ES2397175B1

ES2397175B1 - Compuestos fenólicos del aceite de oliva en una determinada concentración y sus usos

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Publication number: ES2397175B1
Application number: ES201131058A
Authority: ES
Inventors: Francisco Javier DELGADO LISTA; Pablo PÉREZ MARTÍNEZ; Fernando LÓPEZ SEGURA; José LÓPEZ MIRANDA; Francisco PÉREZ JIMÉNEZ; Alberto RANGEL ZÚÑIGA ORIOL; María Dolores LUQUE DE CASTRO
Original assignee: Ciber Fisiopatologia de la Obesidad Y Nutricion (ciberobn); Ciber Fisiopatologia de la Obesidad Y Nutricion Ciberobn; Universidad de Cordoba; Servicio Andaluz de Salud
Current assignee: Ciber Fisiopatologia de la Obesidad Y Nutricion (ciberobn); Ciber Fisiopatologia de la Obesidad Y Nutricion Ciberobn; Universidad de Cordoba; Servicio Andaluz de Salud
Priority date: 2011-06-22
Filing date: 2011-06-22
Publication date: 2014-01-20
Anticipated expiration: 2031-06-22
Also published as: WO2012175780A1; ES2397175A1

Abstract

Compuestos fenólicos del aceite de oliva en una determinada concentración y sus usos.#Uso de compuestos fenólicos del aceite de oliva en una determinada concentración, para la elaboración de un medicamento o composición farmacéutica o alimentaria, para la prevención o el tratamiento de la arteriosclerosis en humanos.

Description

Compuestos fenólicos del aceite de oliva en una determinada concentración y sus usos

La presente invención se encuentra dentro del campo de la nutrición, la medicina y la farmacología, y se refiere al uso de compuestos fenólicos del aceite de oliva en una determinada concentración, para la elaboración de un medicamento

o composición farmacéutica o alimentaria, para la prevención o el tratamiento de la arteriosclerosis en humanos.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Uno de los métodos de cocina más usuales para preparar comida es la fritura. Este proceso puede afectar significativamente la cantidad y calidad de la ingesta de grasas, afectando a la salud del consumidor. Durante la fritura, la grasa sufre importantes cambios en su composición. En la fritura profunda, se producen reacciones químicas, como son los procesos de hidrólisis y oxidación, que afectan tanto a las cualidades nutricionales y sensoriales del alimento consumido como a la seguridad del consumidor. Además, el calentamiento del aceite reduce el contenido natural de los antioxidantes y genera compuestos tóxicos tales como polímeros y compuestos polares. En la generación de estos compuestos tóxicos, durante el proceso de calentamiento, influyen características intrínsecas del aceite, como el grado de insaturación de su contenido graso o su riqueza en agentes antioxidantes, y factores relacionados con la técnica del calentamiento, como la duración, temperatura y número de calentamientos. Los aceites de semillas tienen menor contenido de antioxidantes que el aceite de oliva, en especial que el aceite de oliva virgen y extravirgen, haciéndolo más vulnerables al calentamiento y generando tras su ingesta un incremento en la oxidación de lipoproteínas. Algunas opciones para mejorar la estabilidad de los aceites fritos incluyen la composición modificada en ácidos grasos, como el de girasol alto y medio oleico o el de canola alto oleico y bajo linolénico. Sin embargo, los aditivos son una alternativa potencial para prevenir la oxidación del aceite de fritura, siendo capaz de mejorar su rendimiento.

Pocos estudios se han centrado en las consecuencias biológicas del consumo de aceites de fritura. Los estudios en modelos animales han demostrado que su ingesta aumenta los niveles de lipoproteínas aterogénicas (LDL). En el ser humano, incrementa ciertos productos proaterogénicos, como la fracción oxidada de los quilomicrones y LDL. Además se ha demostrado que el contenido de compuestos polares (sustancias prooxidantes que se generan al someter al aceite a altas temperaturas) en aceites de fritura son predictivos de la hipertensión arterial. Por su parte, otros estudios han asociado el consumo de compuestos polares con la disfunción endotelial, la hipertensión, y la arteriosclerosis, y por tanto con el riesgo cardiovascular.

