ES2396540T3

ES2396540T3 - Clonación y secuenciación del alérgeno Dac g5 y del polen de Dactylis glomerata, su preparación y su utilización

Info

Publication number: ES2396540T3
Application number: ES01940630T
Authority: ES
Inventors: Ronald Van Ree; Erica Van Oort; Caroline Bonneau; Loic Faye; Véronique GOMORD
Original assignee: Seita Groupe Altadis; Stallergenes SA
Current assignee: Seita Groupe Altadis; Stallergenes SA
Priority date: 2000-05-29
Filing date: 2001-05-29
Publication date: 2013-02-22
Anticipated expiration: 2021-05-29
Also published as: EP1285067B1; EP1285067A1; FR2809416B1; US20080166360A1; JP2003534803A; US20030147880A1; WO2001092532A1; FR2809416A1; AU2001274149A1; US7285650B2

Abstract

Molécula de ácido nucleico purificada, caracterizada porque comprende o está constituida por una secuencianucleotídica que codifica para i) el alérgeno Dac g cuya secuencia en aminoácidos está representada con el número SEC ID nº 2 en ellistado de secuencias adjunto; o ii) una de las isoformas maduras del alérgeno Dac g5 cuya secuencia en aminoácidos se selecciona de entrelas secuencias SEC ID nº 4, SEC ID nº 6 o SEC ID nº 8, del listado de secuencias adjunto, o un derivadofuncional y/o inmunológico de éste que presenta una homología de secuencias de aminoácidos superior al90% con la secuencia presentada con el número SEC ID nº 2 adjunta, y capaz de unirse a unos anticuerposanti-Dac g5.

Description

Clonación y secuenciación del alérgeno Dac g5 y del polen de Dactylis glomerata, su preparación y su utilización.

La presente invención tiene por objeto la clonación y la secuenciación de alérgenos de polen de Dactylis glomerata y más particularmente del alérgeno Dac g5. La presente invención tiene asimismo por objeto la producción de este alérgeno recombinante para ser incorporado en preparaciones útiles para el diagnóstico o el tratamiento de las alergias.

Los alérgenos son las proteínas más abundantes del polen y constituyen la causa principal de alergias en los climas templados. El alérgeno objeto de la presente invención es Dac g5 del polen de Dactylis glomerata.

Ciertos individuos predispuestos genéticamente se vuelven hipersensibles (alérgicos) a unos antígenos que proceden de fuentes medioambientales muy variadas. Los antígenos capaces de inducir una reacción de hipersensibilización inmediata o retardada se denominan alérgenos. Los alérgenos pueden en particular tener su origen en los árboles, las plantas herbáceas, los insectos, los mamíferos, la comida, los medicamentos o productos químicos. Los alérgenos se clasifican en grupos I a V según sus propiedades inmunoquímicas. El alérgeno Dac G5 de Dactylis glomerata pertenece al grupo V, como el alérgeno Lol pV de Lolium perenne.

Los anticuerpos implicados en la alergia pertenecen a la clase de las inmunoglobulinas de tipo IgE. En presencia de un alérgeno, las IgE se unen a los mastocitos y a los basófilos, lo cual conduce a la liberación por estas células de diferentes mediadores químicos y a la manifestación de la alergia.

Ésta puede adoptar diferentes formas, como por ejemplo un choque anafiláctico, asma, rinitis o dermatitis atópica.

Cuando se ha establecido el diagnóstico de la alergia a un compuesto particular, la desensibilización del paciente frente al alérgeno implicado es el enfoque terapéutico más frecuente, en particular cuando no se puede evitar la presencia del alérgeno, como en el caso del polen y de los ácaros. Este tipo de tratamiento ha demostrado su eficacia, pero es necesario disponer de un producto eficaz y seguro. En efecto, el tratamiento presenta un riesgo de choque anafiláctico, además, el producto administrado debe estar desprovisto de cualquier impureza que pudiera constituir otro alérgeno potencial. Ahora bien, hoy en día, sólo se utilizan unas mezclas complejas de alérgenos y sin productos puros. Por lo tanto, es necesario poder disponer de alérgenos con una forma estructural lo más parecida posible al alérgeno nativo, y que presente el mayor grado de pureza posible.

