ES2392061T3 - Matriz que comprende un esqueleto proteico de origen natural reticulado - Google Patents

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Abstract

Un armazón que comprende una pluralidad de unidades, cada una compuesta de un polímero sintético unido auna proteína de origen natural o una parte de la misma,en el que dicho polímero sintético es PEG y en el que dicha proteína de origen natural es fibrinógeno desnaturalizado.

Description

Matriz que comprende un esqueleto proteico de origen natural reticulado
Campo y antecedentes de la invención
La presente invención se refiere a una matriz compuesta de un esqueleto proteico de origen natural reticulado por polietilenglicol (PEG) y, más particularmente, a procedimientos para generarla y usarla en la regeneración de tejidos.
La ingeniería tisular, es decir, la generación in vitro de nuevos tejidos vivos, se usa ampliamente para sustituir tejidos enfermos, traumatizados y otros tejidos enfermizos. La estrategia clásica de la ingeniería tisular utiliza células vivas y un armazón básico para el cultivo celular (Langer y Vacanti, 1993; Nerem y Seliktar, 2001). Por tanto, la estructura de armazón intenta imitar la estructura natural del tejido que se está sustituyendo y proporcionar un soporte funcional temporal para las células (Griffith LG, 2002).
Los armazones para ingeniería tisular se fabrican a partir de materiales biológicos o a partir de polímeros sintéticos. Los polímeros sintéticos tales como polietilenglicol (PEG), hidroxiapatita/policaprolactona (HA/PLC), ácido poliglicólico (PGA), ácido poli-L-láctico (PLLA), polimetil metacrilato (PMMA), polihidroxialcanoato (PHA), poli-4hidroxibutirato (P4HB), polipropilenfumarato (PPF) polietilenglicol-dimetacrilato (PEG-DMA), fosfato beta-tricálcico (beta-TCP) y politetrafluoroetileno (PTFE) no biodegradable proporcionan un control preciso sobre las propiedades mecánicas del material (Drury y Mooney, 2003).
Los procedimientos comunes de fabricación de armazones están basados en espumas de polímeros sintéticos. Sin embargo, la migración celular en el interior de los armazones sintéticos está limitada por la ausencia de oxígeno y de aporte de nutrientes. Para superar tales limitaciones, se han desarrollado nuevas estrategias que utilizan fabricaciones sólidas de forma libre y arquitectura vascular interna (Revisado en Sachlos E y Czernuszka JT, 2003; Eur. Cell Mater. 5: 29-39). De igual modo, también se emplean procedimientos de liofilización para crear estructuras tridimensionales únicas con distinta porosidad y permeabilidad. Sin embargo, la creación de poros en estos materiales es un procedimiento agresivo que implica el uso de reactivos tóxicos que eliminan la posibilidad de moldear previamente construcciones tisulares con células vivas. Por lo tanto, muchos de los materiales prefabricados están sometidos a siembra de células poco uniforme y a poblaciones de células no homogéneas dentro de las construcciones. Además, generalmente los materiales se degradan desigualmente durante el proceso de cultivo tisular, creando un tejido altamente anisotrópico con cinética de crecimiento modificada.
La Patente de Estados Unidos Nº: 5.863.984 desvela matrices porosas formadas a partir de un biopolímero tal como colágeno, que está conjugado con PEG por medios químicos o por irradiación. La conjugación con PEG reduce la biodegradabilidad de la matriz, conservando de esta manera su estructura porosa.
Los armazones constituidos por PEG son altamente biocompatibles (Merrill y Salzman, 1983) y presentan características físicas versátiles en base a su porcentaje en peso, longitud de la cadena molecular y densidad de reticulación (Temenoff JS y col., 2002). Además, los hidrogeles de PEG pueden realizar una transición controlada de líquido a sólido (gelificación) en presencia de suspensión celular (Elbert y Hubbell, 2001). Además, la reacción de gelificación del PEG (es decir, PEGilación) puede realizarse en condiciones no tóxicas en presencia de un fotoiniciador (Elisseeff J y col., 2000; Nguyen y West, 2002) o mezclando una solución reactiva de dos partes del PEG funcionalizado y reticulando los constituyentes (Lutolf y Hubbell, 2003).
Sin embargo, aunque los polímeros sintéticos mencionados anteriormente permiten un control preciso sobre el material armazón, a menudo ofrecen información biológica inadecuada para el cultivo celular. Como resultado, estos materiales no son adecuados para el cultivo tisular a largo plazo o para la regeneración tisular in vivo.
Por otro lado, los armazones de origen natural tales como colágeno, fibrina, alginato, ácido hialurónico, gelatina y celulosa bacteriana (CB) proporcionan señales biofuncionales y presentan diversas interacciones celular. Por ejemplo, la fibrina, un sustrato natural de remodelación tisular (Herrick S., y col., 1999), contiene diversos dominios de señalización celular tales como sustrato de degradación por proteasas (Werb Z, 1999) y dominios de adhesión celular (Herrick S., 1999). Sin embargo, como tales materiales biológicos presentan señales intrínsecas múltiples (por ejemplo, regulación de adhesión celular, proliferación, fenotipo celular, producción de matriz y actividad enzimática), su uso como armazones en la regeneración tisular a menudo produce una regulación anómala de sucesos celulares (Hubbell, 2003). Adicionalmente, los armazones naturales a menudo son mucho más débiles después de la reconstitución en comparación con la resistencia del material biológico original y pueden ejercerse escaso control para mejorar sus propiedades físicas.
Por lo tanto, el armazón ideal para la ingeniería tisular debe presentar las características estructurales de los materiales sintéticos con la biofuncionalidad de los materiales naturales (Leach JB, y col., 2004; Leach y Schmidt, 2005). Para este fin, se han propuesto diversos procedimientos de preparación de armazones con biofuncionalidad natural y propiedades físicas de los polímeros sintéticos. Sin embargo, la mayoría de estas estrategias “híbridas”, no llegan a producir un biomaterial con amplia biofuncionalidad intrínseca y un amplio intervalo de propiedades físicas; principalmente debido a que solo emplean un único elemento biofuncional en el diseño del material. Por ejemplo, estudios previos describen la preparación de armazones que consisten en elementos biodegradables injertados en
el esqueleto de una red de hidrogel sintética. Los hidrogeles se prepararon a partir de PEG sintético que se reticuló con oligopéptidos cortos que contenían sustratos enzimáticos capaces de degradarse proteolíticamente mediante enzimas secretadas por células [Lutolf y col (2003); Gobin y West (2002)]. Adicionalmente, para aumentar la biofuncionalidad de dichos hidrogeles, se injertaron motivos de adhesión sintéticos tales como las secuencias RGD [Lutolf y col (2003)] o VEGF (Seliktar y col; 2004, Zisch AH, y col, 2003; FASEB J. 17: 2260-2. Publicado el 16 de octubre de 2003) en el esqueleto de PEG. Sin embargo, el uso de dichos armazones (en los que el PEG es el componente principal) estaba limitado por la bio-retroalimentación y/o respuestas celulares a largo plazo insuficientes que son esenciales para la estabilidad fenotípica.
Otros intentos para aumentar la biofuncionalidad de los armazones incluyen la fabricación de precursores de 100 aminoácidos, de tipo proteico, diseñados por ingeniería genética, que contienen, entre otras cosas, varios sustratos para proteasas y sitios de adhesión (Halstenberg y col. 2002; Biomacromolecules, 3: 710-23). Sin embargo, el tamaño aumentado de los precursores proteicos y la presencia de grupos tiol, necesarios para la reacción de PEGilación, complica la purificación y la solubilización de los precursores durante el proceso de fabricación del armazón. Además, similar a los materiales biosintéticos basados en PEG, los armazones de precursores proteicos diseñados por ingeniería genética no proporcionan la suficiente biofuncionalidad para permitir una estabilidad a largo plazo.
Reduciendo la presente invención a la realización práctica, los autores de la presente invención han revelado que los armazones híbridos biosintéticos, compuestos de un esqueleto de fibrinógeno que está reticulado con cadenas laterales de polietilenglicol (PEG) funcional, son armazones excelentes, biodegradables y que tales armazones pueden usarse en aplicaciones de regeneración tisular.
Sumario de la invención
De acuerdo con un aspecto de la presente invención se proporciona un armazón que comprende una pluralidad de unidades, compuesta cada una por PEG unido a fibrinógeno desnaturalizado.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un hidrogel formado a partir del armazón de la reivindicación 1.
De acuerdo con otro aspecto más de la presente invención se proporciona un procedimiento de generación de un armazón que comprende: (a) la unión por covalencia del PEG al fibrinógeno desnaturalizado para obtener de esta manera una molécula precursora de polímero-proteína, y; (b) la reticulación de una pluralidad de moléculas precursoras para generar de esta manera el armazón biodegradable.
De acuerdo aún con otro aspecto de la presente invención se proporciona un procedimiento para inducir la formación in vivo de un tejido, comprendiendo el procedimiento: (a) proporcionar un armazón formado por una pluralidad de unidades compuesta cada una por PEG unido a fibrinógeno desnaturalizado (b) implantar el armazón en un sujeto para inducir así la formación del tejido.
De acuerdo con otro aspecto adicional más de la presente invención se proporciona un procedimiento para inducir in vivo la formación de un tejido, comprendiendo el procedimiento administrar a un sujeto que lo necesite una composición compuesta por PEG unido a fibrinógeno desnaturalizado, pudiendo la composición formar un armazón dentro de un sujeto e induciendo de esta manera la formación del tejido in vivo.
De acuerdo aún con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un procedimiento para el tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno caracterizado por una lesión o pérdida tisular, comprendiendo el procedimiento: (a) proporcionar un armazón formado por una pluralidad de unidades cada una compuesta por PEG unida a fibrinógeno desnaturalizado y (b) implantar el armazón en el sujeto para inducir de esta manera la formación del tejido y tratar el trastorno caracterizado por una lesión o pérdida tisular.
De acuerdo con un aspecto adicional más de la presente invención se proporciona un procedimiento para el tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno caracterizado por una lesión o pérdida tisular, comprendiendo el procedimiento administrar al sujeto una composición compuesta por PEG unido a fibrinógeno desnaturalizado, pudiendo la composición formar un armazón dentro del sujeto e induciendo así una formación de un tejido y tratar el trastorno caracterizado por una lesión o pérdida tisular.
De acuerdo con otro aspecto más de la presente invención se proporciona una composición de materia que comprende polietilenglicol (PEG) unido a fibrinógeno desnaturalizado.
De acuerdo con características adicionales en realizaciones preferidas de la invención descrita a continuación, el armazón comprende adicionalmente una molécula que puede reticularse, uniendo por covalencia la molécula a las unidades.
De acuerdo con otras características adicionales en las realizaciones preferidas descritas el armazón es biodegradable.
De acuerdo con otras características adicionales en las realizaciones preferidas descritas el PEG se selecciona del grupo que consiste en PEG-acrilato (PEC-Ac) y PEG-vinilsulfona (PEG-VS).
De acuerdo con otras características adicionales en las realizaciones preferidas descritas el PEG-Ac se selecciona del grupo que consiste en PEG-DA, PEG multi-Acrilato en estrella de 4 brazos y PEG multi-Acrilato en estrella de 8 brazos.
De acuerdo con otras características adicionales en las realizaciones preferidas descritas el PEG-DA es PEG-DA de 4-kDa, PEG-DA de 6-kDa, PEG-DA de 10-kDa y/o PEG-DA de 20-kDa.
De acuerdo con otras características adicionales en las realizaciones preferidas descritas el polímero sintético es PEG mientras que la proteína de origen natural es fibrinógeno desnaturalizado.
De acuerdo con otras características adicionales en las realizaciones preferidas descritas el PEG se selecciona del grupo que consiste en PEG-DA, PEG multi-Acrilato en estrella de 4 brazos y PEG multi-Acrilato en estrella de 8 brazos.
De acuerdo con otras características adicionales en las realizaciones preferidas descritas el PEG-DA es PEG-DA de 4-kDa, PEG-DA de 6-kDa, PEG-DA de 10-kDa y/o PEG-DA de 20-kDa.
De acuerdo con otras características adicionales en las realizaciones preferidas descritas el fibrinógeno está desnaturalizado.
De acuerdo con otras características adicionales en las realizaciones preferidas descritas la proporción molar entre el PEG-DA respecto al fibrinógeno en las unidades es de 2-400 a 1, respectivamente.
De acuerdo con otras características adicionales en las realizaciones preferidas descritas la molécula capaz de reticularse se selecciona del grupo que consiste en PEG-DA, PEG multi-Acrilato y PEG-VS.
De acuerdo con otras características adicionales en las realizaciones preferidas descritas el fibrinógeno es fibrinógeno completo o fibrinógeno fragmentado.
De acuerdo con otras características adicionales en las realizaciones preferidas descritas la proteína de origen natural es fibrinógeno completo y se considera una concentración de las unidades en el hidrogel seleccionada de un intervalo de 0,5-35%.
De acuerdo con otras características adicionales en las realizaciones preferidas descritas el fibrinógeno es fibrinógeno fragmentado y se considera una concentración de las unidades en el hidrogel seleccionada de un intervalo de 0,5-35%.
De acuerdo con otras características adicionales en las realizaciones preferidas descritas el módulo de elasticidad del hidrogel está en un intervalo de 0,02-0,11 kPa para un 10-20% de polímero.
De acuerdo con otras características adicionales en las realizaciones preferidas descritas el módulo de elasticidad del hidrogel está en un intervalo de 0,01-0,07 kPa para un 10-20% de polímero.
De acuerdo con otras características adicionales en las realizaciones preferidas descritas la reticulación se efectúa usando PEG, PEG-DA, PEG multi-Acrilato y/o PEG-VS.
De acuerdo con características adicionales en las realizaciones preferidas descritas la reticulación se efectúa in vitro, ex vivo y/o in vivo.
La presente invención aborda con éxito las limitaciones de las configuraciones hasta ahora conocidas proporcionando un armazón biodegradable, adecuado para aplicaciones de regeneración tisular.
A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado al comúnmente entendido por un experto habitual en la técnica a la cual pertenece la presente invención.
Breve descripción de los dibujos
En el presente documento la invención se describe, solo como ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos. Con referencia específica ahora a los dibujos con detalle, se hace hincapié en que las particularidades mostradas son a modo de ejemplo y solo con objeto de ilustrar el análisis de las realizaciones preferidas de la presente invención y se presentan con intención de proporcionar lo que se cree que es la descripción más útil y fácil de entender de los principios y aspectos conceptuales de la presente invención. En este sentido, para un entendimiento fundamental de la invención, no se realizan intentos para mostrar detalles estructurales de la invención con más detalles de los necesarios, la descripción junto con los dibujos pone de manifiesto a los expertos en la técnica como pueden llevarse a cabo las diversas formas de realización de la invención.
