que se usa como plantilla o dominio parental para generar la libreria de analogos de dominio sera una proteina o polipeptido pequenos. Las proteinas o polipeptidos pequenos ofrecen varias ventajas sobre las proteinas grandes: en primer lugar, la masa por sitio de uni6n es reducida. Dominios proteicos altamente estables que tienen bajos pesos moleculares, p.ej., dominios Kunitz (-7 kDa), dominios Kazal (-7 kDa), dominios de inhibidor de tripsina de Cucurbida maxima (CMTI) (-3,5 kDa), y endotelina (-2 kDa), pueden mostrar una uni6n mucho mas alta por gramo que la de los anticuerpos (150 kDa) o anticuerpos de cadena unica (30 kDa). En segundo lugar, la posibilidad de uni6n no especifica se reduce, porque hay menos superficie disponible. En tercer lugar, las proteinas o polipeptidos pequenos pueden ser manipulados para que tengan sitios de ligadura unicos de una manera que es impracticable para proteinas o anticuerpos mas grandes. Por ejemplo, se pueden manipular proteinas pequenas para que tengan lisinas s6lo en sitios adecuados para la ligadura (p.ej., a una matriz de cromatografia), pero esto no es factible para anticuerpos. En cuarto lugar, una estructura polipeptidica constrenida es mas proclive a retener su funcionalidad cuando es transferida con el dominio estructural intacto desde un armaz6n a otro. Por ejemplo, la estructura del dominio de uni6n es proclive a ser transferible desde el armaz6n usado para la presentaci6n en una libreria (p.ej., presentado en un fago) a una proteina aislada retirada del armaz6n de presentaci6n o inmovilizada sobre un sustrato cromatografico.

La inmovilizaci6n de los polipeptidos acordes con la invenci6n esta contemplada, p.ej., sobre matrices cromatograficas para formar medios de separaci6n del factorVIII eficaces para soluciones tales como sangre entera

o medios de cultivo acondicionados que contienen factor VIII secretado desde una celula huesped transformante. Seleccionando plantillas de dominios de uni6n apropiadas, se pueden aislar polipeptidos de uni6n que tienen una unica cisteina libre (no emparejada con otra cisteina que forma habitualmente un enlace disulfuro). Tales polipeptidos tiol-funcionales se pueden usar para una inmovilizaci6n altamente estable a sustratos por formaci6n de un tioeter con yodoacetamida, acido yodoacetico, o grupos acido a-yodocarboxilico similares.

De modo similar, el grupo carboxilo C-terminal del dominio polipeptidico puede ser convertido en una hidrazida (-NH-NH2), para reacci6n con un sustrato aldehido-funcional u otro sustrato reactivo con amina. Se prefiere esta tecnica.

Hay muchos dominios proteicos estables, pequenos, adecuados para uso como dominios de uni6n parentales y para los que esta disponible la siguiente informaci6n util: (1) secuencia de aminoacidos, (2) secuencias de varios dominios hom6logos, (3) estructura tridimensional, y/o (4) datos de estabilidad sobre un intervalo de pH, temperatura, salinidad, disolvente organico, concentraci6n de oxidantes. Algunos ejemplos son: dominios de Kunitz (58 aminoacidos, 3 enlaces disulfuro), dominios de inhibidor de tripsina de Cucurbida maxima (31 aminoacidos, 3 enlaces disulfuro), dominios relacionados con guanilina (14 aminoacidos, 2 enlaces disulfuro), dominios relacionados con enterotoxina IA estable al calor de bacterias gram negativas (18 aminoacidos, 3 enlaces disulfuro), dominios EGF (50 aminoacidos, 3 enlaces disulfuro), dominios kringle (60 aminoacidos, 3 enlaces disulfuro), dominios de uni6n a carbohidratos fungicos (35 aminoacidos, 2 enlaces disulfuro), dominios de endotelina (18 aminoacidos, 2 enlaces disulfuro), y dominio de uni6n a IgG de Estreptococo G (35 aminoacidos, sin enlaces disulfuro). La mayoria, pero no todos estos contienen enlaces disulfuro que mantienen y estabilizan la estructura. El dominio de uni6n parental tambien puede estar basado en un bucle unico (un disulfuro) de una microproteina que es hom6loga a un dominio proteico conocido o no. Por ejemplo, se usaron bucles constrenidos de 7 a 9 aminoacidos para formar librerias para aislar moleculas de uni6n al factor VIII y polipeptidos similares al factor VIII, como se describe mas adelante. Las librerias basadas en estos dominios, preferiblemente presentados en fago, pueden ser construidas y usadas facilmente para la selecci6n de moleculas de uni6n acordes con esta invenci6n.

Proporcionar una libreria de analogos de dominios de uni6n parentales

Una vez que se ha seleccionado un dominio de uni6n parental, se crea una libreria de moleculas de uni6n potenciales para el cribado frente una diana, en este caso factor VIII y/o proteinas similares al factor VIII, bajo las condiciones de uni6n deseadas y (opcionalmente) las condiciones de eluci6n (liberaci6n) deseadas. La libreria se crea preparando una serie de analogos, correspondiendo cada analogo al dominio de uni6n parental, excepto que tiene una o mas sustituciones de aminoacidos en la secuencia de aminoacidos del dominio. Se espera que las sustituciones de aminoacidos alteren las propiedades de uni6n del dominio sin alterar significativamente su estructura, al menos para la mayoria de sustituciones. Se prefiere que las posiciones de aminoacido que se seleccionan para variaci6n (posiciones de aminoacido variables) sean posiciones de aminoacido superficiales, esto es, posiciones en la secuencia de aminoacidos de los dominios que, cuando el dominio esta en su conformaci6n mas estable, aparecen en la superficie exterior del dominio (es decir, la superficie expuesta a la soluci6n). Lo mas preferiblemente, las posiciones de aminoacido a ser variadas seran adyacentes o cercanas entre si, para maximizar el efecto de las sustituciones. Ademas, se pueden anadir aminoacidos extra en la estructura del dominio de uni6n parental. En realizaciones preferidas, especialmente donde esta disponible una gran cantidad de informaci6n referente a las interacciones del factor VIII con otras moleculas, particularmente el dominio de uni6n parental, las posiciones de aminoacido que son esenciales para interacciones de uni6n seran determinadas y conservadas en el proceso de construcci6n de la libreria de analogos (es decir, los aminoacidos esenciales para la uni6n no seran variados).

El objeto de crear la libreria de analogos es proporcionar un numero muy grande de moleculas de uni6n potenciales para reacci6n con la molecula del factor VIII, y en general cuanto mayor es el numero de analogos en la libreria, mayor es la probabilidad de que al menos un miembro de la libreria se una al factor VIII y se libere bajo condiciones preseleccionadas o deseables para liberaci6n. Las librerias disenadas siguiendo una estructura plantilla particular y limitando la variaci6n de aminoacidos en posiciones particulares son muy preferidas, dado que una unica libreria puede abarcar todos los analogos disenados y las secuencias incluidas seran conocidas y presentadas en numeros aproximadamente iguales. En contraste, la sustituci6n aleatoria en s6lo seis posiciones en una secuencia de aminoacidos proporciona mas de 60 millones de analogos, que es un tamano de libreria que empieza a presentar limitaciones practicas incluso cuando se utilizan tecnicas de cribado tan poderosas como la presentaci6n en fagos. Librerias mas grandes que esta plantearian problemas de manejo, p.ej., se necesitaria que los recipientes de fermentaci6n fueran de tamano extraordinario, y, de manera mas importante, la probabilidad de tener todas las variaciones de secuencias polipeptidicas planeadas representadas en la libreria preparada disminuirian bruscamente. Se prefiere por lo tanto crear una libreria disenada o sesgada, en la que las posiciones de aminoacido designadas para variaci6n son consideradas de tal modo que maximicen el efecto de sustituci6n sobre las caracteristicas de uni6n del analogo, y los residuos de aminoacidos permitidos o planeados para uso en sustituciones son limitados, p.ej., en base a que sean proclives a causar que el analogo se una bajo las condiciones de soluci6n a las que la libreria sera cribaba para ligantes.

