ES2392332T3

ES2392332T3 - Genes y usos para la mejora de plantas

Info

Publication number: ES2392332T3
Application number: ES10179464T
Authority: ES
Inventors: Scott Mark Abad; Barry S. Goldman; Jason Cotter; Angie Ferguson; Kindle Karen Hartsuyker; Todd F. James; Balasulojini Karunanandaa; Robert D'ordine; Susan Norris; Li Zhou; Joshua Stein; D. Steven Rounsley
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 2004-03-25
Filing date: 2005-03-24
Publication date: 2012-12-07
Anticipated expiration: 2025-03-24
Also published as: EP1586652A1; US20060041961A1; EP2292773A1; EP2292773B1; US20140325710A1

Abstract

Una semilla transgénica para un cultivo, en la que el genoma de dicha semilla transgénica comprende ADNrecombinante que mejora rasgos de un gen para una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos con almenos el 90% de identidad con SEC ID Nº: 408.

Description

Genes y usos para la mejora de plantas

Campo de la invención

En el presente documento se desvelan invenciones en el campo de la genética de las plantas y la biología del

5 desarrollo. Más específicamente, la presente invención proporciona semillas transgénicas para cultivos, en las que el genoma de dicha semilla comprende ADN recombinante, cuya expresión produce la producción de plantas transgénicas que tienen rasgo(s) mejorado(s).

Antecedentes de la invención

Las plantas transgénicas con rasgos mejorados tales como rendimiento mejorado, tolerancia al estrés

10 medioambiental, resistencia a plagas, tolerancia a herbicidas, composiciones de la semilla modificadas y similares son deseadas tanto por agricultores como por consumidores. Aunque esfuerzos considerables en el cultivo de plantas ha proporcionado beneficios significativos en rasgos deseados, la capacidad para introducir ADN específico en los genomas de la planta proporciona otras oportunidades para la generación de plantas con rasgos mejorados y/o únicos. La capacidad para desarrollar plantas transgénicas con rasgos mejorados depende en parte de la

15 identificación de genes que son útiles en construcciones de ADN recombinante para la producción de plantas transformadas con propiedades mejoradas.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona semillas transgénicas, plantas transgénicas y construcciones de ADN con ADN recombinante que mejora rasgos de un gen u homólogo que se ha demostrado que mejora rasgos en una planta 20 modelo. Más específicamente, tal ADN recombinante es de un gen identificado en un cribado de plantas modelo como se desvela en el presente documento u homólogos de tal gen, por ejemplo, de especies relacionadas o en algunos casos de una amplia gama de especies sin relacionar. En aspectos particulares de la invención, el ADN recombinante expresará una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos el 90% de identidad con SEC ID Nº: 408. En el presente documento se proporciona la Tabla 2 que identifica las secuencias de 25 homólogos para proteínas codificadas por los genes que mejoran rasgos descritas arriba como apéndice. En algunos casos de la mejora de rasgos, el ADN recombinante codifica una proteína; en otros casos, el ADN recombinante suprime la expresión endógena de proteínas. En un amplio aspecto, la presente invención proporciona semilla transgénica para cultivar plantas de cultivo con rasgos mejorados, incluyendo tales plantas de cultivo con rasgos mejorados y las partes de la planta semilla transgénica producida por tales plantas de cultivo. El rasgo 30 mejorado proporcionado por el ADN recombinante en la planta de cultivo transgénico de la presente invención se identifica por comparación con una planta de control, es decir, una planta sin el ADN recombinante que mejora rasgos. En un aspecto de la invención, la planta de cultivo transgénico cultivada a partir de la semilla transgénica tiene rendimiento mejorado, con respecto al rendimiento de una planta de control, por ejemplo, una planta sin el ADN recombinante que produce el aumento de rendimiento. El aumento del rendimiento puede caracterizarse como 35 aumento del rendimiento de la planta bajo condiciones de no estrés, o por aumento del rendimiento de la planta bajo una o más condiciones de estrés medioambiental que incluyen, pero no se limitan a, estrés por falta de agua, estrés por frío, estrés por calor, estrés por alta salinidad, estrés por sombra y estrés por baja disponibilidad de nitrógeno. Otro aspecto adicional de la presente invención también proporciona plantas transgénicas que tienen otros fenotipos mejorados, tales como desarrollo de la planta, morfología de la planta, fisiología de la planta o composición de la

40 semilla mejorados con respecto a un rasgo correspondiente de una planta de control. Los diversos aspectos de la presente invención son especialmente útiles para semilla transgénica y plantas transgénicas que tienen rasgos mejorados en cultivos de maíz, soja, algodón, canola (colza), trigo, girasol, sorgo, alfalfa, cebada, mijo, arroz, tabaco, frutas y verduras, y césped.

La invención también comprende una construcción de ADN recombinante que comprende un promotor funcional en

45 una célula de planta operativamente ligado a ADN recombinante que mejora rasgos de un gen para una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos el 90% de identidad con SEC ID Nº: 408. En un aspecto tal, construcciones de ADN recombinante útiles para la semilla transgénica y plantas transgénicas de la presente invención comprenden un promotor funcional en una célula de planta operativamente ligado a un segmento de ADN para expresar una proteína asociada a un rasgo en una planta modelo o un homólogo. En otro aspecto, las

50 construcciones de ADN recombinante útiles para la semilla transgénica y plantas transgénicas de la presente invención comprenden un promotor funcional en una célula de planta operativamente ligado a un segmento de ADN para suprimir el nivel de una proteína de planta endógena que es un homólogo a una proteína de la planta modelo, estando la supresión asociada a un rasgo mejorado. La supresión puede efectuarse por cualquiera de una variedad de procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, supresión postranscripcional por antisentido, sentido,

55 ARNbc y similares, o por supresión transcripcional.

La presente invención también proporciona una planta de cultivo transgénico o progenie de la misma que comprende en su genoma la construcción de ADN recombinante que mejora rasgos como se ha definido anteriormente y un procedimiento para preparar una planta de cultivo transgénico, que comprende introducir la

construcción de ADN recombinante como se ha definido anteriormente en el genoma de una línea de planta diana.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a semilla de planta transgénica, en la que el genoma de dicha semilla de planta transgénica comprende un ADN recombinante que mejora rasgos como se proporciona en el presente documento, y la planta transgénica cultivada a partir de tal semilla posee un rasgo mejorado con respecto al rasgo de una planta de control. En un aspecto, la presente invención se refiere a plantas transgénicas en las que el rasgo mejorado es uno o más rasgos que incluyen tolerancia al estrés por sequía mejorada, tolerancia al estrés por calor mejorada, tolerancia al estrés por frío mejorada, tolerancia al estrés por alta salinidad mejorada, tolerancia al estrés por baja disponibilidad de nitrógeno mejorada, tolerancia al estrés por sombra mejorada, crecimiento y desarrollo de la planta mejorados en los estados de imbibición de semillas durante la fase vegetativa temprana, y crecimiento y desarrollo de la planta mejorados en los estados de desarrollo de hojas, producción de flores y madurez de la semilla. De particular interés son las plantas transgénicas cultivadas a partir de semillas transgénicas proporcionadas en el presente documento en las que el rasgo mejorado es el aumento del rendimiento de las semillas. Las construcciones de ADN recombinante desveladas por la presente invención comprenden polinucleótidos recombinantes que proporcionan la producción de ARNm para modular la expresión génica, confiriendo rasgos mejorados a las plantas.

Como se usa en el presente documento, “gen” se refiere a ADN cromosómico, ADN de plásmido, ADNc, ADN sintético u otro ADN que codifica un péptido, polipéptido, proteína o molécula de ARN, y regiones que flanquean las secuencias codificantes que participan en la regulación de la expresión.

Como se usa en el presente documento, “semilla transgénica” se refiere a una semilla de planta cuyo genoma ha sido alterado por la incorporación de ADN recombinante, por ejemplo, por transformación como se describe en el presente documento. El término “planta transgénica” se usa para referirse a la planta producida a partir de un evento de transformación original, o progenie de posteriores generaciones o cruces de una planta con una planta transformada, mientras que la progenie contenga el ADN recombinante en su genoma. Como se usa en el presente documento, “ADN recombinante” se refiere a un polinucleótido que tiene una modificación genéticamente manipulada introducida por combinación de elementos endógenos y/o exógenos en una unidad de transcripción, manipulación por mutagénesis, enzimas de restricción y similares, o simplemente insertando múltiples copias de una unidad de transcripción nativa. El ADN recombinante puede comprender segmentos de ADN obtenidos de diferentes fuentes, o segmentos de ADN obtenidos de la misma fuente, que han sido manipulados para unir segmentos de ADN que no existen naturalmente en la forma unida. Un polinucleótido recombinante puede existir fuera de la célula, por ejemplo, como un fragmento de PCR, o integrarse en un genoma, tal como un genoma de planta.

Como se usa en el presente documento, “rasgo” se refiere a una característica fisiológica, morfológica, bioquímica o física de una planta o material o célula de planta particular. En algunos casos, esta característica es visible para el ojo humano, tal como tamaño de la semilla o planta, o puede medirse por técnicas bioquímicas, tales como detectando el contenido de proteína, almidón o aceite de la semilla u hojas, o por observación de un proceso metabólico o fisiológico, por ejemplo, midiendo la captación de dióxido de carbono, o por la observación del nivel de expresión de un gen o genes, por ejemplo, empleando análisis Northern, RT-PCR, ensayos de expresión génica de micromatrices o sistemas de expresión de genes indicadores, o por observaciones agrícolas tales como tolerancia al estrés, rendimiento o tolerancia a patógenos.

Como se usa en el presente documento, “planta de control” es una planta sin ADN recombinante que mejora rasgos. Una planta de control se usa para medir y comparar la mejora de los rasgos en una planta transgénica con tal ADN recombinante que mejora rasgos. Una planta de control adecuada puede ser una planta no transgénica de la línea parental usada para generar una planta transgénica en el presente documento. Alternativamente, la planta de control puede ser una planta transgénica que comprende un vector vacío o gen marcador, pero no contiene el ADN recombinante que produce la mejora de rasgos. Una planta de control también puede ser una progenie segregante negativa de planta transgénica hemicigótica. En ciertas demostraciones de mejora de rasgos, el uso de un número limitado de plantas de control puede producir una amplia variación en el conjunto de datos de control. Para minimizar el efecto de la variación dentro del conjunto de datos de control se usa una “referencia”. Como uso en el presente documento, una “referencia” es una media recortada de todos los datos de tanto plantas transgénicas como de control cultivadas bajo las mismas condiciones y en el mismo estado de desarrollo. La media recortada se calcula eliminando un porcentaje específico, es decir, el 20%, de la observación más pequeña y más grande del conjunto de datos y luego calculando el promedio de la observación restante.

Como se usa en el presente documento, “mejora de rasgos” se refiere a una diferencia detectable y deseable en una característica en una planta transgénica con respecto a una planta de control o una referencia. En algunos casos, la mejora de rasgos puede medirse cuantitativamente. Por ejemplo, la mejora de rasgos puede implicar al menos una diferencia deseable del 2% en un rasgo observado, al menos una diferencia deseable del 5%, al menos aproximadamente una diferencia deseable del 10%, al menos aproximadamente una diferencia deseable del 20%, al menos aproximadamente una diferencia deseable del 30%, al menos aproximadamente una diferencia deseable del 50%, al menos aproximadamente una diferencia deseable del 70%, o al menos aproximadamente una diferencia del 100%, o una diferencia deseable incluso mayor. En otros casos, la mejora de rasgos sólo es medida cualitativamente. Se sabe que puede ser una variación natural en un rasgo. Por tanto, la mejora de rasgos

observada implica un cambio de la distribución normal del rasgo en la planta transgénica en comparación con la distribución de rasgos observada en una planta de control o una referencia, que se evalúa por procedimientos estadísticos proporcionados en el presente documento. La mejora de rasgos incluye, pero no se limita a, aumento del rendimiento, que incluye aumento del rendimiento bajo condiciones de no estrés y aumento del rendimiento bajo condiciones de estrés medioambiental. Las condiciones de estrés pueden incluir, por ejemplo, sequía, sombra, enfermedad fúngica, enfermedad vírica, enfermedad bacteriana, infestación por insectos, infestación por nematodos, exposición a temperaturas bajas, exposición al calor, estrés osmótico, disponibilidad reducida de nutrientes de nitrógeno, disponibilidad reducida de nutrientes de fósforo y alta densidad de plantas. Muchos rasgos agronómicos pueden afectar el “rendimiento” que incluyen, sin limitación, altura de la planta, número de vainas, posición de las vainas en la planta, número de entrenudos, incidencia de rotura de vainas, tamaño de grano, eficiencia de nodulación y fijación de nitrógeno, eficiencia de la asimilación de nutrientes, resistencia a estrés biótico y abiótico, asimilación de carbono, arquitectura de la planta, resistencia al encamado, porcentaje de germinación de semillas, vigor de los plantones y rasgos juveniles. Otros rasgos que pueden afectar el rendimiento incluyen eficiencia de germinación (incluyendo germinación en condiciones de estrés), velocidad de crecimiento (incluyendo velocidad de crecimiento en condiciones de estrés), número de espigas, número de semillas por espiga, tamaño de la semilla, composición de la semilla (almidón, aceite, proteína) y características del relleno de la semilla. También es de interés la generación de plantas transgénicas que demuestran propiedades fenotípicas deseables que pueden o pueden no conferir un aumento en el rendimiento de la planta global. Tales propiedades incluyen morfología de la planta mejorada, fisiología de la planta o componentes mejorados de la semilla madura recolectada de la planta transgénica.

Como se usa en el presente documento, “medioambiente limitante del rendimiento” se refiere a la condición bajo la que una planta tendría la limitación del rendimiento que incluye condiciones de estrés medioambiental.

Como se usa en el presente documento, “condición de estrés” se refiere a la condición no favorable para una planta que afecta adversamente el metabolismo, crecimiento y/o desarrollo de la planta. Una planta bajo la condición de estrés normalmente muestra velocidad de germinación reducida, crecimiento y desarrollo retardados, velocidad de fotosíntesis reducida y que conduce eventualmente a la reducción en el rendimiento. Específicamente, el “estrés por falta de agua” usado en el presente documento se refiere preferentemente a condiciones inferiores a las óptimas para el agua y humedad necesarias para el crecimiento normal de plantas naturales. El contenido relativo de agua (CRA) puede usarse como una medida fisiológica de la falta de agua de la planta. Mide el efecto del ajuste osmótico en el estado de agua de la planta cuando una planta está bajo condiciones de estrés. Las condiciones que pueden producir estrés por falta de agua incluyen estrés osmótico inducido por calor, sequía, alta salinidad y PEG.

“Estrés por frío” usado en el presente documento se refiere preferentemente a la exposición de una planta a una temperatura por debajo (dos o más grados Celsius por debajo) de la normal para una especie particular o cepa particular de planta.

Como se usa en el presente documento, “condición de crecimiento con nitrógeno suficiente” se refiere a la condición de crecimiento en la que la tierra o el medio de crecimiento contiene o recibe suficientes cantidades de nutriente de nitrógeno para sostener un crecimiento de planta sano y/o para que una planta alcance su rendimiento típico para una especie de planta particular o una cepa particular. Como se usa en el presente documento, “nutriente de nitrógeno” significa una cualquiera o cualquier mezcla de las sales de nitrato comúnmente usadas como fertilizante de nitrógeno para las plantas que incluyen, pero no se limitan a, nitrato de potasio, nitrato de calcio, nitrato de sodio, nitrato de amonio. El término amonio como se usa en el presente documento significa una cualquiera o cualquier mezcla de las sales de amonio comúnmente usadas como fertilizante de nitrógeno para las plantas, por ejemplo, nitrato de amonio, cloruro de amonio, sulfato de amonio, etc. Un experto en la materia reconocería qué constituyen tal tierra, medios y aportes de fertilizante para la mayoría de las especies de plantas. “Estrés por baja disponibilidad de nitrógeno” usado en el presente documento se refiere a una condición de crecimiento de la planta que no contiene suficiente nutriente de nitrógeno para mantener un crecimiento sano de la planta y/o para que una planta alcance su rendimiento típico bajo una condición de crecimiento con nitrógeno suficiente, y preferentemente se refiere a una condición de crecimiento con 50% o menos de los aportes de nitrógeno convencionales.

“Estrés por sombra” usado en el presente documento se refiere preferentemente a la disponibilidad limitada de luz que desencadena la respuesta de evitación de sombra en la planta. Las plantas están sometidas a estrés por sombra cuando están localizadas en la parte inferior del follaje, o en estrecha proximidad de vegetación vecina. El estrés por sombra puede agravarse cuando la densidad de plantación supera la densidad reinante promedio para una especie de planta particular. Las densidades reinantes promedio por acre de algunos otros ejemplos de plantas de cultivo en EE.UUU. en el año 2000 fueron: trigo 1.000.000-1.500.000; arroz 650.000-900.000; soja 150.000200.000, canola 260.000-350.000, girasol 17.000-23.000 y algodón 28.000-55.000 plantas por acre (Cheikh, y col., (2003), solicitud de patente de EE.UU. nº 20030101479).

Como se usa en el presente documento, el “aumento del rendimiento” de una planta transgénica de la presente invención puede evidenciarse y medirse de varias formas, que incluyen peso de prueba, número de semillas por planta, peso de la semilla, número de semillas por unidad de área (es decir, semillas, o peso de semillas, por acre), fanegas por acre, toneladas por acre, toneladas por acre, kilogramos por hectárea. Por ejemplo, el rendimiento del maíz puede medirse como la producción de granos de maíz envainado por unidad de área de producción, por

ejemplo, en fanegas por acre o toneladas métricas por hectárea, frecuentemente informadas en una base ajustada a la humedad, por ejemplo, un 15,5% de humedad. El aumento del rendimiento puede resultar de la utilización mejorada de compuestos bioquímicos clave tales como nitrógeno, fósforo e hidrato de carbono, o de respuestas mejoradas a estreses medioambientales tales como frío, calor, sequía, sal y ataque por plagas o patógenos. El ADN recombinante que mejora rasgos también puede usarse para proporcionar plantas transgénicas que tienen crecimiento y desarrollo mejorados y, por último lugar, aumento del rendimiento, como resultado de la expresión modificada de reguladores del crecimiento de las plantas o modificación del ciclo celular o rutas de fotosíntesis.

Como se usa en el presente documento, “expresión” se refiere a la transcripción de ADN para producir ARN. El ARN resultante puede ser, sin limitación, ARNm que codifica una proteína, ARN antisentido que es complementario a un ARNm que codifica una proteína, o un transcrito de ARN que comprende una combinación de regiones de genes sentido y antisentido tales como para su uso en tecnología de ARNi. La expresión como se usa en el presente documento también puede referirse a la producción de proteína codificada de ARNm.

Como se usa en el presente documento, “promotor” incluye referencia a una región de ADN en la dirección 5' del inicio de la transcripción y que participa en el reconocimiento y la unión de ARN polimerasa y otras proteínas para iniciar la transcripción. Un “promotor de planta” es un promotor que puede iniciar la transcripción en células de planta tanto si su origen es como si no una célula de planta. Promotores de plantas a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, aquellos que se obtienen de plantas, virus de plantas y bacterias que comprenden genes expresados en células de planta tales como Agrobacterium o Rhizobium. Ejemplos de promotores bajo el control del desarrollo incluyen promotores que inician preferencialmente la transcripción en ciertos tejidos tales como hojas, raíces o semillas. Tales promotores se denominan “preferidos para tejido”. Los promotores que inician la transcripción sólo en ciertos tejidos se denominan “específicos para tejido”. Un promotor específico para “tipo de célula” acciona principalmente la expresión en ciertos tipos de células en uno o más órganos, por ejemplo, células vasculares en raíces u hojas. Un promotor “inducible” o “represible” es un promotor que está bajo el control medioambiental. Ejemplos de condiciones medioambientales que pueden efectuar la transcripción por promotores inducibles incluyen condiciones anaerobias, o ciertos productos químicos o la presencia de luz. Los promotores específicos para tejido, preferidos para tejido, específicos para tipo de célula e inducibles constituyen la clase de promotores “no constitutivos”. Un promotor “constitutivo” es un promotor que es activo bajo la mayoría de las condiciones. Como se usa en el presente documento, la “orientación antisentido” incluye referencia a una secuencia de polinucleótidos que está operativamente ligada a un promotor en una orientación en la que se transcribe la hebra no codificante. La hebra no codificante es suficientemente complementaria a un producto de transcripción endógeno de forma que la traducción del producto de transcripción endógeno se inhibe frecuentemente.

Como se usa en el presente documento, “operativamente ligado” se refiere a la asociación de dos o más fragmentos de ácido nucleico en un único fragmento de ácido nucleico de manera que la función del uno está afectada por la del otro. Por ejemplo, un promotor está operativamente ligado a una secuencia codificante cuando puede afectar la expresión de esa secuencia codificante (es decir, que la secuencia codificante está bajo el control de la transcripción del promotor). Las secuencias codificantes pueden ligarse operativamente a secuencias reguladoras en orientación sentido o antisentido.

Como se usa en el presente documento, “secuencia consenso” se refiere a una secuencia de aminoácidos artificial de partes conservadas de las proteínas codificadas por genes homólogos, por ejemplo, como se ha determinado por un alineamiento CLUSTALW de secuencia de aminoácidos de proteínas homólogas.

Como se usa en el presente documento, “homólogo” se refiere a un gen relacionado con un segundo gen por ascendencia de una secuencia de ADN ancestral común. El término homólogo puede aplicarse a la relación entre genes separados por el evento de especiación (véase ortólogo) o a la relación entre genes separados por el evento de duplicación genética (véase parálogo). Los homólogos pueden ser del mismo organismo o de un organismo diferente que realiza la misma función biológica. “Ortólogos” se refieren a un conjunto de genes homólogos en diferentes especies que se desarrollaron de un gen ancestral común por especificación. Normalmente, los ortólogos retienen la misma función en el curso de la evolución; y “parálogos” se refiere a un conjunto de genes homólogos en las mismas especies que se han separado entre sí como consecuencia de duplicación genética.

El porcentaje de identidad se refiere al grado al que dos segmentos de ADN o proteína óptimamente alineados son invariantes por toda una ventana de alineamiento de componentes, por ejemplo, secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos. Una “fracción de identidad” para segmentos alineados de una secuencia de prueba y una secuencia de referencia es el número de componentes idénticos que son compartidos por secuencias de los dos segmentos alineados dividido entre el número total de componentes de secuencia en el segmento de referencia durante una ventana de alineamiento que es la más pequeña de la secuencia de prueba completa o la secuencia de referencia completa. “Porcentaje de identidad” (“% de identidad”) es las veces de la fracción de identidad. “100% de identidad con una secuencia de aminoácidos consenso” es 100 veces la fracción de identidad en una ventana de alineamiento de una secuencia de aminoácidos de una proteína de prueba óptimamente alineada con la secuencia de aminoácidos consenso de la presente invención.

Como se usa en el presente documento, “Arabidopsis” significa plantas de Arabidopsis thaliana.

Construcciones de ADN recombinante

La presente invención proporciona construcciones de ADN recombinante que comprenden uno o más polinucleótidos desvelados en el presente documento para conferir uno o más rasgos mejorados a la planta transgénica. Tales construcciones también comprenden normalmente un promotor operativamente ligado a dicho

5 polinucleótido para proporcionar la expresión en una planta diana. Otros componentes de construcción pueden incluir elementos reguladores adicionales tales como regiones sin traducir de 5' o 3' (tal como sitios de poliadenilación), regiones de intrones y péptidos de tránsito o señal. Tales construcciones de ADN recombinante pueden ensamblarse usando procedimientos conocidos para aquellos expertos en la materia.

En una realización preferida, un polinucleótido de la presente invención está operativamente ligado en una

10 construcción de ADN recombinante a un promotor funcional en una planta para proporcionar la expresión del polinucleótido en la orientación sentido de forma que se produzca un polipéptido deseado. También se proporcionan realizaciones en las que un polinucleótido está operativamente ligado a un promotor funcional en una planta para proporcionar la expresión del polinucleótido en la orientación antisentido de forma que se produzca una copia complementaria de al menos una parte de un ARNm nativo para el huésped de la planta diana.

15 Las construcciones recombinantes preparadas según la presente invención también pueden incluir generalmente una región de ADN sin traducir de 3' (UTR) que normalmente contiene una secuencia de poliadenilación tras la región codificante de polinucleótidos. Ejemplos de 3' UTR útiles incluyen aquellas del gen nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (nos), un gen que codifica la subunidad pequeña de una ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa-oxigenasa (rbcS), y el transcrito T7 de Agrobacterium tumefaciens.

20 Las construcciones y los vectores también pueden incluir un péptido de tránsito para elegir como diana un gen diana para un orgánulo de la planta, particularmente para un cloroplasto, leucoplasto u otro orgánulo plástido. Para descripciones del uso de péptidos de tránsito de cloroplastos véanse la patente de EE.UU. 5.188.642 y la patente de EE.UU. nº 5.728.925.

La Tabla 1 proporciona una lista de genes que puede proporcionar ADN recombinante que se usó en una planta

25 modelo para descubrir rasgos mejorados asociados y que puede usarse con homólogos para definir una secuencia de aminoácidos consenso para caracterizar ADN recombinante en las semillas transgénicas, plantas transgénicas, construcciones de ADN y procedimientos de la presente invención. “SEC NUC ID Nº” se refiere a una SEC ID Nºpara la secuencia de ADN particular en la lista de secuencias. “SEC PÉP Nº” se refiere a una SEC ID Nº en la lista de secuencias para la secuencia de aminoácidos de una proteína relacionada con un ADN particular,

30 “construcción_id” se refiere a un número arbitrario usado para identificar una construcción de ADN recombinante particular que comprende el ADN particular.

“Gen” se refiere a un nombre arbitrario usado para identificar el ADN particular.

“Orientación” se refiere a la orientación del ADN particular en una construcción de ADN recombinante con respecto al promotor.

35 “Especie” se refiere al organismo del que se derivó el ADN particular.