En los dibujos:
Las Figuras 1a-b son ilustraciones esquemáticas del ensamblaje del hidrogel de PEG unido a fibrinógeno. La Figura 1a ilustra fragmentos de fibrinógeno PEGilado que contienen un sitio de escisión de proteasa natural (amarillo) y grupos tiol no apareados múltiples (rojo) para la conjugación covalente de PEG funcionalizado mediante la reacción de adición de tipo Michael. En la Figura 1b el ensamblaje del hidrogel de PEG unido a fibrinógeno se consigue por reticulación covalente de PEG-acrilatos que no han reaccionado entre sí, dando como resultado una red de hidrogel de fibrinógeno PEGilado. La reacción de reticulación puede conseguirse por polimerización por radicales libres en presencia de cantidades muy pequeñas de fotoiniciador y luz de baja potencia. Las Figuras 2a-b son tinciones con azul Coomassie® de geles SDS-PAGE que ilustran fragmentos de fibrinógeno PEGilado y no PEGilado antes y después de la PEGilación con PEG funcionalizado. Figura 2a electroforesis de fibrinógeno completo PEGilado en SDS-PAGE al 10%. El fibrinógeno se incubó con PEG diacrilato fraccionalizado lineal de 4-kDa (PEG-DA; carriles 1-3) o con PEG-OH (4 kDa, carril 4). Se observa la presencia de cadenas α (63,5-kDa), cadenas β (56-kDa) y cadenas γ (47-kDa) de fibrinógeno en presencia de PEG-OH después de 12 horas de incubación (carril 4) y el retraso progresivo del fragmento de proteína en el gel de acrilamida después de la incubación con PEG lineal funcionalizado de 4-kDa durante una hora (carril 3), 2 horas (carril 2) o una noche (carril 1). Carril 5 - marcador de peso molecular (patrones de peso molecular BIO-RAD SDS-PAGE, Intervalo de anchura: 200.000-6.000 Da); Figura 2b - Electroforesis en SDS-PAGE al 20% de fragmentos de fibrinógeno PEGilado escindidos con bromuro de cianógeno (CNBr). El fibrinógeno se trató con CNBr durante 12 horas como se describe en Materiales y Procedimientos Experimentales del Ejemplo 1 de la sección de Ejemplos, más adelante, y los fragmentos de fibrinógeno escindidos se incubaron durante 1 hora en presencia (carriles 1 y 2) o en ausencia (carril 3) de PEG-DA lineal fraccionalizado. Se observan las especies de fibrinógeno muy PEGilado (es decir, los fragmentos de alto peso molecular) presentes después de 1 hora de incubación con PEG-DA lineal de 6-kDa (carril 1) y 4-kDa (carril 2). El carril 4 es el marcador de peso molecular. Las Figuras 3a-b son gráficos que ilustran características de tensión – deformación de hidrogeles basados en PEG. La pendiente de la curva de tensión – deformación representa el módulo del material. La dependencia del módulo [expresadas en unidades de kilo Pascal (kPa)] sobre la longitud del PEG usado se midió usando un sistema de ensayo de material de columna sencillo Instron ™ 5544 con el programa informático Merlin (www.instron.com). Figura 3a - comportamiento de hidrogeles PEG-PEG con 20% de polímero (p/v); Figura 3b comportamiento de hidrogeles PEG-fibrinógeno. Obsérvese que las propiedades del material (módulo) dependen del peso molecular del PEG (Figura 3a). Obsérvese también que mientras que en los hidrogeles de PEG-PEG el módulo del hidrogel es directamente proporcional al peso molecular del PEG (Figura 3a), en los hidrogeles de PEG-fibrinógeno se observaron valores de módulo similares usando el PEG de 4-kDa y el PEG de 6-kDa. Además de esta excepción, el comportamiento de tensión – deformación de los hidrogeles de PEGfibrinógeno fue idéntico al de los controles solo con PEG. Las Figuras 4a-c son gráficos que ilustran la capacidad para manipular las propiedades mecánicas de los hidrogeles de PEG-fibrinógeno modificando el porcentaje del polímero usado (Figura 4a), el peso molecular del PEG utilizado (Figura 4b) y la composición polímero/proteína (Figura 4c). La introducción de variaciones en estos parámetros permite la generación de hidrogeles con una amplia gama de posibilidades, incluyendo módulos elásticos diferentes (medido en kPa). La Figura 4a muestra el efecto del aumento del porcentaje de la composición polimérica del fibrinógeno PEGilado de 4-kDa en el módulo elástico de hidrogel; obsérvese que el módulo elástico de los hidrogeles de PEG-fibrinógeno (proteína dividida y completa) aumenta proporcionalmente con el aumento del porcentaje de la composición polimérica (lo que también es cierto para hidrogeles de fibrinógeno PEGilados de 6-kDa y 20-kDa). La Figura 4b demuestra el efecto de aumentar el peso molecular de PEG (usando 20% de polímero) en el módulo elástico de hidrogel; obsérvese que el peso molecular del constituyente de PEG tiene un efecto proporcional directo sobre el módulo elástico de los hidrogeles (lo que también es cierto para hidrogeles con un 10% y un 15% de PEG-fibrinógeno). La Figura 4c muestra el efecto de aumentar la proporción de fibrinógeno PEGilado respecto a PEG-DA adicional en la composición de los hidrogeles (usando 15% de polímero y fibrinógeno completo PEGilado). Obsérvese que la cantidad relativa de fibrinógeno PEGilado y PEG-DA libre, no unido, en la solución precursora repercute directamente en la rigidez del hidrogel después de la polimerización por radicales libres; el gráfico muestra el aumento en la rigidez del hidrogel de PEG-fibrinógeno en función de la adición de PEG-DA libre. Obsérvese que los hidrogeles fabricados solo con PEG-DA (sin fibrinógeno) son siempre más rígidos en comparación con los hidrogeles de fibrinógeno PEGilado. Todas las barras de error muestran desviaciones típicas de la media. Las Figuras 5a-b son gráficos que ilustran la degradación de hidrogeles de PEG-fibrinógeno mediada por proteasas. La liberación de fragmentos de fibrinógeno colorimétricos de los hidrogeles se usó para evaluar la degradación mediada por proteasas después de 30 minutos de incubación con las proteasas colagenasa o tripsina. La Figura 5a ilustra la degradación mediada por proteasas en presencia de una solución con colagenasa 0,5 mg/ml o tripsina 0,05 mg/ml después de 30 minutos de incubación a 37 ºC y agitación suave. Obsérvese que la cantidad de degradación que se produce por la proteólisis mediada por tripsina se ve significativamente afectada por el peso molecular del constituyente de PEG injertado [es decir, más degradación en el caso del PEG de alto peso molecular (20 kDa)], mientras que la cantidad de degradación que se produce por la proteólisis mediada por Colagenasa se ve significativamente afectada por el constituyente de fibrinógeno (es decir, más degradación en el caso de fibrinógeno escindido). La Figura 5b ilustra la degradación mediada por proteasas en función de la concentración de la proteasa. Los
hidrogeles de PEG-fibrinógeno constituidos por PEG al 15% (peso molecular de 6 kDa) y fibrinógeno completo se sometieron a degradación por Tripsina y Colagenasa como se describe anteriormente en el presente documento. Obsérvese la respuesta dependiente de la dosis de los productos de degradación en función de la concentración de la proteasa. Todos los datos de degradación se normalizan con los valores colorimétricos de los hidrogeles completamente degradados en su solución de proteasa respectiva. Las Figuras 6a-e son imágenes microscópicas de contraste de fase de cultivos celulares vasculares en Hidrogeles basados en PEG. La Figura 6a ilustra una monocapa de células endoteliales aórticas de bovino después de crecer durante 24 horas en una superficie de hidrogel de PEG-fibrinógeno (PEG de 4-kDa, 10% de polímero); las Figuras 6b-c representan células de musculo liso aórtico bovino después de crecer tridimensionalmente durante 24 horas dentro de un hidrogel de PEG-fibrinógeno (PEG de 4-kDa, 10% de polímero). Obsérvese la adhesión y propagación tridimensional de las células en los dos portaobjetos en z distintos del gel (Figura 6 b y c); la Figura 6d ilustra la monocapa de células endoteliales aórticas de bovino como en la Figura 6a después de crecer durante 24 horas sobre un hidrogel de control de PEG-PEG (PEG de 4kDa, 10% de polímero); la Figura 6e ilustra las células de músculo liso aórtico como en las Figuras 6b-c después de crecer dentro de un hidrogel de PEG-PEG (PEG de 4-kDa, 10% de polímero). Obsérvese la adhesión y propagación de las células endoteliales (Figura 6a), así como de las células de músculo liso (Figuras 6b-c) cuando crecen en los hidrogeles de PEG-fibrinógeno pero no en los hidrogeles de control PEG-PEG (Figura 6d-e). En ausencia de un sustrato proteolítico en los hidrogeles de control de PEG-PEG, obsérvese que las células de músculo liso encapsuladas no tienen extensiones celulares (Figura 6e). Todas las imágenes se adquirieron digitalmente a un aumento de 200 X usando un microscopio de contraste de fase. Las Figuras 7a-b son secciones histológicas transversales de células similares sembradas hidrogeles basados en PEG representados en la figura 6. Se cultivaron células de musculo liso aórtico bovino durante 48 horas en un hidrogel de PEG-fibrinógeno (PEG de 4 kDa, 10% de polímero, Figura 7a) o un hidrogel de control de PEG-PEG (4 kDa, 10%); los especímenes de hidrogel se cortaron en secciones de 7 μm de grosor y se tiñeron con hematoxilina-eosina (H&E) que tiñe el núcleo celular de color tinción púrpura oscuro. Obsérvese la propagación de células dentro de la red gelatinosa en el hidrogel de PEG-fibrinógeno (Figura 7a) comparada con las células encapsuladas mostradas dentro del hidrogel de control de PEG-PEG, que son proteolíticamente no degradables. Las Figuras 8a-d son fotografías que ilustran la formación del modelo de defecto de tamaño crítico en tibia de rata. La Figura 8a ilustra la inserción de una fijación externa en la tibia de la rata; la Figura 8b ilustra la exposición de la tibia; la Figura 8c ilustra la escisión de una sección de la tibia de 7 mm de anchura; la Figura 8d ilustra la inserción en el sitio del defecto de un cilindro Gelrin™ sólido prefabricado de un diámetro de 3 mm (que está fabricado con el hidrogel de PEG-fibrinógeno de la presente invención). Las Figuras 9a-b son imágenes por rayos x que representan la formación de nuevo tejido óseo dentro del defecto de tamaño crítico en tibia de rata 5 semanas después de la operación e implantación de Gelrin™. En el animal tratado con Gelrin™ se observa claramente la formación de una callosidad perióstica (Figura 9b, flecha) en comparación con el control, animal no tratado (Figura 9a, flecha señala el pérdida de hueso). Aunque la imagen del animal de control, mostrada por rayos X, se tomó 3 semanas después de la operación, 5 semanas después de la operación se obtuvieron resultados similares (datos no mostrados). La Figura 10 es una microfotografía una sección histológica de tibia de rata teñida con hematoxilina-eosina (H&E) que muestra nueva formación de hueso en la región intersticial de la tibia de rata con implante Gelrin™ 5 semanas después de la inducción de un defecto de tamaño crítico. Obsérvese el hueso de tipo compacto aparentemente casi normal, compatible con el córtex usual del hueso de rata, el sistema Haversiano con un pequeño canal central que contiene vasos sanguíneos (flecha pequeña) y las laminillas concéntricamente organizadas. Obsérvense también los osteocitos (OST) normales, una célula en una laguna, de tal manera que no hay muestras de un suceso de remodelación reciente. Incluso a través de una microfotografía polarizada no disponible, el hueso parece tener un modelo laminar en todas las partes. La Figura 11 es una microfotografía de una sección histológica de tibia de rata teñida con hematoxilina-eosina (H&E) que muestra una cicatrización osteonal con una isla cartilaginosa en la región intersticial de la tibia de rata con implante Gelrin™ 5 semanas después de la inducción de un defecto de tamaño crítico. Obsérvese que aunque el propio cartílago es avascular, se observa un crecimiento interno vascular en los bordes superior e inferior del cartílago (flechas cortas), indicativo de osificación endocondral. Adicionalmente, en el borde superior, el tejido fibrovascular que invade el cartílago está acompañado por osteoblastos (OST) cuboidales, lo que indica que se está produciendo la deposición de hueso primario. Obsérvese también el reborde osteoblástico del hueso (prueba de osteogénesis en curso) que se observa en la parte inferior, parcialmente por osteoblastos (OST) cuboidales y parcialmente por células de la pared del hueso (BLC, Bone Lining Cells). Las características en esta imagen son típicas de una restauración ósea normal; similar a lo que se encuentra en el intersticio de un hueso fracturado que se ha fijado sin contacto estrecho. La Figura 12 es una microfotografía de una sección histológica de tibia de rata teñida con hematoxilina-eosina (H&E) que muestra un resto de Gelrin™ en la región intersticial de la tibia de rata con implante Gelrin™ 5 semanas después de la inducción de un defecto de tamaño crítico. Esta imagen muestra con más detalle el Gelrin™ degradado (estrella) fibróticamente encapsulado y regiones de unidades básicas multicelulares (UBM) circundantes. Obsérvense las numerosos trabéculas óseas recién formadas (flechas alargadas) y las trabéculas óseas separadas por grandes rastros de tejido fibroso celular (flechas de doble punta). Cabe mencionar que, durante la cicatrización intersticial de una fractura ósea, se encuentran similares características sin contacto de
las aristas óseas. La Figura 13 es una microfotografía a alto aumento de una sección histológica de tibia de rata teñida con hematoxilina-eosina (H&E) que muestra un resto de Gelrin™ en la región intersticial de la tibia de rata con implante Gelrin™ 5 semanas después de la inducción de un defecto de tamaño crítico. Esta imagen muestra con mas detalle la densa matriz conectiva y la formación de nuevo hueso cerca del Gelrin™ residual de una rata de tibia 5 semanas después del implante. Las flechas cortas indican las regiones de Gelrin™ residual rodeadas por matriz conectiva densa y la formación de nuevo hueso [asterisco (*)]. La arista de corte del hueso con UBM (o la esquina inferior derecha) indica la actividad de remodelación de hueso maduro en la que las UBM preparan el camino para nueva formación de hueso. La aparición de diversas áreas pequeñas de Gelrin™ residual sugiere que esta sección de tejido representa el centro del intersticio. Obsérvese la presencia de tejido fibroso sin respuesta inflamatoria alrededor de los dos grupos redondeados de Gelrin™ descompuesto (flechas cortas), demostrando las características biocompatibles del hidrogel Gelrin™. La Figura 14 es una microfotografía que representa la formación de hueso nuevo ósea en la región intersticial de un animal tratado con Gelrin™. Se observa una sección histológica de una tibia de rata 5 semanas después de la creación de un defecto de tamaño crítico en tibia y posterior implantación de Gelrin™. La grieta observada con los espacios vacíos alrededor del septo (flechas largas) es en parte un resultado de seccionar el bloque de parafina que contiene dos tejidos diferentes (es decir, tejido óseo y fibroso) presentando diferentes propiedades biomecánicas (es decir, un artefacto de seccionamiento). Obsérvese la presencia de un septo tisular fibroso dentro de la “grieta”. Obsérvese también el sistema Haversiano bien formado (flechas cortas) representando parte del córtex preexistente y un hueso compacto. La Figura 15 es una microfotografía de una sección histológica de tibia de rata que representa una vista característica de hueso primario 5 semanas después de la implantación de Gelrin™ en el sitio del defecto de un defecto de tamaño crítico en la tibia de la rata. Obsérvese la osificación endocondral que sufre el cartílago (abajo en el lado izquierdo de la imagen) como demuestra el crecimiento interno de tejido fibroso vascularizado en la matriz condroide (indicado mediante asteriscos). La característica notable es la presencia de hileras de osteoblastos (OST) cuboidales a lo largo del hueso recién formado. Hay incluso un grupo de osteoblastos dentro del propio cartílago (flecha alargada). El diagnóstico de hueso primario se basa en la presencia de restos condroides (basófilos) dentro del hueso (flechas cortas). La presencia de canales de tipo Haversiano ampliados con las hileras de osteoblastos cuboidales adyacentes al hueso, indica la presencia de osteogénesis aposicional abundante en esta fase después del tratamiento. La Figura 16 es una microfotografía de una sección histológica que muestra un hueso primitivo - primario en un defecto de tibia de tamaño crítico de rata tratada con Gelrin™ 5 semanas después del implante. Obsérvese la abundancia de haces residuales de cartílago inicialmente presente (asterisco), que en esta fase se ha sustituido por tejido óseo. Hay una red compleja de canales. Obsérvese que los grandes canales de tipo Haversiano en el centro están al menos parcialmente hipervascularizados y que contienen algunos lipocitos (flecha alargada). La mayoría de las interfaces canal-hueso se cubren por osteoblastos cuboidales (flechas pequeñas) indicativo de osteogénesis viva en curso. La Figura 17 es una microfotografía de baja potencia que muestra una banda de tejido condroide en transición en la región intersticial de un animal tratado con Gerlin™. Obsérvese la banda de cartílago (extremo superior indicada mediante asterisco) en la que se manifiesta una transición de tejido fibroso en tejido condroide (la transición se produce de arriba a abajo, respectivamente). En ambos lados de esta banda, muchas proyecciones tisulares fibrosas vascularizadas (flechas cortas) invaden el cartílago, es decir, inician la osificación endocondral. Aunque el hueso es de un modelo osteonal con numerosos canales Haversianos normales (flechas largas), está estructurado anómalamente de manera que hay varios rastros grandes de tejido fibroso-graso con hileras de osteoblastos cuboidales adyacentes al hueso (indicado por cabezas de flecha). Las Figuras 18a-e son imágenes microscópicas de contraste de fase de cultivos de células de musculo liso vascular en hidrogeles Gerlin™. Las células de musculo liso distribuidas y dispersadas de manera homogénea se cultivaron durante 48 horas dentro de hidrogeles Gerlin™ (PEG de 10-kDa) y la capacidad de las células para adherirse y propagarse dentro de los hidrogeles se evaluó cualitativamente por microscopía de contraste de fase. La Figura 18a ilustra la adhesión y propagación tridimensional de células de músculo liso dentro de hidrogeles Gerlin™ puros. La adición de diversas cantidades de PEG-DA libre (Figura 18b-e) a la matriz de Gerlin™ reduce la degradabilidad proteolítica de los hidrogeles y hace más difícil que las células individuales se propaguen dentro de la matriz. Figura 18a - matriz de Gerlin™ pura; Figura 18b - matriz de Gerlin™ con PEG-DA libre al 0,5%; Figura 18c - matriz de Gerlin™ con PEG-DA libre al 1%; Figura 18d - matriz de Gerlin™ con de PEG-DA libre al 1,5%; Figura 18e - matriz de Gerlin™ con PEG-DA libre al 2%. Obsérvese que la adhesión y propagación de las células dentro de la matriz se reduce en presencia de concentraciones en aumento de PEG-DA libre (es decir, la molécula reticulante) con respecto a la matriz de Gerlin™ pura. Las Figuras 19a-l son microfotografías de grupos de células de músculo liso incluidas dentro de un sustrato de Gerlin™. Las figuras representan el efecto de las concentraciones en aumento de PEG-DA en los hidrogeles de Gerlin™ sobre la migración de las células en el Gerlin™. Los hidrogeles de Gerlin™ que consisten en PEG de 6kDa se prepararon usando hidrogeles de Gerlin™ puros (PEG-fibrinógeno 1,75%; Figuras 19a-d), hidrogeles de Gerlin™ reticulados con PEG-DA libre al 1% (Figuras 19e-h) o hidrogeles de Gerlin™ reticulados con PEG-DA libre al 2% (Figuras 19i-l) y el grado de migración celular de la masa tisular de células (color oscuro) y dentro del Gerlin™ se detectó usando microscopía por contraste de fase después de una (Figuras 19a, e e i), dos (Figuras
19b, f y j), cuatro (Figuras 19c, g y k) o siete (Figuras 19d, h y 1) días en cultivo. Obsérvese la migración celular significativa observada en los hidrogeles de Gerlin™ puros y las extensiones celulares relativamente disminuidas observadas en los hidrogeles de Gerlin™ que estaban reticulados en presencia de PEG-DA libre al 2%.
