ES2393610T3

ES2393610T3 - Cepa de protozoo de la especie Leishmania infantum de virulencia atenuada y su utilización

Info

Publication number: ES2393610T3
Application number: ES04805294T
Authority: ES
Inventors: Anabela Cordeira Da Silva; Ali Ouaissi; Denis Sereno; Jean-Baptiste Vergnes
Original assignee: Institut de Recherche pour le Developpement IRD; Universidade do Porto
Current assignee: Institut de Recherche pour le Developpement IRD; Universidade do Porto
Priority date: 2003-10-29
Filing date: 2004-10-25
Publication date: 2012-12-26
Anticipated expiration: 2024-10-25
Also published as: WO2005044844A2; AU2004286879B2; AU2004286879A1; US20070224224A1; EP1678305A2; FR2861740B1; US7732188B2; FR2861740A1; WO2005044844A3; EP1678305B1; CA2543866A1; ATE534741T1

Abstract

Cepa de protozoo de la especie Leishmania infantum cuya virulencia es inferior a la de la cepa salvaje correspondiente, caracterizada porque se inactiva una sola copia del gen SIR2 presente en el genoma de dicha cepa.

Description

Cepa de protozoo de la especie Leishmania infantum de virulencia atenuada y su utilización.

La presente invención tiene por objeto unas cepas de protozoos de virulencia atenuada y su utilización.

Los protozoos flagelados de la familia de Trypanosomatidae son responsables de numerosas enfermedades que afectan al ser humano y al animal.

Así, entre los protozoos del género Trypanosoma, T. brucei y T. cruzi son, por ejemplo, responsables respectivamente de la enfermedad del sueño y de la enfermedad de Chagas.

Los protozoos del género Leishmania, tales como L. aethiopica, L. donovani, L. infantum, L. major, L. mexicana o L. tropica son responsables de las leishmaniasis. Estas infecciones son endémicas en más de 88 países, y afectan a una porción notable del territorio francés. En el perímetro mediterráneo, y en Francia en particular, las leishmaniasis se deben esencialmente a L. infantum. En el mundo, la OMS estima en 12 millones el número de individuos parasitados y más de 350 millones de personas estarían expuestas diariamente. Existen tres formas principales de leishmaniasis cuya forma más severa, la leishmaniasis visceral, puede ser mortal en ausencia de tratamiento. Esta situación se ha agravado, desde la emergencia del VIH, por el hecho de que estas infecciones se encuentran cada vez más como enfermedades oportunistas en las personas que padecen el síndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA), en particular en el suroeste de Europa. El parásito utiliza el estatus inmunitario deprimido de su huésped para implantarse o reactivarse.

Los tratamientos actuales de leishmaniasis recurren a medicamentos de difícil manejo, tales como la anfotericina B o a medicamentos que pertenecen a la familia de los antimoniales, cuyos efectos secundarios son importantes.

Hoy en día, no existen vacunas que permitan prevenir las infecciones por Leishmania. La puesta a punto de dichas vacunas constituye el objeto de numerosos programas de investigación. Se destacan tres ejes principales; la preparación de vacunas muertas, de vacunas vivas atenuadas o de vacunas sub-unitarias. Entre estos tres ejes, la preparación de vacunas vivas atenuadas parece ser la más prometedora; este tipo de vacuna permite, en efecto, la inmunización más parecida a la realizada por el parásito salvaje. Además, las técnicas modernas de biología molecular permiten preparar cepas de virulencia atenuada por desactivación específica de ciertos genes de virulencia. Se han preparado así varias cepas de Leishmania, de las que un gen de virulencia se ha inactivado, (Titus et al. (1995) Proc. Natl. Acad Sci. USA, 92:10267-10271, WO 98/44943, EP 0 716 697, EP 0 806 476). La elección del gen a inactivar es crucial debido a que condiciona la obtención de una cepa adecuadamente atenuada, es decir, que tiene una capacidad replicativa suficiente para estimular el sistema inmunitario y sin embargo limitada con el fin de evitar cualquier riesgo infeccioso, en particular en el sujeto inmunodeprimido.

Las proteínas SIR2, descubiertas originalmente en la levadura, son conocidas porque intervienen en la condensación de la cromatina por desacetilación de las histonas al nivel de ciertas regiones cromosómicas: los loci HMR y HML responsables de la conmutación de tipo sexual, las regiones sub-teloméricas y las repeticiones de ADNr en las que SIR2 previene la formación de minicírculos extra-cromosómicos mediante recombinación homóloga (Guarente et al. (1999) Nat. Genet. 23:281-5; Gartenberg et al. (2000) Curr. Opin. Microbiol. 3:132-7; Min et al. (2001) Cell 105:269-79). Otros trabajos han demostrado su implicación en los mecanismos de reparación de ADN (Tsukamoto et al. (1997) Nature 388: 900-3).

Sin embargo, el papel biológico de SIR2 no está limitado al "silencing" y a la reparación del ADN, y la función más sorprendente atribuida al SIR2 es sin duda aumentar la longevidad de los organismos que poseen una copia suplementaria de este gen. Esto se ha demostrado en la levadura y en Caenorhabditis elegans (Guarente et al. (2000) Genes Dev. 14:1021-6; Tissenbaum et al. (2001) Nature 410:227-30).

