BRPI0607378A2

BRPI0607378A2 - cassetes de expressço, seqÜÊncia nucleotÍdica isolada, vetor, cÉlula hospedeira transgÊnica ou organismo nço humano, cÉlula de planta ou planta transgÊnica, mÉtodos para identificar e/ou isolar uma seqÜÊncia nucleotÍdica reguladora da transcriÇço, para prover ou produzir um cassete de expressço transgÊnica, e para prover uma seqÜÊncia nucleotÍdica reguladora de transcriÇço sintÉtica, e, seqÜÊncia reguladora de transcriÇço sintÉtica

Info

Publication number: BRPI0607378A2
Application number: BRPI0607378-6A
Authority: BR
Inventors: Elke Duwenig; Linda Patricia Loyall
Original assignee: Basf Plant Science Gmbh
Priority date: 2005-02-26
Filing date: 2006-02-24
Publication date: 2010-03-23
Also published as: AU2006217847A1; EP1856264B1; CN101128591B; CA2598307C; CA2598307A1; US9267147B2; CN101128591A; WO2006089950A2; WO2006089950A3; US20090031440A1; AU2006217847B2; US20130019343A1; EP1856264A2

Abstract

CASSETES DE EXPRESSçO, SEQUENCIA NUCLEOTIDICA ISOLADA, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA TRANSGÊNICA OU ORGANISMO NçO HUMANO, CÉLULA DE PLANTA OU PLANTA TRANSGÊNICA, MÉTODOS PARA IDENTIFICAR E/OU ISOLAR UMA SEQUENCIA NUCLEOTÍDICA REGULADORA DA TRANSCRIÇçO, PARA PROVER OU PRODUZIR UM CASSETE DE EXPRESSçO TRANSGÊNICA, E PARA PROVER UMA SEQÜÊNCIA NUCLEOTÍDICA REGULADORA DE TRANSCRIÇçO SINTÉTICA, E, SEQÜÊNCIA REGULADORA DE TRANSCRIÇçO SINTÉTICA. A presente invenção refere-se a cassetes de expressão compreendendo seqúéncias nucleotídicas reguladoras de transcrição com perfis de expressão preferenciais de semente ou específicos de semente em plantas obteníveis a partir do gene de Arabidopsis thaliana descrito pelo locus Atlg48130 ou seus ortólogos de outras espécies de plantas (como Linum usitatissimum). As seqúéncias nucleotídicas reguladoras de transcrição preferivelmente demonstram uma forte atividade de expressão especialmente em sementes e tecidos de semente.

Description

"CASSETES DE EXPRESSÃO, SEQÜÊNCIA NUCLEOTÍDICAISOLADA, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA TRANSGENICA OUORGANISMO NÃO HUMANO, CÉLULA DE PLANTA OU PLANTATRANSGENICA, MÉTODOS PARA IDENTIFICAR E/OU ISOLAR UMASEQÜÊNCIA NUCLEOTÍDICA REGULADORA DA TRANSCRIÇÃO,PARA PROVER OU PRODUZIR UM CASSETE DE EXPRESSÃOTRANSGENICA, E PARA PROVER UMA SEQÜÊNCIANUCLEOTÍDICA REGULADORA DE TRANSCRIÇÃO SINTÉTICA, E,SEQÜÊNCIA REGULADORA DE TRANSCRIÇÃO SINTÉTICA"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a cassetes de expressãocompreendendo seqüências nucleotídicas reguladoras de transcrição comperfis de expressão preferencial de semente ou específica de semente emplantas obteníveis a partir do gene de Arabidopsis thaliana descrito pelo locusAtlg48130 ou seus ortólogos de outras espécies de plantas (como Linumusitatissimum). As seqüências nucleotídicas reguladoras de transcriçãopreferivelmente demonstram uma atividade de expressão especialmente emsementes e tecidos de semente.

ANTECEDENTES INVENÇÃO

Manipulação de plantas para alterar e/ou melhorar ascaracterísticas fenotípicas (como produtividade ou qualidade) requer aexpressão de genes heterólogos em tecidos de plantas. Esta manipulaçãogenética baseia-se na disponibilidade de um meio para dirigir e controlar aexpressão do gene como requerido. Por exemplo, manipulação genéticabaseia-se na disponibilidade e uso de promotores apropriados que são efetivosem plantas e que regulam expressão de gene de modo a dar os desejadosefeito(s) na planta transgênica.

Os promotores preferenciais de semente ou específicos desemente são úteis para expressar genes assim como para produzir quantidadesgrandes de proteína, para expressar óleos ou proteínas de interesse, porexemplo, anticorpos, genes para aumentar o valor nutricional da semente esemelhantes. É vantajoso assim escolher uma variedade de promotoresdiferentes de modo que o promotor mais apropriado possa ser selecionado para um gene em particular, construção, célula, tecido, planta ou meioambiente. Além disso, o interesse crescente na co- transformação de plantascom unidades múltiplas de transcrição de plantas (PTU) e os problemas empotencial associados com o uso de seqüências regulatórias comuns para estesfins merecem ocasionar a disponibilidade de várias seqüências de promotor.

Assim, se tem uma grande necessidade na arte para aidentificação de novas seqüências que podem ser usadas para a expressão detransgenes selecionados em plantas economicamente importantes. Assim éum objetivo da presente invenção prover novos e alternativos cassetes deexpressão para expressão preferencial de semente ou específica de semente de transgenes em plantas. O objetivo é resolvido pela presente invenção.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Uma primeira forma de realização da invenção refere-se a umcassete de expressão para regular a expressão preferencial de semente ouespecífica de semente em plantas compreendendo

i) pelo menos uma seqüência nucleotídica reguladora datranscrição de um gene codificando uma proteína peroxiredoxina (PER1), efuncionalmente ligada à mesma,

ii) pelo menos uma seqüência de ácido nucleico que éheteróloga com relação à referida seqüência nucleotídica reguladora da transcrição.

Preferivelmente, o cassete de expressão da invençãocompreende

a) pelo menos uma seqüência nucleotídica reguladora datranscrição de um gene de planta, referido gene de planta selecionado dentre ogrupo consistindo de

i) o gene descrito pelo loci do genoma de Arabidopsis thalianado GenBank Atlg48130, e

ii) genes ortólogos do gene descrito pelo loci do genoma deArabidopsis thaliana do GenBank Atlg48130,

e funcionalmente ligado ao mesmo

b) pelo menos uma seqüência de ácido nucleico que éheteróloga com relação à referida seqüência nucleotídica reguladora datranscrição.

A seqüência nucleotídica reguladora da transcrição pode serobtida ou é obtenível a partir de DNA genômico de planta de um genecodificando um polipeptídeo que

a) compreende pelo menos um motivo de seqüênciaselecionado dentre o grupo consistindo das seqüências de aminoácido

i) GDTVPNL (SEQ ID NO: 37), preferivelmenteMPG(I/L)T(L/I)GDTVPNLE (SEQ ID NO: 38),

ii) GDFTPVC (SEQ ID NO: 39), preferivelmenteLFSHPGDFTPVCTTEL (SEQ ID NO: 40),

iii) VKLLGLS (SEQIDNO:41), preferivelmenteRGVKLLGLSCDD (SEQ ID NO: 42),

iv) YPI(I/M)ADP (SEQ ID NO: 43), preferivelmenteSKV(T/N)YPI(I/M)ADP (SEQ ID NO: 44),

v) KLSFLYP (SEQ ID NO: 45), preferivelmente(K/V)(I/V)KLSFLYPS (SEQ ID NO: 46),

vi) GRNMDEV (SEQ ID NO: 47), preferivelmenteTGRNMDEV(L/V)RA (SEQ ID NO: 48),

vii) (I/V)ATP(V/A)NW (SEQ ID NO: 49), preferivelmenteK(I/V)ATP(V/A)NW(K/N)P (SEQ ID NO: 50), e

viii) PSKKGYL (SEQ ID NO: 51), preferivelmenteLPSKKGYLR (SEQ ID NO: 52),ou

b) tem pelo menos 50% identidade de seqüência deaminoácido para um polipeptídeo selecionado dentre o grupo descrito porSEQ ID NO: 13, 15, 17, 19, 21, e 23.

Preferivelmente, o cassete de expressão compreende aseqüência nucleotídica reguladora da transcrição, que é obtida ou é obtenívela partir de DNA genômico de planta de um gene codificando um polipeptídeo(preferivelmente uma proteína ortóloga) que

ii) GDFTPVC (SEQ ID NO: 39), preferivelmenteLFSHPGDFTPVCTTEL (SEQ ID NO: 40),

iii) VKLLGLS (SEQ ID NO: 41),preferivelmente RGVKLLGLSCDD (SEQ ID NO: 42),

v) KLSFLYP (SEQ ID NO: 45), preferivelmente(K/V)(I/V)KLSFLYPS (SEQ ID NO: 46),

vi) GRNMDEV (SEQ ID NO: 47), preferivelmenteTGRNMDEV(L/V)RA (SEQ ID NO: 48),

vii) (I/V)ATP(V/A)NW (SEQ ID NO: 49), preferivelmente K(I/V)ATP(V/A)NW(K/N)P (SEQ ID NO: 50), e

viii) PSKKGYL (SEQ ID NO: 51), preferivelmenteLPSKKGYLR (SEQ ID NO: 52),

e

Preferivelmente, referida proteína ortóloga tem ainda a mesmaatividade enzimática que a da proteína codificada por locus de Arabidopsisthaliana Atlg48130.

Preferivelmente, a seqüência nucleotídica reguladora datranscrição é selecionada dentre o grupo de seqüências consistindo de

i) a seqüência descrita por SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou 11,

ii) um fragmento de pelo menos 50 bases consecutivas de uma seqüência sob i),

iii) uma seqüência nucleotídica tendo similaridade substancialcom uma identidade de seqüência de pelo menos 50% para uma seqüêncianucleotídica reguladora da transcrição descrita por SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9, 10, ou 11;

iv) uma seqüência nucleotídica capaz de hibridizar(preferivelmente sob condições equivalentes à hibridização em dodecil sulfatode sódio a 7% (SDS), 0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 2X SSC, 0,1% SDS a 50°C, mais desejavelmente em dodecil sulfato de sódio a7% (SDS), 0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 1 X SSC,0,1% SDS a 50°C, mais desejavelmente ainda em dodecil sulfato de sódio a7% (SDS), 0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 0,5 X SSC,0,1% SDS a 50°C, preferivelmente em dodecil sulfato de sódio a 7% (SDS),0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 0,1 X SSC, 0,1% SDS a50°C, mais preferivelmente em dodecil sulfato de sódio a 7% (SDS), 0,5 MNaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 0,1 X SSC, 0,1% SDS a 65°C)para uma seqüência nucleotídica reguladora da transcrição descrita por SEQID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou 11, ou o seu complemento;

v) uma seqüência nucleotídica capaz de hibridizar(preferivelmente sob condições equivalentes à hibridização em dodecil sulfatode sódio a 7% (SDS), 0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 2X SSC, 0,1% SDS a 50°C, mais desejavelmente em dodecil sulfato de sódio a7% (SDS), 0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 1 X SSC,0,1%) SDS a 50°C, mais desejavelmente ainda em dodecil sulfato de sódio a7% (SDS), 0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 0,5 X SSC,* 0,1%) SDS a 50°C, preferivelmente em dodecil sulfato de sódio a 7% (SDS),0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 0,1 X SSC, 0,1% SDS a50°C, mais preferivelmente em dodecil sulfato de sódio a 7% (SDS), 0,5 MNaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 0,1 X SSC, 0,1% SDS a 65°C)para um ácido nucleico compreendendo 50 a 200 ou mais nucleotídeosconsecutivos de uma seqüência nucleotídica reguladora da transcrição descritapor SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou 11, ou o seu complemento;

vi) uma seqüência nucleotídica que é o complemento oucomplemento reverso de qualquer uma das seqüências nucleotídicaspreviamente mencionadas sob i) a v).

Em uma forma de realização preferidas, as seqüênciasespecificadas sob ii), iii), iv) v) e vi) acima são capazes de modificartranscrição em uma célula de planta ou organismo, preferivelmente referidasseqüências tem substancialmente a mesma atividade reguladora de transcriçãocomo a seqüência nucleotídica reguladora da transcrição descrita por SEQ IDNO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou 11.

Preferivelmente, uma seqüência nucleotídica tendosimilaridade substancial a uma seqüência nucleotídica reguladora datranscrição descrita por SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou 11 temuma identidade de seqüência de pelo menos 50% ou 60%, preferivelmentepelo menos 70% ou 80%), mais preferivelmente pelo menos 90% ou 95%, omais preferivelmente pelo menos 98%) to uma seqüência descrita por SEQ IDNO: 1,2,3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou 11.Preferivelmente, hibridização é realizada sob condiçõesestringentes (incluindo condições de estringência baixa e elevada), maispreferivelmente sob condições de estringência elevada.

A seqüência nucleotídica heteróloga a ser expressada empreferivelmente ainda mais operativamente ligada regiões 3' não traduzidas,terminação transcrição e/ou sinais de poliadenilação. As regiões -nãotraduzidas 3' são apropriadas para estabilizar a expressão e estrutura demRNA. Isto pode resultar em presença prolongada do mRNA e assim níveisde expressão melhorados. A terminação e sinais de poliadenilação sãoapropriados para estabilizar a expressão de mRNA, para assegurar umcomprimento do transcrito de mRNA constante e para evitar a transcrição deleitura completa. Especialmente em construções de expressão de multigenes,isto é um aspecto importante. Além disso, a terminação correta de transcriçãoestá ligada a uma re-iniciação de transcrição da seqüência de nucleotídeo 5'regulatória resultando em níveis de expressão melhorados. Os sinais acimamencionados podem ser qualquer sinal funcional em plantas e pode porexemplo ser isolado de genes de planta, genes de vírus de plantas, ou outrospatógenos de plantas. No entanto, em uma forma de realização preferida, asregiões não traduzidas 3', terminação de transcrição e sinais de poliadenilação são de genes empregados como a fonte para os promotores desta invenção.

O cassete de expressão pode ser empregado para numerososfins de expressão, como por exemplo expressão de uma proteína, ouexpressão de um RNA anti-sentido, RNA sentido ou filamento duplo.Preferivelmente, a expressão da seqüência de ácido nucleico confere à plantaum traço agronomicamente valioso.

Outras formas de realização da invenção referem-se a vetorescompreendendo um cassete de expressão da invenção, e célula hospedeiratransgênica ou organismo não humano compreendendo um cassete deexpressão ou um vetor da invenção. Preferivelmente o organismo é umaplanta. Mais preferivelmente uma planta usada para produção de óleo como -por exemplo - Brassica napus, Brassica juncea, Linum usitatissimum, soja, ougirassol.

Outra forma de realização preferidos da invenção refere-se aum método para identificar e/ou isolar a seqüência nucleotídica reguladora datranscrição caracterizado em que referida identificação e/ou isolamento utilizaa seqüência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo como descrito porSEQ ID NO: 13, 15, 17, 19, 21, ou 23, ou uma parte de pelo menos 15nucleotídeos consecutivos de referida seqüência de ácido nucleico.Preferivelmente a seqüência de ácido nucleico utilizada para o isolamento édescrita por SEQ ID NO: 12, 14, 16, 18, 20, ou 22 ou uma parte de pelomenos 15 nucleotídeos consecutivos da mesma. Mais preferivelmente,referida identificação e/ou isolamento é realizado por um método selecionadodentre reação em cadeia da polimerase, hibridização, e triagem de base dedados.

Outra forma de realização da invenção refere-se a um métodopara prover ou produzir um cassete de expressão transgênica para expressãoheteróloga em plantas compreendendo as etapas de:

I. isolar uma seqüência nucleotídica reguladora da transcriçãode um gene de planta utilizando pelo menos uma seqüência de ácido nucleicocodificando um polipeptídeo descrito por SEQ ID NO: 13, 15, 17, 19, 21, ou23, ou uma parte de pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos de referidaseqüência de ácido nucleico, e

II. funcionalmente ligar referida seqüência nucleotídicareguladora da transcrição a outra seqüência nucleotídica de interesse, que éheteróloga com relação à referida seqüência nucleotídica reguladora datranscrição.

Outra forma de realização da invenção refere-se a um métodopara prover um cassete de expressão transgênica para expressão preferencialde semente ou específica de semente compreendendo as etapas de:

I. isolar de uma seqüência nucleotídica reguladora datranscrição preferencial de semente ou específica de semente utilizando pelomenos uma seqüência de ácido nucleico ou uma parte da mesma, em quereferida seqüência está codificando um polipeptídeo descrito por SEQ ID NO:8, 10,12, 14, 16, 18, ou 36, ou uma parte de pelo menos 15 nucleotídeosconsecutivos do mesmo, e

II. funcionalmente ligar referida seqüência nucleotídicareguladora da transcrição preferencial de semente ou específica de semente a outra seqüência nucleotídica de interesse, que é heteróloga com relação àreferida seqüência nucleotídica reguladora da transcrição preferencial desemente ou específica de semente.

Preferivelmente, a seqüência nucleotídica utilizada paraisolamento de referida seqüência nucleotídica reguladora da transcrição estácodificando um polipeptídeo compreendendo pelo menos um motivo deseqüência selecionado dentre o grupo consistindo das seqüências deaminoácido

ii) GDFTPVC (SEQ ID NO: 39), preferivelmenteLFSHPGDFTPVCTTEL (SEQ ID NO: 40),

iii) VKLLGLS (SEQ ID NO: 41),preferivelmente RGVKLLGLSCDD (SEQ ID NO: 42),

v) KLSFLYP (SEQ ID NO: 45), preferivelmente(K7V)(I/V)KLSFLYPS (SEQ ID NO: 46),

vi) GRNMDEV (SEQ ID NO: 47), preferivelmenteTGRNMDEV(L/V)RA (SEQ ID NO: 48),vii) (I/V)ATP(V/A)NW (SEQ ID NO: 49), preferivelmenteK(I/V)ATP(V/A)NW(K/N)P (SEQ ID NO: 50), e

viii) PSKKGYL (SEQ ID NO: 51), preferivelmenteLPSKKGYLR (SEQ ID NO: 52).

Algumas das seqüências reguladoras de transcrição aquiprovidas são novas como tal e não foram previamente descritas na arte.Assim, outra forma de realização da invenção refere-se a uma seqüênciaisolada nucleotídica (preferivelmente tendo atividade reguladora detranscrição, mais preferivelmente tendo atividade de promotor) selecionadadentre o grupo de seqüências consistindo de:

a) a seqüência como descrita por SEQ ID NO: 1, 2, 3, ou 4, eseqüências tendo uma identidade de pelo menos 99%, preferivelmente 99,5%,mais preferivelmente 99,8% para uma seqüência como descrita por SEQ IDNO: 1, 2, 3, ou 4, e seqüências compreendendo pelo menos 600 nucleotídeosconsecutivos, preferivelmente pelo menos 800 nucleotídeo consecutivo, maispreferivelmente pelo menos 900 nucleotídeos consecutivos, maispreferivelmente pelo menos 1000 nucleotídeos consecutivos de umaseqüência como descrita por SEQ ID NO: 1, 2, 3, ou 4, e

b) a seqüência como descrita por SEQ ID NO: 9, 10, ou 11, eseqüências tendo uma identidade de pelo menos 40% ou 50%,preferivelmente 60% ou 70%, mais preferivelmente 80 ou 90%, o maispreferivelmente 95% ou 98% para uma seqüência como descrita por SEQ IDNO: 5 ou 26, e seqüências compreendendo pelo menos 15 ou 20 nucleotídeosconsecutivos, preferivelmente pelo menos 50 ou 100 nucleotídeo consecutivo,mais preferivelmente pelo menos 250 nucleotídeos consecutivos, maispreferivelmente pelo menos 500 nucleotídeos consecutivos de uma seqüênciacomo descrita por SEQ ID NO: 9, 10, ou 11.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Fig. 1: Alinhamento da proteína peroxiredoxina putativa(PER1) (Atlg48130 proteína) de Arabidopsis com seus ortólogos de váriasespécies incluindo Brassica napus, Triticum turgidum, Hordeum vulgare,Bromus secalinus e Linum usitatissimum.

Fig 2: Seqüência da seqüência nucleotídica reguladora datranscrição de Linum usitatissimum. As três regiões de promotor comdensidade diferentes de motivos de promotor estão em caixas (A, B, C). Paraexplanação detalhada dos motivos sublinhados, ver exemplo 8.

DEFINIÇÕES

Deve-se entender que esta invenção não é limitada à metodologia particular, protocolos, linhagens de células, espécies de plantas,ou gêneros, construções, e reagentes descritos como tal. Também deve-seentender que a terminologia usada aqui é para o fim de descrever formas derealização particulares somente, e não se destina a limitar o escopo dapresente invenção que será limitada somente pelas reivindicações anexas.

Deve-se notar que como usado aqui e nas reivindicações, as formas singulares"um" , "e" e "o" incluem referências no plural, salvo se o contexto ditarclaramente de outro modo. Assim, por exemplo, referência a um "vetor" éuma referência a um ou mais vetores e inclui seus equivalentes bemconhecidos dos versados, e assim em diante.

O termo "cerca de" é usado aqui para significaraproximadamente, grosseiramente, em torno de, ou na região de. Quando otermo "cerca de" é usado em conjunto com uma faixa numérica, ele modificaesta faixa por extensão dos limites acima e abaixo dos valores numéricosdados. Geralmente, o termo "cerca de" é usado para modificar um valornumérico acima e abaixo do valor dado por uma variância de 20 por cento,preferivelmente 10 por cento para cima ou para baixo (maior ou menor).

Como usado aqui, a palavra "ou" significa qualquer número deuma lista em particular e também inclui qualquer combinação de membrosdesta lista.O termo "gene" é usado amplamente para fazer referência aqualquer segmento de ácido nucleico associado com uma função biológica.Assim, genes incluem seqüências de codificação e/ou as seqüênciasregulatórias requeridas para sua expressão. Por exemplo, gene refere-se a umfragmento de ácido nucleico que expressa mRNA ou RNA funcional, oucodifica uma proteína específica, e que inclui seqüências regulatórias. Osgenes também incluem segmentos de DNA não expressados que, porexemplo, formam seqüências de reconhecimento para outras proteínas. Osgenes podem ser obtidos de várias fontes, incluindo clonagem de uma fontede interesse ou sintetizando de informação de seqüência conhecida ouprevista, e podem incluir seqüências projetadas para ter parâmetros desejados.

O termo gene "nativo" ou "tipo selvagem" refere-se a um geneque está presente no genoma de uma célula não transformada, isto é, umacélula não tendo uma mutação conhecida.

Um "gene marcador" codifica um traço selecionável ou triável.

O termo "gene quimérico" refere-se a qualquer gene quecontém

1) seqüências de DNA, incluindo seqüências regulatórias e decodificação, que não são encontradas juntas na natureza, ou

2) seqüências codificando partes de proteínas não naturalmenteunidas, ou

3) partes de promotores que não são naturalmente unidas.

Assim, um gene quimérico pode compreender seqüênciasregulatórias e seqüências de codificação que são derivadas de fontesdiferentes, ou compreendem seqüências regulatórias, e seqüências decodificação derivadas da mesma fonte, mas dispostas em um modo diferentedo encontrado na natureza.

Um "transgene" se refere a um gene que foi introduzido nogenoma por transformação e é estavelmente mantido. Os transgenes podemincluir, por exemplo, genes que são ou heterólogos ou homólogos aos genesde uma planta particular a ser transformada. Além disso, os transgenes podemcompreender genes nativos inseridos em um organismo não nativo, ou genesquiméricos. O termo "gene endógeno" se refere a um gene nativo em seulocal natural no genoma de um organismo. Um gene "estranho" refere-se aum gene não normalmente encontrado no organismo hospedeiro mas que éintroduzido por transferência de gene.

Um "oligonucleotídeo" correspondendo a uma seqüêncianucleotídica da invenção, por exemplo para uso em reações de amplificaçãoou sondagem, pode ter cerca de 30 ou menos nucleotídeos em comprimento(por exemplo, 9, 12, 15, 18, 20, 21, 22, 23, ou 24, ou qualquer número entre 9e 30). Geralmente, os iniciadores específicos vão até 14 nucleotídeos nocomprimento. Para uma especificidade ótima e eficácia de custo, osiniciadores de 16 a 24 nucleotídeos no comprimento podem ser preferidos. Osversados na arte são bem versados no projeto de iniciadores para uso nosprocessos como PCR. Se requerido, a sondagem pode ser feita comfragmentos de restrição completos do gene descrito aqui que pode ter 100'sou mesmo 1000's nucleotídeos em comprimento.

Os termos "polipeptídeo", "peptídeo", "oligopeptídeo","polipeptídeo", "produto de gene ", "produto de expressão" e "proteína" sãousados de modo interpermutável para fazer referência a um polímero ouoligômero de resíduos de aminoácidos consecutivos. Como usado aqui, otermo „seqüência de aminoácido" ou uma „seqüência de polipeptídeo" refere-se a uma lista de abreviaturas, letras, caracteres ou palavras representandoresíduos de aminoácidos. Os aminoácidos podem ser referidos aqui por seussímbolos de três letras comumente conhecidos ou pelos símbolos de uma letrarecomendados por IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Asabreviaturas usadas aqui são os códigos de uma letra convencionais para osaminoácidos: A, alanina; B, asparagina ou ácido aspártico; C, cisteína; Dácido aspártico; E, glutamato, ácido glutâmico; F, fenilalanina; G, glicina; Hhistidina; I isoleucina; K, lisina; L, leucina; M, metionina; N, asparagina; P,prolina; Q, glutamina; R, arginina; S, serina; T, treonina; V, valina; W,triptofano; Y, tirosina; Z, glutamina ou ácido glutâmico (ver L. Stcenteior,Biochemistry, 1988, W. H. Freeman and Company, novos York. A letra "x"como usada aqui dentro de uma seqüência de aminoácido pode fazerreferência a qualquer resíduo de aminoácido.

"Seqüência de codificação" refere-se a uma seqüência de DNAou RNA que codifica para uma seqüência de aminoácido específica e excluias seqüências não de codificação. Ela pode constituir uma "seqüência decodificação não interrompida" , isto é, faltando um íntron, como em umcDNA ou pode incluir um ou mais íntrons ligados por junções de emendaapropriadas. Um "intron" é uma seqüência de RNA que está contida notranscrito primário mas que é removida através de clivagem e re-ligação doRNA dentro da célula para criar o mRNA maduro que pode ser traduzido emuma proteína.

Os termos "matriz de leitura aberta" e "ORF" referem-se àseqüência de aminoácido codificada entre códons de iniciação de tradução ede terminação de uma seqüência de codificação. Os termos "códon deiniciação" e "códon de terminação" referem-se a uma unidade de trêsnucleotídeos adjacentes ("códon" ) em uma seqüência de codificação queespecifica iniciação e terminação de cadeia, respectivamente, de síntese deproteína (tradução de mRNA).

Um "RNA funcional" refere-se a um RNA anti-sentido,ribozima, ou outro RNA que não é traduzido.

O termo "transcrito de RNA" refere-se a um produto resultantede transcrição catalisada por RNA polimerase de uma seqüência de DNA.Quando o transcrito de RNA está em uma cópia complemento perfeita daseqüência de DNA, ele é referido como o transcrito primário ou pode ser umaseqüência de RNA derivada de processamento pós-transcripcional dotranscrito primário e é referido como o RNA maduro. "RNA mensageiro"(mRNA) refere-se ao RNA que está sem íntrons e que pode ser traduzido emproteína pela célula. "cDNA" refere-se a um DNA de filamento único ouduplo que é complementar a e derivado de mRNA.

"Seqüência nucleotídica reguladora da transcrição","seqüências regulatórias ", e "seqüências regulatórias apropriadas", referem-se, cada, a seqüências de nucleotídeos influenciando a transcrição,processamento de RNA, ou estabilidade,e ou tradução da seqüência denucleotídeo associada (ou funcionalmente ligada) a ser transcrita. A seqüêncianucleotídica reguladora da transcrição pode ter várias localizações com arelação às seqüências nucleotídicas a serem transcritas. A seqüêncianucleotídica reguladora da transcrição pode estar localizada a montante(seqüências não codificando 5') com, ou a jusante (seqüências nãocodificando 3') da base a ser transcrita (por exemplo, uma seqüência decodificação). As seqüências nucleotídicas reguladoras da transcrição podemser selecionadas dentre o grupo consistindo de melhoradores, promotores,seqüências líder de tradução, íntrons, seqüências não traduzidas 5', seqüênciasnão traduzidas 3', e seqüências de sinal de poliadenilação. Elas incluemseqüências naturais e sintéticas, assim como seqüências, que podem ser umacombinação de seqüências sintéticas e naturais. Como é notado acima, otermo "seqüência nucleotídica reguladora da transcrição" não é limitada aospromotores. No entanto, preferivelmente, uma seqüência nucleotídicareguladora da transcrição da invenção compreende pelo menos uma seqüênciade promotor (por exemplo, uma seqüência localizada a montante do início detranscrição de um gene capaz de induzir a transcrição das seqüências ajusante). Em uma forma de realização preferida, a seqüência nucleotídicareguladora da transcrição da invenção compreende a seqüência de promotordo gene correspondente e - opcionalmente e preferivelmente - a região nãotraduzida 5' nativa do referido gene. Além disso, a região não traduzida 3'e/ou a região de poliadenilação do referido gene também pode ser empregada.Como usado aqui, o termo "eis- elemento" ou "motivo de promotor" refere-sea um elemento regulador da transcrição cis-atuante que confere um aspecto decontrole global da expressão do gene. Um cis-elemento pode funcionar paraligar fatores de transcrição, fatores de proteína trans-atuantes que regulam atranscrição. Alguns eis- elementos ligam mais do que um fator de transcrição,e fatores de transcrição podem interagir com diferentes afinidades com maisde um cis-elemento. Os promotores do processo contêm desejavelmente cis- elementos que podem conferir ou modular a expressão do gene. Os cis-elementos podem ser identificados por várias técnicas, incluindo análise dedeleção, isto é, deleção de um ou mais nucleotídeos de terminação 5' ouinterna para um promotor; análise de proteína de ligação a DNA, usandoimpressão digital DNAse I, interferência de metilação, testes de mobilidade -deslocamento de eletroforese, impressão digital genômica em vivo por PCRmediado por ligação, e outros testes convencionais, ou por análise desimilaridade de seqüência de DNA com motivos cis-elementos conhecidos,por métodos de comparação de seqüência de DNA convencional. A estruturafina de um cis-elemento pode ser ainda estudada por mutagênese (ou substituição) de um ou mais nucleotídeos ou outros métodos convencionais.Os cis-elementos podem ser obtidos por síntese química ou por isolamento depromotores que incluem estes elementos, e eles podem ser sintetizados comnucleotídeos de flanco adicionais, que contém sítios de enzima de restriçãoutilizáveis para facilitar a manipulação subseqüente.

"Seqüência de não codificação 5'" ou "seqüência não traduzida5" ou "região" refere-se a uma seqüência nucleotídica localizada 5' (amontante) para a seqüência de codificação. Ela está presente no mRNAtotalmente processado do códon de iniciação e pode afetar o processamentodo transcrito primário para mRNA, estabilidade de mRNA ou eficácia detradução (Turner 1995).

"Seqüência de não codificação 3"' ou "seqüência nãotraduzida 3" ou "região" refere-se a uma seqüência nucleotídica localizada 3'(a jusante) a uma seqüência de codificação e inclui seqüências de sinal depoliadenilação e outras seqüências codificando sinais regulatórios capazes deafetar o processamento de mRNA ou expressão de genes. O sinal depoliadenilação é geralmente caracterizado por afetar a adição de traços deácido poliadenílico à extremidade 3' do precursor de mRNA. O uso dediferentes seqüências de não codificação 3' é exemplificado por Ingelbrecht etal, 1989.

O termo "seqüência líder de tradução" refere-se a uma porçãode seqüência de DNA de um gene entre o promotor e a seqüência decodificação que é transcrita em RNA e está presente no mRNA totalmenteprocessado a montante (5') do códon de partida de tradução. A seqüêncialíder de tradução pode afetar o processamento do transcrito primário paramRNA, estabilidade de mRNA ou eficácia de tradução.

"Peptídeo de sinal" refere-se a uma extensão terminal mínimade um polipeptídeo, que é traduzido em conjunto com o polipeptídeoformando um peptídeo precursor e que é requerido para sua entrada na viasecretória. O termo "seqüência de sinal" refere-se a uma seqüêncianucleotídica que codifica o peptídeo de sinal. O termo "peptídeo de trânsito"como usado aqui, refere-se a parte de um polipeptídeo expressado(preferivelmente para a extensão amino terminal de um polipeptídeo) que étraduzido em conjunto com o polipeptídeo formando um peptídeo precursor eque é requerido para sua entrada em uma organela de célula (como osplastídeos (por exemplo, cloroplastos) ou mitocôndrias). O termo "seqüênciade trânsito" refere-se a uma seqüência nucleotídica que codifica o peptídeo detrânsito.

"Promotor" refere-se a uma seqüência nucleotídica,geralmente a montante (5') para sua seqüência de codificação, que controla aexpressão da seqüência de codificação ao prover o reconhecimento para RNApolimerase e outros fatores requeridos para uma transcrição apropriada."Promotor" inclui um promotor mínimo que é uma seqüência de DNA curtade uma caixa TATA e outras seqüências que servem para especificar o sítiode iniciação de transcrição, para a qual os elementos regulatórios sãoadicionados para controlar a expressão. "Promotor" também refere-se a umaseqüência nucleotídica que inclui um promotor mínimo mais elementosregulatórios que é capaz de controlar a expressão de uma seqüência decodificação ou RNA funcional. Este tipo de seqüência de promotor consistede elementos a montante proximais e mais distais, os últimos elementos comfreqüência referidos como melhoradores. Conseqüentemente, um"melhorador" é uma seqüência de DNA, que pode estimular a atividade dopromotor e pode ser um elemento inato do promotor ou um elemento heterólogo inserido para melhorar o nível ou especificidade de um promotor.Ele é capaz de operar em ambas as orientações (normal ou movimentada) e écapaz de funcionar mesmo quando movimentada ou a montante ou a jusantedo promotor. Ambos os melhoradores e outros elementos promotores amontante ligam as proteínas de ligação a DNA específicas da seqüência que mediam seus efeitos. Os promotores podem ser derivados em sua totalidadede um gene nativo, ou ser compostos de elementos diferentes, derivados depromotores diferentes encontrados na natureza, ou mesmo ser compostos desegmentos de DNA sintético. Um promotor também pode conter seqüênciasde DNA que estão envolvidas na ligação de fatores de proteína, que controlam a eficácia de iniciação de transcrição em resposta a condiçõesfisiológicas ou de desenvolvimento.

O "sítio de iniciação" é a posição circundando o primeironucleotídeo que é parte da seqüência transcrita, que é também definido comoposição + 1. Com relação a este sítio, todas as outras seqüências do gene esuas regiões de controle são numeradas. As seqüências a jusante (isto é, outrasseqüências codificando proteína na direção 3') são denominadas positivas,enquanto as seqüências a montante (principalmente das regiões de controle nadireção 5') são denominadas negativas.

Os elementos promotores, particularmente um elementoTATA, que são inativos ou que tem uma atividade de promotor muitoreduzida na ausência de ativação a montante são referidos como "promotoresmínimos ou de núcleo" . Na presença de um fator de transcrição apropriado, opromotor mínimo funciona para permitir a transcrição. Um „promotor mínimoou de núcleo" assim consiste somente de todos os elementos basaisnecessários para iniciação de transcrição, por exemplo, caixa TATA e/ou uminiciador.

"Expressão constitutiva" refere-se à expressão usando umpromotor constitutivo ou regulado. "Expressão condicional" e "regulada"refere-se à expressão controlada por um promotor regulado.

"Promotor constitutivo" refere-se a um promotor que é capazde expressar a matriz de leitura aberta (ORF) que ele controle em todos ouquase todos os tecidos de plantas durante todos ou quase todos os estágios dedesenvolvimento da planta. Cada um dos elementos de ativação de transcrição não demonstra uma especificidade de tecido absoluta, mas mediam a ativaçãode transcrição na maioria das partes de plantas a um nível de pelo menos 1%do nível alcançado na parte da planta em que a transcrição é mais ativa.

"Promotor regulado" refere-se a promotores que dirigem aexpressão de genes não constitutivamente, mas em um modo regulado de modo temporal e/ou espacial, e inclui tanto promotores específicos de tecido eindutíveis. Ele inclui seqüências naturais e sintéticas, assim como seqüênciasque podem ser uma combinação de seqüências sintéticas e naturais.Promotores diferentes podem dirigir a expressão de um gene em tecidos outipos de células diferentes, ou em estágios diferentes de desenvolvimento, ouem resposta a condições ambientais diferentes. Novos promotores de váriostipos utilizáveis em células de plantas estão sendo constantementedescobertos, cujos numerosos exemplos podem ser encontrados nacompilação por Okamuro et al (1989). Os promotores regulados típicosutilizáveis em plantas incluem, mas não são limitados a promotores indutíveispor agente de segurança, promotores derivados de sistema indutível portetraciclina, promotores derivados de sistemas indutíveis por salicilato,promotores derivados de sistemas indutíveis por álcool, promotores derivadosde sistema indutível por glucocorticóides, promotores derivados de sistemasindutíveis por patógenos, e promotores derivados de sistemas indutíveis porecdisona.

"Promotor específico para tecido" refere-se a promotoresregulados que não são expressados em todas as células de plantas massomente em um ou mais tipos de células em órgãos específicos (como folhas ou sementes), tecidos específicos (como embrião ou cotilédones) ou tipos decélulas específicas (como parênquima de folha ou células de armazenamentode sementes). Estes também incluem promotores que são temporariamenteregulados, como em embriogênese prematura ou tardia, durante oamadurecimento das frutas nas sementes ou frutas em desenvolvimento, em folhas totalmente diferenciada, ou no início da senescência.

"Promotor indutível" refere-se aos promotores regulados quepodem ser ligados em um ou mais tipos de células por um estímulo externo,como químico, luz, hormônio, estresse, ou um patógeno.

"Operativãmente ligado" ou "funcionalmente ligado" refere-se preferivelmente à associação de seqüências de ácido nucleico em fragmentode ácido nucleico único de modo que a função de um é afetada pela outra. Porexemplo, uma seqüência de DNA regulatória é dita como sendo"operativãmente ligada a" ou "associada com" uma seqüência de DNA quecodifica para um RNA ou um polipeptídeo se as duas seqüências estiveremsituadas de modo que a seqüência de DNA regulatória afeta a expressão daseqüência de DNA de codificação (isto é, que a seqüência de codificação ouRNA funcional está sob o controle transcripcional do promotor). Asseqüências de codificação podem ser ligadas operativamente a seqüênciasregulatórias em orientação sentido ou anti-sentido.

"Expressão" refere-se à transcrição e/ou tradução de um geneendógeno, ORF ou porção do mesmo, ou um transgene em plantas. Porexemplo, no caso de construções anti-sentido, expressão pode fazer referênciaà transcrição do DNA anti-sentido somente. Além disso, expressão refere-se átranscrição e acúmulo estável de RNA sentido (mRNA) ou funcional. Aexpressão também pode fazer referência à produção de proteína.

"Expressão específica" é a expressão de produtos de genes,que é limitada a um ou poucos tecidos de plantas (limitação espacial) e/ou aum ou alguns estágios de desenvolvimento de plantas (limitação temporal).

Sabe-se que dificilmente existe uma especificidade verdadeira: promotoresparecem preferivelmente mudar em alguns tecidos, enquanto em outrostecidos pode-se não ter atividade ou apenas uma pequena. Este fenômeno éconhecido como expressão "avariada" . No entanto, com expressão específicanesta invenção significa-se a expressão preferível em um ou em algunstecidos de plantas.

O "padrão de expressão" de um promotor (com ou semmelhorador) é o padrão de níveis de expressão, que mostra onde na planta eem que estágio de desenvolvimento a transcrição é iniciada pelo referidopromotor. Os padrões de expressão de um conjunto de promotores são ditoscomo sendo complementares quando o padrão de expressão de um promotormostra pouca sobreposição com o padrão de expressão do outro promotor. Onível de expressão de um promotor pode ser determinado por medida daconcentração de "estado uniforme" de um mRNA repórter transcrito padrão.Esta medida é indireta porque a concentração do mRNA repórter édependente não somente de sua taxa de síntese, mas também da taxa em que omRNA é degradado. Assim, o nível de estado uniforme é o produto de taxasde síntese e taxas de degradação. A taxa de degradação pode, no entanto, serconsiderada como prosseguindo em uma taxa fixa quando as seqüênciastranscritas são idênticas, e assim este vapor pode servir como uma medida detaxas de síntese. Quando promotores são comparados deste modo, técnicasdisponíveis para os versados na arte são análise Sl-RNAse hibridização,northern blots e RT-PCR competitivo. Esta lista de técnicas não representa, denenhum modo, todas as técnicas disponíveis, mas ao contrário descreveprocedimentos comumente usados para analisar a atividade de transcrição eníveis de expressão de mRNA. A análise de pontos de partida de transcriçãoem praticamente todos os promotores revelou que não se tem geralmente baseúnica em que a transcrição começa, mas ao contrário um conjunto mais oumenos agrupado de sítios de iniciação, cada um que perfaz alguns pontos departida do mRNA. Porque esta distribuição varia de promotor a promotor, asseqüências do mRNA repórter em cada uma das populações iria diferir decada outro. Porque cada espécie de mRNA é mais ou menos inclinado àdegradação, nenhuma taxa de degradação única pode ser esperada paramRNAs repórter diferentes. Foi mostrado para várias seqüências de promotoreucariótico que a seqüência circundando o sítio de iniciação ("iniciador" )desempenha um papel importante na determinação do nível de expressão deRNA dirigida por este promotor específico. Isto também inclui parte dasseqüências transcritas. A fusão direta de seqüências de promotor para repórterdeve assim levar a níveis sub-ótimos de transcrição. Um procedimentocomumente usado para analisar os padrões de expressão e níveis é através dadeterminação do nível "de estado uniforme" de acúmulo de proteína em umacélula. Os candidatos comumente usados para o gene repórter, bemconhecidos dos versados na arte, são beta-glucuronidase (GUS), cloranfenicolacetil transferase (CAT) e proteínas com propriedades fluorescentes, comoproteína fluorescente verde (GFP) de Aequora victoria. Em princípio, noentanto, muitas outras proteínas são apropriadas para este fim, desde que aproteína não interfira com funções de plantas essenciais. Para quantificação edeterminação de localização, várias ferramentas são apropriadas. Os sistemasde detecção podem ser prontamente criados ou disponíveis com base em, porexemplo, imunoquímica, enzimático, detecção fluorescente e quantificação.Os níveis de proteína podem ser determinados em extratos de tecidos deplantas ou em tecido intacto usando análise no local de expressão de proteína.Geralmente, as linhagens transformadas individuais com uma construção derepórter de promotor quimérico irão variar em seus níveis de expressão dogene repórter. Também é observado com freqüência o fenômeno de que estestransformantes não expressam qualquer produto detectável (RNA ouproteína). A variabilidade em expressão é comumente dita como "efeitos deposição" apesar de mecanismos moleculares subjacentes a esta inatividadenão serem geralmente evidentes.

"Super-expressão" refere-se ao nível de expressão em célulastransgênicas ou organismos que excede os níveis de expressão em célulasnormais ou não transformadas (não transgênicas) ou organismos.

"Inibição anti-sentido" refere-se à produção de transcritos deRNA anti-sentido capazes de suprimir a expressão de proteína de um geneendógeno ou transgene.

"Silenciamento de gene" refere-se a supressão dependente dehomologia de genes virais, transgenes, ou genes nucleares endógenos. Osilenciamento de genes pode ser transcripcional, quando a supressão é devidoà transcrição diminuída dos genes afetados, ou pós -transcripcional, quando asupressão é devido a aumentado rotação (degradação) de espécies de RNAhomólogas para os genes afetados (English 1996). O silenciamento de genesinclui silenciamento de genes induzido por vírus (Ruiz et al, 1998).

Os termos "seqüência de DNA heteróloga" , "segmento deDNA exógeno" ou "ácido nucleico heterólogo" , como usado aqui, referem-se, cada, a uma seqüência que se origina de uma fonte estranha à célulahospedeira particular ou, se da mesma fonte, é modificada de sua formaoriginal. Assim, um gene heterólogo em uma célula hospedeira inclui umgene que é endógeno para a célula hospedeira particular mas foi modificadoatravés de, por exemplo, o uso de embaralhamento de DNA. Os temostambém incluem cópias múltiplas não de ocorrência natural, de umaseqüência de DNA de ocorrência natural. Assim, os termos referem-se asegmento de DNA que é estranho ou heterólogo para a célula, ou homólogopara a células mas em uma posição dentro do ácido nucleico da célulahospedeira em que o elemento não é comumente encontrado. Os segmentosde DNA exógenos são expressados para dar polipeptídeos exógenos. Umaseqüência de DNA "homóloga" é uma seqüência de DNA que é naturalmenteassociada com uma célula hospedeira em que ela é introduzida.

"Homólogo a" , no contexto da identidade de seqüência denucleotídeo, refere-se à similaridade entre as seqüências de nucleotídeos deduas moléculas de ácido nucleico ou entre as seqüências de aminoácido deduas moléculas de proteína. Estimativas desta homologia são providas por ouhibridização DNA-DNA ou DNA-RNA sob condições de estringência como ébem conhecido pelos versados na arte (como descrito em Haines e Higgins(eds.), Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, U.K.), ou pelacomparação de similaridade de seqüência entre dois ácidos nucleicos ouproteínas.

O termo "substancialmente similar" refere-se a seqüências denucleotídeo e de aminoácido que representam equivalentes funcionais e/ouestruturais ou ortólogos de seqüências de Arabidopsis thaliana ou Linumusitatissimum descritas aqui.

Em seu sentido mais amplo, o termo "substancialmentesimilar", como usado aqui com relação a uma seqüência nucleotídica significaque a seqüência nucleotídica é parte de um gene que codifica um polipeptídeotendo substancialmente a mesma estrutura e função que um polipeptídeocodificado por um gene para a seqüência nucleotídica de referência, porexemplo a seqüência nucleotídica compreende um promotor de um gene que éo ortólogo do gene correspondendo à seqüência nucleotídica de referência,assim como seqüências de promotor que são estruturalmente relacionadascom as seqüências de promotor particularmente exemplificadas aqui, isto é, asseqüências de promotor substancialmente similares hibridizam para ocomplemento das seqüências de promotor exemplificadas aqui sob condiçõesde estringência elevadas ou muito elevadas. Por exemplo, seqüênciasnucleotídicas alteradas, que simplesmente refletem a degenerescência docódigo genético mas mesmo assim codificam seqüências de aminoácidos quesão idênticas a uma seqüência de aminoácido particular são substancialmentesimilares às seqüências particulares. O termo "substancialmente similar"também inclui seqüências nucleotídicas em que a seqüência foi modificada,por exemplo, para otimizar a expressão em células particulares, assim comoseqüências nucleotídicas codificando um polipeptídeo variante, tendo uma oumais substituições de aminoácidos com relação ao polipeptídeo (nãomodificado) codificado pela seqüência de referência, cuja(s) substituição(ões) não alteram a atividade do polipeptídeo variante com relação aopolipeptídeo não modificado.

Em seu sentido mais amplo, o termo "substancialmentesimilar" quando usado aqui com relação ao polipeptídeo significa que opolipeptídeo tem substancialmente a mesma estrutura e função que opolipeptídeo de referência. Além disso, seqüências de aminoácidos que sãosubstancialmente similares a uma seqüência particular são as em que aidentidade de aminoácido global é pelo menos 50% ou mais para asseqüências presentes. As modificações que resultam em seqüências denucleotídeos ou de aminoácidos equivalentes são bem conhecidas dosversados. A porcentagem de identidade de seqüência de aminoácido entre opolipeptídeo substancialmente similar e o de referência é de pelo mesmo, 50%por exemplo, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%,62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%,75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%,88%, 89%, e mesmo 90% ou more, por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,96%, 97%, 98%, até pelo menos 99%, em que o polipeptídeo de referência éum polipeptídeo (por exemplo, de Arabidopsis thaliana ou Linumusitatissimum) codificado por um gene com um promotor tendo qualquer umadentre SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou 11, uma seqüêncianucleotídica compreendendo uma matriz de leitura aberta tendo qualquer umadentre SEQ ID NOs: 12, 14, 16, 18, 20, ou 22, que codifica uma dentre SEQID NOs: 8, 10,12, 14, 16, 18, ou 36. Uma indicação que dois polipeptídeossão substancialmente similares um com relação ao outro, além de teremsubstancialmente a mesma função, é que um agente, por exemplo umanticorpo, que especificamente liga a um dos polipeptídeos, tambémespecificamente liga ao outro.

As comparações de seqüência podem ser realizadas usando umalgoritmo de alinhamento de seqüência Smith-Waterman (ver, por exemplo,Waterman (1995)). O programa localS, versão 1.16, é preferivelmente usadocom seguintes parâmetros: alinhamento: 1, penalidade de desalinhamento:0.33, penalidade de espaço aberto: 2, penalidade de espaço estendido: 2.

Além disso, uma seqüência nucleotídica que é"substancialmente similar" a uma seqüência nucleotídica de referência é ditaser "equivalente" à seqüência nucleotídica de referência. O versado na artereconhecido que seqüências nucleotídicas equivalentes englobadas por estainvenção também podem ser definidas por sua capacidade de hibridizar, sobcondições baixas, moderadas e/ou estringentes (por exemplo, 0,1 X SSC,0,1% SDS, 65°C), com as seqüências nucleotídicas que estão dentro doescopo literal das presentes reivindicações.

O que se significa por "substancialmente a mesma atividade"quando usado em referência a um fragmento de polinucleotídeo oupolipeptídeo é que o fragmento tem pelo menos 50%, por exemplo, 51%,52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%,65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%,* 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, emesmo 90% ou mais, por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,98%, até pelo menos 99% da atividade de polinucleotídeo de comprimentocompleto ou polipeptídeo de comprimento completo.

"Gene de marcação" refere-se a um gene no replicon queexpressa a seqüência de codificação de marcação desejada, RNA funcional ouproteína. O gene de marcação não é essencial para a replicação do replicon.Além disso, os genes de marcação podem compreender genes não viraisnativos inseridos em um organismo não nativo, ou genes quiméricos, e estarásob o controle de seqüências regulatórias apropriadas. Assim, as seqüênciasregulatórias no gene de marcação podem vir de qualquer fonte, incluindo osvírus. Os genes de marcação podem incluir seqüências de codificação que sãoou heterólogas ou homólogas aos genes de uma planta particular a sertransformada. No entanto, os genes de marcação não incluem genes viraisnativos. Os genes de marcação típicos incluem, mas não são limitados a genescodificando uma proteína estrutural., uma proteína de armazenamento desementes, uma proteína que transporta resistência a herbicida, e uma proteínaque transporta resistência a insetos. As proteínas codificadas por genes demarcação são bem conhecidas como "proteínas estranhas" . A expressão deum gene de marcação em uma planta irá tipicamente produzir um traço deplanta alterado.

O termo "traço de planta alterado" significa qualquer mudançafenotípica ou genotípica em uma planta transgênica com relação aohospedeiro de planta de tipo selvagem ou não transgênico.

"Gene de replicação" refere-se a um gene codificando umaproteína de replicação viral. Além do ORF da proteína de replicação, o genede replicação também pode conter outros ORF(s) de sobreposição ou nãosobreposição, como encontrados em seqüências virais na natureza. Apesar denão essencial para replicação, estes ORFs adicionais podem melhorar oacúmulo de DNA viral e/ou replicação. Os exemplos destes ORFs adicionaissão AC3 e AL3 em ACMV e geminivírus TGMV, respectivamente.

"Gene de replicação trans-atuante quimérico" refere-se ou aum gene de replicação em que a seqüência de codificação de uma proteína dereplicação está sob o controle de um promotor de planta regulado diferente dogene de replicação viral nativo, ou um gene de replicação viral nativomodificado, por exemplo em que uma seqüência(s) específica de sítio éinserida na região 5' transcrita, mas não traduzida. Estes genes quiméricostambém incluem inserção dos sítios conhecidos de ligação de proteína dereplicação entre o promotor e o sítio de partida de transcrição que atenuam atranscrição de gene de proteína de replicação viral.