Descripción de las realizaciones preferidas
La presente descripción se refiere a una matriz compuesta de un esqueleto proteico de origen natural reticulado por polietilenglicol (PEG) que puede usarse en aplicaciones de regeneración tisular. Específicamente, la presente invención se refiere a un armazón de fibrinógeno desnaturalizado PEGilado que puede usarse para tratar trastornos caracterizados por una lesión o perdida tisular usando armazones biodegradables.
Los principios y el funcionamiento del procedimiento de generación de un armazón biodegradable de acuerdo con la presente invención pueden comprenderse mejor con referencia a los dibujos y a las descripciones que se adjuntan.
Las estrategias de ingeniería tisular utilizan armazones básicos que imitan la estructura natural de los tejidos que sustituyen y proporcionan un soporte funcional temporal para las células sembradas en su interior (Griffith LG, 2002). Los armazones pueden fabricarse a partir de materiales biológicos o de polímeros sintéticos. Aunque los polímeros sintéticos [por ejemplo, polietilenglicol (PEG) y polimetil metacrilato (PMMA)], proporcionan un control preciso sobre el material del armazón y sus propiedades mecánicas, tales polímeros no tienen las propiedades biofuncionales que permitan la unión y la propagación de las células (Drury y Mooney, 2003), y por lo tanto no son adecuados para el cultivo tisular prolongado o la regeneración tisular in vivo.
Por otro lado, los armazones de origen natural tales como colágeno y fibrina proporcionan señales biofuncionales y presentan diversas interacciones celulares. Sin embargo, dado que tales materiales biológicos presentan señales intrínsecas múltiples (por ejemplo, regulación de adhesión celular, proliferación, fenotipo celular, producción de matriz y actividad enzimática), su uso como armazones para la regeneración tisular a menudo da como resultado una regulación anómala de acontecimientos celulares (Hubbell, 2003). Además, después de la reconstrucción, la resistencia de dichos armazones es menor que la que caracteriza al material biológico natural (por ejemplo, colágeno).
Para superar tales limitaciones se construyeron armazones “híbridos” injertando elementos biodegradables en esqueletos sintéticos. Por tanto, el esqueleto de PEG sintético se reticuló con oligopéptidos cortos que contenían sustratos enzimáticos, secuencias RGD y/o VEGF [Lutolf y col (2003); Gobin y West (2002); Seliktar y col; 2004, Zisch AH, y col, 2003; FASEB J. 17: 2260-2. EPub. 16 oct 2003], o con precursores de 100 aminoácidos similares a proteína modificados por ingeniería genética (Halstenberg y col. 2002; Biomacromolecules, 3: 710-23). Sin embargo, tales armazones, en los que el PEG era el componente principal, no proporcionaban suficiente bio-retroalimentación y/o respuestas celulares prolongadas que son esenciales para la regeneración tisular y estabilidad fenotípica.
Reduciendo la presente invención a la realización práctica, los autores de la presente invención han descubierto que los armazones híbridos biosintéticos compuestos de un esqueleto de fibrinógeno con cadenas laterales de polietilenglicol (PEG) funcional son excelentes armazones biodegradables y que tales armazones pueden usarse para aplicaciones de regeneración tisular.
Como se muestra en la sección de Ejemplos, más adelante, los autores de la presente invención generaron moléculas precursoras de PEG-fibrinógeno que se usaron adicionalmente para formar armazones de hidrogel. Los armazones de PEG-fibrinógeno de la presente invención presentan propiedades materiales y de biodegradabilidad que son superiores a cualquier armazón conocido de la técnica anterior; también presentan mucha flexibilidad y un módulo elástico que puede controlarse (Figuras 3a-b), biodegradabilidad eficaz (Figuras 5a-b), biofuncionalidad y soporte mejorados para la propagación y extensión celular (Figuras 6a-e, 7a-b, 18a-e y Ejemplos 2 y 4). Adicionalmente, como se muestra en las Figuras 9-17 y en el Ejemplo 3 de la sección de Ejemplos, más adelante, los armazones de PEG-fibrinógeno de la presente invención fueron capaces de regeneración ósea in vivo en ratas expuestas a un defecto de tibia de tamaño crítico.
Por tanto, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un armazón que comprende una pluralidad de unidades compuestas cada una de un polímero sintético unido a una proteína de origen natural o a una parte de la misma.
Como se usa en el presente documento el término “armazón” se refiere a una estructura de soporte bidimensional o tridimensional. El armazón de la presente invención está compuesto de unidades (denominadas indistintamente en el presente documento “moléculas precursoras”) que están unidas directa o indirectamente (por ejemplo, mediante engarce) entre ellas. Tal molécula precursora puede ser, por ejemplo, fibrinógeno PEGilado (véase el Ejemplo 1 de la sección de Ejemplos, más adelante), colágeno PEGilado, fibrinectina PEGilada y similares. Controlando la reticulación, el armazón de la presente invención puede formar una estructura bi- o tri- dimensional de cualquier tamaño, estructura o porosidad. El armazón de la presente invención puede incluirse dentro, o formarse alrededor, de otro armazón o gel o puede unirse a materiales adicionales para formar un armazón híbrido o revestido.
Preferentemente, el armazón de la presente invención puede usarse para servir de soporte al crecimiento, adhesión y propagación de las células y por tanto facilitar el crecimiento celular, la regeneración tisular y/o la reparación tisular.
El término “polímero” se refiere a una pluralidad de unidades de repetición que forman una nueva estructura molecular. La expresión “polímero sintético” se refiere a cualquier polímero que esté fabricado de un material sintético, es decir, un material no natural, no celular. Los ejemplos no limitantes para polímeros sintéticos que pueden usarse junto con la presente invención incluyen polietilenglicol (PEG) (Pm promedio 200; P3015, SIGMA), hidroxiapatita/policaprolactona (HA/PLC) [Choi, D., y col., 2004, Materials Research Bulletin, 39: 417-432; Azevedo MC, y col., 2003, J. Mater Sci. Mater. Med. 14(2): 103-7], ácido poliglicólico (PGA) [Nakamura T, y col., 2004, Brain Res. 1027(1-2): 18-29], ácido poli-L-láctico (PLLA) [Ma Z, y col., 2005, Biomaterials. 26(11): 1253-9], polimetil metacrilato (PMMA) [Pm promedio 93.000, Aldrich Cat. Nº 370037; Li C, y col., 2004, J. Mater. Sci. Mater. Med. 15(1): 85-9], polihidroxialcanoato (PHA) [Zinn M, y col., 2001, Adv. Drug Deliv. Rev. 53(1): 5-21; Sudesh K., 2004, Med. J. Malaysia. 59 Sup. B: 55-6], poli-4-hidroxibutirato (P4HB) [Dvorin EL y col., 2003, Tissue Eng. 9(3): 487-93], polipropilen fumarato (PPF) [Dean D, y col., 2003, Tissue Eng. 9(3): 495-504; He S, y col., 2000, Biomaterials, 21(23): 2389-94], polietilenglicol-dimetacrilato (PEG-DMA) [Oral E y Peppas NA J, 2004, Biomed. Mater. Res. 68A(3): 439-47], fosfato beta-tricálcico (beta-TCP) [Dong J, y col., 2002, Biomaterials, 23(23): 4493-502], y politetrafluoroetileno (PTFE) no biodegradable [Jernigan TW, y col., 2004. Ann. Surg. 239(5): 733-8; discussion 73840].
De acuerdo con realizaciones actualmente preferidas de la presente invención, el polímero sintético usado en la presente invención es PEG. La molécula de PEG usada en la presente invención puede estar linealizada o ramificada (es decir, PEG, de 2 brazos, 4 brazos y 8 brazos) y puede tener cualquier peso molecular, por ejemplo, 4 kDa, 6 kDa y 20 kDa para PEG linealizado o de 2 brazos, 14 kDa y 20 kDa para PEG de 4 brazos y 14 kDa y 20 kDa para PEG de 8 brazos y combinación de los mismos.
Como se muestra en las Figuras 1a-b y en el Ejemplo 1 de la sección de Ejemplos, más adelante, el extremo OH de la molécula de PEG puede reaccionar con un grupo químico tal como acrilato (Ac) o vinilsulfona (VS) que convierte a la molécula de PEG en PEG funcionalizado, es decir, PEG-Ac o PEG-VS. Preferentemente, la molécula de PEG usada en la presente invención es PEG-Ac.
En la técnica se conocen procedimientos para preparar moléculas de PEG funcionalizadas. Por ejemplo, el PEG-VS puede prepararse con argón haciendo reaccionar una solución del PEG-OH en diclorometano (DCM) con NaH y después con di-vinil-sulfona (proporciones molares: OH 1: NaH 5: divinilsulfona 50, a 0,2 gramos de PEG/ml en DCM). El PEG-Ac se prepara con argón haciendo reaccionar una solución del PEG-OH en DCM con cloruro de acriloilo y trietilamina (proporciones molares: OH 1: cloruro de acriloilo 1,5: trietilamina 2, a 0,2 gramos de PEG/ml en DCM), esencialmente como se describe en el Ejemplo 1 de la sección de Ejemplos, más adelante.
Se apreciará que dichos grupos químicos pueden unirse a moléculas de PEG de 2 brazos, 4 brazos u 8 brazos linealizadas.
Preferentemente, el PEG-Ac usado en la presente invención es PEG-DA, PEG multi-Acrilato en estrella de 4 brazos y/o PEG multi-Acrilato en estrella de 8 brazos.
Como se muestra en las Figuras 2a-b y en el Ejemplo 1 de la sección de Ejemplos, más adelante, para preparar moléculas de PEG funcionalizadas, los autores de la presente invención usaron isoformas de PEG-diacrilato (PEG-DA) de 4-kDa, 6-kDa y 20-kDa.
La expresión “proteína de origen natural o una parte de la misma” como se usa en el presente documento se refiere a fibrinógeno desnaturalizado.
Dado que el armazón de la presente invención está compuesto de una proteína de origen natural, tal armazón puede configurarse para ser susceptible a degradación por material biológico, tal como enzimas, es decir, para ser biodegradable.
Como se usa en el presente documento, el término “biodegradable” se refiere ser capaz de degradarse (es decir, descomponerse) por proteasas biológicas o biomoléculas. La biodegradabilidad depende de la disponibilidad de sustratos de degradación (es decir materiales biológicos o partes de los mismos), de la presencia de materiales biodegradantes (por ejemplo, microrganismos, enzimas, proteínas) y de la disponibilidad de oxígeno (para organismos, microrganismos aerobios o partes de los mismos), dióxido de carbono (para organismos, microrganismos anaerobios o partes de los mismos) y/u otros nutrientes. Además, la biodegradabilidad de un material, tal como el armazón de la presente invención, también depende de la estructura y/o de las propiedades mecánicas del material, es decir, la porosidad, flexibilidad, viscosidad, densidad de reticulación, hidrofobicidad/hidrofilicidad y elasticidad que puede influir en el paso y en la disponibilidad de gases y nutrientes, así como en la adhesión y propagación de las células. Los ejemplos de materiales biodegradables incluyen, pero sin limitación, armazones de geles de colágeno reconstituido, de colas de fibrina y de ácido hialurónico.