Como se indic6 previamente, las tecnicas discutidas en Kay et al., anteriormente, y Ladner et al., patente de EE.UU. 5.223.409, son particularmente utiles en la preparaci6n de una libreria de analogos correspondiente a un dominio de uni6n parental seleccionado, analogos que seran presentados en una forma adecuada para el cribado a gran escala de grandes numeros de analogos con respecto a una molecula de factor VIII diana. El uso de paquetes geneticos replicables, y lo mas preferiblemente bacteri6fagos, es un metodo poderoso para generar nuevas entidades de uni6n polipeptidicas que implica introducir un segmento de ADN ex6geno, nuevo, en el genoma de unbacteri6fago (u otro paquete genetico amplificable) de tal modo que el polipeptido codificado por el ADN no nativo aparezca en la superficie del fago. Cuando el ADN insertado contiene diversidad de secuencias, entonces cada fago receptor presenta una variante de la secuencia de aminoacidos plantilla (parental) codificada por el ADN, y la poblaci6n de fagos (libreria) presenta un vasto numero de secuencias de aminoacidos diferentes pero relacionadas.

En un procedimiento de cribado para obtener ligantes del factor VIII segun esta invenci6n, una libreria de fagos se pone en contacto con y se deja unir a una molecula de factor VIII diana, usualmente inmovilizada en un soporte s6lido. Los no ligantes se separan de los ligantes. En diversas maneras, los fagos unidos son liberados del factor VIII, recogidos y amplificados. Dado que los fagos pueden ser amplificados mediante infecci6n de celulas bacterianas, incluso unos pocos fagos de uni6n son suficientes para revelar la secuencia de genes que codifica una entidad de uni6n. Usando estas tecnicas es posible recuperar un fago de uni6n que es aproximadamente 1 en 20 millones en la poblaci6n. Una o mas librerias, que presentan 10-20 millones o mas de polipeptidos de uni6n cada una, pueden ser cribadas rapidamente para encontrar ligantes del factor VIII de alta afinidad. Cuando el proceso de selecci6n trabaja, la diversidad de la poblaci6n cae con cada ronda hasta que s6lo quedan ligantes buenos, es decir, el proceso converge. Tipicamente, una libreria de presentaci6n de fagos contendra varios ligantes estrechamente relacionados (10 a 50 ligantes de 10 millones). Las indicaciones de convergencia incluyen uni6n aumentada (medida por concentraciones de fagos) y recuperaci6n de secuencias estrechamente relacionadas. Despues de que se identifica un primer conjunto de peptidos de uni6n, la informaci6n de secuencia se puede usar para disenar otras librerias sesgadas para miembros que tienen propiedades adicionales deseadas, p.ej., discriminaci6n entre factor VIII y fragmentos particulares o impurezas estrechamente relacionadas en una corriente de alimentaci6n particular.

Tales tecnicas hacen posible no s6lo cribar un gran numero de moleculas de uni6n potenciales sino que hacen practico repetir los ciclos de uni6n/eluci6n y construir librerias sesgadas secundarias para cribar paquetes de

presentaci6n de analogos que cumplan criterios iniciales. Usando estas tecnicas, se puede cribar una libreria sesgada a analogos para revelar miembros que se unen fuertemente (es decir, con alta afinidad) bajo las condiciones de cribado.

Sintesis de analogos polipeptidicos

Siguiendo los procedimientos bosquejados anteriormente, se pueden aislar moleculas de uni6n adicionales para el factor VIII y/o polipeptidos similares al factor VIII a partir de las librerias de presentaci6n en fagos descritas en la presente memoria u otras librerias o colecciones de presentaci6n en fagos de moleculas de uni6n potenciales (p.ej., librerias combinatorias de compuestos organicos, librerias de peptidos aleatorios, etc.). Una vez aisladas, la secuencia de cualquier peptido de uni6n individual o la estructura de cualquier molecula de uni6n puede ser analizada, y el ligante se puede producir en cualquier cantidad deseada usando metodos conocidos. Por ejemplo, las moleculas polipeptidicas de uni6n descritas en la presente memoria, dado que sus secuencias son ahora conocidas, se pueden producir ventajosamente por sintesis quimica seguido de tratamiento bajo condiciones oxidantes apropiadas para obtener la conformaci6n nativa, es decir, los enlaces de disulfuro correctos. La sintesis se puede llevar a cabo por metodologias bien conocidas por los expertos en la tecnica (vease, Kelley et al., en Genetic Engineering Princip!es and Methods, (Setlow, J.K., ed.), Plenum Press, NY., (1990) vol. 12, pags. 1-19; Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis (1989), W. H. Freeman Co., San Francisco). Las moleculas de uni6n de la presente invenci6n se pueden preparar bien por sintesis quimica o bien por semisintesis. Los metodos de sintesis quimica o semisintesis permiten la posibilidad de incorporar residuos de aminoacidos no naturales.

Las moleculas de uni6n a polipeptidos de la presente invenci6n se preparan preferiblemente usando sintesis de peptidos en fase s6lida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149 (1963); Houghten, Proc. Nat!. Acad. Sci. USA, 82:5132 (1985)). La sintesis en fase s6lida empieza en el termino carboxi del polipeptido putativo acoplando un aminoacido protegido a una resina adecuada, que reacciona con el grupo carboxi del aminoacido C-terminal para formar una uni6n que es escindida facilmente despues, tal como una resina de halometilo, p.ej., resina de clorometilo y resina de bromometilo, resina de hidroximetilo, resina de aminometilo, resina de benzhidrilamina, o resina de t-alquiloxicarbonil-hidrazida. Despues de la retirada del grupo protector de a-amino con, por ejemplo, acido trifluoroacetico (TFA) en cloruro de metileno y neutralizaci6n en, por ejemplo, TEA, el siguiente ciclo en la sintesis es facil de llevar a cabo. Los restantes aminoacidos protegidos en a-amino, y, si es necesario, en cadena lateral, son despues acoplados secuencialmente en el orden deseado por condensaci6n para obtener un compuesto intermedio conectado a la resina. Alternativamente, algunos aminoacidos pueden ser acoplados unos a otros formando un oligopeptido antes de la adici6n del oligopeptido a la cadena polipeptidica creciente en la fase s6lida.

La condensaci6n entre dos aminoacidos, o un aminoacido y un peptido, o un peptido y un peptido se puede llevar a cabo segun los metodos de condensaci6n usuales, tales como el metodo de la azida, el metodo del anhidrido de acido mixto, el metodo DCC (diciclohexilcarbodiimida), el metodo del ester activo (metodo del ester de p-nitrofenilo, el metodo BOP [hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris(dimetilamino)fosfonio], el metodo del ester imido del acido N-hidroxisuccinico), y el metodo del reactivo K de Woodward.

Es comun en la sintesis quimica de peptidos la protecci6n de los grupos laterales reactivos de los diversos restos de aminoacidos con grupos protectores adecuados en ese sitio hasta que el grupo es retirado al final despues de que la cadena ha sido ensamblada completamente. Tambien es comun la protecci6n del grupo a-amino en un aminoacido

o un fragmento mientras esa entidad reacciona en el grupo carboxilo, seguido de la retirada selectiva del grupo protector del a-amino para permitir que la reacci6n posterior tenga lugar en esa ubicaci6n. Por consiguiente, es comun que, como etapa en la sintesis, se produzca un compuesto intermedio que incluye cada uno de los residuos de aminoacido situados en la secuencia deseada en la cadena polipeptidica, teniendo diversos de estos residuos grupos protectores de cadenas laterales. Despues, estos grupos protectores son comunmente retirados sustancialmente al mismo tiempo para producir el producto resultante deseado despues de la purificaci6n.

Los grupos protectores tipicos para proteger los grupos de cadena lateral a-y £-amino estan ejemplificados por benciloxicarbonilo (Z), isonicotiniloxicarbonilo (iNOC), O-clorobenciloxicarbonilo [Z(NO2)], p-metoxibenciloxicarbonilo [Z(OMe)], t-butoxicarbonilo (Boc), t-amiloxicarbonilo (Aoc), isoborniloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo, 2-(4-bifenil)2-propiloxicarbonilo (Bpoc), 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), metilsulfoniletoxicarbonilo (Msc), trifluoroacetilo, ftalilo, formilo, 2-nitrofenilsulfenilo (NPS), difenilfosfinotioilo (Ppt), dimetilofosfinotioilo (Mpt), y similares.