Las consecuencias biológicas de la ingesta de aceites fritos son particularmente importantes en las personas obesas. En el medio interno de estas personas existe una inflamación sistémica crónica, de bajo grado, caracterizada por una producción anormal de citoquinas (moléculas de señalización celulares) que tienen propiedades inflamatorias y, además, se activan vías de señalización más complejas que favorecen el desarrollo de la arteriosclerosis. Esta inflamación de bajo grado se relaciona con la activación del factor NF-kB, que es el principal mediador de la respuesta inflamatoria. Su incremento refleja la activación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y se asocia con la expresión de una variedad de citoquinas relacionadas con la inflamación y la respuesta inmune, fenómenos que contribuyen al desarrollo de la arteriosclerosis.

La modulación de la respuesta inflamatoria por la dieta es uno de los principales campos de investigación actuales en nutrición y su relación con el desarrollo de enfermedades cardiovasculares. El sistema inmune sufre, a lo largo del día, numerosos episodios de activación, en relación con las distintas ingestas diarias. Tras una comida, llegan al medio interno vascular ciertos componentes potencialmente patógenos procedentes de la flora bacteriana intestinal, y/o de los alimentos ingeridos. Entre éstos destaca el lipopolisacárido (LPS), estructura común a la pared celular de múltiples bacterias y que tiene capacidad para estimular el sistema inmune y despertar una respuesta inflamatoria. Se ha demostrado que, en presencia elevada de ácidos grasos saturados en la ingesta, la cantidad de LPS y la activación subsecuente del sistema inflamatorio es mayor. Además, independientemente del tipo de grasa consumido, en las horas siguientes a una comida aumentan en sangre productos de glicación avanzada y se produce un incremento del estrés oxidativo. Todo esto puede resultar en una inflamación crónica de bajo nivel, debido a los continuos estímulos proinflamatorios derivados de la alimentación.

Hallazgos recientes vinculan también la grasa de la dieta con la capacidad de absorción de los LPS procedentes de la flora bacteriana habitual del tubo digestivo (denominada microbiota), lo que, como hemos anteriormente, puede condicionar diferencias en el estado inflamatorio, en un mecanismo dependiente de NF-kB, a través de unos mediadores denominados receptores tipo Toll-4 (TLR4).

En definitiva, y a pesar de que el periodo postprandial provoca una situación proinflamatoria, existen datos que demuestran que hay determinados condicionantes, como el tipo de grasa consumida o la existencia de obesidad, que provocan un aumento de este estado inflamatorio. En el caso que nos ocupa, y resumiendo también las evidencias indicadas anteriormente, la ingesta de aceite previamente frito provoca un ambiente proaterogénico, ya que produce tanto un aumento de la inflamación postprandial, debido a la existencia en ese aceite de productos proinflamatorios y prooxidantes y, además, provoca la aparición de un perfil de lipoproteínas aterogénicas en plasma.

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DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han realizado un estudio para conocer si se produce una activación de NF-kB postprandial en PBMCs de personas obesas, como expresión de actividad inflamatoria, tras la ingesta aguda de cuatro diferentes aceites de fritura, con distinta composición y grasa y diferente contenido de antioxidantes, después de un proceso estandarizado de fritura. El conocimiento de las posibles diferencias de activación de NF-kB les ha permitido definir una determinada concentración de compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen que puede prevenir la activación de los mecanismos implicados en el desarrollo de arterioesclerosis en seres humanos, y que pueden administrarse en combinación con otros aceites previamente fritos, de forma que su adición artificial en los alimentos puede reproducir los efectos biológicos presentes en el aceite que los que posee de forma natural.

Por tanto, el uso de los compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen en una concentración de al menos 300 ppm, y preferiblemente de 400 ppm, así como sus composiciones farmacéuticas y alimentarias, son útiles para la prevención y el tratamiento de arteriosclerosis en humanos.