Los programas de secuenciación sistemática han permitido caracterizar otras proteínas emparentadas con SIR2 en diferentes organismos eucariotas y procariotas. Se habla desde entonces de familia proteica, que comprende las proteínas SIR2 nucleares propiamente dichas y los homólogos de SIR2 indiferentemente denominados "Hst" por "Homologue of SIR Two" o "sirtuin" (Frye et al. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 273:793-8). El significado biológico de esta diversidad de proteínas SIR2 no está todavía claramente establecido, pero diferentes trabajos muestran que todos los Hst estudiados poseen, al igual que SIR2, una actividad enzimática de tipo histona desacetilasa que es estrictamente dependiente de NAD. Esta particularidad ha permitido agrupar las proteínas SIR2 en una nueva clase de histona desacetilasa denominada de clase III en oposición a las clases I y II ya caracterizadas.

La existencia de homólogos de SIR2 que tienen unas localizaciones estrictamente citoplásmicas, y la presencia de Hst en las procariotas que no poseen histonas, supone sin embargo que estas enzimas poseen otros sustratos fisiológicos diferentes de las histonas y, por lo tanto, otras funciones biológicas. Los trabajos recientes publicados en este campo muestran, efectivamente, un número creciente de "dianas" caracterizadas de SIR2 o de sus homólogos. El SIRT1 en el ser humano y su homólogo murino son así capaces de fijarse específicamente a p53 e inactivarlo

mediante desacetilación (Vaziri et al. (2001) Cell 107:149-59; Luo et al. (2001) Cell 107:137-48). El SIRT1, de este modo, previene la entrada en apoptosis de células sometidas a un estrés. El factor de transcripción TAF168 en el ratón (Muth et al. (2001) Embo J. 20:1353-62), la proteína Alba en la arqueobacteria S. solfataricus (Bell et al. (2002) Science 296: 148-51) o, más recientemente, el proto-oncogen BCL6 en el ser humano (Bereshchenko et al. (2002) Nat. Genet. 32:606-13) son todos desacetilados por SIR2 o sus homólogos. Esta diversidad de parejas sin interrelación directa y el número de procesos biológicos en los que están implicadas denotan la importancia desempeñada por esta familia proteica en el seno de la célula.

El gen SIR2 de Leishmania major (LmSIR2) que codifica para una proteína que presenta una fuerte homología de secuencia con el SIR2 de levadura se caracterizó por primera vez por el Dr. Ali Ouaissi y su equipo en 1996 (Yahiaoui et al. (1996) Gene 169:115-8). Unos homólogos de esta proteína han sido puestos en evidencia mediante transferencia Western en todas las demás especies de Leishmania estudiadas (L. infantum, L. mexicana, L. braziliensis) así como en Trypanosoma cruzi (Zemzoumi et al. (1998) Biol. Cell. 90:239-45). Esta proteína presenta una localización citoplásmica heterogénea según el estado de desarrollo y según las especies. Se encuentra asociada a unos gránulos citoplásmicos en las formas promastigotas y presenta una localización citoplásmica difusa en la amastigota. La proteína recombinante es asimismo capaz de fijarse en la superficie de los macrófagos J774 y ser internalizada.

Para conocer el papel biológico de esta proteína en el parásito, se realizó la sobreexpresión de la proteína LmSIR2 y de su homólogo, la proteína LiSIR2, en L. infantum. Los resultados obtenidos demuestran que la expresión de estas dos proteínas aumenta la vida útil de los parásitos en fase estacionaria; estando este fenómeno correlacionado con una prevención de la entrada en apoptosis de los parásitos (Vergnes et al. (2002) Gene 296:139-50).

La presente invención tiene por objetivo proporcionar una nueva cepa de protozoos de la familia de las Trypanosomatidae, en particular del género Leishmania, de virulencia atenuada mediante la desactivación de un gen cuyo carácter de virulencia se ha demostrado nuevamente, siendo dicha cepa más eficaz que algunas cepas conocidas hoy en día para inducir una inmunidad contra las infecciones por protozoos.

La presente invención tiene asimismo por objeto la utilización de esta cepa para la preparación de medicamentos, en particular de vacunas, destinados a prevenir o tratar las enfermedades por protozoos.

La presente invención se refiere a una cepa de protozoos de la especie Leishmania infantum cuya virulencia es inferior a la de la cepa salvaje correspondiente, caracterizada porque una sola copia del gen SIR2 presente en el genoma de dicha cepa está inactivada.

La virulencia de una cepa de protozoos se puede medir mediante métodos bien conocidos por el experto en la materia y en particular tal como se describe en los ejemplos 2 y 3 siguientes. En particular, es posible medir la carga parasitaria a lo largo del tiempo de un animal modelo, tal como un ratón, infectado por una cepa de protozoos de la cual se desea evaluar la virulencia y compararla con la de un animal modelo similar infectado por la cepa salvaje correspondiente. La cepa de la cual se desea evaluar la virulencia se denominará de virulencia inferior, o atenuada, si la carga parasitaria de esta cepa disminuye más rápidamente a lo largo del tiempo que la de la cepa salvaje correspondiente.