Como grupos protectores para el grupo carboxi se pueden poner como ejemplos, por ejemplo, ester bencilico (OBzl), ester ciclohexilico (Chx), ester 4-nitrobencilico (ONb), ester t-butilico (Obut), ester 4-piridilmetilico (OPic), y similares. Es deseable que aminoacidos especificos tales como arginina, cisteina y serina, que poseen un grupo funcional distinto a los grupos amino y carboxilo, sean protegidos por un grupo protector adecuado segun demande la ocasi6n. Por ejemplo, el grupo guanidino en la arginina puede ser protegido con nitro, p-toluenosulfonilo, benciloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo, p-metoxibencenosulfonilo, 4-metoxi-2,6-dimetilbencenosulfonilo (Mds), 1,3,5-trimetilfenilsulfonilo (Mts), y similares. El grupo tiol en la cisteina puede ser protegido con p-metoxibencilo, trifenilmetilo, acetilaminometiletilcarbamoilo, 4-metilbencilo, 2,4,6-trimetilbencilo (Tmb), etc., y el grupo hidroxilo en la serina puede ser protegido con bencilo, t-butilo, acetilo, tetrahidropiranilo, etc.

Despues de que se ha completado la secuencia de aminoacidos deseada, el polipeptido intermedio es retirado del

soporte de resina por tratamiento con un reactivo, tal como HF liquido y uno o mas depuradores que contienen el grupo tio, que no s6lo escinde el polipeptido de la resina, sino tambien escinde todos los grupos protectores de cadena lateral remanentes. Despues de la escisi6n con HF, la secuencia de proteina se lava con eter, se transfiere a un gran volumen de acido acetico diluido, y se agita a un pH ajustado a aproximadamente 8,0 con hidr6xido de amonio. Tras el ajuste del pH, el polipeptido toma su disposici6n conformacional deseada.

Los polipeptidos acordes con la invenci6n tambien se pueden preparar comercialmente por companias que proporcionan sintesis de polipeptidos como servicio (p.ej., BACHEM Bioscience, Inc., King of Prussia, PA; Quality Controlled Biochemicals, Inc., Hopkinton, MA).

Uso de las moleculas de uni6n en detecci6n o purificaci6n

Para la detecci6n del factor VIII y/o polipeptidos similares al factor VIII en una soluci6n tal como sangre o medios acondicionados sospechosos de contenerlo, una molecula de uni6n acorde con la invenci6n puede ser marcada de manera detectable, p.ej., radiomarcada o marcada enzimaticamente, despues ser puesta en contacto con la soluci6n, y despues de esto la formaci6n de un complejo entre la molecula de uni6n y el factor VIII diana puede ser detectada. Una molecula de uni6n en fagos acorde con la invenci6n, es decir, un fago recombinante que presenta un polipeptido ligante con el factor VIII en su superficie, puede formar un complejo con el factor VIII y/o polipeptidos similares al factor VIII que es detectable como sedimento en un tubo de reacci6n, que puede ser detectado visualmente despues de sedimentaci6n o centrifugaci6n.

Alternativamente, se puede usar un ensayo de tipo sandwich, en el que una molecula de uni6n al factor VIII esta inmovilizada en un soporte s6lido tal como un tubo de plastico o pocillo, o una matriz cromatografica tal como perlas de sefarosa, despues la soluci6n sospechosa de contener el factor VIII diana se pone en contacto con la molecula de uni6n inmovilizada, los materiales no unidos se retiran por lavado, y el factor VIII o polipeptido similar al factor VIII complejado es detectado usando un reactivo de detecci6n adecuado, tal como un anticuerpo monoclonal que reconoce el factor VIII diana, reactivo que es detectable por algun medio convencional conocido en la tecnica, incluyendo los que estan marcados de manera detectable, p.ej., radiomarcados o marcados enzimaticamente, como con peroxidasa de rabano picante, y similares.

Las moleculas de uni6n acordes con esta invenci6n seran extremadamente utiles para el aislamiento de factor VIII y/o polipeptidos similares al factor VIII por metodos de cromatografia de afinidad. Se puede emplear cualquier metodo convencional de cromatografia. Preferiblemente, un ligando de afinidad de la invenci6n sera inmovilizado en un soporte s6lido adecuado, p.ej., para rellenar una columna cromatografica. El ligando de afinidad inmovilizado puede ser cargado o puesto en contacto despues con una corriente de alimentaci6n bajo condiciones favorables a la formaci6n de complejos molecula de uni6n/factor VIII (o polipeptido similar al factor VIII). Los materiales que no se unen se pueden retirar por lavado, despues el factor VIII (o polipeptido similar al factor VIII) puede ser eluido introduciendo condiciones de soluci6n que favorecen la disociaci6n del complejo de uni6n.

Alternativamente, se puede llevar a cabo una cromatografia discontinua mezclando una soluci6n que contiene el factor VIII diana y la molecula de uni6n, aislando despues los complejos del factor VIII diana y las moleculas de uni6n. Para este tipo de separaci6n, se conocen muchos metodos. Por ejemplo, la molecula de uni6n puede ser inmovilizada en un soporte s6lido, y separada despues de la corriente de alimentaci6n junto con el factor VIII diana por filtraci6n. O la molecula de uni6n puede ser modificada con su propia etiqueta de afinidad, tal como una cola de poliHis, que se puede usar para unir el ligante despues de que se han formado los complejos usando una cromatografia de afinidad con metal inmovilizado. Una vez separado, el factor VIII diana puede ser liberado de la molecula de uni6n bajo condiciones de eluci6n y recuperado en forma pura.

Se debe advertir que aunque se preseleccionaron condiciones de uni6n precisas al obtener los polipeptidos que se unen al factor VIII descritos en la presente memoria, el uso posterior en purificaci6n por afinidad puede revelar condiciones de uni6n y liberaci6n mas 6ptimas bajo las que funcionara el mismo ligando de afinidad aislado. Por tanto, no es critico que la molecula de uni6n, despues del aislamiento segun esta invenci6n, se emplee siempre s6lo en las condiciones de uni6n y liberaci6n que conduzcan a su separaci6n de la libreria.

El aislamiento de moleculas que se unen al factor VIII de acuerdo con esta invenci6n se ilustrara adicionalmente a continuaci6n. Los parametros especificos incluidos en los siguientes ejemplos pretenden ilustrar la practica de la invenci6n, y de ninguna manera se presentan para limitar el alcance de la invenci6n.

Ejemplo I: Aislamiento de moleculas de unian para un polipeptido similar al factor VIII

Las tecnicas descritas anteriormente se emplearon para aislar moleculas de uni6n de alta afinidad por ligandos para un polipeptido similar al factor VIII producido de manera recombinante que consiste en dos segmentos del factor VIII humano, es decir, los aminoacidos 1-743 y 1638 hasta 2332 del factor VIII humano, como se describe en la patente de EE.UU. N° 5.661.008 (Almstedt et al.), obtenido bajo la designaci6n comercial de REFACTO® en Genetics Institute, Inc (Cambridge, MA). El REFACTO® diana fue proporcionado a una concentraci6n de aproximadamente 530 Ig/ml (7800 IU/ml) en His 19,4 mM, NaCl 300 mM, Cacl2 3,4 mM y Tween 80 al 0,1%, pH 7,0.

Se construyeron tres librerias, designadas como TN7 (5 x 109 de diversidad de secuencia de aminoacidos), TN8 (6 x 109 de diversidad de secuencia de aminoacidos) y TN9 (5 x 109 de diversidad de secuencia de aminoacidos) para la expresi6n de polipeptidos diversificados en fagos M13. Cada libreria fue cribada para ligantes a REFACTO® purificado. Cada una de las librerias se construyo para presentar un microproteina basada en una plantilla de 11 o 12 aminoacidos. La libreria TN7 utiliz6 una secuencia plantilla de Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa

5 (SEQ ID NO: 33); la libreria TN8 utiliz6 una secuencia plantilla de Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa (SEQ ID NO: 34); la libreria TN9 utiliz6 una secuencia plantilla de Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa (SEQ ID NO: 35).

Se llevaron a cabo tres rondas de cribados para cada libreria. A la conclusi6n de la tercera ronda de cribados se propagaron los fagos eluidos, y aislados individuales de cada libreria (86 por condici6n de eluci6n) se seleccionaron 10 al azar y se ensayaron por tecnicas ELISA estandar en cuanto a uni6n al factor VIII diana. Los fagos unidos fueron detectados con anticuerpo policlonal anti-M13 conjugado con HRP (Pharmacia). Se us6 un sustrato de peroxidasa TMB para HRP en el mecanismo de detecci6n ELISA. El sustrato TMB produce un color azul despues de la digesti6n con peroxidasa. El color es cuantificado por absorbancia a OD630. Los aislados de fagos que proporcionaron una senal significativa (OD630 > 0,25) por encima del fondo fueron considerados clones positivos. Se

15 realiz6 una secuenciaci6n de ADN de estos aislados para identificar el peptido presentado.

