ES2318077T3 - Polipeptidos hipoalergenicos basados en parvalbumina de peces. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido mutado, derivado de parvalbúmina de pescado, seleccionado entre el grupo que consiste en: (a) polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, en la que los aminoácidos situados en las posiciones 52, 54, 91 y 93 se han sustituido; y (b) polipéptidos que comprenden los aminoácidos del 2 al 109 del SEQ ID NO: 4.

Description

Polipéptidos hipoalergénicos basados en parvalbúmina de peces.

La presente invención se refiere a polipéptidos derivados de la parvalbúmina de carpa, el principal alergeno del pescado. Esos polipéptidos presentan una actividad alergénica disminuida y son útiles como vacunas contra la alergia, para el tratamiento de pacientes alérgicos sensibilizados y para la vacunación profiláctica.

Junto con la leche, huevos, cacahuetes, frutos secos y mariscos, el pescado representa la fuente más importante de alergenos en la inducción de la hipersensibilidad alimentaria mediada por IgE (Bischoff y col., 1996; Etesamifar y Wüthrich 1998; Sampson 1999). Aunque no es un problema sanitario generalizado a nivel mundial, la alergia al pescado puede alcanzar una prevalencia de 1 por cada 1000 individuos en países consumidores de pescado y con industria de procesamiento de pescado (Aas 1987). En los individuos sensibilizados, no sólo el contacto con pescado y su consumo, sino también la inhalación del vapor generado durante su cocinado, puede provocar diversos síntomas clínicos mediados por IgE que afectan a la piel, a las vías respiratorias y al tubo digestivo (Aas 1987; Pascual y col., 1992; O'Neil y col., 1993).

Las parvalbúminas, pequeñas proteínas de unión a calcio, muy abundantes en los músculos blancos de vertebrados inferiores (Pechere 1997) y presentes en menores cantidades en los músculos de contracción rápida de vertebrados superiores (Lehky y col., 1974), se han identificado como los principales alergenos de pescado. Estas proteínas pertenecen a la superfamilia manos EF de proteínas de unión a calcio, que se caracteriza por la presencia de dominios de unión a metales, del tipo hélice-bucle-hélice, denominados manos EF (Kretsinger, 1980). Las parvalbúminas contienen tres de esos motivos en manos EF, (los sitios AB, CD y EF) (Berchtold, 1989; Heizmann y Hunziker, 1991; Ikura, 1996). Dos de estos sitios (CD y EF) están emparejados formando un dominio estable capaz de unir dos cationes, Ca^{2+} o Mg^{2+}. El primero de esos sitios, (AB), no es capaz de unir cationes, pero forma una cubierta que cubre la superficie hidrófoba de la pareja de dominios funcionales y de esta manera actúa como elemento estabilizador (Kretsinger y Nockold, 1973; Declercq y col., 1991; Permyakov y col., 1991). Sobre la base de los datos aportados por las secuencias de aminoácidos, la familia de las proteínas parvalbúminas se puede subdividir en dos linajes evolutivamente diferentes: el grupo \alpha, que consiste en parvalbúminas menos ácidas, con puntos isoeléctricos de, o superiores a, pI 5,0, y el grupo \beta, que consiste en parvalbúminas más ácidas, con puntos isoeléctricos de, o inferiores a, pI 4,5 (Goodman y Pechere, 1977).

Las parvalbúminas muestran una notable resistencia al calor, a los compuestos químicos desnaturalizantes y a las enzimas proteolíticas, características que podría capacitarlas para actuar como potentes agentes sensibilizantes en más del 95% de los pacientes alérgicos al pescado (Aas y Elsayed, 1969; De Martino y col., 1990; O'Neil y col., 1993; Lindstroem y col., 1996; Bugajska-Schretter y col., 1998).

Los autores de la invención encontraron que los pacientes que promueven una respuesta de anticuerpos IgE contra la parvalbúmina de una de las especies de pescados, también reconocen las proteínas homólogas de otras especies de pescados (Bugajska-Schretter y col., 1998). En experimentos de competición con IgE, realizados con parvalbúmina de carpa purificada, los autores de la invención demostraron además que la parvalbúmina de carpa contiene la mayoría de los epítopos para IgE presentes en extractos de proteínas de pescado de diferentes especies (Bugajska-Schretter y col., 2000). Esto demostró la importancia de las parvalbúminas como alergenos de pescado que producen reacciones cruzadas y explicó el porqué los individuos alérgicos exhiben síntomas clínicos tras contacto con distintas especies de pescados.

Hasta la fecha, el único enfoque curativo contra la alergia de tipo I es una inmunoterapia específica contra los alergenos, que está basada en la administración sistémica de cantidades crecientes de alergenos que inducen la aparición de la enfermedad, en forma de extractos que contienen los alergenos, con el propósito de inducir en el paciente un estado de ausencia de respuesta específica al alergeno (Bousquet y col., 1998). Sin embargo, aunque la inmunoterapia específica contra los alergenos se usa de manera muy generalizada en el tratamiento de las alergias respiratorias y de las producidas por venenos, es demasiado peligroso aplicarla en el caso de las alergias alimentarias. Esto es debido al riesgo extremadamente alto de que se produzcan reacciones anafilácticas graves, causadas por la aplicación sistémica de alergenos alimentarios y por la presencia de algunos componentes mal definidos en los extractos de alimentos (y en especial, en los extractos de pescado).

Durante los últimos años, la aplicación de la tecnología del DNA recombinante al campo de la Alergología ha permitido producir un número creciente de alergenos recombinantes y biológicamente activos mediante clonación y expresión de cDNA en hospedadores heterólogos (Valenta y Kraft, 1995). Con los alergenos recombinantes, que imitan fielmente la actividad alergénica de sus correspondientes homólogos naturales, se ha hecho posible determinar el perfil individual de reactividad de los pacientes y desarrollar estrategias de vacunación basadas en componentes, dirigidas a una inmunoterapia específica y diseñada a la medida de los pacientes (Valenta y col., 1998).

Realizando el escrutinio de una genoteca de expresión de cDNA de músculo de carpa, con IgE sérica de pacientes alérgicos al pescado, los autores de la invención han aislado clones de cDNA que codifican isoformas de parvalbúmina reactivas con IgE (Cyp c 1.01 y Cyp c 1.02) y han producido la primera parvalbúmina recombinante de pescado (rCyp c 1.01), que posee características inmunológicas comparables con las del alergeno natural (Swoboda y col., 2002). La rCyp c 1.01 reaccionó con la IgE procedente de todos los pacientes alérgicos al pescado sometidos al ensayo, indujo una liberación de histamina, específica y dependiente de la dosis, por parte de los basófilos, y contenía la mayoría de los epitopos para IgE (el 70%) presentes en extractos de alergenos naturales procedentes de diversas especies de pescado.

La molécula de la rCyp c 1.01 de tipo salvaje no se puede usar con fines terapéuticos. Su administración, incluso a dosis muy bajas, acarrearía un riesgo enorme de inducir efectos secundarios anafilácticos, potencialmente mortales. Un objetivo de la presente invención es proporcionar mutantes o variantes de rCyp c 1.01 con una actividad alergénica disminuida. Los autores de la invención proponen que una de las posibilidades para obtener esos derivados hipoalergénicos de parvalvúmina será la mutagénesis dirigida a sitio específico de aminoácidos críticos, ya estén éstos situados dentro o fuera de los epítopos para IgE, realizada de manera que altere el plegamiento y disminuya el contenido en estructura secundaria de la proteína. Sin embargo, la resistencia de las parvalbúminas frente a factores desestabilizadores, tales como el calor, compuestos químicos desnaturalizantes o enzimas proteolíticas (Elsayed y Aas, 1971), sugiere que quizá sea difícil obtener cambios conformacionales espectaculares que modifiquen la actividad alergénica de la molécula, con la alteración de solamente unos cuantos aminoácidos.

La invención tiene como objetivo proporcionar medios para el tratamiento profiláctico o terapéutico de alergias alimentarias a los alergenos de pescado. Se ha encontrado que mutantes de la parvalbumina de carpa, e.g., de Cyp c 1.01, muestran una fuerte disminución de su unión a IgE y son por lo tanto útiles como agentes hipoalergénicos. La secuencia de aminoácidos de Cyp c 1.01 se muestra en el SEQ ID NO: 1. La invención se refiere a un polipéptido mutado, derivado de parvalbúmina de pescado, seleccionado entre el grupo que consiste en:

(a) polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 1, en la que los aminoácidos situados en las posiciones 52, 54, 91 y 93 se han sustituido; y

(b) polipéptidos que comprenden los aminoácidos del 2 al 109 del SEQ ID NO: 4.