Así pues, un primer aspecto de la invención se refiere al uso de los compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen en una concentración de al menos 300 ppm, en la elaboración de una composición para la prevención o el tratamiento de la ateroesclerosis en humanos, o alternativamente, a una composición que comprende compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen en una concentración de al menos 300 ppm para la prevención o el tratamiento de la arteriosclerosis en humanos.

En una realización preferida de la presente invención, los compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen se encuentran en una concentración de al menos 350 ppm, y más preferiblemente, se encuentran en una concentración de al menos 400 ppm.

En otra realización preferida, los compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen se obtienen del alperujo. En otra realización preferida, el humano presenta un índice de masa corporal (IMC) mayor o igual a 24 kg/m2.

El término “compuestos fenólicos” del aceite de oliva virgen, se refiere a un conjunto de fenoles entre los que se encuentran, pero sin limitarse a ellos, tirosol, apigenina, luteolina ácido vainilinico, ácido p-cumárico, oleuropeína y oleuropeína aglicona.

En otra realización preferida, la composición es una composición farmacéutica o medicamento. Más preferiblemente, la composición farmacéutica comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable, y aún más preferiblemente, la composición farmacéutica comprende, además, otro principio activo.

El término “medicamento”, tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y los animales. En el contexto de la presente invención, la enfermedad es la arteriosclerosis.

Como se emplea aquí, el término “principio activo”, “substancia activa”, “substancia farmacéuticamente activa”, “ingrediente activo” o “ingrediente farmacéuticamente activo” significa cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que afecte a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales. El término incluye aquellos componentes que promueven un cambio químico en la elaboración del fármaco y están presentes en el mismo de una forma modificada prevista que proporciona la actividad específica o el efecto.

Las composiciones de la presente invención pueden formularse para su administración a un animal, y más preferiblemente a un mamífero, incluyendo al hombre, en una variedad de formas conocidas en el estado de la técnica. Así, pueden estar, sin limitarse, en disolución acuosa estéril o en fluidos biológicos, tal como suero. Las disoluciones acuosas pueden estar tamponadas o no tamponadas y contener componentes activos o inactivos adicionales. Los componentes adicionales incluyen sales para modular la fuerza iónica, conservantes incluyendo, pero sin limitarse, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes y similares, así como nutrientes incluyendo glucosa, dextrosa, vitaminas y minerales. Alternativamente, las composiciones pueden prepararse para su administración en forma sólida. Las composiciones pueden combinarse con varios vehículos o excipientes inertes, incluyendo pero sin limitarse a; aglutinantes tales como celulosa microcristalina, goma tragacanto, o gelatina; excipientes tales como almidón o lactosa; agentes dispersantes tales como ácido algínico o almidón de maíz; lubricantes tales como estearato de magnesio, deslizantes tales como dióxido de silicio coloidal; agentes edulcorantes tales como sacarosa o sacarina; o agentes aromatizantes tales como menta o salicilato de metilo.

Tales composiciones y/o sus formulaciones pueden administrarse a un animal, incluyendo un mamífero y, por tanto, al hombre, en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse a, intraperitoneal, intravenoso, intramuscular, subcutáneo, intracecal, intraventricular, oral, enteral, parenteral, intranasal o dérmico. Preferiblemente, la vía de administración es oral.

La dosificación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores, como, por ejemplo, la edad, peso, sexo o tolerancia, del mamífero. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen que produzcan el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias del aceite de oliva virgen, así como del resto de los componentes de la composición, y el efecto terapéutico a conseguir. Los “adyuvantes” y “vehículos farmacéuticamente aceptables” que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidos por los técnicos en la materia.

El término “excipiente” hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción, distribución o acción de cualquiera de los principios activos de la presente invención, estabiliza dicha sustancia activa o ayuda a la preparación del medicamento en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que lo hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos, como, por ejemplo, almidones, azúcares o celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección del medicamento, como, por ejemplo, para aislarlo del aire y/o la humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación como por ejemplo el fosfato de calcio dibásico, función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.

