ES2394013T3

ES2394013T3 - Microvesículas derivadas de levadura recombinante con actividades hemostáticas y usos de las mismas

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Publication number: ES2394013T3
Application number: ES07858230T
Authority: ES
Inventors: Javier PEDREÑO EGEA; Luis Caveda Catasús; Juan Ramón Rodríguez Fernández - Alba
Original assignee: Thrombotargets Europe SL
Current assignee: Thrombotargets Europe SL
Priority date: 2006-12-29
Filing date: 2007-12-28
Publication date: 2013-01-04
Anticipated expiration: 2027-12-28
Also published as: RU2492184C2; MX2009007085A; RU2009129143A; AU2007341252A1; BRPI0720879A2; JP2010514433A; US20100047335A1; JP4813603B2; WO2008080989A1; CN102007144A; AU2007341252B2; EP2118134A1; CN102007144B; BRPI0720879B1; PL2118134T3; CA2673996C; EP2118134B1; EP1939218A1; CA2673996A1; AR064720A1

Abstract

Una microvesícula derivada de levadura portadora de factor tisular (FT) que tiene actividad procoagulante que comprende (i) una membrana de levadura y (ii) una proteína factor tisular (FT) o una variante de la misma con actividad procoagulante, en la que una porción de dicha proteína factor tisular (FT) o un fragmento de la misma con actividad procoagulante está integrada en dicha membrana, en donde dicha microvesícula es obtenible mediante un procedimiento que comprende: (a) someter a fermentación un cultivo de células recombinantes de levadura que expresan la proteína FT o un fragmento de la misma con actividad procoagulante en condiciones que permiten la expresión de dicha proteína FT, o fragmento de la misma con actividad procoagulante; (b) sedimentar el producto que resulta de la etapa a) de fermentación, para obtener un producto de fermentación; (c) someter dicho producto de fermentación de la etapa b) a homogeneización, para obtener un homogeneizado de fermentación; y (d) someter dicho homogeneizado de fermentación de la etapa c) a separación, para obtener un pellet y un extracto de levadura clarificado (CYE) que contiene dicha microvesícula derivada de levadura portadora de FT con actividad procoagulante; (e) recoger dicho extracto de levadura clarificado (CYE) que contiene dicha microvesícula derivada de levadura portadora de FT con actividad procoagulante y, (f) aislar o purificar dichas microvesículas derivadas de levadura portadoras de FT con actividad procoagulante.

Description

Microvesículas derivadas de levadura recombinante con actividades hemostáticas y usos de las mismas

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere, en general, al tratamiento de hemorragias en un sujeto con un agente procoagulante. Más específicamente, la invención se refiere a microvesículas derivadas de levadura portadoras de factor tisular que comprenden una membrana de levadura y una proteína factor tisular, o un fragmento de la misma,

o una proteína factor tisular o un fragmento de la misma fusionada a otro péptido como proteína de fusión con actividad procoagulante y a sus aplicaciones como agente procoagulante útil en el tratamiento de hemorragias en un sujeto así como en la promoción de la angiogénesis y la migración celular. La invención además se refiere a procedimientos para la producción de dicha microvesícula derivada de levadura portadora de factor tisular.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La hemostasis es el mecanismo mediante el cual los seres vivos responden a una hemorragia e implica la participación de dos procesos que funcionan inmediatamente después de una lesión y que permanecen activos durante un largo periodo de tiempo. El primero de ellos se conoce como hemostasis primaria y se caracteriza por la aparición de vasoconstricción en el lugar de la lesión vascular y por la formación de agregados plaquetarios. El segundo se conoce como hemostasis secundaria y es la fase en la cual se forma el coágulo de fibrina por la acción de los diferentes enzimas proteolíticos de la cascada de coagulación.

En la segunda fase del proceso de coagulación sanguínea participan varios cofactores y enzimas proteolíticos, todos ellos conocidos como factores de coagulación, y consiste en varias fases que terminan con la formación de fibrina a partir de la hidrólisis del fibrinógeno gracias a la acción de la trombina. La trombina se forma previamente por la hidrólisis proteolítica de un apoenzima, la protrombina. El factor X de coagulación activado (FXa) lleva a cabo la proteólisis, uniéndose a la superficie de las plaquetas activadas y, sólo en presencia de su cofactor, el factor de coagulación V activado (FVa), y de iones de calcio, es capaz de hidrolizar la protrombina. La activación del factor X de coagulación (FX) se puede producir por dos vías separadas, la vía intrínseca y la vía extrínseca.

La vía intrínseca consiste en una serie de reacciones en las que cada proenzima se hidroliza produciendo su forma proteasa activa. En cada etapa, el enzima proteolítico recién formado catalizará la activación de la siguiente proenzima para producir sucesivamente la forma activa.

En la vía extrínseca de coagulación sanguínea, el factor tisular (FT), expuesto sobre las células adventicias en el lugar de la lesión, se une al factor VII de coagulación/factor VII de coagulación activado (FVII/FVIIa) circulante para formar el complejo FT::FVIIa y, en presencia de calcio, actuar como sustrato de modo que tenga lugar la activación del FX. Actualmente, la vía extrínseca se considera la más importante en la coagulación sanguínea y se acepta que en el caso de una hemorragia producida por una lesión vascular, la coagulación se desencadene debido a la activación de la vía extrínseca, lo que supone la interacción del FT con su ligando, FVII/FVIIa.

El FT consiste en un componente proteico (denominado anteriormente apoproteína-III del factor tisular) y un fosfolípido. El FT se une específicamente al FVII/FVIIa y tiene una función importante en la vía extrínseca de coagulación sanguínea. Las funciones fisiológicas asignadas al FT son bien conocidas, por un lado, es un receptor específico del FVIIa y, una vez formado el complejo FT::FVIIa, actúa como sustrato para que tenga lugar de este modo la activación del FX. De hecho, después de una lesión vascular, el FT, que normalmente está secuestrado en la superficie de las células adventicias que rodean externamente a los vasos sanguíneos, se pone en contacto e interacciona con su ligando, el FVII presente en la sangre, para formar el complejo FT::FVII. Una vez formado este complejo, tiene lugar la autoactivación del FVII, produciendo su forma activa (FVIIa).

La glucosilación es un proceso específico del sitio dirigido por enzimas en el que se añaden sacáridos a lípidos y a proteínas. Se cree que este proceso está implicado en la estabilidad, plegamiento y transporte, aunque no se ha descrito ninguna evidencia de su función real para FT.

Se ha aceptado en general que el FT es el elemento principal responsable de la rapidez con la que se inicia la coagulación. Para que se inicie la coagulación es absolutamente necesario que el FX esté activado y comience la hidrólisis de la protrombina. La fuente de este FXa se ha atribuido principalmente a la interacción del FVIIa con su receptor, el FT.

Se ha descrito la purificación del FT a partir de diversos tejidos como: cerebro humano, cerebro bovino, placenta humana, cerebro ovino y pulmón. Está ampliamente aceptado que aunque existen diferencias en cuanto a la estructura de la proteína FT entre especies, no existen diferencias funcionales cuando se mida mediante ensayos de coagulación in vitro.

Está ampliamente aceptado que para mostrar actividad biológica, el FT debe estar asociado con fosfolípidos in vitro. Se ha demostrado que la eliminación del componente fosfolipídico del FT, por ejemplo, mediante el uso de una fosfolipasa, da lugar a la pérdida de su actividad biológica in vitro. La relipidación puede restablecer la actividad del FT in vitro.

Aunque se ha dispuesto de ciertas cantidades de proteína FT “purificada” cuando se obtiene de los diversos tejidos, la baja concentración de proteína FT en la sangre y en tejidos y el elevado coste, tanto económico como de esfuerzo, de la purificación de la proteína a partir de tejidos, hace de éste un material escaso. Por tanto, existe una necesidad de buscar una fuente alternativa de proteína FT, de forma ventajosa, una proteína FT lipidada.

La proteína FT se ha expresado en diversos sistemas utilizando el ADNc humano clonado. Así, se ha publicado la sobreexpresión de la proteína FT en E. coli (Paborsky y col., Biochemistry 28, 8072 (1989)). Además, la patente US con el número 6.261.803 describe un procedimiento para la preparación de FT recombinante funcional en un organismo hospedador procariota. En E. coli se consigue un alto rendimiento de expresión de la proteína FT completa.

Aunque la expresión heteróloga de proteínas en E. coli presenta algunas ventajas, la expresión de proteínas eucariotas en dicha bacteria se asocia con un gran número de problemas, principalmente cuando la proteína que se desea expresar es una proteína eucariota glucosilada, debido a la falta de sus propios sistemas de glucosilación en la bacteria.

Una estrategia alternativa consiste, por tanto, en expresar una proteína FT mutada que carece del dominio transmembrana. Este FT llamado ”soluble” (o FT “truncado”) se acumula en el citoplasma de las células bacterianas y puede expresarse en cantidades relativamente grandes. Sin embargo, en este sistema, la proteína FT expresada de este modo normalmente está presente en E. coli en un estado cuasicristalino en la forma de los llamados cuerpos de inclusión. Cuando es este el caso, los cuerpos de inclusión se han de solubilizar mediante el uso de grandes cantidades de agentes caotrópicos y las proteínas, que se han monomerizado de esta forma, tienen que plegarse de nuevo, con mucho esfuerzo y normalmente sólo con un bajo rendimiento, para dar la conformación activa renaturalizada. Además, en principio, el FT soluble no es adecuado para su uso en reactivos para tiempo de protrombina puesto que carece del dominio de interacción con fosfolípidos.

Otra aproximación para la sobreexpresión de la proteína FT es el uso de un gran número de sistemas de expresión conocidos y empleados con éxito que codifican productos de fusiones de genes (por ejemplo, con 1-galactosidasa, MalE, glutatión transferasa, His-tag, etc.). Sin embargo, estos sistemas no son adecuados para la expresión de FT biológicamente activo. Aunque pueden detectarse productos de expresión y también puede incrementarse el nivel de expresión cuando se usan dichos sistemas, los productos de expresión obtenidos de este modo se asocian a veces con una pérdida completa de función, que no puede restablecerse, ni incluso usando incluso procedimientos de renaturalización elaborados.

Los problemas de sobreexpresión de la proteína FT en E. coli pueden superarse realizando la expresión de dicha proteína en un sistema eucariota. De este modo, la expresión en células de levadura, en cultivos de células de insecto usando baculovirus como vector o en células de mamífero cultivadas, por ejemplo, células de ovario de hámster o en líneas celulares humanas es, en principio, adecuado. Sin embargo, estos sistemas presentan desventajas importantes, entre otras, los rendimientos de proteínas recombinantes son mucho menores cuando se compara con la producción de E. coli recombinante.

Las cepas de levadura combinan las ventajas de los diferentes sistemas hospedadores anteriores. Por un lado, mimetizan con más exactitud la fisiología nativa de una proteína eucariota que E. coli y, por otro lado, son fáciles de manipular, fáciles de cultivar, presentan un crecimiento mucho más rápido y son mucho más baratas. Sin embargo, también afectan varios factores a la expresión de proteínas en levaduras. Estos factores comprenden, pero no se limitan a:

-: la elección de las secuencias reguladoras del gen, tales como promotores, que controlan la expresión de una proteína heteróloga; las secuencias promotoras empleadas para controlar la expresión heteróloga deben ser, normalmente, “potentes”, es decir, deben lograr una expresión muy alta de la proteína y adecuadamente controlable, por lo cual la expresión puede reprimirse en principio con eficacia hasta que se alcanza una biomasa óptima del cultivo y a continuación activarse rápidamente para lograr la expresión de la proteína; y

-: una secreción eficaz de la proteína heteróloga expresada; la secreción de la proteína expresada (expresión extracelular) es a menudo preferida sobre la expresión intracelular, ya que esta última implicaría primero la rotura de la célula, liberándose, de este modo, el contenido celular completo y, posteriormente, el aislamiento de la proteína deseada a partir de la mezcla de material celular y restos celulares. Aún, la secreción eficaz de una proteína depende, a su vez, de varios factores que incluyen: (i) la elección de las secuencias señal, secuencias peptídicas que normalmente son regiones N-terminales de proteínas secretadas de manera natural y que dirigen la proteína dentro de la ruta secretora celular y (ii) los componentes específicos de la ruta secretora que interaccionan con las secuencias señal y logran la secreción de la proteína adherida.

Stone M.J. y col. (Biochem. J. (1995) 310, 605-614) describen la expresión del dominio de superficie del FT (FT truncado) en Saccharomyces cerevisiae. Para la purificación de FT, los cultivos se cargaron en una columna de inmunoafinidad conjugada con un anticuerpo anti-FT y la proteína se eluyó y dializó. Este ensayo permitía acceder a cantidades de miligramos del FT truncado.

Brucato C.L. y col. (Protein Expression and Purification 26 (2002), 386-393) describen la expresión de la proteína FT recombinante de longitud completa madura de conejo en Pichia pastoris. La purificación de la proteína FT se realiza mediante cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados.

Hasta ahora no se conoce ningún procedimiento para preparar grandes cantidades de FT recombinante biológicamente activo con alto rendimiento a partir de levaduras. De forma ventajosa, dicho FT recombinante debería obtenerse con un alto nivel de actividad, preferiblemente, a un nivel de actividad adecuado para usos terapéuticos. Por tanto, un objeto de la presente invención es generar cantidades útiles de proteína FT lipidada utilizando técnicas de recombinación. De forma ventajosa, la proteína FT recombinante debería ser útil para aplicaciones terapéuticas.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto, la invención se relaciona con una microvesícula derivada de levadura portadora de factor tisular (FT) que comprende (i) una membrana de levadura y (ii) una proteína factor tisular (FT) o una variante de la misma con actividad procoagulante, en la que una porción de dicha proteína factor tisular (FT) o fragmento de la misma con actividad procoagulante está integrada en dicha membrana, en donde dicha microvesícula es obtenible mediante un procedimiento que comprende:

a) someter un cultivo de células recombinantes de levadura que expresan la proteína FT o un fragmento de la misma con actividad procoagulante a fermentación en condiciones que permiten la expresión de dicha proteína FT, o fragmento de la misma con actividad procoagulante;

b) sedimentar el producto que resulta de la etapa a) de fermentación, para obtener un producto de fermentación; c) someter dicho producto de fermentación de la etapa b) a homogeneización, para obtener un homogeneizado de fermentación; y

d) someter dicho homogeneizado de fermentación de la etapa c) a separación, para obtener un pellet y un extracto de levadura clarificado (CYE) que contiene dicha microvesícula derivada de levadura portadora de FT con actividad procoagulante;

e) recoger dicho extracto de levadura clarificado (CYE) que contiene dicha microvesícula derivada de levadura portadora de FT con actividad procoagulante y, f) aislar o purificar dichas microvesículas derivadas de levadura portadoras de FT con actividad procoagulante.

En aspectos adicionales, la invención se relaciona con una composición que comprende una microvesícula derivada de levadura portadora de FT, con una microvesícula derivada de levadura portadora de FT como medicamento, con una composición farmacéutica que comprende una microvesícula derivada de levadura portadora de FT, con una microvesícula derivada de levadura portadora de FT para el tratamiento de hemorragias en un sujeto, y con una microvesícula derivada de levadura portadora de FT para el tratamiento de enfermedades que requieren promover la migración celular y/o la angiogénesis en un sujeto, en donde dicha enfermedad se selecciona de miocardio isquémico, infarto de miocardio, cardiomiopatía isquémica, claudicación de una isquemia límbica crónica (“chronic limb ischemia claudication”), ulceración/gangrena isquémica/dolor en reposo, neuropatía/derrame cerebral isquémico, penumbra isquémica cerca del derrame cerebral/infarto, placa aterosclerótica inestable/ulcerada en arterias coronaria/carótida, trombosis aguda o crónica arterial y/o venosa, cicatrización de herida, derrame cerebral isquémico y hemorrágico, lesiones traumáticas y úlceras.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la producción de una microvesícula derivada de levadura portadora de FT con actividad procoagulante de la invención, que comprende las etapas de:

(a): someter un cultivo de células de levadura recombinantes que expresan la proteína FT o una variante de la misma con actividad procoagulante a fermentación en condiciones que permiten la expresión de dicha proteína FT, o fragmento de la misma con actividad procoagulante;

(b): sedimentar el producto que resulta de la fermentación de la etapa a), para obtener un producto de fermentación;

(c): someter dicho producto de fermentación de la etapa b) a homogeneización, para obtener un homogeneizado de fermentación;

(d): someter dicho homogeneizado de fermentación de la etapa c) a separación, para obtener un sedimento y un extracto de levadura clarificado (CYE) que contiene dicha microvesícula derivada de levadura portadora de FT con actividad procoagulante;

(e): recoger dicho extracto de levadura clarificado (CYE) que contiene dicha microvesícula derivada de levadura portadora de FT con actividad procoagulante y,

(f): aislar o purificar dichas microvesículas derivadas de levadura portadora de FT con actividad procoagulante.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la preparación de microvesículas que comprenden una proteína de membrana de interés, en donde la proteína de interés es rFT, un fragmento del mismo

o un mutante de N-glucosilación del mismo, a partir de una célula hospedadora, que comprende las etapas de:

a) hacer crecer un cultivo de dicha célula hospedadora eucariota en condiciones que permiten la

expresión de dicha proteína de membrana de interés,

b) someter la fracción celular del cultivo de la etapa a) a homogenización,

c) someter el homogeneizado obtenido en la etapa b) a separación para obtener un sedimento (pellet) y

un extracto celular clarificado que contiene dichas microvesículas derivadas de la célula que contienen

la proteína de membrana de interés, y

d) purificar las microvesículas derivadas de la célula mediante fraccionamiento por tamaño, usando

filtración de flujo tangencial y/o usando filtros de membrana que retienen microvesículas que tienen un

diámetro de 0.1 a 0.2 µm.

También se describe una proteína factor tisular (FT) modificada lipidada seleccionada del grupo de:

(i): un FT truncado que carece de todo o parte del dominio responsable de la unión a FVIIa, con actividad procoagulante,

(ii): un mutante de la proteína FT con actividad procoagulante en la que el dominio responsable de la unión a FVIIa no es funcional, y

(iii) un mutante de la proteína FT con actividad procoagulante que tiene al menos un sitio de Nglucosilación no funcional.

También se describe una proteína FT modificada lipidada según la invención para su uso como medicamento, una composición farmacéutica que comprende una proteína FT modificada lipidada y un vehículo farmacéuticamente aceptable, una proteína FT modificada lipidada para el tratamiento de hemorragias en un sujeto y para el tratamiento de una enfermedad que requiere promover la migración celular y/o la angiogénesis en un sujeto.

También se describe una secuencia polinucleotídica que codifica una forma truncada de factor tisular (FT) que carece de la totalidad o de parte del dominio responsable de unión a FVIIa y que tiene actividad procoagulante, una proteína FT mutante que tiene actividad procoagulante en la que el dominio responsable de unión a FVIIa no es funcional, y una proteína FT mutante que tiene actividad procoagulante y que tiene al menos un sitio de Nglucosilación no funcional.

También se describe un vector que comprende una secuencia polinucleotídica de la invención, una célula hospedadora que comprende un polinucleótido de la invención o un vector de la invención, y un anticuerpo que se une específicamente a una proteína FT modificada según la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 muestra la estrategia de clonación para la generación de pTT10301. La Figura 1A muestra el mapa del plásmido pTT10301. Se escindió del plásmido pG1 un fragmento de ADN de 1.050 pb que contenía el promotor GPD (pGPD), un sitio BamHI único y el terminador PGK (PGKt), después de la digestión con los enzimas de restricción HindIII y XbaI. El fragmento de ADN se aisló mediante electroforesis en gel de agarosa, se purificó con un kit de extracción de ADN (Qiagen) y se clonó en el plásmido Yep352, previamente digerido con HindIII y XbaI. El plásmido resultante, plásmido pTT10301 se hizo crecer en E. coli y se purificó con el kit comercial de purificación de ADN JETstart (Genomed GMBH). La Figura 1B muestra el análisis con endonucleasas de restricción del plásmido pTT10301 generado.

La Figura 2 muestra un gráfico de hidropatía de la proteína FT humana. Se representan los cuatro dominios de la proteína (secuencia líder, dominios extracelular, transmembrana y citoplásmico).

La Figura 3 muestra la secuencia de ADNc de la proteína FT humana (GenBank Nº BC011029). El marco de lectura abierto (ORF) está en fase, así como los codones de inicio (ATG) y de parada (TAA). La secuencia de ADNc incluye los cuatro dominios (péptido señal, dominio extracelular, región transmembrana y cola citoplasmática) de la proteína FT humana (hFT). Las flechas muestran el sitio de hibridación de los cebadores A [cebador dirección cadena arriba (“usptream”), que codifica los cuatro primeros aminoácidos del hFT maduro sin el péptido señal y que contiene un codón de inicio ATG en fase con el ORF de FT] y B [cebador dirección cadena abajo (“downstream”), con el codón de parada en negrita], ambos con un sitio de restricción BamHI (subrayado).

La Figura 4 muestra una representación esquemática de la estrategia de clonación para generar el plásmido pTT10302 (Figura 4A). El fragmento de ADN obtenido de la reacción de PCR se digirió con BamHI y se clonó en el plásmido pTT10301, previamente digerido con BamHI y desfosforilado. El plásmido resultante (pTT10302) se hizo crecer en E. coli y se purificó con el kit comercial de purificación de ADN JETstart (Genomed GMBH). La Figura 4B muestra el análisis de restricción del plásmido pTT10302 generado.

La Figura 5 muestra la expresión del rFT en diferentes clones de levadura recombinante. El análisis por transferencia Western de los extractos procedentes de levadura transformada con el plásmido pTT10301 vacío (C-) y con el vector de expresión que contiene la proteína hFT madura recombinante, pTT10302 (carriles 1-8), se realizó usando el anticuerpo monoclonal de ratón anti-CD142 humano purificado (BID Biosciences Pharmingen). Los marcadores de peso molecular en kDa se muestran a la izquierda de la Figura.

La Figura 6 muestra los resultados de una transferencia Western después del tratamiento con endoglucosilasa de los extractos de yTT10301. De este modo, los extractos de levadura que expresa rFT (yTT10301) se trataron con 500 unidades de endoglucosidasa H (Endo H) (carril 2) o N-glucosidasa F (PNGasa F) (carril 3) durante 1 hora a 37ºC, siguiendo las instrucciones del fabricante. Estas muestras y el extracto sin tratar (carril 1) se analizaron mediante transferencia Western con el AcM anti-FT humano. Los marcadores de peso molecular en kDa se muestran a la izquierda de la Figura.

La Figura 7 son fotografías realizadas con microscopio láser confocal que muestran la expresión de rFT en la levadura recombinante yTT10301. Los esferoplastos de la levadura recombinante que expresa rFT se fijaron con paraformaldehído al 4% y se incubaron con un AcM frente a una ATPasa de levadura (Figura 7A) o con un AcM anti-FT humano (Figura 7B). Después de la incubación con un anticuerpo secundario de cabra anti-ratón conjugado a fluoresceína, las células se observaron con un microscopio confocal (1, 3, 5 y 7) o con contraste de fase (2, 4, 6 y 8). Las imágenes se tomaron en un microscopio láser confocal Radiance 2000 de BIO-RAD.

La Figura 8 son fotografías realizadas con microscopio láser confocal que muestran que la expresión del FTr por levadura recombinante depende de la presencia del plásmido pTT10302. Los esferoplastos de la levadura recombinante (yTT10300) que porta el plásmido de expresión vacío pTT10301 se fijaron con paraformaldehído al 4% y se incubaron con un AcM contra a una ATPasa de levadura (Figura 8A) o con un AcM anti-FT humano (Figura 8B). Después de la incubación con un anticuerpo secundario de cabra anti-ratón conjugado a fluoresceína, las células se observaron mediante microscopio confocal (1 y 3) o mediante contraste de fase (2 y 4). Las imágenes se tomaron con un microscopio láser confocal Radiance 2000 de BIO-RAD.

La Figura 9 muestra que el FTr se asocia a membranas de levadura. Se trató un extracto de yTT10301 se trató con Tritón X114 y tras la centrifugación, se tomaron por separado la fase acuosa y el sedimento con el detergente. La fase acuosa se trató de nuevo con Tritón X114 (concentración final al 1%) y se separaron las dos fases como anteriormente. El segundo sedimento con el detergente se mezcló con el primero. El extracto total (carril 1), las fases acuosas primera (carril 2) y la segunda (carril 3) y la fase con el detergente (carril 4) se analizaron mediante SDS-PAGE y se tiñó con Coomassie (Figura 9A) o mediante transferencia Western con un AcM frente al FT humano (Figura 9B).

La Figura 10 es una gráfica que muestra la evolución de los principales parámetros a lo largo de todo el procedimiento de fermentación. Un cambio en la presión de oxígeno (PO2), que es el único parámetro que no se controla, refleja los cambios en los requisitos de oxígeno que sufren las células durante el proceso. La fermentación se detuvo cuando la PO2 alcanzó un estado estacionario (18 horas).

La Figura 11 es un diagrama que representa el esquema general del proceso de fermentación para la producción de CYE-FT.

La Figura 12 muestra los resultados de un análisis por transferencia Western para determinar la presencia del FT en preparaciones obtenidas a partir de la primera prueba de fermentación. Cada carril corresponde a 5 !l de sobrenadante (sn) o sedimento (sd) obtenidos mediante el procedimiento descrito en la Figura 11. Las muestras de proteína se analizaron mediante transferencia Western usando un AcM específico frente al FT humano. El control positivo (FTr) es un FT recombinante comercial (10 ng) producido en E. coli (American Diagnostica, Inc.). Los marcadores de peso molecular en kDa se muestran a la izquierda de la Figura.

La Figura 13 muestra fotografías realizadas por microscopia electrónica de las muestras de CYT-FT. El producto de CYE-FT se adsorbió a rejillas de cobre recubiertas de carbono previamente tratadas mediante una descarga luminiscente. La rejilla se incubó con PBS que contenía albúmina sérica bovina (BSA) al 3% durante 1 hora antes de la incubación con el AcM específico frente al hFT o con un anticuerpo irrelevante. Las rejillas se lavaron exhaustivamente con PBS y se incubaron con un anticuerpo secundario de conejo anti-IgG de ratón conjugado a oro. Las rejillas se lavaron y las muestras se tiñeron negativamente mediante tratamiento con acetato de uranilo al 1%. Las imágenes se obtuvieron en un microscopio electrónico JEOL 1200 EXII. Las flechas indican la posición de las partículas de oro coloidal.

La Figura 14 muestra un esquema del procedimiento de clarificación de CY-FT mediante filtración de flujo tangencial.-A) El CYE-FT se sometió a filtración de flujo tangencial (FFT) en un Sistema de Filtración de Flujo Cruzado (Crossflow Filtration System, Sartorius sartoflow Slice 200 Benchtop). Se filtró secuencialmente CY-FT a través de membranas de 0,45 µm, 0,2 µm y 0,1 µm (Sartorius, polysulfone). Las membranas se equilibraron previamente con tampón fosfato (fosfato de sodio 20 mM pH 7,4, NaCl 500 mM). El material que quedó retenido tras la filtración a través de la membrana de 0,2 µm y antes de la membrana de 0,10 µm se recuperó y se usó como material de partida para las sucesivas etapas de purificación. B) Se usó un sistema dinámico de dispersión (Dynamic Light scattering) para determinar la distribución de tamaño de las microvesículas.

