RS66972B1 - Metode lečenja hemofilije a - Google Patents

Description

Opis

POZADINA PRONALASKA

[0001] Hemofilija A je poremećaj krvarenja uzrokovan defektima u genu koji kodira koagulacioni faktor VIII (FVIII) i pogađa 1-2 od 10.000 muške novorođenčadi. Graw et al., Nat. Rev. Genet. 6(6): 488-501 (2005). Pacijenti oboleli od hemofilije A mogu se lečiti infuzijama prečišćenog ili rekombinantno proizvedenog FVIII. Mnogi komercijalno dostupni FVIII proizvodi imaju poluživot od oko 8-12 sati, što zahteva čestu intravensku primenu kod pacijenata. Videti Weiner M.A. i Cairo, M.S., Pediatric Hematology Secrets, Lee, M.T., 12. Disorders of Coagulation, Elsevier Health Sciences, 2001; Lillicrap, D. Thromb. Res. 122 Suppl 4:S2-8 (2008). Pored toga, isproban je niz pristupa u cilju produženja poluživota FVIII. Na primer, pristupi u razvoju za produženje poluživota faktora zgrušavanja uključuju pegilaciju, glikopegilaciju i konjugaciju sa albuminom. Videti Dumont et al., Blood.119(13): 3024-3030 (2012). Dosledni rezultati su pokazani kod ljudi, na primer, prijavljeno je da rFVIIIFc poboljšava poluživot do ~1,7 puta u poređenju sa ADVATE<®>kod pacijenata sa hemofilijom A. Videti Powell et al., Blood. 119(13): 3031-3037 (2012). Stoga, povećanja poluživota, uprkos manjim poboljšanjima, ukazuju na prisustvo drugih faktora koji ograničavaju poluživot. Videti Liu, T. et al., sastanak ISTH 2007, apstrakt #P-M-035; Henrik, A. et al., sastanak ISTH 2011, apstrakt #P=MO-181; Liu, T. et al., sastanak ISTH 2011, apstrakt #P-WE-131.

[0002] Trenutno preporučeni standard nege uključuje redovnu primenu (rutinsku profilaksu) FVIII kako bi se minimizovao broj epizoda krvarenja. Rutinska profilaksa je povezana sa poboljšanjima dugoročnih ishoda, ali je zahtevan režim ograničen potrebom za čestom intravenskom (IV) primenom. Videti Manco-Johnson et al., N Engl J Med. 357(6):535-44 (2007). FVIII proizvodi produženog poluživota smanjili su učestalost primene FVIII za profilaksu; međutim, svi interaguju sa Fon Vilebrandovim faktorom (VWF) i imaju uporedive cirkulišuće poluživote, u skladu sa gornjom granicom poluživota rFVIII varijanti zbog poluživota endogenog VWF. Videti, npr. Pipe et al., Blood. 128(16):2007-16 (2016). Profilaktičko doziranje za ove FVIII proizvode je svakih 3 do 5 dana. WO 2015/106052 A1 obelodanjuje himerni FVIII protein i opšte doze u rasponu od 0,1 do 100,000 µg/kg telesne težine.

[0003] FVIII proizvodi sledeće generacije sa produženim poluživotom koji sprečavaju i kontrolišu epizode krvarenja tokom dužeg vremenskog perioda, što rezultira ređom primenom, potencijalno bi rešili izazove pridržavanja zahtevnih profilaktičkih režima, što bi zauzvrat moglo poboljšati kvalitet života pacijenata sa hemofilijom.

KRATAK SAŽETAK PRONALASKA

[0004] Pronalazak je detaljno opisan u pratećim patentnim zahtevima. Konkretno, ovaj pronalazak obelodanjuje himerni polipeptid koji se sastoji od proteina faktora VIII (FVIII) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 207, i (ii) proteina Fon Vilebrandovog faktora (VWF) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 202, za upotrebu u lečenju hemofilije A kod humanog subjekta kome je to potrebno, pri čemu se himerni polipeptid primenjuje intravenski u višestrukim dozama od 45 IU/kg do 55 IU/kg, sa intervalom doziranja od najmanje 7 dana, pri čemu je FVIII protein povezan sa VWF proteinom kovalentnom vezom.

[0005] U nekim otelotvorenjima, višestruke doze obuhvataju najmanje dve doze, najmanje tri doze, najmanje četiri doze, najmanje pet doza, najmanje šest doza, najmanje sedam doza, najmanje osam doza, najmanje devet doza, najmanje deset doza, najmanje jedanaest doza, najmanje dvanaest doza, najmanje trinaest doza, najmanje četrnaest doza, najmanje petnaest doza, najmanje šesnaest doza, najmanje sedamnaest doza, najmanje osamnaest doza, najmanje devetnaest doza, najmanje dvadeset doza ili više.

[0006] U nekim otelotvorenjima, lečenje hemofilije A obuhvata kontrolu ili smanjenje učestalosti epizoda krvarenja kod humanog subjekta kome je to potrebno. U nekim otelotvorenjima, lečenje hemofilije A obuhvata prevenciju ili tretiranje epizode krvarenja kod humanog subjekta kome je to potrebno.

[0007] U nekim otelotvorenjima, najmanje jedna od višestrukih doza iznosi oko 50 IU/kg.

[0008] Interval doziranja u nekim otelotvorenjima iznosi najmanje 7 dana, najmanje oko 8 dana, najmanje oko 9 dana, najmanje oko 10 dana, najmanje oko 11 dana, najmanje oko 12 dana, najmanje oko 13 dana, najmanje oko 14 dana, najmanje oko 15 dana, najmanje oko 16 dana, najmanje oko 17 dana, najmanje oko 18 dana, najmanje oko 19 dana, najmanje oko 20 dana, najmanje oko 21 dan, najmanje oko 22 dana, najmanje oko 23 dana, najmanje oko 24 dana, najmanje oko 25 dana, najmanje oko 26 dana, najmanje oko 27 dana, najmanje oko 28 dana, najmanje oko 29 dana, najmanje oko 30 dana, ili najmanje oko 31 dan.

[0009] U nekim otelotvorenjima, učestalost doziranja je jednom nedeljno, jednom u 2 nedelje, jednom u 3 nedelje, ili jednom u 4 nedelje.

[0010] U nekim otelotvorenjima, himerni polipeptid se primenjuje za profilaktičko lečenje.

[0011] U nekim otelotvorenjima, kovalentna veza je peptidna veza ili disulfidna veza.

[0012] U nekim otelotvorenjima, FVIII protein i VWF fragment su povezani kovalentnom vezom između prvog Fc domena i drugog Fc domena. U nekim otelotvorenjima, FVIII protein i VWF fragment su dodatno povezani nekovalentnom interakcijom između FVIII proteina i VWF fragmenta.

[0013] Himerni polipeptid za upotrebu prema ovom pronalasku obuhvata, prema jednom otelotvorenju: (i) FVIII protein koji sadrži prvi FVIII polipeptidni fragment sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 215; prvu XTEN sekvencu sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 218 (AE288_3); drugi FVIII polipeptidni fragment sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 216; i prvi Fc region sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 217; i (ii) VWF protein koji sadrži: D' domen VWF sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 210; D3 domen VWF sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 214; drugu XTEN sekvencu sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 58 (AE144_5A); a2 linker sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 88; i drugi Fc region sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 217, pri čemu je prvi Fc region kovalentno povezan sa drugim Fc regionom disulfidnom vezom.

[0014] Himerni polipeptid obuhvata FVIII protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 207; i VWF protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 202.

[0015] Prema pronalasku, himerni polipeptid se primenjuje intravenskom injekcijom.

[0016] U nekim otelotvorenjima, himerni polipeptid nakon primene rezultira nivoom aktivnosti FVIII u plazmi od najmanje oko 1%, najmanje oko 2%, najmanje oko 3%, najmanje oko 4%, najmanje oko 5%, najmanje oko 6%, najmanje oko 7%, najmanje oko 8%, najmanje oko 9%, ili najmanje oko 10%. U nekim otelotvorenjima, nivo aktivnosti FVIII u plazmi je najmanje oko 3%. U nekim otelotvorenjima, nivo aktivnosti FVIII u plazmi je najmanje oko 5%.

[0017] U nekim otelotvorenjima, himerni polipeptid nakon primene rezultira nivoom aktivnosti FVIII u plazmi od najmanje oko 1 IU/dL, najmanje oko 2 IU/dL, najmanje oko 3 IU/dL, najmanje oko 4 IU/dL, najmanje oko 5 IU/dL, najmanje oko 6 IU/dL, najmanje oko 7 IU/dL, najmanje oko 8 IU/dL, najmanje oko 9 IU/dL, ili najmanje oko 10 IU/dL. U nekim otelotvorenjima, nivo aktivnosti FVIII u plazmi je najmanje oko 3 IU/dL. U nekim otelotvorenjima, nivo aktivnosti FVIII u plazmi je najmanje oko 5 IU/dL.

[0018] U nekim otelotvorenjima, nivo aktivnosti FVIII u plazmi je najmanje oko 10 IU/dL najmanje oko 5 dana nakon primene himernog polipeptida. U nekim otelotvorenjima, nivo aktivnosti FVIII u plazmi je najmanje oko 5 IU/dL najmanje oko 7 dana nakon primene himernog polipeptida. U nekim otelotvorenjima, nivo aktivnosti FVIII u plazmi je najmanje oko 3 IU/dL najmanje oko 8 dana nakon primene himernog polipeptida. U nekim otelotvorenjima, nivo aktivnosti FVIII u plazmi je najmanje oko 1 IU/dL najmanje oko 10 dana nakon primene himernog polipeptida.

[0019] U nekim otelotvorenjima, višestruke doze su oko 50 IU/kg, a interval doziranja je 7 dana. U nekim otelotvorenjima, višestruke doze su oko 50 IU/kg, a interval doziranja je oko 14 dana.

[0020] U nekim otelotvorenjima, najmanje jedna od višestrukih doza je od oko 50 IU/kg do oko 65 IU/kg, a interval doziranja je najmanje oko 10 dana.

[0021] U nekim otelotvorenjima, interval doziranja je od 7 do oko 14 dana. U nekim otelotvorenjima, interval doziranja je najmanje oko 10 dana. U nekim otelotvorenjima, interval doziranja je od oko 10 do oko 21 dan. U nekim otelotvorenjima, interval doziranja je od oko 14 do oko 21 dan. U nekim otelotvorenjima, interval doziranja je oko 14 dana.

[0022] U nekim otelotvorenjima, humani subjekt je žena. U nekim otelotvorenjima, humani subjekt je dete. U nekim otelotvorenjima, humani subjekt je dete mlađe od ili jednako oko 12 godina, mlađe od oko 11 godina, mlađe od oko 10 godina, mlađe od oko 9 godina, mlađe od oko 8 godina, mlađe od oko 7 godina, mlađe od oko 6 godina, mlađe od oko 5 godina, mlađe od oko 4 godine, mlađe od oko 3 godine, mlađe od oko 2 godine, ili mlađe od oko 1 godine.

[0023] U nekim otelotvorenjima, primena indukuje imunološku toleranciju na FVIII kod humanog subjekta. U nekim otelotvorenjima, primena smanjuje inhibitorni imunološki odgovor na FVIII kod humanog subjekta. U nekim otelotvorenjima, inhibitorni imunološki odgovor na FVIII obuhvata visok titar anti-FVIII antitela kod humanog subjekta.

[0024] U nekim otelotvorenjima, primena himernog polipeptida ne indukuje FVIII inhibitor nakon oko 7 dana, oko 10 dana, oko 11 dana, oko 12 dana, oko 13 dana, oko 14 dana, oko 15 dana, oko 20 dana, oko 24 dana, oko 25 dana, oko 28 dana, oko 30 dana, ili oko 35 dana od primene. U nekim otelotvorenjima, primena himernog polipeptida ne indukuje FVIII inhibitor nakon oko 28 dana od primene. Dodatni aspekti i otelotvorenja su obelodanjeni u pratećim patentnim zahtevima.

KRATAK OPIS CRTEŽA/SLIKA

[0025]

Slika 1 je šematski prikaz rFVIIIFc-VWF-XTEN. FVIII: faktor VIII; VWF: Fon Vilebrandov faktor; A1, A2, A3, C1, C2: domeni FVIII; D'D3: domeni VWF; Fc: Fc region konstantnog regiona imunoglobulina.

Slike 2A i 2B prikazuju protokol za testiranje bezbednosti i efikasnosti rFVIIIFc-VWF-XTEN kod humanih pacijenata u kohorti sa niskom dozom (primenjeno 25 IU/kg rFVIIIFc-VWF-XTEN; SLIKA 2A) i kohorti sa visokom dozom (primenjeno 65 IU/kg rFVIIIFc-VWF-XTEN; SLIKA 2B).

Slike 3A-3B su grafički prikazi nivoa aktivnosti FVIII korigovanih za početnu vrednost, na osnovu testa aktiviranog parcijalnog tromboplastinskog vremena (aPTT), kod humanih subjekata sa teškom hemofilijom A kojima je primenjeno 25 IU/kg rFVIII, zatim period ispiranja, a potom 25 IU/kg rFVIIIFc-VWF-XTEN (slika 3A; kohorta sa niskom dozom) ili 65 IU/kg rFVIII, zatim period ispiranja, a potom 65 IU/kg rFVIIIFc-VWF-XTEN (slika 3B; kohorta sa visokom dozom). Horizontalne isprekidane linije označavaju 3%, 5%, 10% i 20% aktivnosti FVIII.

Slika 4 je šematski prikaz dizajna kliničke studije za procenu bezbednosti i podnošljivosti ukupno četiri doze rFVIIIFc-VWF-XTEN jednom nedeljno, u dozi od 50 IU/kg ili 65 IU/kg, kod odraslih muških pacijenata (18 do 65 godina starosti, uključujući) sa teškom hemofilijom A koji su prethodno lečeni (PTP). EOS = Kraj studije; ET = Rani prekid; PK = Farmakokinetika.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0026] Ovo obelodanjivanje se odnosi na himerni polipeptid za upotrebu u lečenju hemofilije A kod humanog subjekta kome je to potrebno. Himerni polipeptid obuhvata (i) faktora VIII (FVIII) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 207, i (ii) proteina Fon Vilebrandovog faktora (VWF) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 202, pri čemu se himerni polipeptid primenjuje intravenski u višestrukim dozama od 45 IU/kg do 55 IU/kg, a interval doziranja je najmanje 7 dana, pri čemu je FVIII protein povezan sa VWF proteinom kovalentnom vezom.

I. Definicije

[0027] Treba napomenuti da se termin „jedan“ ili „jedna“ odnosi na jedan ili više entiteta; na primer, „nukleotidna sekvenca“ podrazumeva jednu ili više nukleotidnih sekvenci. Kao takvi, termini „jedan“ (ili „jedna“), „jedan ili više“ i „najmanje jedan“ mogu se koristiti naizmenično ovde.

[0028] Nadalje, „i/ili“ gde se koristi ovde, treba shvatiti kao specifično obelodanjivanje svake od dve navedene karakteristike ili komponente sa ili bez druge. Tako, termin „i/ili“ kako se koristi u frazi kao što je „A i/ili B“ ovde, namenjen je da uključi „A i B“, „A ili B“, „A“ (samostalno) i „B“ (samostalno). Slično tome, termin „i/ili“ kako se koristi u frazi kao što je „A, B i/ili C“ namenjen je da obuhvati svaki od sledećih aspekata: A, B i C; A, B ili C; A ili C; A ili B; B ili C; A i C; A i B; B i C; A (samostalno); B (samostalno); i C (samostalno).

[0029] Podrazumeva se da gde god su aspekti ovde opisani jezikom „obuhvata“, inače analogne aspekte opisane terminima „sastoji se od“ i/ili „u suštini se sastoji od“ takođe su obezbeđeni.

[0030] Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini korišćeni ovde imaju isto značenje kao što je opšte razumljivo od strane stručnjaka iz oblasti na koju se ovo obelodanjivanje odnosi. Na primer, Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; i Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press, pružaju stručnjaku opšti rečnik mnogih termina korišćenih u ovom obelodanjivanju.

[0031] Jedinice, prefiksi i simboli su označeni u njihovom prihvaćenom obliku po Međunarodnom sistemu jedinica (SI). Numerički opsezi uključuju brojeve koji definišu opseg. Osim ako nije drugačije naznačeno, aminokiselinske sekvence se pišu s leva na desno u amino do karboksi orijentaciji. Naslovi koji su ovde dati nisu ograničenja različitih aspekata obelodanjivanja. U skladu s tim, termini definisani odmah ispod su potpunije definisani pozivanjem na celu specifikaciju.

[0032] Termin „oko“ se ovde koristi da znači približno, grubo, otprilike, ili u regionima. Kada se termin „oko“ koristi u vezi sa numeričkim opsegom, on modifikuje taj opseg proširujući granice iznad i ispod navedenih numeričkih vrednosti. Generalno, termin „oko“ može modifikovati numeričku vrednost iznad i ispod navedene vrednosti sa varijacijom od npr.10 procenata, gore ili dole (više ili niže).

[0033] Termin „polinukleotid“ ili „nukleotid“ obuhvata jednu nukleinsku kiselinu, kao i više nukleinskih kiselina, i odnosi se na izolovani molekul nukleinske kiseline ili konstrukt, npr. informacionu RNK (mRNK) ili plazmidnu DNK (pDNK). Polinukleotid može obuhvatati konvencionalnu fosfodiestarsku vezu ili nekonvencionalnu vezu (npr. amidnu vezu, kao što se nalazi u peptidnim nukleinskim kiselinama (PNA)). Termin „nukleinska kiselina“ odnosi se na bilo koji jedan ili više segmenata nukleinske kiseline, npr. DNK ili RNK fragmente prisutne u polinukleotidu. Pod „izolovanom“ nukleinskom kiselinom ili polinukleotidom podrazumeva se molekul nukleinske kiseline, DNK ili RNK, koji je uklonjen iz svog prirodnog okruženja. Na primer, rekombinantni polinukleotid koji kodira polipeptid faktora VIII sadržan u vektoru smatra se izolovanim za svrhe ovog obelodanjivanja. Dalji primeri izolovanog polinukleotida uključuju rekombinantne polinukleotide održavane u heterolognim ćelijama domaćinima ili prečišćene (delimično ili suštinski) od drugih polinukleotida u rastvoru. Izolovani molekuli RNK uključuju in vivo ili in vitro RNK transkripte polinukleotida ovog obelodanjivanja. Izolovani polinukleotidi ili nukleinske kiseline prema ovom obelodanjivanju dalje uključuju takve molekule proizvedene sintetički. Pored toga, polinukleotid ili nukleinska kiselina mogu uključivati regulatorne elemente kao što su promotori, pojačivači, mesta vezivanja ribozoma ili signali terminacije transkripcije.

[0034] Određeni proteini koje izlučuju ćelije sisara povezani su sa sekretornim signalnim peptidom koji se cepa od zrelog proteina kada se započne izvoz rastućeg proteinskog lanca preko grubog endoplazmatičnog retikuluma. Stručnjaci u ovoj oblasti znaju da se signalni peptidi generalno spajaju sa N-terminusom polipeptida i da se cepaju od kompletnog ili polipeptida „pune dužine“ kako bi se proizveo izlučeni ili „zreli“ oblik polipeptida. Opcionalno, može biti prisutan nativni signalni peptid ili funkcionalni derivat te sekvence koji zadržava sposobnost da usmerava sekreciju polipeptida koji je s njim operativno povezan. Alternativno, može se koristiti heterologni signalni peptid sisara, npr. ljudski tkivni aktivator plazminogena (TPA) ili mišji β-glukuronidazni signalni peptid, ili funkcionalni derivat istog.

[0035] Kako se ovde koristi, termin „polipeptid“ obuhvata jedan „polipeptid“ kao i više „polipeptida“, i odnosi se na molekul sastavljen od monomera (aminokiselina) linearno povezanih amidnim vezama (poznatim i kao peptidne veze). Termin polipeptid odnosi se na bilo koji lanac ili lance od dve ili više aminokiselina, i ne odnosi se na specifičnu dužinu proizvoda. Tako, peptidi, dipeptidi, tripeptidi, oligopeptidi, „protein“, „lanac aminokiselina“, ili bilo koji drugi termin koji se koristi za označavanje lanca ili lanaca od dve ili više aminokiselina, uključeni su u definiciju „polipeptida“, i termin „polipeptid“ se može koristiti umesto, ili naizmenično sa bilo kojim od ovih termina. Termin „polipeptid“ takođe se odnosi na proizvode post-ekspresionih modifikacija polipeptida, uključujući, bez ograničenja, glikozilaciju, acetilaciju, fosforilaciju, amidaciju, derivatizaciju poznatim zaštitnim/blokirajućim grupama, proteolitičko cepanje, ili modifikaciju neprirodnim aminokiselinama. Polipeptid može biti izveden iz prirodnog biološkog izvora ili proizveden rekombinantnom tehnologijom, ali nije nužno preveden iz označene sekvence nukleinske kiseline. Može se generisati na bilo koji način, uključujući hemijsku sintezu.

[0036] „Izolovani“ polipeptid ili fragment, varijanta, ili derivat istog odnosi se na polipeptid koji se ne nalazi u svom prirodnom okruženju. Nije potreban poseban nivo prečišćavanja. Na primer, izolovani polipeptid se može jednostavno ukloniti iz svog nativnog ili prirodnog okruženja. Rekombinantno proizvedeni polipeptidi i proteini izraženi u ćelijama domaćinima smatraju se izolovanim za svrhu obelodanjivanja, kao i nativni ili rekombinantni polipeptidi koji su razdvojeni, frakcionisani, ili delimično ili suštinski prečišćeni bilo kojom prikladnom tehnikom.

[0037] U ovo obelodanjivanje su uključeni i fragmenti ili varijante polipeptida, i bilo koja njihova kombinacija. Termin „fragment“ ili „varijanta“ kada se odnosi na polipeptidne vezujuće domene ili vezujuće molekule ovog obelodanjivanja uključuje sve polipeptide koji zadržavaju barem neka svojstva (npr. FcRn vezujući afinitet za FcRn vezujući domen ili Fc varijantu, koagulacionu aktivnost za FVIII varijantu, ili FVIII vezujuću aktivnost za VWF fragment) referentnog polipeptida. Fragmenti polipeptida uključuju proteolitičke fragmente, kao i delecione fragmente, pored specifičnih fragmenata antitela o kojima se govori drugde ovde, ali ne uključuju prirodno prisutan polipeptid pune dužine (ili zreli polipeptid). Varijante polipeptidnih vezujućih domena ili vezujućih molekula ovog obelodanjivanja uključuju fragmente kao što je gore opisano, i takođe polipeptide sa izmenjenim aminokiselinskim sekvencama zbog aminokiselinskih supstitucija, delecija, ili insercija. Varijante mogu biti prirodno ili neprirodno prisutne. Neprirodno prisutne varijante mogu se proizvesti korišćenjem u struci poznatih tehnika mutageneze. Varijantni polipeptidi mogu obuhvatati konzervativne ili nekonzervativne aminokiselinske supstitucije, delecije ili adicije.

[0038] Termin „VWF protein“ ili „VWF proteini“ korišćen ovde znači bilo koje VWF fragmente koji interaguju sa FVIII i zadržavaju bar jedno ili više svojstava koja se normalno obezbeđuju za FVIII od strane VWF pune dužine, npr. sprečavanje prevremene aktivacije u FVllla, sprečavanje prevremene proteolize, sprečavanje asocijacije sa fosfolipidnim membranama koje bi mogle dovesti do prevremenog klirensa, sprečavanje vezivanja za FVIII klirens receptore koji se mogu vezati za „goli“ FVIII ali ne i za FVIII vezan za VWF, i/ili stabilizovanje interakcija teškog i lakog lanca FVIII. VWF fragment koji se ovde pominje je VWF polipeptid koji je manji od VWF proteina pune dužine, pri čemu VWF fragment zadržava sposobnost interakcije i/ili vezivanja za FVIII.

[0039] „Konzervativna aminokiselinska supstitucija“ je ona u kojoj se aminokiselinski ostatak zamenjuje aminokiselinskim ostatkom koji ima sličan bočni lanac. Familija aminokiselinskih ostataka sa sličnim bočnim lancima su definisane u struci, uključujući bazične bočne lance (npr. lizin, arginin, histidin), kisele bočne lance (npr. asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), nepunjene polarne bočne lance (npr. glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein), nepolarne bočne lance (npr. alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), beta-razgranate bočne lance (npr. treonin, valin, izoleucin) i aromatične bočne lance (npr. tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Tako, ako se aminokiselina u polipeptidu zameni drugom aminokiselinom iz iste familije bočnih lanaca, supstitucija se smatra konzervativnom. Opcionalno, niz aminokiselina može se konzervativno zameniti strukturno sličnim nizom koji se razlikuje po redosledu i/ili sastavu članova familije bočnih lanaca.

[0040] Kao što je poznato u struci, „identitet sekvence“ između dva polipeptida se određuje poređenjem aminokiselinske sekvence jednog polipeptida sa sekvencom drugog polipeptida. Kada se diskutuje ovde, da li je bilo koji određeni polipeptid najmanje oko 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, ili 100% identičan drugom polipeptidu može se odrediti korišćenjem metoda i kompjuterskih programa/softvera poznatih u struci kao što su, ali ne ograničavajući se na, program BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, verzija 8 za Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). BESTFIT koristi algoritam lokalne homologije Smita i Vatermana, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981), da pronađe najbolji segment homologije između dve sekvence. Kada se koristi BESTFIT ili bilo koji drugi program za poravnavanje sekvenci da bi se odredilo da li je određena sekvenca, na primer, 95% identična referentnoj sekvenci prema ovom obelodanjivanju, parametri su, naravno, postavljeni tako da se procenat identiteta izračunava preko pune dužine referentne polipeptidne sekvence i da su dozvoljeni razmaci u homologiji do 5% od ukupnog broja aminokiselina u referentnoj sekvenci.

[0041] Kako se ovde koristi, „aminokiselina koja odgovara“ ili „ekvivalentna aminokiselina“ u VWF sekvenci ili FVIII proteinskoj sekvenci se identifikuje poravnavanjem radi maksimiziranja identiteta ili sličnosti između prve VWF ili FVIII sekvence i druge VWF ili FVIII sekvence. Broj koji se koristi za identifikaciju ekvivalentne aminokiseline u drugoj VWF ili FVIII sekvenci je zasnovan na broju koji se koristi za identifikaciju odgovarajuće aminokiseline u prvoj VWF ili FVIII sekvenci.

[0042] Kako se ovde koristi, termin „mesto insercije“ odnosi se na poziciju u FVIII polipeptidu, ili fragmentu, varijanti, ili derivatu istog, koja je neposredno nizvodno od pozicije na kojoj se može umetnuti komponenta koja produžava poluživot ili heterologna komponenta. „Mesto insercije“ je specificirano kao broj, pri čemu broj predstavlja broj aminokiseline u zrelom nativnom FVIII (SEQ ID NO: 65) kojoj mesto insercije odgovara, koja je neposredno C-terminalna u odnosu na poziciju insercije. Na primer, fraza „a3 obuhvata XTEN na mestu insercije koje odgovara aminokiselini 1656 iz SEQ ID NO: 65“ ukazuje da se heterologna komponenta nalazi između dve aminokiseline koje odgovaraju aminokiselini 1656 i aminokiselini 1657 iz SEQ ID NO: 65.

[0043] Fraza „neposredno nizvodno od aminokiseline“ kako se ovde koristi odnosi se na poziciju odmah pored terminalne karboksilne grupe aminokiseline. Na primer, mesto insercije neposredno nizvodno od aminokiseline 745 koja odgovara zrelom divljem tipu FVIII proteina znači da se mesto insercije nalazi između aminokiseline 745 i aminokiseline 746 koje odgovaraju zrelom divljem tipu FVIII proteina. Slično, fraza „neposredno uzvodno od aminokiseline“ odnosi se na poziciju odmah pored terminalne aminske grupe aminokiseline.

[0044] Fraza „između dve aminokiseline mesta insercije“ kako se ovde koristi odnosi se na poziciju u kojoj je XTEN ili bilo koji drugi polipeptid umetnut između dve susedne aminokiseline. Dakle, fraze „umetnut neposredno nizvodno od aminokiseline“ i „umetnut između dve aminokiseline mesta insercije“ se koriste sinonimno sa „umetnut na mesto insercije“.

[0045] Termini „umetnut,“ „je umetnut,“ „umetnut u“ ili gramatički srodni termini, kako se ovde koriste odnose se na poziciju XTEN u himernom polipeptidu u odnosu na analognu poziciju u nativnom zrelom humanom FVIII. Kako se ovde koriste, termini se odnose na karakteristike rekombinantnog FVIII polipeptida u odnosu na nativni zreli humani FVIII, i ne ukazuju, ne impliciraju ili izvode bilo koje metode ili procese kojima je himerni polipeptid napravljen. Na primer, u referenci na himerni polipeptid dat ovde, fraza „XTEN je umetnut neposredno nizvodno od ostatka 745 FVIII polipeptida“ znači da himerni polipeptid obuhvata XTEN neposredno nizvodno od aminokiseline koja odgovara aminokiselini 745 u nativnom zrelom humanom FVIII, npr. omeđen aminokiselinama koje odgovaraju aminokiselinama 745 i 746 nativnog zrelog humanog FVIII.

[0046] „Fuzioni“ ili „himerni“ protein obuhvata prvu aminokiselinsku sekvencu povezanu sa drugom aminokiselinskom sekvencom sa kojom nije prirodno povezan u prirodi. Aminokiselinske sekvence koje normalno postoje u zasebnim proteinima mogu se spojiti u fuzionom polipeptidu, ili aminokiselinske sekvence koje normalno postoje u istom proteinu mogu se postaviti u novi raspored u fuzionom polipeptidu, npr. fuzija domena faktora VIII ovog obelodanjivanja sa Ig Fc domenom. Fuzioni protein se stvara, na primer, hemijskom sintezom, ili kreiranjem i translacijom polinukleotida u kojem su peptidne regije kodirane u željenom odnosu. Himerni polipeptid može dalje obuhvatati drugu aminokiselinsku sekvencu povezanu sa prvom aminokiselinskom sekvencom kovalentnom, nepeptidnom vezom ili nekovalentnom vezom.