Según aquí se usa, el término "polipéptido" significa un compuesto que comprende al menos 7 aminoácidos que están unidos por enlaces peptídicos. El polipéptido preferiblemente se compone sólo de aminoácidos, pero también puede comprender componentes no proteináceos. La longitud del polipéptido es preferiblemente de al menos 10 aminoácidos, más preferiblemente, de al menos 15 aminoácidos. El polipéptido también puede ser una proteína de fusión que comprende una porción que deriva de la Cyp c 1.01 y una pareja de fusión. La porción derivada de Cyp c 1.01 puede además estar unida a una molécula de transporte, p. ej., la hemocianina de lapa californiana (KLH) (del inglés, " KeyHole Limpet Hemocyanin".

La expresión "parvalbúmina de pescado", según aquí se usa, designa a un polipéptido de unión a calcio, cuya secuencia de aminoácidos es idéntica al menos en el 60% a la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 1. Estos polipéptidos tienen secuencias de aminoácidos idénticas a las de los respectivos alergenos de pescado presentes en la naturaleza.

Un polipéptido "mutado", según la invención, es un polipéptido que ha sido manipulado introduciendo una mutación (sustitución, adición o deleción) en un polipéptido presente en la naturaleza tal como una parvalbúmina de pescado de tipo salvaje.

Un polipéptido "no presente en la naturaleza", según la invención, es un polipéptido que es estructuralmente diferente de los polipéptidos que se pueden encontrar en la naturaleza, tales como las parvalbúminas de pescado de tipo salvaje.

Una sustitución de aminoácidos significa el reemplazo de un aminoácido por un aminoácido diferente. Preferiblemente, se sustituyen los residuos ácidos (ácido glutámico, ácido aspártico). El aminoácido sustituto puede ser de cualquier tipo, preferiblemente no es un aminoácido ácido, más preferiblemente es un aminoácido hidrófobo, aún más preferiblemente el aminoácido sustituto se selecciona entre el grupo que consiste en glicina, alanina, valina, isoleucina y leucina, más preferiblemente, es alanina.

Los polipéptidos de esta realización tienen una longitud de al menos aproximadamente 94 aminoácidos y la longitud preferida es de aproximadamente 109 aminoácidos. Los polipéptidos preferidos tienen 4 sustituciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 1.

Las sustituciones de aminoácidos incluyen sustituciones en las posiciones de aminoácidos 52, 54, 91 y 93 del SEQ ID NO: 1. El polipéptido de la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos cuatro sustituciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 1, en el que dichas al menos cuatro sustituciones de aminoácidos se encuentran en las posiciones del SEQ ID NO: 1 seleccionadas entre las posiciones de aminoácidos 52, 54, 91 ó 93 del SEQ ID NO: 1.

Los polipéptidos más preferidos de este aspecto comprenden una secuencia de aminoácidos como la mostrada en el SEQ ID NO: 4. El polipéptido representado en el SEQ ID NO: 2 porta dos mutaciones cuando se compara con la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 1, concretamente D52A y D54A. El polipéptido representado en el SEQ ID NO: 3 lleva las mutaciones D91A y D93A cuando se compara con el SEQ ID NO: 1. El polipéptido representado en el SEQ ID NO: 4 porta las mutaciones D52A, D54A, D91A y D93A cuando se compara con el SEQ ID NO: 1. También se describen aquí polipéptidos que comprenden los aminoácidos del 52 al 93, del 52 al 102, del 40 al 102, del 30 al 105, del 20 al 105, del 10 al 109 o del 2 al 109 del SEQ ID NO: 4. Los respectivos límites superiores e inferiores se pueden combinar entre ellos. Estas posiciones de aminoácidos se pueden aplicar también a otras parvalbúminas de pescado (véase infra).

También se describen aquí polipéptidos que comprenden un fragmento de los polipéptidos anteriormente descritos en (a). Ese fragmento tiene una longitud de al menos 15 aminoácidos, es decir, consiste en al menos 15 aminoácidos consecutivos del polipéptido anteriormente descrito en (a). Preferiblemente, la longitud del fragmento es de al menos 20 aminoácidos, más preferiblemente es de al menos 25 aminoácidos, aún más preferiblemente es de al menos 30 aminoácidos. Al menos el 90% de los residuos de aminoácidos del fragmento son idénticos a los correspondientes residuos de la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos el 92%, más preferiblemente al menos el 95%. El porcentaje de identidad de la secuencia se determina mediante métodos convencionales. El grado de identidad de la secuencia de aminoácidos del fragmento con respecto al SEQ ID NO: 1 se puede determinar comparando la secuencia de aminoácidos del fragmento y el SEQ ID NO:1 usando el programa "Blast 2 sequences" (Tatusova y col. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174, 247-250). Los parámetros que se usan en este contexto son: matriz: BLOSUM 62; apertura de hueco: 11; extensión de hueco: 1; X de disminución: 50; expectativa: 10; tamaño de palabra: 3; filtro: no.

El polipéptido puede comprender un fragmento de la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 1 con una longitud de al menos 15 aminoácidos. El fragmento consiste en al menos 15 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 20 aminoácidos consecutivos, más preferiblemente al menos 25 aminoácidos consecutivos, muy preferiblemente al menos 30 aminoácidos consecutivos.

Los polipéptidos pueden consistir esencialmente en un fragmento de los polipéptidos anteriormente descritos en (a). Este fragmento consiste esencialmente en al menos 10 aminoácidos consecutivos del polipéptido anteriormente descrito en (a), preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, más preferiblemente al menos 20 aminoácidos consecutivos, aún más preferiblemente al menos 25 aminoácidos consecutivos, muy preferiblemente al menos 30 aminoácidos consecutivos. La secuencia de aminoácidos del fragmento es idéntica en al menos el 80% con respecto a los correspondientes residuos de la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 1. El grado de identidad de las secuencias de aminoácidos se determina según se ha descrito supra. La identidad de secuencia de los fragmentos con respecto a la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 1 es preferiblemente de al menos el 85%, más preferiblemente de al menos el 90%, muy preferiblemente de al menos el 95%.

El polipéptido puede consistir en un fragmento de la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 1. Este fragmento consiste en al menos 10 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 1, preferiblemente en al menos 15 aminoácidos consecutivos, más preferiblemente en al menos 20 aminoácidos consecutivos, incluso más preferiblemente en al menos 25 aminoácidos consecutivos, muy preferiblemente en al menos 30 aminoácidos consecutivos. Los polipéptidos comprenden al menos los aminoácidos que forman uno de los motivos en mano EF (aminoácidos D52 - E63 o D91 - E102 de la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 1). Son ejemplos los polipéptidos que consisten sustancialmente en la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 5 (primer motivo en mano EF) o en el SEQ ID NO: 6 (segundo motivo en mano EF), respectivamente, opcionalmente acoplada a una molécula de transporte tal como la hemocianina de la lapa californiana (KLH).

Los polipéptidos de la presente invención normalmente poseen una actividad alergénica disminuida comparados con la Cyp c 1.01 de tipo salvaje. Según la invención, la expresión "actividad alergénica" significa la capacidad de un compuesto o una composición para inducir una reacción alérgica en un mamífero sensibilizado, p. ej., en un paciente alérgico al pescado. Una reacción alérgica puede ser la desgranulación de las células cebadas, una reacción cutánea positiva y/o una reacción nasal. La actividad alergénica se define preferiblemente en ensayos in vitro o in vivo adecuados. La actividad alergénica se puede determinar en una prueba cutánea según se describe en van Hage-Hamsten y col. J. Allergy Clin. Immunol. 1999, 104, págs. 969-977 o en Pauli y col. Clin. Exp. Allergy 2000, 30, págs. 1076-1084. La actividad alergénica de la Cyp c 1.01 de tipo salvaje se puede determinar usando Cyp c 1.01 producida mediante técnicas recombinantes, que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 1.

Preferiblemente, la actividad alergénica del polipéptido es menor que el 50% de la actividad alergénica de la Cyp c 1.01 de tipo salvaje. Más preferiblemente, la actividad alergénica del polipéptido es menor que el 25% de la de la proteína de tipo salvaje. En la realización más preferida, el polipéptido no posee sustancialmente actividad alergénica. Por lo general, la liberación de histamina inducida por el polipéptido de la invención está significativamente disminuida en comparación con la liberación de histamina inducida por Cyp c 1.01. Un ensayo in vitro preferido para determinar la liberación de histamina es el ensayo de liberación de histamina por parte de los basófilos, según se describe en Vrtala y col., J. Clin. Invest. 1997, 99, págs. 1673-1681. Preferiblemente, la liberación de histamina se reduce en al menos el 25%, más preferiblemente en al menos el 50%, muy preferiblemente en al menos el 75%, determinada a la concentración de alergeno a la que Cyp c 1.01 muestra la liberación máxima de histamina.

La actividad alergénica mencionada en lo que antecede, puede variar dependiendo del suero o del paciente en estudio y los valores anteriormente proporcionados hacen referencia a la actividad alergénica media, p. ej., determinada a través del examen de al menos 20 pacientes alérgicos al pescado, seleccionados al azar, o de sus sueros.