Uno de los medios posibles para alcanzar este objetivo es la producción de alérgenos recombinantes en un organismo hospedante (Laffer, S. et al., J. Allergy Clin. Immunol., Septiembre 1996, volumen 98, nº 3, páginas 652658).

A título de ejemplos, se pueden citar la solicitud de patente publicada con el nº 819 763, que describe la producción de alérgeno Der fII modificado. La patente europea publicada con el nº 406 286 describe la clonación de un alérgeno principal del polen de la cizaña, Lol p1, y la expresión de este gen. La solicitud de patente publicada con el nº 473 111 se refiere asimismo a la producción de alérgenos de ácaros recombinantes utilizados para la desensibilización. La solicitud de patente publicada con el nº 463 059 se refiere a alérgenos derivados de la ambrosía y la utilización de estas proteínas. Estos documentos presentan la expresión de los genes y la producción de las proteínas en E. coli.

Este sistema de expresión adolece del inconveniente de no asegurar las modificaciones post-traduccionales de las proteínas que se pueden realizar en las células eucariotas. Por ejemplo, las proteínas producidas no están glicosiladas, ahora bien, la glicosilación de ciertas proteínas alérgenas puede ser importante para su capacidad de fijación a las IgE (Van Ree et al., J. Biol. Chem., 2000, volumen 275, páginas 11451-11458).

La presente invención se refiere a la clonación, a la secuenciación y a la preparación de una molécula de ácido nucleico purificada que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para la proteína que constituye el alérgeno Dac G5 o un derivado de ésta. La presente invención se refiere asimismo a la inserción de este ácido nucleico en un vector de expresión y a la producción de la proteína recombinante en un organismo o microorganismo hospedante, en particular en unas células vegetales y unas plantas, o parte de plantas, y preferentemente en unas suspensiones celulares y plantas de tabaco. Este alérgeno se produce para su utilización en diagnóstico e inmunoterapia.

La producción de los alérgenos en unas células vegetales, como por ejemplo el tabaco, presenta la ventaja de permitir la producción de proteínas recombinantes glicosiladas. Este medio de producción no se ha utilizado jamás hasta ahora para la producción de alérgenos.

Los trabajos realizados en el marco de la presente invención se han referido:

-: a la clonación del ADNc de Dac g5,

-: a la inserción de la molécula de ácido nucleico clonada en un vector de expresión apropiado,

-: a la producción de Dac g5 recombinante en unos sistemas biológicos,

-: a los ensayos inmunológicos del alérgeno purificado.

Dac g5 es una proteína de 26,5 kDa, de 265 aminoácidos, reconocida por lo menos por el 90% de los sujetos alérgicos al polen de gramíneas.

El alérgeno Dac g5 de Dactylis glomerata pertenece a los alérgenos del grupo V. Se han descrito unas secuencias nucleotídicas que codifican para los alérgenos homólogos a Dac g5 en la técnica anterior (WO 95/06728). Los inventores han definido unos oligonucleótidos degenerados a partir de estas secuencias, con el fin de amplificar específicamente mediante la técnica de RT-PCR un ADNc que codifica Dac g5. Un fragmento de ADNc de tamaño esperado se clonó a partir de una población de ARN totales de polen de Dactylis glomerata y después se secuenció. Este fragmento se utilizó para definir unos cebadores específicos para los protocolos 5' y 3' RACE-PCR. Estos protocolos han permitido completar los extremos 5' y 3' del fragmento. Después de la amplificación de los extremos 5' y 3', se secuenció el ADNc completo que codifica para Dac g5.

Las secuencias obtenidas han permitido definir nuevos cebadores específicos de Dac g5, estos cebadores se han utilizado para clonar el ADNc de la pro-forma y de la forma madura del alérgeno. Las secuencias nucleotídicas de los cebadores utilizadas para las reacciones de PCR son las siguientes:

-: cebador sentido (pro-forma), representado en la figura 2A (cebador Cl) y con el número SEC ID nº 9 en el listado de secuencias adjunto:

5'GGG TCT AGA ATG GCG GTC CAG AAG TAC ACC 3'

-: cebador antisentido, utilizado para clonar la pro-forma, representado en la figura 2A (cebador F1) y con el número SEC ID nº 10 en el listado de secuencias adjunto:

5'GGG GAG CTC TCA GAC TTT GTA GCC ACC GGC 3'

-: cebador sentido (forma madura), representado en la figura 2A (cebador F2) y con el número SEC ID nº 11 en el listado de secuencias adjunto:

5'AAG CTC GAG AAA AGA GCC GAC GCC GGC TAC ACC 3'

-: cebador antisentido, utilizado para clonar la forma madura, representado en la figura 2A (cebador R2) y con el número SEC ID nº 12 en el listado de secuencias adjunto:

5'GGG GGC GGC CGC TCA GAC TTT GTA GCC ACC GGC 3'

Se han secuenciado los clones ADNc, se ha determinado la secuencia en aminoácidos que corresponde a cada secuencia nucleotídica.

Los inventores por lo tanto han conseguido ahora clonar y secuenciar el ácido nucleico que codifica para el alérgeno Dac g5 del polen de Dactylis glomerata. En consecuencia, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico purificada constituida por, o que comprende, una secuencia nucleotídica que codifica para el alérgeno Dac g5 o un derivado de ésta. La secuencia en aminoácido de la pro-forma del alérgeno Dac g5 está representada en la figura 1 y con el número SEC ID nº 2 en el listado de secuencias adjunto. Un fragmento de esta secuencia, delimitado por los aminoácidos en posición 25 a 290, constituye la proteína madura Dac g5. La secuencia en aminoácido de la forma madura del alérgeno Dac g5 está representada en la figura 1 y con el número SEC ID nº 4 en el listado de secuencias adjunto.

La figura 1 adjunta da la secuencia nucleotídica y peptídica de la pro-forma del alérgeno Dac g5 (isoforma 1). La secuencia subrayada corresponde a la secuencia señal ausente de la proteína madura. Los codones y los aminoácidos que difieren en la isoforma 2 están enmarcados. La tabla 1 siguiente indica las variaciones observadas entre las isoformas 1 y 2.

Tabla 1

Posición de los aminoácidos: Isoforma 1 Isoforma 2

40: Thr (ACC) Ala (GCT)

51: Thr (ACG) Lys (AAG)

265: Val (GTT) Ala (GCT)

La figura 2 representa en A la secuencia de los cebadores, y en B las secuencia de la pro-forma del alérgeno Dac g5 y el posicionamiento de los cebadores en esta secuencia.

Se entiende por derivado de la proteína que constituye el alérgeno Dac g5, una proteína cuya secuencia en aminoácidos difiere por la modificación, la supresión o la adición de uno o varios aminoácidos a partir del momento en el que esta proteína es funcionalmente y/o inmunológicamente equivalente a Dac g5.

Dichas modificaciones pueden resultar de la degeneración del código genético o de modificaciones de la secuencia en ácido nucleico mediante cualquier técnica de biología molecular. El experto en la materia está en condiciones de determinar entre estas secuencias las que presentan unas propiedades funcionales e inmunológicas idénticas o parecidas a Dac g5, por ejemplo con la ayuda de anticuerpos. Para ello, los inventores han clonado dos isoformas de Dac g5. Las secuencias en aminoácido de estas isoformas maduras del alérgeno Dac g5 están representadas con los números SEC ID nº 6 y SEC ID nº 8, del listado de secuencias adjunto. La invención prevé por lo tanto asimismo las isoformas de la proteína que constituyen el alérgeno Dac g5 y que presentan una homología de secuencias en aminoácidos superior al 50%, preferentemente superior al 70% y muy preferentemente superior al 90% con la secuencia representada con el número SEC ID nº 2 adjunta. La invención prevé más particularmente una proteína, un derivado funcional e inmunológicamente equivalente a Dac g5, cuya secuencia en aminoácidos se selecciona de entre las secuencias SEC ID nº 6 y SEC ID nº 8 del listado de secuencias adjunto.

Se entiende por fragmento de la proteína que constituye el alérgeno Dac g5, cualquier péptido o polipéptido procedente de la proteína, más particularmente útil para el diagnóstico de la alergia.