El término excipiente “farmacéuticamente aceptable” hace referencia a que el excipiente esté permitido y evaluado de modo que no cause daño a los organismos a los que se administra.

Además, el excipiente debe ser farmacéuticamente adecuado, es decir, un excipiente que permita la actividad del principio activo o de los principios activos, es decir, que sea compatible con el principio activo, en este caso, el principio activo es cualquiera de los compuestos de la presente invención.

Un “vehículo farmacéuticamente aceptable” se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en la elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye, pero sin limitarse, sólidos, líquidos, disolventes o tensioactivos.

El vehículo, al igual que el excipiente, es una sustancia que se emplea en el medicamento para diluir cualquiera de los compuestos de la presente invención hasta un volumen o peso determinado. El vehículo farmacéuticamente aceptable es una sustancia inerte o de acción análoga a cualquiera de las células de la presente invención. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo farmacéuticamente aceptable es el diluyente.

En otra realización preferida la composición es una composición alimentaria. Más preferiblemente, la composición alimentaria comprende un suplemento nutricional. Aún más preferiblemente, la composición comprende una matriz alimentaria. En otra realización preferida, la matriz alimentaria se selecciona de la lista que comprende: leche, yogurt, queso, leche fermentada, leche de soja, cereales precocinados, galletas, pan, bollos, mantequilla, margarina, salchichas, aceites de freír, aceites vegetales, condimentos, zumos de frutas, siropes, helados, productos congelado, gomas de mascar y alimentos intermedios.

En otra realización preferida la matriz alimentaria es un aceite vegetal o una mezcla de aceites vegetales. Más preferiblemente, el aceite vegetal es aceite de girasol. La mezcla de aceites vegetales comprende: aceite de girasol alto oleico y aceite de colza. En otra realización más preferida la mezcla de aceites vegetales comprende: aceite de girasol alto oleico y aceite de colza.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de una composición de la invención (la composición alimentaria o la composición farmacéutica), para prevenir la generación de un ambiente proaterogénico en el endotelio.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la composición alimentaria de la invención en la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la arterioesclerosis, preferentemente en humanos.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1 A: Análisis cuantitativo de la activación postprandial de NF-KB, en células mononucleares de sangre periférica, de las personas que recibieron cuatro modelos de desayuno, con productos de bollería elaborados con distintos tipos de aceites. Puede verse que solo los aceites con polifenoles VOO (Aceite de oliva virgen) y SOP (Aceite vegetal añadido con polifenoles) redujeron la expresión del NF-KB, reflejando que evitaron el estado proinflamatorio inducido por los otros aceites (SFO (Aceite de girasol) y SOD (Aceite de semilla con Dimetilpolisiloxano).

Figura 1B: Análisis cuantitativo de la activación postprandial de IKB-a, en células mononucleares de sangre periférica, de las personas que recibieron cuatro modelos de desayuno, con productos de bollería elaborados con distintos tipos de aceites. Su incremento con los aceites con polifenoles VOO (Aceite de oliva virgen) y SOP (Aceite vegetal añadido con polifenoles) se interpreta como una capacidad de estos aceites para amortiguar la respuesta inflamatoria dependiente

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de la activación del NF-KB.

Figura 2: A las dos horas de la ingesta de los desayunos, con distinto contenido de aceites, se observó que con los aceites ricos en polifenoles (VOO y SOP) no se incrementan los niveles de Lipopolisacárido plasmático (LPS), señalando que no existe una absorción intestinal de dicho componente bacteriano.

EJEMPLOS

Se realizó un ensayo clínico que se describe a continuación, y que pone de manifiesto la especificidad y efectividad de los compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen en una determinada concentración en la prevención de la activación inflamatoria que favorece el desarrollo de la arterioesclerosis en humanos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Población de estudio

El estudio se realizó en veinte obesos sanos (edad media de 56 años, rango entre 40–70). Todos ellos firmaron su consentimiento informado y se les realizó una historia médica completa, examen físico y análisis de química clínica antes de la inscripción. Tenían un índice de masa corporal (IMC) promedio de 37,3 (29,4-44,9) kg/m2, perímetro de cintura de 113,7 cm (88–145), los niveles plasmáticos de colesterol total (CT) de 201.1 ± 3.8 mg/dl, los niveles plasmáticos de triglicéridos (TG) 102.9 ± 3.6 mg/dl, los niveles de colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDLc) de