Las secuencias de aminoacidos de los peptidos presentados fueron deducidas a partir de las secuencias de ADN obtenidas. Los datos de secuencias de los aislados de fagos fueron agrupados por libreria y clasificados segun el grado de similitud. La frecuencia a la que se obtuvo cualquier secuencia dada fue apuntada, dado que esta indica una selecci6n por un ligante especifico. Se encontr6 que los aislados de fagos que tenian el mismo peptido

20 presentado estaban presentes en las poblaciones de fagos obtenidas por ambos de los dos metodos de eluci6n.

Tabla 1: Secuencias de aminoacidos de polipeptidos de uni6n a diana de la libreria TN7

TN7 aislado: secuencia frecuencia (eluci6n) senal de ELISA SEQ ID NO:

A06: His-Ser-Cys-Gly-Ser-Trp-Leu-Phe-Pro-Cys-Phe-Ala 7/96 (EG) 0,5 4

A08: Phe-Gly-Cys-Ser-Trp-Leu-Phe-Pro-Cys-Pro-Phe 2/96 (EG) 0,4 5

D03: Pro-His-Cys-Asn-Trp-Leu-Phe-Pro-Cys-Ser-Leu 7/192 (EG/pH2) 0,2 6

D04: Arg-Leu-Cys-Ser-Trp-Ile-Ser-Pro-Cys-Ser-Ala 6/192 (EG/pH2) 0,3 7

A09: Phe-His-Cys-Ile-Gly-Val-Trp-Phe-Cys-Leu-His 2/192 (EG/pH2) 0,1 8

C5/G10: Arg-Leu-Cys-Ser-Trp-Val-Ser-Pro-Cys-Ser-Ala 1/96 (EG) 0,5 9

Tabla 2:: Secuencias de aminoacidos de polipeptidos de uni6n a diana de la libreria TN8

TN8 aislado: secuencia frecuencia (eluci6n) senal de ELISA SEQ ID NO:

C10: His-Pro-Cys-Gly-Ser-Trp-Leu-Arg-Pro-Cys-Leu-His 10/192 (EG/pH2) 1,0 10

B05: Arg-Gly-Cys-Gly-Ser-Trp-Leu-Arg-Pro-Cys-Leu-Asp 2/192 (EG/pH2) 0,2 11

E04: His-Pro-Cys-Gly-Ser-Trp-Leu-His-Pro-Cys-Ala-Ala 3/192 (EG/pH2) 0,3 12

F02: His-Pro-Cys-Gly-Ser-Trp-Phe-Asn-Pro-Cys-Ala-His 5/192 (EG/pH2) 0,3 13

A02: His-Pro-Cys-Gly-Ser-Trp-Phe-Arg-Pro-Cys-Phe-His 3/96 (EG) 0,7 14

H07: His-Ala-Cys-Gly-Ser-Trp-Phe-Arg-Pro-Cys-His-Ala 3/192 0,4 15

E02: His-Leu-Cys-Gly-Ala-Trp-Phe-Arg-Pro-Cys-Asp-Ala 6/192 (EG/pH2) 0,4 16

C12: His-Leu-Cys-Phe-Ala-Trp-Phe-Arg-Pro-Cys-Asp-Ala 1/96 (EG) 0,4 17

A01: His-Gly-Cys-Gly-Ala-Trp-Phe-Arg-Pro-Cys-His-Ala 4/192 (EG/pH2) 0,2 18

E01: His-Pro-Cys-Gly-Ala-Trp-Phe-Asn-Pro-Cys-Pro-Arg 1/96 (pH2) 0,2 19

H08: His-Pro-Cys-Gly-Ala-Trp-Leu-Arg-Pro-Cys-Tyr-Asn 1/96 (EG) 1,0 20

A11/G10: His-Arg-Cys-Gly-Ser-Trp-Leu-His-Pro-Cys-Leu-Ala 1/96 (EG) 0,3 21

Tabla 3:: Secuencias de aminoacidos de polipeptidos de uni6n a diana de la libreria TN9

TN9 aislado: secuencia frecuencia (eluci6n) senal de ELISA SEQ ID NO:

B04: Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Ala-Phe-Asp-His-Cys-His 6/192 (EG/pH2) 0,8 22

G02: Phe-Cys-Trp-Val-His-Pro-Phe-Ala-His-Cys-Leu 2/96 (EG) 0,2 23

B01: Phe-Cys-His-Val-Phe-His-Phe-Ser-His-Cys-Asp 5/192 (EG/pH2) 0,2 24

A01: Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Ala-Phe-Asp-His-Cys-His 12/192 (EG/pH2) 1,2 25

E03: Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Asn-Phe-Ser-His-Cys-Ser 4/192 (EG/pH2) 1,1 26

C02: Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Pro-Phe-Asn-His-Cys-Asp 5/96 (pH2) 0,4 27

E12: Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Pro-Phe-Asn-His-Cys-Ser 6/96 (EG) 1,0 28

E09: Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Pro-Phe-Gln-His-Cys-Ala 4/192 (EG/pH2) 1,1 29

D06: Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Pro-Phe-His-His-Cys-Phe 2/192 (EG/pH2) 0,3 30

C01: Phe-Cys-His-Val-Phe-Asn-Phe-Val-His-Cys-Ser 2/192 (EG/pH2) 0,5 31

H11: Phe-Cys-His-Val-Phe-Pro-Phe-Leu-His-Cys-Asp 2/192 (EG/pH2) 0,2 32

Ejemplo II: Preparacian de ligandos de afinidad para un Factor VIII diana

En base a los datos presentados anteriormente, se seleccionaron y sintetizaron nueve peptidos para inmovilizaci6n en un material matricial de afinidad. Los peptidos sintetizados se exponen en la Tabla 4.

Tabla 4 Secuencia de aminoacidos de ligandos de afinidad y sus densidades en soporte s6lido

Ligando de afinidad: Aislado de fagos Secuencia (bucle de disulfuro subrayado) Densidad de ligando, mg/ml (Imol/ml)

CS-453: C10-TN8 AEGTGDHPCGSWLRPCLHDPGPEGGGS-NHNH2 2,64 (0,98)

CS-454: E02-TN8 AEGTGDHLCGAWFRPCDADPGPEGGGS-NHNH2 1,79 (0,67)

CS-455: A09-TN7 AEGTGDFHCIGVWFCLHDPGEGGGS-NHNH2 2,21 (0,83)

CS-456: A08-TN7 AEGTGDFGCSWLFPCPFDPGPEGGGS-NHNH2 3,69 (1,43)

CS-458: B04-TN9 AEGTGDFCWVFAFDHCHDPGPEGGGS-NHNH2 3,15 (1,17)

CS-459: E09-TN9 AEGTGDFCWVFPFQHCADPGPEGGGS-NHNH2 2,72 (1,02)

CS-460: D06-TN9 AEGTGDFCWVFPFHHCFDPGPEGGGS-NHNH2 4,24 (1,54)

GI-1: C05-/G10-TN7 Acetil-AEGTGDRLCSWVSPCSADPEGGGSK 0,83 (0,32)

GI-2: A11/G10-TN8 Acetil-AEGTGDHRCGSWLHPCLADPEGGGSK 0,43 (0,16)

Los peptidos de afinidad de la Tabla 4 se identifican, en el orden anterior, con las SEQ ID NOs: 36-44.

5 Los nueve peptidos de afinidad anteriores se produjeron por metodos de sintesis en fase s6lida clasicos descritos anteriormente. Para facilitar la inmovilizaci6n en un soporte s6lido, se incorpor6 una regi6n enlazadora corta hidrazida-funcional de siete aminoacidos (-PGPEGGGS-NHNH2; SEQ ID NO: 45) en el termino carboxi de siete de los peptidos (vease la Tabla 4). Se us6 un enlazador de inmovilizaci6n alternativo con dos de los peptidos (GI-1 y GI2 en la Tabla 4), es decir, -PEGGGSK; (SEQ ID NO: 46), que exhibe una lisina C-terminal para inmovilizaci6n y un

10 amino-termino acetilado.