Los polipéptidos de la invención normalmente muestran una unión disminuida a anticuerpos IgE procedentes de pacientes alérgicos al pescado, comparados con la Cyp c 1.01 de tipo salvaje (SEQ ID NO: 1). La actividad de unión a IgE está preferiblemente disminuida en al menos el 25%, más preferiblemente en al menos el 50%, muy preferiblemente en al menos el 75%. La Cyp c 1.01 recombinante, que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 1, se puede usar para determinar la actividad de unión a IgE de la Cyp c 1.01 de tipo salvaje. La unión de los polipéptidos a IgE se puede determinar en un ensayo ELISA o mediante un análisis de transferencia Western o mediante experimentos de transferencia puntual, usando suero procedente de un paciente alérgico al pescado. La alergia al pescado se diagnostica en suero de acuerdo con un historial clínico del caso, indicativo de una alergia al pescado, una reacción positiva en la prueba cutánea frente a alergenos de pescado, y/o la detección de anticuerpos IgE específicos, dirigidos contra alergenos de pescado, en suero. Las transferencias puntuales se pueden cuantificar midiendo la cantidad de anticuerpos anti-IgE humana, marcados con ^{125}I, mediante contaje gamma, según se ha descrito (Niederberger y col. J. Allergy Clin. Immunol. 1998, 102, 579-591).

La actividad de unión a IgE anteriormente mencionada puede variar dependiendo del suero o del paciente en estudio y los valores anteriormente proporcionados hacen referencia a la actividad media de unión a IgE, p. ej., determinada a través del examen de al menos 20 pacientes alérgicos al pescado, seleccionados al azar, o de sus sueros (véase la tabla 3).

En algunos casos, un polipéptido determinado de la invención puede mostrar una actividad de unión disminuida a anticuerpos IgE de algunos pacientes alérgicos al pescado, mientras que muestra una unión inalterada o incluso aumentada a anticuerpos IgE de otros pacientes alérgicos al pescado. Esos polipéptidos están también dentro del alcance de la invención, ya que son útiles en el tratamiento de pacientes de los que se obtienen los anticuerpos IgE con unión disminuida.

También se describe aquí un método para el tratamiento de un paciente alérgico al pescado, que comprende (a) determinar la actividad de unión de un polipéptido de la invención a anticuerpos IgE procedentes del suero de dicho paciente; (b) determinar la actividad de unión de Cyp c 1.01 a dichos anticuerpos IgE; y (c) tratar al paciente con el polipéptido de la invención si la actividad de unión a IgE determinada en (a) es significativamente menor que la actividad de unión a IgE determinada en (b). Preferiblemente, la actividad de unión a IgE determinada en (a) es menor que el 75%, preferiblemente menor que el 50%, más preferiblemente menor que el 25%, muy preferiblemente menor que el 10% de la determinada en (b).

También se describe aquí un método para fabricar un medicamento para el tratamiento de un paciente alérgico al pescado, que comprende (a) determinar in vitro la actividad de unión de un polipéptido de la invención, a anticuerpos IgE procedentes del suero de dicho paciente; (b) determinar in vitro la actividad de unión de Cyp c 1.01 a dichos anticuerpos IgE; y (c) seleccionar el polipéptido de la invención y mezclarlo con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable cuando la actividad de unión a IgE determinada en (a) es significativamente menor que la actividad de unión a IgE determinada en (b). Preferiblemente, la actividad de unión a IgE determinada en (a) e menor que el 75%, preferiblemente menor que el 50%, más preferiblemente menor que el 25%, y muy preferiblemente de menos del 10% de la determinada en (b).

Preferiblemente, los polipéptidos derivados de parvalbúmina de pescado de la invención inducen respuestas de anticuerpos IgG in vivo. Por lo tanto, los anticuerpos anteriormente descritos comprenden en general al menos un epítopo para IgG. Un anticuerpo comprende al menos un epítopo para IgG cuando es capaz de inducir una respuesta de anticuerpos IgG en un individuo o en un animal experimental. Uno de los correspondientes ensayos para determinar una respuesta de IgG se encuentra descrito en el documento EP 1 403 280 A1 que se refiere a polipéptidos hipoalergénicos que están basados en alergenos de polen. Más preferiblemente, estos anticuerpos IgG son "anticuerpos bloqueadores" o "anticuerpos protectores" que impiden que los anticuerpos IgE se unan a Cyp c 1.01. De este modo se obtiene una disminución significativa de los síntomas alérgicos.

También se describe un polipéptido híbrido que consiste esencialmente en 2 ó 3 fragmentos de diferentes parvalbúminas de pescado y/o de los diferentes polipéptidos anteriormente descritos. El polipéptido híbrido preferiblemente tiene una longitud de al menos 90 aminoácidos.

Se ha encontrado que los polipéptidos de la invención que portan mutaciones que corresponden a las mutaciones representadas por las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6 poseen propiedades inesperadas y ventajosas. Las posiciones de aminoácidos diana de estas secuencias de aminoácidos se pueden sustituir o delecionar también en otras parvalbúminas de pescado. Por lo tanto, la presente invención se refiere a un polipéptido mutado, derivado de una parvalbúmina de pescado, en el que en relación con la secuencia de tipo salvaje de la parvalbúmina de pescado, se han sustituido posiciones de aminoácidos que corresponden a los residuos de aminoácidos que están sustituidos en SEQ ID NO: 4 con respecto a los de SEQ ID NO: 1. La identificación de posiciones de aminoácidos en otras parvalbúminas de pescado, que corresponden a posiciones de aminoácidos mutadas en uno cualquiera de los SEQ ID NO: de 2 a 6, está dentro de un nivel ordinario de experiencia. Por ejemplo, el experto puede alinear cualquiera de las secuencias mostradas en los SEQ ID NO: de 1 a 6, con la secuencia de aminoácidos de una parvalbúmina de pescado determinada, usando el programa "Blast 2 sequences" anteriormente descrito. A partir de ese alineamiento, se pueden deducir fácilmente las posiciones de aminoácidos correspondientes que han de ser mutadas. Como ejemplo, la Figura 6 muestra un alineamiento de la parvalbúmina Cyp c 1.01 y la parvalbúmina procedente de Ictalurus punctatus (SEQ ID NO: 10). Las posiciones de aminoácidos que ha de ser sustituidas o delecionadas corresponden a las posiciones D52, D54, D91 y/o D93 del SEQ ID NO: 1. Estas posiciones corresponden a las posiciones D68, D70, D107 y D109 de la secuencia de aminoácidos de la parvalbúmina procedente de Ictalurus punctatus (SEQ ID NO: 10). Los polipéptidos derivados de parvalbúminas de pescado pueden estar comprendidos en un péptido de mayor tamaño o pueden ir acoplados a una proteína de transporte adecuada, tal como KLH. También pueden presentar una actividad alergénica y una capacidad de unión a IgE disminuidas en comparación con sus respectivas formas de tipo salvaje, y son capaces de inducir una respuesta de IgG según se ha descrito supra. Se conocen las secuencias de aminoácidos de varias parvalbúminas de pescado:

TABLA 1

1

Los polipéptidos derivados de otras parvalbúminas de pescado distintas de la Cyp c 1.01 comprenden preferiblemente sustituciones o deleciones en las posiciones de aminoácidos correspondientes a las sustituidas en uno cualquiera de los SEQ ID NO: de 2 a 6.

La invención se refiere también a un polipéptido no presente en la naturaleza, derivado de una parvalbúmina de pescado de tipo salvaje, que comprende una secuencia de aminoácidos en la que, en relación con los aminoácidos de dicha parvalbúmina de pescado de tipo salvaje, se han sustituido los aminoácidos situados en las posiciones que corresponden a las posiciones 52, 54, 91 y 93 del SEQ ID NO: 1.

Un ejemplo lo constituye un polipéptido no presente en la naturaleza, derivado de la isoforma 1b de la parvalbúmina de Danio rerio, que comprende una secuencia de aminoácidos en la que, en relación con la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 7, se han sustituido los aminoácidos situados en las posiciones 52 y 54; o en las posiciones 91 y 93; o preferiblemente en las posiciones 52, 54, 91 y 93. Otro ejemplo lo constituye un polipéptido no presente en la naturaleza, derivado de la parvalbúmina alfa (A1) de Cyprinus carpio, que comprende una secuencia de aminoácidos en la que, en relación con la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 8, se han sustituido los aminoácidos situados en las posiciones 51 y 53; o en las posiciones 90 y 92; o preferiblemente en las posiciones 51, 53, 90 y 92.

La Cyp c 1.01 de tipo salvaje representada por la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 1 y las proteínas que consisten esencialmente en la Cyp c 1.01 de tipo salvaje, no son polipéptidos de la presente invención. Las parvalbúminas de pescado presentes en la naturaleza o las proteínas recombinantes que consisten en los mismos aminoácidos, no son polipéptidos de esta solicitud (p. ej., las parvalbúminas listadas en la anterior tabla 1, etc.).