La Figura 15 muestra un perfil de cromatografía de exclusión molecular del producto CYE-FT llevado a cabo en una columna de Sephacryl S-500. La elución se llevó a cabo a 4ºC con tampón fosfato y se recogieron fracciones de 4 mL a una velocidad de flujo de 1 mL/minuto. La elución de proteína se monitorizó mediante medición de la densidad óptica a 280 nm.

La Figura 16 muestra un ensayo de transferencia Western para detectar rFT. Se sometieron 15 µL de cada fracción a electroforesis en un gel de Tris-glicina-SDS-PAGE al 12,5%. Tras la electroforesis, las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. A continuación, las membranas se incubaron con un anticuerpo monoclonal de ratón comercial antiFT (American Diagnostica) durante 1 hora. Las membranas se incubaron, a continuación, con anticuerpo IgG anti-ratón de conejo, seguido de la incubación con anticuerpos IgG de cabra anti-ratón conjugados a peroxidada de rábano. Las proteínas inmunorreactivas se detectaron mediante quimioluminiscencia usando kits ECL Advanced Western-blotting (GE Healthcare).

La Figura 17 muestra un perfil de proteínas de diferentes lotes de microvesículas que contienen FTr purificado mediante cromatografía de exclusión molecular. A) Proteínas de cuatro lotes diferentes de microvesículas purificadas que contienen FTr (como se indica arriba de la figura) se fraccionaron mediante SDS-PAGE, y el gen se tiñó con azul de coomassie. Los marcadores de peso molecular se muestran en el lado izquierdo de la Figura. B) Análisis de densitometría de las diferentes bandas de proteínas en cada lote realizado tras el escaneado del gel teñido.

La Figura 18 muestra un análisis de cromatografía en capa fina. PA: ácido fosfatídico (Sigma), PS: fosfatidilserina (Fluka); PG: fosfatidilglicerol (Sigma), CAR: Cardiolipina (Sigma), ERG: Ergosterol (Fluka), PE: fosfatidiletanolamina (Sigma), PI: fosfatidilinositol (Sigma), PC: fosfatidilcolina (Sigma), TAG: triacilglicéridos (Sigma).

La Figura 19 muestra la secuencia de ADNc de la proteína FT humana (GenBank Nº BC011029). El marco de lectura abierto (ORF) está en fase, así como los codones de inicio (ATG) y de parada (TAA). La secuencia de ADNc incluye los cuatro dominios (péptido señal, dominio extracelular, región transmembrana y cola citoplasmática) de la proteína FT humana (hFT). Las flechas muestran el sitio de hibridación de los cebadores A (SEC ID NO: 1) [cebador dirección cadena arriba, que codifica los cuatro primeros aminoácidos del hFT maduro sin el péptido señal y con un codón de inicio ATG en fase con el ORF de FT] y E (SEC ID NO: 3) [cebador dirección cadena abajo, nucleótidos que codifican las histidinas en negrita], ambos con un sitio de restricción BamHI (subrayado).

La Figura 20 muestra la estrategia de clonación para la generación de pTT10303. La Figura 20A muestra que el fragmento de ADN obtenido de la reacción de PCR se digirió con BamHI y se clonó en el plásmido pTT10301, previamente digerido con BamHI y desfosforilado. El plásmido resultante pTT10303 se hizo crecer en E. coli y se purificó con el kit comercial de purificación de ADN JETstart (Genomed Gmbh). La Figura 20B muestra el análisis de restricción del plásmido pTT10303 generado.

La Figura 21 muestra los resultados de un análisis por transferencia Western de la expresión de FTr-his-tag. Análisis por transferencia Western de los extractos procedentes de cultivos de levadura recombinante yTT10302 (carriles 14, que corresponden a los clones 2 a 5) y FTr producido en E. coli (C+). La transferencia se hizo reaccionar con el anticuerpo monoclonal anti-CD142 humano de ratón purificado (BD Biosciences Pharmingen). Los marcadores de peso molecular en kDa se muestran a la izquierda de la Figura.

La Figura 22 muestra también los resultados de la expresión de FTr-his-tag. La Figura 22A muestra el SDS-PAGE y la tinción con azul de Coomassie de los extractos de levadura yTT10300 (carril 1), yTT10301 que expresa FTr (carril 2) o yTT10302 (clon Nº 5) que expresa FTr-his-tag (carril 3). El control positivo se corresponde con 5 ng de un FTr producido en E. coli (carril 4). La Figura 22B es un análisis por transferencia Western de las mismas muestras mostradas en la Figura 17A, usando el anticuerpo monoclonal anti-CD142 humano purificado (BD Biosciences Pharmingen) de ratón. Los marcadores de peso molecular en kDa se muestran a la izquierda de la Figura.

La Figura 23 muestra esquemáticamente el procedimiento de purificación de 6HT-FT.

La Figura 24 muestra los resultados de la purificación de 6HT-FT mediante cromatografía de afinidad. Se usó CYE6HT-FT como material de partida. El extracto se filtró a través de un filtro de 0,2 !m de tamaño de poro mediante filtración tangencial y se aplicó a una columna de cromatografía de afinidad por iones metálicos quelantes comercial de 5 ml (HiTrap®, Pharmacia Biotech). La columna se sometió a tres lavados consecutivos con tampón inicial (tampón fosfato 20 mM, NaCl 500 mM, pH 7,4) sin imidazol, con imidazol 10 mM y con imidazol 100 mM, respectivamente. El 6HT-FT se eluyó con el mismo tampón que contenía imidazol 1 M. Se recogieron fracciones de elución de 2,5 ml (carriles 4 a 7, que se corresponden, respectivamente, con las fracciones # 1, # 2, # 3 y #4) y se dializaron frente a tampón fosfato 20 mM, NaCl 50 mM, pH 7,4. El extracto inicial de levadura filtrado (carril 1), el material no unido (carril 2), el último lavado con el tampón inicial que contenía 100 mM y las primeras cuatro fracciones de elución se analizaron mediante SDS-PAGE y transferencia Western (Figura 24A) o tinción con plata (Figura 24B). Los marcadores de peso molecular en kDa se indican a la izquierda de la Figura.

La Figura 25 muestra los resultados de un análisis por transferencia Western del 6HT-FT purificado después del tratamiento con endoglucosidasa. La fracción purificada de 6HT-FT se trató con 500 unidades de PNGasa F (carril 2)

o Endo H (carril 3) siguiendo las instrucciones del fabricante. Estas muestras y el eluato sin tratar (carril 1) se analizaron mediante transferencia Western con un AcM anti-FT humano. Los marcadores de peso molecular en kDa se muestran a la izquierda de la Figura.

La Figura 26 muestra los resultados de una inmunoelectromicroscopía del 6HT-FT purificado mediante cromatografía de afinidad. La primera fracción de elución se adsorbió en rejillas de cobre recubiertas de coloidón. La rejilla se trató para el inmunomarcaje con oro con un anticuerpo monoclonal anti-FT.

La Figura 27 es una representación esquemática de una microvesícula derivada de levadura portadora de FT de la invención. La Figura 27A muestra la representación esquemática de una microvesícula derivada de levadura portadora de FT de la invención que comprende una membrana derivada de levadura (1) y una proteína FT (2) (o un fragmento de la misma con actividad procoagulante) integrada en dicha membrana derivada de levadura (1). Se representan el espacio intramicrovesicular (3) y el espacio extramicrovesicular (4). Las Figuras 27B y 27C muestran la arquitectura básica de una microvesícula derivada de la levadura portadora de FT de la invención. Los lípidos de la bicapa lipídica de la membrana derivada de la levadura son anfipáticos; tienen cabezas polares hidrófilas (5) apuntando al espacio extramicrovesicular (4) y dos colas de hidrocarburos hidrófobas (6) que apuntan al espacio intramicrovesicular (3). En la realización mostrada en la Figura 27B, el dominio N-terminal de la proteína FT (2), o un fragmento de la misma con actividad procoagulante, se orienta hacia el espacio extramicrovesicular (4). En la realización mostrada en la Figura 27C, el dominio N-terminal de la proteína FT (2), o un fragmento de la misma con actividad procoagulante, se orienta hacia el espacio intramicrovesicular (3).

La Figura 28 muestra la secuencia de ADNc de la proteína FT humana (GenBank Nº BC011029). El marco de lectura abierto (ORF) está en fase, así como los codones de inicio (ATG) y de parada (TAA). La secuencia de ADNc incluye los cuatro dominios (péptido señal, dominio extracelular, región transmembrana y cola citoplasmática) de la proteína FT humana (hFT). Las flechas muestran el sitio de hibridación de los cebadores F (SEC ID NO: 4) [cebador dirección cadena arriba que codifica los cuatro primeros aminoácidos del hFT maduro sin el péptido señal y que tiene un codón de inicio ATG en fase con el ORF de FT] y E (SEC ID NO: 5) [cebador dirección cadena abajo, nucleótidos que codifican las histidinas en negrita], ambos con un sitio de restricción BamHI (subrayado).

La Figura 29 muestra la estrategia de clonación para la generación de pTT10304. A) El fragmento de ADN obtenido de la reacción de PCR se digirió con BamHI y se clonó en el plásmido pTT10301, previamente digerido con BamHI y desfosforilado. El plásmido resultante pTT10304 se hizo crecer en E. coli y se purificó con el kit comercial de purificación de ADN JETstart (Genomed Gmbh). B) muestra el análisis de restricción del vector pTT10304 generado.

La Figura 30 muestra una representación esquemática de la posición de las mutaciones puntuales en los sitios de glucosilación en FT humano.

La Figura 31 muestra una transferencia Western incubada con un anticuerpo anti-FT1. PM1 se refiere al cambio Ala-Asn en la posición 11, PM2 se refiere a un cambio Ala-Asn en la posición 124, y PM3 se refiere a un cambio Asn-Ala en la posición 137. PM1,2; 1,3; y 1,2,3 se refieren a combinaciones de ellos. TT103MH es el tipo salvaje de FT.

Figura 32. Curvas de respuesta a dosis de la actividad procoagulante de TT-103 y FTr relipidado. La actividad procoagulante se midió mediante un coagulómetro usando plasma humano normal reunido y diferentes concentraciones tanto de TT-103 de diferentes lotes como FTr relipidizado.

La Figura 33 muestra las actividades procoagulantes in vitro de TT-103 no tratado (1), TT-103 sometido a tratamiento con Tritón X-100 (2), TT-103 sometido a tratamiento con Tritón X-100 tras diálisis, permitiendo la relipidación de FTr (3), liposomas vacíos (4) y microvesículas de levaduras recombinantes que no expresan rFT (5). La cantidad de FTr determinada por ELISA fue la misma (120 ng/mL) en las muestras 1, 2 y 3.

La Figura 34 muestra la actividad procoagulante de TT-103 en plasma heparinizado (TT-103) comparado con FTr relipidizado, trombina y Thromborel S.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Microvesícula derivada de levadura portadora de FT de la invención

En un aspecto, la invención se refiere a una microvesícula derivada de levadura portadora de factor tisular, denominada a partir de aquí en este documento “microvesícula derivada de levadura portadora de FT de la invención”, que comprende (i) una membrana de levadura y (ii) una proteína factor tisular (FT) o una variante de la misma con actividad procoagulante, en la que una porción de dicha proteína factor tisular (FT) o variante de la misma con actividad procoagulante está integrada en dicha bicapa lipídica, en donde dicha microvesícula es obtenible mediante un procedimiento que comprende: (a) someter un cultivo de células recombinantes de levadura que expresan la proteína FT o un fragmento de la misma con actividad procoagulante, a fermentación en condiciones que permiten la expresión de dicha proteína FT, o fragmento de la misma con actividad procoagulante;

(b): sedimentar el producto que resulta de la etapa a) de fermentación, para obtener un producto de fermentación;

(c): someter dicho producto de fermentación de la etapa b) a homogeneización, para obtener un homogeneizado de fermentación; y (d) someter dicho homogeneizado de fermentación de la etapa c) a separación, para obtener un pellet y un extracto de levadura clarificado (CYE) que contiene dicha microvesícula derivada de levadura portadora de FT con actividad procoagulante; (e) recoger dicho extracto de levadura clarificado (CYE) que contiene dicha microvesícula derivada de levadura portadora de FT con actividad procoagulante; y (f) aislar o purificar dichas microvesículas derivadas de levadura portadoras de FT con actividad procoagulante. La microvesícula derivada de levadura portadora de FT de la invención tiene actividad procoagulante y, por tanto, puede usarse como medicamento para el tratamiento de hemorragias en un sujeto.

Como se usa en este documento, la expresión “microvesícula derivada de levadura” se refiere a un compartimento pequeño y cerrado, compuesto esencialmente de membranas, o fragmentos de las mismas, procedentes de células de levadura. Una membrana se refiere, en general, a una capa organizada de pocas moléculas de espesor que forman el límite de una célula (es decir, la membrana celular o plasmática) o los límites de los orgánulos intracelulares.

El componente (i) de la microvesícula derivada de levadura portadora de FT de la invención es una membrana de levadura que procederá de las células de levadura usadas en la producción de la microvesícula derivada de levadura portadora de FT de la invención. Normalmente, una membrana está compuesta por dos capas lipídicas orientadas (es decir, una bicapa lipídica) en las que las proteínas pueden incluirse. Una bicapa lipídica, que es la estructura básica de las membranas de una célula, está formada generalmente por moléculas anfipáticas (por ejemplo, fosfolípidos, ácidos grasos, etc.) en un ambiente acuoso, estando orientada cada una de las moléculas con el grupo hidrófilo hacia el exterior de la capa y el grupo hidrófobo hacia el interior de la capa. Normalmente, las proteínas están incluidas en la bicapa lipídica; de modo que la microvesícula derivada de levadura portadora de FT de la invención contiene proteínas de las membranas de células de levadura, que generalmente están integradas en dichas membranas de células de levadura.

En una realización particular, dicha microvesícula derivada de levadura procede de membranas de células de levadura o fragmentos de la misma, tal como, por ejemplo, membranas plasmáticas de células de levadura o fragmentos de las mismas. En otra realización particular, dicha microvesícula derivada de levadura procede de membranas de orgánulos intracelulares de células de levadura, o fragmentos de las mismas, tal como núcleo, aparato de Golgi, retículo endoplasmático, etc.

Dichas microvesículas derivadas de levadura procederán, en general, de células de levadura usadas en la producción de las mismas (por ejemplo, después de someter el producto de fermentación de la levadura a un tratamiento de homogenización como se muestra en el procedimiento descrito en el Ejemplo 1). En particular, puede usarse cualquier célula de levadura para producir dichas microvesículas derivadas de levadura, de forma ventajosa, células de levadura no floculentas y, preferiblemente, una célula de levadura clasificada como célula de levadura “generalmente reconocida como segura” (o GRAS) por la Food and Drug Administration (FDA) para consumo humano, puesto que dichas sustancias GRAS aprobadas no necesitan aprobación previa a la comercialización por la FDA porque son sustancialmente inocuos para animales, incluidos los seres humanos. Ejemplos ilustrativos no limitativos de células de levadura que pueden usarse en el procedimiento de producción de la microvesícula derivada de levadura portadora de FT de la invención son las llamadas especies de levadura de bebidas alcohólicas que producen alcohol, ácido carbónico gas, levadura de panadería y similares metabolizando un material líquido para la fabricación de cerveza. Específicamente, células de levadura preferidas incluyen células de levadura de Saccharomyces sp., etc., por ejemplo, la cepa T73 ura3-de S. cerevisiae, un derivado de la cepa T73 de S. cerevisiae, una cepa ampliamente usada en la producción de vino (Ejemplo 1) o Pichia sp.

El componente (ii) de la microvesícula derivada de levadura portadora de FT de la invención es una proteína factor tisular (FT) o una variante de la misma con actividad procoagulante.

Tal y como aquí se utiliza “variante de FT” se refiere a cualquier polipéptido derivado de FT mediante sustitución, inserción o deleción de uno o más aminoácidos.

En una realización particular, dicho componente (ii) de la microvesícula derivada de levadura portadora de FT de la invención es una proteína FT.

La expresión “factor tisular” o “FT” según se usa en este documento incluye FT nativo o de tipo salvaje (wt)de cualquier especie animal, incluyendo seres humanos, así como mutantes de la misma que mantienen al menos una de las funciones de dicho FT wt, de forma ventajosa, una función del FT wt relacionada con la coagulación.

La proteína FT es una glucoproteína integral de membrana que está ampliamente distribuida en el reino animal la cual, según se encuentra en la naturaleza, consiste en un componente proteico (proteína) y un fosfolípido. En la proteína FT se presentan algunos sitios de glucosilación para la adición de cadenas laterales de oligosacáridos a dicha proteína para obtener una proteína FT en una forma glucosilada. Dependiendo del grado de glucosilación, puede disponerse de diferentes formas glucosiladas de proteína FT. A este respecto, la FT madura contiene tres posibles sitios de N-glucosilación de la forma Asn-Xaa-Ser/Thr (Asn11-Leu12-Thr13, Asn124-Val125-Thr126 y Asn137-Asn138-Thr139). Típicamente, la N-glucosilación en levaduras supone un núcleo interno de aproximadamente diez residuos de manosa, unido a la asparagina a través de dos residuos GlcNAc y una cadena lateral exterior de 50-100 residuos de manosa. Por tanto, la N-glucosilación podría añadir potencialmente hasta 300 residuos de manosa a FT, un aumento en la masa molecular de aproximadamente 60 kDa. Además, también es posible que pudieran unirse varios residuos de manosa a diversos sitios de O-glucosilación (más de 25). En una realización particular, la microvesícula derivada de levadura portadora de FT de la invención comprende una proteína FT glucosilada. Como se usa en este documento, el término “glucosilada” incluye cualquier grado de glucosilación.

En la Figura 27 se muestra una representación esquemática de una microvesícula derivada de levadura portadora de FT de la invención.

La proteína FT tiene una estructura por dominios, es decir, es una proteína con regiones funcionales independientes. En una realización particular, dicha proteína FT es la proteína FT humana (hFT). Cada uno de los dominios de la proteína hFT tiene características estructurales y funcionales únicas: (1) un péptido señal o una región con una secuencia líder de 32 aminoácidos que se procesa post-traduccionalmente cuando la proteína es procesada de la forma inmadura a la madura; (2) un dominio extracelular hidrófilo N-glucosilado que comprende aproximadamente 219 aminoácidos terminales; (3) un fragmento de aproximadamente 23 aminoácidos, principalmente hidrófobos, que se cree son los aminoácidos del dominio transmembrana; y (4) los 21 aminoácidos del extremo carboxílico que se cree son los aminoácidos que forman parte del fragmento citoplasmático de la proteína. El dominio estructural de la proteína hFT permite la producción de, por ejemplo, el dominio extracelular de la proteína o de fragmentos funcionales de la misma. Se conoce la secuencia de aminoácidos de la proteína hFT y puede consultarse en bases de datos de proteínas, tales como, por ejemplo, NCBI (hFT, número de acceso: P13726).

Además, la proteína FT puede ser miembro de una proteína de fusión, conteniendo dicha proteína de fusión una primera región que comprende la proteína FT unida a una segunda región que comprende otro péptido o proteína. Dicha segunda región puede estar unida a la región amino terminal de dicha proteína FT o, alternativamente, dicha segunda región puede estar unida a la región carboxilo terminal de dicha proteína FT. Tanto la primera como la segunda región pueden unirse directamente entre si o pueden unirse a través de un polipéptido engarce entre dichas primera y segunda regiones.

En una realización particular, dicha proteína de fusión comprende una proteína FT y una etiqueta, normalmente una etiqueta peptídica, unida al dominio C-terminal o N-terminal de dicha proteína FT. Generalmente, dicha etiqueta es un péptido o una secuencia de aminoácidos que puede usarse en el aislamiento o purificación de dicha proteína de fusión. De este modo, dicha etiqueta es capaz de unirse a uno o más ligandos, tal como, por ejemplo, uno o más ligandos de una matriz de afinidad, tal como un suporte cromatográfico o perlas, con elevada afinidad. Un ejemplo de dicha etiqueta es una etiqueta de histidina (His-tag o HT), tal como una etiqueta compuesta de 6 residuos de histidina (His6 o H6), que puede unirse a una columna de níquel (Ni2+) o cobalto (Co2+) con elevada afinidad. La Histag, como se muestra en los Ejemplos 2 y 3, tiene la característica deseable de que puede unirse a sus ligandos en condiciones que son desnaturalizantes para la mayoría de las proteínas y que interrumpen la mayoría de las interacciones proteína-proteína. Por tanto, puede usarse para eliminar la proteína anzuelo (“bait protein”) marcada con H6 tras la interrupción de las interacciones proteína-proteína en las que ha participado el anzuelo.

Ejemplos ilustrativos no limitativos adicionales de etiquetas útiles en el aislamiento o purificación de una proteína de fusión incluyen la etiqueta de Arg, la etiqueta FLAG, la etiqueta Strep, un epítopo capaz de ser reconocido por un anticuerpo, tal como la etiqueta c-myc (reconocida por un anticuerpo anti-c-myc), etiqueta SBP, etiqueta-S, péptido de unión a calmodulina, dominio de unión a celulosa, dominio de unión a quitina, etiqueta de glutatión S-transferasa, proteína de unión a maltosa, NusA, TrxA, DsbA, etiqueta-Avi, etc. (Terpe K., Appl. Microbiol. Biotechnol. (2003), 60:523-525), una secuencia de aminoácidos tal como Ala-His-Gly-His-Arg-Pro; Pro-Ile-His-Asp-His-Asp-His-Pro-His-Leu-Val-Ile-His-Ser; Gly-Met-Thr-Cys-X-X-Cys; �-galactosidasa, etc.

En una realización particular, dicha etiqueta es una His-tag unida al dominio C-terminal de dicha proteína FT. En otra realización, dicha etiqueta es una His-tag unida al dominio N-terminal de dicha proteína FT.

Dicha proteína de fusión también tiene actividad procoagulante. La actividad procoagulante de dicha proteína de fusión puede evaluarse como se ha mencionado previamente, por ejemplo, mediante cualquiera de los ensayos de coagulación mencionados en el Ejemplo 4, tal como mediante un ensayo de coagulación in vitro en plasma o mediante un ensayo de coagulación in vitro en sangre completa no anticoagulada, o mediante un ensayo in vivo en un modelo animal de hemorragia grave o mediante un ensayo in vivo en un modelo animal de hemorragia letal, tal como los ensayos mencionados en el Ejemplo 4.

Dicha proteína de fusión puede obtenerse por medios convencionales, por ejemplo, por medios de expresión génica de la secuencia de nucleótidos que codifica dicha proteína de fusión en una célula de levadura adecuada. La consiguiente etiqueta puede usarse, si se desea, para el aislamiento o purificación de dicha proteína de fusión.

En otra realización particular, dicho componente (ii) de la microvesícula derivada de levadura portadora de FT de la invención es un fragmento de FT que tiene actividad procoagulante.

Según se usa en este documento, la expresión "fragmento de la proteína FT con actividad procoagulante" incluye cualquier péptido de FT que, cuando está lipidado, tiene actividad procoagulante. La actividad procoagulante de un fragmento de FT puede determinarse fácilmente mediante cualquier ensayo convencional, por ejemplo, mediante cualquiera de los ensayos de coagulación mencionados en el Ejemplo 4. Sólo a modo de ejemplo, la actividad procoagulante de un fragmento de FT puede determinarse mediante un ensayo de coagulación in vitro en plasma o mediante un ensayo de coagulación in vitro de sangre completa no anticoagulada, o mediante un ensayo in vivo en un modelo animal de hemorragia grave o mediante un ensayo in vivo en un modelo animal de hemorragia letal, tal como los ensayos mencionados en el Ejemplo 4.

La secuencia de aminoácidos de dicho fragmento de la proteína FT con actividad procoagulante puede ser idéntica a la del fragmento correspondiente de la proteína FT nativa o, alternativamente, puede tener inserciones, deleciones o modificaciones de uno o más aminoácidos con respecto a la proteína FT nativa, siempre que el fragmento resultante de la proteína FT tenga actividad procoagulante.

En una realización particular, el fragmento de FT con actividad procoagulante comprende una proteína FT madura. La expresión “FT madura” según se usa en este documento, se refiere a la proteína FT cuya secuencia de aminoácidos carece del péptido señal. En una realización preferida, dicha proteína FT madura comprende la proteína FT humana madura. Además, en una realización específica, dicha proteína FT humana madura tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.

En otra realización particular, el fragmento de la proteína FT que tiene actividad procoagulante es una proteína FT en la que se ha perdido todo o parte del dominio responsable de la unión a FVIIa y, consecuentemente, la proteína resultante es incapaz de unirse a FVIIa. Dicho fragmento de la proteína FT con actividad procoagulante pero que carece del dominio responsable de la unión a FVIIa es referido, algunas veces, como "proteína FT truncada" o "forma truncada de FT" en esta descripción. Por extensión, dicha “proteína FT truncada” puede incluir mutantes de la proteína FT con actividad procoagulante en los que el dominio responsable de la unión a FVIIa no es funcional.

En una realización particular, dicha proteína FT truncada comprende el dominio de interacción con el Factor X, la región transmembrana y la cola citoplasmática y carece, parcial o totalmente, del dominio responsable de la unión a FVIIa. Adicionalmente, en una realización específica, dicha proteína FT truncada es una forma truncada de la proteína FT humana que contiene el dominio de interacción con el Factor X (aa 174-251), la región transmembrana (aa 252-274) y la cola citoplasmática (aa 275-295) y una etiqueta de histidina adicional (Ejemplo 3). Sorprendentemente, los inventores han descubierto ahora que dicha forma truncada de la proteína FT, que carece del dominio responsable de la unión a FVIIa, tiene actividad procoagulante (Tabla 3 del Ejemplo 4).

Los inventores de la presente invención han encontrado sorprendentemente que dicho fragmento de FT, que carece de todo o parte del dominio responsable de la unión a FVIIa, tiene actividad procoagulante. Este resultado fue sorprendente ya que es bien conocido que el FT actúa en la ruta extrínseca de coagulación sanguínea por estar expuesto en las células adventicias en el lugar de la lesión se une al Factor VII de coagulación/Factor VII de coagulación activado (FVII/FVIIa) circulante para formar el complejo FT::FVIIa que, en presencia de calcio, actúa como sustrato para que tenga lugar de este modo la activación de FX. Está aceptado que, en el caso de hemorragia producida por una lesión vascular, la coagulación se desencadena debido a la activación de la ruta extrínseca que implica la interacción de FT con su ligando, FVII/FVIIa.

En otra realización, el FT modificado contiene una o más mutaciones en el dominio responsable de la unión a FVIIa, dando como resultado que el FT modificado sea incapaz de unirse a dicho FVIIa o bien que lo hace con una afinidad sustancialmente reducida. Se conocen mutaciones puntuales en el dominio de unión a FVIIa de FT que impiden la unión a dicho FVIIa (e.g. las descritas por Kelley, R.F. et al., 1995, Biochemistry, 34:10383-10392, cuyos contenidos se incorporan en esta descripción por referencia en su totalidad).