Tabla 1

SEC NUC ID: SEC PÉPID construcción_id Gen Orientación Especie

1: 240 19867 CGPG4046 Sentido Glycine max

2: 241 74518 CGPG6792 Sentido Pseudomonas fluorescens PfO-1

3: 242 15816 CGPG2244 Sentido Arabidopsis thaliana

4: 243 17918 CGPG2774 Sentido Arabidopsis thaliana

5: 244 15306 CGPG1909 Antisentido Arabidopsis thaliana

6: 245 12038 CGPG1087 Sentido Arabidopsis thaliana

7: 246 12046 CGPG1106 Sentido Arabidopsis thaliana

8: 247 13432 CGPG1525 Sentido Arabidopsis thaliana

9: 248 13711 CGPG1114 Sentido Arabidopsis thaliana

10: 249 14809 CGPG692 Sentido Arabidopsis thaliana

(continuación)

SEC NUC ID: SEC PÉP ID construcción_id Gen Orientación Especie

11: 250 14951 CGPG1636 Sentido Arabidopsis thaliana

12: 251 15632 CGPG1469 Sentido Arabidopsis thaliana

13: 252 16147 CGPG2088 Sentido Arabidopsis thaliana

14: 253 16158 CGPG2169 Sentido Arabidopsis thaliana

15: 254 16170 CGPG2192 Sentido Arabidopsis thaliana

16: 255 16171 CGPG2194 Sentido Arabidopsis thaliana

17: 256 16175 CGPG2204 Sentido Arabidopsis thaliana

18: 257 17430 CGPG2478 Sentido Arabidopsis thaliana

19: 258 17819 CGPG2587 Sentido Arabidopsis thaliana

20: 259 17921 CGPG2878 Sentido Arabidopsis thaliana

21: 260 17928 CGPG2739 Sentido Arabidopsis thaliana

22: 261 18637 CGPG3450 Sentido Arabidopsis thaliana

23: 262 18816 CGPG2406 Sentido Arabidopsis thaliana

24: 263 19227 CGPG3025 Sentido Arabidopsis thaliana

25: 264 19429 CGPG3486 Sentido Arabidopsis thaliana

26: 265 70235 CGPG96 Sentido Arabidopsis thaliana

27: 266 72634 CGPG4855 Sentido Arabidopsis thaliana

28: 267 72752 CGPG5532 Sentido Saccharomyces cerevisiae

29: 268 12007 CGPG1089 Antisentido Arabidopsis thaliana

30: 269 12290 CGPG977 Antisentido Arabidopsis thaliana

31: 270 12343 CGPG581 Antisentido Arabidopsis thaliana

32: 271 14348 CGPG1692 Antisentido Arabidopsis thaliana

33: 272 15708 CGPG2167 Antisentido Arabidopsis thaliana

34: 273 17615 CGPG2458 Antisentido Arabidopsis thaliana

35: 274 17622 CGPG2454 Antisentido Arabidopsis thaliana

36: 275 70714 CGPG1480 Antisentido Arabidopsis thaliana

37: 276 17925 CGPG2883 Sentido Arabidopsis thaliana

38: 277 18541 CGPG2971 Sentido Arabidopsis thaliana

39: 278 11425 CGPG628 Sentido Arabidopsis thaliana

40: 279 12263 CGPG799 Sentido Arabidopsis thaliana

41: 280 12288 CGPG811 Sentido Arabidopsis thaliana

42: 281 12910 CGPG985 Sentido Arabidopsis thaliana

43: 282 14335 CGPG1685 Sentido Arabidopsis thaliana

(continuación)

SEC NUC ID: SEC PÉP ID construcción_id Gen Orientación Especie

44: 283 17427 CGPG2475 Sentido Arabidopsis thaliana

45: 284 19140 CGPG1758 Sentido Arabidopsis thaliana

46: 285 19179 CGPG740 Sentido Arabidopsis thaliana

47: 286 19251 CGPG3118 Sentido Arabidopsis thaliana

48: 287 19443 CGPG2834 Sentido Arabidopsis thaliana

49: 288 19607 CGPG3397 Sentido Arabidopsis thaliana

50: 289 19915 CGPG4072 Sentido Glycine max

51: 290 70222 CGPG28 Sentido Arabidopsis thaliana

52: 291 70464 CGPG3773 Sentido Arabidopsis thaliana

53: 292 70474 CGPG3806 Sentido Arabidopsis thaliana

54: 293 70484 CGPG3853 Sentido Arabidopsis thaliana

55: 294 72474 CGPG4667 Sentido Glycine max

56: 295 13047 CGPG1324 ANTISENTIDO Arabidopsis thaliana

57: 296 13304 CGPG1282 ANTISENTIDO Arabidopsis thaliana

58: 297 13474 CGPG1600 ANTISENTIDO Arabidopsis thaliana

59: 298 19252 CGPG3121 SENTIDO Arabidopsis thaliana

60: 299 12612 CGPG1181 SENTIDO Arabidopsis thaliana

61: 300 12926 CGPG1299 SENTIDO Arabidopsis thaliana

62: 301 13230 CGPG1276 SENTIDO Arabidopsis thaliana

63: 302 14235 CGPG1665 SENTIDO Arabidopsis thaliana

64: 303 17305 CGPG2261 SENTIDO Arabidopsis thaliana

65: 304 17470 CGPG2606 SENTIDO Arabidopsis thaliana

66: 305 17718 CGPG1791 SENTIDO Arabidopsis thaliana

67: 306 17904 CGPG1912 SENTIDO Arabidopsis thaliana

68: 307 18280 CGPG3547 SENTIDO Arabidopsis thaliana

69: 308 18287 CGPG3563 SENTIDO Arabidopsis thaliana

70: 309 18501 CGPG2237 SENTIDO Arabidopsis thaliana

71: 310 18877 CGPG3097 SENTIDO Arabidopsis thaliana

72: 311 19531 CGPG3028 SENTIDO Arabidopsis thaliana

73: 312 70405 CGPG1672 SENTIDO Arabidopsis thaliana

74: 313 72136 CGPG5320 SENTIDO Glycine max

75: 314 72611 CGPG4812 SENTIDO Arabidopsis thaliana

76: 315 12627 CGPG1003 SENTIDO Arabidopsis thaliana

(continuación)

SEC NUC ID: SEC PÉP ID construcción_id Gen Orientación Especie

77: 316 12813 CGPG825 SENTIDO Arabidopsis thaliana

78: 317 14945 CGPG1776 SENTIDO Arabidopsis thaliana

79: 318 15345 CGPG1504 SENTIDO Arabidopsis thaliana

80: 319 15348 CGPG1514 SENTIDO Arabidopsis thaliana

81: 320 16325 CGPG2195 SENTIDO Arabidopsis thaliana

82: 321 16702 CGPG531 SENTIDO Arabidopsis thaliana

83: 322 16836 CGPG2283 SENTIDO Arabidopsis thaliana

84: 323 17002 CGPG1926 SENTIDO Arabidopsis thaliana

85: 324 17012 CGPG2073 SENTIDO Arabidopsis thaliana

86: 325 17017 CGPG1722 SENTIDO Arabidopsis thaliana

87: 326 17344 CGPG2404 SENTIDO Arabidopsis thaliana

88: 327 17426 CGPG2474 SENTIDO Arabidopsis thaliana

89: 328 17655 CGPG2899 SENTIDO Arabidopsis thaliana

90: 329 17656 CGPG2714 SENTIDO Arabidopsis thaliana

91: 330 17906 CGPG2145 SENTIDO Arabidopsis thaliana

92: 331 18278 CGPG3544 SENTIDO Arabidopsis thaliana

93: 332 18822 CGPG2398 SENTIDO Arabidopsis thaliana

94: 333 18881 CGPG3126 SENTIDO Arabidopsis thaliana

95: 334 192133 CGPG3622 SENTIDO Arabidopsis thaliana

96: 335 19239 CGPG3197 SENTIDO Arabidopsis thaliana

97: 336 192477 CGPG3112 SENTIDO Arabidopsis thaliana

98: 337 19460 CGPG2824 SENTIDO Arabidopsis thaliana

99: 338 19512 CGPG2898 SENTIDO Arabidopsis thaliana

100: 339 19533 CGPG3032 SENTIDO Arabidopsis thaliana

101: 340 19603 CGPG3385 SENTIDO Arabidopsis thaliana

102: 341 72126 CGPG5310 SENTIDO Glycine max

103: 342 72437 CGPG5068 SENTIDO Arabidopsis thaliana

104: 343 72441 CGPG5079 SENTIDO Arabidopsis thaliana

105: 344 72639 CGPG4861 SENTIDO Arabidopsis thaliana

106: 345 14825 CGPG1883 Antisentido Arabidopsis thaliana

107: 346 17931 CGPG2890 Sentido Arabidopsis thaliana

108: 347 18854 CGPG3524 Sentido Arabidopsis thaliana

109: 348 12237 CGPG1206 Sentido Arabidopsis thaliana

(continuación)

SEC NUC ID: SEC PÉP ID construcción_id Gen Orientación Especie

110: 349 13414 CGPG1246 Sentido Arabidopsis thaliana

111: 350 16160 CGPG2172 Sentido Arabidopsis thaliana

112: 351 16226 CGPG1980 Sentido Arabidopsis thaliana

113: 352 16803 CGPG2179 Sentido Arabidopsis thaliana

114: 353 18260 CGPG3373 Sentido Arabidopsis thaliana

115: 354 18642 CGPG3230 Sentido Arabidopsis thaliana

116: 355 18721 CGPG3618 Sentido Arabidopsis thaliana

117: 356 19254 CGPG3123 Sentido Arabidopsis thaliana

118: 357 70247 CGPG34 Sentido Arabidopsis thaliana

119: 358 70650 CGPG4337 Sentido Arabidopsis thaliana

120: 359 11787 CGPG951 ANTISENTIDO Arabidopsis thaliana

120: 359 12635 CGPG951 Sentido Arabidopsis thaliana

121: 360 13641 CGPG1211 ANTISENTIDO Arabidopsis thaliana

122: 361 14515 CGPG1115 ANTISENTIDO Arabidopsis thaliana

123: 362 14920 CGPG2027 ANTISENTIDO Arabidopsis thaliana

124: 363 15204 CGPG2000 ANTISENTIDO Arabidopsis thaliana

125: 364 15216 CGPG1906 ANTISENTIDO Arabidopsis thaliana

125: 364 19058 CGPG1906 SENTIDO Arabidopsis thaliana

126: 365 15330 CGPG1237 ANTISENTIDO Arabidopsis thaliana

127: 366 19610 CGPG3419 SENTIDO Arabidopsis thaliana

128: 367 14338 CGPG1706 SENTIDO Arabidopsis thaliana

129: 368 17809 CGPG2436 SENTIDO Arabidopsis thaliana

130: 369 72471 CGPG4648 SENTIDO Glycine max

131: 370 16403 CGPG1983 SENTIDO Arabidopsis thaliana

132: 371 17737 CGPG2623 SENTIDO Arabidopsis thaliana

133: 372 18395 CGPG2994 SENTIDO Arabidopsis thaliana

134: 373 72772 CGPG2418 SENTIDO Arabidopsis thaliana

135: 374 19441 CGPG2783 SENTIDO Arabidopsis thaliana

136: 375 11409 CGPG136 SENTIDO Arabidopsis thaliana

137: 376 10486 CGPG137 SENTIDO Arabidopsis thaliana

138: 377 12104 CGPG693 SENTIDO Arabidopsis thaliana

139: 378 12258 CGPG836 SENTIDO Arabidopsis thaliana

140: 379 12909 CGPG1195 SENTIDO Arabidopsis thaliana

(continuación)

SEC NUC ID: SEC PÉP ID construcción_id Gen Orientación Especie

141: 380 14310 CGPG1037 SENTIDO Arabidopsis thaliana

142: 381 14317 CGPG1150 SENTIDO Arabidopsis thaliana

143: 382 14709 CGPG990 SENTIDO Arabidopsis thaliana

144: 383 15123 CGPG1730 SENTIDO Arabidopsis thaliana

145: 384 16013 CGPG978 SENTIDO Arabidopsis thaliana

146: 385 16185 CGPG2025 SENTIDO Arabidopsis thaliana

147: 386 16719 CGPG1817 SENTIDO Arabidopsis thaliana

148: 387 17490 CGPG2638 SENTIDO Arabidopsis thaliana

149: 388 17905 CGPG2101 SENTIDO Arabidopsis thaliana

150: 389 18385 CGPG3609 SENTIDO Arabidopsis thaliana

151: 390 18392 CGPG2989 SENTIDO Arabidopsis thaliana

153: 392 18531 CGPG3215 SENTIDO Arabidopsis thaliana

154: 393 18603 CGPG3423 SENTIDO Arabidopsis thaliana

155: 394 19530 CGPG3026 SENTIDO Arabidopsis thaliana

156: 395 70202 CGPG3949 SENTIDO Glycine max

157: 396 72009 CGPG5273 SENTIDO Saccharomyces cerevisiae

158: 397 72119 CGPG5332 SENTIDO Glycine max

159: 398 10188 CGPG147 Antisentido Arabidopsis thaliana

160: 399 10404 CGPG25 Antisentido Arabidopsis thaliana

161: 400 11333 CGPG583 Antisentido Arabidopsis thaliana

162: 401 11719 CGPG710 Antisentido Arabidopsis thaliana

163: 402 13663 CGPG1241 Antisentido Arabidopsis thaliana

164: 403 13958 CGPG1711 Antisentido Arabidopsis thaliana

165: 404 15214 CGPG1904 Antisentido Arabidopsis thaliana

166: 405 10483 CGPG447 Sentido Arabidopsis thaliana

167: 406 11711 CGPG466 Sentido Arabidopsis thaliana

168: 407 11909 CGPG471 Sentido Arabidopsis thaliana

169: 408 12216 CGPG1091 Sentido Arabidopsis thaliana

170: 409 12236 CGPG1193 Sentido Arabidopsis thaliana

171: 410 12256 CGPG824 Sentido Arabidopsis thaliana

172: 411 12806 CGPG714 Sentido Arabidopsis thaliana

173: 412 12904 CGPG204 Sentido Arabidopsis thaliana

174: 413 13212 CGPG1384 Sentido Arabidopsis thaliana

(continuación)

SEC NUC ID: SEC PÉP ID construcción_id Gen Orientación Especie

175: 414 13232 CGPG1281 Sentido Arabidopsis thaliana

176: 415 13912 CGPG1283 Sentido Arabidopsis thaliana

177: 416 14327 CGPG1606 Sentido Arabidopsis thaliana

178: 417 14704 CGPG1066 Sentido Arabidopsis thaliana

179: 418 14714 CGPG1431 Sentido Arabidopsis thaliana

180: 419 15142 CGPG1917 Sentido Arabidopsis thaliana

181: 420 17450 CGPG2684 Sentido Arabidopsis thaliana

182: 421 18607 CGPG3496 Sentido Arabidopsis thaliana

183: 422 19409 CGPG2691 Sentido Arabidopsis thaliana

184: 423 19412 CGPG2727 Sentido Arabidopsis thaliana

185: 424 13005 CGPG724 ANTISENTIDO Arabidopsis thaliana

186: 425 10203 CGPG272 ANTISENTIDO Arabidopsis thaliana

187: 426 11327 CGPG551 ANTISENTIDO Arabidopsis thaliana

188: 427 11814 CGPG1041 ANTISENTIDO Arabidopsis thaliana

188: 427 12018 CGPG1041 SENTIDO Arabidopsis thaliana

189: 428 13003 CGPG673 ANTISENTIDO Arabidopsis thaliana

190: 429 13949 CGPG1686 ANTISENTIDO Arabidopsis thaliana

191: 430 16416 CGPG2258 ANTISENTIDO Arabidopsis thaliana

192: 431 16438 CGPG1847 ANTISENTIDO Arabidopsis thaliana

193: 432 17124 CGPG2432 ANTISENTIDO Arabidopsis thaliana

194: 433 19132 CGPG1755 ANTISENTIDO Arabidopsis thaliana

195: 434 17922 CGPG2880 SENTIDO Arabidopsis thaliana

196: 435 19719 CGPG4171 SENTIDO Glycine max

197: 436 17336 CGPG1732 SENTIDO Arabidopsis thaliana

197: 436 14274 CGPG1732 ANTISENTIDO Arabidopsis thaliana

198: 437 17735 CGPG2423 SENTIDO Arabidopsis thaliana

199: 438 19249 CGPG3115 SENTIDO Arabidopsis thaliana

200: 439 18513 CGPG3485 SENTIDO Arabidopsis thaliana

201: 440 11517 CGPG224 SENTIDO Arabidopsis thaliana

202: 441 12363 CGPG981 SENTIDO Arabidopsis thaliana

203: 442 12922 CGPG1294 SENTIDO Arabidopsis thaliana

204: 443 15360 CGPG1719 SENTIDO Arabidopsis thaliana

205: 444 16028 CGPG2047 SENTIDO Arabidopsis thaliana

(continuación)

SEC NUC ID: SEC PÉP ID construcción_id Gen Orientación Especie

206: 445 16648 CGPG2504 SENTIDO Agrobacterium tumefaciens

207: 446 16705 CGPG1005 SENTIDO Arabidopsis thaliana

208: 447 16715 CGPG2273 SENTIDO Arabidopsis thaliana

209: 448 17316 CGPG2146 SENTIDO Arabidopsis thaliana

210: 449 17331 CGPG1708 SENTIDO Arabidopsis thaliana

211: 450 17339 CGPG2461 SENTIDO Arabidopsis thaliana

212: 451 17420 CGPG2465 SENTIDO Arabidopsis thaliana

213: 452 17446 CGPG2728 SENTIDO Arabidopsis thaliana

214: 453 17487 CGPG2633 SENTIDO Arabidopsis thaliana

215: 454 17740 CGPG2605 SENTIDO Arabidopsis thaliana

216: 455 17752 CGPG2831 SENTIDO Arabidopsis thaliana

217: 456 18021 CGPG685 SENTIDO Arabidopsis thaliana

218: 457 18245 CGPG3343 SENTIDO Arabidopsis thaliana

219: 458 18617 CGPG3521 SENTIDO Arabidopsis thaliana

220: 459 18734 CGPG3198 SENTIDO Arabidopsis thaliana

221: 460 18823 CGPG2830 SENTIDO Arabidopsis thaliana

222: 461 19222 CGPG3017 SENTIDO Arabidopsis thaliana

223: 462 19430 CGPG3487 SENTIDO Arabidopsis thaliana

224: 463 12332 CGPG356 Antisentido Arabidopsis thaliana

225: 464 13649 CGPG1544 Antisentido Arabidopsis thaliana

226: 465 16113 CGPG2128 Antisentido Arabidopsis thaliana

227: 466 12069 CGPG1188 Sentido Arabidopsis thaliana

228: 467 12906 CGPG313 Sentido Arabidopsis thaliana

229: 468 13443 CGPG1233 Sentido Arabidopsis thaliana

230: 469 14707 CGPG1141 Sentido Arabidopsis thaliana

231: 470 15116 CGPG1509 Sentido Arabidopsis thaliana

232: 471 16117 CGPG2234 Sentido Arabidopsis thaliana

233: 472 16136 CGPG2144 Sentido Arabidopsis thaliana

234: 473 19077 CGPG1808 Sentido Arabidopsis thaliana

235: 474 19178 CGPG3683 Sentido Saccharomyces cerevisiae

236: 475 70752 CGPG4465 Sentido Arabidopsis thaliana

237: 476 707533 CGPG4469 Sentido Arabidopsis thaliana

238: 477 70809 CGPG388 Sentido Arabidopsis thaliana

(continuación)

SEC NUC ID: SEC PÉP ID construcción_id Gen Orientación Especie

239: 478 72091 CGPG5264 Sentido Saccharomyces cerevisiae

ADN recombinante

ADN a modo de ejemplo para su uso en la presente invención para mejorar los rasgos en plantas se proporcionan en el presente documento como SEC ID Nº: 1 a SEC ID Nº: 151 y SEC ID Nº: 153 a SEC ID Nº: 239. Un subconjunto 5 de ADN a modo de ejemplo incluye fragmentos de los polinucleótidos enteros desvelados que consisten en oligonucleótidos de al menos 15, preferentemente al menos 16 ó 17, más preferentemente al menos 18 ó 19, e incluso más preferentemente al menos 20 o más nucleótidos consecutivos. Tales oligonucleótidos son fragmentos de las moléculas más grandes que tienen una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 1 a SEC ID Nº: 151 y SEC ID Nº: 153 a SEC ID Nº: 239 y se usan, por ejemplo, como sondas y cebadores para la

10 detección de los polinucleótidos de la presente invención.

También son de interés en la presente invención variantes del ADN proporcionado en el presente documento. Tales variantes pueden producirse naturalmente, que incluyen ADN de genes homólogos de la misma especie o de una diferente, o pueden ser variantes no naturales, por ejemplo, ADN sintetizado usando procedimientos de síntesis química, o generarse usando técnicas de ADN recombinante. La degeneración del código genético proporciona la

15 posibilidad de sustituir al menos una base de la secuencia codificante de proteínas de un gen con una base diferente sin hacer que cambie la secuencia de aminoácidos del polipéptido producida a partir del gen. Por tanto, un ADN útil en la presente invención puede tener cualquier secuencia de bases que haya sido cambiada de las secuencias proporcionadas en el presente documento por sustitución según la degeneración del código genético.

Los homólogos de los genes que proporcionan ADN demostrado como útil en mejorar los rasgos en plantas modelo

20 desveladas en el presente documento generalmente demostrarán identidad significativa con el ADN proporcionado en el presente documento. El ADN es sustancialmente idéntico a un ADN de referencia si, cuando las secuencias de los polinucleótidos están óptimamente alineadas, hay aproximadamente el 60% de equivalencia de nucleótidos; más preferentemente el 70%; más preferentemente el 80% de equivalencia; más preferentemente el 85% de equivalencia; más preferentemente el 90%; más preferentemente el 95%; y/o más preferentemente el 98% o el 99%

25 de equivalencia con respecto a una ventana de comparación. Una ventana de comparación tiene preferentemente al menos 50-100 nucleótidos, y más preferentemente es la longitud entera del polinucleótido proporcionado en el presente documento. El alineamiento óptimo de secuencias para alinear una ventana de comparación puede realizarse por algoritmos; preferentemente por implementaciones computerizadas de estos algoritmos (por ejemplo, Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0-10.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI).

30 El polinucleótido de referencia puede ser una molécula de longitud completa o una parte de una molécula más larga. Preferencialmente, la ventana de comparación para determinar la identidad de polinucleótidos de secuencias codificantes de proteínas es la región codificante entera.

ADN recombinante

Proteínas útiles para conferir rasgos mejorados son proteínas enteras o al menos una porción suficiente de la

35 proteína entera para conferir la actividad biológica relevante de la proteína. El término “proteína” también incluye moléculas que consisten en una o más cadenas de polipéptidos. Por tanto, una proteína útil en la presente invención puede constituir una proteína entera que tiene la actividad biológica detectada, o puede constituir una parte de una proteína oligomérica que tiene múltiples cadenas de polipéptidos. Proteínas útiles para la generación de plantas transgénicas que tienen rasgos mejorados incluyen proteínas con una secuencia de aminoácidos proporcionada en

40 el presente documento como SEC ID Nº: 240 a SEC ID Nº: 390 y SEC ID Nº: 392 a SEC ID Nº: 478, además de homólogos de tales proteínas.

Los homólogos de las proteínas útiles en la presente invención pueden identificarse por comparación de la secuencia de aminoácidos de la proteína con secuencias de aminoácidos de proteínas de la misma fuente de planta

o de fuentes de plantas diferentes, por ejemplo, manualmente o usando algoritmos de búsqueda basados en

45 homología conocidos tales como aquellos comúnmente conocidos y denominados BLAST, FASTA y Smith-Waterman. Como se usa en el presente documento, un homólogo es una proteína del mismo organismo o de organismos diferentes que realiza la misma función biológica que el polipéptido con el que se compara. Una relación ortóloga entre dos organismos no se manifiesta necesariamente como una correspondencia uno a uno entre dos genes, debido a que un gen puede duplicarse o delecionarse después de la separación filogenética del organismo,

50 tal como especiación. Para una proteína dada puede no haber ortólogo o más de un ortóloga. Otros factores de implicación incluyen transcritos alternativamente cortados y empalmados del mismo gen, identificación de genes limitada, copias redundantes del mismo gen con diferentes longitudes de secuencia o secuencia corregida. Puede usarse un programa de alineamiento de secuencias local, por ejemplo BLAST, para buscar en una base de datos de secuencias para encontrar secuencias similares y usarse el valor de esperanza (valor de E) resumen para medir la

55 similitud de bases de la secuencia. Como un éxito de proteína con el mejor valor de E para un organismo particular puede no ser necesariamente un ortólogo o el único ortólogo, en la presente invención se usa una búsqueda de

BLAST recíproco para filtrar secuencias de éxito con valores de E significativos para identificación ortóloga. El BLAST recíproco implica la búsqueda de los éxitos significativos contra una base de datos de secuencias de aminoácidos del organismo base que son similares a la secuencia de la proteína de consulta. Un éxito es un ortólogo probable cuando el mejor éxito de BLAST recíproco es la propia proteína de consulta o una proteína codificada por un gen duplicado después de especiación. Por tanto, homólogo se usa en el presente documento para describir proteína que se asume que tiene similitud funcional por inferencia de la similitud de bases de secuencia. La relación de homólogos con secuencias de aminoácidos de SEC ID Nº: 479 a SEC ID Nº: 12463 con las proteínas con secuencias de aminoácidos de SEC ID Nº: 240 a SEC ID Nº: 478 se encuentra en la Tabla 2 adjunta.

Otro aspecto de la invención comprende proteínas homólogas funcionales que se diferencian en uno o más aminoácidos de aquellos de una proteína que mejora rasgos desvelada en el presente documento como resultado de una o más de las sustituciones de aminoácidos conservativas muy conocidas, por ejemplo, valina es un sustituto conservativo para alanina y treonina es un sustituto conservativo para serina. Las sustituciones conservativas para un aminoácido dentro de la secuencia nativa pueden seleccionarse de otros miembros de una clase a la que pertenece el aminoácido que se produce naturalmente. Aminoácidos representativos dentro de estas diversas clases incluyen, pero no se limitan a: (1) aminoácidos ácidos (negativamente cargados) tales como ácido aspártico y ácido glutámico; (2) aminoácidos básicos (positivamente cargados) tales como arginina, histidina y lisina; (3) aminoácidos polares neutros tales como glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; y (4) aminoácidos (hidrófobos) no polares neutros tales como alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los sustitutos conservados para un aminoácido dentro de una secuencia de aminoácidos nativa pueden seleccionarse de otros miembros del grupo al que pertenece el aminoácido que se produce naturalmente. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales de hidroxilo alifáticas es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Grupos de sustitución de aminoácidos naturalmente conservativos son: valina-leucina, valina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, ácido aspártico-ácido glutámico y asparagina-glutamina. Otro aspecto de la invención comprende proteínas que se diferencian en uno o más aminoácidos de aquellos de una secuencia de proteínas descrita como resultado de deleción o inserción de uno o más aminoácidos en una secuencia nativa.

Los homólogos de las proteínas que mejoran rasgos desveladas proporcionadas en el presente documento generalmente demostrarán identidad de secuencias significativa. Son de particular interés proteínas que tienen al menos el 90% de identidad de secuencias con una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 408. Por supuesto, proteínas útiles también incluyen aquellas con mayor identidad, por ejemplo, del 90% al 99% de identidad. La identidad de homólogos de proteínas se determina alineando óptimamente la secuencia de aminoácidos de un homólogo de proteína putativa con una secuencia de aminoácidos definida y calculando el porcentaje de aminoácidos idénticos y conservativamente sustituidos sobre la ventana de comparación. La ventana de comparación para determinar la identidad puede ser la secuencia de aminoácidos entera desvelada en el presente documento, por ejemplo, la secuencia completa de SEC ID Nº: 408.

Los genes que son homólogos entre sí pueden agruparse en familias e incluirse en múltiples alineamientos de secuencias. Entonces puede derivarse una secuencia consenso para cada grupo. Este análisis permite la derivación de residuos o motivos conservados y específicos para clase (familia) que son funcionalmente importantes. Estos residuos y motivos conservados pueden validarse adicionalmente con estructura de proteínas 3D, si está disponible. La secuencia consenso puede usarse para definir el alcance completo de la invención, por ejemplo, para identificar proteínas con una relación homóloga. Por tanto, la presente invención contempla que los homólogos de proteínas incluyan proteínas con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90% de identidad con tales secuencias de aminoácidos consenso.