Los ligandos candidatos se inmovilizaron sobre una resina cromatografica de metacrilato de etilenglicol sustituido con formilo (Toyopearl Formyl 650-M, tamano de poro de -1000 A; TosoHaas, Montgomeryville, PA). Los peptidos que contienen hidrazida fueron inmovilizados facilitando la formaci6n del enlace hidrazona, los peptidos GI-1 y GI-2 fueron inmovilizados por medio de aminaci6n reductiva usando NaCNBH3. La cantidad de polipeptido inmovilizado

15 en el soporte s6lido se determin6 cuantificando la cantidad de polipeptido libre que quedaba en soluci6n. La cantidad de ligando inmovilizado por ml de resina estuvo en el intervalo de 0,7-1,5 Imol para los peptidos inmovilizados por hidrazina.

Los nueve peptidos fueron evaluados por cromatografia de afinidad en cuanto a su capacidad de capturar el REFACTO® descrito en el Ejemplo I, bajo condiciones de uni6n y liberaci6n especificas. Los tampones usados en

20 estas evaluaciones se exponen en la Tabla 5.

Tabla 5

Condiciones de uni6n y eluci6n empleadas

Tamp6n de uni6n: NH4OAc 100mM, pH 6,3, NaCl 0,8M, Sorbitol 1M, Tween 80 al 0,02%, EDTA 3mM, CaCl2 5mM

Tamp6n de eluci6n A: Etilenglicol al 50%, His 20mM, NaCl 0,25M, CaCl2 20mM, Tween 80 al 0,01%, pH 7

Tamp6n de eluci6n B: CaCl2 0,35M, His 20mM, NaCl 0,3M, Tween 80 al 0,01%, pH 7

limpieza a pH 2: Gly 100mM, NaCl 1M, pH 2

El polipeptido similar al factor VIII (REFACTO®) se diluy6 en tamp6n SP hasta una concentraci6n de 150 Ig/ml.

25 Cada una de las resinas de afinidad (- 350 Il) se introdujeron en columnas de vidrio, y se aplicaron aproximadamente 150 Ig del factor VIII diana a las columnas de afinidad preparadas a un caudal de 200 Il/minuto (velocidad lineal de 170 cm/hora). El material unido se eluy6 secuencialmente con los tampones mostrados en la Tabla 5, y la eluci6n de las proteinas fue seguida por absorbancia UV a 280 nm. Se recogieron las fracciones y la masa y actividad del polipeptido similar al factor VIII recuperado se determin6 por HPLC de fase inversa y por ensayo enzimatico.

Para la determinaci6n de la masa, se gener6 una curva patr6n con REFACTO® (0-200 Ig) y la cantidad presente en cada fracci6n se calcul6 segun tecnicas bien conocidas en la tecnica. Se us6 HPLC de fase inversa en presencia de EDTA 20 mM para romper la molecula de REFACTO® en sus subunidades componentes, que fueron eluidas con un gradiente de acetonitrilo/TFA al 0,01%. El ensayo de actividad fue un ensayo basado en los factores IX, X. Los resultados para cada resina de afinidad se exponen a continuaci6n (Tabla 6).

Tabla 6

Resumen de datos obtenidos con nueve ligandos de afinidad

Condician de elucian (% de recuperacian)

Peptido: Ensayo Flujo A B pH2 Total

Resina no tratada: RP-HPLC Actividad 64,4 64,4 2,8 0,6 0 0 67,2 65,0

CS-453: RP-HPLC Actividad 0 0 43,2 26,4 0 0 43,2 26,4

CS-454: RP-HPLC Actividad 2,5 2,2 45,1 42,4 0 0 47,6 44,6

CS-455: RP-HPLC Actividad 65,8 61,6 1,4 1,3 0 0 67,2 62,9

CS-456: RP-HPLC Actividad 3,4 4,8 44,8 43,0 0 0 48,2 47,8

CS-458: RP-HPLC Actividad 1,8 1,4 54,3 55,6 0 0 56,1 57,0

CS-459: RP-HPLC Actividad 1,6 6,4 42,1 31,2 0 0 43,7 37,6

CS-460: RP-HPLC Actividad 24,6 28,4 28,8 0 0 0 53,4 28,4

GI-1: RP-HPLC Actividad 65,7 64,0 0 0 0 0 65,7 64,0

GI-2: RP-HPLC Actividad 31,3 33,7 28,1 20,3 0 2,0 61,4 53,9

En general, la cantidad total del factor VIII diana recuperado despues de cromatografia sobre los nueve ligandos estuvo en el intervalo de 40-67%. Los ligandos polipeptidicos CS-453, CS-454, CS-456 y CS-459 capturaron virtualmente todo el factor VIII diana aplicado, siendo el material unido eluido en presencia de etilenglicol. No se encontr6 actividad en el eluante de pH 2, por lo tanto se supuso que nada de la diana qued6 unida al ligando. La 15 incapacidad de las resinas CS-455 y GI-1 de capturar la diana puede ser debida a degradaci6n o inestabilidad del peptido, o a baja densidad de ligando en el soporte.

Ejemplo III: Unian comparativa de nhfVIII y REFACTO®

Se realizaron experimentos para demostrar que los ligandos polipeptidicos inmovilizados del Ejemplo II se unen a y liberan factor VIII humano nativo (nhfVIII) bajo condiciones similares y con rendimientos similares a los observados 20 con el polipeptido similar al factor VIII REFACTO®.

Para estos experimentos, se obtuvo nhfVIII de American Diagnostica, Inc. (Greenwich, CT; producto #408 nat) en la forma de un polvo liofilizado que contenia agentes estabilizantes. El nhfVIII se reconstituy6 segun las instrucciones del fabricante en un tamp6n de reconstituci6n (NH4OAc 72mM, pH 6,3, NaCl 360mM, Tween 80 0,04%) (Tamp6n 1).

Se us6 un kit de ELISA comercial (IMUBIND fVIII ELISA kit, Producto #884, American Diagnostica, Inc., Greenwich, CT), desarrollado para detectar el factor VIII, segun las instrucciones del fabricante a fin de detectar tanto las dianas REFACTO® como nhfVIII. El kit emplea un ensayo ELISA sandwich en el que la diana es capturada por un anticuerpo monoclonal inmovilizado, y la diana capturada es detectada con un segundo conjugado anticuerpo monoclonal-peroxidasa de rabano picante (HRP). La adici6n del sustrato de peroxidasa y su posterior reacci6n con la HRP produce un color azul (detectado a 630 nm) que cambia a amarillo (detectado a 450 nm) tras la adici6n de la disoluci6n de detenci6n de acido sulfurico 0,5 N. La respuesta de color es calibrada con patrones de factor VIII proporcionados por el fabricante.

La uni6n a REFACTO® se ensay6 en el Tamp6n 1. La uni6n tanto de REFACTO® como de nhfVIII se ensay6 usando tres resinas de afinidad preparadas como en el Ejemplo II, usando los peptidos de afinidad CS-454, CS-456 y CS-458 inmovilizados en medio Toyopearl Formyl 650-M. La densidad de ligando para cada polipeptido fue 1,79 mg/ml (0,67 Imol/ml), 3,69 mg/ml (1,43 Imol/ml) y 3,15 mg/ml (1,17 Imol/ml) respectivamente.

Para cada uno de los tres peptidos inmovilizados ensayados, perlas de peptido de 200 ml de una suspensi6n de polipeptido acoplado a Toyopearl se centrifugaron brevemente (30 segundos a 2000 x g a temperatura ambiente), el fluido sobrenadante se retir6, y las perlas (sedimentos) se lavaron dos veces. Para cada lavado, las perlas se resuspendieron en 500 Il de Tamp6n 1 y se centrifugaron como antes.

La soluci6n madre de REFACTO® se diluy6 hasta una concentraci6n final de 200 U/ml en Tamp6n 1, y 250 Il de la soluci6n diluida (- 50 U total) se anadieron a un sedimento lavado de cada una de las perlas de peptido. La suspensi6n se incub6 en una mezcladora de tambor vertical a temperatura ambiente durante una hora, periodo de uni6n despues del cual las perlas fueron convertidas en un sedimento por centrifugaci6n (30 segundos, 2000 x g) y las soluciones sobrenadantes, que representaban la fracci6n no unida ("No unido" en la Tabla 7, a continuaci6n), se retiraron y conservaron para el ensayo de la actividad del factor VIII no unido.