Por tanto, el armazón de la presente invención se fabrica por reticulación de copias múltiples de una molécula precursora que está compuesta de un polímero sintético unido a una proteína de origen natural o a una parte de la misma.
Por ejemplo, como se muestra en las Figuras 1a-b, 2a-b y en el Ejemplo 1 de la sección de Ejemplos, más adelante, los autores de la presente invención fabricaron una molécula precursora de fibrinógeno PEGilado desnaturalizando moléculas de fibrinógeno y haciéndolas reaccionar con PEG-driacrilatos funcionalizados.
Por tanto, de acuerdo con realizaciones preferidas de la presente invención, la molécula precursora de polímeroproteína se fabricada con PEG y fibrinógeno.
La proporción molar entre el polímero sintético (por ejemplo, PEG) y la proteína de origen natural (por ejemplo, fibrinógeno) de la presente invención puede influir en el tamaño del poro, resistencia, flexibilidad y elasticidad del armazón de la presente invención. Por tanto, un exceso del polímero sintético conduciría a unir los grupos funcionales del polímero (por ejemplo, PEG-DA) con todos los sitios de unión posibles en la proteína de origen natural y daría como resultado un tamaño de poro más pequeño, más sitios de reticulación, mayor resistencia, menos flexibilidad y rigidez aumentada. Por otro lado, la unión de solo dos moléculas de polímero sintético a cada molécula de la proteína (es decir, una proporción molar de 2:1) daría como resultado un tamaño de poro más grande, menos sitios de reticulación, menor resistencia, mayor flexibilidad y elasticidad aumentada. Se apreciará que la proporción molar entre el polímero sintético y la proteína también puede influir en la biodegradabilidad del armazón. Por tanto, se espera que una mayor proporción molar (es decir, un exceso de polímero) de cómo resultado una menor biodegradabilidad debido a una posible ocultación de sitios de degradación de la proteína. Los expertos en la materia pueden ajustar la proporción molar entre el polímero sintético y la proteína para obtener el armazón deseado con las características físicas y biológicas óptimas.
Por ejemplo, dado que cada molécula de fibrinógeno incluye 29 sitios posibles que pueden unirse al PEG, la molécula precursora de PEG-fibrinógeno puede prepararse usando un amplio intervalo de proporciones molares. Preferentemente, la proporción molar usada en la presente invención es de 2-400 (PEG) con respecto a 1 (fibrinógeno), más preferentemente, la proporción molar es de 30-300 (PEG) con respecto a 1 (fibrinógeno), más preferentemente, la proporción molar es de 100-200 (PEG) con respecto a 1 (fibrinógeno), más preferentemente, la proporción molar es de 130-180 (PEG) con respecto a 1 (fibrinógeno). Como se muestra en el Ejemplo 1 de la sección de Ejemplos, más adelante, una proporción molar preferible entre PEG-DA y fibrinógeno es de 145 (PEG) con respecto a 1 (fibrinógeno).
El fibrinógeno usado en la presente invención puede ser fibrinógeno completo (es decir, no escindido) o fibrinógeno fragmentado, que puede obtenerse usando, por ejemplo, escisión por CNBr (véase el Ejemplo 1 de la sección Ejemplos, más adelante).
Como se ha mencionado anteriormente, el armazón de la presente invención se forma por reticulación de las moléculas precursoras de polímero-proteína de la presente invención. Tal reticulación puede realizarse in vitro, ex vivo y/o in vivo.
La reticulación de acuerdo con este aspecto de la presente invención se realiza sometiendo las moléculas precursoras a una reacción de polimerización por radicales libres (es decir, una reacción de reticulación). Los procedimientos de reticulación de polímeros se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, reticulación mediante fotoiniciación (en presencia de una luz apropiada, por ejemplo, 365 nm), reticulación química [en presencia de un donante de radicales libres] y/o calentamiento [a las temperaturas apropiadas]. Preferentemente, la reticulación de acuerdo con la presente invención se efectúa por fotoiniciación.
La fotoiniciación puede tener lugar usando un agente de fotoiniciación (es decir, un fotoiniciador) tal como óxido de bis(2,4,6-trimetilbenzoil) fenilfosfina (BAPO) (Fisher JP y col., 2001; J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 12: 673-87), 2,2dimetoxi-2-fenilacetofenona (DMPA) (Witte RP y col., 2004; J. Biomed. Mater. Res. 71A(3): 508-18), camforquinona (CQ), 1-fenil-1,2-propanodiona (PPD) (Park YJ y col., 1999, Dent. Mater. 15(2): 120-7; Gamez E, y col., 2003, Cell Transplant. 12(5): 481-90), el complejo organometálico Cp’Pt(CH(3))(3) (Cp’ = eta(5)-C(5)H(4)CH(3)) (Jakubek V y Lees AJ, 2004; Inorg. Chem. 43(22): 6869-71), 2-hidroxi-1-[4-(hidroxietoxi)fenil]-2-metil-1-propanona (Irgacure 2959) (Williams CG, y col., 2005; Biomaterials. 26(11): 1211-8), dimetilaminoetil metacrilato (DMAEMA) (Priyawan R, y col., 1997; J. Mater. Sci. Mater. Med. 8(7): 461-4), 2,2-dimetoxi-2-fenilacetofenona (Lee YM y col., 1997; J. Mater. Sci. Mater. Med. 8(9): 537-41), benzofenona (BP) (Wang Y y Yang W. 2004; Langmuir. 20(15): 6225-31), flavina (Sun G, y Anderson VE. 2004; Electrophoresis, 25(7-8): 959-65).
La reacción de fotoiniciación puede realizarse usando una diversidad de longitudes de onda incluyendo longitudes de onda UV (190-365 nm), y luz visible (400-1100 nm) y a diversas intensidades lumínicas. Se apreciará que para las aplicaciones ex vivo o in vivo, el fotoiniciador y las longitudes de onda utilizadas son preferentemente no tóxicos y/o no peligrosos para la salud.
Por ejemplo, como se observa en el Ejemplo 1 de la sección de Ejemplos, más adelante, la molécula precursora de PEG-fibrinógeno se reticuló por fotoiniciación en presencia de Igracure™ 2959 y una iluminación de luz UV no tóxica (por ejemplo, 5 minutos a una longitud de onda de 365 nm, 4-5 mVatios/cm2 de intensidad).
Se apreciará que, aunque las moléculas precursoras de polímero-proteína de la presente invención (por ejemplo fibrinógeno PEGilado) pueden reticularse sin la adición de una molécula reticulante, la reticulación de acuerdo con la presente invención también puede utilizar una molécula que pueda reticular los precursores del polímero-proteína. Dichas moléculas reticulantes pueden ser, por ejemplo, PEG, PEG-DA, PEG multi-Acrilato y/o PEG-VS.
Por ejemplo, como se muestra en el Ejemplo 1 de la sección de Ejemplos más adelante, para potenciar la reacción de reticulación, se usó una molécula de PEG funcionalizado (por ejemplo, PEG-DA).
La concentración de las moléculas reticulantes (por ejemplo, PEG-DA) puede influir en la resistencia, flexibilidad, elasticidad y biodegradabilidad del armazón y la determinación de tal concentración depende de la aplicación del armazón y forma parte de las habilidades de los expertos en la materia. Por ejemplo, se espera que, un exceso de una molécula reticulante de cómo resultado poros más pequeños, más sitios de reticulación y mayor resistencia y menor flexibilidad del armazón. Por otro lado, como se observa en las Figuras 18a-e, 19a-l y en el Ejemplo 4 de la sección de Ejemplos, más adelante, un exceso de PEG-DA (es decir, la molécula reticulante de la presente invención) da como resultado una biodegradabilidad del armazón reducida, como se indica mediante la adhesión y/o propagación celular reducidas. Se apreciará que una biodegradabilidad reducida es probablemente un resultado de ocultar o modificar los sitios de unión de la proteína o las señales que son necesarias para la degradación de la proteína.
De acuerdo con realizaciones preferidas de la presente invención, la reticulación se efectúa de tal manera que las moléculas precursoras de polímero-proteína de la presente invención se disuelven en una solución basada en agua y tales soluciones adicionalmente se someten a reticulación (por ejemplo, usando fotoionización) para formar un armazón de hidrogel.
Como se observa en el Ejemplo 1 de la sección de Ejemplos, más adelante, se formó un hidrogel de PEGfibrinógeno mezclando las moléculas precursoras de fibrinógeno PEGilado con el agente de fotoiniciación (Igracure™2959) en presencia o ausencia de PEG-DA y exponiendo dicha mezcla a luz UV. Brevemente, los precursores de fibrinógeno PEGilado se disolvieron en 1 ml de PBS 50 mM, pH 7,4 y 25 ºC para conseguir una concentración final de polímero-proteína de 10, 15 o 20% (p/v). La solución precursora también contenía un constituyente reticulante de PEG-DA a una proporción molar de 1:2 PEG-DA con respecto a grupos funcionales en el fibrinógeno PEGilado. La solución precursora se mezcló con 10 μl de solución del fotoiniciador Igracure™2959 (Ciba Specialty Chemicals, Tarrytown, Nueva York) en etanol al 70% (100 mg/ml) y se centrifugó durante 5 minutos a 14.000 RPM. Después, la solución se colocó en tubos de Teflón (de 5 min de diámetro y 20 mm de longitud) y se polimerizó con luz UV (365 nm, 4-5 mW/cm2) durante 15 minutos de acuerdo con protocolos publicados (Lum LY y col., 2003).
De acuerdo con realizaciones preferidas de la presente invención el hidrogel puede generarse a partir de fibrinógeno completo PEGilado o fibrinógeno fragmentado PEGilado. Generalmente, el peso molecular y la longitud del PEG injertado influyen en el grado de solubilidad de la proteína PEGilada, es decir, una mayor longitud y/o peso molecular del PEG da como resultado un aumento en la solubilidad de la proteína PEGilada. Se apreciará que la solubilidad de la proteína PEGilada también está influida por la presencia de fibrinógeno completo o escindido. Preferentemente, la concentración de las moléculas precursoras en el hidrogel es entre el 0,5 al 35%, más preferentemente, cuando se usa fibrinógeno completo PEGilado, la concentración de las moléculas precursoras en el hidrogel es entre el 0,5 al 5% (dependiendo del PM y de la longitud del PEG injertado usado para PEGilar la proteína) y cuando se usa fibrinógeno fragmentado PEGilado, la concentración de las moléculas precursoras en el hidrogel es entre el 5 - 35% (dependiendo del PM y de la longitud del PEG usado para PEGilar la proteína).
Los hidrogeles de PEG-fibrinógeno de la presente invención mostraron una flexibilidad superior sobre los hidrogeles de PEG-PEG de la técnica anterior. Por ejemplo, mientras que en el hidrogel de PEG-PEG (usando PEG de 4 kDa) se consiguió una deformación del 30% empleando una tensión de 90 kPa, en el de hidrogel de PEG-fibrinógeno (usando PEG de 4 kDa) se consiguió una deformación similar empleando solo 4 kPa (Figuras 3a-b y Figuras 4a-c).
Preferentemente, el módulo de elasticidad de los hidrogeles fabricados a partir de fibrinógeno completo PEGilado está en un intervalo de 0,02-011 kPa para 10-20% de polímero y el módulo de elasticidad de los hidrogeles fabricados a partir de fibrinógeno fragmentado PEGilado está un intervalo de 0,01-0,07 kPa para 10-20% de polímero.
Además, los armazones de hidrogel de la presente invención presentan alta biodegradabilidad en comparación con los armazones de hidrogel de la técnica anterior [por ejemplo, hidrogeles fabricados con un reticulante oligopeptídico que contiene un sustrato para proteasas (Seliktar y col 2004)]. Por ejemplo, como se muestra en las Figuras 5a-b y en el Ejemplo 1 de la sección de Ejemplos, más adelante, se observó una degradación significativa del 45 - 70% o 35 - 85% de los hidrogeles de PEG-fibrinógeno después de 30 minutos de incubación en presencia de tripsina 0,05 mg/ml o colagenasa 0,5 mg/ml, respectivamente. Además, como también se observa en la Figura 5b, mayores concentraciones de tripsina (es decir, 1-2 mg/ml) dieron como resultado una degradación completa del hidrogel después de 30 minutos de incubación.
Por tanto, la biodegradabilidad del armazón de hidrogel de la presente invención puede determinarse sometiendo tales hidrogeles a degradación enzimática usando proteasas tales como plasmina, tripsina, colagenasa, quimiotripsina y similares.
Se apreciará que la biodegradabilidad y la biofuncionalidad del armazón del hidrogel de la presente invención también puede aumentarse uniendo o impregnado una proteína, tal como una proteína de señalización celular, o una (como se describe en el presente documento anteriormente) al hidrogel de la presente invención. La unión de tales proteínas al armazón de hidrogel de la presente invención se realiza preferentemente por inmovilización covalente de una proteína PEGilada a la red del hidrogel de PEG durante la reticulación (Seliktar y col 2004, JBMR). La inmovilización de tal factor se consigue haciendo reaccionar directamente el PEG funcionalizado con un tiol, que no ha reaccionado, que está presente en un resto de cisteína de la secuencia de la proteína. La impregnación del hidrogel con factores de crecimiento puede realizarse deshidratando el armazón y después sumergiendo los hidrogeles en una solución que contenga los factores de crecimiento y agitando suavemente dichos hidrogeles durante algunas horas hasta que los factores de crecimiento penetren en el armazón durante el proceso de hidratación. Del mismo modo, el hidrogel puede impregnarse con un factor de crecimiento por incubación, durante una noche, en una solución que contenga el factor hasta que el factor de crecimiento se difunda en la red polimérica del armazón por difusión lenta, pasiva. Esto último está influenciado por el grado de reticulación, la porosidad del armazón y las propiedades estructurales descritas en el presente documento anteriormente.
Además de ser asequible de producir, el armazón de la presente invención es muy reproducible, flexible (puede tensarse o estirarse fácilmente), presenta propiedades estructurales que pueden controlarse, es manejable para controlar la biodegradación; características que lo hacen suficientemente adecuado para la regeneración in vivo o ex vivo de tejidos tales como hueso, cartílago, músculo cardíaco, tejido dérmico, vasos sanguíneos y otros tejidos (blandos y duros) en el organismo. Por ejemplo, un armazón de hidrogel de este tipo puede colocarse fácilmente en intersticios dentro de un tejido o un órgano, después de lo cual puede rellenar el espacio vacío e iniciar el proceso de regeneración a medida que el armazón se va degradando.
De hecho, como se muestra en las Figuras 8-17 y en el Ejemplo 3 de la sección de Ejemplos, más adelante, la implantación del armazón de la presente invención en un defecto de tibia de tamaño crítico en rata dio como resultado la formación de hueso nuevo.
Por tanto, de acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para inducir in vivo la formación de un tejido.
La frase “in vivo” se refiere en el interior de un organismo vivo, tal como una planta o un animal, preferentemente en mamíferos, preferentemente en sujetos humanos.
El procedimiento se efectúa implantando el armazón de la presente invención en un sujeto para de esta manera inducir la formación del tejido.
Como se usa en el presente documento, el término “sujeto” se refiere a un vertebrado, preferentemente un mamífero, más preferentemente un ser humano (hombre o mujer) de cualquier edad.