[0047] Termin „povezan“ kako se ovde koristi odnosi se na prvu aminokiselinsku sekvencu ili nukleotidnu sekvencu kovalentno ili nekovalentno spojenu sa drugom aminokiselinskom sekvencom ili nukleotidnom sekvencom, respektivno. Prva aminokiselinska ili nukleotidna sekvenca može biti direktno spojena ili jukstapozirana sa drugom aminokiselinskom ili nukleotidnom sekvencom ili alternativno, posredna sekvenca može kovalentno spojiti prvu sekvencu sa drugom sekvencom. Termin „povezan“ znači ne samo fuziju prve aminokiselinske sekvence sa drugom aminokiselinskom sekvencom na C-terminusu ili N-terminusu, već takođe uključuje umetanje cele prve aminokiselinske sekvence (ili druge aminokiselinske sekvence) unutar bilo koje dve aminokiseline u drugoj aminokiselinskoj sekvenci (ili prvoj aminokiselinskoj sekvenci, respektivno). Opcionalno, prva aminokiselinska sekvenca može biti povezana sa drugom aminokiselinskom sekvencom peptidnom vezom ili linkerom. Prva nukleotidna sekvenca može biti povezana sa drugom nukleotidnom sekvencom fosfodiestarskom vezom ili linkerom. Linker može biti peptid ili polipeptid (za polipeptidne lance) ili nukleotid ili nukleotidni lanac (za nukleotidne lance) ili bilo koja hemijska komponenta (za polipeptidne i polinukleotidne lance). Termin „povezan“ je takođe označen crticom (-).

[0048] Kako se ovde koristi, termin „povezan sa“ odnosi se na kovalentnu ili nekovalentnu vezu formiranu između prvog aminokiselinskog lanca i drugog aminokiselinskog lanca.

Opcionalno, termin „povezan sa“ znači kovalentnu, nepeptidnu vezu ili nekovalentnu vezu. Ova povezanost može biti označena dvotačkom, tj. (:). U drugim slučajevima, to znači kovalentnu vezu osim peptidne veze. Na primer, aminokiselina cistein obuhvata tiolnu grupu koja može formirati disulfidnu vezu ili most sa tiolnom grupom na drugom cisteinskom ostatku. U većini prirodno prisutnih IgG molekula, CH1 i CL regioni su povezani disulfidnom vezom i dva teška lanca su povezana sa dve disulfidne veze na pozicijama koje odgovaraju 239 i 242 koristeći Kabat numerički sistem (pozicija 226 ili 229, EU numerički sistem). Primeri kovalentnih veza uključuju, ali nisu ograničeni na, peptidnu vezu, metalnu vezu, vodoničnu vezu, disulfidnu vezu, sigma vezu, pi vezu, delta vezu, glikozidnu vezu, agnosticnu vezu, savijenu vezu, dipolnu vezu, Pi povratnu vezu, dvostruku vezu, trostruku vezu, četvorostruku vezu, petostruku vezu, šestostruku vezu, konjugaciju, hiperkonjugaciju, aromatičnost, haptičnost, ili antibonding. Neograničavajući primeri nekovalentne veze uključuju jonsku vezu (npr. katjon-pi vezu ili solnu vezu), metalnu vezu, vodoničnu vezu (npr. dihidrogen vezu, dihidrogen kompleks, vodoničnu vezu sa niskom barijerom, ili simetričnu vodoničnu vezu), van der Waals silu, Londonovu disperzionu silu, mehaničku vezu, halogensku vezu, aurofilnost, interkalaciju, slaganje, entropijsku silu ili hemijsku polarnost.

[0049] Kao što se ovde koristi, termin „mesto cepanja“ ili „mesto enzimskog cepanja“ odnosi se na mesto prepoznato od strane enzima. Određena mesta enzimskog cepanja obuhvataju mesto intracelularne obrade. Opciono, polipeptid ima mesto enzimskog cepanja koje cepa enzim aktiviran tokom kaskade zgrušavanja, tako da se cepanje takvih mesta dešava na mestu formiranja ugruška. Primeri takvih mesta uključuju, npr. ona prepoznata od trombina, faktora XIa ili faktora Xa. Primeri mesta cepanja FXIa uključuju, npr. TQSFNDFTR (SEQ ID NO: 1) i SVSQTSKLTR (SEQ ID NO: 3). Primeri mesta cepanja trombina uključuju, npr. DFLAEGGGVR (SEQ ID NO: 4), TTKIKPR (SEQ ID NO: 5), LVPRG (SEQ ID NO: 6) , ALRPR (SEQ ID NO: 7), ISDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 106), DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 88), i IEPRSFS (SEQ ID NO: 194). Druga mesta enzimskog cepanja su poznata u struci i opisana su na drugim mestima ovde.

[0050] Kao što se ovde koristi, termin „mesto obrade“ ili „mesto intracelularne obrade“ odnosi se na tip mesta enzimskog cepanja u polipeptidu koje je meta za enzime koji funkcionišu nakon translacije polipeptida. Opciono, takvi enzimi funkcionišu tokom transporta iz lumena Golgijevog aparata do trans-Golgijevog kompartmenta. Enzimi za intracelularnu obradu cepaju polipeptide pre sekrecije proteina iz ćelije. Primeri takvih mesta obrade uključuju, npr. ona koja su meta familije endopeptidaza PACE/furin (gde je PACE akronim za Paired Basic Amino Acid Cleaving Enzyme - enzim za cepanje uparenih baznih aminokiselina). Ovi enzimi su lokalizovani na Golgijevoj membrani i cepaju proteine na karboksi-terminalnoj strani sekvence motiva Arg-[bilo koji ostatak]-(Lys ili Arg)-Arg. Kao što se ovde koristi, familija enzima „furin“ uključuje, npr. PCSK1 (takođe poznat kao PC1/PC3), PCSK2 (takođe poznat kao PC2), PCSK3 (takođe poznat kao furin ili PACE), PCSK4 (takođe poznat kao PC4), PCSK5 (takođe poznat kao PC5 ili PC6), PCSK6 (takođe poznat kao PACE4) ili PCSK7 (takođe poznat kao PC7/LPC, PC8 ili SPC7). Druga mesta obrade su poznata u struci.

[0051] U konstruktima koji uključuju više od jednog mesta obrade ili cepanja, podrazumeva se da takva mesta mogu biti ista ili različita.

[0052] „Obradivi linker“, kao što se ovde koristi, odnosi se na linker koji sadrži najmanje jedno mesto intracelularne obrade, koja su opisana drugde ovde.

[0053] Kao što se ovde koristi, termin „poluživot“ se odnosi na biološki poluživot određenog polipeptida in vivo. Poluživot se može predstaviti kao vreme potrebno da se polovina unete količine kod subjekta eliminiše iz cirkulacije i/ili drugih tkiva kod životinje. Kada se konstruiše kriva klirensa datog polipeptida kao funkcija vremena, kriva je obično bifazna sa brzom αfazom i dužom β-fazom. α-faza tipično predstavlja uspostavljanje ravnoteže unetog Fc polipeptida između intra- i ekstravaskularnog prostora i, delimično, određena je veličinom polipeptida. β-faza tipično predstavlja katabolizam polipeptida u intravaskularnom prostoru. Opciono, FVIII i himerni polipeptidi koji sadrže FVIII su monofazni, i stoga nemaju alfa fazu, već samo jednu beta fazu. Stoga, u određenim slučajevima termin poluživot, kako se ovde koristi, odnosi se na poluživot polipeptida u β-fazi. Tipičan poluživot beta faze humanog antitela kod ljudi je 21 dan. Opciono, poluživot je izražen kao poluživot terminalne faze.

[0054] Hemostatski poremećaj, kao što se ovde koristi, znači genetski nasleđeno ili stečeno stanje koje karakteriše tendencija ka krvarenju, bilo spontano ili kao rezultat traume, zbog narušene sposobnosti ili nemogućnosti formiranja fibrinskog ugruška. Primeri takvih poremećaja uključuju hemofilije. Tri glavna oblika su hemofilija A (nedostatak faktora VIII), hemofilija B (nedostatak faktora IX ili „božićna bolest“) i hemofilija C (nedostatak faktora XI, blaga tendencija krvarenja). Drugi hemostatski poremećaji uključuju, npr. Fon Vilebrandovu bolest, nedostatak faktora XI (nedostatak PTA), nedostatak faktora XII, nedostatke ili strukturne abnormalnosti u fibrinogenu, protrombinu, faktoru V, faktoru VII, faktoru X ili faktoru XIII, Bernard-Soulierov sindrom, koji je defekt ili nedostatak u GPlb. GPlb, receptor za VWF, može biti defektan i dovesti do nedostatka primarnog formiranja ugruška (primarna hemostaza) i povećane tendencije krvarenja), i Glancmanova i Negelijeva trombastenija (Glancmanova trombastenija). Kod zatajenja jetre (akutni i hronični oblici), postoji nedovoljna proizvodnja faktora koagulacije od strane jetre; to može povećati rizik od krvarenja.

[0055] „Primena“ ili „primenenjivanje“, kako se ovde koristi, odnosi se na isporuku ovde opisanog sastava subjektu, npr. himernog polipeptida. Sastav, npr. himerni polipeptid, može se primeniti na subjektu metodama poznatim u struci. Konkretno, sastav se može primeniti intravenozno, subkutano, intramuskularno, intradermalno ili putem bilo koje mukozne površine, npr. oralno, sublingvalno, bukalno, nazalno, rektalno, vaginalno ili putem plućnog puta. Himerni polipeptid. Opciono, primena je samoprimena, ili roditelj primenjuje himerni polipeptid na detetu, ili se himerni polipeptid primenjuje na subjektu od strane zdravstvenog radnika kao što je lekar, medicinski tehničar ili medicinska sestra.

[0056] Kao što se ovde koristi, termin „doza“ se odnosi na jednokratnu primenu sastava na subjektu. Jedna doza se može primeniti odjednom, npr. kao bolus, ili tokom određenog vremenskog perioda, npr. putem intravenske infuzije. Termin „više doza“ znači više od jedne doze, npr. više od jedne primene.

[0057] Kada se odnosi na koadministraciju više od jednog sastava, doza sastava A može se primeniti istovremeno sa dozom sastava B. Alternativno, doza sastava A može se primeniti pre ili posle doze sastava B. Opciono, sastav A i sastav B se kombinuju u jednu formulaciju.

[0058] Kao što se ovde koristi, termin „interval“ ili „interval doziranja“ se odnosi na vreme koje protekne između prve doze sastava A i sledeće doze istog sastava primenjene na subjektu. Interval doziranja se može odnositi na vreme koje protekne između prve i druge doze, ili se interval doziranja može odnositi na vreme koje protekne između više doza.

[0059] Termin „učestalost doziranja“, kako se ovde koristi, odnosi se na broj doza primenjenih po specifičnom intervalu doziranja. Na primer, učestalost doziranja se može napisati kao jednom nedeljno, jednom svake dve nedelje, itd. Stoga, interval doziranja od 7 dana može se napisati i kao interval doziranja jednom u 7 dana ili jednom svake nedelje, ili jednom nedeljno.

[0060] Termin „profilaktički tretman“, kako se ovde koristi, se odnosi na primenu terapije za lečenje hemofilije, gde je takav tretman namenjen sprečavanju ili smanjenju ozbiljnosti jednog ili više simptoma hemofilije, npr. epizoda krvarenja, npr. jedne ili više spontanih epizoda krvarenja, i/ili oštećenja zglobova. Videti Jimenez-Yuste et al., Blood Transfus. 12(3):314-19 (2014). Da bi se sprečila ili smanjila ozbiljnost takvih simptoma, npr. epizoda krvarenja i progresija bolesti zglobova, pacijenti sa hemofilijom A mogu primati redovne infuzije faktora zgrušavanja kao deo profilaktičkog režima lečenja. Osnova takvog profilaktičkog tretmana je zapažanje da pacijenti sa hemofilijom sa nivoom faktora zgrušavanja, npr. FVIII, od 1% ili više retko doživljavaju spontane epizode krvarenja i imaju manje komorbiditeta povezanih sa hemofilijom u poređenju sa pacijentima sa teškom hemofilijom. Videti, npr. Coppola A. et al, Semin. Tromb. Hemost. 38(1): 79-94 (2012).. Zdravstveni radnici koji leče ove pacijente sa hemofilijom pretpostavili su da održavanje nivoa faktora na oko 1% redovnim infuzijama potencijalno može smanjiti rizik od simptoma hemofilije, uključujući epizode krvarenja i oštećenja zglobova. Videti id. Naknadna istraživanja su potvrdila ove koristi kod pedijatrijskih pacijenata sa hemofilijom koji primaju profilaktički tretman sa faktorom zgrušavanja, čineći profilaktički tretman ciljem za ljude sa teškom hemofilijom. Videti id.

[0061] „Profilaktički“ tretman se takođe može odnositi na preventivnu primenu sastava opisanog ovde, npr. himernog polipeptida, na subjektu kako bi se kontrolisala, upravljala, sprečila ili smanjila pojava ili ozbiljnost jednog ili više simptoma hemofilije A, npr. epizoda krvarenja. Profilaktički tretman sa faktorom zgrušavanja, npr. FVIII, je standard nege za subjekte sa teškom hemofilijom A. Videti, npr. Oldenburg, Blood 125:2038-44 (2015). Opciono, profilaktički tretman se odnosi na primenu sastava objavljenog ovde na subjektu kome je potreban kako bi se smanjila pojava jednog ili više simptoma hemofilije A. Profilaktički tretman može uključivati primenu više doza. Višestruke doze koje se koriste u profilaktičkom tretmanu obično se primenjuju u određenim intervalima doziranja. Opciono, godišnja stopa krvarenja može se smanjiti na manje od 10, manje od 9, manje od 8, manje od 7, manje od 6, manje od 5, manje od 4, manje od 3, manje od 2, ili manje od 1.

[0062] Termin „tretman po potrebi“ ili „epizodni tretman“ odnosi se na primenu himernog molekula „po potrebi“ kao odgovor na simptome hemofilije A, npr. epizodu krvarenja, ili pre aktivnosti koja može izazvati krvarenje. U jednom aspektu, tretman po potrebi se može dati subjektu kada krvarenje počne, kao što je nakon povrede, ili kada se krvarenje očekuje, kao što je pre operacije. U drugom aspektu, tretman po potrebi se može dati pre aktivnosti koje povećavaju rizik od krvarenja, kao što su kontaktni sportovi. Opciono, tretman po potrebi se daje kao pojedinačna doza, ili se tretman po potrebi daje kao prva doza, nakon čega sledi jedna ili više dodatnih doza. Kada se himerni polipeptid primenjuje po potrebi, jedna ili više dodatnih doza se mogu primeniti najmanje oko 12 sati, najmanje oko 24 sata, najmanje oko 36 sati, najmanje oko 48 sati, najmanje oko 60 sati, najmanje oko 72 sata, najmanje oko 84 sata, najmanje oko 96 sati, najmanje oko 108 sati, ili najmanje oko 120 sati nakon prve doze. Treba napomenuti, međutim, da interval doziranja povezan sa tretmanom po potrebi nije isti kao interval doziranja koji se koristi za profilaktički tretman.

[0063] U nekim otelotvorenjima, subjektu kome je potreban opšti hemostatski agens se podvrgava, ili će se podvrgnuti operaciji. Himerni polipeptid iz obelodanjivanja može se primeniti pre ili posle operacije. Himerni polipeptid iz obelodanjivanja se takođe može primeniti tokom ili posle operacije za kontrolu akutne epizode krvarenja. Kada se himerni polipeptid primenjuje pre operacije, primena može biti najmanje oko 1 sat, najmanje oko 2 sata, najmanje oko 4 sata, najmanje oko 8 sati, najmanje oko 12 sati, najmanje oko 24 sata, najmanje oko 36 sati, najmanje oko 48 sati, ili najmanje oko 72 sata pre operacije. Kada se himerni polipeptid primenjuje nakon operacije, primena može biti najmanje oko 1 sat, najmanje oko 2 sata, najmanje oko 4 sata, najmanje oko 8 sati, najmanje oko 12 sati, najmanje oko 24 sata, najmanje oko 36 sati, najmanje oko 48 sati, ili najmanje oko 72 sata nakon operacije. Operacija može uključivati, ali nije ograničena na, transplantaciju jetre, resekciju jetre, stomatološke procedure ili transplantaciju matičnih ćelija.

[0064] Kao što se ovde koristi, termin „akutno krvarenje“ odnosi se na epizodu krvarenja bez obzira na osnovni uzrok. Na primer, subjekt može imati traumu, uremiju, nasledni poremećaj krvarenja (npr. nedostatak faktora VII), poremećaj trombocita, ili rezistenciju zbog razvoja antitela na faktore zgrušavanja.

[0065] „Lečiti“, „tretman“, „lečenje“, kao što se ovde koristi, odnosi se na, npr. smanjenje ozbiljnosti bolesti ili stanja; smanjenje trajanja toka bolesti; ublažavanje jednog ili više simptoma povezanih sa bolešću ili stanjem; pružanje korisnih efekata subjektu sa bolešću ili stanjem, bez nužnog izlečenja bolesti ili stanja, ili profilaksu jednog ili više simptoma povezanih sa bolešću ili stanjem. U nekim otelotvorenjima, termin „lečenje“ ili „tretman“ znači održavanje najnižeg nivoa FVIII od najmanje oko 1 IU/dL, 2 IU/dL, 3 IU/dL, 4 IU/dL, 5 IU/dL, 6 IU/dL, 7 IU/dL, 8 IU/dL, 9 IU/dL, 10 IU/dL, 11 IU/dL, 12 IU/dL, 13 IU/dL, 14 IU/dL, 15 IU/dL, 16 IU/dL, 17 IU/dL, 18 IU/dL, 19 IU/dL, ili 20 IU/dL kod subjekta primenom himernog polipeptida ili VWF fragmenta iz obelodanjivanja. Kao što se ovde koristi, „najniži nivo“ kod pacijenta sa hemofilijom je merenje najniže koncentracije postignute terapijom faktora, npr. terapijom FVIII, pre primene sledeće doze. U drugim otelotvorenjima, lečenje ili tretman znači održavanje najnižeg nivoa FVIII od najmanje oko 1 IU/dL između intervala doziranja. U drugim otelotvorenjima, lečenje ili tretman znači održavanje najnižeg nivoa FVIII od najmanje oko 3 IU/dL između intervala doziranja. U drugim otelotvorenjima, lečenje ili tretman znači održavanje najnižeg nivoa FVIII od najmanje oko 5 IU/dL između intervala doziranja. U drugim otelotvorenjima, lečenje ili tretman znači održavanje najnižeg nivoa FVIII između oko 1 i oko 20 IU/dL, oko 2 i oko 20 IU/dL, oko 3 i oko 20 IU/dL, oko 4 i oko 20 IU/dL, oko 5 i oko 20 IU/dL, oko 6 i oko 20 IU/dL, oko 7 i oko 20 IU/dL, oko 8 i oko 20 IU/dL, oko 9 i oko 20 IU/dL, ili oko 10 i oko 20 IU/dL tokom intervala doziranja.

[0066] „Lečenje“ ili „tretman“ bolesti ili stanja takođe može uključivati održavanje aktivnosti FVIII kod subjekta na nivou uporedivom sa najmanje oko 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, ili 20% aktivnosti FVIII kod nehemofiličnog subjekta između intervala doziranja. U drugim otelotvorenjima, lečenje ili tretman znači održavanje nivoa aktivnosti FVIII od najmanje oko 1% između intervala doziranja. U drugim otelotvorenjima, lečenje ili tretman znači održavanje nivoa aktivnosti FVIII od najmanje oko 2% između intervala doziranja. U drugim otelotvorenjima, lečenje ili tretman znači održavanje nivoa aktivnosti FVIII od najmanje oko 3% između intervala doziranja. U drugim otelotvorenjima, lečenje ili tretman znači održavanje nivoa aktivnosti FVIII od najmanje oko 4% između intervala doziranja. U drugim otelotvorenjima, lečenje ili tretman znači održavanje nivoa aktivnosti FVIII od najmanje oko 5% između intervala doziranja. U drugim otelotvorenjima, lečenje ili tretman znači održavanje nivoa aktivnosti FVIII od najmanje oko 6% između intervala doziranja. U drugim otelotvorenjima, lečenje ili tretman znači održavanje nivoa aktivnosti FVIII od najmanje oko 7% između intervala doziranja. U drugim otelotvorenjima, lečenje ili tretman znači održavanje nivoa aktivnosti FVIII od najmanje oko 8% između intervala doziranja. U drugim otelotvorenjima, lečenje ili tretman znači održavanje nivoa aktivnosti FVIII od najmanje oko 9% između intervala doziranja. U drugim otelotvorenjima, lečenje ili tretman znači održavanje nivoa aktivnosti FVIII od najmanje oko 10% između intervala doziranja. Minimalni najniži nivo potreban za lečenje može se meriti jednom ili više poznatih metoda (na primer, aPTT testovima ili hromogenim testovima opisanim ovde) i može se prilagoditi (povećati ili smanjiti) za svaku osobu.

II. Upotreba himernog polipeptida

[0067] Određeni aspekti ovog pronalaska usmereni su na himerni polipeptid, definisan ovde, za upotrebu u lečenju hemofilije A kod subjekta kome je to potrebno, što obuhvata primenu himernog polipeptida na subjektu u određenim intervalima doziranja. Na primer, himerni polipeptid se primenjuje na subjektu u višestrukim dozama.

[0068] U nekim otelotvorenjima, višestruke doze obuhvataju najmanje dve doze, najmanje tri doze, najmanje četiri doze, najmanje pet doza, najmanje šest doza, najmanje sedam doza, najmanje osam doza, najmanje devet doza, najmanje deset doza, najmanje jedanaest doza, najmanje dvanaest doza, najmanje trinaest doza, najmanje četrnaest doza, najmanje petnaest doza, najmanje šesnaest doza, najmanje sedamnaest doza, najmanje osamnaest doza, najmanje devetnaest doza, najmanje dvadeset doza ili više. U nekim otelotvorenjima, višestruke doze se primenjuju tokom najmanje oko 1 mesec, najmanje oko 2 meseca, najmanje oko 3 meseca, najmanje oko 4 meseca, najmanje oko 5 meseci, najmanje oko 6 meseci, najmanje oko 12 meseci, najmanje oko 18 meseci, najmanje oko 2 godine, najmanje oko 3 godine, najmanje oko 4 godine, najmanje oko 5 godina, najmanje oko 10 godina, najmanje oko 15 godina, najmanje oko 20 godina, ili najmanje oko 25 godina.

[0069] U nekim otelotvorenjima, lečenje hemofilije A obuhvata sprečavanje epizode krvarenja kod humanog subjekta kome je to potrebno. U nekim otelotvorenjima, lečenje hemofilije A obuhvata lečenje epizode krvarenja kod humanog subjekta kome je to potrebno. U nekim otelotvorenjima, lečenje hemofilije A obuhvata kontrolisanje učestalosti ili frekvencije epizode krvarenja kod humanog subjekta kome je to potrebno. U nekim otelotvorenjima, lečenje hemofilije A obuhvata smanjenje učestalosti ili frekvencije epizode krvarenja kod humanog subjekta kome je to potrebno.

A. Doze

[0070] U nekim otelotvorenjima, količine svake od višestrukih doza su iste. U drugim otelotvorenjima, jedna ili više višestrukih doza se razlikuju od jedne ili više drugih višestrukih doza.

[0071] U nekim otelotvorenjima, najmanje jedna od višestrukih doza himernog polipeptida je od oko 50 IU/kg do oko 55 IU/kg.

[0072] U nekim otelotvorenjima, najmanje jedna od višestrukih doza je oko 45 IU/kg, oko 50 IU/kg, oko 55 IU/kg. U određenim otelotvorenjima, najmanje jedna od višestrukih doza je oko 45 IU/kg. U određenim otelotvorenjima, najmanje jedna od višestrukih doza je oko 50 IU/kg. U određenim otelotvorenjima, najmanje jedna od višestrukih doza je oko 55 IU/kg.

[0073] U nekim otelotvorenjima, himerni polipeptid se primenjuje profilaktički u dozi od 50 IU/kg jednom nedeljno.

[0074] U nekim otelotvorenjima, himerni polipeptid se primenjuje po potrebi U određenim otelotvorenjima, himerni polipeptid se primenjuje po potrebi kao višestruke doze od oko 45 IU/kg, oko 50 IU/kg, ili oko 55 IU/kg.

[0075] U nekim otelotvorenjima, primena himernog polipeptida prema ovim metodama ne indukuje FVIII inhibitor nakon oko 7 dana, oko 10 dana, oko 11 dana, oko 12 dana, oko 13 dana, oko 14 dana, oko 15 dana, oko 20 dana, oko 24 dana, oko 25 dana, oko 28 dana, oko 30 dana, ili oko 35 dana od primene. U nekim otelotvorenjima, primena himernog polipeptida ne indukuje FVIII inhibitor nakon oko 28 dana od primene.

B. Interval doziranja

[0076] Himerni polipeptid se primenjuje kao višestruke doze u intervalima doziranja od najmanje 7 dana, najmanje oko 8 dana, najmanje oko 9 dana, najmanje oko 10 dana, najmanje oko 11 dana, najmanje oko 12 dana, najmanje oko 13 dana, najmanje oko 14 dana, najmanje oko 15 dana, najmanje oko 16 dana, najmanje oko 17 dana, najmanje oko 18 dana, najmanje oko 19 dana, najmanje oko 20 dana, najmanje oko 21 dan, najmanje oko 22 dana, najmanje oko 23 dana, najmanje oko 24 dana, najmanje oko 25 dana, najmanje oko 26 dana, najmanje oko 27 dana, najmanje oko 28 dana, najmanje oko 29 dana, najmanje oko 30 dana, ili najmanje oko 31 dan.

[0077] U određenim otelotvorenjima, interval doziranja, npr. za profilaktički tretman hemofilije A, iznosi najmanje oko 8 dana. U određenim otelotvorenjima, interval doziranja, npr. za profilaktički tretman hemofilije A, iznosi najmanje oko 9 dana. U određenim otelotvorenjima, interval doziranja je najmanje oko 10 dana. U određenim otelotvorenjima, interval doziranja, npr. za profilaktički tretman hemofilije A, iznosi najmanje oko 11 dana. U određenim otelotvorenjima, interval doziranja, npr. za profilaktički tretman hemofilije A, iznosi najmanje oko 12 dana. U određenim otelotvorenjima, interval doziranja, npr. za profilaktički tretman hemofilije A, iznosi najmanje oko 13 dana. U određenim otelotvorenjima, interval doziranja, npr. za profilaktički tretman hemofilije A, iznosi najmanje oko 14 dana. U određenim otelotvorenjima, interval doziranja, npr. za profilaktički tretman hemofilije A, iznosi najmanje oko 21 dan. U određenim otelotvorenjima, interval doziranja, npr. za profilaktički tretman hemofilije A, iznosi najmanje oko 27 dana. U određenim otelotvorenjima, interval doziranja, npr. za profilaktički tretman hemofilije A, iznosi najmanje oko 30 dana.

[0078] Učestalost doziranja, npr. za profilaktički tretman hemofilije A, je jednom nedeljno, najmanje jednom svake 2 nedelje, najmanje jednom svake 3 nedelje, najmanje jednom svake 4 nedelje, najmanje jednom svake 5 nedelja, ili najmanje jednom svake 6 nedelja. U određenim otelotvorenjima, interval doziranja, npr. za profilaktički tretman hemofilije A, je jednom nedeljno. U određenim otelotvorenjima, interval doziranja, npr. za profilaktički tretman hemofilije A, je najmanje 2 nedelje. U određenim otelotvorenjima, interval doziranja, npr. za profilaktički tretman hemofilije A, je najmanje 3 nedelje. U određenim otelotvorenjima, interval doziranja, npr. za profilaktički tretman hemofilije A, je najmanje 4 nedelje.

[0079] U nekim otelotvorenjima, učestalost doziranja, npr. za profilaktički tretman hemofilije A, je oko 2 puta svaka tri meseca, oko 1 put mesečno, oko 2 puta mesečno, oko 3 puta mesečno, ili oko 4 puta mesečno. U određenim otelotvorenjima, učestalost doziranja je oko 2 puta mesečno. U određenim otelotvorenjima, učestalost doziranja je oko 3 puta mesečno. U određenim otelotvorenjima, učestalost doziranja je oko 4 puta mesečno.

[0080] U nekim otelotvorenjima, interval doziranja, npr. za profilaktički tretman hemofilije A, je najmanje oko 7 do 9 dana. U nekim otelotvorenjima, interval doziranja, npr. za profilaktički tretman hemofilije A, je najmanje oko 7 do 10 dana. U nekim otelotvorenjima, interval doziranja, npr. za profilaktički tretman hemofilije A, je najmanje oko 7 do 11 dana. U nekim otelotvorenjima, interval doziranja, npr. za profilaktički tretman hemofilije A, je najmanje oko 7 do 12 dana. U nekim otelotvorenjima, interval doziranja, npr. za profilaktički tretman hemofilije A, je najmanje oko 7 do 13 dana. U nekim otelotvorenjima, interval doziranja, npr. za profilaktički tretman hemofilije A, je najmanje oko 7 do 14 dana. U nekim otelotvorenjima, interval doziranja, npr. za profilaktički tretman hemofilije A, je najmanje oko 8 do 14 dana. U nekim otelotvorenjima, interval doziranja, npr. za profilaktički tretman hemofilije A, je najmanje oko 9 do 14 dana. U nekim otelotvorenjima, interval doziranja, npr. za profilaktički tretman hemofilije A, je najmanje oko 10 do 14 dana. U nekim otelotvorenjima, interval doziranja, npr. za profilaktički tretman hemofilije A, je najmanje oko 11 do 14 dana. U nekim otelotvorenjima, interval doziranja, npr. za profilaktički tretman hemofilije A, je najmanje oko 10 do 21 dan. U nekim otelotvorenjima, interval doziranja, npr. za profilaktički tretman hemofilije A, je najmanje oko 12 do 14 dana. U nekim otelotvorenjima, interval doziranja, npr. za profilaktički tretman hemofilije A, je najmanje oko 12 do 15 dana. U nekim otelotvorenjima, interval doziranja, npr. za profilaktički tretman hemofilije A, je najmanje oko 13 do 15 dana. U nekim otelotvorenjima, interval doziranja, npr. za profilaktički tretman hemofilije A, je najmanje oko 14 do 21 dan.