Los inventores de la presente invención también han observado que la actividad procoagulante del FT así como su expresión en células hospedadoras de levadura se incrementa cuando dicho FT tiene mutaciones en los sitios de glucosilación que impiden la unión de al menos una de las tres cadenas N-glucosilo encontradas en el FT tipo salvaje. De este modo, en una realización particular, la microvesícula derivada de levadura portadora de FT de la invención comprende un fragmento no glucosilado de la proteína FT con actividad procoagulante. Como se ha mencionado anteriormente, el término “glucosilada” incluye cualquier grado de glucosilación. En una realización preferida, la variante de FT es un polipéptido en el que al menos uno de los sitios de N-glucosilación del FT ha sido modificado para hacerlo no funcional, es decir, incapaz de servir como sitio aceptor para la adición de cadenas de glicósido. Los sitios de N-glucosilación en la secuencia del FT que pueden ser modificados han sido descritos previamente, es decir, el sitio Asn11-Leu12-Thr13, el sitio Asn124-Val125-Thr126 y/o el sitio Asn137-Asn138-Thr139 . Cualquier modificación de las regiones consenso de N-glucosilación es adecuada en tanto en cuanto la adición de la cadena N-glucosilo resulta impedida o sustancialmente inhibida. Preferentemente, la modificación es introducida en el residuo de Asn correspondiente a las posiciones 11, 124 y/ó 136 del FT humano maduro, ya que ese residuo sirve como aceptor para la unión de la cadena de glucosilo. Tal como aquí se utiliza “sitios correspondientes a los sitios 11, 124 y/ó 136 en el FT humano maduro” se refiere a sitios de N-glucosilación en otros ortólogos de FT que pueden aparecer en una posición diferente en la cadena polipeptídica pero que se corresponden con los sitios de Nglucosilación en el FT humano maduro cuando las secuencias humana y ortóloga se alinean en base a la similitud de secuencias. Un algoritmo adecuado para el alineamiento de múltiples secuencias de FT y, por tanto, para identificar los sitios de N–glucosilación en ortólogos de FT correspondientes a los sitios en el FT humano maduro es el programa PILEUP que forma parte del GCG Software Package(Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wis.). PILEUP crea un alineamiento de múltiples secuencias a partir de un grupo de secuencias relacionadas usando alineamientos por pares, progresivos, para mostrar la relación y el porcentaje de identidad de secuencia. PILEUP usa una simplificación del método de alineamiento progresivo de Feng and Doolittle, J.Mol. Evol., 35: 351-360 (1987). Preferentemente, los residuos de Asn en las posiciones 11, 124 y/ó 136 se sustituyen por Ala. De este modo, en una realización preferida, la variante de FT que forma parte de las microvesículas se selecciona del grupo N11A, N124A, N137A, N11A y N124A, N11A y N137A, N124A y N137A y N11A, N124A y N137A en el FT humano maduro. En cualquier otro ortólogo de FT, las mutaciones tendrán lugar en los residuos de Asn correspondientes que forman sitios consenso de N-glucosilación.

Además, como en el caso de la proteína FT, el fragmento de proteína FT con actividad procoagulante usado en la realización de esta invención puede ser un miembro de una proteína de fusión, conteniendo dicha proteína de fusión una primera región que comprende dicho fragmento de la proteína FT con la actividad procoagulante de la misma, unida a una segunda región que comprende otro péptido o proteína. Dicha segunda región puede estar unida a la región amino terminal de dicho fragmento de la proteína FT o, alternativamente, dicha segunda región puede estar unida a la región carboxilo terminal de dicho fragmento de la proteína FT. Tanto la primera como la segunda región pueden estar unidas directamente o pueden unirse a través de un polipéptido engarce entre dichas primera y segunda regiones.

En una realización particular, dicha proteína de fusión comprende un fragmento de la proteína FT con actividad procoagulante y una etiqueta unida al dominio C-terminal o N-terminal de dicho fragmento de la proteína FT. Generalmente, dicha etiqueta es un péptido o una secuencia de aminoácidos que puede usarse en el aislamiento o purificación de dicha proteína de fusión. Ejemplos ilustrativos no limitativos de etiquetas disponibles para la producción de esta proteína de fusión incluyen los mencionados previamente en relación con la proteína de fusión, en la que la primera región era una proteína FT. En una realización particular, dicha etiqueta es una His-tag unida al dominio C-terminal de dicha proteína FT o del fragmento de la misma con actividad procoagulante. En otra realización, dicha etiqueta es una His-tag unida al dominio N-terminal de dicha proteína FT o fragmento de la misma con actividad procoagulante. Esta proteína de fusión también tiene actividad procoagulante, la actividad procoagulante de la misma puede ensayarse como se ha mencionado previamente, por ejemplo, mediante cualquiera de los ensayos de coagulación mencionados en el Ejemplo 4.

Según la invención, una porción de dicha proteína FT o fragmento de la misma con actividad procoagulante está integrado en dicha membrana de levadura. Normalmente, dicha porción comprende la región lipófila de dicha proteína o fragmento (es decir, el dominio central de la FT), mientras que las regiones hidrófilas de la misma (es decir, la región amino terminal y la región carboxilo terminal de dicha proteína FT) se orienta hacia el lado exoplasmático o el endoplasmático de la membrana. La información con respecto a las regiones lipófilas e hidrófilas de la proteína FT puede obtenerse a partir de la Figura 2 que muestra un perfil de hidropatía de la proteína FT. La Sección 1.4 del Ejemplo 1 muestra que dicha proteína FT o fragmento de la misma con actividad procoagulante se integra en la membrana (es decir, es una proteína asociada a la membrana).

En una realización particular, el dominio N-terminal de la proteína FT o del fragmento de la misma con actividad procoagulante se orienta hacia el lado exoplasmático de dicha membrana, mientras que en otra realización particular, el dominio N-terminal de dicha proteína FT o fragmento con actividad procoagulante se orienta hacia el lado endoplasmático de dicha membrana (Figura 27).

El tamaño de la microvesícula derivada de levadura portadora de FT de la invención puede variar dentro de un intervalo relativamente amplio, normalmente, dicho tamaño es igual o inferior a 1 !m, típicamente igual o inferior a 0,1 !m. En una realozacoón particular, el tamaño de las microvesículas derivadas de levadura portadora de FT de la invención oscila de 0,1 a 0,01 !m, según se determina por microscopia electrónica (Sección 1.6 del Ejemplo 1).

Procedimiento para la producción de microvesículas de la invención derivadas de levadura portadora de FT

Normalmente, las microvesículas derivadas de levadura portadoras de FT de la invención pueden obtenerse mediante técnicas de recombinación. De este modo, en otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para la producción de una microvesícula derivada de levadura portadora de FT con actividad procoagulante y que comprende (i) una membrana de levadura, y (ii) una proteína factor tisular (FT) o una variante de la misma que tiene actividad procoagulante, en donde una porción de dicha proteína de factor tisular (FT) o fragmento de la misma que tiene actividad procoagulante está integrada en dicha membrana (es decir, la microvesícula derivada de levadura portadora de FT de la invención), denominada a partir de ahora como el "procedimiento de la invención", que comprende:

a) someter un cultivo de células recombinantes de levadura que expresan la proteína FT o un fragmento de

la misma con actividad procoagulante a fermentación en condiciones que permiten la expresión de dicha

proteína FT, o una fragmento de la misma con actividad procoagulante;

b) sedimentar el producto que resulta de la fermentación de la etapa a), para obtener un producto de

fermentación;

c) someter dicho producto de fermentación de la etapa b) a homogeneización, para obtener un

homogeneizado de fermentación; y

d) someter dicho homogeneizado de fermentación de la etapa c) a separación, para obtener un sedimento y

un extracto de levadura clarificado (CYE) que contiene dicha microvesícula derivada de levadura portadora

de FT con actividad procoagulante (es decir, la microvesícula derivada de levadura portadora de FT de la

invención);

e) recoger dicho extracto de levadura clarificado (CYE) que contiene dicha microvesícula derivada de

levadura portadora de FT con actividad procoagulante; y,

f) aislar o purificar dichas microvesículas derivadas de levadura portadora de FT con actividad procoagulante.

Las células de levadura recombinantes que expresan la proteína FT o un fragmento de la misma con actividad procoagulante pueden obtenerse mediante procedimientos de recombinación convencionales conocidos por los expertos en la materia. Brevemente, una célula de levadura se transforma con un vector de expresión de levaduras que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína FT o un fragmento de la misma que tiene actividad procoagulante, unida operativamente a un promotor funcional de levadura.

El ADNc que codifica la proteína FT o un fragmento de la misma con actividad procoagulante puede amplificarse mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando una biblioteca de ADNc como molde y los cebadores apropiados. El Ejemplo 1 describe la amplificación del ADNc que codifica la proteína hFT madura; el Ejemplo 2 describe la amplificación del ADNc que codifica la proteína hFT madura con 18 nucleótidos más (que codifica seis histidinas) en el extremo 3'; y el Ejemplo 3 describe la amplificación del ADNc que codifica una forma truncada de la proteína hFT (FTT), que contiene el dominio de interacción con el factor X, la región transmembrana y la cola citoplasmática con 18 nucleótidos más (que codifican seis histidinas) en el extremo 3'.

Un “vector”, como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha unido. La expresión “vector de expresión de levaduras” como se usa en este documento, se refiere a construcciones de expresión de ADN, por ejemplo, segmentos de ácido nucleico, plásmidos, cósmidos, fagos, virus o partículas víricas capaces de sintetizar las proteínas sujeto codificadas por sus respectivos genes recombinantes (es decir, proteína FT o fragmento de la misma con actividad procoagulante) portada por el vector en una levadura. Alternativamente, también pueden usarse segmentos de ácido nucleico para crear células de levadura transgénicas, usando recombinación no direccional u homóloga, en la que el gen o genes de interés se integran de manera estable en el genoma de la levadura. Normalmente, el vector de expresión de levadura comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el factor tisular (FT) o un fragmento de la misma con actividad procoagulante unido operativamente a un promotor que es funcional en las células de levadura (es decir, un promotor funcional de levaduras).

Los vectores usados en la invención son, por ejemplo, vectores capaces de replicación y/o expresión autónoma de los ácidos nucleicos a los que están unidos en las células de levadura. En la presente memoria los términos “plásmido” y “vector” se usan de forma indistinta, ya que el plásmido es la forma de vector usada con más frecuencia. Además, se pretende que la invención incluya otras formas de vectores de expresión que tienen funciones equivalentes y que posteriormente a este documento sean conocidos en la técnica. Dicho vector de expresión de levaduras puede ser un vector de expresión episomal de levaduras y un vector de expresión integrador de levaduras y pueden obtenerse mediante técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia.

Por tanto, en una realización, dicho vector de expresión de levaduras es un vector de expresión episomal de levaduras. La expresión “vector de expresión episomal de levaduras” según se usa en este documento se refiere a un vector de expresión que se mantiene como una molécula de ADN extracromosómico en el citoplasma de la levadura. En una realización particular, dicho vector de expresión episomal de levaduras, además de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína FT o un fragmento de la misma con actividad procoagulante unida operativamente a un promotor funcional de levadura, además comprende: (i) un gen de selección de levadura; (ii) un origen de replicación de levadura; (iii) un gen de selección bacteriano; y (iv) una señal de terminación de la transcripción de levaduras. Ventajosamente, dicho vector de expresión episomal de levaduras además comprende un único sitio de restricción para la clonación del gen seleccionado (proteína FT o un fragmento de la misma con actividad procoagulante) bajo el control del promotor funcional de levadura y seguido de la señal de terminación de la transcripción de levaduras.

Prácticamente puede usarse cualquier promotor funcional de levadura, gen de selección de levadura, origen de replicación de levadura, gen de selección bacteriano, señal de terminación de la transcripción de levadura, y sitio de restricción para clonación, en la producción de dicho vector de expresión episomal de levaduras; no obstante, en una realización particular, se usa el promotor de la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (pGPD) como promotor funcional de levaduras; en otra realización particular, se usa el gen URA3 (URA3) como gen de selección de levaduras; en otra realización particular, se usa el origen de replicación 2 micras (2!) de levadura como origen de replicación de levadura; en otra realización particular, se usa el gen de resistencia a ampicilina (Amp) como el gen de selección bacteriano; y en otra realización particular, se usa la señal de terminación de la transcripción de la fosfoglicerato quinasa (PGKt) como señal específica de terminación de la transcripción de levaduras. Por tanto, en una realización específica (Ejemplos 1-3), el vector de expresión episomal de levaduras comprende (i) el gen URA3;

(ii) el gen Amp para la selección y propagación del vector en E. coli; (iii) el origen de replicación 2µ de levadura; (iv) la pGPD; (v) la señal específica de terminación de la transcripción de PGKt de levadura; y (vi) un sitio de restricción BamHI único que permite la clonación de genes seleccionados bajo el control de la pGPD y seguido de la secuencia de PGKt.

En otra realización, dicho vector de expresión de levaduras es un vector de expresión de integración de levaduras. La expresión “vector de expresión de integración de levaduras” según se usa en este documento se refiere a un vector que es capaz de integrarse en el genoma de la levadura. En una realización particular, dicho vector de expresión de integración de levaduras comprende: (i) un gen de selección bacteriano; y (ii) un casete de expresión insertado en un gen de selección de levaduras, comprendiendo además dicho casete de expresión un promotor funcional de levadura, una señal de terminación de la transcripción de levaduras y un sitio de restricción único para clonar el gen seleccionado (proteína FT o fragmento de la misma con actividad procoagulante).

Prácticamente, en la producción de dicho vector de expresión integrador de levadura puede usarse cualquier gen de selección bacteriano, casete de expresión insertado en un gen de selección de levadura, promotor funcional de levadura, señal de terminación de la transcripción de levadura, y un sitio de restricción único para la clonación del gen seleccionado; sin embargo, en una realización particular, se usa el gen de resistencia a ampicilina (Amp) como gen de selección bacteriano; en otra realización particular, el casete de expresión pGPD-BamHI-PGKt insertado en la región central del gen URA3 se usa como casete de expresión que contiene un promotor funcional de levadura (pGPD), una señal de terminación de la transcripción de levaduras (PGKt), y un sitio de restricción único (BamHI) para la clonación del gen seleccionado en la región central del gen URA3.

En la presente invención puede usarse prácticamente cualquier célula de levadura susceptible de ser transformada con dicho vector de expresión de levadura que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína FT o un fragmento de la misma con actividad procoagulante, unida operativamente a un promotor funcional de levadura. La transformación de las células de levadura con dicho vector de expresión de levaduras puede realizarse por medios convencionales conocidos por los expertos en la materia (Sambrook y col., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual).

En una realización preferida, dicha levadura es una levadura no floculenta (es decir, células de levadura que cuando se dispersan en un procedimientos de fermentación, no floculan (se agregan)). Ventajosamente, dicha célula de levadura es una célula de levadura GRAS. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de células de levadura que pueden usarse en el procedimiento de la invención son las llamadas especies de levaduras de bebidas alcohólicas (levaduras usadas para la producción de bebidas alcohólica) que producen alcohol, ácido carbónico gas, levadura de panadería y similares metabolizando un material líquido para la fabricación de cerveza. Específicamente, las preferidas se seleccionan entre S. cerevisiae. Ejemplos de estas levaduras de bebidas alcohólicas incluyen células de la levadura de la cerveza, células de la levadura del vino, y células de la levadura del sake. En una realización preferida de la invención, la célula de levadura es una célula de la levadura del vino, tal como S. cerevisiae T73 ura3(Ejemplos 1-3).

Una vez que se transforma la célula de levadura, la siguiente etapa consiste en someter un cultivo de células de levadura recombinantes que expresan la proteína FT o fragmento de la misma con actividad procoagulante a fermentación en condiciones que permitan la expresión de dicha proteína FT, o fragmento de la misma con actividad procoagulante. En una realización particular, dicha célula de levadura se crece en un medio adecuado en el que dicha célula de levadura pueda expresar el producto heterólogo deseado (proteína FT o fragmento de la misma con actividad procoagulante). Los medios de cultivo apropiados para el cultivo de células de levadura son bien conocidos por los expertos en la materia y se seleccionarán entre los más apropiados en vista de las células de levadura que se vayan a cultivar. Puede usarse cualquier material para producir un producto de fermentación siempre que sea adecuado para la fermentación producida por las células de levadura no aglutinantes empleadas, y pueden usarse materiales conocidos a voluntad. Por ejemplo, maltas, zumos de fruta, líquidos azucarados, líquidos de cereales sacarificados, y similares se usan normalmente solos o en combinaciones según sea apropiado para la producción de bebidas alcohólicas. También, pueden añadirse a estos los nutrientes apropiados y similares cuando sea necesario.

Las condiciones de fermentación en esencia no son diferentes de las condiciones conocidas y puede fijarlas un experto en la materia. En una realización particular, la fermentación se continúa mediante el control de la evolución de los principales parámetros a lo largo del procedimiento de fermentación y se detiene cuando la presión de oxígeno (PO2) alcanza un estado estacionario.

A continuación, el producto de fermentación que resulta de la etapa a) de la fermentación se sedimenta mediante procedimientos convencionales, tal como mediante centrifugación, y se resuspende en un tampón de lisis adecuado antes de someter dicho producto a homogeneización. Las levaduras pueden homogeneizarse por procedimientos convencionales, por ejemplo, mediante alta presión en un homogeneizador para obtener un homogeneizado de fermentación.

El homogeneizado de fermentación se somete a continuación a separación por procedimientos convencionales, tales como centrifugación, para obtener un sedimento y un extracto de levadura clarificado (CYE) que contiene dichas microvesículas derivadas de levadura portadoras de FT con actividad procoagulante (es decir, la microvesícula derivada de levadura portadora de FT de la invención) que puede recogerse por separado. En la Figura 11 se muestra un esquema general del procedimiento de la invención.

La presencia de proteína FT o un fragmento de la misma con actividad procoagulante puede determinarse mediante métodos convencionales, tales como, análisis por transferencia Western usando un anticuerpo monoclonal (AcM) específico anti-proteína FT. Adicionalmente, la actividad procoagulante del CYE puede determinarse mediante cualquier ensayo convencional, tal como cualquiera de los ensayos de coagulación mencionados en el Ejemplo 4, por ejemplo, típicamente mediante un ensayo de coagulación in vitro en plasma o en sangre completa no anticoagulada, etc.

El examen adicional de muestras de CYE mediante microscopia inmunoelectrónica mostraba la presencia de microvesículas derivadas de levadura marcadas con el AcM anti-FT en la superficie de dichas microvesículas. Dichas microvesículas, que comprenden la proteína FT o un fragmento de la misma con actividad procoagulante, también tienen actividad procoagulante y se corresponden con las microvesículas derivadas de levadura portadoras de FT de la invención.

Opcionalmente, si se desea, dichas microvesículas derivadas de levadura portadoras de FT con actividad procoagulante obtenidas previamente según el procedimiento de la invención puede concentrarse, aislarse o purificarse mediante métodos convencionales conocidos por el experto en la materia. A modo de ilustración, la purificación por cromatografía de afinidad de proteínas que contienen una etiqueta peptídica (por ejemplo, una Histag, etc.), en el extremo C-o N-terminal, es un procedimiento bien establecido usado para obtener preparaciones altamente purificadas de un gran número de proteínas. Como cualquier procedimiento cromatográfico, dicho procedimiento puede llevarse fácilmente a producción a gran escala. Podrían realizarse procedimientos de purificación alternativos tales como cromatografía de inmunoafinidad, aunque requerirían la disponibilidad de soluciones madre de anticuerpos mono o policlonales específicos anti-FT bien estandarizadas, específicamente para una producción a gran escala.

De este modo, el procedimiento de aislamiento y purificación dependerá, entre otras cosas, de la naturaleza de la proteína FT o fragmento de la misma que tiene actividad procoagulante, es decir, si es una proteína de fusión con una etiqueta para la unión a uno o más ligandos de una matriz de afinidad, tal como un soporte cromatográfico o perlas, con elevada afinidad (por ejemplo, una His-tag, etc.) o un epítopo capaz de ser reconocido por un anticuerpo, tal como c-myc-tag (reconocido por un anticuerpo anti-c-myc), etc.

La Figura 23 muestra esquemáticamente un método para purificar microvesículas derivadas de levadura portadora de una proteína FT recombinante (o variante de la misma con actividad procoagulante) en forma de proteína de fusión fusionada a una etiqueta de His [es decir, microvesículas derivadas de levadura portadoras de (proteína FTHis-tag) o “producto farmacológico 6HT-FT” como se menciona en la Figura 23]. Brevemente, un extracto de levadura clarificado (CYE) obtenido según el procedimiento descrito previamente, que contiene microvesículas derivadas de levadura portadoras de (proteína FT-his-tag) se filtra (por ejemplo, a través de un filtro de 0,2 !m de tamaño de poro mediante filtración de flujo tangencial) antes de cargarse en una columna de afinidad apropiada (por ejemplo, columna de afinidad HiTrap®); a continuación, tras aplicar la muestra, se recupera el material que pasa a través de la columna (material no retenido) y la columna se somete a varios lavados y, después del último lavado, las microvesículas derivadas de levadura portadoras de (proteína FT-His-tag) se eluyen añadiendo a la columna un tampón apropiado (por ejemplo, un tampón que contenga imidazol) y las fracciones eluídas se recogen y dializan para obtener las microvesículas derivadas de levadura portadoras de (proteína FT-His-tag) aislada o purificada.

También, en otra realización, las microvesículas derivadas de levadura portadoras de FT de la invención pueden purificarse mediante un equipo ÄKTA cebado. El ÄKTA cebado es un sistema de cromatografía líquida automatizado de General Electric Healthcare que puede usarse en el desarrollo de protocolos estándar de purificación que podrían llevarse fácilmente a producciones a gran escala.

Método para la purificación de microvesículas que comprenden una proteína de membrana de interés a partir de un hospedador eucariota

Los inventores de la presente invención han observado también que las vesículas presentes en el extracto clarificado derivado de células que expresan FT, adicionalmente, puede ser enriquecido, adicionalmente, usando técnicas de separación por tamaño. Sin desear estar vinculado a ninguna teoría, se cree que la técnica de separación por tamaño usando una membrana que tiene un tamaño de poro definido permite la eliminación de otros componentes del extracto celular que están disminuyendo la actividad procoagulante de la proteína. Se cree que el método desarrollado por los inventores es aplicable de manera general a la purificación de cualquier proteína de membrana producida en un hospedador eucariota en donde dicha membrana. Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la preparación de microvesículas que comprenden una proteína de membrana de interés que comprende las etapas de:

a) hacer crecer un cultivo de una célula hospedadora de levadura bajo condiciones que permitan la expresión

de dicha proteína de membrana de interés;

b) someter las células del cultivo de la etapa (a) a homogenización;

c) someter el homogeneizado de la etapa (b) a separación, para dar lugar a un pellet y a un extracto

clarificado que contiene dichas microvesículas derivadas de células que contienen la proteína de

membrana de interés;

d) purificar dichas microvesículas derivadas de células mediante separación por tamaño, usando filtración de

flujo tangencial y/o usando filtros de membrana que retienen microvesículas que tienen un diámetro de 0.1

a 0.2 µm.

Etapa (a) Crecimiento de un cultivo de una célula de levadura

Los hospedadores de levadura que pueden utilizarse en el contexto de la presente invención incluyen cualquier célula que pueda ser cultivada en el laboratorio o en una planta de producción pero, más preferiblemente, una célula que pueda ser manipulada genéticamente para expresar dentro de la célula una proteína de membrana de interés. La levadura que puede usarse en la presente invención incluye Saccharomyces, Pichia).

Los hospedadores eucarióticos usados pueden expresar sus proteínas como parte del proteoma normal o pueden haber sido modificadas mediante la introducción de un ácido nucleico exógeno que codifica la proteína de membrana de interés. En ambos casos, las células necesitan ser cultivadas bajo condiciones que permitan la expresión de la proteína de membrana de interés. Si la proteína de membrana de interés está codificada por un ácido nucleico, este ácido nucleico puede colocarse en un vector bajo el control de un promotor. Ejemplos de promotores conocidos adecuados para la puesta en práctica de la invención incluyen promotores constitutivos tales como los encontrados en algunos virus eucariotas (poliomavirus, adenovirus, SV40, CMV, virus del sarcoma aviar, virus de la hepatitis B, promotor del gen de la metalotioneína, virus de la timidina quinasa del herpes simple, regiones LTR retrovirales, promotor de la inmunoglobulina, promotor de la actina, promotor EF-1 alfa así como promotores inducibles en donde la expresión del gen dirección cadena abajo requiere la adición de una sustancia de una señal exógena al cultivo tal como el promotor de la tetraciclina, luz UV/NFKappaB, Cre/lox, promotores de choque térmico, promotores de la RNA polimerasa II regulables descritos en WO2006/135436 así como promotores específicos de tejido, tales como el promotor PSA descrito en WO2006/012221.

Las células se cultivan usando cualquier medio de cultivo apropiado. El experto en la materia apreciará que el medio de cultivo ha de ser escogido dependiendo del tipo de célula hospedadora que vaya a usarse. Sin embargo, el experto en la materia dispone de una amplia variedad de medios para cada tipo celular tal como se describe en Sambrook, J. et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)) and Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al, John Wiley & Sons (1992)).

Prácticamente cualquier proteína de membrana puede expresarse y purificarse según el método de la invención. Si la proteína de interés es una proteína de membrana, entonces la proteína puede expresarse como tal porque será dirigida al sistema de membrana de la célula hospedadora siempre que contenga una secuencia señal. Proteínas de membrana que pueden expresarse usando el método de la invención incluyen receptores, transportadores tales como receptores de estrógeno, transportadores de aminoácidos, receptores andrógenos, receptores pituitarios, receptores de transferrina, receptores de progesterona y transportadores de glucosa. También es posible expresar proteínas solubles usando el método de la invención si estas proteína solubles están fusionadas a una secuencia señal en el extremo N-terminal y a un dominio transmembrana en el extremo C-terminal. De este modo, la proteína de fusión se insertará en las membranas de la célula hospedadora y se purificará en las microvesículas. En una realización particular, la proteína de membrana de interés es FTr, un fragmento del mismo o un mutante de Nglucosilación del mismo como se ha descrito anteriormente.

Etapa (b) Homogenización

En la etapa (b), las células del cultivo son homogeneizadas para dar lugar a un homogeneizado. Las células necesitan ser separadas del medio de cultivo usando cualquier técnica disponible a el experto en la materia (centrifugación, sedimentación, filtración y similares). Una vez las células están aisladas, se someten a una homogeneización de manera que se rompan las paredes celulares y las membranas plasmáticas y se libera en los contenidos intracelulares al tampón en donde la homogeneización se lleva a cabo. La rotura de las células se lleva a cabo usando cualquier método apropiado conocido en el estado de la técnica como alta presión, cavitación con nitrógeno, choque osmótico usando tampón hipotónico, tratamiento con ultrasonidos, homogeneización mecánica, métodos enzimolíticos de disrupción de tejidos, sonicación. La homogeneización se lleva a cabo en ausencia de cualquier detergente. Preferiblemente, la homogeneización se lleva a cabo a alta presión.

Etapa (c): Separación del homogeneizado

A continuación, el homogeneizado es fraccionado mediante medios convencionales con el fin de separar las células no rotas y los grandes agregados de los contenidos liberados de las células. Preferiblemente, el fraccionamiento se lleva a cabo por centrifugación a 13.000xg. El sobrenadante obtenido tras la centrifugación es un extracto celular clarificado que comprende material soluble así como diferentes poblaciones de microvesículas de distintos tamaños que resultan de la fragmentación del sistema de membranas celular.