130.2 ± 3.0 mg/dL y los niveles de colesterol de las lipoproteínas de alta densidad (HDLc) de 50.8 ± 1.2 mg/dl, niveles de glucosa plasmática de 100.9 ± 0.9 mg/dL y niveles de insulina de 10.7 ± 0.5 mU/L. Ninguno de los participantes mostraron indicios de enfermedades crónicas (hepática, renal, tiroides, corazón). Todos fueron no diabéticos, no fumadores, sin manifestación clínica de enfermedad cardiovascular y sin tratamiento. Ninguno tomaba medicamentos o vitaminas que se conozca que afectan a los lípidos plasmáticos. El protocolo del estudio fue aprobado por la Comisión de Investigación del Hospital Universitario Reina Sofía, de acuerdo con el marco institucional y las Directrices de Buenas Prácticas Clínicas.

Diseño del estudio

Todos los voluntarios recibieron cuatro desayunos con magdalenas elaboradas con cuatro aceites diferentes. Cada desayuno contenía 0,45 ml de aceite y 40 equivalentes de retinol, por kilogramo de peso corporal, y una distribución de calorías de 56% de grasas, 9% de proteínas y 35% de hidratos de carbono. Los desayunos eran administrados con un diseño aleatorizado y cruzado, siguiendo un modelo de cuadrado latino, lo que aumentó el poder del estudio. Los voluntarios fueron divididos en cuatro grupos de forma aleatoria y estratificada por sexo para recibir cada desayuno con un periodo de lavado de dos semanas entre cada uno de ellos. Los aceites fueron sometidos previamente a un proceso de fritura estandarizado (20 ciclos de calentamiento a 180 ºC durante 5 minutos por ciclo). Los aceites utilizados en el desayuno, así como su composición, son los siguientes:

1.: Aceite de oliva virgen (VOO) con 400 ppm de antioxidantes fenólicos naturales: 70,5% ácidos grasos monoinsaturados (MONO), 11,1% de ácidos grasos poliinsaturados (POLI) y 18,4% de ácidos grasos saturados (SAT),

2.: Aceite de girasol (SFO): 34,3% MONO, 58,3% de POLI y 7.3% de SAT.

3.: Mezcla de aceites de semillas mixta (30% de girasol alto oleico y 70% de aceite de colza) enriquecido con 2 mg/kg de dimetilpolisiloxano antioxidante (SOD): 71,8% de MONO, 18,0% de POLI y 10,2% SAT.

4.: Mezcla de aceites y semillas (30% de girasol alto oleico y 70% de aceite de colza) enriquecido con 400 ppm de compuestos fenoles extraídos del residuo de la producción de aceite de oliva-alperujo (SOP): 76,7% de MONO, 17,6% de POLI y 5,8% de SAT.

Enriquecimiento de los aceites con fenoles extraídos de alperujo.

Se realizó con el método de Girón et al. (2009. J Agric Food Chem 57(7): p. 2797-802), basado en extracción sólido– líquido (S–L). Un volumen de extracto de alperujo se puso en contacto con 3 ml de aceite y se agitó vigorosamente durante 30 min. Transcurrido este tiempo, la fase etanol–agua se separó por centrifugación a 3000 rpm durante 10 min. El aceite enriquecido resultante se analizó para determinar la concentración de fenoles totales e individuales.

Procedimiento de fritura. Dos litros de cada aceite se colocó en una freidora inoxidable y se sometió a 20 ciclos de calentamiento (a 180 º C ± 5 º C durante 5 minutos/ciclo).

Determinación de fenoles en los aceites

La concentración de fenoles en los aceites enriquecidos se determinó tanto de forma global (método de Folin– Ciocalteu), como individual (separación cromatográfica y detección mediante espectrometría de absorción molecular — HPLC–DAD) después de la extracción de los analitos seleccionados.