[0081] Primeri doza i učestalosti doziranja, uključujući one obuhvaćene ovim pronalaskom, opisani su u tabeli 1.

Tabela 1A: Količine doziranja i odgovarajuća učestalost doziranja, npr. za profilaktički tretman hemofilije.

Tabela 1B: Količine doziranja i odgovarajući intervali doziranja, npr. za profilaktički tretman hemofilije.

[0082] U nekim otelotvorenjima, kao što je za profilaktički tretman hemofilije A, najmanje jedna od višestrukih doza se primenjuje u dozi od oko 50 IU/kg sa intervalom doziranja od najmanje 7 do 9 dana. U nekim otelotvorenjima, najmanje jedna od višestrukih doza se primenjuje u dozi od oko 50 IU/kg sa intervalom doziranja od najmanje 7 do 10 dana. U nekim otelotvorenjima, najmanje jedna od višestrukih doza se primenjuje u dozi od oko 50 IU/kg sa intervalom doziranja od najmanje 7 do 11 dana. U nekim otelotvorenjima, najmanje jedna od višestrukih doza se primenjuje u dozi od oko 50 IU/kg sa intervalom doziranja od najmanje 7 do 12 dana. U nekim otelotvorenjima, najmanje jedna od višestrukih doza se primenjuje u dozi od oko 50 IU/kg sa intervalom doziranja od najmanje 7 do 13 dana. U nekim otelotvorenjima, najmanje jedna od višestrukih doza se primenjuje u dozi od oko 50 IU/kg sa intervalom doziranja od najmanje 7 do 14 dana. U nekim otelotvorenjima, najmanje jedna od višestrukih doza se primenjuje u dozi od oko 50 IU/kg sa intervalom doziranja od najmanje oko 8 do 14 dana. U nekim otelotvorenjima, najmanje jedna od višestrukih doza se primenjuje u dozi od oko 50 IU/kg sa intervalom doziranja od najmanje oko 9 do 14 dana. U nekim otelotvorenjima, najmanje jedna od višestrukih doza se primenjuje u dozi od oko 50 IU/kg sa intervalom doziranja od najmanje oko 10 do 14 dana. U nekim otelotvorenjima, najmanje jedna od višestrukih doza se primenjuje u dozi od oko 50 IU/kg sa intervalom doziranja od najmanje oko 10 do 21 dan. U nekim otelotvorenjima, najmanje jedna od višestrukih doza se primenjuje u dozi od oko 50 IU/kg sa intervalom doziranja od najmanje oko 11 do 14 dana. U nekim otelotvorenjima, najmanje jedna od višestrukih doza se primenjuje u dozi od oko 50 IU/kg sa intervalom doziranja od najmanje oko 12 do 14 dana. U nekim otelotvorenjima, najmanje jedna od višestrukih doza se primenjuje u dozi od oko 50 IU/kg sa intervalom doziranja od najmanje oko 12 do 15 dana. U nekim otelotvorenjima, najmanje jedna od višestrukih doza se primenjuje u dozi od oko 50 IU/kg sa intervalom doziranja od najmanje oko 13 do 15 dana. U nekim otelotvorenjima, najmanje jedna od višestrukih doza se primenjuje u dozi od oko 50 IU/kg sa intervalom doziranja od najmanje oko 14 do 21 dan.

[0083] U određenim otelotvorenjima, najmanje jedna od višestrukih doza je oko 50 IU/kg, a interval doziranja je najmanje 7 dana. U određenim otelotvorenjima, najmanje jedna od višestrukih doza je oko 50 IU/kg, a interval doziranja je najmanje oko 8 dana. U određenim otelotvorenjima, najmanje jedna od višestrukih doza je oko 50 IU/kg, a interval doziranja je najmanje oko 9 dana. U određenim otelotvorenjima, najmanje jedna od višestrukih doza je oko 50 IU/kg, a interval doziranja je najmanje oko 10 dana. U određenim otelotvorenjima, najmanje jedna od višestrukih doza je oko 50 IU/kg, a interval doziranja je najmanje oko 11 dana. U određenim otelotvorenjima, najmanje jedna od višestrukih doza je oko 50 IU/kg, a interval doziranja je najmanje oko 12 dana. U određenim otelotvorenjima, najmanje jedna od višestrukih doza je oko 50 IU/kg, a interval doziranja je najmanje oko 13 dana. U određenim otelotvorenjima, najmanje jedna od višestrukih doza je oko 50 IU/kg, a interval doziranja je najmanje oko 14 dana. U određenim otelotvorenjima, najmanje jedna od višestrukih doza je oko 50 IU/kg, a interval doziranja je najmanje oko 15 dana. U određenim otelotvorenjima, najmanje jedna od višestrukih doza je oko 50 IU/kg, a interval doziranja je najmanje oko 16 dana. U određenim otelotvorenjima, najmanje jedna od višestrukih doza je oko 50 IU/kg, a interval doziranja je najmanje oko 17 dana. U određenim otelotvorenjima, najmanje jedna od višestrukih doza je oko 50 IU/kg, a interval doziranja je najmanje oko 18 dana. U određenim otelotvorenjima, najmanje jedna od višestrukih doza je oko 50 IU/kg, a interval doziranja je najmanje oko 19 dana. U određenim otelotvorenjima, najmanje jedna od višestrukih doza je oko 50 IU/kg, a interval doziranja je najmanje oko 20 dana. U određenim otelotvorenjima, najmanje jedna od višestrukih doza je oko 50 IU/kg, a interval doziranja je najmanje oko 21 dan.

[0084] U nekim otelotvorenjima, himerni polipeptid se primenjuje za profilaktički tretman hemofilije A. Profilaktički tretman hemofilije A uključuje ublažavanje ili smanjenje ozbiljnosti simptoma hemofilije A na kontinuiranoj ili skoro kontinuiranoj osnovi. U nekim otelotvorenjima, profilaktički tretman se primenjuje pre pojave simptoma hemofilije A, npr. pre incidenta krvarenja. U drugim otelotvorenjima, profilaktički tretman se primenjuje redovno, npr. u ovde opisanom intervalu doziranja, kako bi se sprečila pojava ili smanjila ozbiljnost simptoma pre njihovog nastanka. Bilo koji ovde obelodanjen interval doziranja može se koristiti u profilaktičkom tretmanu hemofilije A.

[0085] U drugim otelotvorenjima, himerni polipeptid se primenjuje pre aktivnosti koja može izazvati jedan ili više simptoma hemofilije A, npr. kao tretman po potrebi. Na primer, himerni polipeptid iz ovog obelodanjivanja može se primeniti na subjektu koji pati od hemofilije A pre nego što se subjekt podvrgne operaciji ili se uključi u aktivnost koja inače povećava rizik od fizičke traume i/ili incidenta krvarenja.

[0086] U nekim otelotvorenjima, subjekt je prethodno lečen jednom ili više terapija zamene FVIII. U određenim otelotvorenjima, subjekt nije reagovao na prethodnu terapiju zamene FVIII. U određenim otelotvorenjima, terapija zamene FVIII je ELOCATE<®>ili ADVATE<®>. U nekim otelotvorenjima, subjekt je odrasla osoba. U nekim otelotvorenjima, subjekt je odrasli muškarac. U drugim otelotvorenjima, subjekt je odrasla žena. U drugim otelotvorenjima, subjekt je dete, npr. starosti manje od ili jednako oko 12 godina, manje od ili jednako oko 11 godina, manje od ili jednako oko 10 godina, manje od ili jednako oko 9 godina, manje od ili jednako oko 8 godina, manje od ili jednako oko 7 godina, manje od ili jednako oko 6 godina, manje od ili jednako oko 5 godina, manje od ili jednako oko 4 godine, manje od ili jednako oko 3 godine, manje od ili jednako oko 2 godine, ili manje od ili jednako oko 1 godine). U nekim otelotvorenjima, subjekt je ženskog pola. U nekim otelotvorenjima, subjekt je muškog pola. U nekim otelotvorenjima, subjekt je ženskog pola starosti manje od ili jednako oko 12 godina. U nekim otelotvorenjima, subjekt je ženskog pola starosti manje od ili jednako oko 11 godina. U nekim otelotvorenjima, subjekt je ženskog pola starosti manje od ili jednako oko 10 godina.

[0087] Himerni polipeptid opisan ovde može se primeniti bilo kojim putem poznatim u struci korišćenjem intravenske injekcije.

[0088] U nekim otelotvorenjima, himerni polipeptid nakon primene rezultira nivoom aktivnosti FVIII u plazmi od najmanje oko 1%, najmanje oko 2%, najmanje oko 3%, najmanje oko 4%, najmanje oko 5%, najmanje oko 6%, najmanje oko 7%, najmanje oko 8%, najmanje oko 9%, ili najmanje oko 10%. U određenim otelotvorenjima, nivo aktivnosti FVIII u plazmi je najmanje oko 3%. U nekim otelotvorenjima, nivo aktivnosti FVIII u plazmi je najmanje oko 4%. U nekim otelotvorenjima, nivo aktivnosti FVIII u plazmi je najmanje oko 5%. U nekim otelotvorenjima, nivo aktivnosti FVIII u plazmi je najmanje oko 4%. U nekim otelotvorenjima, nivo aktivnosti FVIII u plazmi je najmanje oko 5%. U nekim otelotvorenjima, nivo aktivnosti FVIII u plazmi je najmanje oko 5,6%. U nekim otelotvorenjima, nivo aktivnosti FVIII u plazmi je najmanje oko 7%. U nekim otelotvorenjima, nivo aktivnosti FVIII u plazmi je najmanje oko 10%. U nekim otelotvorenjima, nivo aktivnosti FVIII u plazmi je najmanje oko 12%. U nekim otelotvorenjima, nivo aktivnosti FVIII u plazmi je najmanje oko 12,95%. Kao što se ovde koristi, nivo aktivnosti u plazmi izražen je kao procenat (%). Alternativno, aktivnost u plazmi se može izraziti u jedinicama IU/dL, pri čemu je 1% jednako 1 IU/dL.

[0089] U nekim otelotvorenjima, nivo aktivnosti FVIII u plazmi je najmanje oko 10% najmanje oko 5 dana nakon primene himernog polipeptida, npr. u dozi od 25 IU/kg. U nekim otelotvorenjima, nivo aktivnosti FVIII u plazmi je najmanje oko 12% najmanje oko 5 dana nakon primene himernog polipeptida, npr. u dozi od 25 IU/kg. U nekim otelotvorenjima, nivo aktivnosti FVIII u plazmi je najmanje oko 12,95% najmanje oko 5 dana nakon primene himernog polipeptida, npr. u dozi od 25 IU/kg. U nekim otelotvorenjima, nivo aktivnosti FVIII u plazmi je najmanje oko 5% najmanje oko 7 dana nakon primene himernog polipeptida, npr. u dozi od 25 IU/kg. U nekim otelotvorenjima, nivo aktivnosti FVIII u plazmi je najmanje oko 5,6% najmanje oko 7 dana nakon primene himernog polipeptida, npr. u dozi od 25 IU/kg. U nekim otelotvorenjima, nivo aktivnosti FVIII u plazmi je najmanje oko 3% najmanje oko 8 dana nakon primene himernog polipeptida, npr. u dozi od 25 IU/kg. U nekim otelotvorenjima, nivo aktivnosti FVIII u plazmi je najmanje oko 1% najmanje oko 10 dana nakon primene himernog polipeptida, npr. u dozi od 25 IU/kg.

C. Indukcija imune tolerancije

[0090] Određeni aspekti ovog obelodanjivanja usmereni su na indukciju imune tolerancije na FVIII kod subjekta. Na primer, himerni polipeptid opciono smanjuje inhibitorni odgovor na FVIII kod subjekta ili ne indukuje imuni odgovor na himerni polipeptid nakon primene. Drugi aspekt ovog obelodanjivanja usmeren je na indukciju imune tolerancije kod ljudi sa hemofilijom, pri čemu efektivna količina himernog polipeptida indukuje imunsku toleranciju kod ljudi. Različite metode indukcije imune tolerancije korišćenjem himernih polipeptida koji sadrže FVIII i Fc domen obelodanjene su u međunarodnoj publikaciji br. WO 2018/102760 A1.

[0091] Nakon indukcije imune tolerancije, režim postepenog smanjivanja doze sastava ili himernog polipeptida može se opciono primeniti na ljude. U određenim otelotvorenjima, indukcija imune tolerancije nastaje kada je titar inhibitornih antitela kod ljudi manji od oko 0,6 BU. U određenim otelotvorenjima, indukcija imune tolerancije nastaje kada je titar inhibitornih antitela kod ljudi manji od oko 0,6 BU i 60% oporavka aktivnosti faktora zgrušavanja, kako se prati u plazmi. Nakon režima postepenog smanjivanja doze, profilaktička doza himernog polipeptida opisanog ovde može se primeniti na ljude.

[0092] U određenim aspektima, ljudi nisu bili lečeni prethodnom imuno-tolerancijskom terapijom protiv faktora zgrušavanja, npr. protiv FVIII. Himerni polipeptid, npr. rFVIIIFc-VWF-XTEN, može se primeniti na ljude u bilo kom trenutku kada je utvrđeno da je došlo do razvoja inhibitornog imunog odgovora, npr. nakon merenja nivoa inhibitornog imunog odgovora kod ljudi. U drugim otelotvorenjima, himerni polipeptid se može primeniti na ljude koji još uvek nisu razvili jedan ili više inhibitornih imunih odgovora kako bi se sprečio razvoj inhibitornog imunog odgovora. U nekim otelotvorenjima, himerni polipeptid se primenjuje na ljude koji imaju veliku verovatnoću (npr. porodična istorija, genetska predispozicija, ili prisustvo biomarkera) za razvoj inhibitornog imunog odgovora. U nekim otelotvorenjima, metoda dalje obuhvata merenje nivoa inhibitornog imunog odgovora ili verovatnoće razvoja inhibitornog imunog odgovora pre primene.

[0093] U nekim otelotvorenjima, himerni polipeptid se primenjuje na ljude manje od oko 1 dan, manje od oko 2 dana, manje od oko 3 dana, manje od oko 4 dana, manje od oko 5 dana, manje od oko 6 dana, manje od oko 7 dana, manje od oko 2 nedelje, manje od oko 3 nedelje, manje od oko 4 nedelje, manje od oko 2 meseca, manje od oko 3 meseca, manje od oko 4 meseca, manje od oko 5 meseci, manje od oko 6 meseci, manje od oko 1 godine, manje od oko 2 godine, manje od oko 3 godine, manje od oko 4 godine, ili manje od oko 5 godina nakon što je utvrđeno da je došlo do razvoja inhibitornog imunog odgovora ili da postoji verovatnoća razvoja inhibitornog imunog odgovora, npr. nakon merenja nivoa inhibitornog imunog odgovora ili verovatnoće razvoja inhibitornog imunog odgovora kod ljudi. U određenim otelotvorenjima, himerni polipeptid se primenjuje na ljude odmah nakon što je utvrđeno da je došlo do razvoja inhibitornog imunog odgovora ili da postoji verovatnoća razvoja inhibitornog imunog odgovora, npr. nakon merenja nivoa inhibitornog imunog odgovora ili verovatnoće razvoja inhibitornog imunog odgovora kod ljudi. U posebnim otelotvorenjima, himerni polipeptid se primenjuje na ljude manje od oko 5 minuta, manje od oko 10 minuta, manje od oko 15 minuta, manje od oko 20 minuta, manje od oko 30 minuta, manje od oko 45 minuta, manje od oko 1 sata, manje od oko 2 sata, manje od oko 3 sata, manje od oko 4 sata, manje od oko 5 sati, manje od oko 6 sati, manje od oko 7 sati, manje od oko 8 sati, manje od oko 9 sati, manje od oko 10 sati, manje od oko 11 sati, manje od oko 12 sati, oko 18 sati, ili manje od oko 24 sata nakon što je utvrđeno da je došlo do razvoja inhibitornog imunog odgovora ili da postoji verovatnoća razvoja inhibitornog imunog odgovora, npr. nakon merenja nivoa inhibitornog imunog odgovora ili verovatnoće razvoja inhibitornog imunog odgovora kod ljudi. U posebnim otelotvorenjima, himerni polipeptid se primenjuje na ljude oko 5 minuta, oko 10 minuta, oko 15 minuta, oko 20 minuta, oko 30 minuta, oko 45 minuta, oko 1 sat, oko 2 sata, oko 3 sata, oko 4 sata, oko 5 sati, oko 6 sati, oko 7 sati, oko 8 sati, oko 9 sati, oko 10 sati, oko 11 sati, oko 12 sati, oko 18 sati, ili oko 24 sata nakon što je utvrđeno da je došlo do razvoja inhibitornog imunog odgovora ili da postoji verovatnoća razvoja inhibitornog imunog odgovora, npr. nakon merenja nivoa inhibitornog imunog odgovora ili verovatnoće razvoja inhibitornog imunog odgovora kod ljudi. U određenim otelotvorenjima, himerni polipeptid se primenjuje na ljude manje od oko 1 dan nakon što je utvrđeno da je došlo do razvoja inhibitornog imunog odgovora ili da postoji verovatnoća razvoja inhibitornog imunog odgovora, npr. nakon merenja nivoa inhibitornog imunog odgovora ili verovatnoće razvoja inhibitornog imunog odgovora kod ljudi.

[0094] Indukcija imunog odgovora može se nastaviti sve dok nivo inhibitora ne bude niži od određenog nivoa ili dok se inhibitori ne mogu detektovati. U određenim otelotvorenjima, period indukcije može trajati najmanje oko 24 nedelje, najmanje oko 26 nedelja, najmanje oko 28 nedelja, najmanje oko 30 nedelja, najmanje oko 32 nedelje, najmanje oko 34 nedelje, najmanje oko 36 nedelja, najmanje oko 38 nedelja, najmanje oko 40 nedelja, najmanje oko 42 nedelje, najmanje oko 44 nedelje, najmanje oko 46 nedelja, najmanje oko 48 nedelja, najmanje oko 50 nedelja, najmanje oko 52 nedelje, najmanje oko 54 nedelje, najmanje oko 56 nedelja, najmanje oko 58 nedelja, najmanje oko 60 nedelja, najmanje oko 62 nedelje, najmanje oko 64 nedelje, najmanje oko 66 nedelja, najmanje oko 68 nedelja, najmanje oko 70 nedelja. U jednom posebnom otelotvorenju, period indukcije je manji od 60 nedelja.

[0095] Inhibitorni imuni odgovor lečen metodama opisanim ovde može uključivati bilo koji odgovor unutar ljudskog organizma koji negativno utiče na jedan ili više efekata tretmana faktorom zgrušavanja. U nekim otelotvorenjima, inhibitorni imuni odgovor obuhvata proizvodnju inhibitornih antitela protiv faktora zgrušavanja, npr. inhibitornih anti-FVIII antitela. U određenim otelotvorenjima, metoda ovog obelodanjivanja dalje obuhvata merenje titra jednog ili više inhibitornih antitela kod ljudi pre (npr. na početku) i nakon primene efektivne količine himernog polipeptida opisanog ovde, ili polinukleotida koji ga kodira. U nekim otelotvorenjima, titar inhibitornih antitela pre primene (npr. na početku) je najmanje oko 0,6 Bethesda jedinica (BU). U određenim otelotvorenjima, titar inhibitornih antitela pre primene (npr. na početku) je najmanje oko 1 BU, najmanje oko 2 BU, najmanje oko 3 BU, najmanje oko 4 BU, najmanje oko 5 BU, najmanje oko 6 BU, najmanje oko 7 BU, najmanje oko 10 BU, najmanje oko 20 BU, najmanje oko 30 BU, najmanje oko 40 BU, najmanje oko 50 BU, najmanje oko 100 BU, najmanje oko 150 BU, ili najmanje oko 200 BU. U jednom posebnom otelotvorenju, titar inhibitornih antitela pre primene (npr. na početku) je najmanje oko 5 BU.

[0096] U nekim otelotvorenjima, metode obelodanjene ovde smanjuju titar inhibitornih antitela kod humanog subjekta u odnosu na titar inhibitornih antitela pre primene. U određenim otelotvorenjima, titar inhibitornih antitela nakon primene je manji od oko 0,6 BU. U nekim otelotvorenjima, titar inhibitornih antitela nakon primene je manji od oko 0,5 BU, manji od oko 0,4 BU, manji od oko 0,3 BU, manji od oko 0,2 BU, ili manji od oko 0,1 BU. U jednom posebnom otelotvorenju, titar inhibitornih antitela nakon primene je 0 BU. U drugim otelotvorenjima, titar inhibitornih antitela nakon primene je manji od 5 BU, manji od 4 BU, manji od 3 BU, manji od 2 BU, manji od 1 BU, manji od 0,9 BU, manji od 0,8 BU, manji od 0,7 BU, ili manji od 0,6 BU.

[0097] U nekim otelotvorenjima, primena himernog polipeptida opisanog ovde povećava diferencijaciju makrofaga kod ljudi ka fenotipu sličnom M2, u poređenju sa diferencijacijom makrofaga kod netretiranih kontrola i ljudi lečenih samo faktorom zgrušavanja. U nekim otelotvorenjima, fenotip sličan M2 obuhvata povećanu regulaciju NRF2 puta, PPAR gama puta, ili oba, NRF2 puta i PPAR gama puta. U nekim otelotvorenjima, fenotip sličan M2 obuhvata povećanu regulaciju CD206 (MRC1). U nekim otelotvorenjima, fenotip sličan M2 obuhvata povećanu regulaciju ARG1. U nekim otelotvorenjima, fenotip sličan M2 obuhvata povećanu regulaciju CD206 (MRC1) i ARG1.

[0098] U nekim otelotvorenjima, primena himernog polipeptida opisanog ovde rezultira većom ekspresijom jednog ili više gena kod ljudi, u odnosu na ekspresiju jednog ili više gena kod netretiranog subjekta ili kod subjekta lečenog samo faktorom zgrušavanja. U nekim otelotvorenjima, primena rezultira većom ekspresijom jednog ili više gena iz grupe koja se sastoji od Hmox1, PPAR gama, LPL, EGR2, SLCO4A1, hema oksigenaze 1 (HO-1), inhibitora rasta indukovanog oksidativnim stresom 1 (OSGIN1), superoksid dismutaze 1 (SOD1), glutation-disulfid reduktaze (GSR), katalitičke subjedinice glutamat-cistein ligaze (GCLC), modifikatorske subjedinice glutamat-cistein ligaze (GCLM), NAD(P)H kinon dehidrogenaze 1 (NQO1), proteina koji vezuje masne kiseline 5 (FABP5), B7-H3 (CD276), člana SLAM familije 3 (SLAMF3; limfocitni antigen 9; LY9), člana SLAM familije 7 (SLAMF7), manoznog receptora C-tipa 1 (MRC1), člana nosača familije 12 člana 4 (SLC12A), neuropilina 1 (NRP1), i bilo koje kombinacije toga. U nekim otelotvorenjima, primena rezultira većom ekspresijom jednog ili više gena NRF2 puta. U određenim otelotvorenjima, jedan ili više gena NRF2 puta su izabrani iz grupe koja se sastoji od HO-1, OSGIN1, SOD1, GSR, GCLC, GCLM, NQO1, i bilo koje kombinacije toga. U nekim otelotvorenjima, primena rezultira većom ekspresijom jednog ili više gena PPAR gama puta. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više gena PPAR gama puta su izabrani iz grupe koja se sastoji od PPAR gama, LPL, FABP5, EGR2, i bilo koje kombinacije toga. U nekim otelotvorenjima, primena rezultira većom ekspresijom jednog ili više gena iz grupe koja se sastoji od B7-H3 (CD276), SLAMF3, SLAMF7, MRC1, SLC12A, NRP1, i bilo koje kombinacije toga. U posebnim otelotvorenjima, primena rezultira većom ekspresijom jednog ili više gena u odnosu na ekspresiju jednog ili više gena kod netretiranih ljudi ili ljudi kojima je primenjen samo faktor zgrušavanja, pri čemu je ekspresija najmanje oko 1,5 puta veća, najmanje oko 2 puta veća, najmanje oko 2,5 puta veća, najmanje oko 3 puta veća, najmanje oko 3,5 puta veća, najmanje oko 4 puta veća, najmanje oko 4,5 puta veća, ili najmanje oko 5 puta veća.

[0099] U nekim otelotvorenjima, diferencijalna ekspresija jednog ili više gena se primećuje manje od 6 sati nakon primene himernog polipeptida opisanog ovde. U nekim otelotvorenjima, diferencijalna ekspresija se primećuje manje od 12 sati nakon primene. U nekim otelotvorenjima, diferencijalna ekspresija se primećuje manje od 18 sati nakon primene. U nekim otelotvorenjima, diferencijalna ekspresija se primećuje manje od 24 sati nakon primene.

[0100] U nekim otelotvorenjima, inhibitorni imuni odgovor obuhvata ćelijski posredovani imuni odgovor. U određenim otelotvorenjima, ćelijski posredovani imuni odgovor obuhvata oslobađanje citokina. U nekim otelotvorenjima, citokin je bilo koji citokin povezan sa povećanim imunim odgovorom. U nekim otelotvorenjima, citokin je izabran iz grupe koja se sastoji od IL-1, IL-6, IL-16, IL-12, IL-4, IL-17, faktora nekroze tumora α (TNF-α), interferona α, interferona γ i bilo koje kombinacije toga. U jednom otelotvorenju, ćelijski posredovani imuni odgovor obuhvata povećane serumske nivoe IL-12. U drugom otelotvorenju, ćelijski posredovani imuni odgovor obuhvata povećane serumske nivoe IL-4. U drugom otelotvorenju, ćelijski posredovani imuni odgovor obuhvata povećane serumske nivoe IL-17. U drugom otelotvorenju, ćelijski posredovani imuni odgovor obuhvata povećane serumske nivoe TNF-α.

[0101] Različite genske mutacije su povezane sa povećanim rizikom od razvoja inhibitornog imunog odgovora. Na primer, polimorfizam TNF-α -308G>A unutar Hap2, koji je povezan sa povećanim konstitutivnim i induktivnim nivoima transkripcije TNF, povezan je sa povećanim rizikom od razvoja inhibitornog imunog odgovora. Videti Astermark et al., Blood 108: 3739-3745 (2006). Stoga, u nekim otelotvorenjima, ljudi imaju genetski polimorfizam povezan sa povećanim TNF-α. U nekim otelotvorenjima, polimorfizam je TNF-α -308G>A polimorfizam. U nekim otelotvorenjima, ljudi imaju polimorfizam u IL10 genu, npr. polimorfizam povezan sa povećanom sekrecijom IL10. U nekim otelotvorenjima, FVIII-Fc se primenjuje na subjektu sa alelom 134 IL10G mikrosatelita u promotorskom regionu IL10 gena. Videti Astermark et al. Hemostatis, Thrombosis, and Vascular Biology 108: 3739-3745 (2006).

[0102] U nekim otelotvorenjima, ljudi imaju genetski polimorfizam povezan sa smanjenom ekspresijom CTLA-4 (citotoksični T-limfocitni antigen 4). U nekim otelotvorenjima, ljudi imaju mutaciju u DR15 (HLA-DR15) ili DQB0602 MHC (glavni kompleks histokompatibilnosti) molekulima klase II . Drugi MHC molekuli klase II povezani sa razvojem inhibitornog imunog odgovora kod subjekata sa hemofilijom su A3, B7, C7, DQA0102, C2, DQA0103, DQB0603, i DR13 (videti Inhibitors in Patients with Hemophilia, E.C. Rodriguez-Merchan & C.A. Lee, Eds., Blackwell Science, Ltd,, 2002).

[0103] U nekim otelotvorenjima, metode obelodanjene ovde smanjuju nivo jednog ili više citokina kod subjekta u poređenju sa nivoom jednog ili više citokina kod subjekta nakon prethodnog tretmana polipeptidom koji se sastoji od FVIII proteina. U drugom otelotvorenju, metode obelodanjene ovde smanjuju nivo jednog ili više citokina kod subjekta u poređenju sa nivoom jednog ili više citokina kod subjekta pre primene. U drugim otelotvorenjima, ekspresija jednog ili više tolerogenih molekula je povećana nakon primene metoda obelodanjenih ovde u odnosu na nivo ekspresije jednog ili više tolerogenih molekula pre primene. U određenim otelotvorenjima, jedan ili više tolerogenih molekula su izabrani iz IL-10, TGF-β, IL-35, IDO-1, i bilo koje kombinacije toga.

[0104] U drugim otelotvorenjima, imuni odgovor obuhvata klinički simptom izabran iz grupe koja se sastoji od: povećane tendencije krvarenja, visoke potrošnje faktora zgrušavanja, nedostatka odgovora na terapiju faktorom zgrušavanja, smanjene efikasnosti terapije faktorom zgrušavanja, skraćenog poluživota faktora zgrušavanja, i bilo koje kombinacije toga. U određenim otelotvorenjima, imuni odgovor obuhvata klinički simptom izabran iz grupe koja se sastoji od: povećane tendencije krvarenja, visoke potrošnje faktora zgrušavanja, nedostatka odgovora na terapiju faktorom zgrušavanja, smanjene efikasnosti terapije faktorom zgrušavanja, smanjenog oporavka aktivnosti faktora zgrušavanja kako se prati u plazmi, skraćenog poluživota faktora zgrušavanja, i bilo koje kombinacije toga.