"Integrado cromossomicamente" refere-se à integração de umgene estranho ou construção de DNA no DNA hospedeiro por ligaçõescovalentes. Onde os genes não são "integrados cromossomicamente" elespodem ser "transientemente expressados" . A expressão transiente de um generefere-se a expressão de um gene que não é integrado no cromossomohospedeiro mas funciona independentemente, ou como parte de um plasmídeode replicação autônoma ou cassete de expressão, por exemplo ou como partede outro sistema biológico, como um vírus.

O termo "transformação" refere-se à transferência de umfragmento de ácido nucleico no genoma de uma célula hospedeira, resultandoem uma herança geneticamente estável. As células hospedeiras contendo osfragmentos de ácido nucleico transformados são referidas como células"transgênicas" , e organismos compreendendo células transgênicas sãoreferidos como "organismos transgênicos" . Os exemplos de métodos detransformação de plantas e células de plantas incluem transformação mediadapor Agrobacterium (De Blaere 1987) e tecnologia de bombardeio departículas (US 4.945.050). As plantas totais podem ser regeneradas de célulastransgênicas por métodos bem conhecidos dos versados (ver, por exemplo,Fromm 1990).

"Transformado", "transgênico," e "recombinante" referem-se aum organismo hospedeiro como uma bactéria ou uma planta em que umamolécula de ácido nucleico heteróloga foi introduzida. A molécula de ácidonucleico pode ser integrada de modo estável no genoma geralmente bemconhecido na arte e é descrita em (Sambrook 1989; Innis 1995; Gelfand 1995;Innis & Gelfand 1999). Os métodos conhecidos de PCR incluem, mas não sãolimitados aos métodos usando iniciadores em pares, iniciadores abrigados,iniciadores específicos únicos, iniciadores degenerados, iniciadoresespecíficos de genes, iniciadores específicos de vetores, iniciadoresparcialmente desalinhados e outros. Por exemplo, plantas ou calos"transformados" "transformantes," e "transgênicos" tinham passado atravésdos processos de transformação e contém um gene estranho integrado em seucromossomo. O termo "não transformado" refere-se a plantas normais quenão tinham passado através do processo de transformação.

"Transientemente transformado" refere-se a células em quetransgenes e DNA estranho foram introduzidos (por exemplo, por taismétodos como transformação mediada por Agrobacterium ou bombardeiobiolístico) mas não selecionado para uma manutenção estável.

"Transformado estavelmente" refere-se às células que foramselecionadas e regeneradas em um meio de seleção após transformação.

"Expressão transiente" refere-se à expressão em células emque um vírus ou um transgene é introduzido por infecção viral ou por taismétodos como transformação mediada por Agrobacterium, eletroporação, oubombardeio biolístico, mas não selecionadas para sua manutenção estável.

"Geneticamente estável" e "herdável" referem-se a elementosgenéticos cromossomicamente integrados que são mantidos estavelmente naplanta e estavelmente herdados por progênie através de gerações sucessivas.

"Transformante primário" e "geração TO" fazem referência aplantas transgênicas que são da mesma geração genética como o tecido quefoi inicialmente transformado (isto é não tendo passado através de meiose efertilização desde a transformação).

"Transformantes secundários" e as "gerações TI, T2, T3, etc"referem-se a plantas transgênicas derivadas de transformantes primáriosatravés de um ou mais ciclos de meiose e fertilização. Eles podem serderivados por auto-fertilização de transformantes primários ou secundários oucruzamentos de transformantes primários ou secundários com outras plantastransformadas ou não transformadas.

"Tipo selvagem" refere-se a um vírus ou organismoencontrado na natureza sem qualquer mutação conhecida.

Os termos "genoma" ou "DNA genômico" se referem àinformação genética herdável de um organismo hospedeiro. O referido DNAgenômico compreende o DNA do núcleo (também referido como DNAcromossômico), mas também o DNA dos plastídeos (por exemplo,cloroplastos) e outros organelas celulares (por exemplo, mitocôndrias).Preferivelmente, os termos genoma ou DNA genômico fazem referência aoDNA cromossômico do núcleo.

O termo "DNA cromossômico" ou "seqüência de DNAcromossômico" deve ser entendido como o DNA genômico do núcleo celularindependente do estado do ciclo celular. O DNA cromossômico pode assimser organizado em cromossomos ou cromatídeos, eles podem ser condensadosou não enrolado. Uma inserção no DNA cromossômico pode ser demonstradae analisada por vários métodos bem conhecidos dos versados na arte, porexemplo, análise de reação em cadeia da polimerase (PCR), análise Southernblot, hibridização em situ fluorescente, (FISH), e PCR em situ.

O termo "ácido nucléico" refere-se a deoxirribonucleotídeosou ribonucleotídeos e seus polímeros em forma de filamento único ou duplo,compostos de monômeros (nucleotídeos) contendo um açúcar, fosfato oubase, que é ou uma purina ou pirimidina. Salvo especificamente limitado, otermo engloba ácidos nucleicos contendo análogos conhecidos denucleotídeos naturais, que tem propriedades de ligação similares como oácido nucleico de referência e são metabolizados em um modo similar aosnucleotídeos de ocorrência natural. Salvo especificado em contrário, umaseqüência de ácido nucleico particular também engloba implicitamente suasvariantes conservativamente modificadas (por exemplo, substituição de códondegenerado) e seqüências complementares assim como a seqüênciaexplicitamente indicada. Especificamente, substituições de códon degeneradopodem ser obtidas por geração de seqüências em que a terceira posição de umou mais códons selecionados (ou todos) é substituída com resíduos de basemista e/ou deoxiinosina (Batzer 1991; Ohtsuka 1985; Rossolini 1994). Um"fragmento de ácido nucleico "é uma fração de uma dada molécula de ácido nucléico. Em plantas superiores, ácido desoxirribonucleico (DNA) é omaterial genético enquanto ácido ribonucléico (RNA) está envolvido emtransferência de informação contida dentro do DNA em proteínas. O termo"seqüência nucleotídica" refere-se a um polímero de DNA ou RNA que podeser de filamento único ou duplo, opcionalmente contendo bases de nucleotídeos sintéticas, não naturais ou alteradas, capazes de incorporação empolímeros de DNA ou RNA. Os termos "ácido nucleico" ou "seqüência deácido nucleico" também podem ser usados de modo interpermutável comgene, cDNA, DNA e RNA codificados por um gene.

A invenção engloba composições de proteína ou ácidonucleico isoladas ou substancialmente purificadas. No contexto da presenteinvenção, uma molécula de DNA "isolada" ou "purificada" ou umpolipeptídeo "isolado" ou "purificado" é uma molécula de DNA oupolipeptídeo que, pela mão do homem, existe além de seu meio nativo e,assim, não é um produto da natureza. Uma molécula de DNA isolada oupolipeptídeo pode existir em uma forma purificada ou pode existir em ummeio não nativo, como, por exemplo, uma célula hospedeira transgênica. Porexemplo, uma proteína ou molécula de ácido nucleico "isolada" ou"purificada" ou porção biologicamente ativa da mesma, é substancialmenteisenta de outro material celular, ou meio de cultura quando produzida portécnicas recombinantes, ou substancialmente isenta de precursores químicosou outros produtos químicos quando quimicamente sintetizada.Preferivelmente, um ácido nucleico "isolado" é isento de seqüências(preferivelmente seqüências codificando proteína) que naturalmenteflanqueiam o ácido nucleico (isto é, seqüências localizadas nas extremidades5' e 3' do ácido nucleico) no DNA genômico do organismo do qual o ácidonucleico é derivado. Por exemplo, em várias formas de realização, a moléculade ácido nucleico isolada pode conter menos que cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2kb, 1 kb, 0,5 kb, ou 0,1 kb de seqüências nucleotídicas que naturalmenteflanqueiam a molécula de ácido nucleico no DNA genômico da célula da qualo ácido nucleico é derivado. Uma proteína que é substancialmente isenta dematerial celular inclui preparações de proteína ou polipeptídeo tendo menosque cerca de 30%, 20%, 10%, 5%, (por peso seco) de proteína contaminante.Quando a proteína da invenção, ou porção biologicamente ativa da mesma, érecombinantemente produzida, preferivelmente meio de cultura representamenos que cerca de 30%, 20%, 10%, ou 5% (por peso seco) de precursoresquímicos ou não proteína de produtos químicos de interesse. As seqüênciasnucleotídicas da invenção incluem tanto as seqüências de ocorrência natural,assim como formas mutantes (variantes). Estas variantes irão continuar apossuir a atividade desejada, isto é, ou atividade de promotor ou atividade doproduto codificado pela matriz de leitura aberta de seqüência nucleotídica nãovariante.

O termo "variante" com relação a uma seqüência (porexemplo, polipeptídeo ou seqüência de ácido nucleico como - por exemplo -a seqüência nucleotídica reguladora da transcrição da invenção) se destina asignificar seqüências substancialmente similares. Para seqüênciasnucleotídicas compreendendo uma matriz de leitura aberta, variantes incluemas seqüências que, devido à degenerescência do código genético, codificam aseqüência idêntica de aminoácidos da proteína nativa. As variantes alélicas deocorrência natural como estas podem ser identificadas com o uso de técnicade biologia molecular bem conhecidas, como, por exemplo, reação em cadeiada polimerase (PCR) e hibridização. Seqüências nucleotídicas variantestambém incluem seqüências nucleotídicas sinteticamente derivadas, como as geradas, por exemplo, por uso de mutagênese dirigida ao sítio, e para matrizde leitura aberta, codificam a proteína nativa, assim como as que codificamum polipeptídeo tendo substituições de aminoácido com relação à proteínanativa. Em geral, as variantes de seqüência nucleotídica da invenção terãopelo menos 40, 50, 60, a 70%, por exemplo, preferivelmente 71%, 72%, 73%,74%, 75%, 76%, 77%, 78%, a 79%, geralmente pelo menos 80%, porexemplo, 81%-84%, pelo menos 85%, por exemplo, 86%, 87%, 88%, 89%,90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, a 98% e 99% de identidadepara seqüências nucleotídicas para a seqüência nucleotídica nativa (tiposelvagem ou endógeno).

"Variações conservativamente modificadas" de uma particularseqüência de ácido nucleico refere-se às seqüências de ácido nucleico quecodificam seqüências de aminoácido idênticas ou essencialmente idênticas, ouonde a seqüência de ácido nucleico não codifica uma seqüência deaminoácido, para seqüências essencialmente idênticas. Devido àdegenerescência do código genético, um grande número de ácidos nucleicosfuncionalmente idênticos codificam qualquer dado polipeptídeo. Por exemplo,os códons CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, e AGG codificam, todos, oaminoácido arginina. Assim, em cada posição onde uma arginina éespecificada por um códon, o códon pode ser alterado em quaisquer doscódons correspondentes descritos sem alterar a proteína codificada. Estasvariações de ácido nucleico são "variações silentes" que são uma espécie de"variações conservativamente modificadas". Cada seqüência de ácidonucleico descrita aqui, que codifica um polipeptídeo também descreve cadavariação silente possível, exceto onde indicado ao contrário. Um versado iráreconhecer que cada códon em um ácido nucleico (exceto ATG, que écomumente o único códon para metionina) pode ser modificado para dar umamolécula funcionalmente idêntica por técnicas padrões, conseqüentemente,cada "variação silente" de um ácido nucleico, que codifica um polipeptídeo éimplícita em cada seqüência descrita.

As moléculas de ácido nucleico da invenção podem ser"otimizadas" para melhorar a expressão em plantas de interesse (ver, porexemplo, WO 91/16432; Perlak 1991; Murray 1989). Deste modo, a matriz deleitura aberta em genes ou fragmentos de gene pode ser sintetizada usandocódons preferidos pelas plantas (ver, por exemplo, Campbell & Gowri, 1990para uma discussão de uso de códons preferidos do hospedeiro). Assim, asseqüências nucleotídicas podem ser otimizadas para expressão em qualquerplanta. Reconhece-se que todo ou qualquer parte da seqüência do gene podeser otimizada ou sintética. Isto é, as seqüências sintéticas ou parcialmenteotimizadas podem ser também usadas. As seqüências nucleotídicas variantes eproteínas também englobam seqüências e proteínas derivadas de umprocedimento mutagênico e recombinogênico, como embaralhamento deDNA. Com este procedimento, uma ou mais diferentes seqüências decodificação podem ser manipuladas para criar um novo polipeptídeopossuindo as propriedades desejadas. Deste modo, bibliotecas depolinucleotídeos recombinantes são geradas a partir de uma população depolinucleotídeos de seqüência relacionada compreendendo regiões deseqüência que tem uma identidade de seqüência substancial e podem serrecombinadas de modo homólogo em vitro ou em vivo. As estratégias paraeste embaralhamento de DNA são bem conhecidas na arte (ver, por exemplo,Stemmer 1994; Stemmer 1994; Crameri 1997; Moore 1997; Zhang 1997;Crameri 1998; e US 5.605.7912, 14, 16, 18, 20, e 22,837,458).

Por polipeptídeo "variante" destina-se indicar um polipeptídeoderivado da proteína nativa por deleção (assim chamada truncagem) ou adiçãode um ou mais aminoácidos para a extremidade N-terminal e/ou C-terminalda proteína nativa; deleção ou adição de um ou mais aminoácidos em um oumais sítios da proteína nativa; ou substituição de um ou mais aminoácidos emum ou mais sítios na proteína nativa. Estas variantes podem resultar de, porexemplo, polimorfismo genético ou de manipulação humana. Os métodospara esta manipulação são geralmente bem conhecidos na arte.

Assim, os polipeptídeos podem ser alterados em vários modosincluindo substituições de aminoácidos, deleções, truncagens e inserções. Osmétodos para estas manipulações são geralmente bem conhecidos na arte. Por exemplo, as variantes de seqüência de aminoácido dos polipeptídeos podemser preparadas por mutações no DNA. Os métodos para mutagênese ealterações de seqüência de nucleotídeos são bem conhecidos na arte (ver, porexemplo, Kunkel 1985; Kunkel 1987; US 4.873.192; Walker & Gaastra, 1983e as referencias citadas). O guia para as substituições apropriadas deaminoácidos que não afetam a atividade biológica da proteína de interessepodem ser encontrados no modelo de Dayhoff et al. (1978). Substituiçõesconservativas, como troca de um aminoácido por outro tendo propriedadessimilares são preferidas. As substituições, deleções ou adições individuais quealteram, adicionam ou deletam um único aminoácido ou uma porcentagempequena de aminoácidos (tipicamente menos que 5%, mais tipicamente menosque 1%) em uma seqüência codificada são "variações conseryativamentemodificadas," onde as alterações resultam na substituição de um aminoácidocom um aminoácido quimicamente similar. As tabelas de substituído conservativa provendo aminoácidos funcionalmente similares são bemconhecidas na arte. Os seguintes cinco grupos contém, cada, aminoácidos quesão substituições conservativas de um para o outro: Alifático: Glicina (G),Alanina (A), Valina (V), Leucina (L), Isoleucina (I); Aromático: Fenilalanina(F), Tirosina (I), Triptofano (W); contendo enxofre: Metionina (M), Cisteína(C); Básico: Arginina (R), Lisina (K), Histidina (H); Ácido: ácido aspártico(D), ácido glutâmico (E), Asparagina (N), Glutamina (Q). Ver, também,Creighton, 1984. Além disso, substituições individuais, deleções ou adiçõesque alteram, adicionam ou deletam um aminoácido único ou umaporcentagem pequena de aminoácidos em uma seqüência codificada são também "variações conservativamente modificadas".

"Cassete de expressão "como usado aqui significa umaseqüência de DNA capaz de dirigir expressão de uma particular seqüêncianucleotídica em uma célula hospedeira apropriada, compreendendo umpromotor operativamente ligado a uma seqüência nucleotídica de interesse,que é -opcionalmente - ligada operativamente a sinais de terminação e/ououtros elementos regulatórios. Um cassete de expressão também podecompreender seqüências requeridas para uma tradução apropriado daseqüência nucleotídica. A região de codificação geralmente codifica para umaproteína de interesse mas também pode codificar para um RNA de interessefuncional, por exemplo RNA anti-sentido ou um RNA não traduzido, nadireção sentido ou anti-sentido. O cassete de expressão compreendendo aseqüência nucleotídica de interesse pode ser quimérico, significando que pelomenos um de seus componentes é heterólogo com relação a pelo menos umde seus outros componentes. O cassete de expressão também pode ser um queé de ocorrência natural, mas foi obtido em uma forma recombinante utilizávelpara expressão heteróloga. Um cassete de expressão pode ser montado demodo completamente extracelular (por exemplo, técnicas de clonagemrecombinante). No entanto, um cassete de expressão também pode sermontado usando componentes endógenos em parte. Por exemplo, um cassetede expressão pode ser obtido por colocação (ou inserção) de uma seqüênciade promotor a montante de uma seqüência endógena, que assim se tornafuncionalmente ligada e controlada por referidas seqüências de promotor. Domesmo modo, a seqüência de ácido nucleico a ser expressada pode sercolocada (ou inserida) a jusante de uma seqüência endógena de promotorassim formando um cassete de expressão. A expressão da seqüêncianucleotídica no cassete de expressão pode também estar sob o controle de umpromotor constitutivo ou de um promotor indutível, que inicia a transcriçãosomente quando a célula hospedeira é exposta a algum estímulo externoparticular. No caso de um organismo multicelular, o promotor também podeser específico para um tecido particular ou órgão ou estágio dedesenvolvimento (por exemplo, promotores específicos de semente oupreferenciais de semente da invenção). Em uma forma de realização preferida,estes cassetes de expressão irão compreender a região de iniciação detranscrição da invenção ligada a uma seqüência nucleotídica de interesse. Estecassete de expressão é preferivelmente provido com uma pluralidade de sítiosde restrição para inserção do gene de interesse para estar sob a regulaçãotranscripcional das regiões regulatórias. O cassete de expressão pode conter,adicionalmente, genes marcadores selecionáveis. O cassete irá incluir nadireção 5'- 3' de transcrição, uma região de iniciação de transcripcional etranslacional, uma seqüência de DNA de interesse, e uma região determinação transcripcional e translacional funcional em plantas. A região determinação pode ser nativa com a região de iniciação transcripcional, pode sernativa com a seqüência de DNA de interesse, ou pode ser derivada de outrafonte. As regiões de terminação convenientes são disponíveis de plasmídeo Tide A. tumefaciens, como as regiões de terminação de octapina sintase enopalina sintase e outras descritas abaixo (ver também, Guerineau 1991;Proudfoot 1991; Sanfacon 1991; Mogen 1990; Munroe 1990; Bailas 1989;Joshi 1987).

"Vetor" é definido como incluindo, inter alia, qualquerplasmídeo, cosmídeo, fago ou vetor binário de Agrobacterium em formacircular ou linear de filamento duplo ou único que pode ou não ser auto-transmissível ou mobilizável, e que pode transformar hospedeiro procariótico ou eucariótico ou por integração no genoma celular ou existirextracromossomicamente (por exemplo, plasmídeo de replicação autônomacom uma origem de replicação).

São especificamente incluídos os vetores de transporte o quesignifica um veículo de DNA capaz de, de modo natural ou por projeto,replicação em dois diferentes organismos hospedeiros, que podem serselecionado dentre actinomicetes e espécies relacionadas, bactérias eeucarióticos (por exemplo, células de plantas superiores, mamíferos, leveduraou fungos).

Preferivelmente, o ácido nucleico no vetor está sob o controlede, e ligado operativamente a um promotor apropriado ou outros elementosregulatórios para transcrição em uma célula hospedeira, como microbiana, porexemplo, bacteriana, ou célula de planta. O vetor pode ser um vetor deexpressão bi-funcional que funciona em múltiplos hospedeiros. No caso deDNA genômico, este pode conter seu próprio promotor ou outros elementos regulatórios e, no caso de cDNA, este pode estar sob o controle de umpromotor apropriado ou outros elementos regulatórios para expressão nacélula hospedeira.

"Vetores de clonagem" tipicamente contêm um ou um númeropequeno de sítios de reconhecimento de endonuclease de restrição em que asseqüências de DNA estranho podem ser inseridas em um modo determinávelsem perda da função biológica essencial do vetor, assim como um genemarcador que é apropriado para uso na identificação e seleção de célulastransformadas com o vetor de clonagem. Os genes marcadores tipicamenteincluem genes que provêem resistência a tetraciclina, resistência ahigromicina ou resistência a ampicilina.

Uma "planta transgênica" é uma planta tendo uma ou maiscélulas de planta que contém um vetor de expressão.

"Tecido de planta" inclui tecidos diferenciados e nãodiferenciados de plantas, incluindo, mas não limitados a raízes, hastes, brotos,folhas, pólen, sementes, tecido de tumor e várias formas de células e culturacomo células únicas, protoplasto, embriões, e tecido de calos. O tecido daplanta pode ser em plantas ou em um órgão, tecido ou cultura de células.

Os seguintes termos são usados para descrever as relações dasseqüências entre dois ou mais ácidos nucleicos ou polinucleotídeos: (a)"seqüência de referência" , (b) "janela de comparação" , (c) "identidade deseqüência" , (d) "porcentagem de identidade de seqüência" e (e) "identidadesubstancial" .

(a) Como usado aqui, "seqüência de referência" é umaseqüência definida usada como uma base para a comparação de seqüências.Uma seqüência de referência pode ser um subconjunto ou a totalidade de umaseqüência especificada; por exemplo, como um segmento de uma seqüênciade genes ou de cDNA de comprimento completo ou seqüência de genes ou decDNA completo.

(b) Como usado aqui, "janela de comparação" faz referência aum segmento contíguo e especificado de uma seqüência de polinucleotídeos,em que a seqüência de polinucleotídeos na janela de comparação podecompreender adições ou deleções (isto é, espaços "gaps" ) comparada 'aseqüência de referência (que não compreende adições ou deleções) paraalinhamento ótimo das duas seqüências. Em geral, a janela de comparaçãotem pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de comprimento, e, opcionalmente,pode ser 30, 40, 50, 100, ou mais longa. Os versados na arte compreendemque para evitar uma similaridade elevada em uma seqüência de referênciadevido à inclusão de espaços na seqüência de polinucleotídeos, umapenalidade de espaço é tipicamente introduzida e é subtraída do número dealinhamentos.

Os métodos de alinhamento de seqüências para comparaçãosão bem conhecidos na arte. Assim, a determinação da identidade percentual entre quaisquer duas seqüências pode ser obtida usando um algoritmomatemático. Exemplos não limitantes, preferidos, de algoritmos matemáticossão o algoritmo de Myers e Miller (1988); o algoritmo de homologia local deSmith et al. (1981); o algoritmo de alinhamento de homologia de Needlemane Wunsch (1970); o método de pesquisa-para-local de Perason e Lipman(1988); o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) modificado como em Karlin eAltschul (1993).

Implementações por computador destes algoritmosmatemáticos podem ser utilizadas para comparação de seqüências de modo adeterminar a identidade da seqüência. Estas implementações incluem, mas não estão limitadas a: CLUSTAL no programa PC/Gene (disponível deIntelligenetics, Mountain View, Califórnia); o programa ALIGN (versão 2.0)e GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA no pacote de softwareWisconsin Genetics, versão 8 (disponível de Genetics Computer Group(GCG), 575 Science Drive, Madison, Wis. USA). Alinhamentos usando estes programas podem ser realizados usando os parâmetros de default. O programaCLUSTAL é bem descrito por Higgins et al. 1988, 1989; Corpet 1988, Huanget al. (1992) e Perason 1994). O programa ALIGN é baseado no algoritmo deMyers e Miller supra. Os programas BLAST de Altschul et al. (1990) sãobaseados no algoritmo de Karlin e Altschul supra. Os alinhamentos múltiplos(isto é, mais de 2 seqüências) são preferivelmente realizados usando oalgoritmo Clustal W Thompson 1994; por exemplo, no software VetorNTI™,versão 9; Invitrogen Inc.) com a matriz de classificação matrizBLOSUM62MT2 com as configurações de default (penalidade de abertura deespaço 15/19, penalidade de extensão de espaço 6.66/0,05; faixa depenalidade de separação de espaço 8; % identidade para o retardo dealinhamento 40; usando os espaços específicos de resíduo e os espaços deresíduo hidrofilicos).

Software para realizar as análises BLAST é acessível ao público através do National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo envolve primeiro aidentificação de pares de seqüência de elevado escore (HSPs) poridentificação de palavras curtas de comprimento W na seqüência de busca,que ou se alinham ou atendem a um escore de limiar de valor positivo T quando alinhado com uma palavra do mesmo comprimento em uma seqüênciade base de dados. T é referido como o limiar de escore de palavra vizinha(Altschul 1990). Estas dicas de palavra vizinha inicial atuam como sementespara a iniciação de buscas para encontrar HSPs mais longos contendo asmesmas. As dicas de palavras são então estendidas em ambas as direções junto de cada seqüência desde que o escore de alinhamento cumulativo possaser aumentado. Os escores cumulativos são calculados usando, paraseqüências nucleotídicas, os parâmetros M (escore de prêmio para um par deresíduos alinhados; sempre > 0) e N (escore de penalidade para resíduosdesalinhados; sempre <0). Para seqüências de aminoácidos, uma matriz deescore é usada para calcular o escore cumulativo. A extensão das dicas depalavras em cada direção é parada quando o escore de alinhamentocumulativo fica fora da quantidade X de seu valor obtido máximo, o escorecumulativo via a zero ou abaixo devido ao acúmulo de um ou maisalinhamentos de resíduo de escore negativo, ou o final de ambas asseqüências é alcançado.

Além de calcular a identidade de seqüência percentual, oalgoritmo BLAST também realiza uma análise estatística da similaridadeentre duas seqüências (ver, por exemplo, Karlin & Altschul (1993). Umamedida de similaridade provida pelo algoritmo BLAST é a probabilidade desoma menor (P(N)), que prove uma indicação da probabilidade pela qual umalinhamento entre duas seqüências de nucleotídeo ou de aminoácido deveocorrer por acaso. Por exemplo, uma seqüência de ácido nucleico de teste éconsiderada similar à seqüência de referência se a menor probabilidade desoma em comparação com seqüência de ácido nucleico de teste paraseqüência de ácido nucleico de referência for menos do que cerca de 0,1, maispreferivelmente menor que cerca de 0,01, e o mais preferivelmente menor quecerca de 0,001.

Para obter alinhamentos espaçados para fins de comparaçãoGapped BLAST (em BLAST 2.0) pode ser utilizado como descrito emAltschul et al. 1997. Alternativamente, PSI-BLAST (em BLAST 2.0) pode serusado para realizar uma busca iterada que detecta relações distantes entremoléculas. Ver Altschul et al., supra. Quando utilizando BLAST, GappedBLAST, PSI-BLAST, os parâmetros de default dos respectivos programas(por exemplo, BLASTN para seqüências nucleotídicas, BLASTX paraproteínas) podem ser usados. O programa BLASTN (para seqüênciasnucleotídicas) usa, como defaults, um comprimento de palavra (W) de 11,uma expectativa (E) de 10, um corte de 100, M=5, N=-4, e uma comparaçãode ambos os filamentos. Para seqüências de aminoácidos, o programaBLASTP usa, como defaults, um comprimento de palavra (W) de 3, umaexpectativa (E) de 10, e a matriz de escore BLOSUM62 (ver Henikoff &Henikoff, 1989). Ver http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Alinhamento tambémpode ser realizado manualmente por inspeção.

Para fins da presente invenção, comparação de seqüênciasnucleotídicas para determinação de identidade de seqüência percentual para asseqüências de promotor descritas aqui é preferivelmente feita usando oprograma BlastN (versão 1.4.7 ou posterior) com seus parâmetros de defaultou qualquer programa equivalente. Por "programa equivalente "se destinaqualquer programa de comparação de seqüência que, para quaisquer duasseqüências em questão, gera um alinhamento tendo alinhamentos de resíduosde nucleotídeo ou aminoácidos idênticos, e uma identidade de seqüênciapercentual idêntica quando comparado com o alinhamento correspondentegerado pelo programa preferido.

(c) Como usado aqui, "identidade de seqüência" ou"identidade" no contexto de duas seqüências de polipeptídeos ou deaminoácidos faz referência aos resíduos nas duas seqüências que são iguaisquando alinhadas para correspondência máxima sobre uma janela decomparação especificada. Quando a percentagem da seqüência de identidadeé usada em referência a proteínas, reconhece-se que as posições dos resíduosque não são idênticos freqüentemente diferem por substituições deaminoácidos conservativas, onde resíduos de aminoácidos são substituídospor outros resíduos de aminoácidos com propriedades químicas similares (porexemplo, carga ou hidrofobicidade) e, assim, não trocam as propriedadesfuncionais da molécula. Quando as seqüências diferem nas substituiçõesconservativas, a identidade de seqüência percentual pode ser ajustada paracima para corrigir a natureza conservativa da substituição. As seqüências quediferem pelas substituições conservativas são referidas como tendo"similaridade de seqüência" ou "similaridade" . Meios para obter esta configuração são bem conhecidos dos versados na arte. Tipicamente, istoenvolve classificar uma substituição conservativa como uma desalinhamentoparcial em vez de um completo, aumentando assim a identidade de seqüênciapercentual. Assim, por exemplo, quando a um aminoácido idêntico éconferida uma classificação de 1 e a uma substituição não conservativa éconferida uma classificação de zero, a uma substituição conservativa éconferida uma classificação entre zero e 1. A classificação de substituiçõesconservativas é calculada, por exemplo, como implementado no programaPC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Califórnia).

(d) Como usado aqui, "porcentagem de identidade deseqüência" significa um valor determinado comparando duas seqüênciasotimamente alinhadas sobre uma janela de comparação, em que a porção daseqüência de polinucleotídeos na janela de comparação pode compreenderadições ou deleções (isto é, espaços) como comparada à seqüência dereferência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ótimodas duas seqüências. A percentagem é calculada determinando o número deposições em que a base de ácido nucleico idêntica ou resíduo de aminoácidosocorre em ambas as seqüências para dar o número de posições alinhadas,dividindo o número de posições alinhadas de modo correto pelo número totalde posições na janela de comparação, e multiplicando o resultado por 100para dar a identidade de seqüência percentual.

(e) (i) O termo "identidade substancial" de seqüênciaspolinucleotídicas significa que um polinucleotídeo compreende umaseqüência que tem pelo menos 50%, 50% por exemplo, 51%, 52%, 53%,54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%,67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, ou 79%,preferivelmente pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%»,88%, ou 89%, mais preferivelmente pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, ou94%, e o mais preferivelmente pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% deidentidade de seqüência, comparado a uma seqüência de referência usandoum dos programas de alinhamento descritos usando parâmetros padrões. Umversado na arte irá reconhecer que estes valores podem ser ajustados de modoapropriado para determinar a identidade correspondente de proteínascodificadas por duas seqüências nucleotídicas ao levar em conta adegenerescência do códon, similaridade de aminoácido, posicionamento doquadro de leitura, e outros. A identidade substancial de seqüências deaminoácidos para estes fins normalmente significa identidade de seqüência depelo menos 50% ou 60%, preferivelmente pelo menos 70% ou 80%, maispreferivelmente pelo menos 90%, 95%, e o mais preferivelmente pelo menos98%.

Outra indicação de que as seqüências nucleotídicas sãosubstancialmente idênticas é se duas moléculas hibridizam uma à outra emcondições estringentes. (ver abaixo). Geralmente, as condições estringentes são selecionadas para ser 5°C mais baixas do que o ponto de fusão térmico(Tm) na seqüência específica em um pH e resistência iônica definidos. Noentanto, as condições estringentes englobam temperaturas na faixa de cerca de1°C a cerca de 20°C, dependendo do grau desejado de estringência comoqualificado de outro modo aqui. Ácidos nucleicos que não hibridizam um ao outro em condições estringentes são ainda substancialmente idênticos se ospolipeptídeos que eles codificam forem substancialmente idênticos. Isto podeocorrer, por exemplo, quando uma cópia de um ácido nucleico é criadausando a degeneração de códons máxima permitida pelo código genético.

Uma indicação de que duas seqüências de aminoácidos são substancialmente idênticas é quando o polipeptídeo codificado pelo primeiro ácido nucleico éimunologicamente reativo cruzado com o polipeptídeo codificado pelosegundo ácido nucleico.

(ii) O termo "identidade substancial" no contexto de umpeptídeo indica que o peptídeo compreende uma seqüência com pelo menos 50%, por exemplo, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%,61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%,74%, 75%, 76%, 77%, 78%, ou 79%, preferivelmente 80%, 81%, 82%, 83%,84%, 85%, 86%, 87%, 88%, ou 89%, mais preferivelmente pelo menos 90%,91%, 92%, 93%, ou 94%, ou mesmo mais preferivelmente, 95%, 96%, 97%,98% ou 99%, de identidade de seqüência para a seqüência de referência sobrea janela de comparação especificada. Preferivelmente, alinhamento ótimo éconduzido usando o algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman eWunsch (1970). Uma indicação de que duas seqüências de peptídeos sãosubstancialmente idênticas é que um peptídeo é imunologicamente reativocom anticorpos criados contra o segundo peptídeo. Assim, um peptídeo ésubstancialmente idêntico a um segundo peptídeo, por exemplo, onde os doispeptídeos diferem somente por uma substituição conservativa.

Para comparação de seqüências, tipicamente uma seqüênciaatua como uma seqüência de referência para a qual seqüências de teste sãocomparadas. Quando usando um algoritmo de comparação de seqüência, asseqüências de teste e referência são colocadas como entrada no computador,coordenadas subseqüentes são designadas, se necessário, e os parâmetros deprograma de algoritmo de seqüência são designados. O algoritmo decomparação de seqüência então calcula a identidade de seqüência percentualpara a(s) seqüência(s) de teste com relação à seqüência de referência combase nos parâmetros de programa designados.

Como notado acima, outra indicação de que duas seqüênciasde ácido nucleico são substancialmente idênticas é que as duas moléculashibridizam uma na outra sob condições estringentes. A expressão"hibridizando especificamente para" refere-se à ligação, duplexagem, ouhibridização de uma molécula somente para uma seqüência nucleotídicaparticular sob condições estringentes quando esta seqüência está presente emum DNA ou RNA de mistura complexa (por exemplo, celular total). "Liga(m)substancialmente" refere-se a uma hibridização complementar entre um ácidonucleico de sonda e um ácido nucleico de marcação e englobadesalinhamentos menores que podem ser acomodados por redução daestringência do meio de hibridização para obter a detecção desejada daseqüência de ácido nucleico de marcação."Condições de hibridização estringentes" e "condições delavagem de hibridização estringentes" no contexto de experiências dehibridização de ácido nucleico como hibridização Southern e Northern sãodependentes de seqüência e são diferentes sob parâmetros ambientaisdiferentes. O Tm é a temperatura (sob pH e resistência iônica definidas) emque 50% da seqüência de marcação hibridizam para uma sonda perfeitamentealinhada. A especificidade é tipicamente a função de lavagens pós-hibridização, os fatores críticos sendo a resistência iônica e a temperatura dasolução de lavagem final. Para híbridos DNA-DNA, o Tm pode seraproximado da equação de Meinkoth e Wahl (1984):

Tm = 81,5°C + 16,6 (log10 M) + 0,41 (% GC) - 0,61 (% forma) - 500/L

em que M é a molaridade de cátions monovalentes, % GC é apercentagem de nucleotídeos guanosina e citosina no DNA, a % de forma é apercentagem de formamida na solução de hibridização, e L é o comprimentodo híbrido nos pares de bases. O Tm é reduzido em cerca de 1°C para cada 1%de desalinhamentos; assim, as condições de Tm, de hibridização e/ou lavagempodem ser ajustadas para hibridizar em seqüências da identidade desejada.Por exemplo, se seqüências com > 90% de identidade forem consideradas, oTm pode ser diminuído em 10°C. Em geral, as condições estringentes sãoselecionadas de modo a serem de cerca de 5°C mais baixas do que o ponto defusão térmico I para a seqüência específica e seu complemento em um pH eresistência iônica definidos. No entanto, condições severamente estringentespodem utilizar uma hibridização e/ou lavagem em 1, 2, 3 ou 4°C mais baixosdo que o ponto de fusão térmico I; condições moderadamente estringentespodem utilizar uma hibridização e/ou lavagem em 6, 7, 8, 9 ou 10°C maisbaixos do que o ponto de fusão térmico I; condições de baixa estringênciapodem utilizar uma hibridização e/ou lavagem em 11, 12, 13, 14, 15 ou 20°Cmais baixos do que o ponto de fusão térmico I.Usando a equação,composições de hibridização e de lavagem e T desejados, os versados na artecompreenderão que variações na estringência de soluções de hibridizaçãoe/ou lavagem são inerentemente descritas. Se o grau desejado de combinaçõesincorretas resultar em um T de menos do que 45°C (solução aquosa) ou 32°C(solução de formamida), prefere-se aumentar a concentração de SSC de modoque uma temperatura mais elevada pode ser usada. Um guia extenso sobre ahibridização de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen 1993. Geralmente,condições de hibridização altamente estringentes e lavagem são selecionadaspara serem cerca de 5 °C menores do que o ponto de fusão térmico Tm para aseqüência específica em um pH e resistência iônica definidos.

Um exemplo de condições altamente estringentes de lavagemé 0,15 M NaCl a 72°C durante cerca de 15 minutos. Um exemplo decondições estringentes de lavagem é uma lavagem a 0,2 X SSC a 65°Cdurante 15 minutos (ver, Sambrook, infra, para uma descrição de tampãoSSC). Com freqüência, uma lavagem de alta estringência é precedida por umalavagem de baixa estringência para remover o sinal de sonda de fundo. Umexemplo de lavagem de estringência média para um duplex de, por exemplo,mais do que 100 nucleotídeos, é 1 X SSC a 45°C durante 15 minutos. Umexemplo lavagem de estringência baixa para um duplex de, por exemplo, maisdo que 100 nucleotídeos, é 4 a 6 X SSC a 40°C durante 15 minutos. Parasondas curtas (por exemplo, cerca de 10 a 50 nucleotídeos), condiçõesestringentes tipicamente envolvem concentrações de sal de menos que cercade 1,5 M, mais preferivelmente cerca de 0,01 a 1,0 M, concentração iônica deNa (ou) a pH 7,0 a 8,3, e a temperatura é tipicamente pelo menos cerca de30°C e pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (por exemplo, >50nucleotídeos). Condições estringentes também podem ser obtidas com aadição de agentes desestabilizantes como formamida. Geralmente, umarelação de sinal para ruído de 2 X (ou maior) do que observado para umasonda não relacionada no teste particular de hibridização indica detecção deuma específica hibridização. Ácidos nucleicos que não hibridizam um emcada outro sob condições estringentes são ainda substancialmente idênticos seas proteínas que eles codificam são substancialmente idênticas. Isto ocorre,por exemplo, quando uma cópia de um ácido nucleico é criada usando adegenerescência de códon máxima permitida pelo código genético.

Condições muito estringentes são selecionadas para seremiguais ao Tm para uma sonda particular. Um exemplo de condiçõesestringentes para hibridização de ácidos nucleicos complementares que temmais do que 100 resíduos complementares no filtro em um blot Southern ouNorthern é 50% formamida, por exemplo, hibridização em 50% formamida, 1M NaCl, 1% SDS a 37°C, e uma lavagem em 0,1 x SSC a 60 a 65°C.Condições exemplares de baixa estringência incluem hibridização com umasolução de tampão de 30 a 35% formamida, 1 M NaCl, 1% SDS (dodecilsulfato de sódio) a 37°C, e uma lavagem em 1 X a 2 X SSC (20 X SSC=3,0M NaCl/0,3 M citrato trissódico) a 50 a 55°C. Condições exemplares deestringência moderada incluem hibridização em 40 a 45% formamida, 1,0 MNaCl, 1% SDS a 37°C, e uma lavagem em 0,5 X a 1 X SSC a 55 a 60°C.

Os seguintes são exemplos de conjuntos de condições dehibridização/lavagem que podem ser usadas para clonar seqüênciasnucleotídicas ortólogas que são substancialmente idênticas às seqüênciasnucleotídicas de referência da presente invenção: uma seqüência nucleotídicade referência preferivelmente hibridiza na seqüência nucleotídica dereferência em dodecil sulfato de sódio a 7% (SDS), 0,5 M NaP04, 1 mMEDTA a 50°C com lavagem em 2 X SSC, 0,1% SDS a 50°C, maisdesejavelmente em dodecil sulfato de sódio a 7% (SDS), 0,5 MNaP04, 1 mMEDTA a 50°C com lavagem em 1 X SSC, 0,1% SDS a 50°C, maisdesejavelmente ainda em dodecil sulfato de sódio a 7% (SDS), 0,5 M NaP04,1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 0,5 X SSC, 0,1% SDS a 50°C,preferivelmente em dodecil sulfato de sódio a 7% (SDS), 0,5 M NaP04, 1mM EDTA a 50°C com lavagem em 0,1 X SSC, 0,1% SDS a 50°C, maispreferivelmente em dodecil sulfato de sódio a 7% (SDS), 0,5 M NaPC>4, 1mM EDTA a 50°C com lavagem em 0,1 X SSC, 0,1% SDS a 65°C.

"Embaralhamento de DNA "é um método para introduzirmutações ou rearranjos, preferivelmente aleatoriamente, em uma molécula deDNA ou para gerar mudanças de seqüências de DNA entre duas ou maismoléculas de DNA, preferivelmente aleatoriamente. A molécula de DNAresultante do embaralhamento de DNA é uma molécula de DNA embaralhadaque é uma molécula de DNA não de ocorrência natural derivada de pelomenos uma molécula de DNA gabarito. O DNA embaralhado preferivelmentecodifica um polipeptídeo variante modificado com relação ao polipeptídeocodificado pelo DNA gabarito, e pode ter uma atividade biológica alteradacom relação ao polipeptídeo codificado pelo DNA gabarito.

"Molécula de DNA recombinante" é uma combinação deseqüências de DNA que são unidas juntas usando tecnologia de DNArecombinante e procedimentos usados para unir juntas as seqüências de DNAcomo descrito, por exemplo, em Sambrook et al., 1989.

A palavra "planta" refere-se a qualquer planta, particularmentea plantas agronomicamente úteis (por exemplo, plantas de semente), e "célulade planta" é uma unidade estrutural e fisiológica da planta, que compreendeuma parede celular também pode se referir a um protoplasto. A célula deplanta pode estar na forma de uma célula única isolada ou uma célulacultivada, ou como uma parte de uma unidade organizada superior como, porexemplo, um tecido de planta, ou um órgão de planta diferenciado em umaestrutura que está presente em qualquer estágio do desenvolvimento da planta.

Estas estruturas incluem um ou mais órgãos de plantas incluindo, mas não sãolimitados a, fruta, broto, caule, folha, pétala da flor, etc. Preferivelmente, Otermo "planta" inclui plantas completas, órgãos/estruturas vegetativos dobroto (por exemplo, folhas, caules e tubérculos), raízes, flores eórgãos/estruturas florais (por exemplo, brácteas, sépalas, pétala, estames,carpelos, anteros e óvulos), sementes (incluindo embrião, endosperma, e capada semente) e frutas (o ovário maduro), tecidos de plantas (por exemplo,tecido vascular, tecido triturado e semelhantes) e células (por exemplo,células de guarda, células de ovo, tricomas e semelhantes), e sua progênie. Aclasse de plantas que pode ser usada no método da invenção é geralmente tãoampla como a classe de plantas superiores e inferiores que podem passar pelastécnicas de transformação, incluindo angiospermas (plantas monocotiledôneae dicotiledônea), gimnospermas, fetos, e algas multicelulares. Inclui plantasde uma variedade de níveis plóides, incluindo aneuplóide, poliplóide,diplóide, haplóide e hemizigótico. Estão incluídos no escopo da invenção osgêneros e espécies de plantas superiores e inferiores do reino vegetal. Estãoainda incluídas as plantas maduras, semente, brotos e mudinhas, e partes,material de propagação (por exemplo, sementes e fruta) e culturas, porexemplo culturas de célula, dai derivadas. Preferidos são plantas e materiaisde planta das seguintes famílias de plantas: Amaranthaceae, Brassicaceae,Carophyllaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cucurbitaceae, Labiatae,Leguminosae, Papilionoideae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae, Rosaceae,Saxifragaceae, Scrophulariaceae, Solanaceae, Tetragoniaceae. Plantasanuais, perenes monocotiledôneas e dicotiledôneas são organismoshospedeiros preferidos para a geração de plantas transgênicas. O uso dosistema de recombinação ou método de acordo com a invenção é aindavantajoso em plantas ornamentais, silvicultura, fruta, ou árvores ornamental,flores, flores de corte, arbustos ou gramas. Referida planta pode incluir -masnão deve ser limitado a - briófítos como, por exemplo, Hepaticae (hepática) eMusci (musgos); pteridófitos como fetos, rabo-de-cavalo, e flores-das-montanhas; gimnospermas como coníferas, cicádias, ginkgo e Gnetaeae;algas como Clorophyceae, Faeophpyceae, Rhodophyceae, Myxophyceae,Xanthophyceae, Bacillariophyceae (diatomáceas) e Euglenophyceae. Plantaspara os fins da invenção podem compreender as famílias de Rosaceae comorosas, Ericaceae como rododentros, azaléias, Euphorbiaceae como poinsetiase crotão, Caryophyllaceae como cravos, Solanaceae como petunias,Gesneriaceae como violeta africana, Balsaminaceae como não-me-toques,Orchidaceae como orquídeas, Iridaceae como gladíolo, íris, frésia e açafrão, Compositae como tagetes, Geraniaceae como gerânio, Liliaceae comoDrachaena, Moraceae como ficus, Araceae como filodendros e muitas outras.As plantas transgênicas de acordo com a invenção são ainda selecionadas emparticular dentre as plantas de cultura dicotiledôneas como, por exemplo, dasfamílias de Leguminosae como ervilha, alfafa e soja; a família deUmbelliferae, particularmente o gênero Daucus (muito particularmente asespécies carota (cenoura)) e Apium (muito particularmente as espéciesgraveolens var. dulce (aipo)) e muitas outras; a família de Solanaceae,particularmente o gênero Lycopersicon, muito particularmente as espéciesesculentum (tomate) e o gênero Solanum, muito particularmente as espéciestuberosum (batata) e melongena (berinjela), tabaco e muitas outras; e o gêneroCapsicum, muito particularmente as espécies annum (pimenta) e muitasoutras; a família de Leguminosae, particularmente o gênero Glicina, muitoparticularmente as espécies max (soja) e muitas outras; e a família deCruciferae, particularmente o gênero Brassica, muito particularmente asespécies napus (colza de semente oleígena), campestris (beterraba), oleraceacv Tastie (repolho), oleracea cv Snowball Y (couve-flor) e oleracea cvEmperor (brócolis); e o gênero Arabidopsis, muito particularmente asespécies thaliana e muitas outras; a família de Compositae, particularmente ogênero Lactuca, muito particularmente as espécies sativa (alface) e muitasoutras. As plantas transgênicas de acordo como a invenção podem serselecionadas dentre plantas de culturas monocotiledôneas, como, porexemplo, cereais como trigo, cevada, sorgo e painço, centeio, triticale, milho,arroz ou aveia, e cana de açúcar. Ainda preferidas são as árvores como maçã,pêra, marmelo, ameixa, cereja, pêssego, nectarina, damasco, mamão papaya,manga, e outras espécies lenhosas incluindo árvores coníferas e decíduascomo álamo, pinheiro, sequóia, cedro, carvalho, etc. Especialmente preferidossão Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, colza de semente oleígena,soja, milho (milho), trigo, Linum usitatissimum (linhaça e linho), Camelinasativa, Brassica juncea, batata e tagetes.

Um "aumento significante" é um aumento que é maior do quea margem de erro inerente à técnica de medida, preferivelmente um aumentoem cerca de 2 vezes ou mais.

"Significantemente menor" significa que a diminuição é maiordo que a margem de erro inerente à técnica de medida, preferivelmente umadiminuição de cerca de 2 vezes ou mais.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção assim prove moléculas de ácido nucleicoisoladas compreendendo uma seqüência nucleotídica de planta que dirige atranscrição preferencial de semente ou específica de semente de umfragmento de ácido nucleico operativamente ligado em uma célula de planta.

Especificamente, a presente invenção prove cassetestransgênicos de expressão para regular a expressão preferencial de semente ouespecífica de semente em plantas compreendendo

a) pelo menos uma seqüência nucleotídica reguladora datranscrição de um gene codificando uma proteína peroxiredoxina (PER1), efuncionalmente ligada à mesma

Preferivelmente, o cassete de expressão da invençãocompreende

i) o gene descrito pelos loci do genoma de Arabidopsisthaliana do GenBank Atlg48130, e

ii) genes ortólogos do gene descrito pelos loci do genoma deArabidopsis thaliana do GenBank Atlg48130,

e funcionalmente ligado ao mesmo

Os promotores preferenciais de semente ou específicos desemente podem ser úteis para expressar genes assim como para produzirquantidades grandes de proteína, para expressar óleos ou proteínas deinteresse, por exemplo, anticorpos, genes para aumentar o valor nutricional dasemente e semelhantes.

O termo "semente" no contexto da invenção significa umasemente de uma planta em qualquer estágio de seu desenvolvimento, isto épartindo da fusão de pólen e oócitos, continuando sobre o estágio do embriãoe o estágio da semente dormente, até a germinação da semente, terminandocom os órgãos de mudinhas prematuras, como por exemplo cotilédones ehipocótilo.

"Transcrição específica de semente "no contexto destainvenção significa a transcrição de uma seqüência de ácido nucleico por umelemento regulador de transcrição em um modo em que a transcrição dereferida seqüência de ácido nucleico em sementes contribui a mais do que90%, preferivelmente mais do que 95%, mais preferivelmente mais do que99% da quantidade completa do RNA transcrito de referida seqüência deácido nucleico na planta completa durante qualquer um de seus estágios dedesenvolvimento. Estas seqüências nucleotídicas reguladoras de transcriçãoespecificamente descritas aqui são consideradas como sendo seqüênciasnucleotídicas reguladoras de transcrição específicas de semente.

"Transcrição preferencial de semente "no contexto destainvenção significa a transcrição de uma seqüência de ácido nucleico por umelemento regulador de transcrição em um modo em que a transcrição dereferida seqüência de ácido nucleico em sementes contribui para mais do que50%, preferivelmente mais do que 70%, mais preferivelmente mais do que80% da quantidade completa do transcrito de RNA da referida seqüência deácido nucleico na planta completa durante qualquer um dos seus estágios dedesenvolvimento.

"Homologo" é um termo genético usado na arte para indicaruma seqüência de polinucleotídeo ou polipeptídeo possuindo um grau elevadode parentesco de seqüência com uma seqüência de referência. Este parentescopode ser quantificado por determinação do grau de identidade e/ou similaridadeentre as duas seqüências como acima definido. Está dentro do significado destetermo genérico, os termos "ortólogo", e "parálogo". "Parálogo" refere-se a umpolinucleotídeo ou polipeptídeo que está dentro da mesma espécie que éfuncionalmente similar. "Ortólogo" refere-se a um polinucleotídeo oupolipeptídeo que é o equivalente funcional do polinucleotídeo ou polipeptídeoem outra espécie. Um ortólogo de gene significa preferivelmente um gene, queestá codificando uma proteína ortóloga. Mais especificamente, o termo"ortólogo" denota um polipeptídeo ou proteína obtido de uma espécie que é acontra-parte funcional de um polipeptídeo ou proteína de uma espéciediferente. As diferenças de seqüência dentre os ortólogos são o resultado deespeciação. Mais preferivelmente, "gene ortólogo" ou "ortólogo" como usadoaqui com relação ao gene de Arabidopsis descrito pelo locus Atlg48130 (e/ouo gene de Linum usitatissimum compreendendo a seqüência como descrita porSEQ ID NO: 9, 10, 11 ou 20) significa um gene codificando uma proteína quetem pelo menos 50% ou 60%, preferivelmente pelo menos 70% ou 80%, maispreferivelmente pelo menos 80% ou 90%, o mais preferivelmente pelo menos95% identidade de seqüência de aminoácido para um polipeptídeo descrito porqualquer uma das SEQ ID NOs: 13 ou 21. Mais preferivelmente, referidaproteína ainda tem a propriedade enzimática de uma proteína peroxiredoxina(PER1). Várias destas proteínas (proteínas ortólogas) são descritas aqui, porexemplo, pela seqüência de polipeptídeos como descrita por SEQ ID NO: 13,15, 17, 19, 21 ou 23. A identidade entre as proteínas ortólogas é descrita na

Tabela 1 abaixo.