La desactivación de un gen se puede realizar según diferentes métodos bien conocidos por el experto en la materia, y en particular tal como se describe en el ejemplo 1 de la presente descripción. En particular, es posible sustituir, mediante recombinación homóloga, la secuencia cromosómica de un gen dado por una secuencia idéntica en la que se ha insertado la secuencia de un gen de resistencia a un fármaco de selección, tal como un antibiótico. Alternativamente, es posible sustituir la totalidad o parte de la secuencia cromosómica de un gen dado, por ejemplo la secuencia de un gen de resistencia a un fármaco de selección, tal como un antibiótico, mediante recombinación homóloga en los extremos.

La identificación de un gen SIR2 para una especie de la familia de las Trypanosomalidae, para la cual no se ha identificado aún, se puede realizar según unas técnicas bien conocidas por el experto en la materia, a partir de las secuencias ya conocidas de SIR2 de especies diferentes, y en particular las de Leishmania infantum (GenBank AF487351, SEC ID nº 3), Leishmania amazonensis (GenBank AF534109, SEC ID nº 5), Leishmania major (GenBank L40331, SEC ID nº 4) y Trypanosoma brucei (GenBank AF102869, SEC ID nº 6). Si se dispone de la secuencia completa o parcial del genoma de la cepa para la cual se desea identificar el gen SIR2, es posible utilizar un programa de comparación de secuencia de tipo BLAST (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410) que permita detectar las secuencias que presentan una similitud de secuencia suficiente con las secuencias ya conocidas de SIR2. Alternativamente, tal como se describe en el ejemplo 1 de la presente descripción, también es posible fabricar unas sondas, por ejemplo mediante PCR, a partir de las secuencias ya conocidas de SIR2, marcarlas con la ayuda de un marcador fluorescente o radioactivo por ejemplo, y proceder a un cribado, por ejemplo según el método de Southern, de un banco de ADN complementario o cromosómico de una cepa para la cual se desea identificar un gen SIR2.

El genoma de los protozoos es diploide, es decir que cada gen está presente en dos copias respectivamente

presentes en cada uno de los cromosomas homólogos.

La utilización de dicha cepa es ventajosa en la medida en la que la desactivación de una sola copia del gen SIR2 es suficiente para inducir una disminución de la virulencia de la cepa para la cual se ha inactivado este gen.

Una cepa protozoaria pertenece al género Trypanosoma o al género Leishmania.

Una cepa protozoaria pertenece al género Leishmania y en particular a las especies seleccionadas de entre el grupo que comprende L. donovani, L. major, L. tropica, L. mexicana, L. infantum, L. amazonensis y L. braziliensis.

La presente invención se refiere asimismo a una composición inmunógena caracterizada porque comprende una cepa tal como se ha definido anteriormente.

La presente invención se refiere asimismo a una composición farmacéutica, en particular vacunal, que comprende, a título de sustancia activa, una cepa tal como se ha definido anteriormente en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Según un modo de realización particular, dicha composición farmacéutica, en particular vacunal, comprende además un adyuvante, tal como una cepa de Mycobacterium vaccae o BCG, de alúmina, de lípido A monofosforilado o interleucina 12.

La utilización de adyuvante es bien conocida por el experto en la materia. Los compuestos adyuvantes permiten en particular aumentar la respuesta inmunitaria del organismo al que se administra una composición inmunógena, farmacéutica o vacunal, frente al compuesto inmunógeno comprendido en dicha composición.

La Mycobacterium vaccae o la BCG son unos agentes bacterianos vivos, bien conocidos por el experto en la materia, susceptibles de inducir una activación del sistema inmunitario y mejorar la respuesta inmunitaria frente a los protozoos de la invención.

Los demás adyuvantes mencionados anteriormente están descritos en particular en «Report on the fourth TDR/IDRI Meeting on Second-Generation Vaccines against Leishmaniasis» de Dumonteil et al., disponible en la OMS y en Hadman (2002) Clin. Microbiol. Rev. 14:229-43.

Según otro modo de realización particular, dicha composición farmacéutica, en particular vacunal, conviene para la administración de una dosis unitaria de aproximadamente 5.104 a aproximadamente 5.107 protozoos por kg.

La expresión “por kg” se refiere a la masa corporal del sujeto a tratar.

Dicha composición farmacéutica, en particular vacunal, comprende, a título de sustancia activa, una cepa de Leishmania infantum para la cual se ha inactivado una copia del gen SIR2, tal como se ha definido anteriormente.

Según un modo de realización preferido, dicha composición farmacéutica, en particular vacunal, comprende asimismo uno o varios compuestos que se pueden utilizar para la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades relacionadas con una infección por un protozoo, tales como las enfermedades por tripanosomas y las leishmaniasis, tales como:

-: la miltefosina, los antimoniales, la anfotericina B, el benznidazol, el nifurtimox, la pentamidina, y sus derivados, los derivados arsénicos, el melarsopol y la difluorometilornitina,

-: unos protozoos, en particular del género Trypanosoma o Leishmania, inactivados o de virulencia atenuada por desactivación de un gen diferente de SIR2,

-: unos antígenos de protozoos, tales como las proteínas gp46, gp63, LACK, TSA, STI1, Hsp80, SLA, FPA, 1 G6, 4H6, GBP, CPA, CPB, LeIF, A2 o el lipofosfoglicano, o

-: unas secuencias de ácidos nucleicos que codifican para dichos antígenos proteicos de protozoos.