Una molécula de ácido nucleico purificada que comprende, o que está constituida, por una secuencia nucleotídica (ADNc) que codifica para la pro-forma del alérgeno Dac g5 está representada con el número SEC ID nº 1 en el listado de secuencias adjunto. La invención se refiere también a un derivado, y más particularmente a una molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína madura que está delimitada por los nucleótidos en posición 75 a 870 de la secuencia nucleotídica representada con el número SEC ID nº 1 en el listado de secuencias adjunto. Esta secuencia está representada con el número SEC ID nº 3 en el listado de secuencias adjunto.

La invención se refiere asimismo a las moléculas de ácido nucleico que codifican unas isoformas de la proteína Dac g5 madura y más particularmente aquellas en las que las secuencias de aminoácidos están representadas con los números SEC ID nº 6 y SEC ID nº 8 en el listado de secuencias adjunto.

A partir de la secuencia nucleotídica que codifica para Dac g5 o una de sus isoformas, el experto en la materia puede definir unas secuencias nucleotídicas que codifican para unas proteínas o polipéptidos que corresponden a un fragmento de Dac g5 o de una de sus isoformas y que poseen por ejemplo por lo menos un epítopo de Dac g5 o un epítopo de una de las isoformas de Dac g5. Puede definir también una secuencia nucleotídica que codifica para unas proteínas equivalentes funcionalmente a Dac g5 o a una de sus isoformas pero cuya secuencia de aminoácidos no es idéntica a la de Dac g5 o a una de sus isoformas.

Por último, puede definir una secuencia nucleotídica que codifica para unas proteínas equivalentes a Dac g5 o a una de sus isoformas en el plano inmunológico. Estas proteínas son, por ejemplo, capaces de enlazarse a unos anticuerpos anti-Dac g5, pero no poseen la función enzimática del alérgeno Dac g5 nativo. Se entiende más particularmente por derivado de una molécula de ácido nucleico según la invención, una molécula de ácido nucleico capaz de hibridarse en condiciones de hibridación estándares con una de las secuencias nucleotídicas representadas con los números SEC ID nº 1 y SEC ID nº 3 en el listado de secuencias adjunto. Se trata, por ejemplo, de las secuencias nucleotídicas que codifican las isoformas de Dac g5 representadas con los números SEC ID nº 5 y SEC ID nº 7 del listado de secuencias adjunto.

Se describe asimismo la mutagénesis de la proteína que permite introducir en ciertas posiciones definidas de la proteína uno o varios sitios que llevan una función particular. Puede tratarse, por ejemplo, de introducir un sitio de N-glicosilación sobre el alérgeno.

La invención se refiere también a una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica para el alérgeno Dac g5 o una de sus isoformas, o un derivado de éstos funcional y/o inmunológico de la proteína Dac g5, o de una de sus isoformas, un promotor unido de manera funcional a dicha secuencia, eventualmente un gen de selección dispuesto bajo el control de su propio promotor o incluso del mismo promotor que dicha secuencia, y ventajosamente una secuencia de terminación dispuesta aguas abajo de dicha secuencia. Puede tratarse de un casete o preferentemente de un vector de expresión que comprende en particular un origen de replicación eucariota o procariota, una secuencia promotora adaptada, un marcado de selección y una secuencia nucleotídica que codifica para el alérgeno Dac g5 o una de sus isoformas, o un derivado de éstos dispuesto bajo el control de dichas secuencias de regulación. El experto en la materia seleccionará sin dificultad, de entre los vectores de expresión conocidos de la técnica anterior, el vector mejor adaptado para el organismo hospedante en el que tiene previsto producir la proteína.

La invención prevé, muy particularmente, para la producción de la proteína que constituye el alérgeno Dac g5 o una de sus isoformas, un vector que permite la expresión del ácido nucleico en unas células eucariotas, y preferentemente en unas células vegetales o en unas levaduras.

También se puede construir el vector de expresión con el fin de permitir la producción de la proteína recombinante definida anteriormente en forma de una proteína de fusión. El polipéptido fusionado a la proteína de interés puede ser en particular útil para permitir o facilitar la purificación de ésta. Este polipéptido puede ser en particular una secuencia constituida por varias histidinas o "Histidine-Tag" añadidas en una región variable no crítica para la actividad y la conformación de la molécula, puede tratarse de una región interna o de un extremo N- o C-terminal. La adición de una secuencia "Histidine-Tag" permite purificar la proteína recombinante mediante cromatografía de afinidad sobre una columna de metal quelado.