Promotores

En la bibliografía se han descrito numerosos promotores que son activos en células vegetales. Éstos incluyen promotores presentes en genomas de la planta, además de promotores de otras fuentes, que incluyen promotor de nopalina sintasa (NOS) y promotores de octopina sintasa (OCS) llevados sobre plásmidos inductores de tumor de Agrobacterium tumefaciens, promotores de caulimovirus tales como promotores del virus del mosaico de la coliflor o del virus del mosaico de la escrofularia. Por ejemplo, véanse las patentes de EE.UU. nº 5.858.742 y 5.322.938 que desvelan versiones del promotor constitutivo derivado del virus del mosaico de la coliflor (CaMV35S), patente de EE.UU. nº 5.378.619 que desvela un promotor 35S del virus del mosaico de la escrofularia (FMV), la patente de EE.UU. 6.437.217 que desvela un promotor RS81 del maíz, la patente de EE.UU. 5.641.876 que desvela un promotor de actina de arroz, la patente de EE.UU. 6.426.446 que desvela un promotor RS324 de maíz, la patente de EE.UU. 6.429.362 que desvela un promotor PR-1 de maíz, la patente de EE.UU. 6.232.526 que desvela un promotor A3 de maíz, la patente de EE.UU. 6.177.611 que desvela promotores de maíz constitutivos, la patente de EE.UU.

6.433.252 que desvela un promotor de oleosina L3 de maíz, la patente de EE.UU. 6.429.357 que desvela un promotor e intrón de actina 2 de arroz, la patente de EE.UU. 5.837.848 que desvela un promotor específico para la

raíz, la patente de EE.UU. 6.084.089 que desvela promotores inducibles en frío, la patente de EE.UU. 6.294.714 que desvela promotores inducibles ligeros, la patente de EE.UU. 6.140.078 que desvela promotores inducibles por sales, la patente de EE.UU. 6.252.138 que desvela promotores inducibles por patógenos, la patente de EE.UU. 6.175.060 que desvela promotores inducibles por deficiencia de fósforo, la publicación de solicitud de patente de EE.UU. 2002/0192813A1 que desvela elementos de 5', 3' y de intrón útiles en el diseño de vectores de expresión de plantas eficaces, la solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 09/078.972 que desvela un promotor de coixina, la solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 09/757.089 que desvela un promotor de aldolasa de cloroplastos del maíz y la patente de EE.UU. solicitud nº de serie 10/739.565 que desvela promotores inducibles por falta de agua. Estos y numerosos otros promotores que funcionan en células vegetales son conocidos para aquellos expertos en la materia y están disponibles para su uso en polinucleótidos recombinantes de la presente invención para proporcionar la expresión de genes deseados en células vegetales transgénicas.

Además, los promotores pueden alterarse para contener múltiples “secuencias potenciadoras” para ayudar a elevar la expresión génica. Tales potenciadores se conocen en la técnica. Incluyendo una secuencia potenciadora con tales construcciones, la expresión de la proteína seleccionada puede potenciarse. Estos potenciadores se encuentran frecuentemente 5' con respecto al inicio de la transcripción en un promotor que funciona en células eucariotas, pero frecuentemente pueden insertarse en la orientación directa o inversa 5' o 3' con respecto a la secuencia codificante. En algunos casos, estos elementos potenciadores de 5' son intrones. Se consideran que son particularmente útiles como potenciadores los intrones de 5' de los genes actina I de arroz y actina 2 de arroz. Ejemplos de otros potenciadores que pueden usarse según la invención incluyen elementos del promotor 35S del CaMV, genes octopina sintasa, el gen alcohol deshidrogenasa de maíz, el gen reducido 1 de maíz y promotores de plantas no eucariotas.

En algunos aspectos de la invención se prefiere que el elemento promotor en la construcción de ADN pueda provocar expresión suficiente para producir la producción de una cantidad eficaz de un polipéptido en condiciones de falta de agua. Tales promotores pueden identificarse y aislarse de la región reguladora de genes que se expresan en exceso en condiciones de falta de agua. Promotores inducibles por falta de agua específicos para su uso en la presente invención se derivan de la región reguladora de 5' de genes identificados como un gen de la proteína de choque térmico 17.5 (HSP17.5), un gen HVA22 (HYA22), un gen Rab17 y un gen ácido cinámico 4-hidroxilasa (CA4H) (CA4H) de Zea maize. Tales promotores inducibles por falta de agua se desvelan en la solicitud de EE.UU. nº de serie 10/739.565.

En otros aspectos de la invención se desea expresión suficiente en tejidos de semilla de planta para efectuar mejoras en la composición de la semilla. Promotores a modo de ejemplo para su uso para la modificación de la composición de la semilla incluyen promotores de genes de la semilla tales como napina (patente de EE.UU. 5.420.034), oleosina L3 de maíz (patente de EE.UU. 6.433.252), zeína Z27 (Russell y col. (1997) Transgenic Res. 6(2):157-166), globulina 1 (Belanger y col. (1991) Genetics 129:863-872), glutelina 1 (Russell (1997), arriba) y antioxidante de peroxirredoxina (Per1) (Stacy y col. (1996) Plant Mol Biol. 31(6):1205-1216).

En todavía más aspectos de la invención se desea la expresión preferencial en tejidos verdes de la planta. Promotores de interés para tales usos incluyen aquellos de genes tales como SSU (Fischhoff y col. (1992) Plant Mol Biol. 20:81-93), aldolasa y piruvato ortofosfato dicinasa (PPDK) (Taniguchi y col. (2000) Plant Cell Physiol. 41(1):4248).

Expresión en exceso de genes

La “expresión en exceso de genes” usada en el presente documento en referencia a un polinucleótido o polipéptido indica que el nivel de expresión de una proteína diana, en una planta transgénica o en una célula huésped de la planta transgénica, supera niveles de expresión en una planta no transgénica. En una realización preferida de la presente invención, una construcción de ADN recombinante comprende el polinucleótido de interés en la orientación sentido con respecto al promotor para lograr la expresión en exceso de genes, que se identifica como tal en la Tabla

1.

Supresión de genes

La supresión de genes incluye cualquiera de los procedimientos muy conocidos para suprimir la transcripción de un gen o la acumulación del ARNm correspondiente a ese gen previniéndose así la traducción del transcrito en proteína. La supresión de genes postraduccional está mediada por la transcripción de ADN recombinante integrado para formar ARN bicatenario (ARNbc) que tiene homología con un gen elegido como diana para supresión. Esta formación de ARNbc resulta lo más comúnmente de la transcripción de una repetición invertida integrada del gen diana, y es una característica común del procedimiento de supresión de genes conocido como supresión antisentido, cosupresión y ARN interferente (ARNi). La supresión transcripcional puede mediarse por un ARNbc transcrito que tiene homología con una secuencia de ADN del promotor para efectuar lo que se llama supresión del promotor trans.

Más particularmente, la supresión de genes postraduccionales insertando una construcción de ADN recombinante con ADN en orientación antisentido para regular la expresión génica en células vegetales se desvela en la patente de EE.UU. 5.107.065 (Shewmaker y col.) y la patente de EE.UU. 5.759.829 (Shewmaker y col.). Plantas

transgénicas transformadas usando tales construcciones de ADN en orientación antisentido para la supresión de genes pueden comprender ADN integrado dispuesto como repeticiones invertidas que resultan de la inserción de la construcción de ADN en plantas por transformación mediada por Agrobacterium como se desvela por Redenbaugh y col. en “Safety Assessment of Genetically Engineered Flavr Savr™ Tomato”, CRC Press, Inc. (1992). Las inserciones de repeticiones invertidas pueden comprender una parte o toda la construcción de T-ADN, por ejemplo, una repetición invertida de una unidad de transcripción completa o una repetición invertida de secuencia terminadora de la transcripción. El cribado para ADN insertado que comprende elementos de repetición invertida puede mejorar la eficiencia de identificación de eventos de transformación eficaces para el silenciamiento de genes si la construcción de transformación es una construcción de ADN antisentido simple que debe insertarse en múltiples copias o una construcción de ADN de repeticiones invertidas compleja (por ejemplo, una construcción de ARNi) que puede insertarse como una única copia.

La supresión de genes postraduccional insertando una construcción de ADN recombinante con ADN en orientación sentido para regular la expresión génica en plantas se desvela en la patente de EE.UU. 5.283.184 (Jorgensen y col.) y la patente de EE.UU. 5.231.020 (Jorgensen y col.). El T-ADN insertado que proporciona la supresión de genes en plantas transformadas con tales construcciones sentido por Agrobacterium está organizado predominantemente en estructuras de repetición invertida, como se desvela por Jorgensen y col., Mol. Gen. Genet., 207:471-477 (1987). Véase también Stam y col., “The Plant Journal” 12(1), 63-82 (1997) que usaron estudios de segregación para soportar el hallazgo de Jorgensen de que el silenciamiento de genes está mediado por loci de T-ADN de transgén multimérico en los que los T-ADN están dispuestos en repeticiones invertidas. El cribado para ADN insertado que comprende elementos de repetición invertida puede mejorar la eficiencia del silenciamiento de genes cuando se transforma con construcciones de ADN en orientación sentido simples. La eficiencia del silenciamiento de genes también puede mejorarse cribando para eventos de una única inserción cuando se transforma con una construcción de ARNi que contiene elementos de repeticiones invertidas.

Como se desvela por Redenbaugh y col., la supresión de genes puede conseguirse insertando en un genoma de planta ADN recombinante que transcribe ARNbc. Un inserto de ADN tal puede transcribirse en un elemento de ARN que tiene la región 3' como un ARN bicatenario. Las construcciones de ARNi también se desvelan en el documento EP 0426195 A1 (Goldbach y col. -1991) en el que se construye ADN recombinante para la transcripción en ARNbc de horquilla para proporcionar plantas transgénicas con resistencia al virus del marchitamiento manchado del tabaco. Los ARN bicatenarios también se desvelaron en el documento WO 94/01550 (Agrawal y col.) en el que el ARN antisentido se estabilizó con un segmento 3' auto-complementario. Agrawal y col. se refirieron a la patente de EE.UU. 5.107.065 para usar tales ARN antisentido auto-estabilizados para regular la expresión génica en células vegetales; véase el documento WO 94/01550. Otros elementos formadores de horquillas bicatenarias en ARN transcrito se desvelan en el documento WO 98/05770 (Werner y col.) en el que el ARN antisentido es estabilizado por repeticiones formadoras de horquillas de nucleótidos poli(CG). Véase también la publicación de solicitud de patente de EE.UU. nº 2003/0175965 A1 (Lowe y col.) que desvela la supresión de genes una construcción de ARNi que comprende una secuencia codificante de genes precedida de las repeticiones invertidas de 5'UTR. Véase también la publicación de solicitud de patente de EE.UU. nº 2002/0048814 A1 (Oeller) en la que construcciones de ARNi se transcriben en ARN sentido o antisentido que es estabilizado por un cola de poli(T)-poli(A). Véase también la publicación de solicitud de patente de EE.UU. nº 2003/0018993 A1 (Gutterson y col.) en la que el ARN sentido o antisentido es estabilizado por una repetición invertida de la región sin traducir de 3' del gen NOS. Véase también la publicación de solicitud de patente de EE.UU. nº 2003/0036197 A1 (Glassman y col.) en la que el ARN que tiene homología con una diana es estabilizado por dos regiones de ARN complementarias.

El silenciamiento de genes también puede efectuarse transcribiendo ARN de un ADN en orientación tanto sentido como antisentido, por ejemplo, como se desvela por Shewmaker y col. en la patente de EE.UU. 5.107.065 en la que en el Ejemplo 1 un vector binario se preparó con genes aroA tanto sentido como antisentido. Véase también la patente de EE.UU. 6.326.193 en la que el ADN que elige como diana el gen está operativamente ligado a promotores opuestos.

El silenciamiento de genes también puede afectarse transcribiendo a partir de ADN sentido y antisentido contiguo. A este respecto véase Sijen y col., The Plant Cell, vol. 8, 2277-2294 (1996), que desvela el uso de construcciones que llevan repeticiones invertidas de un gen del virus del mosaico de caupí en plantas transgénicas para mediar en la resistencia al virus. Tales construcciones para supresión de genes postranscripcional en plantas por ARN bicatenario también se desvelan en el documento WO 99/53050 (Waterhouse y col.), el documento WO 99/49029 (Graham y col.), la solicitud de patente de EE.UU. nº 10/465.800 (Fillatti), la patente de EE.UU. 6.506.559 (Fire y col.). Véase también la solicitud de EE.UU. nº de serie 10/393.347 (Shewmaker y col.) que desvela construcciones y procedimientos para expresar simultáneamente uno o más genes recombinantes mientras que a la vez se suprimen simultáneamente uno o más genes nativos en una planta transgénica. Véase también la patente de EE.UU.

6.448.473 (Mitsky y col.) que desvela vectores de supresión de múltiples genes para su uso en plantas.

La supresión transcripcional tal como la supresión del promotor trans puede afectarse expresando una construcción de ADN que comprende un promotor operativamente ligado a repeticiones invertidas del ADN de promotor para un gen diana. Las construcciones útiles para tal supresión de genes mediada por la supresión del promotor trans se desvelan por Mette y col., The EMBO Journal, vol. 18, nº 1, pág. 241-148, 1999 y por Mette y col., The EMBO Journal, vol. 19, nº 19, pág. 5194-5201-148, 2000.

La supresión también puede lograrse por inserción de mutaciones creadas por elementos transposables que también pueden prevenir la función del gen. Por ejemplo, en muchas plantas dicotiledóneas, la transformación con el T-ADN de Agrobacterium puede lograrse fácilmente y pueden obtenerse rápidamente grandes números de transformantes. Por tanto, algunas especies tienen líneas con elementos transposables activos que pueden usarse eficientemente para la generación de grandes números de mutaciones de inserción, mientras que algunas otras especies carecen de tales opciones. Las plantas mutantes producidas por Agrobacterium o mutagénesis de transposón y que tienen expresión alterada de un polipéptido de interés pueden identificarse usando los polinucleótidos de la presente invención. Por ejemplo, puede cribarse una gran población de plantas mutadas con polinucleótidos que codifican el polipéptido de interés para detectar plantas mutadas que tienen una inserción en el gen que codifica el polipéptido de interés.

Apilamiento de genes

La presente invención también contempla que el ADN recombinante que mejora rasgos proporcionado en el presente documento pueda usarse en combinación con otro ADN recombinante para crear plantas con múltiples rasgos deseados. Las combinaciones generadas pueden incluir múltiples copias de una cualquiera o más de las construcciones de ADN recombinante.

Estas combinaciones apiladas pueden crearse mediante cualquier procedimiento que incluye, pero no se limita a, hibridación de plantas transgénicas, o múltiples transformaciones genéticas.

Procedimientos de transformación de plantas

En la técnica se conocen numerosos procedimientos para transformar células de planta con ADN recombinante y pueden usarse en la presente invención. Dos procedimientos comúnmente usados para la transformación de plantas son transformación mediada por Agrobacterium y bombardeo con microproyectiles. Los procedimientos de bombardeo con microproyectiles se ilustran en las patentes de EE.UU. 5.015.580 (soja); 5.550.318 (maíz);

5.538.880 (maíz); 5.914.451 (soja); 6.160.208 (maíz); 6.399.861 (maíz) y 6.153.812 (trigo) y la transformación mediada por Agrobacterium se describe en las patentes de EE.UU. 5.159.135 (algodón); 5.824.877 (soja); 5.591.616 (maíz); y 6.384.301 (soja). Para el sistema de transformación de plantas basado en Agrobacterium tumefaciens, elementos adicionales presentes en las construcciones de transformación incluirán secuencias de la frontera izquierda y derecha del T-ADN para facilitar la incorporación del polinucleótido recombinante en el genoma de la planta.

En general se prefiere introducir ADN heterólogo al azar, es decir, en una localización no específica, en el genoma de una línea de planta diana. En casos especiales puede ser útil elegir como diana la inserción de ADN heterólogo con el fin de lograr la integración específica para sitio, por ejemplo, para sustituir un gen existente en el genoma, para usar un promotor existente en el genoma de la planta o para insertar un polinucleótido recombinante en un sitio predeterminado conocido por ser activo para la expresión génica. Existen varios sistemas de recombinación específicos para sitio que son conocidos por funcionar en plantas incluyendo cre-lox como se desvela en la patente de EE.UU. 4.959.317 y FLP-FRT como se desvela en la patente de EE.UU. 5.527.695.

Los procedimientos de transformación de la presente invención se ponen preferentemente en práctica en cultivo de tejido en medios y en un entorno controlado. “Medios” se refiere a las numerosas mezclas nutritivas que se usan para cultivar células in vitro, es decir, fuera del organismo vivo intacto. Dianas de células receptoras incluyen, pero no se limitan a, células de meristemo, callo, embriones inmaduros y células gaméticas tales como microesporas, polen, esperma y óvulos. Se contempla que cualquier célula a partir de la cual pueda regenerarse una planta fértil es útil como célula receptora. El callo puede iniciarse a partir de fuentes de tejido que incluyen, pero no se limitan a, embriones inmaduros, meristemos apicales de plantones, microesporas y similares. Células que pueden proliferar como callo también son células receptoras para transformación genética. Los procedimientos de transformación y los materiales prácticos para producir plantas transgénicas de la presente invención, por ejemplo, diversos medios y células receptoras diana, transformación de embriones inmaduros y posterior regeneración de plantas transgénicas fértiles, se desvelan en las patentes de EE.UU. 6.194.636 y 6.232.526 y la solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 09/757.089.

En la práctica, el ADN se introduce en sólo un pequeño porcentaje de células diana en un experimento cualquiera. Se usan genes marcadores para proporcionar un sistema eficiente para la identificación de aquellas células que son establemente transformadas recibiendo e integrando una construcción de ADN transgénica en sus genomas. Genes marcadores preferidos proporcionan marcadores selectivos que confieren resistencia a un agente selectivo tal como un antibiótico o herbicida. Células potencialmente transformadas se exponen al agente selectivo. En la población de células supervivientes serán aquellas en las que generalmente el gen que confiere resistencia se ha integrado y expresado a niveles suficientes para permitir la supervivencia de la célula. Las células pueden probarse adicionalmente para confirmar integración estable del ADN exógeno. Genes marcadores selectivos útiles incluyen aquellos que confieren resistencia a antibióticos tales como kanamicina (nptII), higromicina B (aph IV) y gentamicina (aac3 y aacC4) o resistencia a herbicidas tales como glufosinato (bar o pat) y glifosato (EPSPS). Ejemplos de tales marcadores de selección se ilustran en las patentes de EE.UU. 5.550.318; 5.633.435; 5.780.708 y 6.118.047. También pueden emplearse marcadores cribables que proporcionan una capacidad para identificar visualmente

transformantes, por ejemplo, un gen que expresa una proteína coloreada o fluorescente tal como una luciferasa o proteína verde fluorescente (GFP) o un gen que expresa un gen beta-glucuronidasa o uidA (GUS) para el que se conocen diversos sustratos cromogénicos. También se contempla que combinaciones de marcadores cribables y de selección serán útiles para la identificación de células transformadas. Véase el documento WO 99/61129 que desvela el uso de una fusión de genes entre un gen marcador de selección y un gen marcador cribable, por ejemplo, un gen NPTII y un gen GFP.

Las células que sobreviven a la exposición al agente selectivo, o células que han sido puntuadas positivas en un ensayo de cribado, pueden cultivarse en medios de regeneración y permitir que maduren en plantas. Las plántulas en desarrollo pueden transferirse a mezcla de crecimiento de plantas sin tierra y aclimatarse, por ejemplo, en una cámara medioambientalmente controlada a aproximadamente el 85% de humedad relativa, 600 ppm de CO2 y 25250 microeinstein m-2 s-1 de luz antes de transferirse a un invernadero o cámara de crecimiento para maduración. Las plantas maduran preferentemente tanto en una cámara de crecimiento como en un invernadero. Las plantas se regeneran de aproximadamente 6 semanas a 10 meses después de identificarse un transformante, dependiendo del tejido inicial. Durante la regeneración, las células crecen dando plantas sobre medios sólidos a aproximadamente 19 a 28ºC. Después de que las plantas en regeneración hayan alcanzado el estado de desarrollo de brotes y raíces, pueden transferirse a un invernadero para el crecimiento y pruebas adicionales. Las plantas pueden polinizarse usando procedimientos de cultivo de plantas convencionales conocidos para aquellos expertos en la materia y producir semilla.

Puede recuperarse progenie de las plantas transformadas y probarse para la expresión del polinucleótido recombinante exógeno. Ensayos útiles incluyen, por ejemplo, ensayos “biológicos moleculares” tales como transferencia Southern y Northern y PCR; ensayos “bioquímicos” tales como detectar la presencia de ARN, por ejemplo, ARN bicatenario, o un producto de proteína, por ejemplo, por medios inmunológicos (ELISA y transferencias Western) o por función enzimática; ensayos de partes de la planta tales como ensayos de hojas o raíces; y por tanto, analizar el fenotipo de la planta regenerada completa.

Descubrimiento de ADN recombinante que mejora rasgos

Para identificar ADN recombinante que confiere rasgos mejorados a las plantas, Arabidopsis thaliana se transformó con una construcción de ADN recombinante candidata y se cribó para un rasgo mejorado.

La Arabidopsis thaliana se usa como modelo para genética y metabolismo en plantas. La Arabidopsis tiene un genoma pequeño y están disponibles estudios bien documentados. Es fácil de cultivar en grandes números y también están disponibles mutantes que definen mecanismos genéticamente controlados importantes, o pueden obtenerse fácilmente. Están disponibles diversos procedimientos para introducir y expresar genes homólogos aislados (véase Koncz, y col., eds. Methods in Arabidopsis Research. y col. (1992), World Scientific, New Jersey, New Jersey, en “Prefacio”).

Se empleó un procedimiento de cribado de dos etapas que comprendía dos pases de caracterización de rasgo para garantizar que la modificación del rasgo dependiera de la expresión del ADN recombinante, pero no debido a la localización cromosómica de la integración del transgén. Se establecieron doce líneas transgénicas independientes para cada construcción de ADN recombinante y se ensayaron para los niveles de expresión transgénica. Se usaron cinco líneas transgénicas con niveles transgénicos de alta expresión en el cribado de primer pase para evaluar la función del transgén en plantas transgénicas T2. Posteriormente, se evaluaron adicionalmente tres eventos transgénicos, que se había mostrado que tenían uno o más rasgos mejorados, en el cribado de segundo pase para confirmar la capacidad del transgén para conferir un rasgo mejorado. La siguiente Tabla 3 resume los rasgos mejorados que se han confirmado como se proporciona por una construcción de ADN recombinante.

En particular, la Tabla 3 informa

“SEC PÉP ID Nº” que es la secuencia de aminoácidos de la proteína relacionada con el ADN en la construcción de ADN recombinante correspondiente a una secuencia de proteínas de una SEC ID Nº. en la lista de secuencias;

“construcción_id” es un nombre arbitrario para el ADN recombinante, se describe más particularmente en la Tabla 1;

“comentario” se refiere a una descripción de la proteína diana principal obtenida de una consulta de secuencias de aminoácidos de cada SEC PÉP ID Nº en la base de datos GenBank del Centro nacional de información biotecnológica (ncbi). Más particularmente, “gi” es el nº de ID de GenBank para el principal éxito de BLAST;

“descripción” se refiere a la descripción del principal éxito de BLAST;

“valor de e” proporciona el valor de esperanza para el éxito de BLAST;

“identidad” se refiere al porcentaje de residuos de aminoácidos idénticamente apareados a lo largo de la longitud de la porción de las secuencias que es alineada por BLAST entre la secuencia de interés proporcionada en el presente documento y la secuencia éxito en GenBank;

“rasgos” identifica por un código de dos letras la mejora confirmada en una planta transgénica proporcionada por el ADN recombinante. Los códigos para rasgos mejorados son: “CK” que indica mejora de la tolerancia al frío identificada bajo un cribado de tolerancia al choque al frío; “CS” que indica mejora de la tolerancia al frío identificada por un cribado de tolerancia a la germinación con frío;

5 “SD” que indica mejora de la tolerancia a la sequía identificada por un cribado de tolerancia al estrés por sequía; “PEG” que indica mejora de la tolerancia al estrés osmótico identificada por un cribado de tolerancia al estrés osmótico inducido por PEG;

“HS” que indica mejora de la tolerancia al estrés por calor identificada por un cribado de la tolerancia al estrés por calor; 10 “SS” que indica mejora de la tolerancia al estrés por alta salinidad identificada por un cribado de la tolerancia al

estrés por sal; “LN” que indica mejora de la eficiencia del uso de nitrógeno identificada por un cribado de tolerancia a bajo nitrógeno;

“LL” que indica respuesta de evitación de la sombra atenuada identificada por un cribado de tolerancia a la sombra

15 bajo una condición de luz tenue; “PP” que indica crecimiento y desarrollo mejorados en fases tempranas identificados por un cribado de crecimiento y desarrollo temprano de la planta;

“SP” que indica crecimiento y desarrollo mejorados en estados tardíos identificados por un cribado de crecimiento y desarrollo tardío de la planta proporcionado en el presente documento.