[0105] U određenim otelotvorenjima, ljudima je prethodno dijagnostikovan inhibitorni imuni odgovor. Takva dijagnoza se može postaviti bilo kojim metodama poznatim u struci. Na primer, ljudi se mogu okarakterisati da imaju imuni odgovor na faktor zgrušavanja, npr. FVIII, ako ljudi imaju jedno ili više od sledećeg: (a) titar inhibitornih antitela na faktor zgrušavanja veći ili jednak 0,6 BU; (b) povećane serumske nivoe jednog ili više citokina izabranih iz grupe koja se sastoji od IL-12, IL-4, IL-17 i TNF-α; (c) povećanu tendenciju krvarenja; (d) visoku potrošnju faktora zgrušavanja; (e) nedostatak odgovora na terapiju faktorom zgrušavanja; (f) smanjenu efikasnost terapije faktorom zgrušavanja; (g) skraćen poluživot faktora zgrušavanja, i bilo koju kombinaciju toga. U jednom posebnom otelotvorenju, ljudi su okarakterisani da imaju imuni odgovor na faktor zgrušavanja ako ljudi imaju titar inhibitornih antitela na faktor zgrušavanja veći ili jednak 0,6 BU.

[0106] U nekim otelotvorenjima, ljudima je prethodno dijagnostikovan razvoj inhibitornog imunog odgovora na faktor zgrušavanja najmanje oko 1 mesec, najmanje oko 2 meseca, najmanje oko 3 meseca, najmanje oko 4 meseca, najmanje oko 5 meseci, najmanje oko 6 meseci, najmanje oko 7 meseci, najmanje oko 8 meseci, najmanje oko 9 meseci, najmanje oko 10 meseci, najmanje oko 11 meseci, najmanje oko 12 meseci, najmanje oko 13 meseci, najmanje oko 14 meseci, najmanje oko 15 meseci, najmanje oko 16 meseci, najmanje oko 17 meseci, najmanje oko 18 meseci, najmanje oko 19 meseci, najmanje oko 20 meseci, najmanje oko 21 mesec, najmanje oko 22 meseca, najmanje oko 23 meseca, najmanje oko 24 meseca, najmanje oko 27 meseci, najmanje oko 30 meseci, najmanje oko 33 meseca, najmanje oko 36 meseci, najmanje oko 39 meseci, najmanje oko 42 meseca, najmanje oko 45 meseci, najmanje oko 48 meseci, najmanje oko 51 mesec, najmanje oko 54 meseca, najmanje oko 57 meseci, najmanje oko 60 meseci, najmanje oko 6 godina, najmanje oko 7 godina, najmanje oko 8 godina, najmanje oko 10 godina, najmanje oko 15 godina, ili najmanje oko 20 godina pre primene. U jednom otelotvorenju, ljudima je prethodno dijagnostikovan razvoj inhibitornog imunog odgovora na faktor zgrušavanja najmanje oko 5 godina pre primene.

[0107] Metode obelodanjene ovde opciono obezbeđuju poboljšano vreme do tolerancije u poređenju sa standardnim metodama indukcije imune tolerancije. Termin „vreme do tolerancije“, kako se ovde koristi, odnosi se na količinu vremena između primene prve doze sastava ili himernog proteina koji sadrži faktor zgrušavanja i Fc region, i razvoja imune tolerancije kod ljudi. Smanjenje vremena do tolerancije može imati značajne koristi za ljude, uključujući, ali ne ograničavajući se na smanjenje ukupnog finansijskog opterećenja potrebnog za postizanje tolerancije. U nekim otelotvorenjima, vreme do tolerancije je oko 1 do oko 24 nedelje, oko 1 do oko 23 nedelje, oko 1 do oko 22 nedelje, oko 1 do oko 21 nedelju, oko 2 do oko 20 nedelja, oko 2 do oko 19 nedelja, oko 2 do oko 18 nedelja, oko 2 do oko 17 nedelja, oko 3 do oko 16 nedelja, oko 3 do oko 15 nedelja, oko 3 do oko 14 nedelja, oko 3 do oko 13 nedelja, oko 4 do oko 12 nedelja, oko 4 do oko 11 nedelja, oko 4 do oko 10 nedelja, oko 4 do oko 9 nedelja, oko 5 do oko 8 nedelja, oko 5 do oko 7 nedelja, oko 5 do oko 6 nedelja, oko 1 do oko 12 nedelja, oko 1 do oko 11 nedelja, oko 1 do oko 10 nedelja, oko 1 do oko 9 nedelja, oko 1 do oko 8 nedelja, oko 1 do oko 7 nedelja, oko 1 do oko 6 nedelja, oko 1 do oko 5 nedelja, ili oko 1 do oko 4 nedelje. U nekim otelotvorenjima, vreme do tolerancije je manje od oko 70 nedelja, manje od oko 65 nedelja, manje od oko 60 nedelja, manje od oko 58 nedelja, manje od oko 56 nedelja, manje od oko 54 nedelje, manje od oko 52 nedelje, manje od oko 50 nedelja, manje od oko 48 nedelja, manje od oko 46 nedelja, manje od oko 44 nedelje, manje od oko 42 nedelje, manje od oko 40 nedelja, manje od oko 38 nedelja, manje od oko 36 nedelja, manje od oko 34 nedelje, manje od oko 32 nedelje, manje od oko 30 nedelja, manje od oko 28 nedelja, manje od oko 26 nedelja, manje od oko 24 nedelje, manje od oko 23 nedelje, manje od oko 22 nedelje, manje od oko 21 nedelju, manje od oko 20 nedelja, manje od oko 19 nedelja, manje od oko 18 nedelja, manje od oko 17 nedelja, manje od oko 16 nedelja, manje od oko 15 nedelja, manje od oko 14 nedelja, manje od oko 13 nedelja, manje od oko 12 nedelja, manje od oko 11 nedelja, manje od oko 10 nedelja, manje od oko 9 nedelja, manje od oko 8 nedelja, manje od oko 7 nedelja, manje od oko 6 nedelja, manje od oko 5 nedelja, manje od oko 4 nedelje, manje od oko 3 nedelje, manje od oko 2 nedelje, ili manje od oko 1 nedelje. U određenim otelotvorenjima, vreme do tolerancije je oko 4 do oko 12 nedelja. U jednom otelotvorenju, vreme do tolerancije je oko 4 nedelje. U drugom otelotvorenju, vreme do tolerancije je oko 12 nedelja. U nekim otelotvorenjima, vreme do tolerancije je manje od oko 10 meseci. U nekim otelotvorenjima, vreme do tolerancije je manje od oko 9 meseci. U nekim otelotvorenjima, vreme do tolerancije je manje od oko 8 meseci. U nekim otelotvorenjima, vreme do tolerancije je manje od oko 7 meseci. U nekim otelotvorenjima, vreme do tolerancije je manje od oko 6 meseci. U nekim otelotvorenjima, vreme do tolerancije je manje od oko 5 meseci. U nekim otelotvorenjima, vreme do tolerancije je manje od oko 4 meseca. U nekim otelotvorenjima, metode ovog obelodanjivanja rezultiraju kraćim vremenom do tolerancije kod ljudi nakon tretmana sastavom ili himernim proteinom koji sadrži faktor zgrušavanja i Fc region u poređenju sa vremenom do tolerancije nakon tretmana samo faktorom zgrušavanja.

[0108] U nekim otelotvorenjima, razvoj imune tolerancije karakteriše titar inhibitornog antitela na faktor zgrušavanja manji od oko 0,6 BU. U nekim otelotvorenjima, razvoj imune tolerancije karakteriše titar inhibitornog antitela na faktor zgrušavanja manji od oko 0,5 BU. U nekim otelotvorenjima, razvoj imune tolerancije karakteriše titar inhibitornog antitela na faktor zgrušavanja manji od oko 0,4 BU. U nekim otelotvorenjima, razvoj imune tolerancije karakteriše titar inhibitornog antitela na faktor zgrušavanja manji od oko 0,3 BU. U nekim otelotvorenjima, razvoj imune tolerancije karakteriše titar inhibitornog antitela na faktor zgrušavanja manji od oko 0,2 BU. U nekim otelotvorenjima, razvoj imune tolerancije karakteriše titar inhibitornog antitela na faktor zgrušavanja manji od oko 0,1 BU. U nekim otelotvorenjima, razvoj imune tolerancije karakteriše titar inhibitornog antitela na faktor zgrušavanja od 0,0 BU. U određenim otelotvorenjima, titar inhibitornih imunih antitela se primećuje pri dva uzastopna merenja, npr. u dve uzastopne nedelje unutar četvoronedeljnog perioda.

[0109] U nekim otelotvorenjima, razvoj imune tolerancije karakteriše inkrementalni oporavak >66% (npr. inkrementalni oporavak od oko 67%, oko 68%, oko 69%, oko 70%, oko 71%, oko 72%, oko 73%, oko 74%, oko 75%, oko 76%, oko 77%, oko 78%, oko 79%, oko 80%, oko 81%, oko 82%, oko 83%, oko 84%, oko 85%, oko 86%, oko 87%, oko 88%, oko 89%, oko 90%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99%, ili oko 100%). Kao što se ovde koristi, „inkrementalni oporavak“ odnosi se na vršne nivoe FVIII 15-30 minuta nakon infuzije.

[0110] Nakon završetka perioda indukcije i perioda postepenog smanjivanja doze, subjekt može nastaviti sa profilaktičkim tretmanom himernim proteinom. Profilaktički režim doziranja može biti bilo koji režim doziranja obelodanjen ovde.

[0111] U nekim otelotvorenjima, ljudi lečeni metodama obelodanjenim ovde primaju ili su nedavno primali imunostimulativnu terapiju. Na primer, inhibitori su takođe zabeleženi kod pacijenata sa hemofilijom A pozitivnih na HCV koji su bili podvrgnuti tretmanu interferonom, kao i kod pacijenata sa hemofilijom A pozitivnih na HIV koji su imali sindrom imunološke rekonstitucije povezan sa antiretrovirusnom terapijom. Videti Izveštaj Stručnog sastanka o FVIII proizvodima i razvoju inhibitora, Evropska agencija za lekove (28. februar 2006.-2. mart 2006.). Stoga, u nekim otelotvorenjima, ljudi primaju terapiju interferonom. U nekim otelotvorenjima, ljudi primaju antivirusnu terapiju. U nekim otelotvorenjima, ljudi primaju antiretrovirusnu terapiju i imaju sindrom imunološke rekonstitucije.

[0112] U određenim otelotvorenjima, ljudi su imali manje od 150 dana izloženosti (ED) faktoru zgrušavanja, npr. FVIII. U jednom otelotvorenju, ljudi su imali manje od 50 ED. U drugom otelotvorenju, ljudi su imali manje od 20 ED.

[0113] Neki aspekti obelodanjeni ovde usmereni su na smanjenje ozbiljnosti ili učestalosti alergijske ili anafilaktičke reakcije na faktor zgrušavanja kod subjekta kome je to potrebno, što obuhvata primenu sastava ili himernog proteina koji sadrži faktor zgrušavanja i Fc region subjektu. U nekim otelotvorenjima, primena sastava ili himernog proteina smanjuje ozbiljnost anafilaktoidne reakcije na faktor zgrušavanja. U nekim otelotvorenjima, primena sastava ili himernog proteina smanjuje ozbiljnost alergijske reakcije na faktor zgrušavanja.

III. Himerni polipeptidi

[0114] Himerni polipeptidi u skladu sa ovim pronalaskom obuhvataju FVIII protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 207, i VWF fragment koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 202. VWF fragment se koristi za sprečavanje ili blokiranje interakcije FVIII proteina sa endogenim VWF, čime se sprečava uklanjanje FVIII proteina putem VWF puta klirensa. Da bi se sprečila disocijacija FVIII proteina od VWF fragmenta, FVIII protein i VWF fragment su direktno povezani kovalentnom vezom.

[0115] Kovalentna veza može biti bilo koja kovalentna veza poznata u struci. U nekim otelotvorenjima, kovalentna veza je disulfidna veza. U nekim otelotvorenjima, kovalentna veza je peptidna veza. U drugim otelotvorenjima, FVIII protein je modifikovan kako bi se povećala jačina interakcije između FVIII proteina i VWF fragmenta. U drugim otelotvorenjima, VWF fragment je modifikovan kako bi se povećala jačina interakcije između FVIII proteina i VWF fragmenta. U daljim otelotvorenjima, FVIII protein i VWF protein su oba modifikovana kako bi se povećala jačina interakcije između FVIII proteina i VWF fragmenta.

[0116] U posebnim otelotvorenjima, FVIII protein koji sadrži FVIII polipeptid i VWF fragment koji sadrži D' domen i D3 domen VWF direktno se povezuju putem najmanje jedne kovalentne veze između najmanje jedne aminokiseline u FVIII polipeptidnoj sekvenci i najmanje jedne aminokiseline u D' i D3 domenima VWF. U drugim otelotvorenjima, FVIII protein i VWF fragment se indirektno povezuju putem najmanje jedne kovalentne veze između najmanje jedne aminokiseline u FVIII polipeptidnoj sekvenci i najmanje jedne aminokiseline u heterolognoj sekvenci fuzionisanoj direktno ili indirektno sa D' i D3 domenima VWF. U drugim otelotvorenjima, FVIII protein i VWF fragment se indirektno povezuju putem najmanje jedne kovalentne veze između najmanje jedne aminokiseline u sekvenci VWF fragmenta i najmanje jedne aminokiseline u heterolognoj sekvenci fuzionisanoj direktno ili indirektno sa FVIII polipeptidom. U daljim otelotvorenjima, FVIII protein i VWF fragment se indirektno povezuju putem najmanje jedne kovalentne veze između najmanje jedne aminokiseline u heterolognoj sekvenci fuzionisanoj direktno ili indirektno sa D' i D3 domenima VWF i najmanje jedne aminokiseline u heterolognoj sekvenci fuzionisanoj direktno ili indirektno sa FVIII polipeptidom.

[0117] Himerni polipeptid ili protein za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom obuhvata FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc heterodimer. FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc heterodimer himerni polipeptid obuhvata: (i) FVIII protein koji sadrži FVIII polipeptid, XTEN umetnut unutar B domena FVIII polipeptida, i prvi Fc region; i (ii) VWF protein koji sadrži VWF fragment, drugu XTEN sekvencu, a2 linker i drugi Fc region. Šematski prikaz primera FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc heterodimera, nazvanog rFVIIIFc-VWF-XTEN, prikazan je na slici 1.

III.A. Polipeptidi faktora VIII

[0118] „Faktor VIII“, skraćen u celoj ovoj prijavi kao „FVIII“, kako se ovde koristi, znači funkcionalni FVIII polipeptid u svojoj normalnoj ulozi u koagulaciji, osim ako nije drugačije naznačeno. Stoga, termin FVIII uključuje varijante polipeptida koje su funkcionalne. „FVIII protein“ se koristi za označavanje FVIII polipeptida (ili proteina) samog, FVIII polipeptida fuzionisanog sa dodatnim polipeptidima, i FVIII polipeptida povezanog sa jednim ili više dodatnih polipeptida sve dok FVIII protein ispoljava FVIII funkciju/aktivnost. Termini „FVIII polipeptid“, „FVIII deo“ i „FVIII“ odnose se samo na sekvencu FVIII polipeptida. Primeri FVIII funkcija/aktivnosti uključuju, ali nisu ograničeni na, sposobnost aktiviranja koagulacije, sposobnost da deluje kao kofaktor za faktor IX, ili sposobnost formiranja tenaznog kompleksa sa faktorom IX u prisustvu Ca<2+>i fosfolipida, koji zatim konvertuje faktor X u aktivirani oblik Xa. FVIII polipeptid može biti humani, svinjski, pseći, pacovski ili mišji FVIII polipeptid. Pored toga, poređenja između FVIII kod ljudi i drugih vrsta identifikovala su konzervirane ostatke koji su verovatno neophodni za funkciju (Cameron et al., Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998); US 6,251,632). Poznate su sekvence polipeptida i polinukleotida pune dužine, kao i mnogi funkcionalni fragmenti, mutanti i modifikovane verzije. Različite FVIII aminokiselinske i nukleotidne sekvence obelodanjene su u npr. američkim publikacijama br.

2015/0158929 A1, 2014/0308280 A1 i 2014/0370035 A1 i međunarodnoj publikaciji br.

2015/106052 A1. FVIII polipeptidi uključuju npr. FVIII pune dužine, FVIII pune dužine minus Met na N-terminusu, zreli FVIII polipeptid (minus signalnu sekvencu), zreli FVIII polipeptid sa dodatnim Met na N-terminusu, i/ili FVIII polipeptid sa potpunom ili delimičnom delecijom B domena. FVIII varijante uključuju deleciju B domena, bilo delimičnu ili potpunu deleciju.

[0119] FVIII polipeptid himernog polipeptida koji se ovde koristi ima FVIII aktivnost u plazmi. Aktivnost FVIII može se meriti bilo kojim poznatim metodama u struci. Dostupan je niz testova za procenu funkcije sistema koagulacije: test aktiviranog parcijalnog tromboplastinskog vremena (aPTT), hromogeni test, ROTEM test, test protrombinskog vremena (PT) (takođe se koristi za određivanje INR), test fibrinogena (često Clauss metodom), broj trombocita, test funkcije trombocita (često PFA-100), TCT, vreme krvarenja, test mešanja (da li se abnormalnost koriguje ako se plazma pacijenta pomeša sa normalnom plazmom), testovi faktora koagulacije, antifosfolipidna antitela, D-dimer, genetski testovi (npr. faktor V Leiden, protrombinska mutacija G20210A), razblaženo vreme zgrušavanja zmijskog otrova (dRVVT), razni testovi funkcije trombocita, tromboelastografija (TEG ili Sonoclot), tromboelastometrija (TEM<®>npr. ROTEM<®>), ili vreme liziranja euglobulina (ELT).

[0120] aPTT test je indikator performansi koji meri efikasnost i „unutrašnjeg“ (takođe nazvanog puta kontaktne aktivacije) i zajedničkih puteva koagulacije. Ovaj test se obično koristi za merenje aktivnosti zgrušavanja komercijalno dostupnih rekombinantnih faktora zgrušavanja, npr. FVIII. Tipično se koristi u kombinaciji sa protrombinskim vremenom (PT), koje meri ekstrinzični put. (Videti, npr. Kamal et al., Mayo Clin Proc., 82(7):864-873 (2007)). U jednom otelotvorenju, aPTT se testira pomoću testa gde se aktivnost FVIII meri korišćenjem Dade<®>Actin<®>FSL aktiviranog PTT reagensa (Siemens Health Care Diagnostics) na BCS<®>XP analizatoru (Siemens Healthcare Diagnostics). U određenim otelotvorenjima, himerni polipeptid ima FVIII aktivnost u plazmi od najmanje oko 1%, najmanje oko 2%, najmanje oko 3%, najmanje oko 4%, najmanje oko 5%, najmanje oko 6%, najmanje oko 7%, najmanje oko 8%, najmanje oko 9%, najmanje oko 10%, najmanje oko 11%, najmanje oko 12%, najmanje oko 13%, najmanje oko 14%, najmanje oko 15%, najmanje oko 15%, najmanje oko 16%, najmanje oko 17%, najmanje oko 18%, najmanje oko 19%, ili najmanje oko 20% mereno aPTT testom.

[0121] aPTT test se takođe može koristiti za procenu potentnosti himernog polipeptida pre primene na pacijentu ili subjektu. (Hubbard AR, et al. J Thromb Haemost 11: 988-9 (2013)). aPTT test se dalje može koristiti u kombinaciji sa bilo kojim od ovde opisanih testova, bilo pre primene ili nakon primene na pacijentu ili subjektu.

[0122] ROTEM analiza pruža informacije o celokupnoj kinetici hemostaze: vremenu zgrušavanja, formiranju ugruška, stabilnosti ugruška i lizi. Različiti parametri u tromboelastometriji zavise od aktivnosti plazmatskog koagulacionog sistema, funkcije trombocita, fibrinolize ili mnogih faktora koji utiču na ove interakcije. Ovaj test može pružiti potpunu sliku sekundarne hemostaze.

[0123] Mehanizam hromogenog testa zasniva se na principima kaskade koagulacije krvi, gde aktivirani FVIII ubrzava konverziju faktora X u faktor Xa u prisustvu aktiviranog faktora IX, fosfolipida i jona kalcijuma. Aktivnost faktora Xa se procenjuje hidrolizom p-nitroanilid (pNA) supstrata specifičnog za faktor Xa. Početna brzina oslobađanja p-nitroanilina merena na 405 nM direktno je proporcionalna aktivnosti faktora Xa, a time i aktivnosti FVIII u uzorku. U jednom otelotvorenju, hromogeni test je BIOPHEN FVIII:C test (Hyphen Biomed, Neurville sur Oise, Francuska).

[0124] Hromogeni test preporučuje Potkomitet za FVIII i faktor IX Naučnog i standardizacionog komiteta (SSC) Međunarodnog društva za trombozu i hemostazu (ISTH). Od 1994. godine, hromogeni test je takođe referentna metoda Evropske farmakopeje za dodelu potentnosti FVIII koncentrata. Stoga, u nekim otelotvorenjima, himerni polipeptid koji sadrži FVIII polipeptid ima FVIII aktivnost uporedivu sa himernim polipeptidom koji sadrži zreli FVIII polipeptid ili BDD FVIII polipeptid (npr. RECOMBINATE<®>, KOGENATE FS<®>, HELIXATE FS<®>, XYNTHA/REFACTO AB<®>, HEMOFIL-M<®>, MONARC-M<®>, MONOCLATE-P®, HUMATE-P<®>, ALPHANATE<®>, KOATE-DVI<®>, AFSTYLA<®>I HYATE:C<®>).

[0125] Hromogeni test se takođe može koristiti za procenu potentnosti himernog polipeptida pre primene na pacijentu ili subjektu. (Hubbard AR, et al. J Thromb Haemost 11: 988-9 (2013)). Hromogeni test se dalje može koristiti u kombinaciji sa bilo kojim od ovde opisanih testova, bilo pre primene ili nakon primene na pacijentu ili subjektu.

[0126] U drugim otelotvorenjima, himerni polipeptid koji sadrži FVIII polipeptid iz ovog obelodanjivanja ima brzinu generisanja faktora Xa uporedivu sa himernim polipeptidom koji sadrži zreli FVIII polipeptid ili BDD FVIII polipeptid (npr. ADVATE<®>, REFACTO<®>ili ELOCTATE<®>).

[0127] Da bi se aktivirao faktor X u faktor Xa, aktivirani faktor IX (faktor IXa) hidrolizuje jednu arginin-izoleucinsku vezu u faktoru X kako bi formirao faktor Xa u prisustvu Ca<2+>, membranskih fosfolipida i FVIII kofaktora. Stoga, interakcija FVIII sa faktorom IX je ključna u putu koagulacije. U određenim otelotvorenjima, himerni polipeptid koji sadrži FVIII polipeptid može da interaguje sa faktorom IXa brzinom uporedivom sa himernim polipeptidom koji sadrži sekvencu zrelog FVIII polipeptida ili BDD FVIII polipeptid (npr. ADVATE<®>, REFACTO<®>ili ELOCTATE<®>).

[0128] Pored toga, FVIII je vezan za Fon Vilebrandov faktor dok je neaktivan u cirkulaciji. FVIII se brzo razgrađuje kada nije vezan za VWF i oslobađa se iz VWF delovanjem trombina. U nekim otelotvorenjima, himerni polipeptid koji sadrži FVIII polipeptid vezuje se za Fon Vilebrandov faktor, npr. VWF fragment obelodanjen ovde, na nivou uporedivom sa himernim polipeptidom koji sadrži sekvencu zrelog FVIII polipeptida ili BDD FVIII polipeptid (npr. ADVATE<®>, REFACTO<®>ili ELOCTATE<®>).

[0129] FVIII može biti inaktiviran aktiviranim proteinom C u prisustvu kalcijuma i fosfolipida. Aktivirani protein C cepa teški lanac FVIII nakon arginina 336 u A1 domenu, što narušava mesto interakcije supstrata faktora X, i cepa nakon arginina 562 u A2 domenu, što pojačava disocijaciju A2 domena kao i narušava mesto interakcije sa faktorom IXa. Ovo cepanje takođe deli A2 domen (43 kDa) i generiše A2-N (18 kDa) i A2-C (25 kDa) domene. Dakle, aktivirani protein C može katalizovati višestruka mesta cepanja u teškom lancu. U nekim otelotvorenjima, himerni polipeptid koji sadrži FVIII polipeptid se inaktivira aktiviranim proteinom C na nivou uporedivom sa himernim polipeptidom koji sadrži sekvencu zrelog FVIII polipeptida ili BDD FVIII polipeptid (npr. ADVATE<®>, REFACTO<®>ili ELOCTATE<®>).

[0130] U drugim otelotvorenjima, himerni polipeptid koji sadrži FVIII polipeptid ima FVIII aktivnost in vivo uporedivu sa himernim polipeptidom koji sadrži sekvencu zrelog FVIII polipeptida ili BDD FVIII polipeptid (npr. ADVATE<®>, REFACTO<®>ili ELOCTATE<®>). U posebnom otelotvorenju, himerni polipeptid koji sadrži FVIII polipeptid je sposoban da zaštiti HemA miša na nivou uporedivom sa himernim polipeptidom koji sadrži sekvencu zrelog FVIII polipeptida ili BDD FVIII polipeptid (npr. ADVATE<®>, REFACTO<®>ili ELOCTATE<®>) u modelu preseka repne vene HemA miša.

[0131] Primeri sekvenci humanog FVIII (pune dužine) prikazani su u nastavku.

[0132] FVIII polipeptidi uključuju FVIII pune dužine, FVIII pune dužine minus Met na N-terminusu, zreli FVIII (minus signalnu sekvencu), zreli FVIII sa dodatnim Met na N-terminusu, i/ili FVIII sa potpunom ili delimičnom delecijom B domena. FVIII varijante uključuju deleciju B domena, bilo delimičnu ili potpunu deleciju.

[0133] Sekvenca nativnog zrelog humanog FVIII polipeptida prikazana je kao SEQ ID NO: 65. Nativni FVIII polipeptid ima sledeću formulu: A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2, gde su A1, A2 i A3 strukturno povezani „A domeni“, B je „B domen“, C1 i C2 su strukturno povezani „C domeni“, a a1, a2 i a3 su kisele regije za razdvajanje. Pozivajući se na primarnu aminokiselinsku sekvencu u SEQ ID NO: 65, A1 domen humanog FVIII proteže se od Ala1 do oko Arg336, a1 regija za razdvajanje proteže se od oko Met337 do oko Val374, A2 domen proteže se od oko Ala375 do oko Tyr719, a2 regija za razdvajanje proteže se od oko Glu720 do oko Arg740, B domen proteže se od oko Ser741 do oko Arg1648, a3 regija za razdvajanje proteže se od oko Glu1649 do oko Arg1689, A3 domen proteže se od oko Ser1690 do oko Leu2025, C1 domen proteže se od oko Gly2026 do oko Asn2072, a C2 domen proteže se od oko Ser2073 do Tyr2332. Osim specifičnih proteolitičkih mesta cepanja, određivanje lokacija granica između domena i regiona FVIII može varirati u različitim referencama u literaturi. Granice navedene ovde su stoga označene kao približne upotrebom termina „oko“.

[0134] Humani FVIII gen je izolovan i izražen u ćelijama sisara (Toole, J. J., et al., Nature 312:342-347 (1984); Gitschier, J., et al., Nature 312:326-330 (1984); Wood, W. I., et al., Nature 312:330-337 (1984); Vehar, G. A., et al., Nature 312:337-342 (1984); WO 87/04187; WO 88/08035; WO 88/03558; i američki patent br.4,757,006). Aminokiselinska sekvenca FVIII je izvedena iz cDNK kao što je prikazano u američkom patentu br.4,965,199. Pored toga, FVIII sa delimičnom ili potpunom delecijom B-domena prikazan je u američkom patentu br.

4,994,371 i 4,868,112. Opciono, B-domen humanog FVIII je zamenjen B-domenom humanog faktora V, kao što je prikazano u američkom patentu br.5,004,803. cDNK sekvenca koja kodira humani faktor VIII i aminokiselinska sekvenca prikazane su u SEQ ID NO: 1 i 2, respektivno, američke publikacije prijave br.2005/0100990.

[0135] Svinjska FVIII sekvenca objavljena je u Toole, J. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5939-5942 (1986). Dalje, kompletna svinjska cDNK sekvenca dobijena PCR amplifikacijom FVIII sekvenci iz biblioteke cDNK slezine svinja prijavljena je u Healey, J. F., et al., Blood 88:4209-4214 (1996). Hibridni humani/svinjski FVIII sa supstitucijama svih domena, svih podjedinica i specifičnih aminokiselinskih sekvenci obelodanjeni su u američkom patentnu br.5,364,771 od strane Lollara i Runge, i u WO 93/20093. Nedavno su nukleotidne i odgovarajuće aminokiselinske sekvence A1 i A2 domena svinjskog FVIII i himernog FVIII sa svinjskim A1 i/ili A2 domenima zamenjenim odgovarajućim humanim domenima prijavljene u WO 94/11503. Američki patent br. 5,859,204, Lollar, J. S., takođe obelodanjuje svinjsku cDNK i dedukovane aminokiselinske sekvence. Američki patent br.

6,458,563 obelodanjuje svinjski FVIII sa delecijom B-domena.

[0136] Američki patent br. 5,859,204, Lollar, J. S. prijavljuje funkcionalne mutante FVIII sa smanjenom antigenošću i smanjenom imunoreaktivnošću. Američki patent br. 6,376,463, Lollar, J. S. takođe prijavljuje mutante FVIII sa smanjenom imunoreaktivnošću. Američka publikacija prijave br. 2005/0100990, Saenko et al. prijavljuje funkcionalne mutacije u A2 domenu FVIII.