Las perlas convertidas en sedimento se lavaron una vez anadiendo 250 Il de Tamp6n 1, se mezclaron brevemente y la suspensi6n se centrifug6 como antes. Las soluciones sobrenadantes ("Lavado" en la Tabla 7), se retiraron y conservaron para el ensayo de la actividad del factor VIII.

Los sedimentos lavados se resuspendieron en 250 Il de Tamp6n A (L-histidina-HCl 20mM, NaCl 250mM, CaCl2 20mM, Tween 80 al 0,01%, etilenglicol al 50%, pH 6,3) y se incubaron en una mezcladora de tambor vertical durante 15 minutos a temperatura ambiente. Al final del periodo de eluci6n, se centrifugaron las suspensiones como anteriormente. Las soluciones sobrenadantes ("Eluato" en la Tabla 7), se retiraron y conservaron para el ensayo de la actividad del factor VIII eluido.

La soluci6n de REFACTO® de partida (diluida) (Entrada) y cada muestra (No unido, Lavado y Eluato) tomadas como se describe anteriormente se diluyeron 1:1400 en Diluyente de Ensayo (proporcionado con el kit), despues se sometieron a ELISA usando el kit de ensayo de factor VIII comercial. La Tabla 7 resume los resultados.

Tabla 7

Uni6n y eluci6n discontinua de REFACTO® con ligandos polipeptidicos inmovilizados

Ligando peptidico: % de entrada recuperada en:

inmovilizado: Entrada No unido Lavado Eluato Total

CS-454: 100 24 12 49 85

CS-456: 100 47 20 24 91

CS-458: 100 20 10 47 76

Para cada polipeptido inmovilizado ensayado, casi todo del REFACTO® (> 75%) anadido a la reacci6n de uni6n fue recuperado en las fracciones No unido, Lavado y Eluato. Una pequena cantidad de material (10%-25%) puede haber sido retenido en las perlas despues de la eluci6n.

Despues, las perlas de afinidad fueron regeneradas mediante un lavado en etilenglicol al 50%, His 20mM, NaCl 0,25M, CaCl2 20mM, Tween 80 al 0,01%, pH 7, y dos lavados con 250 Il de H3PO4 30mM, NaCl 1M, pH 2 (15 minutos para cada lavado). Despues de los lavados a pH 2, las perlas se lavaron una vez en PBS que contenia azida al 0,05% y se almacenaron a 4°C.

Una muestra de nhfVIII se diluy6 hasta una concentraci6n final de 100 U/ml por adici6n de 2,32 ml de H2O, 180 Il de NH4OAc 1M, pH 6,3 (hasta 72 mM), y 1 Il de Tween 80 (hasta 0,04%). La soluci6n madre de REFACTO® se diluy6 hasta 100 U/ml en un Tamp6n 1 modificado, en el que la concentraci6n de NaCl se redujo de 660mM a 330mM.

Los peptidos inmovilizados se ensayaron en cuanto a la uni6n a nhfVIII en comparaci6n con REFACTO®. Como

5 control de no uni6n, un polipeptido de la libreria TN9 (B10), que se une a una diana no relacionada y no se une a un factor VIII diana, se inmoviliz6 en las mismas perlas de metacrilato, como se describe anteriormente. Despues, las soluciones de nhfVIII y REFACTO® se mezclaron con perlas de afinidad regeneradas que portaban los ligandos CS454, CS-456 y CS-458 en un procedimiento de purificaci6n discontinuo comparativo. Las condiciones de reacci6n se exponen en la Tabla 8.

10 Tabla 8

Condiciones de reacci6n para el ensayo de uni6n a nhfVIII

Ligando peptidico inmovilizado: Volumen de la suspensian de perlas (Il) Diana (100 U/ml) Volumen de reaccian (Il)

CS-454: 200 hfVIII 500

CS-456: 200 hfVIII 500

CS-458: 200 hfVIII 500

TN9-B10: 200 hfVIII 500

CS-458: 100 REFACTO® 250

TN9-B10: 100 REFACTO® 250

Los resultados de estas pruebas se exponen en la Tabla 9. Tabla 9 Uni6n y eluci6n discontinua de nhfVIII y REFACTO® con ligandos polipeptidicos inmovilizados

Ligando peptidico: Diana % de total recuperado en:

inmovilizado: No unido Lavado Eluato

CS-454: hfVIII 67 12 21

CS-456: hfVIII 70 14 16

CS-458: hfVIII 48 13 39

TN9-B10: hfVIII 86 14 0

CS-458: REFACTO® 59 14 27

TN9-B10: REFACTO® 90 10 0

En conclusi6n, los ligandos polipeptidicos inmovilizados, CS-458, CS-454 y CS-456 se unen a y liberan nhfVIII bajo condiciones similares y con rendimientos similares a los observados previamente con un polipeptido similar al factor

VIII.

Siguiendo la descripci6n precedente, se pueden apreciar las importantes caracteristicas para moleculas de uni6n por

20 afinidad que permiten la detecci6n o separaci6n de factor VIII o polipeptidos similares al factor VIII en o de cualquier soluci6n. Realizaciones adicionales de moleculas de uni6n de la invenci6n y metodos alternativos adaptados a una soluci6n o corriente de alimentaci6n particular seran evidentes a partir del estudio de la descripci6n precedente. Todas las tales realizaciones y alternativas obvias pretenden estar dentro del alcance de esta invenci6n, definida por las reivindicaciones que siguen.

35 7293(2) Listado de secuencias -11.03.09 LISTADO DE SECUENCIAS

�110> Potter, M. Daniel Yu, Jinan Kelley, Brian D Deetz, Jeffrey S Booth, James E

�120> Moleculas de uni6n para Factor VIII humano y proteinas similares al Factor VIII humano

�130> DYX-008.0 PCT

�140> PCT/US00/00043

�141> 2000-01-03

�150> 09/224.785

�151> 1999-01-04

�160> 46

�170> PatentIn Ver. 2.1

�210> 1

�211> 11

�212> PRT

�213> Secuencia Artificial �220>

�223> Descripci6n de la Secuencia Artificial: peptido en bucle sintetico de uni6n �220>

�221> VARIANTE

�222> (1)..(2)

�223> Xaa1 es Arg, Phe, His o Pro; Xaa2 es Ser, Gly, Leu o His �220>

�221> VARIANTE

�222> (4)..(8)

�223> Xaa3 es Gly, Asn, Ile o Ser; Xaa4 es Ser, Trp o Gly; Xaa5 es Trp, Ile, Leu o Val; Xaa6 es Phe, Trp o Ser; Xaa7 es Pro o Phe

�220>

�221> VARIANTE

�222> (10)..(11)

�223> Xaa8 es Ser, Leu, Pro o Phe; Xaa9 es Ala, Phe, Leu o His

�400> 1

Xaa Xaa Xys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa 1 5 10

�210> 2

�211> 12

�212> PRT

�213> Secuencia Artificial 5 �220>

�221> VARIANTE

�222> (1)..(2)

10 �223> Xaa1 es Arg o His; Xaa2 es Ala, Arg, Gly, Leu o Pro �220>

�221> VARIANTE

�222> (4)..(5)

�223> Xaa4 es Gly o Phe; Xaa5 es Ala o Ser 15 �220>

�221> VARIANTE

�222> (7)..(8)

�223> Xaa7 es Leu o Phe; Xaa8 es Arg, Asn o His

�220> 20 �221> VARIANTE

�222> (11)..(12)

�223> Xaa11 es Ala, Asp, His, Leu, Phe, Pro o Tyr; Xaa12 es Ala, Arg, Asn, Asp o His

�400> 2

Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Pro Cys Xaa Xaa25 1 5 10

�210> 3

�211> 11

�212> PRT

30 �213> Secuencia Artificial �220>

�221> VARIANTE 35 �222> 3

�223> Xaa3 es His o Trp �220>

�221> VARIANTE

�222> (5)..(6)

�223> Xaa5 es His o Phe; Xaa6 es Ala, Asn, His o Pro

�220> 5 �221> VARIANTE

�222> (8)

�223> Xaa8 es Ala, Asn, Asp, Gln, His, Leu, Ser o Val �220>

�221> VARIANTE 10 �222> (11)