El armazón de la presente invención puede implantarse en el sujeto usando una herramienta quirúrgica tal como un escalpelo, cuchara, espátula u otro dispositivo quirúrgico.
Se apreciará que la formación in vivo de un tejido también puede conseguirse administrando al sujeto las moléculas precursoras del armazón y posteriormente reticulando las moléculas precursoras in vivo.
Por tanto, de acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un procedimiento para inducir in vivo la formación de un tejido. El procedimiento se efectúa administrando a un sujeto que lo necesite una composición compuesta de un polímero sintético unido a una proteína de origen natural o a una parte de la misma, siendo la composición capaz de formar un armazón en el interior del sujeto y de esta manera inducir la formación del tejido in vivo.
Como se usa en el presente documento “una composición compuesta de un polímero sintético unido a una proteína de origen natural o a una parte de la misma” se refiere a la molécula precursora de polímero-proteína de la presente invención que se ha descrito anteriormente en el presente documento.
De acuerdo con realizaciones preferidas de la presente invención, el procedimiento de acuerdo con este aspecto comprende adicionalmente una etapa de reticulación después de administrar la composición. La reticulación puede realizarse como se ha descrito anteriormente en el presente documento usando agentes y/o condiciones no tóxicas, no peligrosas para la salud.
De acuerdo con realizaciones preferidas de la presente invención, el procedimiento de acuerdo con este aspecto comprende adicionalmente administrar al sujeto una molécula capaz de reticular la composición.
La frase “molécula capaz de reticular la composición” se refiere al agente reticulante descrito anteriormente en el presente documento (por ejemplo, PEG-DA).
Se apreciará que el armazón de la presente invención también puede usarse para la formación ex vivo de un tejido.
Por tanto, de acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un procedimiento para inducir ex vivo la formación de un tejido.
El término “tejido” se refiere a parte de un organismo que consiste en un agregado de células que tienen una estructura y función similares. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, tejido cerebral, retina, tejido dérmico, tejido hepático, tejido pancreático, hueso, cartílago, tejido conectivo, tejido sanguíneo, tejido muscular, tejido cardíaco, tejido vascular, tejido renal, tejido pulmonar, tejido gonadal, tejido hematopoyético y tejido graso. Preferentemente, el término “tejido” como se usa en el presente documento también incluye la frase “órgano” que se refiere a una unidad estructural y funcional completamente diferenciada en un animal que está especializado para alguna función particular. Los ejemplos no limitantes de órganos incluyen cabeza, cerebro, ojo, pierna, mano, corazón, hígado, riñón, pulmón, páncreas, ovario, testículo y estómago.
Como se usa en el presente documento, la frase “ex vivo” se refiere a células vivas que derivan de un organismo y crecen (o se cultivan) fuera del organismo vivo, preferentemente, fuera del cuerpo de un vertebrado, de un mamífero
o de un ser humano. Por ejemplo, las células que derivan de un ser humano, tales como células musculares humanas o células endoteliales aórticas humanas y que se cultivan fuera del organismo se denominan células que están cultivadas ex vivo.
Por tanto, el armazón de la presente invención, que se forma in vivo, ex vitro o ex vivo, puede usarse para inducir la formación y/o regeneración tisular y por tanto para tratar a individuos que padecen una lesión o pérdida tisular.
Por tanto, de acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un procedimiento para el tratamiento de un sujeto que padece un trastorno caracterizado por una lesión o pérdida tisular.
Como se usa en el presente documento la expresión “trastorno caracterizado por una lesión o pérdida tisular” se refiere a cualquier trastorno, enfermedad o afección que presente una lesión tisular (por ejemplo, tejido no funcional, tejido canceroso o pre-canceroso, tejido dañado, tejido fracturado, tejido fibrótico o tejido isquémico) o una pérdida tisular (por ejemplo, después de un traumatismo, una enfermedad infecciosa, una enfermedad genética y similar) que requiere regeneración tisular. Los ejemplos de trastornos o afecciones que requieren regeneración tisular incluyen, pero sin limitación, cirrosis hepática tal como en pacientes con hepatitis C (hígado), diabetes de tipo 1 (páncreas), fibrosis quística (pulmón, hígado, páncreas), cáncer de hueso (hueso), reparación de quemaduras y de heridas (piel), degeneración macular relacionada con la edad (retina), infarto de miocardio, reparación de miocardio, lesiones del SNC (mielina), defectos de cartílago articular (condrocitos), degeneración de vejiga, degeneración intestinal y similares.
El tratamiento “tratamiento” se refiere a inhibir o a detener el desarrollo de una enfermedad, trastorno o afección y/o producir la reducción, remisión o regresión de una enfermedad, trastorno o afección en un individuo que padece, o al que se le ha diagnosticado, la enfermedad, trastorno o afección. Los expertos en la materia podrán usar diversas metodologías y ensayos para dirigir el desarrollo de una enfermedad, trastorno o afección y de manera similar diversas metodologías y ensayos que pueden usarse para dirigir la reducción, remisión o regresión de una enfermedad, trastorno o afección.
El procedimiento se efectúa implantando el armazón de la presente invención solo o después de sembrar tal armazón con células, o administrando al sujeto las unidades del armazón (por ejemplo, las moléculas precursoras de polímero-proteína de la presente invención) para inducir de esta manera la formación del tejido y tratar el trastorno caracterizado por una lesión o pérdida tisular.
Ejemplos
A continuación se hace referencia a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores, ilustran la invención de una manera no limitante.
Generalmente, la nomenclatura usada en el presente documento y en los procedimientos de laboratorio utilizados en el presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Tales técnicas se explican a fondo en la bibliografía. Véase, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook y col., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., Ed. (1994); Ausubel y col., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson y col., "Recombinant DNA", Scientific American Books, Nueva York; Birren y col. (Eds.) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); las metodologías se exponen en las patentes de Estados Unidos Nos: 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., Ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), tercera edición; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., Ed. (1994); Stites y
col. (Eds.), "Basic and Clinical Immunology" (8ª edición), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (Eds.), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., Nueva York (1980); inmunoensayos disponibles se describen ampliamente en la bibliografía de patentes y científica, véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº: 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 y 5.281.521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., Ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D. y Higgins S. J., Eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D. y Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., Ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak y col., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); todas ellas incorporadas por referencia a medida que se exponen completamente en el presente documento. A lo largo de este documento se proporcionan otras referencias generales. Se piensa que los procedimientos incluidos en ellas se conocen bien en la técnica y se proporcionan por comodidad para el lector
Ejemplo 1
GENERACIÓN DE HIDROGELES PEG-FIBRINÓGENO
A partir de PEG y fibrinógeno se generaron armazones por ingeniería tisular con propiedades mecánicas controlables y señales biofuncionales adecuadas. Brevemente, fragmentos de fibrinógeno desnaturalizado se PEGilaron con PEG-diacrilatos, se mezclaron con fotoiniciador y se expusieron a luz UV para formar un material de hidrogel en presencia de una suspensión celular. La degradabilidad del armazón de PEG-fibrinógeno también se sometió a ensayo por proteólisis mediada por enzimas, de la siguiente manera.
Materiales y Procedimientos Experimentales
Síntesis de PEG Diacrilato (PEG-DA) - El PEG-diacrilato (PEG-DA) se preparó a partir de PEG lineal, PM = 4-kDa, 6-kDa y 20-kDa (Fluka, Buchs, Suiza), básicamente como se describe en cualquier parte (Lutolf y Hubbell, 2003; Elbert DL., y col., 2001). Brevemente, la acrilación de PEG-OH se realizó con argón haciendo reaccionar una solución del PEG-OH en diclorometano (DCM) (Aldrich, Sleeze, Alemania) con cloruro de acriloilo (Merck, Darmstadt, Alemania) y trietilamina (Fluka) a una proporción molar de 1 de OH con respecto a 1,5 de cloruro de acriloilo con respecto a 1,5 detrietilamina (0,2 g de PEG/ml en DCM). El producto final se precipitó en presencia de éter dietílico enfriado con hielo y se secó al vacío durante una noche. El grado de conversión del grupo terminal se confirmó mediante RMN 1H y se encontró que era del 97-99% (datos no mostrados).
Escisión de fibrinógeno con bromuro de cianógeno - Se disolvió fibrinógeno completo [Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania, Cat Nº F8630, Nº de Acceso GenBank AAC67562.1. (cadena α; SEC ID Nº: 1); Nº de Acceso GenBank CAA23444.1 (cadena β; SEC ID Nº: 2) y Nº de Acceso GenBank CAA33562.1 (cadena γ; SEC ID Nº: 3)] en una solución de ácido fórmico al 70% que contenía 17 mg/ml de Bromuro de Cianógeno (CNBr) (Aldrich, Cat. Nº C9, 149-2) y se incubó durante una noche en la oscuridad a 25 ºC. Los fragmentos de fibrinógeno escindido se dializaron durante 2 días a 4 ºC en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 50 mM a un pH de 7,4 con un cambio de dos veces al día de tampón para eliminar de la solución todo el CNBr y el ácido fórmico. Los fragmentos dializados se conservaron en PBS a 4 ºC hasta que se sometieron a PEGilación. Dado que la injertación del PEG tiene un efecto detectable sobre la movilidad de la proteína en geles de acrilamida (Kurfurst MM, 1992; Pomroy NC y Deber CM, 1998), la observación de los fragmentos de fibrinógeno PEGilados se realizó cargando las muestras en una SDS-PAGE (Electroforesis en Gel de Poliacrilamida-Dodecil Sulfato Sódico) seguido por tinción con azul de Coomassie®.
PEGilación del fibrinógeno - Para PEGilar la proteína de fibrinógeno, a una solución de fibrinógeno de 7 mg/ml en PBS 50 mM con urea 8 M se añadió clorhidrato de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP·HCl) (Sigma) (proporción molar
68:1 de TCEP con respecto a cisteínas de fibrinógeno) y la solución se dejó con agitación durante 15 min a 25 ºC hasta estar completamente disuelta. Después de la disolución del fibrinógeno, se le añadió una solución de PEG-DA (250-300 mg/ml) en PBS 50 mM y urea 8 M y se hizo reaccionar durante una noche en la oscuridad a 25 ºC. La proporción molar del PEG con respecto al fibrinógeno fue de 145:1 (PEG-DA lineal, PM 4-kDa, 6-kDa y 20-kDa). El producto proteínico PEGilado final se precipitó durante 20 minutos a temperatura ambiente mientras se agitaba en 5X de acetona en exceso (Frutarom, Haifa, Israel). La solución de proteína precipitada se centrifugó durante 20 minutos a 5000 RPM (rotor Sorvall GSA) y el sedimento se volvió a disolver a una concentración de proteína de 20 mg/ml en PBS que contenía urea 8 M. La solución de proteína PEGilada se dializó después durante 2 días a 4 ºC frente a PBS que contenía ácido acético congelado (Frutarom) al 0,1% (v/v) cambiando el PBS dos veces al día (Spectrum, límite nominal de PM de 12-14-kDa). El producto dializado se usó inmediatamente o se liofilizó en una solución de D-(+)-glucosa (Riedel-deHaën, Alemania) al 10% para mejorar la solubilidad después de la redisolución. El producto PEGilado liofilizado se conservó en Argón a -80 ºC hasta seis meses.
Foto-polimerización de hidrogeles de PEG - A partir de una solución precursora de fibrinógeno PEGilado (completo o escindido) se prepararon hidrogeles de PEG-fibrinógeno. La solución precursora se preparó disolviendo fibrinógeno PEGilado en 1 ml de PBS 50 mM, pH 7,4 y a 25 ºC para conseguir una concentración final de 10, 15 o 20% de polímero (p/v). La solución precursora también contenía un constituyente reticulante de PEG-DA a una
proporción molar de 1:2 de PEG-DA con respecto a grupos funcionales sobre el fibrinógeno PEGilado. El PEG-DA adicional se usó para reticular eficazmente los macrómeros de la proteína PEGilada y para minimizar los impedimentos estéricos que dan como resultado una mala gelificación. La solución precursora se mezcló con 10 μl de la solución fotoiniciadora Igracure™2959 (Ciba Specialty Chemicals, Tarrytown, Nueva York) en etanol al 70% (100 mg/ml) y se centrifugó durante 5 minutos a 14.000 RPM. Después, la solución se colocó en tubos de Teflón (de 5 mm de diámetro y 20 de longitud) y se polimerizó con luz UV (365 nm, 4-5 mW/cm2) durante 15 minutos de acuerdo con protocolos publicados (Lum LY y col., 2003). Después de la polimerización, los hidrogeles se cortaron en secciones de 5 mm de longitud para someter a ensayo mecánico. Los hidrogeles de control se prepararon disolviendo 10, 15 o 20 % (p/v) de PEG-DA en 1 ml de PBS 50 mM con Igracure™ y después polimerizando con luz UV como se ha descrito anteriormente.
Ensayo de las propiedades mecánicas -Las propiedades mecánicas de compresión de los hidrogeles acelulares de PEG-fibrinógeno se evaluaron usando un sistema de ensayo de material de una sola columna Instron™ 5544 con el programa informático Merlin. Las características de tensión-deformación de tapones de 5 mm de diámetro (5 mm de longitud) se midieron por estiramiento constante (0,025 mm/seg) entre dos fijaciones (libres) rígidas, no porosas. El material se tensó a una tensión de 30% y se registró la fuerza de desplazamiento. El programa informático Merlin convirtió automáticamente los datos originales en una relación de tensión-deformación que describe el material. El módulo elástico se determinó directamente a partir de los datos de tensión-deformación como la pendiente promedio de la parte inferior de la curva de tensión-deformación ( < 15% de deformación).
Ensayo de biodegradación - Para evaluar la tasa de degradación enzimática del hidrogel, se unió colorante Coomassie® azul brillante G-250 (Aldrich) a los hidrogeles de PEG-fibrinógeno y la liberación del colorante Coomassie® se midió espectrofotométricamente. Los hidrogeles se tiñeron en Coomassie® al 0,1% (p/v) durante una noche con agitación suave y se destiñeron durante 1 hora en tampón decolorante. Dado que el colorante Coomassie® se une a proteínas con afinidad muy alta, después de la tinción inicial, los hidrogeles se destiñeron para liberar todo el colorante no unido. Después, los geles se transfirieron a placas multipocillo y se incubaron con concentraciones conocidas de colagenasa (Sigma) o de tripsina (BD Biosciences, Sparks, MD) en PBS. La degradación enzimática por colagenasa y tripsina se correlacionó con la liberación de fibrinógeno unido a Coomassie® de la red de hidrogel después de un periodo de incubación de 24 horas. Las muestras de sobrenadante (350 μl) se transfirieron a una cubeta de cuarzo y se midieron usando el espectrofotómetro UV/Vis (Hitachi Instruments Inc., Estados Unidos). Todos los datos se normalizaron con las mediciones espectrofotométricas de los hidrogeles completamente degradados por sus enzimas respectivas.
Análisis estadístico - El análisis estadístico se realizó usando las funcionalidades de análisis estadístico de Microsoft Excel. Para cada variable se cuantificaron y analizaron los datos de al menos dos experimentos independientes. Las comparaciones entre tratamientos múltiples se realizaron con análisis de varianza (ANOVA) mientras que las comparaciones entre tratamientos se realizaron usando un ensayo de dos colas de la t de Student considerando un valor de P < 0,05 estadísticamente significativo.