[0137] „B-domen“ FVIII, kako se ovde koristi, je isti kao B-domen poznat u struci koji je definisan unutrašnjom identitetom aminokiselinske sekvence i mestima proteolitičkog cepanja, npr. ostaci Ser741-Arg1648 humanog FVIII pune dužine. Drugi domeni humanog FVIII definisani su sledećim aminokiselinskim ostacima: A1, ostaci Ala1-Arg372; A2, ostaci Ser373-Arg740; A3, ostaci Ser1690-Asn2019; C1, ostaci Lys2020-Asn2172; C2, ostaci Ser2173-Tyr2332. Sekvenca A3-C1-C2 uključuje ostatke Ser1690-Tyr2332. Preostala sekvenca, ostaci Glu1649-Arg1689, obično se naziva a3 kiseli region. Lokacije granica za sve domene, uključujući B-domene, za svinjski, mišji i pseći FVIII su takođe poznate u struci. Prema ovom pronalasku, B domen FVIII je deleciran („faktor VIII sa delecijom B-domena“ ili „BDD FVIII“).

[0138] „FVIII sa delecijom B-domena“ može imati potpune ili delimične delecije obelodanjene u američkim patentima br. 6,316,226, 6,346,513, 7,041,635, 5,789,203, 6,060,447, 5,595,886, 6,228,620, 5,972,885, 6,048,720, 5,543,502, 5,610,278, 5,171,844, 5,112,950, 4,868,112 i 6,458,563, američkim publikacijama br. US 2017/0073393 A1 i US 2012/308641 A1, i međunarodnim publikacijama br. WO 2011/041770 A1, WO 2015/106052 A1 (PCT/US2015/010738) i WO 2016/025764. Opciono, sekvenca FVIII sa delecijom B-domena obuhvata bilo koju od delecija obelodanjenih u koloni 4, red 4 do kolone 5, red 28 i primerima 1-5 američkog patenta br.6,316,226 (takođe u US 6,346,513), ili je faktor VIII sa delecijom B-domena S743/Q1638 faktor VIII sa delecijom B-domena (SQ BDD FVIII) (npr. faktor VIII sa delecijom od aminokiseline 744 do aminokiseline 1637, npr. faktor VIII koji ima aminokiseline 1-743 i aminokiseline 1638-2332 zrelog FVIII), ili FVIII sa delecijom B-domena ima deleciju obelodanjenu u koloni 2, redovi 26-51 i primerima 5-8 američkog patenta br. 5,789,203 (takođe US 6,060,447, US 5,595,886, i US 6,228,620), ili faktor VIII sa delecijom B-domena ima deleciju opisanu u koloni 1, redovi 25 do kolone 2, red 40 američkog patenta br.5,972,885; koloni 6, redovi 1-22 i primeru 1 američkog patenta br.6,048,720; koloni 2, redovi 17-46 američkog patenta br. 5,543,502; koloni 4, red 22 do kolone 5, red 36 američkog patenta br.5,171,844; koloni 2, redovi 55-68, slici 2, i primeru 1 američkog patenta br. 5,112,950; koloni 2, red 2 do kolone 19, red 21 i tabeli 2 američkog patenta br. 4,868,112; koloni 2, red 1 do kolone 3, red 19, koloni 3, red 40 do kolone 4, red 67, koloni 7, red 43 do kolone 8, red 26, i koloni 11, red 5 do kolone 13, red 39 američkog patenta br.7,041,635; ili koloni 4, redovi 25-53, američkog patenta br. 6,458,563. Opciono, FVIII polipeptid sa delecijom B-domena obuhvata deleciju većine B-domena, ali i dalje sadrži amino-terminalne sekvence B-domena koje su suštinske za in vivo proteolitičku obradu primarnog translacionog proizvoda u dva polipeptidna lanca, kako je obelodanjeno u WO 91/09122, ili je FVIII polipeptid sa delecijom B-domena konstruisan sa delecijom aminokiselina 747-1638, tj. virtuelno potpunom delecijom B-domena. Hoeben R.C., et al. J. Biol. Chem. 265 (13): 7318-7323 (1990). Polipeptid faktora VIII sa delecijom B-domena takođe može sadržati deleciju aminokiselina 771-1666 ili aminokiselina 868-1562 FVIII. Meulien P., et al. Protein Eng.2(4): 301-6 (1988). Dodatne delecije B domena uključuju: deleciju aminokiselina 982 do 1562 ili 760 do 1639 (Toole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1986) 83, 5939-5942)), 797 do 1562 (Eaton, et al. Biochemistry (1986) 25:8343-8347)), 741 do 1646 (Kaufman (PCT objavljena prijava br. WO 87/04187)), 747-1560 (Sarver, et al., DNA (1987) 6:553-564)), 741 do 1648 (Pasek (PCT prijava br.88/00831)) ili 816 do 1598 odnosno 741 do 1648 (Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988) No 82:16-25, EP 295597)). Opciono, FVIII polipeptid sa delecijom B-domena obuhvata deleciju aminokiselinskih ostataka 746 do 1648 zrelog FVIII (što odgovara deleciji od 765 do 1665 FVIII pune dužine), ili deleciju aminokiselinskih ostataka 745 do 1648 zrelog FVIII (što odgovara deleciji od 764 do 1665 FVIII pune dužine).

[0139] Opciono, BDD FVIII uključuje FVIII polipeptid koji sadrži fragmente B-domena koji zadržavaju jedno ili više mesta N-vezane glikozilacije, npr. ostatke 757, 784, 828, 900, 963, ili opciono 943, koji odgovaraju aminokiselinskoj sekvenci FVIII pune dužine. Primeri fragmenata B-domena uključuju 226 aminokiselina ili 163 aminokiseline B-domena kako je obelodanjeno u Miao, H.Z., et al., Blood 103(a): 3412-3419 (2004), Kasuda, A, et al., J. Thromb. Haemost. 6: 1352-1359 (2008), i Pipe, S.W., et al., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011) (tj. zadržano je prvih 226 aminokiselina ili 163 aminokiseline B domena). Opciono, BDD FVIII dalje obuhvata tačkastu mutaciju na ostatku 309 (iz Phe u Ser) radi poboljšanja ekspresije BDD FVIII polipeptida. Videti Miao, H.Z., et al., Blood 103(a) 3412-3419 (2004). Opciono, BDD FVIII uključuje FVIII polipeptid koji sadrži deo B-domena, ali ne sadrži jedno ili više mesta cepanja furina (npr. Arg1313 i Arg 1648). Videti Pipe, S.W., et al., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011). Opciono, BDD FVIII obuhvata jednolančani FVIII koji sadrži deleciju u aminokiselinama 765 do 1652 koje odgovaraju zrelom FVIII pune dužine (takođe poznatom kao rFVIII-SingleChain i AFSTYLA<®>). Videti američki patent br.

7,041,635. Svaka od prethodnih delecija može se izvršiti u bilo kojoj FVIII sekvenci.

[0140] Opciono, FVIII se cepa odmah nakon arginina na aminokiselini 1648 (u FVIII pune dužine ili SEQ ID NO: 65), aminokiselini 754 (u S743/Q1638 faktoru VIII sa delecijom B-domena ili SEQ ID NO: 67), ili odgovarajućem argininskom ostatku (u drugim varijantama), što rezultira teškim i lakim lancem. Opciono, FVIII polipeptid obuhvata teški i laki lanac, koji su povezani ili pridruženi metalnim jonom posredovanom nekovalentnom vezom.

[0141] Opciono, FVIII je jednolančani FVIII koji nije bio cepan odmah nakon arginina na aminokiselini 1648 (u FVIII pune dužine ili SEQ ID NO: 65), aminokiselini 754 (u S743/Q1638 faktoru VIII sa delecijom B-domena ili SEQ ID NO: 67), ili odgovarajućem argininskom ostatku (u drugim varijantama). Jednolančani FVIII može obuhvatati jednu ili više aminokiselinskih supstitucija. Opciono, aminokiselinska supstitucija je na ostatku koji odgovara ostatku 1648, ostatku 1645, ili oba zrelog polipeptida faktora VIII pune dužine (SEQ ID NO: 65) ili ostatku 754, ostatku 751, ili oba SQ BDD faktora VIII (SEQ ID NO: 67). Aminokiselinska supstitucija može biti bilo koja aminokiselina osim arginina, npr. izoleucin, leucin, lizin, metionin, fenilalanin, treonin, triptofan, valin, alanin, asparagin, asparaginska kiselina, cistein, glutaminska kiselina, glutamin, glicin, prolin, selenocistein, serin, tirozin, histidin, ornitin, pirolizin ili taurin.

[0142] FVIII se dalje može cepati trombinom i zatim aktivirati kao FVllla, služeći kao kofaktor za aktivirani faktor IX (FIXa). Aktivirani FIX zajedno sa aktiviranim FVIII formira Xase kompleks i konvertuje faktor X u aktivirani faktor X (FXa). Za aktivaciju, FVIII se cepa trombinom nakon tri argininska ostatka, na aminokiselinama 372, 740 i 1689 (što odgovara aminokiselinama 372, 740 i 795 u sekvenci FVIII sa delecijom B-domena), cepanje generiše FVllla koji ima lance 50kDa A1, 43kDa A2 i 73kDa A3-C1-C2. Opciono, FVIII polipeptid je neaktivni FVIII ili aktivirani FVIII.

[0143] Protein koji sadrži FVIII polipeptid povezan sa ili pridružen VWF proteinu ima FVIII aktivnost zgrušavanja, npr. aktiviranje faktora IX kao kofaktora za konverziju faktora X u aktivirani faktor X (FXa).

[0144] „Hibridni“ ili „himerni“ polipeptidi i proteini, kako se ovde koristi, uključuju kombinaciju prvog polipeptida i drugog polipeptida. Opciono, hibridni ili himerni polipeptid obuhvata jednolančani polipeptidni lanac, npr. himerni polipeptid koji obuhvata FVIII polipeptid i XTEN. Videti, npr. US 2015/0158929 A1. Opciono, hibridni ili himerni polipeptid obuhvata kombinaciju prvog polipeptidnog lanca, npr. VWF fragment fuzionisan sa XTEN sekvencom i prvim Ig konstantnim regionom ili delom njega, sa drugim polipeptidnim lancem, npr. FVIII polipeptid fuzionisan sa drugim Ig konstantnim regionom ili delom njega, čime se formira heterodimer. Videti, npr. US 2015/0266943 A1, US 2016/0251408 A1, US 2017/0073393 A1..

[0145] Prema ovom pronalasku, rFVIIIFc-VWF-XTEN obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 207.

[0146] Dalje polipeptidne sekvence koje se odnose na FVIII proteine himernih polipeptida obelodanjenih ovde navedene su u tabelama 18-19.

[0147] Poznato je mnogo funkcionalnih FVIII varijanti, kao što je gore i dole diskutovano. Pored toga, stotine nefunkcionalnih mutacija u FVIII identifikovane su kod pacijenata sa hemofilijom, i utvrđeno je da je efekat ovih mutacija na funkciju FVIII više posledica njihovog položaja unutar trodimenzionalne strukture FVIII nego prirode supstitucije (Cutler et al., Hum. Mutat. 19:274-8 (2002)). Pored toga, poređenja između FVIII kod ljudi i drugih vrsta identifikovala su konzervirane ostatke koji su verovatno neophodni za funkciju (Cameron et al., Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998); US 6,251,632).

III.B. Fragmenti Fon Vilebrandovog faktora (VWF)

[0148] VWF (takođe poznat kao F8VWF) je veliki multimerni glikoprotein prisutan u krvnoj plazmi i konstitutivno se proizvodi u endotelu (u Vajbel-Paladeovim telima), megakariocitima (α-granule trombocita) i subendotelijalnom vezivnom tkivu. Osnovni VWF monomer je protein od 2813 aminokiselina. Svaki monomer sadrži niz specifičnih domena sa specifičnom funkcijom: D'/D3 domen (koji se vezuje za faktor VIII), A1 domen (koji se vezuje za trombocitni GPlb-receptor, heparin i/ili eventualno kolagen), A3 domen (koji se vezuje za kolagen), C1 domen (u kome se RGD domen vezuje za trombocitni integrin αIIbβ3 kada je aktiviran), i „cisteinski čvor„ domen na C-terminalnom kraju proteina (koji VWF deli sa faktorom rasta izvedenim iz trombocita (PDGF), transformišućim faktorom rasta-β (TGFβ) i β-humanim horionskim gonadotropinom (βHCG)).

[0149] Termin „VWF fragment“ kako se ovde koristi, uključuje, ali nije ograničen na, funkcionalne VWF fragmente koji obuhvataju D' domen i D3 domen, koji su sposobni da inhibiraju vezivanje endogenog VWF za FVIII. Opciono, VWF fragment se vezuje za FVIII protein ili blokira mesto vezivanja VWF na FVIII proteinu, čime inhibira interakciju FVIII proteina sa endogenim VWF. Opciono, VWF fragment blokira vezivanje FVIII za endogeni VWF, čime sprečava klirens FVIII proteina putem puta klirensa VWF. VWF fragmenti uključuju derivate, varijante, mutante ili analoge koji zadržavaju ove aktivnosti VWF.

[0150] Sekvenca monomera od 2813 aminokiselina za humani VWF prijavljena je kao pristupni broj NP000543.2 u Genbanku. Nukleotidna sekvenca koja kodira humani VWF prijavljena je kao pristupni broj NM000552.3 u Genbanku. Nukleotidna sekvenca humanog VWF označena je kao SEQ ID NO: 20. SEQ ID NO: 21 je aminokiselinska sekvenca VWF pune dužine. Svaki domen VWF je naveden u tabeli 6.

TABELA 6. VWF sekvence (humane)

[0151] VWF protein, kako se ovde koristi, je VWF fragment koji obuhvata D' domen i D3 domen VWF, pri čemu se VWF fragment vezuje za faktor VIII (FVIII) i inhibira vezivanje endogenog VWF (VWF pune dužine) za FVIII.

[0152] VWF fragment koji obuhvata D' domen i D3 domen je povezan sa FVIII proteinom. Videti, npr. US 2015/0023959 A1, US 2015/0266943 A1, US 2016/0251408 A1, US 2017/0073393 A1, US 2018/185455 A1, US 2018/0051067 A1, US 2017/0152300 A1, US 9,878,017 B2, US 9,458,223 B2, US 8,575,104 B2, WO 2017/117630 A1, US 2018/0161402 A1, WO 2017/117631 A1, WO 2018/087271 A1, US 9,107,902 B2, WO 2017/222337 A1, WO 2015/185758 A1. Povezivanjem sa FVIII proteinom, VWF fragment iz obelodanjivanja štiti FVIII od cepanja proteazama i aktivacije FVIII, stabilizuje teški i laki lanac FVIII, i sprečava klirens FVIII putem receptora čistača. U drugim otelotvorenjima, VWF fragment se vezuje za ili je povezan sa FVIII proteinom i blokira ili sprečava vezivanje FVIII proteina za fosfolipid i aktivirani protein C. Sprečavanjem ili inhibiranjem vezivanja FVIII proteina sa endogenim, VWF pune dužine, VWF fragment iz obelodanjivanja smanjuje klirens FVIII putem VWF receptora za klirens i na taj način produžava poluživot himernog polipeptida. Produženje poluživota himernog polipeptida je stoga posledica vezivanja ili povezivanja VWF fragmenta (kojem nedostaje mesto vezivanja VWF receptora za klirens) sa FVIII proteinom i zaštite FVIII proteina od endogenog VWF koji sadrži mesto vezivanja VWF receptora za klirens. FVIII protein vezan za ili zaštićen VWF fragmentom takođe može omogućiti recikliranje FVIII proteina. Eliminacijom mesta vezivanja receptora puta klirensa VWF sadržanih u molekulu VWF pune dužine, FVIII/VWF heterodimeri iz obelodanjivanja su zaštićeni od puta klirensa VWF, čime se dodatno produžava poluživot FVIII.

[0153] VWF proteini korisni za obelodanjivanje mogu imati i druge modifikacije, npr. protein može biti pegilovan, glikozilovan, hesilovan ili polisijalilovan.

[0154] Himerni polipeptid iz pronalaska obuhvata VWF protein koji obuhvata VWF fragment, XTEN sekvencu, a2 linker FVIII i Fc region. VWF protein obuhvata, po redosledu od N-terminala do C-terminala, VWF fragment, fuzionisan sa XTEN sekvencom, fuzionisan sa a2 linkerom, fuzionisan sa Fc regionom. VWF protein obuhvata D' domen VWF koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 210, D3 domen VWF koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 214, XTEN sekvencu koja obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 58 (AE144_5A), a2 linker koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 88, i Fc region koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 217.

[0155] Prema ovom pronalasku, himerni polipeptid je rFVIIIFc-VWF-XTEN i obuhvata VWF protein koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 202.

[0156] Dodatne primarne sekvence polipeptida VWF proteina navedene su u tabelama 18-19.

III.C. Komponente za produžavanje poluživota

[0157] Himerni polipeptid u skladu sa ovim pronalaskom obuhvata komponente za produžavanje poluživota u obliku Fc regiona i XTEN sekvenci.

III.C.1. Konstantni region Ig ili njegov deo

[0158] Himerni polipeptid uključuje prvi konstantni region Ig fuzionisan sa FVIII polipeptidom pomoću linkera. Himerni polipeptid dalje uključuje drugi konstantni region Ig fuzionisan sa VWF proteinom. U posebnim otelotvorenjima, prvi konstantni region Ig je povezan sa ili pridružen drugom konstantnom regionu Ig kovalentnom vezom, npr. disulfidnom vezom.

[0159] Konstantni region Ig može poboljšati farmakokinetička ili farmakodinamička svojstva himernog polipeptida u kombinaciji sa XTEN sekvencom i VWF proteinom. U određenim otelotvorenjima, konstantni region Ig produžava poluživot molekula fuzionisanog sa konstantnim regionom Ig.

[0160] Konstantni region Ig se sastoji od domena označenih kao CH (konstantni teški) domeni (CH1, CH2, itd.). U zavisnosti od izotipa (tj. IgG, IgM, IgA, IgD ili IgE), konstantni region može biti sastavljen od tri ili četiri CH domena. Neki izotipi (npr. IgG) konstantni regioni takođe sadrže i regiju šarki. Videti Janeway et al. 2001, Immunobiology, Garland Publishing, N.Y., N.Y.

[0161] Konstantni region Ig za proizvodnju himernog polipeptida ovog obelodanjivanja je humani izotip IgG1.

[0162] Sekvence konstantnog regiona Ig mogu se klonirati, npr. korišćenjem lančane reakcije polimeraze i prajmera koji su odabrani za amplifikaciju željenog domena. Za kloniranje sekvence konstantnog regiona Ig iz antitela, mRNK se može izolovati iz hibridoma, slezine ili limfocitnih ćelija, reverzno transkribovati u DNK, a geni antitela se potom amplifikuju pomoću PCR metode. PMetode PCR amplifikacije detaljno su opisane u američkim patentima br.

4,683,195; 4,683,202; 4,800,159; 4,965,188; i u, npr. "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications" Innis et al. eds., Academic Press, San Diego, CA (1990); Ho et al. 1989. Gene 77:51; Horton et al. 1993. Methods Enzymol. 217:270). PCR može biti iniciran konsenzusnim prajmerima konstantnog regiona ili specifičnijim prajmerima zasnovanim na objavljenim DNK i aminokiselinskim sekvencama teških i lakih lanaca. Kao što je gore diskutovano, PCR se takođe može koristiti za izolovanje DNK klonova koji kodiraju lake i teške lance antitela. U ovom slučaju biblioteke se mogu skriningovati konsenzusnim prajmerima ili većim homolognim sondama, kao što su sonde mišjeg konstantnog regiona. Brojni setovi prajmera pogodni za amplifikaciju gena antitela poznati su u struci (npr. 5' prajmeri zasnovani na N-terminalnoj sekvenci prečišćenih antitela (Benhar and Pastan. 1994. Protein Engineering 7:1509); brza amplifikacija krajeva cDNK (Ruberti, F. et al. 1994. J. Immunol. Methods 173:33); sekvence lider antitela (Larrick et al. 1989 Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:1250)). Kloniranje sekvenci antitela je dalje opisano u Newman et al., američkom patentu br.5,658,570, podnetom 25. januara 1995.

[0163] Kao što se ovde koristi, termin „Fc region“ je definisan kao deo polipeptida koji odgovara Fc regionu nativnog Ig, tj. kako je formiran dimernom asocijacijom odgovarajućih Fc domena njegova dva teška lanca. Nativni Fc region formira homodimer sa drugim Fc regionom. Nasuprot tome, termin „genetski fuzionisan Fc region“ ili „jednolančani Fc region“ (scFc region), kako se ovde koristi, odnosi se na sintetički dimerni Fc region sastavljen od Fc domena genetski povezanih unutar jednog polipeptidnog lanca (tj. kodiranih u jednoj neprekidnoj genetskoj sekvenci).

[0164] Fc region konstantnog regiona Ig, u zavisnosti od Ig izotipa, može uključivati CH2, CH3 i CH4 domene, kao i regiju šarki. Himerni polipeptidi koji obuhvataju Fc region Ig daju himernom polipeptidu nekoliko poželjnih svojstava, uključujući povećanu stabilnost, produženi serumski poluživot (videti Capon et al., 1989, Nature 337:525), kao i vezivanje za receptore Fc kao što je neonatalni Fc receptor (FcRn) (američki patenti br. 6,086,875, 6,485,726, 6,030,613; WO 03/077834; US2003-0235536A1). Fc region prema ovom pronalasku obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 217.

[0165] Konstantni region Ig ili njegov deo može biti partner za vezivanje FcRn. FcRn je aktivan u odraslim epitelnim tkivima i izražen je u lumenu creva, plućnim disajnim putevima, nosnim površinama, vaginalnim površinama, površinama debelog creva i rektuma (američki patent br.6,485,726). FcRn partner za vezivanje je deo Ig koji se vezuje za FcRn. Drugi primer FcRn partnera za vezivanje je albumin, detaljnije opisan u nastavku.

[0166] FcRn receptor je izolovan iz nekoliko vrsta sisara, uključujući ljude. Sekvence humanog FcRn, majmunskog FcRn, pacovskog FcRn i mišjeg FcRn su poznate (Story et al.

1994, J. Exp. Med. 180:2377). FcRn receptor vezuje IgG (ali ne i druge klase Ig kao što su IgA, IgM, IgD i IgE) pri relativno niskom pH, aktivno transportuje IgG transcelularno u luminalnom ka seroznom pravcu, a zatim oslobađa IgG pri relativno višem pH koji se nalazi u intersticijalnim fluidima. Izražen je u odraslom epitelnom tkivu (američki patentni br.

6,485,726, 6,030,613, 6,086,875; WO 03/077834; US2003-0235536A1) uključujući epitel pluća i creva (Israel et al. 1997, Immunology 92:69) epitel proksimalnih bubrežnih tubula (Kobayashi et al. 2002, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282:F358), , kao i nazalni epitel, vaginalne površine i površine žučnog stabla.

[0167] FcRn partneri za vezivanje korisni u ovom obelodanjivanju obuhvataju molekule koji se mogu specifično vezati za FcRn receptor, uključujući ceo IgG, Fc fragment IgG i druge fragmente koji uključuju kompletan vezujući region FcRn receptora. Region Fc dela IgG koji se vezuje za FcRn receptor opisan je na osnovu rendgenske kristalografije (Burmeister et al.

1994, Nature 372:379). Glavna kontaktna površina Fc sa FcRn je blizu spoja CH2 i CH3 domena. Fc-FcRn kontakti su svi unutar jednog teškog lanca Ig. FcRn partneri za vezivanje uključuju ceo IgG, Fc fragment IgG i druge fragmente IgG koji uključuju kompletan vezujući region FcRn. Glavna kontaktna mesta uključuju aminokiselinske ostatke 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 i 314 CH2 domena i aminokiselinske ostatke 385-387, 428 i 433-436 CH3 domena. Referenciranje aminokiselinskih numerisanja Ig ili Ig fragmenata, ili regiona, zasnovano je na Kabat et al.1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md.

[0168] Fc regioni ili FcRn partneri za vezivanje vezani za FcRn mogu se efikasno transportovati preko epitelnih barijera putem FcRn, čime se obezbeđuje neinvazivni način sistemske primene željenog terapeutskog molekula. Pored toga, fuzioni proteini koji obuhvataju Fc region ili FcRn partner za vezivanje se endocituju ćelijama koje eksprimiraju FcRn. Ali umesto da budu označeni za degradaciju, ovi fuzioni proteini se ponovo recikliraju u cirkulaciju, čime se povećava in vivo poluživot ovih proteina. Delovi konstantnih regiona Ig su opciono Fc region ili FcRn partner za vezivanje koji se tipično povezuje, putem disulfidnih veza i drugih nespecifičnih interakcija, sa drugim Fc regionom ili drugim FcRn partnerom za vezivanje kako bi formirali dimere i multimere višeg reda.

[0169] Dva FcRn receptora mogu vezati jedan Fc molekul. Kristalografski podaci sugerišu da svaki FcRn molekul vezuje jedan polipeptid Fc homodimera. Vezivanje FcRn partnera za vezivanje, npr. Fc fragmenta IgG, za biološki aktivan molekul obezbeđuje sredstvo za oralnu, bukalnu, sublingvalnu, rektalnu, vaginalnu, nazalnu ili plućnu primenu biološki aktivnog molekula kao aerosola, ili putem očiju.

[0170] FcRn vezujući partnerski region je molekul ili njegov deo koji se može specifično vezati za FcRn receptor sa posledičnim aktivnim transportom Fc regiona putem FcRn receptora. Specifično vezan odnosi se na dva molekula koji formiraju kompleks koji je relativno stabilan pod fiziološkim uslovima. Specifično vezivanje karakteriše visoki afinitet i nizak do umeren kapacitet, za razliku od nespecifičnog vezivanja koje obično ima nizak afinitet sa umerenim do visokim kapacitetom. Tipično, vezivanje se smatra specifičnim kada je konstanta afiniteta KA veća od 10<6>M<-1>, ili veća od 10<8>M<-1>. Ako je potrebno, nespecifično vezivanje se može smanjiti bez značajnog uticaja na specifično vezivanje variranjem uslova vezivanja. Odgovarajući uslovi vezivanja, kao što su koncentracija molekula, jonska snaga rastvora, temperatura, vreme dozvoljeno za vezivanje, koncentracija blokirajućeg agensa (npr. serumski albumin, mlečni kazein), itd. mogu se optimizovati od strane stručnjaka koristeći rutinske tehnike.

[0171] Opciono, imunoglobulinski konstantni region ili njegov deo obuhvata aminokiselinsku sekvencu u regiji šarki ili njen deo koji formira jednu ili više disulfidnih veza sa drugim imunoglobulinskim konstantnim regionom ili njegovim delom. Disulfidna veza imunoglobulinskog konstantnog regiona ili njegovog dela postavlja prvi polipeptid koji obuhvata FVIII polipeptid i drugi polipeptid koji obuhvata VWF fragment zajedno, tako da endogeni VWF ne zamenjuje VWF fragment i ne vezuje se za FVIII polipeptid. Stoga, disulfidna veza između prvog imunoglobulinskog konstantnog regiona ili njegovog dela i drugog imunoglobulinskog konstantnog regiona ili njegovog dela sprečava interakciju između endogenog VWF i FVIII polipeptida. Ova inhibicija interakcije između VWF i FVIII polipeptida omogućava poluživotu himernog polipeptida da pređe dvostruko ograničenje. Regija šarki ili njen deo se dalje može povezati sa jednim ili više domena CH1, CH2, CH3, fragmentom toga, i bilo kojim kombinacijama toga. U posebnom otelotvorenju, imunoglobulinski konstantni region ili njegov deo je regija šarki i CH2.

[0172] U određenim otelotvorenjima, konstantni region Ig ili njegov deo je hemi-glikozilovan. Na primer, himerni polipeptid koji obuhvata dva Fc regiona ili FcRn partnere za vezivanje može sadržati prvi, glikozilovani, Fc region (npr. glikozilovani CH2 region) ili FcRn partner za vezivanje i drugi, aglikozilovani, Fc region (npr. aglikozilovani CH2 region) ili FcRn partner za vezivanje. U drugim otelotvorenjima, Fc region ili FcRn partner za vezivanje je potpuno glikozilovan, tj. svi Fc regioni su glikozilovani. U drugim otelotvorenjima, Fc region može biti aglikozilovan, tj. nijedna od Fc komponenti nije glikozilovana.

III.C.2. XTEN sekvence

[0173] Kao što se ovde koristi, „XTEN sekvenca“ se odnosi na polipeptide produžene dužine sa neprirodnim, suštinski neponavljajućim sekvencama koje su uglavnom sastavljene od malih hidrofilnih aminokiselina, pri čemu sekvenca ima nizak stepen ili nikakvu sekundarnu ili tercijarnu strukturu pod fiziološkim uslovima. Kao himerni polipeptidni partner, XTEN mogu služiti kao nosač, dajući određena poželjna farmakokinetička, fizičko-hemijska i farmaceutska svojstva kada su povezani sa VWF proteinom ili FVIII sekvencom iz obelodanjivanja kako bi se stvorio himerni polipeptid. Takva poželjna svojstva uključuju, ali nisu ograničena na, poboljšane farmakokinetičke parametre i karakteristike rastvorljivosti. Kao što se ovde koristi, „XTEN“ izričito isključuje antitela ili fragmente antitela kao što su jednolančana antitela ili Fc fragmenti lakog lanca ili teškog lanca.

[0174] Kraća XTEN sekvenca pruža poboljšano svojstvo produžavanja poluživota u poređenju sa dužom XTEN sekvencom kada je XTEN sekvenca fuzionisana sa VWF proteinom. Stoga, XTEN sekvenca fuzionisana sa VWF proteinom sadrži manje od 288 aminokiselina u dužini, tj. kraća je od 288 aminokiselina. XTEN sekvenca fuzionisana sa VWF proteinom je aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 58, a himerni polipeptid pokazuje poboljšan poluživot u poređenju sa himernim polipeptidom bez XTEN sekvence.

[0175] Himerni polipeptid iz obelodanjivanja dalje obuhvata dodatnu drugu XTEN sekvencu. Dodatna druga XTEN sekvenca je fuzionisana sa FVIII polipeptidom. Dodatna XTEN sekvenca je kao što je navedeno u SEQ ID NO: 218.