�223> Xaa11 es Ala, Asp, His, Leu, Phe o Ser

�400> 3

Phe Cys Xaa Val Xaa Xaa Phe Xaa His Cys Xaa 1 5 10 15

�210> 4

�211> 12

�212> PRT

�213> Secuencia Artificial 20 �220>

�223> Descripci6n de la Secuencia Artificial: peptido en bucle sintetico de uni6n

�400> 4

His Ser Cys Gly Ser Trp Leu Phe Pro Cys Phe Ala 1 5 10 25

�210> 5

�211> 11

�212> PRT

�213> Secuencia Artificial 30 �220>

�400> 5

Phe Gly Cys Ser Trp Leu Phe Pro Cys Pro Phe 1 5 10 35

�210> 6

�211> 11

�212> PRT

�213> Secuencia Artificial �220>

�400> 6

Pro His Cys Asn Trp Leu Phe Pro Cys Ser Leu 5 1 5 10

�210> 7

�211> 11

�212> PRT

10 �213> Secuencia Artificial �220>

�400> 7

Arg Leu Cys Ser Trp Ile Ser Pro Cys Ser Ala15 1 5 10

�210> 8

�211> 11

�212> PRT

20 �213> Secuencia Artificial �220>

�400> 8

Phe His Cys Ile Gly Val Trp Phe Cys Leu His25 1 5 10

�210> 9

�211> 11

�212> PRT

30 �213> Secuencia Artificial �220>

�400> 9

Arg Leu Cys Ser Trp Val Ser Pro Cys Ser Ala35 1 5 10

�210> 10

�211> 12

�212> PRT 40 �213> Secuencia Artificial �220>

�400> 10

His Pro Cys Gly Ser Trp Leu Arg Pro Cys Leu His 5 1 5 10

�210> 11

�211> 12

�212> PRT

10 �213> Secuencia Artificial �220>

�400> 11

Arg Gly Cys Gly Ser Trp Leu Arg Pro Cys Leu Asp 15 1 5 10

�210> 12

�211> 12

�212> PRT

20 �213> Secuencia Artificial �220>

�400> 12

His Pro Cys Gly Ser Trp Leu His Pro Cys Ala Ala25 1 5 10

�210> 13

�211> 12

�212> PRT

30 �213> Secuencia Artificial �220>

�400> 13

His Pro Cys Gly Ser Trp Phe Asn Pro Cys Ala His35 1 5 10

�210> 14

�211> 12

�212> PRT 40 �213> Secuencia Artificial �220>

�400> 14

His Pro Cys Gly Ser Trp Phe Arg Pro Cys Phe His 5 1 5 10

�210> 15

�211> 12

�212> PRT

10 �213> Secuencia Artificial �220>

�400> 15

His Ala Cys Gly Ser Trp Phe Arg Pro Cys His Ala 15 1 5 10

�210> 16

�211> 12

�212> PRT

20 �213> Secuencia Artificial �220>

�400> 16

His Leu Cys Gly Ala Trp Phe Arg Pro Cys Asp Ala25 1 5 10

�210> 17

�211> 12

�212> PRT

30 �213> Secuencia Artificial �220>

�400> 17

His Leu Cys Phe Ala Trp Phe Arg Pro Cys Asp Ala35 1 5 10

�210> 18

�211> 12

�212> PRT 40 �213> Secuencia Artificial �220>

�400> 18

His Gly Cys Gly Ala Trp Phe Arg Pro Cys His Ala 5 1 5 10

�210> 19

�211> 12

�212> PRT

10 �213> Secuencia Artificial �220>

�400> 19

His Pro Cys Gly Ala Trp Phe Asn Pro Cys Pro Arg15 1 5 10

�210> 20

�211> 12

�212> PRT

20 �213> Secuencia Artificial �220>

�400> 20

His Pro Cys Gly Ala Trp Leu Arg Pro Cys Tyr Asn25 1 5 10

�210> 21

�211> 12

�212> PRT

30 �213> Secuencia Artificial �220>

�400> 21

His Arg Cys Gly Ser Trp Leu His Pro Cys Leu Ala 35 1 5 10

�210> 22

�211> 11

�212> PRT 40 �213> Secuencia Artificial �220>

�400> 22

Phe Cys Trp Val Phe Ala Phe Asp His Cys His 5 1 5 10

�210> 23

�211> 11

�212> PRT

10 �213> Secuencia Artificial �220>

�400> 23

Phe Cys Trp Val His Pro Phe Ala His Cys Leu15 1 5 10

�210> 24

�211> 11

�212> PRT

20 �213> Secuencia Artificial �220>

�400> 24

Phe Cys His Val Phe His Phe Ser His Cys Asp25 1 5 10

�210> 25

�211> 11

�212> PRT

30 �213> Secuencia Artificial �220>

�400> 25

Phe Cys Trp Val Phe Ala Phe Asp His Cys His35 1 5 10

�210> 26

�211> 11

�212> PRT 40 �213> Secuencia Artificial �220>

�400> 26

Phe Cys Trp Val Phe Asn Phe Ser His Cys Ser 5 1 5 10

�210> 27

�211> 11

�212> PRT

10 �213> Secuencia Artificial �220>

�400> 27

Phe Cys Trp Val Phe Pro Phe Asn His Cys Asp15 1 5 10

�210> 28

�211> 11

�212> PRT

20 �213> Secuencia Artificial �220>

�400> 28

Phe Cys Trp Val Phe Pro Phe Asn His Cys Ser25 1 5 10

�210> 29

�211> 11

�212> PRT

30 �213> Secuencia Artificial �220>

�400> 29

Phe Cys Trp Val Phe Pro Phe Gln His Cys Ala35 1 5 10

�210> 30

�211> 11

�212> PRT 40 �213> Secuencia Artificial

�220>

�400> 30

Phe Cys Trp Val Phe Pro Phe His His Cys Phe 1 5 10

�210> 31

�211> 11

�212> PRT

�213> Secuencia Artificial �220>

�400> 31

Phe Cys His Val Phe Asn Phe Val His Cys Ser 1 5 10

�210> 32

�211> 11

�212> PRT

�213> Secuencia Artificial �220>

�400> 32

Phe Cys His Val Phe Pro Phe Leu His Cys Asp 1 5 10

�210> 33

�211> 11

�212> PRT

�213> Secuencia Artificial �220>

�223> Descripci6n de la Secuencia Artificial: plantilla para peptido en bucle sintetico de uni6n �220>

�211> VARIANTE

�222> (1)..(11)

�223> las posiciones de aminoacido 3 y 9 son cys invariante; todas las demas posiciones Xaa son variadas pero no Cys, para proporcionar una libreria de 5x10(9) peptidos diferentes basados en la secuencia plantilla

�400> 33

Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa 1 5 10

�210> 34

�211> 12

�212> PRT

�213> Secuencia Artificial �220>

�211> VARIANTE

�222> (1)..(12)

�223> las posiciones de aminoacido 3 y 10 son cys invariante; todas las demas posiciones Xaa son variadas pero no Cys, para proporcionar una libreria de 6x10(9) peptidos diferentes basados en la secuencia plantilla

�400> 34

Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa 1 5 10

�210> 35

�211> 11

�212> PRT

�213> Secuencia Artificial �220>

�211> VARIANTE

�222> (1)..(11)

�223> las posiciones de aminoacido 2 y 10 son cys invariante; todas las demas posiciones Xaa son variadas pero no Cys, para proporcionar una libreria de 5x10(9) peptidos diferentes basados en la secuencia plantilla

�400> 35

Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa 1 5 10

�210> 36

�211> 27

�212> PRT

�213> Secuencia Artificial �220>

�223> Descripci6n de la Secuencia Artificial: ligando de afinidad al Factor VIII sintetico

�400> 36

Ala Glu Gly Thr Gly Asp His Pro Cys Gly Ser Trp Leu Arg Pro Cys Leu His Asp Pro Gly Pro Glu Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 20 25

�210> 37

�211> 27

�212> PRT

�213> Secuencia Artificial 5 �220>

�400> 37

Ala Glu Gly Thr Gly Asp His Leu Cys Gly Ala Trp Phe Arg Pro Cys Asp Ala Asp Pro Gly Pro Glu Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 20 25 10

�210> 38

�211> 26

�212> PRT

�213> Secuencia Artificial 15 �220>

�400> 38

Ala Glu Gly Thr Gly Asp Phe His Cys Ile Gly Val Trp Phe Cys Leu His Asp Pro Gly Pro Glu Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 20 25 20