Tabela 1: Identidade entre as proteínas ortólogas (proteínas decomprimento completo)

<table>table see original document page 57</column></row><table> Tabela 2: Identidade entre as proteínas ortólogas emcomparação com os fragmentos da proteína de Linum usitatissimum(comparação é limitada ao comprimento do fragmento e faixa de identidade écalculada por sua parte sobre o comprimento das seqüências parciais deLinum usitatissimum apenas)

<table>table see original document page 57</column></row><table>Preferivelmente a seqüência nucleotídica reguladora datranscrição da invenção compreende pelo menos uma seqüência de promotordo gene respectivo (por exemplo, uma seqüência localizada a montante doinício de transcrição do gene respectivo capaz de induzir a transcrição dasseqüências a jusante). Referida seqüência nucleotídica reguladora datranscrição pode compreender a seqüência de promotor de referidos genesmas pode ainda compreender outros elementos como a seqüência 5'-nãotraduzida, melhorador, íntrons etc. Preferivelmente, referida seqüência depromotor dirige a transcrição preferencial de semente ou específica desemente de um segmento de ácido nucleico operativamente ligado em umaplanta ou célula de planta por exemplo, um DNA de planta ligadocompreendendo uma matriz de leitura aberta para um gene estrutural ouregulatório.

A seguinte Tabela 1 ilustra os genes dos quais os promotoresda invenção são preferivelmente isolados, a função de referidos genes, ocDNA codificado pelos referidos genes, e a proteína (ORF) codificada pelosreferidos genes.

Tabela 1: Genes, dos quais os promotores da invenção sãopreferivelmente isolados, função putativa de referidos genes, cDNA e aproteína codificada pelos referidos genes.

<table>table see original document page 58</column></row><table>

Algumas das seqüências reguladoras de transcrição providasaqui são novas e como tal não foram previamente descritas nas arte. Assim,outra forma de realização da invenção refere-se a uma seqüência isoladanucleotídica (preferivelmente tendo atividade reguladora de transcrição, maispreferivelmente tendo atividade de promotor) selecionada dentre o grupo deseqüências consistindo de:

Como especificado acima na seção de DEFINIÇÃO,identidades entre seqüências nucleotídicas são preferivelmente medidas peloprograma BLASTN usando parâmetros de default com um comprimento depalavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, um corte de 100, M=5, N=-4, euma comparação de ambos os filamentos. Para medir a identidade entreseqüências de aminoácido, o programa BLASTP é usado com parâmetros dedefault com um comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10,e a matriz de escore BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff, 1989). OPrograma BLAST versão 1.4.7 ou posterior é usado.Preferivelmente, a seqüência nucleotídica reguladora datranscrição é selecionada dentre o grupo de seqüências consistindo de

i) a seqüência descrita por SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, ou 11,

ii) um fragmento de pelo menos 50 bases consecutivas de uma seqüência sob i),

iv) uma seqüência nucleotídica capaz de hibridizar(preferivelmente sob condições equivalentes à hibridização em dodecil sulfatode sódio a 7% (SDS), 0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 2X SSC, 0,1% SDS a 50°C, mais desejavelmente em dodecil sulfato de sódio a 7% (SDS), 0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 1 X SSC,0,1% SDS a 50°C, mais desejavelmente ainda em dodecil sulfato de sódio a7% (SDS), 0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 0,5 X SSC,0,1% SDS a 50°C, preferivelmente em dodecil sulfato de sódio a 7% (SDS),0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 0,1 X SSC, 0,1% SDS a50°C, mais preferivelmente em dodecil sulfato de sódio a 7% (SDS), 0,5 MNaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 0,1 X SSC, 0,1% SDS a 65°C)para uma seqüência nucleotídica reguladora da transcrição descrita por SEQID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou 11, ou o seu complemento;

v) uma seqüência nucleotídica capaz de hibridizar (preferivelmente sob condições equivalentes à hibridização em dodecil sulfatode sódio a 7% (SDS), 0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 2X SSC, 0,1% SDS a 50°C, mais desejavelmente em dodecil sulfato de sódio a7% (SDS), 0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 1 X SSC,0,1% SDS a 50°C, mais desejavelmente ainda em dodecil sulfato de sódio a7% (SDS), 0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 0,5 X SSC,0,1% SDS a 50°C, preferivelmente em dodecil sulfato de sódio a 7% (SDS),0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 0,1 X SSC, 0,1% SDS a50°C, mais preferivelmente em dodecil sulfato de sódio a 7% (SDS), 0,5 MNaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 0,1 X SSC, 0,1% SDS a 65°C)para um ácido nucleico compreendendo 50 a 200 ou mais nucleotídeosconsecutivos de uma seqüência nucleotídica reguladora da transcrição descritapor SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou 11, ou o seu complemento;

vi) uma seqüência nucleotídica que é o complemento oucomplemento reverso de qualquer uma das seqüências nucleotídicaspreviamente mencionadas sob i) to v).

Em uma forma de realização preferida, as seqüênciasespecificadas sob ii), iii), iv) v) e vi) acima são capazes de modificar atranscrição em uma célula de planta ou organismo, preferivelmente referidasseqüências têm substancialmente a mesma atividade reguladora de transcriçãocomo a seqüência nucleotídica reguladora da transcrição descrita por SEQ IDNO: 1,2,3,4, 5,6, 7, 8, 9,10, ou 11.

Preferivelmente, uma seqüência nucleotídica tendosimilaridade substancial a uma seqüência nucleotídica reguladora datranscrição descrita por SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou 11 temuma identidade de seqüência de pelo menos 50% ou 60%, preferivelmentepelo menos 70% ou 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% ou 95%, omais preferivelmente pelo menos 98% to uma seqüência descrita por SEQ IDNO: 1,2,3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, ou 11.

Preferivelmente, a hibridização é realizada sob condiçõesestringentes (incluindo condições de estringência baixa e elevada), maispreferivelmente sob condições de estringência elevada.

A seqüência nucleotídica reguladora da transcrição pode serobtida ou é obtenível a partir de DNA genômico de planta de um genecodificando um polipeptídeo (preferivelmente de um gene ortólogo isto é,codificando uma proteína ortóloga) que

ii) GDFTPVC (SEQ ID NO: 39), preferivelmenteLFSHPGDFTPVCTTEL (SEQ ID NO: 40),

iii) VKLLGLS (SEQ ID NO:41),preferivelmente RGVKLLGLSCDD (SEQ ID NO: 42),

v) KLSFLYP (SEQ ID NO: 45),

preferivelmente (K/V)(I/V)KLSFLYPS (SEQ ID NO: 46),

vi) GRNMDEV (SEQ ID NO: 47), preferivelmenteTGRNMDEV(L/V)RA (SEQ ID NO: 48),

vii) (I/V)ATP(V/A)NW (SEQ ID NO: 49),preferivelmente K(I/V)ATP(V/A)NW(K/N)P (SEQ ID NO:50), e

viii) PSKKGYL (SEQ ID NO: 51), preferivelmenteLPSKKGYLR (SEQ ID NO: 52),

ou

Um equivalente funcional da seqüência nucleotídicareguladora da transcrição pode ser obtido ou é obtenível a partir de DNAgenômico de planta de um gene codificando um polipeptídeo (preferivelmentede um gene ortólogo isto é, codificando uma proteína ortóloga) que ésubstancialmente similar e preferivelmente tem pelo menos 50% ou 60%,preferivelmente pelo menos 70% ou 80%, mais preferivelmente pelo menos90% ou 95%, o mais preferivelmente pelo menos 97% ou 98% identidade deseqüência de aminoácido para um polipeptídeo descrito por qualquer uma dasSEQ ID NOs: 13, 15, 17, 19, 21, ou 23, respectivamente, ou um fragmento dereferida seqüência nucleotídica reguladora da transcrição que demonstraatividade de promotor em um modo preferencial de semente ou específico desemente.

Os equivalentes funcionais adicionais à seqüência nucleotídicareguladora da transcrição da invenção são obteníveis de DNA genômico deplanta de um gene codificando um polipeptídeo que compreende pelo menosdois ou três, preferivelmente pelo menos quatro ou cinco, maispreferivelmente seis, o mais preferivelmente todos os motivos de seqüênciadescritos por SEQ ID NO: 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49,50, 51 ou 52 e - preferivelmente - demonstra atividade de promotor emplantas (preferivelmente em um modo preferencial de semente ou específicode semente).

a) compreende pelo menos um, preferivelmente pelo menosdois ou três, mais preferivelmente todos o(s) motivo(s) de seqüênciaselecionado (s) dentre o grupo consistindo das seqüências de aminoácido

ii) GDFTPVC (SEQ ID NO: 39), preferivelmenteLFSHPGDFTPVCTTEL (SEQ ID NO: 40),

iii) VKLLGLS (SEQ ID NO: 41),preferivelmente RGVKLLGLSCDD (SEQ ID NO: 42),

v) KLSFLYP (SEQ ID NO: 45), preferivelmente(K/V)(I/V)KLSFLYPS (SEQ ID NO: 46),

vi) GRNMDEV (SEQ ID NO: 47), preferivelmenteTGRNMDEV(L/V)RA (SEQ ID NO: 48),

viii) PSKKGYL (SEQ ID NO: 51), preferivelmenteLPSKKGYLR (SEQ ID NO: 52), e

b) tem pelo menos 50% identidade de seqüência deaminoácido para um polipeptídeo selecionado dentre o grupo descrito porSEQ ID NO: 13, 15, 17, 19,21, e 23.

Preferivelmente, referida proteína ortóloga tem ainda a mesmaatividade enzimática que a proteína codificada pelo locus de Arabidopsisthaliana locus Atlg48130.

A atividade de uma seqüência nucleotídica reguladora datranscrição é considerada equivalente se a transcrição for iniciada em ummodo preferencial de semente ou específico de semente (como definidoacima). Este perfil de expressão é preferivelmente demonstrado usando genesrepórteres operativamente ligados à referida seqüência nucleotídicareguladora da transcrição. Genes repórteres preferidos (Schenborn 1999)neste contexto são proteína fluorescente verde (GFP) (Chui 1996; Leffel1997), cloranfenicol transferase, luciferase (Millar 1992), B-glucuronidase ouP-galactosidase. Especialmente preferido é B-glucuronidase (Jefferson 1987).

Além disso, a atividade reguladora de transcrição de umafunção equivalente pode variar da atividade de sua seqüência parental,especialmente com relação ao nível de expressão. O nível de expressão podeser maior ou menor do que o nível de expressão da seqüência parental. Ambasas derivações podem ser vantajosas dependendo da seqüência de ácidonucleico de interesse a ser expressada. Preferidas são estas seqüênciasfuncionais equivalentes, que - em comparação com sua seqüência parental-não deriva do nível de expressão de referida seqüência parental em mais doque 50%, preferivelmente 25%, mais preferivelmente 10% (como a serpreferivelmente julgado por ou expressão de mRNA ou expressão de proteína(por exemplo, gene repórter)). Ainda preferidas são seqüências equivalentesque demonstram uma expressão aumentada em comparação com suaseqüência parental, preferivelmente um aumento de pelo menos 50%, maispreferivelmente em pelo menos 100%, o mais preferivelmente em pelo menos500%.

Preferivelmente, equivalente funcional da seqüêncianucleotídica reguladora da transcrição pode ser obtido ou é obtenível a partirde DNA genômico de planta de um gene expressando um mRNA descrito porum cDNA que é substancialmente similar e preferivelmente tem pelo menos50% ou 60%, preferivelmente pelo menos 70% ou 80%, mais preferivelmentepelo menos 90% ou 95%, o mais preferivelmente pelo menos 97% ou 98% deidentidade de seqüência para uma seqüência descrita por qualquer uma dentreSEQ ID NOs: 12, 14, 16, 18, 20, ou 22, respectivamente, ou um fragmento dereferida seqüência nucleotídica reguladora da transcrição que demonstraatividade de promotor em um modo preferencial de semente ou específico desemente.

Este equivalente funcional da seqüência nucleotídicareguladora da transcrição pode ser obtido a partir de outras espécies de plantausando as seqüências de promotor de Arabidopsis thaliana ou Linumusitatissimum preferenciais de semente ou específicas de semente, descritasaqui como sondas para triar genes estruturais homólogos em outras plantaspor hibridização sob condições de hibridização baixas, moderadas ouestringentes. Regiões das seqüências de promotor preferenciais de semente ouespecíficas de semente da presente invenção que são conservadas dentre asespécies também podem ser usadas como iniciadores de PCR para amplificarum segmento de uma espécie diferente de Arabidopsis ou Linumusitatissimum, e este segmento usado como uma sonda de hibridização (aúltima abordagem permitir uma triagem de maior estringência) ou em umteste de transcrição para determinar a atividade do promotor. Além disso, asseqüências de promotor preferenciais de semente ou específicas de sementepodem ser empregadas para identificar seqüências estruturalmenterelacionadas em uma base de dados usando algoritmos de computador.

Mais especificamente, com base nas seqüências de ácidonucleico da a presente invenção, ortólogos podem ser identificados ouisolados do genoma de qualquer organismo desejado, preferivelmente deoutra planta, de acordo como técnicas bem conhecidas com base em suasimilaridade de seqüência para as seqüências de ácido nucleico deArabidopsis ou Linum usitatissimum, por exemplo, hibridização, PCR oucomparações de seqüência geradas por computador. Por exemplo, toda ouuma parte de uma seqüência de ácido nucleico particular de Arabidopsisthaliana ou Linum usitatissimum é usada como uma sonda que seletivamentehibridiza para as outras seqüências de genes presentes em uma população defragmentos DNA genômico ou cDNA clonados (isto é, bibliotecas genômicasou cDNA) de um organismo de fonte selecionado. Além disso, as bibliotecasde cDNA e genômicas apropriadas podem ser preparadas a partir de qualquercélula ou tecido de um organismo. Estas técnicas incluem triagem porhibridização de bibliotecas de DNA em placas (ou placas ou colônias; ver, porexemplo, Sambrook 1989) e amplificação por PCR usando iniciadores deoligonucleotídeo preferivelmente correspondendo a domínios de seqüênciaconservados dentre o polipeptídeo relacionado ou subseqüências dasseqüências nucleotídicas providas aqui (ver, por exemplo, Innis 1990). Estesmétodos são particularmente bem apropriados para o isolamento deseqüências de genes de organismos intimamente relacionados com osorganismos dos quais a seqüência de sonda é derivada. A aplicação destesmétodos usando seqüências de Arabidopsis thaliana ou Linum usitatissimumcomo sondas é bem apropriada para o isolamento de seqüências de gene dequalquer organismo de fonte, preferivelmente outras espécies de plantas. Emuma abordagem de PCR, iniciadores de oligonucleotídeo podem serprojetados para uso em reações PCR para amplificar as seqüências de DNAcorrespondentes do cDNA ou DNA genômico extraído de qualquer planta deinteresse. Métodos para projetar iniciadores de PCR e clonagem de PCR sãogeralmente conhecidos na arte.

Em técnicas de hibridização, toda ou parte de uma seqüêncianucleotídica é usada como uma sonda que seletivamente hibridiza para outrasseqüências nucleotídicas correspondentes presentes em uma população defragmentos de DNA genômico clonados ou fragmentos de cDNA (isto é,bibliotecas genômica ou cDNA) de um organismo selecionado. As sondas dehibridização podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de cDNA,fragmentos de RNA, ou outros oligonucleotídeos, e podem ser rotuladas comum grupo detectável como 32P, ou qualquer outro marcador detectável. Assim,por exemplo, sondas para hibridização podem ser feitas por rotulação deoligonucleotídeos sintéticos com base em uma seqüência da invenção.Métodos para a preparação de sondas para hibridização e para construção debibliotecas de cDNA e genômica são geralmente conhecidos na arte e sãodescritos em Sambrook et al. (1989). Em geral, seqüências que hibridizampara as seqüências descritas aqui terão pelo menos cerca de 50% to 70% emesmo cerca de 80%) 85%), 90%, 95% a 9 8% ou mais de identidade com asseqüências descritas. Isto é, a similaridade de seqüência das seqüências podeestar na faixa, compartilhando pelo menos cerca de 50% to 70%, e mesmocerca de 80%, 85%, 90%, 95% a 98% de similaridade de seqüência.

As moléculas de ácido nucleico da invenção também podemser identificadas por, por exemplo, uma busca de base de dados conhecidaspara genes codificando polipeptídeos tendo uma seqüência especificada deidentidade de aminoácido ou DNA tendo uma identidade de seqüêncianucleotídica especificada. Métodos de alinhamento de seqüências paracomparação são bem conhecidos na arte e são descritos aqui acima.

Assim, as moléculas de ácido nucleico isolado da invençãoincluem os ortólogos das seqüências de Arabidopsis thaliana ou Linumusitatissimum descritas aqui, isto é, as seqüências nucleotídicascorrespondentes em organismos diferentes de Arabidopsis thaliana ou Linumusitatissimum incluindo, mas não limitados a, plantas diferentes deArabidopsis thaliana ou Linum usitatissimum, preferivelmente plantasdicotiledôneas, por exemplo, alfafa, girassol, soja, algodão, amendoim,tabaco, colza de semente oleígena ou beterraba de açúcar, mas tambémplantas de cereal como milho, trigo, centeio, gramas, sorgo, painço, cana deaçúcar, cevada e banana. Um gene ortólogo é um gene de uma espéciediferente que codifica um produto tendo a mesma ou função similar, porexemplo, catalisando a mesma reação como um produto codificado por umgene de um organismo de referência. Assim, um ortólogo inclui polipeptídeostendo menos que, por exemplo, 50% de identidade de seqüência deaminoácidos, mas cujo ortólogo codifica um polipeptídeo tendo a mesma oufunção similar. Bases de dados como GenBank podem ser empregadas paraidentificar seqüências relacionadas com as seqüências de Arabidopsis, porexemplo, ortólogos em outras plantas dicotiledôneas. Alternativamente,técnicas de DNA recombinantes, como hibridização ou PCR, podem serempregadas para identificar seqüências relacionadas com as seqüências deArabidopsis thaliana ou Linum usitatissimum ou para clonar as seqüênciasequivalentes de DNAs diferentes.As seqüências nucleotídicas reguladoras de transcrição dainvenção ou seus equivalentes funcionais podem ser obtidas ou isoladas dequalquer fonte de planta ou não planta, ou produzidas sinteticamente pormeios puramente químicos. As fontes preferidas incluem, mas não sãolimitadas às plantas, como definidas na seção de DEFINIÇÃO acima.

Assim, outra forma de realização preferida da invenção refere-se a um método para identificar e/ou isolar a seqüência nucleotídicareguladora da transcrição (preferivelmente com atividade reguladora detranscrição preferencial de semente ou específica de semente) caracterizadoem que a referida identificação e/ou isolamento utiliza a seqüência de ácidonucleico codificando um polipeptídeo como descrita por SEQ ID NO: 13, 15,17, 19, 21, ou 23, ou uma parte de referida seqüência de ácido nucleico.Preferidas são seqüências de ácido nucleico descritas por SEQ ID NO: 12, 14,16, 18, 20, ou 22 ou partes das mesmas. "Parte" neste contexto significa umaseqüência de ácido nucleico de pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos,preferivelmente pelo menos 25 nucleotídeos consecutivos, maispreferivelmente pelo menos 50 nucleotídeos consecutivos.

O método para identificação e/ou isolamento pode ser baseadoem (mas não é limitado a) métodos descritos acima como reação em cadeia dapolimerase, hibridização ou triagem de base de dados. Preferivelmente, estemétodo da invenção é baseado em uma reação em cadeia da polimerase, emque referida seqüência de ácido nucleico ou sua parte é utilizada como uminiciador de oligonucleotídeo. O versado na arte conhece vários métodos paraamplificar e isolar o promotor de um gene partindo de parte de sua seqüênciade codificação (como, por exemplo, parte de um cDNA). Estes métodospodem incluir mas não são limitados a métodos como PCR inverso (" iPCR")ou "PCR interlaçado assimétrico térmico" (" TAIL PCR" ).

Assim, outra forma de realização da invenção refere-se a ummétodo para prover ou produzir um cassete de expressão transgênica paraexpressão heteróloga em plantas compreendendo as etapas de:

I. isolar de uma seqüência nucleotídica reguladora datranscrição um gene de planta utilizando pelo menos uma seqüência de ácidonucleico codificando um polipeptídeo descrito por SEQ ID NO: 13, 15, 17,19, 21, ou 23, ou uma parte de pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos dereferida seqüência de ácido nucleico, e

Ainda outra forma de realização da invenção refere-se a ummétodo para prover um cassete de expressão transgênica para expressãopreferencial de semente ou específica de semente compreendendo as etapasde:

I. isolar a seqüência nucleotídica reguladora da transcriçãopreferencial de semente ou específica de semente utilizando pelo menos umaseqüência de ácido nucleico ou uma parte da mesma, em que referidaseqüência está codificando um polipeptídeo descrito por SEQ ID NO: 13, 15,17, 19, 21, ou 23, ou uma parte de pelo menos 15 nucleotídeos consecutivosdo mesmo, e

II. funcionalmente ligar referida seqüência nucleotídicareguladora da transcrição preferencial de semente ou específica de semente aoutra seqüência nucleotídica de interesse, que é heteróloga com relação àreferida seqüência nucleotídica reguladora da transcrição preferencial desemente ou específica de semente.

Preferivelmente, a seqüência nucleotídica utilizada paraisolamento de referida seqüência nucleotídica reguladora da transcrição estácodificando um polipeptídeo (preferivelmente de um gene ortólogo isto é,codificando uma proteína ortóloga) compreendendo pelo menos um motivode seqüência selecionado dentre o grupo consistindo da seqüência deaminoácido

ii) GDFTPVC (SEQ ID NO: 39), preferivelmenteLFSHPGDFTPVCTTEL (SEQ ID NO: 40),

iii) VKLLGLS (SEQ ID NO: 41),preferivelmente RGVKLLGLSCDD (SEQ ID NO: 42),

v) KLSFLYP (SEQ ID NO: 45),

preferivelmente (K/V)(I/V)KLSFLYPS (SEQ ID NO: 46),

vi) GRNMDEV (SEQ ID NO: 47), preferivelmenteTGRNMDEV(L/V)RA (SEQ ID NO: 48),

vii) (I/V)ATP(V/A)NW (SEQ ID NO: 49),preferivelmente K(I/V)ATP(V/A)NW(K/N)P (SEQ ID NO: 50),e

viii) PSKKGYL (SEQ ID NO: 51), preferivelmenteLPSKKGYLR (SEQ ID NO: 52).

Preferivelmente, a seqüência de ácido nucleico empregadapara o isolamento compreende pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos,preferivelmente pelo menos 25 nucleotídeos consecutivos, maispreferivelmente pelo menos 50 nucleotídeos consecutivos de uma seqüênciadescrita por SEQ ID NO: 12, 14, 16, 18, 20, ou 22. Preferivelmente, oisolamento da seqüência nucleotídica reguladora da transcrição preferencialde semente ou específica de semente é realizado por uma reação em cadeia dapolimerase utilizando referida seqüência de ácido nucleico como uminiciador. A ligação operacionável pode ser realizada por método declonagem padrão bem conhecido na arte, como clonagem mediada por ligaçãoou clonagem mediada por recombinação.

Preferivelmente, as seqüências nucleotídicas reguladoras detranscrição e promotores da invenção incluem um pedaço consecutivo decerca de 25 a 2000, incluindo 50 a 500 ou 100 a 250, e até a 1000 ou 1500,nucleotídeos contíguos, por exemplo, 40 a cerca de 743, 60 a cerca de 743,125 a cerca de 743, 250 a cerca de 743, 400 a cerca de 743, 600 a cerca de743, de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, e 11, ouos seus promotores ortólogos, que incluem a região de promotor mínima.

Em uma forma de realização particular da invenção, referidopedaço consecutivo de cerca de 25 a 2000, incluindo 50 a 500 ou 100 a 250, eaté 1000 ou 1500, nucleotídeos contíguos, por exemplo, 40 a cerca de 743, 60a cerca de 743, 125 a cerca de 743, 250 a cerca de 743, 400 a cerca de 743,600 a cerca de 743, tem pelo menos 50% ou 60%, preferivelmente pelomenos 70% ou 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% e o maispreferivelmente pelo menos 95%, identidade de seqüência de ácido nucleicocom um correspondente pedaço consecutivo de cerca de 25 a 2000, incluindo50 a 500 ou 100 a 250, e até 1000 ou 1500, nucleotídeos contíguos, porexemplo, 40 a cerca de 743, 60 a cerca de 743, 125 a cerca de 743, 250 acerca de 743, 400 a cerca de 743, 600 a cerca de 743, de qualquer um dentreSEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, e 11, ou os seus promotoresortólogos, que incluem a região de promotor mínima. O pedaço acimadefinido de nucleotídeos contíguos preferivelmente compreendem um ou maismotivos de promotor selecionados dentre o grupo consistindo de caixa TATA,caixa GC-, caixa CAAT- e um sítio de partida de transcrição.

As seqüências nucleotídicas reguladoras de transcrição dainvenção ou seus equivalentes funcionais são capazes de dirigir a expressãopreferencial de semente ou específica de semente de uma seqüência decodificação em uma célula alvo, particularmente em uma célula de planta. Asseqüências de promotor e métodos descritos aqui são úteis na regulação daexpressão preferencial de semente ou específica de semente, respectivamente,de qualquer seqüência nucleotídica heteróloga em uma planta hospedeira afim de variar o fenótipo desta planta. Estes promotores podem ser usados comcombinações de melhorador, elementos a montante, e/ou ativação deseqüências das regiões de flanco 5' de genes estruturais expressáveis emplantas Similarmente, o elemento a montante pode ser usado em combinaçãocom várias seqüências de promotor de planta.

As seqüências nucleotídicas reguladoras de transcrição epromotores da invenção são úteis para modificar o fenótipo de uma planta.Varias mudanças no fenótipo de uma planta transgênica são desejáveis, isto é,a modificação da composição de ácido graxo em uma planta, alteração do teorde aminoácido de uma planta, alteração do mecanismo de defesa aospatógenos da planta, e semelhantes. Estes resultados podem ser obtidos aoprover a expressão de produtos heterólogos ou aumentada expressão deprodutos endógenos em plantas. Alternativamente, os resultados podem serobtidos ao prover uma redução de expressão de um ou mais produtosendógenos, particularmente enzimas ou cofatores na planta. Estas mudançasresultam em uma alteração no fenótipo da planta transformada.

Geralmente, as seqüências nucleotídicas reguladoras detranscrição e promotores da invenção podem ser empregadas para expressarum segmento de ácido nucleico que é operativamente ligado ao referidopromotor como, por exemplo, uma matriz de leitura aberta, ou uma porção damesma, uma seqüência anti-sentido, uma seqüência codificando para umaseqüência de RNA filamento duplo, ou um transgene em plantas.

Uma ligação operativa pode - por exemplo - compreender umarranjo seqüencial da seqüência nucleotídica reguladora da transcrição dainvenção (por exemplo, uma seqüência como descrita por SEQ ID NO: 1, 2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou 11) com a seqüência de ácido nucleico a serexpressada, e -opcionalmente -elementos regulatórios adicionais como porexemplo elementos de poliadenilação ou terminação de transcrição,melhoradores, íntrons etc, em um modo em que a seqüência nucleotídicareguladora da transcrição pode preencher sua função no processo deexpressão da seqüência de ácido nucleico de interesse sob as condiçõesapropriadas. O termo "condições apropriadas" significa preferivelmente apresença do cassete de expressão em uma célula de planta. Preferidos são osarranjos, em que a seqüência de ácido nucleico de interesse a ser expressada écolocada a jusante (isto é, na direção 3') da seqüência nucleotídica reguladorada transcrição da invenção em um modo, em que ambas as seqüências sãocovalentemente ligadas. Opcionalmente, seqüências adicionais podem serinseridas entre as duas seqüências. Estas seqüências podem ser por exemplosítios de clonagem de ligador ou múltiplos. Além disso, as seqüências podemser inseridas codificando para partes de proteínas de fusão (no caso de umaproteína de fusão da proteína codificada pelo ácido nucleico de interesse serdestinada a ser expressada). Preferivelmente, a distância entre a seqüência deácido nucleico de interesse a ser expressada e a seqüência nucleotídicareguladora da transcrição da invenção é não é maior do que 200 pares de base,preferivelmente não é maior que 100 pares de base, mais preferivelmente no émaior do que 50 pares de base.

Uma ligação operativa com relação a qualquer cassete deexpressão ou da invenção pode ser realizada por vários métodos conhecidosna arte, compreendendo procedimentos tanto em vitro como em vivo. Assim,um cassete de expressão da invenção ou um vetor compreendendo estecassete de expressão pode ser realizado usando técnicas de recombinação eclonagem padrões bem conhecidas na arte (ver por exemplo, Maniatis 1989;Silhavy 1984; Ausubel 1987).

Um cassete de expressão também pode ser montado porinserção de uma seqüência nucleotídica reguladora da transcrição da invenção(por exemplo, uma seqüência como descrita por SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, ou 11) no genoma da planta. Esta inserção irá resultar em umaligação operativa em uma seqüência de ácido nucleico de interesse que, comotal, já existia no genoma. Esta inserção do ácido nucleico de interesse éexpressada em um modo preferencial de semente ou específico de sementedevido às propriedades reguladoras da transcrição da seqüência nucleotídicareguladora da transcrição. A inserção pode ser dirigida ou por acaso.Preferivelmente a inserção é dirigida e realizada por, por exemplo,recombinação homóloga. Por este procedimento, um promotor natural podeser trocado contra a seqüência nucleotídica reguladora da transcrição dainvenção, assim modificando o perfil de expressão de um gene endógeno. Aseqüência nucleotídica reguladora da transcrição também pode ser inseridaem um modo, em que o mRNA anti-sentido de um gene endógeno éexpressado, assim induzindo o silenciamento do gene.

Similar, uma seqüência de ácido nucleico de interesse a serexpressada pode ser inserida no genoma da planta compreendendo aseqüência nucleotídica reguladora da transcrição em seu meio genômico inatural (isto é ligado ao seu gene natural) em um modo em que a seqüênciainserida se torna operativamente ligada à seqüência nucleotídica reguladorada transcrição, assim formando um cassete de expressão da invenção.

O cassete de expressão pode ser empregado para numerososfins de expressão como por exemplo expressão de uma proteína, ou expressãode um RNA anti-sentido, RNA sentido ou filamento duplo. Preferivelmente, aexpressão da seqüência de ácido nucleico confere à planta um traçoagronomicamente valioso.

A matriz de leitura aberta a ser ligada à seqüência nucleotídicareguladora da transcrição da invenção pode ser obtida a partir de um gene deresistência de inseto, um gene de resistência a doença como, por exemplo,gene de resistência a doença bacteriana, um gene de resistência a doença defungos, gene de resistência a doença viral, um gene de resistência a doença denematódeos, um gene de resistência a herbicida, um gene afetando acomposição ou qualidade dos grãos, um gene de utilização de nutrientes, umgene de redução de micotoxina, um gene de esterilidade masculina, um genede marcador selecionável, um gene de marcador triável, um marcadorselecionável negativo, marcador selecionável positivo, um gene afetando ascaracterísticas agronômicas da planta, isto é, rendimento, capacidade de ficarem pé, e semelhantes, ou um gene de resistência ao meio ambiente ouestresse, isto é, um ou mais genes que conferem resistência ou tolerância aherbicidas, resistência ou tolerância a insetos, resistência ou tolerância adoenças, (viral, bacteriana, fungica, oomicetos, ou nematódeos), resistênciaou tolerância a estresse, (como exemplificado por resistência ou tolerância aseca, calor, frio, congelamento, umidade excessiva, estresse de sal, ou estresseoxidativo), rendimentos aumentados, teor e compleição alimentícia, aparênciafísica, esterilidade masculina, secura, capacidade de ficar em pé, fertilidade,propriedades ou quantidade de amido, quantidade e qualidade do óleo,composição de proteína ou aminoácido, e semelhantes. Por "resistente"significa-se uma planta, que não demonstra substancialmente mudançasfenotípicas como uma conseqüência de uma administração de agentes,infecção com um patógeno ou exposição a estresse. Por "tolerante", significa-se uma planta que, apesar de mostrar algumas mudanças fenotípicas comouma conseqüência de infecção, não tem uma capacidade reprodutivasubstancialmente diminuída ou metabolismo substancialmente alterado.

As seqüências nucleotídicas reguladoras de transcriçãopreferenciais de semente ou específicas de semente (por exemplo,promotores) são úteis para expressar uma ampla variedade de genes incluindoos que alteram as vias metabólicas, conferem resistência a doenças, para aprodução de proteínas, por exemplo, produção de anticorpos, ou paramelhorar a absorção de nutrientes semelhantes. As seqüências nucleotídicasreguladoras de transcrição preferenciais de semente ou específicas de semente(por exemplo, promotores) podem ser modificadas de modo a seremreguláveis, por exemplo, indutíveis. Os genes e seqüências nucleotídicasreguladoras de transcrição (por exemplo, promotores) descritos aqui acimapodem ser usados para identificar genes ortólogos e suas seqüênciasnucleotídicas reguladoras de transcrição (por exemplo, promotores) que sãotambém provavelmente expressados em um tecido e/ou modo dedesenvolvimento particulares. Além disso, as seqüências nucleotídicasreguladoras de transcrição ortólogas (por exemplo, promotores) são úteis paraexpressar matrizes de leitura aberta ligadas. Além disso, por alinhamento dasseqüências nucleotídicas reguladoras de transcrição (por exemplo,promotores) destes ortólogos, novos elementos eis podem ser identificadosque são úteis para gerar seqüências nucleotídicas reguladoras de transcriçãosintéticas (por exemplo, promotores).

A expressão regulando as seqüências nucleotídicasespecificadas acima pode ser opcionalmente operativamente ligado a outrasseqüências regulatórias apropriadas, por exemplo, uma seqüência determinador de transcrição, operador, sítio de ligação de repressor, sítio deligação de fator de transcrição e/ou um melhorador.

A presente invenção ainda prove um vetor recombinantecontendo o cassete de expressão da invenção, e células hospedeirascompreendendo o cassete de expressão ou vetor, por exemplo,compreendendo um plasmídeo. O cassete de expressão ou vetor podeaumentar o genoma de uma planta transformada ou pode ser mantido extracromossomicamente. O cassete de expressão ou vetor da invenção pode estarpresente no núcleo, cloroplasto, mitocôndria e/ou plastídeo das células daplanta. Preferivelmente, o cassete de expressão ou vetor da invenção estácompreendida no DNA cromossômico do núcleo da planta. A presenteinvenção também prove uma planta transgênica preparada por este método, asemente desta planta e plantas de progênie desta incluindo híbridos ecruzamentos endogâmicos. O cassete de expressão pode ser operativamenteligado a um gene estrutural, a sua matriz de leitura aberta, ou uma porção damesma. O cassete de expressão pode ainda compreender um plasmídeo Ti eestar contido em uma célula de Agrobacterium tumefaciens; ele pode sertransportado em uma micropartícula, em que a micropartícula é apropriadapara transformação balística de uma célula de planta; ou pode estar contidoem uma célula de planta ou protoplasto. Além disso, o cassete de expressãoou vetor pode estar contido em uma planta transformada ou células da mesma,e a planta pode ser uma dicotiledônea ou monocotiledônea. Em particular, aplanta pode ser uma planta dicotiledônea. Preferidas plantas transgênicas sãomilho, soja, cevada, alfafa, girassol, canola, soja, algodão, amendoim, sorgo,tabaco, beterraba de açúcar, arroz, trigo, centeio, gramas, painço, cana deaçúcar, tomate, ou batata transgênicos.

A invenção também prove um método de cruzamento deplantas, por exemplo, para preparar uma planta transgênica fértil cruzada. Ométodo compreende cruzar uma planta transgênica fértil compreendendo umcassete de expressão particular da invenção com ela mesma ou com umasegunda planta, por exemplo, uma faltando o cassete de expressão particular,preparar a semente de uma planta transgênica fértil cruzada compreendendo ocassete de expressão particular. A semente é então plantada para obter umaplanta transgênica fértil cruzada. A planta pode ser uma monocotiledônea ou adicotiledônea. Em uma forma de realização particular, a planta é uma plantadicotiledônea. A planta transgênica fértil cruzada pode ter o cassete deexpressão particular herdado através de um parental feminino ou através deum parental masculino. A segunda planta pode ser uma planta endogâmica. Aplanta transgênica fértil cruzada pode ser um híbrido. Também estão incluídasna presente invenção sementes de qualquer uma destas plantas transgênicasférteis cruzadas.As seqüências nucleotídicas reguladoras de transcrição dainvenção ainda compreendem seqüências que são complementares a uma (aseguir seqüência de "teste") que hibridiza sob condições estringentes com amolécula de ácido nucleico como descrita por SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9, 10, ou 11 assim como RNA que é transcrito da molécula de ácidonucleico. Quando a hibridização é realizada sob condições estringentes, ou amolécula de teste ou a de ácido nucleico da invenção é preferivelmentesuportada, por exemplo, em uma membrana ou chip de DNA. Assim, ou umamolécula de teste desnaturada ou de ácido nucleico da invenção épreferivelmente primeiro ligada a um suporte e a hibridização é efetuada porum período de tempo especificado a uma temperatura de, por exemplo, entre55 e 70°C, em solução salina tamponada com citrato de potência dupla (SC)contendo 0,1% SDS seguido por enxágüe do suporte na mesma temperaturamas com um tampão tendo uma concentração de SC reduzida. Dependendodo grau de estringência requerido, estes tampões de concentração reduzidasão tipicamente de SC de potência única contendo 0,1% SDS, SC de potênciamédia, contendo 0,1% SDS e SC de potência de um décimo, contendo 0,1%SDS. Mais preferivelmente, a hibridização é realizada sob condições deestringência elevada (como definido acima).

Virtualmente qualquer composição de DNA pode ser usadapara a distribuição às células de planta recipientes, por exemplo, células dedicotiledônea, para produzir, por fim, plantas transgênicas férteis de acordocom a presente invenção. Por exemplo, segmentos ou fragmentos de DNA naforma de vetores e plasmídeos, ou segmentos ou fragmentos de DNA linear,em alguns casos contendo somente o elemento de DNA a ser expressado naplanta, e semelhantes, podem ser empregados. A construção de vetores, quepodem ser empregados em conjunto com a presente invenção, serão bemconhecidos dos versados à luz da presente descrição (ver, por exemplo,Sambrook 1989; Gelvin 1990).Vetores, plasmídeos, cosmídeos, YACs (cromossomosartificiais de leveduras) ACs (cromossomos artificiais bacterianos) esegmentos de DNA para uso na transformação destas células irão, comoevidente, geralmente compreender o cDNA, gene ou genes que se desejaintroduzidas nas células. Estas construções de DNA podem ainda incluirestruturas como promotores, melhoradores, poliligadores, ou mesmo genesregulatórios como desejado. O segmento de DNA, fragmento ou geneescolhido para introdução celular irá com freqüência codificar uma proteínaque será expressada nas células recombinantes resultantes, como irão resultarem um traço triável ou selecionável 6 que irá conferir um fenótipo melhoradoà planta regenerada. No entanto, este não pode ser sempre o caso, e a presenteinvenção também engloba plantas transgênicas incorporando transgenes nãoexpressados.

Em algumas formas de realização, é contemplado que se podedesejar empregar vetores virais competentes para replicação na transformaçãode monocotiledôneas. Estes vetores incluem, por exemplo, vetores detransporte do vírus do ananismo do trigo (WDV) como pWl-11 e PW1-GUS(Ugaki 1991). Estes vetores são capazes de replicação autônoma em célulasde milho assim como E. coli, e como tal pode prover aumentada sensibilidadepara detectar DNA distribuído nas células transgênicas. Um vetor dereplicação também pode ser útil para distribuição de genes flanqueados porseqüências de DNA de elementos transposáveis, como Ac, Ds, ou Mu. Foiproposto (Laufs 1990) que a transposição destes elementos dentro do genomado milho requer replicação de DNA. É também contemplado que elementostransposáveis devem ser úteis para introdução de segmentos de DNA oufragmentos faltando elementos necessários para a seleção e manutenção dovetor de plasmídeo em bactérias, por exemplo, genes de resistência aantibióticos e origens de replicação de DNA. É também proposto que o uso deum transposável elemento como Ac, Ds, ou Mu deve ativamente promover aação do DNA desejado e assim aumentar a freqüência de células estavelmentetransformadas. O uso de um elemento transposável como Ac, Ds, ou Mu podeativamente promover a integração do DNA de interesse e assim aumentar afreqüência de células estavelmente transformadas. Elementos transposáveispodem ser úteis para permitir a separação de genes de interesse de elementosnecessários para seleção e manutenção de um vetor plasmídeo em bactériasou seleção de um transformante. Por uso de um elemento transposável,seqüências de DNA desejáveis e indesejáveis podem ser transposadas além decada outra no genoma, como que através de segregação genética em progênie,pode-se identificar plantas com ou seqüências de DNA ou desejáveis ouindesejáveis.

A seqüência nucleotídica de interesse ligada a uma ou maisdas seqüências nucleotídicas reguladoras de transcrição da invenção pode, porexemplo, codificar para um RNA ribossômico, um RNA anti-sentido ouqualquer outro tipo de RNA que não é traduzido em proteína. Em outra formade realização preferida da invenção, referida seqüência nucleotídica deinteresse é traduzida em um produto de proteína. A seqüência nucleotídicareguladora da transcrição e/ou seqüência nucleotídica de interesse ligada àmesma pode ser de origem homóloga ou heteróloga com relação à planta a sertransformada. A molécula recombinante de DNA útil para introdução emcélulas de planta inclui a que foi derivada ou isolada de qualquer fonte, quepode ser subseqüentemente caracterizada com relação a estrutura, tamanhoe/ou função, quimicamente alterada, e posteriormente introduzida em plantas.Um exemplo de uma seqüência nucleotídica ou segmento de interesse"derivado "de uma fonte, poderia ser uma seqüência nucleotídica ou segmentoque é identificado como um fragmento utilizável dentro de um dadoorganismo, e que é então quimicamente sintetizado em forma essencialmentepura. Um exemplo desta seqüência nucleotídica ou segmento de interesse"isolado" de uma fonte, deveria ser uma seqüência nucleotídica ou segmentoque é excisado ou removido de referida fonte por meios químicos, porexemplo, pelo uso de endonucleases de restrição, de modo que pode ser aindamanipulada, por exemplo, amplificada, para uso na invenção, pelametodologia de engenharia genética. Esta seqüência nucleotídica ou segmentoé comumente referida como "recombinante."

Assim, uma seqüência nucleotídica, segmento ou fragmento deinteresse utilizável inclui DNA completamente sintético, DNA semi-sintético,DNA isolado de fontes biológicas, e DNA derivado de RNA introduzido.Geralmente, o DNA introduzido não é originalmente residente no genótipo daplanta, que é o recipiente do DNA, mas está no escopo da invenção isolar umgene de um dado genótipo de planta, e subseqüentemente introduzir múltiplascópias do gene no mesmo genótipo, por exemplo, para melhorar a produçãode um dado produto de gene como uma proteína de armazenamento ou umaproteína que confere tolerância ou resistência a falta d'água.

A molécula recombinante introduzida de DNA inclui mas nãoé limitada a, DNA de genes de planta, e genes não de planta como os debactérias, leveduras, animais ou vírus. O DNA introduzido pode incluir genesmodificados, porções de genes, ou gene quiméricos, incluindo genes domesmo ou diferentes genótipos. O termo "gene quimérico" ou "DNAquimérico" é definido como um gene ou uma seqüência de DNA ou segmentocompreendendo pelo menos duas seqüências ou segmentos de DNA deespécies que não combinam DNA sob condições naturais, ou cujas seqüênciasou segmentos de DNA são posicionadas ou ligadas em um modo que nãoocorre normalmente no genoma nativo de planta não transformada.

A molécula recombinante introduzida de DNA usada paratransformação aqui pode ser circular ou linear, filamento duplo ou filamentoúnico. Geralmente, o DNA está na forma de DNA quimérico, como DNAplasmídeo que pode também conter regiões de codificação flanqueadas porseqüências regulatórias, que promovem a expressão do DNA recombinantepresente na planta resultante. Geralmente, a molécula recombinanteintroduzida de DNA será relativamente pequena, isto é, menor do que cercade 30 kb para minimizar qualquer susceptibilidade a degradação física,química ou enzimática, que se sabe aumenta como o tamanho da molécula denucleotídeo aumenta. Como notado acima, o número de proteínas, transcritosde RNA ou sua misturas, que é introduzido no genoma da planta, épreferivelmente pre-selecionado e definido por exemplo, dentre um a cerca de5-10 de tais produtos do DNA introduzido que podem ser formados.

Dois métodos principais para o controle de expressão sãoconhecidos, ou seja.: super-expressão e sub-expressão. Super -expressão podeser obtida por inserção de uma ou mais do que uma cópia extra do geneselecionado. No entanto, não é conhecido para plantas ou sua progênie,originalmente transformada com uma ou mais do que uma cópia extra de umaseqüência nucleotídica, para demonstrar os efeitos de sub-expressão assimcomo super-expressão. Para sub-expressão, existem dois métodos principais,que são comumente referidos na arte como "regulação negativa anti-sentido"e "regulação negativa sentido"(sentido regulação negativa é também referidacomo "co-supressão"). Genericamente estes processos são referidos como"silenciamento de gene". Ambos os métodos levam a uma inibição deexpressão do gene de marcação.

A obtenção de níveis suficientes de expressão de transgene nostecidos de plantas apropriados é um aspecto importante na produção deculturas geneticamente engenheiradas. Expressão de seqüências de DNAheterólogas em um hospedeiro de planta é dependente da presença de umpromotor ligado operativamente que é funcional dentro do hospedeiro deplanta. A escolha da seqüência de promotor irá determinar quando e ondedentro do organismo a seqüência de DNA heteróloga é expressada.

E especificamente contemplado pelos inventores que se podemutageneizar um promotor para potencialmente melhorar a utilidade doselementos para a expressão de transgenes em plantas. A mutagênese desteselementos pode ser realizada em seqüências de promotor aleatórias emutageneizadas triadas para atividade por um procedimento de tentativa eerro. Alternativamente, seqüências particulares que provêem o promotor comcaracterísticas de expressão desejáveis, ou o promotor com atividade demelhora de expressão, pode ser identificado e estas ou seqüências similaresintroduzidas nas seqüências via mutação. É ainda contemplado que se podemutageneizar estas seqüências a fim de melhorar sua expressão de transgenesem uma espécie particular.

Os meios para mutageneizar um segmento de DNAcodificando a seqüência de promotor da presente invenção são bemconhecidos dos versados na arte. Como indicado, modificações do promotorou outros elementos regulatórios podem ser feitas por procedimentos demutagene aleatória ou sítio-específica. O promotor e outros elementosregulatórios podem ser modificados por alteração de sua estrutura através deadição ou deleção de um ou mais nucleotídeos de uma seqüência que codificaas correspondentes seqüências não modificadas.

Mutagênese pode ser realizada de acordo com qualquer umadas técnicas conhecidas na arte, como, e não limitados a, síntese de umoligonucleotídeo tendo uma ou mais mutações dentro de uma seqüência deuma região regulatória particular. Em particular, mutagene sítio-específica éuma técnica utilizável na preparação de mutantes de promotor, através demutagênese específica do DNA subjacente. A técnica ainda prove uma prontacapacidade de preparar e testar variantes de seqüência, por exemplo,incorporando uma ou mais das acima considerações, por introdução de umaou mais mudanças de seqüência nucleotídica no DNA. Mutagene sítio-específica permite a produção de mutantes através de uso de seqüênciasoligonucleotídicas específicas que codificam a seqüência de DNA da desejadamutação, assim como um suficiente número de nucleotídeos adjacentes,prover uma seqüência de iniciador de suficiente tamanho e complexidadeseqüência para formar um duplex estável em ambos os lados da junção dedeleção sendo atravessada. Tipicamente, um iniciador de cerca de 17 a cercade 75 nucleotídeos ou mais em comprimento é preferido, com cerca de 10 acerca de 25 ou mais resíduos em ambos os lados da junção de uma seqüênciasendo alterados.

Em geral, a técnica de mutagene sítio-específica é bemconhecida na arte, como exemplificado por várias publicações. Como seránotado, a técnica tipicamente emprega um vetor de fago, que existe em tantouma forma de filamento único como filamento duplo. Os vetores úteis típicosem mutagênese sítio-dirigida incluem vetores como o fago Ml3. Estes fagossão prontamente comercialmente disponíveis e seu uso é geralmente bemconhecidos versados na arte. Plasmídeos de filamento duplo também sãoempregados como rotina em mutagênese sítio-dirigida, que elimina a etapa detransferência do gene de interesse de um plasmídeo a um fago.

Em geral, mutagênese sítio-dirigida de acordo com o presenteé realizada por primeiro obtenção de um vetor de filamento único ouafastamento por fusão dos dois filamentos de um vetor de filamento duplo,que inclui em sua seqüência, uma seqüência de DNA que codifica o promotor.

O iniciador de oligonucleotídeo contendo a seqüência mudada desejada épreparado, geralmente sinteticamente. Este iniciador é então anelado com ovetor de filamento único, e submetido a enzimas de polimerização de DNAcomo fragmento Klenow de polimerase I de E. coli, a fim de completar asíntese do filamento contendo a mutação. Assim, um heteroduplex é formadoem que um filamento codifica a seqüência original não mudada e o segundofilamento contendo a desejada mutação. Este vetor heteroduplex é entãousado para transformar ou transfectar as células apropriadas, como células deE. coli, e células são selecionadas que incluem vetores recombinantescontendo o arranjo de seqüência mudado. Vetor DNA pode então ser isoladodestas células e usado para transformação da planta. Um esquema de seleçãogenético foi projetado por Kunkel et al. (1987) para enriquecer os clonesincorporando oligonucleotídeos mutagênicos. Alternativamente, o uso dePCR com enzimas termoestáveis, comercialmente disponíveis, como Taqpolimerase pode ser usado para incorporar um iniciador oligonucleotídeomutagênico em um fragmento de DNA amplificado que pode então serclonado em um vetor de clonagem ou expressão apropriado. Osprocedimentos de mutagênese mediados por PCR de Tomic et al. (1990) eUpender et al. (1995) fornecem dois exemplos destes protocolos. Um PCRempregando uma ligase termoestável em adição a uma polimerasetermoestável, também pode ser usado para incorporar um oligonucleotídeomutagênico fosforilado em um fragmento de DNA amplificado que podeentão ser clonado em um vetor de clonagem ou expressão apropriado. Oprocedimento de mutagênese descrito por Michael (1994) prove um exemplode um tal protocolo.

A preparação de variantes de seqüência dos segmentos deDNA codificando promotores selecionados, usando mutagênese sítio-dirigidaé provido como um meio de produzir espécies potencialmente úteis e não sesignifica ser limitativo, como existem outros modos em que as variantes de seqüências de DNA podem ser obtidas. Por exemplo, vetores recombinantescodificando a seqüência de promotor desejada podem ser tratados comagentes mutagênicos, como hidroxilamina, para obter variantes de seqüência.

Como usado aqui; o termo "procedimento de mutagênesedirigida para oligonucleotídeo "refere-se a processos dependentes de gabarito e propagação mediada por vetor que resultam em um aumento naconcentração de uma molécula específica de ácido nucleico relativa à suaconcentração inicial, ou em um aumento na concentração de um sinaldetectável, como amplificação. Como usado aqui, o termo "procedimento demutagênese dirigido a oligonucleotídeo" também se destina a fazer referênciaa um processo que envolve uma extensão dependente de gabarito de umamolécula de iniciador. O termo processo dependente de gabarito refere-se àsíntese de ácido nucleico de um RNA ou uma molécula de DNA em que aseqüência do filamento recentemente sintetizado de ácido nucleico é ditadapor regras bem conhecidas de formação de pares de bases complementares(ver, por exemplo, Watson e Rarnstad, 1987). Tipicamente, metodologiasmediadas por vetor envolvem a introdução do fragmento de ácido nucleicoem um vetor de DNA ou RNA, a amplificação clonal do vetor, e arecuperação do fragmento de ácido nucleico amplificado. Exemplos de taismetodologias são providos por patente US No. 4.233.224. Vários processosdependentes de gabarito são disponíveis para amplificar as seqüências demarcação de interesse presentes em uma amostra, estes métodos sendo bemconhecidos na arte e especificamente descritos aqui abaixo.