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Extracción de los compuestos fenólicos del aceite. Alícuotas de aceite de 2 g se agitaron durante 30 min con 20 ml de metanol y 2 ml de hexano. La fase de metanol, que contiene los compuestos fenólicos, se separó por centrifugación, se evaporó hasta la preconcentración adecuada y se almacenó a –20 º C hasta su posterior análisis.

Separación y cuantificación mediante HPLC–DAD. El método aplicado fue el propuesto por el Consejo Oleícola Internacional (COI) para la determinación individual de los compuestos fenólicos del aceite de oliva. La columna analítica empleada fue una Inertisil ODS-2 de fase reversa de 250 × 4 mm i.d., 5 μm; el volumen de inyección de 10 μl y la fase móvil una mezcla de A (agua acidificada con 0,2% de ácido fosfórico) y B (acetonitrilo- metanol, 1:1 v / v) a 1 ml/min. Una elución lineal inicial en gradiente de 0 a 50% B en 40 minutos fue seguido por otros gradiente de elución lineal de 50 a 60% B en 5 minutos y un tercer gradiente de 60 a 100% B en 10 minutos. Por último, el instrumento fue mantenido en condiciones isocráticas (100% B) durante 2 min. Es necesaria una etapa de equilibración de 5 minutos para restablecer las condiciones iniciales y alcanzar la estabilización de la fase móvil. Los fenoles eluídos se midieron a 230, 280, 325 y 350 nm (tiempo de elución total inferior a 57 min).

Muestras de sangre y aislamiento de PMBCs

Se obtuvieron muestras de sangre venosa (40 ml) en tubos con EDTA tras 12 horas de ayuno y a las 4 horas después de la ingestión del desayuno. Las muestras se diluyeron 1:1 en PBS, y las células se separaron en 15 ml de gradiente de Ficoll (solución de aislamiento de linfocitos, Rafer) por centrifugación 800 x g durante 25 min. La fase de PBMCs se extrajo con pipeta Pasteur, se lavó dos veces con PBS frío y se suspendió en solución tampón de lisis [10 mM de N-2 10 mM de N-2 hidroxietil piperazina ácido-N'-2-etano (HEPES), pH 7,5, 15 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 2 MgCl2, 1 mM ditiotreitol (TDT), 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF).

Análisis de lípidos y determinaciones bioquímicas

Los parámetros lipídicos se midieron con un autoanalizador modular DDPPII Hitachi (Roche, Basel, Switzerland) utilizando reactivos específicos (Boehringer-Mannheim, Mannheim, Germany). Los triglicéridos (TG) y el colesterol total (CT) se midió por métodos colorimétricos enzimáticos y el colesterol HDL (C-HDL) por métodos enzimáticos. El colesterol LDL (C-LDL) se calculó por la formula de Friedewald basada en los valores de CT, TG, y C-HDL. Las concentraciones de glucosa plasmática se midieron en un analizador Hitachi 917 (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) por el método de la glucosa oxidasa (GOD-PAP).

Extracción de la proteína nuclear

Las células se resuspendieron en tampón de lisis celular, se descongelaron y se lisaron en hielo durante 10 minutos. Los tubos se agitaron para romper las membranas celulares y se centrifugaron a 16 000 x g a 4 ° C durante 5 min. Luego se resuspendieron en solución tampón de lisis celular (10 mM HEPES, pH 7,5, 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5% NonidetP - 40 y 0,5 mM PMSF) y se mantuvieron en hielo durante 10 minutos, siendo finalmente centrifugadas a 16 000 x g a 4 º C durante 5 min. Los sobrenadantes se almacenaron como extractos citoplasmáticos. Los pellets que contienen la fracción nuclear se resuspendieron en tampón de extracción nuclear [20 mM de HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF] y se incubaron en hielo durante 20 min. A continuación, la suspensión se centrifugó a 16 000 x g durante 15 min a 4 ° C y del sobrenadante se recogió el extracto nuclear. La concentración de proteínas fue estimada utilizando el reactivo de Bradford (Bio-Rad).