La invención se refiere asimismo a un hospedante, eucariota o procariota, transformado por un vector de expresión como se ha definido anteriormente. Este hospedante puede por ejemplo ser E. coli, Saccharomyces cerevisiae, Pichia Pastoris, o una célula vegetal, en particular una célula de Nicotiana tabacumdans en cuyo genoma se incorpora de manera estable la molécula de ácido nucleico que codifica para el alérgeno Dac g5 o una de sus isoformas o un derivado de éstos.

La presente invención se refiere asimismo a un organismo o microorganismo, preferentemente una célula o una planta, muy preferentemente de tabaco, que ha incorporado en su genoma, ventajosamente de manera estable, una molécula de ácido nucleico de la invención colocada bajo el control de una secuencia de regulación con el fin de expresar el alérgeno Dac g5 o una de sus isoformas en estas células, en una planta o una parte determinada de planta.

Se pueden preparar unas plantas transgénicas según la invención transformando una célula vegetal con dicha molécula de ácido nucleico y después regenerando una planta a partir de la célula transformada.

La invención se refiere a un procedimiento de obtención de la proteína Dac g5 recombinante o de una de sus isoformas, o de un derivado funcional o inmunológico de Dac g5 o de una de sus isoformas. Este procedimiento comprende el cultivo de un organismo, procariota o eucariota, transformado por un vector de expresión tal como se ha definido anteriormente, en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la expresión de dicha proteína.

Este procedimiento comprende también el aislamiento de las proteínas producidas a partir del cultivo de los organismos transformados. En el caso particular de la expresión de proteínas recombinantes en unas células de tabaco, las células que expresan el alérgeno de interés se seleccionan por inmunodetección con la ayuda de un anticuerpo dirigido contra la forma natural de Dac g5. Los alérgenos se localizan por fraccionamiento celular, y después se purifican a partir de suspensiones celulares transgénicas por inmunodetección con la ayuda de un anticuerpo dirigido contra la forma natural de Dac g5. El procedimiento según la invención comprende también el análisis estructural e inmunológico de la o de las proteínas producidas.

Se describe asimismo por lo tanto el alérgeno Dac g5 o un derivado de éste recombinante obtenido mediante dicho procedimiento. La invención se refiere a la pro-forma y a la forma madura del alérgeno Dac g5. La invención se refiere a las isoformas de la forma madura de Dac g5. Se describen asimismo unos fragmentos peptídicos o polipeptídcos de Dac g5 o de una de sus isoformas, así como unas proteínas funcionalmente o inmunológicamente equivalentes a Dac g5 o a una de sus isoformas. Las proteínas equivalentes a Dac g5 o a una de sus isoformas pueden ser obtenidas en particular mediante mutagénesis dirigida aplicada a la molécula de ADN que codifica para Dac g5 o una de sus isoformas. Se describe asimismo una proteína de fusión recombinante que comprende la proteína Dac g5 o una de sus isoformas, un fragmento de estas proteínas o un equivalente funcional o inmunológico.

Este alérgeno recombinante, un derivado de éste, como el alérgeno natural, pueden ser utilizados para preparar unos anticuerpos monoclonales o policlonales. Los anticuerpos monoclonales se preparan según unas técnicas clásicas, bien conocidas por el experto en la materia. Se pueden obtener unos anticuerpos policlonales inmunizando unos animales con el alérgeno Dac g5 con la ayuda de un adyuvante adaptado, los anticuerpos son después purificados del suero de los animales inmunizados.

Estos anticuerpos pueden servir asimismo para detectar la presencia del alérgeno Dac g5, de un fragmento peptídico de la proteína o de una de sus isoformas o de un equivalente inmunológico de éstas, en un medio particular como por ejemplo un medio de cultivo.