[0176] XTEN sekvence obuhvataju nepreklapajuće sekvencne motive koji se sastoje od više jedinica nepreklapajućih sekvenci izabranih iz jedne familije motiva izabrane iz tabele 7, što rezultira familijarnom sekvencom. Kao što se ovde koristi, „familija“ znači da XTEN ima motive izabrane samo iz jedne kategorije motiva iz tabele 7; tj. AD, AE, AF, AG, AM, AQ, BC, ili BD XTEN, i da su sve druge aminokiseline u XTEN koje ne pripadaju motivu iz familije izabrane da bi se postiglo potrebno svojstvo, kao što je dozvola za ugradnju restrikcionog mesta kodirajućim nukleotidima, ugradnja sekvence cepanja, ili postizanje bolje veze sa FVIII ili VWF. XTEN obuhvata više jedinica motivnih sekvenci iz dve ili više familija motiva iz tabele 7. Ove sekvence mogu biti odabrane kako bi se postigle željene fizičko-hemijske karakteristike, uključujući svojstva kao što su neto naelektrisanje, hidrofilnost, nedostatak sekundarne strukture ili nedostatak ponavljanja, koja su uslovljena aminokiselinskim sastavom motiva, a detaljnije su opisana u nastavku. Motivi ugrađeni u XTEN mogu biti odabrani i sastavljeni korišćenjem ovde opisanih metoda kako bi se postigao XTEN od približno 36 do približno 3000 aminokiselinskih ostataka.

Tabela 7. XTEN sekvencni motivi od 12 aminokiselina i familije motiva

[0177] Aminokiselinske sekvence za određene primere XTEN sekvenci prikazane su u tabeli 8.

TABELA 8. XTEN sekvence

[0178] Opciono, XTEN sekvenca korišćena u obelodanjivanju utiče na fizičko ili hemijsko svojstvo, npr. farmakokinetiku, himernog polipeptida ovog obelodanjivanja. XTEN sekvenca korišćena u ovom obelodanjivanju može pokazivati jedno ili više sledećih povoljnih svojstava: konformacionu fleksibilnost, povećanu rastvorljivost u vodi, visok stepen otpornosti na proteaze, nisku imunogeničnost, nisko vezivanje za receptore sisara, ili povećan hidrodinamički (ili Stoksov) radijus. Opciono, XTEN sekvenca povezana sa FVIII proteinom u ovom obelodanjivanju povećava farmakokinetička svojstva kao što su duži terminalni poluživot ili povećana površina ispod krive (AUC), tako da himerni polipeptid opisan ovde ostaje in vivo duže vreme u poređenju sa FVIII divljeg tipa. Opciono, XTEN sekvenca korišćena u ovom obelodanjivanju povećava farmakokinetička svojstva kao što su duži terminalni poluživot ili povećana površina ispod krive (AUC), tako da FVIII protein ostaje in vivo duže vreme u poređenju sa FVIII divljeg tipa.

[0179] Različite metode i testovi mogu se koristiti za određivanje fizičko-hemijskih svojstava proteina koji sadrže XTEN sekvencu. Takve metode uključuju, ali nisu ograničene na analitičku centrifugaciju, EPR, HPLC-jonsku razmenu, HPLC-ekskluziju po veličini, HPLC-reverznu fazu, rasejanje svetlosti, kapilarnu elektroforezu, cirkularni dihroizam, diferencijalnu skenirajuću kalorimetriju, fluorescenciju, IR, NMR, Ramansku spektroskopiju, refraktometriju i UV/vidljivu spektroskopiju. Dodatne metode su obelodanjene u Amau et al., Prot Expr and Purif 48, 1-13 (2006).

[0180] Dodatni primeri XTEN sekvenci obelodanjeni su u američkim publikacijama patenata br. 2010/0239554 A1, 2010/0323956 A1, 2011/0046060 A1, 2011/0046061 A1, 2011/0077199 A1, ili 2011/0172146 A1, ili u međunarodnim publikacijama patenata br. WO 2010091122 A1, WO 2010144502 A2, WO 2010144508 A1, WO 2011028228 A1, WO 2011028229 A1, WO 2011028344 A2, ili WO 20130122617 A1.

III.C.2. Albumini

[0181] Albumin ili njegov deo može biti partner za vezivanje FcRn. U određenim aspektima, himerni polipeptid korišćen u kontekstu ovog obelodanjivanja obuhvata najmanje jedan polipeptid albumina ili njegov fragment, varijantu ili derivat. Humani serumski albumin (HSA, ili HA), protein od 609 aminokiselina u svom obliku pune dužine, odgovoran je za značajan deo osmotskog pritiska seruma i takođe funkcioniše kao nosač endogenih i egzogenih liganda. Termin „albumin“, kako se ovde koristi, uključuje albumin pune dužine ili njegov funkcionalni fragment, varijantu, derivat ili analog. Primeri albumina ili njegovih fragmenata ili varijanti su obelodanjeni u američkim publikacijama patenata br. 2008/0194481A1, 2008/0004206 A1, 2008/0161243 A1, 2008/0261877 A1 ili 2008/0153751 A1 ili PCT publikacijama prijava br.

2008/033413 A2, 2009/058322 A1 ili 2007/021494 A2.

[0182] Polipeptidi koji vezuju albumin (ABP) mogu obuhvatati, bez ograničenja, bakterijske domene za vezivanje albumina, peptide koji vezuju albumin, ili fragmente antitela koji vezuju albumin. Domen 3 iz streptokoknog proteina G, kao što su obelodanili Kraulis et al., FEBS Lett. 378:190-194 (1996) i Linhult et al., Protein Sci.11:206-213 (2002), je primer bakterijskog domena za vezivanje albumina. Primeri peptida koji vezuju albumin su obelodanjeni u Dennis et al., J. Biol. Chem. 2002, 277: 35035-35043 (2002). Primeri fragmenata antitela koji vezuju albumin su obelodanjeni u Muller and Kontermann, Curr. Opin. Mol. Ther.9:319-326 (2007); Roovers et al., Cancer Immunol. Immunother. 56:303-317 (2007), i Holt et al., Prot. Eng. Design Sci., 21:283-288 (2008).

[0183] U određenim aspektima, himerni polipeptid korišćen u kontekstu ovog obelodanjivanja obuhvata najmanje jedno mesto vezivanja za nepolipeptidni mali molekul, varijantu ili derivat koji se može vezati za albumin. Na primer, himerni polipeptid može uključivati jednu ili više organskih komponenti za vezivanje albumina. Primer takvih komponenti za vezivanje albumina je 2-(3-maleimidopropanamido)-6-(4-(4jodofenil)butanamido)heksanoat („Albu“ oznaka) kao što su obelodanili Trussel et al., Bioconjugate Chem. 20:2286-2292 (2009).

[0184] U određenim otelotvorenjima, VWF fragment opisan ovde je fuzionisan sa albuminom. U nekim otelotvorenjima, konstrukti VWF fragment-albumin formiraju homodimere. U nekim otelotvorenjima, D'D3 domen VWF koji je fuzionisan sa albuminom povezuje se sa FVIII polipeptidom. U određenim otelotvorenjima, D'D3 domen VWF fuzionisan sa albuminom povezan je sa FVIII polipeptidom interakcijom jačom od prirodnih nekovalentnih interakcija između FVIII divljeg tipa i VWF.

III.C.3. CTP

[0185] U određenim aspektima, himerni polipeptid korišćen u kontekstu ovog obelodanjivanja obuhvata najmanje jedan C-terminalni peptid (CTP) β podjedinice humanog horionskog gonadotropina, ili njegov fragment, varijantu ili derivat. Poznato je da CTP peptidi produžavaju poluživot tog proteina. Videti, npr. američki patent br. 5,712,122. Neograničavajući primeri CTP peptida obelodanjeni su u američkoj publikaciji patentne prijave br. US 2009/0087411 A1.

III.C.4. PAS

[0186] U određenim aspektima, himerni polipeptid korišćen u kontekstu ovog obelodanjivanja obuhvata najmanje jedan PAS peptid ili njegov fragment, varijantu ili derivat. PAS peptid ili PAS sekvenca, kako je ovde upotrebljeno, označava aminokiselinsku sekvencu koja se sastoji uglavnom od ostataka alanina i serina, ili se sastoji uglavnom od ostataka alanina, serina i prolina, pri čemu aminokiselinska sekvenca formira konformaciju slučajne zavojnice pod fiziološkim uslovima. Shodno tome, PAS sekvenca je gradivni blok, aminokiselinski polimer ili sekvencna kaseta koja obuhvata, u suštini se sastoji od, ili se sastoji od alanina, serina i prolina, a koja se može koristiti kao deo heterologne komponente u himernom polipeptidu. Aminokiselinski polimer takođe može formirati konformaciju slučajne zavojnice kada se drugi ostaci osim alanina, serina i prolina dodaju kao manja komponenta u PAS sekvencu. Pod „manjim konstituentom“ podrazumeva se da se aminokiseline različite od alanina, serina i prolina mogu dodati u PAS sekvencu do određenog stepena, npr. do oko 12%, tj. oko 12 od 100 aminokiselina PAS sekvence, do oko 10%, do oko 9%, do oko 8%, oko 6%, oko 5%, oko 4%, oko 3%, tj. oko 2%, ili oko 1% aminokiselina. Aminokiseline različite od alanina, serina i prolina mogu biti odabrane iz grupe koja se sastoji od Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Tyr i Val. Pod fiziološkim uslovima, PAS peptid formira konformaciju slučajne zavojnice i na taj način može posredovati u povećanoj in vivo i/ili in vitro stabilnosti rekombinantnog proteina iz obelodanjivanja, i ima prokoagulantnu aktivnost.

[0187] Neograničavajući primeri PAS peptida su obelodanjeni u npr. američkoj publikaciji patenta br.2010/0292130 A1; PCT publikaciji prijave br. WO 2008/155134 A1; i evropskom izdatom patentu EP2173890.

III.C.5. HAP

[0188] U određenim aspektima, himerni polipeptid korišćen u kontekstu ovog obelodanjivanja obuhvata najmanje jedan homo-aminokiselinski polimer (HAP) peptid ili njegov fragment, varijantu ili derivat. HAP peptid može obuhvatati ponavljajuću sekvencu glicina, koja ima najmanje 50 aminokiselina, najmanje 100 aminokiselina, 120 aminokiselina, 140 aminokiselina, 160 aminokiselina, 180 aminokiselina, 200 aminokiselina, 250 aminokiselina, 300 aminokiselina, 350 aminokiselina, 400 aminokiselina, 450 aminokiselina ili 500 aminokiselina u dužini. HAP sekvenca je sposobna da produži poluživot komponente fuzionisane sa ili povezane sa HAP sekvencom. Neograničavajući primeri HAP sekvenci uključuju, ali nisu ograničeni na (Gly)n, (Gly4Ser)n ili s(Gly4Ser)n, gde je n 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20. U nekim otelotvorenjima, n je 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ili 40. U drugim otelotvorenjima, n je 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, ili 200. videti, npr. Schlapschy M et al., Protein Eng. Design Selection, 20: 273-284 (2007).

III.C.6. Transferin

[0189] U određenim aspektima, himerni polipeptid korišćen u kontekstu ovog obelodanjivanja obuhvata najmanje jedan transferin peptid ili njegov fragment, varijantu ili derivat. Bilo koji transferin može se fuzionisati sa himernim polipeptidom korišćenim u metodama ovog obelodanjivanja. Kao primer, transferin humanog divljeg tipa (Tf) je protein od 679 aminokiselina, približno 75 kDa (bez glikozilacije), sa dva glavna domena, N (oko 330 aminokiselina) i C (oko 340 aminokiselina), koji izgleda da potiču iz duplikacije gena. Videti GenBank pristupne brojeve NM001063, XM002793, M12530, XM039845, XM 039847 i S95936 (www.ncbi.nlm.nih.gov).

[0190] Transferin transportuje gvožđe putem endocitoze posredovane transferinskim receptorom (TfR). Nakon oslobađanja gvožđa u endozomski odeljak i recikliranja kompleksa Tf-TfR na ćelijsku površinu, Tf se oslobađa nazad u ekstracelularni prostor za sledeći ciklus transporta gvožđa. Tf poseduje dug poluživot koji prelazi 14-17 dana (Li et al., Trends Pharmacol. Sci. 23:206-209 (2002)). Fuzioni proteini transferina su proučavani za produžavanje poluživota, ciljanu isporuku za terapije raka, oralnu isporuku i produženu aktivaciju proinsulina (Brandsma et al., Biotechnol. Adv., 29: 230-238 (2011); Bai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:7292-7296 (2005); Kim et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 334:682-692 (2010); Wang et al., J. Controlled Release 155:386-392 (2011)).

III.C.7. PEG

[0191] U određenim aspektima, himerni polipeptid korišćen u kontekstu ovog obelodanjivanja obuhvata najmanje jedno mesto vezivanja za nepolipeptidnu heterolognu komponentu ili njen fragment, varijantu ili derivat. Na primer, himerni polipeptid korišćen u metodama ovog obelodanjivanja može uključivati jedan ili više polietilen glikol (PEG) komponenti vezanih za jedan ili više aminokiselinskih ostataka u faktoru zgrušavanja i/ili Fc regionu.

[0192] PEGilacija proteina može se odnositi na konjugat formiran između proteina i najmanje jednog molekula polietilen glikola (PEG). PEG je komercijalno dostupan u velikom broju molekulskih težina i raspona prosečnih molekulskih težina. Tipični primeri raspona prosečnih molekulskih težina PEG uključuju, ali nisu ograničeni na, oko 200, oko 300, oko 400, oko 600, oko 1000, oko 1300-1600, oko 1450, oko 2000, oko 3000, oko 3000-3750, oko 3350, oko 3000-7000, oko 3500-4500, oko 5000-7000, oko 7000-9000, oko 8000, oko 10000, oko 8500-11500, oko 16000-24000, oko 35000, oko 40000, oko 60000 i oko 80000 Daltona. Ove prosečne molekulske težine su date samo kao primeri i ni na koji način nisu ograničavajuće.

[0193] Himerni polipeptid korišćen u kontekstu ovog obelodanjivanja može biti PEGilovan tako da uključuje mono- ili poli- (npr.2-4) PEG komponente. PEGilacija se može izvesti bilo kojom od PEGilacionih reakcija poznatih u struci. Metode za pripremu PEGilovanog proteinskog proizvoda generalno će uključivati (i) reagovanje polipeptida sa polietilen glikolom (kao što je reaktivni estar ili aldehidni derivat PEG) pod uslovima pod kojima se peptid iz obelodanjivanja vezuje za jednu ili više PEG grupa; i (ii) dobijanje produkata reakcije. Generalno, optimalni uslovi reakcije za reakcije će se određivati od slučaja do slučaja na osnovu poznatih parametara i željenog rezultata.

[0194] Postoji niz metoda vezivanja PEG dostupnih stručnjacima u oblasti, na primer Malik F et al., Exp. Hematol.20:1028-35 (1992); Francis, Focus on Growth Factors 3(2):4-10 (1992); evropske publikacije patenata br. EP0401384, EP0154316 i EP0401384; i međunarodne publikacije patentnih prijava br. WO92/16221 i WO95/34326. Kao neograničavajući primer, FVIII varijante mogu sadržati cisteinske supstitucije, a cisteini se mogu dalje konjugovati sa PEG polimerom. Videti Mei et al., Blood 116:270-279 (2010) i američki patent br.7,632,921.

[0195] U određenim otelotvorenjima, himerni polipeptid obuhvata jednolančani FVIII polipeptid kovalentno povezan sa VWF fragmentom koji obuhvata D' domen i D3 domen VWF, pri čemu FVIII polipeptid obuhvata deleciju B domena, pri čemu je FVIII polipeptid pegilovan, i pri čemu je VWF fragment fuzionisan direktno ili indirektno na N-terminus FVIII polipeptida (npr. PEG-scFVIII-D'D3, „MG1121“ ili LAFATE). U drugim otelotvorenjima, himerni polipeptid obuhvata jednolančani FVIII polipeptid kovalentno povezan sa VWF fragmentom koji obuhvata D' domen i D3 domen VWF, pri čemu FVIII polipeptid obuhvata deleciju B domena, pri čemu je VWF fragment pegilovan, i pri čemu je VWF fragment fuzionisan direktno ili indirektno na N-terminus FVIII polipeptida (npr. scFVIII-D'D3-PEG). U drugim otelotvorenjima, himerni polipeptid obuhvata jednolančani FVIII polipeptid kovalentno povezan sa VWF fragmentom koji obuhvata D' domen i D3 domen VWF, pri čemu FVIII polipeptid obuhvata deleciju B domena, pri čemu su FVIII polipeptid i VWF fragment pegilovani, i pri čemu je VWF fragment fuzionisan direktno ili indirektno na N-terminus FVIII polipeptida (npr. scFVIII-D'D3-PEG).

III.C.8. HES

[0196] U određenim aspektima, himerni polipeptid korišćen u kontekstu ovog obelodanjivanja obuhvata najmanje jedan hidroksietil skrob (HES) polimer. HES je derivat prirodno prisutnog amilopektina i razgrađuje se alfa-amilazom u telu. HES pokazuje povoljna biološka svojstva i koristi se kao sredstvo za nadoknadu volumena krvi i u terapiji hemodilucije u klinikama. Videti, npr. Sommermeyer et al., Krankenhauspharmazie 8:271-278 (1987); i Weidler et al., Arzneim.-Forschung/Drug Res. 41: 494-498 (1991).

[0197] HES se uglavnom karakteriše raspodelom molekulske težine i stepenom supstitucije. HES ima prosečnu molekulsku težinu (težinsku srednju vrednost) od 1 do 300 kD, od 2 do 200 kD, od 3 do 100 kD, ili od 4 do 70 kD. Hidroksietil skrob može dalje pokazivati molarni stepen supstitucije od 0,1 do 3, od 0,1 do 2, od 0,1 do 0,9, ili od 0,1 do 0,8, i odnos između C2:C6 supstitucije u opsegu od 2 do 20 u odnosu na hidroksietil grupe. HES sa prosečnom molekulskom težinom od oko 130 kD je VOLUVEN<®>iz kompanije Fresenius. VOLUVEN<®>je veštački koloid, koji se koristi npr. za nadoknadu volumena u terapijskoj indikaciji za terapiju i profilaksu hipovolemije. Postoji niz metoda vezivanja HES dostupnih stručnjacima u oblasti npr. iste metode vezivanja PEG opisane gore.

III.C.9. PSA

[0198] U određenim aspektima, himerni polipeptid korišćen u kontekstu ovog obelodanjivanja obuhvata najmanje jedan polimer polisijalinske kiseline (PSA). PSA su prirodno prisutni nerazgranati polimeri sijalinske kiseline proizvedeni od strane određenih bakterijskih sojeva i kod sisara u određenim ćelijama. Videti, npr. Roth J. et al. (1993) u Polysialic Acid: From Microbes to Man, eds. Roth J., Rutishauser U., Troy F. A. (BirkhäuserVerlag, Basel, Switzerland), pp. 335-348. PSA se mogu proizvesti u različitim stepenima polimerizacije od n=oko 80 ili više ostataka sijalinske kiseline do n=2 ograničenom kiselom hidrolizom ili varenjem neuraminidazama, ili frakcionisanjem prirodnih, bakterijski izvedenih oblika polimera. Postoji niz metoda vezivanja PSA dostupnih stručnjacima u oblasti npr. iste metode vezivanja PEG opisane gore. U određenim aspektima, aktivirana PSA se takođe može vezati za cisteinski aminokiselinski ostatak unutar faktora zgrušavanja, npr. na FVIII, ili unutar Fc regiona. Videti, npr. američki patent br.5846951.

III.C.10. Receptori za klirens

[0199] U određenim aspektima, poluživot himernog polipeptida korišćenog u kontekstu ovog obelodanjivanja može se produžiti tako da faktor zgrušavanja himernog polipeptida obuhvata FVIII polipeptid i najmanje jedan fragment FVIII receptora za klirens ili FVIII-vezujući fragment, varijantu ili derivat. Umetanje rastvorljivih oblika receptora za klirens, kao što je receptor LRP1, protein srodan receptoru za lipoproteine niske gustine, ili njegovih fragmenata, može blokirati vezivanje FVIII za receptore za klirens i na taj način produžiti njegov poluživot, npr. in vivo poluživot. LRP1 je integralni membranski protein od 600 kDa koji je uključen u klirens različitih proteina posredovan receptorima, uključujući FVIII. Videtie, npr. Lenting et al., Haemophilia 16:6-16 (2010). Drugi odgovarajući FVIII receptori za klirens su, npr. LDLR (receptor za lipoproteine niske gustine), VLDLR (receptor za lipoproteine veoma niske gustine) i megalin (LRP-2) ili njihovi fragmenti. Videti, npr. ovenschen et al., Blood 106:906-912 (2005); Bovenschen, Blood 116:5439-5440 (2010); Martinelli et al., Blood 116:5688-5697 (2010).

III.D. Mesta insercije

[0200] Prema ovom pronalasku, XTEN je umetnut u B domen FVIII. Specifično, XTEN sekvenca koja obuhvata aminokiselinsku sekvencu AE288_3 (SEQ ID NO: 218) umetnuta je između aminokiselina 745 i 746 zrelog FVIII, pri čemu zreli FVIII ima deleciju aminokiselinskih ostataka 746-1648, tačnije, XTEN je umetnut odmah nizvodno od aminokiseline 745.

III.E. Linkeri

[0201] Himerni polipeptid ovog obelodanjivanja dalje obuhvata jedan linker u VWF fragmentu. Linker je cepajući linker, koji se može cepati različitim proteazama kada se primeni subjektu in vivo, npr. na mestu koagulacije. Cepajući linker omogućava cepanje komponente, npr. VWF proteina, od XTEN sekvence, dakle od himernog polipeptida na mestu kaskade koagulacije, čime se aktiviranom FVIII (FVllla) omogućava da ispolji svoju FVllla aktivnost.

[0202] U nekim otelotvorenjima, himerni polipeptid korišćen u kontekstu ovog pronalaska obuhvata prvi polipeptid koji obuhvata (i) FVIII polipeptid i (ii) prvi Ig konstantni region i drugi polipeptid koji obuhvata (iii) VWF protein, (iv) linker (npr. cepajući linker), (v) XTEN sekvencu i (vi) drugi Ig konstantni region.

[0203] Linker korišćen u kontekstu ovog pronalaska je a2 linker koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 88.

III.F. Mesta cepanja

[0204] Cepajući linker može uključivati komponentu sposobnu za cepanje bilo hemijski (npr. hidroliza estarske veze), enzimski (tj. uključivanje sekvence cepanja proteaze), ili fotolitički (npr. hromofor kao što je 3-amino-3-(2-nitrofenil) propionska kiselina (ANP)) kako bi se jedan molekul oslobodio od drugog. Primeri cepajućih linkera mogu se naći, na primer, u američkim patentnim publikacijama br. US 2016/0229903 A1 i US 2016/0251408 A1.

[0205] U određenim otelotvorenjima, cepajući linker se može cepati u testu cepanja trombinom kako je ovde navedeno ili kako je poznato u struci.

[0206] U posebnim otelotvorenjima, himerni polipeptid ovog obelodanjivanja obuhvata: (i) FVIII protein koji sadrži FVIII polipeptid, prvu XTEN sekvencu i prvi Fc region; i (ii) VWF fragment koji sadrži D' domen VWF i D3 domen VWF, drugu XTEN sekvencu, a2 linker FVIII i drugi Fc region; pri čemu:

(a) FVIII protein ima deleciju aminokiselina 746 do 1648 koje odgovaraju zrelom FVIII;

(b) prva XTEN sekvenca je umetnuta unutar FVIII polipeptida odmah nizvodno od aminokiseline 745 koja odgovara zrelom FVIII;

(c) prva XTEN sekvenca obuhvata aminokiselinsku sekvencu AE288_3 (SEQ ID NO:

218);

(d) prvi Fc region je fuzionisan na C-terminus FVIII polipeptida;

(e) druga XTEN sekvenca je fuzionisan na C-terminus VWF fragmenta;

(f) druga XTEN sekvenca obuhvata aminokiselinsku sekvencu AE144_5A (SEQ ID NO:

58);

(g) a2 linker je fuzionisan na C-terminus XTEN;

(h) a2 linker obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 88;

(i) drugi Fc region je fuzionisan na C-terminus a2 linkera; i

(j) prvi Fc region je kovalentno povezan sa drugim Fc regionom disulfidnom vezom.

[0207] Prema pronalasku, himerni polipeptid obuhvata dve polipeptidne sekvence: prvu polipeptidnu sekvencu koja obuhvata aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 207; i drugu polipeptidnu sekvencu koja obuhvata VWF fragment koji obuhvata D' domen VWF i D3 domen VWF i Fc region kao što je navedeno u SEQ ID NO: 202.

IV. Farmaceutski sastavi

[0208] Sastavi koji sadrže himerni polipeptid za upotrebu u ovom obelodanjivanju mogu sadržati odgovarajući farmaceutski prihvatljiv nosač. Na primer, mogu sadržati ekscipijense i/ili aditive koji olakšavaju preradu aktivnih jedinjenja u preparate dizajnirane za isporuku na mesto delovanja.

[0209] Farmaceutski sastav se može formulisati za parenteralnu primenu (tj. intravenoznu, subkutanu ili intramuskularnu) putem bolus injekcije. Formulacije za injekcije mogu biti predstavljene u obliku jedinične doze, npr. u ampulama ili u višedoznim bočicama sa dodatim konzervansom. Sastavi mogu poprimiti oblike suspenzija, rastvora ili emulzija u uljanim ili vodenim vehikulumima, i sadržati agense za formulisanje kao što su agensi za suspenziju, stabilizaciju i/ili dispergovanje. Alternativno, aktivni sastojak može biti u praškastom obliku za rekonstituciju sa odgovarajućim vehikulumom, npr. vodom bez pirogena.

[0210] Pogodne formulacije za parenteralnu primenu takođe uključuju vodene rastvore aktivnih jedinjenja u obliku rastvorljivom u vodi, na primer, soli rastvorljive u vodi. Pored toga, mogu se primeniti suspenzije aktivnih jedinjenja kao odgovarajuće uljane injekcione suspenzije. Pogodni lipofilni rastvarači ili vehikulumi uključuju masna ulja, na primer, susamovo ulje, ili sintetičke estre masnih kiselina, na primer, etil oleat ili trigliceride. Vodene injekcione suspenzije mogu sadržati supstance koje povećavaju viskoznost suspenzije, uključujući, na primer, natrijum karboksimetil celulozu, sorbitol i dekstran. Opciono, suspenzija može sadržati i stabilizatore. Lipozomi se takođe mogu koristiti za inkapsuliranje molekula iz obelodanjivanja za isporuku u ćelije ili intersticijalne prostore. Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača su fiziološki kompatibilni rastvarači, disperzioni medijumi, premazi, antibakterijska i antigljivična sredstva, izotonični i agensi za usporavanje apsorpciju, voda, fiziološki rastvor, fosfatni puferovani fiziološki rastvor, dekstroza, glicerol, etanol i slično. Opciono, sastav obuhvata izotonične agense, na primer, šećere, polialkohole kao što su manitol, sorbitol ili natrijum hlorid. Opciono, sastavi obuhvataju farmaceutski prihvatljive supstance kao što su agensi za vlaženje ili manje količine ekscipijensa kao što su agensi za vlaženje ili emulgovanje, konzervansi ili puferi, koji poboljšavaju rok trajanja ili efikasnost aktivnih sastojaka.

[0211] Sastavi kako je ovde obelodanjeno, mogu biti u različitim oblicima, uključujući, na primer, tečne (npr. injekcione i infuzione rastvore), disperzije, suspenzije, polučvrste i čvrste oblike doze. Preferirani oblik zavisi od načina primene i terapijske primene.

[0212] Sastav se može formulisati kao rastvor, mikroemulzija, disperzija, lipozom ili druga uređena struktura pogodna za visoku koncentraciju leka. Sterilni injekcioni rastvori mogu se pripremiti inkorporiranjem aktivnog sastojka u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa jednim ili kombinacijom gore navedenih sastojaka, po potrebi, nakon čega sledi filtracija i sterilizacija. Generalno, disperzije se pripremaju inkorporiranjem aktivnog sastojka u sterilni vehikulum koji sadrži osnovni disperzioni medijum i potrebne druge sastojke iz gore navedenih. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injekcionih rastvora, preferirane metode pripreme su vakuum sušenje i sušenje zamrzavanjem koje daje prašak aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz prethodno sterilno filtriranog rastvora. Pravilna fluidnost rastvora može se održati, na primer, upotrebom premaza kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. Produžena apsorpcija injekcionih sastava može se postići uključivanjem u sastav agensa koji odlaže apsorpciju, na primer, monostearatnih soli i želatina.

[0213] Aktivni sastojak se može formulisati sa formulacijom ili uređajem sa kontrolisanim oslobađanjem. Primeri takvih formulacija i uređaja uključuju implantate, transdermalne flastere i mikroinkapsulirane sisteme isporuke. Biorazgradivi, biokompatibilni polimeri mogu se koristiti, na primer, etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliorthoestri i polilaktička kiselina. Metode za pripremu takvih formulacija i uređaja poznate su u struci. Videti, npr. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

[0214] Injekcione depo formulacije mogu se napraviti formiranjem mikroinkapsuliranih matrica leka u biorazgradivim polimerima kao što je polilaktid-poliglikolid. U zavisnosti od odnosa leka i polimera, i prirode korišćenog polimera, brzina oslobađanja leka se može kontrolisati. Drugi primeri biorazgradivih polimera su poliorthoestri i polianhidridi. Depo injekcione formulacije se takođe mogu pripremiti zarobljavanjem leka u lipozomima ili mikroemulzijama.

[0215] Dodatna aktivna jedinjenja mogu biti inkorporirana u sastave. Opciono, himerni polipeptid iz obelodanjivanja je formulisan sa drugim faktorom zgrušavanja, ili njegovom varijantom, fragmentom, analogom ili derivatom. Na primer, faktor zgrušavanja uključuje, ali nije ograničen na, faktor V, faktor VII, faktor VIII, faktor IX, faktor X, faktor XI, faktor XII, faktor XIII, protrombin, fibrinogen, Fon Vilebrandov faktor ili rekombinantni rastvorljivi tkivni faktor (rsTF) ili aktivirane oblike bilo čega od prethodnog. Faktor zgrušavanja hemostatskog agensa može takođe uključivati antifibrinolitičke lekove, npr. epsilonaminokapronsku kiselinu, traneksaminsku kiselinu.