Etapa (d): Purificación por separación de tamaños.

El extracto celular clarificado obtenido en la etapa (c) es fraccionado, a continuación, en función del tamaño de las microvesículas que forman dicho extracto de forma que se seleccionan aquellas que tienen un tamaño de diámetro específico. Los autores de la presente invención han encontrado que las técnicas de purificación por separación de tamaños pueden usarse para proporcionar una preparación de microvesículas con una pureza suficiente como para que puedan ser administradas terapéuticamente sin etapas adicionales de purificación tales como cromatografía y otros métodos considerados anteriormente necesarios. Sin intención de estar vinculados a ninguna teoría particular, se cree que en las etapas del procedimiento los extractos celulares clarificados a través de un fraccionamiento de separación por tamaños resultan en un producto con una carga reducida de contaminantes. Además, los contaminantes son de un tamaño y naturaleza que pueden ser separados fácilmente de las microvesículas mediante una simple etapa de purificación por separación de tamaños.

La filtración por membrana es una técnica ampliamente conocida en el campo del bioprocesado. Una membrana se define como una estructura que tiene unas dimensiones laterales mucho mayores que su grosor, a través del cual tiene lugar la transferencia de masa bajo una variedad de fuerzas conductoras. Mientras que muchos filtros pueden considerarse membranas, los filtros también incluyen materiales cuyas dimensiones laterales normalmente no son 100 veces mayores que su profundidad y cuya función de separación es principalmente mediante la captura de especies o partículas a través de su profundidad. Los parámetros más comunes usados para caracterizar membranas se clasifican en tres categorías. Estas son propiedades de transporte, características del poro (geometría) y propiedades de superficie (o compuesto químico de forma predominante). Sin embargo, las propiedades de transporte dependen de forma significativa de las características del poro y la superficie. Mientras que la separación de membrana puede ser más lenta y un proceso de volumen más bajo que otros procesos de separación, su eficacia lo hace un método que puede usarse para recuperar pequeñas cantidades de productos valiosos.

Los sistemas de filtrado de membrana pueden diseñarse de diferentes maneras para tener diferentes propiedades de filtración. El criterio de diseño incluye: operación en “dead-end” (con o sin agitación) o en modo de flujo cruzado; recuperación total o parcial de la mezcla de alimentación; aplicación de una presión transmembrana externa a través de una bomba, capa de gas inerte, o evacuación del permeado del dispositivo; y el uso de hojas planas [flat sheets] (separado o múltiple), paquete de fibras huecas o membranas tubulares. Los métodos de separación por tamaños utilizan una membrana de separación por tamaño que puede ser una membrana de diálisis u otra similar como las conocidas por el experto en la materia. Materiales de membrana de diálisis apropiados útiles en la filtración de membrana por separación de tamaños incluyen los disponibles comercialmente tal como los producidos a partir de poliétersulfona, policarbonato, nailón, polipropileno y similares. Proveedores de estos materiales de membrana de diálisis incluyen Akzo-Nobel, Millipore, Inc., Poretics, Inc., y Pall Corp., a modo de ejemplo.

En una realización particular, el fraccionamiento por tamaño basado en membrana es la filtración de flujo tangencial (TFF), también conocida como “filtración de flujo a través”. La filtración de flujo tangencial es un proceso de separación dirigido por presión en donde el fluido es bombeado tangencialmente a lo largo de la superficie de una membrana. Una presión aplicada sirve para obligar a la porción del fluido que incluye los contaminantes a través de una membrana hasta el tamaño de filtrado. Particulados y macromoléculas que son demasiado grandes para pasar a través de los poros de membrana son retenidos en el lado superior de la corriente. En comparación con las técnicas de filtración de flujo normal (NFF,) en las que los componentes retenidos se acumulan en la superficie de la membrana, la filtración de flujo tangencial arrastra los componentes retenidos mediante el flujo del fluido.

TFF se clasifica en base al tamaño de los componentes que son separados. Un valor de tamaño de poro de membrana se da típicamente en valores de micra e indica que las partículas más grandes que dicho valor serán retenidas por la membrana. Límite nominal de peso molecular (NMWL), por otro lado, es una indicación de que la mayoría de las macromoléculas disueltas con pesos moleculares mayores que el NMWL y algunas con pesos moleculares menores que el NMWL serán retenidas por la membrana. La forma de un componente, su habilidad para deformarse y su interacción con otros componentes en la solución afectan a la retención. Diferentes fabricantes de membranas emplean distintos criterios para asignar valores de NMWL a una familia de membranas pero el experto en la materia sería capaz de determinar el valor apropiado empíricamente.

La ultrafiltración es una de las formas más ampliamente empleadas de TFF y se usa para separar proteínas de los componentes del tampón mediante intercambio de tampón, desalinización o concentración, pero también puede usarse para la filtración de los extractos celulares clarificados de la invención. Tamaños de poro típicos para la filtración de las microvesículas están en el rango de hasta 0.2 a 0.1 micras. En una realización particular, el TFF contiene una primera membrana que tiene un tamaño de poro de 0,2 micras y una segunda membrana que tiene un tamaño de poro de 0,1 micras de forma que el espacio entre las membranas acumula microvesículas que tienen un diámetro entre 0,2 y 0,1 micras.

En una operación de unidad TFF, se usa una bomba para generar flujo de la corriente de alimentación a través del canal entre las superficies de las dos membranas. Durante cada paso del fluido sobre la superficie de membrana, la presión aplicada obliga a una parte del fluido a pasar a través de la membrana y entrar en la corriente del filtrado. El resultado es un gradiente en la concentración de la materia prima de las condiciones de carga en el centro del canal a las condiciones de la pared más concentrada en la superficie de la membrana. Existe también un gradiente de concentración a lo largo de la longitud del canal de alimentación desde la entrada hasta la salida (retención) en que el fluido de forma más progresiva pasa al lado de filtrado. El flujo de materia prima a lo largo de la longitud de la membrana causa una caída de la presión desde la alimentación hasta el final del material retenido del canal. El flujo sobre el lado del filtrado de la membrana es típicamente bajo y existe poca restricción, de forma que la presión a lo largo de la longitud de la membrana sobre el lado de filtrado es aproximadamente constante.

Las membranas pueden fabricarse a partir de varios materiales que ofrecen alternativas en las características de ”flushing” y compatibilidad química. Materiales apropiados incluyen celulosa, poliétersulfona y otros materiales conocidos por el experto en la materia. En ciertas realizaciones particulares se usa la poliétersulfona. Las membranas típicas de poliétersulfona tienden a adsorber proteínas así como otros componentes biológicos, causando el ensuciamiento de la membrana y una disminución del flujo. Algunas membranas son modificadas hidrofílicamente para que sean más resistentes al ensuciamiento, tal como Biomax (Millipore).

El experto en la materia reconocería que serían útiles varios tipos de módulos de TFF en la puesta en práctica de la invención. Módulos de TFF útiles incluyen pero no se limitan a módulos de plato liso (también conocidos como casetes), módulos enrollados en espiral y módulos de fibra hueca.

Para cualquier módulo, los parámetros claves del proceso pueden ser rápidamente optimizados por el experto en la materia. Dichos parámetros incluyen la velocidad de flujo cruzado, la presión transmembrana (PTM), el control del filtrado, el área de membrana, y el diseño de diafiltración. La velocidad de flujo cruzado depende del módulo seleccionado. En general, una mayor tasa de flujo cruzado da lugar a un mayor flujo a igual PTM e incrementa la acción de barrido a través de la membrana y reduce el gradiente de concentración a través de la superficie de membrana. Muchas aplicaciones de TFF aplican un flujo cruzado y presión en un punto determinado y el filtrado fluye descontrolado y sin restricción fuera del módulo. Este es el tipo de operación más sencilla pero en algunas circunstancias puede ser deseable usar algún tipo de control de filtrado, que se consigue simplemente ajustando la presión con la válvula de retenido. El área de membrana se selecciona tras determinar el flujo del proceso y el volumen total que va a ser procesado y es dependiente también del tiempo del proceso.

La concentración puede llevarse a cabo de forma típica mediante centrifugación a 2.000-4.500 g, tal como entre 2.500-4.000g, o entre 2.750-3.500g, o entre 3.000-.0500, tal como 3.000g ó 3.100g ó 3.200g ó 3.300 g ó 3.400g ó 3.500g.

De forma típica, la centrifugación puede llevar varias horas, es decir, durante más de una hora, tal como durante 110 horas.

Para minimizar cualquier efecto negativo sobre la estabilidad del polipéptido de interés, la centrifugación puede llevarse a cabo, en particular, a una temperatura en el rango de 2 a 200ºC, tal como en el rango de 3-15ºC o en el rango de 3-10ºC o en el rango de 3-6ºC.

Tampones preferidos usados en la TFF son tampón fosfato, tampón HEPES o tampón TRIS. Sin embargo, el tampón en ciertas realizaciones tiene una concentración de 5 mM a 15 mM, incluyendo concentraciones de al menos 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM y 15 mM y que además incluye concentraciones mM entre ellos. En ciertas realizaciones, el tampón tiene un pH de entre 7,2 a 7,5. Por tanto, en una realización el tampón tiene un pH de 7,2, 7,3, 7,4 ó 7,5 o valores de pH fraccionados entre ellos. En otra realización, el tampón de intercambio además comprende de 0,10 a 0,20 M de NaCl y de 3,5% a 4,5% de sacarosa.

En una realización particular, a la preparación de microvesículas obtenida tras la etapa de fraccionamiento por tamaños se le aplica además una segunda etapa de purificación que permite la separación de las microvesículas que tienen la mayor cantidad/actividad de proteína de cualquier otro producto presente en la muestra.

En una realización, dicha segunda etapa de purificación se lleva a cabo mediante una segunda etapa de fraccionamiento por tamaños. En otra realización, la segunda etapa de purificación se puede llevar a cabo por cromatografía de afinidad. Si las microvesículas contienen FT, entonces la cromatografía de afinidad se lleva a cabo usando un compuesto que muestra afinidad por FT (e.g. un anticuerpo). Si las microvesículas contiene unan proteína de fusión que comprende FT y una etiqueta (tag), la cromatografía de afinidad también puede llevarse a cabo mediante el uso de un ligando que muestra afinidad hacia dicha etiqueta (tag). Preferiblemente, la etiqueta es una etiqueta de hexahistidinas, en cuyo caso la cromatografía de afinidad se lleva a cabo usando una columna de afinidad por metales.

Una vez que la preparación de microvesículas se ha purificado, el eluato de la etapa de fraccionamiento se somete a un ensayo para detectar la presencia de la proteína de interés y aquellas fracciones que contienen la mayor la actividad o cantidad de proteína son agrupadas y usadas directamente. El perfil de elución de la columna puede ensayarse por la presencia de una determinada proteína (ELISA; Western blot, RIA y similares) o puede ensayarse por la presencia de actividad de la proteína de interés. El experto en la materia apreciará que el ensayo de la actividad dependerá de la proteína que vaya a ser purificada. En una realización particular, la proteína de interés es FT y la actividad que puede detectarse para identificar aquellas fracciones que contienen las vesículas que comprenden dicha proteína es la actividad procoagulante como se explica en el Ejemplo 5.

Usos terapéuticos de las microvesículas derivadas de levadura portadora de FT de la invención

Diferentes ensayos han demostrado que las microvesículas derivadas de levadura portadora de FT de la invención muestran actividad procoagulante. Efectivamente, el Ejemplo 4 incluye:

a) ensayos in vitro que demuestran que las microvesículas derivadas de levadura portadoras de FT de la invención causan la formación del coágulo de fibrina y la coagulación sanguínea tanto en condiciones saludables como de enfermedad; a saber, dichos ensayos muestran que dichas microvesículas derivadas de levadura portadoras de FT de la invención son capaces de coagular:

-: plasma de sujetos sanos (ensayos de coagulación en plasma);

-: plasma deficiente en FVIII, en FIX o en FXI (ensayos de coagulación en plasma);

-: plasma con deficiencia plaquetaria adquirida (ensayos de coagulación en plasma trombocitopénico);

-: plasma con deficiencia plasmática en FXI en presencia de un anticuerpo anti-FVII (ensayos de

coagulación en plasma);

-: sangre de sujetos sanos (ensayos de coagulación en sangre completa no anticoagulada) y

-: sangre de pacientes hemofílicos (ensayos de coagulación en sangre completa no anticoagulada);

b) ensayos in vivo que demuestran que la microvesícula derivada de levadura portadora de FT de la invención es un agente útil en el tratamiento tópico antihemorrágico en modelos de hemorragia grave (aplicando directamente en el vaso sanguíneo previamente seccionado); a saber, dichos ensayos muestran que dicha microvesícula derivada de levadura portadora de FT es útil como agente hemostático tópico en animales de experimentación tratados y no tratados con heparina.

c) ensayos in vivo que demuestran que la microvesícula derivada de levadura portadora de FT de la invención es un agente útil para el tratamiento tópico antihemorrágico en modelos de hemorragia letal (aplicando directamente en el vaso sanguíneo previamente seccionado); a saber, dichos ensayos muestran que dicha microvesícula derivada de levadura portadora de FT es útil como agente hemostático tópico en un modelo animal de hemorragia letal mediante la sección proximal de las colas de ratones deficientes en FVIII.

Estos resultados muestran claramente que la microvesícula derivada de levadura portadora de FT de la invención es un agente procoagulante o antihemorrágico útil en el tratamiento tópico de hemorragias en un sujeto.

De este modo, la microvesícula derivada de levadura portadora de FT de la invención puede usarse como medicamento, concretamente como un agente antihemorrágico, especialmente, como un agente procoagulante o como un agente antihemorrágico para aplicación tópica, en el tratamiento de hemorragias en un sujeto.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a la microvesícula derivada de levadura portadora de FT de la invención como medicamento. En una realización particular, la invención se refiere a la microvesícula derivada de levadura portadora de FT de la invención como medicamento tópico con actividad procoagulante (antihemorrágica) adecuada para tratar hemorragias en un sujeto.

Aunque la microvesícula derivada de levadura portadora de FT de la invención podría aplicarse tópicamente para tratar la hemorragia en un sujeto, es decir, sin mezclarla con un vehículo farmacéuticamente aceptable, puesto que los componentes del extracto de levadura clarificado (CYE) que comprende dichas microvesículas derivadas de levadura portadoras de FT, obtenidas según el procedimiento de la invención, son sustancialmente inocuas para un sujeto, en general, para la administración a un sujeto, la microvesícula derivada de levadura portadora de FT de la invención se formulará en una forma de administración farmacéutica adecuada para su administración, preferiblemente para su administración tópica en el tratamiento tópico (local) de la hemorragia.

De este modo, en otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica, denominada a partir de aquí en este documento como la composición farmacéutica de la invención, que comprende una microvesícula derivada de levadura portadora de FT de la invención y un vehículo, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dicha composición farmacéutica se formula entonces en una forma de administración farmacéutica adecuada para su administración a un sujeto.

A continuación, para su administración a un sujeto, las microvesículas derivadas de levadura portadora de FT de la invención se formularán en una forma de administración farmacéutica, preferiblemente una forma de administración farmacéutica adecuada para su administración tópica, para cuyo fin se incorporarán los portadores y excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados para la preparación de la forma de administración farmacéutica deseada. La información sobre dichos portadores y excipientes, así como sobre dichas formas de administración adecuada para la administración de dicho producto de la invención, pueden encontrarse en los tratados de galénica. En el libro titulado “Tratado de Farmacia Galénica”, de C. Faulí i Trillo, 1ª Edición, 1993, Ediciones de Luzán 5, S.A., puede encontrarse una revisión de las diferentes formas de administración de fármacos en general, y de sus procedimientos de preparación.

Aunque podrían usarse diferentes formas de administración farmacéutica de microvesículas derivadas de levadura portadoras de FT de la invención, en la práctica es más ventajosa la administración de dicho producto por vía tópica; por tanto dichas microvesículas derivadas de levadura portadoras de FT de la invención se formularán en una forma farmacéutica adecuada para su administración tópica. Ejemplos ilustrativos no limitativos de dichas formas farmacéuticas incluyen aerosoles, soluciones, suspensiones, emulsiones, geles, pomadas, cremas, vendajes, parches, ungüentos, colutorios, etc. Para este fin, la composición farmacéutica de la invención incluirá los vehículos, portadores y/o excipientes farmacéuticamente aceptables requeridos para preparar la forma de administración farmacéutica de microvesículas derivadas de levadura portadoras de FT de la invención.

Por tanto, en una realización particular, la composición farmacéutica de la invención es una composición farmacéutica para la administración tópica de microvesículas derivadas de levadura portadoras de FT de la invención que comprende dicho producto y un vehículo, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable, adecuado para la administración tópica de dichas microvesículas derivadas de levadura portadoras de FT de la invención. Se pueden encontrar ejemplos ilustrativos y no limitativos de vehículos, portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados para la administración tópica de dichas microvesículas derivadas de levadura portadoras de FT en tratados de farmacia galénica.

En una realización particular, la composición farmacéutica de la invención comprende microvesículas de levadura portadoras de FT que comprenden la proteína FT humana o un fragmento de la misma con actividad procoagulante, tal como, por ejemplo, FT humana madura o una proteína FT humana truncada (es decir, una proteína FT humana en la que falta todo o parte del dominio responsable de la unión a FVIIa o una proteína FT humana mutante con actividad procoagulante en la que el dominio responsable de la unión a FVIIa no es funcional.

Las microvesículas derivadas de levadura portadoras de FT de la invención estarán presentes en la composición farmacéutica de la invención en una cantidad terapéuticamente eficaz. Dicha cantidad puede variar dentro de un amplio intervalo, por ejemplo, entre aproximadamente 1,0 pg de proteína activa/ml y 1,0 mg de proteína activa/ml, preferiblemente entre 0,05 !g de proteína activa/ml y 10 !g de proteína activa/ml e incluso más preferiblemente entre aproximadamente 0,1 !g de proteína activa/ml y 2,0 !g de proteína activa/ml.

La dosis de microvesícula derivada de levadura portadora de FT de la invención a administrarse al sujeto puede variar dentro de un amplio intervalo, por ejemplo, entre aproximadamente 1,0 pg de proteína activa/ml y 1,0 mg de proteína activa/ml, preferiblemente entre 0,05 !g de proteína activa/ml y 10 !g de proteína activa/ml e incluso, más preferiblemente entre aproximadamente 0,1 !g de proteína activa/ml y 2,0 !g de proteína activa/ml. La dosis de microvesícula derivada de levadura portadora de FT a administrar dependerá de varios factores, incluyendo entre ellos las características de la proteína FT o fragmento de la misma con actividad procoagulante usado, tal como por ejemplo, su actividad y vida media biológica, la concentración de proteína FT o fragmento de la misma con actividad procoagulante en la formulación, la afección clínica del sujeto o paciente, el trastorno hemorrágico que se va a tratar, etc. Por esta razón, las dosis mencionadas en este documento deben considerarse sólo como orientación para los expertos en la materia, y esta persona podrá ajustar las dosis según las variables mencionadas previamente. Sin embargo, la composición farmacéutica de la invención puede administrarse una o más veces al día con fines preventivos o terapéuticos.

La composición farmacéutica de la invención puede usarse junto con otros fármacos adicionales útiles en la prevención y/o el tratamiento de una diátesis hemorrágica (por ejemplo, factores de coagulación, plasma humano, etc.) para proporcionar una terapia combinada. Dichos fármacos adicionales pueden ser parte de la misma composición farmacéutica o, alternativamente, pueden proporcionarse en forma de una composición separada para su administración simultánea o sucesiva (secuencial en el tiempo) con respecto a la administración de la composición farmacéutica de la invención.

La composición farmacéutica de la invención también puede colocarse en un soporte. Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un producto que comprende la composición farmacéutica de la invención y un soporte. El término “soporte” según se usa en este documento, se refiere a un sustrato de un material adecuado que permite el depósito de la composición farmacéutica de la invención en él, llevándola y liberándola en el sitio deseado, por ejemplo, en el sitio donde la composición farmacéutica de la invención ejerce su efecto terapéutico. Dicho soporte puede ser un soporte sólido o un soporte no sólido, por ejemplo, un soporte líquido o un soporte gaseoso. Los ejemplos ilustrativos no limitantes de soportes sólidos incluyen vendajes, tiritas, compresas, esparadrapos, etc. Los ejemplos ilustrativos no limitantes de soportes líquidos incluyen geles, aerosoles, colutorios, etc. Los ejemplos ilustrativos no limitantes de soportes gaseosos incluyen aire, propelentes, etc.

En una realización particular, la composición farmacéutica de la invención comprende microvesículas de levadura portadoras de FT que comprenden proteína FT humana o un fragmento de la misma con actividad procoagulante, tal como, por ejemplo, FT humana madura o proteína FT humana truncada (es decir, una proteína FT humana en la que falta todo o parte del dominio responsable de la unión a FVIIa o un mutante de la proteína FT humana con actividad procoagulante en la que el dominio responsable de la unión a FVIIa no es funcional).

Este producto que comprende la composición farmacéutica de la invención depositada en un soporte puede obtenerse mediante procedimientos convencionales, por ejemplo, mezclando la composición farmacéutica de la invención y el soporte. La interacción entre la composición farmacéutica de la invención y el soporte puede ser una interacción física o química, dependiendo de la naturaleza de los componentes de la composición farmacéutica de la invención y del soporte usado.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de la microvesícula derivada de levadura portadora de FT de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de hemorragias en un sujeto, en particular, para el tratamiento tópico de hemorragias en un sujeto sano o en un sujeto con diátesis hemorrágica.

La expresión “tratamiento tópico”, según se usa en este documento, se refiere a la aplicación del tratamiento directamente en el lugar donde se necesita, por ejemplo, en secciones discontinuas de la piel (cortes, etc.) y en el tejido vascular (rotura de vasos, etc.) en hemorragias venosas y arteriales debidas a heridas abiertas, cirugía, etc., y en hemorragias mucocutáneas y microvasculares.

Según esta invención y como se muestra en el Ejemplo 4, las microvesículas derivadas de levadura portadora de FT de la invención pueden actuar como un agente procoagulante o antihemorrágico y, consecuentemente, dicho producto puede usarse para tratar o corregir trastornos hemorrágicos, especialmente aquellos trastornos hemorrágicos asociados con diátesis hemorrágica.

La expresión “diátesis hemorrágica” se refiere al proceso que causa un trastorno hemostático y que como resultado da lugar a la aparición de un síndrome hemorrágico que ocasionalmente puede darse con un sangrado extenso y excesivo. La diátesis hemorrágica puede estar causada por una coagulopatía congénita o adquirida y/o por un trastorno plaquetario congénito y adquirido.

El término "coagulopatía" se refiere a un trastorno de un factor de coagulación. Este trastorno puede ser debido a una deficiencia o déficit de un factor de coagulación específico, cuya consecuencia será la aparición de un síndrome hemorrágico, o debido a un trastorno de un factor de coagulación. La coagulopatía generalmente puede ser una coagulopatía congénita o una coagulopatía adquirida.

Como ejemplos ilustrativos no limitantes de coagulopatías congénitas pueden mencionarse deficiencias de factores de coagulación seleccionadas entre las del factor V (FV) de coagulación, factor VII (FVII) de coagulación, factor VIII (FVIII) de coagulación, cuyo déficit o deficiencia causa hemofilia A, factor IX (FIX) de coagulación cuyo déficit o deficiencia causa hemofilia B, factor X (FX) de coagulación, factor IX (FIX) de coagulación, cuyo déficit o deficiencia causa hemofilia C, factor XII (FXII) de coagulación, factor XIII (FXIII) de coagulación y sus combinaciones.

Las coagulopatías adquiridas pueden tener orígenes diferentes. Ejemplos ilustrativos incluyen deficiencias en la síntesis de factor de coagulación en insuficiencia hepática grave, terapia anticoagulante (tal como heparina, heparinas de bajo peso molecular, warfarina, derivados de cumarina, dicumarinas, etc.). Un mecanismo alternativo se basa en un consumo exagerado de factores de coagulación, de modo que no están disponibles para formar el coágulo en una lesión sangrante. Este mecanismo tiene lugar en el síndrome de coagulación o coagulopatía intravascular diseminada debido al consumo que se da en enfermedades múltiples tales como sepsis grave que daña la microcirculación en el endotelio, activando plaquetas y factores de coagulación, con la formación de múltiples microtrombos; en la invasión de la sangre por FT, tal como en la liberación placentaria; en la retención de un feto muerto; en traumas múltiples con aplastamiento de tejidos; en mordeduras de serpientes venenosas, etc. En la vasculitis, el daño parietal y endotelial libera activadores de coagulación. El consumo de factores de coagulación se agrava con la lisis de la fibrina de los numerosos microtrombos debido a la acción de la plasmina con liberación de PDF, que son antiplaquetarios y anticoagulantes.

La expresión “trastorno plaquetario” se refiere a un trastorno tanto en el número como en la capacidad funcional de las plaquetas, cuyo resultado es la aparición de un síndrome hemorrágico. Dicho trastorno plaquetario puede ser congénito o adquirido.

En una realización particular, dicho trastorno plaquetario es un trastorno plaquetario congénito. Los ejemplos ilustrativos no limitantes de trastornos plaquetarios congénitos incluyen la enfermedad de Glanzmann, enfermedad de Bernard Soulier, síndrome de Bolin-Jamieson, síndrome de Wiskott-Aldrich, síndrome de Paris-Trousseau-Jacobsen, trombocitopenia del cromosoma X, síndrome plaquetario de Gray, síndrome de Sebastian y anemia de Fanconi.

En otra realización particular, dicho trastorno plaquetario es un trastorno plaquetario adquirido. Ejemplos ilustrativos no limitantes de trastornos plaquetarios adquiridos incluyen trastornos mieloproliferativos, tales como trombocitemia, policitemia, leucemia mielocítica crónica, etc.; hay trastornos plaquetarios funcionales en metaplasia mieloide con el tiempo de sangrado aumentado, defectos en la retención de perlas de vidrio, defecto en la agregación de plaquetas, liberación anómala y defecto del factor III plaquetario. Los defectos plaquetarios funcionales se han encontrado en disproteinemias del escorbuto y en enfermedad cardiaca congénita y en cirrosis.

Las expresiones “coagulopatía adquirida” y “trastorno plaquetario adquirido” se refieren al origen del trastorno, que puede ser iatrogénico o secundario a otra enfermedad.

El término “sujeto” según se usa en este documento incluye cualquier miembro de una especie animal, incluyendo la especie humana; a modo de ejemplo ilustrativo no limitante, dicho sujeto puede ser un mamífero, tal como un primate, un animal doméstico, un roedor, etc., preferiblemente dicho sujeto es un hombre o una mujer de cualquier edad o raza. En una realización particular, dicho sujeto es un ser humano sin antecedentes de trastornos de la hemostasis, tal como un individuo que no tiene coagulopatías o trastornos plaquetarios. En otra realización particular, dicho sujeto es un ser humano que tiene antecedentes de trastornos de la hemostasis, tal como un individuo que tiene diátesis hemorrágica, por ejemplo, una coagulopatía, tal como una coagulopatía congénita o adquirida, o un trastorno plaquetario, tal como un trastorno plaquetario congénito o adquirido.