Tabla 3

SEC PÉP ID Nº: construcción_id Comentario

valor de e: identidad gi Descripción rasgos

240: 19867 2,00E-72 47 15226242 (NM_128336) proteína hipotética [Arabidopsis thaliana] CK CS

241: 74518 0 100 17980436 bacteriofitocromo [Pseudomonas fluorescens] DS LN PEG PP CK CS

242: 15816 1,00E-101 100 18414706 (NM_120565) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] dbj]BAB08987.1 CK

243: 17918 5,00E-78 81 15232662 (AB017071) proteína similar a dedo de cinc;proteína similar a proteína Ser/Thr cinasa[Arabidopsis thaliana] SS CK

244: 15306 1,00E-121 57 15227057 (NM_126342) predicha por genefinder y genscan [Arabidopsis thaliana] CS

245: 12038 2,00E-47 100 18413298 proteína regulada por auxina [Arabidopsis thaliana] gi|3068 1325]ref]NP_849354.1 PP CS

246: 12046 CS

247: 13432 1,00E-79 53 18396732 (NM_111270) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] gb|AAF05858.1 CS

248: 13711 1,00E-33 84 15232724 proteína expresada [Arabidopsis thaliana] gi|1128068|pir T45643 proteína hipotética CS

249: 14809 1,00E-142 100 15230177 AF488576_1 (AF488576) factor de transcripciónbHLH putativo [Arabidopsis thaliana] CS

250: 14951 1,00E-146 100 4056434 (AC005990) Similar a la proteína OBP32pepgb|U37698 de Arabidopsis thaliana PP CS

251: 15632 0 89 9758356 (AB013396) factor 4 de iniciación eucariota,proteína similar a elF4 [Arabidopsis thaliana] CS

252: 16147 0 100 11890406 (AF197940) SAM:fosfoetanolamina Nmetiltransferasa [Arabidopsis thaliana] g CS

(continuación)

SEC PÉP ID Nº: construcción_id Comentario

valor de e: identidad gi Descripción rasgos

253: 16158 1,00E-68 100 18412355 (NM_106587) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] CS

254: 16170 2,00E-82 91 15224757 (NM_127488) proteína de choque térmico pequeña putativa [Arabidopsis thaliana] CS

255: 16171 4,00E-92 72 18401372 (NM_128284) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] CS

256: 16175 1,00E-157 85 15240715 (NM_126137) proteína putativa [Arabidopsis thaliana] CS

257: 17430 1,00E-155 90 13878155 (AF370340) proteína transportadora de dicarboxilato mitocóndrica putativa [Arabidopsisthaliana] CS

258: 17819 1,00E-140 95 15236507 (NM_116915) proteína hipotética [Arabidopsis thaliana] emb|CAB77971.1 SS CS

259: 17921 1,00E-110 74 18415982 (NM_118393) similar a proteína asociada a HSP [Arabidopsis thaliana] CS

260: 17928 1,00E-74 100 15231105 (NM_115730) proteína similar a coactivador de la transcripción [Arabidopsis thaliana] PP CS

261: 18637 1,00E-128 87 15233509 (NM_118226) proteína putativa [Arabidopsis thaliana] CS

262: 18816 0 94 18398254 (NM_102942) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] LL CS

263: 19227 1,00E-164 96 15219482 (NM_106009) MAP cinasa, putativa [Arabidopsis thaliana] CS

264: 19429 0 100 15237038 (NM_118860) proteína similar a GH3 [Arabidopsis thaliana] CS

265: 70235 2,00E-94 100 15234243 (NM_117229) fosfolípido hidroperóxido glutatión peroxidasa [Arabidopsis thaliana] PP CS

(continuación)

SEC PÉP ID Nº: construcción_id Comentario

valor de e: identidad gi Descripción rasgos

266: 72634 ' 4,00E-52 86 30699033 Proteína relacionada con GAST1 [Arabidopsis thaliana] CS

267: 72752 0 100 6319971 (NC_001136) proteína fosfatasa específica parafosfotirosina; Ptp1p [Saccharomyces cerevisiae] PP CS

268: 12007 1,00E-119 76 15236117 (NM_118746) proteína sin caracterizar [Arabidopsis thaliana] HS

269: 12290 5,00E-66 92 18396460 (NM_111186) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] HS

270: 12343 1,00E-111 61 18414724 (NM_120571) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] 9b|AAF61902.1|AF208051_1 (AF208051) proteína similar a proteína de choque térmico pequeña HS

271: 14348 0 100 15234254 (NM_118912) proteína putativa [Arabidopsis thaliana] pir T05878 isp4 homólogo de proteínaT29A15.220 HS

272: 15708 7,00E-71 87 18394214 (NM_101391) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] HS

273: 17615 1,00E-108 85 18414711 (NM_120567) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] CS HS

274: 17622 0 93 15238837 (NM_121852) proteína putativa [Arabidopsis thaliana] HS

275: 70714 0 94 7446439 proteína cinasa específica para serina/treoninaprobable (EC 2.7.1.-) F1715.140 - Arabidopsis thaliana emb|CAA19877.1| (AL031032) proteínasimilar a proteína cinasa [Arabidopsis thaliana] HS

276: 17925 1,00E-157 82 18405518 (NM_129646) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] pir T00747 proteína RHC1a de dedo RING-H2 HS CK

277: 18541 1,00E-128 83 15237100 (NM_119735) proteína hipotética [Arabidopsis thaliana] HS CS

(continuación)

SEC PÉP ID Nº: construcción_id Comentario

valor de e: identidad gi Descripción rasgos

278: 11425 1,00E-155 100 18405364 (AB024028) subunidad beta del proteasoma 20S; endopeptidasa multicatalítica [Arabidopsis thaliana] HS

279: 12263 9,00E-39 100 15241279 proteína relacionada con dedo de cinc pequeña [Arabidopsis thaliana]gi|12230183|sp|Q9XGY4|IM08_AR ATH Subunidad Tim8 de translocasa de la membrana interna de importación mitocóndrica HS

280: 12288 0 97 7488126 AAB01678.1| (U27590) Proteína de transporte de Fe(II) [Arabidopsis thaliana] HS

281: 12910 0 90 17065456 (AY062804) Proteína específica para A6 anther[Arabidopsis thaliana] HS

282: 14335 0 93 15229692 (NM_111953) desaturasa de ácidos grasosomega 3, precursor de cloroplastos [Arabidopsis thaliana] LL HS

283: 17427 0 100 13878127 (AF370326) 2-nitropropano dioxigenasa putativa [Arabidopsis thaliana] HS

284: 19140 0 100 15223458 (NM_104489) proteína de unión a ADN de SAR,putativa [Arabidopsis thaliana]gb|AAF02835.1|AC009894_6 (AC009894) proteína nucleolar [Arabidopsis thaliana]gblAAG40838.1|AF302492_1 (AF302492) Proteína similar a NOP56 [Arabidopsis thaliana] HS

285: 19179 7,00E-97 92 18390408 (NM_100335) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] gb|AAB80630.1| (AC002376) Fuerte similitud con proteína de membrana inducida por ABA de Triticum (gb|U80037) PP SS HS

286: 19251 0 100 21553584 (AY085451) 3-isopropilmalato deshidrogenasaputativa [Arabidopsis thaliana] HS

(continuación)

SEC PÉP ID Nº: construcción_id Comentario

valor de e: identidad gi Descripción rasgos

287: 19443 1,00E-171 100 15220490 (NM_102700) proteína de dedo de cinc, putativa[Arabidopsis thaliana]gb|AAG51745.1|[AC08667_24 (AC068667) proteína de dedo de cinc, putativa; 86473-88078 [Arabidopsis thaliana] HS

288: 19607 0 90 15239867 (NM_124313) xilosidasa [Arabidopsis thaliana] HS

289: 19915 2,00E-87 50 15229221 (NM_111278) proteína similar a NAM (no meristemo apical) [Arabidopsis thaliana] SP HS

290: 70222 0 97 15240523 (NM_124341) aminoácido permeasa 6(emb|CAA65051.1) [Arabidopsis thaliana] DS PP HS

291: 70464 1,00E-106 92 15233481 (NM_118221) proteína putativa [Arabidopsis thaliana] HS

292: 70474 1,00E-148 99 20127049 (AF488587) factor de transcripción bHLHputativo [Arabidopsis thaliana] HS

293: 70484 0 93 18418491 (NM_119632) proteína putativa [Arabidopsis thaliana] CS PP HS

294: 72474 1,00E-129 81 14150732 (AF374475) proteína de respuesta inducida hipersensible [Oryza sativa] PP HS

295: 13047 1,00E-170 86 15237573 (NM_123481) proteína similar a purina permeasa [Arabidopsis thaliana] dbj[BAB09718.1|(AB010072) proteína similar a purina permeasa[Arabidopsis thaliana] LL

296: 13304 0 92 15227905 (NM_127337) proteína 12 asociada a senescencia putativa [Arabidopsis thaliana] LL

297: 13474 0 97 2318131 (AF014824) histona desacetilasa [Arabidopsis thaliana] LL

298: 19252 3,00E-85 100 18397475 (NM_111486) proteína fosfatasa de especificidad dual putativa [Arabidopsis thaliana] PP LL SS HS CS

299: 12612 7,00E-84 67 18397426 (NM_111472) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] LL

(continuación)

SEC PÉP ID Nº: construcción_id Comentario

valor de e: identidad gi Descripción rasgos

300: 12926 2,00E-08 63 18407064 proteína expresada [Arabidopsis thaliana] gi[25408990|pir LL

301: 13230 3,00E-68 83 15233017 (NM_111160) proteína desconocida [Arabidopsis thaliana] LL

302: 14235 1,00E-142 82 18402650 (NM_103835) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] LL

303: 17305 0 100 15222179 (NM_100550) cinasa de azúcar, putativa[Arabidopsis thaliana] LL

304: 17470 1,00E-138 76 15219110 AAD17313.1| (AF123310) proteína NAM de dominio NAC [Arabidopsis thaliana] LL

305: 17718 2,00E-91 91 15228362 (NM_114694) proteína putativa [Arabidopsis thaliana] LL

306: 17904 0 97 18399578 (NM_112070) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] LL

307: 18280 0 97 18398767 AAM66940.1| (AY088617) similar a proteína inducible por sal asociada a membrana[Arabidopsis thaliana] DS LL

308: 18287 1,00E-148 100 15223439 (NM_100045) proteína de unión a polifosfoinositida, putativa [Arabidopsis thaliana] LL

309: 18501 0 94 18418838 (NM_121863) proteína putativa [Arabidopsis thaliana] gb|AAG35778.1|AF280057_1 (AF280057) tonneau 2 [Arabidopsis thaliana] LL

310: 18877 1,00E-85 100 18408502 (NM_105311) proteína relacionada con calmodulina [Arabidopsis thaliana] LL

311: 19531 0 98 15241970 (NM_125674) 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato reductoisomerasa (DXR) [Arabidopsis thaliana) LL

312: 70405 0 85 18390592 (NM_100475) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] ss LL

(continuación)

SEC PÉP ID Nº: construcción_id Comentario

valor de e: identidad gi Descripción rasgos

313: 72136 2,00E-37 66 123379 Proteína similar a HMG1/2 (proteína SB11) gi|99914|pi||S22309 proteína HMG-1 del grupode alta movilidad - soja gi|18645|emb|CAA41200.1| gen de proteína similar a HMG-1 [Glycine max] LL

314: 72611 1,00E-102 82 6721504 (AP001072) proteína hipotética [Oryza sativa(grupo de cultivar japonica)] LL

315: 12627 0 100 15236663 (NM_118524) proteína similar a UDPglucosa 4epimerasa [Arabidopsis thaliana] LN

316: 12813 0 96 2454184 (U80186) subunidad beta de piruvato deshidrogenasa E1 [Arabidopsis thaliana] LN

317: 14945 1,00E-122 92 18400517 (NM_112338) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] dbj|BAB02642.1| (AP002061) Proteínasimilar a MtN3 LN

318: 15345 0 97 15237392 (NM_123987) ornitina aminotransferasa [Arabidopsis thaliana] LN

319: 15348 0 81 18414239 (NM_117530) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] LN

320: 16325 1,00E-105 100 15225174 (NM_128763) alanina acetil transferasa putativa[Arabidopsis thaliana] gb|AAD15401.1 LN

321: 16702 0 77 18408943 (NM_105480) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] sp|Q9M647|IAR1_ARATH proteína 1 de resistencia a IAA-alanina LN

322: 16836 0 100 11692854 AF327534_1 (AF327534) adenosin trifosfatasaputativa [Arabidopsis thaliana] LN

323: 17002 1,00E-138 56 18414140 (NM_117486) Proteína expresada [Arabidopsis thaliana] gb|AAK68800.1| (AY042860) Proteínadesconocida [Arabidopsis thaliana] LN

324: 17012 3,00E-79 100 18398187 (NM_127222) factor 5 despolimerizante de actina [Arabidopsis thaliana] LN

(continuación)

SEC PÉP ID Nº: construcción_id Comentario

valor de e: identidad gi Descripción rasgos

325: 17017 1,00E-155 86 11358585 Arabidopsis thaliana similar a la proteína de membrana de la envoltura nuclear LN

326: 17344 3,00E-49 100 18424201 Familia SKP1 [Arabidopsis thaliana]gi|9759236|dbj|BABO9760.1| contiene similitudcon el id del gen elongina C: MNC17.5 [Arabidopsis thaliana]gi|15028385|gb|AAK76669.1| proteína elongina putativa] PP LN

327: 17426 0 95 15238801 (NM_124151) precursor de farnesil difosfato sintasa (gb|AAB49290.1) [Arabidopsis thaliana] LN

328: 17655 1,00E-129 86 15227472 (NM_129758) proteína de dedo de cinc tipo C2H2 putativa [Arabidopsis thaliana] LN

329: 17656 1,00E-135 74 15233081 (NM_115995) proteína de unión a ADN putativa[Arabidopsis thaliana] LN

330: 17906 1,00E-129 100 18378887 (NM_100065) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] PP LN

331: 18278 0 95 15220147 (NM_103617) Ciclina, putativa [Arabidopsis thaliana] LN

332: 18822 0 92 15232759 (NM_111813) proteína cinasa putativa [Arabidopsis thaliana] LN

333: 18881 0 100 18401029 (NM_112485) L-asparaginasa putativa [Arabidopsis thaliana] LN

334: 19213 2,00E-70 91 18408726 (NM_105394) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] LN

335: 19239 1,00E-59 100 15235876 [Arabidopsis thaliana] relacionada con la subunidad de ARN polimerasa dirigida contra ADN gi|25313101|pir||A85078 LN

336: 19247 1,00E-81 53 9711883 (AP002524) proteína hipotética-similar alcromosoma 3L de Drosophila melanogaster, CG10171 producto génico [Oryza sativa (grupo de cultivar de japonica)] LN

(continuación)

SEC PÉP ID Nº: construcción_id Comentario

valor de e: identidad gi Descripción rasgos

337: 19460 1,00E-146 80 15238816 (NM_121850) [Arabidopsis thaliana] similar a la proteína de unión a ADN de dominio AP2 LN

338: 19512 0 85 15237502 (NM_124046) [Arabidopsis thaliana] similar a laproteína bHLH LN

339: 19533 0 99 18395911 (NM_102409) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] LN

340: 19603 0 87 18403383 (NM_113143) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] dbj|BAB01784.1|(AB022215) glucoproteína rica en hidroxiprolina [Arabidopsis thaliana] LN

341: 72126 5,00E-78 53 12005328 (AF239956) desconocida [Hevea brasiliensis] LN

342: 72437 8,00E-89 92 11994756 (AP001313) [Arabidopsis thaliana] similar a laproteína kinetochore (similar a Skp1p) LN

343: 72441 5,00E-95 84 15218602 (NM_100157) proteína L19 ribosómica, putativa[Arabidopsis thaliana] LN

344: 72639 2,00E-73 91 18403896 (NM_104101) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] LN

345: 14825 0 93 15242814 (NM_120445) proteína similar a proteína cinasa[Arabidopsis thaliana] PEG

346: 17931 1,00E-136 68 15242003 (NM_125688) [Arabidopsis thaliana] similar a proteína de dedo de cinc Dof PEG CS

347: 18854 1,00E-164 79 18423918 (NM_125077) proteína de ensamblaje de nucleosomas [Arabidopsis thaliana] PEG HS

348: 12237 1,00E-21 76 18398176 proteína expresada [Arabidopsis thaliana]gi|12322743|gb|AAG51367.1 |ACO 12562_28 PEG

349: 13414 2,00E-69 92 12324443 (AC012329) proteína desconocida; 50647-51606 [Arabidopsis thaliana] PEG

350: 16160 1,00E-176 87 18415888 (NM_118352) proteína putativa [Arabidopsis thaliana] PEG

(continuación)

SEC PÉP ID Nº: construcción_id Comentario

valor de e: identidad gi Descripción rasgos

351: 16226 1,00E-138 96 9294682 (AP001305) contiene similitud con el gen_id:MHC9.3 mediador en la regulación de la transcripción de ARN polimerasa [Arabidopsis thaliana] HS PE G

352: 16803 1,00E-146 90 18394201 (NM_101382) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] gb|AAD39643.1|AC007591_8 (AC007591) Contiene un dominio de unión a PF|00175 oxidoreductasa FAD/NADH. PEG

353: 18260 0 100 15219795 (NM_100349) canal de K+ putativo, subunidad beta [Arabidopsis thaliana] PEG

354: 18642 2,00E-68 71 15235819 (NM_118411) proteína predicha [Arabidopsis thaliana] PP PEG

355: 18721 3,00E-21 53 18408611 proteína rica en glicina [Arabidopsis thaliana]gi|12597766|gb|AAG60079.1|AC0 13288_13 PEG

356: 19254 0 96 18398480 (NM_111769) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] PEG

357: 70247 0 95 15238559 (NM_122954) precursor de glutamato-amoniacoligasa (EC 6.3.1.2), cloroplasto (done IambdaAtgsI1) (pir||S18600) [Arabidopsis thaliana] CS DS HS PP PEG

358: 70650 1,00E-83 57 18399283 (NM_127582) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] PP PEG

359: 12635 0 97 15231953 (NM_111700) hipocotilo no fototrópico putativo [Arabidopsis thaliana] HS

359: 11787 0 97 15231953 (NM_111700) hipocotilo no fototrópico putativo[Arabidopsis thaliana] PP

360: 13641 1,00E-42 87 15218189 [Arabidopsis thaliana] relacionada con la cadena ligera de dineína gi|25405535|pir|E96562 PP

(continuación)

SEC PÉP ID Nº: construcción_id Comentario

valor de e: identidad gi Descripción rasgos

361: 14515 0 71 15128395 (AP003255) contiene EST AU100655(C11462), C26007(C114 62) similar al cromosoma 3 deArabidopsis thaliana, F24B22,150-proteína desconocida [Oryza sativa (grupo de cultivar de japonica)] PP

362: 14920 0 100 4239819 (AB010875) PHR1 [Arabidopsis thaliana] PP

363: 15204 0 96 15230379 (NM_112829) tirosina fosfatasa putativa [Arabidopsis thaliana] PP

364: 19058 0 96 18396298 (NM_102496) proteína expresada (Arabidopsisthaliana] LN

364: 15216 0 96 18396298 (NM_102496) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] PP

365: 15330 5,00E-68 59 18400296 (NM_112272) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] PP

366: 19610 0 100 18409509 (NM_115079) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] PP CS

367: 14338 0 100 15222967 (NM_103926) esterol delta7 reductasa[Arabidopsis thaliana] sp PP HS CS

368: 17809 0 100 15242240 (NM_124576) proteína similar a sorbitol deshidrogenasa [Arabidopsis thaliana] PP HS

369: 72471 3,00E-83 52 18395821 (NM_111011) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] DS PP HS

370: 16403 1,00E-176 73 15237042 (NM_117178) proteína similar a 98b [Arabidopsis thaliana] p PP LL LN

371: 17737 0 86 15240924 (NM_122624) [Arabidopsis thaliana] similar a proteína de dedo de cinc RING-H2 PP LN

372: 18395 0 84 18401775 (NM_128415) factor de transcripción del dominio AP2 putativo [Arabidopsis thaliana] SS PP LN

(continuación)

SEC PÉP ID Nº: construcción_id Comentario

valor de e: identidad gi Descripción rasgos

373: 72772 0 100 15226228 (NM_128328) citocromo P450 putativo[Arabidopsis thaliana] HS SP PP LN

374: 19441 0 85 9294477 (AB018114) [Arabidopsis thaliana] similar a proteína de dedo RING PP PEG

375: 10486 1,00E-99 100 15237535 (NM_120465) Flor 1 terminal (TFL1) [Arabidopsis thaliana] PP

376: 11409 1,00E-133 100 68888 proteína GL1 de diferenciación de Trichoma -Arabidopsis thaliana CS LN ss PP

377: 12104 1,00E-132 92 15230178 AF488577_1 (AF488577) factor de transcripciónbHLH putativo [Arabidopsis thaliana] PP

378: 12258 1,00E-22 59 21554390 arabinogalactano-proteína [Arabidopsis thaliana] PP

379: 12909 0 100 18398696 (NM_111831) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] PP

380: 14310 0 96 15226784 (NM_129655) proteína desconocida [Arabidopsis thaliana] PP

381: 14317 0 100 18395560 (NM_126399) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] PP

382: 14709 0 91 15219676 (NM_100303) beta-cetoacil-CoA sintasa putativa [Arabidopsis thaliana] pirllT00951 3-oxoacil-[acilproteína transportadora]sintasa probable (EC2.3.1.41) F20D22.1 PP

383: 15123 0 97 15238451 (NM_120596) proteína putativa [Arabidopsis thaliana] PP

384: 16013 4,00E-91 85 15241799 (NM_125629) [Arabidopsis thaliana] similar a proteína relacionada con la maduración PP

385: 16185 0 95 18420375 (NM_120069) cisteína proteinasa RD19A [Arabidopsis thaliana] PP

386: 16719 0 100 18401703 (NM_103632) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] PP

(continuación)

SEC PÉP ID Nº: construcción_id Comentario

valor de e: identidad gi Descripción rasgos

387: 17490 8,00E-93 92 18405248 (NM_104392) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] PP

388: 17905 8,00E-75 69 18404002 (NM_113306) proteína de dedo de PHD, putativa[Arabidopsis thaliana] PP

389: 18385 1,00E-117 100 15223626 (NM_104559) proteína de la membrana integral, putativa [Arabidopsis thaliana] PP

390: 18392 0 95 15227193 (NM_127194) factor de transcripción de homeodominio putativo [Arabidopsis thaliana] SS PP

392: 18531 1,00E-142 100 15242792 (NM_125746) proteína putativa [Arabidopsis thaliana] PP

393: 18603 0 94 18415840 (NM_118332) proteína similar a alcohol deshidrogenasa [Arabidopsis thaliana] PP

394: 19530 0 96 15242217 (NM_122138) proteína similar a Ruv ADNhelicasa [Arabidopsis thaliana] PP

395: 70202 0 61 15241293 (NM_121408) proteína putativa [Arabidopsis thaliana] HS PP

396: 72009 0 91 6319543 (NC_001134) Proteína de transporte de aminoácidos para valina, leucina, isoleucina ytirosina; Tat1p [Saccharomyces cerevisiae] PP

397: 72119 3,00E-70 57 126078 PROTEÍNA D-34 ABUNDANTE DURANTE LA EMBRIOGÉNESIS TARDÍA (LEA D-34) PP

398: 10188 0 92 15228011 (NM_129846) citocromo P450 putativo[Arabidopsis thaliana] DS

399: 10404 1,00E-151 94 99713 Proteína homeolítica Agamous -Arabidopsis thaliana DS

400: 11333 1,00E-145 100 7207994 (AF083220) antígeno nuclear celular proliferante [Arabidopsis thaliana] DS

401: 11719 0 87 15240257 (NM_126126) Proteína similar a ciclina D3[Arabidopsis thaliana] DS

(continuación)

SEC PÉP ID Nº: construcción_id Comentario

valor de e: identidad gi Descripción rasgos

402: 13663 1,00E-152 94 15227497 (NM_129769) proteína desconocida [Arabidopsis thaliana] DS

403: 13958 0 96 15222885 (NM_101226) aminoalcoholfosfotransferasa[Arabidopsis thaliana] SP DS

404: 15214 0 92 15223772 (NM_106341) Proteína de la familia Tub, putativa[Arabidopsis thaliana] DS

405: 10483 2,00E-86 100 15223944 (NM_100757) superoxidasa dismutasa[Arabidopsis thaliana] SP DS

406: 11711 0 100 15234217 (NM_119505) 2-deshidro-3-desoxifosfoheptonatoaldolasa [Arabidopsis thaliana] DS

407: 11909 1,00E-126 88 99735 Precursor de L-ascorbato peroxidasa (EC 1.11.1.11) -Arabidopsis thaliana (fragmento) DS

408: 12216 0 100 15236949 ' (NM_118837) proteína putativa [Arabidopsis thaliana] DS

409: 12236 2,00E-55 100 15231278 [Arabidopsis thaliana] relacionada con proteína específica del polen DS

410: 12256 0 100 2317731 (AF013628) polipéptido-2 reversiblemente glucosilado [Arabidopsis thaliana] DS

411: 12806 1,00E-157 86 15235640 (NM_119926) proteína putativa [Arabidopsis thaliana] DS

412: 12904 0 96 15239631 BAA97512.1| (AB026634) Proteína similar a la proteína de 3'(2'),5'-bisfosfato nucleotidasa[Arabidopsis thaliana] SP DS

413: 13212 4,00E-74 93 15236917 (AL161566) proteína putativa [Arabidopsis thaliana] DS

414: 13232 5,00E-30 60 15223263 proteína expresada [Arabidopsis thaliana] gi|7485996|pir|T00711 DS

415: 13912 9,00E-68 100 18406846 064644|SP18_ARATH Polipéptido asociado a Sin3 probable [Arabidopsis thaliana] DS

(continuación)

SEC PÉP ID Nº: construcción_id Comentario

valor de e: identidad gi Descripción rasgos

416: 14327 0 92 15221444 (NM_102795) proteína de unión a GTP putativa[Arabidopsis thaliana] DS

417: 14704 3,00E-71 46 17228240 (NC_003272) proteína hipotética [Nostoc sp. PCC 7120] DS

418: 14714 0 94 15219541 (NM_106032) 3 similar a insensible a etileno(EIL3) [Arabidopsis thaliana] DS

419: 15142 0 74 15235217 (NM_118107) proteína putativa [Arabidopsis thaliana] SP DS

420: 17450 1,00E-169 100 15232066 AAF26152.1|AC008261_9 (AC008261) proteínade caja homeótica-cremallera de leucina putativa, HAT7 [Arabidopsis thaliana] DS

421: 18607 1,00E-151 94 15221373 (NM_105503) factor de transcripción putativo[Arabidopsis thaliana] DS

422: 19409 0 73 15241667 (NM_120281) proteína de homeodominio putativo [Arabidopsis thaliana] DS

423: 19412 0 96 15228826 (NM_116132) proteína putativa [Arabidopsis thaliana] DS

424: 13005 0 99 15239405 (NM_122447) ciclina 3a [Arabidopsis thaliana] gb|AAC98445.1| (AC006258) ciclina 3a [Arabidopsis thaliana] SP SS PEG

425: 10203 0 81 18405485 (NM_104444) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] SP

426: 11327 0 92 12643807 Subunidad alfa de la proteína farnesiltransferasa(subunidad alfa de CAAX farnesiltransferasa)(proteínas RAS preniltransferasa alfa) (FTasaalfa)[Arabidopsis thaliana] SP

427: 12018 1,00E-175 96 18404664 (NM_129374) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] LL

427: 11814 1,00E-175 96 18404664 (NM_129374) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] SP

(continuación)

SEC PÉP ID Nº: construcción_id Comentario

valor de e: identidad gi Descripción rasgos

428: 13003 1,00E-169 85 18394319 (NM_101474) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] SP

429: 13949 1,00E-160 85 18399097 (NM_103124) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] SP

430: 16416 1,00E-161 94 15236283 (NM_116570) componente de importación de la proteína de cloroplastos putativa [Arabidopsis thaliana] SP

431: 16438 1,00E-167 78 18403775 (AC004667) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] gb|AAM62820.1| (AY085599) similar a la proteína Glo3 de dedo de cinc [Arabidopsis thaliana] SP

432: 17124 0 100 15221491 (NM_104934) similar a monooxigenasa que contiene flavina (sp|P36366); similar a ESTgb|R30018, gb|H36886, gb|N37822 y gb|T88100 [Arabidopsis thaliana] SP

433: 19132 0 92 18396094 (NM_111084) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] SP

434: 17922 1,00E-134 83 7485939 AAC13593.1| (AF058914) contiene similitud con la reparación del daño de ADN de Arabidopsis thaliana/proteína DRT111 de resistencia a tolerancia (SW:P42698) LL SP CS

435: 19719 1,00E-141 72 6692816 (AB036735) alcohol alílico deshidrogenasa [Nicotiana tabacum] PEG SP HS

436: 14274 8,00E-90 100 18407428 (NM_130339) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] SP

436: 17336 8,00E-90 100 18407428 (NM_130339) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] SP LL

437: 17735 1,00E-108 91 18404601 (NM_129353) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] SP LL

438: 19249 5,00E-43 100 21553354 proteína 7 de unión a ARN rico en glicina [Arabidopsis thaliana] PP SP LN

(continuación)

SEC PÉP ID Nº: construcción_id Comentario

valor de e: identidad gi Descripción rasgos

439: 18513 0 96 15226492 (NM_130274) proteína putativa cinasa [Arabidopsis thaliana] pir||IT02181 homólogo F14M4.11 de proteína cinasa SP PP SS