Onde um clone compreendendo um promotor foi isolado deacordo com a presente invenção, pode-se desejar delimitar as regiões depromotor essenciais dentro de um clone. Um meio marcado efetivo parapreparar os promotores mutagenizantes se baseia na identificação deelementos regulatórios putativos dentro da seqüência de promotor. Isto podeser iniciado por comparação com seqüências de promotor conhecidas comosendo expressadas em um modo específico de tecido ou de desenvolvimentosingular. Seqüências, que são compartilhadas dentre promotores com padrõessimilares de expressão, são provavelmente candidatos para a ligação defatores de transcrição e são assim provavelmente elementos que conferempadrões de expressão. Confirmação destes elementos regulatórios putativospode ser obtida por análise de deleção de cada região regulatória putativa,seguido por análise funcional de cada construção de deleção por teste de umgene repórter, que é funcionalmente fixado a cada construção. Como tal, umavez que a seqüência de promotor de partida é provida, qualquer um dentre umnúmero de mutantes de deleção diferentes do promotor de partida pode serprontamente preparado.

Os fragmentos funcionalmente equivalentes de uma seqüêncianucleotídica reguladora da transcrição da invenção podem também ser obtidospor remoção ou deleção de seqüências não essenciais sem a deleção daessencial. A limitação da seqüência nucleotídica reguladora da transcrição aoseus elementos mediadores de transcrição essenciais pode ser realizada invitro por mutações de deleção de tentativa-e-seta, ou in silico usando rotinasde busca do elemento promotor. Regiões essenciais para a atividade dopromotor com freqüência demonstram agrupamentos de alguns elementos depromotor conhecidos. Esta análise pode ser realizada usando algoritmosdisponíveis de computador, como PLACE ("Plant Cis-acting RegulatoryDNA Elements" ; Higo 1999), a base de dados de BIOBASE " Transfac"(Biologische Datenbanken GmbH, Braunschweig; Wingender 2001) ou a basede dados PlantCARE (Lescot 2002).

Preferivelmente, fragmentos equivalentes funcionais de umadas seqüências nucleotídicas reguladoras de transcrição da invençãocompreende pelo menos 100 pares de base, preferivelmente, pelo menos 200pares de base, mais preferivelmente pelo menos 500 pares de base de umaseqüência nucleotídica reguladora da transcrição como descrita por SEQ IDNO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou 11. Mais preferivelmente, este fragmentocomeça a partir da extremidade 3' das seqüências indicadas.

Especialmente preferidos são os fragmentos equivalentes deseqüências nucleotídicas reguladoras de transcrição, que são obtidos pordeleção da região codificando a região 5'-não traduzida do mRNA, assimsomente provendo a região do promotor (não transcrita). A região 5'-nãotraduzida pode ser facilmente determinada por métodos conhecidos na arte(como análise 5'-RACE). Assim, algumas das seqüências nucleotídicasreguladoras de transcrição da invenção são fragmentos equivalentes de outrosseqüências (ver Tabela 2 abaixo).Tabela 2: Relações de seqüências nucleotídicas reguladoras detranscrição da invenção

<table>table see original document page 89</column></row><table>

Como indicado acima, mutantes de deleção, mutantes dedeleção do promotor da invenção também podem ser aleatoriamentepreparados e então testados. Com esta estratégia, uma série de construçõessão preparadas, cada contendo uma porção diferente do clone (um subclone),e estas construções são então tríadas para atividade. Um meio apropriado paraa triagem da atividade consiste em fixar um promotor deletado ou construçãode intron, que contém um segmento deletável para um marcador selecionávelou triável, e para isolar somente as células expressando o gene marcador.Deste modo, um número de diferentes construções de promotor deletado sãoidentificadas que ainda retém a atividade desejada, ou mesmo melhorada. Omenor segmento, que é requerido para atividade, é assim identificado atravésde comparação das construções selecionadas. Este segmento pode então serusado para a construção de vetores para a expressão de genes exógenos.

Uma análise de motivo de promotor pode ser feita, porexemplo, por uso do software Genomatix Matlnspector Release professional7.3 (Agosto 2004) (ver Exemplo 8 para detalhes. De acordo com outra formade realização da invenção, a seqüência reguladora de transcrição compreendida nos cassetes de expressão compreende pelo menos uma regiãode seqüência selecionada (preferivelmente 2 regiões, mais preferivelmentetodas as 3 regiões; em que preferivelmente a região b) está seguindo a regiãoa), e região c) se seguindo a região a) e/ ou região b)) dentre o grupoconsistindo de

a) uma região (tendo um comprimento de 50 a 1500 bp,preferivelmente 60 a 1000 bp) compreendendo pelo menos dois,preferivelmente três ou quatro, mais preferivelmente cinco de seis, o maispreferivelmente todos os seguintes motivos:

i) TACT (SEQ ID NO: 53), preferivelmente anTACTctt(SEQ ID NO: 77), mais preferivelmente agTACTctttga (SEQ ID NO: 101),

ii) AGAA (SEQ ID NO: 54), preferivelmentegannnnacnAGAA (SEQ ID NO: 78), mais preferivelmente agaggagacaAGAAa (SEQ ID NO: 102),

iii) AAAG (SEQ ID NO: 55), preferivelmentegannntgcAAAGnnna (SEQ ID NO: 79), mais preferivelmentegaagttgcAAAGttgag (SEQ ID NO: 103),

iv) CCAT (SEQ ID NO: 56), preferivelmente CCATtccttgtagta (SEQ ID NO: 80), mais preferivelmente

CCATtccttgtagtact (SEQ ID NO: 104),

v) TAAA (SEQ ID NO: 57), preferivelmente TAAAnaatc(SEQ ID NO: 81), mais preferivelmente TAAAtaatctat (SEQ ID NO: 105),

vi) CTAT (SEQ ID NO: 58), preferivelmenteccattgCTATcctngntagaaacta (SEQ ID NO: 82), mais preferivelmentetccattgCTATccttgttagaaactaa (SEQ ID NO: 106),

vii) ACGT (SEQ ID NO: 59), mais preferivelmentetnnnACGTa (SEQ ID NO: 83), mais preferivelmente ttttacACGTacc (SEQIDNO: 107),

em que referidos motivos são preferivelmente orientados emorientação 5'-3' de acordo como a numeração indicada acima (isto é, númeroii) está a jusante de número i)), b) uma região (tendo um comprimento de 50 a1000 bp, preferivelmente 60 a 500 bp) compreendendo pelo menos dois,preferivelmente três ou quatro, mais preferivelmente cinco de seis, o maispreferivelmente todos os seguintes motivos

i) AAAA (SEQ ID NO: 60), preferivelmenteannnnaAAAAtgtta (SEQ ID NO: 84), mais preferivelmenteacaaaacaAAAAtgttaatat (SEQ ID NO: 108),

ii) GTTA (SEQ ID NO: 61), preferivelmente annanGTTA(SEQ ID NO: 85), mais preferivelmente acaaaaatGTTAata (SEQ ID NO:109),

iii) TTAA (SEQ ID NO: 62), preferivelmente TTAAna (SEQID NO: 86), mais preferivelmente aaaaatgTTAAtatttt (SEQ ID NO: 110),

iv) ACAT (SEQ ID NO: 63), preferivelmentegaaannannnACAT (SEQ ID NO: 87), mais preferivelmenteatatgaaaatattaACATttt (SEQ ID NO: 111),

v) TnCC (SEQ ID NO: 64), preferivelmente TnCCnnannngt(SEQ ID NO: 88), mais preferivelmente aatTTCCatatttgtaggaaa (SEQ IDNO: 112),

em que referidos motivos são preferivelmente orientados emorientação 5'-3' de acordo como a numeração indicada acima (isto é, númeroii) está a jusante de número i)),

c) uma região (tendo um comprimento de 50 a 1500 bp,preferivelmente 60 a 1000 bp) compreendendo pelo menos dois,preferivelmente três ou quatro, mais preferivelmente cinco de seis, o maispreferivelmente todos os seguintes motivos

i) CATG (SEQ ID NO: 65), preferivelmente CATGca (SEQID NO: 89), mais preferivelmente cccaagtaCATGcaaaatttaacggtt (SEQ IDNO: 113),

ii) TTAT (SEQ ID NO: 66), mais TTATtataagtaaat (SEQID NO: 90), mais preferivelmente TTATtataagtaaattg (SEQ ID NO: 114),

iii) TTTT (SEQ ID NO: 67), mais TTTTt (SEQ ID NO: 91),mais preferivelmente atTTTTtatta (SEQ ID NO: 115),iv) ACGT (SEQ ID NO: 68), preferivelmentegtggnngnnnACGT (SEQ ID NO: 92), mais preferivelmenteaaatgtggtagcgtACGTgtg (SEQ ID NO: 116),

v) AGAA (SEQ ID NO: 69), preferivelmenteggnnnntcnAGAA (SEQ ID NO: 93), mais preferivelmente tggcggctccAGAAt(SEQ IDNO: 117),

vi) ACGT (SEQ ID NO: 70), preferivelmente cgUCGTggc(SEQ ID NO: 94), mais preferivelmente cttgcgt4CGrggcggc (SEQ ID NO:118),

vii)ACGT (SEQ ID NO: 71), preferivelmente ACGTggc(SEQ ID NO: 95), mais preferivelmente tgaagagaACGTggccctgag (SEQ IDNO: 119),

viii) ACGT (SEQ ID NO: 72), preferivelmentegnnnACGTg (SEQ ID NO: 96), mais preferivelmentetgcatgaagagaACGTggccctgagtc (SEQ ID NO: 120),

ix) CATG (SEQ ID NO: 73), preferivelmente CATGca (SEQID NO: 97), mais preferivelmente gttctcttCATGcaaggatagtagaac (SEQ IDNO: 121),

x) ACCC (SEQ ID NO: 74), preferivelmente cACCCanc(SEQ ID NO: 98), mais preferivelmente actccACCCacctcc (SEQ ID NO: 122) ,

xi) CCAT (SEQ ID NO: 75), preferivelmente cannCCATc(SEQ ID NO: 99), mais preferivelmente ctttcccatcCCATcca (SEQ ID NO: 123) ,

xii) TTTT (SEQ ID NO: 76), preferivelmente TTTTt (SEQID NO: 100), mais preferivelmente caTTTTtatca (SEQ ID NO: 124),

em que referidos motivos são preferivelmente orientados emorientação 5'-3' de acordo como a numeração indicada acima (isto é, númeroii) está a jusante de número i)).O termo "motivo" como usado acima significa que nem todosos nucleotídeos da seqüência indicada precisam estar presentes para qualificara presença de um motivo. Os nucleotídeos individuais de uma matriz demotivo completa (por exemplo, atagattaTTTAgaa) são de relevânciadiferente. O motivo compreende uma região conservada (por exemplo,attaTTTA), - que consiste de uma região de núcleo (por exemplo, TTA;letras maiúsculas em negrito) e uma parte menos conservada (por exemplo,att, letras minúsculas em negrito). Os motivos descritos acima podem estarpresentes em uma ou mais cópias na região respectiva (ver Exemplo 8 porexemplos).

Mais especificamente, a seqüência reguladora de transcriçãocompreendida nos cassetes de expressão compreende pelo menos uma regiãode seqüência (preferivelmente 2 regiões, mais preferivelmente todas as 3regiões; em que preferivelmente região b) é seguinte região a), e região c) seseguindo a região a) e/ ou região b)) selecionada dentre o grupo consistindode

a) uma região (tendo um comprimento de 50 a 1500 bp,preferivelmente 60 a 1000 bp) compreendendo pelo menos dois,preferivelmente três ou quatro, mais preferivelmente cinco de seis, o maispreferivelmente todos os motivos de promotor descritos por SEQ ID NO: 53,54, 55, 56, 57, 58, ou 59, em que referidos motivos são preferivelmenteorientados em orientação 5'-3' de acordo com sua numeração de SEQ ID (istoé, SEQ ID NO: 54 está a jusante de SEQ ID NO: 53),

b) uma região (tendo um comprimento de 50 a 1000 bp,preferivelmente 60 a 500 bp) compreendendo pelo menos dois,preferivelmente três ou quatro, mais preferivelmente cinco de seis, o maispreferivelmente todos os motivos de promotor descritos por SEQ ID NO: 60,61, 62, 63 ou 64, em que referidos motivos são preferivelmente orientados emorientação 5'-3' de acordo com sua numeração de SEQ ID (isto é, SEQ IDNO: 61 está a jusante de SEQ ID NO: 60),

c) uma região (tendo um comprimento de 50 a 1500 bp,prefenvelmente 60 a 1000 bp) compreendendo pelo menos dois,prefenvelmente três ou quatro, mais prefenvelmente cinco de seis, o maispreferivelmente todos os motivos de promotor descritos por SEQ ID NO: 65,66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, ou 76, em que referidos motivos sãopreferivelmente orientados em orientação 5'-3' de acordo com sua numeraçãode SEQ ID (isto é, SEQ ID NO: 71 está a jusante de SEQ ID NO: 70).

Preferivelmente, a seqüência reguladora de transcriçãocompreendida nos cassetes de expressão compreende pelo menos uma regiãode seqüência (preferivelmente 2 regiões, mais preferivelmente todas as 3regiões; em que preferivelmente região b) é seguinte região a), e região c) seseguindo a região a) e/ ou região b)) selecionada dentre o grupo consistindode

a) uma região (tendo um comprimento de 50 a 1500 bp,preferivelmente 60 a 1000 bp) compreendendo pelo menos dois,preferivelmente três ou quatro, mais preferivelmente cinco de seis, o maispreferivelmente todos os motivos de promotor descritos por SEQ ID NO: 77,78, 79, 80, 81, 82, ou 83, em que referidos motivos são preferivelmenteorientados em orientação 5'-3' de acordo com sua numeração de SEQ ID (istoé, SEQ ID NO: 78 está a jusante de SEQ ID NO: 77),

b) uma região (tendo um comprimento de 50 a 1000 bp,preferivelmente 60 a 500 bp) compreendendo pelo menos dois,preferivelmente três ou quatro, mais preferivelmente cinco de seis, o maispreferivelmente todos os motivos de promotor descritos por SEQ ID NO: 84,85, 86, 87, ou 88, em que referidos motivos são preferivelmente orientadosem orientação 5'-3' de acordo com sua numeração de SEQ ID (isto é, SEQ IDNO: 85 está a jusante de SEQ ID NO: 84),

c) uma região (tendo um comprimento de 50 a 1500 bp,preferivelmente 60 a 1000 bp) compreendendo pelo menos dois,preferivelmente três ou quatro, mais preferivelmente cinco de seis, o maispreferivelmente todos os motivos de promotor descritos por SEQ ID NO: 89,90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100, em que referidos motivos sãopreferivelmente orientados em orientação 5'-3' de acordo com sua numeraçãode SEQ ID (isto é, SEQ ID NO: 71 está a jusante de SEQ ID NO: 70).

Mais preferivelmente, a seqüência reguladora de transcriçãocompreendida nos cassetes de expressão compreende pelo menos uma regiãode seqüência (preferivelmente 2 regiões, mais preferivelmente toda as 3regiões; em que preferivelmente a região b) é seguinte região a), e região c) seseguindo a região a) e/ ou região b)) selecionada dentre o grupo consistindode

a) uma região (tendo um comprimento de 50 a 1500 bp,preferivelmente 60 a 1000 bp) compreendendo pelo menos dois,preferivelmente três ou quatro, mais preferivelmente cinco de seis, o maispreferivelmente todos os motivos de promotor descritos por SEQ ID NO: 101,102, 103, 104, 105, 106, ou 107, em que referidos motivos sãopreferivelmente orientados em orientação 5'-3' de acordo com sua numeraçãode SEQ ID (isto é, SEQ ID NO: 78 está a jusante de SEQ ID NO: 77),

b) uma região (tendo um comprimento de 50 a 1000 bp,preferivelmente 60 a 500 bp) compreendendo pelo menos dois,preferivelmente três ou quatro, mais preferivelmente cinco de seis, o maispreferivelmente todos os motivos de promotor descritos por SEQ ID NO: 108,109, 110, 111, ou 112, em que referidos motivos são preferivelmenteorientados em orientação 5'-3' de acordo com sua numeração de SEQ ID (istoé, SEQ ID NO: 85 está a jusante de SEQ ID NO: 84),

c) uma região (tendo um comprimento de 50 a 1500 bp,preferivelmente 60 a 1000 bp) compreendendo pelo menos dois,preferivelmente três ou quatro, mais preferivelmente cinco de seis, o maispreferivelmente todos os motivos de promotor descritos por SEQ ID NO: 113,114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, ou 124, em que referidosmotivos são preferivelmente orientados em orientação 5'-3' de acordo comsua numeração de SEQ ID (isto é, SEQ ID NO: 114 está a jusante de SEQ IDNO: 115).

Os motivos essenciais dos promotores descritos aqui tambémpodem ser empregados para construir um promotor sintético por fusão dosreferidos motivos juntos por técnicas de clonagem padrão.

Assim, outra forma de realização da invenção refere-se a umaseqüência reguladora de transcrição sintética compreendendo pelo menos umaregião de seqüência (preferivelmente 2 regiões, mais preferivelmente todas as3 regiões; em que preferivelmente região b) é seguinte região a), e região c) seseguindo a região a) e/ ou região b)) selecionada dentre o grupo consistindode

c) uma região (tendo um comprimento de 50 a 1500 bp,preferivelmente 60 a 1000 bp) compreendendo pelo menos dois,preferivelmente três ou quatro, mais preferivelmente cinco de seis, o maispreferivelmente todos os motivos de promotor descritos por SEQ ID NO: 65,66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, ou 76, em que referidos motivos sãopreferivelmente orientados em orientação 5'-3' de acordo com sua numeraçãode SEQ ID (isto é, SEQ ID NO: 71 está a jusante de SEQ ID NO: 70).

Preferivelmente, a seqüência reguladora de transcriçãosintética compreende pelo menos uma região de seqüência (preferivelmente 2regiões, mais preferivelmente todas as 3 regiões; em que preferivelmenteregião b) é a seguinte região a), e região c) se seguindo a região a) e/ ouregião b)) selecionada dentre o grupo consistindo de

c) uma região (tendo um comprimento de 50 a 1500 bp,preferivelmente 60 a 1000 bp) compreendendo pelo menos dois,preferivelmente três ou quatro, mais preferivelmente cinco de seis, o maispreferivelmente todos os motivos de promotor descritos por SEQ ID NO: 89,90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100, em que referidos motivos sãopreferivelmente orientados em orientação 5'-3' de acordo com sua numeraçãode SEQ ID (isto é, SEQ ID NO: 71 está a jusante de SEQID NO: 70).

Mais preferivelmente, a seqüência reguladora de transcriçãosintética compreende pelo menos uma região de seqüência (preferivelmente 2regiões, mais preferivelmente todas as 3 regiões; em que preferivelmenteregião b) é seguinte região a), e região c) se seguindo a região a) e/ ou regiãob)) selecionada dentre o grupo consistindo de

Ainda outra forma de realização da invenção refere-se a ummétodo para prover um seqüência nucleotídica reguladora de transcriçãosintética caracterizado em que os motivos de promotor isolados ouagrupamentos de motivos de promotor são combinados (por exemplo, portécnicas de clonagem padrão, como ligação ou recombinação), estes motivoscompreendendo pelo menos 5, preferivelmente pelo menos 8, maispreferivelmente pelo menos 10, o mais preferivelmente pelo menos 15 todosos motivos descritos por qualquer uma dentre SEQ ID NO: 53, 54, 55, 56, 57,58, 59,: 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, ou 76.

Preferivelmente, o método para prover seqüênciasnucleotídicas reguladoras de transcrição sintéticas, caracterizado em que osmotivos de promotor isolados ou agrupamento de motivos de promotor sãocombinados (por exemplo, por técnicas de clonagem padrão, como ligação ourecombinação) estes motivos compreendendo pelo menos 5, preferivelmentepelo menos 8, mais preferivelmente pelo menos 10, o mais preferivelmentepelo menos 15 ou todos os motivos descritos por qualquer uma dentre SEQID NO: 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94,95,96, 97, 98, 99, ou 100.

Mais preferivelmente, o método para prover seqüênciasnucleotídicas reguladoras de transcrição sintéticas, é caracterizado em que osmotivos de promotor isolados ou agrupamento de motivos de promotor sãocombinados (por exemplo, por técnicas de clonagem padrão, como ligação ourecombinação), estes motivos compreendendo pelo menos 5, preferivelmentepelo menos 8, mais preferivelmente pelo menos 10, o mais preferivelmentepelo menos 15 ou todos os motivos descritos por qualquer uma dentre SEQIDNO: 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112,: 113, 114,115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, ou 124,

Preferivelmente, referidos motivos são orientados emorientação 5'-3' de acordo com sua numeração de SEQ ID (isto é, SEQ IDNO: 114 está a jusante de SEQ ID NO: 115).

Um cassete de expressão da invenção pode compreender aindaelementos regulatórios. O termo neste contexto deve ser entendido em umsignificado amplo compreendendo todas as seqüências que podem influenciara construção ou função do cassete de expressão. Elementos regulatóriospodem, por exemplo, modificar a transcrição e/ou translação em organismoprocariótico ou eucariótico. Em uma forma de realização preferida, o cassetede expressão da invenção compreendido a jusante (na direção 3') daseqüência de ácido nucleico a ser expressada em uma seqüência determinação da transcrição e - opcionalmente elementos regulatóriosadicionais- cada associado operativamente à seqüência de ácido nucleico aser expressada (ou a seqüência nucleotídica reguladora da transcrição).

Os elementos regulatórios adicionais podem compreenderpromotores, promotores mínimos, ou elementos promotores adicionais, quepodem modificar as propriedades de regulação da expressão. Por exemplo aexpressão pode ser feita dependendo de alguns fatores de estresse, comoestresse de água, abscisina (Lam 1991) ou estresse de calor (Schoffl 1989).Além disso, promotores ou elementos de promotor adicionais podem serempregados, que podem realizar a expressão em outros organismos (comoE.coli ou Agrobacterium). Estes elementos regulatórios podem serencontrados nas seqüências de promotor ou bactérias como amy e SP02 ounas seqüências de promotor de promotores levedura ou fungicos (comoADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, e ADH).

Além disso, é contemplado que promotores combinandoelementos de mais do que um promotor podem ser utilizáveis. Por exemplo,US 5.491.288 descreve combinar um promotor do vírus do mosaico da couve-flor com um promotor de histona. Assim, os elementos dos promotoresdescritos aqui podem ser combinados com elementos de outros promotores.Promotores, que são úteis para expressão na planta de transgenes incluem os que são indutíveis, virais, sintéticos, constitutivos (Odell 1985), temporariamente regulados, espacialmente regulado, específicos para tecido e regulado espacial-temporariamente.

Onde a expressão em tecidos ou órgãos específicos é desejada, promotores específicos de tecido podem ser usados. Em contraste, onde expressão de gene em resposta a um estímulo é desejada, promotores indutíveis são os elementos regulatórios de escolha. Onde a expressão contínua é desejada em todas as células de uma planta, promotores constitutivos são utilizados. Seqüências regulatórias adicionais a montante e/ou a jusante da seqüência de núcleo de promotor podem ser incluídas em construções de expressão de vetores de transformação para ocasionar níveis variados de expressão de seqüências nucleotídicas heterólogas em uma planta transgênica.

A variedade de seqüências regulatórias 5' e 3' transcripcionais são disponíveis para uso na presente invenção. Terminadores transcripcionais são responsáveis pela terminação de transcrição e poliadenilação correta de mRNA. A seqüência de DNA regulatório 3' não traduzida preferivelmente inclui de cerca de 50 a cerca de 1.000, mais preferivelmente cerca de 100 a cerca de 1.000, pares de base de nucleotídeos e contém seqüências de terminação transcripcional e translacional da planta. Os terminadores transcripcionais apropriados e os que são conhecidos como funcionando em plantas incluem o terminador CaMV 35S, o terminador tml, o terminador de nopalina sintase, o terminador rbcS E9 de ervilha, o terminador para o transcrito T7 do gene octopina sintase de Agrobacterium tumefaciens, e a extremidade 3' dos genes de inibidor de protease I ou II de batata ou tomate, apesar de outros elementos 3' conhecidos dos versados na arte poderem ser também empregados. Alternativamente, pode-se também usar uma gama coixina oleosina3 ou outro terminador de gênero Coix.Os elementos 3' preferidos incluem os do gene nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens (Bevan 1983), o terminador para o transcrito T7 do gene octopina sintase de Agrobacterium tumefaciens, e a extremidade 3' dos genes de inibidor de protease I ou II de batata ou tomate.

Como a seqüência de DNA entre o sítio de iniciação de transcrição e o início da seqüência de codificação, isto é, a seqüência líder não traduzida, pode influenciar a expressão de gene, pode-se também desejar empregar uma seqüência líder em particular. As seqüências líder preferidas são contempladas como incluindo as, que incluem seqüências, previstas para dirigir a expressão ótima do gene fixado, isto é, incluindo uma seqüência líder de consenso preferida, que pode aumentar ou manter a estabilidade do mRNA e evitar a iniciação de tradução inapropriada. A escolha de tais seqüências será conhecida dos versados na arte à luz da presente descrição. Seqüências que são derivadas de genes que são altamente expressados em plantas serão as mais preferidas.

Os elementos regulatórios preferidos também incluem a região 5'-não traduzida, íntrons e a região 3'-não traduzida de genes. Estas seqüências que são verificadas como melhorando a expressão de gene em plantas transgênicas incluem seqüências de íntrons (por exemplo, de Adhl, bronze 1, actina 1, actina 2 (WO 00/760067), ou o intron de sacarose sintase; ver: The Maize Handbook, Capítulo 116, Freeling e Walbot, Eds., Springer, New York (1994)) e seqüências líder viral (por exemplo, de TMV, MCMV e AMV; Gallie 1987). Por exemplo, várias seqüências líder não traduzidas derivadas de vírus são conhecidas como melhorando a expressão. Especificamente, seqüências líder do vírus do mosaico do tabaco (TMV), vírus de sarapintado clorótico do milho (MCMV), e vírus do mosaico da alfafa (AMV) foram demonstrados como sendo efetivos na melhora da expressão (por exemplo, Gallie 1987; Skuzeski 1990). Outros líderes conhecidos na arte incluem mas não são limitados a: líderes de Picornavirus,por exemplo, líder de EMCV (região de não codificação de 5' de Encefalomiocardite) (Elroy-Stein 1989); líder de Potyvirus, por exemplo, líder de TEV (vírus do ataque do tabaco); líder de MDMV (vírus do mosaico do ananismo de milho); líder de proteína de ligação de cadeia pesada de 5 imunoglobulina humana (BiP), (Macejak 1991); líder não traduzido do mRNA de proteína de capa do vírus mosaico de alfafa (AMV RNA 4), (Jobling 1987; líder de vírus mosaico do tabaco (TMV), (Gallie 1989; e líder de vírus de sarapintado clorótico do milho (MCMV) (Lommel 1991. ver também, Della-Cioppa 1987. Elementos regulatórios como intron Adh 1 (Callis 1987), intron sacarose sintase (Vasil 1989) ou elemento omega TMV (Gallie 1989), podem ainda ser incluídos onde desejado. São especialmente preferidas a região 5' não traduzida, íntrons e a região 3' não traduzida selecionadas dentre

a) o gene descrito pelo loci do genoma de Arabidopsis thaliana do GenBank At 1 g48130 e

b) genes ortólogos do gene descrito pelo loci do genoma de Arabidopsis thaliana do GenBanki Atlg48130.

Mais preferidas são as seqüências 5'-não traduzidas compreendidas nas seqüências como descritas por SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 10, ou 11 (ver listagem de seqüência para especificação da localização).

Os preferidos elementos regulatórios adicionais são seqüências de melhoradores ou seqüências de poliadenilação.

A seqüência nucleotídica heteróloga a ser expressada é preferivelmente ainda operativamente ligada a regiões 3' não traduzidas terminação de transcrição e/ou sinal de poliadenilação. As regiões 3'-não traduzidas são apropriadas para estabilizar a expressão e estrutura de mRNA. Isto pode resultar em presença prolongada do mRNA e assim níveis de expressão melhorados. Os sinais de terminação e poliadenilação são apropriados para estabilizar a expressão de mRNA, para assegurar ocomprimento do transcrito de mRNA constante e para evitar a transcrição através da leitura. Especialmente em construções de expressão de múltiplos genes, este é um aspecto importante. Além disso, a terminação de transcrição correta é ligada a uma re-iniciação de transcrição da seqüência nucleotídica 5' regulatória, resultando em níveis de expressão melhorados. Os sinais acima mencionados podem ser qualquer sinal funcional em plantas e pode por exemplo ser isolado de genes de planta, genes de vírus de planta ou outros patógenos de planta. No entanto, em uma forma de realização preferida, as regiões 3' não traduzidas, terminação de transcrição e sinais de poliadenilação são dos genes empregados como a fonte para os promotores desta invenção. Ainda mais preferidos são as seguintes seqüências:

SEQ ID NO: 125 apresentando uma seqüência de 876 nucleotídeos seguindo a região de codificação (CDS) do gene peroxiredoxina (PER1) de Arabidopsis thaliana (Atlg48130) compreendendo 3'-UTR usado como seqüência de terminação transcripcional

SEQ ID NO: 126 apresentando uma seqüência de 400 nucleotídeos seguindo a região de codificação (CDS) do gene peroxiredoxina (PER1) de Arabidopsis thaliana (Atlg48130) compreendendo 3'-UTR usado como seqüência de terminação transcripcional (SEQ ID NO: 126 é um derivado truncado de SEQ ID NO: 125)

SEQ ID NO: 127 apresentando uma seqüência de 227 nucleotídeos apresentando a região 3'-não traduzida do gene peroxiredoxina (PERl)(Atlg48130).

Conseqüentemente, em uma forma de realização preferida, o cassete de expressão da invenção ainda compreende funcionalmente associada à seqüência nucleotídica a ser expressada pelo menos uma seqüência selecionada dentre o grupo consistindo de:

a) as seqüências descritas por SEQ ID NO: 125, 126, e 127, e

b) uma seqüência compreendendo um fragmento de pelomenos 25 (preferivelmente pelo menos 50 ou 75 ou 100, mais preferivelmente pelo menos 150 ou 200, o mais preferivelmente 250 ou 300) nucleotídeos consecutivos de uma seqüência descrita por SEQID NO: 125, 126, ou 127,

c) uma seqüência tendo uma identidade de pelo menos 50% (preferivelmente pelo menos 60%, 70% ou 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% ou 95%, o mais preferivelmente pelo menos 98%) para uma seqüência descrita por SEQ ID NO: 125, 126, ou 127

d) uma seqüência capaz de hibridizar (preferivelmente sob condições equivalentes à hibridização em dodecil sulfato de sódio a 7% (SDS), 0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 2 X SSC, 0,1% SDS a 50°C, mais desejavelmente em dodecil sulfato de sódio a 7% (SDS), 0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 1 X SSC, 0,1% SDS a 50°C, mais desejavelmente ainda em dodecil sulfato de sódio a 7% (SDS), 0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 0,5 X SSC, 0,1% SDS a 50°C, preferivelmente em dodecil sulfato de sódio a 7% (SDS), 0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 0,1 X SSC, 0,1% SDS a 50°C, mais preferivelmente em dodecil sulfato de sódio a 7% (SDS), 0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 0,1 X SSC, 0,1% SDS a 65°C) para um ácido nucleico compreendendo 50 a 200 ou mais (preferivelmente todos) nucleotídeos consecutivos das seqüência descritas por SEQ ID NO: 125, 126, ou 127, ou o seu complemento,

em que referida seqüência é capaz de mediar a estabilização de RNA, estabilização de expressão de RNA, terminação de transcrição de RNA e/ou poliadenilação de RNA.

As seqüências sozinhas são apropriadas e utilizáveis na expressão transgênica em plantas. Conseqüentemente, outra forma de realização da invenção refere-se a um cassete de expressão compreendendo:

i) pelo menos uma seqüência nucleotídica reguladora da transcrição capaz de mediar transcrição em plantas e funcionalmente ligada àmesma,

ii) pelo menos uma seqüência de ácido nucleico, e funcionalmente ligada à mesma

iii) pelo menos uma seqüência selecionada dentre o grupoconsistindo de:

a) as seqüências descritas por SEQ ID NO: 125, 126, e 127, e

b) uma seqüência compreendendo um fragmento de pelo menos 25 (preferivelmente pelo menos 50 ou 75 ou 100, mais preferivelmente pelo menos 150 ou 200, o mais preferivelmente 250 ou 300) nucleotídeosconsecutivos de uma seqüência descrita por SEQ ID NO: 125, 126, ou 127,

d) uma seqüência capaz de hibridizar (preferivelmente sobcondições equivalentes à hibridização em dodecil sulfato de sódio a 7% (SDS), 0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 2 X SSC, 0,1% SDS a 50°C, mais desejavelmente em dodecil sulfato de sódio a 7% (SDS), 0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 1 X SSC, 0,1% SDS a 50°C, mais desejavelmente ainda em dodecil sulfato de sódio a 7% (SDS), 0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 0,5 X SSC, 0,1% SDS a 50°C, preferivelmente em dodecil sulfato de sódio a 7% (SDS), 0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 0,1 X SSC, 0,1% SDS a 50°C, mais preferivelmente em dodecil sulfato de sódio a 7% (SDS), 0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 0,1 X SSC, 0,1% SDS a 65°C) para um ácido nucleico compreendendo 50 a 200 ou mais (preferivelmente todos) nucleotídeos consecutivos de as seqüência descrita por SEQ ID NO: 125, 126, ou 127, ou o seu complemento,

em que referida seqüência iii) é capaz de mediar aestabilização de RNA, estabilização de expressão de RNA, terminação de transcrição de RNA e/ou poliadenilação de RNA;

em que ou referida seqüência reguladora de transcrição i) ou referida seqüência iii) ou ambos i e iii) são heterólogas com relação para referida seqüência nucleotídica ii).

Outras seqüências de poliadenilação preferidas são de genes de plantas ou genes T-DNA de Agrobacterium (como por exemplo as seqüência de terminador de genes OCS (octopina sintase) ou NOS (nopalina sintase)).

Exemplos de melhoradores incluem elementos do promotor deCaMV 35S, genes octopina sintase (Ellis et al., 1987), o gene actina I de arroz, o gene álcool desidrogenase de milho (Callis 1987), o gene shrunken I de milho (Vasil 1989), elemento Omega TMV (Gallie 1989) e promotores de eucariotes não de plantas (por exemplo, levedura; Ma 1988). Vetores para uso de acordo com a presente invenção podem ser construídos para incluir o elemento melhorador de ocs. Este elemento foi primeiro identificado como um melhorador palindrômico de 16 bp de gene octopina sintase (ocs) de ultilano (Ellis 1987), e está presente em pelo menos 10 outros promotores (Bouchez 1989). O uso de um elemento melhorador, como os elementos ocs e particularmente cópias múltiplas do elemento, irão atuar para aumentar o nível de transcrição de promotores adjacentes quando aplicados no contexto de transformação de plantas.

Um cassete de expressão da invenção (ou um vetor derivado do mesmo) pode compreender elementos funcionais adicionais, que devem ser entendidos no sentido amplo como todos os elementos que influenciam a construção, propagação, ou função de um cassete de expressão ou um vetor ou um organismo transgênico compreendendo os mesmos. Estes elementos funcionais podem incluir origens de replicação (para permitir a replicação em bactérias; para o ORI de pBR322 ou o ori de PI5A; Sambrook 1989), ou elementos requeridos para transferência de T-DNA de Agrobacterium (comopor exemplo as bordas esquerda e/ou direita do T-DNA).

Por fim, os segmentos de DNA os mais desejáveis para introdução em, por exemplo, um genoma de dicotiledôneas, podem ser genes homólogos ou famílias de genes que codificam um traço desejado (por exemplo, aumentado rendimento por acre) e que são introduzidos sob o controle de novos promotores ou melhoradores, etc, ou talvez mesmo homólogos ou promotores específicos para tecido (por exemplo, específicos para raiz, colar/bainha, verticilo, haste, haste da espiga, caroço, ou folha) ou elementos de controle. De fato, visa-se que um uso particular da presente invenção será na expressão de um gene em um modo preferencial de semente ou específico de semente.

Além disso, vetores podem ser construídos e empregados na marcação intracelular e um produto de gene específico dentro das células de uma planta transgênica ou em direção de uma proteína para o meio extracelular. Isto será geralmente obtido por junção de uma seqüência de DNA codificando uma seqüência de peptídeo de transito ou de sinal para a seqüência de codificação de um gene particular. O peptídeo de transito ou sinal resultante irá transportar a proteína a um destino intracelular ou extracelular particular, respectivamente, e será então pós -translacionalmente removido. Os peptídeos de transito ou sinal atuam por facilitação do transporte de proteínas através de membranas intracelulares, por exemplo, vacúolo, vesícula, plastídeo e membranas mitocondriais, enquanto peptídeos de sinal dirigem proteínas através da membrana extracelular.

Um exemplo particular deste uso diz respeito à direção de um gene de resistência a herbicida, como o gene EPSPS, a uma organela particular como o cloroplasto em vez do citoplasma. Isto é exemplificado pelo uso do peptídeo de trânsito rbcs que confere marcação específica de plastídeo de proteínas. Além disso, propõe-se que pode ser desejável marcar certos genes responsáveis por esterilidade masculina para o mitocôndrio, ou marcarcertos genes para resistência a organismos fitopatogênicos nos espaços extracelulares, ou marcar proteínas para o vacúolo.

Ao facilitar o transporte da proteína em compartimentos dentro e fora da célula, estas seqüências podem aumentar o acúmulo de produto de genes protegendo os mesmos da degradação proteolítica. Estas seqüências também permitem que seqüências de mRNA adicionais de genes altamente expressados sejam fixadas à seqüência de codificação dos genes. Uma vez que mRNA sendo traduzido por ribossomas é mais estável do que mRNA nu, a presença de mRNA traduzível em frente do gene pode aumentar a estabilidade global do transcrito de mRNA do gene e, assim, aumentar a síntese do produto de gene. Uma vez que seqüências de trânsito e de sinal são geralmente removidas pós- translacionalmente do produto de tradução inicial, o uso destas seqüências permite a adição de seqüências traduzidas extras que podem não aparecer no polipeptídeo final. A marcação de certas proteínas pode ser desejável a fim de melhorar a estabilidade da proteína (US 5.545.818).

Pode ser utilizável marcar o próprio DNA dentro de uma célula. Por exemplo, pode ser utilizável marcar o DNA introduzido no núcleo à medida que isto pode aumentar a freqüência de transformação. Dentro do próprio núcleo pode ser utilizável marcar um gene a fim de obter integração sítio-específica. Por exemplo, pode ser utilizável ter um gene introduzido através de transformação substituindo um gene existente na célula. Outros elementos incluem os que podem ser regulados por agentes endógenos ou exógenos, por exemplo, por proteínas dedo de zinco, incluindo proteínas dedo de zinco ocorrendo naturalmente ou proteínas dedo de zinco quiméricas (ver, por exemplo, US 5.789.538, WO 99/48909; WO 99/45132; WO 98/53060; WO 98/53057; WO 98/53058; WO 00/23464; WO 95/19431; e WO 98/54311) ou fatores de transcrição como myb. Por exemplo, uma proteína dedo de zinco quimérica pode incluir seqüências de aminoácidos, que seligam a uma seqüência de DNA específica (o dedo de zinco) e seqüências de aminoácidos que ativam (por exemplo, seqüências GAL 4) ou reprimem a transcrição das seqüências ligadas à seqüência de DNA específica.

É um dos objetos da presente invenção prover moléculas de DNA recombinantes compreendendo uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a invenção operativamente ligada a um segmento de nucleotídeo de interesse.

Um segmento de nucleotídeo de interesse reflete os interesses e mercados comerciais envolvidos no desenvolvimento de culturas. Asculturas e mercados comerciais mudam e, à medida que as nações em desenvolvimento abrem seus mercados ao mundo, novas culturas e tecnologias também irão surgir. Além disso, como a compreensão de traços e características agronômicas, como a produção e heterose aumentam, a escolha de genes para transformação irá mudar como uma conseqüência. Ascategorias gerais de nucleotídeos de interesse incluem, por exemplo, genes envolvidos em informação, como dedos de zinco, os envolvidos em comunicação, como quinases, e os envolvidos domésticos, como proteínas de choque térmico. As categorias de transgenes mais específicas, por exemplo, incluem genes codificando traços importantes para agronomia, resistência ainseto, resistência a doenças, resistência a herbicida, esterilidade, características de grão, e produtos comerciais. Os genes de interesse incluem, geralmente, os envolvidos metabolismo de nutrientes, amido, óleo, ou carboidrato, bem como os que afetam o tamanho de grão de cereal, carga de sacarose, proteínas dedo de zinco, ver, por exemplo, US 5.789.538, WO99/48909; WO 99/45132; WO 98/53060; WO 98/53057; WO 98/53058; WO 00/23464; WO 95/19431; e WO 98/54311, e outros.

Um versado na arte reconhece que o nível de expressão e regulação de um transgene em uma planta pode variar significativamente de linhagem para linhagem. Assim, tem-se que testar várias linhagens paraencontrar uma com o nível de expressão e regulação desejado. Uma vez que uma linhagem é identificada com a especificidade de regulação desejada de um transgene Cre quimérico, ela pode ser cruzada com linhagens possuindo diferentes replicons inativos ou transgene inativo para ativação.

Outras seqüências, que podem ser ligadas ao gene de interesse, que codifica um polipeptídeo, são as que podem marcar uma organela específico, por exemplo, no mitocôndrio, núcleo, ou plastídeo, em uma célula de planta. A marcação pode ser obtida provendo o polipeptídeo com uma seqüência de peptídeo de marcação apropriada, como peptídeo de sinal secretório (para secreção ou parede celular ou marcação de membrana, um peptídeo de trânsito plastídeo, um peptídeo de trânsito cloroplasto, por exemplo, a proteína de ligação a/b de clorofila, um peptídeo de marcação mitocondrial, um peptídeo de marcação de vacúolo, ou um peptídeo de marcação nuclear, e outros. Por exemplo, a subunidade pequena de peptídeode trânsito de ribulose bisfosfato carboxilase, do peptído de trânsito EPSPS ou do peptídeo de trânsito de ácido dihidropicolínico sintase pode ser usada, para exemplos de seqüências de marcação de organela de plastídeo (ver WO 00/12732). Os plastídeos são uma classe de organelas de planta derivados de pró-plastídeos e incluem cloroplastos, leucoplastos, amiloplastos e cromoplastos. Os plastídeos são sítios principais de biossíntese em plantas. Além da fotossíntese no cloroplasto, os plastídeos também são sítios de biossíntese de lipídeos, redução de nitrato em amônio e armazenamento de amido. E apesar dos plastídeos conterem seu próprio genoma circular, a maior parte das proteínas localizadas nos plastídeos são codificadas pelo genoma nuclear e são importadas dentro da organela a partir do citoplasma.

Os transgenes usados com a presente invenção serão freqüentemente genes que dirigem a expressão de uma proteína particular ou produto de polipeptídeo, mas eles também podem ser segmentos de DNA não expressáveis,, por exemplo, transposons como Ds que não dirigem sua própriatransposição. Como usado aqui, um "gene expressável" é qualquer gene que é capaz de ser transcrito em RNA (por exemplo, mRNA, RNA anti-sentido, etc.) ou traduzido em uma proteína, expressado como um traço de interesse, ou outros, etc, e não está limitado a genes de marcador selecionável, triável ou não selecionável. A invenção também contempla que, quando um gene expressável, que não é necessariamente um gene marcador é empregado em combinação com um gene marcador, pode-se empregar os genes separados tanto em segmentos de DNA iguais como diferentes para transformação. No último caso, os vetores diferentes são liberados simultaneamente nas célulasrecipientes de modo a maximizar a co-transformação.

A escolha dos segmentos de DNA particulares a serem liberados às células recipientes com freqüência dependerá da finalidade da transformação. Uma das principais finalidades de transformação de plantas de cultura é adicionar alguns traços comercialmente desejáveis,agronomicamente importantes, à planta. Estes traços incluem, mas não estão limitados a, resistência ou tolerância a herbicida, resistência ou tolerância a inseto, resistência ou tolerância a doenças (viral, bacteriana, tungica, por nematódeos); resistência e/ou tolerância a estresse, como exemplificado por resistência ou tolerância aos estresses provocados por seca, calor,resfriamento, congelamento, umidade excessiva, sal; estresse oxidativo; produções aumentadas; composição e teor do alimento; aparência física; esterilidade masculina; secagem; capacidade de ficar em pé; fecundidade, propriedades de amido; quantidade e qualidade de óleo; e outros. Pode-se desejar incorporar um ou mais genes conferindo qualquer um destes traços outraços desejáveis, como, por exemplo, um gene ou genes codificando resistência a patógenos.

Em algumas formas de realização, a presente invenção contempla a transformação de uma célula recipiente com mais do que um transgene vantajoso. Dois ou mais transgenes podem ser supridos em umevento de transformação único usando qualquer um dos vetores de codificação de transgene distintos, ou usando um vetor único incorporando duas ou mais seqüências codificando o gene. Por exemplo, os plasmídeos contendo as unidades de expressão bar e aroA em qualquer orientação convergente, divergente ou co-linear, são considerados particularmente utilizáveis. Outras combinações preferidas são os de um gene de resistência a inseto, como um gene Bt, junto com um gene inibidor de protease como pinll, ou o uso de bar em combinação com qualquer um dos genes acima. Como evidente, qualquer um de dois ou mais transgenes de qualquer descrição, como os conferindo resistência a herbicida, inseto, doença (viral, bacteriana, fungica, por nematódeo) ou a seca, esterilidade masculina, secura, capacidade de ficar em pé, fecundidade, propriedades de amido, qualidade ou quantidade de óleo, ou os aumentando a produção ou a qualidade nutricional podem ser empregados, como desejado.

1. Transgenes Exemplares

1.1 Resistência a Herbicida

Os genes codificando fosfinotricina acetiltransferase (bar e pat), genes EPSP sintase tolerantes a glifosato, gene gox de enzima degradativa de glifosato codificando glifosato oxidorredutase, genes deh (codificando uma enzima desalogenase que inativa dalapon), acetolactato sintase resistente a herbicida (por exemplo, sulfoniluréia e imidazolinona), e bxn (codificando uma enzima nitrilase que degrada bromoxinila) são bons exemplos de genes resistentes a herbicida para uso em transformação. Os genes bar e pat codificam uma enzima, fosfinotricina acetiltransferase (PAT), que inativa o herbicida fosfinotricina e previne que este composto iniba as enzimas glutamina sintetase. A enzima 5-enolpiruvilshikimato 3-fosfato sintase (EPSP sintase) é normalmente inibida pelo herbicida N-(fosfonometil) glicina (glifosato). No entanto, são conhecidos genes que codificam enzimas EPSP sintase resistentes a glifosato. O gene deh codifica a enzima dalapondesalogenase e confere resistência ao herbicida dalapon. O gene bxn codifica uma enzima nitrilase específica que converte bromoxinila em um produto de degradação não herbicida.

1.2 Resistência a insetos

Um aspecto importante da presente invenção diz respeito àintrodução de genes conferindo resistência a inseto em plantas. Os genes de resistência a inseto potenciais, que podem ser introduzidos, incluem, genes da toxina de cristal Bacillus thurigiensis ou genes Bt (Watrud 1985). Os genes Bt podem prover resistência a pragas de lepidópteros ou coleópteros como brocade milho europeu (ECB) e larva nociva da raiz de milho (CRW). Genes de toxina Bt preferidos para uso nestas formas de realização incluem os genes CrylA(b) e CrylA(c). Genes de endotoxinas de outras espécies de B. thurigiensis, que afetam o crescimento ou desenvolvimento de insetos, também podem ser empregados sob este aspecto. Inibidores de proteasetambém podem proporcionar resistência (Johnson 1989) e, assim, terão utilidade na transformação de plantas. O uso de um gene II inibidor de protease, pinll, de tomate ou batata é visado como sendo particularmente utilizável. Ainda mais vantajoso é o uso de um gene pinll em combinação com um gene de toxina Bt, cujo efeito combinado foi descoberto pelospresentes inventores como produzindo uma atividade inseticida sinergística. Outros genes, que codificam inibidores do sistema digestivo de insetos, ou os que codificam enzimas ou co-fatores que facilitam a produção de inibidores, também podem ser utilizáveis. Inibidores de cistatina e amilase, como os de trigo e cevada, podem exemplificar este grupo.

Também, genes codificando lecitinas podem conferirpropriedades inseticidas adicionais ou alternativas. Lecitinas (originalmente denominadas fito-hemaglutininas) são proteínas de ligação de carboidratos multivalentes, que têm a capacidade de aglutinar glóbulos vermelhos de uma faixa de espécies. As lecitinas foram identificadas recentemente como agentesinseticidas com atividade contra gorgulhos, ECB e larvas nocivas da raiz (Murdock 1990; Czapla & Lang, 1990). Os genes de lectina contemplados como sendo utilizáveis incluem, por exemplo, aglutinina de cevada e germe de trigo (WGA) e lecitinas de arroz (Gatehouse 1984), com WGA sendo preferido.

Os genes controlando a produção de polipeptídeos pequenos ativos contra insetos quando introduzidos em pragas de insetos, como, por exemplo, peptídeos líticos, hormônios de peptídeos e toxinas e venenos, formam um outro aspecto da invenção. Por exemplo, é contemplado que a expressão do hormônio juvenil esterase, dirigido para pragas de insetos específicas, também podem resultar em atividade inseticida, ou talvez causar o término da metamorfose (Hammock 1990).

Plantas transgênicas expressando genes, que codificam enzimas que afetam a integridade da cutícula de insetos, formam ainda um outro aspecto da invenção. Estes genes incluem os codificando, por exemplo, quitinase, proteases, lípases e também genes para a produção de nik-comicina, um composto que inibe a síntese de quitina, sendo que a introdução de qualquer um destes é contemplada como produzindo plantas de milho resistentes a insetos. Os genes que codificam atividades que afetam a muda de insetos, como os que afetam a produção do ecdisteróise UDP-glucosil transferase, também estão dentro do escopo dos transgenes utilizáveis da presente invenção.

Os genes que codificam enzimas que facilitam a produção de compostos que reduzem a qualidade nutricional da planta hospedeira para as pragas de insetos também são englobados pela presente invenção. Pode ser possível, por exemplo, conferir atividade inseticida em uma planta alterando sua composição de esterol. Os esteróis são obtidos pelos insetos a partir de sua dieta e são usados para síntese de hormônios e estabilidade de membranas. Assim, alterações na composição de esterol da planta porexpressão de novos genes, por exemplo, os que promovem diretamente a produção de esteróis indesejáveis ou os que convertem esteróis desejáveis em formas indesejáveis, podem ter um efeito negativo sobre o crescimento e/ou desenvolvimento de insetos e, assim, dotar a planta com atividade inseticida. As lipoxigenases são enzimas de planta ocorrendo naturalmente que demonstram efeitos antinutricionais para os insetos e reduzem a qualidade nutricional de sua dieta. Assim, outras formas de realização da invenção referem-se a plantas transgênicas com atividade de lipoxigenase melhorada que podem ser resistentes à alimentação de insetos.

A presente invenção também prove métodos e composições pelos quais podem ser alcançadas mudanças qualitativas ou quantitativas em metabólitos secundários de plantas. Um exemplo refere-se à transformação de plantas para produzir DIMBOA que, como contemplado, irão conferir resistência à broca do milho europeu, larvas nocivas da raiz, e várias outras pragas de insetos de milho. Genes candidatos que são particularmente considerados para uso a este respeito incluem os genes no locus bx que se sabe estar envolvido na via sintética de DIMBOA (Dunn 1981). A introdução de genes que podem regular a produção de maisina, e genes envolvidos na produção de dhurrina em sorgo, também é contemplada como utilizável para facilitar a resistência a lagarta da espiga e larva nociva da raiz, respectivamente.

Tripsacum dactyloides é uma espécie de grama que é resistente a certos insetos, incluindo larva nociva da raiz do milho. Antecipa-se que os genes codificando proteínas que são tóxicas para insetos ou estão envolvidas na biossíntese de compostos tóxicos para insetos serão isolados de Tripsacum e que estes novos genes serão utilizáveis para conferir resistência a insetos. Sabe-se que a base de resistência a insetos em Tripsacum é genética, porque referida resistência foi transferida para Zea mays via cruzamentos sexuais (Branson & Guss, 1972).Outros genes codificando proteínas caracterizadas como tendo atividade inseticida potencial também podem ser usados como transgenes de acordo com o presente. Estes genes incluem, por exemplo, o inibidor de tripsina de feijão-de-vaca (CpTI; Hilder 1987), que pode ser usado como um deterrente de larva nociva da raiz; genes codificando avermectina (Campbell 1989; Ikeda 1987) que podem demonstrar ser particularmente utilizáveis como um deterrente de larva nociva da raiz de milho; genes de proteínas inativantes de ribossoma; e ainda genes que regulam estruturas de plantas. Milho transgênico incluindo genes de anticorpo antiinseto e genes que codificam para enzimas que podem abrigar um inseticida não tóxico (pró-inseticida) aplicado no exterior da planta dentro de um inseticida no interior da planta também são contemplados.