Por tanto, en una realización particular, la invención se refiere al uso de microvesículas derivadas de levadura portadoras de FT de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento tópico de hemorragias en un ser humano sin antecedentes de trastornos de la hemostasis. En otra realización particular, la invención se refiere al uso de microvesículas derivadas de levadura portadoras de FT de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento tópico de hemorragias en un ser humano que tiene una diátesis hemorrágica.

Como se mencionó anteriormente, para la administración tópica a un sujeto, las microvesículas derivadas de levadura portadoras de FT de la invención se formularán en una forma farmacéutica adecuada para su administración tópica en el tratamiento tópico (local) de hemorragias en un sujeto. Ejemplos ilustrativos no limitantes de dichas formas farmacéuticas incluyen aerosoles, soluciones, suspensiones, emulsiones, geles, pomadas balsámicas, cremas, vendajes, parches, pomadas, colutorios, etc. Para este fin, la composición farmacéutica que comprende microvesículas derivadas de levadura portadoras de FT de la invención incluirá los vehículos, portadores y excipientes farmacéuticamente aceptables requeridos para la preparación de la forma de administración farmacéutica elegida. La información con respecto a la composición farmacéutica (forma de administración farmacéutica, dosis, cantidad del compuesto activo, etc.) se ha mencionado ya en conexión con la composición farmacéutica de la invención.

También se ha descrito que el FT induce angiogénesis e incrementa la producción de VEGF (Ollivier et al., 2000, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 20:1374-1381; Chen et al., 2000, Thromb.Haemost., 86:334-345 y Watanabe et al., 1999, Thromb.Res., 96:183-189). Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con las microvesículas derivadas de levadura de la invención para el tratamiento de enfermedades en las que se requiere una angiogénesis incrementada o migración celular incrementada, en donde dicha enfermedad se selecciona de miocardio isquémico, infarto de miocardio, cardiomiopatía isquémica, claudicación de una isquemia límbica crónica, ulceración/gangrena isquémica/dolor en reposo, neuropatía/derrame cerebral isquémico, penumbra isquémica cerca del derrame cerebral/infarto, placa aterosclerótica inestable/ulcerada en arterias coronaria/carótida, trombosis aguda o crónica arterial y/o venosa, cicatrización de herida, derrame cerebral isquémico y hemorrágico, lesiones traumáticas y úlceras.

Enfermedades asociadas con una angiogénesis reducida que podrían beneficiarse del tratamiento de las composiciones promotoras de angiogénesis de la invención incluyen enfermedades de la arteria coronaria e.g. miocardio isquémico, infarto de miocardio, cardiomiopatía isquémica o enfermedad arterial periférica tal como claudicación de isquemia límbica crónica (músculo esquelético) o dolor en las extremidades durante el descanso/isquemia ulceración/gangrena. También se requiere promover la angiogénesis en accidentes cerebrales isquémicos/neuropatías, tales como tejido nervioso/cerebro, e.g., penumbra isquémica alrededor de un infarto/ataque. Alternativamente, el efecto proangiogénico de las composiciones de la invención puede ser utilizado para promover la cicatrización y/o endotelialización de las superficies luminales intravasculares, por ejemplo, para promover la endotelialización de placas ateroscleróticas inestables/ulceradas, e.g., en arterias coronarias/ carótidas,

o en superficies luminales desendotelializadas tales como las encontradas después de una endarterectomía, por ejemplo, dentro de la arteria carótida, trombectomía (arterial y/o venosa), angioplastia, tal como angioplastia por balón, láser, o criogénica, una aterectomía, o tras trombólisis, administrando una composición que incluye un agente de óxido nítrico. Las composiciones proangiogénicas de la invención también pueden ser útiles en la resolución de trombosis arterial y/o venosa aguda o crónica, por ejemplo, revascularización y/o neovascularización y/o recanalización. En otra realización, las composiciones de la invención promueven el desarrollo de lechos neocapilares para aplicaciones en terapia génica, aplicaciones en regeneración de órganos y para órganos híbridos bioartificiales (e.g. páncreas, riñón, pulmón, hígado), colocamiento así como promoción y/o potenciación de la cicatrización de heridas y/o para promover granulación tisular, por ejemplo, para heridas crónicas tales como heridas isquémicas, diabéticas, neuropáticas basadas en estasis venoso.

También se ha descrito que el FT promueve la migración celular (Ott et al., 2005, Circulation, 111:349-355 and WO0105353). Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con composiciones que comprenden el FT de la invención para promover la migración celular en pacientes que lo necesitan. Será evidente que se pueden tratar diferentes enfermedades dependiendo del tipo celular cuya migración se desea estimular con las composiciones de la invención. Por ejemplo, los pacientes que sufren una lesión en un lumen corporal tal como un vaso sanguíneo, arteria, arteria coronaria, vena, lumen esofágico, y uretra, requieren una estimulación de la migración de células endoteliales; los pacientes que sufren lesiones en el sistema nervioso central como resultado de un accidente cerebral isquémico y hemorrágico (“ischemic and hemorrhagic stroke”), y de una lesión traumática requerirán una estimulación de las células neurales al sitio de la lesión; los pacientes que sufren úlceras que pueden ser crónicas y resistentes al tratamiento en, por ejemplo, pacientes diabéticos y ancianos, e.g. úlceras en piernas y escaras por reposo en cama, heridas corneales, quemaduras, abrasiones, incisiones quirúrgicas, sitios de injerto del donante (“donor graft sites”), y lesiones causadas por agentes infecciosos. Otras afecciones médicas que pueden ser tratadas son condiciones crónicas (tales como úlcera venosa crónica, úlcera diabética, úlcera por compresión, llagas por presión) y úlceras o llagas de la superficie de la mucosa), lesiones de la superficie de la piel y epitelio causadas por una infección o afección inflamatoria persistente, o por un defecto genético (tal como formación de queloides y anormalidades de la coagulación) se beneficiarán de una estimulación de una migración de células epiteliales necesarias para repoblar el tejido dañado.

Composición que comprende microvesículas derivadas de levadura portadoras de FT de la invención

En otro aspecto, la invención se refiere a una composición, referida a partir de ahora en este documento como “la composición de la invención”, que comprende microvesículas derivadas de levadura portadoras de FT de la invención y un vehículo.

Prácticamente, puede usarse en dicha composición de la invención cualquier vehículo que no afecta de manera adversa a las microvesículas derivadas de levadura portadora de FT de la invención.

En una realización, dicho vehículo es un medio sustancialmente líquido, tal como el medio que rodea a las microvesículas derivadas de levadura portadoras de FT de la invención obtenidas poniendo en práctica el procedimiento de la invención. Por tanto, en una realización particular, la composición de la invención comprende el extracto de levadura clarificado obtenido en la práctica del procedimiento de la invención.

FT truncada que carece de todo o parte del dominio responsable de la unión a FVIIa

Como se mencionó anteriormente, sorprendentemente, los inventores han encontrado que una proteína FT truncada, incapaz de unirse a FVIIa, tiene actividad procoagulante. Como puede verse en el Ejemplo 4, los inventores han mostrado que dicha forma truncada de la proteína FT tiene actividad procoagulante en un ensayo de coagulación en el plasma.

De este modo, se describe un FT truncado que carece de todo o parte del dominio responsable de la unión a FVIIa, denominado a partir de ahora en este documento como “FT truncado carente del dominio de unión a FVIIa de la invención”, en el que falta todo o parte del dominio responsable de la unión al factor FVIIa y, en consecuencia, es incapaz de unirse a FVIIa, pero tiene actividad procoagulante. Por extensión, dicho “FT truncado carente del dominio de unión a FVIIa de la invención” incluye mutantes de la proteína FT con actividad procoagulante en los que el dominio responsable de la unión a FVIIa no es funcional debido a mutaciones.

El FT truncado carente del dominio de unión a FVIIa de la invención puede obtenerse por medios convencionales, por ejemplo, por medios de expresión génica de la secuencia de nucleótidos que codifica dicha proteína en un sistema de expresión adecuado (levadura, bacteria, células eucariotas, células de insectos, etc.).

Para determinar si la FT truncada carente del dominio de unión a FVIIa de la invención es capaz de unirse a FVIIa, pueden usarse ensayos de unión como el descrito en la publicación internacional WO00/04148. Además, la actividad procoagulante del FT truncado que carece del dominio de unión a FVIIa puede evaluarse como se ha mencionado previamente, por ejemplo, mediante cualquiera de los ensayos de coagulación mencionados en el Ejemplo 4, tal como mediante un ensayo de coagulación in vitro en plasma o mediante un ensayo de coagulación in vitro en sangre completa no anticoagulada, o mediante un ensayo in vivo en un modelo animal de hemorragia grave o mediante un ensayo in vivo en un modelo animal de hemorragia letal, tal como los ensayos mencionados en el Ejemplo 4.

En una realización particular, dicho FT truncado carente del dominio de unión a FVIIa comprende el dominio de interacción con el Factor X, la región transmembrana y la cola citoplasmática y carece, parcial o totalmente, del dominio responsable de la unión a FVIIa. Adicionalmente, en una realización específica, dicho FT truncado carente del dominio de unión a FVIIa es una forma truncada de la proteína FT humana que contiene el dominio de interacción con el factor X (aa 174-251), la región transmembrana (aa 252-274) y la cola citoplasmática (aa 275-295) y una etiqueta de histidinas adicional (Ejemplo 3). Sorprendentemente, los inventores han descubierto ahora que dicha forma truncada de la proteína FT, que carece del dominio responsable de la unión a FVIIa, tiene actividad procoagulante (Ejemplo 4, Tabla 3).

En otra realización, el FT es modificado mediante una o más mutaciones puntuales en el dominio de unión a FVIIa de manera que dicho dominio ya no es capaz de unirse a FVIIa. Se conocen mutaciones puntuales en el dominio de unión a FVIIa de FT que impiden la unión a dicho FVIIa (e.g. las descritas por Kelley, R.F. et al., 1995, Biochemistry, 34:10383-10392, cuyos contenidos se incorporan en esta descripción por referencia en su totalidad).

Sorprendentemente se ha observado que dicho fragmento de FT, que carece de todo o parte del dominio responsable de la unión a FVIIa, tiene actividad procoagulante puesto que, como es bien conocido, en la ruta extrínseca de coagulación sanguínea, el FT se une al FVII/FVIIa circulante para formar el complejo FT::FVIIa y, en presencia de calcio, actuar como sustrato para que tenga lugar de ese modo la activación de FX. Está aceptado que en el caso de una hemorragia producida por una lesión vascular, la coagulación se desencadena debido a que la activación de la ruta extrínseca implica la interacción de FT con su ligando, FVII/FVIIa.

El FT truncado carente del dominio de unión a FVIIa dominio de la invención puede estar glucosilado o no. De este modo, en una realización particular, el FT truncado carente del dominio de unión a FVIIa de la invención no está glucosilado, mientras que en otra realización particular, dicho FT truncado carente del dominio de unión a FVIIa de la invención está glucosilado. Como se ha mencionado anteriormente, el término “glucosilado” incluye cualquier grado de glucosilación.

FT mutantes que tienen uno o más sitios de glucosilación no funcionales

Tal como se ha mencionado, los inventores también han observado que la actividad procoagulante del FT así como su expresión en células hospedadoras de levadura se incrementa cuando dicho FT tiene mutaciones en los sitios de glucosilación que impiden la unión de al menos una de las tres cadenas N-glucosilo encontradas en el FT tipo salvaje. De este modo, la microvesícula derivada de levadura portadora de FT comprende un fragmento no glucosilado de la proteína FT con actividad procoagulante. Como se ha mencionado anteriormente, el término “glucosilado” incluye cualquier grado de glucosilación. La variante de FT puede ser un polipéptido en el que al menos uno de los sitios de N-glucosilación del FT ha sido modificado para hacerlo no-funcional, es decir, incapaz de servir como sitio aceptor para la adición de cadenas de glicósido. Los sitios de N-glucosilación en la secuencia del FT que pueden ser modificados han sido mencionados previamente, es decir, el sitio Asn11-Leu12-Thr13, el sitio Asn124-Val125-Thr126 y/o el sitio Asn137-Asn138-Thr139. Cualquier modificación de las regiones consenso de Nglucosilación es adecuada en tanto en cuanto la adición de la cadena N-glucosilo resulta impedida o sustancialmente inhibida. Preferentemente, la modificación es introducida en el residuo Asn correspondiente a las posiciones 11, 124 y/ó 136 del FT humano maduro, ya que ese residuo sirve como aceptor para la unión de la cadena de glucosilo. Tal como aquí se utiliza “sitios correspondientes a los sitios 11, 124 y/o 136 en el FT humano maduro” se refiere a sitios de N-glucosilación en otros ortólogos de FT que pueden aparecer en una posición diferente en la cadena polipeptídica pero que se corresponden con los sitios de N-glucosilación en el FT humano maduro cuando las secuencias humana y ortóloga se alinean en base a la similitud de secuencias. Un algoritmo adecuado para el alineamiento de múltiples secuencias de FT y, por tanto, para identificar los sitios de N– glucosilación en ortólogos de FT correspondientes a los sitios en el FT humano maduro es el programa PILEUP que forma parte del GCG Software Package(Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Versión 7, Madison, Wis.). PILEUP crea un alineamiento de múltiples secuencias a partir de un grupo de secuencias relacionadas usando alineamientos por pares, progresivos, para mostrar la relación y el porcentaje de identidad de secuencia. PILEUP usa una simplificación del método de alineamiento progresivo de Feng y Doolittle, J.Mol. Evol.,

35: 351-360 (1987). Preferentemente, los residuos de Asn en las posiciones 11, 124 y/ó 136 se sustituyen por Ala. De este modo, en una realización preferida, la variante de FT que forma parte de las microvesículas se selecciona deN11A, N124A, N137A, N11A y N124A, N11A y N137A, N124A y N137A y N11A, N124A y N137A en el FT humano maduro. En cualquier otro ortólogo de FT, las mutaciones tendrán lugar en los residuos de Asn correspondientes que forman los sitios consenso de N-glucosilación.

El FT truncado carente del dominio de unión a FVIIa, el FT mutante que tiene el dominio de unión a FVIIa no funcional y los mutantes que llevan uno o más sitios de N-glucosilación no funcionales de la invención, pueden ser un miembro de una proteína de fusión, conteniendo dicha proteína de fusión una primera región que comprende dicho FT truncado carente del dominio de unión a FVIIa, teniendo dicho FT mutante un dominio de unión al FVIIa no funcional y teniendo dichos FT mutantes uno o más sitios de N-glucosilación no funcionales unida a una segunda región que comprende otro péptido o proteína. Dicha segunda región puede estar unida a la región amino terminal de dicho FT truncado carente del dominio de unión a FVIIa, teniendo dicho FT mutante un dominio de unión al FVIIa no funcional y teniendo dichos FT mutantes que tienen uno o más sitios de N-glucosilación no funcionales de la invención o, alternativamente, dicha segunda región puede estar unida a la región carboxilo terminal de dicha FT truncada carente del dominio de unión a FVIIa, teniendo dicho FT mutante un dominio de unión al FVIIa no funcional y teniendo dichos FT mutantes uno o más sitios de N-glucosilación no funcionales. Tanto la primera como la segunda región pueden estar unidas directamente o pueden unirse a través de un polipéptido engarce entre dichas primera y segunda región.

En una realización particular, dicha proteína de fusión comprende un FT truncado carente del dominio de unión a FVIIa, un FT mutante que tiene un dominio de unión al FVIIa no funcional o un FT mutante que tiene uno o más sitios de N-glucosilación no funcionales y una etiqueta, normalmente una etiqueta peptídica, unida al dominio Cterminal o N-terminal de dicho FT truncado carente del dominio de unión a FVIIa. Generalmente, dicha etiqueta es un péptido o una secuencia de aminoácidos que puede usarse en el aislamiento o purificación de dicha proteína de fusión. Previamente se han mencionado ejemplos ilustrativos no limitantes de dichas etiquetas. En una realización particular, dicha etiqueta es una etiqueta de His unida al dominio C-terminal de dicha proteína FT. En otra realización, dicha etiqueta es una His-tag unida al dominio N-terminal de dicha proteína FT.

El FT truncado carente del dominio de unión a FVIIa, el FT mutante que tiene un dominio de unión al FVIIa no funcional y los FT mutantes que tienen uno o más sitios de N-glucosilación no funcionales pueden usarse como medicamento, por ejemplo, como agente procoagulante en el tratamiento de hemorragias en un sujeto.

Por tanto, también se describe dicho FT truncado carente del dominio de unión a FVIIa, dicho FT mutante teniendo un dominio de unión al FVIIa no funcional y dichos FT mutantes teniendo uno o más sitios de N-glucosilación no funcionales como medicamento. También se describe dicho FT truncado carente del dominio de unión a FVIIa de la invención, dicho FT mutante teniendo un dominio de unión al FVIIa no funcional y dichos FT mutantes que tienen uno o más sitios de N-glucosilación no funcionales como medicamento con actividad procoagulante adecuado para el tratamiento de hemorragias en un sujeto.

Adicionalmente, se describe una composición farmacéutica que comprende un FT truncado carente del dominio de unión a FVIIa, un FT mutante que tiene un dominio de unión al FVIIa no funcional o un FT mutante que tiene uno o más sitios de N-glucosilación no funcionales y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización particular, dicha composición farmacéutica es una composición farmacéutica para la administración tópica de una FT truncada carente del dominio de unión a FVIIa de la invención, que comprende una proteína FT truncada carente del dominio de unión a FVIIa, un mutante FT que tiene un dominio de unión al FVIIa no funcional o un FT mutante que tiene uno o más sitios de N-glucosilación no funcionales, y un portador farmacéuticamente aceptable adecuado para la administración tópica de dicho FT truncado carente del dominio de unión a FVIIa, o del mutante de FT que tiene uno o más sitios de N-glucosilación no funcionales.

También se describe un FT truncado carente del dominio de unión a FVIIa, un FT mutante que tiene un dominio de unión a FVIIa no funcional y unos FT mutantes que tienen uno o más sitios de N-glucosilación no funcionales para el tratamiento de una enfermedad que requiere promover la migración celular y/o la angiogénesis en un sujeto. También se describe un FT truncado carente del dominio de unión al FVIIa, un FT mutante que tiene un dominio de unión al FVIIa no funcional y un FT mutante que tiene uno o más sitios de N-glucosilación no funcionales para promover la angiogénesis y/o para promover la migración celular en un sujeto que lo necesita.

En general, para la administración a un sujeto, el FT truncado carente del dominio de unión a FVIIa, el FT mutante que tiene un dominio de unión a FVIIa no funcional o los FT mutantes que tienen uno o más sitios de N-glucosilación no funcionales se formularán en una forma farmacéutica adecuada para su administración tópica en el tratamiento tópico (local) de la hemorragia. Ejemplos ilustrativos no limitantes de dichas formas farmacéuticas incluyen aerosoles, soluciones, suspensiones, emulsiones, geles, pomadas balsámicas, cremas, vendajes, parches, ungüentos, colutorios, etc. Para este fin, la composición farmacéutica que comprende el FT truncado carente del dominio de unión a FVIIa incluirá los portadores y excipientes farmacéuticamente aceptables requeridos para la preparación de la forma de administración farmacéutica elegida. Por tanto, en una realización particular, esta composición farmacéutica de la invención comprende, además de la proteína FT truncada de la invención, un vehículo farmacéuticamente aceptable como puede encontrarse en tratados de galénica.

El FT truncado carente del dominio de unión a FVIIa, el FT mutante que tiene un dominio de unión al FVIIa no funcional y dichos FT mutantes que tienen uno o más sitios de N-glucosilación no funcionales estarán presentes en esta composición farmacéutica en una cantidad terapéuticamente eficaz. Dicha cantidad puede variar dentro de un amplio intervalo, por ejemplo, entre aproximadamente 1,0 pg de proteína activa/ml y 1,0 mg de proteína activa/ml, preferiblemente entre 0,05 !g de proteína activa/ml y 10 !g de proteína activa/ml e incluso más preferiblemente entre aproximadamente 0,1 !g de proteína activa/ml y 2,0 !g de proteína activa/ml.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una secuencia de un polinucleótido que codifica dicho FT truncado carente del dominio de unión a FVIIa, dicho FT mutante teniendo un dominio de unión a FVIIa no funcional y dichos FT mutantes teniendo uno o más sitios de N-glucosilación no funcionales.

También se describe un vector que comprende una secuencia polinucleotídica tal y como se describe en el presente documento. Vectores adecuados para su empleo en la invención incluyen vectores de expresión procarióticos tales como pUC18, pUC19, Bluescript y sus derivados mp18, mp19, pBR322, pMB9, CoIEl, pCR1, RP4, fagos y vectores lanzadera tales como pSA3 y pAT28, vectores de expresión en levaduras tales como plásmidos 2 micras, plásmidos integrativos, vectores YEP, plásmidos centroméricos y similares, vectores de expresión en plantas tales como pIBI, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB, pMDC, pMY, pORE y similares, vectores de expresión en células de insecto, e.g., pAC y pVL, vectores de expresión eucarióticos basados en vectores virales (adenovirus, virus adenoasociados, retrovirus y lentivirus) así como vectores no virales tales como pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl, pZeoSV2, pCI, pSVL y pKSV-10, pBPV-1, pML2d y pTDTl.

También se describe una célula hospedadora que comprende un polinucleótido según se define más arriba o dicho vector como se ha definido más arriba. Células adecuadas que se pueden usar, preferiblemente, son las células eucariotas, más preferiblemente una célula de vertebrado o invertebrado, células de insecto o células fúngicas, incluso más preferiblemente la célula de vertebrado es una célula de Xenopus, una célula aislada de un pez cebra o células de mamífero. Preferiblemente, la célula de mamífero es una célula de una línea celular estable tal como CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK 293, 3T3, WI38 y similares, células madre embrionarias, una célula madre adulta o una célula somática.

También se describe un anticuerpo que se une específicamente a un FT truncado carente del dominio de unión a FVIIa, un FT mutante que tiene un dominio de unión a FVIIa no funcional o FT mutantes que tienen uno o más sitios de N-glucosilación no funcionales. Anticuerpos apropiados incluyen anticuerpos “intactos”, que comprenden una región variable de unión a antígeno así como un dominio constante de cadena ligera (CL) y dominios constantes de cadena pesada, CH1, CH2 y CH3, fragmentos “Fab” que resultan de la digestión con papaína de un anticuerpo intacto y que comprende un único sitio de unión al antígeno y una región CL y una región CH1, fragmentos “F(ab’)2” que resultan de la digestión con pepsina de un anticuerpo intacto y que contienen dos sitios de unión a antígeno, fragmentos “Fab” contienen el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada y tiene un único sitio de unión a antígeno. Los fragmentos Fab’ difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el carboxilo terminal del dominio CH1 de la cadena pesada que incluyen una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo, “Fv” es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de unión a antígeno y uno de reconocimiento a antígeno completo, fragmentos de anticuerpo “scFv” que comprenden los dominios VL y VH de un anticuerpo o cadena sencilla, en donde estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica, “diabodies” comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado por un engarce peptídico que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena y “anticuerpos biespecíficos” (BAcs) son anticuerpos sencillos, divalentes (o fragmentos inmunoterapéuticamente efectivos de los mismos) que tienen dos sitios de unión a antígeno específicos diferentes.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deberían considerarse como una limitación de la misma.

Ejemplos

Los Ejemplos 1-3 describen la producción en levaduras de un producto procoagulante basado en la expresión de (i) la proteína FT humana madura, opcionalmente en forma de una proteína de fusión fusionada con una His-tag (Ejemplo 3) y de (ii) una forma truncada de una proteína FT humana fusionada con una His-tag (Ejemplo 4) y de (iii) mutantes de N-glucosilación del FT humano (Ejemplo 5). Dichos productos procoagulantes, todos juntos, se denominan genéricamente en el Ejemplo 6, por simplicidad, como factor tisular microvesiculado, FT microvesiculado

o mFT. El ejemplo 2 enseña la purificación de mFT.

El Ejemplo 6 describe algunos ensayos in vitro realizados con el fin de evaluar la capacidad de dicho mFT para provocar el coágulo de fibrina en sujetos sanos y hemofílicos a concentraciones diferentes así como algunos ensayos in vivo realizados con el fin de evaluar la capacidad de dicho mFT para tratar hemorragias en modelos de hemorragia grave y letal.

EJEMPLO 1

Producción de un producto procoagulante basado en la expresión de la proteína FT de longitud completa en levadura (CYE-FT)

1.1. Vector de expresión en levadura

Para la expresión de FT recombinante, se generó un vector episomal de levaduras (pTT-10301) a partir de los plásmidos pG1 (Nº de la ATCC 37305) y Yep352 (Nº de la ATCC 37673) siguiendo la estrategia de clonación mostrada en la Figura 1. El plásmido pTT-10301 contiene los siguientes elementos:

i) el gen URA3 que permite la selección de la levadura recombinante en ausencia de uracilo en el medio de cultivo, ii) el gen de resistencia a ampicilina (Amp) para la selección y propagación del vector plasmídico en E. coli. iii) el origen de replicación 2 micras (2!) de levadura, que permite la replicación episomal del vector en levadura, iv) el promotor de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GPD), que controla la transcripción de los genes situados downstream. v) la señal específica de terminación de transcripción de levadura de la fosfoglicerato quinasa (PGK) y vi) un sitio de restricción BamHI único que permite la clonación de genes seleccionados bajo el control del promotor de GPD (pGPD) y seguido de la secuencia de terminación de PGK (PGKt).

La Figura 1A muestra el mapa del vector plasmídico pTT10301. El análisis con endonucleasas de restricción para confirmar la correcta organización de todos los elementos en el plásmido se muestra en la Figura 1B.

Para la amplificación del plásmido se usó la cepa DH5a de E. coli (Stratagene). Las células bacterianas portadoras del plásmido pTT10301 se cultivaron a 37ºC en medio de cultivo Luria Broth Ampicilina (LBA) (triptona al 1%, NaCl al 1%, extracto de levadura a 0,5%, 50 mg de ampicilina por ml). Las soluciones madre de glicerol de cultivos bacterianos recombinantes que contiene el plásmido pTT-10301 se mantuvieron a -80ºC.

1.2. Gen recombinante

El factor tisular (FT) es una proteína de 295 aminoácidos (aa) con una secuencia líder de 32 aa. La proteína madura puede dividirse en tres dominios: un dominio extracelular (aa 33-251), una región transmembrana (aa 252-274) y una cola citoplasmática (aa 275-295). La Figura 2 muestra el perfil de hidropatía de la proteína FT humana (hFT).

Mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), el ADNc que codifica la proteína hFT madura (aa 33-295) se amplificó como un fragmento de 816 pb. Para esta reacción de PCR, se usó como molde una biblioteca de ADNc de placenta humana (Marathon-Ready cDNA, Clontech Laboratorios, Inc), y se usaron como cebadores los oligonucleótidos A (SEQ. ID NO:1) y B (SEQ. ID NO:2), que hibridan respectivamente con el extremo 5’ o 3’ del gen del FT humano.

La Figura 3 muestra la secuencia de hibridación de los cebadores A (SEQ. ID NO:1) y B (SEQ. ID NO:2) dentro de la secuencia del ADN de hFT (nº de acceso a GenBank Nº BC011029). El cebador identificado como SEQ. ID NO:1

codifica los cuatro primeros aminoácidos del hFT maduro carente del péptido señal y que contiene un codón de iniciación ATG en fase con el ORF de hFT.