Resultados Experimentales
La PEGilación del fibrinógeno puede realizarse usando PEG-DA de 4-kDa, 6-kDa y/o 20-kDa. - Los hidrogeles de PEG-fibrinógeno se prepararon por unión covalente de fragmentos de proteína a PEG-DA y reticulando mediante fotoiniciación con UV. La Figura 1a ilustra la capacidad potencial del constituyente de fibrinógeno para unirse al PEG fraccionalizado. Se usó una reacción de adición de tipo Michael (Lutolf M y col, 2001, Bioconjugate chem. 12(6):1051-6) para formar un enlace éster entre los grupos tiol libres en las cisteínas del fibrinógeno y los grupos terminales del acrilato en el PEG-DA (es decir, reacción de PEGilación) usando diversos fragmentos de peso molecular de 4-kDa, 6-kDa y 20-kDa de PEG-DA.
Para confirmar adicionalmente la presencia de fragmentos de fibrinógeno PEGilado y determinar las condiciones óptimas para la reacción de PEGilación, los productos de reacción se sometieron a SDS-PAGE seguido por tinción con azul de Coomassie®. Como se muestra en la Figura 2a, después de la incubación del fibrinógeno completo con un fragmento de PEG-DA de 4-kDa, se observó un cambio dependiente del tiempo a fragmentos de mayor peso molecular. Por lo tanto, aunque después de una hora de incubación con el PEG-DA de 4-kDa, muchos de los fragmentos se elevaron por encima de 60 kDa, después de dos horas y/o una noche de incubación la mayoría de los fragmentos fueron mayores de 250 kDa. Además, como se muestra en la Figura 2b, cuando el fibrinógeno escindido con CNBr se incubó con cualquiera de los fragmentos de PEG-DA de 4-kDa o 6-kDa, a la hora de incubación, se observó un cambio considerable a fragmentos de mayor peso molecular.
Estos resultados demuestran claramente que la PEGilación del fibrinógeno es más eficaz en fibrinógeno escindido con CNBr que en fibrinógeno completo. Además, estos resultados muestran que la PEGilación del fibrinógeno es una reacción dependiente del tiempo.
El producto de PEG-fibrinógeno presenta un alto porcentaje de fibrinógeno PEGilado - Después de una reacción de PEGilación durante una noche, el producto de fibrinógeno PEGilado se purificó del exceso de PEG-DA sin reaccionar, usando precipitación con acetona, que precipita selectivamente la proteína (es decir, fibrinógeno PEGilado). Cabe mencionar que la adición de acetona, a temperatura ambiente, a la reacción de PEG-DA [usando
una solución de yoduro como se describe en cualquier parte (24)] no produjo la precipitación de PEG-DA libre, sin reaccionar (datos no mostrados). Se apreciará que el exceso de PEG sin reaccionar puede teóricamente enredarse con cadenas del PEG injertado sobre la proteína PEGilada y por tanto quedar parte de la proteína PEGilada durante la precipitación. Para confirmar la pureza del fibrinógeno PEGilado, se comparó el peso en seco del producto PEGilado total con la cantidad de proteína total, medida usando un ensayo BCA de Pierce en una solución de fibrinógeno PEGilado purificado. El peso en seco de la proteína PEGilada debe ser la suma de los pesos del fibrinógeno y del PEG injertado, suponiendo una PEGilación al 100%. Las fracciones de proteína teóricas para el fibrinógeno PEGilado usando PEG de 4-kDa, 6-kDa y 20-kDa (suponiendo una PEGilación al 100% y una pureza al 100%) son del 59%, 49% y 22%, respectivamente. Los resultados indican una fracción de proteína de 45 ± 5,0% usando el PEG de 4-kDa, 39 ± 3,4% usando el PEG de 6-kDa y 36 ± 1,5% usando el PEG de 20-kDa. La diferencia entre las fracciones de proteína teórica y medida puede atribuirse a diversos factores, incluyendo el exceso de PEG sin reaccionar, la PEGilación parcial y/o el error de las mediciones del ensayo BCA. Cabe mencionar que el exceso de PEG sin reaccionar no fue visible en SDS-PAGE teñido con yodo-acetato (datos no mostrados), confirmando así la observación de que el fibrinógeno está muy PEGilado después de una reacción durante una noche con PEG-DA. Por tanto, estos resultados sugieren que la desviación de las fracciones de proteína esperadas es consecuencia de una PEGilación parcial o de errores en la determinación de las concentraciones de proteína usando el ensayo BCA.
La escisión del fibrinógeno con bromuro de cianógeno facilita la preparación de soluciones de fibrinógeno PEGilado - Dado que la combinación de PEG altamente hidrófilo con el fibrinógeno parcialmente hidrófobo puede dar como resultado un núcleo de proteína altamente hidrófobo, la molécula de fibrinógeno se desnaturalizó antes de someterse a la reacción de PEGilación. Dicha desnaturalización minimiza la formación del núcleo hidrófobo después de la PEGilación y mejora la significativamente la solubilidad del producto. La desnaturalización de la molécula de fibrinógeno se consiguió usando CNBr, una molécula proteolítica que escinde químicamente péptidos adyacentes a metionina en la secuencia del fibrinógeno. La escisión con CNBr de fibrinógeno bovino (3 partes de fibrinógeno por 2 partes de CNBr) da como resultado 30 fragmentos (F1-F30) que varían en tamaño de 35-kDa a 0,1-kDa cada uno. Ocho de estos fragmentos contienen dos o más grupos tiol no apareados que pueden contribuir a la estructura de la red de hidrogel (véanse las Tablas 1 y 2, a continuación). La Figura 2a demuestra la presencia de pequeños fragmentos de fibrinógeno antes y después de la PEGilación usando SDS-PAGE. Además, los fragmentos de fibrinógeno PEGilado, escindido con CNBr, presentan la misma eficacia de PEGilación y pureza de proteína que la de la proteína completa PEGilada después de precipitación con acetona (datos no mostrados). Por tanto, usando el procedimiento de la presente invención, se prepararon soluciones de fibrinógeno PEGilado con concentraciones de hasta 300 mg/ml en condiciones no desnaturalizantes.
Tabla 1
Fragmentos de fibrinógeno y cisteínas a partir de fibrinógeno completo
Fragmentos
Alfa beta gamma Total
P.M.
65 53,3 47,6 165,9
Cisteínas
8 11 10 29
Tabla 2
Fragmentos de fibrinógeno y cisteínas a partir de fragmentos multi tiol de fibrinógeno escindido
Fragmentos
F1 F2 F3 F4 F7 F8 F15 F16 Total
P.M.
32,4 24,6 12,1 10 7 6,3 3,8 3,8 100
Cisteínas
2 4 3 4 2 2 4 4 25
Los hidrogeles de PEG-fibrinógeno son muy elásticos - Para confirmar la formación de hidrogeles a partir de precursores de la proteína PEGilada, se midieron las propiedades mecánicas de compresión del material usando el sistema de ensayo de material de una sola columna Instron™ 5544. Estas mediciones confirmaron la formación de hidrogeles acelulares de PEG-fibrinógeno (y controles PEG-PEG) con diversas concentraciones de polímero (10%, 15% y 20% p/v) y diferentes pesos moleculares de PEG (4-kDa y 6-kDa, 20-kDa) así como la formación de hidrogeles constituidos por fibrinógeno completo (completo) o fibrinógeno escindido con CNBr (escindido). Otras mediciones de las características de tensión-deformación de los hidrogeles de PEG demuestran que la característica de tensión-deformación, tanto de hidrogeles de PEG-PEG como de PEG-fibrinógeno, es no lineal y altamente dependiente del peso molecular del precursor de PEG (Figuras 3a y b). Además, como se muestra en los gráficos de tensión-deformación (Figuras 3a-b), el módulo de elasticidad observado en los hidrogeles de PEG-fibrinógeno (en el intervalo de 0,12 - 0,14) fue significativamente menor que el de los hidrogeles de PEG-PEG (en el intervalo de 2,5 3,21). Además, se observó que el módulo elástico (determinado a partir de la curva de tensión-deformación) era dependiente del porcentaje del polímero, del peso molecular del precursor de PEG y del esqueleto de fibrinógeno
(Figuras 4a-c). En general, se encontró que, el módulo elástico de los hidrogeles de PEG-PEG (a cualquier porcentaje de concentración de polímero determinado) era significativamente mayor que el de los hidrogeles de PEG-fibrinógeno (n = 5, p < 0,05). Del mismo modo, se encontró que, el módulo elástico de los hidrogeles de PEGfibrinógeno preparados con fibrinógeno completo, era significativamente diferente al de los hidrogeles preparados con fibrinógeno escindido (n = 5, p < 0,05).
La biodegradación de los hidrogeles de PEG-fibrinógeno es dependiente del PM del componente de PEG y del esqueleto proteico - La biodegradación de los hidrogeles se cuantificó sometiendo hidrogeles de PEGfibrinógeno puros marcados colorimétricamente (PEG-DA al 15% p/v, PM 6-kDa) a diversas concentraciones de proteasas (por ejemplo, colagenasa o tripsina) y evaluando la disolución de los geles. Por tanto, a medida que se disuelve el hidrogel, los fragmentos que se liberan en un tampón de revestimiento se cuantifican usando espectrofotómetro. Como se observa en la Figura 5a, la degradación de los hidrogeles de PEG-fibrinógeno se vio afectada tanto por el PM del PEG injertado como por la estructura molecular del esqueleto proteico del hidrogel. Por tanto, cambiando el PM del PEG de 6-kDa a 20-kDa se produce una degradación acelerada en presencia de 0,05 mg/ml de tripsina (n = 6, p < 0,05) pero no en presencia de 0,5 mg/ml de colagenasa. Del mismo modo, la degradación de los hidrogeles de fibrinógeno escindido en 0,5 mg/ml de colagenasa fue significativamente mayor que la de los hidrogeles de fibrinógeno completo (n = 6, p < 0,05). Como se muestra en la Figura 5b, el aumento de concentraciones de tripsina o colagenasa produce un mayor porcentaje de degradación de los hidrogeles. Se obtuvieron resultados similares analizando los hidrogeles de fibrinógeno PEGilado degradado en SDS-PAGE (datos no mostrados).
En su conjunto, estos resultados demuestran la generación de hidrogeles de PEG-fibrinógeno únicos que proporcionan ventajas singulares sobre otros materiales armazón: (i) las propiedades mecánicas de los hidrogeles de PEG son altamente maleables; (ii) la funcionalidad biológica se conserva por el esqueleto proteico de la red polimérica y (iii) el módulo elástico del hidrogel de PEG-fibrinógeno es dependiente del peso molecular del constituyente de PEG y proporcional al porcentaje de la composición polimérica.
Análisis y Discusión
El uso de materiales sintéticos basados en proteínas es una nueva estrategia para diseñar la “próxima generación” de armazones de hidrogel para ingeniería tisular (16, 23, 26-30). Estos materiales pueden promover el crecimiento celular y muestran biodegradabilidad proteolítica mediante sus dominios biológicos proporcionando a la vez exigentes propiedades mecánicas en base a su composición sintética. Normalmente, varios de estos materiales de hidrogel híbrido se usan como matrices de crecimiento interno o como sustratos de cultivo celular que se aprovechan de los oligopéptidos biológicamente activos en el esqueleto del material que imita las propiedades del tejido natural (17, 18). Aunque estos materiales cumplen los criterios generales de biofuncionalidad, los oligopéptidos de pequeño tamaño proporcionan solo una mínima parte de las señales bioactivas presentes en la matriz extracelular natural (ECM). Para superar esta limitación, se han creado algunas estrategias que usan tecnologías de ADN recombinante para crear un esqueleto de diseño de tipo proteico con bioactividad intrínseca (16), mientras que otras estrategias añaden factores de crecimiento bioactivos que se inmovilizan de manera covalente (23, 27, 31) o no covalente (32) en el material.
El material de hidrogel de la presente invención contiene un esqueleto proteico natural sobre el que por covalencia se unen PEG disfuncionales y se reticulan entre sí usando fotopolimerización. El esqueleto proteico comprende fragmentos alfa, beta y gamma de fibrinógeno desnaturalizado. Estos fragmentos de fibrinógeno son intrínsecamente bioactivos con secuencias proteolíticamente sensibles, motivos de adhesión celular y otras secuencias de señalización celular (14). Los grupos tiol libres presentes en restos de cisteína no apareados en el fragmento de fibrinógeno desnaturalizado se conjugan por covalencia, mediante una reacción de adición de tipo Michael, con un doble enlace insaturado en el PEG-DA funcionalizado. El material de hidrogel de la presente invención usa fibrinógeno desnaturalizado ya que este consiste en una gran cantidad de grupos tiol libres (es decir, restos de cisteína no apareados) que pueden reaccionar con PEG-DA. Después de la PEGilación, se usan acrilatos que no han reaccionado en los PEG disfuncionales para reticular el esqueleto de fibrinógeno en una red de hidrogel usando fotopolimerización.
La estructura molecular de los hidrogeles está muy influenciada por el grado de reticulación. Además del porcentaje del polímero, el otro factor crucial determinante de la reticulación del hidrogel es la proporción de grupos terminales de acrilato reactivos en el PEG por PM de proteína (acrilatos por kDa de proteína PEGilada). Suponiendo que cada PEG se une a fibrinógeno con un grupo terminal acrilato, el fibrinógeno completamente PEGilado contiene 29 grupos acrilato para cada molécula de proteína, o aproximadamente 0,1 acrilato/kDa para el fibrinógeno PEGilado de 4 kDa, 0,086 acrilato/kDa para el fibrinógeno PEGilado de 6 kDa y 0,039 acrilato/kDa para el fibrinógeno PEGilado de 20 kDa. Una solución de PEG-DA pura contiene 0,5 acrilatos/kDa para el PEG de 4 kDa, 0,33 acrilatos/kDa para el PEG de 6 kDa y 0,1 acrilatos/kDa para el PEG de 20 kDa. Si la proporción de acrilatos con respecto al PM es demasiado baja, la solución polimérica no formará un hidrogel continuo. Por esta razón, los experimentos realizados en este estudio utilizaron altas concentraciones de fibrinógeno PEGilado (≥ 10 %).
El fibrinógeno PEGilado requiere un esfuerzo sustancial para disolverse a estas altas concentraciones. Dado que la solubilidad del fibrinógeno PEGilado está muy influida por el injerto de las cadenas de PEG, presumiblemente debido
a la formación de un complejo de proteína hidrófobo en presencia de un injerto de PEG altamente hidrófilo, la proteína de fibrinógeno usada en la presente invención utiliza una escisión no reversible por CNBr. Por tanto, la PEGilación de fibrinógeno escindido, da como resultado un precursor proteico altamente soluble para la formación del hidrogel.
Las propiedades mecánicas de los hidrogeles de PEG-fibrinógeno escindido y completo se definieron usando el comportamiento de tensión-deformación con compresión libre uniaxial en condiciones cuasi-estáticas. El material de PEG-fibrinógeno demuestra las características de tensión-deformación no lineales típicas de un material polimérico, similares a los geles de control de PEG-PEG. El compuesto se comporta como un sólido viscoelástico con histéresis mínima bajo carga cíclica repetitiva (datos no mostrados). La rigidez del material, determinada a partir del módulo de elasticidad, es directamente proporcional al porcentaje de polímero de la composición. Se apreciará que la rigidez del material de los hidrogeles poliméricos puede atribuirse directamente al grado de reticulación. En el polímero de PEG-fibrinógeno, la cantidad de grupos funcionales disponible para la reticulación es proporcional a la concentración polimérica. Por tanto, el módulo del material es directamente proporcional a la cantidad de polímero en el hidrogel.