La enfermedades por tripanosomas corresponden en particular a la enfermedad del sueño (T. brucei) y a la enfermedad de Chagas (T. cruzi).

Las leishmaniasis pueden ser, en particular, provocadas por L. donovani, L. major, L. tropica, L. mexicana, L. infantum, L. amazonensis o L. braziliensis, y se manifiestan en cuatro formas principales: la leishmaniasis visceral (kala azar), la leishmaniasis cutánea, la leishmaniasis muco-cutánea y la leishmaniasis cutánea difusa.

Ventajosamente, la adición de uno o varios de los compuestos mencionados anteriormente permite activar el sistema inmunitario del organismo al que se ha administrado dicha composición de manera sinérgica con las cepas

de protozoos de la invención.

Los protozoos denominados inactivados corresponden a unos protozoos muertos en particular por una autoclave.

Los protozoos denominados de virulencia atenuada mediante desactivación de un gen diferente de SIR2, corresponden en particular a unos protozoos, en particular de la Leishmania, para los cuales se han inactivado uno de los genes DHFR-TS, CPA, CPB, A2, o TR.

Los antígenos de protozoos mencionados anteriormente corresponden en particular a unos antígenos de Leishmania y están descritos en particular en «Report on the fourth TDRI/DRI Meeting on Second-Generation Vaccines against Leishmaniasis» de Dumonteil et al., disponible en la OMS, y en Handman (2002) Clin. Microbiol. Rev. 14:229-43.

La invención se refiere asimismo a un producto que comprende:

•: por lo menos una cepa tal como se ha definido anteriormente, y

•: por lo menos un compuesto que se puede utilizar para la prevención o el tratamiento de las enfermedades relacionadas con una infección por un protozoo, tales como las enfermedades por tripanosomas y las leishmaniasis, tales como:

-: unos antígenos de protozoos, tales como las proteínas gp46, gp63, LACK, TSA, STI1, Hsp80, SLA, FPA, 1G6, 4H6, GBP, CPA, CPB, LeIF, A2 o el lipofosfoglicano, o

como producto de combinación para una utilización simultánea, separada o espaciada en el tiempo para la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades relacionadas con una infección por un protozoo, tales como las enfermedades por tripanosomas y las leishmaniasis.

La invención se refiere asimismo a la utilización de una cepa tal como se ha definido anteriormente, para la preparación de un medicamento, en particular una vacuna, destinado a la prevención y/o el tratamiento de las leishmaniasis.

La invención se refiere asimismo a la utilización mencionada anteriormente de una cepa de Leishmania infantum para la cual se ha inactivado una copia del gen SIR2, tal como se ha definido anteriormente, para la preparación de un medicamento, en particular una vacuna, destinado a la prevención y/o el tratamiento de las leishmaniasis, en particular de las leishmaniasis por Leishmania infantum.

Por otra parte, un modo de realización particular de la invención prevé asimismo la utilización de una cepa tal como se ha definido anteriormente, estando dicha cepa además muerta, en particular mediante tratamiento térmico o químico, con la ayuda de glutaraldehído por ejemplo, para la preparación de medicamentos o vacunas, en particular en el ámbito de la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades relacionadas con una infección por un protozoo, tales como las enfermedades por tripanosomas y las leishmaniasis.

La invención se refiere asimismo a las composiciones farmacéuticas que comprenden dichas cepas muertas, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Descripción de las figuras

Figura 1A, figura 1B

Las figuras 1A y 1B representan los locus de los alelos salvajes (LiSIR2)(figura 1A) o inactivados mediante los genes de resistencia a la neomicina (LiSIR2::NEO) (figura 1B). Los sitios de restricción están representados por H: Hind III,

P: Pst I, C : Cla I, S: Sac I. Las flechas indican el tamaño de los fragmentos de restricción obtenidos.

Figura 2A, figura 2B

La figura 2A representa un análisis según el método de transferencia de Southern del ADN genómico que procede de clones salvajes de L. infantum digerido por Pst I (pista 1), de clones para los cuales se ha inactivado una copia del gen LiSIR2 (pistas 2 y 3) e hibridado con la sonda LiSIR2.

La figura 2B representa un análisis mediante transferencia Southern del ADN genómico de clones salvajes de L. infantum digerido por Sac I (pista 1), de clones para los cuales se ha inactivado una copia del gen LiSIR2 (pistas 2 y 3), e hibridado con la sonda NEO.

5 Figura 3A y figura 3B

Las figuras 3A y 3B representan las cinéticas de crecimiento de los parásitos en formas promastigotas (figura 3A) y amastigotas (figura 3B) de los diferentes clones: salvaje (cuadrados negros) y LiSIR2/LiSIR2::NEO (círculos y

10 triángulos blancos) inoculados con 2.106 parásitos/ml. El eje de las abscisas representa el tiempo (en días) y el eje de las ordenadas el número de parásitos por ml (a multiplicar por log 104 para la figura 3A y por 104 para la figura 3B).