Las parvalúbminas hipoalergénicas no consisten necesariamente en sólo secuencias de aminoácidos derivadas de proteínas parvalbúminas. Es posible que también comprendan "secuencias identificadoras" que facilitarán la purificación de las proteínas después de su expresión en las células hospedadoras. Un ejemplo de ese tipo de "secuencia identificadora" es la secuencia identificadora hexahistidina que permite la purificación de la proteína mediante una cromatografía basada en la quelación con Ni^{2+}. Sin embargo, en la técnica se conocen y se usan varios otras secuencias identificadoras.

La presente invención también proporciona moléculas de polinucleótidos, que incluyen moléculas de DNA y RNA, que codifican los polipéptidos que aquí se describen. Los expertos en la técnica reconocerán con facilidad que, teniendo en cuenta la degeneración del código genético, es posible que exista una variación considerable en las secuencias entre estas moléculas de polinucleótidos. El polinucleótido puede ser monocatenario o bicatenario. Se ha de reconocer que, según la presente invención, cuando un polinucleótido es reivindicado según aquí se describe, se entiende que lo que se reivindica es tanto la cadena con sentido, como la cadena antisentido y como el DNA bicatenario que posee ambas cadenas con sentido y antisentido reasociadas entre sí por medio de sus respectivos enlaces de hidrógeno. También se reivindica el RNA mensajero (mRNA) que codifica los polipéptidos de la presente invención. Ese RNA mensajero codificará un polipéptido usando los mismos codones que los usados por el DNA, con la excepción de que cada nucleótido timina (T) se reemplaza por un nucleótido uracilo (U).

Los métodos para preparar DNA y RNA se conocen perfectamente en la técnica. Un clon de longitud completa que codifica Cyp c 1.01 se puede obtener mediante procedimientos de clonación convencionales. El DNA que codifica Cyp c 1.01 se puede amplificar mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando cebadores específicos adecuados. Los polinucleótidos de la presente invención también se pueden sintetizar mediante métodos químicos, por ejemplo, usando el método de la fosforamidita. La secuencia codificadora del cDNA de Cyp c 1.01 se muestra en el SEQ ID NO: 18.

La invención se refiere además a un vector o plásmido que contiene un polinucleótido como el descrito en lo que antecede. En general, la secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido de la invención está operativamente ligada a otros elementos genéticos requeridos para su expresión, que generalmente incluyen un promotor y un terminador de la transcripción, dentro de un vector de expresión. El vector frecuentemente contendrá también uno o más marcadores de selección (p. ej., genes que codifican la resistencia a antibióticos) o uno o más orígenes de replicación, aunque los expertos en la técnica reconocerán que en determinados sistemas, los marcadores de selección se pueden suministrarse en vectores distintos, y que la replicación del DNA exógeno se puede facilitar mediante de su integración en el genoma de la célula hospedadora. La selección de promotores, terminadores, marcadores de selección, vectores y demás elementos, es una cuestión de diseño rutinario, dentro del nivel de una experiencia ordinaria en la técnica. Muchos de esos elementos se encuentran descritos en la literatura y se encuentran disponibles a través de proveedores comerciales.

Otro aspecto de la invención es una célula hospedadora transformada o transfectada con un vector o con un plásmido según la invención. Las células hospedadoras pueden ser células procariotas o eucariotas. Las células hospedadoras procariotas, que incluyen cepas de la bacteria Escherichia coli, Bacillus y de otros géneros, son células hospedadores útiles que están dentro de la presente invención. Las células de levadura, de insectos o líneas de células de mamíferos, como las células CHO, se pueden usar como células hospedadoras eucariotas. Las técnicas para transformar estos hospedadores y para expresar las secuencias de DNA extraño clonado en ellos, son muy conocidas en la técnica (véase, p. ej., Sambrook y col., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).

Las células hospedadoras de la invención se pueden usar para producir los polipéptidos de la invención. Otro aspecto más de la invención es por lo tanto un método para preparar un polipéptido según la invención, que comprende cultivar las células hospedadoras anteriormente descritas en las condiciones en las que dicho polipéptido se expresa y recuperar opcionalmente dicho polipéptido a partir de las células hospedadoras. Cuando se expresa un polipéptido de la invención en bacterias tales como E. coli, el polipéptido puede ser retenido en el citoplasma, posiblemente en forma de cuerpos de inclusión insolubles. En este caso, las células se lisan y los cuerpos de inclusión se recuperan y se desnaturalizan usando, por ejemplo, isotiocianato de guanidina o urea. El polipéptido desnaturalizado se puede entonces volver a plegar diluyendo el desnaturalizante, tal como mediante diálisis frente a una disolución de urea y de una combinación de glutation oxidado y reducido, seguida de una diálisis frente a una disolución salina tamponada.

Las células hospedadoras transformadas o transfectadas se cultivan conforme a procedimientos convencionales en un medio de cultivo que contiene nutrientes y otros componentes requeridos para el crecimiento de las células hospedadoras elegidas. En la técnica se conocen diversos medios adecuados, que incluyen medios definidos y medios complejos y que generalmente incluyen una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y minerales. Se prefiere purificar los péptidos de la presente invención hasta una pureza \geq 80%, más preferiblemente hasta una pureza \geq 95%, y es particularmente preferido un estado farmacéuticamente puro que es puro en una proporción mayor que el 99,9% con respecto a macromoléculas contaminantes, en particular, con respecto a otras proteínas y ácidos nucleicos, y libre de agentes infecciosos y pirogénicos. Preferiblemente, un polipéptido purificado de la invención se encuentra sustancialmente libre de otros polipéptidos. Un polipéptido recombinante expresado de la invención se puede purificar usando métodos de fraccionamiento y/o métodos y medios de purificación convencionales. Para el fraccionamiento de las muestras se puede usar una precipitación en sulfato amónico y ácido o una extracción caotrópica. Los polipéptidos de la invención también e pueden aislar mediante cromatografía de afinidad usando anticuerpos dirigidos contra el polipéptido. Los polipéptidos más cortos se purifican preferiblemente usando HPLC. Se describen métodos de purificación de proteínas, p. ej., en Methods in Enzymology, Volúmen 182. Guide to Protein Purification. Academic Press New York 1990 y Scopes, Protein Purification. Springer Verlag, Heidelberg 1994.

Los polipéptidos de la invención también se pueden preparar a través de síntesis química, por ejemplo, según se describe en Merryfield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1963 y en Etherton y col., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford 1989.

La invención se refiere también al uso del polipéptido o polinucleótido o célula de la invención para la fabricación de un medicamento para tratar y/o prevenir la alergia al pescado. Este trastorno normalmente es una alergia a uno o más alergenos de pescado, p. ej., a Cyp c 1.01. Preferiblemente, el trastorno es una hipersensibilidad al pescado mediada por IgE. Se ha encontrado que Cyp c 1.01 contiene la mayoría de los epítopos para IgE relevantes de diferentes alergenos de pescados. Por lo tanto, estos polipéptidos o polinucleótidos se pueden usar en el tratamiento de casi todas las alergias al pescado. Preferiblemente, el trastorno alérgico que ha de ser tratado es la alergia a Cyp c 1.01 o a al menos una de las proteínas listadas en la anterior tabla 1. El medicamento se puede usar para el tratamiento terapéutico de la alergia al pescado o para la vacunación profiláctica para prevenir el desarrollo del trastorno.

La invención también concierne a una composición farmacéutica que comprende al menos uno de los polipéptidos o al menos uno de los polinucleótidos de la invención. La composición puede comprender además un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, el polipéptido de la invención se ha acoplado a una molécula de transporte tal como KLH.

Otro aspecto de la invención es un kit farmacéutico que comprende al menos uno de los polipéptidos o polinucleótidos de la invención. El kit puede comprender dos o más polipéptidos diferentes, o dos o más polinucleótidos diferentes según la presente invención. En una de las realizaciones el kit comprende al menos un polipéptido mutado, derivado de Cyp c 1.01, y al menos un polipéptido mutado, derivado de otro alergeno de pescado. Puede contener otros alergenos procedentes de carpa o de otro pescado.