Las condiciones de la PCR fueron las siguientes: 35 ciclos de PCR (94ºC, 30 s; 45ºC 30 s, 72ºC 1 minuto) y una etapa de extensión final de 7 minutos a 72ºC. A continuación, se purificó el producto de PCR (sistema de purificación de ADN de Qiagen).

1.3. Generación del vector de expresión plasmídico FTr

El fragmento de ADN amplificado por PCR obtenido como se menciona en la Sección 1.2 se digirió con BamHI para eliminar los extremos, se precipitó con etanol y se clonó en el vector pTT10301 previamente digerido con BamHI. Tras el análisis con endonucleasas de restricción de varios clones, se seleccionó un plásmido que contenía el gen del hFT maduro recombinante (denominado a partir de ahora en este documento FTr) en la orientación correcta con respecto al promotor GPD (pGPD), denominado pTT10302 (Figura 4).

La secuencia del ADN del FTr contenido en el plásmido pTT10302 era idéntica al 100% con la secuencia publicada (GenBank Nº BC011029). La secuencia de ADN del ADN que codifica FTr se realizó en un secuenciador automático (ABI prism 370, Applied Biosystems) usando los cebadores A (SEQ. ID NO:1) y B (SEQ. ID NO:2) y reactivos del Big Dye Terminator. Las células de E. coli DH5a portadora del plásmido pTT10302 se crecieron durante una noche a 37ºC en medio LBA y se usaron para preparar soluciones madre de glicerol, que se mantuvieron a -80ºC.

1.4. Expresión de FTr por levadura recombinante

Para generar una levadura recombinante que exprese el factor tisular humano maduro recombinante (FTr), se usó el vector de expresión pTT10302 para transformar células de levadura T73 ura3-.

T73 ura3-es un derivado de la cepa T73 de S. cerevisiae muy bien caracterizado, que se usa mucho en la producción de vino. T73 es una cepa diploide seleccionada en la región de Alicante, España (Colección Española de Cultivos Tipo, número de acceso CECT1894) y se comercializa en todo el mundo para la industria alimentaria por Lallemand Inc. (Montreal, Quebec, Canadá). La cepa T73 ura3-es un derivado de T73 en el que se han alterado ambas copias del gen URA3 (J. Agric. Food Chem. 1998, 46, 1689-1693). T73 ura3-es una cepa de levadura URAfenotípicamente estable y segura para la alimentación que permite la generación de levaduras recombinantes T73 usando los vectores plasmídicos que llevan el gen marcador de selección URA3.

Para generar soluciones madre de trabajo, las células T73 ura3– se crecieron en una placa Petri y se aisló una única colonia que se creció a 30ºC en medio YPD (extracto de levadura al 1%, peptona bacteriológica al 2%, glucosa al 2%) hasta alcanzar una densidad de 107 células/ml. A continuación, las células de levadura se sedimentaron mediante centrifugación, se resuspendieron en glicerol al 15% en medio mínimo selectivo (base de nitrógeno de extracto de levadura y medio sintético completo sin uracilo; YNB CSM-URA) y se congelaron en alícuotas a -80ºC hasta su uso. Se descongelaron tres alícuotas elegidas al azar y se analizó la ausencia de contaminación bacteriana. En primer lugar, se descongeló una nueva alícuota T73 ura3-y se hizo que las células fueran susceptibles a la adquisición del vector plasmídico según el protocolo LiAc/SS-DNA/PEG (Methods in Enzymology 1994, 350:87-96). Se siguió una estrategia similar para generar levaduras recombinantes de control portadoras del plásmido pTT10301 vacío.

Los clones de levadura recombinante se seleccionaron por su capacidad para crecer en medio sin uracilo. Se aislaron ocho clones independientes transformados con pTT10302 y se cultivaron durante una noche en medio sin uracilo. Estos cultivos de levadura recombinante, denominados yTT10301, se sedimentaron y homogeneizaron usando perlas de vidrio. De forma similar, también se sometió al mismo procedimiento a clones independientes de levadura transformada con pTT10301 (denominada yTT10300).

Las proteínas de los diferentes clones de ambos tipos de levaduras recombinantes se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa que se sometió a análisis por inmunotransferencia. Como se muestra en la Figura 5, todos los clones seleccionados de los cultivos de yTT10301 (clones 1 a 8) expresaban varios polipéptidos que eran reconocidos por el anticuerpo monoclonal (AcM) específico anti-FT humano CD142 (BD Biosciences Pharmingen). Sin embargo, ninguno de los clones yTT10300 mostraba polipéptidos inmunorreactivos con el AcM específico anti-FT humano (carril C, en la Figura 5, corresponde con uno de estos clones).

Como se muestra en la Figura 5, el tamaño molecular del producto inmunorreactivo principal en yTT10301 (carriles 1 a 8) era de aproximadamente 35 kDa (señalados con un asterisco). Podía observarse otros productos con masas moleculares de 44 y 46 kDa (señalados con flechas) y también un agregado mayor que oscilaba de 70 a 115 kDa de tamaño (flecha). Los polipéptidos con pesos moleculares inferiores a 35 kDa probablemente se corresponden con los productos de degradación de FTr.

La aparición de varios productos relacionados con el FT que mostraban movilidades electroforéticas diferentes podría ser debida a la agregación de la proteína, a diferentes grados de glucosilación o a ambos. Para investigar estas posibilidades, los extractos de yTT10301 (clon Nº 7) se trataron con las endoglucosidasas Endo H y PNGasa

F. Como se muestra en la Figura 6, después de la incubación con Endo H (carril 2) o con PNGasa F (carril 3), el agregado mayor (75 a 150 kDa) desaparecía mientras que se veía claramente un producto de 75 kDa (comparar el carril 1 con los carrilles 2 y 3). Además, las bandas de proteínas de 44 y 46 kDa también desaparecían con ambos tratamientos. En muestras tratadas con Endo H (carril 2), parece que los productos de 44 y 46 kDa dan lugar a un producto de aproximadamente 36 kDa. El tratamiento con PNGasa F daba lugar a la aparición de dos bandas, de 37 y 39 kDa (carril 3). Por otro lado, el producto de 35 kDa permanecía invariable tras el tratamiento con estas glucosidasas. De este modo, parece que el producto de 35 kDa se corresponde con la proteína FTr no glucosilada y el producto de 75 kDa que puede reconocerse tras el tratamiento con la endoglucosidasa puede representar un dímero de la proteína no glucosilada. El agregado mayor observado en las muestras sin tratar podría corresponderse con el mismo dímero pero con diferente grado de glucosilación. De forma similar, las proteínas de 44 y 46 kDa parecen corresponderse con la proteína de 35 kDa con diferentes patrones de glucosilación.

El peso molecular predicho para hFT carente del péptido señal determinado según la secuencia de aminoácidos es de 29,8 kDa. La discrepancia entre la masa molecular predicha y la observada podría ser debida a la migración anómala de la proteína en SDS-PAGE debido a la presencia de una extensión de aminoácidos hidrófobos.

Adicionalmente, la expresión de FTr por yTT10301 se analizó mediante un microscopio láser confocal de barrido. Para estos estudios, se fijaron esferoplastos (es decir, una levadura carente de pared celular producida por tratamiento enzimático) de levaduras recombinantes que expresan FTr (yTT10301, clon Nº 7) y que no expresan FTr (yTT10300), y se fijaron e incubaron con el AcM anti-FT humano o con un AcM frente a una ATPasa de membrana de levadura. Como se muestra en la Figura 7, el AcM anti-ATPasa marcaba específicamente sólo la superficie de los esferoplastos (fotografías 1 y 3 de la Figura 7A). Sin embargo, el AcM anti-FT humano mostraba una señal de distribución por toda la célula, lo que indicaba la presencia de FTr no sólo en la membrana plasmática, sino también dentro de la células, asociado probablemente con los compartimentos celulares membranosos internos (fotografías 5 y 7 de la Figura 7B). Por otro lado, como se muestra en la Figura 8, en células de levadura portadoras de un plásmido vacío (yTT10300), el AcM anti-ATPasa también daba una señal específica en la superficie celular (fotografía 1 de la Figura 8A), pero, como era de esperar, no se detectaba marcaje con el anticuerpo anti-FT humano (fotografía 3 de la Figura 8B).

Para confirmar que el FTr era una proteína asociada a membrana, las células de levadura yTT10301 se trataron con tampón de lisis que contenía el detergente Tritón X-114 (a una concentración final del 1%). Después de una hora de incubación a 4ºC, el lisado se aplicó sobre un gradiente amortiguador de sacarosa al 6%, se calentó a 30ºC durante 3 minutos y se centrifugó a 300 x g durante 3 minutos para separar la fase acuosa superior de la fase inferior con el detergente. Se recogió la fase acuosa y el sedimento con el detergente se mantuvo en hielo. Después de tomar una pequeña alícuota para el análisis posterior, la fase acuosa se sometió a una segunda ronda de extracción con Tritón X-114. Después de una nueva fase de separación, se recogió una segunda fase acuosa y el nuevo sedimento con el detergente se añadió al anterior. La mezcla de ambos sedimentos con el detergente y la dos fases acuosas se analizaron mediante SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie (Figura 9A) y mediante una inmunotransferencia con el AcM anti-FT humano (Figura 9B). Como se muestra en la Figura 9B, los productos derivados de FTr característicos se observaban exclusivamente en la fase del detergente (carril 4) y no en ninguna de la dos fases acuosas (carriles 2 y 3). En el gel teñido con Coomassie podemos ver que la mayoría de las proteínas de los extractos de levadura permanecían en la fase acuosa (carriles 2 y 3). Este resultado muestra claramente que el FTr expresado por yTT10301 está asociado a la membrana.

1.5. Proceso de fermentación

Para analizar la producción de los extractos de levadura yTT10301 a nivel preindustrial, los inventores realizaron fermentaciones en un biorreactor de 2 litros (Biostat B-2L, BRAUN). Las condiciones de funcionamiento y el medio de cultivo fueron:

Condiciones de funcionamiento: T: 30ºC; velocidad de agitación: 250-300 rpm; pH: 4,5; flujo de aire: 6 l/m. Medio de cultivo: CSM-URA: 0,78 g/l; YNB: 6,7 g/l; sacarosa: 20 g/l

La gráfica de la Figura 10 muestra la evolución de los principales parámetros a lo largo de todo el procedimiento de fermentación. Un cambio en la presión de oxígeno (PO2), que es el único parámetro que no se controla, refleja los cambios en los requerimientos de oxígeno que sufren las células durante el procedimiento. La fermentación se detuvo cuando la PO2 alcanzó un estado estacionario (señalado con una flecha) (18 h).

El producto resultante de la fermentación se sedimentó mediante centrifugación a 3.000 rpm (1.200xg) durante 10 min y se resuspendió en 200 ml de tampón de lisis (PIPEs 25 mM (pH 7,8), NaCl 50 mM). Las levaduras se homogeneizaron a elevada presión (1.000 bar (108 Pa)) (homogeneizador NIRO SOAVIS, Panda 2K) y se recogieron por separado el homogeneizado centrifugado a 13.000 rpm (13.000xg) durante 30 min a 4ºC, y el sedimento (50 ml) y el sobrenadante del extracto de levadura clarificado (CYE) (150 ml). El esquema general del procedimiento se representa en la Figura 11.

La concentración de proteína en ambas preparaciones se cuantificó mediante el ensayo colorimétrico convencional BCA (Pierce) y se determinó la presencia de FTr mediante análisis por inmunotransferencia. Los resultados de estos ensayos mostraron que la concentración de proteína total era similar en ambas muestras (sedimento: 3,8 mg/ml y CYE: 3,9 mg/ml) y, por consiguiente, la cantidad de FTr detectada por inmunotransferencia también era equivalente en el CYE y en el sedimento como se muestra en la Figura 12.

La actividad procoagulante, determinada como se describe en el EJEMPLO 4, en el CYE y en el sedimento también era similar cuando ambas muestras se analizaron el mismo día de la preparación (1.400 ng/ml de FTr activo), pero la estabilidad de FTr era mucho menor en los extractos sedimentados (1.500 frente a 199 ng/ml) el 4º día antes de la preparación, probablemente debido a la presencia de proteasas en esta fracción. De este modo, se seleccionó la fracción CYE para preparaciones posteriores de producto farmacéutico.

1.6. Microscopia electrónica

Para caracterizar mejor el producto CYE, se realizó un análisis por microscopia inmunoelectrónica. El examen de las muestras de CYE mediante microscopia electrónica (ME) mostró la presencia de un gran número de vesículas derivadas de levadura de diferentes tamaños (que oscilan de 0,1 a 0,01 !m). Aproximadamente el 5-10% de estas vesículas se marcaban con el AcM anti-FT humano como se observaba por la presencia de partículas de oro en su periferia (indicado con flechas) (Figura 13). Por otro lado, en las rejillas control que se incubaban con un AcM no relacionado se observaban muy escaso número de partículas de oro que no estaban asociadas a vesículas (no mostrado).

Está bien establecido (Thromb. Haemost. 2001; 86: 66-74) que la actividad óptima de coagulación sanguínea requiere la asociación de FT a lípidos y, puesto que los extractos de levadura que no expresan FT a partir de yTT10300 no mostraban ninguna actividad procoagulante, estos resultados indicaban que la actividad procoagulante del CYE podría residir en el FTr lipidado que resulta de la asociación del FTr a las microvesículas membranosas derivadas de levadura, denominadas a partir de aquí en este documento como CYE-FT (es decir, una fracción de CYE, con actividad procoagulante, que contiene FTr asociada con microvesículas membranosas derivadas de levadura).

EJEMPLO 2

Producción de un producto procoagulante enriquecido en microvesículas que contienen el mFT de cadena completa (FTm).

2.1 Proceso de purificación

Un extracto clarificado de levadura que contenía FTr (en adelante CYE-FT) obtenido de yTT10301 se preparó según el procedimiento descrito previamente (Ejemplo 1, secciones 1.1 a 1.5). El CYE-FT fue sometido a pasos sucesivos de filtración de flujo tangencial en un sistema de filtración CrossFlow (Sartorius sartoflow Slice 320 Benchtop) usando filtros con una reducción gradual del tamaño de poro (membranas 0,45 µm, 0,2 µm y 0,1 µm) (Sartorius, polisulfona). Un diagrama del procedimiento se presenta en la figura 14A.

Para purificar las vesículas que contenían FTr (FTm), se cargaron 10 ml de CYE-FT filtrado, correspondiente a las vesículas de 0,1 µm a 0,2 µm de tamaño (retenido de 0,1 µm) en una columna de exclusión en gel (columna Sephacryl S500 –HR 60 cm-26 mm, 320 mL General Electric) equilibrada previamente con tampón fosfato a 1 mL/min en el mismo tampón y acoplado a un sistema FPLC AKTA. La elución se llevó a cabo a un flujo de de 1 mL/min en el mismo tampón y se recogieron 42 fracciones de 4 mL cada una. El patrón de elución se monitorizó mediante la medida de la absorbancia de las fracciones a 280 nm. Los perfiles cromatográficos obtenidos en distintos ensayos de purificación fueron similares. La gráfica en la figura 15 muestra un patrón cromatográfico representativo.

Alícuotas de cada fracción se analizaron mediante western blot y mediante un ensayo de actividad para identificar las fracciones con actividad procoagulante. La figura 16 muestra que las fracciones 5-25 que acumulan FTm detectable mediante Western blot fueron aquellas en las que se concentró la actividad (Tabla 1).

Tabla 1 Actividad procoagulante de FTm en las fracciones 5-42 obtenidas mediante purificación mediante exclusión por tamaño.

35 Finalmente, para concentrar la actividad, las fracciones 5 a 43 de cada proceso de purificación se reunieron y se sometieron de nuevo a filtración de flujo tangencial a través de un filtro de 0,1 µm. De esta manera es posible obtener lotes reproducibles (14,31, 14,32, 15,32 y 15,36) de FTm biológicamente activo, según se muestra en la Tabla 2, y estos lotes mostraron un perfil proteico similar.

Tabla 2 Comparación del contenido proteico total y de la actividad procoagulante entre los lotes

Proteína total µg/mL: Proteína Activa ng/mL

mFT Pool 14.31: 346 709

mFT Pool 14.32: 283 659

mFT Pool 15.32: 271 745

mFT Pool 15.36: 342 718

45 2.2 Caracterización bioquímica de vesículas que contienen FTr purificadas mediante cromatografía de exclusión molecular. 2.2.1 Contenido en proteína.

50 Las microvesículas donde el FTr está insertado contienen, además de FTr, otras proteínas integrales de membrana derivadas de la célula hospedadora de levadura. Se analizó la composición en proteínas de los diferentes lotes de FTm purificado mediante cromatografía en gel de poliacrilamida SDS y tinción con azul de Coomassie (Figura 17A). La comparación visual del gel teñido indica que el perfil de proteína de los diferentes lotes era casi idéntico. Para llevar a cabo un análisis más exacto, el gel fue escaneado y cada línea del gel se sometió a densitometría y se obtuvo para cada lote un gráfico que muestra los picos que corresponden a las diferentes bandas de proteínas y la intensidad relativa de cada proteína. Los perfiles de proteína de los cuatro lotes mostrados en la Figura 17 (panel B) son extremadamente similares.

2.2.2 Contenido en lípidos.

Se analizó el contenido en lípidos de FTm mediante cromatografía en capa fina siguiendo el procedimiento descrito por Hara and Radin (Anal. Biochem. 1978, 90: 420-426) con algunas modificaciones (Rodríguez-Sureda y Peinado-Onsurbe, 2005, Anal.Biochem. 343:277-282). Básicamente, se disolvieron 120 mg de producto liofilizado en un tubo de cristal en 1 mL de una mezcla de hexano e isopropanol (3:2, v:v). El vial, protegido de la luz para evitar la oxidación lipídica, se mantuvo en un agitador orbital durante 24 horas. A este tiempo, se añadió 0,3 mL de sulfato de sodio (0,47 M). Para facilitar la fase de separación, la muestra se centrifugó. La fase superior (hexano) contiene lípidos apolares mientras que los polares como los fosfolípidos, se encuentran cercanos a la interfase. La fase superior se transfirió a un vial diferente y se evaporó usando gas nitrógeno para evitar la oxidación lipídica. El extracto seco que contenía los lípidos se disolvió en cloroformo (0,2 mL). La TLC se llevó a cabo sobre un plato de silica gel usando como fase móvil cloroformo:metanol y agua (C:M:W, 345:133:21, v:v:v). En paralelo a las muestras, los lípidos estándar se analizaron bajo las mismas condiciones. Una vez que las muestras se corrieron sobre los platos, los lípidos se visualizaron por adición de vapores de iodo. La identificación de los diferentes componentes lipídicos en las muestras se hizo por comparación de su movilidad con la movilidad de los lípidos estándar.

Mediante esta técnica, se pudo determinar que tanto CYE-FT (lote 91) a diferentes concentraciones (5, 10 y 20 µg/ml) como el producto purificado (Lote 14.31 a 5, 10 y 20 µg/ml) contenían un conjunto complejo de lípidos, incluyendo triacilglicéridos, ergosterol, fosfatidiletanolamina, cardiolipina, ácido fosfatídico, fosfatidilcolina y fosfatidilserina/fosfatidilinositol (Figura 18). El perfil lipídico de las microvesículas que contenían FTr difirió del perfil derivado de FTr lipidizado obtenido mediante incorporación de FTr en liposomas sintéticos según los procedimientos descritos por, entre otros, Waters, E.K. and Morrisey, J.H. (Biochemistry, 2006, 45:3769-3774), Brucato, C. et al (Protein Expression and Purification, 1998, 26:386-393), WO9848283, and Guha, A. et al (Proc.Natl.Acad.Sic.USA, 1986, 83:299-302). Mientras que los liposomas sintéticos descritos en todos estos documentos comprenden esencialmente una combinación de fosfatidilcolina y fosfatidilserina, o una combinación de fosfatidilcolina, fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina, las microvesículas derivadas de levadura purificadas según la presente invención comprenden componentes adicionales tal como ergosterol y cardiolipina que no se encuentran en los liposomas que contienen FTr.

EJEMPLO 3

Producción de un producto micro-coagulante basado en la expresión de la proteína FT de longitud completa modificada por his-tag en levadura (6HT-FT)

3.1. Producción de FTr que contiene una 6xhis-tag en el extremo carboxilo terminal.

La purificación por cromatográfica de afinidad de proteínas que contienen una etiqueta de histidina (his-tag) en el extremo C o N terminal, es un procedimiento bien estandarizado que se ha usado mucho para obtener preparaciones altamente purificadas de un gran número de proteínas. Como cualquier procedimiento cromatográfico, el procedimiento puede llevarse fácilmente a producción a gran escala. Por esta razón, se ha producido una FTr que contiene una 6xHis-tag en el extremo carboxilo terminal.

3.2. Generación del vector de expresión plasmídico de FTr-his-tag

El ADNc que codifica la proteína hFT madura (aa 33-295) con 18 nucleótidos más (que codifican para seis histidinas) en el extremo 3' terminal, se amplificó como un fragmento de 842 pb mediante PCR. Para esta reacción, se ha seguido una estrategia similar a la descrita en el Ejemplo 1 (Secciones 1.2 y 1.3). De este modo, se usó como molde una biblioteca de ADNc de placenta humana (Marathon-Ready cDNA, Clontech Laboratories, Inc.) y los oligonucleótidos A (SEQ ID NO:1) y E (SEQ ID NO:3) se usaron como cebadores. En el oligonucleótido E (SEQ ID NO:3) el codón de terminación (TAA) de la secuencia de ADN de hFT se sustituyó por una secuencia de nucleótidos que codifica 6 residuos de histidina seguido de un nuevo codón de terminación (TAG). La Figura 19 muestra el sitio de los cebadores A (SEQ ID NO:1) y E (SEQ ID NO:3) en la secuencia del ADN de hFT (nº de acceso del GenBank BC011029).

Después de 35 ciclos de PCR ((94ºC 30s, 45ºC 30s, 72ºC 1 min) y una etapa de extensión final de 7 min a 72ºC, se purificó un producto de ADN con el tamaño esperado (sistema de purificación de ADN de Qiagen).

El fragmento de ADN amplificado por PCR se digirió con BamHI para eliminar los extremos, se precipitó con etanol y se clonó en el vector pTT10301 previamente digerido con BamHI. Después del análisis con endonucleasas de restricción de varios clones, se seleccionó el plásmido pTT10303, que contenía el gen hFT-his-tag recombinante en la orientación correcta con respecto al promotor GPD (pGPD) (Figura 20).

Los inventores además confirmaron que la secuencia de ADN del hFT-his-tag recombinante clonado en pTT10301 era idéntica al 100% a la secuencia del ADN del hFT publicada previamente (Nº de acceso a GenBank BC011029) y que contenía los 18 nucleótidos adicionales esperados en el extremo 3'. El análisis de la secuencia de ADN del hFThis-tag se realizó en un secuenciador automático (ABI prism 370, Applied Biosystems) usando los cebadores A (SEQ ID NO:1) y E (SEQ ID NO:3) y reactivos del Big Dye Terminator. Las células DH5a portadoras del plásmido pTT10303 se crecieron durante una noche a 37ºC en medio LBA y se usaron para preparan soluciones madre de glicerol.

3.3. Expresión de FTr-his-tag

Para generar levaduras recombinantes que expresan la hFT-his-tag madura recombinante (FTr-his-tag), se usó el vector de expresión pTT10303 para transformar células de levadura T73 ura3-como se describe en el Ejemplo 1 (Sección 1.4). Los clones de levadura recombinantes (denominados yTT10302) se seleccionaron por su capacidad para crecer en medio sin uracilo. Se aislaron cinco clones independientes de yTT10302 y se cultivaron durante una noche en medio sin uracilo. El análisis por inmunotransferencia mostraba que todos los clones seleccionados expresaban polipéptidos reconocidos por el AcM anti-FT humano (Figura 21). La Figura 22 muestra el patrón de expresión de FTr-his-tag de un clon seleccionado (clon Nº 5 de yTT10302) en comparación con extractos de levaduras recombinantes yTT10300 e yTT10301. Como se muestra, los tamaños moleculares de los productos inmunorreactivos con anti-FT expresados por yTT10302 eran de aproximadamente 36, 38, 45, 47 y 49 kDa (señalados con flechas), mientras que también podrían observarse otros agregados de mayor peso molecular (aproximadamente de 100 a 115 kDa) (flecha). Como en el caso de los extractos de levaduras yTT10301, estas diferencias en la movilidad se corresponden con diferentes grados de glicosilación del FTr como se muestra en la Figura 20.

3.4. Purificación de FTr-his-tag mediante cromatografía 3.4.1. Procedimiento de purificación

Para la purificación de FTr-his-tag, los inventores empezaron a partir de los extractos clarificados que contenían hFT-his-tag (denominado a partir de ahora en este documento como CYE-6HT-FT) obtenidos de yTT10302 siguiendo el procedimiento previamente descrito (Ejemplo 1, Sección 1.5). Dicho CYE-6HT-FT se filtró a través de un filtro de 0,2 !m de tamaño de poro mediante filtración de flujo tangencial antes de cargarlo en una columna de afinidad HiTrap® de 5 ml (Pharmacia Biotech), que se lavó previamente con agua y se equilibró con tampón de inicio (tampón fosfato 20 mM, NaCl 500 mM, pH 7,4). Después de aplicar la muestra, se recuperó el material que pasaba a través de la columna (material no retenido) y la columna se sometió a tres lavados: el primero con 40 ml de tampón inicial (tampón fostato 20 mM, NaCl 500 mM, pH 7,4); el segundo lavado se hizo con 40 ml de tampón inicial que contenía imidazol 10 mM y el tercero con 40 ml de tampón inicial suplementado con imidazol 100 mM. Después del último lavado, la proteína FTr-his-tag microvesiculada, denominada 6HT-FT, se eluyó añadiendo a la columna 25 ml de tampón inicial que contenía imidazol 1 M y se recogieron fracciones de elución de 2,5 ml (fracciones Nº 1, 2, 3 y 4). El esquema general del procedimiento se representa en la Figura 23.

Estas fracciones se dializaron en tampón de diálisis (tampón fosfato 20 mM, NaCl 50 mM, pH 7,4) y el extracto inicial, el materia no retenido, el último lavado antes de la elución y las fracciones de la cuarta elución dializada se analizaron en SDS-PAGE y se tiñeron con plata o mediante inmunotransferencia. Como se muestra en la inmunotransferencia de la Figura 24A, después de la unión a la columna, el producto 6HT-FT puede recuperarse con éxito principalmente en las tres primeras fracciones eluídas (carriles 4-6). Es destacable que cuando las proteínas de las mismas muestras se visualizaron mediante la tinción con plata del gel (Figura 24B), sólo se podían observar bandas de proteínas en los carriles correspondientes al extracto de levadura inicial (carril 1) y al material no retenido (carril 2), pero no en las fracciones eluídas (carriles 4-7). Además, la cantidad de proteína total en estas muestras estaba por debajo del límite de detección del reactivo control BCA (20 !g/ml).