Figura 4A y figura 4B

15 Las figuras 4A y 4B representan el efecto del anticuerpo monoclonal IIIG4 dirigido contra la proteína SIR2 de L. major sobre el crecimiento de los amastigotas de L. infantum salvajes (figura 4A) o para los cuales se ha inactivado una copia del gen LiSIR2 (figura 4B). En la figura 4A la curva representada por los triángulos negros representa el efecto de IIIG4 diluido al 1/20 y la curva representada por los cuadrados negros el efecto del anticuerpo de control

20 IIIB9F10 dirigido contra una proteína flagelar de T. cruzi (la Tc24). En la figura 4B, las curvas representadas respectivamente por los círculos blancos, los cuadrados blancos, los círculos negros y los cuadrados negros representan el efecto de IIIG4 diluido al 1/20, de IIIB9F10, de IIIG4 diluido al 1/40 y de un control.

Figuras 5A y 5B

25 La figura 5A representa la variación con respecto a los parásitos salvajes (en porcentaje, eje de las ordenadas) de la cantidad de parásitos en fase G0/G1 (1), en fase S (2) o en fase G2/M (3) para unos parásitos que sobreexpresan la proteína SIR2 de L. major (columna blanca), o que tienen una copia inactivada del gen SIR2 (LiSIR2/LiSIR2::NEO) (columna negra).

30 La figura 5B representa el porcentaje de parásitos en apoptosis para unos parásitos salvajes (1), que tienen una copia inactivada del gen SIR2 (LiSIR2/LiSIR2::NEO) (2) o que sobreexpresa la proteína SIR2 de L. major (3), en presencia de Sirtinol con 25 μg/l (inhibidor de SIR2) y de YOPRO-1 (marcador de apoptosis, Idzioreck et al. (1995) J. Immunol. Methods 185:249-258).

35 Figuras 6A y 6B

La figura 6A representa la reducción de la incorporación de uracilo tritiado (eje de las ordenadas, en porcentaje) en unos macrófagos derivados de la línea TPH1 infectados por unas cepas mutantes independientes de tipo 40 LiSIR2/LiSIR2::NEO (columnas blancas y negras) con respecto a unos macrófagos infectados por una cepa salvaje.

La figura 6B representa la carga parasitaria en el bazo de ratones BALB/c infectados (eje de las ordenadas, log del número de parásitos por gramo), mediante una cepa de L. infantum salvaje (rombos negros), o bien mediante una cepa de L. infantum para la cual se ha inactivado una copia del gen SIR2 (LiSIR2+/- cuadrados blancos), en función

45 del tiempo (eje de las abscisas, en semanas), se observa una reducción progresiva de la carga parasitaria en los ratones infectados por los clones mutantes, y no se ha podido detectar ningún parásito vivo 6 semanas después de la infección.

Figura 7

50 La figura 7 representa la carga parasitaria en el bazo de ratones BALB/c infectados (eje de las ordenadas, log del número de parásitos por gramo) mediante una cepa de L. infantum salvaje (barra negra), o bien mediante una cepa de L. infantum para la cual se ha inactivado una copia del gen SIR2 (LiSIR2+/- barra blanca), y después reinfectados después de 6 semanas mediante una cepa de L. infantum salvaje. La carga parasitaria se determina 6 semanas

55 después de la reinfección. Se observa una reducción significativa de la carga parasitaria en los ratones que han sido primo-infectados por los clones mutantes.

Ejemplos

60 La presente invención se desprende de la demostración por parte de los inventores del carácter virulento del gen SIR1 en los protozoos de la familia de las Trypanosomatidae.

Ejemplo 1

65 Obtención de una cepa de Leishmania infantum para la cual el gen SIR2 está inactivado

1. Desactivación del gen SIR2 de L. infantum (LiSIR2)

Se inactivó el gen único LiSIR2 en el parásito mediante recombinación homóloga.

Las cepas promastigotas de L. infantum (clon MHOM/67/ITMAP-263) y los clones mutantes que se derivan de las mismas se obtuvieron mediante dilución límite y cultivo a 26ºC en un medio SDM-79 (Brun et al. (1979) Acta Trop.

36: 289-292) suplementado con 10% de suero de ternero fetal inactivado a 56ºC, 100 U/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina, y 10 μg/ml de neomicina (G418) durante un periodo de selección de los clones recombinantes. Las poblaciones clonales de amastigotes axénicos se han mantenido a 36 +/- 1ºC en presencia de 5% de CO2 en un medio acelular MAA/20 (Sereno et al. (1997) Antimicrob. Agents Chemother. 41:972-976).

Se ha cribado un banco de ADN genómico de L. infantum con la sonda que tiene la secuencia del gen SIR2 de L. major con el fin de aislar un gran fragmento genómico que contiene el gen LiSIR2 y sus regiones flanqueantes.