Para uso farmacéutico, los polipéptidos de la presente invención se formulan para administración oral o parenteral, en particular, subcutánea, conforme a métodos convencionales. En general, las formulaciones farmacéuticas incluirán un polipéptido de la invención junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como disolución salina, disolución salina tamponada con fosfato, dextrosa al 5% en agua, o un vehículo similar. Las formulaciones pueden incluir además uno o más excipientes, conservantes, solubilizantes, agentes de tamponamiento, albúmina para impedir la pérdida de proteínas en las superficies de los viales, etc. Los métodos de formulación son muy conocidos en la técnica y se encuentran descritos, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, compilador, Mack Publishing Co., Easton, PA, Edición 19ª, 1995. Las dosis terapéuticas o profilácticas generalmente estarán en el intervalo de 0,1 \mug -100 \mug por inyección en un volumen de 100 \mul - 200 \mul, siendo la dosis exacta determinada por el médico conforme a los estándares aceptados, y teniendo en cuenta la naturaleza y gravedad del estado que se ha de tratar, las características del paciente, etc. La determinación de la dosis está dentro del nivel de experiencia ordinaria en la técnica. La cantidad puede variar dependiendo del modo de tratamiento. Durante un tratamiento de inmunoterapia se pueden administrar dosis únicas de aproximadamente de 25 \mug a 75 \mug en un volumen de aproximadamente 100 \mul por inyección. En el caso de la administración oral, se puede contemplar una dosificación de 0,1 \mug a 50 mg. En el caso de las vacunas, los pacientes normalmente no reciben tratamiento varias veces al día, excepto en el caso de la "inmunoterapia rápida". Las inmunoterapias comunes incluyen aproximadamente 8 vacunaciones que se administran en intervalos de una a dos semanas y que se continúan a lo largo de un período de 2 a 3 años. Preferiblemente, se aplican 4 inyecciones por año, con un intervalo de 3 meses durante de 3 a 5 años. En una realización particular, la composición farmacéutica contiene más de un polipéptido.

El polinucleótido de la invención es útil en las vacunas de DNA para tratar y/o prevenir la alergia al pescado.

La invención también se refiere al uso de polipéptidos hipoalergénicos de parvalbúmina, de polinucleótidos que codifican polipéptidos hipoalergénicos o de células que expresan parvalbúminas hipoalergénicas, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la hipersensibilidad a pescado mediada por IgE. Ese medicamento se puede componer del polinucleótido, que se podría usar directamente para una vacuna basada en DNA contra la alergia al pescado. Como alternativa, el polipéptido hipoalergénico se podría usar para preparar formulaciones para tratamiento oral, sublingual o parenteral de trastornos alérgicos de Tipo I. Los modos de aplicación de los tratamientos parenterales pueden ser la administración por vía nasal de la parvalbúmina hipoalergénica o inyección subcutánea de los polipéptidos hipoalergénicos unidos a un adyuvante. Además, las posibles aplicaciones también comprenden formas de inmunoterapia basadas en células. En este caso, células presentadoras de antígeno se transforman con vectores que contienen la secuencia de polinucleótidos del hipoalergeno y dichas células expresan luego el hipoalergeno
in vivo.

La invención también se refiere a la composición farmacéutica del medicamento que contiene un polipéptido, un polinucleótido o una célula según la invención. Esta composición farmacéutica incluye vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables, tales como tampones o disoluciones de sales. En una realización particular la composición farmacéutica también contiene un adyuvante.

Uno o los dos sitios funcionales de unión a calcio de la rCyp c 1.01, se modificaron reemplazando dos aminoácidos ácidos por residuos no polares. Sorprendentemente, la introducción de esas mutaciones puntuales en solamente uno de los dominios de unión a calcio presentó ya efectos importantes sobre la reactividad del alergeno con IgE. Sin embargo, se observaron cambios variables de la capacidad de unión a IgE, dependiendo de los sueros usados y algunos pacientes incluso exhibieron reactividades con IgE más altas frente a esos mutantes de parvalbúmina que frente a la proteína de tipo salvaje. En cambio, las modificaciones en los dos dominios de unión a calcio produjeron claramente la alteración de todos los epítopos importantes para IgE, ya que la reactividad con IgE quedó suprimida por completo en todos los sueros ensayados. Con unos cuantos cambios de aminoácidos loa autores de la invención lograron así convertir un alergeno alimentario altamente reactivo (rCyp c 1.01) en moléculas hipoalergénicas que se pueden usar para una inmunoterapia contra la alergia al pescado, específica para el alergeno.

Teniendo en cuenta la estabilidad de la parvalbúmina, no se hubiera esperado que solamente unas cuantas mutaciones puntuales (sustituciones de aminoácidos) fueran suficientes para producir un polipéptido que exhibe una actividad alergénica disminuida.

La notable reactividad cruzada con IgE entre las parvalbúminas de las especies de pescado de consumo habitual, y el hecho de que la parvalbúmina recombinante de carpa (rCyp c 1.01) contiene la mayoría de los epítopos para IgE presentes en extractos de alergenos de varias especies de pescados (Swoboda y col., 2002), sugieren que las moléculas hipoalergénicas basadas en rCyp c 1.01 se pueden usar para tratar a la mayoría de los pacientes alérgicos al pescado.

Las moléculas hipoalergénicas de parvalbúmina abrirán por lo tanto nuevos caminos para la inmunoterapia contra la hipersensibilidad al pescado mediada por IgE. Debido a que las variantes hipoalergénicas consisten en componentes definidos, será posible producir formulaciones perfectamente definidas para el tratamiento con vacunas. Además, la carencia de actividad alergénica permitirá la administración de las parvalbúminas hipoalergénicas a dosis elevadas, de modo comparable a las vacunas habitualmente usadas para la prevención de las infecciones víricas, lo que dará como resultado una eficacia alta del tratamiento. En relación con esto, se puede tener en consideración usar estas moléculas también para una vacunación profiláctica o para la inducción de tolerancia en individuos todavía no sensibilizados.

Las diferentes realizaciones de la invención que aquí se describen se pueden combinar entre ellas, en particular las formas preferidas de los aspectos de la invención.

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Descripción de las tablas y figuras

Tabla 1. Ejemplos de parvalbúminas de pescado presentes en la naturaleza.

Tabla 2. Porcentaje de inhibición de la reactividad de IgE frente a extractos de proteína procedentes de bacalao, atún y salmón después de la preabsorción de los sueros con parvalbúmina recombinante de carpa (medido en un sistema de CAP-FEIA).

Tabla 3. Reactividad de IgE de pacientes alérgicos a pescado frente a parvalbúmina recombinante (de tipo salvaje) sometida a transferencia puntual y frente a mutantes de parvalbúmina (Mut-EF, Mut-CD, Mut-CD/EF). La reactividad de IgE se cuantificó mediante contaje gamma. Los resultados se presentan en cuentas por minuto (cpm).

Figura 1: Análisis de dicroísmo circular en el ultra-violeta lejano, de parvalbúmina recombinante (de tipo salvaje) purificada y de los mutantes de parvalbúmina (Mut-EF, Mut-CD, Mut-CD/EF). Los resultados se encuentran expresados en forma de la elipticidad media por residuo (\Theta) (eje y) a una longitud de onda determinada (eje x).

Figura 2: SDS-PAGE y análisis de inmunotransferencia de parvalbúmina recombinante (de tipo salvaje) purificada y de los mutantes de parvalbúmina (Mut-EF, Mut-CD, Nut-CD/EF). A, SDS-PAGE teñida con azul brillante de Coomassie. B, Inmunotransferencia que muestra la reactividad de IgE frente al suero de un paciente alérgico al pescado. Los pesos moleculares están indicados en los márgenes izquierdos.

Figura 3: Reactividad de la IgE de cuatro pacientes alérgicos al pescado frente a muestras duplicadas sometidas a transferencia puntual en nitrocelulosa, de parvalbúmina recombinante (de tipo salvaje) y de los mutantes de parvalbúmina (Mut-EF, Mut-CD, Mut-CD/EF).

Figura 4: Inhibición de la unión de IgE a parvalbúmina natural de carpa sometida a transferencia puntual en nitro-celulosa, después de la preincubación del suero de un paciente alérgico a pescado con parvalbúmina recombinante (de tipo salvaje), con los mutantes de parvalbúmina (Mut-EF, Mut-CD, Mut-CD/EF) o con albúmina de suero bovino (pista BSA). Los pesos moleculares se encuentran indicados en el margen izquierdo.

Figura 5: Actividad biológica de parvalbúmina recombinante (de tipo salvaje) purificada y de los mutantes de parvalbúmina (Mut-EF, Mut-CD, MutCD/EF). Inducción de la liberación de histamina por parte de los basófilos de un paciente alérgico a pescado, estimulado con distintas concentraciones (\mug/ml) de las proteínas recombinantes (eje x). El porcentaje de la histamina liberada en el sobrenadante se representa en el eje y.

Figura 6: Alineamiento de Cyp c 1.01 y de la parvalbúmina procedente de Ictalurus punctatus.