1.3 Resistência ao estresse ou ambiental

A melhora da capacidade de uma planta de tolerar vários estresses ambientais como, mas não limitadas a, seca, excesso de umidade, resfriamento, congelamento, temperatura elevada, sal e estresse oxidativo, também pode ser efetuada através da expressão de genes heterólogos, ou super expressão de genes homólogos. Os benefícios podem ser realizados em termos de resistência aumentada a temperaturas de congelamento através da introdução de uma proteína "anticongelamento" como a de Winter Flounder (Cutler 1989) ou derivados de genes sintéticos da mesma. Tolerância melhorada a resfriamento também pode ser conferida através da expressão aumentada de glicerol-3-fosfato acetiltransferase em cloroplastos (Murata 1992; Wolter 1992). A resistência ao estresse oxidativo (freqüentemente exacerbada por condições como temperaturas de resfriamento em combinação com intensidades de muita luz) pode ser conferida por expressão de superóxido dismutase (Gupta 1993), e pode ser melhorada por glutationa redutase (Bowler 1992). Estas estratégias podem permitir tolerância a congelamento em campos de brotação recente, bem como estendendo aszonas de maturidade posterior das variedades de maior produção para as de maturidade relativa anterior.

A expressão de novos genes que afetam favoravelmente o teor de água nas plantas, potencial de água total, potencial osmótico e turgidez pode melhorar a capacidade da planta de tolerar a seca. Como usado aqui, os termos "resistência à seca" e "tolerância a seca" são usados para fazer referência a uma resistência ou tolerância aumentada das plantas ao estresse induzido por uma redução na disponibilidade de água, como comparado em circunstâncias normais, e à capacidade da planta funcionar e sobreviver emambientes com baixo teor de água, e apresentar um desempenho em um modo relativamente superior. Neste aspecto da invenção, é proposto, por exemplo, que a expressão de um gene codificando a biossíntese de solutos osmoticamente ativos pode conferir proteção contra seca. Dentro desta classe de genes estão os DNAs codificando desidrogenase manitol (Lee e Saier, 1982) e trehalose-6-fosfato sintase (Kaasen 1992). Através da ação subseqüente de fosfatases nativas na célula ou pela introdução e co-expressão de uma fosfatase específica, os genes introduzidos resultarão no acúmulo tanto de manitol como de trehalose, respectivamente, ambos os quais foram bem documentados como compostos protetores capazes de mitigar os efeitos do estresse. Verificou-se o acúmulo de manitol em tabaco transgênico e os resultados preliminares indicam que plantas expressando altos níveis deste metabólito são capazes de tolerar um estresse osmótico aplicado (Tarczynski 1992).

Similarmente, a eficácia de outros metabólitos na proteção tanto da função enzimática (por exemplo, alanopina ou ácido propiônico) como da integridade da membrana (por exemplo, alanopina) foi documentada (Loomis 1989) e, assim, a expressão do gene codificando a biossíntese destes compostos pode conferir resistência à seca de um modo similar a ou complementar à do manitol. Outros exemplos de metabólitos ocorrendonaturalmente que são osmoticamente ativos e/ou provêem algum efeito protetor direto durante seca e/ou dessecação incluem açúcares e derivados de açúcar como frutose, eritritol (Coxson 1992), sorbitol, dulcitol (Karsten 1992), glicosilglicerol (Reed 1984; Erdmann 1992), sacarose, estaquiose (Koster & Leopold 1988; Blackman 1992), ononitol e pinitol (Vernon & Bohnert 1992) e rafinose (Bernal-Lugo & Leopold 1992). Outros solutos osmoticamente ativos, que não são açúcares, incluem, mas não estão limitados a, prolina e glicina-betaína (Wyn-Jones e Storey, 1981). O crescimento continuado de canópia e a capacidade reprodutiva aumentada durante os períodos de estresse podem ser aumentados por introdução e expressão de genes como os controlando os compostos osmoticamente ativos discutidos acima e outros destes compostos, como representado em uma forma de realização exemplar pela enzima mioinositol O-metiltransferase.

É contemplado que a expressão de proteínas específicas também pode aumentar a tolerância à seca. Três classes de proteínas embriogênicas tardias foram designadas com base em similaridades estruturais (ver Dure 1989). Todas as três classes destas proteínas foram demonstradas em sementes em maturação (isto é, dessecando). Nestes 3 tipos de proteínas, o tipo II (tipo dehidrina) estava geralmente implicado em tolerância à seca e/ou dessecação em partes de plantas vegetativas (por exemplo, Mundy e Chua, 1988; Piatkowski, 1990; Yamaguchi-Shinozaki, 1992). Recentemente, verificou-se que a expressão de um LEA tipo III (HVA-I) em tabaco influencia a altura da planta, maturidade e tolerância à seca (Fitspatrick, 1993). A expressão de genes estruturais de todos os três grupos pode, assim, conferir tolerância à seca. Outros tipos de proteínas induzidas durante o estresse provocado por água incluem tiol proteases, aldosales e transportadores de transmembrana (Guerrero 1990), que podem conferir várias funções protetores e/ou do tipo de reparo durante o estresse da seca. A expressão de um gene que efetua a biossíntese de lipídeos e, assim, acomposição da membrana também pode ser utilizável para conferir resistência à seca na planta.

Muitos genes que melhoram a resistência à seca têm modos complementares de ação. Assim, combinações destes genes podem ter efeitos aditivos e/ou sinergísticos na melhora de resistência à seca em milho. Muitos destes genes também melhoram a tolerância ao congelamento (ou resistência); os estresses físicos ocasionados durante congelamento e seca são similares por natureza e podem ser mitigados de modo similar. O benefício pode ser conferido via expressão constitutiva ou específica de tecido destes genes, masos meios preferidos de expressar estes novos genes podem ser através do uso de um promotor induzido por turgor (como os promotores para os genes induzidos por turgor descritos em Guerrero et al. 1990 e Shagan 1993). Padrões de expressão espaciais e temporais destes genes podem possibilitar que o milho suporte melhor o estresse.

A expressão de genes que estão envolvidos com traçosmorfológicos específicos que permitem extrações de água aumentadas do solo secando pode ocasionar benefício. Por exemplo, a introdução e expressão de genes que alteram as características da raiz podem melhorar a absorção de água. A expressão de genes que melhoram a capacidade reprodutiva duranteos tempos de estresse pode ser de valor significativo. Por exemplo, a expressão de DNAs que melhoram a sincronia da dispersão de pólen e receptividade das partes de flores femininas, isto é, estigmas, pode ser de benefício. Além disso, a expressão de genes que minimizam o aborto do caroço dos grãos de cereais durante os tempos de estresse pode aumentar aquantidade de grãos a ser coletados e, assim, representar valor. A regulação dos níveis de citoquinina em monocotiledôneas, como milho, por introdução e expressão de um gene isopentenil transferase com seqüências regulatórias apropriadas, pode melhorar o rendimento e resistência ao estresse em monocotiledôneas (Gan 1995).Dado o papel global da água na determinação da produção, é contemplado que possibilitando às plantas utilizar água de modo mais eficiente, através da introdução e expressão de novos genes, será melhorado o desempenho global mesmo quando a disponibilidade de água no solo não é limitante. Introduzindo genes que melhoram a capacidade das plantas em maximizar o uso de água através de uma faixa total de estresses referentes à disponibilidade de água, a estabilidade do rendimento da produção ou consistência de seu desempenho pode ser alcançada.

Proteção melhorada de planta a fatores de estresses abióticoscomo seca, calor ou frio, também pode ser obtida - por exemplo, - super expressando polipeptídeos anticongelamento de Myoxocefalus Scorpius (WO 00/00512), Myoxocefalus octodecemspinosus, o ativador de transcrição de Arabidopsis thaliana CBF1, glutamato desidrogenases (WO 97/12983, WO 98/11240), genes de proteína quinase dependentes de cálcio (WO 98/26045),calcineurinas (WO 99/05902), caseína quinase de leveduras (WO 02/052012), farnesiltransferases (WO 99/06580; Pei ZM et al. (1998) Science 282: 287-290), ferritina (Deak M et al. (1999) Nature Biotechnology 17: 192-196), oxalato oxidase (WO 99/04013; Dunwell JM (1998) Biotechn Genet Eng Rev 15: 1-32), fator DREB1A ("elemento B IA de resposta a desidratação" ;Kasuga M et al. (1999) Nature Biotech 17: 276-286), genes de síntese de manitol ou trehalose como trehalose-fosfato sintase ou trehalose-fosfato fosfatase (WO 97/42326) ou inibindo genes como trehalase (WO 97/50561).

1.4 Resistência às doenças

É proposto que resistência a doenças pode ser realizada através da introdução de genes no ciclo das plantas. É possível produzir resistência a doenças causadas por vírus, bactérias, fungos, patógenos de raiz, insetos e nematódeos. Também é contemplado que o controle de organismos produzindo micotoxina pode ser realizado através da expressão de genes introduzidos.A resistência a vírus pode ser produzida através da expressão de novos genes. Por exemplo, foi demonstrado que a expressão de uma proteína de capa viral em uma planta transgênica pode conferir resistência à infecção da planta por este vírus e talvez outros vírus intimamente relacionados (Cuozzo 1988, Hemenway 1988, Abel 1986). É contemplado que a expressão de genes anti-sentido marcados em funções virais essenciais pode conferir resistência ao referido vírus. Por exemplo, um gene anti-sentido marcado no gene responsável por replicação de ácido nucleico viral pode inibir a referida replicação e levar à resistência ao vírus. Acredita-se que a interferência com outras funções virais através do uso de genes anti-sentido também pode aumentar a resistência ao vírus. Além disso, é proposto que pode ser possível obter resistência ao vírus através de outras abordagens, incluindo, mas não limitadas ao uso de vírus satélites.

E proposto que resistência aumentada às doenças causadas por bactérias e fungos pode ser alcançada através da introdução de novos genes. É contemplado que genes codificando os denominados "antibióticos peptídicos" , proteínas relacionadas a patogênese (PR), resistência a toxina, e proteínas afetando interações hospedeiro- patógeno como características morfológicas serão utilizáveis. Antibióticos peptídicos são seqüências de polipeptídeos, que são inibidoras para crescimento de bactérias e outros microorganismos. Por exemplo, as classes de peptídeos referidas como cecropinas e magaininas inibem o crescimento de muitas espécies de bactérias e fungos. É proposto que a expressão de proteínas PR em plantas pode ser utilizável para conferir resistência a doença bacteriana. Estes genes são induzidos após ingestão dopatógeno em uma planta hospedeira e devem ser divididos em pelo menos cinco classes de proteínas (Boi 1990). Incluídas entre as proteínas PR estão beta-l,3-glucanases, quitinases e osmotina e outras proteínas que, acredita-se, funcionam em resistência de plantas a organismos doentes. Outros genes foram identificados que têm propriedades antifungicas, por exemplo, UDA(lectina de urtiga picante) e heveína (Broakgert 1989; Barkai-Golan 1978). Sabe-se que certas doenças de plantas são causadas pela produção de fitotoxinas. Resistência a estas doenças pode ser obtida através da expressão de um novo gene que codifica uma enzima capaz de degradar ou de outro modo inativar a fitotoxina. Os novos genes de expressão que alteram interações entre a planta hospedeira e patógeno podem ser utilizáveis para reduzir a capacidade do organismo doente de invadir os tecidos da planta hospedeira, por exemplo, um aumento no caráter ceroso da cutícula da folha ou outras características morfológicas.

Nematódeos parasíticos de plantas são uma das causas de doenças em muitas plantas. É proposto que pode ser possível tornar uma planta resistente a estes organismos através da expressão de novos genes. Antecipa-se que o controle de infestações de nematódeos pode ser realizado alterando-se a capacidade do nematódeo de reconhecer ou atacar uma plantahospedeira ou possibilitar à planta produzir compostos nematicidas, incluindo mas não limitados a proteínas.

Além disso, uma resistência a fungos, insetos, nematódeos e doenças pode ser obtida pelo acúmulo marcado de alguns metabólitos ou proteínas. Estas proteínas incluem, mas não estão limitadas a glucosinolatos(defesa contra herbívoros), quitinases ou glucanases e outras enzimas que destroem a parede celular de parasitas, proteínas inativando ribossomas (RIPs) e outras proteínas de resistência da planta e reação ao estresse como são induzidas quando as plantas são feridas ou atacadas por micróbios, ou quimicamente, por exemplo, por ácido salicílico, ácido jasmônico ou etileno,ou lisozinas de fontes não plantas como, por exemplo, T4-lisozima ou lisozima de uma variedade de mamíferos, proteínas inseticidas como endotoxina de Bacillus thurigiensis, inibidor de a-amilase ou inibidores de protease (inibidor de tripsina de feijão-de-vaca), lecitinas como aglutinina de germe de trigo, RNAses ou ribozimas. Outros exemplos são ácidos nucleicosque codificam a proteína chit42 endoquitinase de Trichoderma harzianum (GenBank Número de acesso S78423) ou citocromo multi-funcional, não hidroxilante P-450 (CYP79) de sorgo bicolor (GenBank Número de Acesso U32624), ou equivalentes funcionais destas. O acúmulo de glucosinolatos como proteção de pragas (Rask L et al. (2000) Plant Mol Biol 42: 93-113; Menard R et al. (1999) Fitochemistry 52: 29-35), a expressão de endotoxinas de Bacillus thurigiensis (Vaeck et al. (1987) Nature 328: 33-37) ou a proteção contra ataque por fungos, por expressão de quitinases, por exemplo, de feijões (Broglie et al. (1991) Science 254: 1194-1197), é vantajosa. Resistência a pragas como, por exemplo, a praga de arroz Nilaparvata lugens em plantas de arroz pode ser obtida por expressão de aglutinina lectina de anêmola {Galanthus nivalis) (Rao et al. (1988) Plant J 15 (4): 469-77). A expressão de genes crylA(b) e crylAc sintéticos, que codificam endotoxinas D de Bacillus thurigiensis específico de lepidópteros pode ocasionar uma resistência a pragas de insetos em várias plantas (Goyal RK et al. (2000) Crop Protection 19 (5): 307-312). Outros genes de marcação que são apropriados para a defesa contra patógenos compreendem "proteína de inibição de poligalacturonase" (PGIP), taumatina, invertase e peptídeos antimicrobianos como lactoferrina (Lee TJ et al. (2002) J Amer Soe Horticult Sei 127 (2): 158-164). Outras seqüências de ácido nucleico que podem ser vantajosamente usadas aqui incluem traços de controle de insetos (patentes US 6.063.597; 6.063.756; 6.093.695; 5.942.664; e 6.110.464), resistência a doença fungica (patentes US 5.516.671; 5.773.696; 6.121.436; 6.316.407; e 6.506.962), resistência a vírus (patentes US 5.304.730 e 6.013.864), resistência a nematódeos (patente US6.228.992), e resistência a doença bacteriana (patente US 5.516.671).

1.5 Redução/ Eliminação de Micotoxina

A produção de micotoxinas, incluindo aflatoxina e fumonisina, por fungos associados com plantas é um fator significativo para tornar o grão não utilizável. Estes organismos fungicos não causam sintomas de doençae/ou interferem com o crescimento da planta, mas produzem produtos químicos (micotoxinas) que são tóxicos para os animais. A inibição do crescimento destes fungos pode reduzir a síntese destas substâncias tóxicas e, assim, reduzir perdas de grãos devido à contaminação por micotoxinas. Os novos genes podem ser introduzidos em plantas que podem inibir a síntese da micotoxina sem interferir com o crescimento de fungos. A expressão de um novo gene, que codifica uma enzima capaz de tornar a micotoxina não tóxica, pode ser utilizável a fim de obter contaminação de grão por micotoxina reduzida. O resultado de qualquer um dos mecanismos acima pode ser umapresença reduzida de micotoxina no grão.

1.6 Composição ou Qualidade do Grão Os genes podem ser introduzidos em plantas, particularmente cereais comercialmente importantes como milho, trigo ou arroz, para melhorar o grão para o qual o cereal é primariamente cultivado. Uma amplafaixa de novas plantas transgênicas produzidas deste modo pode ser visada dependendo do uso final particular do grão.

Por exemplo, o uso principal de grão de milho é voltado para alimentos ou ração. A introdução de genes que alterem a composição do grão pode melhorar muito o valor do alimento ou da ração. Os componentes primários de grão de milho são amido, proteína e óleo. Cada um destes componentes primários de grão de milho pode ser melhorado alterando seu nível de composição. Vários exemplos podem ser mencionados para fins ilustrativos mas de modo algum prover uma lista exaustiva de possibilidades.

A proteína de muitos grãos de cereais é subótima para fins deração ou de alimento, especialmente quando consumida por porcos, aves domésticas e humanos. A proteína é deficiente em vários aminoácidos que são essenciais na dieta destas espécies, requerendo a adição de suplementos ao grão. Aminoácidos essenciais limitantes podem incluir lisina, metionina, triptofano, treonina, valina, arginina e histidina. Alguns aminoácidos tornam-se limitantes somente após o grão ser suplementado com outros insumos para formulações de ração. Por exemplo, quando o grão é suplementado com farinha de soja para atender aos requisitos de lisina, metionina torna-se limitante. Os níveis destes aminoácidos essenciais em sementes e grãos podem ser elevados por mecanismos que incluem, mas não estão limitados à introdução de genes para aumentar a biossíntese dos aminoácidos, diminuir a degradação dos aminoácidos, aumentar o armazenamento de aminoácidos em proteínas, ou aumentar o transporte dos aminoácidos às sementes ou grãos.

Um mecanismo para aumentar a biossíntese dos aminoácidos éintroduzir genes que desregulam as vias biossintéticas de aminoácidos de modo que a planta não mais pode controlar adequadamente os níveis que são produzidos. Isto pode ser feito desregulando ou contornando etapas na via biossintética de aminoácidos que são normalmente regulados por níveis do produto final de aminoácido da via. Exemplos incluem a introdução de genes que codificam versões desreguladas das enzimas aspartoquinase ou ácido dihidrodipicolínico (DHDP)- sintase para aumentar a produção de lisina e treonina, e antranilato sintase para aumentar a produção de triptofano. A redução do catabolismo dos aminoácidos pode ser obtida por introdução de seqüências de DNA que reduzem ou eliminam a expressão de genescodificando enzimas que catalisam etapas nas vias catabólicas como a enzima lisina-cetoglutarato redutase.

A composição da proteína do grão pode ser alterada para melhorar o equilíbrio de aminoácidos em uma variedade de modos, incluindo elevar a expressão de proteínas nativas, diminuir a expressão dos comcomposição fraca, mudar a composição de proteínas nativas, ou introduzir genes codificando proteínas totalmente novas possuindo composição superior. O DNA pode ser introduzido, que diminui a expressão de membros da família de zeína de proteínas em armazenamento. Este DNA pode codificar ribozimas ou seqüências anti-sentido dirigidas para conferir expressão de proteínas zeínaou expressão de reguladores da expressão de zeína como o produto do gene opaco-2. A composição de proteína do grão pode ser modificada através do fenômeno de co-supressão, isto é, inibição da expressão de um gene endógeno através da expressão de um gene estrutural idêntico ou fragmento de gene introduzido através de transformação (Goring 1991). Além disso, o DNA introduzido pode codificar enzimas, que degradam zeínas. Os decréscimos na expressão de zeína que são obtidos podem ser acompanhados por aumentos em proteínas com composição de aminoácidos mais desejáveis ou aumentos em outros constituintes principais da semente como amido. Além disso, umgene quimérico pode ser introduzido que compreende uma seqüência de codificação para uma proteína nativa de composição de aminoácidos adequada, tal como para uma das proteínas globulina ou zeína de 10 kD e um promotor ou outra seqüência regulatória designada para elevar a expressão de referida proteína. A seqüência de codificação de referido gene pode incluir códons adicionais ou de substituição para aminoácidos essenciais. Além disso, uma seqüência de codificação obtida de outras espécies, ou, uma seqüência parcialmente ou completamente sintética codificando uma seqüência de peptídeo completamente única designada para melhorar a composição de aminoácidos da semente pode ser empregada.

A introdução de genes que alteram o teor de óleo do grão pode ser de grande valor. Aumentos no teor de óleo podem resultar em aumentos no teor de energia metabolizável e densidade das sementes para usos em ração e alimentos. Os genes introduzidos podem codificar enzimas que removem ou reduzem limitações de taxa ou etapas reguladas na biossíntese de ácido graxo ou lipídeo. Estes genes podem incluir, mas não estão limitados aos que codificam acetil-CoA carboxilase, ACP-aciltransferase, beta-cetoacil-ACP sintase, mais outras atividades biossintéticas de ácido graxo bem conhecidas. Outras possibilidades são genes que codificam proteínas que não possuem atividade enzimática como proteína de transporte de acila. Outros exemplosincluem 2-acetiltransferase, complexo piruvato de oleosina desidrogenase, acetil CoA sintetase, citrato de ATP liase, ADP- glicose pirofosforilase e genes de transporte carnitina-CoA-acetil-CoA. Antecipa-se que a expressão de genes relacionada à biossíntese de óleo será marcada no plastídeo, usando uma seqüência de peptídeo de trânsito plastídeo e, preferivelmente, expressada no embrião da semente. Os genes podem ser introduzidos os quais alteram o equilíbrio de ácidos graxos presentes no óleo proporcionando uma alimentação mais saudável ou nutritiva. O DNA introduzido também pode codificar seqüências que bloqueiam a expressão de enzimas envolvidas na biossíntese de ácidos graxos, alterando as proporções de ácidos graxos presentes no grão como descrito abaixo.

Genes podem ser introduzidos os quais melhoram o valor nutritivo do componente amido do grão, por exemplo, aumentando o grau de ramificação, resultando na utilização melhorada do amido em vacas ao retardar seu metabolismo.

Além de afetar os constituintes principais do grão, genes podem ser introduzidos, os quais afetam uma variedade de outros aspectos nutritivos, de processamento, ou outra qualidade do grão como usado para ração ou alimento. Por exemplo, a pigmentação do grão pode ser aumentada ou diminuída. A melhora e estabilidade da pigmentação amarela é desejável em algumas rações animais e pode ser obtida por introdução de genes que resultam em produção melhorada de xantofilas e carotenos eliminando as etapas de limitação de taxas em sua produção. Estes genes podem codificar formas alteradas das enzimas fitoeno sintase, fitoeno desaturase ou licopeno sintase. Além disso, milho branco não pigmentado é desejável para produção de muitos produtos alimentícios e pode ser produzido pela introdução de DNA, que bloqueia ou elimina etapas nas vias de produção de pigmento.

Ração ou alimentos compreendendo alguns grãos de cereais possui quantidades insuficientes de vitaminas e deve ser suplementada paraproporcionar um valor nutritivo adequado. A introdução de genes que melhoram a biossíntese de vitaminas em sementes pode ser considerada incluindo, por exemplo, vitaminas A, E, B12, colina, e outras. Por exemplo, grãos de milho também não possuem um teor de mineral suficiente para um valor nutritivo ótimo. Os genes que afetam o acúmulo ou disponibilidade de compostos contendo fósforo, enxofre, cálcio, manganês, zinco e ferro dentre outros podem ser valiosos. Um exemplo pode ser a introdução de um gene que reduz a produção de ácido itálico ou codifica a enzima fitase, de modo a melhora a quebra de ácido fítico. Estes genes podem aumentar os níveis de fosfato disponíveis na dieta, reduzindo a necessidade de suplementação com fosfato mineral.

Numerosos outros exemplos de melhora de cereais para fins de ração e alimentos podem ser descritos. As melhoras podem mesmo não envolver necessariamente o grão, mas podem, por exemplo, melhorar o valor do grão para silagem. A introdução de DNA para realizar isto pode incluir seqüências que alteram a produção de lignina como as que resultam no fenótipo de "nervura central marrom de folhas" associado com o valor superior de ração para gado.

Além de dirigir melhoras no valor da ração ou alimento, genes também podem ser introduzidos os quais melhoram o processamento de grãos e melhoram o valor dos produtos resultantes do processamento. O primeiro método de processar certos grãos como milho é via moagem a úmido. O milho pode ser melhorado através da expressão de novos genes que aumentam a eficácia e reduzem o custo de processamento como diminuindo o tempo de infusão.

A melhora do valor de produtos de moagem a úmido pode incluir alterar a quantidade ou qualidade de amido, óleo, farinha de glúten de milho, ou os componentes da ração com glúten de milho. A elevação do teor de amido pode ser obtida através da identificação e eliminação das etapas delimitação de relações na biossíntese de amido ou diminuindo os níveis dos outros componentes do grão resultando em aumentos proporcionais de amido. Um exemplo do primeiro pode ser a introdução de genes codificando enzimas ADP-glicose pirofosforilase com atividade regulatória alterada ou que são expressados em nível maior. Exemplos das últimas podem incluir inibidores seletivos de, por exemplo, biossíntese de proteína ou de óleo expressados durante os últimos estágios do desenvolvimento de grão de cereal.

As propriedades do amido podem ser beneficamente alteradas por mudança da relação de amilose para amilopectina, o tamanho das moléculas de amido, ou seu padrão de ramificação. Através destas mudanças, uma ampla faixa de propriedades pode ser modificada as quais incluem, mas não estão limitadas a mudanças em temperatura de gelatinização, calor de gelatinização, transparência das películas e pastas, propriedades teológicas, e outras. Para realizar estas mudanças em propriedades, os genes que codificam atividade de amido sintase solúvel ou ligada a grânulos ou atividade da enzima de ramificação podem ser introduzidos sozinhos ou em combinação. DNA como construções anti-sentido também pode ser usado para diminuir os níveis de atividade endógena destas enzimas. Os genes ou construções introduzidos podem possuir seqüências regulatórias que sincronizam sua expressão em intervalos específicos em biossíntese de amido e desenvolvimento de grânulos de amido. Além disso, pode ser aconselhável introduzir e expressar genes que resultam na derivatização in vivo, ou outra modificação, das porções de glicose da molécula de amido. A fixação covalente de qualquer molécula pode ser visada, limitada somente pela existência de enzimas que catalisem as derivatizações e a acessibilidade de substratos apropriados no grânulo de amido. Exemplos de derivações importantes podem incluir a adição de grupos funcionais como grupos aminas, carboxilas ou fosfato, que provêem sítios de derivatizações in vitro subseqüentes ou afetam as propriedades do amido através da introdução decargas iônicas. Exemplos de outras modificações podem incluir mudançasdiretas das unidades de glicose como perda de grupos hidroxila ou suaoxidação em grupos aldeído ou carboxila.

Óleo é um outro produto de moagem a úmido de milho ououtros grãos, cujo valor pode ser melhorado pela introdução e expressão degenes. A quantidade de óleo que pode ser extraída por moagem a úmido podeser elevada por abordagens, como descrito para ração e alimentos acima. Aspropriedades do óleo também podem ser alteradas para melhorar seudesempenho na produção e uso de óleo de cozinha, gorduras para bolos, lubrificantes ou outros produtos derivados de óleo ou melhora de seusatributos para a saúde quando usados nas aplicações relacionadas a alimentos.Novos ácidos graxos também podem ser sintetizados que, quando da extração,podem servir como materiais de partida para síntese de produtos químicos. Asmudanças em propriedades do óleo podem ser obtidas alterando o tipo, nível,ou arranjo de lipídeos dos ácidos graxos presentes no óleo. Isto, por sua vez,pode ser realizado pela adição de genes que codificam enzimas que catalisama síntese de novos ácidos graxos e os lipídeos possuindo os mesmos ouaumentando os níveis de ácidos graxos nativos enquanto possivelmentereduzindo os níveis dos precursores. Alternativamente, seqüências de DNA podem ser introduzidas as quais tornam mais lentas ou bloqueiam as etapas nabiossíntese de ácido graxo resultando no aumento em intermediáriosprecursores de ácido graxo. Genes que podem ser adicionados incluemdessaturases, epoxidases, hidratases, desidratases, e outras enzimas quecatalisam reações envolvendo intermediários de ácido graxo. Exemplosrepresentativos de etapas catalíticas que podem ser bloqueadas incluem asdessaturações de ácido esteárico em oleico e ácido oleico em linolênicoresultando nos respectivos acúmulos de ácidos esteárico e oleico.

Melhoras nos outros produtos principais de moagem a úmidode cereais, farinha de glúten e ração de glúten também podem ser obtidas pelaintrodução de genes para obter novas plantas. Possibilidades representativasincluem, mas não estão limitadas às descritas acima para melhora do valor daração ou alimentação.

Além disso, pode ser ainda considerado que a planta seja usadapara a produção ou fabricação de compostos biológicos utilizáveisapropriados que ou não foram produzidos de todo, ou não foram produzidosno mesmo nível, na planta anteriormente. As novas plantas produzindo estescompostos são tornadas possíveis pela introdução e expressão de genes pormétodos de transformação. As possibilidades incluem, mas não estãolimitadas a qualquer composto biológico que é atualmente produzido porqualquer organismo como proteínas, ácidos nucleicos, metabólitos primários eintermediários, polímeros carboidratos, etc. Os compostos podem serproduzidos pela planta, extraído quando da colheita e/ou processamento, eusados para qualquer fim utilizável atualmente reconhecido como fármacos,fragrâncias, enzimas industriais, para citar apenas alguns.

Outras possibilidades para exemplificar a faixa de traços oupropriedades do grão potencialmente codificadas por genes introduzidos emplantas transgênicas incluem grão com menor susceptibilidade à quebra parafins de exportação ou tamanho de grita maior quando processados pormoagem a seco através de introdução de genes que melhoram a síntese degama-zeína, milho de pipoca com melhorado estouro, qualidade e volume deexpansão através dos genes que aumentam a espessura do pericarpo, milhocom grão mais branco para uso em alimentos através de introdução de genesque efetivamente bloqueiam a expressão de enzimas envolvidas nas vias de produção de pigmentos, e melhorada qualidade de bebidas alcoólicas oumilho dose através de introdução de genes que afetam o aroma como o geneshrunken (codificando sacarose sintase) para milho doce.

1.7 Composição ou qualidade do tubérculo ou sementeVários traços podem ser expressados com vantagem,especialmente em sementes ou tubérculos para melhorar a composição ouqualidade. As seqüências de ácido nucleico úteis que podem ser combinadascom a seqüência de ácido nucleico promotora da presente invenção e provertraços no produto final melhorados, incluem, sem limitação, as codificandoproteínas de armazenamento em semente, enzimas de vias de ácido graxo,enzimas biossintéticas de tocoferol, enzimas biossintéticas de aminoácidos, eenzimas de ramificação de amido. Uma discussão de DNAs heterólogosexemplares úteis para a modificação de fenótipos de planta pode serencontrada em, por exemplo, patentes US Nos. 6.194.636; 6.207.879;6.232.526; 6.426.446; 6.429.357; 6.433.252; 6.437.217; 6.515.201; e6.583.338 e PCT Publicação WO 02/057471, cada sendo especificamenteincorporada aqui por referência em sua totalidade. Estes traços incluem masnão são limitados a:

- Expressão de enzimas metabólicas para uso no setor dealimentos e rações, por exemplo de fitases e celulases. Especialmentepreferidos são ácidos nucleicos como o cDNA artificial, que codifica umafitase microbiana (GenBank Número de Acesso: A19451) ou seusequivalentes funcionais.

- Expressão de genes, que ocasionam um acúmulo de produtosquímicos finos, como de tocoferóis, tocotrienóis ou carotenóides. Umexemplo, que pode ser mencionado, é fitoeno dessaturase. Preferidos sãoácidos nucleicos, que codificam a fotoeno dessaturase de Narcissuspseudonarcissus (GenBank Número de Acesso: X78815) ou seus equivalentesfuncionais. Preferidas enzimas biossintéticas de tocoferol incluem tyrA,slrl736, ATPT2, dxs, dxr, GGPPS, HPPD, GMT, MT1, tMT2, AANT1, slr1737, e uma construção anti-sentido para ácido homogentísico dioxigenase(Kridl et al., Seed Sei. Res., 1:209:219 (1991); Keegstra, Cell, 56(2):247-53(1989); Nawrath et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 91:12760-12764 (1994);Xia et al., J. Gen. Microbiol., 138:1309-1316 (1992); Lois et al., Proc. Natl.Acad. Sei. USA, 95 (5):2105-2110 (1998); Takahashi et al., Proc. Natl. Acad.Sei. USA, 95(17):9879-9884 (1998); Norris et al., Plant Physiol., 117:1317-1323 (1998); Bartley e Scolnik, Plant Physiol., 104:1469-1470 (1994); Smithet al., Plant J., 11:83-92 (1997); WO 00/32757; WO 00/10380; Saint Guily etal., Plant Physiol., 100(2): 1069-1071 (1992); Sato et al., J. DNA Res.,7(1):31-63 (2000), todos incorporados aqui por referência.

- produção de amido (patente US Nos. 5.750.876 e 6.476.295),produção elevada de proteínas (patente US No. 6.380.466), amadurecimentode frutas (patente US No. 5.512.466), nutrição animal e humana melhorada(patente US Nos. 5.985.605 e 6.171.640), biopolímeros (patente US No.5.958.745 e Publicação de Patente U.S. No. 2003/0028917), resistência aoestresse ambiental (patente US No. 6.072.103), peptídeos farmacêuticos(patente US No. 6.080.560), traços de processamento melhorados (patente USNo. 6.476.295), digestibilidade melhorada (patente US No. 6.531.648), baixoteor de rafinose (patente US No. 6.166.292), produção industrial de enzimas(patente US No. 5.543.576), aroma melhorado (patente US No. 6.011.199),fixação de nitrogênio (patente US No. 5.229.114), produção de sementeshíbridas (patente US No. 5.689.041), e produção de biocombustível (patenteUS No. 5.998.700), os elementos genéticos e transgenes descritos nas patenteslistadas acima são aqui incorporados por referência. As enzimas deramificação de amido preferidas (para modificação de propriedades de amido)incluem as especificadas em patentes US Nos. 6.232.122 e 6.147.279; e PCTPublicação WO 97/22703, todos incorporados aqui por referência.

- produção de óleos modificados (patente US No. 6.444.876),produção de alto teor de óleo (patentes US Nos. 5.608.149 e 6.476.295), outeor de ácido graxo modificado (patente US No. 6.537.750). Preferidasenzimas de via de ácido graxo incluem tioesterases (patentes us Nos.5.512.482; 5.530.186; 5.945.585; 5.639.790; 5.807.893; 5.955.650;5.955.329; 5.759.829; 5.147.792; 5.304.481; 5.298.421; 5.344.771; e5.760.206). diacilglicerol aciltransferases (Publicações de Patentes U.S.20030115632A1 e 20030028923A1), e desaturases (patentes US Nos. 5. 689.050; 5. 663. 068; 5.614.393; 5.856.157; 6.117.677; 6.043.411; 6.194.167;5.705.391; 5.663.068; 5.552.306; 6.075.183; 6.051.754; 5.689.050;5.789.220; 5.057.419; 5.654.402; 5.659.645; 6.100,091; 5.760.206;6.172.106; 5.952.544; 5.866.789; 5.443.974; e 5.093.249) todos incorporadosaqui por referência.

- Enzimas biossintéticas preferidas de aminoácidos incluemantranilato sintase (patente US No. 5,965,727 e publicações PCT WO97/26366, WO 99/11800, WO 99/49058), triptofano decarboxilase (PCTPublicação WO 99/06581), treonina decarboxilase (patentes US Nos.5,534,421 e 5,942,660; Publicação PCT WO 95/19442), treonina deaminase(Publicações PCT WO 99/ 02656 e WO 98/55601), ácido dihidrodipicolínicosintase (patente US No. 5,258,300), e aspartato quinase (patentes US Nos.5.367.110; 5.858.749; e 6.040.160) todos incorporados aqui por referência.

- Produção de nutracêuticos, como, por exemplo, ácidosgraxos poliinsaturados, (por exemplo, ácido araquidônico, ácidoeicosapentaenóico, ou ácido docosahexaenóico) por expressão de ácido graxoelongases e/ou desaturases, ou produção de proteínas com valor nutricionalmelhorado como, por exemplo, com um teor elevado de aminoácidosessenciais (por exemplo, o gene de albumina de elevado teor de metionina 2Sda castanha-do-pará). Preferidos são ácidos nucleicos que codificam aalbumina de elevado teor de metionina 2S de Bertholletia excelsa (GenBankNúmero de Acesso: AB044391), A6-acil-lipídeo desaturase de Physcomitrellapatens (GenBank Número de Acesso: AJ222980; Girke et al. (1998) Plant J15:39-48), A6-desaturase de Mortierella alpina (Sakuradani et al. 1999 Gene238:445-453), A5-desaturase de Caenorhabditis elegans (Michaelson et al.1998, FEBS Letters 439:215-218), A5-ácido graxo desaturase deCaenorhabditis elegans (des-5) (GenBank Número de Acesso: AF078796),A5-desaturase de Mortierella alpina (Michaelson et al. JBC 273:19055-19059), A6-elongase de Caenorhabditis elegans (Beaudoin et al. 2000, PNAS97:6421-6426), A6-elongase de Physcomitrella patens (Zank et al. 2000,Biochemical Society Transactions 28:654-657), ou seus equivalentesfuncionais.

- Produção de proteínas e enzimas de elevada qualidadepara fins industriais (por exemplo, enzimas, como lipases) ou como fármacos(como, por exemplo, anticorpos, fatores de coagulação de sangue, interferons,linfocinas, fator de estimulação de colônias, ativadores de plasminogene,hormônios ou vacinas, como descrito por Hood EE, Jilka JM (1999) CurrOpin Biotechnol 10(4): 382-6; Ma JK, Vine ND (1999) Curr Top MicrobiolImmunol 236:275-92). Por exemplo, foi possível produzir avidinarecombinante a partir de albume de galinha e (3-glucuronidase bacteriano(GUS) em uma grande escala em plantas de milho transgênico (Hood et al.(1999) Adv Exp Med Biol 464:127-47. Review).

A obtenção de uma aumentada capacidade dearmazenamento em células que normalmente compreendem menos proteínasde armazenamento ou lipídeos de armazenamento, com o fim de aumentar aprodução destas substâncias, por exemplo por expressão de acetil-CoAcarboxilase. Preferidos ácidos nucleicos são os, que codificam acetil-CoAcarboxilase de Medicago sativa (ACCase) (GenBank Número de Acesso:L25042), ou seus equivalentes funcionais. Alternativamente, em algunscenários, uma teor de proteína de armazenamento elevado pode ser vantajosopara a produção de produto com elevado teor de Protewin. Preferidasproteínas de armazenamento de semente incluem zeínas (patentes US Nos.4.886.878; 4.885.357; 5.215.912; 5.589.616; 5.508.468; 5.939.599;5.633.436; e 5.990.384; Publicações PCT WO 90/01869. WO 91/13993, WO92/14822, WO 93/08682, WO 94/20628, WO 97/28247, WO 98/26064, eWO 99/40209), proteínas 7S (patentes US Nos. 5.003.045 e 5.576.203),proteína de castanha-do-pará (patente US No. 5.850.024), proteínas isentas defenilalanina (PCT Publicação WO 96/17064), albumina (Publicação PCT WO97/35023), b-conglicinina (Publicação PCT WO 00/19839), 11S (patente USNo. 6.107.051), alfa-hordotionina (patente US Nos. 5.885.802 e 5.88.5801),proteínas de armazenamento de semente de arcelina (patente US No.5.270.200), lectinas (patente US No. 6.110.891), e glutenina (patente US Nos.5.990.389 e 5.914.450) todos incorporados aqui por referência.

- Redução dos níveis de atividade de enzimas fosforilase detubérculo tipo a- glucano L (GLTP) ou fosforilase de tubérculo tipo ct-glucano H (GHTP) preferivelmente dentro do tubérculo de batata (ver US5.998.701). A conversão de amidos em açúcar em tubérculos de batata,particularmente quando armazenados em temperaturas abaixo 7°C, é reduzidaem tubérculos demonstrando atividade de enzima GLTP ou GHTP reduzida.A redução do adoçamento no frio de batatas permite o armazenamento dasbatatas em temperaturas mais frias, resultando em dormência prolongada,reduzida incidência de doenças e aumentada vida de armazenamento. Aredução da atividade de GLTP ou GHTP dentro do tubérculo de batata podeser obtida por tais técnicas como a supressão de expressão de gene usandoRNA homólogo anti-sentido ou filamento duplo, o uso de seqüências de co-supressão, silenciamento regulatório. Uma planta de batata tendocaracterísticas de armazenamento no frio melhoradas, compreendendo umaplanta de batata transformada com um cassete de expressão tendo umaseqüência de promotor TPT operativamente ligada a uma seqüência de DNAcompreendendo pelo menos 20 nucleotídeos de um gene codificando uma aglucano fosforilase selecionada dentre o grupo consistindo de fosforilase detubérculo de tipo a glucano L- (GLTP) e fosforilase de tipo a glucano H(GHTP).

Outros exemplos de genes vantajosos são mencionados porexemplo em Dunwell JM, Transgenic approaches to crop improvement, J ExpBot. 2000; 51 Spec No; pags. 487-96.

1.8 Características Agronômicas de Plantas

Dois dos fatores determinando onde as plantas podem sercultivadas são a temperatura média diária durante a estação de crescimento e aextensão de tempo entre as geadas. Dentro das áreas, onde é possível cultivaruma planta particular existem limitações variadas sobre o tempo máximo quese permite cultivar até a maturidade e ser colhida. A planta a ser cultivada emuma área selecionada por sua capacidade de amadurecer e secar para ter umteor de umidade que pode ser colhida dentro do período de tempo requeridocom uma produção máxima possível. Assim, plantas de variadas maturidadesforam desenvolvidas para diferentes locais de cultivo. Além da necessidadede uma secagem suficiente para permitir a colheita, temos a desejabilidade deter a ocorrência de uma secagem máxima no campo de modo a minimizar aquantidade de energia requerida para a secagem adicional após a colheita.

Também, quanto mais prontamente o grão pode secar, mais tempo se temdisponível para o crescimento e o enchimento do caroço. Os genes queinfluenciam a maturidade e/ou secagem podem ser identificados eintroduzidos nas linhagens de plantas usando técnicas de transformação paracriar novas variedades adaptadas para diferentes locais de cultivo ou o mesmo local de cultivo, mas tendo uma relação de produção para umidade melhoradana colheita. A expressão de genes que estão envolvidos na regulação dodesenvolvimento da planta pode ser especialmente utilizável, por exemplo, osgenes de bainha áspera e sem lígula, que foram identificados em plantas.

Os genes podem ser introduzidos em planta que irão melhorar a capacidade de ficar em pé e outras características do crescimento dasplantas. Por exemplo, a expressão de novos genes, que conferem caules maisfortes, melhorados sistemas de raiz, ou evitam ou reduzem a queda de espigaspodem ser de grande valor para o fazendeiro de cultivo de milho. Aintrodução e expressão de genes que aumentam a quantidade total de fotoassimilado disponível, por exemplo, por aumento da distribuição de luz e/ouintersecção podem ser vantajosas. Além disso, a expressão de genes queaumentam a eficácia de fotossíntese e/ou a canópia das folhas pode aindaaumentar os ganhos em produtividade. Estas abordagens podem permitir aumentadas populações de plantas no campo.

O retardo da senescência vegetativa de estação tardia podeaumentar o fluxo de assimilados no grão e, assim, aumentar a produção. Asuper-expressão de genes dentro de plantas que estão associados com"permanecer verde" ou a expressão de qualquer gene que retarda asenescência pode ser vantajoso. Por exemplo, um mutante de nãoamarelecimento foi identificado em Festuca pratensis (Davies 1990).Expressão deste gene assim como de outros pode evitar a ruptura prematurade clorofila e, assim manter a função da canópia.

1.9 Utilização de Nutrientes

A capacidade de utilizar os nutrientes e minerais disponíveispode ser um fator limitante no crescimento de muitas plantas. Foi propostoque seria possível alterar a absorção de nutrientes, tolerar extremos de pH,mobilização através da planta, reuniões de armazenamento, e disponibilidadepara atividades metabólicas pela introdução de novos genes. Estasmodificações podem permitir a uma planta utilizar de modo mais eficiente osnutrientes disponíveis. Foi contemplado que um aumento na atividade de, porexemplo, uma enzima que está normalmente presente na planta e envolvida nautilização de nutriente iria aumentar a disponibilidade de um nutriente. Umexemplo desta enzima seria uma fitase. Também é contemplado que aexpressão de um novo gene pode tornar uma fonte de nutriente disponível aqual não era previamente acessível, por exemplo, uma enzima que libera umcomponente de valor nutriente de uma molécula mais complexa, talvez umamacromolécula.

1.10 Esterilidade masculinaA esterilidade masculina é utilizável na produção de sementehíbrida. Foi proposto que a esterilidade masculina pode ser produzida atravésda expressão de novos genes, por exemplo, foi mostrado que a expressão degenes que codificam proteínas que interferem com o desenvolvimento dainflorescência e/ou gametófito masculino resultam em esterilidade masculina.Os genes de ribonuclease quiméricos que expressam nos anteros de tabacotransgênico e colza de semente oleígena foram demonstrados como levando aesterilidade masculina (Mariani 1990). Por exemplo, um número de mutaçõesforam descobertas em milho que confere esterilidade masculina citoplásmica.Uma mutação em particular, referida como citoplasma T, tambémcorrelaciona com sensibilidade para a mangra da folha do milho Southern.Uma seqüência de DNA, designada TURF-13 (Levings 1990), foi identificadaque correlaciona com citoplasma T. Isto seria possível através da introduçãode TURF-13 via transformação para separar a esterilidade masculina desensibilidade à doença. Como é necessário ser possível restaurar a esterilidademasculina para fins de cruzamento e para a produção de grãos, foi propostoque os genes codificando restauração de esterilidade masculina tambémpodem ser introduzidos.

1.11. Seqüências Não Expressando Proteínas

1.11.1 Expressando RNA

DNA pode ser introduzido em plantas para o fim de expressartranscritos de RNA que funcionam para afetar o fenótipo de planta que aindanão foram traduzidos em proteína. Dois exemplos são RNA anti-sentido eRNA com atividade ribozima. Ambos podem servir a possíveis funções naredução ou eliminação da expressão de genes de planta nativos ouintroduzidos.

Genes podem ser construídos ou isolados, que quandotranscritos, produzem RNA anti-sentido ou RNA filamento duplo que écomplementar a todo ou parte(s) de RNA(s) mensageiro marcado. O RNAanti-sentido reduz a produção do produto polipeptídeo do RNA mensageiro.O produto polipeptídeo pode ser qualquer proteína codificada pelo genoma daplanta. Os genes acima mencionados serão referidos como genes anti-sentido.Um genes anti-sentido pode assim ser introduzido em uma planta por métodosde transformação para produzir uma nova planta transgênica com expressãoreduzida de uma proteína de interesse selecionada. Por exemplo, a proteínapode ser uma enzima que catalisa uma reação na planta. Redução da atividadede enzima pode reduzir ou eliminar os produtos da reação que incluemqualquer um composto enzimaticamente sintetizado na planta, como ácidosgraxos, aminoácidos, carboidratos, ácidos nucleicos e semelhantes.Alternativamente, a proteína pode ser uma proteína de armazenamento, comouma zeína, ou uma proteína estrutural, cuja expressão diminuída pode levar amudanças na composição do aminoácido da semente ou mudançasmorfológicas da planta, respectivamente. As possibilidades citadas acima sãoprovidas somente a título de exemplo e não representam a faixa completa deaplicações.

Expressão de RNA anti-sentido ou RNA filamento duplo porum dos cassetes de expressão da invenção é especialmente preferida. Tambémexpressão de RNA sentido pode ser empregada para silenciamento de genes(co-supressão). Este RNA é preferivelmente um RNA não traduzível. Aregulação do gene por RNA filamento duplo ("RNA interferência filamentoduplo"; dsRNAi) é bem conhecido na arte e descrito para vários organismosincluindo plantas (por exemplo, Matzke 2000; Fire A et al 1998; WO99/32619; WO 99/53050; WO 00/68374; WO 00/44914; WO 00/44895; WO 00/49035; WO 00/63364).

Genes também podem ser construídos ou isolados, que quandotranscritos produzem enzimas de RNA, ou ribozimas, que podem atuar comoendoribonucleases e catalisam a clivagem de moléculas de RNA comseqüências selecionadas. A clivagem de RNA's mensageiros selecionadospode resultar na produção reduzida de seus produtos polipeptídeoscodificados. Estes genes podem ser usados para preparar novas plantastransgênicas, que possuem os mesmos.

As plantas transgênicas podem possuir níveis reduzidos depolipeptídeos incluindo mas não limitados aos polipeptídeos citados acimaque podem ser afetados por RNA anti-sentido.

É também possível que genes podem ser introduzidos paraproduzir novas plantas transgênicas, que tem expressão reduzida de umproduto de gene nativo, por um mecanismo de cossupressão. Foi demonstradoem tabaco, tomate, e petúnia (Goring 1991; Smith 1990; Napoli 1990; van derKrol 1990) que a expressão do transcrito sentido de um gene nativo iráreduzir ou eliminar a expressão do gene nativo em um modo similar aoobservado para genes anti-sentido. O gene introduzido pode codificar toda ouparte da proteína nativa introduzida mas sua tradução pode não ser requeridapara redução de níveis desta proteína nativa.

1.11.2 Não Expressando RNA

Por exemplo, elementos DNA incluindo os de elementostransposaveis como Ds, Ac, ou Mu, podem ser inseridos em um gene e causarmutações. Estes elementos de DNA podem ser inseridos a fim de inativar (ouativar) em um gene e assim "etiquetar" um traço particular. Neste caso, oelemento transposável não causa instabilidade da mutação etiquetada, porquea utilidade do elemento não depende de sua capacidade de se movimentar nogenoma. Uma vez etiquetado o traço desejado, a seqüência de DNAintroduzida pode ser usada para clonar o correspondente gene, por exemplo,usando a seqüência de DNA introduzido como um iniciador PCR junto comtécnicas PCR de clonagem de genes (Shapiro, 1983; Dellaporta 1988). Umavez identificado(s), o (s) gene(s) completo (s) para o traço particular,incluindo regiões de controle ou regulatórias onde desejado pode (m) serisolado(s), clonado(s) e manipulado(s) como desejado. A utilidade doselementos de DNA introduzidos em um organismo para o fim de etiquetargenes é independente da seqüência de DNA e não depende de qualqueratividade biológica da seqüência de DNA, isto é, transcrição em RNA outradução em proteína. A única função do elemento de DNA é romper aseqüência de DNA de um gene.

É contemplado que seqüências de DNA não expressadas,incluindo seqüências sintética novas, podem ser introduzidas em células como"rótulos" de propriedade destas células e plantas e suas sementes. Não serianecessário rotular para um elemento de DNA para interromper a função de um gene endógeno ao organismo hospedeiro, como a única função deste DNAseria identificar a origem do organismo. Por exemplo, seria possívelintroduzir uma seqüência de DNA singular em uma planta e este elemento deDNA iria identificar todas as células, plantas, e progênie destas células comotendo surgido da fonte rotulada. É proposto que a inclusão de DNAs de rótulos iria permitir distinguir um germplasma de propriedade ou germplasmaderivado de tal, de um germplasma não rotulado..

Outro elemento possível, que pode ser introduzido, é umelemento de região de fixação de matriz (MAR), como elemento de lisozimaA de galinha (Stief 1989), que pode ser posicionado em torno de um gene deinteresse expressável para efetuar um aumento em expressão global do gene ediminuir os efeitos dependentes de posição quando da incorporação nogenoma da planta (Stief 1989; Phi-Van 1990).