Brevemente, se amplificó el gen SIR2 de L. major (Yahiaoui et al. (1996) Gene 169:115-8) mediante PCR utilizando dos cebadores específicos LmSIR2-A (5'-gaattcGATATGACAGGGTCTCCG-3') (SEC ID nº 1) y LmSIR2-B (5'ctcgagCAGTCACCATGTTGGCAG-3') (SEC ID nº 2). El fragmento amplificado de 1200 pb obtenido se clonó en el vector pCR2.1 utilizando el kit de clonación comercial "TA cloning kit" (Invitrogen). El fragmento radiomarcado con α(32P)dCTP se utilizó para cribar el banco genómico de L. infantum utilizando unos protocolos estándares (Yahiaoui et al. (1996) Gene 169:115-8) bien conocidos por el experto en la materia. Se analizaron unos clones positivos mediante unas enzimas de restricción y se analizaron según el método de transferencia de Southern utilizando la misma sonda radiomarcada. Un fragmento de 6 kb generado por la enzima Hind III que tiene el gen LiSIR2 se subclonó en el plásmido pUC18 (designación: pUC-SIR) y se secuenció. La determinación de los cuadros de lectura permitió identificar una secuencia nucleotídica de 1119 pb (SEC ID nº 3) que codifica una proteína de 373 aa que muestra 93% de similitud con el gen LmSIR2 de L. major. Esta secuencia se sometió a Genbank bajo el código AF487351. Una representación esquemática del alelo salvaje que tiene el fragmento de 6 kb se da en la figura 1A. Se ha abierto el plásmido pUC-SIR mediante la enzima Cla I que tiene un sitio único en el gen LiSIR2 y se ha tratado sucesivamente por la nucleasa de judía mungo y la fosfatasa con el fin de generar unos extremos francos desfosforilados. El casete que contiene el gen que codifica para la neomicina fosfotransferasa (NEO) utilizado para la construcción del vector para la desactivación se derivó de la construcción pSPYneo (Papadopoulou et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:7310-7315). El casete NEO bajo el control de las regiones ricas en bases pirimídicas se aisló mediante una digestión por Bam HI-Bgl II y tratado por la polimerasa de Klenow para generar extremos francos. El gen de resistencia a la neomicina se integró entonces en el sitio único Cla I presente en la secuencia que codifica LiSIR2 (figura 1B). La construcción linealizada por Hind III se ha electroporado después en los promastigotes de la fase de crecimiento logarítmico del clon salvaje L. infantum MON1 (clon: MHOM/67/ITMAP-263). Después de la selección, los parásitos obtenidos se clonaron mediante dilución límite y se caracterizaron.

Brevemente, se transfectaron los promastigotes mediante electroporación con 1 μg de ADN linealizado purificado sobre gel de agarosa tal como se ha descrito anteriormente (450 V.cm-1 450 μF) (Vergnes et al. (2002) Gene 296:139-50). En un primer momento, los promastogites se incubaron en 5 ml de medio SDM-79 sin adición de antibiótico de selección durante 24h. Después de esta etapa, se añadió el antibiótico neomicina (G418) en el medio de cultivo a razón de 10 μg/ml durante dos semanas. Los parásitos obtenidos se clonaron mediante el método de dilución límite en presencia de 10 μg/ml de G418.

2.: Caracterización molecular de los mutantes LiSIR2+/-

La desactivación de un alelo del gen LiSIR2 se realizó integrando la construcción que contiene el gen de resistencia a la neomicina (mutante LiSIR2+/-o LiSIR2/LiSIR2::NEO). La transferencia Southern revela en todos los clones recombinantes la presencia de un alelo salvaje de 4 kb y dos fragmentos suplementarios de 2,8 kb y 2,5 kb que corresponden al alelo LiSIR2::NEO, de acuerdo con el perfil de restricción obtenido por Pst I (figuras 1A, 1B y 2A).

3.: Caracterización fenotípica de los parásitos mutantes LiSIR2+/

a. LiSIR2 es indispensable para la multiplicación de las formas amastigotas axénicas

Para estudiar el efecto de la desactivación de un alelo del gen LiSIR2 sobre la proliferación de los parásitos en cultivo axénico, los inventores realizaron unas cinéticas de crecimiento en los dos estados parasitarios utilizando el yoduro de propidio como marcador de viabilidad. Las curvas de crecimiento del clon salvaje y de los mutantes se realizaron inoculando el medio de cultivo SDM-79 o MAA/20 con respectivamente 2.106 ó 4.106 promastigotes o amastigotes; los recuentos se realizaron a intervalos de 24h, tal como se ha descrito anteriormente (Vergnes et al. (2002) Gene 296: 139-50). La desactivación de un alelo del gen LiSIR2 no afecta el crecimiento de los parásitos en forma promastigota (figura 3A). Se observa, por el contrario, en estos mismos parásitos en forma amastigota, una fuerte disminución de su capacidad para proliferar en cultivo con respecto a los parásitos salvajes (figura 3B).

Para confirmar la implicación directa del nivel de síntesis de LiSIR2 en la capacidad de proliferación de los parásitos

en forma amastigota, se realizaron unas cinéticas de crecimiento de amastigotes salvajes (figura 4A) o que han perdido una copia del gen LiSIR2 (figura 4B) en presencia del anticuerpo monoclonal IIIG4 (Vergnes et al. (2002) Gene 296:139-50) dirigido contra la proteína LmSIR2. Se utilizó como control un anticuerpo monoclonal IIIB9F10 (Ouaissi et al. (1992) Biol. Cell. 75:11-17) del mismo isotipo dirigido contra la proteína Tc24 de Trypanosoma cruzi. La adición del anticuerpo IIIG4 a la dilución 1/20 ralentiza considerablemente el crecimiento de los parásitos salvajes, con la aparición de una fase de latencia muy prolongada. Los mismos parásitos en presencia de IIIB9F10 a una concentración idéntica tienen una cinética de crecimiento comparable a la del clon salvaje (figura 4A). El mismo experimento realizado con un clon parasitario desprovisto de una copia del gen LiSIR2 (clon LiSIR2+/-) muestra que el anticuerpo IIIG4 utilizado al 1/20 bloquea totalmente la proliferación y mata los parásitos. El mismo anticuerpo diluido al 1/40 o el IIIB9F10 diluido al 1/20 no modifican la cinética de crecimiento de los amastigotes con respecto al clon control LiSIR2+/-. La acción de IIIG4 parece ser por lo tanto dosis-dependiente, lo cual sugiere que la proteína LiSIR2 sea indispensable a los amastigotes para multiplicarse.