[0216] Režimi doziranja se mogu prilagoditi da obezbede optimalan željeni odgovor. Na primer, može se primeniti jedan bolus, može se primeniti nekoliko podeljenih doza tokom vremena, ili se doza može proporcionalno smanjiti ili povećati prema zahtevima terapijske situacije. Prednost je formulisati parenteralne sastave u obliku jedinične doze radi lakše primene i ujednačenosti doziranja. Videti, npr. Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, Pa.1980).

[0217] Pored aktivnog jedinjenja, tečni oblik doze može sadržati inertne sastojke kao što su voda, etil alkohol, etil karbonat, etil acetat, benzil alkohol, benzil benzoat, propilen glikol, 1,3-butilen glikol, dimetilformamid, ulja, glicerol, tetrahidrofurfuril alkohol, polietilen glikoli i estri masnih kiselina sorbitana.

[0218] Neograničavajući primeri pogodnih farmaceutskih nosača su takođe opisani u Remington's Pharmaceutical Sciences od strane E. W. Martina. Neki primeri ekscipijenata uključuju skrob, glukozu, laktozu, saharozu, želatin, slad, pirinač, brašno, kredu, silika gel, natrijum stearat, glicerol monostearat, talk, natrijum hlorid, sušeno obrano mleko, glicerol, propilen, glikol, vodu, etanol i slično. Sastav takođe može sadržati pH puferujuće reagense, i agense za vlaženje ili emulgovanje.

[0219] Opciono, farmaceutski sastav obuhvata himerni polipeptid i farmaceutski prihvatljiv nosač. FVIII protein u himernom polipeptidu ima produžen poluživot u poređenju sa FVIII proteinom divljeg tipa ili odgovarajućim FVIII proteinom bez VWF fragmenta. Opciono, poluživot himernog polipeptida je produžen najmanje oko 1,5 puta, najmanje oko 2 puta, najmanje oko 2,5 puta, najmanje oko 3 puta, najmanje oko 4 puta, najmanje oko 5 puta, najmanje oko 6 puta, najmanje oko 7 puta, najmanje oko 8 puta, najmanje oko 9 puta, najmanje oko 10 puta, najmanje oko 11 puta, ili najmanje oko 12 puta duže od FVIII divljeg tipa. U drugim otelotvorenjima, poluživot faktora VIII je najmanje oko 17 sati, najmanje oko 18 sati, najmanje oko 19 sati, najmanje oko 20 sati, najmanje oko 21 sat, najmanje oko 22 sata, najmanje oko 23 sata, najmanje oko 24 sata, najmanje oko 25 sati, najmanje oko 26 sati, najmanje oko 27 sati, najmanje oko 28 sati, najmanje oko 29 sati, najmanje oko 30 sati, najmanje oko 31 sat, najmanje oko 32 sata, najmanje oko 33 sata, najmanje oko 34 sata, najmanje oko 35 sati, najmanje oko 36 sati, najmanje oko 48 sati, najmanje oko 60 sati, najmanje oko 72 sata, najmanje oko 84 sata, najmanje oko 96 sati, ili najmanje oko 108 sati. Opciono, poluživot himernog polipeptida je produžen oko 3 puta u poređenju sa FVIII divljeg tipa.

[0220] Sastav se opciono primenjuje intravenskom primenom.

[0221] Opciono, sastav se koristi za lečenje bolesti ili stanja krvarenja kod subjekta kome je to potrebno. Bolest ili stanje krvarenja je izabrano iz grupe koja se sastoji od poremećaja koagulacije krvarenja, hemoartroze, mišićnog krvarenja, oralnog krvarenja, hemoragije, hemoragije u mišiće, oralne hemoragije, traume, trauma glave, gastrointestinalnog krvarenja, intrakranijalne hemoragije, intraabdominalne hemoragije, intratorakalne hemoragije, preloma kostiju, krvarenja centralnog nervnog sistema, krvarenja u retrofaringealnom prostoru, krvarenja u retroperitonealnom prostoru, krvarenja u ovojnici iliopsoas mišića i bilo koje kombinacije toga. Opciono, subjekt je zakazan za operaciju. Opciono, tretman je profilaktički ili po potrebi.

[0222] Sada kada je detaljno opisano ovo obelodanjivanje, isto će biti jasnije shvaćeno referencom na sledeće primere, koji su ovde uključeni isključivo radi ilustracije i nemaju za cilj da ograničavaju obelodanjivanje.

PRIMERI

Primer 1: Prva studija na ljudima FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc heterodimera

[0223] Faktor-bazirana supstituciona terapija predstavlja osnovu lečenja hemofilije. Konvencionalni rekombinantni FVIII (rFVIII) proizvodi imaju kratak poluživot, što zahteva čestu primenu. Značajni napredak u nezi pacijenata postignut je primenom rFVIIIFc (Eloctate<®>), uključujući najduži interval doziranja za hemofiliju A; adekvatnu kontrolu krvarenja, uključujući profilaktičku, u akutnim, perioperativnim i hitnim situacijama; zaštitu izvan kontrole krvarenja, uključujući zaštitu zglobova i poboljšan kvalitet života; i dugoročni dosledan i dobro karakterisan bezbednosni profil. Međutim, sedmično ili duže profilaktičko doziranje faktora VIII i dalje ostaje nezadovoljena potreba za većinu ljudi sa hemofilijom A.

[0224] Ova studija istražuje bezbednost i farmakokinetiku (PK) rFVIIIFc-VWF-XTEN, himernog polipeptida koji se sastoji od (i) FVIII polipeptida, XTEN umetnutog unutar B domena FVIII polipeptida, i prvog Fc regiona; i (ii) VWF fragmenta, druge XTEN sekvence, a2 linkera, i drugog Fc regiona (slika 1).

Dizajn studije

[0225] Cilj ove studije bio je procena bezbednosti, podnošljivosti i FVIII aktivnosti (PK) pojedinačne doze rFVIIIFc-VWF-XTEN u poređenju sa rFVIII. Populacija pacijenata uključivala je prethodno lečene odrasle muškarce sa teškom hemofilijom A (<1 IU/dL [<1%] nivo endogene FVIII aktivnosti) sa najmanje 150 dana izloženosti FVIII proizvodima, i bez istorije pozitivnog inhibitorskog testa ili kliničkih znakova smanjenog odgovora na primenu FVIII. Primarni krajnji ishodi bili su neželjeni događaji i kliničke abnormalnosti u laboratorijskim testovima, uključujući razvoj inhibitora. Ključni sekundarni krajnji ishodi uključivali su farmakokinetičke parametre, uključujući, ali ne ograničavajući se na, poluživot eliminacije (t1/2), klirens (CL), površinu ispod krive od 0 do beskonačnosti (AUC0-∞), srednje vreme zadržavanja (MRT) i inkrementalni oporavak (IR).

[0226] Pacijenti su bili uključeni u kohortu niske doze (7 pacijenata; Sslika 2A) ili kohortu visoke doze (9 pacijenata; slika 2B). Na svakom pacijentu je primenjen rFVIII (ADVATE<®>), nakon čega je sledio period uzorkovanja za PK. Nakon kratkog perioda ispiranja (≥ 3 dana za kohortu niske doze (slika 2A) i ≥ 4 dana za kohortu visoke doze (slika 2B)), na svakom subjektu je zatim primenjen rFVIIIFc-VWF-XTEN, nakon čega je sledio period uzorkovanja za PK. Subjekti su bili pod sigurnosnim nadzorom 28 dana nakon injekcije rFVIIIFc-VWF-XTEN, uključujući prikupljanje uzoraka za procenu inhibitora 14 i 28 dana nakon injekcije rFVIIIFc-VWF-XTEN. Pacijenti u kohorti niske doze primili su 25 IU/kg rFVIII i 25 IU/kg rFVIIIFc-VWF-XTEN. Pacijenti u kohorti visoke doze primili su 65 IU/kg rFVIII i 65 IU/kg rFVIIIFc-VWF-XTEN.

Metode

[0227] Farmakokinetički parametri su mereni modifikovanim testom koagulacije aaktiviranog parcijalnog tromboplastinskog vremena (aPTT) („jednostepeni“ test). Ukratko, FVIII aktivnost se meri u modifikovanom aPTT testu koristeći Dade<®>Actin<®>FSL aktiviranog PTT reagensa (Siemens Health Care Diagnostics) na BCS<®>XP analizatoru (Siemens Healthcare Diagnostics). Kalibracione krive sa 7 tačaka (visoka: 1,500-0,050 IU/mL; niska: 0,150-0,0025IU/mL) pripremljene su koristeći kalibrator specifičan za rFVIIIFc-VWF-XTEN. Za visoku kalibracionu krivu, rFVIIIFc-VWF-XTEN kalibrator [1.000 IU/mL] se razređuje u Tris/BSA puferu (50 mM, 150 mM natrijum hlorid, pH 7,4 /- 0,2, koji sadrži 1% BSA). Ovo razređivanje sprovodi BCS<®>XP analizator da bi se generisali unapred odabrani kalibracioni nivoi FVIII aktivnosti. Oni se zatim testiraju u radnom razređenju 1:2 pripremljenom u Tris/BSA puferu. Za nisku kalibracionu krivu, rFVIIIFc-VWF-XTEN kalibrator [1,000 IU/mL] se razređuje u imunodepletiranoj plazmi sa nedostatkom FVIII (Siemens Healthcare Diagnostics) pomoću BCS<®>XP analizatora, i testira se nerazređen (u odsustvu radnog razređenja). Kalibracija se vrši u duplikatu. Krive se crtaju po FVIII aktivnosti u IU/mL (xosa) i vremenu zgrušavanja u sekundama (y-osa). I visoke i niske kalibracione krive koriste linearnu log-lin regresijsku krivu.

[0228] Uzorci se testiraju u duplikatu koristeći metatest visoke kalibracione krive (radna razređenja 1:2, 1:4 i 1:8 u Tris/BSA) ili metatest niske kalibracione krive (nerazređeno, radna razređenja 1:2 i 1:4 u imunodepletiranoj plazmi sa nedostatkom FVIII). Nakon odgovarajućeg radnog razređenja, svi kalibratori, uzorci pacijenata i uzorci kontrole kvaliteta mešaju se u odnosu 1:1 sa imunodepletiranom plazmom sa nedostatkom FVIII, koja sadrži manje od ili jednako 0,010 IU/mL FVIII aktivnosti i najmanje 0,400 IU/mL ostalih faktora zgrušavanja. Nakon što se uzorci pomešaju sa ovom plazmom, dodaje se aPTT reagens i smeša se inkubira. Nakon inkubacije, dodaje se kalcijum hlorid i optički se meri vreme do formiranja ugruška. Algoritam zatim ispituje da li pojedinačni rezultati radnog razređenja spadaju u /- 15,0% od srednje vrednosti kako bi se odredila prijavljena FVIII aktivnost. Minimalno dva rezultata radnog razređenja metatesta su neophodna za određivanje prijavljene FVIII aktivnosti, osim blizu donje granice kvantifikacije (LLOQ).

Rezultati: Kohorta niske doze

[0229] Sedam subjekata je uključeno u kohortu niske doze; jedan subjekat se povukao iz razloga koji nisu povezani sa studijom pre nego što je primio rFVIIIFc-VWF-XTEN. Šest subjekata je primilo pojedinačnu, nisku dozu rFVIIIFc-VWF-XTEN (25 IU/kg). Karakteristike prva četiri subjekta lečena u kohorti niske doze uključivale su: prethodno lečene odrasle muškarce sa teškom hemofilijom A (<1 IU/dL [<1%] nivo endogene FVIII aktivnosti); svi subjekti su bili kavkazoidi; starost subjekata kretala se od 19-60 godina, sa prosečnom starosti od 33 godine; i prosečna težina je bila 85 kg (u rasponu od 67,2-100,6 kg).

[0230] Kod svih pacijenata, rFVIIIFc-VWF-XTEN je generalno bio dobro podnošen, i nisu primećeni inhibitori 14. ili 28. dana nakon doziranja.

[0231] Prosečna aktivnost FVIII nakon infuzije za prvih šest subjekata koji su primili pojedinačnu nisku dozu rFVIIIFc-VWF-XTEN (25 IU/kg) bila je oko 12,0% 5. dana i oko 5,3% 7. dana (slika 3A). Prosečna aktivnost FVIII ostala je iznad 1% tokom 10 dana (slika 3A). Farmakokinetički parametri, mereni aktiviranim parcijalnim tromboplastinskim vremenom (aPTT), za rFVIIIFc-VWF-XTEN (25 IU/kg) i rFVIII (25 IU/kg) prikazani su u tabeli 9. Primećeno je da rFVIIIFc-VWF-XTEN ima prosečan poluživot od oko 37,6 sati kod humanih subjekata, što je bilo preko 4 puta duže od prosečnog poluživota za rFVIII (oko 9,12 sati) primenjenog u istoj dozi.

Tabela 9: Farmakokinetički (PK) parametri za kohortu niske doze

Rezultati: Kohorta visoke doze

[0232] Devet subjekata je uključeno u kohortu visoke doze. Subjektima je primenjena pojedinačna, visoka doza rFVIIIFc-VWF-XTEN (65 IU/kg). Jedan subjekat nije mogao biti testiran za PK parametre iz razloga koji nisu povezani sa studijom. Karakteristike subjekata lečenih u kohorti visoke doze uključivale su: prethodno lečene odrasle muškarce sa teškom hemofilijom A (<1 IU/dL [<1%] nivo endogene FVIII aktivnosti); 7 od 9 subjekata su bili kavkazoidi; starost subjekata kretala se od 32-63 godine, sa prosečnom starosti od 44 godine; i prosečna težina je bila 81,1 kg (u rasponu od 61,5-100,7 kg).

[0233] Prosečna aktivnost FVIII nakon infuzije za osam evaluiranih subjekata koji su primili pojedinačnu visoku dozu rFVIIIFc-VWF-XTEN (65 IU/kg) bila je oko 38,0% 5. dana i oko 17% 7. dana (slika 3B). Prosečna aktivnost FVIII ostala je iznad 1% tokom 14 dana (slika 3B). Farmakokinetički parametri, mereni aktiviranim parcijalnim tromboplastinskim vremenom (aPTT), za rFVIIIFc-VWF-XTEN (65 IU/kg) i rFVIII (65 IU/kg) prikazani su u tabeli 10. Primećeno je da rFVIIIFc-VWF-XTEN ima prosečan poluživot od oko 42,5 sati kod humanih subjekata, što je bilo preko 3 puta duže od prosečnog poluživota za rFVIII (oko 13 sati) primenjenog u istoj dozi.

Tabela 10: Farmakokinetički (PK) parametri za kohortu visoke doze

Zaključci:

[0234] rFVIIIFc-VWF-XTEN je bio dobro podnošen kod svih pacijenata sa teškom hemofilijom A koji su lečeni bilo pojedinačnom niskom dozom (25 IU/kg) ili pojedinačnom visokom dozom (65 IU/kg). Nijedan pacijent nije razvio inhibitor FVIII. rFVIIIFc-VWF-XTEN je pokazao poluživot koji je bio 3 do 4 puta duži od rFVIII, što sugeriše proboj u ograničenju poluživota nametnutom od strane VWF. Održana, visoka aktivnost FVIII ima potencijal da obezbedi produženu zaštitu od svih tipova krvarenja.

Primer 2: Studija ponovljenih doza FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc heterodimera

[0235] rFVIIIFc-VWF-XTEN je bio dobro podnošen i obezbedio je održane nivoe FVIII u kohorti subjekata koji su primili pojedinačnu dozu rFVIIIFc-VWF-XTEN. (Primer 1). Ova studija će proceniti bezbednost i podnošljivost, kao i karakterisati farmakokinetiku ponovljenih doza rFVIIIFc-VWF-XTEN (slika 1).

Dizajn studije

[0236] Ukupno 4 doze rFVIIIFc-VWF-XTEN, jednom nedeljno, biće primenjene na odraslim muškim pacijentima sa teškom hemofilijom A koji su prethodno lečeni FVIII terapijom i imali su najmanje 150 dana izloženosti takvom FVIII tretmanu. Biće uključene dve kohorte, svaka sa približno deset odraslih muškaraca starosti od 18 do 65 godina. Svaki subjekt u kohorti 1 primiće ukupno četiri doze rFVIIIFc-VWF-XTEN od 50 IU/kg jednom nedeljno, 1., 8., 15. i 22. dana. Svaki subjekt u kohorti 2 primiće ukupno četiri doze rFVIIIFc-VWF-XTEN od 65 IU/kg jednom nedeljno, 1., 8., 15. i 22. dana.

[0237] Šematski prikaz dizajna kliničke studije prikazan je na slici 4. Uzorak za farmakokinetičku analizu pre doze biće uzet 1. dana. Pored toga, biće uzeto više PK uzoraka nakon doziranja 1. i 22. dana, a uzorak na najnižem nivou (168h) biće uzet pre doziranja 8., 15. i 22. dana. Subjekti će proći period bezbednosnog nadzora od 28 dana nakon poslednje doze rFVIIIFc-VWF-XTEN, uključujući procenu inhibitora 14. i 28. dana nakon poslednje doze rFVIIIFc-VWF-XTEN. Za subjekte koji završe sve četiri doze rFVIIIFc-VWF-XTEN jednom nedeljno, period bezbednosnog nadzora završiće se posetom na kraju studije (EOS) 50. dana (+3 dana). Za subjekte koji prekinu lečenje ranije, period bezbednosnog nadzora završiće se posetom radi ranog prekida (ET) 28 dana nakon poslednje doze rFVIIIFc-VWF-XTEN.

[0238] Primarni cilj studije je procena bezbednosti i podnošljivosti ukupno četiri doze intravenskog (IV) rFVIIIFc-VWF-XTEN primenjenih jednom nedeljno. Primarni krajnji ishodi su pojava neželjenih događaja (AE) i pojava klinički značajnih abnormalnosti u laboratorijskim testovima, uključujući razvoj inhibitora (neutrališućih antitela usmerenih protiv FVIII) kako je utvrđeno putem Nijmegen-modifikovanog Bethesda testa. (Verbruggen et al, Thrombosis and Haemostasis, 73: 247-251 (1995)).

[0239] Sekundarni cilj studije je karakterizacija farmakokinetike rFVIIIFc-VWF-XTEN nakon ukupno četiri IV doze primenjene jednom nedeljno, pri čemu je aktivnost FVIII određena jednofaznim testom zgrušavanja aktiviranog parcijalnog tromboplastinskog vremena (aPTT), kao što je opisano u primeru 1. Sekundarni krajnji ishodi su PK parametri procenjeni putem procene parametara, uključujući, ali ne ograničavajući se na, maksimalnu aktivnost (Cmax), poluživot (t1⁄2), ukupan klirens u stanju ravnoteže (CLss), indeks akumulacije (Al), površinu ispod krive aktivnosti-vremena od nultog sata tokom intervala doziranja (AUC0-tau), volumen distribucije u stanju ravnoteže (Vss), srednje vreme zadržavanja (MRT), IR, najnižu (najniži nivo) koncentraciju koju lek dostiže pre primene sledeće doze (Ctrough) i vreme do 1% iznad početne vrednosti za aktivnost FVIII.

[0240] Eksploratorni cilj studije je karakterizacija farmakokinetike rFVIIIFc-VWF-XTEN nakon ukupno četiri IV doze primenjene jednom nedeljno, pri čemu je aktivnost FVIII određena dvofaznim hromogenim testom koagulacije. Eksploratorni krajnji ishodi su PK parametri procenjeni putem procene parametara, uključujući, ali ne ograničavajući se na, Cmax, t1⁄2, CLss, Al, AUCO-tau, Vss, MRT, IR, Ctrough i vreme do 1% iznad početne vrednosti za aktivnost FVIII.

Metode

[0241] Aktivnost FVIII je određena modifikovanim testom zgrušavanja aktiviranog parcijalnog tromboplastinskog vremena (aPTT) („jednostepeni“), kako je detaljno opisano u primeru 1.

[0242] Dvostepeni hromogeni test koagulacije meri aktivnost FVIII koristeći BIOPHEN FVIII:C test (Hyphen Biomed 221402-RUO) na BCS<®>XP analizatoru (Siemens Healthcare Diagnostics). Ukratko, fosfolipidi, kalcijum i trombinom aktivirani FVIII:C formiraju enzimski kompleks u prisustvu konstantne količine faktora IXa. Ovaj enzimski kompleks zauzvrat aktivira faktor X (FX), koji se isporučuje u konstantnoj i suvišnoj koncentraciji u odnosu na faktor Xa (FXa). Aktivacija FX u FXa direktno je povezana sa količinom FVIII:C, koji je ograničavajući faktor u testu u prisustvu konstantne i suvišne količine faktora IXa. Aktivnost generisanog FXa zatim se meri pomoću specifičnog hromogenog FXa supstrata, SXa-11 (Hyphen Biomed). Faktor Xa cepa SXa-11 i oslobađa paranitroanilin (pNA). Količina oslobođenog pNA direktno je proporcionalna količini generisanog FXa. Postoji direktna veza između količine FVIII:C u uzorku, količine generisanog FXa i količine oslobođenog pNA. Oslobađanje pNA određuje se razvojem boje na talasnoj dužini od 405 nm.

[0243] Kalibracione krive sa 8 tačaka (visoka: 1,500 - 0,150 IU/mL; niska: 0,200 - 0,008 IU/mL) pripremaju se korišćenjem kalibratora specifičnog za rFVIIIFc-VWF-XTEN. Za visoku kalibracionu krivu, rFVIIIFc-VWF-XTEN pri 1 IU/mL se razređuje u Tris/BSA puferu da bi se generisali unapred odabrani nivoi kalibracije FVIII aktivnosti. Ovo razređivanje sprovodi BCS<®>XP analizator. Unapred odabrani nivoi kalibracije FVIII aktivnosti testiraju se u radnom razređenju 1:4 u Tris/BSA puferu. Za nisku kalibracionu krivu, rFVIIIFc-VWF-XTEN pri 1 IU/mL se prethodno razređuje 1:4 u kongenitalnoj plazmi sa nedostatkom FVIII (Helena Laboratories), a zatim se dalje razređuje BCS<®>XP analizatorom u Tris/BSA puferu da bi se generisali unapred odabrani nivoi kalibracije FVIII aktivnosti koji se testiraju bez daljeg razređenja u reakcionom podešavanju.

[0244] Kalibracija se vrši u duplikatu. Krive se crtaju za FVIII aktivnost u IU/mL (x-osa) i promenu apsorbance/min (y-osa). Za visoku kalibracionu krivu koristi se linearna log-log regresijska kriva. Za nisku kalibracionu krivu koristi se linearna lin-lin regresijska kriva. Uzorci se testiraju u duplikatu bilo na visokoj kalibracionoj krivoj u radnom razređenju 1:4 ili na niskoj kalibracionoj krivoj koristeći razređenje 1:4 u kongenitalnoj plazmi sa nedostatkom FVIII ili nerazređeni (u odsustvu radnog razređenja).

Rezultati

Demografske i početne karakteristike

[0245] Ukupno 10 odraslih muških subjekata starosti od 18 do 65 godina (uključivo) uključeno je u kohortu 1 (50 IU/kg), a 5 odraslih muških subjekata starosti od 18 do 65 godina (uključivo) uključeno je u kohortu 2 (65 IU/kg). Svih 10 subjekata u kohorti doziranja od 50 IU/kg primilo je 4 doze rFVIIIFc-VWF-XTEN. Tri od 5 subjekata uključenih u kohortu doziranja od 65 IU/kg primilo je najmanje jednu dozu rFVIIIFc-VWF-XTEN. Svih 15 uključenih subjekata bilo je iz jednog centra u Sofiji, Bugarska. Od 15 uključenih subjekata, 13 subjekata je primilo najmanje jednu dozu BIVV001 i uključeni su u sažetak demografskih i početnih karakteristika. Svi subjekti su bili muškog pola. Medijana starosti je bila 35 godina (raspon: 25 do 55 godina) i svi subjekti su bili bele rase. Medijana težine je bila 86,7 kg (raspon: 51,0 do 130,9 kg) a medijana indeksa telesne mase bila je 25,9 kg/m<2>(raspon: 16,4 do 40,9 kg/m<2>).

Analiza bezbednosti

[0246] Za privremenu analizu, ukupno 13 subjekata je uključeno u set za analizu bezbednosti (n=10 iz kohorte od 50 IU/kg i n=3 iz kohorte od 65 IU/kg). Sve analize bezbednosti su izvršene na osnovu seta za analizu bezbednosti i uključivale su sve subjekte koji su primili najmanje jednu dozu rFVIIIFc-VWF-XTEN.

[0247] Neželjeni događaj koji se pojavio tokom lečenja (TEAE) definiše se kao svaki neželjeni događaj koji je počeo na dan ili posle prve primene rFVIIIFc-VWF-XTEN i unutar 28 dana nakon poslednje primene rFVIIIFc-VWF-XTEN. Za neželjene događaje sa nedostajućim datumima početka pretpostavlja se da su povezani sa lečenjem, osim ako datum završetka nije bio pre datuma doziranja. Generalno, neželjeni događaji su sumirani po učestalosti subjekata po kohorti i ukupno, kao i predstavljeni u listingu podataka po kohorti i subjektu. Ozbiljni neželjeni događaji koji se pojavili tokom lečenja (TESAE) takođe su procenjivani za svakog subjekta, ali nijedan nije primećen kod lečenih subjekata (tabela 11).

[0248] Od 15 uključenih subjekata, 13 subjekata je primilo najmanje jednu dozu rFVIIIFc-VWF-XTEN i uključeni su u analizu bezbednosti. Prijavljeno je 19 TEAE kod 8 od 13 subjekata (61,5%) (tabela 11). Nije prijavljen nijedan ozbiljan ili povezan TEAE i nijedan subjekat nije prekinuo studiju zbog TEAE. Najčešći TEAE bili su artralgija, infekcija gornjih disajnih puteva, glavobolja i rinitis (po 2/13 subjekata; 15,4 %). Nije otkriven razvoj inhibitora FVIII i nije bilo izveštaja o ozbiljnoj preosetljivosti ili anafilaksiji. Na svakom nivou sumiranja subjekata, subjekat se broji jednom ako je prijavio jedan ili više događaja. Procenti navedeni u tabeli 11 zasnivaju se na broju subjekata koji su primili najmanje jednu dozu rFVIIIFc-VWF-XTEN u svakoj kohorti i ukupno.

TABELA 11. Sažetak neželjenih događaja koji se pojavili tokom lečenja (TEAE) u setu za analizu bezbednosti

Analiza imunogenosti

[0249] Svi subjekti su procenjivani za razvoj inhibitora i prisustvo anti-rFVIIIFc-VWF-XTEN antitela na skriningu, 1. dana, 8. dana, 15. dana, 22. dana, 36. dana i 50. dana (poseta na kraju studije -EOS, ili poseta za rani prekid-ET). Testiranje na inhibitore je obavljeno u centralnoj laboratoriji korišćenjem Nijmegen-modifikovanog Bethesda testa. Ako bi rezultat Nijmegen-modifikovanog Bethesda testa bio ≥0,6 BU/mL, odvojeni uzorak bi bio prikupljen i testiran radi potvrde razvoja inhibitora u roku od 2 do 4 nedelje. Testiranje na potencijalno formiranje antitela obavljeno je u centralnoj laboratoriji korišćenjem validiranog rFVIIIFc-VWF-XTEN-specifičnog testa za antitela na lek (ADA). Potvrđeni pozitivni uzorci su dalje karakterisani za antitela specifična za FVIII, D'D3 ili XTEN. Broj i procenat subjekata koji su bili pozitivni na razvoj inhibitora, kao i broj i procenat subjekata koji su bili pozitivni na antirFVIIIFc-VWF-XTEN antitela, sumirani su po kohorti korišćenjem seta za analizu bezbednosti.

[0250] Nijedan subjekat nije razvio pozitivan rezultat testa na antitela na lek nakon primene rFVIIIFc-VWF-XTEN.

Farmakokinetička analiza i rezultati

[0251] Generalno, podaci o bezbednosti i PK su sumirani korišćenjem standardne deskriptivne statistike za kontinuirane i kategoričke podatke. Podaci su sumirani po kohorti. Kontinuirane varijable su sumirane korišćenjem deskriptivne statistike, uključujući broj neizostavljenih vrednosti (n), srednju vrednost, standardnu devijaciju (SD), medijanu, minimum i maksimum. Farmakokinetički parametri su takođe sumirani korišćenjem geometrijske sredine i procenta koeficijenta varijacije (%CV). Kategoričke varijable su sumirane po broju i procentima.

[0252] Sve PK analize su obavljene na osnovu Seta za PK analizu (PKAS) i uključivale su 9 subjekata iz kohorte doziranja od 50 IU/kg koji su imali adekvatne kolekcije uzoraka krvi nakon primene rFVIIIFc-VWF-XTEN.

FVIII aktivnost

[0253] Da bi se karakterisala farmakokinetika rFVIIIFc-VWF-XTEN nakon ukupno četiri doze primenjene jednom nedeljno intravenski, aktivnost FVIII je određena kod svakog subjekta u unapred određenim vremenskim tačkama. Aktivnost FVIII je sumirana po kohorti, planiranoj PK poseti i vremenskoj tački za jednostepeni (aktivirano parcijalno tromboplastinsko vreme [aPTT]) test zgrušavanja i hromogeni koagulacioni test. Profili aktivnosti FVIII u odnosu na vreme iscrtani su u originalnoj i logaritamskoj skali za oba testa aktivnosti FVIII. Pojedinačna aktivnost FVIII je navedena za svakog subjekta po kohorti, planiranoj PK poseti i vremenskoj tački za oba testa aktivnosti FVIII. Rezultati za aktivnost FVIII prema jednostepenom [aPTT] testu prikazani su u tabeli 12. Rezultati za aktivnost FVIII prema hromogenom testu prikazani su u tabeli 13.