La invención se refiere además a las composiciones farmacéuticas destinadas al tratamiento y/o al diagnóstico de una alergia y que comprenden como principio activo una cantidad eficaz de Dac g5, de una de las isoformas de la proteína

o de un derivado funcional o inmunológico de ésta, o también de un anticuerpo dirigido contra ésta. En estas composiciones, el principio activo está asociado a un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones destinadas al tratamiento de la alergia se formulan según unos principios adaptados y conocidos por el experto en la materia con el fin de ser inyectadas por vía subcutánea o mediante cualquier otra vía de administración.

La invención se refiere asimismo a un procedimiento de detección de la sensibilidad manifestada por un individuo al polen de herbáceas y en particular al polen de Dactylis glomerata. Este procedimiento comprende la detección de la presencia de anticuerpos que une una de las isoformas de la proteína recombinante Dac g5 o un derivado funcional y/o inmunológico de éstas, o un anticuerpo específico de éstas. Este procedimiento comprende en particular una etapa durante la cual una muestra que procede del individuo se pone en contacto con una de las isoformas de la proteína recombinante Dac g5, un derivado de éstas o un anticuerpo dirigido contra éstos, en unas condiciones que permiten la

5 formación de un complejo antígeno/anticuerpo, y después la detección de dicho complejo.

La invención se refiere por último a un agente reactivo de diagnóstico de una alergia, caracterizado porque comprende una preparación que contiene una de las isoformas de la proteína recombinante Dac g5 y/o un derivado de una de las isoformas de Dac g5, o un anticuerpo dirigido contra éstas.

Listado de secuencias

<110> SEITA

STALLERGENE 15

<120> Clonación y secuenciación del alérgeno Dac g5 del polen de Dactylis glomerata, su preparación y su utilización

<130> 7770PCTDACG5

20 <140> XXXXX

<141>

<150> FR00/06857

<151> 25

<160> 12

<170> PatentIn Ver. 2.1

<210> 1 30 <211> 873

<212> ADN

<213> Dactylis glomerata

<220> 35 <221> CDS

<222> (1) .. (873)

<223> pro-secuencia Dac g5

<400> 1

<210> 2

<211> 290

<212> PRT

<213> Dactylis glomerata

<400> 2

<210> 3

<211> 798 5 <212> ADN

<213> Dactylis glomerata

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(798)

<223> Dac g5 secuencia madura

<400> 3

<210> 4

<211> 265

<212> PRT

<213> Dactylis glomerata

<400> 4

<210> 5

<211> 798 5 <212> ADN

<213> Dactylis glomerata

<220>

<221> CDS 10 <222> (1) .. (798)

<223> Dac g5 secuencia madura isoforma 1

<400> 5

<210> 6

<211> 265

<212> PRT

<213> Dactylis glomerata

<400> 6

<210> 7

<211> 798 5 <212> ADN

<213> Dactylis glomerata

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(798)

<223> Dac g5 secuencia madura isoforma 2

<400> 7

<210> 8

<211> 265

<212> PRT

<213> Dactylis glomerata

<400> 8

5: <210> 9 <211> 30 <212> ADN <213> Dactylis glomerata

10: <220> <221> misc_feature <222> (1) .. (30) <223> cebador sentido prosecuencia

<400> 9

15: gggtctagaa tggcggtcca gaagtacacc 30

20: <210> 10 <211> 30 <212> ADN <213> Dactylis glomerata

25: <220> <221> misc_feature <222> (1) .. (30) <223> Cebador antisentido prosecuencia

<400> 10

30 35: ggggagctct cagactttgt agccaccggc <210> 11 <211> 33 <212> ADN <213> Dactylis glomerata <220> <221> misc_feature 30

<222> (1) .. (33) <223> Cebador sentido secuencia madura

5: <400> 11 aagctcgaga aaagagccga cgccggctac acc 33

10: <210> 12 <211> 33 <212> ADN <213> Dactylis glomerata

15: <220> <221> misc_feature <222> (1) .. (33) <223> Cebador antisentido secuencia madura

<400> 12

20: gggggcggcc gctcagactt tgtagccacc ggc 33

Claims

REIVINDICACIONES

1. Molécula de ácido nucleico purificada, caracterizada porque comprende o está constituida por una secuencia nucleotídica que codifica para

i) el alérgeno Dac g5 cuya secuencia en aminoácidos está representada con el número SEC ID nº 2 en el listado de secuencias adjunto; o

ii) una de las isoformas maduras del alérgeno Dac g5 cuya secuencia en aminoácidos se selecciona de entre las secuencias SEC ID nº 4, SEC ID nº 6 o SEC ID nº 8, del listado de secuencias adjunto, o un derivado funcional y/o inmunológico de éste que presenta una homología de secuencias de aminoácidos superior al 90% con la secuencia presentada con el número SEC ID nº 2 adjunta, y capaz de unirse a unos anticuerpos anti-Dac g5.
2.

Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, caracterizada porque comprende o está constituida por una secuencia nucleotídica seleccionada de entre las secuencias SEC ID nº 1, SEC ID nº 3, SEC ID nº 5 o SEC ID nº 7 del listado de secuencias adjunto.
3.

Molécula de ácido nucleico recombinante, caracterizada porque comprende una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, un promotor unido de manera funcional a dicha molécula de ácido nucleico, eventualmente un gen de selección colocado bajo el control de su propio promotor o del mismo promotor que dicha molécula de ácido nucleico, y ventajosamente una secuencia de terminación colocada aguas abajo de dicha molécula de ácido nucleico.
4.

Vector de expresión, caracterizado porque comprende un origen de replicación eucariota o procariota, una secuencia promotora adaptada, un marcador de selección y una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, colocada bajo el control de dichas secuencias de regulación.
5.

Hospedante eucariota no humano o procariota transformado por una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 3, o por un vector de expresión según la reivindicación 4.
6.

Hospedante según la reivindicación 5, caracterizado porque está constituido por una célula vegetal en cuyo genoma se incorpora, ventajosamente de manera estable, una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
7.

Planta y muy preferentemente planta de tabaco, que ha incorporado de manera estable en su genoma una molécula de ácido nucleico, según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, colocada bajo el control de una secuencia de regulación de manera que el alérgeno Dac g5 se exprese en una parte determinada de la planta.
8.

Suspensión celular, muy particularmente de tabaco, cuyas células han incorporado de manera estable en su genoma una molécula de ácido nucleico, según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, colocada bajo el control de una secuencia de regulación de manera que el alérgeno Dac g5 se exprese en dichas células.
9.

Levadura que ha incorporado de manera estable en su genoma una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, colocada bajo el control de una secuencia de regulación de manera que se exprese el alérgeno Dac g5.
10.

Procedimiento de obtención de la proteína Dac g5 recombinante, de una isoforma o de un derivado funcional o inmunológico de ésta, tales como se han definido en la reivindicación 1, caracterizado porque comprende el cultivo de un organismo, procariota o eucariota, transformado por una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 3,

o por un vector de expresión según la reivindicación 4, en unas condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la expresión de dicha proteína, y después el aislamiento de las proteínas producidas a partir del cultivo de los organismos transformados.
11.

Proteína recombinante que comprende o que está constituida por el alérgeno Dac g5 de secuencia SEC ID nº 2, una isoforma de éste de secuencia seleccionada de entre las secuencias SEC ID nº 4, SEC ID nº 6 o SEC ID nº 8, o un derivado de éste que presenta una homología de secuencias de aminoácidos superior al 90% con la secuencia presentada con el número SEC ID nº 2 y capaz de unirse a unos anticuerpos anti-Dac g5.
12.

Composición farmacéutica para el tratamiento o el diagnóstico de una alergia, caracterizada porque comprende como principio activo una cantidad eficaz de una proteína según la reivindicación 11 o de un anticuerpo obtenido mediante inmunización de un animal con esta proteína y dirigido contra esta proteína.
13.

Procedimiento in vitro de detección de la sensibilidad manifestada por un individuo al polen de herbáceas y en particular al polen de Dactylis glomerata, caracterizado porque comprende la puesta en contacto de una muestra que procede de un individuo con la proteína según la reivindicación 11 o un anticuerpo obtenido por inmunización de

un animal con esta proteína y dirigido contra esta proteína, en unas condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno/anticuerpo, y después la detección de dicho complejo.
14.

Agente reactivo de diagnóstico de una alergia, caracterizado porque comprende una proteína según la reivindicación 11 o un anticuerpo obtenido por inmunización de un animal con esta proteína y dirigido contra esta proteína.