Outras seqüências nucleotídicas de interesse que podem sercontempladas para uso dentro do escopo da presente invenção em ligaçãooperativa com as seqüências de promotor de acordo como a invenção sãomoléculas ácido nucleico isoladas, por exemplo, DNA ou RNA,compreendendo a seqüência nucleotídica da planta de acordo como ainvenção, compreendendo uma matriz de leitura aberta que é preferivelmenteexpressada em um tecido específico, isto é, tecido de semente, raiz, tecidoverde (folha e caule), panícula, ou pólen, ou é expressada constitutivamente.2. Genes Marcadores

A fim de melhorar a capacidade de identificar transformantes,pode-se desejar empregar um gene marcador selecionável ou triável como, ouem adição a, o gene de interesse expressável. "Genes Marcadores" são genesque conferem um fenótipo distinto a células expressando o gene marcador eassim permite que estas células transformadas sejam distintas das células quenão tem o marcador. Estes genes podem codificar ou um marcadorselecionável ou triável, dependendo de se o marcador confere um traço que se"selecionar" por meios químicos, isto é, através do uso de um agente seletivo(por exemplo, um herbicida, antibióticos, ou semelhantes), ou se forsimplesmente um traço que se pode identificar através de observação ou teste,isto é, por "triagem " (por exemplo, traço do locus R, a proteína fluorescenteverde (GFP)). Como evidente, muitos exemplos de genes marcadoresapropriados são conhecidos na arte e podem ser empregados na prática dainvenção.

Estão incluídos dentro dos termos de genes marcadoresselecionáveis ou triáveis, também os genes que codificam um "marcadorsecretável" cuja secreção pode ser detectada como um meio de identificaçãoou seleção para células transformadas. Os exemplos incluem marcadores, quecodificam um antígeno secretável que pode ser identificado por interação deanticorpo, ou mesmo enzimas secretaveis, que podem ser detectadas por suaatividade catalítica. As proteínas secretaveis caem em várias classes,incluindo proteínas pequenas, difusíveis, por exemplo por ELISA, enzimasativas pequenas detectáveis em solução extracelular (por exemplo, alfa-amilase, beta-lactamase, fosfinotricina acetiltransferase); e proteínas que sãoinseridas ou aprisionadas na parede celular (por exemplo, proteínas queincluem uma seqüência líder como que encontrada na unidade de expressãode extensina ou PR-S de tabaco).Com relação a marcadores secretáveis selecionáveis, o uso deum gene que codifica a proteína que se torna seqüestrada na parede celular, ecuja proteína inclui um epítopo único, é considerado como sendoparticularmente vantajoso. Este marcador de antígeno secretado poderiaidealmente empregar uma seqüência de epítopo que iria prover um fundobaixo no tecido da planta, uma seqüência líder-promotor, que iria conferiruma expressão eficiente e marcação através da membrana de plasma, e iriaproduzir proteína que é ligada na parede celular e ainda acessível aanticorpos. Uma proteína de parede normalmente secretada modificada paraincluir um epítopo único iria atender a estas tais exigências.

Um exemplo de uma proteína apropriada para modificação demodo é extensina, ou glicoproteína rica em hidroxiprolina (HPRG). Porexemplo, a molécula HPRG de milho (Steifel 1990) é bem caracterizada emtermos de biologia molecular, expressão e estrutura da proteína. No entanto, qualquer uma dentre uma variedade de proteínas de parede ricas em ultilanoe/ou glicina (Keller 1989) pode ser modificada pela adição de sítio antigênicopara criar um marcador triável.

Uma forma de realização exemplar de um marcador triávelsecretável refere-se ao uso de uma seqüência de milho codificando a proteína HPRG de parede, modificada para incluir um epítopo de 15 resíduos da pro-região de interleucina de murinos, no entanto, virtualmente qualquer epítopodetectável pode ser empregado em tais formas de realização, comoselecionado dentre a variedade extremamente ampla de combinações deantígeno -anticorpo conhecidas dos versados na arte. O epítopo extracelularúnico pode então ser detectado diretamente usando rotulação de anticorposem conjunto com adjuvantes cromogênicos ou fluorescentes.

Elementos da presente descrição podem ser exemplificados emdetalhes através do uso dos genes bar e/ou GUS, e também através do uso devários outros marcadores. Como evidente, à luz da descrição, numerososoutros genes marcador selecionáveis e/ou triáveis possíveis serão evidentespara os versados na arte além dos especificados aqui abaixo. Assim, seráentendido que a seguinte discussão é exemplar em vez de exaustiva. Á luz dastécnicas aqui descritas e as técnicas recombinantes gerais que são bemconhecidas na arte, a presente invenção torna possível a introdução dequalquer gene, incluindo genes marcadores, em uma célula recipiente demodo a gerar uma planta transformada.

2.1 Marcadores Selecionáveis

Vários marcadores selecionáveis são conhecidos na arteapropriados para transformação de planta. Estes marcadores podem incluirmas não são limitados a:

2.1.1 Marcadores de seleção negativa

Os marcadores de seleção negativa conferem resistência a umcomposto biocida como um inibidor metabólico (por exemplo, 2-desoxiglicose-6-fosfato, WO 98/45456), antibióticos (por exemplo,canamicina, G418, bleomicina ou higromicina) ou herbicidas (por exemplo,fosfinotricina ou glifosato). Material de planta transformada (por exemplo,células, tecidos ou plântulas), que expressam genes marcadores, são capazesde desenvolver na presença de concentrações de um composto de seleçãocorrespondente (por exemplo, antibiótico ou herbicida), que suprimem ocrescimento de um tecido de tipo selvagem não transformado. Os marcadoresde seleção negativa especialmente preferidos são os, que conferem resistênciaa herbicidas. Exemplos, que pode ser mencionados, são:

- Fosfinotricina acetiltransferases (PAT; também chamadoresistência a Bialofos ®; bar; de Block 1987; Vasil 1992, 1993; Weeks 1993;Becker 1994; Nehra 1994; Wan & Lemaux 1994; EP 0 333 033; US4,975,374). Preferidos são o gene bar de Streptomyces hygroscopicus ou ogene pat de Streptomyces viridochromogenes. PAT inativa o ingrediente ativono herbicida bialafos, fosfinotricina (PPT). PPT inibe a glutamina sintetase,(Murakami 1986; Twell 1989) causando um rápido acúmulo de amônia emorte celular.

- 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintase alterada (EPSPS)conferindo resistência a Glifosate® (N-(fosfonometil)glicina) (Hinchee 1988;Shah 1986; Della-Cioppa 1987). Onde se emprega um gene EPSP sintasemutante, benefício adicional pode ser realizado através da incorporação de umpeptídeo de transito de cloroplasto apropriado, CTP (EP-A1 0 218 571).

- enzimas degradando Glifosate® (Glifosate® oxidoreductase; gox),

- dehalogenases inativando Dalapon® (deh)acetolactato sintases inativando sulfoniluréia- e/ouimidazolinona (ahas ou ALS; por exemplo variantes ahas/ALS mudadas com,por exemplo, a mutação S4, XI12, XA17, e/ou Hra (EP-A1 154 204)

- nitrilases degradando Bromoxinil® (bxn; Stalker 1988)

- genes de resistência a canamicina ou geneticina (G418)(NPTII; NPT ou neo; Potrikus 1985) codificando por exemplo, paraneomicina fosfotransferases (Fralei 1983; Nehra 1994)

- 2-Desoxiglicose-6-fosfato fosfatase (produto de geneDOGRl-; WO 98/45456; EP 0 807 836) conferindo resistência contra 2-desoxiglicose (Randez-Gil 1995).

- higromicina fosfotransferase (HPT), que media a resistênciaa higromicina (Vanden Elzen 1985).

- dihidrofolato reductase alterada (Eichholtz 1987) conferindoresistência contra metotrexato (Thillet 1988);

- genes antranilato sintase mudados que conferem resistência a-metil triptofano.

Os genes marcadores selecionáveis negativos adicionais queconferem resistência a antibióticos incluem o gene aadA, que confereresistência ao antibiótico espectinomicina, gentamicina acetil transferase,estreptomicina fosfotransferase (SPT), aminoglicosídeo-3-adenil transferase eo determinante de resistência a bleomicina (Hayford 1988; Jones 1987; Svab1990;Hille 1986).

Especialmente preferidos são os marcadores de seleçãonegativos que conferem resistência contra os efeitos tóxicos impostos por D-aminoácidos, como por exemplo, D-Alanina e D-serina (WO 03/060133;Erikson 2004). Especialmente preferidos marcadores de seleção negativosneste contexto são o gene dao\ (EC: 1.4. 3.3: GenBank Número de acesso:U60066) da levedura Rhodotorula gracilis {Rhodosporidium toruloides) e ogene dsdA de E. coli (D-serina dehidratase (D-serina deaminase) [EC: 4.3.1.18; GenBank número de acesso: J01603).

O material de planta transformada (por exemplo, células,embriões, tecidos ou plântulas) que expressam tais genes marcadores sãocapazes de desenvolver na presença de concentrações de um composto deseleção correspondente (por exemplo, antibiótico ou herbicida) que suprimecrescimento de um tecido tipo selvagem não transformado. As plantasresultantes pode ser cruzadas e hibridizadas de modo comum. Duas ou maisgerações devem ser cultivadas a fim de assegurar que a integração genômicaseja estável e hereditária. Os métodos correspondentes são descritos (Jenes1993; Potrykus 1991).

Além disso, genes repórteres podem ser empregados parapermitir a triagem visual, que pode ou não (dependendo do tipo de generepórter) requerer suplementação com um substrato como um composto deseleção.

Vários esquemas de tempo podem ser empregados para osvários genes marcadores de seleção negativos. Em caso de genes deresistência (por exemplo, contra herbicidas ou D-aminoácidos) a seleção épreferivelmente aplicada através de fase de indução de calo durante cerca de 4semanas e além de pelo menos 4 semanas em regeneração. Este esquema deseleção pode ser aplicado para todos os regimes de seleção. É além dissopossível (apesar de não explicitamente preferido) fazer a seleção tambématravés de um esquema completo de regeneração incluindo a formação daraiz.

Por exemplo, com o gene de resistência a fosfinotricina (bar)como o marcador seletivo, fosfinotricina uma concentração de cerca de 1 a 50mg/l pode ser incluído no meio. Por exemplo, com o gene daol como omarcador seletivo, D-serina ou D-Alanina a uma concentração de cerca de 3 a100 mg/l pode ser incluída no meio. As concentrações típicas para seleção sãode 20 a 40 mg/l. Por exemplo, com os genes ahas mudados como o marcadorseletivo, PURSUIT™ a uma concentração de cerca de 3 a 100 mg/l pode serincluído no meio. As concentrações típicas para seleção são de 20 a 40 mg/l.

2.1.2 Marcador de seleção positivo

Além disso, marcador de seleção positivo pode ser empregado.Genes como isopenteniltransferase de Agrobacterium tumefadens(cepa:P022; Genbank Número de acesso: AB025109) podem -como umaenzima chave da biossíntese de citoquinina - facilitar a regeneração deplantas transformadas (por exemplo, por seleção em meio isento decitoquinina). Os métodos correspondentes de seleção são descritos (Ebinuma2000a,b). Os marcadores de seleção positivos adicionais, que conferem umavantagem de crescimento a uma planta transformada em comparação comuma não transformada, são descritos por exemplo, em EP-A 0 601 092. Osmarcadores de seleção de estimulação do crescimento podem incluir (mas nãodevem ser limitados a) P -glucuronidase (em combinação com por exemplo,um glucuronídeo de citoquinina), mannose-6-fosfato isomerase (emcombinação com mannose), UDP-galactose-4-epimerase (em combinaçãocom por exemplo, galactose), em que mannose-6-fosfato isomerase emcombinação com mannose é especialmente preferida.

2.1.3 Marcador de contra-seleçãoOs marcadores de contra-seleção são especialmenteapropriados para selecionar organismos como seqüências deletadas definidascompreendendo o referido marcador (Koprek 1999). Exemplos para marcadorcontra- seleção compreendem timidina quinases (TK), citosina deaminases(Gleave 1999; Perera 1993; Stougaard 1993), proteínas citocromo P450(Koprek 1999), haloalcano desalogenases (Naested 1999), produtos de genesiaaH (Sundaresan 1995), citosina deaminase codA (Schlaman & Hooykaas1997), produtos de gene tms2 (Fedoroff & Smith 1993), ou a-naftalenoacetamida (NAM; Depicker 1988). Os marcadores de contra seleção podemser úteis na construção de linhagens de etiqueta transposon. Por exemplo, aomarcar um elemento transposável autônomo como Ac, Master Mu, ou En/Spncom um marcador de contra seleção, pode-se selecionar transformantes emque o elemento autônomo não está estavelmente integrado no genoma. Istoseria desejável, por exemplo, quando a expressão transiente do elementoautônomo é desejada para ativar em trans a transposição de um elementotransposável defeituoso, como Ds, mas a integração estável do elementoautônomo não é desejada. A presença do elemento autônomo pode não serdesejada a fim de estabilizar o elemento defectivo, isto é, evitar que ele aindapasse por transposição. No entanto, é proposto que se a integração estável deum elemento transposável autônomo for desejada em uma planta, a presençade um marcador selecionável negativo pode tornar possível eliminar oelemento autônomo durante o processo de cruzamento.

2.2. Marcadores triáveis

Os marcadores triáveis que podem ser empregados incluem,mas não são limitados a, gene beta-glucuronidase (GUS) ou uidA que codificauma enzima para os vários substratos cromogênicos são conhecidos; um geneR-locus, que codifica um produto que regula a produção de pigmentos deantocianina (cor vermelha) em tecidos de plantas (Dellaporta 1988); genebeta-lactamase (Sutcliffe 1978), que codifica uma enzima para a qual osvários substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, PADAC, umacefalosporina cromogênica); um gene xylE (Zukowsky 1983) que codificauma catecol dioxigenase que pode converter catecóis cromogênicos; um genea-amilase (Ikuta 1990); um gene tirosinase (Katz 1983) que codifica umaenzima capaz de oxidar tirosina em DOPA e dopaquinona que por sua vezcondensa para formar o composto melamina facilmente identificável, gene (3 -galactosidase, que codifica uma enzima para a qual existem substratoscromogênicos; um gene luciferase (lux) (Ow 1986), que permite paradetecção de bioluminescência; ou mesmo um gene aequorina (Prasher 1985),que pode ser empregado em detecção de bioluminescência sensível a cálcio,ou um gene de proteína fluorescente verde (Niedz 1995).

Genes do complexo de genes R do milho são contempladospor serem particularmente úteis como marcadores triável. O complexo degenes R em milho codifica uma proteína que atua para regular a produção depigmentos antocianina na maior parte da semente e tecido de planta. Um genedo complexo de genes R foi aplicado em transformação de milho, porque aexpressão deste gene em células transformadas não prejudica as células.Assim, um gene R introduzido em tais células irá causar a expressão de umpigmento vermelho e, se estavelmente incorporado, pode ser visualmenteclassificado como um setor vermelho. Se uma linhagem de milho fordominante para genes codificando os intermediários enzimáticos na viabiossintética de antocianina (C2, Al, A2, Bzl e Bz2), mas transporta um alelorecesso no locus R, transformação de qualquer célula da qual a linhagem comR irá resultar em uma formação de pigmento vermelho. As linhagensexemplares incluem Wisconsin 22 que contém o alelo rg-Stadler e TR112, umderivado K55 que é r-g, b, PI. Alternativamente, qualquer genótipo de milhopode ser utilizado se os alelos Cl e R forem introduzidos juntos.

Foi ainda proposto que as regiões de gene regulatório R podemser empregadas em construções quimérica a fim de prover mecanismos paracontrolar a expressão de gene quiméricos. Uma maior diversidade deexpressão fenotípica é conhecida no locus R do que em qualquer um dosoutros locus (Coe 1988). É contemplado que regiões regulatórias obtidas deregiões 5' para o gene R estrutural seriam valiosas na direção da expressão degenes, por exemplo, resistência a insetos, resistência a seca, tolerância aherbicida ou outras regiões codificando proteínas. Para os fins da presenteinvenção, acredita-se que qualquer um dos vários membros da família do geneR pode ser empregado com sucesso (por exemplo, P, S, Lc, etc). No entanto,o mais preferido será geralmente Sn (particularmente Sn:bol3). Sn é ummembro dominante do complexo de genes R e é funcionalmente similar aoslociReBem que Sn controla a deposição específica de tecido dos pigmentosde antocianina em algumas células de mudinhas e de planta, assim, seufenótipo é similar a R.

Um outro marcador triável contemplado para uso na presenteinvenção é luciferase de vaga-lume, codificado pelo gene lux. A presença dogene lux em células transformadas pode ser detectada usando, por exemplo,filme de raio-x, contagem de cintilação, espectrofotometria fluorescente,câmeras de vídeo de luz fraca, câmaras de contagem de fótons ouluminometria de múltiplas cavidades. É também visado que este sistema podeser desenvolvido para uma triagem populacional para bioluminescência, comoem placas de cultura de tecidos, ou mesmo para uma triagem da plantacompleta. Onde o uso de um gene marcador triável como lux ou GFP édesejado, benefício pode ser realizado por criação de uma fusão de gene entreo gene marcador triável e um gene marcador selecionável, por exemplo, umgene de fusão GFP-NPTII. Isto pode permitir, por exemplo, seleção de célulastransformadas seguido por triagem de plantas transgênicas ou sementes.

3. Moléculas de DNA exemplares

A invenção prove uma molécula de ácido nucleico isolada, porexemplo, DNA ou RNA, compreendendo uma seqüência nucleotídica deplantas, compreendendo uma matriz de leitura aberta que é preferivelmenteexpressada em um tecido de planta específico, isto é, em sementes, raízes,tecido verde (folha e caule), panículas ou pólen, ou é expressadaconstitutivamente, ou um seu promotor.

Estes promotores incluem, mas não são limitados a,constitutivos, indutíveis, regulados temporalmente, regulados emdesenvolvimento, regulados espacialmente, regulados quimicamente,respondentes a estresse, específicos de tecido, promotores virais e sintéticos.Seqüências de promotor são conhecidas como sendo fortes ou fracas. Umpromotor forte prove um nível elevado de expressão de gene, enquanto umpromotor fraco prove um nível muito baixo de expressão de gene. Umpromotor indutível é um promotor que prove ligar ou desligar a expressão degene em resposta a um agente adicionado exogenamente, ou a um estímuloambiental ou de desenvolvimento. Um promotor bacteriano, como o promotorPtac, pode ser induzido em variados níveis de expressão de gene dependendodo nível de isotiopropilgalactosídeo adicionado às células bacterianastransformadas. Uma seqüência isolada de promotor que é um promotor fortepara ácido nucleico heterólogo é vantajosa porque ela prove um nívelsuficiente de expressão de gene para permitir uma detecção e seleção fáceisde células transformadas e prove um nível elevado de expressão de genes,quando desejado.

Dentro de uma região de promotor de planta, existem váriosdomínios que são necessários para a função completa do promotor. Oprimeiro de destes domínios esta imediatamente a montante do gene estruturale forma a "região de promotor de núcleo "contendo seqüências de consenso,normalmente 70 pares de base imediatamente a montante do gene. A regiãode promotor de núcleo contém as caixas características CAAT e TATA maisas seqüências circundantes, e representa a seqüência de iniciação detranscrição que define o início do ponto de transcrição para o gene estrutural.A presença da região de promotor de núcleo define umaseqüência como sendo um promotor: se a região estiver ausente, o promotor énão funcional. Além disso, a região de promotor de núcleo é insuficiente paraproporcionar uma atividade de promotor completa. Uma série de seqüênciasregulatórias a montante do núcleo constitui o restante do promotor. Asseqüências regulatórias determinam o nível de expressão, padrão espacial etemporal de expressão e, para um sub-conjunto importante de promotores, aexpressão sob condições indutivas (regulação por fatores externos, como luz,temperatura, produtos químicos, hormônios).

A expressão regulada da proteína de replicação viral detransatuação quimérica pode ser ainda regulada por outras estratégicasgenéticas. Por exemplo, ativação de genes mediada por Cre, como descritopor Odell et al. 1990. Assim, um fragmento de DNA contendo seqüênciaregulatória 3' ligada por sítios lox entre o promotor e a proteína de replicaçãocodificando a seqüência que bloqueia a expressão de um gene de replicaçãoquimérica do promotor pode ser removido por excisão mediada por Cre eresultar na expressão do gene de replicação trans-atuando. Neste caso, o geneCre quimérico, o gene de replicação trans-atuando quimérico, ou ambos,podem estar sob o controle de promotores indutíveis ou específicos de tecidoe desenvolvimento. Uma estratégia genética alternada é o uso de genesupressor de tRNA. Por exemplo, a expressão regulada de um gene supressorde tRNA pode controlar de modo condicional a expressão de uma seqüênciacodificando proteína de replicação trans-atuando contendo um códon determinação apropriado, com descrito por Ulmasov et al. 1997. Novamente,nem o gene supressor de tRNA quimérico, nem o gene de replicação trans-atuando quimérico, ou ambos, pode estar sob o controle de promotoresindutíveis ou específicos de tecido e desenvolvimento.

Freqüentemente é desejável ter uma expressão contínua ouindutível de uma seqüência de DNA em todas as células de um orgânica emum modo independente de tecido.. Por exemplo, resistência aumentada deuma infecção de planta t6 por patógenos de origem no solo e ar, pode serobtida por manipulação genética do genoma da planta de modo acompreender um promotor contínuo ligado operativamente a um gene deresistência a patógeno heterólogo, com as proteínas de resistência a patógenosão continuamente expressadas em todos os tecidos da planta.

Alternativamente, pode ser desejável inibir a expressão de umaseqüência de DNA nativa dentro das sementes de uma planta de modo a obterum fenótipo desejado. Neste caso, esta inibição pode ser obtida comtransformação da planta para compreender um promotor ligadooperativamente a uma seqüência nucleotídica anti-sentido, de modo que aexpressão preferencial de semente ou específica de semente da seqüência anti-sentido produz um transcrito de RNA que interfere com a tradução de mRNAda seqüência de DNA nativo.

Para definir uma região de promotor mínima, um segmento deDNA representando a região de promotor é removido da região 5' do gene deinteresse e operativamente ligado à seqüência codificando um gene marcador(repórter) por técnicas de DNA recombinantes bem conhecidas na arte. Ogene repórter é operativamente ligado a jusante do promotor, de modo que ostranscritos se iniciando no promotor prosseguem através do gene repórter. Osgenes repórter geralmente codificam proteínas, que são facilmente medidas,incluindo, mas não limitadas a, cloranfenicol acetil transferase (CAT), beta-glucuronidase (GUS), proteína fluorescente verde (GFP), beta-galactosidase(beta-GAL), e luciferase.

A construção contendo o gene repórter sob o controle dopromotor é então introduzida em um tipo de célula apropriado por técnicas detransfecção bem conhecidas na arte. Para estar a proteína repórter, lisados decélula são preparados e testes apropriados, que são bem conhecidos na arte,para a proteína repórter são realizados. Por exemplo, se CAT for o generepórter de escolha, os Usados de células transfectadas com construçõescontendo CAT sob o controle de um promotor sob estudo são misturados comcloranfenicol e acetil-coenzima A (acetil-CoA) isotopicamente rotulados. Aenzima CAT transfere o grupo acetila de acetil-CoA para a posição 2- ou 3 decloranfenicol. A reação é monitorada por cromatografia de camada fina, quesepara o cloranfenicol acetilado de material não reagido. Os produtos dereação são então visualizados por auto-radiografia.

O nível de atividade de enzima corresponde à quantidade deenzima que foi feita, que por sua vez revela o nível de expressão do promotorde interesse. Este nível de expressão pode ser comparado a outros promotorespara determinar a resistência relativa do promotor sob estudo. A fim de secertificar que o nível de expressão é determinado pelo promotor, em vez depela estabilidade do mRNA, o nível do mRNA repórter pode ser medidodiretamente, como por análise Northern blot.

Uma vez detectada a atividade, análises mutacionais e/oudelecionais podem ser empregadas para determinar a região mínima e/ouseqüências requeridas para iniciar a transcrição. Assim, as seqüências podemser deletados na extremidade 5' da região do promotor e/ou na extremidade 3'da região de promotor, e as substituições de nucleotídeos introduzidas. Estasconstruções são então introduzidas nas células e sua atividade determinada.

Em uma forma de realização, o promotor pode ser umpromotor gama zeína, um promotor oleló de oleosina, um promotor deglobulinas, um promotor I de actina, um promotor cl de actina, um promotorde sacarose sintetase, um promotor de INOPS, um promotor de EXM5, umpromotor de globulina2, um b-32, um promotor ADPG-pirofosforilase, umpromotor Ltpl, um promotor Ltp2, um promotor de oleosina olel7, umpromotor de oleosina olel8, um promotor de actina 2, um promotor deproteína específica de pólen, um promotor de pectato liase específica depólen, um promotor de proteína específico de antero, um promotor de RTS2de gene específico de antero, um promotor de gene específico de pólen, umpromotor de gene específico de tapeturn, um promotor RAB24 de geneespecífico de tapeturn, um promotor de subunidade alfa de antranilato sintase,um promotor de alfa zeína, um promotor de subunidade beta de antranilato sintase, um promotor de dihidrodipicolinato sintase, um promotor Thil, umpromotor de álcool desidrogenase, um promotor de proteína de ligação cab,um promotor de H3C4, um promotor de enzima de ramificação de amidoRUBISCO SS, um promotor de ACCase, um promotor de actina3, umpromotor de actina7, um promotor GF14-12 de proteína regulatória, um promotor L9 de proteína ribossômica, um promotor de enzima biossintéticacelulose, um promotor de S-adenosil-L-homocisteína hidrolase, um promotorde superóxido dismutase, um promotor de receptor de C-quinase, umpromotor de fosfoglicerato mutase, um promotor de mRNA RCc3 específicode raiz, um promotor de glicose-6 fosfato isomerase, um promotor de pirofosfato-fructose 6-fosfatolfosfotransferase, um promotor de ubiquitina,um promotor de beta-cetoacil-ACP sintase, um promotor 1 Ide foto sistema de33 kDa, um promotor de proteína envolvendo oxigênio, um promotor desubunidade ATPase vacuolar de 69 kDa, um promotor de proteína semelhantea metalotioneína, um promotor de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, um promotor de proteína semelhante a ABA e indutível do amadurecimento, umpromotor de fenilalanina amônia liase, um promotor de adenosina trifosfataseS-adenosil-L-homocisteína hidrolase, um de promotor a-tubulina, umpromotor cab, um promotor PEPCase, um promotor de gene R, um promotorde lectina, um promotor de complexo de colheita de luz, um promotor deproteína de choque térmico, um promotor de calcona sintase, um promotor dezeína, um promotor de globulina-1, um promotor de ABA, um promotor deproteína de ligação a auxina, um promotor de gene UDP glicose flavonóideglicosil -transferase, um promotor NTI, um promotor de actina, um promotoropaco 2, um promotor b70, um promotor de oleosina, um promotor CaMV35S, um promotor CaMV 34S, um promotor CaMV 19S, um promotor dehistoria, um promotor indutível do turgor, um promotor de carboxilase RuBPde subunidade pequena de ervilha, um promotor de Ti plasmídeo manopinasintase, um promotor de Ti plasmídeo nopalina sintase, um promotor decalcona isomerase de petúnia, um promotor de proteína I rica em glicina defeijão, um promotor de transcrito de CaMV 35S, um promotor de patatina debatata, ou um promotor de carboxilase RuBP de subunidade pequena de S-E9.

4. Plantas transformadas (transgênicas) da invenção emétodos de preparação

As espécies de plantas podem ser transformadas com aconstrução de DNA da presente invenção pela transformação mediada porDNA de protoplastos de células de planta e subseqüente regeneração daplanta a partir dos protoplastos transformados, de acordo com procedimentosbem conhecidos na arte.

Qualquer tecido de planta capaz de propagação clonalsubseqüente, seja por organogenese ou embriogênese, pode ser transformadocom um vetor da presente invenção. O termo "organogenese," como usadoaqui, significa um processo pelo qual os brotos e raízes são desenvolvidosseqüencialmente de centros meristemáticos; o termo "embriogênese," comousado aqui, significa um processo pelo qual os brotos e raízes se desenvolvemjuntos em um modo combinado (não seqüencialmente), seja a partir de célulassomáticas ou gametas. O tecido escolhido particular irá variar dependendodos sistemas de propagação clonal disponíveis, e melhor apropriados parauma espécie em particular sendo transformada. As marcações exemplares detecido incluem discos de folha, pólen, embriões, cotilédones, hipocótilos,megagametófitos, tecido de calos, tecido meristemático existente (porexemplo, eritemas apicais, brotos axilares, e meristemas de raiz), e tecido demeristema induzido, (por exemplo, meristema de cotilédone e meristema deultilano).Plantas da presente invenção podem adquirir um variedade deformas. As plantas pode ser quimeras de células transformadas e células nãotransformadas; as plantas podem ser transformantes clonais (por exemplo,todas as células transformadas para conter o cassete de expressão); as plantaspodem compreender enxertos de tecidos transformados e não transformados(por exemplo, um estoque de raiz transformada enxertado em um rebento nãotransformado em espécies de cítricos). As plantas transformadas podem serpropagadas por uma variedade de meios, como por técnicas de propagaçãoclonal ou cruzamentos clássicos. Por exemplo, a planta de primeira geração(ou TI) transformada pode ser auto-cruzada para dar a segunda geração deplantas transformadas homozigóticas (ou T2), e as plantas T2 aindapropagadas através de técnicas de cruzamento clássicas. Um marcadordominante selecionável (como npt II) pode ser associado com o cassete deexpressão para auxiliar no cruzamento.

Assim, a presente invenção prove uma célula de plantatransformada (transgênica), in planta ou ex planta, incluindo um plastídeotransformado ou outra organela, por exemplo, núcleo, mitocôndria oucloroplasto. A presente invenção pode ser usada para transformação dequalquer uma dentre as espécies de plantas, incluindo, mas não limitadas a,células de uma espécie de planta especificada acima na seção deDEFINIÇÃO. Preferivelmente, as plantas transgênicas da presente invençãosão plantas de cultura e em particular cereais (por exemplo, milho, alfafa,girassol, arroz, Brassica, canola, soja, cevada, soja, beterraba de açúcar,algodão, cártamo, amendoim, sorgo, trigo, painço, tabaco, Linumusitatissimum (linhaça e linho), Camelina sativa, Brassica juncea, etc), emesmo mais preferivelmente milho, arroz e soja. Outras formas de realizaçãoda invenção estão relacionadas com células, culturas de célula, tecidos, partes(como órgãos de plantas, folhas, raízes, etc.) e material de propagação (comosementes) destas plantas.O cassete de expressão transgênica da invenção pode nãosomente estar compreendido em plantas ou células de plantas mas podetambém estar contido com vantagem em outros organismos, como porexemplo bactérias. Assim, outra forma de realização da invenção refere-se acélulas transgênicas ou organismos transgênicos não humanos,compreendendo um cassete de expressão da invenção. Preferidos são osorganismos procarióticos e eucarióticos. Ambos os microorganismos eorganismos superiores estão compreendidos. Os microorganismos preferidossão bactérias, levedura, algas, e fungos. As bactérias preferidas são as dogênero Escherichia, Erwinia, Agrobacterium, Flavobacterium, Alcaligenes,Pseudomonas, Bacillus ou Cyanobacterim como - por exemplo -Synechocystis e outras bactérias descritas em Brock Biology ofMicroorganisms 8a. Edição (páginas A-8, A-9, A10 e Ali). O maispreferivelmente, as células transgênicas ou organismos transgênicos nãohumanos, compreendendo um cassete de expressão da invenção, são umacélula de planta ou planta (como definido acima), mais preferivelmente aplanta usada para a produção de óleo como - por exemplo - Brassica napus,Brassica juncea, Linum usitatissimum, soja, Camelina ou girassol.

São especialmente preferidos os microorganismos capazes deinfectar plantas e transferir o DNA em seu genoma, especialmente bactériasdo gênero Agrobacterium, preferivelmente Agrobacterium tumefaciens erizogenes. Preferidas leveduras são Cândida, Saccharomyces, Hansenula ePichia. Preferidos fungos são Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neurospora,Fusarium, e Beauveria. Os mais preferidos são os organismos de plantas,como definido acima.

A transformação de plantas pode ser empreendida com umaúnica molécula de DNA ou múltiplas moléculas de DNA (isto é, co-transformação), e ambas as técnicas são apropriadas para uso com os cassetesde expressão da presente invenção. Numerosos vetores de transformação sãodisponíveis para a transformação de plantas, e os cassetes de expressão destainvenção podem ser usados em conjunto com qualquer um destes vetores. Aseleção de vetor irá depender das técnicas de transformação preferidas e asespécies de marcação para a transformação.

Várias técnicas se encontram disponível e conhecidas dosversados na arte para a introdução de construções em um hospedeiro de célulade planta. Estas técnicas geralmente incluem transformação com DNAempregando A. tumefaciens ou A. rhizogenes como o agente detransformação, lipossomas, precipitação PEG, eletroporação, injeção de DNA, absorção direta de DNA, bombardeio de microprojéteis, aceleração departículas, e semelhantes (Ver, por exemplo, EP 295959 e EP 138341) (verabaixo). No entanto, células diferentes das células de planta podem sertransformadas com os cassetes de expressão da invenção. As descrições geraisde vetores de expressão de plantas e genes repórter, e a transferência de genes por Agrobacterium e mediada por Agrobacterium, podem ser encontradas emGruber et al. (1993).

Os vetores de expressão contendo fragmentos genômicos ousintéticos podem ser introduzidos em protoplastos ou em tecidos intactos oucélulas isoladas. Preferivelmente, os vetores de expressão são introduzidos em tecido intacto. Os métodos gerais de cultivo de tecidos de plantas sãoprovidos, por exemplo, por Maki et al., (1993); e por Phillips et al. (1988).Preferivelmente, vetores de expressão são introduzidos em milho ou outrostecidos de plantas usando um método de transferência de genes direto,distribuição mediada por microprojéteis, injeção de DNA,, eletroporação esemelhantes. Mais preferivelmente, os vetores de expressão são introduzidosem tecidos de plantas usando a distribuição por meio de microprojéteis, com odispositivo biolístico. Ver, por exemplo, Tomes et al. (1995). Os vetores dainvenção podem não somente ser usados para expressão de genes estruturais,como também podem ser usados em clonagem de exon-trap, ouprocedimentos trap de promotor para detectar a expressão diferencial degenes em vários tecidos (Lindsey 1993; Auch & Reth 1990).

É particularmente preferido usar os vetores de tipo binário deplasmídeos Ti e Ri de Agrobacterium spp. Os vetores derivados de Titransformam uma ampla variedade de plantas superiores, incluindo plantasmonocotiledôneas e dicotiledôneas, como soja, algodão, colza, tabaco, e arroz(Pacciotti 1985: Byrne 1987; Sukhapinda 1987; Lorz 1985; Potrykus, 1985;Park 1985: Hiei 1994). O uso de T-DNA para transformar células de plantatem recebido um estudo extensivo sendo amplamente descrito (EP 120516;Hoekema, 1985; Knauf, 1983; e An 1985). Para a introdução em plantas, osgenes quiméricos da invenção podem ser inseridos em vetores binários, comodescrito nos exemplos.

Outros métodos de transformação são disponíveis dos versadosna arte, como absorção direta de construções de DNA estranhas (ver EP295959), técnicas de eletroporação (Fromm 1986) ou bombardeio balísticoem alta velocidade com partículas de metal revestidas com as construções deácido nucleico (Kline 1987, e US 4.945.050). Uma vez transformadas, ascélulas pode ser regeneradas pelos versados na arte. São de particularrelevância, os métodos recentemente descritos para transformar os genesestranhos em culturas comercialmente importantes, como colza (De Block1989), girassol (Everett 1987), soja (McCabe 1988; Hinchee 1988; Chee1989; Christou 1989; EP 301749), arroz (Hiei 1994), e milho (Gordon-Kamm1990; Fromm 1990).

Os versados na arte irão notar que a escolha do método podedepender do tipo de planta, isto é, monocotiledônea ou dicotiledônea,marcada para transformação. Os métodos apropriados de transformação decélulas de planta incluem, mas não são limitados a, microinjeção (Crossway1986), eletroporação (Riggs 1986), transformação mediada porAgrobacterium (Hinchee 1988), transferência direta de genes (Paszkowski1984), e aceleração balística de partículas usando dispositivos disponíveis deAgracetus, Inc., Madison, Wis. e BioRad, Hercules, Calif. (ver, por exemplo,US 4,945,050; e McCabe 1988). Ver, também, Weissinger 1988; Sanford1987 (cebola); Christou 1988 (soja); McCabe 1988 (soja); Datta 1990 (arroz); Klein 1988 (milho); Klein 1988 (milho); Klein 1988 (milho); Fromm 1990(milho); e Gordon-Kamm 1990 (milho); Svab 1990 (cloroplasto de tabaco);Koziel 1993 (milho); Shimamoto 1989 (arroz); Christou 1991 (arroz); Pedidode patente européia EP 0 332 581 (gramas de pomares e outros Pooideae);Vasil 1993 (trigo); Weeks 1993 (trigo).

Em outra forma de realização, uma seqüência nucleotídica dapresente invenção é diretamente transformada no genoma do plastídeo. Atecnologia de transformação do plastídeo é extensivamente descrita em US5.451.513, 5.545.817, e 5.545.818, em pedido PCT no. WO 95/16783, e emMcBride et al., 1994. A técnica básica para transformação de cloroplastosenvolve a introdução de regiões de DNA de plastídeo clonado flanqueandoum marcador selecionável junto com o gene de interesse em um tecido demarcação apropriado, por exemplo, usando biolística ou transformação deprotoplastos (por exemplo, transformação mediada por PEG ou cloreto decálcio). As regiões de flanco 1 a 1,5 kb, chamadas seqüências de marcação,facilitam a recombinação ortóloga com o genoma do plastídeo e assimpermitem a substituição ou modificação de regiões específicas do plastoma.Inicialmente, mutações por pontos nos genes 16S rRNA e rpsl2 docloroplasto conferindo resistência a espectinomicina e/ou estreptomicina sãoutilizados como marcadores selecionáveis para transformação (Svab 1990;Staub 1992). Isto resultou em transformantes homoplásmicos estáveis a umafreqüência de aproximadamente um por 100 bombardeios de folhas alvo. Apresença de sítios de clonagem entre estes marcadores permitiu a criação deum vetor de marcação de plastídeo para introdução de genes estranhos (Staub1993). Aumentos substanciais em freqüência de transformação são obtidospor substituição dos genes de resistência a antibióticos de proteína-r ou rRNArecessivos com um marcador selecionável dominante, o gene aadA bacterianocodificando a enzima destoxificando espectinomicina aminoglicosídeo-3N-adeniltransferase (Svab 1993). Outros marcadores selecionáveis úteis para atransformação de plastídeos são conhecidos na arte e englobados dentro doescopo da invenção. Tipicamente, aproximadamente 15-20 ciclos de divisãode células seguindo a transformação são requeridos para alcançar um estadohomoplastídico. A expressão de plastídeos, em que genes são inseridos porrecombinação ortóloga em todas dos vários milhares de cópias do genoma deplastídeo circular presentes em cada célula de planta, obtém vantagem donúmero de cópias enorme com relação aos genes expressados nucleares demodo a permitir níveis de expressão que podem prontamente exceder 10% daproteína de planta solúvel total. Em uma forma de realização preferida, umaseqüência nucleotídica da presente invenção é inserida em um vetor demarcação de plastídeo e transformada no genoma de plastídeo de umhospedeiro de planta desejado. As plantas homoplásticas para genomas deplastídeos contendo uma seqüência nucleotídica da presente invenção sãoobtidas, e são b preferivelmente capazes de uma expressão elevada daseqüência nucleotídica.

As células de Agrobacterium tumefaciens contendo um vetorcompreendendo um cassete de expressão da presente invenção, em que ovetor compreende um plasmídeo Ti, são úteis em métodos de fabricação deplantas transformadas. Células de planta são infectadas com umAgrobacterium tumefaciens, como descrito acima, de modo a produzir umacélula de planta transformada, e então a planta é regenerado a partir da célulade planta transformada. Numerosos sistemas de vetor de Agrobacteriumutilizáveis para realizar a presente invenção são conhecidos.

Várias cepas de Agrobacterium podem ser empregadas,preferivelmente cepas de Agrobacterium tumefaciens desarmado ourhizogenes. Em uma forma de realização preferida, cepas de Agrobacteriumpara uso na prática da invenção incluem cepas de octopina, por exemplo,LBA4404 ou cepas de agropina, por exemplo, EHA101 ou EHA105. As cepasapropriadas de A. tumefaciens para transferência de DNA são por exemploEHA101[pEHA101] (Hood 1986), EHA105[pEHA105] (Li 1992),LBA4404[pAL4404] (Hoekema 1983), C58Cl[pMP90] (Koncz & Schell1986), e C58Cl[pGV2260] (Deblaere 1985). Outras cepas apropriadas sãoAgrobacterium tumefaciens C58, uma cepa de nopalina. Outras cepasapropriadas são A. tumefaciens C58C1 (Van Larebeke 1974), A136 (Watson1975) ou LBA4011 (Klapwijk 1980). Em outra forma de realização preferida,a bactéria de origem no solo é uma variante desarmada de Agrobacteriumrhizogenes cepa K599 (NCPPB 2659). Preferivelmente, estas cepas estãocompreendendo uma variante de plasmídeo desarmada em um plasmídeo Ti-ou Ri- provendo as funções requeridas para a transferência de T-DNA emcélulas de planta (por exemplo, os genes vir). Em uma forma de realizaçãopreferida, a cepa de Agrobacterium usada para transformar o tecido de plantapre-cultivado com composto fenólico de planta contém um plasmídeo Ti detipo L,L-succinamopina, preferivelmente desarmado, como pEHAlOl. Emoutra forma de realização preferida, a cepa de Agrobacterium usada paratransformar o tecido de planta pre-cultivado com um composto fenólico deplanta contém um plasmídeo Ti de tipo octopina, preferivelmente desarmado,como pAL4404. Geralmente, quando usando plasmídeos Ti tipo octopina ouplasmídeos auxiliares, é preferido que o gene virF seja deletado ou inativado(Jarschow 1991).

O método da invenção também pode ser usado em combinaçãocom cepas de Agrobacterium particulares, para ainda aumentar a eficácia detransformação, como as cepas de Agrobacterium em que a expressão de genevir e/ou sua indução é alterada devido à presença de genes virA ou virGmutantes ou quiméricos (por exemplo, Hansen 1994; Chen e Winans 1991;Scheeren-Graiz, 1994). Preferidas são ainda combinações de Agrobacteriumtumefaciens cepa LBA4404 (Hiei 1994) com plasmídeos super-virulentos.Estes são preferivelmente vetores com base em pTOK246 (Ishida 1996).

Um vetor binário ou qualquer outro vetor pode ser modificadopor técnicas de recombinação de DNA comuns, multiplicado em E. coli, eintroduzido em Agrobacterium por, por exemplo, eletroporação ou outrastécnicas de transformação (Mozo & Hooykaas 1991).

Agrobacterium é cultivado e usado em um modo similar aodescrito em Ishida (1996). O vetor compreendendo cepa de Agrobacteriumpode, por exemplo, ser cultivado durante 3 dias em meio YP (5 g/l extrato delevedura, 10 g/l peptona, 5 g/l NaCl, 15 g/l agar, pH 6.8) suplementado com oantibiótico apropriado (por exemplo, 50 mg/l espectinomicina). Bactérias sãocoletadas com um laço do meio sólido e recolocadas em suspensão. Em umaforma de realização preferida da invenção, culturas de Agrobacterium sãoiniciadas por uso de alíquotas congeladas a -80°C.

A transformação do tecido de marcação (por exemplo, umembrião imaturo) por Agrobacterium pode ser realizada por apenas contato dotecido de marcação com o Agrobacterium. A concentração de Agrobacteriumusada para infecção e co-cultivo pode precisar ser variada. Por exemplo, umasuspensão de células de Agrobacterium tendo uma densidade de população deaproximadamente 105 - 1011, preferivelmente IO6 a 1010, mais preferivelmentecerca de IO8 células ou cfu / ml é preparada e o tecido de marcação é imersonesta suspensão durante cerca de 3 a 10 minutos. O tecido de marcaçãoresultante é então cultivado em um meio sólido durante vários dias junto comAgrobacterium.

Preferivelmente, a bactéria é empregada em concentração deIO6 a 1010 cfu/ml. Em uma forma de realização preferida para a etapa de co-cultivo, cerca de 1 a 10 ul de uma suspensão de bactérias de origem no solo(por exemplo, Agrobactérias) no meio de co-cultivo são diretamenteaplicados a cada explante de tecido de marcação e secados ao ar. Istoeconomiza mão de obra e tempo e está reduzindo o dano mediado porAgrobacterium por pretendido pelo uso em excesso de Agrobacterium.

Para o tratamento por Agrobacterium, as bactérias sãorecolocadas em suspensão em um meio de co-cultivo compatível com aplanta. A. Suplementação do meio de co-cultivo com antioxidantes (porexemplo, nitrato de prata), composto absorvendo fenol (comopolivinilpirrolidona, Perl 1996) ou compostos tiol (por exemplo, ditiotreitol,L-cisteína, Olhoft 2001) que podem diminuir a necrose de tecido devido àsrespostas de defesa da planta (como a oxidação fenólica) pode ainda melhorara eficiência da transformação mediada por Agrobacterium. Em outra forma derealização preferida, o meio de co-cultivo compreende pelo menos umcomposto tiol, preferivelmente selecionado dentre o grupo consistindo detiolsulfato de sódio, ditiotrietol (DTT) e cisteína. Preferivelmente aconcentração está entre cerca de 1 mM e lOmM de L-Cisteína, 0,1 mM a 5mM DTT, e/ou 0,1 mM a 5 mM tiolsulfato de sódio. Preferivelmente, o meioempregado durante o co-cultivo compreende de cerca de 1 uM a cerca de 10uM de nitrato de prata e de cerca de 50 mg/L a cerca de 1.000 mg/L de L-Cisteína. Isto resulta em uma vulnerabilidade altamente reduzida do tecido de marcação contra o dano mediado por Agrobacterium (como necrose induzida)e melhora altamente a eficiência de transformação global.

Vários sistemas de vetor podem ser usados em combinaçãocom Agrobacteria. Preferidos são sistemas de vetor binário. Os vetoresbinários comuns são baseados em plasmídeos com "uma faixa de hospedeiroampla" como pRK252 (Bevan 1984) ou pTJS75 (Watson 1985) derivados doplasmídeo RK2 tipo P. A maior parte deste vetores são derivados de pBIN19(Bevan 1984). Vários vetores binários são conhecidos, alguns sendocomercialmente disponíveis como, por exemplo, pBI101.2 ou pBIN19(Clontech Laboratories, Inc. USA). Vetores adicionais foram melhorados comrelação ao tamanho e manipulação (por exemplo, pPZP; Hajdukiewicz 1994).Sistemas de vetor melhorados são descrito também em WO 02/00900.

Métodos usando ou uma forma de transferência de genes diretaou transferência mediada por Agrobacterium, geralmente, mas nãonecessariamente, são empreendidos com um marcador selecionável, que podeprover resistência a um antibiótico (por exemplo, canamicina, higromicina oumetotrexato) ou um herbicida (por exemplo, fosfinotricina). A escolha de ummarcador selecionável para transformação de plantas não é, no entanto, críticapara a invenção.

Para algumas espécies de plantas, diferentes marcadores deseleção de antibióticos ou herbicidas podem ser preferidos. Os marcadores deseleção usados como rotina em transformação incluem o gene nptll queconfere resistência a canamicina e antibióticos relacionados (Messing &Vierra, 1982; Bevan 1983), o gene bar que confere resistência ao herbicidafosfinotricina (White 1990, Spencer 1990), o gene hph que confere resistênciaao antibiótico higromicina (Blochlinger & Diggelmann), e o gene dhfr, queconfere resistência a metotrexato (Bourouis 1983).

5. Produção e Caracterização de plantas estavelmentetransformadas

As células de plantas transgênicas são então colocadas em ummeio seletivo apropriado para a seleção de células transgênicas, que são entãocultivadas até a formação do calo. Brotos são cultivados a partir dos calos. Asplântulas são geradas do broto por cultivo em meio de formação de raiz. Asvárias construções normalmente serão unidas a um marcador para seleção emcélulas de planta. Convenientemente, o marcador pode ser resistência a umbiocida (particularmente um antibiótico, como canamicina, G418, bleomicina,higromicina, cloranfenicol, herbicida, ou semelhantes). O marcador particularusado irá permitir a seleção de células transformadas, como comparado acélulas faltando o DNA, que foi introduzido. Componentes de construções deDNA incluindo cassetes de transcrição desta invenção podem ser preparados apartir de seqüências, que são nativas (endógenas) ou estranhas (exógenas) aohospedeiro. Por "estranho" significa-se que a seqüência não é encontrada nohospedeiro de tipo selvagem em que a construção é introduzida. Asconstruções heterologas irão conter pelo menos uma região, que não é nativapara o gene do qual a região de transcrição-iniciação-região é derivada.

Para confirmar a presença dos transgenes em células e plantastransgênicas, uma variedade de testes pode ser realizada. Estes testes incluem,por exemplo, testes de "biologia molecular "bem conhecidos dos versados naarte, como Southern e Northern blotting, hibridização in situ e métodos deamplificação com base em ácido nucleico, como PCR ou RT-PCR ouTaqMan; testes "bioquímicos", como detectando a presença de um produto deproteína, por exemplo, por meios imunológicos (ELISAs e Western blots) oupor função enzimática, testes de partes das plantas, como testes de sementes; etambém, por análise do fenótipo da planta regenerada completa, por exemplo,para resistência a doenças ou pragas.

DNA pode ser isolado das linhagens de células ou qualqueruma das partes da planta para determinar a presença do segmento de ácidonucleico pré-selecionado através do uso de técnicas bem conhecidas dosversados na arte. Nota-se que as seqüências intactas nem sempre estarãopresentes, provavelmente devido ao rearranjo ou deleção de seqüências nacélula.

A presença de elementos de ácido nucleico introduzidosatravés de métodos desta invenção pode ser determinada por reação em cadeiada polimerase (PCR). Usando esta técnica, fragmentos discretos de ácidonucleico são amplificados e detectados por gel eletroforese. Este tipo de aanálise permite determinar se um segmento de ácido nucleico pré-selecionadoestá presente em um transformante estável, mas não fornece a integração dosegmento de ácido nucleico pré-selecionado introduzido no genoma da célulahospedeira. Além disso, não é possível usando técnicas de PCR determinar seos transformantes tem genes exógenos introduzidos em diferentes sítios nogenoma, isto é, se os transformantes são de origem independente. Écontemplado que usando as técnicas PCR, seria possível clonar os fragmentosdo DNA genômico hospedeiro adjacente a um segmento de DNA pré-selecionado introduzido.

A prova positiva de integração do DNA no genoma hospedeiroe as identidades independentes de transformantes podem ser determinadasusando a técnica de hibridização Southern. Usando esta técnica, seqüências deDNA específicas, que foram introduzidas no genoma hospedeiro e estãoflanqueando as seqüências de DNA hospedeiro podem ser identificadas.Assim, o padrão de hibridização Southern de um dado transformante servecomo uma característica de identificação deste transformante. Além disso, épossível através de hibridização Southern, demonstrar a presença desegmentos de DNA pré-selecionados introduzidos em DNA de pesomolecular elevado, isto é, confirmar que o segmento de DNA introduzido pré-selecionado foi integrado no genoma da célula hospedeira. A técnica dehibridização Southern prove informação que é obtida usando PCR, porexemplo, a presença de um segmento de DNA pré-selecionado, mas tambémdemonstra a integração no genoma e caracteriza cada transformanteindividual.

É contemplado que usando as técnicas de hibridização "dot"ou "slot blot" que são modificações de técnicas de hibridização Southern,pode-se obter a mesma informação que é derivada de PCR, por exemplo, apresença de um segmento de DNA pré-selecionado.

Ambas as técnicas de hibridização PCR e Southern podem serusadas para demonstrar a transmissão de um segmento de DNA pré-selecionado para a progênie. Na maior parte dos casos, o padrão dehibridização Southern característico para um dado transformante irá segregarem progênie, como um ou mais genes mendelianos (Spencer 1992); Laursen1994) indicando uma herança estável do gene. A natureza não quimérica docalo e dos transformantes parentais (Ro) foi sugerida por transmissão dalinhagem germinal e os padrões idênticos de hibridização Southern blot e aintensidades do DNA transformante em calos, plantas Ro plantas e progênieRi que segregaram para o gene transformado.