b. La desactivación de un alelo del gen LiSIR2 bloquea los parásitos en fase G0/G1 del ciclo celular

Para conocer el modo de acción de LiSIR2 en las formas amastigotas, se realizaron unos estudios del ciclo celular sobre los parásitos mutantes que tienen diferentes niveles de expresión de la proteína LiSIR2 con respecto a los parásitos salvajes. Los clones inactivados LiSIR2/LiSIR2::NEO no poseen un fuerte porcentaje de células bloqueadas en fase G0/G1 del ciclo (figura 5A). En cambio, se observa un enriquecimiento de las células en fase G2/M en los parásitos que sobreexpresan la proteína LmSIR2 (clon pTEX-LmSIR2).

Se realizaron otros experimentos utilizando el Sirtinol (Calbiochem), que es un inhibidor específico de las proteínas SIR2. Se observa a una concentración de 25 μg/ml un enriquecimiento de los parásitos en fase G0/G1 con la aparición en el clon 2 de un pico pre-G0/G1 que corresponde a la fragmentación del ADN genómico observada durante la fase final de la apoptosis. Los clones salvajes y sobreexpresantes presentan unos fenotipos respectivamente intermedios. La utilización de YOPRO-1, un marcador de apoptosis (Idzioreck et al. (1995) J. Immunol. Methods 185: 249-258), sobre estos mismos parásitos en presencia de Sirtinol muestra que el nivel de expresión de la proteína LiSIR2 es directamente proporcional al porcentaje de apoptosis observado en los parásitos (figura 5B).

Ejemplo 2

Virulencia atenuada de los parásitos mutantes in vitro

La virulencia de varios clones que han perdido un alelo del gen LiSIR2 se determinó in vitro comparando el nivel de incorporación de Uracile 3H entre unos macrófagos infectados por unos parásitos salvajes e infectados por las cepas mutantes. La infección de los macrófagos derivados de la línea THP1 por unos amastigotes se realizó de forma rutinaria tal como se ha descrito anteriormente (Sereno et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:3097-3102). Se observa en todos los clones analizados LiSIR2/LiSIR2::NEO una reducción significativa de aproximadamente 50% del nivel de incorporación con respecto a los parásitos salvajes (figura 6A).

Ejemplo 3

Virulencia atenuada de los parásitos mutantes in vivo

La virulencia de estos parásitos se determinó asimismo in vivo midiendo la carga parasitaria en el bazo de ratones BALB/c infectados por el clon L. infantum salvaje (WT) o bien por un clon desprovisto de una copia del gen LiSIR2 (LSIR2+/-).

Se infectaron unos ratones machos de 7 semanas de edad (Harlan Iberica, España) por vía intraperitoneal (i.p.) con 108 promastigotes del clon mutante en el que se inactivó una copia del gen LiSIR2 (LiSIR2+/-), como control, y se infectaron unos ratones de misma edad y sexo por vía intraperitoneal (i.p.) con 108 promastigotes del clon salvaje. Los bazos extraídos de los dos grupos de ratones se homogeneizaron y se sometieron a una dilución seriada (1 a 4.10-6) en placas de microtitulación de 96 pocillos. Después de 15 días de incubación a 26ºC, se registró la presencia o ausencia de promastigotes en los pocillos de cultivo. El título es la última dilución que permite objetivar un parásito por pocillo. El número de parásitos por gramo de tejido (carga parasitaria) se calcula como sigue:

Carga parasitaria = (media geométrica de la inversa del título de cada pocillo por triplicado/peso del homogenado de bazo) x la inversa de la fracción del homogenado de bazo inoculado en el primer pocillo de la placa de cultivo.

A pesar de que los clones LiSIR2+/- sean infecciosos (carga parasitaria sustancialmente idéntica en los dos casos después de dos semanas de infección), se observa una reducción progresiva de la carga parasitaria en los ratones infectados por los clones mutantes, y no se ha podido detectar ningún parásito vivo 6 semanas después de la infección (figura 6B), lo que hace de estos clones unas cepas particularmente adaptadas para la preparación de una vacuna viva atenuada.

Ejemplo 4

Vacunación de ratones mediante los parásitos mutantes

Se utilizaron los clones LiSIR2+/- con el fin de proceder a ensayos de vacunación de ratones BALB/c.

Se infectó un grupo de ratones machos de 7 semanas de edad (Harlan Iberica, España) (n = 3) por vía intraperitoneal con 108 promastigotes del clon mutante, en el que se desactivó una copia del gen LiSIR2 (LiSIR2+/-). Como control, se infectó otro grupo de ratones (n = 4) de mismo sexo y edad con 108 promastigotes del clon salvaje.

Al cabo de 6 semanas, los animales de cada grupo recibieron una infección de prueba de 108 promastigotes del clon salvaje.

Después, 6 semanas más tarde, se midió la carga parasitaria tal como se ha descrito en el ejemplo 3.