440: 11517 1,00E-153 85 18412044 (NM_106509) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] SP

441: 12363 0 100 15242458 (NM_123934) proteína similar a lipasa/hidrolasa con motivos GDSL [Arabidopsis thaliana] SP

442: 12922 7,00E-81 100 18403216 (NM_128881) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] SP

443: 15360 1,00E-152 89 18398108 (NM_111674) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] SP

444: 16028 0 100 15232435 (NM_115274) proteína similar al transporte de péptidos [Arabidopsis thaliana] SP

445: 16648 1,00E-134 100 15891409 NP_534027.1] (NC_003305) 3-oxoacil-(acilproteína transportadora)reductasa [cepa deAgrobacterium tumefaciens C58 (U. Washington)] SP

446: 16705 0 95 15236458 (NM_116899) proteína similar a nodulina[Arabidopsis thaliana] SP

447: 16715 0 96 15238198 (NM_120537) proteína putativa (Arabidopsis thaliana) SP

448: 17316 1,00E-124 95 18378907 (NM_100079) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] SP

449: 17331 0 85 15220100 (NM_106680) transportador de sulfato putativo[Arabidopsis thaliana] SP

450: 17339 2,00E-79 100 15228208 (NM_114633) proteína putativa [Arabidopsis thaliana] SP

451: 17420 1,00E-124 94 15229782 (NM_114248) proteína similar a glutatión transferasa [Arabidopsis thaliana] SP

(continuación)

SEC PÉP ID Nº: construcción_id Comentario

valor de e: identidad gi Descripción rasgos

452: 17446 1,00E-144 88 15230344 (NM_115620) proteína similar a factor de transcripción AP2 [Arabidopsis thaliana] SP

453: 17487 1,00E-71 78 15218649 (NM_102603) factor de unión a elementos sensibles a etileno, putativo [Arabidopsis thaliana] SP

454: 17740 0 97 15232593 (NM_114527) proteína similar a espantapájaros[Arabidopsis thaliana] SP

455: 17752 1,00E-176 94 9755372 (AC000107) F17F8.3 [Arabidopsis thaliana] SP

456: 18021 0 96 7262677 (AC012188) Contiene similitud con proteína B relacionada con MYB de Gallus gallus g [Arabidopsis thaliana] SP

457: 18245 1,00E-168 86 15239503 (NM_122484) Similar a factor de transcripción GATA [Arabidopsis thaliana] SP

458: 18617 3,00E-69 94 18424873 (NM_125879) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] SP

459: 18734 0 96 15237253 (NM_121609) Similar a proteína de resistencia a UVB [Arabidopsis thaliana] SP

460: 18823 0 82 15222227 AAM62510.11 (AY085278) proteína BELL1.1 de homeodominio, putativa [Arabidopsis thaliana] SP

461: 19222 0 100 18390636 (NM_100509) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] PP SP

462: 19430 0 95 18405149 (NM_129533) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] SP

463: 12332 1,00E-113 84 15221408 (NM_106142) activador de la transcripción relacionado con myb, putativo [Arabidopsis thaliana] SS

464: 13649 1,00E-127 92 11281134 proteína hipotética F9G14.50 -Arabidopsis thaliana SS

(continuación)

SEC PÉP ID Nº: construcción_id Comentario

valor de e: identidad gi Descripción rasgos

465: 16113 0 97 15217485 AAD18098.1| (AC006416) Idéntica al gengb[Y10557 g5bf de proteína de unión a ARN putativo de Arabidopsis thaliana [Arabidopsis thaliana] SS

466: 12069 1,00E-63 100 18410081 (NM_105902) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] SS

467: 12906 0 98 5915825 Citocromo P450 71B2 dbj|BAA28537.1|(D78605) citocromo P450 monooxigenasa [Arabidopsis thaliana] SS

468: 13443 1,00E-111 100 18409105 (NM_114908) proteína expresada [Arabidopsis thaliana] SS

469: 14707 0 96 13122288 (AB047808) Proteína similar a proteasa l (pfpl)[Arabidopsis thaliana] SS

470: 15116 1,00E-167 100 15242465 (NM_121002) Proteína similar a pirofosfatasainorgánica [Arabidopsis thaliana] SS

471: 16117 1,00E-90 78 15227349 (NM_129704) Proteína similar a calmodulina[Arabidopsis thaliana] SS

472: 16136 1,00E-115 92 15222919 (NM_101236) proteína desconocida [Arabidopsis thaliana] ss

473: 19077 8,00E-98 70 15221874 (NM_101737) proteína hipotética [Arabidopsis thaliana] HS PP SS

474: 19178 0 95 6321456 (NC_001139) gamma-aminobutirato (GABA) transaminasa (4-aminobutirato aminotransferasa); Uga1p [Saccharomyces cerevisiae] CK HS PE G PP SS

475: 70752 4,00E-46 100 15224299 [Arabidopsis thaliana] relacionada con inhibidorde tripsina gi|3287862|sp|O22867|ITI5_ARAT H SS

476: 70753 4,00E-86 100 15231204 (NM_112176) Proteína ADNJ, putativa[Arabidopsis thaliana] SS

(continuación)

SEC PÉP ID Nº: construcción_id Comentario

valor de e: identidad gi Descripción rasgos

477: 70809 6,00E-70 48 20503004 (AC098693) Proteína hipotética [Oryza sativa(grupo de cultivar de japonica)] LL PP ss

478: 72091 1,00E-177 94 6322655 (NC_001143) Interactúa con y puede ser un regulador positivo de GLC7 que codifica proteína fosfatasa de tipo1; Sds22p [Saccharomyces cerevisiae] LL LN SS

Cribados de mejora de rasgos

SD - Mejora de la tolerancia a la sequía identificada por cribado de tolerancia al estrés por sequía de la tierra:la sequía o las condiciones de falta de agua imponen principalmente estrés osmótico en plantas. Las plantas son particularmente vulnerables a la sequía durante el estado de floración. La condición de sequía en el procedimiento de cribado desvelado en el Ejemplo 1B empezó en el momento de la floración y se mantuvo hasta el final de la cosecha. La presente invención proporciona ADN recombinante que puede mejorar la tasa de supervivencia de la planta bajo tal condición de sequía sostenida. ARN recombinante a modo de ejemplo para conferir tal tolerancia a la sequía se identifica como tal en la Tabla 3. Tal ARN recombinante puede encontrar uso particular en generar plantas transgénicas que son tolerantes a la condición de sequía impuesta durante el momento de la floración y en otros estados del ciclo vital de la planta. Como se demuestra a partir del cribado de la planta modelo, en algunas realizaciones de plantas transgénicas con ADN recombinante que mejora rasgos cultivadas bajo tal condición de sequía sostenida, también puede aumentarse el peso de semilla total por planta, además de aumentar la tasa de supervivencia dentro de una población transgénica, proporcionando un mayor potencial de rendimiento con respecto a plantas de control.

PEG - Mejora de la tolerancia a la sequía identificada por cribado de tolerancia al estrés osmótico inducido por PEG: Diversos niveles de sequía pueden inducirse artificialmente usando diversas concentraciones de polietilenglicol (PEG) para producir diferentes potenciales osmóticos (Pilon-Smits y col. (1995) Plant Physiol. 107:125-130). Se ha informado que varias características fisiológicas son indicaciones fidedignas para la selección de plantas que poseen tolerancia a la sequía. Estas características incluyen la tasa de germinación de semillas y crecimiento de plantones. Los rasgos pueden ensayarse relativamente fácilmente midiendo la tasa de crecimiento de plantones en disolución de PEG. Por tanto, un cribado de la tolerancia al estrés osmótico inducido por PEG es un sustituto útil para el cribado de tolerancia a la sequía. Como se demuestra a partir del cribado de la planta modelo, realizaciones de plantas transgénicas con ADN recombinante que mejoran rasgos identificadas en un cribado de tolerancia al estrés osmótico inducido por PEG pueden sobrevivir mejor a las condiciones de sequía proporcionando un mayor potencial de rendimiento con respecto a plantas de control.

SS - Mejora de la tolerancia a la sequía identificada por cribado de tolerancia al estrés por alta salinidad: Tres factores diferentes son responsables de las lesiones por sal: (1) efectos osmóticos, (2) alteraciones en el proceso de mineralización, (3) efectos tóxicos producidos por los iones salinos, por ejemplo, inactivación de enzimas. Aunque el primer factor de estrés por sales produce el marchitamiento de las plantas, que es similar al efecto de la sequía, el aspecto iónico del estrés por sales es claramente distinto de la sequía. La presente invención proporciona genes que ayudan a las plantas a mantener la biomasa, crecimiento de las raíces y/o desarrollo de la planta en condiciones de alta salinidad que se identifican como tales en la Tabla 3. Como el efecto osmótico es uno de los componentes principales del estrés por sales, que es común al estrés por sequía, el ADN recombinante que mejora rasgos identificado en un cribado de tolerancia al estrés por alta salinidad puede proporcionar cultivos transgénicos con tolerancia a la sequía mejorada.

HS - Mejora de la tolerancia a la sequía identificada por cribado de tolerancia al estrés por calor: El estrés por calor y por sequía frecuentemente se producen simultáneamente, limitando el crecimiento de la planta. El estrés por calor puede producir la reducción en la velocidad de la fotosíntesis, inhibición del crecimiento de hojas y potencial osmótico en plantas. Por tanto, los genes identificados por la presente invención como genes que confieren tolerancia al estrés por calor también pueden conferir tolerancia a la sequía mejorada a las plantas.

CK y CS - Mejora de la tolerancia al estrés por frío: La baja temperatura puede producir inmediatamente limitaciones mecánicas, cambios en actividades de macromoléculas y potencial osmótico reducido. En la presente invención se establecieron dos condiciones de cribado, es decir, cribado de tolerancia al choque al frío (CK) y cribado de tolerancia a la germinación con frío (CS), para buscar plantas transgénicas que mostraran ventaja de crecimiento visual a menor temperatura. En el cribado de tolerancia a la germinación con frío, plantas de Arabidopsis transgénicas se expusieron a una temperatura constante de 8ºC desde la siembra hasta el día 28 después de la siembra. Los nucleótidos recombinantes identificados por tal cribado como genes que confieren tolerancia al estrés por frío son particularmente útiles para la producción de planta transgénica que puede germinar más fuertemente en una temperatura fría con respecto a las plantas naturales. En el cribado de tolerancia al choque al frío, las plantas transgénicas se cultivaron primero bajo la temperatura de crecimiento normal de 22ºC hasta el día 8 después de la siembra, y posteriormente se colocaron bajo 8ºC hasta el día 28 después de la siembra. En algunas realizaciones preferidas, las plantas transgénicas transformadas con las construcciones de ADN recombinante que comprenden SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 2 muestran crecimiento más fuerte en ambos cribados de tolerancia al frío.

Mejora de la tolerancia a múltiples estreses: Diferentes tipos de estreses conducen frecuentemente a reacción idéntica o similar en las plantas. Los genes que se activan o inactivan como una reacción al estrés pueden tanto actuar directamente de forma que el producto genético reduzca un estrés específico como pueden actuar indirectamente activando otros genes de estrés específicos. Manipulando la actividad de tales genes reguladores, es decir, genes de tolerancia a múltiples estreses, puede permitirse que la planta reaccione con diferentes tipos de estreses. Por ejemplos, pueden usarse SEC ID Nº: 37, SEC ID Nº: 38 y SEC ID Nº: 128 para mejorar tanto la tolerancia al estrés por calor como la tolerancia al estrés por frío en plantas. De particular interés, plantas transformadas con SEC ID Nº: 59 pueden resistir al estrés por calor, estrés por sales y estrés por frío. Además de

estos genes de tolerancia a múltiples estreses, los genes que confieren tolerancia al estrés proporcionados por la presente invención pueden usarse en combinaciones para generar plantas transgénicas que pueden resistir a condiciones de múltiples estreses.

PP - Mejora del crecimiento y desarrollo temprano de la planta.

Se sabe en la técnica que para minimizar el impacto de enfermedad en la rentabilidad del cultivo es importante empezar la temporada con plantas vigorosas sanas. Esto significa evitar enfermedades de la semilla y plantones, conduciendo al aumento de la captación de nutrientes y al aumento del posible rendimiento. Tradicionalmente, sembrar pronto y aplicar fertilizante son los procedimientos usados para promover el vigor temprano de los plantones. En el estado de desarrollo temprano, los embriones de plantas sólo establecen el eje de raíz-brote básico, órgano(s) de almacenamiento de cotiledones y poblaciones de citoblastos, llamadas los meristemos apicales de raíces y brotes, que continuamente generan nuevos órganos durante todo el desarrollo posembrionario. “Crecimiento y desarrollo temprano” usado en el presente documento engloba los estados de imbibición de semillas durante la fase vegetativa temprana. La presente invención proporciona genes que son útiles para producir plantas transgénicas que tienen ventajas en uno o más procesos que incluyen, pero no se limitan a, germinación, vigor de los plantones, crecimiento de raíces y morfología de las raíces bajo condiciones de no estrés. Las plantas transgénicas que se originan a partir de un plantón más fuerte son menos susceptibles a los patógenos fúngicos y bacterianos que se unen a semillas en germinación y plantones. Además, los plantones con ventaja en el crecimiento de raíces son más resistentes al estrés por sequía debido a la amplia arquitectura y más profunda de las raíces. Por tanto, puede reconocerse por aquellos expertos en la materia que los genes que confieren la ventaja de crecimiento en fases tempranas a plantas también pueden usarse para generar plantas transgénicas que son más resistentes a diversas condiciones de estrés debido al desarrollo de la planta temprano mejorado. La presente invención proporciona tales genes a modo de ejemplo que confieren tanto la tolerancia al estrés como las ventajas de crecimiento a plantas, identificados como tales en la Tabla 3, por ejemplo, SEC ID Nº: 128, que pueden mejorar el crecimiento y desarrollo temprano de la planta y conferir tolerancia al calor y al frío a las plantas.

SP - Mejora del crecimiento y desarrollo tardío de la planta

“Crecimiento y desarrollo tardío” usado en el presente documento engloba los estados de desarrollo de hojas, producción de flores y madurez de la semilla. En ciertas realizaciones, las plantas transgénicas producidas usando genes que confieren ventajas de crecimiento a plantas proporcionadas por la presente invención, identificados como tales en la Tabla 3, presentan al menos una característica fenotípica que incluye, pero no se limita a, aumento del radio de la roseta, aumento del peso seco de la roseta, peso seco de la semilla, peso seco de la silicua y longitud de la silicua. Por una parte, el radio de la roseta y el peso seco de la roseta se usan como índices de la capacidad de fotosíntesis y, por tanto, la potencia de fuente de la planta y el potencial de rendimiento de una planta. Por otra parte, el peso seco de la semilla, peso seco de la silicua y longitud de la silicua se usan como índices para la potencia de sumidero de la planta, que se consideran los determinantes directos del rendimiento.

LL - Mejora de la tolerancia al estrés por sombra

Los efectos de la luz sobre el desarrollo de la planta son especialmente importantes en el estado de plantón. Bajo condiciones de luz normal con luz directa libre, un plantón se desarrolla según un patrón fotomorfogénico característico, en el que las plantas tienen cotiledones abiertos y extendidos e hipocotilos cortos. Entonces, la energía de la planta se dedica al cotiledón y al desarrollo de hojas mientras que se minimiza el crecimiento en la extensión longitudinal. Bajo condición de luz tenue en el que la calidad e intensidad de la luz se reducen por sombra, obstrucción o alta densidad de población, un plantón muestra un patrón de evitación de la sombra, en el que el plantón muestra una expansión reducida de cotiledones y la extensión de hipocotilos aumenta enormemente. Como resultado, una planta bajo condición de luz tenue aumenta significativamente su longitud de peciolo en la extensión del desarrollo de la hoja, semilla o fruto y órgano de almacenamiento, afectando así adversamente el rendimiento. La presente invención proporciona nucleótidos recombinantes que permiten que las plantas tengan una respuesta de evitación de la sombra atenuada de manera que la fuente de la planta pueda contribuir a un crecimiento reproductor eficientemente, resultando mayor rendimiento con respecto a las plantas naturales. Un experto en la materia puede reconocer que las plantas transgénicas generadas por la presente invención pueden ser adecuadas para una siembra de mayor densidad, resultando así un aumento del rendimiento por unidad de área. En algunas realizaciones preferidas, la presente invención proporciona plantas transgénicas que tienen una respuesta a luz tenue atenuada y ventaja en la formación de capullos de flores.

LN - Mejora de la tolerancia al estrés por baja disponibilidad de nitrógeno

El nitrógeno es un factor clave en el crecimiento de la planta y el rendimiento del cultivo. El metabolismo, crecimiento y desarrollo de las plantas están profundamente afectados por su suministro de nitrógeno. El suministro de nitrógeno limitado altera la relación de brote con respecto a raíz, desarrollo de raíces, actividad de enzimas del metabolismo primario y la tasa de senescencia (muerte) de hojas viejas. Todos los cultivos de campo tienen una dependencia fundamental de fertilizante nitrogenoso orgánico. Como el fertilizante es rápidamente consumido por la mayoría de los tipos de tierra, debe suministrarse a cultivos en crecimiento dos o tres veces durante la temporada de crecimiento. La eficiencia mejorada del uso de nitrógeno por las plantas debe permitir que los cultivos se cultiven

bajo condición de estrés por baja disponibilidad de nitrógeno como resultado del bajo aporte de fertilizante o la mala calidad de la tierra.

Según la presente invención, las plantas transgénicas generadas usando los nucleótidos recombinantes, que confieren eficiencia mejorada del uso de nitrógeno, identificados como tales en la Tabla 3, presentan uno o más rasgos deseables que incluyen, pero no se limitan a, aumento del peso de los plantones, aumento del número de hojas verdes, aumento del número de hojas en la roseta, aumento de la longitud de las raíces y formación avanzada de capullos de flores. Un experto en la materia puede reconocer que las plantas transgénicas con eficiencia mejorada del uso de nitrógeno, establecidas por la presente invención, también pueden tener composiciones de aminoácidos o de proteínas alteradas, aumento del rendimiento y/o mejor calidad de la semilla. Las plantas transgénicas de la presente invención pueden cultivarse productivamente bajo condiciones deficientes en nutrientes de nitrógeno, es decir, tierras pobres en nitrógeno y aporte de fertilizantes con bajo contenido de nitrógeno, que haría que cesara el crecimiento de las plantas naturales o disminuyera de manera que las plantas naturales fueran prácticamente inútiles. Las plantas transgénicas también pueden usarse ventajosamente para lograr maduración más temprana, crecimiento más rápido y/o cultivos de mayor rendimiento y/o producir alimentos y piensos para animales más nutritivos cuando se cultivan usando condiciones de crecimiento no limitantes de nitrógeno.

Rasgos apilados

La presente invención también engloba plantas transgénicas con rasgos manipulados apilados, por ejemplo, un cultivo que tiene un fenotipo mejorado resultante de la expresión de un ADN recombinante que mejora rasgos en combinación con rasgos de resistencia a herbicidas y/o plagas. Por ejemplo, los genes de la presente invención pueden apilarse con otros rasgos de interés agronómico, tales como un rasgo que proporciona resistencia a herbicidas, por ejemplo, un rasgo de RoundUp Ready, o resistencia a insectos, tal como usando un gen de Bacillus thuringiensis que proporciona resistencia contra lepidópteros, coleópteros, homópteros, hemiópteros y otros insectos. Los herbicidas para los que la resistencia es útil en una planta incluyen herbicidas de glifosato, herbicidas de fosfinotricina, herbicidas de oxinilo, herbicidas de imidazolinona, herbicidas de dinitroanilina, herbicidas de piridina, herbicidas de sulfonilurea, herbicidas de bialafos, herbicidas de sulfonamida y herbicidas de glufosinato. Para ilustrar que la producción de plantas transgénicas con resistencia a herbicidas es una capacidad de aquellos expertos en la materia se hace referencia a las publicaciones de solicitud de patente de EE.UU. 2003/0106096A1 y 2002/0112260A1 y las patentes de EE.UU. 5.034.322; 5.776.760, 6.107.549 y 6.376.754. Para ilustrar que la producción de plantas transgénicas con resistencia a plagas es una capacidad de aquellos expertos en la materia se hace referencia a las patentes de EE.UU. 5.250.515 y 5.880.275 que desvelan plantas que expresan una endotoxina de la bacteria Bacillus thuringiensis, a la patente de EE.UU. 6.506.599 que desvela el control de invertebrados que se alimentan de plantas transgénicas que expresan ARNbc para suprimir un gen diana en el invertebrado, a la patente de EE.UU. 5.986.175 que desvela el control de plagas víricas por plantas transgénicas que expresan replicasa vírica y a la publicación de solicitud de patente de EE.UU. 2003/0150017 A1 que desvela el control de plagas por una planta transgénica que expresa un ARNbc elegido como diana para suprimir un gen en la plaga.

Una vez se ha identificado un ADN recombinante que confiere un rasgo mejorado de interés en plantas de Arabidopsis transgénicas, están disponibles varios procedimientos para usar la secuencia de ese ADN recombinante y el conocimiento sobre la proteína que codifica para identificar homólogos de esa secuencia de la misma planta o diferentes especies de plantas u otros organismos, por ejemplo, bacterias y levadura. Por tanto, puede identificarse un gen homólogo con una secuencia de ADN homóloga a cualquiera de SEC ID Nº: 1 a SEC ID Nº: 151 y SEC ID Nº: 153 a SEC ID Nº: 239, o una proteína homóloga con una secuencia de aminoácidos homóloga a SEC ID Nº: 408. Además, se proporcionan homólogos para una secuencia enumerada como SEC ID Nº: 408.

El ADN recombinante que mejora rasgos y los procedimientos de uso de tal ADN recombinante que mejora rasgos para generar plantas transgénicas con rasgos mejorados proporcionadas por la presente invención no se limitan a cualquiera especie de planta particular. De hecho, las plantas según la presente invención pueden ser de cualquier especie de planta, es decir, pueden ser monocotiledóneas o dicotiledóneas. Preferentemente, serán plantas útiles agrícolas, es decir, plantas cultivadas por el hombre para los fines de la producción de alimentos o aplicaciones técnicas, particularmente industriales. Son de particular interés en la presente invención plantas de maíz y de soja. Por la presente invención se proporcionan construcciones de ADN recombinante optimizadas para la transformación de soja y la transformación de maíz. Otras plantas de interés en la presente invención para la producción de plantas transgénicas que tienen rasgos mejorados incluyen, sin limitación, algodón, canola, trigo, girasol, sorgo, alfalfa, cebada, mijo, arroz, tabaco, cultivos de frutas y verduras, y césped.

En ciertas realizaciones, la presente invención contempla usar un gen ortólogo en la generación de plantas transgénicas con rasgos similarmente mejorados como el homólogo de Arabidopsis transgénico. Las propiedades fisiológicas mejoradas en plantas transgénicas de la presente invención pueden confirmarse en respuestas a condiciones de estrés, por ejemplo, en ensayos usando condiciones de estrés impuestas para detectar respuestas mejoradas a estrés por sequía, deficiencia de nitrógeno, condiciones de crecimiento con frío o, alternativamente, bajo condiciones de estrés naturalmente presentes, por ejemplo, bajo condiciones del campo. La medida de la biomasa puede hacerse en plantas cultivadas en invernadero o en el campo y puede incluir mediciones tales como la altura de la planta, diámetro del tallo, pesos secos de la raíz y el brote y, para plantas de maíz, longitud y diámetro de la espiga.

Los datos de rasgos de cambios morfológicos pueden recogerse por observación visual durante el proceso de regeneración de la planta, además de en plantas regeneradas transferidas a la tierra. Tales datos de rasgos incluyen características tales como plantas normales, plantas pobladas, plantas más altas, tallos más gruesos, hojas estrechas, hojas rayadas, fenotipo nodoso, clorosis, albino, producción de antocianina, o madroños, espigas o raíces alteradas. Otros rasgos mejorados pueden identificarse por mediciones tomadas bajo condiciones en el campo tales como días hasta la liberación de polen, días hasta la formación de barbas, velocidad de extensión de las hojas, contenido de clorofila, temperatura de la hoja, posición, vigor de los plantones, longitud entrenudos, altura de la planta, número de hojas, área de la hoja, macollamiento, raíces adventicias, capacidad para permanecer verde, encamado de los tallos, encamado de las raíces, salud de la planta, esterilidad/prolificidad, quebrado en verde y resistencia a plagas. Además, puede confirmarse el rasgo característico de grano recolectado, que incluye número de granos por fila en la espiga, número de filas de granos en la espiga, aborto de granos, peso de los granos, tamaño de los granos, densidad de granos y calidad física de los granos.

Para confirmar el rendimiento de híbridos en plantas de maíz transgénico que expresan genes de la presente invención puede desearse probar híbridos durante múltiples años en múltiples localizaciones en una localización geográfica en la que convencionalmente se cultiva maíz, por ejemplo, en Iowa, Illinois, u otras localizaciones en la región centro-oeste de Estados Unidos, bajo condiciones de campo “normales”, además de bajo condiciones de estrés, por ejemplo, bajo estrés por sequía o por densidad de población.

Las plantas transgénicas pueden usarse para proporcionar partes de la planta según la invención para la regeneración o cultivo de tejido de células o tejidos que contienen las construcciones descritas en el presente documento. Partes de la planta para estos fines pueden incluir hojas, tallos, raíces, flores, tejidos, epicotilo, meristemos, hipocotilos, cotiledones, polen, ovarios, células y protoplastos, o cualquier otra porción de la planta que pueda usarse para regenerar plantas transgénicas, células, protoplastos o cultivo de tejido adicionales. Las semillas de plantas transgénicas que se proporcionan por la presente invención pueden usarse para propagar más plantas que contienen las construcciones de ADN recombinante que mejoran rasgos de la presente invención. Estos descendientes pretenden incluirse en el alcance de la presente invención si contienen una construcción de ADN recombinante que mejora rasgos de la presente invención, tanto si estas plantas están autofecundadas o cruzadas como si no con diferentes variedades de plantas.

Los diversos aspectos de la invención se ilustran por medio de los siguientes ejemplos. Los ejemplos no cubiertos por el alcance de las reivindicaciones son para fines ilustrativos.

Ejemplos

Ejemplo 1. Identificación de ADN recombinante que confiere rasgo(s) mejorado(s) a plantas

A. Construcciones de expresión para la transformación de plantas de Arabidopsis

Cada gen de interés se amplificó a partir de un ADNc genómico o biblioteca de ADNc usando cebador específico para secuencias en la dirección 5' y en la dirección 3' de la región codificante. Los vectores de transformación se prepararon para transcribir constitutivamente ADN en orientación tanto sentido (para potenciar la expresión de proteínas) como en orientación antisentido (para la supresión de genes endógenos) bajo el control de un promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor potenciado (patente de EE.UU. 5.359.142) directamente o indirectamente (Moore y col. PNAS 95:376-381, 1998; Guyer y col. Genetics 149: 633-639, 1998; solicitud de patente internacional nº PCT/EP98/07577). Los vectores de transformación también contienen un gen bar como marcador de selección para resistencia al herbicida glufosinato. La transformación de plantas de Arabidopsis se llevó a cabo usando el procedimiento de infiltración de vacío conocido en la técnica (Bethtold y col. Methods Mol. Biol. 82:259-66, 1998). Las semillas recogidas de las plantas, llamadas semillas T1, se cultivaron posteriormente en un medio selectivo que contenía glufosinato para seleccionar plantas que en realidad se transformaron y produjeron semilla transgénica T2. Para el cribado de primer pase, las semillas T2 semillas de cinco líneas transgénicas independientes de Arabidopsis fueron

B. Cribado de tolerancia a la sequía de la tierra

Este ejemplo describe un cribado de tolerancia a la sequía de la tierra para identificar plantas de Arabidopsis transformadas con ADN recombinante que se marchitarán menos rápidamente y/o producirán mayor rendimiento de las semillas cuando se cultiven en tierra bajo condiciones de sequía.