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La invención se ilustra más ampliamente por medio de los siguientes ejemplos no limitativos:

Ejemplo 1

Estudios cuantitativos de inhibición de IgE muestran que la parvalbúmina recombinante de carpa contiene la mayoría de los epítopos para IgE presentes en diferentes especies de pescados

Para investigar y cuantificar el potencial para presentar reacciones cruzadas de la parvalbúmina recombinante de carpa, sueros de 16 pacientes alérgicos a pescado se preincubaron con la parvalbúmina recombinante de tipo salvaje, expresada y purificada según se ha descrito previamente (Swoboda y col., 2002), y después se expusieron a extractos de los alergenos procedentes de bacalao, atún y salmón. La cuantificación de la reactividad de IgE remanente mediante medidas de CAP-FEIA, reveló una disminución de la unión de IgE al extracto de bacalao de entre el 62% y el 96%, al extracto de atún de entre el 33% y el 98%, y al extracto de salmón de entre el 41% y el 95% (Tabla 2). Estos hallazgos indicaron que la parvalbúmina recombinante de carpa representa un alergeno con una elevada capacidad de presentar reacciones cruzadas, que contiene una gran porción de los epítopos para IgE presentes en extractos de alergenos de diferentes especies de pescados.

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Protocolo experimental

Sueros de 16 pacientes alérgicos al pescado se preincubaron con 5 \mug de parvalbúmina recombinante de carpa o, con fines de control, con 5 \mug de BSA. La reactividad de IgE remanente frente a extractos de pescado procedentes de bacalao, atún y salmón, se cuantificó usando el sistema de CAP-FEIA (Pharmacia, Uppsala, Sweden). El porcentaje de inhibición de la unión de IgE a los extractos de pescado después de la preabsorción al alergeno recombinante se calculó como ((cpm_{BSA} - cpm_{parv})/cpm_{BSA}) x 100, en donde cpm_{BSA} y cpm_{parv} indican la unión de IgE después de la preabsorción con BSA y con parvalbúmina recombinante de carpa, respectivamente.

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TABLA 2 Porcentaje de inhibición de la reactividad de IgE frente a extractos procedentes de bacalao, atún y salmón, después de la preabsorción de los sueros con parvalbúmina recombinante de carpa (medida en el sistema de CAP-FEIA)

2

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Ejemplo 2

Construcción de mutantes de parvalbúmina

Con el fin de modificar el cDNA de parvalbúmina de carpa, Cyp c 1.01 (EMBL, número de acceso AJ292211) en uno o en los dos sitios funcionales de unión a calcio (dominio CD o dominio EF), se llevó a cabo una mutagénesis dirigida a sitio específico usando el kit Chameleon Double-Stranded, Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA). Los dominios de unión a Ca^{2+} se mutaron reemplazando los aminoácidos primero y tercero de los bucles de unión a calcio (Asp) por residuos no polares de Ala. Los experimentos de mutagénesis se realizaron conforme a las instrucciones del fabricante, con dos oligonucleótidos sintéticos (mutCD y mutEF), usando como molde el DNA de Cyp c 1.01 clonado en el vector de expresión pET-17b (Swoboda y col., 2002). Ambos oligonucleótidos abarcaban 45 pb del cDNA de la parvalbúmina. El cebador mutCD (5'-AAG GCC TTT GCT GTC ATT GCC CAA GCC AAG AGC GGC TTC ATT GAG-3'; SEQ ID NO: 16) introdujo cambios en los codones 52 (GAC \rightarrow GCC) y 54 (GAC \rightarrow GCC) y en cebador mutEF (5'-GCC TTC CTG AAA GCT GGA GCC TCT GCT GGT GAT GGC AAG ATT GGA-3'; SEQ ID NO: 17) introdujo cambios en los codones 90 (GAC \rightarrow GCC) y 92 (GAT \rightarrow GCT), respectivamente. Los codones modificados están subrayados en las secuencias de los oligonucleótidos. Las modificaciones se confirmaron mediante secuenciación con el método de terminación de la cadena con didesoxinucleotídicos (Sanger y col., 1977) usando un kit de secuenciación de T7 (Pharmacia, Uppsala, Sweden) y las proteínas resultantes se denominaron Mut-CD (mutación en el dominio CD), Mut-EF (mutación en el dominio EF) y Mut-CD/EF (proteína mutada en ambos dominios).

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Ejemplo 3

Expresión y purificación de parvalbúmina recombinante de carpa y de los mutantes de parvalbúmina

La parvalbúmina recombinante de tipo salvaje y los tres mutantes de parvalbúmina se expresaron en la cepa BL21(DE3) de Escherichia coli. La expresión de las proteínas Mut-CD y Mut-EF, inducida por isopropiltiogalactopiranósido (IPTG), dio como resultado una producción de proteína similar a la observada en el caso de la proteína de tipo salvaje (Swoboda y col., 2002), con una proporción del 25% - 30% de la proteína recombinante en la proteína total de E. coli. Sin embargo, las bacterias que expresan Mut-CD/EF crecieron más lentamente y sólo aproximadamente el 2% - 3% de la proteína bacteriana total representó la proteína Nut-CD/EF. Las proteínas recombinantes se purificaron a partir de las fracciones citoplásmicas solubles de los extractos bacterianos mediante cromatografía de intercambio aniónico hasta alcanzar una homogeneidad de aproximadamente el 95%, juzgada por medio de la tinción de geles de poliacrilamida al 15%, en presencia de dodecilsulfato sódico, teñidos con azul brillante de Coomassie (SDS-PAGE; Fig. 2A) (Laemmli 1970).

Protocolo experimental

La expresión de las proteínas recombinantes se indujo en células BL21 (DE3) de E. coli, que habían crecido en medio LB que contenía ampicilina, 100 mg/l, hasta alcanzar una OD 600 de 0,4. Después de una inducción de dos horas a 37ºC, la mayor parte de la proteína se encontró en las fracciones solubles del extracto bacteriano. Las células se recogieron, se resuspendieron en Tris 10 mM (pH 7,5), PMSF 1 mM, y se lisaron con varios ciclos de congelación-descongelación, congelándolas en nitrógeno líquido y descongelándolas a 10ºC - 15ºC. En el caso de Mut-CD/EF, las células descongeladas finalmente fueron también sometidas a rotura mecánica con un Ultraturrax (Polytron, Kinematica AG, Suiza). Después de una centrifugación a 20.000 xg durante 30 min a 4ºC, el sobrenadante clarificado se aplicó a una columna de DEAE celulosa-Sepharose (DEAE Sepharose Fast Flow, Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia). Las fracciones que contenían las proteínas purificadas se eluyeron con un gradiente salino lineal (NaCl 0 M - 0,5 M en Tris 10 mM, pH 7,5) y se dializaron frente a PBS (pH 7,4).

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Ejemplo 4

Un análisis estructural de los mutantes de parvalbúmina muestra que mutaciones puntuales dan lugar a importantes cambios conformacionales

El espectro de CD en el ultravioleta lejano (Fig. 1) de la parvalbúmina recombinante de tipo salvaje se caracterizó por presentar dos mínimos anchos a 208 nm y 223 nm, y un máximo pronunciado por debajo de 200 nm. Esa forma es típica de una proteína perfectamente estructurada que contiene una cantidad considerable de hélices \alpha. La totalidad de los espectros de los mutantes que habían sido modificados en uno de los dominios de unión a calcio (Mut-CD y Mut EF) mostraron las mismas características de proteínas plegadas que la proteína de tipo salvaje. Sin embargo, las mutaciones introducidas en los dos dominios de unión a calcio (como sucede en Mut-CD/EF) dieron lugar a marcadas diferencias en la forma del espectro en el UV lejano. El único mínimo ancho observado a aproximadamente 202 nm indica un significativo descenso en el contenido en hélice a y en la estructura secundaria de la molécula, y una transición hacia una conformación no plegada y enrollada aleatoriamente. Mediante la introducción de unas cuantas mutaciones puntuales dirigidas, los autores de la invención habrían logrado de esta manera modificar significativamente la estructura de este alergeno altamente estable.

Protocolo experimental

Las medidas por dicroismo circular (CD) se realizaron en un espectropolarímetro J-715 de Jasco (Tokio, Japón), con concentraciones de proteína entre 12,3 \muM - 24,0 \muM, usando una cubeta de cuarzo de longitud del paso de luz de 1 mm (Helima, Mullheim, Baden, Alemania) equilibrada a 20ºC. Los espectros se registraron con una resolución de 0,2 nm a una velocidad de barrido de 50 nm/min y fueron el resultado de la media de 3 barridos. Los espectros finales se corrigieron sustrayendo el correspondiente espectro de referencia obtenido en idénticas condiciones. Los resultados se encuentran expresados como la elipticidad media por residuo (B) a una longitud de onda determinada.

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Ejemplo 5

Los mutantes de parvalbílmina muestran una capacidad de unión a IgE disminuida

La reactividad de IgE frente a las parvalbúminas de tipo salvaje y mutadas se analizó en experimentos de inmunotransferencia y de transferencia puntual. La inmuno-transferencia mostrada en la Figura 2B se analizó con el suero de un paciente alérgico al pescado e ilustra la capacidad de unión a IgE de las proteínas desnaturalizadas e inmovilizadas. Los sueros siempre presentaron una fuerte reactividad de la IgE frente al alergeno de tipo salvaje, una disminución de la unión de la IgE a Mut-CD o Mut-EF y una ausencia de unión a Mut-CD/EF.