Estos resultados, junto con el resultado de la inmunotransferencia, claramente demostraban que mediante este procedimiento de cromatografía de afinidad podía obtenerse el producto 6HT-FT muy purificado. Lo que es más importante, las fracciones de elución Nº 1-3 dializadas mantenían la actividad procoagulante, determinada como se describe en el EJEMPLO 4, y sorprendentemente, la fracción Nº 1 esencialmente mostraba la misma actividad procoagulante que el extracto CYE-6HT-FT inicial. Como era de esperar, la fracción que contenía menos cantidad de proteína FTr inmunorreactiva (fracción Nº 4, carril 7) no mostraba ninguna actividad procoagulante.

Las diferencias entre la concentración total de proteína frente a la actividad en estas dos muestras puede resumirse como sigue.

Concentración de proteína total (mg/ml): Concentración de FTr (ng/ml)

CYE-6HT-FT: 6,2 275

Fracción Nº 1 de 6HT-FT: ND* 252

ND*: No detectable mediante un ensayo colorimétrico convencional (BCA) (límite de detección 20 !g/ml)

3.4.2. Procedimientos analíticos

Como se muestra en la inmunotransferencia de la Figura 19, el producto 6HT-FT en las fracciones eluídas estaba compuesto, como en el extracto completo de la levadura, por varias bandas de proteína que variaban en tamaño, que probablemente se originaban por la glucosilación diferencial de la proteína FTr-his-tag. Para estudiar esta posibilidad, la fracción eluída Nº 1 se sometió al tratamiento con endoglucosidasa. Brevemente, los extractos de levaduras que expresaban FTr (yTT10301) tratados con 500 unidades (U) de endoglucosidasa H (Endo H) o N-Glucosidasa F (PNGasa F) durante 1 hora a 37ºC se analizaron adicionalmente mediante inmunotransferencia con el AcM anti-FT humano. La Figura 25 muestra que tras el tratamiento con PNGasa F (carril 2) o Endo H (carril 3), desaparecían las bandas de proteínas de 45, 47 y 49 kDa con ambos tratamientos. Tras la incubación con PNGasa F sólo se observaban dos polipéptidos, el de 36 y el de 38 kDa que probablemente aumentaban debido a la desglucosilación de los productos de 45, 47 y 49 kDa (compare los carrilles 1 y 2). El tratamiento con Endo H daba lugar a un único producto inmunorreactivo de 36 kDa (carril 3) que debería corresponder con la proteína FTr-his-tag no glucosilada.

Además, 6HT-FT purificada se analizó mediante ME tras haber sido sometida a inmunotinción con AcM anti-FT humano como se describe en el Ejemplo 1 (Sección 1.6). Como se muestra en la Figura 26, puede observarse un gran número de partículas de oro, la mayoría de las cuales estaban asociadas a vesículas pequeñas de tamaño regular. En una muestra similar de levaduras que no expresan FTr, analizada en paralelo, el número de partículas de oro se reducía considerablemente (no mostrado). Este resultado indica que el procedimiento de cromatografía de afinidad usada para purificar el producto 6HT-FT permite la recuperación de 6HT-FT biológicamente activo que está asociado a microvesículas de membrana derivadas de levaduras.

EJEMPLO 4

Producción de un producto procoagulante basado en la expresión de una forma truncada de la proteína hFT en levaduras (CYE-FTT)

4.1. Generación del vector plasmídico de expresión de FT-his-tag truncada (FTT-his-tag)

El ADNc que codifica una forma truncada de la proteína hFT (FTT), que contiene el dominio de interacción con el factor X (aa 174-251), la región transmembrana (aa 252-274) y la cola citoplasmática (aa 275-295) con 18 nucleótidos más (que codifican seis histidinas) en el extremo 3', se amplificó mediante PCR como un fragmento de 398 pb. Se siguió una estrategia similar a la descrita en el Ejemplo 1 (Secciones 1.2 y 1.3). De este modo, se usó como molde una biblioteca de ADNc de placenta humana (Marathon-Ready cDNA, Clontech Laboratories, Inc.), y como cebadores se usaron los oligonucleótidos F y E. En el oligonucleótido E, el codón de terminación (TAA) de la secuencia del ADN de hFT se sustituyó por una secuencia de nucleótidos que codificaba 6 residuos de histidina seguido de un nuevo codón de terminación (TAG). La Figura 28 muestra el sitio de los cebadores F y E en la secuencia del ADN de hFT (Nº de acceso a GenBank BC011029).

El fragmento de ADN amplificado por PCR se digirió con BamHI para eliminar los extremos, se precipitó con etanol y se clonó en el vector pTT10301 previamente digerido con BamHI. Después del análisis de varios clones con endonucleasas de restricción, se seleccionó el plásmido pTT10304 que contenía el gen FTT-his-tag recombinante en la orientación correcta con respecto al promotor GPD (pGPD) (Figura 29).

Los inventores además confirmaron que la secuencia de ADN del FTr-his-tag recombinante clonado en pTT10301 era idéntica al 100% a la secuencia publicada previamente (Nº de acceso a GenBank BC011029) y que contenía los 18 nucleótidos adicionales esperados en el extremo 3' (Figura 25). Las células DH5a portadoras del plásmido pTT10304 se crecieron durante una noche a 37ºC en medio LBA y se usaron para preparan soluciones madre de glicerol.

4.2. Expresión de rFTT-his-tag por levaduras recombinantes.

Para generar levaduras recombinantes que expresan la hFT-his-tag humano truncado recombinante (rFTT-his-tag), se usó el vector de expresión pTT10304 para transformar células de levadura T73 ura3-como se describe en el Ejemplo 1 (Sección 1.4). Los clones de levadura recombinante (denominados yTT10304) se seleccionaron por su capacidad para crecer en medio sin uracilo.

5 Para la expresión de rFTT-his-tag, se prepararon los extractos de levadura clarificados (CYE) obtenidos de yTT10304 siguiendo el procedimiento previamente descrito en el Ejemplo 1 (Sección 1.5), con actividad procoagulante, denominados CYE-FTT (es decir, extractos de levadura clarificado (CYE) que contienen el factor tisular truncado microvesiculado (FTT)) y se analizó su actividad como se describe en el EJEMPLO 1.

EJEMPLO 5

Generación del vector de expresión plasmídico del FT mutante en sitios de glucosilación

15 FT muestra tres diferentes residuos donde ocurre la N-glucosilación, principalmente N11, N124 y N137. Mutantes sencillos que comprometen estos restos (N11A, N124A y N137A) y todas las posibles combinaciones de los mismos se construyeron usando los procedimientos estándar (Figura 30).

Mutagénesis dirigida de oligonucleótido

20 Se usó una reacción estándar de PCR usando los oligonucleótidos citados en la tabla 3 para general los diferentes mutantes (Current Protocols in Molecular Biology, capítulo 15). Se usó el plásmido pTT10302 como ADN molde y Pfu se uso como polimerasa ya que muestra una alta fidelidad y baja tasa de error.

25 Tabla 3

Nombre (SEQ ID NO): Localización del cambio de aa Dirección Secuencia del Oligo 5´-3´

TT-7071 (6): 11-Asn a Ala Directo TGACACCGTCGTATACGTAATTGAACCTTT AGT

TT7075 (7): 11-Asn a Ala Reverso ACTGTGGCAGCATATCGATTAACTTGGAAA TCA

TT-7072 (8): 124-Asn a Ala Directo ATCTTCTACGGTCACTGCCACTTTTGTTCC CAC

TT-7076 (9): 124-Asn a Ala Reverso GTGGGAACAAAAGTGGCAGTGACCGTAGA AGAT

TPM1 (10): 137-Asn a Ala Directo ACTTTAGTCAGTTGGGCAAACACTTTCCTA AGC

TPM2 (11): 137-Asn a Ala Reverso GCTTAGGAAAGTGTTTGCCCTTCTGACTAA AGT

Resultados

Mutaciones puntuales en FT que afectan a los sitios de glucosilación

30 La Figura 31 muestra un western blot antiFT comparando el perfil de los diferentes mutantes en los sitios de glucosilación con el tipo salvaje. Como puede verse, el perfil es diferente en todos ellos, y cuando se trata con glucosilasas, todas las bandas se transforman en una, lo que significa que el perfil observado se debe al diferente estado de glucosilación.

35 Se determinó la actividad coagulante de estos mutantes y se muestra en la Tabla 4. Todos los datos se normalizaron respecto al tipo salvaje, cuya actividad y expresión se ha considerado como 100. Ambas mutaciones sencillas en 11 (PM11) y 124 (PM2) mostraron un incremento en actividad, aunque sorprendentemente, el efecto más notable se observó cuando el resto 124 se mutó, ya que su actividad y expresión se incrementó significativamente (6 y 2 veces

40 respectivamente). La actividad de estos doble y triple mutante cuando PM2 estaba involucrado también se incrementó.

Tabla 4 Actividad relativa y expresión de los diferentes mutantes en los sitios de glucosilación cuando se comparan al tipo salvaje 6HT-FT

Actividad relativa Expresión relativa

PM/6H-FT*100 PM/6H-FT*100

WT 100 100

PM1 190 48

PM2 602 194

PM3 64 67

PM1&2 206 52

PM1&3 0 15

PM2&3 114 108

PM1&2&3 294 12

PM: Punto de mutación

EJEMPLO 6

Evaluación de la actividad procoagulante del factor tisular microvesiculado (mFT)

10 Para su simplificación, en este ejemplo, “factor tisular microvesiculado”, “FT microvesiculado” o “mFT” se refieren, en general, al factor tisular, factor tisular modificado (mediante sustitución, eliminación, adición o intercambio de uno o más aminoácidos), la proteína de fusión que comprende en factor tisular o el factor tisular truncado que carece de parte o todo el dominio de unión a FVIIa, estando todos ellos total o parcialmente glucosilados y asociados a microvesículas derivadas de levaduras (es decir, estando integrados en la capa lipídica de las microvesículas) a no

15 ser que se indique lo contrario.

Con el fin de evaluar la actividad procoagulante del factor tisular microvesiculado proporcionado por la presente invención, se realizaron una serie de ensayos in vitro e in vivo, específicamente:

: 20 1. Ensayos in vitro que demuestran que el FT microvesiculado provoca la formación de un coágulo de fibrina y la coagulación sanguínea tanto en condiciones sanas como patológicas.

1.1 Ensayos de coagulación en el plasma de sujetos sanos.

1.2 Comparación del efecto procoagulante de vesículas purificadas mediante filtración en gel y FT relipidado.

: 25 1.3 Ensayos de coagulación en plasmas deficientes en FVIII, en FIX o en FXI.

1.4 Ensayos de coagulación en plasmas trombocitopénicos.

1.5 Ensayos de coagulación en plasma de plasmas deficientes en FVIII, FIX y FXI en la presencia de un anticuerpo anti-FVII.

1.6 Ensayos de coagulación en sangre completa no anticoagulada de sujetos sanos.

: 30 1.7 Ensayos de coagulación en sangre completa no anticoagulada de pacientes hemofílicos (ensayos de coagulación en sangre completa no anticoagulada).

2. Ensayos in vivo que demuestran que el FT microvesiculado es un agente útil para el tratamiento tópico

antihemorrágico en modelos de hemorragia grave (aplicándolo directamente en los vasos sanguíneos 35 previamente seccionados).

2.1. Ensayo en un modelo animal de hemorragia grave mediante sección proximal de las colas de las ratas.

2.2. Ensayo en un modelo animal de hemorragia grave previamente tratado con heparina.

40 3. Ensayos in vivo que demuestran que FT microvesiculado es un agente útil para el tratamiento tópico antihemorrágico en modelos de hemorragia letal (aplicándose directamente en los vasos sanguíneos previamente seccionados).

3.1 Ensayo en un modelo animal de hemorragia letal mediante sección proximal de colas de ratones deficientes en FVIII.

I. MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS Materiales

Como fuente del factor tisular microvesiculado (mFT) se usaron tres compuestos diferentes:

(i): extractos de levadura clarificados que contienen FT microvesiculado (CYE-FT), obtenidos según el Ejemplo 1;

(ii): proteína de fusión FT-marcada con hexahistidina (6HT-FT) purificada y microvesiculada, obtenida según el Ejemplo 2 y

(iii) extractos de levadura clarificados que contiene el factor tisular trucado microvesiculado (CYE-FTT), obtenido según el Ejemplo 3;

Los plasmas comerciales deficientes en los factores de coagulación FVIII, FIX y FXI se obtuvieron de Dade Behring Marburg GmbH.

El anticuerpo monoclonal anti-FVII humano comercial (clon HVII-1) se obtuvo de Sigma Aldrich.

Los ratones hemofílicos comerciales (Alelo: F8tm1Kaz; normalmente denominados MFVIII-16; mutado por Haig H Kazazian; referencia: Bi L; Lawler AM; Antonarakis SE; High KA; Gearhart JD; Kazazian HH Jr. 1995. Targeted disruption of the mouse factor VIII gene produces a model of haemophilia A, Nat Genet 10(1):119-21) se compraron del Jackson Laboratory.

FT comercial se obtuvo de American Diagnostica.

Muestras de suero de cinco donantes sanos se obtuvieron del Banco de Sangre del Hospital Vall d’Hebrón (Departament de Sang i Teixits, Pg Vall d' Hebrón, 119-129, 08035, Barcelona). Las muestras de plasma se examinaron para la presencia de virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, HIV y TPHA y dieron negativo. Las cinco muestras de plasma se juntaron y se congelaron a -15ºC en viales de 1,5 ml hasta su uso.

Procedimientos

Relipidación de FTr

Se relipidizó el FTr comercial (American Diagnostica) siguiendo el procedimiento estándar descrito por Morrisey (http://www.tf7.org/relipidation2.pdf) en donde FTr se incorpora en liposomas fosfolipídicos. La cantidad de FTr en las muestras se determinó mediante el kit de ELISA del factor tisular IMUBIND de American Diagnostica (No. 845) usando las especificaciones del proveedor.

Ensayos in Vitro

Para determinar si un factor tisular truncado microvesiculado carece de parte o todo el dominio de unión a FVII, y para saber si seguía siendo activo, en primer lugar, se realizó un ensayo de unión del factor tisular truncado microvesiculado al FVIIa para determinar si podía detectarse o no la unión del factor tisular truncado microvesiculado al FVIIa y, en segundo lugar, si el ensayo de coagulación en plasma podía usarse para determinar si el factor tisular truncado microvesiculado seguía siendo activo como procoagulante.

Ensayo de unión del factor tisular truncado microvesiculado al FVIIa

Para determinar la interacción entre la proteína de fusión FT marcada con hexahistidina microvesiculada purificada (6HT-FT), extractos de levadura clarificados que contenían FT microvesiculado (CYE-FT) o extractos de levadura clarificados que contenían FT truncado microvesiculado (CYE-FTT) y el factor de coagulación VIIa (FVIIa), los autores de la invención siguieron una versión modificada del procedimiento descrito en la publicación internacional WO 00/04148. Por este medio, se ensayó la unión de 6H-FT, CYE-FT o CYE-FTT a FVIIa biotinilado como un ensayo de tipo ELISA. Para esto, se preparó FVIIa biotinilado (BEGR-7a) como se describe previamente (Kelley y col., 1995 Biochem. 34:10383-10392). A continuación, se recubrieron placas de microvaloración de 96 pocillos con BEGR-7a usando estreptavidina como agente de captura. Los pocillos se lavaron dos veces con Tween 20 al 0,05% en agua destilada y se bloquearon con PBS que contenía leche en polvo descremada al 1% (solución bloqueante) durante 2h. Tras esto, se añadieron a los pocillos diluciones 1:10 de 6HT-FT, CYE-FT o CYE-FTT, empezando a una concentración de 10 !g/ml, preparados en tampón TNC (Tris 20 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, CaCl2 5 mM) y que contenía una cantidad fija de BEGR-7a conjugado con estreptavidina o estreptavidina sola. Tras 2 h de incubación a T/A, los pocillos se lavaron otra vez con Tween 20 al 0,05% para eliminar el material no unido. Se usó un antisuero policlonal de conejo específico anti-FT para detectar el complejo FT-FVIIa en las soluciones que contenían los diferentes FT. Para ello, se añadió a los pocillos una dilución 1:500 de la dilución de los sueros anti-FT y se incubaron 2 h a 37ºC. Las placas se lavaron cinco veces antes de que se añadiera en anticuerpo de detección. El anticuerpo de cabra anti-inmunoglobulina G (IgG) de conejo conjugado con peroxidasa (Southern Biotechnology Associated) se diluyó 1:1000 en solución de bloqueo y se incubó durante 1 h a 37ºC. Las placas se lavaron otras cinco veces y se usó peróxido de hidrógeno y ortofenilenediamina (OPD) al 0,05% para desarrollar la reacción. Después de 10 a 15 minutos de incubación a temperatura ambiente, la reacción se detuvo mediante la adición de H2SO4 (2N) y se midió la absorbancia a 492 nm en un lector de placas Multiskan Plus (Labsystem).

Ensayos de coagulación en plasma

La actividad procoagulante espontánea (sin estimular) en plasma se midió mediante un ensayo de coagulación en dos etapas en un coagulómetro de 4 canales (Start 4, Diagnostica Stago). Brevemente, se añadieron 50 !l de plasma pobre en plaquetas a las cubetas ya atemperadas y 50 !l de la muestra (mFT, o agua destilada como control). Esta mezcla se dejó incubar durante 60 segundo a 37ºC e inmediatamente se añadieron 50 !l de cloruro cálcico 25 mM y se determinó el tiempo de coagulación en segundos en el coagulómetro, verificada mediante la formación del coágulo. Los plasmas pobres en plaquetas se obtuvieron mediante centrifugación y se determinó el número de plaquetas mediante un Coulter.

El efecto procoagulante de mFT en los plasmas deficientes en factores de coagulación (FVIII, FIX o FXI) correspondientes a la hemofilia A, B o C, respectivamente, se analizó usando plasmas comerciales (Dade Behring Marburg GmbH) empobrecidos mediante técnicas de inmunoafinidad. En cada caso, el contenido final de dichos factores de coagulación era menor del 1%.

El efecto procoagulante en condiciones similares a trombocitopenia se investigó en plasmas empobrecidos en plaquetas con un procedimiento secuencial de centrifugación.

Ensayos de coagulación en sangre completa

La actividad procoagulante en sangre completa no anticoagulada se determinó mediante un procedimiento de coagulación. Se añadieron los diferentes agentes (mFT) que se iban a estudiar en un volumen final de 0,2 ml de 0,8 ml de sangre completa no anticoagulada y se midió el tiempo de coagulación con un cronómetro desde el inicio de la extracción hasta la aparición de un coágulo sanguíneo estable y consolidado. El efecto de los diferentes agentes se evaluó mediante el acortamiento o alargamiento de los tiempos de coagulación sanguínea.

Las muestras de sangre completa se obtuvieron de pacientes o de voluntarios sanos.

Ensayos in vivo

Modelo de hemorragia grave mediante sección proximal de la cola de la rata

Se distribuyeron de forma aleatoria ratas macho Sprage-Dawley que pesaban de 300-600 gramos en 2 grupos de tratamiento: -un grupo control, compuesto de al menos 3 animales que recibieron tratamiento tópico con solución salina fisiológica, y -un segundo grupo, también compuesto por al menos 3 animales, que recibieron tratamiento tópico con mFT. Todos los compuestos entraban en contacto tópico con la sección proximal de la cola de los animales para actuar hemostáticamente a un volumen de 1 ml/min administrado directamente sobre la superficie de la herida con la rata hacia arriba. La formación del coágulo estable y consolidado se puso de manifiesto mediante la confirmación del cese de la hemorragia.

Modelo de hemorragia grave mediante la sección proximal de la cola de la rata, en animales tratados con fármacos anticoagulantes

a) animales tratados con 6HT-FT

Se distribuyeron de forma aleatoria ratas macho Sprage-Dawley que pesaban de 300-600 gramos en 2 grupos de tratamiento: -un grupo control, compuesto de al menos 14 animales que recibieron tratamiento tópico con solución salina fisiológica, y -un segundo grupo compuesto de 5 animales que recibieron 200 U/kg de heparina por vía intravenosa (i.v.) 15 minutos antes de iniciar el procedimiento de transección de la cola. Este grupo se trató tras 15 minutos con 1.494 ng/ml de mFT (6HT-FT). El mFT se puso en contacto tópico con la sección proximal de la cola del animal para actuar hemostáticamente, administrando gota a gota mediante una pipeta eppendorf de plástico.

La formación del coágulo estable y consolidado se puso de manifiesto mediante la confirmación del cese de la hemorragia.

b) animales tratados con CYE-FT

5 Se distribuyeron de forma aleatoria 27 ratas macho Sprage-Dawley que pesaban de 300-600 gramos en 5 grupos de tratamiento:

-: un grupo control, compuesto por al menos 14 animales que recibieron tratamiento tópico con solución salina

10 fisiológica; -dos grupos que recibieron 200 U/kg de heparina i.v. 15 minutos antes de iniciar el procedimiento de transección de la cola (para ser tratados con CYE-FT (n=3) y con solución salina fisiológica (n=5)) y -otros dos grupos que recibieron por vía oral 0,1 mg/kg/día de warfarina durante tres días antes de iniciar el procedimiento de transección de la cola (para ser tratados con CYE-FT (n=3) y con solución salina fisiológica (n=2)).

15 Por tanto, había un grupo control tratado para cada tratamiento de anticoagulación. CYE-FT entraba en contacto tópico con la sección proximal de la cola del animal para actuar hemostáticamente administrado mediante una pipeta eppendorf de plástico. La formación del coágulo estable y consolidado se puso de manifiesto mediante la confirmación del cese de la hemorragia.

20 Modelo de hemorragia letal mediante sección proximal de la cola usando ratones deficientes en el factor VIII

El propósito de este ensayo era evaluar los efectos de la administración tópica de mFT en un modelo de hemorragia letal (transección de la vena de la cola) usando ratones deficientes en el factor VIII (Hemofilia A) obtenidos mediante

25 mutación dirigida a gen.

Los ratones que eran homocigóticos para el alelo mutante ligado al cromosoma X eran viables y fértiles. Las hembras homocigotas y los machos portadores tenían menos del 1% de actividad de factor VIII normal y mostraban tiempos de coagulación prolongados. Estos ratones reúnen las características principales de la hemofilia A y

30 proporcionan un excelente modelo para su uso en la exploración de estrategias terapéuticas alternativas.

Había 5 grupos de tratamiento, con 3 a 5 ratones por grupo, como sigue:

Grupo A: Ratones control Vehículo 0 ng/ml

Grupo B: Ratones macho hemofílicos Vehículo 0 ng/ml

Grupo C: Ratones macho hemofílicos mFT 1.494 ng/ml

Grupo D: Ratones hembra hemofílicos Vehículo 0 ng/ml

Grupo E: Ratones hembra hemofílicos mFT 1.494 ng/ml

La concentración de la solución madre de proteína mFT era 1.494 ng/ml de material biológicamente activo. Sólo se

35 usó una dosis directamente de los recipientes de solución madre y no se realizaron diluciones. Las dosis de ensayo del producto se calcularon en base a la concentración de proteína biológicamente activa usando un ensayo de coagulación en dos etapas. mFT y el vehículo se administraron tópicamente en el sitio de la hemorragia de la cola de los ratones gota a gota con una velocidad de 0,25 ml/minuto durante un máximo de 20 minutos (5 ml).

40 II. RESULTADOS

1. Ensayos in vitro que demuestran que el FT microvesiculado induce la coagulación sanguínea tanto en condiciones sanas como patológicas.

45 Se realizaron varios ensayos in vitro con el fin de evaluar la capacidad de mFT para inducir un coágulo de fibrina en sujetos sanos y hemofílicos a diferentes concentraciones. Como se ha mencionado previamente, el “tiempo de coagulación” se refiere al tiempo que necesita el coágulo para consolidarse en una muestra de sangre no anticoagulada.

50 1.1 El FT microvesiculado es capaz de coagular el plasma de sujetos sanos (ensayo de coagulación en plasma)

El ensayo directo de la actividad procoagulante de mFT en plasmas sanos a diferentes concentraciones demostraba que mFT es capaz de disminuir muy significativamente el tiempo de coagulación en condiciones plasmáticas sanas, de un modo dosis-respuesta evidente. Incluso a concentraciones muy bajas de mFT (2 ng/ml) el tiempo de

55 coagulación del plasma sano se reduce al menos 3 veces. A concentraciones mayores (100 ng/ml) se reduce en más de 5 veces. La Tabla 5 muestra los resultados de tres experimentos independientes para la proteína de fusión FT-etiqueta hexahistidina (6HT-FT) microvesiculada purificada, la Tabla 6 para los extractos de levaduras clarificados que contienen FT microvesiculado (CYE-FT) y la Tabla 7 para extractos de levadura aclarada que contienen FT truncada microvesiculada (CYE-FTT).

Tabla 5

La proteína de fusión FT-etiqueta de hexahistidina microvesiculada purificada (6HT-FT) disminuye el tiempo

de coagulación en plasma sano de un modo dosis-respuesta

6HT-FT (ng/ml) Tiempo de coagulación (segundos)

0,00 168,60 ± 6,06

2,00: 63,27 ±2,17

5,00: 55,56 ± 0,76

20,00: 45,47 ± 0,92

50,00: 37,50 ± 0,75

100,00 31,10 ± 0,12

Media ± ETM (n= 3)

10 Tabla 6 Los extractos de levadura clarificados que contienen FT microvesiculado (CYE-FT) disminuyen el tiempo de coagulación en plasma sano de un modo dosis-respuesta

CYE-FT (ng/ml) Tiempo de coagulación (segundos)

0,00 320,4±81,3

0,43: 67,35±4,6

4,30: 37,6±1,9

43,00: 23,1±1,09

209 18,08±0,26

Media ± EMT (n=4)

15 Tabla 7 Los extractos de levadura clarificados que contienen FT truncado microvesiculado (CYE-FTT) disminuyen el tiempo de coagulación en plasma sano

CYE-FTT (ng/ml) Tiempo de coagulación (segundos)

0,00 233,4±2,65

20,00 85,6±1,1

Media ± EMT (n=2)

1.2 FT microvesiculado es capaz de coagular plasma con una eficiencia mejorada en comparación con FTr relipidado usando procedimientos estándar.

1.2.1 La actividad procoagulante de FTm comparada con FTr comercial relipidado usando un procedimiento 25 estándar.

Se relipidizó FTr comercial (American Diagnostica) siguiendo el procedimiento estándar descrito por Morrisey (http://www.tf7.org/relipidation2.pdf) en donde FTr se incorpora en liposomas fosfolipídicos. Las muestras de plasma de cinco donantes sanos se obtuvieron del banco de sangre del hospital Vall d’Hebrón, Departamento “Banc de

30 Sang i Teixits” (Pg, Vall d’Hebrón, 119-129, 08035 Barcelona). Las muestras de plasma se muestrearon en busca del virus de la Hepatitis B (HBV), Hepatitis C (HCV), HIV y TPHA y todos fueron negativos. Las cinco muestras de plasma se empaquetaron y congelaron a -20ºC en viales de 1,5 ml hasta su uso. La cantidad de FTr en las muestras se cuantificó mediante el kit de ELISA del factor tisular IMUBIND de American Diagnostica (No. 845) usando las especificaciones del proveedor.