Apesar das técnicas de análise de DNA poderem serconduzidas usando DNA isolado de qualquer parte de uma planta, RNA podesomente ser expressado em tipos particulares de células ou tecido e assim seránecessário preparar o RNA para análise a partir destes tecidos. As técnicasPCR também podem ser usadas para detecção e quantificação de RNAproduzido a partir dos segmentos de DNA pré-selecionados introduzidos.Nesta aplicação de PCR, é primeiro necessário reverter o RNA transcrito emDNA, usando enzimas como transcriptase reversa, e então, através de uso detécnicas PCR convencionais, amplificar o DNA. Na maior parte dos casos, astécnicas de PCR, apesar de utilizáveis, não irão demonstrar a integridade doproduto RNA. Outra informação sobre a natureza do produto RNA pode serobtida por Northern blotting. Esta técnica irá demonstrar a presença de umaespécie de RNA e dar informação sobre a integridade do RNA. A presença ou ausência de uma espécie de RNA pode também ser determinada usandohibridizações Northern "dot" ou "slot blot". Estas técnicas são modificaçõesde Northern blotting e somente irão demonstrar a presença ou ausência deuma espécie de RNA.

Apesar de Southern blotting e PCR poderem ser usados paradetectar o segmento de DNA pré-selecionado em questão, eles não forneceminformação como com relação ao segmento de DNA pré-selecionado sendoexpressado. Expressão pode ser avaliada por especificamente identificando osprodutos de proteína dos segmentos de DNA pré-selecionados introduzidosou avaliação das mudanças fenotípicas ocasionadas por sua expressão.Testes para a produção e identificação de proteínas específicaspodem fazer usas propriedades físico químicas, estruturais, funcionais, ououtras das proteínas. As propriedades físico químicas ou estruturais singularespermitem que as proteínas sejam separadas e identificadas por procedimentoseletroforéticos, como eletroforese de gel nativo ou desnaturante oufocalização isoelétrica, ou por técnicas de cromatografia como cromatografiade troca iônica ou exclusão de gel. As estruturas singulares de proteínasindividuais oferecem oportunidades para uso de anticorpos específicos paradetectar sua presença em formatos como testes ELISA. As combinações deabordagens podem ser empregadas com uma especificidade ainda maior,como Western blotting em que os anticorpos são usados para localizarprodutos de genes individuais que foram separados por técnicaseletroforéticas. As técnicas adicionais podem ser empregadas para confirmarabsolutamente a identidade do produto de interesse como avaliação porseqüenciamento de aminoácidos após purificação. Apesar destes estaremdentre os mais comumente empregados, outros procedimentos também podemser usados.

Os procedimentos de teste também podem ser usados paraidentificar a expressão de proteínas por sua funcionalidade, especialmente acapacidade de enzimas de catalisar reações químicas específicas envolvendosubstratos e produtos específicos. Estas reações podem ser seguidas ao provere quantificar a perda de substratos ou a geração de produtos das reações porprocedimentos físicos ou químicos. Os exemplos são tão variados como asenzimas a serem analisadas.

Com muita freqüência, a expressão de um produto de gene édeterminada por avaliação dos resultados fenotípicos de sua expressão. Estestestes podem tomar muitas formas, incluindo, mas não limitadas a análise demudanças em composição química, morfologia, ou propriedades fisiológicasda planta. As mudanças morfológicas podem incluir uma estatura maior outalos mais espessos. Com muita freqüência, mudanças em resposta de plantasou partes de plantas a serem impostas, os tratamentos são avaliados sobcondições cuidadosamente controladas, chamadas biotestes.

6. Uso de plantas transgênicas

Uma vez que o cassete de expressão da invenção foitransformado em uma espécie de planta particular, ele pode ser propagado nasespécies ou movimentado para outras variedades das mesmas espécies,particularmente incluindo variedades comerciais, usando técnicas de criaçãotradicionais. As plantas particularmente preferidas da invenção incluem asculturas agronomicamente importantes listadas acima. As propriedadesgenéticas engenheiradas nas sementes e plantas transgênicas descritas acimasão passadas adiante por reprodução sexual e podem, assim, ser mantidas epropagadas nas plantas da progênie. A presente invenção também refere-se auma célula, tecido, órgão, semente ou parte de planta de uma plantatransgênica, obtidos da planta transgênica. Também estão incluídos nainvenção os descendentes transgênicos da planta, assim como células, tecidos,órgãos, sementes e partes das plantas de plantas transgênicas obtidos partirdos descendentes.

Preferivelmente, o cassete de expressão na planta transgênica ésexualmente transmitido. Em uma forma de realização preferida, a seqüênciade codificação é sexualmente transmitida através de um ciclo sexual normalcompleto da planta RO para a geração RI. Adicionalmente preferido, o cassetede expressão é expressado nas células, tecidos, sementes ou planta de umaplanta transgênica em uma quantidade que é diferente da quantidade nascélulas, tecidos, sementes ou planta de uma planta, que somente difere em queo cassete de expressão está ausente. As plantas transgênicas produzidas aquisão assim esperadas como sendo úteis para uma variedade de fins comerciaise de pesquisa. Plantas transgênicas podem ser criadas para uso em agriculturatradicional de modo a possuir traços benéficos para o agricultor (por exemplo,traços agronômicos como resistência a falta cTágua, resistência a pragas,resistência a herbicidas ou produção aumentada), benéficos para oconsumidor do grão coletado de um planta (por exemplo, teor nutritivomelhorado em ração animal ou alimentação humana; teor de vitamina,aminoácidos e antioxidantes aumentado; a produção de anticorpos(imunização passiva) e nutracêuticos), ou benéficos para os processadores deração (por exemplo, traços de processamento aumentados). Em tais usos, asplantas são geralmente cultivadas para o uso de seu grão em rações animaisou alimentos para humanos. Adicionalmente, o uso de promotores específicosde raiz em plantas transgênicas pode proporcionar traços benéficos que estãolocalizados nas raízes consumíveis (por animais e humanos) de plantas comocenouras, pastinacas, e beterrabas. No entanto, outras partes das plantas,incluindo talos, cascas, partes vegetativas, e semelhantes, também podem terutilidade, incluindo uso como parte de silagem para animais ou finsornamentais. Com freqüência, constituintes químicos (por exemplo, óleos ouamidos) de milho e outras culturas são extraídos para rações ou uso industriale plantas transgênicas podem ser criadas tendo níveis melhorados oumodificados de tais componentes.

Plantas transgênicas também podem encontrar uso nafabricação comercial de proteínas ou outras moléculas, onde a molécula deinteresse é extraída ou purificada de partes de plantas, sementes, esemelhantes. Células ou tecidos de um planta também podem ser cultivados,levados a crescer in vitro, ou fermentados para fabricar tais moléculas. Asplantas transgênicas também podem ser usadas em programas de cruzamentocomercias, ou podem ser cruzadas ou criadas em plantas de espécie de culturarelacionada. As melhoras codificadas pelo cassete de expressão podem sertransferidas, por exemplo, de células de milho para células de outras espécies,por exemplo, por fusão de protoplastos.

As plantas transgênicas podem ter muitos usos em pesquisa oucruzamentos, incluindo a criação de novas plantas mutantes através demutagênese insercional, a fim de identificar os mutantes benéficos que podemser depois criados por mutação e seleção tradicional. Um exemplo deve ser aintrodução de uma seqüência de DNA recombinante codificando um elementotransposável que pode ser usado para gerar variação genética. Os métodos dainvenção também podem ser usados para criar plantas tendo "seqüências deassinatura" singulares, ou outras seqüências de marcador que podem serusadas para identificar variedades e linhagens de propriedade de umaempresa.

Assim, as plantas e sementes transgênicas de acordo com ainvenção podem ser usadas no cruzamento de plantas, que visa odesenvolvimento de plantas com melhoradas propriedades conferidas pelocassete de expressão, como tolerância de seca, doença, ou outros estresses. As'varias etapas de cruzamento são caracterizadas por intervenção humana bemdefinida, como seleção das linhagens a serem cruzadas, dirigindo apolinização das linhagens parentais, ou selecionando as plantas descendentesapropriadas. Dependendo das propriedades desejadas, diferentes medidas decruzamento são tomadas. As técnicas relevantes são bem conhecidas na arte eincluem, mas não são limitadas a hibridização, cruzamento endogâmico,cruzamento retro-cruzado, cruzamento de múltiplas trilhas, mistura devariedades, hibridização interespecífica, técnicas aneuplóides, etc. As técnicasde hibridização também incluem a esterilização de plantas para dar plantasestéreis masculinas ou femininas por meios mecânicos, químicos oubioquímicos. A polinização cruzada de uma planta estéril masculina compólen de uma linhagem diferente assegura que o genoma da planta estérilmasculina diferente da planta fértil feminina irá alcançar uniformementepropriedades de ambas as linhagens parentais. Assim, as sementes e plantastransgênicas de acordo com a invenção podem ser usadas para o cruzamentode linhagens de plantas melhoradas, que, por exemplo, aumentam a eficáciade métodos convencionais como tratamento de pesticida ou herbicida oupermitem prescindir destes referidos métodos devido às suas propriedadesgenéticas modificadas. Alternativamente, novas culturas com melhoradatolerância ao estresse podem ser obtidas que, devido a seu "equipamento"genético otimizado fornecem um produto coletado de maior qualidade do queos produtos que não foram capazes de tolerar condições de desenvolvimentoadversas comparáveis.

EXEMPLOS

Materiais e métodos gerais

Salvo indicado em contrário, produtos químicos e reagentesnos Exemplos foram obtidos de Sigma Chemical Company (St. Louis, MO),endonucleases de restrição foram obtidos de New England Biolabs (Beverly,MA) ou Roche (Indianapolis, IN), oligonucleotídeos foram sintetizados porMWG Biotech Inc. (High Point, NC), e outras enzimas de modificação ou kitscom relação a produtos bioquímicos e testes biológicos moleculares foram deClontech (Paio Alto, CA), Farmácia Biotech (Piscataway, NJ), PromegaCorporation (Madison, WI), ou Stratagene (La Jolla, CA). Materiais parameios de cultura de células foram obtidos de Gibco/BRL (Gaithersburg, MD)ou DIFCO (Detroit, MI). As etapas de clonagem realizadas para os fins dapresente invenção, como, por exemplo, clivagens de restrição, eletroforese degel agarose, purificação de fragmentos de DNA, transferência de ácidosnucleicos em membranas de nitrocelulose e náilon, ligação de fragmentos deDNA, transformação de células de E. coli, cultivo de bactérias, multiplicaçãode fagos e análises de seqüência de DNA recombinante são realizados comodescrito por Sambrook (1989). O seqüenciamento de moléculasrecombinantes de DNA é realizado usando sequenciador de DNAfluorescência a laser de ABI seguindo o método de Sanger (Sanger 1977).

Exemplo 1: Geração de plantas transgênicas

1.1 Geração de plantas transgênicas de Arabidopsisth ali a na

Para gerar plantas transgênicas de Arabidopsis, Agrobacteriumtumefaciens (cepa C58Cl[pMP90]) é transformado com as várias construçõesde promotor: :GUS vetor (ver abaixo). As cepas resultantes de Agrobacteriumsão subseqüentemente empregadas para obter plantas transgênicas. Para estefim, uma colônia de Agrobacterium isolada transformada é incubada em 4 mlde cultura (meio: meio YEB com 50 ug/ml canamicina e 25 ug/mlRifampicina) durante a noite a 28°C. Com esta cultura, uma cultura de 400 mldo mesmo meio é inoculada e incubada durante a noite (28 °C, 220 rpm). Asbactérias precipitaram por centrifugação (Rotor GSA, 8.000 U/min, 20 min) ea pelota é recolocada em suspensão em meio de infiltração (1/2 MS-Meio; 0,5g/l MES, pH 5,8; 50 g/l sacarose). A suspensão é colocada em uma caixa deplanta (Duchefa) e 100 ml SILVET L-77 (Osi Special-ties Inc., Cat. P030196)são adicionados a uma concentração final de 0,02%. Uma caixa de planta com8 a 12 plantas é colocada em um exsicador durante 10 a 15 min, sob vácuo,com ventilação espontânea subseqüente, (expansão). Este processo é repetido2-3 vezes. A seguir, todas as plantas são transferidas em sacos com soloúmido e cultivadas sob condições tempo diurno longo (16 h luz; temperaturado dia 22-24°C, temperatura da noite 19 °C; 65% umidade relativa). Assementes são coletadas após 6 semanas.

1.2 Geração de linhaça transgênica

As plantas de linhaça transgênica podem ser geradas porexemplo pelo método de Bell et al., 1999, In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant.35(6): 456-465 por meio de bombardeio de partículas. As transformações mediadas por Agrobacteria podem ser geradas por exemplo pelo método deMlynarova et al. (1994), Célula de planta Report 13: 282-285.

1.3 Transformação mediada por Agrobacterium de Brassica napus

Colza de semente oleígena pode ser transformada por pecíolocotiledonário ou transformação de hipocótilos (Moloney 1989; De Block1989). O uso de antibióticos para a seleção de Agrobacteria e plantas dependedo vetor binário e da cepa de Agrobacterium usada para a transformação. Aseleção de colza de semente oleígena é geralmente realizada usandocanamicina como marcador de planta selecionável.

Mais especificamente, colza de semente oleígena pode sertransformada como a seguir: cepas de Agrobacterium transformadas com oplasmídeo de interesse cultivadas em 50 mL meio YEB a 28°C durante anoite. A solução de Agrobacterium é misturada com meio líquido de co-cultivo (sais MSB5 concentrados duplos (Duchefa), 30 g/L sacarose(Duchefa), 3.75 mg/Ll BAP (6-benzilamino purina, Duchefa), 0,5 g/L MES(Duchefa), 0,5 mg/L GA3 (ácido giberélico, Duchefa); pH5.2) até OD650 de0,5 é alcançado. Pecíolos de mudinhas de 4 dias de Brassica napus cv. Westarcultivadas em meio de crescimento B (sais MSB5 (Duchefa), 3% sacarose(Duchefa), 0.8% oxoidagar (Oxoid GmbH); pH 5,8) são cortados. Os pecíolossão imersos durante 2-3 segundos na solução de Agrobacterium e depoiscolocados em meio sólido para co-cultivo (meio de co-cultivo suplementadocom 1.6% Oxoidagar). O co-cultivo dura 3 dias (a 24°C e cerca de 50uMol/m2s intensidade de luz). Depois, os pecíolos são transferidos para omeio de co-cultivo suplementado com o agente de seleção apropriado (18mg/L canamicina (Duchefa) para plantas compreendendo o marcador nptll decanamicina para plantas transportando o marcador de resistência nptll, ou 0.3a 30 mM D-aminoácidos; como descrito abaixo) para plantas compreendendoum cassete de expressão para o gene daol de Rhodotorula gracilis) e300 mg/L Timentina (Duchefa)

Os pecíolos transformados são incubados no meio de seleçãodurante quatro semanas a 24°C. Esta etapa é repetida até os brotosaparecerem. Os brotos são transferidos para meio A6 (sais MS (SigmaAldrich), 20 g/L sacarose, 100 mg/L mio-inositol (Duchefa), 40 mg/L adeninasulfato (Sigma Aldrich), 500 mg/L MES, 0,0025 mg/L BAP (Sigma), 5 g/Loxoidagar (Oxoid GmbH), 150 mg/L timetina (Duchefa), 0,1 mg/L IBA(ácido indol butírico, Duchefa); pH 5,8) suplementado com o agente deseleção apropriado (18 mg/L canamicina (Duchefa) para plantascompreendendo o marcador nptll de canamicina para plantas transportando omarcador de resistência nptll, ou 0.3 a 30 mM D-aminoácidos; como descritoabaixo) até eles serem alongados. Os brotos alongados são cultivados emmeio A7 (meio A6 sem BAP) para a formação de raiz. As plantas com raizsão transferidas para solo e cultivadas na estufa.

EXEMPLO 2: Condições de crescimento para plantas paraa análise de expressão específica de tecido

Para obter mudinhas de 4 e 7 dias de idade, cerca de 400sementes (Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia) são esterilizadas com a80% (v/v) solução etanol:água durante 2 minutos, tratadas com solução dehipoclorito de sódio (0,5% v/v) durante 5 minutos, lavadas três vezes comágua destilada e incubadas a 4°C durante 4 dias para assegurar umagerminação padronizada. Subseqüentemente, as sementes são incubadas emdiscos de Petri com meio MS (Sigma M5519) suplementado com 1%sacarose, 0,5 g/l MES (Sigma M8652), 0.8% Difco-BactoAgar (Difco 0140-01), ajustado a pH 5.7. As mudinhas são cultivadas sob um ciclo de 16 h luz /8 h escuro (luz branca Philips 58W/33) a 22°C e coletadas após 4 ou 7 dias,respectivamente.

Para obter o tecido de raiz, 100 sementes são esterilizadascomo descrito acima, incubadas a 4°C durante 4 dias, e transferidas parafrascos de 250ml com meio MS (Sigma M5519) suplementado com 3%sacarose e 0,5 g/l MES (Sigma M8652) adicionais, ajustado a pH 5.7 duranteo posterior crescimento. As mudinhas são cultivadas a um ciclo de 16 h luz / 8h escuro (luz branca Philips 58W/33) a 22°C e 120 rpm e coletadas após 3semanas. Para todos os outros órgãos de plantas empregados, sementes sãosemeadas em solo padrão (Tipo VM, Manna-Italia, Via S. Giacomo 42, 39050San Giacomo/ Laives, Bolzano, Itália), incubadas durante 4 dias a 4°C paraassegurar uma germinação uniforme, e subseqüentemente cultivadas sob umregime de 16 h luz / 8 escuro (OSRAM Lumi-lux Dayluz 36W/12) a 22°C. Asfolhas de roseta jovem são coletadas no estágio de 8 folhas (após cerca de 3semanas), folhas de roseta madura são coletadas após 8 semanas brevementeantes da formação do caule. Os ápices dos caules saindo dos brotos sãocoletados brevemente após a brotação. Caule, folhas do caule, e botões de florsão coletados em estágio de desenvolvimento 12 (Bowmann J (ed.),Arabidopsis, Atlas of Morphology, Springer New York, 1995) antes dodesenvolvimento do estame. As flores abertas são coletadas em estágio dedesenvolvimento 14 imediatamente após o desenvolvimento do estame. Asflores murchando são coletadas em estágio 15 a 16. Os brotos verdes eamarelos usados para a análise têm um comprimento de 10 a 13 mm.

As plantas transgênicas de colza e linhaça regeneradas sãotestadas em cultura de tecidos para funcionalidade parcial prematura. Para asanálises detalhadas, 3 plantas individuais por linhagem de inserção única oumúltipla (5-15 linhagens em total por construção) são analisadas na geraçãoTI a T3 com relação à expressão em potencial dos candidatos de promotor emtodos os tecidos não semente, assim como em diferentes fases dedesenvolvimento da semente:

- sementes maduras

- mudinhas de 3 dias de idade: base da raiz, ponta da raiz, raizprincipal, raiz lateral, outras áreas da raiz, cotilédone, hipocótilo

- mudinhas de 10 dias de idade: base da raiz, ponta da raiz, raizprincipal, raiz lateral, outras áreas da raiz, cotilédone, hipocótilo, folhasprimárias, seguintes folhas

- mudinhas de 17 dias de idade: base da raiz, ponta da raiz, raizprincipal, raiz lateral, outros áreas da raiz, cotilédone, hipocótilo, folhasprimárias, seguintes folhas

- Planta adulta: raiz, folhas jovens, folhas maduras, caule

- Flor 0, cápsula /síliquas/fruta 1 daf, 3 daf, semente/embrião 3daf, cápsula/síliquas/fruta 6 daf, semente/embriãoó daf, cápsula/síliquas/fruta9 daf, semente/embrião 9 daf, cápsula/síliquas/fruta 12 daf, semente/embrião12 daf, cápsula/síliquas/fruta 15 daf, semente/embrião 15 daf,cápsula/síliquas/fruta 18 daf, semente/embrião 18 daf, cápsula/síliquas/fruta21 daf, semente/embrião 21 daf, cápsula/síliquas/fruta 24 daf, semente/embrião 24 daf (dias após fertilização)

- alternativamente, embriões de, por exemplo, cápsula delinhaça e síliquas de semente de colza são isolados de diferentes estágios dedesenvolvimento de fruta com base em parâmetros visuais e classificados nosseguintes estágios de desenvolvimento do embrião: prematuro, jovem, médio,tardio e maduro.

Os promotores são também verificados por sua indutibilidadepor estresse biótico e abiótico via pulverização de ABA sobre as folhas.

EXEMPLO 3:

Demonstração de perfil de expressãoPara demonstrar e analisar as propriedades reguladoras detranscrição de um promotor da ligação útil a operativamente, o promotor ou seus fragmentos para um gene repórter, que pode ser empregado paramonitorar sua expressão tanto qualitativamente como quantitativamente.Preferivelmente B-glucuronidase bacteriano é usado (Jefferson 1987). Aatividade B-glucuronidase pode ser monitorada in planta com substratoscromogênicos como ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-B-D-glucurônicodurante testes de atividade correspondentes (Jefferson 1987). Paradeterminação de atividade de promotor e especificidade de tecido, tecido deplanta é dissecado, incrustado, colorido e analisado como descrito (porexemplo, Báumlein 1991).

Para atividade quantitativa de B-glucuronidase, análise MUG(metilumbeliferil glucuronídeo) é usado como um substrato, que é convertidoem MU (metilumbeliferone) e ácido glucurônico. Sob condições alcalinas,esta conversão pode ser quantitativamente monitorada fluorometricamente(excitação a 365 nm, medida a 455 nm; SpectroFluorimeter Thermo LifeSciences Fluoroscan) como descrito (Bustos 1989).

EXEMPLO 4: Clonagem dos fragmentos do promotorPara isolar os fragmentos do promotor descritos por SEQ IDNO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, e 11, DNA genômico é isolado de Arabidopsisthaliana (ecotipo Columbia) ou Brassica napus como descrito (Galbiati2000). O genômico DNA isolado é empregado como DNA matriz para umaamplificação mediada por reação em cadeia da polimerase (PCR) usando osiniciadores de oligonucleotídeos e protocolos indicados abaixo (Tabela 3).

Tabela 3: Iniciadores de oligonucleotídeos PCR paraamplificação das várias seqüências nucleotídicas reguladoras de transcrição eenzimas de restrição para modificação dos produtos PCR resultantes

<table>table see original document page 182</column></row><table><table>table see original document page 183</column></row><table>

A amplificação é realizada como a seguir:

100 ng DNA genômico

1XPCR tampão

2,5 mM MgCl2,

200 uM cada de dATP, dCTP, dGTP e dTTPpmol de cada um dos iniciadores oligonucleotídeo

2,5 Unidades Pfu DNA Polimerase (Stratagene)em um volume final de 50 ul

O seguinte programa de temperatura é empregado para asvárias amplificações (BIORAD Thermocycler).

1.95°C durante 5 min

2. 54°C durante 1 min, seguido por 72°C durante 5 min e 95°Cdurante 30 segundos. Repetido 25 vezes

3. 54°C durante 1 min, seguido por 72°C durante 10 min.

4. armazenamento a 4°C

Os produtos PCR resultantes são digeridos com asendonucleases de restrição especificadas na Tabela acima (Tabela 3) eclonados no vetor pSUN0301 (SEQ ID NO: 147) (pre-digerido com asmesmas enzimas) a montante e em ligação operativa ao gene glucuronidase(GUS). Seguindo a transformação estável de cada uma destas construções emArabidopsis thaliana, a especificidade do tecido e perfil de expressão foramanalisados para um teste GUS histoquímico e quantitativo, respectivamente.

EXEMPLO 5: Perfil de expressão das várias construçõespromotor::GUS em plantas de A. Thaliana, colza e linhaça estavelmentetransformadas

O padrão de expressão de glucuronidase (GUS) dospromotores peroxiredoxina (PER1) de Arabidopsis (pAtPer; SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, e 8) e Linum usitatissimum (pLuPer; SEQ ID NO: 9, 10, e 11)foram investigados em Arabidopsis, colza e linhaça.

Resultados gerais: Expressão GUS fraca a média - forte foidetectada em embriões prematuros e jovens. Expressão GUS média - forte aforte foi encontrada em embriões médios, tardios e maduros. Não foiverificada funcionalidade parcial.

Caracterização em Arabidopsis: expressão GUS forte dospromotores pAtPer e pLuPer foi detectada em embriões durante todos osestágios de desenvolvimento. Não foi verificada funcionalidade parcial.

Caracterização em colza: expressão fraca do promotor pAtPerfoi detectada em embriões prematuros e jovens. A expressão média - forte aforte foi encontrada em sementes médias, tardias e maduras. Não foiverificada funcionalidade parcial. Expressão média - forte a forte do promotorpLuPer foi encontrada em sementes prematuras, jovens, médias, tardias emaduras. Não foi verificada funcionalidade parcial.

Caracterização em linhaça: em embriões prematuros e jovensde linhaça, os promotores pAtPer e pLuPer não mostram expressão ou umaexpressão fraca. A expressão média - forte destes promotores foi encontradaem sementes médias, tardias e maduras. Não foi verificada funcionalidadeparcial.

EXEMPLO 7: Construção de vetor para experimentos desuper-expressão e "abate" de genes

7.1 Super-expressão

Vetores usados para expressão de "genes candidatos" decomprimento completo de interesse em plantas (super-expressão) sãoprojetados para super-expressar a proteína de interesse e são de dois tiposgerais, biolístico e binário, dependendo do método de transformação de plantaa ser usado.

Para transformação biolística (vetores biolísticos), asexigências são como a seguir:

1. uma estrutura dorsal com um marcador selecionávelbacteriano (tipicamente, um gene de resistência a antibiótico) e origem dereplicação funcional em Escherichia coli (E. coli; por exemplo,, ColEl), e

2. uma porção específica de planta consistindo de:

a. um cassete de expressão de gene consistindo de umpromotor (por exemplo. ZmUBIint MOD), o gene de interesse (tipicamente,um cDNA de comprimento completo) e um terminador transcripcional (porexemplo, terminador nos de Agrobacterium tumefaciens);

b. um cassete de marcador selecionável de planta, consistindode um promotor apropriado, gene marcador selecionável (por exemplo,, D-aminoácido oxidase; daol) e terminador transcripcional (por exemplo,terminador nos).

Vetores projetados para transformação por Agrobacteriumtumefaciens {A. tumefaciens; vetores binários) consistem de:

1. uma estrutura dorsal com um marcador selecionávelbacteriano funcional em tanto E. coli como em A. tumefaciens (por exemplo,resistência a espectinomicina mediada pelo gene aadA) e duas origens dereplicação, funcionais em cada um dos hospedeiros bacterianos acimamencionados, mais o gene virG de A. tumefaciens',

2. uma porção específica de planta, como descrito para vetoresbiolísticos acima, exceto neste caso esta porção é flanqueada por seqüênciasde borda direita e esquerda de A. tumefaciens que mediam a transferência doDNA flanqueado por estas duas seqüências para a planta.

7.2 Vetores de silenciamento de genes

Vetores projetados para reduzir ou abolir a expressão de umgene único ou de uma família ou genes relacionados (vetores desilenciamento de genes) são também de dois tipos gerais correspondentes àmetodologia usada para regular de modo negativo a expressão de genes: RNAinterferência anti-sentido ou filamento duplo (dsRNAi).

(a) Anti-sentido

Para vetores anti-sentido, um fragmento de gene decomprimento completo ou parcial (tipicamente, uma porção do cDNA) podeser usado nos mesmos vetores descritos para expressão de comprimentocompleto, como parte do cassete de expressão do gene. Para a regulação demodo negativo mediada por anti-sentido da expressão de gene, a região decodificação do gene ou fragmento de gene estará na orientação oposta relativaao promotor; assim, mRNA será feito a partir do filamento não de codificação(anti-sentido) in planta.

(b) dsRNAi

Para vetores dsRNAi, um fragmento de gene parcial(tipicamente, comprimento de 300 a 500 pares de bases) é usado no cassete deexpressão do gene, e é expressado em ambas as orientações sentido e anti-sentido, separado por uma região de espaçador (tipicamente, um íntron deplanta, por exemplo, o intron OsSHl 1, ou um marcador selecionável, porexemplo, conferindo resistência a canamicina). Vetores deste tipo sãoprojetados para formar uma cepa de mRNA de filamento duplo, resultando daformação de pares de bases de dois fragmentos de genes complementares inplanta.

Os vetores biolísticos ou binários projetados para super-expressão ou abate podem variar em vários diferentes modos, incluindo, porexemplo, os marcadores selecionáveis usados em plantas e bactérias, osterminadores transcripcionais usados nos cassetes de expressão de genes e demarcador selecionável de plantas, e as metodologias usadas para clonagemem gene ou fragmentos de genes de interesse (tipicamente, clonagem baseadaem recombinase Gateway™ ou mediada por enzima de restriçãoconvencional).

EXEMPLO 8: Análise do elemento promotorA análise do motivo de promotor foi feita usando o softwarede Genomatix Matlnspector versão profissional 7.3 (agosto de 2004). Opromotor de perooxiredoxina (PER 1) de Linum usitatissimum (pLuPer; SEQID NO: 9; 1727bp) está compreendendo três regiões com densidade diferentede motivos de promotor (ver Fig. 2; região A, B, C). A seguinte lista estáapresentando alguns dos motivos de promotor compreendidos. A posição estáindicando a posição de nucleotídeo na seqüência descrita por SEQ ID NO: 9.O motivo é descrito de acordo como os seguintes princípios:

• atagattaTTTAgaa - Motivo de matriz (completo)

• attaTTTA - região conservada de motivo

• TTA - (negrito, letras maiúsculas) região de núcleo de motivo

• att - (negrito, letras minúsculas) parte de motivo depromotor conservada mas menos conservada do que a região de núcleo

8.1 Região A (1 - 794 bp; somente em SEQ ID NO: 9) estácompreendendo numerosos motivos de promotor característicos paraexpressão específica de semente:

- Proteína de ligação de DNA de batata-doce que liga àsseqüências theSP8a (ACTGTGTA) e SP8b (TACTATT) de genes esporaminae beta-amilase

Posição: 178-186 (+ filamento); Motivo: agTACTctttga

- Elemento de choque térmico. Posição 223-235 (filamento+);Motivo: agaggagaçaAGAAa

- Caixa de Prolamina, conservada em promotores do gene deproteína de armazenamento de semente de cereal

Posição: 266-281 (filamento +); Motivo: gaagttgcAAAGttgag

- Opaco-2. Posição: 316-330 (- filamento); Motivo:CCATtccttgtagtact

- Storekeeper (STK), proteína de ligação de DNA específicoda planta importante para expressão do gene específico de tubérculo eindutível de sacarose.

Posição 621-628 (filamento -); Motivo: TAAAtaatctat

- Caixa de legumina, elemento de seqüência altamenteconservado, cerca de 100 bp a montante do TSS em genes de legumina

Posição: 645-669 (filamento -), 655-679 (filamento -). Motivo:tccattgCTATccttgttagaaactaa

- Elementos de resposta ABA. Posição: 727-734 (filamento +).Motivo: ttttacACGTacc

8.2 Região B (795 - 1269bp; compreendida em SEQ ID NO: 9e 10) está compreendendo uma densidade relativamente baixa de motivos depromotor específicos de semente, mas mais geral ou outros motivos.

Determina a identidade de meristema floral edesenvolvimento de sépalas e pétalas

Posição: 857-872 (filamento +), 917-931 (filamento -); 1013-1027 (filamento+) e um motivo similar a 1134-1139 (filamento +); Motivo:acaaaacaAAAAtgttaatat

- Proteína semelhante a Myb de Petunia hybrida. Posição: 864-872 (filamento +), 801-809 (filamento -); 1178-1186 (filamento -); 1218-1226(filamento +); 1268-1276 (filamento +); Motivo: acaaaaatGTTAata.

- SBF. Posição: 870-875 (filamento +), 898-903 (filamento -),1179-1184 (filamento -). Motivo: aaaaatgTTAAtatttt

- Elementos semelhantes a OCS. Posição: 867-880 (filamento -). Motivo: atatgaaaatattaACATttt

- Agamous, requerido para desenvolvimento normal da flor,similaridade a proteínas SRF (humano) e MCM (levedura) Posição: 919-930(filamento +); Motivo: aatTTCCatatttgtaggaaa

8.3 Região C (1270- 1727bp; compreendida pela SEQ IDSNO: 9, 10 e 11) (~ SEQ. ID NO 11) compreendendo agrupamentos de algunspromotores de motivos específicos de semente:

- Motivos RY e Sph conservados em promotores específicosde semente Posição 1282-1287 (filamento -), 1522-1527 (filamento -) e 1615-1620 (filamento +); Motivo: cccaagtaÇATGçaaaatttaacggtt

- Opaco-2. Posição: 1372-1386 (filamento -), 1608-1622 (-) e1688-1696 (filamento +). Motivo: TTATtataagtaaattg

- Embrião de soja fator 4. Posição: 1386-1390 (filamento -),1713-1717 (filamento +); Motivo: atTTTTtatta

- Elementos semelhantes a OCS. Posição: 1446-159 (filamento+); Motivo: aaatgtggtagcgtACGTgtg

- Elemento de choque térmico. Posição: 1571-1583 (filamento-); Motivo: tggcggctccAGAAt

- Ativador 1- de transcrição de arroz (RITA), proteína zipperde leucina básica, altamente expressada durante desenvolvimento da semente.

Posição: 1584-1587 (filamento -); Motivo: cttgcgt4ÇGTggcggc

- Proteína 8 bZIP de Oryza sativa. Posição: 1602-1608(filamento -), 1583-1589 (-); Motivo: tgaagagaACGTggccctgag

- Elementos de resposta ABA. Posição: 1598-1608 (filamento-), 1581-1589 (-), 1452-1460 (+); Motivo: tgcatgaagagaACGTggccctgagtc

- Motivos RY e Sph conservados em promotores específicosde semente. Posição: -1615-1620 (filamento +); Motivo:gttctcttCATGcaaggatagtagaac

- SEF3, embrião de soja fator 3. Posição: 1641-1650(filamento +). Motivo: actccACCCacctcc

- Opaco-2. Posição: 1688-1696 (filamento +); Motivo:ctttcccatcCCATcca

- Embrião de soja fator 4. Posição:1713-1717 (filamento +);Motivo: caTTTTtatcaREFERÊNCIAS

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Todas as publicações, patentes e pedidos de patente são aquiincorporados por referência. Apesar do relatório acima desta invenção ter sidodescrito com relação a algumas formas de realização preferidas da mesma, emuitos detalhes terem sido especificados para fins de ilustração, será evidentepara os versados na arte que a invenção é susceptível de formas de realizaçãoadicionais e que alguns dos detalhes aqui descritos podem ser variadosconsideravelmente sem sair dos princípios básicos da invenção.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> BASF Plant Science GmbH

<120> Cassetes de expressão para expressão preferencial de semente emplantas

<130> AE20050148 / PF56382-AT<160> 127

<170> Patentln versão 3.3<210> 1<211> 1683<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana<220>

<221> promotor<222> (1) .. (1683)

<223> seqüência nucleotidica reguladora da transcrição de gene deArabidopsis

thaliana Atlg48130 (peroxiredoxina) compreendendoregião não traduzida5'

<220>

<221> misc_aspecto<222> (1503) . . (1508)

<223> motivos RY e Sph conservados em promotores específicos de semente (Filamento +) ctcttttgCATGcacctcaatttgaac

<220>

<221> sinal TATA<222> (1586) .. (1593)<223> caixa TATA putativa

<220>

<221> 5 T UTR

<222> (1620) .. (1683)

<223> região não traduzida 5? putativa

<400> 1

<table>table see original document page 202</column></row><table>agattatacg aagacacgtg gcgtgaaccc aattcataac aacgccacgc tatactcttt 1500

tgcatgcacc tcaatttgaa catcatcaag tctctctctc tctttttctg actttgatcc 1560

acgaacctaa ccagcttgcg atctctattt aatcggtcct cgacgcaact tcaacttcta 1620

ctacatccat tcacatcaaa tcaatacaga aagttttttc tatatataaa tataaaaggt 1680aaa 1683

<210> 2<211> 1619<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> promotor<222> (1)..(1619)

thaliana Atlg48130 (peroxiredoxina)

<220>

<221> sinal TATA<222> (1586) . . (1593)<223> caixa TATA putativa

<400> 2

gccacatcat gtttagactt atctccataa agaaaaccac tcatcaaagc taatacaaaa 60

gctctagtgt gacacttcaa cgtcacttca tcaggatcag caggtaaatt ccgaaaattc 120

tcacgcagcc acgctaagga cacatgagaa ccatgaagat ccttgggacc tggcctatga 180

ccaagcaaat cctcacataa atcagcccag ttgtattttg tactaccagt tactgcaggt 240

ccatcgacac gtagacccaa caaaatattc acatcttgta aagtcacagt gatctctcca 300

gcaggaagat gaaaagtatg cgtttcgggt ctccatctct ccaccaaagc tgttatcaga 360

gcataatcaa gttgtataaa ggcaaccttg taaactccat atagaccaaa ctctatcaac 420

ttttgacaca cgagaggatc cagaggccaa tctcgcatcc ccaataactt gtgccgacat 4 80

gtcagttcac gaggaggaac ctgaatgtga agtataacgg taaaaaggaa ataattaaaa 540

caacggaagc aaaacaagaa acaagatgaa atgagaaact agtaacacac ctcatcttcc 600

catatagcag ctgatctatg ctcatgttgc cacaccaata tagattgatc aactggacca 660

ggatccaaat caaagtttaa tagactttgc acctccatct atataatata tcacaggaca 720

ataaacacaa tgatcagtga ttatacaaca tcaaagaaaa cttgtaattc tgggaatata 780

actgagaaat gagaattaaa gattcataat ttgaacacaa gaaatcctaa actggtacga 840

aagaaaaatt gctcaacaaa aaaatcaagc taattactcg tatacaaaga cacgaagaac 900

taatacaaga aacaagaaac aacaaaccac aaagagattg aaccaatcca aattcgacaa 960

cataaaccaa gtgtgtgggt gattggaatc agaggacgta ccaaagaaaa gcgtccgtga 1020

tcaacaaaaa ccaaaaagag acgtttgaaa taaaccagag gaagacgaag aataattaag 1080

caaagagaag cgttaagcgg gagcgagaaa ggaaacgaga gaaagagaga gcttccagat 1140

ccgacagaag ttttcggctt cttctttttc gtttaagaac ttctgatcct cctaggtctg 1200

tccgaagaac taatcttttt gaggtaacga cgccgttttt ctcaaaacat gggcccatta 12 60

accatagtct cggcccaaac gaaacttaat acgacaatgt ttgggtgtaa acgcaaagat 1320

tttgtcgatt atcacaagta aaaaaataaa tacaaacact tgagtctctc tagacatcgt 1380

gcgtcgcctt agctttaagt tttttctcga aacaaaagag ttattttatt tgaactttga 1440

agattatacg aagacacgtg gcgtgaaccc aattcataac aacgccacgc tatactcttt 1500

tgcatgcacc tcaatttgaa catcatcaag tctctctctc tctttttctg actttgatcc 1560

acgaacctaa ccagcttgcg atctctattt aatcggtcct cgacgcaact tcaacttct 1619

<210> 3<211> 985<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> promotor<222> (1)..(985)

<223> seqüência nucleotidica reguladora da transcrição (região depromotor de núcleo putativo) de gene de Arabidopsis thaliana

Atlg48130(peroxiredoxina) compreendendo região não traduzida 5?

<220>

<221> sinal TATA

<222> (888)..(895)

<223> caixa TATA putativa

<220>

<221> 5!UTR

<222> (922)..(985)

<223> região não traduzida 51 putativa

<400> 3

ctatataata

aacttgtaat

aagaaatcct

cgtatacaaa

tgaaccaatc

taccaaagaa

aggaagacga

gagaaagaga

acttctgatc

ttctcaaaac

gtttgggtgt

cttgagtctc

agttatttta

acaacgccac

tctctttttc

ctcgacgcaa

tctatatata

tatcacaggatctgggaataaaactggtacgacacgaagacaaattcgacaagcgtccgtagaataattagagcttccagctcctaggtcatgggcccataaacgcaaagtctagacatctttgaactttgctatactcttgactttgatcttcaacttcaatataaaag

caataaacactaactgagaagaaagaaaaaactaatacaaaacataaaccgatcaacaaaagcaaagagaatccgacagatgtccgaagataaccatagtattttgtcgagtgcgtcgccgaagattatatttgcatgcaccacgaaccttactacatccgtaaa

aatgatcagtatgagaattattgctcaacagaaacaagaaaagtgtgtggaaccaaaaagagcgttaagcagttttcggcactaatctttctcggcccaattatcacaagttagctttaacgaagacacgcctcaatttgaaccagcttgattcacatca

gattatacaaaagattcataaaaaaatcaaacaacaaaccgtgattggaaagacgtttgagggagcgagattcttcttttttgaggtaacacgaaacttataaaaaaatagttttttctctggcgtgaacaacatcatcacgatctctataatcaataca985

catcaaagaa 60

atttgaacac 120

gctaattact 180

acaaagagat 240

tcagaggacg 300

aataaaccag 360

aaggaaacga 420

tcgtttaaga 480

gacgccgttt 54 0

atacgacaat 600

aatacaaaca 660

gaaacaaaag 7 20

ccaattcata 780

agtctctctc 840

ttaatcggtc 900

gaaagttttt 960

<210> 4<211> 921<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> promotor<222> (1)..(921)

Atlg48130

(peroxiredoxina)

<220>

<221> sinal TATA

<222> (888)..(895)

<223> caixa TATA putativa

<400> 4

ctatataata

aacttgtaat

aagaaatcct

cgtatacaaa

tgaaccaatc

taccaaagaa

aggaagacga

gagaaagaga

acttctgatc

ttctcaaaac

gtttgggtgt

cttgagtctc

agttatttta

tatcacaggatctgggaataaaactggtacgacacgaagacaaattcgacaagcgtccgtagaataattagagcttccagctcctaggtcatgggcccataaacgcaaagtctagacatctttgaacttt

caataaacactaactgagaagaaagaaaaaactaatacaaaacataaaccgatcaacaaaagcaaagagaatccgacagatgtccgaagataaccatagtattttgtcgagtgcgtcgccgaagattata

aatgatcagtatgagaattattgctcaacagaaacaagaaaagtgtgtggaaccaaaaagagcgttaagcagttttcggcactaatctttctcggcccaattatcacaagttagctttaacgaagacacg

gattatacaaaagattcataaaaaaatcaaacaacaaaccgtgattggaaagacgtttgagggagcgagattcttcttttttgaggtaacacgaaacttataaaaaaatagttttttctctggcgtgaac

catcaaagaa 60

atttgaacac 120

gctaattact 180

acaaagagat 24 0

tcagaggacg 300

aataaaccag 360

aaggaaacga 420

tcgtttaaga 480

gacgccgttt 540

atacgacaat 600

aatacaaaca 660

gaaacaaaag 720

ccaattcata 780acaacgccac gctatactct tttgcatgca cctcaatttg aacatcatca agtctctctc 840tctctttttc tgactttgat ccacgaacct aaccagcttg cgatctctat ttaatcggtc 900ctcgacgcaa cttcaacttc t 921

<210> 5<211> 1696<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> promotor<222> (1) .. (1696)

<223> seqüência nucleotidica reguladora da transcrição (derivado) degene de Arabidopsis thaliana gene Atlg48130 (peroxiredoxina)compreendendo região não traduzida 51

<220>

<221> sinal TATA<222> (1595) .. (1602)<223> caixa TATA putativa

<220>

<221> 51UTR

<222> (1633)..(1696)

<223> região não traduzida 51 putativa

<400> 5

<table>table see original document page 205</column></row><table><210> 6<211> 1632<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<220><221> promotor<222> (1)..(1632)

<223> seqüência nucleotidica reguladora da transcrição (derivado) degene de Arabidopsis thaliana Atlg48130 (peroxiredoxina)

<220>

<221> sinal TATA<222> (1595) .. (1602)<223> caixa TATA putativa

<400> 6

gccacatcat gtttagactt atctccataa agaaaaccac tcatcaaagc taatacaaaa 60

gctctagtgt gacacttcaa cgtcacttca tcaggatcag caggtaaatt ccgaaaattc 120

tcacgcagcc acgctaagga cacatgagaa ccatgaagat ccttgggacc tggcctatga 180

ccaagcaaat cctcacataa atcagcccag ttgtattttg tactaccagt tactgcaggt 240

ccatcgacac gtagacccaa caaaatattc acatcttgta aagtcacagt gatctctcca 300

gcaggaagat gaaaagtatg cgtttcgggt ctccatctct ccaccaaagc tgttatcaga 360

gcataatcaa gttgtataaa ggcaaccttg taaactccat atagaccaaa ctctatcaac 420

ttttgacaca cgagaggatc cagaggccaa tctcgcatcc ccaataactt gtgccgacat 480

gtcagttcac gaggaggaac ctgaatgtga agtataacgg taaaaaggaa atatatatta 540

aaacaacgga agcaaaacaa gaaacaagat gaaatgagaa actagtaaca cacctcataa 600

tcttcccata tagcagctga tctatgctca tgttgccaca ccaatataga ttgatcaacc 660

attggaccag gatccaaatc aaagtttaat agactttgca cctccatcta tataatatat 720

cacaggacaa taaacacaat gatcagtgat tatacaacat caaagaaaac ttgtaattct 780

gggaatataa ctgagaaatg agaattaaag attcataatt tgaacacaag aaatcctaaa 84 0

ctggtacgaa agaaaaattg ctcaacaaaa aaatcaagct aattactcgt atacaaagac 900

acgaagaact aatacaagaa acaagaaaca acaaaccaca aagagattga accaatccaa 960

attcgacaac ataaaccaag tgtgtgggtg attggaatca gaggacgtac caaagaaaag 1020

cgtccgtgat caacaaaaac caaaaagaga cgtttgaaat aaaccagagg aagacgaaga 1080

ataattaagc aaagagaagc gttaagcggg agcgagaaag gaaacgagag aaagagagag 1140

cttccagatc cgacagaagt tttcggcttc ttctttttcg tttaagaact tctgatcctc 1200

ctaggtctgt ccgaagaact aatctttttg aggtaacgac gccgtttttc tcaaaacatg 1260

ggcccattaa ccatagtctc ggcccaaacg aaacttaata cgacaatgtt tgggtgtaaa 1320

cgcaaagatt ttgtcgatta tcacaagtaa aaaaataaat acaaacactt gagtctctct 1380

agacatcgtg cgtcgcctta gctttaagtt ttttctcgaa acaaaagagt tattttattt 1440

gaactttgaa gattatacga agacacgtgg cgtgaaccca attcataaca acgccacgct 1500

atactctttt gcatgcacct caatttgaac atcatcaagt ctctctctct ctttttctga 1560

ctttgatcca cgaacctaac cagcttgcga tctctattta atcggtcctc gacgcaactt 1620catataactt ct 1632

<210> 7<211> 989<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> promotor<222> (1)..(989)

<223> seqüência nucleotidica reguladora da transcrição (derivado;

região de promotor de núcleo putativo) de gene de Arabidopsisthaliana Atlg48130 (peroxiredoxina) compreendendo região não

traduzida 5?

<220>

<221> sinal TATA

<222> (888)..(895)

<223> caixa TATA putativa

<220>

<221> 5'UTR

<222> (926)..(989)

<223> região não traduzida 51 putativa<400> 7

ctatataata tatcacagga caataaacac aatgatcagt gattatacaa catcaaagaa 60

aacttgtaat tctgggaata taactgagaa atgagaatta aagattcata atttgaacac 120

aagaaatcct aaactggtac gaaagaaaaa ttgctcaaca aaaaaatcaa gctaattact 180

cgtatacaaa gacacgaaga actaatacaa gaaacaagaa acaacaaacc acaaagagat 240

tgaaccaatc caaattcgac aacataaacc aagtgtgtgg gtgattggaa tcagaggacg 300

taccaaagaa aagcgtccgt gatcaacaaa aaccaaaaag agacgtttga aataaaccag 360

aggaagacga agaataatta agcaaagaga agcgttaagc gggagcgaga aaggaaacga 4 20

gagaaagaga gagcttccag atccgacaga agttttcggc ttcttctttt tcgtttaaga 480

acttctgatc ctcctaggtc tgtccgaaga actaatcttt ttgaggtaac gacgccgttt 540

ttctcaaaac atgggcccat taaccatagt ctcggcccaa acgaaactta atacgacaat 600

gtttgggtgt aaacgcaaag attttgtcga ttatcacaag taaaaaaata aatacaaaca 660

cttgagtctc tctagacatc gtgcgtcgcc ttagctttaa gttttttctc gaaacaaaag 720

agttatttta tttgaacttt gaagattata cgaagacacg tggcgtgaac ccaattcata 780

acaacgccac gctatactct tttgcatgca cctcaatttg aacatcatca agtctctctc 840

tctctttttc tgactttgat ccacgaacct aaccagcttg cgatctctat ttaatcggtc 900

ctcgacgcaa cttcatataa cttctactac atccattcac atcaaatcaa tacagaaagt 960tttttctata tataaatata aaaggtaaa 989

<210> 8<211> 925<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> promotor<222> (1)..(925)

<223> seqüência nucleotidica reguladora da transcrição {derivado;

{região de promotor de núcleo putativo) de gene de Arabidopsisthaliana

Atlg4 8130 (peroxiredoxina)

<220>

<221> sinal TATA

<222> (888)..(895)

<223> caixa TATA putativa

<400> 8

<table>table see original document page 207</column></row><table>

<210> 9<211> 1727<212> DNA

<213> Linum usitatissimum

<220>

<221> promotor<222> (1) .. (1727)<223> seqüência nucleotidica reguladora da transcrição (derivado) de geneortólogo de Linum usitartissimum para gene de Arabidopsisthaliana

Atlg48130 (peroxiredoxina) compreendendo região não traduzida 5'<220>

<221> misc_aspecto<222> (1282) .. (1287)

<223> motivos RY e Sph conservados em promotores específicos de semente(filamento-)

cccaagtaCATGcaaaatttaacggtt

<220>

<221> misc_aspecto<222> (1615)..(1620)

<223> RY e Sph motivos conservados em promotores específicos de semente( +

filamento) gttctcttCATGcaaggatagtagaac

<220>

<221> sinal TATA<222> (1652)..(1656)<223> caixa TATA putativa

<400> 9

cacgggcagg acatagggac tactacaagc atagtatgct tcagacaaag agctaggaaa 60

gaactcttga tggaggttaa gagaaaaaag tgctagaggg gcatagtaat caaacttgtc 120

aaaaccgtca tcatgatgag ggatgacata atataaaaag ttgactaagg tcttggtagt 180

actctttgat tagtattata tattggtgag aacatgagtc aagaggagac aagaaaccga 240

ggaaccatag tttagcaaca agatggaagt tgcaaagttg agctagccgc tcgattagtt 300

acatctccta agcagtacta caaggaatgg tctctatact ttcatgttta gcacatggta 360

gtgcggattg acaagttaga aacagtgctt aggagacaaa gagtcagtaa aggtattgaa 420

agagtgaagt tgatgctcga caggtcagga gaagtccctc cgccagatgg tgactaccaa 480

ggggttggta tcagctgaga cccaaataag attcttcggt tgaaccagtg gttcgaccga 540

gactcttagg gtgggatttc actgtaagat ttgtgcattt tgttgaatat aaattgacaa 600

ttttttttat ttaattatag attatttaga atgaattaca tatttagttt ctaacaagga 660

tagcaatgga tgggtatggg tacaggttaa acatatctat tacccaccca tctagtcgtc 720

gggttttaca cgtacccacc cgtttacata aaccagaccg gaattttaaa ccgtacccgt 780

ccgttagcgg gtttcagatt tacccgttta. atcgggtaaa acctgattac taaatatata 840

ttttttattt gataaacaaa acaaaaatgt taatattttc atattggatg caattttaag 900

aaacacatat tcataaattt ccatatttgt aggaaaataa aaagaaaaat atattcaaga 960

acacaaattt caccgacatg acttttatta cagagttgga attagatcta acaattgaaa 1020

aattaaaatt aagatagaat atgttgagga acatgacata gtataatgct gggttacccg 1080

tcgggtaggt atcgaggcgg atactactaa atccatccca ctcgctatcc gataatcact 1140

ggtttcgggt atacccattc ccgtcaacag gcctttttaa ccggataatt tcaacttata 1200

gtgaatgaat tttgaataaa tagttagaat accaaaatcc tggattgcat ttgcaatcaa 1260

attttgtgaa ccgttaaatt ttgcatgtac ttgggataga tataatagaa ccgaattttc 1320

attagtttaa tttataactt actttgttca aagaaaaaaa atatctatcc aatttactta 1380

taataaaaaa taatctatcc aagttactta ttataatcaa cttgtaaaaa ggtaagaata 1440

caaatgtggt agcgtacgtg tgattatatg tgacgaaatg ttatatctaa caaaagtcca 1500

aattcccatg gtaaaaaaaa tcaaaatgca tggcaggctg tttgtaacct tggaataaga 1560

tgttggccaa ttctggagcc gccacgtacg caagactcag ggccacgttc tcttcatgca 1620

aggatagtag aacaccactc cacccacctc ctatattaga cctttgccca accctcccca 1680actttcccat cccatccaca aagaaaccga catttttatc ataaatc 1727

<210> 10<211> 933<212> DNA

<213> iniciador de oligonucleotideo

<220>

<221> promotor<222> (1)..(933)<223> seqüência nucleotidica reguladora da transcrição (derivado;região de promotor de núcleo putativo) de gene ortólogo de

Linum usitartissimum para gene de Arabidopsis thaliana Atlg48130(peroxiredoxina) compreendendo região não traduzida 5f

<220>

<221> sinal TATA

<222> (858)..(862)

<223> caixa TATA putativa

<400> 10

<table>table see original document page 209</column></row><table>

<210> 11<211> 458<212> DNA

<213> iniciador de oligonucleotideo

<220>

<221> promotor<222> (1)..(458)

<223> seqüência nucleotidica reguladora da transcrição (derivado;

região de promotor de núcleo putativo) de gene ortólogo de Linum

usitartissimum para gene de Arabidopsis thaliana Atlg48130(peroxiredoxina) compreendendo região não traduzida 5?