Además, los autores de la invención también evaluaron la capacidad de unión a IgE de proteínas parvalbúminas no desnaturalizadas y sometidas a transferencia puntual, usando sueros de 23 pacientes alérgicos al pescado (Fig. 3). Los ensayos de transferencia puntual confirmaron los datos obtenidos en los experimentos de inmunotransferencia y demostraron que las modificaciones en uno solo de los dominios de unión a calcio (Mut-CD o Mut-EF) producían cambios variables en la reactividad con IgE dependiendo de los sueros usados. Algunos pacientes incluso presentaron reactividades más altas de la IgE frente a Mut-CD o Mut-EF que frente al alergeno de tipo salvaje. Por otra parte, las mutaciones en las dos regiones de unión a calcio (Nut-CD/EF) produjeron una pérdida completa de la capacidad de unión a IgE en todos los sueros ensayados. En el caso de Mut-CD/EF, la cuantificación de la reactividad con IgE medida mediante contaje gamma, reveló capacidades de unión a IgE entre del 0,5% al 67,6% de las capacidades de unión a IgE de la proteína parvalbúmina de tipo salvaje (Tabla 3).

TABLA 3 Reactividad de la IgE de pacientes alérgicos al pescado frente a la parvalbúmina recombinante sometida a transferencia puntual y frente a los mutantes de parvalbúmina. La reactividad de la IgE se cuantificó mediante contaje gamma. Los resultados se presentan en cuentas por minuto (cpm)

3

Los autores de la invención también investigaron la capacidad de las variantes recombinantes de parvalbúmina para inhibir la unión de la IgE a la parvalbúmina natural de carpa, transferida a nitrocelulosa, usando ensayos competitivos de inmunotransferencia (Fig. 4). En estos experimentos los sueros de los pacientes se preadsorbieron un exceso de la proteína de tipo salvaje y de las proteínas mutantes antes de exponerlos al alergeno natural inmovilizado. Durante la preincubación, la reacción entre las proteínas y los anticuerpos IgE tuvo lugar por lo tanto en disolución y de esta manera imitaban la situación in vivo. Como se muestra en la Figura 4, la unión de IgE al alergeno natural se inhibió completamente con la adición de la proteína salvaje recombinante. Mut-CD y Mut-EF exhibieron una capacidad de inhibición notablemente más baja que la de la proteína de tipo salvaje, mientras que la preincubación con Mut-CD/EF no tuvo efecto alguno sobre la unión de IgE a la parvalbúmina natural.

Estos resultados sugirieron que mediante sustituciones de aminoácidos en uno de los dos sitios de unión a calcio, la estructura global de la molécula de parvalbúmina no se altera significativamente. No obstante, también se puede sacar como conclusión que las mutaciones en uno solo de los dominios sí tuvieron efecto sobre epítopos para células B locales, debido a que Mut-CD o Mut-EF produjeron una notable disminución de la reactividad de la IgE en algunos de los sueros. Sin embargo, las modificaciones en las dos regiones de unión a calcio produjeron un cambio tan importante de los epítopos conformacionales y/o del plegamiento de la proteína, que la unión con la IgE quedó completamente suprimida en todos los sueros de pacientes alérgicos ensayados.

Protocolos experimentales Análisis de inmunotransferencia y de transferencia puntual

Las reactividades de las variantes recombinantes de parvalbúmina de carpa frente a la IgE sérica procedente de pacientes alérgicos al pescado, se determinó en experimentos de inmunotransferencia o de transferencia puntual. En el caso de la inmunotransferencias, 1,5 \mug de las proteínas purificadas se separaron mediante SDS-PAGE (Laemmli 1970) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Schleicher y Schuell, Dassel, Alemania; Towbin y col., 1979). En el caso de los análisis de transferencia puntual, parte alícuotas de aproximadamente 0,5 \mug de las proteínas parvalbúminas se puntearon sobre membranas de nitrocelulosa (Schleicher y Schuell). En los dos casos, los filtros se analizaron con sueros de pacientes diluidos en proporción 1:10 en PBST (PBS, pH 7,5, que contiene Tween 20 al 0,5% v/v) y los anticuerpos IgE unidos se detectaron con anticuerpos anti-IgE humana, marcados con ^{125}I y diluidos en proporción 1:15 (RAST, Pharmacia, Uppsala, Suecia).

Experimentos competitivos de inmunotransferencia

En el caso de los experimentos de inmunotransferencia para medir la inhibición, sueros procedentes de pacientes alérgicos al pescado se preincubaron con las proteínas recombinantes purificadas y, con fines de control, con una proteína inmunológicamente no relacionada (BSA) (10 \mug/ml de suero diluido en proporción 1:10). Después de ello, la parvalbúmina natural purificada y transferida a nitrocelulosa, se incubó con las muestras de suero preadsorbidas y la IgE unida se detectó usando un anticuerpo anti-IgE humana, procedente de conejo, marcado con ^{125}I (Pharmacia).

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Ejemplo 6

Capacidad disminuida de los mutantes de la parvalbúmina recombinante para inducir la liberación de histamina por parte de los basófilos

Para analizar la actividad biológica de los mutantes de parvalbúmina, basófilos de sangre periférica de un paciente alérgico al pescado se incubaron con diferentes concentraciones de las proteínas recombinantes de tipo salvaje y mutantes (Fig. 5). La proteína recombinante de tipo salvaje indujo una fuerte liberación de histamina dependiente de la dosis, por parte de los granulocitos de los basófilos. Las cantidades de histamina liberada fueron menores, cuando los granulocitos se expusieron a Mut-CD o Mut-EF y disminuyeron enormemente tras la exposición de las células a Mut-CD/EF. Esta actividad alergénica significativamente disminuida de Mut-CD/EF sugiere que el derivado mutado de parvalbúmina representa una molécula candidata adecuada para aplicaciones terapéuticas.

Protocolo experimental Ensayo de liberación de histamina por parte de los basófilos

Se aislaron granulocitos a partir de muestras de sangre heparinizada de un paciente alérgico al pescado, mediante sedimentación en dextrano. Las células se incubaron con concentraciones crecientes de las variantes recombinantes de la parvalbúmina de carpa, de anticuerpo anti-IgE humana, o de tampón, según se ha descrito previamente (Valent y col., 1989). La histamina liberada se midió en los sobrenadantes libres de células mediante radioinmunoensayo (Immunotech, Marsella, Francia).

Referencias

Aas, K. 1987. Fish allergy and the cod allergen model. En Food allergy and intolerance, J. Brostoff y S.T. Challa-combe, compiladores. Balliere Tindall, Londres, pág. 356.

Aas, K. y S. M. Elsayed. 1969. Characterisation of a major allergen (cod). J. Allergy 44: 333.

Berchtold, M.W. 1989. Structure and expression of genes encoding three-domain Ca^{2+}-binding proteins parvalbumin and oncomodulin. Biochim. Biophys. Acta 1009: 201.

Bischoff, S.C., A. Herrmann y M.P. Manns. 1996. Prevalence of adverse reactions to food in patients with gastrointestinal diseases. Allergy 51: 811.

Bousquet, J., R. Lockey, H.J. Mailing y los miembros del comité de la WHO. 1998. Allergen immunotherapy: therapeutic vaccines for allergic diseases. J. Allergy Clin. Immunol. 102: 558.

Bugajsaka-Schretter, A., L. Elfman, T. Fuchs, S. Kapiotis, H. Rumpold, R. Valenta y S. Spitzauer. 1998. Parvalbumin, a cross-reactive fish allergen, contains IgE-binding epitopes sensitive to periodate treatment and Ca^{2+} depletion. J. Allergy Clin. Immunol. 101: 67.

Bugajska-Schretter, A., M. Grote, L. Vangelista, P. Valent, W. R. Sperr, H. Rumpold, A. Pastore, R. Reichelt, R. Valenta y S. Spitzauer. 2000. Purification, biochemical, and immunological characterisation of a major food allergen: different immunoglobulin E recognition of the apo- and calcium-bound forms of carp parvalbumin. Gut. 46: 661.

De Martino, M., E. Novembre, L. Galli, A. De Marco, P. Botarelli, E. Marano y A. Vierucci. 1990. Allergy to different fish species in cod-allergic children: in vivo and in vitro studies. J. Allergy Clin. Immunol. 86: 909.

Declercq, J.P., B. Tinant, J. Parello y J. Rambaud. 1991. Ionic interactions with parvalbumins. Crystal structure determination of pike 4.10 parvalbumin in four different ionic environments. J. Mol. Biol. 220: 1017.

Etesamifar, M. y B. Wüthrich. 1998. IgE-mediated food allergies including oral allergy syndrome in 383 patients. Allergologie 21: 451.

Elsayed, S. y K. Aas. 1971. Characterisation of a major allergen (cod). Observation on effect of denaturation on the allergenic activity. J. Allergy 47: 283.