35 Se analizó en primer lugar las posibles diferencias en actividad entre rFT incorporado en microvesículas de levadura

o cuando se insertaron en liposomas sintéticos. Para estos experimentos, se ensayó la actividad coagulante de cuatro lotes distintos de mFT (lotes P4, P7, P8 y P9) y un lote de FTr relipidado in vitro, todos ellos con concentraciones conocidas de FTr según se determinó mediante ELISA. Así, diluciones seriales de FTm (de los

40 cuatro lotes diferentes) o el FTr relipidado comercial se probaron en cuanto a su actividad en un test estándar de coagulación. Se observó que la actividad procoagulante de FTm fue siempre mayor (entre uno y dos órdenes de magnitud) en todo el rango de concentraciones e independientemente del lote ensayado que la actividad de las diluciones correspondientes de FTr relipidado (Figura 32).

1.2.2 La actividad procoagulante de FTr insertado en microvesículas derivadas de levadura (FTm) en comparación con el mismo FTr insertado en liposomas sintéticos.

Los esfuerzos para relipidar FTr extraído de microvesículas FTm mostraron que la actividad FTr se encuentra 5 enormemente reducida en comparación con las microvesículas originales que contenía FTr (figura 33) Parece existir un requerimiento conformacional para una actividad óptima de factor tisular.

1.2.3 Actividad procoagulante de FTm en plasma heparinizado.

10 Adicionalmente, la actividad presente en las preparaciones reconstituidas fue despreciable en algunos modelos in vivo de hemorragia (animales heparinizados) (Figura 34).

Tomados en su conjunto, los resultados mostrados en 1.2 indican que la combinación única de FT y membranas de levadura presentes en FTm o vesículas 6H-FT de acuerdo con la invención muestran un conjunto de actividades 15 hemostáticas que no se pueden obtener mediante la inserción convencional de FTr en liposomas sintéticos.

1.3 El FT microvesiculado es capaz de coagular el plasma de pacientes deficientes en FVIII, FIX y FXI (ensayo de coagulación en plasma)

20 El ensayo directo de actividad procoagulante de mFT en plasmas deficientes en el factor de coagulación FVIII (hemofilia A), FIX (hemofilia B) y FXI (hemofilia C) obtenidos mediante inmunodepleción a diferentes concentraciones, demostraba que mFT es capaz de disminuir muy significativamente el tiempo de coagulación en condiciones de hemofilia, de un modo dosis-respuesta evidente. Incluso a concentraciones de mFT muy bajas (2 ng/ml) era capaz de provocar la coagulación de plasmas empobrecidos en FVIII, FIX o FXI. A las concentraciones

25 más altas (100 ng/ml), mFT reduce el tiempo de coagulación en plasmas empobrecidos al mismo nivel que en plasmas sanos. La Tabla 8 muestra los resultados de 3 experimentos independientes de la proteína de fusión FTetiqueta hexahistidina microvesiculada purificada (6HT-FT) y la Tabla 9 muestra los resultados de los extractos de levadura clarificados que contienen FT microvesiculado (CYE-FT).

30 Tabla 8 La proteína de fusión FT-etiqueta hexahistidina microvesiculada purificada disminuye el tiempo de coagulación en plasmas deficientes en el factor de coagulación FVIII (hemofilia A), FIX (hemofilia B) y FXI (hemofilia C) de una forma dosis-respuesta

6HT-FT FVIII FIX FXI

(ng/ml) (hemofilia A) (hemofilia B) (hemofilia C) Tiempo de coagulación Tiempo de coagulación Tiempo de coagulación (segundos) (segundos) (segundos)

0,00: 600±0,0 600±0,0 600±0,0

2,00: 87,43±3,01 78,37±0,82 66,43±2,17

5,00: 57,43±1,68 52,20±0,69 51,67±0,64

20,00: 48,57±1,23 41,70±1,18 46,07±1,70

50,00: 39,80±0,67 34,40±0,42 38,93±1,23

100,00 32,77±0,38 29,17±0,43 32,50±0,85

Media ± ETM (n= 3)

Tabla 9 Los extractos de levadura clarificados que contienen FT microvesiculado disminuyen el tiempo de coagulación en plasmas deficientes en el factor FVIII (hemofilia A), FIX (hemofilia B) y FXI (hemofilia C) de una forma dosis-respuesta

CYE-FT FVIII FIX FXI

0,00 >600 >600 <600

0,043: 127,9±0 126,7±1,2 -

0,43: 63,25±5 64,15±5 130,2±0

4,3: 34,65±2,65 35,47±2,57 36,9±4,0

43,0: 20,15±1,05 20,6±1,4 20,85±1,15

Media ± ETM (n= 2)

1.4 El FT microvesiculado es capaz de coagular el plasma de deficiencias plaquetarias adquiridas (ensayos de coagulación en plasma trombocitopénico)

El ensayo directo de la actividad procoagulante de mFT en plasma de deficiencias plaquetarias adquiridas demostraba que mFT es capaz de disminuir muy significativamente el tiempo de coagulación en plasmas trombocitopénicos con diferentes de recuentos de plaquetas. Incluso a recuentos plaquetarios muy bajos (<1.000/!l) el tiempo de coagulación se reducía drásticamente con los extractos de levadura clarificados que contiene FT

5 microvesiculados (CYE-FT), como se muestra en la Tabla 10.

Tabla 10 Los extractos de levadura clarificados que contienen FT microvesiculado (CYE-FT) disminuyen el tiempo de coagulación en plasmas trombocitopénicos

Recuento de Sin mFT Con CYE-FT plaquetas Tiempo de coagulación (60 ng/ml) (segundos) Tiempo de coagulación (segundos)

350.000/!l 226,3 21,9 150.000/!l 232,6 22,8 50.000/!l 253,9 22,4 9.000/!l 321,2 21,3 <1.000/!l >400 21,3

10 Media ± ETM (n= 1)

1.5 El FT microvesiculado es capaz de coagular plasma de deficiencias plasmáticas en FVIII, FIX y FXI en presencia de un anticuerpo anti-FVII (ensayos de coagulación en plasma)

15 El efecto del FT microvesiculado sobre la coagulación del plasma se analizó mediante ensayos de coagulación usando plasmas deficientes en FVIII, FIX y FXI (FVIII DP, FIX DP y FXI DP) de voluntarios sanos en presencia de un anticuerpo monoclonal frente a FVII. Los resultados claramente muestran que los extractos de levadura clarificados que contienen FT microvesiculado (CYE-FT) son capaces de producir la coagulación del plasma, incluso reducir extraordinariamente el tiempo de coagulación aún en ausencia de FVIII, FIX y FXI y en presencia de un anticuerpo

20 monoclonal frente a FVII, como se muestra en la Tabla 11. La coagulación en ausencia de FX, y en presencia de anticuerpos FVII significa que, sorprendentemente, mFT no actúa a través de la vía intrínseca ni a través de la vía extrínseca de coagulación.

Tabla 11

25 Los extractos de levadura clarificados que contienen FT microvesiculado (CYE-FT) coagulan plasmas deficientes el FVIII, FIX y FXI en presencia de anticuerpos anti-FVII Sin mFT Con CYE-FT Tiempo de (70 ng/ml) coagulación Tiempo de coagulación (segundos) (segundos) FVIII DP 308,17±5,41 29,6±4,85

FVIII DP + anti-FVII: >395 45,9±0,86

FIX DP: 347,4±23,03 26,77±3,97

FIX DP + anti-FVII: >400 41,67±0,55

FXI DP: 3311±5,43 32,9±5,8

FXI DP + anti-FVII: >400 49,17±1,2

Plasma normal: 126,28±85 28,15±0,05

Plasma normal + anti-FVII 216,8±0 42,55±2,05

Media ± ETM (n= 4)

1.6 El FT microvesiculado es capaz de coagular la sangre de sujetos sanos (ensayo de coagulación en sangre 30 completa no anticoagulada)

El ensayo directo de la actividad procoagulante de mFT en sangre completa de sujetos sanos a diferentes concentraciones demostró que mFT es capaz de disminuir muy significativamente el tiempo de coagulación, de un modo dosis-respuesta evidente. Incluso a concentraciones de mFT muy bajas (1 ng/ml) era capaz de reducir el

35 tiempo de coagulación de la sangre completa de sujetos sanos. A las concentraciones más altas (100 ng/ml), mFT reduce el tiempo de coagulación en plasmas empobrecidos más de 8 veces. La Tabla 12 muestra los resultados de tres experimentos independientes de la proteína de fusión FT-etiqueta hexahistidina microvesiculada purificada (6HT-FT) y la Tabla 13 muestra los resultados de los extractos de levadura clarificados que contienen FT microvesiculado (CYE-FT).

Tabla 12 La proteína de fusión FT-etiqueta de hexahistidina microvesiculada purificada disminuye el tiempo de coagulación en sangre completa de pacientes sanos de un modo dosis-respuesta

6HT-FT (ng/ml) Tiempo de coagulación (minutos) 0,00 4,23 ± 0,54 1,00 2,03 ± 0,14

10,00 1,17 ± 0,12

100,00 0,33 ± 0,03

Media ± EMT (n=3)

Tabla 13 Los extractos de levadura clarificados que contienen FT microvesiculado (CYE-FT) disminuyen el tiempo de coagulación en sangre completa de pacientes sanos en modo dosis-respuesta

CYE-FT (ng/ml) Tiempo de coagulación (segundos) 0,00 264,7±33,4 0,043 235,0±37,5

0,43: 168,3±14,2

4,30: 76,6±12,1

43,0: 43,3±8,8

208 23,0±3,0

Media ± EMT (n=3)

1.7 El FT microvesiculado es capaz de coagular la sangre de pacientes hemofílicos (ensayos de coagulación en sangre completa no anticoagulada)

El ensayo directo de la actividad procoagulante de mFT en sangre completa de pacientes hemofílicos a diferentes

15 concentraciones demostraba que mFT es capaz de disminuir muy significativamente el tiempo de coagulación, de un modo dosis-respuesta evidente. Incluso a concentraciones bajas de mFT (2-5 ng/ml) es capaz de normalizar el tiempo de coagulación de la sangre completa de pacientes hemofílicos. A concentraciones más altas (20 ng/ml), mFT reduce el tiempo de coagulación en sangre completa de hemofílicos a menos de un minuto. La Tabla 14 muestra los resultados de tres experimentos independientes de la proteína de fusión FT-etiqueta hexahistidina

20 microvesiculada purificada (6HT-FT) y la Tabla 15 muestra los resultados de los extractos de levadura clarificados que contienen FT microvesiculado (CYE-FT).

Tabla 14 La proteína de fusión FT-etiqueta de hexahistidina microvesiculada purificada (6HT-FT) disminuye el tiempo 25 de coagulación en sangre completa de pacientes con hemofilia A y B de un modo dosis-respuesta6HT-FT (ng/ml) FVIII (hemofilia A) FXI (hemofilia B) Tiempo de coagulación (minutos) Tiempo de coagulación (minutos)

0,00 17,17 ± 1,56 19,27 ± 0,84

1,00 8,50 ± 0,47 11,23 ± 0,65

10,00 3,93 ± 0,30 6,40 ± 0,32

100,00 0,80 ± 0,12 0,77 ± 0,15

Media ± EMT (n=3)

Tabla 15 Los extractos de levadura clarificados que contienen FT microvesiculado (CYE-FT) disminuyen el tiempo de 30 coagulación en sangre completa de pacientes con hemofilia A y B de un modo dosis-respuesta CYE-FT (ng/ml) FVIII (hemofilia A) FXI (hemofilia B) Tiempo de coagulación (minutos) Tiempo de coagulación (minutos)

0,00 15,3±1,2 18,4±2,1

1,00 9,8±1,3 11,2±0,1

10,00 5,7±0,7 5,8±0,3

100,00 1,4±0,2 1,5±0,1

Media ± EMT (hemofilia A, n=3; hemofilia B, n=2)

2. Ensayos in vivo que demuestran que FT microvesiculado es un agente útil para el tratamiento tópico antihemorrágico en modelos de hemorragia grave (aplicándolo directamente en los vasos sanguíneos previamente seccionados)

Se realizaron varios ensayos in vivo con el fin de evaluar la capacidad de mFT para inducir un coágulo de fibrina en sujetos sanos y hemofílicos a diferentes concentraciones.

2.1 El FT microvesiculado es útil como agente hemostático tópico en un modelo animal de hemorragia grave 5 mediante la sección proximal de colas de rata

Los estudios in vivo usando un modelo de hemorragia grave en ratas mediante transección total de la cola mostraban una reducción significativa del tiempo de hemorragia: de 18,16±1,61 a 8,36±0,82 minutos cuando los animales se trataban con 6HT-FT a 1.494 ng/ml hasta 1,7 !g de concentración de proteína total; de 18,16±5,98 a

10 9,33±1,05 minutos cuando los animales se trataban con CYE-FT a 200 ng/ml/min.

2.2 El FT microvesiculado es útil como agente hemostático tópico en un modelo animal de hemorragia grave tratado previamente con heparina

15 Los estudios in vivo usando un modelo de hemorragia grave en ratas tratadas previamente con anticoagulante (es decir, 200 UI de heparina) mediante la sección total de la cola mostraban un efecto antihemorrágico muy significativo. Las ratas no tratadas con 6HT-FT sangraban hasta su muerte después de 90 minutos, mientras que las ratas tratadas con 6HT-FT a 1.494 ng/ml paraban de sangrar en 15,46±1,20 minutos y mostraron un 100% de supervivencia. Por otro lado, el uso de CYE-FT también mostró un efecto antihemorrágico similar. Las ratas tratadas

20 previamente con heparina sangraban hasta su muerte tras 90 minutos, mientras que las ratas tratadas con CYE-FT paraban de sangrar en 14,2±2,4 (n=5) minutos y también mostraban un 100% de supervivencia. Las ratas tratadas previamente con warfarina reducían su tiempo de coagulación de 41,6±16,45 a 5,8±0,64 (n=3) minutos cuando se trataban con CYE-FT (200 ng/ml).

25 3. Ensayos in vivo que demuestran que FT microvesiculado es un agente útil para el tratamiento tópico antihemorrágico en modelos de hemorragia letal (aplicándose directamente en los vasos sanguíneos previamente seccionados).

3.1 El FT microvesiculado es útil como agente hemostático tópico en un modelo animal de hemorragia letal mediante 30 la sección proximal de las colas de ratas deficientes en FVIII

En un modelo de hemorragia letal en ratones hemofílicos (ratones deficientes en FVIII), la administración tópica de 6HT-FT daba lugar a una espectacular reducción del tiempo de sangrado (de 31,4±4,74 a 5,14±0,69 minutos en machos hemofílicos y de 43,33±13,48 a 5,0±2,0 minutos en ratones hembra) comparable al tiempo de sangrado

35 obtenido en ratones normales no hemofílicos (5,0±0,65 minutos). Esta reducción de tiempo de sangrado se asoció con la falta de mortalidad en el grupo tratado con 6HT-FT mientras que todos los ratones hemofílicos tratados con vehículos sangraban hasta su muerte. La Tabla 16 muestra los resultados de cinco y tres experimentos independientes para la proteína de fusión FT-etiqueta hexahistidina (6HT-FT) microvesiculada purificada.

40 Tabla 16 La proteína de fusión FT-etiqueta hexahistidina (6HT-FT) microvesiculada purificada disminuye el tiempo de sangrado en un modelo de hemorragia letal por la sección proximal de las colas de ratas deficientes en FVIII

Tratamiento: Peso del animal (g) 6HT-FT (ng/ratón) Tiemposangrado (min) de Mortalidad

Media+ETM
Media+ETM
Media+ETM: N % Media (min)

Ratones macho control: Vehículo 23,56±0,74 0+/-0 5±0,65 5 0 --

Ratones macho hemofílicos: Vehículo 20,94±0,35 0+/-0 31,4±4,74 5 100 44,8±8,43

Ratones macho hemofílicos: 6HT-FT 21,04±0,49 1.807+/-291 5,14±0,69 5 0 --

Ratones hembra hemofílicos: Vehículo 19,7±1 0+/-0 43,33±13,48 3 100 50±16,04

Ratones hembra hemofílicos: 6HT-FT 19,43±0,29 1618+/-498 5±2 3 0 --

Media ± ETM (Control y machos hemofílicos, n=5; hembras hemofílicas, n=3)

Los resultados en general muestran el potente potencial hemostático de mFT en sujetos sanos e incluso en

45 pacientes hemofílicos, demostrado esto in vitro (plasma y sangre completa de pacientes hemofílicos) así como en modelos in vivo usando un modelo de ratón defectuosas para el gen de la hemofilia A. Adicionalmente, mFT es capaz de coagular plasmas que tienen tanto la vía intrínseca como la extrínseca bloqueada.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una microvesícula derivada de levadura portadora de factor tisular (FT) que tiene actividad procoagulante que comprende (i) una membrana de levadura y (ii) una proteína factor tisular (FT) o una variante de la misma con actividad procoagulante, en la que una porción de dicha proteína factor tisular (FT) o un fragmento de la misma con actividad procoagulante está integrada en dicha membrana, en donde dicha microvesícula es obtenible mediante un procedimiento que comprende:

(a)

someter a fermentación un cultivo de células recombinantes de levadura que expresan la proteína FT o un fragmento de la misma con actividad procoagulante en condiciones que permiten la expresión de dicha proteína FT, o fragmento de la misma con actividad procoagulante;

(b)

sedimentar el producto que resulta de la etapa a) de fermentación, para obtener un producto de fermentación;

(c)

someter dicho producto de fermentación de la etapa b) a homogeneización, para obtener un homogeneizado de fermentación; y

(d)

someter dicho homogeneizado de fermentación de la etapa c) a separación, para obtener un pellet y un extracto de levadura clarificado (CYE) que contiene dicha microvesícula derivada de levadura portadora de FT con actividad procoagulante;

(e)

recoger dicho extracto de levadura clarificado (CYE) que contiene dicha microvesícula derivada de levadura portadora de FT con actividad procoagulante y,

(f)

aislar o purificar dichas microvesículas derivadas de levadura portadoras de FT con actividad procoagulante.
2.

Microvesícula derivada de levadura según la reivindicación 1, en la que dicha proteína factor FT, o una variante de la misma con actividad procoagulante, está glucosilada.
3.

Microvesícula derivada de levadura según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha proteína factor FT, o una variante de la misma con actividad procoagulante, es un miembro de una proteína de fusión, conteniendo dicha proteína de fusión una primera región que comprende la proteína FT, o un fragmento de la misma con actividad procoagulante, unida a una segunda región que comprende otro péptido o proteína.
4.

Microvesícula derivada de levadura según la reivindicación 3, en la que dicha proteína de fusión comprende una proteína FT, o una variante de la misma con actividad procoagulante, y una etiqueta.
5.

Microvesícula derivada de levadura según la reivindicación 4, en la que dicha etiqueta es una etiqueta de histidina (His-tag).
6.

Microvesícula derivada de levadura según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende una proteína FT madura, preferiblemente, una proteína FT madura humana.
7.

Microvesícula derivada de levadura según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende una proteína FT truncada con actividad procoagulante en la que se ha perdido todo o parte del dominio responsable de la unión a FVIIa (aa 32 a 174).
8.

Microvesícula derivada de levadura según la reivindicación 7, en la que dicha proteína FT truncada comprende el dominio de interacción con el Factor X, la región transmembrana y la cola citoplasmática y carece, parcial o totalmente, del dominio responsable de la unión a FVIIa.
9.

Microvesícula derivada de levadura según la reivindicación 8, en la que dicha proteína FT truncada comprende el dominio de interacción con el Factor X (aa 174-251), la región transmembrana (aa 252-274) y la cola citoplasmática (aa 275-295) del FT humano y una etiqueta de histidina adicional.
10.

Microvesícula derivada de levadura según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que FT contiene al menos un sitio de N-glucosilación no funcional.
11.

Microvesícula derivada de levadura según la reivindicación 10, en la que dicho sitio o sitios de N-glucosilación no funcionales son aquellos que corresponden a los sitios de N-glucosilación NLT en las posiciones 11-13, NVT en las posiciones 124-126 o NNT en las posiciones 137-139 en el rFT maduro humano.
12.

Microvesícula derivada de levadura según la reivindicación 11, en la que el FT contiene una o más mutaciones Asn a Ala en los residuos Asn en las posiciones correspondientes a las posiciones 11, 124 ó 137 en el FT maduro humano.
13.

Microvesícula derivada de levadura según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que el dominio Nterminal de dicha proteína FT o variante de la misma con actividad procoagulante se orienta hacia el lado exoplasmático de dicha membrana.
14.

Microvesícula derivada de levadura según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que el dominio Nterminal de dicha proteína FT o variante de la misma con actividad procoagulante se orienta hacia el lado endoplasmático de dicha membrana.
15.

Una microvesícula derivada de levadura portadora de FT de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha purificación se lleva a cabo mediante purificación por etiqueta o por cromatografía de inmunoafinidad.
16.

Una composición que comprende una microvesícula derivada de levadura portadora de FT según cualquiera de las reivindicaciones 1-15.
17.

Microvesícula derivada de levadura portadora de FT según cualquiera de la reivindicaciones 1 a 15, para su uso como medicamento.
18.

Una composición farmacéutica que comprende una microvesícula derivada de levadura portadora de FT según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
19.

Una microvesícula derivada de levadura portadora de FT de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para su uso en el tratamiento de hemorragias en un sujeto.
20.

Una microvesícula derivada de levadura portadora de FT según la reivindicación 19 para su uso en el tratamiento tópico de hemorragias en un sujeto.
21.

Una microvesícula derivada de levadura portadora de FT según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para su uso en el tratamiento de una enfermedad que requiere promocionar la migración celular y/o la angiogénesis en un sujeto, en donde dicha enfermedad se selecciona de miocardio isquémico, infarto de miocardio, cardiomiopatía isquémica, claudicación de una isquemia límbica crónica, ulceración/gangrena isquémica/dolor en reposo, neuropatía/derrame cerebral isquémico, penumbra isquémica cerca del derrame cerebral/infarto, placa aterosclerótica inestable/ulcerada en arterias coronaria/carótida, trombosis aguda o crónica arterial y/o venosa, cicatrización de herida, derrame cerebral isquémico y hemorrágico, lesiones traumáticas y úlceras.
22.

Una microvesícula derivada de levadura portadora de FT para su uso de acuerdo con la reivindicación 21, en donde la herida se selecciona de heridas corneales, quemaduras, abrasiones, incisiones quirúrgicas, sitios donantes de injerto, lesión en un lumen corporal tal como vaso sanguíneo, arteria, arteria coronaria, vena, lumen esofágico y uretra; lesiones causadas por agentes infecciosos; lesiones en piel y superficie epitelial causadas por una infección o afección inflamatoria persistente; lesiones en piel y superficie epitelial causadas por un defecto genético tal como formación de queloide y anormalidades en coagulación.
23.

Una microvesícula derivada de levadura portadora de FT para su uso según la reivindicación 21, en donde la úlcera se selecciona de úlceras en piernas, llagas de cama, úlcera venosa crónica, úlcera diabética, úlcera por compresión, llagas por presión y úlceras o llagas de la superficie mucosa.
24.

Un procedimiento para la producción de una microvesícula derivada de levadura portadora de FT con actividad procoagulante y que comprende (i) una membrana de levadura y (ii) una proteína factor tisular (FT) o una variante de la misma con actividad procoagulante, en la que una porción de dicha proteína factor tisular (FT) o un fragmento de la misma con actividad procoagulante está integrada en dicha membrana, que comprende:

(a)

someter a fermentación un cultivo de células recombinantes de levadura que expresan la proteína FT o un fragmento de la misma con actividad procoagulante en condiciones que permiten la expresión de dicha proteína FT, o fragmento de la misma con actividad procoagulante;

(b)

sedimentar el producto que resulta de la etapa a) de fermentación, para obtener un producto de fermentación;

(c)

someter dicho producto de fermentación de la etapa b) a homogeneización, para obtener un homogeneizado de fermentación; y

(d)

someter dicho homogeneizado de fermentación de la etapa c) a separación, para obtener un pellet y un extracto de levadura clarificado (CYE) que contiene dicha microvesícula derivada de levadura portadora de FT con actividad procoagulante;

(e)

recoger dicho extracto de levadura clarificado (CYE) que contiene dicha microvesícula derivada de levadura portadora de FT con actividad procoagulante; y

(f)

aislar o purificar dichas microvesículas derivadas de levadura portadoras de FT con actividad procoagulante.
25.

Procedimiento según la reivindicación 24, en el que dicha purificación se realiza mediante purificación por etiqueta o mediante cromatografía de afinidad.
26.

Un procedimiento para la preparación de microvesículas que comprenden una proteína de membrana de interés, en la que dicha proteína de interés es rFT, un fragmento del mismo o un mutante de N-glicosilación del mismo, a partir de una célula de levadura que comprende las etapas de:

(a)

hacer crecer un cultivo de dicha célula de levadura en condiciones que permiten la expresión de dicha proteína de membrana de interés,

(b)

someter la fracción celular del cultivo de a) a homogenización,

(c)

someter el homogeneizado obtenido en la etapa b) a separación, para obtener un pellet y un extracto celular clarificado que contiene dichas microvesículas derivadas celulares que contienen la proteína de membrana de interés, y

(d)

purificar dichas microvesículas derivadas celulares mediante fraccionamiento por tamaño usando filtración de flujo tangencial y/o usando filtros de membrana que retienen microvesículas que con un diámetro de 0,1 a 0,2 µm.
27.

Procedimiento según la reivindicación 26 que comprende una etapa adicional de concentración mediante cromatografía de exclusión por tamaños o una etapa adicional de purificación mediante cromatografía de afinidad usando un ligando que muestra afinidad por la proteína de membrana de interés.
28.

Uso de una microvesícula derivada de levadura portadora de FT según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de hemorragias en un sujeto.
29.

Uso según la reivindicación 28 en el que la microvesícula derivada de levadura portadora de FT se administra tópicamente.
30.

Uso de una microvesícula derivada de levadura portadora de FT según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de una enfermedad que requiere promocionar la migración celular y/o la angiogénesis en un sujeto, en donde dicha enfermedad se selecciona de miocardio isquémico, infarto de miocardio, cardiomiopatía isquémica, claudicación de una isquemia límbica crónica, ulceración/gangrena isquémica/dolor en reposo, neuropatía/derrame cerebral isquémico, penumbra isquémica cerca del derrame cerebral/infarto, placa aterosclerótica inestable/ulcerada en arterias coronaria/carótida, trombosis aguda

o crónica arterial y/o venosa, cicatrización de herida, derrame cerebral isquémico y hemorrágico, lesiones traumáticas y úlceras.
31.

Uso según la reivindicación 30, en el la herida se selecciona de heridas corneales, quemaduras, abrasiones, incisiones quirúrgicas, sitios donadores de injerto, lesión en un lumen corporal tal como un vaso sanguíneo, arteria, arteria coronaria, vena, lumen esofágico y uretra; lesiones causadas por agentes infecciosos; lesiones en piel y superficie epitelial causadas por una infección o afección inflamatoria persistente; lesiones en piel y superficie epitelial causadas por un defecto genético tal como formación de un queloide y anormalidades en coagulación.
32.

Uso según la reivindicación 30, en el que la úlcera se selecciona de úlceras en piernas, llagas de cama, úlcera venosa crónica, úlcera diabética, úlcera por compresión, llagas por presión y úlceras o llagas de la superficie mucosa.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden 5 excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patentes citados en la descripción

Literatura diferente de patentes citada en la descripción