[0254] Ukratko, nakon doziranja 1. dana, srednje vrednosti FVIII aktivnosti zasnovane na jednostepenom i hromogenom testu nakon 72 sata bile su 45,53% i 29,37%, nakon 120 sati bile su 21,56% i 13,49% i nakon 168 sati bile su 7,91% i 5,97%, respektivno. Nakon doziranja 22. dana, srednje vrednosti FVIII aktivnosti zasnovane na jednostepenom i hromogenom testu nakon 72 sata bile su 46,28% i 30,46%, nakon 120 sati bile su 22,30% i 14,48% i nakon 168 sati bile su 9,83%, i 6,74%, respektivno. Generalno, kod svih pacijenata, vremenskih tačaka i sa oba testa, najniži nivo za rFVIIIFc-VWF-XTEN pri 50 IU/kg jednom nedeljno u ovoj privremenoj analizi kretao se između 7-10%.

PK parametri

[0255] Pojedinačne procene PK parametara navedene su za svakog subjekta i opisno sumirane po kohorti, planiranoj PK poseti i vremenskoj tački za oba testa aktivnosti FVIII.

[0256] Geometrijska sredina poluživota eliminacije (t1/2) za sve subjekte koji su primali rFVIIIFc-VWF-XTEN pri 50 IU/kg jednom nedeljno u ovoj privremenoj analizi bila je 41,24 sata prema jednostepenom testu (tabela 16B) i 43,87 sati prema hromogenom testu (tabela 17B).

[0257] Nakon doziranja 1. dana, geometrijska sredina maksimalne FVIII aktivnosti (Cmax) bila je 113 IU/dL sa jednostepenim testom (tabela 14) i 108 IU/dL sa hromogenim testom (tabela 15). Nakon doziranja 22. dana, geometrijska sredina FVIII aktivnosti u stanju ravnoteže (Cmaxss) bila je 127 IU/dL prema jednostepenom testu (tabela 16A) i 115 IU/dL prema hromogenom testu (tabela 17A).

[0258] Nakon doziranja 1. dana, geometrijska sredina kumulativne FVIII aktivnosti (AUC0-tau) bila je 7650 h*IU/dL prema jednostepenom testu (tabela 14) i 5630 h*IU/dL prema hromogenom testu (tabela 15). Nakon doziranja 22. dana, geometrijska sredina AUC0-taubila je 8270 h*IU/dL prema jednostepenom testu (tabela 16A) i 5880 h*IU/dL prema hromogenom testu (tabela 17A).

[0259] Podaci o Cmaxi AUC0-taupodaci 1. i 22. dana doziranja pokazali su minimalnu akumulaciju, podržanu indeksom akumulacije (Al) od 1,07 (jednostepeni test, tabela 16B) i 1,08 (hromogeni test, tabela 17B). Za sve podatke o PK parametrima prikazane u tabelama 12-17, vrednosti ispod granice kvantifikacije (BLQ) su tretirane kao 0 u svrhu analize. Gde je bilo potrebno za izračunavanje PK parametara, s obzirom da krajnje vreme infuzije nije zabeleženo, trajanje infuzije je imputirano kao 8 minuta za svakog subjekta u skladu sa smernicama za primenu u dokumentu studije Uputstva za rukovanje i primenu.

TABELA 12. Sažetak nivoa aktivnosti FVIII korigovanih za početnu vrednost (IU/dL) na osnovu jednostepenog aPTT testa zgrušavanja: Nivo doze seta za PK analizu: 50 IU/kg)

TABELA 13. Sažetak nivoa aktivnosti FVIII korigovanih za početnu vrednost (IU/dL) na osnovu hromogenog testa: Set za PK analizu (nivo doze: 50 IU/kg)

TABELA 14. Sažetak farmakokinetičkih parametara doziranja 1. dana za FVIII aktivnost korigovanu za početnu vrednost na osnovu jednostepenog aPTT testa zgrušavanja: Set za PK analizu

TABELA 15: Sažetak farmakokinetičkih parametara doziranja 1. dana za FVIII aktivnost korigovanu za početnu vrednost na osnovu hromogenog testa: Set za PK analizu

TABELA 16A. Dan 22 - Sažetak farmakokinetičkih parametara za aktivnost FVIII korigovanu za početnu vrednost na osnovu jednostepenog aPTT testa zgrušavanja: Set za PK analizu (deo 1)

TABELA 16B: Dan 22 - Sažetak farmakokinetičkih parametara za aktivnost FVIII korigovanu za početnu vrednost na osnovu jednostepenog aPTT testa zgrušavanja: Set za PK analizu (deo 2)

TABELA 17A. Dan 22 - Sažetak farmakokinetičkih parametara za FVIII aktivnost korigovanu za početnu vrednost na osnovu hromogenog testa: Set za PK analizu (deo 1)

TABELA 17B. Dan 22 - Sažetak farmakokinetičkih parametara za FVIII aktivnost korigovanu za početnu vrednost na osnovu hromogenog testa: Set za PK analizu (deo 2)

Zaključci

[0260] Dosledno rezultatima uočenim u studiji sa pojedinačnom dozom (primer 1), nedeljno doziranje rFVIIIFc-VWF-XTEN je generalno bilo dobro podnošeno i nisu detektovani inhibitori tokom 28 dana nakon poslednje primene rFVIIIFc-VWF-XTEN. rFVIIIFc-VWF-XTEN u dozi od 50 IU/kg pokazao je srednji poluživot eliminacije (t1/2) od 41,24 i 43,87 sati sa jednostepenim i hromogenim testovima, respektivno. Ovi privremeni rezultati pokazuju da se poboljšani poluživot uočen pri pojedinačnoj dozi rFVIIIFc-VWF-XTEN održava i pri ponovljenom nedeljnom doziranju (QW), što snažno signalizira da se prednosti rFVIIIFc-VWF-XTEN mogu ostvariti kod pacijenata sa hemofilijom A koji primaju tretman prema profilaktičkom režimu doziranja FVIII.

Primer 3: Studija faze 3 rFVIIIFc-VWF-XTEN kod prethodno lečenih pacijenata sa teškom hemofilijom A

[0261] Ova studija će proceniti bezbednost i podnošljivost i karakterisati farmakokinetiku primene 50 IU/kg rFVIIIFc-VWF-XTEN jednom nedeljno (slika 1). Primarni cilj studije je procena efikasnosti profilaktičkog tretmana sa rFVIIIFc-VWF-XTEN u poređenju sa tretmanom sa rFVIIIFc-VWF-XTEN po potrebi. Sekundarni cilj studije je procena rFVIIIFc-VWF-XTEN kao profilaktičkog tretmana, njegovog uticaja na epizode krvarenja i potrošnju rFVIIIFc-VWF-XTEN, zdravlje zglobova i kvalitet života meren ishodima koje prijavljuju pacijenti (PRO), kao i procena rFVIIIFc-VWF-XTEN za tretman po potrebi.

[0262] Pored toga, farmakokinetički (PK) cilj je karakterizacija PK profilaktičke primene rFVIIIFc-VWF-XTEN na početku za sve subjekte i ponovljena na tri meseca za unapred definisanu podgrupu subjekata, na osnovu aPTT FVIII testa aktivnosti. Dodatni ciljevi su procena efikasnosti rFVIIIFc-VWF-XTEN kod subjekata koji se podvrgavaju operaciji, kao i procena bezbednosti i podnošljivosti rFVIIIFc-VWF-XTEN. Dalje, strukturni ishodi zdravlja zglobova biće procenjeni ultrazvukom, a biće procenjen i uticaj tretmana na druge mere kvaliteta života i na korišćenje zdravstvenih resursa.

Dizajn studije

[0263] Ovo je ključna, otvorena, multicentrična studija bezbednosti, efikasnosti i PK intravenskog rFVIIIFc-VWF-XTEN faze 3, kod pacijenata starijih od 12 godina sa teškom hemofilijom A (definisana kao <1 IU/dL [<1%] endogenog FVIII). Približno dvadeset i pet subjekata koji su trenutno na režimu po potrebi primiće rFVIIIFc-VWF-XTEN u dozi od 50 IU/kg IV po potrebi tokom dvadeset i šest nedelja, a zatim će primati rFVIIIFc-VWF-XTEN u dozi od 50 IU/kg IV jednom nedeljno u okviru profilaktičkog režima lečenja tokom dvadeset i šest nedelja. Subjekti koji su trenutno na profilaktičkom režimu lečenja primiće rFVIIIFc-VWF-XTEN u dozi od 50 IU/kg IV jednom nedeljno u okviru profilaktičkog režima lečenja tokom pedeset i dve nedelje.

[0264] Biće uključeno približno 140 subjekata starosti ≥12 godina; ponovljene PK procene biće izvršene na podgrupi od približno šesnaest subjekata nakon 12 nedelja.

[0265] Subjekti će biti podvrgnuti skriningu i, nakon ispunjavanja kriterijuma za uključenje, preći će na jedan od dva režima lečenja (tj. po potrebi ili profilaksa) sa rFVIIIFc-VWF-XTEN u dozi od 50 IU/kg IV. Svi subjekti će proći početne PK procene nakon perioda ispiranja (najmanje 4 do 5 dana, u zavisnosti od trenutne terapije). Subjekti će proći procene efikasnosti i bezbednosti tokom cele studije. Ove procene bezbednosti uključivaće testiranje na potencijalno formiranje inhibitora. Praćenje bezbednosti putem posete ili telefonskog poziva biće obavljeno dvadeset i osam dana nakon poslednje doze rFVIIIFc-VWF-XTEN, osim ako se subjekat ne uključi u otvorenu produženu studiju.

[0266] Kraj studije (EOS) može nastupiti kada su ispunjena oba kriterijuma: (i) najmanje 104 subjekta su dostigla 50 dana izloženosti (ED) i završila validan test na inhibitor nakon 50. ED; i (ii) najmanje dvadeset i pet subjekata je završilo grupu studije za tretman po potrebi, uključujući 26-nedeljni period profilaktičkog tretmana, ili se povuklo iz studije ranije. Pored toga, subjekti iz bilo koje grupe koji se podvrgnu operaciji tokom studije biće uključeni u hiruršku podgrupu. Cilj je minimum deset velikih hirurških zahvata kod najmanje pet subjekata kako bi se procenila kontrola i prevencija krvarenja u hirurškom okruženju.

[0267] Subjekti će dolaziti u kliniku unutar približno 28-dnevnog perioda skrininga radi utvrđivanja podobnosti. Pored posete za skrining, subjekti će se vraćati u kliniku na posete na početku studije, 4. nedelje, 12. nedelje, 26. nedelje, 36. nedelje, 52. nedelje i EOS/ET. Period doziranja biće duži od 52 nedelje. Subjekti koji uđu u grupu profilaktičkog lečenja primiće 52 doze rFVIIIFc-VWF-XTEN jednom nedeljno i dodatne doze po potrebi za lečenje epizoda krvarenja. Subjekti koji uđu u grupu lečenja po potrebi primiće rFVIIIFc-VWF-XTEN po potrebi tokom 26-nedeljnog perioda lečenja po potrebi i 26 doza rFVIIIFc-VWF-XTEN jednom nedeljno i dodatne doze po potrebi za lečenje epizoda krvarenja tokom narednog 26-nedeljnog perioda profilaktičkog lečenja. Bezbednost će biti procenjivana tokom cele studije. Poseta za praćenje bezbednosti ili telefonski poziv biće obavljen 28 dana nakon poslednje doze rFVIIIFc-VWF-XTEN, osim ako se subjekat ne uključi u otvorenu produženu studiju.

[0268] Primarni krajnji ishod studije biće komparacija kod istog subjekta godišnje stope krvarenja (ABR) dok su subjekti na rFVIIIFc-VWF-XTEN tretmanu po potrebi (26 nedelja) u odnosu na profilaktičko lečenje jednom nedeljno (26 nedelja).

[0269] Sekundarni krajnji ishodi studije će uključivati (i) komparaciju kod istog subjekta ABR na rFVIIIFc-VWF-XTEN profilaksi u odnosu na istorijski ABR (za subjekte na profilaksi koji su učestvovali u prethodnoj opservacionoj studiji); (ii) pojavu epizoda krvarenja i potrošnju (ukupni ABR, ABR po tipu i lokaciji, i ukupnu, godišnju potrošnju rFVIIIFc-VWF-XTEN po subjektu); (iii) odgovor na tretman; (iv) indeks efikasnosti (procenat subjekata koji održavaju najniži nivo od L3% 7. dana); (v) zdravlje zglobova; i (vi) promene u merama kvaliteta života (haem-A-QoL i PROMIS-SF fizička funkcija za subjekte starije od 18 godina; i HAEMO-QoL i PROMIS Pediatric-SF fizička aktivnost za subjekte mlađe od 18 godina).

[0270] Odgovor na tretman će uključivati (i) broj infuzija i dozu rFVIIIFc-VWF-XTEN potrebnih za rešavanje epizode krvarenja; (ii) procenat epizoda krvarenja koje zahtevaju jednu infuziju za rešavanje; (iii) procenu subjekta o odgovoru na rFVIIIFc-VWF-XTEN tretman pojedinačnih epizoda krvarenja na osnovu skale od 4 tačke; (iv) i globalnu procenu istraživača o odgovoru subjekta na rFVIIIFc-VWF-XTEN tretman na osnovu skale od 4 tačke.

[0271] Evaluacija zdravlja zglobova će uključivati (i) ABR epizoda krvarenja u zglobovima; (ii) rezoluciju ciljanog zgloba nakon 52 nedelje, na osnovu kriterijuma Međunarodnog društva za trombozu i hemostazu (ISTH); (iii) funkcionalne ishode na osnovu apsolutne promene od početne vrednosti do 52 nedelje procenjene modifikovanim skorom zdravlja zglobova kod hemofilije (mHJHS) ili HJHS); (iv) procenat subjekata bez pogoršanja zglobova nakon 52 nedelje procenjenog mHJHS ili HJHS.

[0272] Dodatni krajnji ishodi uključuju (i) maksimalnu (vršnu) koncentraciju leka u plazmi (Cmax), poluživot eliminacije (t1⁄2), indeks akumulacije (Al), površinu ispod krive koncentracije leka u plazmi u zavisnosti od vremena (AUC), prividni volumen distribucije u stanju ravnoteže (Vss), srednje vreme zadržavanja (MRT), inkrementalni oporavak (IR), najnižu koncentraciju leka u plazmi (Ctrough) i vreme iznad unapred definisanih nivoa FVIII aktivnosti; (ii) procene hemostatskog odgovora subjekata na rFVIIIFc-VWF-XTEN tretman od strane istraživača ili hirurga na skali odgovora od 4 tačke, broj i dozu infuzija potrebnih za održavanje hemostaze tokom operacije, ukupnu potrošnju rFVIIIFc-VWF-XTEN tokom hirurškog perioda, procenjeni gubitak krvi tokom operacije, broj i tip transfuzija komponenti krvi potrebnih tokom operacije i epizode krvarenja nakon operacije tokom hirurškog perioda; (iii) pojavu neželjenih događaja (AE) i ozbiljnih neželjenih događaja (SAE), klinički značajne abnormalnosti u fizičkom pregledu, vitalnim znacima i laboratorijskim testovima, kao i razvoj inhibitora (neutrališućih antitela usmerenih protiv FVIII kako je utvrđeno putem Nijmegenmodifikovanog Bethesda testa; i (iv) anatomske i strukturalne pokazatelje zdravlja zglobova putem ultrazvučnog snimanja u subpopulaciji, promene u drugim merama kvaliteta života (EQ-5D-5L, PGIC (samo 52. nedelja), PROMIS za intenzitet bola, PROMIS-SF za ometanje bolom (subjekti ≥ 18 godina), PROMIS Pediatric-SF za ometanje bolom (subjekti < 18 godina)) i korišćenje zdravstvenih resursa - HRU.

Kriterijumi za uključivanje/isključivanje

[0273] Kandidati koji ispunjavaju uslove moraju da zadovolje sledeće kriterijume podobnosti: (1) starost ≥12 godina u trenutku davanja informisanog pristanka; (2) dijagnoza teška hemofilija A, definisana kao <1 IU/dL (<1%) nivo endogenog FVIII, dokumentovano od strane sertifikovane kliničke laboratorije; (3) prethodno lečenje hemofilije A (profilaktičko ili po potrebi) bilo kojim rekombinantnim i/ili iz plazme deriviranim FVIII, ili krioprecipitatom, sa najmanje 150 dana izloženosti (ED), (4) trenutno na profilaktičkom režimu lečenja sa komercijalnim FVIII proizvodom i najmanje četiri epizode krvarenja u dvanaest meseci pre uključivanja u studiju, ili trenutno na režimu lečenja po potrebi sa komercijalnim FVIII proizvodom i najmanje dvanaest epizoda krvarenja u dvanaest meseci pre uključivanja u studiju; i (5) broj trombocita ≥100,000 ćelija/µL na skriningu (test obavljen u centralnoj laboratoriji i pregledan pre doze 1. dana). Subjekti će biti isključeni iz sledećih razloga: (1) drugi poznati poremećaji koagulacije pored hemofilije A; (2) istorija preosetljivosti ili anafilaksije povezane sa bilo kojim FVIII proizvodom; (3) istorija pozitivnog testa na inhibitor ili klinički znaci smanjenog odgovora na FVIII primene (porodična anamneza inhibitora neće isključiti subjekta); (4) pozitivan rezultat testa na inhibitor, uzetog na skriningu, definisan kao ≥0,6 BU/mL; (5) abnormalna funkcija bubrega, definisana kao kreatinin u serumu >2,0 mg/dL, uzet na skriningu; (6) alanin aminotransferaza (ALT) ili aspartat aminotransferaza (AST) u serumu >5 × gornje granice normale (ULN), uzet na skriningu; (7) ukupan bilirubin u serumu >3 × ULN, uzet na skriningu; (8) upotreba fitusirana ili emicizumaba u periodu od 12 nedelja pre skrininga; (9) tretman unutar 12 nedelja pre skrininga terapeutskim monoklonskim antitelom, Fc fuzionim proteinom osim rFVIIIFc, ili IV imunoglobulinom; (10) tretman acetilsalicilnom kiselinom (ASA) unutar 2 nedelje pre skrininga ili tretman nesteroidnim antiinflamatornim lekovima (NSAIL) u dozi jednakoj ili većoj od maksimalne doze navedene u regionalnim informacijama o propisivanju za svaki proizvod; (11) sistemski tretman unutar 12 nedelja pre skrininga hemoterapijom i/ili drugim imunosupresivnim lekovima (osim za lečenje virusa hepatitisa C [HCV] ili HIV); dozvoljena je upotreba kortikosteroida, osim za sistemski kortikosteroidni tretman koji se daje svakodnevno ili svaki drugi dan u dozi od 20 mg/dan prednizona ili njegovog ekvivalenta duže od 14 dana; dozvoljena je lokalna, topikalna i/ili inhalaciona upotreba steroida; (12) velika hirurška intervencija unutar 8 nedelja pre skrininga (velika hirurška intervencija se definiše kao bilo koja hirurška procedura (elektivna ili hitna) koja obično, ali ne uvek, uključuje opštu anesteziju i/ili respiratornu asistenciju, pri kojoj se penetrira i izlaže velika telesna šupljina, ili se proizvodi značajno narušavanje fizičkih ili fizioloških funkcija (npr. laparotomija, torakotomija, kranijotomija, zamena zgloba ili amputacija ekstremiteta).

SEKVENCE

[0274]

VWF031 nukleotidna sekvenca (SEQ ID NO: 147)

Ċ

VWF031 proteinska sekvenca (SEQ ID NO: 86)

Ċ

VWF034 nukleotidna sekvenca (SEQ ID NO: 148)

Ċ

VWF034 proteinska sekvenca (SEQ ID NO: 87)

Ċ

VWF050 nukleotidna sekvenca (IHH trostruki mutant) (SEQ ID NO: 149) Ċ

VWF050 proteinska sekvenca (IHH trostruki mutant) (SEQ ID NO: 150) Ċ

VWF057 nukleotidna sekvenca (SEQ ID NO: 151)

Ċ

VWF058 nukleotidna sekvenca (VWF034 sa IHH mutacijom) (SEQ ID NO: 153)

VWF058 proteinska sekvenca (VWF034 sa IHH mutacijom) (SEQ ID NO: 154)

FVIII 169 nukleotidna sekvenca (SEQ ID NO: 155)

131

Ċ

FVIII 169 proteinska sekvenca (SEQ ID NO: 70)

Ċ

FVIII 263 nukleotidna sekvenca (IHH trostruki mutant) (SEQ ID NO: 156)

Ċ

FVIII 263 proteinska sekvenca (IHH trostruki mutant) (SEQ ID NO: 157) Ċ

FVIII 282 nukleotidna sekvenca (SEQ ID NO: 158)

Ċ

FVIII 282 proteinska sekvenca (SEQ ID NO: 159)

FVIII 283 nukleotidna sekvenca (FVIII 169 sa IHH trostrukom mutacijom) (SEQ ID NO: 160)

FVIII 283 proteinska sekvenca (FVIII 169 sa IHH trostrukom mutacijom) (SEQ ID NO: 161)

Ċ

pSYNFVIII 010 nukleotidna sekvenca-(dvolančani FVIIIFc) (SEQ ID NO: 162)

pSYNFVIII 010 proteinska sekvenca-(dvolančani FVIIIFc) (SEQ ID NO: 163)

FVIII 195 proteinska sekvenca (dvolančani FVIIIIFc sa dva 144 AE XTEN na aminokiselinama 1656 i 1900) (SEQ ID NO: 73)

Ċ

pSYN-FVIII-173 sekvenciranje zrelog proteina (SEQ ID NO: 72):

FVIII 196 proteinska sekvenca (dvolančani FVIIIFc sa tri 144 AE XTEN na aminokiselinama 26, 1656 i 1900) (SEQ ID NO: 74)

FVIII 199 proteinska sekvenca (jednolančani FVIIIFc sa tri 144 AE XTEN na aminokiselinama 1656 i 1900) (SEQ ID NO: 75)

FVIII 201 proteinska sekvenca (jednolančani FVIIIFc sa tri 144 AE XTEN na aminokiselinama 26, 1656 i 1900) (SEQ ID NO: 76)

FVIII 203 proteinska sekvenca (jednolančaniFVIIIFc sa dva AE XTEN; jedan 288AE XTEN u B-domenu i jedan 144 AE XTEN na aminokiselini 1900) (SEQ ID NO: 77) FVIII 204 proteinska sekvenca (jednolančaniFVIIIFc sa dva AE XTEN; jedan 288AE XTEN u B-domenu i jedan 144 AE XTEN na aminokiselini 403) (SEQ ID NO: 78)

FVIII 205 proteinska sekvenca (jednolančaniFVIIIFc sa dva AE XTEN; jedan 288AE XTEN u B-domenu i jedan 144 AE XTEN na aminokiselini 18) (SEQ ID NO: 79)

pSYN FVIII 266 proteinska sekvenca (FVIIIFc sa 42 AE-XTEN na aminokiselinama 18 i 288 AE XTEN u B-domenu) SEQ ID NO: 80)

pSYN FVIII 267 proteinska sekvenca (FVIIIFc sa 72 AE-XTEN na aminokiselinama 18 i 288 AE XTEN u B-domenu) SEQ ID NO: 81)

pSYN FVIII 268 proteinska sekvenca (FVIIIFc sa 144 AE-XTEN na aminokiselini 18) SEQ ID NO: 82)

pSYN FVIII 269 proteinska sekvenca (FVIIIFc sa 72 AE-XTEN na aminokiselini 18) SEQ ID NO: 83)

pSYNFVIII 271 proteinska sekvenca (FVIIIFc sa 42 AE-XTEN na aminokiselini 18) SEQ ID NO: 84)

pSYN FVIII proteinska sekvenca 272 ( FVIII sa 144 AE XTEN na aminokiselinama 18 i 244 AE XTEN u B-domenu- bez Fc) SEQ ID NO: 85)

pSYN-FVIII-161 proteinska sekvenca (SEQ ID NO: 69) (FVIII sekvenca aminokiselinskih pozicija 1-1457; podvučeni region predstavlja Fc region; talasasto podvučeni region predstavlja cepajući linker između prvog Fc i VWF fragmenta; dvostruko podvučeni region predstavlja VWF fragment; podebljani region predstavlja cepajući linker između VWF fragmenta i Fc).

Ċ

pSYN-FVIII-170 proteinska sekvenca (SEQ ID NO: 71)

pSYN FVIII 310 nukleotidna sekvenca (kodira FVIII sa potpunom delecijom B-domena osim 2 aminokiselinska ostatka i 288 AE-XTEN umetnutih nakon aa 742) (SEQ ID NO:170)

pSYN FVIII 310 proteinska sekvenca (FVIII sa potpunom delecijom B-domena osim 2 aminokiselinska ostatka i 288 AE-XTEN umetnutih nakon aa 742) (SEQ ID NO:171)

pSYN FVIII 312 nukleotidna sekvenca (kodira FVIII sa potpunom delecijom B-domena osim 5 aminokiselinskih ostataka i 288 AE-XTEN umetnutih nakon aa 745 - B5 verzija) (SEQ ID NO:172)

pSYN FVIII 312 proteinska sekvenca (FVIII sa potpunom delecijom B-domena osim 5 aminokiselinskih ostataka i 288 AE-XTEN umetnutih nakon aa 745 - B5 verzija) (SEQ ID NO:173)

pSYN VWF059 nukleotidna sekvenca (kodira VWF D'D3-Fc sa kiselim regionom 2 (a2) mestom trombina u linkeru) (SEQ ID NO: 196)

pSYN VWF059 proteinska sekvenca (VWF D'D3-Fc sa a2 regionom FVIII mesta trombina u linkeru) - podebljana podvučena oblast prikazuje a2 region (SEQ ID NO: 197)

pSYN VWF062 nukleotidna sekvenca (kodira VWF D'D3-Fc bez mesta trombina u linkeru) (SEQ ID NO: 198)

pSYN VWF062 proteinska sekvenca (VWF D'D3-Fc bez mesta trombina u linkeru) (SEQ ID NO: 199)

pSYN VWF073 nukleotidna sekvenca- (kodira VWFD1D2D'D3 - 144 AE XTEN - FVIII skraćeni a2 mesto trombina - Fc) (SEQ ID NO:174)

pSYN VWF073 proteinska sekvenca- (VWFD1D2D'D3 - 144 AE XTEN - skraćeni a2 mesto trombina - Fc) (SEQ ID NO:175)

Tabela 18: Primeri sekvenci himernih polipeptida

175 Ċ

Ċ

Tabela 19. Dodatne sekvence himernih polipeptida

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Himerni polipeptid koji obuhvata

(i) protein faktora VIII (FVIII) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 207;

i

(ii) protein Fon Vilebrandovog faktora (VWF) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 202,

za upotrebu u lečenju hemofilije A kod humanog subjekta kome je to potrebno, pri čemu se himerni polipeptid primenjuje intravenski u višestrukim dozama od 45 IU/kg do 55 IU/kg i interval doziranja je najmanje 7 dana, pri čemu je FVIII protein povezan sa VWF proteinom kovalentnom vezom.

2. Himerni polipeptid za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je kovalentna veza disulfidna veza.

3. Himerni polipeptid za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu je svaka od višestrukih doza 50 IU/kg, a interval doziranja je 7 dana.

4. Himerni polipeptid za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, pri čemu je himerni polipeptid za profilaktički tretman.

5. Himerni polipeptid za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, pri čemu subjekat ima tešku hemofiliju A.

6. Himerni polipeptid za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, pri čemu subjekat ima manje od 1 IU/dL endogenog FVIII.

7. Himerni polipeptid za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, pri čemu je subjekat prethodno primio tretman za hemofiliju A bilo kojim rekombinantnim FVIII, FVIII deriviranim iz plazme, ili krioprecipitatom tokom najmanje 150 dana izloženosti (ED).

8. Himerni polipeptid za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, pri čemu je subjekat ili

(a) trenutno na profilaktičkom režimu lečenja sa komercijalnim FVIII proizvodom i imao je najmanje četiri epizode krvarenja u dvanaest meseci pre primene himernog polipeptida; ili

(b) trenutno na režimu lečenja po potrebi sa komercijalnim FVIII proizvodom i imao je najmanje dvanaest epizoda krvarenja u dvanaest meseci pre primene himernog polipeptida.

9. Himerni polipeptid za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, pri čemu subjekat ima broj trombocita od najmanje 100,000 ćelija/µL.

10. Himerni polipeptid za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, pri čemu subjekat nema druge poremećaje koagulacije pored hemofilije A.

11. Himerni polipeptid za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10, pri čemu subjekat nema istoriju razvoja inhibitora na FVIII proizvod.

12. Himerni polipeptid za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 11, pri čemu se višestruke doze primenjuju tokom najmanje oko 1 mesec, najmanje oko 2 meseca, najmanje oko 3 meseca, najmanje oko 4 meseca, najmanje oko 5 meseci, najmanje oko 6 meseci, najmanje oko 12 meseci, najmanje oko 18 meseci, najmanje oko 2 godine, najmanje oko 3 godine, najmanje oko 4 godine, najmanje oko 5 godina, najmanje oko 10 godina, najmanje oko 15 godina, najmanje oko 20 godina, ili tokom najmanje oko 25 godina.

13. Himerni polipeptid za upotrebu u profilaktičkom lečenju teške hemofilije A kod subjekta kome je to potrebno, pri čemu himerni polipeptid obuhvata

(i) FVIII protein koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 207; i (ii) VWF protein koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 202; pri čemu se višestruke doze himernog polipeptida primenjuju intravenski kao pojedinačna nedeljna doza od 50 IU/kg.

14. Himerni polipeptid za upotrebu prema patentnom zahtevu 13, pri čemu se višestruke doze primenjuju tokom najmanje oko 6 meseci.

15. Himerni polipeptid za upotrebu prema patentnom zahtevu 13, pri čemu se višestruke doze primenjuju tokom najmanje oko 52 nedelje.