Los resultados obtenidos (figura 7) indican que la carga parasitaria media es de aproximadamente 20.000 parásitos por gramo de tejido para el grupo de ratones que han recibido una inyección del clon LiSIR2+/- y de aproximadamente 440.000.000 parásitos por gramo de tejido para el otro grupo. Esto confirma el potencial de vacunación de las cepas LiSIR2+/-de la invención.

Por otra parte, se estudió asimismo el efecto protector inducido por unos parásitos LiSIR2+/- inactivados, es decir muertos, por el glutaraldehído.

Por último, se realizaron asimismo unos experimentos de vacunación similares a los descritos anteriormente, implicando un número más grande de ratones (n = 12), o bien con los clones mutados, o bien con los clones mutados inactivados, con el fin de medir diferentes parámetros después de la infección, tal como la carga parasitaria, la producción de anticuerpos antiparásitos (clase y sub-clase), los niveles de proliferación celulares, así como el perfil de secreción de las citoquinas.

Listado de secuencias

<110> INSTITUT POUR LA RECHERCHE ET LE DEVELOPPEMENT

<120> CEPAS DE PROTOZOO DE VIRULENCIA ATENUADA Y SU UTILIZACIÓN

<130> WOB 03 BZ IRD LEIS

<160> 6

<170> PatentIn versión 3.1

<210> 1

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador PCR

<400> 1 gaattcgata tgacagggtc tccg 24

<210> 2

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador PCR

<400> 2 ctcgagcagt caccatgttg gcag 24

<210> 3

<211> 1122

<212> ADN

<213> Leishmania infantum

<400>

<210> 4 10 <211> 1146

<212> ADN

<213> Leishmania major

<400> 15

<210> 5

<211> 775

<212> ADN

<213> Leishmania amazonensis

<400> 5

<210> 6

<211> 1056

<212> ADN 15 <213> Trypanosoma brucei

<400> 6

Claims

REIVINDICACIONES

1. Cepa de protozoo de la especie Leishmania infantum cuya virulencia es inferior a la de la cepa salvaje

correspondiente, caracterizada porque se inactiva una sola copia del gen SIR2 presente en el genoma de dicha 5 cepa.
2. Composición inmunógena, caracterizada porque comprende una cepa según la reivindicación 1.
3. Composición farmacéutica, en particular vacunal, que comprende a título de sustancia activa una cepa según la 10 reivindicación 1 en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
4. Composición farmacéutica, en particular vacunal, según la reivindicación 3, que comprende además por lo menos un adyuvante, tal como una cepa de Mycobacterium vaccae o BCG, alúmina, lípido A monofosforilado, o interleucina
12. 15
5.

Composición farmacéutica, en particular vacunal, según la reivindicación 3 ó 4, que conviene para la administración de una dosis unitaria de aproximadamente 5.104 a aproximadamente 5.107 protozoos por kg.
6.

Composición farmacéutica, en particular vacunal, según una de las reivindicaciones 3 a 5, que comprende

20 asimismo uno o varios compuestos que se pueden utilizar para la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades relacionadas con una infección por un protozoo, tales como las enfermedades por tripanosomas y las leishmaniasis, tales como:

-

la miltefosina, los antimoniales, la anfotericina B, el benznidazol, el nifurtimox, la pentamidina y sus derivados, los 25 derivados arsénicos, el melarsopol y la difluorometilornitina,

-

unos protozoos, en particular del género Trypanosoma o Leishmania, inactivados o de virulencia atenuada por desactivación de un gen diferente de SIR2,

30 - unos antígenos de protozoos, tales como las proteínas gp46, gp63, LACK, TSA, STI1, Hsp80, SLA, FPA, 1G6, 4H6, GBP, CPA, CPB, LeIF, A2 o el lipofosfoglicano, o

-

unas secuencias de ácidos nucleicos que codifican para dichos antígenos proteicos de protozoos.

35 7. Producto que comprende:

•

por lo menos una cepa según la reivindicación 1, y

•

por lo menos una composición que se puede utilizar para la prevención o el tratamiento de las enfermedades

40 relacionadas con una infección por un protozoo, tales como las enfermedades por tripanosomas y las leishmaniasis, tales como:

-

la miltefosina, los antimoniales, la anfotericina B, el benznidazol, el nifurtimox, la pentamidina y sus derivados,

los derivados arsénicos, el melarsopol y la difluorometilornitina, 45

-

unos protozoos, en particular del género Trypanosoma o Leishmania, inactivados o de virulencia atenuada por desactivación de un gen diferente de SIR2,

-

unos antígenos de protozoos, tales como las proteínas gp46, gp63, LACK, TSA, STI1, Hsp80, SLA, FPA, 50 1G6, 4H6, GBP, CPA, CPB, LeIF, A2 o el lipofosfoglicano, o

-

unas secuencias de ácidos nucleicos que codifican para dichos antígenos proteicos de protozoos,

como producto de combinación para una utilización simultánea, separada o espaciada en el tiempo para la 55 prevención y/o el tratamiento de las enfermedades relacionadas con una infección por un protozoo, tales como las enfermedades por tripanosomas y las leishmaniasis.
8. Utilización de una cepa según la reivindicación 1, para la preparación de un medicamento, en particular una vacuna, destinado a la prevención y/o el tratamiento de las leishmaniasis.