La relación entre el módulo elástico del hidrogel y la longitud de la cadena molecular del constituyente de PEG injertado es ambigua. Mientras que los hidrogeles puros presentan una relación proporcional entre el módulo del material y el PM del PEG, la adición de la proteína en la red de hidrogel puede tener un profundo impacto sobre esta relación, dependiendo del tamaño relativo de los dos polímeros. En el caso de hidrogeles de fibrinógeno completo PEGilado, en los que el PEG es significativamente más pequeño que la proteína, el impacto del PM del PEG sobre el módulo es más pronunciado. Por el contrario, la relación entre el PM del PEG y el módulo de los hidrogeles es menos pronunciada cuando los hidrogeles están constituidos por proteína escindida. En cualquier caso, cuando se compara el módulo elástico, es difícil resolver la diferencia entre el PEG de 4 kDa y el PEG de 6 kDa.
Los datos de las propiedades mecánicas demuestran una diferencia significativa en la rigidez de los hidrogeles constituidos por fibrinógeno PEGilado puro frente a hidrogeles de PEG puro. Independientemente del PM del PEG, los hidrogeles de fibrinógeno PEGilado son siempre menos rígidos que los hidrogeles de PEG puro. Esto puede atribuirse al hecho de que los hidrogeles de PEG puro (preparados con similar porcentaje en peso del polímero) contienen casi 5 veces más grupos funcionales disponibles para la reticulación que los hidrogeles PEGilados. La discrepancia en los sitios de reticulación surge debido a que el constituyente de fibrinógeno representa más de la mitad del peso del polímero pero no contiene sitios de reticulación intrínsecos y cada PEG injertado sobre el fibrinógeno PEGilado solo tiene un grupo funcional sencillo disponible para la reticulación, a diferencia de los dos grupos funcionales sobre el PEG-DA libre. Pueden producirse otras limitaciones de reticulación debido a impedimentos estéricos producidos por las voluminosas moléculas de fibrinógeno PEGilado.
La adición de PEG-DA libre a los hidrogeles de fibrinógeno PEGilado introduce sitios de reticulación en la red del hidrogel y por consiguiente modifica la rigidez del material. Por lo tanto, el equilibrio entre el fibrinógeno PEGilado y el PEG-DA libre adicional puede usarse para modular la rigidez de los hidrogeles sin comprometer los dominios funcionales del constituyen de fibrinógeno. Es importante destacar que la adición de PEG libre al hidrogel de fibrinógeno PEGilado puede tener un impacto significativo sobre la degradabilidad de los hidrogeles en presencia de proteasas secretadas por células (datos no mostrados).
Basándose en estos hallazgos, está claro que la longitud molecular de la cadena y el porcentaje de la composición representan dos parámetros independientes para controlar las propiedades mecánicas del material. Un parámetro adicional que puede modificar las propiedades mecánicas del material es el número de sitios de reticulación sobre cada molécula de PEG injertada. Como se ha indicado anteriormente, el PEG lineal injertado solo contiene un grupo funcional para la reticulación del hidrogel; sin embargo, las moléculas de PEG contienen diversos grupos funcionales tales como los PEG en estrella que también pueden injertarse sobre el fibrinógeno para formar hidrogeles. Aunque no se ha usado PEG en estrella como parte de la presente investigación, futuros estudios apuntan a aumentar la rigidez de los hidrogeles de PEG-fibrinógeno usando precursores de PEG en estrella de 4 brazos y de 8 brazos.
El esqueleto de fibrinógeno del material de hidrogel proporciona sensibilidad proteolítica mediante sustratos de origen natural por fibrinólisis. La fibrinólisis es un proceso fisiológico mediante el cual la molécula de fibrina natural se desmantela proteolíticamente por serina proteasas. En teoría, el esqueleto de fibrinógeno se escinde en presencia de proteasas activadas, dando como resultado la disolución completa del hidrogel de PEG-fibrinógeno. Los resultados mostrados en este estudio demuestran que los hidrogeles de PEG-fibrinógeno puro son proteolíticamente degradables mientras que los controles de PEG-PEG no son susceptibles a proteólisis (datos no mostrados).
Los datos de degradación revelan diversos otros modelos interesantes en lo que respecta a la degradación proteolítica de los hidrogeles de fibrinógeno escindido y completo en presencia de tripsina o colagenasa después de 30 minutos. El fibrinógeno escindido presenta menos sustrato para la degradación aumentando de esta manera la disolución del hidrogel normalizada en Colagenasa (n = 5, p < 0,05). En tripsina, los hidrogeles de fibrinógeno escindido y completo se degradan casi idénticamente. Probablemente esto se explica por la observación de que 0,05 mg/ml de tripsina se saturan con sustrato mientras que 0,5 mg/ml de colagenasa no se saturan con sustrato. Es evidente que el PM del constituyente de PEG también influye en los resultados de degradación. En tripsina, los hidrogeles de PEG de 20 kDa están significativamente más degradados que los hidrogeles de PEG de 6 kDa
después de 30 minutos, mientras que en colagenasa no hay diferencias significativas en la degradación entre las dos condiciones (n = 6, p < 0,05). Los hidrogeles de PEG de 20 kDa comprenden menos fibrinógeno lo que da como resultado una disolución más rápida del hidrogel. Esto también puede explicarse por la observación de que 0,05 mg/ml de tripsina se saturan con enzima y no puede degradar tan rápido los hidrogeles de fibrinógeno PEGilado de 20 kDa. Futuros estudios examinarán más aspectos de degradabilidad proteolítica del material de PEG-fibrinógeno, incluyendo la cinética de degradación y la fibrinólisis en presencia de plasmina.
Ejemplo 2
Los hidrogeles de PEG-fibrinógeno dan soporte a la propagación y extensión celular
Para someter a ensayo la capacidad de los hidrogeles de PEG-fibrinógeno para promover la expansión y diferenciación de cultivos celulares, se cultivaron células endoteliales aórticas y células de músculo liso de bovino en diversos hidrogeles basados en PEG, de la siguiente manera.
Materiales y procedimientos experimentales
Estudios de cultivo celular in vitro – Se aislaron células de músculo liso aórtico de bovino (BSMC, Bovine aortic Smooth Muscle Cells) de donantes jóvenes y cultivaron de acuerdo con un protocolo modificado de Oakes y col., 1982. Las BSMC se cultivaron hasta el 6º pase en Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco, Reino Unido) que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS) (Biological Industries, Israel), penicilina-estreptomicina al 1% (Biological Industries) y L-glutamina al 1% (Gibco). Los hidrogeles de PEG que contenían las BSMC se prepararon mezclando una suspensión celular con PBS y solución de precursor de fibrinógeno PEGilado que contenía el fotoiniciador Igracure™ para constituir una solución al 10% (p/v) con 1,5 x 106 células/ml. Se añadieron alícuotas de 100 μl de la suspensión en los pocillos en una placa de 96 pocillos de fondo plano y se pusieron bajo luz ultravioleta (4-5 mW/cm2) durante 5 minutos en una campana de flujo laminar. Inmediatamente, a los hidrogeles polimerizados se añadió medio de cultivo DMEM (que contenía FBS al 10%) y se cambió diariamente (100 μl/pocillo).
Estudios de viabilidad de células después de exposición a luz ultravioleta – Para verificar que la exposición a luz ultravioleta no dañaba a las células en el hidrogel, se aislaron células endoteliales aórticas de bovino (BAEC, Bovine Aortic Endothelial Cells) y se cultivaron hasta el 6º pase de acuerdo con protocolos publicados (Remuzzi A., y col., 1984). Las células BAEC se sembraron y cultivaron en la parte superior de hidrogeles de PEG de 1 mm de espesor en placas de 24 pocillos como se describe en cualquier parte (Seliktar D., y col., 2004). La densidad de la siembra de las células BAEC fue de 30.000 células/cm2. Las células BAEC y BSMC se observaron diariamente usando un microscopio de contraste de fase Nikon TE2000 y se tomaron fotos digitales con una cámara CCD digital (Jenoptik, Alemania).
Evaluaciones histológicas – Los hidrogeles de PEG-fibrinógeno con células se congelaron en 2-metilbutano enfriado con nitrógeno líquido (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) y se cortaron en secciones de 7 μm de espesor usando un criostato. Las secciones se fijaron con acetona enfriada con hielo en portaobjetos de vidrio para observar al microscopio y se tiñeron con Hematosilina y Eosina (H&E) para visualizar la morfología celular. La morfología celular se documentó usando un microscopio de luz Nikon (TS-100) conectado a una estación de trabajo de formación de imágenes digitales (Sony Corporation, Japón).
Resultados experimentales
Los hidrogeles de PEG-fibrinógeno dan soporte a la propagación y a la adhesión celular – Para someter a ensayo la capacidad de los hidrogeles de PEG-fibrinógeno de dar soporte tridimensional a la propagación y a la adhesión, se cultivaron células endoteliales (BAEC) o de músculo liso (BSMC) sobre la superficie, o dentro, de los hidrogeles de PEG. Las células BAEC se sembraron sobre la superficie de los hidrogeles a una concentración de
30.000 células/cm2 y 24 horas después de la siembra celular se evaluó el grado de adhesión y la propagación celular usando microscopia por contraste de fase. Como se muestra en las Figuras 6a y d, mientras que las células BAEC que crecían sobre hidrogeles de PEG-fibrinógeno presentaban adhesión y propagación celular significativa (Figura 6a), las células BAEC que crecían sobre hidrogeles de PEG-PEG eran redondeadas y no se observaba propagación (Figura 6d). Estos resultados demuestran una mayor capacidad de los hidrogeles de PEG-fibrinógeno para dar soporte a la adhesión o propagación celular sobre los de PEG-PEG. La capacidad de los hidrogeles de PEGfibrinógeno para dar soporte tridimensional a la propagación y adhesión celular también se sometió a ensayo dispersando células BSMC en la solución precursora (1,5 x 106 células/ml, PEG de 4 kDa, 10% de polímero) antes de la fotopolimerización. Después del ensamblaje, la red de hidrogel contenía células BSMC con morfología redonda distribuidas homogéneamente. Sin embargo, después de 24 horas de cultivo, las BSMC cultivadas dentro de los hidrogeles de PEG-fibrinógeno formaron adhesiones, procesos y extensiones celulares estables (Figuras 6b-c). Además, los hidrogeles de fibrinógeno PEGilado constituidos por fibrinógeno escindido también dieron soporte a la adhesión y extensión de las células BSMC dentro de los hidrogeles PEGilados (datos no mostrados). Por otro lado, las células BSMC cultivadas dentro de hidrogeles de PEG-PEG eran redondeadas y no se observaba ninguna extensión celular visible (Figura 6e). En una evaluación histológica adicional de las células BSMC cultivadas dentro de los hidrogeles de PEG se confirmó la observación de que las BSMC se extendían dentro de la red de hidrogel de PEG-fibrinógeno (Figura 7a), pero no dentro de los hidrogeles de control de PEG-PEG (Figura 7b).
Análisis y discusión
El armazón de hidrogel de PEG sin el esqueleto de fibrinógeno carece por completo de dominios biofuncionales para el cultivo celular. El esqueleto de fibrinógeno proporciona al material de hidrogel al menos dos características biofuncionales: sensibilidad proteolítica y adhesividad celular. Con respecto a lo último, los hidrogeles de PEGfibrinógeno dan soporte a la adhesión y propagación de células endoteliales en presencia de proteínas séricas mientras que los controles de PEG-PEG no pueden dar soporte a la adhesión celular. Por lo tanto, las moléculas de adhesión a la superficie de células endoteliales pueden unirse directamente a dominios de adhesión sobre el esqueleto de fibrinógeno o a otras proteínas séricas que interaccionan no específicamente con el fibrinógeno. Una vez unidas, las células pueden tunelizase proteolíticamente a través de la red de hidrogel con la ayuda de enzimas secretadas por células tales como colagenasa. Esto se ilustra mejor con células del musculo liso que quedan atrapadas tridimensionalmente dentro del material de hidrogel después de la fotopolimerización y que comienzan a formar grupos de células después de 24 horas de cultivo. Las microfotografías de contraste de fase y cortes transversales histológicos confirman que las BSMC forman extensiones similares a flagelos que permiten su migración dentro de la red de hidrogel. En este sentido, no se observan diferencias entre los armazones de hidrogel de fibrinógeno completo y escindido. En cambio, las BSMC permanecieron redondeadas y homogéneamente dispersas y no se observaron extensiones celulares en los controles de PEG-PEG no degradables.
Por tanto, los dominios biológicos en el esqueleto de fibrinógeno proporcionan motivos de unión para la adhesión de células endoteliales y células de musculo liso así como sensibilidad proteolítica para la biodegradación. Las células de músculo liso demuestran la capacidad de penetrar proteolíticamente a través del material del hidrogel y formar redes de células interconectadas. Por tanto, los armazones de la presente invención son novedosos, biodegradables y altamente adecuados para el cultivo de células en un entorno 3-D para terapias de regeneración tisular.
Ejemplo 3
Regeneración in vivo de hueso usando el armazón Gelrin™ de PEG-FIBRINÓGENO
Para someter a ensayo el potencial del material del armazón de PEG-fibrinógeno para facilitar la regeneración tisular, se introdujo un defecto de tibia de tamaño crítico en ratas y se implantó el armazón Gelrin ™ en el sitio de cirugía (diáfisis tibial).
Materiales y procedimientos experimentales
Animales – Cinco días antes del experimento, ratas hembra Sprague-Dawley (de 3-4 meses de vida) se adaptaron a vivir en una jaula para animales. El peso de los animales se controló durante este periodo para garantizar una estabilidad y adaptación correctas. Los animales tuvieron alimento y agua a diario sin restricciones.
Introducción de un defecto de tibia de tamaño crítico – Los animales se anestesiaron con una combinación de Quetamina (120 mg/kg) y Xilacina (17 mg/kg). Durante el procedimiento quirúrgico los animales se colocaron en una placa térmica para mantener la temperatura corporal (y evitar la hipotermia). La tibia derecha se rasuró y se frotó con una solución de tinción de polidina. La parte media de la tibia derecha se expuso desde el lado medio anterior por incisión longitudinal (Figura 8a). Se colocó un fijador externo proximal y distal a la sección media de la tibia (Figura 8b). Se perforaron dos agujas en la tibia proximal (21G) y tibia distal (23G) y conectaron dos fijadores externos (tornillos) para formar una fijación estable del hueso. Se cortó una abertura de 10 mm usando una sierra de disco en la parte entre las agujas proximal y distal de los fijadores (Figura 8c). La fíbula no se osteotomizó.
Implantación de un armazón de PEG-fibrinógeno (Gelrin™) – Se insertó un tapón de PEG-fibrinógeno (5 mm de diámetro y 10 mm de longitud) en el sitio del defecto y se envolvió con tejido conectivo circundante para asegurar el tapón en el sitio (Figura 8d). La herida incisional se saturó usando hilo quirúrgico de nylon. A los animales se les administró antibióticos profilácticos (ampicilina 0,1 gramos/100 gramos). Inmediatamente después de la cirugía, los animales se sometieron a rayos X y se evaluaron posteriormente por exploración de rayos X semanal. Los animales se movían con libertad en la jaula durante todo el periodo de seguimiento post- operatorio. Al final de un periodo de evaluación de 2 meses, los animales se sacrificaron con CO2 y la tibia derecha se recogió para someter a ensayo histológico y mecánico.