Se sembraron semillas T2 en platos llanos llenos de Metro/Mix® 200 (The Scoits® Company, EE.UU.). Se añadieron bóvedas de humedad a cada plato llano y los platos llanos se asignaron a localizaciones y se pusieron en cámaras de crecimiento de clima controlado. Las plantas se cultivaron bajo una pauta de temperatura de 22ºC por el día y 20ºC por la noche, con un fotoperiodo de 16 horas e intensidad de luz promedio de 170 µmol/m2/s. Después de aparecer las primeras hojas verdaderas se quitaron las bóvedas de humedad. Las plantas se pulverizaron con el herbicida glufosinato y se pusieron de nuevo en la cámara de crecimiento durante 3 días adicionales. Los platos planos se regaron durante 1 hora la semana siguiente al tratamiento con herbicida. El riego continuó cada siete días hasta que fueron evidentes los primordios de capullos de flores, momento en el que las plantas se regaron por última vez.

Para identificar plantas tolerantes a la sequía, las plantas se evaluaron para respuesta a marchitamiento y rendimiento de las semillas. Empezando diez días después del último riego, las plantas se examinaron diariamente hasta que se marchitaron 4 plantas/línea. En los próximos seis días, las plantas se monitorizaron para la respuesta de marchitamiento. Se asignaron cinco puntuaciones de sequía según la inspección visual de los fenotipos: 1 para

5 sana, 2 para verde oscura, 3 para marchitamiento, 4 marchitamiento grave, y 5 para muerte. Una puntuación de 3 o superior se consideró como marchitada.

Al final de este ensayo, el rendimiento de las semillas medido como peso de la semilla por planta bajo la condición de sequía se caracterizó para las plantas transgénicas y sus controles y se analizó como una respuesta cuantitativa según el Ejemplo 1M.

10 Se usaron dos enfoques para el análisis estadístico de la respuesta de marchitamiento. Primero se analizó la puntuación de riesgo para fenotipo de marchitamiento y se trató como una respuesta cualitativa según el Ejemplo 1L. Alternativamente se llevó a cabo el análisis de supervivencia en el que las proporciones de plantas transgénicas y de control marchitadas y no marchitadas se compararon con cada uno de los seis días bajo puntuación y se realizó una prueba del orden logarítmico global para comparar las dos curvas de supervivencia usando el software

15 estadístico S-PLUS (S-PLUS 6, Guide to statistics, Insightful, Seattle, WA, EE.UU.). La Tabla 4 proporciona una lista de construcciones de ADN recombinante que mejoran la tolerancia a la sequía en plantas transgénicas.

Tabla 4

SEC PÉP ID: Construcción_id Orientación Puntuación de riesgo de la respuesta de marchitamiento Peso de semilla/planta Análisis de supervivencia de la respuesta de marchitamiento

Media RS: valor de p c delta valor de p c Diferencia de tiempo hasta el marchitamiento valor de p c

241: 74518 SENTIDO -0,131 0,985 / 1,26 0 S 0 1 /

290: 70222 SENTIDO -0,032 0,726 / 0,461 0,001 S -0,63 0,21 /

307: 18280 SENTIDO -0,066 0,937 / 0,402 0,004 S 0 1 /

357: 70247 SENTIDO 0,11 0,169 T 0,336 0,006 S -0,57 0,134 /

369: 72471 SENTIDO 0,16 0,038 S -0,053 0,546 / 0,16 0,226 /

398: 10188 ANTISENTIDO 0,133 0,004 S 0,68 0 S 0,24 0,297 /

399: 10404 ANTISENTIDO 0,13 0,068 T 0,2 0,271 / 0,57 0,083 T

400: 11333 ANTISENTIDO 0,266 0,007 S 0,291 0,293 / 0,77 0,131 T

401: 11719 ANTISENTIDO 0,56 0,006 S -0,088 0,751 / 0 1 /

402: 13663 ANTISENTIDO 0,123 0,024 S -0,198 0,763 / 0,04 0,852 /

403: 13958 ANTISENTIDO 0,526 0,001 S 0,518 0,08 T 0 1 /

404: 15214 ANTISENTIDO 0,018 0,208 / 0,19 0,243 / 0,06 0,815 /

405: 10483 SENTIDO 0,313 0,012 S -0,095 0,795 / 0,28 0,358 /

406: 11711 SENTIDO 0,346 0,005 S 0,218 0,009 S 0,3 0,371 /

407: 11909 SENTIDO 0,094 0,021 S 0,002 0,493 / 0,26 0,767 /

408: 12216 SENTIDO 0,623 0 S -0,195 0,714 / 2,55 0,007 S

409: 12236 SENTIDO 0,233 0,019 S 0,32 0,026 S 0,29 0,124 T

410: 12256 SENTIDO 0,254 0,001 S 0,133 0,245 / 0,09 0,869 /

411: 12806 SENTIDO 0,198 0,016 S 0,689 0,018 S 0,16 0,696 /

412: 12904 SENTIDO 0,292 0,033 S -1,195 0,992 / 0,81 0,023 S

413: 13212 SENTIDO 0,24 0,006 S 0,676 0,01 S 0,25 0,559 /

414: 13232 SENTIDO 0,166 0,134 T -0,044 0,568 / 0,81 0,105 T

(continuación)

415: 13912 SENTIDO 0,3 0 S -0,084 0,74 / 0,91 0,054 T

416: 14327 SENTIDO 0,181 0,008 S -0,423 0,831 / 0,75 0,021 S

417: 14704 SENTIDO 0,174 0,01 S 0,26 0,003 S 0,92 0,538 /

418: 14714 SENTIDO 0,313 0,007 S -0,283 0,987 / 0,3 0,702 /

419: 15142 SENTIDO 0,28 0 S -0,498 0,871 / 0,29 0,196 T

420: 17450 SENTIDO 0,117 0,102 T 0,238 0,079 T -0,05 0,834 /

421: 18607 SENTIDO 0,161 0,013 S -0,167 0,782 / 0,64 0,034 S

422: 19409 SENTIDO 0,177 0,032 S 0,33 0,119 T 0,36 0,298 /

423: 19412 SENTIDO 0,501 0,001 S -0,006 0,515 / 0,15 0,84 /

S: representa que las plantas transgénicas mostraron mejora estadísticamente significativa del rasgo con respecto a la referencia (p<0,05, valor de p, de la delta de una respuesta cuantitativa o de la puntuación de riesgo de una respuesta cualitativa, es la probabilidad de que la diferencia observada entre las plantas transgénicas y la referencia se produzca por casualidad) T: representa que las plantas transgénicas mostraron una tendencia de mejora de rasgos con respecto a la referencia, preferentemente con p<0,2 , /: representa que las plantas transgénicas no mostraron ninguna alteración o tuvieron cambio desfavorable en los rasgos examinados en comparación con la referencia en el presente conjunto de datos

C. Cribado de tolerancia al estrés por calor

Bajo altas temperaturas, plantones de Arabidopsis se vuelven cloróticos y se inhibe el crecimiento de raíces. Este ejemplo expone el cribado de tolerancia al estrés por calor para identificar plantas de Arabidopsis transformadas con 5 el gen de interés que son más resistentes al estrés por calor basándose principalmente en su peso de plantones y crecimiento de raíces bajo alta temperatura. Semillas T2 se sembraron en placas en 1/2 X sales MS, 1% de Phytagel, con 10 µg/ml de glufosinato (7 por placa con 2 semillas de control; 9 semillas totales por placa). Las placas se colocaron a 4ºC durante 3 días para estratificar las semillas. Entonces, las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 3 horas y luego se mantuvieron verticalmente durante 11 días adicionales a temperatura de 34ºC 10 por el día y 20ºC por la noche. El fotoperiodo fue 16 h. La intensidad de luz promedio fue ~ 140 µmol/m2/s. Después de 14 días de crecimiento, las plantas se puntuaron para resistencia a glufosinato, longitud de las raíces, estado de crecimiento final, color visual y peso fresco de los plantones. Se tomó una fotografía de la placa completa en el día

14.

La evaluación visual se llevó a cabo para evaluar la robustez del crecimiento basándose en el tamaño de las hojas y 15 el tamaño de las rosetas.

El peso de los plantones y la longitud de las raíces se analizaron como respuestas cuantitativas según el Ejemplo 1M. El estado de crecimiento final en el día 14 se puntuó como éxito si el 50% de las plantas había alcanzado 3 hojas en la roseta y el tamaño de las hojas era superior a 1 mm (Boyes y col. (2001) The Plant Cell 13, 1499-1510). Los datos del estado de crecimiento se analizaron como una respuesta cualitativa según el Ejemplo 1L. La Tabla 5

20 proporciona una lista de construcciones de ADN recombinante que mejoran la tolerancia al calor en plantas transgénicas.

Tabla 5

SEC PÉP ID: Construcción_id Orientación Peso de los plantones Longitud de las raíces Estado de crecimiento

delta: valor de p c delta valor de p c media RS valor de p c

268: 12007 ANTISENTIDO 1,283 0 S 0,221 0,018 S 0,844 0,044 S

269: 12290 ANTISENTIDO 0,92 0,002 S -0,09 0,683 / 0,4 0,14 T

270: 12343 ANTISENTIDO 1,186 0 S 0,008 0,478 / -0,066 0,818 /

271: 14348 ANTISENTIDO 0,917 0 S 0,047 0,352 / 0,034 0,314 /

272: 15708 ANTISENTIDO 1,12 0 S 0,122 0,092 T 0,467 0,016 S

273: 17615 ANTISENTIDO 1,134 0 S 0,176 0,084 T 0,541 0,102 T

274: 17622 ANTISENTIDO 0,728 0 S -0,142 0,874 / 0,875 0,002 S

275: 70714 ANTISENTIDO 1,029 0 S 0,032 0,355 / -0,003 0,515 /

276: 17925 SENTIDO 0,969 0 S -0,027 0,588 / 0,22 0,215 /

277: 18541 SENTIDO 0,977 0 S -0,012 0,559 / 0,982 0,028 S

278: 11425 SENTIDO 1,255 0 S 0,152 0,096 T 0,516 0,005 S

279: 12263 SENTIDO 0,869 0,003 S -0,023 0,552 / 0,481 0,113 T

280: 12288 ANTISENTIDO 1,256 0 S 0,086 0,314 / 0,968 0,036 S

281: 12910 SENTIDO 1,067 0,105 T 0,097 0,274 / -0,417 1 /

282: 14335 SENTIDO 1,107 0 S 0,16 0 S -0,024 0,804 /

283: 17427 SENTIDO 0,837 0 S -0,069 0,706 / 0,569 0,087 T

284: 19140 SENTIDO 0,894 0 S 0,111 0,131 T 1,794 0 S

285: 19179 SENTIDO 1,039 0 S -0,095 0,742 / 0,614 0,063 T

286: 19251 SENTIDO 0,77 0 S -0,061 0,771 / 0,543 0,027 S

287: 19443 SENTIDO 1,115 0 S 0,042 0,369 / 0,537 0,078 T

288: 19607 SENTIDO 0,939 0 S 0,024 0,381 / 0,095 0,215 /

289: 19915 SENTIDO 1,336 0,057 T 0,19 0,299 / 0,07 0 S

290: 70222 SENTIDO 0,778 0,004 S -0,078 0,677 / 1,153 0,015 S

291: 70464 SENTIDO 1,039 0 S 0,026 0,411 / 0,806 0,04 S

292: 70474 SENTIDO 1,026 0 S 0,094 0,207 / 1,145 0,03 S

293: 70484 SENTIDO 1,511 0 S 0,236 0,004 S 0,688 0,016 S

294: 72474 SENTIDO 0,816 0 S 0,095 0,229 / 1,149 0,01 S

(continuación)

delta: valor de p c delta valor de p c media RS valor de p c

298: 19252 SENTIDO 0,571 0,111 T 0,02 0,416 / 1,27 0,022 S

347: 18854 SENTIDO 0,854 0 S -0,14 0,896 / 0,595 0,148 T

351: 16226 SENTIDO 1,372 0 S 0,244 0,009 S 0,112 0,017 S

357: 70247 SENTIDO 1,146 0 S 0,124 0,114 T 0,953 0,029 S

359: 12635 SENTIDO 0,702 0,109 T 0,587 0,001 S 0,637 0,06 T

367: 14338 SENTIDO 0,888 0 S 0,036 0,326 / 0,17 0,077 T

368: 17809 SENTIDO 0,838 0,002 S 0,033 0,308 / 0,619 0,04 S

369: 72471 SENTIDO 1,051 0,001 S 0,067 0,227 / 1,531 0,005 S

373: 72772 SENTIDO 1,364 0 S 0,299 0,002 S 0,648 0,045 S

395: 70202 SENTIDO 1,159 0 S -0,116 0,941 / 0,339 0,159 T

435: 19719 SENTIDO 1,184 0 S 0,032 0,411 / 1,433 0,018 S

473: 19077 SENTIDO 1,405 0 S 0,026 0,369 / 0,61 0,013 S

474: 19178 SENTIDO 1,381 0 S 0,267 0,008 S 1,54 0,006 S

S: representa las plantas transgénicas que mostraron mejora de rasgos estadísticamente significativa con respecto a la referencia (p<0,05) T: representa las plantas transgénicas que mostraron una tendencia de mejora de rasgos con respecto a la referencia, preferentemente con p<0,2 /: representa las plantas transgénicas que no mostraron ninguna alteración o tuvieron cambio desfavorable en los rasgos examinados en comparación con la referencia en el presente conjunto de datos

D. Cribado de tolerancia al estrés por sal

Este ejemplo expone el cribado de estrés por alta salinidad para identificar plantas de Arabidopsis transformadas con el gen de interés que son tolerantes a altos niveles de sal basándose en su velocidad de desarrollo, crecimiento 5 de raíces y acumulación de clorofila bajo altas condiciones de sal.

Semillas T2 se sembraron en placas de selección de glufosinato que contenían NaCl 90 mM y se cultivaron bajo condiciones de luz y temperatura convencionales. Todos los plantones usadas en el experimento se cultivaron a una temperatura de 22ºC por el día y 20ºC por la noche, un fotoperiodo de 16 horas, una intensidad de luz promedio de aproximadamente 120 µmol/m2. En el día 11, las plantas se midieron para la longitud de raíces primarias. Después

10 de 3 días más de crecimiento (día 14), las plantas se puntuaron para estado transgénico, longitud de raíces primarias, estado de crecimiento, color visual y los plantones se reunieron para medición del peso fresco. También se tomó una fotografía de la placa completa en el día 14.

La evaluación visual se llevó a cabo para evaluar la robustez del crecimiento basándose en el tamaño de las hojas y el tamaño de las rosetas.

15 El peso de los plantones y la longitud de las raíces se analizaron como respuestas cuantitativas según el Ejemplo 1M. El estado de crecimiento final en el día 14 se puntuó como éxito si el 50% de las plantas alcanzaron 3 hojas en la roseta y el tamaño de las hojas era superior a 1 mm (Boyes, D.C. y col. (2001), The Plant Cell 13, 1499/1510). Los datos del estado de crecimiento se analizaron como una respuesta cualitativa según el Ejemplo 1L.

Tabla 6: Una lista de nucleótidos recombinantes que mejoran la tolerancia a alta salinidad en plantas

SECPÉP ID: Construcciónid Peso de plantones en el día 14 Longitud de las raíces en el día 11 Longitud de las raíces en el día 14 Estado de crecimiento

delta: valor de p c delta valor de p c delta valor de p c mediaRS valor de p c

243: 17918 0,749 0,001 S 0,007 0,945 / 0,054 0,348 / 0,107 0,152 T

258: 17819 0,713 0,026 S 0,281 0,09 T 0,29 0,01 S 1,565 0,025 S

285: 19179 0,939 0 S 0,228 0,044 S 0,269 0,001 S 1,561 0,034 S

298: 19252 0,831 0,003 S 0,327 0,016 S 0,334 0,001 S 1,5 0,028 S

312: 70405 0,266 0,096 T 0,051 0,628 / 0,202 0,014 S -0,201 0,766 /

372: 18395 0,506 0,008 S 0,27 0,033 S 0,24 0,007 S 0,653 0,016 S

376: 11409 0,834 0,004 S 0,305 0,007 S 0,329 0,001 S 0,712 0,073 T

390: 18392 0,767 0 S 0,325 0,005 S 0,181 0,034 S 0,698 0,109 T

424: 13005 0,787 0,003 S 0,228 0,021 S 0,161 0,12 T 1,079 0,013 S

439: 18513 0,779 0,019 S 0,377 0,013 S 0,298 0,002 S 0,679 0,069 T

463: 12332 0,292 0,604 / 0,204 0,22 / 0,057 0,829 / 0,538 0,188 T

464: 13649 0,418 0,03 S 0,062 0,493 / 0,147 0,1 T 1,39 0,028 S

465: 16113 0,108 0,305 / 0,168 0,221 / 0,138 0,076 T 1,09 0,068 T

466: 12069 0,708 0,043 S 0,162 0,091 T 0,165 0,354 / 0,306 0,074 T

467: 12906 0,764 0,05 T 0,185 0,039 S 0,175 0,01 S 1,212 0,009 S

468: 13443 0,113 0,629 / -0,061 0,542 / -0,001 0,993 / 0,658 0,096 T

469: 14707 0,388 0,159 T 0,088 0,452 / -0,094 0,564 / 0,366 0,012 S

470: 15116 0,576 0,02 S 0,362 0,01 S 0,221 0,063 T 1,414 0,027 S

471: 16117 0,038 0,789 / 0,02 0,87 / -0,003 0,98 / 0,599 0,224 /

472: 16136 0,465 0,001 S 0,297 0 S 0,172 0,007 S 1,911 0,005 S

(continuación)

473: 19077 0,525 0,02 S 0,23 0,006 S 0,214 0 S 0,299 0,116 T

474: 19178 0,398 0,22 / 0,231 0,106 T 0,219 0,046 S 0,456 0,213 /

475: 70752 0,273 0,379 / 0,122 0,387 / 0,096 0,417 / -0,022 0,519 /

476: 70753 0,21 0,459 / -0,015 0,864 / 0,116 0,286 / 0,489 0,128 T

477: 70809 0,802 0,007 S 0,233 0 S 0,348 0 S 2,24 0,009 S

478: 72091 0,608 0,014 S 0,115 0,249 / 0,152 0,091 T 0,398 0,267 /

S: representa las plantas transgénicas que mostraron mejora de rasgos estadísticamente significativa con respecto a la referencia (p<0,05)T: representa las plantas transgénicas que mostraron una tendencia de mejora de rasgos con respecto a la referencia, preferentemente con p<0,2/: representa las plantas transgénicas que no mostraron ninguna alteración o tuvieron cambio desfavorable en los rasgos examinados en comparación con la referenciaen el presente conjunto de datos

E. Cribado de la tolerancia al estrés osmótico inducido por polietilenglicol (PEG)

Hay numerosos factores que pueden influir en la germinación de semillas y el posterior crecimiento de plantones, siendo uno la disponibilidad de agua. Los genes que pueden afectar directamente la tasa de éxito de la germinación y el crecimiento temprano de plantones son rasgos agronómicos posiblemente útiles para mejorar la germinación y

5 el crecimiento de plantas de cultivo bajo estrés por sequía. En este ensayo se usó PEG para inducir estrés osmótico en líneas transgénicas en germinación de semillas de Arabidopsis thaliana con el fin de cribar líneas de semillas osmóticamente resistentes.

Semillas T2 se sembraron en placas de selección de glufosinato que contenían 3% de PEG y se cultivaron bajo condiciones de luz y temperatura convencionales. Las semillas se sembraron en cada placa que contenía 3% de 10 PEG, 1/2 X sales MS, 1% de Phytagel y 10 µg/ml de glufosinato. Las placas se colocaron a 4ºC durante 3 días para estratificar las semillas. En el día 11, las plantas se midieron para longitud de raíces primarias. Después de 3 días de crecimiento más, es decir, en el día 14, las plantas se puntuaron para estado transgénico, longitud de raíces primarias, estado de crecimiento, color visual y los plantones se reunieron para medición del peso fresco. Se tomó una fotografía de la placa completa en el día 14. La evaluación visual se llevó a cabo para evaluar la robustez del

15 crecimiento basándose en el tamaño de las hojas y el tamaño de las rosetas.

El peso de los plantones y la longitud de las raíces se analizaron como respuestas cuantitativas según el Ejemplo 1M. El estado de crecimiento final en el día 14 se puntuó como éxito o fracaso basándose en si las plantas alcanzaron 3 hojas en la roseta y el tamaño de las hojas era superior a 1 mm. Los datos del estado de crecimiento se analizaron como una respuesta cualitativa según el Ejemplo 1L.

Tabla 7: Una lista de nucleótidos recombinantes que mejoran la tolerancia al estrés osmótico en plantas

SEC PÉP ID: Construcción Peso de los plantones en el día14 Longitud de las raíces en el día 11 Longitud de las raíces en el día14 Estado de crecimiento

241: 74518 0,53 0,018 S 0,217 0,024 S 0,51 0,001 S 4 0 S

345: 14825 0,414 0,181 T 0,271 0,053 T 0,102 0,34 / 2,105 0,01 S

346: 17931 0,295 0,425 / 0,124 0,574 / 0,116 0,454 / 2,069 0,085 T

347: 18854 0,484 0,015 s 0,342 0,011 S 0,159 0,073 T 1,023 0,238 /

348: 12237 0,371 0,165 T 0,325 0,001 S 0,297 0,003 S 2,191 0,017 S

349: 13414 0,137 0,311 / 0,241 0,069 T 0,265 0,045 S 2,461 0,027 S

350: 16160 0,303 0,044 S 0,242 0,035 S 0,077 0,512 / 3,381 0,001 S

351: 16226 0,367 0,047 S 0,132 0,224 / 0,097 0,276 / 4 0 S

352: 16803 0,382 0,036 S 0,125 0,489 / 0,224 0,023 S 4 0 S

353: 18260 0,183 0,315 / 0,125 0,315 / 0,146 0,143 T 3,362 0,002 S

354: 18642 0,076 0,674 / 0,199 0,09 T 0,199 0,029 S 3,056 0,002 S

355: 18721 0,336 0,104 T 0,177 0,145 T 0,109 0,228 / 2,281 0,02 S

356: 19254 0,334 0,242 / 0,155 0,227 / 0,153 0,183 T 0,905 0,129 T

357: 70247 0,45 0,138 T 0,334 0,008 S 0,169 0,07 T 2,692 0,013 S

358: 70650 0,215 0,121 T 0,105 0,114 T 0,092 0,255 / 2,749 0,011 S

374: 19441 0,413 0,017 S 0,256 0,003 S 0,098 0,085 T 2,324 0,04 S

424: 13005 0,685 0,008 S 0,395 0,002 S 0,226 0,013 S 3,787 0 S

435: 19719 0,306 0,04 S 0,135 0,051 T -0,028 0,426 / -0,338 0,598 /

474: 19178 0,515 0,02 S 0,21 0,059 T 0,169 0,08 T 3,53 0 S

S: representa las plantas transgénicas que mostraron mejora de rasgos estadísticamente significativa con respecto a la referencia (p<0,05)T: representa las plantas transgénicas que mostraron una tendencia de mejora de rasgos en comparación con la referencia, preferentemente con p<0,2/: representa las plantas transgénicas que no mostraron ninguna alteración o tuvieron cambio desfavorable en los rasgos examinados en comparación con la referencia enel presente conjunto de datos

F. Cribado de tolerancia al choque al frío

Este ejemplo expone un cribado para identificar plantas de Arabidopsis transformadas con los genes de interés que son más tolerantes al estrés por frío sometidas durante el día 8 al día 28 después de la siembra de semillas. Durante estas fases tempranas cruciales se midieron el crecimiento de plantones y el aumento del área de la hoja para

5 evaluar la tolerancia cuando plantones de Arabidopsis se expusieron a bajas temperaturas. Usando este cribado pueden encontrarse alteraciones genéticas que permiten que las plantas germinen y crezcan mejor que las plantas naturales bajo exposición repentina a bajas temperaturas.

Se probaron semillas T2. Once plantones de cada línea más una línea de control se plantaron juntos en una placa que contenía ½ X sales de Gamborg con 0,8 Phytagel™, 1% de Phytagel y 0,3% de sacarosa. Entonces, las placas 10 se orientaron horizontalmente y se estratificaron durante tres días a 4ºC. En el día tres, las placas se sacaron de la estratificación y se expusieron a condiciones convencionales (fotoperiodo de 16 h, 22ºC por el día y 20ºC por la noche) hasta el día 8. En el día ocho, las placas se sacaron de las condiciones convencionales y se expusieron a condiciones de choque al frío (fotoperiodo de 24 h, 8ºC tanto por el día como por la noche) hasta el día final del ensayo, es decir, el día 28. Las áreas de las rosetas se midieron el día 8 y el día 28, que se analizaron como

15 respuestas cuantitativas según el Ejemplo 1M.

Tabla 8: Una lista de nucleótidos recombinantes que mejoran la tolerancia al estrés por choque al frío en plantas

SEC PÉPID: Construcción_id Orientación Área en roseta en el día 8 Área en roseta en el día 28 Diferencia en el área en roseta entre el día 28 y el día 8

delta: valor de p c delta valor de p c delta valor de p c

240: 19867 SENTIDO -0,032 0,603 1 0,15 0,309 / 0,426 0,064 T

241: 74518 SENTIDO 0,184 0,192 T 0,653 0,001 S 0,796 0 S

242: 15816 SENTIDO 0,366 0,027 S 0,592 0,002 S 0,666 0,004 S

243: 17918 SENTIDO 0,594 0 S 0,982 0 S 1,325 0 S

276: 17925 SENTIDO 0,479 0,001 S 0,693 0 S 0,872 0 S

474: 19178 SENTIDO 0,23 0,083 T 0,435 0,026 S 0,435 0,103 T

S: representa las plantas transgénicas que mostraron mejora de rasgos estadísticamente significativa con respecto a la referencia (p<0,05) T: representa las plantas transgénicas que mostraron una tendencia de mejora de rasgos en comparación con la referencia, preferentemente con p<0,2 /: representa las plantas transgénicas que no mostraron ninguna alteración o tuvieron cambio desfavorable en los rasgos examinados en comparación con la referencia en el presente conjunto de datos

G. Cribado de tolerancia a la germinación con frío

Este ejemplo expone un cribado para identificar que plantas de Arabidopsis transformadas con los genes de interés son resistentes al estrés por frío basándose en su tasa de desarrollo, crecimiento de raíces y acumulación de

20 clorofila bajo condiciones de baja temperatura.