Etherton y col., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford 1989.

Goodman, M. y J.F. Pechere. 1977. The evolution of muscular parvalbumins investigated by the maximum parsimony method. J. Mol. Evol. 9: 131.

Heizmann, C.W. y W. Hunziker. 1991. Intracellular calcium-binding proteins: more sites than insights. Trends Biochem. Sci. 16: 98.

Ikura, M. 1996. Calcium-binding and conformation response in EF-hand proteins. Trends Biochem. Sci. 21: 14.

Kretsinger, R.H. y C.E. Nockold. 1973. Carp muscle calcium-binding protein. II. Structure determination and general description. J. Biol. Chem. 248: 3313.

Kretsinger, R.H. 1980. Structure and evolution of calcium-modulated proteins. C. R. C. Crit. Rev. Biochem. 8: 119.

Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of the structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680.

Lehky, P., H.E. Blum, E.A. Stein y E.H. Fisher. 1974. Isolation and characterisation of parvalbumins from skeletal muscle of higher vertebrates. J. Biol. Chem. 249: 4332.

Lindstroem, C.D.V., T. van Do, I. Hordvik, C. Endresen y S. Elsayed. 1996. Cloning of two distinct cDNAs encoding parvalbumin, the major allergen of Atlantic salmon (Salmo salar). Scand. J. Immunol. 44: 335.

Merrifield y col. 1963. J. Am. Chem. Soc. 85: 2149.

Niederberger y col. 1998. J. Allergy Clin. Immunol. 102: 579.

O'Neil, C., A.A. Helbling y S.B. Lehrer. 1993. Allergic reactions to fish. Clin. Rev. Allergy 11: 183.

Pascual, C., M.M. Esteban y J.F. Crespo. 1992. Fish allergy: evaluation of the importance of cross-reactivity. J. Pediatr. 121: 29.

Pauli y col. 2000. Clin. Exp. Allergy 30: 1076.

Pechere, J.F. 1997. The significance of parvalbumin among muscular calcium proteins. In Calcium-Binding Proteins and Calcium. R.H. Wasserman, R. Corradino, E. Carafoli, R.H. Kretsinger, D.H. MacLennan y F.L. Siegel, compiladores. Elsevier, Holanda, pág. 213.

Permyakov, E.A., V.N. Medvedkin, Y.V. Mitin y R.H. Kretsinger. 1991. Noncovalent complex between domain AB and domain CD*EF of parvalbumn. Biochim. Biophys. Acta 1076: 667.

Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, compilador, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19ª Edición 1995.

Sambrook y col., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.

Sampson, H. 1999. Food allergy. Part 1: Immunopathogenesis and clinical disorders. J. Allergy Clin. Immunol. 103: 717.

Sanger, F., S. Nicklen y A.R. Coulson. 1977. DNA sequencing with chain terminating. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463.

Scopes, Protein Purification. Springer Verlag, Heidelberg 1994.

Swoboda, I., A. Bugajska-Schretter, P. Verdino, W. Keller, W.R. Sperr, P. Valent, R. Valenta y S. Spitzauer. 2002. Recombinant carp parvalbumin, the major cross-reactive fish allergen: A tool for diagnosis and therapy of fish allergy. J. Immunol. 168: 4576.

Tatusova y col. 1999. FEMS Microbiol. Lett. 174: 247.

Towbin, H., T. Staehelin y J. Gordon. 1979. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350.

Valent, P., J. Besemer, M. Muhm, O. Majdic, K. Lechner y P. Bettelheim. 1989. Interleukin 3 activates human blood basophils via high-affinity binding sites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5542.

Valenta, R. y D. Kraft. 1995. Recombinant allergens for diagnosis and therapy of allergic diseases. Curr. Opin. Immunol. 7: 751.

Valenta, R., S. Vrtala, S. Laffer, S. Spitzauer y D. Kraft. 1998. Recombinant allergens. Allergy 53: 552.

Van Hage-Hamsten y col. 1999. J. Allergy Clin. Immunol. 104: 969.

Vrtala y col. 1997. J. Clin. Invest. 99: 1673.

Methods in Enzymology, Vol. 182, Guide to Protein Purification, Academic Press, Nueva York, 1990.

<110> BIOMAY Produktions- und Handels-Aktiengesellschaft

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<120> Polipéptidos hipoalergénicos basados en parvalbúmina de pescado

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<130> Cyp c 1.01

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<160> 18

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 109

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<212> PRT

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<213> Cyprinus carpio

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<400> 1

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4

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<210> 2

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<211> 109

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> D52A, D54A

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<400> 2

5

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<210> 3

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<211> 109

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> D91A, D93A

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<400> 3

6

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<210> 4

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<211> 109

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> D52A, D54A, D91A, D93A

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<400> 4

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7

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<210> 5

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<211> 62

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Mano EF 1

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<400> 5

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8

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<210> 6

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Mano EF 2

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<400> 6

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\hskip1cm

9

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<210> 7

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<211> 109

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<212> PRT

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<213> Danio rerio

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<400> 7

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10

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<210> 8

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<211> 108

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<212> PRT

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<213> Cyprinus carpio

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<220>

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<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

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<222> (19).. (19)

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<223> Xaa es desconocido

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<220>

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<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

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<222> (21).. (21)

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<223> xaa es desconocido

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<400> 8

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11

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

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<211> 109

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<212> PRT

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<213> Cyprinus carpio

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<400> 9

12

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<210> 10

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<211> 125

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<212> PRT

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<213> Ictalurus punctatus

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<400> 10

13

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<210> 11

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<211> 109

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<212> PRT

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<213> Gadus morhua

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<400> 11

14

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<210> 12

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<211> 109

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<212> PRT

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<213> Danio rerio

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<400> 12

15

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<210> 13

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<211> 109

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<212> PRT

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<213> Danio rerio

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

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16

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<210> 14

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<211> 108

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<212> PRT

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<213> Electrophorus electricus

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<400> 14

17

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<210> 15

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<211> 109

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<212> PRT

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<213> Scomber japonicus

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<400> 15

18

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<210> 16

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<211> 45

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador mutCD

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<400> 16

\hskip1cm

19

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<210> 17

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<211> 45

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador mutEF

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<400> 17

\hskip1cm

20

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<210> 18

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<211> 330

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<212> DNA

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<213> Cyprinus carpio

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<400> 18

21

Claims (17)

1. Un polipéptido mutado, derivado de parvalbúmina de pescado, seleccionado entre el grupo que consiste en:

(a) polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, en la que los aminoácidos situados en las posiciones 52, 54, 91 y 93 se han sustituido; y

(b) polipéptidos que comprenden los aminoácidos del 2 al 109 del SEQ ID NO: 4.

2. Un polipéptido según la reivindicación 1, que posee una capacidad disminuida para inducir una reacción alérgica en un paciente alérgico al pescado, en comparación con un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 1.

3. Un polipéptido según la reivindicación 1 ó 2, que es capaz de inducir una respuesta de IgG en un mamífero.

4. Un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3, que induce una liberación de histamina que está significativamente disminuida en comparación con la de un polipéptido que cosiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 1.

5. Un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, que posee una actividad de unión a IgE disminuida en comparación con la de un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 1.

6. Un polipéptido mutado que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 4.

7. Un polipéptido mutado derivado de una parvalbúmina de pescado, que comprende la secuencia de tipo salvaje de la parvalbúmina de pescado en la que se han sustituido las posiciones de aminoácidos que corresponden a las posiciones de aminoácidos 52, 54, 91 y 93 del SEQ ID NO: 1.

8. Un polinucleótido que codifica un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7.

9. Un vector o un plásmido que contiene un polinucleótido según la reivindicación 8.

10. Una célula hospedadora aislada, transformada o transfectada con un vector o un plásmido según la reivindicación 9.

11. Un método para preparar un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7, que comprende cultivar las células hospedadoras aisladas según la reivindicación 10, en condiciones en las que dicho polipéptido se expresa y, opcionalmente, recuperar dicho polipéptido a partir de dichas células hospedadoras.

12. Un método para preparar un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7, que comprende sintetizar dicho polipéptido mediante métodos químicos.

13. El uso de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7, o de un polinucleótido según la reivindicación 8, o de una célula hospedadora aislada según la reivindicación 10, en la fabricación de un medicamento para tratar y/o prevenir una alergia al pescado.

14. El uso según la reivindicación 13, en el que el trastorno alérgico es una alergia a un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 1.

15. El uso según la reivindicación 13 ó 14, en el que el medicamento se usa para vacunación profiláctica.

16. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7, o un polinucleótido según la reivindicación 8, o una célula hospedadora aislada según la reivindicación 10, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

17. Un kit farmacéutico que comprende un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7, o un polinucleótido según la reivindicación 8, o una célula hospedadora aislada según la reivindicación 10, o una composición farmacéutica según la reivindicación 16.