<220>

<221> sinal TATA

<222> (383)..(387)

<223> caixa TATA putativa

<400> 11

accgttaaat tttgcatgta cttgggatag atataataga accgaatttt cattagttta 60

atttataact tactttgttc aaagaaaaaa aatatetate caatttactt ataataaaaa 120

ataatetate caagttactt attataatca acttgtaaaa aggtaagaat acaaatgtgg 180

tagcgtacgt gtgattatat gtgacgaaat gttatatcta acaaaagtcc aaattcccat 240

ggtaaaaaaa atcaaaatgc atggcaggct gtttgtaacc ttggaataag atgttggcca 300

attctggagc cgccacgtac gcaagactca gggccacgtt ctcttcatgc aaggatagta 360

gaacaccact ccacccacct cctatattag acctttgccc aaccctcccc aactttccca 420

tcccatccac aaagaaaccg acatttttat cataaatc 458

<210> 12<211> 973<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<220><221> CDS<222> (109)..(759)

<223> codificando para produto de gene de Arabidopsis thaliana Atlg48130(peroxiredoxina)

<400> 12tggcgatctc tatttaatcg gtcctcgacg caacttcaac ttctactaca tccattcaca 60tcaaatcaat acagaaagtt ttttctatat ataaatataa aaggtaaa atg cca ggg 117

Met Pro Gly

1

ate aca cta gga gac acg gtg ceg aac cta gaa gtg gag acg aca cat 165

lie Thr Leu Gly Asp Thr Vai Pro Asn Leu Glu Vai Glu Thr Thr His

10 15

gac aag ttc aaa ctt cat gac tac ttc gcc aat tet tgg acc gtc etc 213

Asp Lys Phe Lys Leu His Asp Tyr Phe Ala Asn Ser Trp Thr Vai Leu

25 30 35

ttc tet cat cec ggg gat ttc aca cec gtg tgc acc acg gag ctt ggt 261

Phe Ser His Pro Gly Asp Phe Thr Pro Vai Cys Thr Thr Glu Leu Gly

40 45 50

gcg atg gcc aaa tac gct cat gag ttc gat aag aga ggc gtg aag etc 309

Ala Met Ala Lys Tyr Ala His Glu Phe Asp Lys Arg Gly Vai Lys Leu

55 60 65

ctt ggt ctg tet tgt gac gat gta cag tca cac aaa gac tgg ate aaa 357

Leu Gly Leu Ser Cys Asp Asp Vai Gln Ser His Lys Asp Trp lie Lys

70 75 80

gat att gaa gcc ttt aat cac gga age aag gtg aat tac ceg ata ate 405

Asp lie Glu Ala Phe Asn His Gly Ser Lys Vai Asn Tyr Pro lie lie

85 90 95

gct gac ceg aac aaa gag ate att cet cag ctt aac atg att gat cca 453

Ala Asp Pro Asn Lys Glu lie lie Pro Gln Leu Asn Met lie Asp Pro

100 105 110 115

att gag aac gga ceg tet cgt gcc ctt cat att gtt ggt cet gac agt 501

lie Glu Asn 120 Gly Pro Ser 125 Arg Ala Leu 130 His lie Vai Gly Pro Asp Ser

aag ata aaa ttg age ttc ttg tat ceg tcg acc acg gga cgt aac atg 549

Lys lie Lys Leu Ser Phe Leu Tyr Pro Ser Thr Thr Gly Arg Asn Met

135 140 14 [5

gac gaa gta ttg agg gct tta gac tcg ttg ttg atg gcg tec aag cac 597

Asp Glu 150 Vai Leu Arg 155 Ala Leu Asp 160 Ser Leu Leu Met Ala Ser Lys His

aat aac aag ate gcc act ceg gtt aac tgg aag cca gat caa ceg gtt 645

Asn Asn Lys lie Ala Thr Pro Vai Asn Trp Lys Pro Asp Gln Pro Vai

165 170 175

gtg att tcg cet gct gtg tcg gac gag gaa gcc aaa aag atg ttc cca 693

Vai lie Ser Pro Ala Vai Ser Asp Glu Glu Ala Lys Lys Met Phe Pro

180 185 190 195

cag ggt ttc aag acc gcc gat ctt ceg tca aag aaa ggc tat ctg cgt 741

Gln Gly Phe Lys Thr Ala Asp Leu Pro Ser Lys Lys Gly Tyr Leu Arg

200 205 210

cgc aca gag gtc tet tga aaagataata acaaaagcct actatataac 789Arg Thr Glu Vai Ser215

gtacatgcaa gtattgtatg atattaatgt ttttacgtac gtgtaaacaa aaataattac 849gtttgtaacg tatggtgatg atgtggtgca ctaggtgtag gccttgtatt aataaaaaga 909agtttgttct atatagagtg gtttagtacg acgatttatt tactaaacaa aaaaaaaaaa 969aaaa 973

<210> 13<211> 216<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 13

Met Pro Gly lie Thr Leu Gly Asp Thr Vai Pro Asn Leu Glu Vai Glu15 10 15

Thr Thr His Asp Lys Phe Lys Leu His Asp Tyr Phe Ala Asn Ser Trp20 25 30

Thr Vai Leu Phe Ser His Pro Gly Asp Phe Thr Pro Vai Cys Thr Thr35 40 45

Glu Leu Gly Ala Met Ala Lys Tyr Ala His Glu Phe Asp Lys Arg Gly50 55 60

Vai Lys Leu Leu Gly Leu Ser Cys Asp Asp Vai Gln Ser His Lys Asp

65 70 75 80

Trp lie Lys Asp lie Glu Ala Phe Asn His Gly Ser Lys Vai Asn Tyr

85 90 95

Pro lie lie Ala Asp Pro Asn Lys Glu lie lie Pro Gln Leu Asn Met100 105 110

lie Asp Pro lie Glu Asn Gly Pro Ser Arg Ala Leu His lie Vai Gly115 120 125

Pro Asp Ser Lys lie Lys Leu Ser Phe Leu Tyr Pro Ser Thr Thr Gly130 135 140

Arg Asn Met Asp Glu Vai Leu Arg Ala Leu Asp Ser Leu Leu Met Ala

145 150 155 160

Ser Lys His Asn Asn Lys lie Ala Thr Pro Vai Asn Trp Lys Pro Asp

165 170 175

Gln Pro Vai Vai lie Ser Pro Ala Vai Ser Asp Glu Glu Ala Lys Lys180 185 190

Met Phe Pro Gln Gly Phe Lys Thr Ala Asp Leu Pro Ser Lys Lys Gly195 200 205

Tyr Leu Arg Arg Thr Glu Vai Ser210 215

<210> 14<211> 862<212> DNA

<213> Brassica napus

<220>

<221> CDS

<222> (37)..(687)

<223> codificando para ortólogo de Brassica napus de produto de gene deArabidopsis thalianaAt lg4 8130 (peroxiredoxina)

<400> 14

ccaatacata cattttcatt tcgataacaa gaaaaa atg cca ggg ate aca cta 54

Met Pro Gly lie Thr Leu1 5

gga gac acg gtg cca aac cta gag gtg gag acg aca cac aag aac ttc 102Gly Asp Thr Vai Pro Asn Leu Glu Vai Glu Thr Thr His Lys Asn Phe

10 15 20

aag etc cat gac tac ttc gcc gat tet tgg acc gtc etc ttc tet cac 150Lys Leu His Asp Tyr Phe Ala Asp Ser Trp Thr Vai Leu Phe Ser His25 30 35<table>table see original document page 212</column></row><table>

attgtataat aatgctcaca atgggttgat aaaaatatga aaaactacgt ttgtaacgta 787tcgtgtgtgt gctctggagg atatagcctt atattaatag aaataatgtg ttttataaaa 847aaaaaaaaaa aaaaa 862

<210> 15<211> 216<212> PRT

<213> Brassica napus<400> 15

Met Pro Gly lie Thr Leu Gly Asp Thr Vai Pro Asn Leu Glu Vai Glu15 10 15

Thr Thr His Lys Asn Phe Lys Leu His Asp Tyr Phe Ala Asp Ser Trp20 25 30

Thr Vai Leu Phe Ser His Pro Gly Asp Phe Thr Pro Vai Cys Thr Thr35 40 45

Glu Leu Gly Ala Met Gly Lys Tyr Ala His Glu Phe Glu Gln Arg Gly50 55 60

Vai Lys Leu Leu Gly Leu Ser Cys Asp Asp lie Gln Ser His Lys Asp65 70 75 80

Trp lie Pro Asp lie Glu Ala Phe Thr Pro Gly Ser Lys Vai Thr Tyr85 90 95Pro lie lie Ala Asp Pro Asn Lys Glu lie lie Pro Gln Leu Asn Met100 105 110

lie Asp Pro lie Glu Asn Gly Pro Ser Arg Ala Leu His Vai Vai Gly115 120 125

Pro Asp Cys Lys lie Lys Leu Ser Phe Leu Tyr Pro Ser Thr Thr Gly130 135 140

Arg Asn Met Asp Glu Vai Leu Arg Ala Leu Asp Ser Leu Leu Met Ala

145 150 155 160

Ala Lys His Lys Asn Lys lie Ala Thr Pro Vai Asn Trp Lys Pro Asp

165 170 175

Glu Pro Vai Vai lie Ser Pro Ala Vai Ser Asp Glu Glu Ala Lys Lys180 185 190

Leu Phe Pro Gln Gly Phe Lys Thr Ala Lys Leu Pro Ser Lys Lys Gly195 200 205

Tyr Leu Arg Vai Ala Asp Vai Ser210 215

<210> 16

<211> 816

<212> DNA

<213> Bromus secalinus

<220>

<221> CDS

<222> (2)..(610)

<223> codificando para ortólogo de Bromus secalinus de produto de gene deArabidopsis thaliana Atlg4 8130 (peroxiredoxina)

<400> 16

c tcc acc cat ggc aag ate cgc ate cac gac tac gtc gcc aac ggc tac 49Ser Thr His Gly Lys lie Arg lie His Asp Tyr Vai Ala Asn Gly Tyr

1 5 10 15

gtc ate etc ttc tcg cac cec ggc gat ttc acc ceg gtg tgc acg acg 97

Vai lie Leu Phe Ser His Pro Gly Asp Phe Thr Pro Vai Cys Thr Thr

20 25 30

gag ctg gcg gcg atg gcc aac tac gcc aag gag ttc gag aag agg ggc 145

Glu Leu Ala Ala Met Ala Asn Tyr Ala Lys Glu Phe Glu Lys Arg Gly

35 40 45

gtc aag ctg ctg ggc ate tcc tgc gac gac gtg cag tcc cac aag gag 193

Vai Lys Leu Leu Gly lie Ser Cys Asp Asp Vai Gln Ser His Lys Glu

50 55 60

tgg acc aag gac ate gag gcc tac aag cet ggg age aag gtg acg tac 241

Trp Thr Lys Asp lie Glu Ala Tyr Lys Pro Gly Ser Lys Vai Thr Tyr

65 70 75 80

ceg ate atg gcg gac ceg gac cgg tcg gcc ate aag cag etc aac atg 289

Pro lie Met Ala Asp Pro Asp Arg Ser Ala lie Lys Gln Leu Asn Met

85 90 95

gtg gat ceg gac gag aag gac gcg gag ggg cag ctg ceg tcg cgc acg 337

Vai Asp Pro Asp Glu Lys Asp Ala Glu Gly Gln Leu Pro Ser Arg Thr

100 105 110

ctg cac ate gtg ggg ceg gac aag aag gtg aag ctg age ttc ctg tac 385

Leu His lie Vai Gly Pro Asp Lys Lys Vai Lys Leu Ser Phe Leu Tyr

115 120 125

ceg tcg tgc acg ggg agg aac atg gac gag gtt gtg cgc gcg gtg gac 433

Pro Ser Cys Thr Gly Arg Asn Met Asp Glu Vai Vai Arg Ala Vai Asp<table>table see original document page 214</column></row><table><210> 18<211> 864<212> DNA

<213> Hordeum vulgare

<220>

<221> CDS

<222> (51)..(707)

<223> codificando para ortólogo de Hordeum vulgare de produto de genede Arabidopsis thaliana Atlg48130 (peroxiredoxina)

<400> 18

gttcgcagca gcaaagagca cgcagcaact agctttcagt tgtttcaacc atg ccg 56

Met Pro1

ggg etc acc att ggc gac acc gtc cec aac ctg gag ctg gac tec acc 104

Gly Leu Thr lie Gly Asp Thr Vai Pro Asn Leu Glu Leu Asp Ser Thr

5 10 15

cat ggc aag ate cgc ate cac gac tac gtc ggc aac ggc tac gtc ate 152

His Gly Lys lie Arg lie His Asp Tyr Vai Gly Asn Gly Tyr Vai lie'

20 25 30

etc ttc tcg cac cec ggt gat ttc acc ccg gtg tgc acg acg gag ctg 200

Leu Phe Ser His Pro Gly Asp Phe Thr Pro Vai Cys Thr Thr Glu Leu

35 40 45 50

gcg gcc atg gcc aac tac gcc aag gag ttc gag aag cgg ggc gtg aag 248

Ala Ala Met Ala Asn Tyr Ala Lys Glu Phe Glu Lys Arg Gly Vai Lys

55 60 65

ctg etc ggc ate tec tgc gac gac gtg cag tec cac aag gag tgg acc 296

Leu Leu Gly lie Ser Cys Asp Asp Vai Gln Ser His Lys Glu Trp Thr

70 75 80

aag gac ate gag gcc tac aag cet ggg age aag gtg acg tac ccg ate 344

Lys Asp lie Glu Ala Tyr Lys Pro Gly Ser Lys Vai Thr Tyr Pro lie

85 90 95

atg gcg gac ccg gac cgg tcg gcg ate aag cag etc aac atg gtg gac 392

Met Ala Asp Pro Asp Arg Ser Ala lie Lys Gln Leu Asn Met Vai Asp

100 105 110

ccg gac gag aag gac gcg cag ggg cag ctg ccg tec cgc acc ctg cac 440

Pro Asp Glu Lys Asp Ala Gln Gly Gln Leu Pro Ser Arg Thr Leu His

115 120 125 130

ate gtg ggg ccg gac aag gtg gtg aag ctg age ttc ctg tac ccg tcg 488

lie Vai Gly Pro Asp Lys Vai Vai Lys Leu Ser Phe Leu Tyr Pro Ser

135 140 145

tgc acg ggg cgg aac atg gac gag gtg gtg cgc gcc gtg gac tcg ctg 536

Cys Thr Gly Arg Asn Met Asp Glu Vai Vai Arg Ala Vai Asp Ser Leu

150 155 160

ctg acg gcg gea aag cac aag gtg gea acc ccg gcc aac tgg aag cec 584

Leu Thr Ala Ala Lys His Lys Vai Ala Thr Pro Ala Asn Trp Lys Pro

165 170 175

ggc gag tgc gtt gtg ate gcg cec ggc gtc tec gac gag gag gcc aag 632

Gly Glu Cys Vai Vai lie Ala Pro Gly Vai Ser Asp Glu Glu Ala Lys

1E Í0 1! 35 190

aag atg ttc ccg cag ggg ttc gag acc gcc gac ctg cec tec aag aag 680

Lys Met Phe Pro Gln Gly Phe Glu Thr Ala Asp Leu Pro Ser Lys Lys

195 200 205 210

ggc tac etc cgc ttc acc aag gtc tag gcgtccgtcc gtgctagctc 727

Gly Tyr Leu Arg Phe Thr Lys Vai

215

gtcggcgctt gctcggttac ttatggtggt ggtatgtgtc gttgtggtgc gtgcgtactt 787ttgtggtagc atgtgtcgtt tcttctgtaa ttctactcgc gtcgccgagc tatetetact 847gtgacttcgc ctctttc 864

<210> 19<211> 218<212> PRT

<213> Hordeum vulgare<400> 19

Met Pro Gly Leu Thr lie Gly Asp Thr Vai Pro Asn Leu Glu Leu Asp15 10 15

Ser Thr His Gly Lys lie Arg lie His Asp Tyr Vai Gly Asn Gly Tyr20 25 30

Vai lie Leu Phe Ser His Pro Gly Asp Phe Thr Pro Vai Cys Thr Thr35 40 45

Glu Leu Ala Ala Met Ala Asn Tyr Ala Lys Glu Phe Glu Lys Arg Gly50 55 60

Vai Lys Leu Leu Gly lie Ser Cys Asp Asp Vai Gln Ser His Lys Glu

65 70 75 80

Trp Thr Lys Asp lie Glu Ala Tyr Lys Pro Gly Ser Lys Vai Thr Tyr

85 90 95

Pro lie Met Ala Asp Pro Asp Arg Ser Ala lie Lys Gln Leu Asn Met100 105 110

Vai Asp Pro Asp Glu Lys Asp Ala Gln Gly Gln Leu Pro Ser Arg Thr115 120 125

Leu His lie Vai Gly Pro Asp Lys Vai Vai Lys Leu Ser Phe Leu Tyr130 135 140

Pro Ser Cys Thr Gly Arg Asn Met Asp Glu Vai Vai Arg Ala Vai Asp

145 150 155 160

Ser Leu Leu Thr Ala Ala Lys His Lys Vai Ala Thr Pro Ala Asn Trp165 170 175

Lys Pro Gly Glu Cys Vai Vai lie Ala Pro Gly Vai Ser Asp Glu Glu180 185 190

Ala Lys Lys Met Phe Pro Gln Gly Phe Glu Thr Ala Asp Leu Pro Ser195 200 205

Lys Lys Gly Tyr Leu Arg Phe Thr Lys Vai210 215

<210> 20<211> 273<212> DNA

<213> Linum usitatissimum

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(273)

<223> codificando para ortólogo de Linum usitatissimum de produto de genede Arabidopsis thaliana Atlg48130 (peroxiredoxina)

<400> 20

atg cct gga etc acc ate ggg gac acc gtc cca aat ctt gaa gtg gag 48

Met Pro Gly Leu Thr lie Gly Asp Thr Vai Pro Asn Leu Glu Vai Glu

15 10 15 -

age act cat gga gtc ate aat etc cac gac ttc ttc acc aat tec tgg 96

Ser Thr His Gly Vai lie Asn Leu His Asp Phe Phe Thr Asn Ser Trp20 25 30

acc ate etc ttc tet cac cec ggt gat ttc acg ceg gtg tgc acc acg 144

Thr lie Leu Phe Ser His Pro Gly Asp Phe Thr Pro Vai Cys Thr Thr

35 40 45

gaa cta ggg aag atg gea gct tat gcg ceg gag ttt gag aag aga ggg 192

Glu Leu Gly Lys Met Ala Ala Tyr Ala Pro Glu Phe Glu Lys Arg Gly

50 55 60

gtc aaa etc ctg ggc ttg tca tgc gac gac gtt ttg tet cat gtc gag 240

Vai Lys Leu Leu Gly Leu Ser Cys Asp Asp Vai Leu Ser His Vai Glu

65 70 75 80

tgg ate aag gac gta gaa gcc ttc acc gtg age 273

Trp lie Lys Asp Vai Glu Ala Phe Thr Vai Ser

85 90

<210> 21

<211> 91

<212> PRT

<213> Linum usitatissimum

<400> 21

Met Pro Gly Leu Thr lie Gly Asp Thr Vai Pro Asn Leu Glu Vai Glu

1 5 10 15

Ser Thr His Gly Vai lie Asn Leu His Asp Phe Phe Thr Asn Ser Trp

20 25 30

Thr lie Leu Phe Ser His Pro Gly Asp Phe Thr Pro Vai Cys Thr Thr

35 40 45

Glu Leu Gly Lys Met Ala Ala Tyr Ala Pro Glu Phe Glu Lys Arg Gly

50 55 60

Vai Lys Leu Leu Gly Leu Ser Cys Asp Asp Vai Leu Ser His Vai Glu

65 70 75 80

Trp lie Lys Asp Vai Glu Ala Phe Thr Vai Ser

85 90

<210> 22<211> 827<212> DNA

<213> Triticum turgidum

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(657)

<223> codificando para ortólogo de Triticum turgidum de produto de genede Arabidopsis thaliana Atlg4 8130 (peroxiredoxina)

<400> 22

atg ceg ggg ctg acg ata ggc gac acc gtc cec aac ctg gag ctg gac 48

Met Pro Gly Leu Thr lie Gly Asp Thr Vai Pro Asn Leu Glu Leu Asp

1 5 10 15

tec acc cat ggc aag ate cgg ate cac gac tac gtc ggc aac ggc tac 96

Ser Thr His Gly Lys lie Arg lie His Asp Tyr Vai Gly Asn Gly Tyr

20 25 30

gtc ate etc ttc tca cac cec ggt gat ttc acc ceg gtg tgc acg acg 144

Vai lie Leu Phe Ser His Pro Gly Asp Phe Thr Pro Vai Cys Thr Thr

35 40 45

gag tta gcg gcg atg gcc aac tac gcc aag gag ttc gag aag cgg ggc 192

Glu Leu Ala Ala Met Ala Asn Tyr Ala Lys Glu Phe Glu Lys Arg Gly

50 55 60

gtg aag ctg ctg ggc ate tec tgc gac gac gtg cag tec cac aag gaa 240Vai Lys Leu Leu Gly lie Ser Cys Asp Asp Vai Gln Ser His Lys Glu65 70 75 80

tgg acc aag gac ate gag gcc tac aag cet ggg age aag gtg acg tac 288Trp Thr Lys Asp lie Glu Ala Tyr Lys Pro Gly Ser Lys Vai Thr Tyr

85 90 95

ceg ate atg gcg gac ceg gac cgg tcg gcc ate aag caa ctg aac atg 336Pro lie Met Ala Asp Pro Asp Arg Ser Ala lie Lys Gln Leu Asn Met

100 105 110

gtc gac cec gac gag aag gac gcg gag ggg cag ctg ceg tec cgc acc 384Vai Asp Pro Asp Glu Lys Asp Ala Glu Gly Gln Leu Pro Ser Arg Thr

115 120 125

ttg cac ate gtg ggg ceg gac aag aag gtg aag ctg age ttc ctg tac 432Leu His lie Vai Gly Pro Asp Lys Lys Vai Lys Leu Ser Phe Leu Tyr

130 135 140

ceg tcg tgc acg ggg cgg aac atg gac gag gtg gtg cgc gcc gtg gac 480Pro Ser Cys Thr Gly Arg Asn Met Asp Glu Vai Vai Arg Ala Vai Asp145 150 155 160

tcg ctg ctg acg gcg gcc aag cac aag gtg gcc acc ceg gcc aac tgg 528Ser Leu Leu Thr Ala Ala Lys His Lys Vai Ala Thr Pro Ala Asn Trp

165 170 175

aat cec ggg gag tgc gtg gtg ate gcg cec ggc gtc tec gac gac ggg 576Asn Pro Gly Glu Cys Vai Vai lie Ala Pro Gly Vai Ser Asp Asp Gly

180 185 190

gcc aag aag atg ttc ceg cag ggg ttc gag act gcc gac ctg cec tec 624Ala Lys Lys Met Phe Pro Gln Gly Phe Glu Thr Ala Asp Leu Pro Ser

195 200 205

aag aag ggg tac etc cgc ttc acc aag gtc tag gcgtgcgtcc gtgctagctc 677Lys Lys Gly Tyr Leu Arg Phe Thr Lys Vai210 215

gtcggcgcct gctcggttac tcgtggcggt ctgtgtcgtt gtggtccgtg cgtacttttg 737tggtggtacg tgtcgtttct tctgtaaatc taccagcgtc tccgagctat gtatgtgtac 797tgtgactttg tctcaaaaaa aaaaaaaaaa 827

<210> 23<211> 218<212> PRT

<213> Triticum turgidum<400> 23

Met Pro Gly Leu Thr lie Gly Asp Thr Vai Pro Asn Leu Glu Leu Asp15 10 15

Ser Thr His Gly Lys lie Arg lie His Asp Tyr Vai Gly Asn Gly Tyr20 25 30

Vai lie Leu Phe Ser His Pro Gly Asp Phe Thr Pro Vai Cys Thr Thr35 40 45

Glu Leu Ala Ala Met Ala Asn Tyr Ala Lys Glu Phe Glu Lys Arg Gly50 55 60

Vai Lys Le u Leu Gly lie Ser Cys Asp Asp Vai Gln Ser His Lys Glu

65 70 75 80

Trp Thr Lys Asp lie Glu Ala Tyr Lys Pro Gly Ser Lys Vai Thr Tyr

85 90 95

Pro lie Met Ala Asp Pro Asp Arg Ser Ala lie Lys Gln Leu Asn Met100 105 110

Vai Asp Pro Asp Glu Lys Asp Ala Glu Gly Gln Leu Pro Ser Arg Thr115 120 125Leu His lie Vai Gly Pro Asp Lys130 135 140

Pro Ser Cys Thr Gly Arg Asn Met145 150 155

Ser Leu Leu Thr Ala Ala Lys His165 170

Lys Vai Lys Leu Ser Phe Leu Tyr

Asp Glu Vai Vai Arg Ala Vai Asp160

Lys Vai Ala Thr Pro Ala Asn Trp175

Asn Pro Gly Glu Cys Vai Vai lie Ala Pro Gly Vai Ser Asp Asp Gly180 185 190

Ala Lys Lys Met Phe Pro Gln Gly Phe Glu Thr Ala Asp Leu Pro Ser195 200 205

Lys Lys Gly Tyr Leu Arg Phe Thr Lys Vai210 215

<210> 24

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador de oligonucleotídeo<400> 24

ttttttgtcg acgccacatc atgtttagac ttatctcca 39

<210> 25

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador de oligonucleotideo<400> 25

ttaattcata tgtttacctt ttatatttat atatagaaaa aact 44

<210> 26

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador de oligonucleotideo<400> 26

ttaattaagc ttagaagttg aagttgcgtc ga 32

<210> 27

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador de oligonucleotideo<400> 27

ttttttacta gtctatataa tatatcacag gaca 34

<210> 28<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador de oligonucleotideo

<400> 28

ttaattcata tgtttacctt ttatatttat ata 33

<210> 29

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador de oligonucleotideo<400> 29

ttaattcata tgagaagttg aagttgcgtc ga 32

<210> 30

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador de oligonucleotideo<400> 30

ttaattaagc ttagaagtta tatgaagttg cgtcga 36

<210> 31

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador de oligonucleotideo<400> 31

ttaattggta cctttacctt ttatatttat ata 33

<210> 32

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador de oligonucleotideo<400> 32

ttaattcata tgagaagtta tatgaagttg cgt 33

<210> 33

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador de oligonucleotideo<400> 33<table>table see original document page 221</column></row><table><table>table see original document page 222</column></row><table><213> Artificial<220>

<223> motivo de aminoácido para peroxiredoxina (ortólogos de produto degene de Arabidopsis thaliana Atlg48130)

<220>

<221> VARIANTE<222> (4)..(4)<223> variação(I/M)

<400> 43

Tyr Pro lie lie Ala Asp Pro1 5

<210> 44

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<221> VARIANTE<222> (4)..(4)<223> variação(T/N)

<220>

<221> VARIANTE<222> (8)..(8)<223> variação(I/M)

<400> 44

Ser Lys Vai Thr Tyr Pro lie lie Ala Asp Pro15 10

<210> 45

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<400> 45

Lys Leu Ser Phe Leu Tyr Pro1 5

<210> 46

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<221> VARIANTE<222> (1)..(1)<table>table see original document page 224</column></row><table><213> Artificial<220>

<220>

<221> VARIANTE<222> (2)..(2)<223> (I/V) variação

<220>

<221> VARIANTE<222> (6)..(6)<223> variação(V/A)

<400> 50

Lys lie Ala Thr Pro Vai Asn Trp Lys Pro1 5 10

<210> 51

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<400> 51

Pro Ser Lys Lys Gly Tyr Leu1 5

<210> 52

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<400> 52

Leu Pro Ser Lys Lys Gly Tyr Leu Arg1 5

<210> 53

<211> 4

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> motivo de promotor<400> 53

tact 4

<210> 54

<211> 4

<212> DNA

<213> Artificial

<220><table>table see original document page 226</column></row><table><213> Artificial

<220>

<223> motivo de promotor

<400> 60aaaa

<210> 61

<211> 4

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> motivo de promotor

<400> 61gtta

<210> 62

<211> 4

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> motivo de promotor

<400> 62ttaa

<210> 63

<211> 4

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> motivo de promotor

<400> 63acat

<210> 64

<211> 4

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> motivo de promotor<220>

<221> misc_aspecto

<222> (2)..(2)

<223> n é a, c, g, ou t

<400> 64tncc

<210> 65

<211> 4

<212> DNA

<213> Artificial

<220><table>table see original document page 228</column></row><table><table>table see original document page 229</column></row><table><table>table see original document page 230</column></row><table><220>

<223> motivo de promotor <400> 80

ccattccttg tagta

<210> 81

<211> 9

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> motivo de promotor <220>

<221> misc_aspecto

<222> (5)..(5)

<223> n é a, c, g, ou t

<400> 81 taaanaatc

<210> 82

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> motivo de promotor <220>

<221> misc_aspecto

<222> (14) .. (14)

<223> n é a, c, g, ou t

<220>

<221> misc_aspecto

<222> (16)..(16)

<223> n é a, c, g, ou t

<400> 82

ccattgctat cctngntaga aacta

<210> 83

<211> 9

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> motivo de promotor <220>

<221> misc_aspecto

<222> (2) .. (4)

<223> n é a, c, g, ou t

<400> 83 tnnnacgta

<210> 84

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial<table>table see original document page 232</column></row><table><221> misc_aspecto

<222> (8).7(10)

<223> n é a, c, g, ou t

<400> 87 gaaannannn acat

<210> 88

<211> 12

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> motivo de promotor <220>

<221> misc_aspecto

<222> (2)..(2)

<223> n é a, c, g, ou t

<220>

<221> misc_aspecto

<222> (5)..(6)

<223> n é a, c, g, ou t

<220>

<221> misc_aspecto

<222> (8)..(10)

<223> n é a, c, g, ou t

<400> 88 tnccnnannn gt

<210> 89

<211> 6

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> motivo de promotor

<400> 89 catgca

<210> 90

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> motivo de promotor <400> 90

ttattataag taaat

<210> 91

<211> 5

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> motivo de promotor<400> 91 ttttt

<210> 92

<211> 14

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> motivo de promotor <220>

<221> misc_aspecto

<222> (5) .. (6)

<223> n é a, c, g, ou t

<220>

<221> misc_aspecto

<222> (8)..(10)

<223> n é a, c, g, ou t

<400> 92 gtggnngnnn acgt

<210> 93

<211> 13

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> motivo de promotor <220>

<221> misc_aspecto

<222> (3)..(6)

<223> n é a, c, g, ou t

<220>

<221> misc_aspecto

<222> (9)..(9)

<223> n é a, c, g, ou t

<400> 93 ggnnnntcna gaa

<210> 94

<211> 10

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> motivo de promotor

<400> 94 cgtacgtggc

<210> 95 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial

<220>

<223> motivo de promotor<400> 95 acgtggc

<210> 96

<211> 9

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> motivo de promotor <220>

<221> misc_aspecto

<222> (2) .. (4)

<223> n é a, c, g, ou t

<400> 96 gnnnacgtg

<210> 97

<211> 6

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> motivo de promotor

<400> 97 catgca

<210> 98

<211> 8

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> motivo de promotor <220>

<221> misc_aspecto

<222> (7)..(7)

<223> n é a, c, g, ou t

<400> 98 cacccanc

<210> 99

<211> 9

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> motivo de promotor <220>

<221> misc_aspecto

<222> (3)..(4)

<223> n é a, c, g, ou t

<400> 99 cannccatc<table>table see original document page 236</column></row><table><400> 105 taaataatct at

<210> 106

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> motivo de promotor <400> 106

tccattgcta tccttgttag aaactaa

<210> 107

<211> 13

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> motivo de promotor

<400> 107 ttttacacgt acc

<210> 108

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> motivo de promotor <400> 108

acaaaacaaa aatgttaata t

<210> 109

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> motivo de promotor

<400> 109 acaaaaatgt taata

<210> 110

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> motivo de promotor

<400> 110

aaaaatgtta atatttt

<210> 111

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial<table>table see original document page 238</column></row><table><212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> motivo de promotor

<400> 117 tggcggctcc agaat

<210> 118

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> motivo de promotor

<400> 118

cttgcgtacg tggcggc

<210> 119

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> motivo de promotor

<400> 119

tgaagagaac gtggccctga g

<210> 120

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> motivo de promotor

<400> 120

tgcatgaaga gaacgtggcc ctgagtc

<210> 121

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> motivo de promotor

<400> 121

gttctcttca tgcaaggata gtagaac

<210> 122

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> motivo de promotor

<400> 122 actccaccca cctcc<table>table see original document page 240</column></row><table><400> 126

aaagataata acaaaagcct actatataac gtacatgcaa gtattgtatg atattaatgt 60

ttttacgtac gtgtaaacaa aaataattac gtttgtaacg tatggtgatg atgtggtgca 120

ctaggtgtag gccttgtatt aataaaaaga agtttgttct atatagagtg gtttagtacg 180

acgatttatt tactagtcgg attggaatag agaaccgaat tcttcaatcc ttgcttttga 240

tcaagaattg aaaccgaatc aaatgtaaaa gttgatatat ttgaaaaacg tattgagctt 300

atgaaaatgc taatactctc atctgtatgg aaaagtgact ttaaaaccga acttaaaagt 360 gacaaaaggg gaatatcgca tcaaaccgaa tgaaaccgat 400

<210> 127

<211> 227

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> 3'UTR

<222> (1)..(227)

<223> 3' região não traduzida de transcrito Atlg48130 de Arabidopsis thalianaperoxiredoxina (PER1)

<400> 127

aaagataata acaaaagcct actatataac gtacatgcaa gtattgtatg atattaatgt 60 ttttacgtac gtgtaaacaa aaataattac gtttgtaacg tatggtgatg atgtggtgca 120 ctaggtgtag gccttgtatt aataaaaaga agtttgttct atatagagtg gtttagtacg 180 acgatttatt tactagtcgg attggaatag agaaccgaat tcttcaa 227

PF 56382 2

PF 56382

Claims

1. Cassetes de expressão para regular expressão específica de semente ou preferencial de semente em plantas, caracterizados de compreendera) pelo menos uma seqüência nucleotídica reguladora da transcrição de um gene codificando uma proteína peroxiredoxina (PER1), e funcionalmente ligado à mesma,b) pelo menos uma seqüência de ácido nucleico que é heteróloga com relação à referida seqüência nucleotídica reguladora da transcrição.

2. Cassetes de expressão para regular expressão específica de semente ou preferencial de semente em plantas, caracterizados de compreendera) pelo menos uma seqüência nucleotídica reguladora da transcrição de um gene de planta, referido gene de planta selecionado dentre o grupo consistindo dei) o gene descrito pelo loci do genoma de Arabidopsis thaliana do GenBank Atlg48130, eii) genes ortólogos do gene descrito pelo loci do genoma de Arabidopsis thaliana do GenBank Atlg48130,e funcionalmente ligados ao mesmo,b) pelo menos uma seqüência de ácido nucleico que é heteróloga com relação à referida seqüência nucleotídica reguladora da transcrição.

3. Cassete de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a seqüência nucleotídica reguladora da transcrição é obtenível a partir de DNA genômico de planta de um gene codificando um polipeptídeo quea) compreende pelo menos um motivo de seqüênciaselecionado dentre o grupo consistindo das seqüências de aminoácidoi) GDTVPNL (SEQ ID NO: 37),ii) GDFTPVC (SEQ ID NO: 39),iii) VKLLGLS (SEQ ID NO: 41), iv) (YPI(I/M)ADP (SEQ ID NO: 43),v) KLSFLYP (SEQ ID NO: 45),(vi) GRNMDEV (SEQ ID NO: 47),vii) (I/V)ATP(V/A)NW (SEQ ID NO: 49), eviii) PSKKGYL (SEQ ID NO: 51), oub) tem pelo menos 50% identidade de seqüência de aminoácido para um polipeptídeo selecionado dentre o grupo descrito por SEQ ID NO: 13, 15, 17, 19, 21, e 23.

4. Cassete de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a seqüência nucleotídica reguladora da transcrição é obtenível a partir de DNA genômico de planta de um gene codificando um polipeptídeo quea) compreende pelo menos um motivo de seqüência selecionado dentre o grupo consistindo das seqüências de aminoácidoi) GDTVPNL (SEQ ID NO: 37),ii) GDFTPVC (SEQ ID NO: 39),iii) VKLLGLS (SEQ ID NO: 41),iv) YPI(I/M)ADP (SEQ ID NO: 43),v) KLSFLYP (SEQ ID NO: 45), vi) GRNMDEV (SEQ ID NO: 47),vii) (I/V)ATP(V/A)NW (SEQ ID NO: 49), eviii) PSKKGYL (SEQ ID NO: 51), eb) tem pelo menos 50% identidade de seqüência deaminoácido para um polipeptídeo selecionado dentre o grupo descrito por SEQIDNO: 13, 15, 17, 19, 21, e 23.

5. Cassete de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a seqüência nucleotídica reguladora da transcrição compreende pelo menos uma região de seqüência selecionada dentre o grupo consistindo de a) uma região compreendendo pelo menos dois dos motivos de promotor descritos por SEQ ID NO: 53, 54, 55, 56, 57, 58, ou 59,b) uma região compreendendo pelo menos dois dos motivos de 1 a promotor descritos por SEQ ID NO: 60, 61, 62, 63 ou 64,c) uma região compreendendo pelo menos dois dos motivos de promotor descritos por SEQ ID NO: 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, ou 76.

6. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a seqüência nucleotídica reguladora da transcrição compreende pelo menos uma região de seqüência selecionada dentre o grupo consistindo dea) uma região compreendendo pelo menos dois dos motivos de promotor descritos por SEQ ID NO: 77, 78, 79, 80, 81, 82, ou 83, b) uma região compreendendo pelo menos dois dos motivos de promotor descritos por SEQ ID NO: 84, 85, 86, 87, ou 88,c) uma região compreendendo pelo menos dois dos motivos de promotor descritos por SEQ ID NO: 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100.

7. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que a seqüência nucleotídica reguladora da transcrição compreende pelo menos uma região de seqüência selecionada dentre o grupo consistindo dea) uma região compreendendo pelo menos dois dos motivos depromotor descritos por SEQ ID NO: 101, 102, 103, 104, 105, 106, ou 107,b) uma região compreendendo pelo menos dois dos motivos de promotor descritos por SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, ou 112,c) uma região compreendendo pelo menos dois dos motivos de promotor descritos por SEQ ID NO: 113, 114, 115, 116, 117, -----118, 119, 120, 121, 122, 123, ou 124.

8. Cassete de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a seqüência nucleotídica reguladora da transcrição é selecionada dentre o grupo de seqüências consistindo dei) a seqüência descrita por SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou 11,ii) um fragmento de pelo menos 50 bases consecutivas de uma seqüência sob i),iii) uma seqüência nucleotídica tendo similaridade substancialcom uma identidade de seqüência de pelo menos 50% para uma seqüência nucleotídica reguladora da transcrição descrita por SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou 11;iv) uma seqüência nucleotídica capaz de hibridizar sob condições equivalentes a hibridização em 7% dodecil sulfato de sódio (SDS),-0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 2 X SSC, 0,1% SDS a 50°C para uma seqüência nucleotídica reguladora da transcrição descrita por SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou 11, ou o seu complemento;v) uma seqüência nucleotídica capaz de hibridizar sob condições equivalentes a hibridização em 7% dodecil sulfato de sódio (SDS),-0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 2 X SSC, 0,1% SDS a 50°C para um ácido nucleico compreendendo 50 a 200 ou mais nucleotídeos consecutivos de uma seqüência nucleotídica reguladora da transcrição descrita por SEQ ID NO: 1, 2, 3, ---4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou 11, ou o seu complemento;vi) uma seqüência nucleotídica que é o complemento ou complemento reverso de qualquer uma das seqüências nucleotídicas previamente mencionadas sob i) a v).

9. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que as seqüências especificadas sob ii), iii), iv) v) evi) de acordo com a reivindicação 8 são capazes de modificar transcrição em uma célula de planta ou organismo.

10. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que as seqüências especificadas sob ii), iii), iv) v) evi) de acordo com a reivindicação 8 tem substancialmente a mesma atividade reguladora de transcrição como a seqüência nucleotídica reguladora da transcrição descrita por SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou 11.

11. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que as seqüências especificadas sob iii) de acordo com a reivindicação 8 tem uma identidade de seqüência de pelo menos 80% para uma seqüência descrita por SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou 11.

12. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que as seqüências especificadas sob iv) ou v) de acordo com a reivindicação 8 são hibridizadas sob condições estringentes com a seqüência de marcação especificada.

13. Cassete de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a expressão da seqüência de ácido nucleico resulta em expressão de uma proteína, ou expressão de umRNA anti-sentido, RNA sentido ou filamento duplo.

14. Cassete de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a expressão da seqüência de ácido nucleico confere à planta um traço agronomicamente valioso.

15. Cassete de expressão de acordo com qualquerreivindicação 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão ainda compreende funcionalmente associado à seqüência nucleotídica a ser expressada pelo menos uma seqüência selecionado dentre o grupo consistindo de:a) as seqüências descritas por SEQ ID NO: 125, 126, e 127, eb) uma seqüência compreendendo um fragmento de pelo menos 25 nucleotídeos consecutivos de uma seqüência descrita por SEQ ID NO: 125, 126, ou 127,c) uma seqüência tendo uma identidade de pelo menos 50%, para uma seqüência descrita por SEQ ID NO: 125, 126, ou 127d) uma seqüência capaz de hibridizar sob condições equivalentes a hibridização em 7% dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 2 X SSC, 0,1% SDS a 50°C para um ácido nucleico compreendendo 50 a 200 ou mais (preferivelmentetodos) nucleotídeos consecutivos de como uma seqüência descrita por SEQID NO: 125, 126, ou 127, ou o seu complemento,em que referida seqüência é capaz de mediar estabilização deRNA, estabilização de expressão de RNA, terminação de transcrição de RNAe/ou poliadenilação de RNA. 20

16. Seqüência nucleotídica isolada, caracterizada pelo fato deser selecionada dentre o grupo de seqüências consistindo de:a) a seqüência como descrita por SEQ ID NO: 1, 2, 3, ou 4, e seqüências tendo uma identidade de pelo menos 99% para uma seqüência como descrita por SEQ ID NO: 1, 2, 3, ou 4, e seqüências compreendendo pelo menos 600 nucleotídeos consecutivos de uma seqüência como descrita por SEQ ID NO: l,2,3,ou4,eb) a seqüência como descrita por SEQ ID NO: 9, 10, ou 11, e seqüências tendo uma identidade de pelo menos 40% para uma seqüência como descrita por SEQ ID NO: 5 ou 26, e seqüências compreendendo pelomenos 15 nucleotídeos consecutivos de uma seqüência como descrita porSEQ IDNO: 9, 10, ou 11,

17. Vetor, caracterizado pelo fato de compreender umaseqüência isolada de ácido nucleico como definida na reivindicação 16 ou umcassete de expressão como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15.

18. Célula hospedeira transgênica ou organismo não humano,caracterizada pelo fato de compreender um cassete de expressão comodefinido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, ou um vetor comO definido na reivindicação 17.

19. Célula de planta ou planta transgênica, caracterizada pelofato de compreender o cassete de expressão como definido em qualquer umadas reivindicações 1 a 15, ou um vetor como definido na reivindicação 17.

20. Célula de planta ou planta transgênica de acordo com areivindicação 19, caracterizada pelo fato de que referida planta ou célula deplanta é de uma planta usada para produção de óleo.

21. Método para identificar e/ou isolar uma seqüêncianucleotídica reguladora da transcrição, caracterizado pelo fato de que referidaidentificação e/ou isolamento utiliza uma seqüência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo como descrito por SEQ ID NO: 13, 15, 17, 19,-21, ou 23, ou uma parte de pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos dereferida seqüência de ácido nucleico.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de que as seqüências de ácido nucleico são descritas por SEQ ID NO: 12, 14, 16, 18, 20, ou 22 ou uma parte de pelo menos 15 nucleotídeosconsecutivos das mesmas.

23. Método de acordo com a reivindicação 21 ou 22,caracterizado pelo fato de que referida identificação e/ou isolamento érealizada por um método selecionado dentre reação em cadeia da polimerase,hibridização, e triagem de base de dados.

24. Método para prover ou produzir um cassete de expressãotransgênica para expressão heteróloga em plantas, caracterizado pelo fato decompreender as etapas de: I. isolar de uma seqüência nucleotídica reguladora datranscrição de um gene de planta utilizando pelo menos uma seqüência deácido nucleico codificando um polipeptídeo descrito por SEQ ID NO: 13, 15,17, 19, 21, ou 23, ou uma parte de pelo menos 15 nucleotídeos consecutivosde referida seqüência de ácido nucleico, e II. funcionalmente ligar referida seqüência nucleotídicareguladora da transcrição a outra seqüência nucleotídica de interesse, que éheteróloga com relação à referida seqüência nucleotídica reguladora datranscrição.

25. Método para prover um cassete de expressão transgênica para expressão específica de semente ou preferencial de semente,caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:I. isolar de uma seqüência nucleotídica reguladora datranscrição preferencial de semente ou específica de semente utilizando pelomenos uma seqüência de ácido nucleico ou uma parte da mesma, em que referida seqüência está codificando um polipeptídeo descrito por SEQ ID NO:-13, 15, 17, 19, 21, ou 23, ou uma parte de pelo menos 15 nucleotídeosconsecutivos do mesmo, eII. funcionalmente ligar referida seqüência nucleotídicareguladora da transcrição preferencial de semente ou específica de semente a outra seqüência nucleotídica de interesse, que é heteróloga com relação àreferida seqüência nucleotídica reguladora da transcrição preferencial desemente ou específica de semente.

26. Métodos de acordo com qualquer uma das reivindicações-21 a 25, caracterizados pelo fato de que a seqüência nucleotídica utilizadapara isolamento de referida seqüência nucleotídica reguladora da transcriçãoestá codificando um polipeptídeo compreendendo pelo menos um motivo deseqüência selecionado dentre o grupo consistindo das seqüências deaminoácidoi) GDTVPNL (SEQ ID NO: 37),ii) GDFTPVC (SEQ ID NO: 39),iii) VKLLGLS (SEQ ID NO: 41),iv) YPI(I/M)ADP (SEQ ID NO: 43),v) KLSFLYP (SEQ ID NO: 45),vi) GRNMDEV (SEQ ID NO: 47),vii) (I/V)ATP(V/A)NW (SEQ ID NO: 49), eviii) PSKKGYL (SEQ ID NO: 51),

27. Seqüência reguladora de transcrição sintética,caracterizada pelo fato de compreender pelo menos uma região de seqüênciaselecionada dentre o grupo consistindo dea) uma região compreendendo pelo menos dois dos motivos depromotor descritos por SEQ ID NO: 53, 54, 55, 56, 57, 58, ou 59,b) uma região compreendendo pelo menos dois dos motivos depromotor descritos por SEQ ID NO: 60, 61, 62, 63 ou 64,c) uma região compreendendo pelo menos dois dos motivos depromotor descritos por SEQ ID NO: 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75,ou 76.

28. Seqüência reguladora de transcrição sintética de acordocom a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que referida seqüência estácompreendendo pelo menos uma região de seqüência selecionada dentre ogrupo consistindo dea) uma região compreendendo pelo menos dois dos motivos depromotor descritos por SEQ ID NO: 77, 78, 79, 80, 81, 82, ou 83,b) uma região compreendendo pelo menos dois dos motivos depromotor descritos por SEQ ID NO: 84, 85, 86, 87, ou 88,c) uma região compreendendo pelo menos dois dos motivos depromotor descritos por SEQ ID NO: 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99,ou 100.

29. Seqüência reguladora de transcrição sintética de acordocom a reivindicação 27 ou 28, caracterizada pelo fato de que a referidaseqüência está compreendendo pelo menos uma região de seqüênciaselecionada dentre o grupo consistindo dea) uma região compreendendo pelo menos dois dos motivos depromotor descritos por SEQ ID NO: 101, 102, 103, 104, 105, 106, ou 107,b) uma região compreendendo pelo menos dois dos motivos depromotor descritos por SEQ ID NO: 108, 109, 110, 111, ou 112,c) uma região compreendendo pelo menos dois dos motivos depromotor descritos por SEQ ID NO: 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, ou 124.

30. Método para prover uma seqüência nucleotídica reguladorade transcrição sintética, caracterizado pelo fato de que os motivos depromotores isolados ou agrupamentos de motivos de promotores sãocombinados, referidos motivos ou agrupamentos de motivos compreendendopelo menos 5 dos motivos descritos por qualquer uma dentre SEQ ID NO: 53,-54, 55, 56, 57, 58, 59,: 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73,-74, 75, ou 76.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizadopelo fato de que os motivos isolados de promotores ou agrupamentos demotivos de promotores são combinados, referidos motivos ou agrupamentosde motivos compreendendo pelo menos 5 dos motivos descritos por qualqueruma dentre SEQ ID NO: 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90,-91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100.

32. Método de acordo com a reivindicação 30 ou 31,caracterizado pelo fato de que os motivos de promotores isolados ouagrupamentos de motivos de promotores são combinados, referidos motivosou agrupamentos de motivos compreendendo pelo menos dos motivosdescritos por qualquer uma dentre SEQ ID NO: 101, 102, 103, 104, 105, 106,-107, 108, 109, 110, 111, 112,: 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121,-122, 123, ou 124.

33. Cassete de expressão, caracterizado pelo fato decompreenderi) pelo menos uma seqüência nucleotídica reguladora datranscrição capaz de mediar a transcrição em plantas e funcionalmente ligadoà mesma,ii) pelo menos uma seqüência de ácido nucleico, efuncionalmente ligada à mesmaiii) pelo menos uma seqüência selecionada dentre o grupoconsistindo de:a) as seqüências descritas por SEQ ID NO: 125, 126, e 127, eb) uma seqüência compreendendo um fragmento de pelomenos 25 nucleotídeos consecutivos de uma seqüência descrita por SEQ IDNO: 125, 126, ou 127,c) uma seqüência tendo uma identidade de pelo menos 50%para uma seqüência descrita por SEQ ID NO: 125, 126, ou 127d) uma seqüência capaz de hibridizar sob condiçõesequivalentes à hibridização em 7% dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 MNaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 2 X SSC, 0,1% SDS a 50°Cpara um ácido nucleico compreendendo 50 a 200 ou mais (preferivelmentetodos) nucleotídeos consecutivos de uma seqüência descrita por SEQ ID NO:-125, 126, ou 127, ou o seu complemento,em que referida seqüência iii) é capaz de mediar estabilizaçãode RNA, estabilização de expressão de RNA, terminação de transcrição deRNA e/ou poliadenilação de RNA; eem que ou referida seqüência reguladora de transcrição i) oureferida seqüência iii) ou ambas i e iii) são heterólogas com relação à referidaseqüência nucleotídica ii).