Resultados experimentales
Se sabe que, la introducción de un defecto de tibia de tamaño crítico en rata produce una mortalidad de hasta un 20%. Se introdujo un defecto de tibia de tamaño crítico en rata en 25 ratas (Figuras 8a-d), de las cuales 17 ratas se sometieron posteriormente a implante de armazón usando los hidrogeles de PEG-fibrinógeno o de PEG-PEG (véase la Tabla 3, más adelante, para ratas representativas). De cuatro a siete semanas después de someter a las ratas a defectos de tibia de tamaño crítico estas se sacrificaron y se evaluaron las tibias para determinar la presencia, grado y localización de crecimiento interno tisular y formación de hueso nuevo. Como se observa en las Figuras 9a-b, cinco semanas después de la cirugía en la tibias de rata con implante Gelrin ™ (Figura 9b) puede observarse un hueso nuevo pero no en las ratas de control (Figura 9a).
Tabla 3
Implantación de armazón en defecto de tibia de tamaño crítico en rata
Nº de Rata
Fecha de la cirugía Pata Composición de Hidrogel Días después de la operación
5
24/5/04 Izquierda PEG-fibrinógeno (escindido, 4-kDa) 15% P/V total; PEG-fibrinógeno 10% y PEG-DA 5% 42
6
24/5/04 Derecha PEG-fibrinógeno (escindido, 4-kDa) 15% P/V total; PEG-fibrinógeno 10% y PEG-DA 5% 35
7
16/8/04 Derecha PEG-fibrinógeno (completo, 10 kDa) 1,75 % PEGfibrinógeno (Gelrin ™ ) y 3 % PEG-DA 49
8
16/8/04 Derecha PEG-fibrinógeno (completo, 10 kDa) 1,75 % PEGfibrinógeno (Gelrin ™ ) y 3 % PEG-DA
9
16/8/04 Derecha PEG-fibrinógeno (completo, 10 kDa) 1,75 % PEGfibrinógeno (Gelrin ™ ) y 3 % PEG-DA 35
11
27/7/04 Derecha Solo PEG (4-kDa) 10% P/V 41
12
27/7/04 Derecha Solo PEG (4-kDa) 10% P/V 41
13
27/7/04 Derecha Solo PEG (6-kDa) 15% WN 41
14
27/7/04 Derecha Solo PEG (6-kDa) 15% P/V 41
15
27/7/04 Derecha Sin hidrogel - control 41
16
27/7/04 Derecha Sin hidrogel - control 41
21
13/7/04 Derecha PEG-fibrinógeno (completo, 10 kDa) 1,75 % PEGfibrinógeno (Gelrin ™ ) y 3 % PEG-DA
22
13/7/04 Derecha PEG-fibrinógeno (completo, 10 kDa) 1,75 % PEGfibrinógeno (Gelrin ™ ) y 3 % PEG-DA
23
27/9/04 Derecha PEG-fibrinógeno (completo, 10 kDa) 1,75 % PEGfibrinógeno (Gelrin ™ ) y 3 % PEG-DA
24
27/9/04 Derecha PEG-fibrinógeno (completo, 10 kDa) 1,75 % PEGfibrinógeno (Gelrin ™ ) y 3 % PEG-DA
Tabla 3: Experimentos representativos in vivo realizados después de la introducción del defecto de tibia de tamaño crítico en rata. A las ratas se les implantaron hidrogeles de PEG-PEG (solo PEG) o de PEG-fibrinógeno. Los hidrogeles de PEG-fibrinógeno se prepararon a partir de precursores de PEG-fibrinógeno y reticulantes de PEG-DA. Los precursores de PEG-fibrinógeno se prepararon a partir de fibrinógeno completo (Gelrin ™ ) o de fibrinógeno escindido con CNBr.
Las Figuras 10-17 demuestran la presencia de tejido óseo y cartilaginoso normal cinco semanas después de la introducción de un defecto de tibia de tamaño crítico e implantación de Gelrin ™. Por tanto, las tibias de ratas tratadas con Gelrin ™ mostraron tejido fibroso bien vascularizado, orientado y densamente texturizado (Figura 13),
5 cicatrización osteonal (Figura 11) y sistemas Haversianos con canales centrales pequeños que contenían vasos sanguíneos (Figura 10).
Ejemplo 4
El constituyente de PEG sintético puede controlar la biodegradabilidad de los hidrogeles de PEG-fibrinógeno
La biodegradabilidad de los hidrogeles de PEG-fibrinógeno se reduce añadiendo PEG-DA libre a los
10 hidrogeles – Para definir adicionalmente el efecto de la concentración de la molécula reticulante de la presente invención [es decir PEG-DA (PEG libre)] sobre la biodegradabilidad del hidrogel, se sembraron 1x106 células de musculo liso por ml dentro de hidrogeles Gelrin ™ (1,75% PEG-fibrinógeno, PEG 10-kDa) que contenían diversas concentraciones de PEG-DA. Los hidrogeles sembrados se cultivaron durante 48 horas, después de lo cual, usando un microscopio invertido, se evaluó la capacidad de las células para adherirse y propagarse dentro de los hidrogeles.
Como se observa en las Figuras 18a-e, mientras que las células cultivadas en la matriz pura de Gelrin ™ (en ausencia de PEG-DA libre) mostraron extensiones celulares y propagación significativa, las células cultivadas en hidrogeles fabricados con concentraciones en aumento de PEG libre (es decir 0,5-2%) carecían de extensiones celulares y eran más redondeadas. Estos resultados demuestran que el exceso de una molécula reticulante (PEG-DA) en la matriz de Gelrin ™ reduce la degradabilidad mediada por células y la penetración celular a través del hidrogel.
La biodegradabilidad y la extensión celular disminuyen en hidrogeles Gelrin™ constituidos por más del 1% de una molécula reticulante (PEG-DA) – Para ensayar adicionalmente el efecto de la molécula reticulante (es decir, PEG-DA funcionalizado) sobre la propagación celular a través del armazón de PEG-fibrinógeno de la presente invención, se prepararon matrices Gelrin ™ (1,75 % PEG-fibrinógeno, PEG 10-kDa) como hidrogeles puros (en ausencia de reticulante PEG-DA libre) o en presencia de 1 o 2% de PEG-DA libre y grupos de células constituidos por células del músculo liso muy compactas dentro de una matriz gelatinosa de colágeno (grupo de 5 x 106 células en un mg de colágeno ). Los grupos se sembraron en el centro de cada hidrogel colocando la masa celular en la matriz Gelrin ™ antes de la polimerización y formando el armazón alrededor del tejido de manera que encapsule la masa de tejido desde todos los lados. El grado de extensión celular se controló después de 1, 2, 4 y 7 días de cultivo usando microscopía de contraste de fase. Como se muestra en las Figuras 19a-1, en hidrogeles puros Gelrin ™, se observaron extensiones celulares significativas comenzando después de un día de cultivo. En cambio, las extensiones celulares disminuyeron relativamente en grupos de células de musculo liso cultivadas dentro de hidrogeles Gelrin ™ fabricados en presencia 2% de PEG-DA.
En conjunto, estos resultados demuestran que la biodegradabilidad y propagación celular a través de los armazones depende del grado de reticulación del hidrogel; mayores concentraciones de una molécula reticulante (PEG-DA) se correlacionan inversamente con la biodegradabilidad del hidrogel del armazón de la presente invención.
Se aprecia que determinadas características de la invención, que por aclaración se describen en el contexto de realizaciones distintas, también pueden proporcionarse en combinación en una sola realización. Por el contrario, diversas características de la invención que, por brevedad, se describen en el contexto de una sola realización, también pueden proporcionarse por separado o en cualquier subcombinación adecuada.
Aunque la invención se ha descrito junto con sus realizaciones específicas, es evidente que para los expertos en la materia serán obvias muchas alternativas, modificaciones y variaciones. Por consiguiente, todas estas alternativas, modificaciones y variaciones pretenden incluirse dentro del espíritu y amplio alcance de las reivindicaciones adjuntas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes mencionadas en esta memoria descriptiva se incorporan en la misma en su totalidad por referencia, al mismo grado como si cada publicación, patente o solicitud de patente individual se especificase e individualmente se indicase como incorporada en el presente documento por referencia. Además, las citas o identificaciones de cualquier referencia en esta solicitud no deben interpretarse como una admisión de que tal referencia esté disponible como técnica anterior a la presente invención.
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(En el texto se citan referencias adicionales)
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<213> Bos Taurus
<400> 1
<210> 2
<211> 425
<212> PRT
<213> Bos Taurus
<400> 2
<210> 3
<211> 444
<212> PRT
<213> Bos Taurus
<400> 3
<210> 4
<211> 644
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
<210> 5
<211> 491
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
<210> 6
<211> 453
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6

Claims (26)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un armazón que comprende una pluralidad de unidades, cada una compuesta de un polímero sintético unido a una proteína de origen natural o una parte de la misma, en el que dicho polímero sintético es PEG y en el que dicha proteína de origen natural es fibrinógeno desnaturalizado.
  2. 2.
    Un procedimiento de generación un armazón que comprende:
    (a)
    la unión por covalencia de un polímero sintético a una proteína de origen natural o a una parte de la misma para obtener de esta manera una molécula precursora de polímero-proteína, y
    (b)
    la reticulación de una pluralidad de dichas moléculas precursoras para generar de esta manera el armazón biodegradable, en el que dicho polímero sintético es PEG y en el que dicha proteína de origen natural es fibrinógeno desnaturalizado.
  3. 3.
    El armazón de la reivindicación 1, que adicionalmente comprende una molécula que puede reticularse, uniendo por covalencia dicha molécula dichas unidades.
  4. 4.
    El armazón o el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho fibrinógeno es fibrinógeno completo o fibrinógeno fragmentado.
  5. 5.
    El armazón o el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho PEG se selecciona del grupo que consiste en PEG-DA, PEG multi-acrilato en estrella de 4 brazos y PEG multi-acrilato en estrella de 8 brazos.
  6. 6.
    El armazón o el procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicho PEG-DA es un PEG-DA de 4-kDa, PEG-DA de 6-kDa, PEG-DA de 10-kDa y/o PEG-DA de 20-kDa.
  7. 7.
    El armazón o el procedimiento de la reivindicación 6, en el que una proporción molar entre dicho PEG-DA y dicho fibrinógeno en dichas unidades es de 2-400 a 1, respectivamente.
  8. 8.
    Un hidrogel formado a partir del armazón de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 7 o formado a partir del armazón producido por el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 4 a 7.
  9. 9.
    El hidrogel de la reivindicación 8, en el que dicha proteína de origen natural es fibrinógeno completo y en el que una concentración de dichas unidades en dicho hidrogel se selecciona de un intervalo de 0,5-35%.
  10. 10.
    El hidrogel de la reivindicación 8, en el que dicho fibrinógeno es fibrinógeno fragmentado y en el que una concentración de dichas unidades en dicho hidrogel se selecciona de un intervalo de 0,5-35%.
  11. 11.
    El hidrogel de la reivindicación 9, en el que el módulo de elasticidad de dicho hidrogel está en un intervalo de 0,02-0,11 kPa para un 10-20% de polímero.
  12. 12.
    El hidrogel de la reivindicación 10, en el que el módulo de elasticidad de dicho hidrogel está en un intervalo de 0,01-0,07 kPa para un 10-20% de polímero.
  13. 13.
    Una composición compuesta de un polímero sintético unido a una proteína de origen natural o a una parte de la misma, en el que dicho polímero sintético es PEG y en el que dicha proteína de origen natural es fibrinógeno desnaturalizado para su uso en
    (a)
    la inducción de la formación in vivo de un tejido, en el que, dicha composición puede formar un armazón en un sujeto, induciendo así la formación de tejido in vivo, o
    (b)
    el tratamiento de un sujeto que padece un trastorno caracterizado por una lesión o pérdida tisular, en el que dicha composición puede formar un armazón en el sujeto, induciendo así la formación de un tejido y tratando el trastorno caracterizado por una lesión o pérdida tisular.
  14. 14.
    La composición de la reivindicación 13 para su uso, en la que adicionalmente al sujeto se le debe administrar una molécula que puede reticular dicha composición.
  15. 15.
    La composición de la reivindicación 13 para su uso, en la que dicho PEG se selecciona del grupo que consiste en PEG-acrilato (PEG-Ac) y PEG-vinilsulfona (PEG-VS).
  16. 16.
    La composición de la reivindicación 15 para uso, en la que dicho PEG-Ac se selecciona del grupo que consiste en PEG-DA, PEG multi-acrilato en estrella de 4 brazos y PEG multi-acrilato en estrella de 8 brazos.
  17. 17.
    La composición de la reivindicación 16 para su uso, en la que dicho PEG-DA es un PEG-DA de 4-kDa, PEG-DA de 6-kDa, PEG-DA de 10-kDa y/o PEG-DA de 20-kDa.
  18. 18.
    La composición de la reivindicación 17 para su uso, en la que una proporción molar entre dicho PEG-DA y dicho fibrinógeno en dicha composición es de 2-400 a 1, respectivamente.
  19. 19.
    La composición de la reivindicación 13 para su uso, en la que dicho fibrinógeno es fibrinógeno completo o fibrinógeno fragmentado.
  20. 20.
    La composición de la reivindicación 14 para su uso, en la que dicha molécula capaz de reticulación se selecciona del grupo que consiste en PEG-DA, PEG multi-acrilato y PEG-VS.
    5 21. La composición de la reivindicación 13 para su uso, en la que dicho armazón es biodegradable.
  21. 22. La composición de la reivindicación 13(b) para su uso, en la que dicha lesión tisular está asociada a un trastorno seleccionado del grupo que consiste en cirrosis hepática, diabetes de Tipo 1, fibrosis quística, cáncer de hueso, reparación de quemaduras y de heridas, degeneración macular relacionada con la edad, infarto de miocardio, reparación de miocardio, lesiones del SNC, defecto de cartílago reticular, degeneración de la vejiga y degeneración
    10 intestinal.
  22. 23.
    Una composición de material que comprende polietilenglicol (PEG) unido a fibrinógeno desnaturalizado, en el que dicha composición de material puede formar un armazón.
  23. 24.
    La composición de material de la reivindicación 23, en la que dicho PEG se selecciona del grupo que consiste en PEG-acrilato (PEG-Ac) y PEG-vinilsulfona (PEG- VS).
    15 25. La composición de material de la reivindicación 24, en la que dicho PEG-Ac se selecciona del grupo que consiste en PEG-DA, PEG multiacrilato en estrella de 4 brazos y PEG multiacrilato en estrella de 8 brazos.
  24. 26. La composición de material de la reivindicación 25, en la que dicho PEG-DA es un PEG-DA de 4-kDa, PEG-DA de 6-kDa, PEG-DA de 10-kDa y/o PEG-DA de 20-kDa.
  25. 27. La composición de material de la reivindicación 25, en la que una proporción molar entre dicho PEG-DA y dicho 20 fibrinógeno es de 2-400 a 1, respectivamente.
  26. 28. La composición de material de la reivindicación 22, en la que dicho fibrinógeno es fibrinógeno completo o fibrinógeno fragmentado.
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