�210> 39

�211> 26

�212> PRT

�213> Secuencia Artificial 25 �220>

�400> 39

Ala Glu Gly Thr Gly Asp Phe Gly Cys Ser Trp Leu Phe Pro Cys Pro Phe Asp Pro Gly Pro Glu Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 20 25 30

�210> 40

�211> 26

�212> PRT

�213> Secuencia Artificial 35 �220>

�400> 40

Ala Glu Gly Thr Gly Asp Phe Cys Trp Val Phe Ala Phe Asp His Cys His Asp Pro Gly Pro Glu Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 20 25 40

�210> 41

�211> 26

�212> PRT

�213> Secuencia Artificial 5 �220>

�400> 41

Ala Glu Gly Thr Gly Asp Phe Cys Trp Val Phe Pro Phe Gln His Cys Ala Asp Pro Gly Pro Glu Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 20 25 10

�210> 42

�211> 26

�212> PRT

�213> Secuencia Artificial 15 �220>

�400> 42

Ala Glu Gly Thr Gly Asp Phe Cys Trp Val Phe Pro Phe His His Cys Phe Asp Pro Gly Pro Glu Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 20 25 20

�210> 43

�211> 25

�212> PRT

�213> Secuencia Artificial 25 �220>

�400> 43

Ala Glu Gly Thr Gly Asp Arg Leu Cys Ser Trp Val Ser Pro Cys Ser Ala Asp Pro Glu Gly Gly Gly Ser Lys 1 5 10 15 20 25 30

�210> 44

�211> 26

�212> PRT

�213> Secuencia Artificial 35 �220>

�400> 44

Ala Glu Gly Thr Gly Asp His Arg Cys Gly Ser Trp Leu His Pro Cys Leu Ala Asp Pro Glu Gly Gly Gly Ser Lys 1 5 10 15 20 25 40

�210> 45

�211> 8

�212> PRT

�213> Secuencia Artificial 5 �220>

�223> Descripci6n de la Secuencia Artificial: enlazador de inmovilizaci6n sintetico para peptido C-terminal

�400> 45

Pro Gly Pro Glu Gly Gly Gly Ser 1 5 10

�210> 46

�211> 7

�212> PRT

�213> Secuencia Artificial 15 �220>

�400> 46

Pro Glu Gly Gly Gly Ser Lys 1 5

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un polipeptido que se une al factor VIII y/o a un polipeptido similar al factor VIII, caracterizado por que dicho polipeptido tiene una secuencia de aminoacidos:

Phe-Cys-X18-Val-X19-X20-Phe-X21-His-Cys-X22 (SEQ ID NO: 3), en donde X18 es His o Trp; X19 es His o Phe; X20 es Ala, Asn, His o Pro; X21 es Ala, Asn, Asp, Gln, His, Leu, Ser, o Val; X22 es Ala, Asp, His, Leu, Phe o Ser.
2.

Un polipeptido que se une al factor VIII y/o a un polipeptido similar al factor VIII, caracterizado por que dicho polipeptido tiene una secuencia de aminoacidos que incluye una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en:

Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Ala-Phe-Asp-His-Cys-His; Phe-Cys-Trp-Val-His-Pro-Phe-Ala-His-Cys-Leu; Phe-Cys-His-Val-Phe-His-Phe-Ser-His-Cys-Asp; Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Ala-Phe-Asp-His-Cys-His; Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Asn-Phe-Ser-His-Cys-Ser; Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Pro-Phe-Asn-His-Cys-Asp; Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Pro-Phe-Asn-His-Cys-Ser; Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Pro-Phe-Gln-His-Cys-Ala; Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Pro-Phe-His-His-Cys-Phe; Phe-Cys-His-Val-Phe-Asn-Phe-Val-His-Cys-Ser; y Phe-Cys-His-Val-Phe-Pro-Phe-Leu-His-Cys-Asp;

o un polipeptido que se une al factor VIII y/o a un polipeptido similar al factor VIII, caracterizado por que dicho polipeptido tiene una secuencia de aminoacidos que incluye una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en:

AEGTGDFCWVFAFDHCHDPGPEGGGS-NHNH2; AEGTGDFCWVFPFQHCADPGPEGGGS-NHNH2; y AEGTGDFCWVFPFHHCFDPGPEGGGS-NHNH2.
3.

El polipeptido segun la reivindicaci6n 1, en donde el polipeptido es capaz de unirse al factor VIII humano y/o a un polipeptido similar al factor VIII en una soluci6n que comprende: NH4OAc 100mM, NaCl 0,8M, Sorbitol 1M, Tween 80 al 0,02%, EDTA 3mM, CaCl25mM, pH 6,3, y disociarse de dicho factor VIII humano y/o polipeptido similar al factor VIII en una soluci6n que contiene etilenglicol al 50%.
4.

El polipeptido segun la reivindicaci6n 3, que se disocia de dicho factor VIII humano y/o polipeptido similar al factor VIII cuando se pone en contacto con una soluci6n que comprende etilenglicol al 50%, His 20mM, NaCl 0,25mM, CaCl2 20mM, Tween 80 al 0,01%, pH 7.
5.

El polipeptido segun la reivindicaci6n 3, en donde el polipeptido tiene una secuencia de aminoacidos que incluye una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en: Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Ala-Phe-Asp-His-Cys-His; Phe-Cys-Trp-Val-His-Pro-Phe-Ala-His-Cys-Leu; Phe-Cys-His-Val-Phe-His-Phe-Ser-His-Cys-Asp; Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Ala-Phe-Asp-His-Cys-His; Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Asn-Phe-Ser-His-Cys-Ser; Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Pro-Phe-Asn-His-Cys-Asp;

Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Pro-Phe-Asn-His-Cys-Ser; Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Pro-Phe-Gln-His-Cys-Ala;

Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Pro-Phe-His-His-Cys-Phe; Phe-Cys-His-Val-Phe-Asn-Phe-Val-His-Cys-Ser; y Phe-Cys-His-Val-Phe-Pro-Phe-Leu-His-Cys-Asp;

o el polipeptido segun la reivindicaci6n 3, en donde la molecula de uni6n es un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos que incluye una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en: AEGTGDFCWVFAFDHCHDPGPEGGGS-NHNH2;

AEGTGDFCWVFPFQHCADPGPEGGGS-NHNH2; y AEGTGDFCWVFPFHHCFDPGPEGGGS-NHNH2.
6. Un metodo para detectar factor VIII humano y/o un polipeptido similar al factor VIII en una soluci6n sospechosa de contenerlo, que comprende:

(a)

poner en contacto tal soluci6n con un polipeptido segun cualquiera de las reivindicaciones 1-5; y

(b)

determinar si se ha producido uni6n entre dicho polipeptido y dicho factor VIII humano y/o polipeptido similar al factor VIII.
7. Un metodo para purificar factor VIII humano y/o polipeptido similar al factor VIII, que comprende:

(a)

inmovilizar un polipeptido segun cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en un soporte s6lido;

(b)

poner en contacto una soluci6n que contiene factor VIII humano y/o un polipeptido similar al factor VIII con dicho soporte;

(c)

separar la soluci6n de dicho soporte; y

(d)

obtener el factor VIII humano y/o polipeptido similar al factor VIII del soporte.
8. Medios de separaci6n, que comprenden:

(a)

un material matricial cromatografico, y, inmovilizado en el mismo,

(b)

un polipeptido segun cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
9. Medios de separaci6n, que comprenden el producto de reacci6n de:

(a)

un material matricial cromatografico reactivo con aminas, y

(b)

un polipeptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
10.

Los medios de separaci6n de la reivindicaci6n 9, en donde dicho material matricial es una resina cromatografica de metacrilato aldehido-funcional.
11.

Los medios de separaci6n de la reivindicaci6n 10, en donde dicha resina es un soporte copolimerico de etilenglicol-metacrilato sustituido con formilo.
12.

Un metodo para separar factor VIII o un polipeptido similar al factor VIII de una soluci6n que lo contiene, que comprende:

(a)

poner en contacto dicha soluci6n con los medios de separaci6n segun cualquiera de las reivindicaciones 8-11 bajo condiciones de uni6n,

(b)

retirar el material no unido, y

(c)

eluir el factor VIII o polipeptido similar al factor VIII unido de dichos medios de separaci6n.