Se sembraron semillas T2 y todos los plantones usados en el experimento se cultivaron a 8ºC. Las semillas se desinfectaron primero superficialmente usando gas cloro y luego se sembraron en placas de ensayo que contenían una disolución acuosa de 1/2 X de mezcla de sal basal B/5 de Gamborg (Sigma/Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA G/5788), 1% de Phytagel™ (Sigma-Aldrich, P-8169) y 10 ug/ml de BASTA™ (Bayer Crop Science, Fráncfort,

25 Alemania), con el pH final ajustado a 5,8 usando KOH. Las placas de prueba de mantuvieron verticalmente durante 28 días a una temperatura constante de 8ºC, un fotoperiodo de 16 h e intensidad de luz promedio de aproximadamente 100 µmol/m2/s. 28 días después de la siembra se midió la longitud de las raíces, se observó el estado de crecimiento, se evalúo el color visual y se tomó una fotografía de la placa completa.

La evaluación visual se llevó a cabo para evaluar la robustez del crecimiento basándose en el tamaño de las hojas y 30 el tamaño de las rosetas.

La longitud de las raíces en el día 28 se analizó como una respuesta cuantitativa según el Ejemplo 1M. El estado de crecimiento en el día 7 se analizó como una respuesta cualitativa según el Ejemplo 1L.

Tabla 9: Una lista de nucleótidos recombinantes que mejoran la tolerancia al estrés por frío en plantas

SEC PÉP ID: Construcción_id Orientación Longitud de las raíces en el día 28 Estado de crecimiento en el día 28

delta: valor de p c Media RAS valor de p c

240: 19867 SENTIDO 0,071 0,292 / 1,954 0,103 T

241: 74518 SENTIDO 0,278 0,031 S 4 0 S

244: 15306 ANTISENTIDO 0,176 0,142 T 1,582 0,067 T

245: 12038 SENTIDO 0,045 0,188 T 2,271 0,022 S

246: 12046 SENTIDO 0,177 0,125 T 3,513 0 S

247: 13432 SENTIDO 0,182 0,015 S 1,108 0,078 T

248: 13711 SENTIDO 0,15 0,022 S 2,357 0,012 S

249: 14809 SENTIDO -0,034 0,631 / 1,95 0,047 S

250: 14951 SENTIDO 0,237 0,053 T 3,387 0,001 S

251: 15632 SENTIDO 0,003 0,481 / 0,49 0,275 /

252: 16147 SENTIDO 0,176 0,016 S 3,284 0,003 S

253: 16158 SENTIDO 0,084 0,235 / 1,432 0,138 T

254: 16170 SENTIDO 0,066 0,354 / 1,995 0,088 T

255: 16171 SENTIDO -0,178 0,842 / -0,671 0,732 /

256: 16175 SENTIDO -0,054 0,7 / 1,231 0,184 T

257: 17430 SENTIDO 0,254 0,135 T 2,776 0,009 S

258: 17819 SENTIDO 0,221 0,028 S -0,475 0,922 /

259: 17921 SENTIDO -0,151 0,912 / 1,291 0,179 T

260: 17928 SENTIDO 0,368 0,028 S 2,599 0,003 S

261: 18637 SENTIDO 0,158 0,225 / 1,143 0,164 T

262: 18816 SENTIDO 0,206 0,075 T I 3,038 0,002 S

263: 19227 SENTIDO 0,198 0,058 T 3,068 0,002 S

264: 19429 SENTIDO 0,258 0,062 T I 2,582 0,006 S

265: 70235 SENTIDO 0,175 0,065 T 2,584 0,006 S

266: 72634 SENTIDO 0,169 0,064 T 2,835 0,001 S

267: 72752 SENTIDO 0,292 0,019 S 2,816 0,002 S

273: 17615 ANTISENTIDO 0,317 0,006 S 2,239 0,022 S

277: 18541 SENTIDO 0,321 0,072 T 2,631 0,014 S

293: 70484 SENTIDO 0,2 0,018 S 2,61 0,016 S

298: 19252 SENTIDO 0,391 0,002 S 1,041 0,084 T

346: 17931 SENTIDO 0,096 0,059 T 1,213 0,142 T

(continuación)

delta: valor de p c Media RAS valor de p c

357: 70247 SENTIDO 0,299 0,006 S 2,607 0,005 S

366: 19610 SENTIDO 0,33 0,079 T 4 0 S

367: 14338 SENTIDO 0,223 0,071 T 1,125 0,087 T

376: 11409 SENTIDO 0,193 0 S 1,831 0,024 S

434: 17922 SENTIDO 0,238 0,029 S 3,109 0,002 S

H. Cribado de tolerancia a la sombra-luz tenue

Las plantas se someten a una respuesta morfológica característica en sombra que incluye el alargamiento del peciolo, un cambio en el ángulo de las hojas y una reducción en el contenido de clorofila. Aunque estos cambios 5 pueden conferir una ventaja competitiva a individuos, en un monocultivo la respuesta de evitación de la sombra se cree que reduce la biomasa global de la población. Por tanto, alteraciones genéticas que previenen la respuesta de evitación de la sombra pueden asociarse a mayor rendimiento. Los genes que favorecen en crecimiento bajo condiciones de luz tenue también pueden promover el rendimiento, ya que niveles de luz inadecuados frecuentemente limitan el rendimiento. Este protocolo describe un cribado para buscar plantas de Arabidopsis que

10 muestran una respuesta de evitación de la sombra atenuada y/o crecen mejor que plantas de control bajo intensidad de luz tenue. De particular interés, los inventores estuvieron buscando plantas que no extendieran su longitud de peciolo, tuvieran un aumento en el peso de los plantones con respecto a la referencia y tuvieran hojas que fueran más próximas a paralelas a la superficie de la placa.

Se sembraron semillas T2 en placas de selección de glufosinato con ½ de medio MS. Las semillas se sembraron en

15 1/2 X de sales MS, 1% de Phytagel, 10 ug/ml de BASTA. Las plantas se cultivaron en placas verticales a una temperatura de 22ºC por el día, 20ºC por la noche y bajo luz tenue (aproximadamente 30 uE/m2/s, relación rojo/rojo lejano (655/665/725/735) ~0,35 usando luces PLAQ con filtro de color GAM nº 680). Veintitrés días después de sembrarse los plantones se registraron mediciones que incluyeron estado de los plantones, número de hojas en la roseta, estado de los capullos de flores, ángulo del peciolo-hoja, longitud del peciolo y pesos frescos reunidos. Se

20 tomó una imagen digital de la placa completa en el día de medición. El peso de los plantones y la longitud del peciolo se analizaron como respuestas cuantitativas según el Ejemplo 1M. El número de hojas en la roseta, formación de capullos en floración y el ángulo de la hoja se analizaron como respuestas cualitativas según el Ejemplo 1L.

Tabla 10: Una lista de nucleótidos recombinantes que mejoran la tolerancia a la sombra en plantas

SECPÉP ID: Construcción_id Formación de capullos de flores en el día 23 Ángulo de la hoja en el día 23 Longitud del peciolo en el día 23 Número de hojas en la roseta en el día 23 Peso de los plantonesen el día 23

media RS: valor de p c mediaRS valor de p c delta valor de p c media RS valor de p c delta valor de p c

262: 18816 3,007 0,003 S 0,738 0,003 S 0,046 0,561 / -0,383 0,929 / 0,171 0,011 S

282: 14335 1,81 0,029 S 0,404 0,032 S 0,204 0,301 / -0,043 0,814 / 0,39 0,093 T

295: 13047 2,261 0,006 S 0,482 0,106 T -0,097 0,31 / 1,655 0,088 T 0,463 0,022 S

296: 13304 -0,118 0,643 / -0,164 0,861 / -0,228 0,106 T 1,214 0,068 T 0,244 0,421 /

297: 13474 -0,319 0,583 / 0,419 0,062 T -0,051 0,153 T 0,633 0,032 s 0,223 0,002 S

298: 19252 -2 0,962 / 0,239 0,257 / 0,099 0,242 / 1,153 0,056 T 0,497 0 S

299: 12612 -0,627 0,975 / -0,094 0,766 / -0,037 0,341 / 0,61 0,092 T -0,304 0,298 /

300: 12926 0,827 0,15 T -0,278 1 / -0,02 0,51 / 0,489 0,218 / -0,374 0,279 /

301: 13230 -0,228 0,954 / -0,05 0,668 / 0,057 0,33 / 1,83 0,025 S 0,33 0,124 T

302: 14235 -0,511 1 / 0,084 0,271 / -0,324 0,045 S -0,205 0,848 / -0,536 0,016 /

303: 17305 0,056 0,374 / 0,036 0,226 / -0,055 0,59 / 0,788 0,143 T -0,058 0,761 /

304: 17470 0,319 0,344 / 0,231 0,112 T -0,218 0,24 / 1,314 0,052 T 0,094 0,612 /

305: 17718 -1,438 0,985 / 0,005 0,486 / -0,148 0,016 S 1,793 0,027 S 0,033 0,728 /

306: 17904 0,965 0,105 T 0,252 0,071 T -0,15 0,359 / 1,01 0,027 S -0,022 0,844 /

307: 18280 -0,176 0,626 / 0,284 0,258 / -0,056 0,547 / 1,35 0,037 S 0,269 0,086 T

308: 18287 -2,441 0,941 / 0,078 0,348 / -0,022 0,785 / 1,193 0,05 T 0,292 0,056 T

309: 18501 -0,087 1 / -0,326 1 / -0,254 0,05 T 0,23 0,438 / -0,303 0,789 /

310: 18877 0,181 0,414 / 0,016 0,41 / -0,119 0,372 / 0,351 0,212 / 0,076 0,604 /

311: 19531 4 0 S 0,04 0,379 / -0,142 0,344 / -0,253 0,809 / 0,001 0,998 /

312: 70405 -0,931 0,991 / -0,114 0,957 / -0,186 0,038 S 0,674 0,188 T 0,13 0,177 T

(continuación)

SECPÉP ID: Construcción_id Formación de capullos de flores en el día 23 Ángulo de la hoja en el día 23 Longitud del peciolo en el día 23 Número de hojas en la roseta en el día 23 Peso de los plantones en el día 23

313: 72136 -1,001 1 / 1,063 0,08 T -0,621 0,008 S 0,775 0,014 S -1,081 0,018 /

314: 72611 -0,476 0,834 / 0,868 0,121 T -0,262 0,102 T 1,728 0,044 S -0,365 0,23 /

370: 16403 2,223 0,01 S 0,132 0,144 T -0,157 0,484 / -1,052 0,999 / 0,148 0,766 /

427: 12018 1,283 0,059 T 0,309 0,254 / -0,006 0,959 / 0,663 0,14 T -0,643 0,017 /

434: 17922 1,171 0,136 T -0,046 0,58 / 0,057 0,624 / -0,042 0,614 / 0,317 0,056 T

436: 17336 -0,987 1 / -0,297 1 / -0,11 0,079 T 1,082 0,074 T -0,121 0,636 /

437: 17735 -3,705 1 / -0,016 0,524 / -0,135 0,084 T 0,882 0,022 S 0,014 0,9 /

477: 70809 -1,333 0,913 / 0,184 0,173 T 0,102 0,256 / 0,236 0,148 T 0,449 0,046 S

478: 72091 1,908 0,006 S 0,009 0,422 / 0,251 0,004 / -0,056 1 / 0,413 0,083 T

S: representa las plantas transgénicas que mostraron mejora de rasgos estadísticamente significativa con respecto a la referencia (p<0,05)T: representa las plantas transgénicas que mostraron una tendencia de mejora de rasgos con respecto a la referencia, preferentemente con p<0,2/: representa las plantas transgénicas que no mostraron ninguna alteración o tuvieron cambio desfavorable en los rasgos examinados en comparación con la referencia enel presente conjunto de datos.

I. Cribado de crecimiento y desarrollo temprano de la planta

Este ejemplo expone una plataforma de análisis fenotípico basado en placa para la rápida detección de fenotipos que son evidentes durante las dos primeras semanas de crecimiento. En este cribado los inventores buscaron genes que confirieran ventajas en los procesos de germinación, vigor de los plantones, crecimiento de raíces y morfología

5 de las raíces bajo condiciones de crecimiento no estresadas a las plantas. Las plantas transgénicas con ventajas en el crecimiento y el desarrollo de plantones se determinaron por el peso de los plantones y la longitud de las raíces en el día14 después de sembrar la semilla.

Se sembraron semillas T2 en placas de selección de glufosinato y se cultivaron bajo condiciones convencionales (~100 uE/m2/s, fotoperiodo de 16 h, 22ºC por el día, 20ºC por la noche). Las semillas se estratificaron durante 3 días

10 a 4ºC. Los plantones se cultivaron verticalmente (a una temperatura de 22ºC por el día, 20ºC por la noche). Las observaciones se tomaron en el día 10 y el día 14. Tanto el peso de los plantones como la longitud de las raíces en el día 14 se analizaron como respuestas cuantitativas según el Ejemplo 1M.

Tabla 11: Una lista nucleótidos recombinantes que mejoran el crecimiento y el desarrollo temprano de la planta

SEC PÉP ID: Construcción_id Orientación Longitud de las raíces en el día 14 Peso de los plantones en el día14

delta: valor de p c delta valor de p c

241: 74518 SENTIDO 0,216 0,01 S 0,454 0,049 S

245: 12038 SENTIDO 0,101 0,046 S 0,629 0,003 S

250: 14951 SENTIDO 0,15 0,072 T 0,138 0,378 /

260: 17928 SENTIDO 0,062 0,22 / 0,246 0,069 T

265: 70235 SENTIDO 0,079 0,519 / 0,414 0,026 S

267: 72752 SENTIDO 0,301 0,001 S 0,789 0,002 S

285: 19179 SENTIDO 0,216 0,024 S 0,603 0,01 S

290: 70222 SENTIDO 0,047 0,468 / 0,394 0,014 S

293: 70484 SENTIDO 0,068 0,364 / 0,444 0,024 S

294: 72474 SENTIDO 0,241 0,051 T 0,183 0,564 /

298: 19252 SENTIDO 0,065 0,392 / 0,316 0,054 T

326: 17344 SENTIDO 0,042 0,565 / 0,223 0,066 T

330: 17906 SENTIDO 0,11 0,152 T 0,419 0,011 S

354: 18642 SENTIDO on 0,247 / 0,257 0,043 S

357: 70247 SENTIDO -0,04 0,842 / 0,237 0,134 T

358: 70650 SENTIDO 0,121 0,077 T 0,135 0,442 /

359: 11787 ANTISENTIDO -0,083 0,784 / 0,167 0,365 /

360: 13641 ANTISENTIDO 0,092 0,15 T 0,336 0,053 T

361: 14515 ANTISENTIDO 0,051 0,616 / 0,351 0,038 S

362: 14920 ANTISENTIDO 0,08 0,358 / 0,101 0,739 /

363: 15204 ANTISENTIDO 0,203 0,015 S 0,076 0,811 /

364: 15216 ANTISENTIDO 0,316 0,023 S 0,632 0,073 T

365: 15330 ANTISENTIDO 0,084 0,428 / 0,435 0,002 S

366: 19610 SENTIDO 0,192 0,011 S 0,523 0,008 S

(continuación)

delta: valor de p c delta valor de p c

367: 14338 SENTIDO 0,145 0,155 T 0,589 0,072 T

368: 17809 SENTIDO 0,014 0,928 / -0,121 0,753 /

369: 72471 SENTIDO 0,07 0,023 S 0,407 0,048 S

370: 16403 SENTIDO 0,199 0,027 S 0,6 0,003 S

371: 17737 SENTIDO 0,049 0,472 / 0,242 0,073 T

372: 18395 SENTIDO 0,219 0,001 S 0,58 0,002 S

373: 72772 SENTIDO 0,224 0,023 S 0,442 0,106 T

374: 19441 SENTIDO 0,271 0 S 0,482 0,019 S

375: 10486 SENTIDO 0,191 0,03 S 0,343 0,052 T

376: 11409 SENTIDO 0,258 0,034 S 0,468 0,006 S

377: 12104 SENTIDO 0,1 0,379 / 0,489 0,009 S

378: 12258 SENTIDO 0,16 0,05 T 0,392 0,137 T

379: 12909 SENTIDO 0,139 0,267 / 0,322 0,261 /

380: 14310 SENTIDO 0,544 0 S 0,764 0,026 S

381: 14317 SENTIDO 0,134 0,18 T 0,117 0,64 /

382: 14709 SENTIDO 0,206 0,009 S 0,389 0,117 T

383: 15123 SENTIDO 0,026 0,872 / 0,27 0,348 /

384: 16013 SENTIDO 0,046 0,622 / 0,464 0,01 S

385: 16185 SENTIDO 0,191 0,045 S 0,145 0,596 /

386: 16719 SENTIDO 0,019 0,872 / 0,424 0,088 T

387: 17490 SENTIDO 0,186 0,026 S 0,272 0,102 T

388: 17905 SENTIDO 0,239 0,004 S 0,346 0,196 T

389: 18385 SENTIDO 0,287 0,003 S 0,687 0,003 S

390: 18392 SENTIDO 0,088 0,338 / 0,504 0,012 S

392: 18531 SENTIDO 0,313 0,015 S 0,627 0 S

393: 18603 SENTIDO 0,212 0 S 0,165 0,187 T

394: 19530 SENTIDO 0,106 0,137 T 0,342 0,025 S

395: 70202 SENTIDO 0,218 0,056 T 0,279 0,223 /

396: 72009 SENTIDO 0,191 0,054 T 0,328 0,043 S

397: 72119 SENTIDO 0,236 0 S 0,259 0,008 S

438: 19249 SENTIDO 0,054 0,375 / 0,222 0,048 S

439: 18513 SENTIDO 0,204 0,044 S 0,193 0,322 /

(continuación)

delta: valor de p c delta valor de p c

461: 19222 SENTIDO 0,255 0,072 T 0,622 0,034 S

473: 19077 SENTIDO -0,049 0,669 / 0,2 0,227 /

474: 19178 SENTIDO 0,303 0 S 0,592 0,001 S

477: 70809 SENTIDO 0,128 0,093 T 0,224 0,185 T

Para otras respuestas: S: representa las plantas transgénicas que mostraron mejora de rasgos estadísticamente significativa con respecto a la referencia (p<0,05) T: representa las plantas transgénicas que mostraron una tendencia de mejora de rasgos con respecto a la referencia, preferentemente con p<0,2 /: representa las plantas transgénicas que no mostraron ninguna alteración o tuvieron cambio desfavorable en los rasgos examinados en comparación con la referencia en el presente conjunto de datos

J. Cribado de crecimiento y desarrollo tardío de la planta

Este ejemplo expone una plataforma fenotípica basada en tierra para identificar genes que confieren ventajas en los procesos de desarrollo de las hojas, producción de flores y madurez de la semilla a las plantas.

5 Se cultivaron plantas de Arabidopsis en una mezcla para macetas comercial (Metro Mix 360, Scotts Co., Marysville, OH) que consistía en 30-40% de vermiculita hortícola de calidad media, 35-55% de musgo de turberas de esfagno, 10-20% de ceniza de corteza procesada, 1-15% de corteza de pino y una carga de nutriente iniciador. La tierra se complementó con fertilizante de liberación controlada Osmocote a una tasa de 30 mg/ft3. Se imbibieron semillas T2 en 1% de disolución de agarosa durante 3 días a 4ºC y luego se sembraron a una densidad de ~5 por maceta de 2

10 ½". Se ordenaron treinta y dos macetas en una rejilla de 4 por 8 en un terreno plano de invernadero convencional. Las plantas se cultivaron en habitaciones medioambientalmente controladas bajo una duración del día de 16 h con una intensidad de luz promedio de ~200 µmoles/m2/s. Los valores de consigna de las temperaturas para el día y la noche fueron 22ºC y 20ºC, respectivamente. La humedad se mantuvo al 65%. Las plantas se regaron por subirrigación cada dos días en promedio hasta la semifloración, momento en el que las plantas se regaron diariamente

15 hasta que se completó la floración.

La aplicación del herbicida glufosinato se realizó para seleccionar individuos T2 que contenían el transgén diana. Se aplicó una única aplicación de glufosinato cuando las primeras hojas reales fueron visibles. Cada maceta se dejó menos densa para dejar un único plantón resistente a glufosinato ~3 días después de aplicarse la selección.

El radio de la roseta se midió en el día 25. La longitud de la silicua se midió en el día 40. Las partes de la planta se

20 recogieron en el día 49 para mediciones de peso seco si se detuvo la producción de flores. De otro modo, los pesos secos de las rosetas y silicuas se llevaron a cabo en el día 53. Las semillas se recogieron en el día 58. Todas las mediciones se analizaron como respuestas cuantitativas según el Ejemplo 1M.

Tabla 12: Una lista de nucleótidos recombinantes que mejoran el crecimiento y desarrollo tardío de la planta

SEC PÉP ID: construcción _id Peso seco de la roseta Radio de la roseta Peso seco de la semilla Peso seco de la silicua Longitud de la silicua

delta: valor de p c delta valor de p c delta valor de p c delta valor de p c delta valor de p c

289: 19915 0,234 0,027 S 0,2 0,002 S 0,214 0,142 T 0,165 0,138 T -0,172 0,863 /

373: 72772 0,194 0,291 / 0,022 0,068 T 0,259 0,003 S 0,102 0,343 / -0,223 0,889 /

403: 13958 -0,065 0,797 / -0,279 0,863 / 0,146 0,041 S 0,092 0,177 T 0,009 0,158 T

405: 10483 -0,073 0,946 / 0,302 0,002 S 0,288 0,022 T 0,592 0 S 0,137 0 S

412: 12904 0,048 0,131 T 0,149 0,003 S 0,349 0,002 S 0,061 0,066 T -0,045 0,961 /

419: 15142 -0,211 0,945 / 0,074 0,076 T 0,284 0,002 S -0,088 0,984 / 0,014 0,374 /

424: 13005 -0,175 0,954 / 0,091 0,014 S 0,629 0,013 S 0,169 0,106 T -0,031 0,627 /

425: 10203 0,2 0,036 S -0,023 0,587 / -0,757 0,922 / -0,059 0,756 / 0,018 0,15 T

426: 11327 -0,046 0,747 / 0,056 0,138 T 0,327 0,08 T -0,109 0,94 / 0,009 0,142 T

427: 11814 -0,127 0,799 / -0,085 0,866 / 0,397 0,016 S -0,184 0,91 / 0,05 0,236 /

428: 13003 0,004 0,47 / -0,018 0,589 / 0,78 0,003 S -0,168 0,939 / -0,264 0,94 /

429: 13949 -0,009 0,538 / -0,309 0,953 / 0,719 0,008 S -0,214 0,995 / 0,002 0,476 /

430: 16416 0,396 0,001 S 0,099 0,03 S -0,654 0,999 / 0,034 0,187 T 0,013 0,13 T

431: 16438 -0,501 0,802 / -0,516 0,9 / 0,63 0,021 S -0,968 0,842 / -0,461 0,905 /

432: 17124 -0,226 0,898 / -0,022 0,618 / 0,702 0,012 S -0,479 0,942 / -0,055 0,99 /

433: 19132 0,149 0,133 T 0 0,5 / -0,229 0,965 / 0,198 0,019 S -0,232 0,974 /

434: 17922 0,206 0,012 S -0,002 0,52 / 0,541 0,037 S -0,017 0,757 / 0,028 0,3 /

435: 19719 0,301 0,016 S 0,074 0,178 T -0,395 0,988 / 0,112 0,246 / -0,031 0,608 /

436: 14274 0,03 0,411 / 0,131 0,087 T 0,429 0,009 S -0,086 0,948 / -0,181 0,968 /

436: 17336 0,425 0,021 S -0,129 0,934 / -0,343 0,949 / 0,09 0,143 T 0,018 0,443 /

(continuación)

437: 17735 -0,377 0,995 / -0,194 0,977 / 0,663 0,024 S -0,315 1 / -0,024 0,648 /

438: 19249 -0,284 0,977 / -0,166 0,768 / 0,337 0,046 S -0,101 0,796 / 0,053 0,076 T

439: 18513 0,194 0,202 / 0,096 0,112 T 0,248 0,159 T -0,13 0,676 / -0,072 0,802 /

440: 11517 -0,033 0,586 / 0,073 0,052 T 0,133 0,25 / 0,145 0,217 / -0,016 0,762 /

441: 12363 0,204 0,135 T -0,087 0,926 / 0,578 0,013 S 0,188 0,053 T 0,036 0,176 T

442: 12922 0,202 0,003 S -0,035 0,928 / 0,453 0,14 T 0,164 0,096 T 0,006 0,298 /

443: 15360 0,36 0,018 S -0,046 0,728 / -0,141 0,75 / 0,07 0,05 T 0,049 0,099 T

444: 16028 0,341 0,032 S -0,036 0,548 / 0,044 0,403 / 0,18 0,034 S -0,015 0,604 /

445: 16648 -0,49 0,989 / 0,033 0,374 / 0,471 0,025 S -0,169 0,8 / 0,018 0,228 /

446: 16705 0,227 0,072 T -0,168 0,985 / 0,502 S -0,228 0,996 / -0,045 0,932 /

447: 16715 0,011 0,442 / 0,059 0,161 T 0,485 0,042 S -0,087 0,724 / 0,058 0,03 S

448: 17316 -0,047 0,812 / 0,047 0,08 T 0,109 0,391 / -0,172 0,747 / 0,229 0,008 S

449: 17331 -0,451 0,979 / -0,156 0,916 / 0,001 S -0,11 0,761 / 0,043 0,069 T

450: 17339 0,306 0,026 S 0,152 0,024 S -0,738 0,936 S 0,095 0,369 / 0,008 0,356 /

451: 17420 -0,171 0,931 / -0,242 0,856 / 0,828 0,015 S -0,291 0,817 / -1,008 0,898 /

452: 17446 -0,226 0,909 / -0,038 0,673 / 0,302 0,026 S 0,145 0,118 T -0,001 0,522 /

453: 17487 -0,331 0,966 / 0,074 0,016 S 0,479 0,045 S -0,209 0,995 / 0,04 0,132 T

454: 17740 -0,036 0,641 / 0,016 0,414 / 0,763 0,057 T 0,087 0,15 T 0,095 0 S

455: 17752 0,35 0,041 S -0,107 0,673 / -0,619 0,915 / 0,343 0,004 S 0,022 0,294 /

(continuación)

456: 18021 -0,252 0,947 / -0,131 0,836 / 0,287 0,079 T -0,249 0,685 / -0,018 0,64 /

457: 18245 -0,227 0,99 / -0,031 0,629 / 0,422 0,011 S -0,126 0,758 / -0,048 0,827 /

458: 18617 -0,193 0,955 / -0,3 0,95 / 0,877 0,001 S -0,328 0,971 / 0,075 0,077 T

459: 18734 0,248 0,043 S 0,033 0,192 T -0,959 0,981 / 0,059 0,146 T -0,012 0,618 /

460: 18823 0,229 0,114 T 0,069 0,181 T -0,056 0,677 / 0,282 0,048 S 0,032 0,24 /

461: 19222 0,591 0,014 S 0,045 0,304 / -0,258 -0,767 / 0,156 0,1 T -0,076 0,698 /

462: 19430 0,362 0,024 S -0,02 0,776 / -0,751 0,857 / 0,036 0,281 / -0,231 0,848 /

K. Cribado de tolerancia a bajo nitrógeno

Bajo condiciones de bajo nitrógeno, los plantones de Arabidopsis se vuelven cloróticos y tienen menos biomasa. Este ejemplo expone el cribado de tolerancia a bajo nitrógeno para identificar plantas de Arabidopsis transformadas con el gen de interés que están alteradas en su capacidad para acumular biomasa y/o retener clorofila bajo

5 condición de bajo nitrógeno.

Se sembraron semillas T2 en placas que contenían 0,5x medio Hoagland libre de N T NH4NO3 0,1 mM T 0,1% de sacarosa T 1% de Phytagel y se cultivaron bajo condiciones de luz y temperatura convencionales. A los 12 días de crecimiento, las plantas se puntuaron para el estado de los plantones (es decir, viables o no viables) y la longitud de las raíces. Después de 21 días de crecimiento, las plantas se puntuaron para color visual, peso de los plantones,

10 número de hojas verdes, número de hojas en la roseta, longitud de las raíces y formación de capullos en floración. También se tomó una fotografía de cada planta en este momento de tiempo.

El peso de los plantones y la longitud de las raíces se analizaron como respuestas cuantitativas según el Ejemplo 1M. El número de hojas verdes, el número de hojas en la roseta y la formación de capullos de flores se analizaron como respuestas cualitativas según el Ejemplo 1L. Los inventores consideraron que las plantas transgénicas 15 crecieron mejor bajo la condición de bajo nitrógeno evidenciado porque tienen más hojas verdes u hojas más verdes en comparación con la referencia. Además, el cambio en la longitud de las raíces en cualquier dirección, es decir, tanto aumento como disminución, beneficiará el crecimiento de la planta. Las plantas transgénicas con aumento de la longitud de las raíces bajo una condición de bajo nitrógeno permitirán que las plantas obtengan nutriente de una distancia más alejada, mientras que las plantas transgénicas con disminución de la longitud de las raíces, a la vez

20 que mantiene un crecimiento sano evidenciado por las hojas verdes, pueden haber desarrollado un mecanismo intrínseco de usar eficientemente fuente de nitrógeno .

Tabla 13: Una lista de nucleótidos recombinantes que mejoran la tolerancia a la disponibilidad de bajo nitrógeno en plantas

SECPÉPID: Construcción_id Formación de capullos de flores Número de hojas verdes Longitud de las raíces Número de hojas en la roseta en el día 21 Peso de la roseta

media RS: valor de p c media RS valor de p c delta valor de p c media RS valor de p c delta valor de p c

241: 74518 -0,141 0,97 / -0,123 1 / 0,097 0,006 T -0,532 0,983 / 0,104 0,007 S

315: 12627 -0,881 1 / 1,713 0,001 S -0,222 0,052 S 1,622 0,008 S -0,037 0,136 /

316: 12813 -1,269 1 / 1,151 0,011 S -0,01 0,89 / 1,858 0,001 S 0,14 0 S

317: 14945 -1,131 1 / 0,899 0,014 S -0,056 0,486 / 0,305 0,289 / -0,038 0,587 /

318: 15345 -0,158 0,626 / 0,961 0,014 S -0,352 0,004 S -0,308 0,739 / 0,069 0,297 /

319: 15348 -0,582 0,937 / 0,755 0,015 S -0,17 0,082 T 0,923 0,046 S -0,033 0,214 /

320: 16325 -0,947 0,999 / 0,995 0,003 S -0,204 0,079 T 1,15 0,01 S -0,014 0,652 /

321: 16702 -0,315 0,997 / 0,567 0,023 S 0,16 0,01 S 0,572 0,071 T 0,012 0,614 /

322: 16836 -1,291 1 / 0,149 0,098 T 0,141 0,029 S 2,117 0 S 0,035 0,247 /

323: 17002 -1,153 1 / 0,32 0,013 S 0,209 0,007 S 1,818 0,001 S 0,131 0 S

324: 17012 -1,201 1 / 0,348 0,025 S 0,291 0,002 S 1,485 0,001 S 0,082 0,107 T

325: 17017 -0,352 1 / 0,982 0,003 S -0,112 0,159 T 0,276 0,127 T -0,009 0,725 /

326: 17344 -1,897 1 / 0,736 0,039 S 0,111 0,181 T 1,344 0,02 S 0,076 0,001 S

327: 17426 -1,364 1 / 1,185 0,002 S -0,218 0,008 S 0,814 0,094 T -0,076 0,034 /

328: 17655 -1,059 1 / 1,094 0,002 S -0,084 0,208 / 1,656 0 S 0,024 0,637 /

329: 17656 -1,309 1 / 0,465 0,04 S 0,107 0,228 / 1,317 0,001 S -0,046 0,058 /

330: 17906 -1,21 1 / 0,058 0,369 / 0,213 0 S 1,251 0,006 S 0,057 0,262 /

331: 18278 0,025 0,45 / 0,838 0,003 S 0,04 0,592 / 2,056 0,001 S 0,016 0,667 /

332: 18822 -0,47 1 / 0,697 0 S 0,189 0,29 S 1,17 0,001 S 0,048 0,07 T

333: 18881 1,062 0,022 S -0,365 0,949 / 0,08 0,211 / -1,211 1 / 0,006 0,845 /

334: 19213 -0,095 0,712 / -0,298 1 / 0,18 0,001 S -0,802 1 / 0,056 0,062 T

335: 19239 -0,187 0,931 / 1,466 0 S -0,104 0,186 T 1,297 0,006 S -0,048 0,187 /

336: 19247 -0,346 0,913 / 0,274 0,022 S 0,013 0,833 / 1,818 0,001 S 0,088 0,216 /

(continuación)

337: 19460 -0,526 0,994 / 1,427 0 S -0,004 0,932 / 0,952 0,01 S 0,003 0,952 /

338: 19512 -0,546 1 / 1,611 0 S 0,152 0,011 S 0,824 0,001 S 0,041 0,226 /

339: 19533 -0,283 0,929 / 1,909 0 S 0,072 0,353 / 1,904 0,001 S -0,002 0,952 /

340: 19603 -0,25 0,932 / 0,287 0,213 / 0,208 0,005 s 0,234 0,214 / 0,135 0,021 S

341: 72126 0,337 0,017 S -0,447 0,944 / -0,149 0,059 T 0,23 0,147 T 0,253 0 S

342: 72437 0,907 0,016 S -0,36 0,989 / 0,111 0,049 S -0,689 0,999 / 0,09 0,005 S

343: 72441 0,354 0,011 S 0,57 0,002 S -0,115 0,078 T 0,269 0,124 T -0,041 0,361

344: 72639 0,578 0,065 T -0,198 0,956 / 0,23 0,001 S -0,181 0,756 / 0,13 0,005 S

364: 19058 1,236 0,008 S -0,087 0,974 / -0,103 0,244 / -0,326 0,94 / 0,123 0,066 T

370: 16403 -0,972 1 / 0,63 0,023 S -0,182 0,006 S 1,751 0,002 S -0,028 0,202 /

371: 17737 -1,124 1 / 0,352 0,038 S 0,059 0,512 / 1,404 0,017 S -0,038 0,381 /

372: 18395 -0,567 1 / 0,522 0,023 S 0,182 0,004 S 0,935 0,007 S 0,027 0,318 /

373: 72772 0,439 0,019 S -0,113 0,827 / 0,211 0,006 S -0,141 0,739 / 0,106 0,006 S

376: 11409 0,001 0,498 / 0,327 0,094 T -0,069 0,316 / 0,264 0,287 / 0,008 0,843 /

438: 19249 -0,834 1 / 0,257 0,058 T 0,061 0,25 / 1,01 0,004 S 0,038 0,438 /

478: 72091 -0,803 1 / -0,273 1 / 0,526 0 S 1,033 0,029 s 0,167 0,003 S

L. Análisis estadístico para respuestas cualitativas

Tabla 14: Una lista de respuestas analizadas como respuestas cualitativas

repuesta: cribado categorías (éxito frente a fracaso)

puntuación de riesgo de respuesta de marchitamiento: cribado de tolerancia a la sequía marchitadas frente a no marchitadas

estado de crecimiento en el día 14: cribado de tolerancia al estrés por calor el 50% de plantas alcanza el estado 1,03 frente a no

estado de crecimiento en el día 14: cribado de tolerancia al estrés por sales el 50% de plantas alcanza el estado 1,03 frente a no

estado de crecimiento en el día 14: cribado de tolerancia al estrés osmótico inducido por PEG el 50% de plantas alcanza el estado 1,03 frente a no

estado de crecimiento en el día 7: cribado de tolerancia al estrés por germinación con frío el 50% de plantas alcanza el estado 0,5 frente a no

número de hojas en la roseta en el día 23: cribado de tolerancia a la sombra-luz tenue aparecieron 5 hojas frente a no

formación de capullos de flores en el día 23: cribado de tolerancia a la sombra-luz tenue aparecieron capullos de flores frente a no

ángulo de la hoja en el día 23: cribado de tolerancia a la sombra-luz tenue >60 grados frente a <60 grados

número de hojas verdes en el día 21: cribado de tolerancia a bajo nitrógeno aparecieron 6 ó 7 hojas frente a no

número de hojas en la roseta en el día 21: cribado de tolerancia a bajo nitrógeno aparecieron 6 ó 7 hojas frente a no

formación de capullos de flores en el día 21: cribado de tolerancia a bajo nitrógeno aparecieron capullos de flores frente a no

Las plantas se agruparon en grupos transgénicos y de referencia y se puntuaron como éxito o fracaso según la

Tabla 14. Primero se calculó el riesgo (R), que es la proporción de plantas que se puntuaron como plantas de

5 fracaso dentro del grupo. Luego se calculó el riesgo relativo (RR) como la relación de R (transgénicos) con respecto

a R (referencia). La puntuación de riesgo (PR) se calculó como -log2RR. Posteriormente, las puntuaciones de riesgo

de múltiples eventos para cada transgén de interés se evaluaron para significancia estadística por la prueba de la t

usando el software estadístico S-PLUS (S-PLUS 6, Guide to statistics, Insightful, Seattle, WA, EE.UU.). La PR con

un valor superior a 0 indica que las plantas transgénicas rinden mejor que la referencia. La PR con un valor inferior a 10 0 indica que las plantas transgénicas rinden peor que la referencia. La PR con un valor igual a 0 indica que el

rendimiento de las plantas transgénicas y la referencia no muestra ninguna diferencia.

M. Análisis estadístico para respuestas cuantitativas

Tabla 15: Una lista de respuestas analizadas como respuestas cuantitativas

respuesta: cribado

rendimiento de las semillas: cribado de tolerancia al estrés por sequía

peso de los plantones en el día 14: cribado de tolerancia al estrés por calor

longitud de las raíces en el día 14: cribado de tolerancia al estrés por calor

peso de los plantones en el día 14: cribado de tolerancia al estrés por sales

longitud de las raíces en el día 14: cribado de tolerancia

longitud de las raíces en el día 11: cribado de tolerancia al estrés por sales

peso de los plantones en el día 14: cribado de tolerancia al estrés osmótico inducido por PEG

(continuación)

respuesta: cribado

longitud de las raíces en el día 11: cribado de tolerancia al estrés osmótico inducido por PEG

longitud de las raíces en el día 14: cribado de tolerancia al estrés osmótico inducido por PEG

área de la roseta en el día 8: cribado de tolerancia al choque al frío

área de la roseta en el día 28: cribado de tolerancia al choque al frío

diferencia en el área de la rosea del día 8 al día 28: cribado de tolerancia al choque al frío

longitud de las raíces en el día 28: cribado de tolerancia al estrés por frío

peso de los plantones en el día 23: cribado de tolerancia a la sombra-luz tenue

longitud del peciolo en el día 23: cribado de tolerancia a la sombra-luz tenue

longitud de las raíces en el día 14: cribado de crecimiento y desarrollo temprano de la planta

peso de los plantones en el día14: cribado de crecimiento y desarrollo temprano de la planta

radio de la roseta en el día 25: cribado de crecimiento y desarrollo tardío de la planta

peso seco de la semilla en el día 58: cribado de crecimiento y desarrollo tardío de la planta

peso seco de la silicua en el día 53: cribado de crecimiento y desarrollo tardío de la planta

longitud de la silicua en el día 40: cribado de crecimiento y desarrollo tardío de la planta

peso de los plantones en el día 21: cribado de tolerancia a bajo nitrógeno

longitud de las raíces en el día 21: cribado de tolerancia a bajo nitrógeno

Las mediciones (M) de cada planta se transformaron por cálculo de log2. La delta se calculó como log2M(transgénico)-log2M(referencia). Posteriormente, la delta media de múltiples eventos del transgén de interés se evaluó para significancia estadística por la prueba de la t usando el software estadístico S-PLUS (S-PLUS 6, Guide

5 to statistics, Insightful, Seattle, WA, EE.UU.). Delta con un valor superior a 0 indica que las plantas transgénicas rinden mejor que la referencia. Delta con un valor inferior a 0 indica que las plantas transgénicas rinden peor que la referencia. Delta con un valor igual a 0 indica que el rendimiento de las plantas transgénicas y la referencia no muestra ninguna diferencia.

Ejemplo 2 Identificación de Homólogos

10 Se construyó una “Base de datos de todas las proteínas” que podía buscarse con BLAST a partir de secuencias de proteínas conocidas usando una base de datos de secuencias patentada y la base de datos de aminoácidos no redundantes (aa nr) del Centro nacional de información biotecnológica (NCBI). Para cada organismo a partir del cual se obtuvo una secuencia de ADN proporcionada en el presente documento se construyó una “Base de datos de proteínas de organismos” de secuencias de proteínas conocidas del organismo; la Base de datos de proteínas de

15 organismos es un subconjunto de la Base de datos de todas las proteínas basado en la ID de taxonomía de NCBI para el organismo.

La Base de datos de todas las proteínas se consultó usando la secuencia de aminoácidos de proteína relacionada para el ADN de gen usado en el ADN recombinante que mejora rasgos, es decir, secuencias de SEC ID Nº: 240 a SEC ID Nº: 478 usando “blastp” con corte del valor de e de 1e-8. Se mantuvieron hasta 1000 éxitos principales y se

20 separaron por nombres de organismos. Para cada organismo distinto del de la secuencia de consulta se mantuvo una lista para éxitos del propio organismo de consulta con un valor de e más significativo que el mejor éxito del organismo. La lista contiene genes probablemente duplicados, y se denomina la Lista núcleo. Se mantuvo otra lista para todos los éxitos de cada organismo, clasificada por valor de e, y denominada la Lista de éxitos.

La Base de datos de proteínas de organismos se consultó usando secuencias de aminoácidos de SEC ID Nº: 240 a

25 SEC ID Nº: 478 usando “blastp” con corte del valor de e de 1e-4. Se mantuvieron hasta 1000 éxitos principales. Se construyó una base de datos que podía buscarse con BLAST basándose en estos éxitos, y se denomina “SubDB”. SubDB se consultó con cada secuencia en la Lista de éxitos usando “blastp” con corte del valor de e de 1e-8. El éxito con el mayor valor de e se comparó con la Lista núcleo del organismo correspondiente. Se considera que el éxito es un ortólogo probable si pertenece a la Lista núcleo, de otro modo no se considera que sea un ortólogo

probable y no hay más búsqueda de secuencias en la Lista de éxitos para el mismo organismo. Se identificaron ortólogos probables de un gran número de organismos distintos y se informan por secuencias de aminoácidos de SEC ID Nº: 479 a SEC ID Nº: 12463. Estos ortólogos se informan en las Tablas 2 como homólogos a las proteínas relacionadas con genes usados en ADN recombinante que mejora rasgos.

5 Ejemplo 3 Construcción de la secuencia consenso

Se seleccionó el programa ClustalW para alineamientos de múltiples secuencias de la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 439 y 25 homólogos. Los tres factores principales que afectan espectacularmente los alineamientos de secuencias son (1) matrices de peso de proteínas; (2) penalización por abertura de hueco; (3) penalización por extensión de hueco. Las matrices de peso de proteínas disponibles para el programa ClustalW incluyen las series 10 Blosum, Pam y Gonnet. Se probaron ampliamente aquellos parámetros con penalización por abertura de hueco y penalización por extensión de hueco. Basándose en los resultados de prueba, la matriz de pesos de Blosum, la penalización por abertura de hueco de 10 y la penalización por extensión de hueco de 1 se eligieron para el alineamiento de múltiples secuencias. Se adjuntan las secuencias de SEC ID Nº: 439, sus homólogos y la secuencia consenso en el extremo. Los símbolos para la secuencia consenso son (1) letras en superíndice para el 100% de

15 identidad en todas posiciones de la salida de alineamiento de múltiples secuencias; (2) letras en subíndice para >=70% de identidad; símbolo; (3) “X” indicó <70% de identidad; (4) los guiones “-” que significan que los huecos estuvieron en >=70% de las secuencias.

Ejemplo 4 Construcción de transformación de maíz

Los vectores de destino GATEWAY™ (disponibles de Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) se construyeron para inserción de ADN que mejora rasgos para la transformación de maíz. Los elementos de cada vector de destino se resumen en la Tabla 16 más adelante e incluyen una región de transcripción del marcador de selección y una región de transcripción de la inserción de ADN. La región de transcripción del marcador de selección comprende un promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor operativamente ligado a un gen que codifica neomicina fosfotransferasa II (nptII), seguido de tanto la región de 3' del gen nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (nos) como de la región 3' del gen inhibidor II de proteinasa de patata (pinII). La región de transcripción de la inserción de ADN comprende un promotor de actina 1 de arroz, un potenciador 1 del intrón 1 del exón 1 de actina de arroz, un sitio de inserción flanqueado por att y la región 3' del gen pinII de patata. Siguiendo procedimientos convencionales proporcionados por Invitrogen, la región de inserción flanqueada por att se sustituye por recombinación con ADN que mejora rasgos, en una orientación sentido para la expresión de un proteína que mejora rasgos y en una orientación de supresión de genes (es decir, orientación tanto antisentido como en una orientación sentido y antisentido) para una supresión que mejora rasgos de una proteína. Aunque el vector con ADN que mejora rasgos insertado en la región de inserción flanqueada por att es útil para la transformación de plantas por administración de ADN directo, tal como bombardeo con microproyectiles, es preferible bombardear tejido de planta diana con unidades de transcripción en tándem que se han cortado del vector. Para transformación mediada por Agrobacterium de plantas, el vector también comprende fronteras de T-ADN de Agrobacterium que flanquean las unidades de transcripción.

Los vectores para transformación mediada por Agrobacterium se preparan con cada uno de los genes que mejoran rasgos que tienen una secuencia de SEC ID Nº: 1 a SEC ID Nº: 151 y SEC ID Nº: 153 a SEC ID Nº: 239 con el ADN únicamente en orientación sentido para la expresión de la proteína que mejora rasgos relacionada y en una orientación de supresión de genes para supresión de la proteína relacionada. Cada vector se transforma en callo de maíz que se propaga en una planta que se cultiva para producir semilla transgénica. Las plantas de la progenie son autopolinizadas para producir semilla que se selecciona para semilla homocigótica. La semilla homocigótica se usa para producir plantas endogámicas, para la introgresión del rasgo en líneas de élite y para cruzar para producir semilla híbrida. Las plantas transgénicas de progenie que comprenden el ADN que mejora rasgos con una secuencia de SEC ID Nº: 1 a SEC ID Nº: 151 y SEC ID Nº: 153 a SEC ID Nº: 239 tienen uno o más rasgos mejorados que incluyen, pero no se limitan a, aumento del rendimiento y los desvelados en la Tabla 3. El maíz transgénico que incluye endogámico e híbridos también se producen con ADN a partir de cada uno de los homólogos identificados y proporcionan semillas para plantas con el rasgo mejorado del ADN relacionado de SEC ID Nº: 1 a SEC ID Nº: 151 y SEC ID Nº: 153 a SEC ID Nº: 239. También se producen plantas de maíz transgénico cuando el ADN que mejora rasgos es transcrito por cada uno de los promotores del grupo seleccionado de un promotor de globulina 1 de maíz, un promotor de oleosina de maíz, un promotor de glutelina 1, un promotor de aldolasa, un promotor Z27 de zeína, un promotor de piruvato ortofosfato dicinasa (PPDK), un promotor alfa 7S de soja, un promotor del antioxidante peroxirredoxina (Per1) y un promotor 35S de CaMV.

La semilla producida por las plantas se proporciona a los agricultores para permitir la producción de cultivos de maíz con rasgos mejorados asociados al ADN que mejora rasgos.

Tabla 16: Elementos de un vector de transformación de maíz a modo de ejemplo

FUNCIÓN: ELEMENTO REFERENCIA

región de transcripción de la inserción de ADN: Promotor de actina 1 de arroz Patente de EE.UU. 5.641.876

Potenciador 1 del intrón 1 del exón 1 de actina de arroz: Patente de EE.UU. 5.641.876

región de transcripción de la inserción de ADN (región de inserción flanqueada por att): AttR1 Manual de instrucciones de GATEWAY™ Cloning Technology

gen CmR: Manual de instrucciones de GATEWAY™ Cloning Technology

genes ccdA, ccdB: Manual de instrucciones de GATEWAY™ Cloning Technology

attR2: Manual de instrucciones de GATEWAY™ Cloning Technology

región de transcripción de la inserción de ADN: Región 3' de pinII de patata An y col. (1989) Plant Cell 1:115122

región de transcripción del marcador de selección: Promotor 35S de CaMV Patente de EE.UU. 5.858.742

Marcador de selección nptII: Patente de EE.UU. 5.858.742

Región 3' de nos: Patente de EE.UU. 5.858.742

Región 3' de PinII: An y col. (1989) Plant Cell 1:115122

región de mantenimiento de E. coli: Origen de replicación ColE1

Origen de replicación F1

Resistencia a ampicilina Bla

Ejemplo 5 Construcción de transformación de soja

Las construcciones para su uso en la transformación de soja pueden prepararse por clonación basada en enzima de restricción en un vector de expresión común. Elementos de un vector de expresión común a modo de ejemplo se 5 muestran en la Tabla 17 más adelante e incluyen un casete de expresión del marcador de selección y un gen del casete de expresión de interés. El casete de expresión del marcador de selección comprende el promotor del gen act 7 de Arabidopsis (AtAct7) con intrón y 5'UTR, el péptido de tránsito de Arabidopsis EPSPS, la región codificante CP4 sintética con uso de codón preferido dicotiledóneo y una 3' UTR del gen nopalina sintasa. El gen del casete de expresión de interés comprende un promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor operativamente ligado a un gen

10 que mejora rasgos en una orientación sentido para la expresión de una proteína que mejora rasgos y en una orientación de supresión de genes (es decir, orientación tanto antisentido como en una orientación sentido y antisentido) para una supresión que mejora rasgos de una proteína.

Pueden construirse vectores similares a los descritos anteriormente para su uso en sistemas de transformación de soja mediados por Agrobacterium, teniendo cada ADN que mejora rasgos una secuencia de SEC ID Nº: 1 a SEC ID 15 Nº: 151 y SEC ID Nº: 153 a SEC ID Nº: 239 con el ADN únicamente en orientación sentido para la expresión de la proteína relacionada y en una orientación de supresión de genes para la supresión de la proteína relacionada. Las plantas de soja transgénica que se producen que comprenden el ADN que mejora rasgos con una secuencia de SEC ID Nº: 1 a SEC ID Nº: 151 y SEC ID Nº: 153 a SEC ID Nº: 239 tienen uno o más rasgos mejorados que incluyen, pero no se limitan a, los desvelados en la Tabla 3 y el aumento del rendimiento. Las plantas de soja 20 transgénica también se producen con ADN de cada uno de los homólogos identificados y proporcionan semillas para plantas con rasgo mejorado del ADN relacionado de SEC ID Nº: 1 a SEC ID Nº: 151 y SEC ID Nº: 153 a SEC ID Nº:

239. También se producen plantas de soja transgénica en la que el ADN que mejora rasgos es transcrito por un promotor deseable que incluye, pero no se limita a, el promotor 35S potenciado, promotor de napina y promotor SSU de Arabidopsis.

25 La semilla producida por las plantas se proporciona a los agricultores para permitir la producción de cultivos de soja con rasgos mejorados asociados al ADN que mejora rasgos.

TABLA 17: Elementos de una construcción de transformación de soja a modo de ejemplo

Función: Elemento Referencia

Transformación por Agro: Frontera derecha de B-ARGtu. Depicker, A. y col. (1982) Mol Appl Genet 1:561-573

Resistencia a antibióticos: CR-Ec.aadA-SPC/STR

Represor de cebadores del plásmido ColE1: CR-Ec.rop

Origen de replicación: OR-Ec.oriV-RK2

Transformación por Agro: Frontera izquierda de B-ARGtu. Barker, R.F. y col. (1983) Plant Mol Biol 2:335-350

Casete de expresión del marcador de selección de planta: Promotor del gen act 7 de Arabidopsis (AtAct7) con intrón y 5'UTR McDowell y col. (1996) Plant Physiol. 111:699-711.

5'UTR del gen act 7 de Arabidopsis

Intrón en 5'UTR de AtAct7

Región de péptido de tránsito de Arabidopsis EPSPS: Klee, H.J. y col. (1987) MGG 210:437-442

Región codificante CP4 sintética con uso de codón preferido dicotiledóneo

Una 3'UTR del gen nopalina sintasa del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens: Patente de EE.UU. 5.858.742

Gen de la planta del casete de expresión de interés: Promotor para ARN 35S de CaMV que contiene una duplicación de la región -90 a 350 Patente de EE.UU. 5.322.938

Gen del sitio de inserción de interés

Extremo 3' de E6 de algodón: Acceso de GenBank U30508

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Una semilla transgénica para un cultivo, en la que el genoma de dicha semilla transgénica comprende ADN recombinante que mejora rasgos de un gen para una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos el 90% de identidad con SEC ID Nº: 408.
2.

La semilla transgénica según la reivindicación 1, en la que dicha proteína tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 408.
3.

La semilla transgénica según la reivindicación 1, en la que dicho ADN recombinante se usa para producir dicha proteína.
4.

La semilla transgénica según la reivindicación 1, en la que

(a)

dicha proteína tiene la función de una proteína específica que se ha demostrado en una planta modelo con eficacia para un rasgo mejorado en comparación con una planta sin dicho ADN recombinante en la que dicho rasgo es tolerancia al estrés por sequía; y

(b)

plantas transgénicas cultivadas a partir de dicha semilla transgénica presentan tolerancia al estrés por sequía.
5.

La semilla transgénica según la reivindicación 1, en la que

(a)

dicho cultivo es susceptible a un entorno de estrés por sequía; y

(b)

plantas transgénicas cultivadas a partir de dicha semilla transgénica prosperan en dicho entorno de estrés por sequía.
6.

La semilla transgénica según la reivindicación 1, en la que plantas transgénicas cultivadas a partir de dicha semilla presentan tolerancia al estrés por sequía en comparación con plantas similares sin el ADN recombinante cuando dichas plantas se cultivan en un entorno de estrés por sequía y dicha proteína tiene la función de la proteína con una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 408.
7.

Una construcción de ADN recombinante que comprende un promotor funcional en una célula de planta operativamente ligado un ADN recombinante que mejora rasgos de un gen para una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos el 90% de identidad con SEC ID Nº: 408.
8.

La construcción de ADN recombinante según la reivindicación 7, en la que dicha proteína tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 408.
9.

La construcción de ADN recombinante según la reivindicación 7, en la que dicho ADN recombinante se usa para producir dicha proteína.
10.

Una planta de cultivo transgénico o progenie de la misma que comprende en su genoma la construcción de ADN recombinante que mejora rasgos como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.
11.

Un procedimiento para preparar una planta de cultivo transgénico que comprende introducir la construcción de ADN recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 en el genoma de una línea de planta diana.