Ensayos de movilidad electroforética Shift (EMSA)

Los extractos nucleares fueron testados mediante su capacidad de unión con NF-kB, utilizando oligonucleótidos consenso SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3, de Santa Cruz Biotechnology, utilizando el kit de Digoxigenina EMSA de Roche Diagnostics (Basilea, Suiza). Un total de 15 μg de proteína nuclear fueron tratados de acuerdo con las instrucciones del kit. Los complejos se detectaron con el sustrato quimioluminiscente CSPD y fueron expuestos a Hyperfilm de Amersham Biosciences, en un soporte de película de 4 – 16 horas a temperatura ambiente.

Western Blotting

Los extractos citoplasmáticos (70 μg) se resuspendieron en un gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) de electroforesis al 12% de dodecil sulfato sódico y posteriormente se transfirieron a membranas de nitrocelulosa en Tris 25 mM, glicina 192 mM, metanol al 20% y se sometieron a 15 V durante 1 hora usando transferencia semi-seca y siguiendo los protocolos estándar. La cantidad de proteína transferida se comprobó utilizando la solución de mancha Ponceau-S en 1% de ácido acético. Los sitios de unión inespecífica se bloquearon por incubación de la membrana en TTBS (25 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20, pH 7,6), con 5% de leche en polvo. Las membranas se incubaron durante una noche a 4 °C con anticuerpos primarios policlonales anti-IKB-a (Santa Cruz Biotechnology) (1:200 en 5% de leche descremada en polvo en TTBS). La membrana se lavó con TTBS y se incubó con el anticuerpo secundario [IgG anti-conejo, conjugado con HRP (Biotecnología Santa Cruz) (1:1000 en 5% de leche en polvo en TTBS)] durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de un lavado con TTBS, las proteínas se detectaron mediante el kit de quimioluminiscencia del reactivo Luminol Reagent detection system (Santa Cruz Biotechnology). Los niveles de proteína se cuantificaron con el densitómetro calibrado SG-800 (Bio-Rad) y fueron analizados con el Quantity One 4.6.5 software. Los resultados fueron calculados en términos de densidad óptica integrada (IOD) normailizada según el método de tinción con rojo Ponceau S y se expresaron en unidades arbitrarias (UA).

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Determinación de LPS

La endotoxinas (LPS) se midieron mediante una prueba de lisado de amebocitos de Limulus (QCL-1000; Lonza Ibérica, SA Barcelona, España), según lo recomendado por el fabricante. Se recolectó el suero en tubos no pirogénicos y se congeló a –20 °C hasta el ensayo. Todos los procedimientos fueron realizados en condiciones no pirogénicas. El suero fue diluido al 1:5, mezclados con lisado de amebocitos de Limulus (LAL) y fue incubado a 37 ºC durante 10 minutos. Una solución de sustrato se mezcló con la muestra LAL y se incubó a 37 ºC durante 6 minutos. La reacción se detuvo con el reactivo de parada. Cuando la endotoxina está presente en el suero, se desarrolla un color amarillo. La absorbancia de la solución coloreada se leyó a 405 nm. La recuperación de lipopolisacárido fue de entre 50 y 200%. La sensibilidad del ensayo fue de 0,005 unidades Ehrlich/ml (0,5 pg/ml). Los coeficientes intra- e inter-ensayo de variación para la determinación de LPS fueron entre 5–10%.

Análisis estadístico

Todos los datos se expresan como valores medios y error típico. Se utilizó SSPS 15 para Windows (SPSS Inc., Chicago) para el análisis estadístico. Los datos fueron analizados utilizando el análisis de varianza (ANOVA) para medidas repetidas. El estadístico de contraste utilizado en el supuesto de que la esfericidad no se cumpliera era de Greenhouse-Geisser. En este análisis se estudió:

1.: El efecto del tipo de aceite ingerido, independiente del tiempo.

2.: El punto de tiempo postprandial.

3.: La interacción de ambos factores.

Estos valores indican el grado de la respuesta postprandial en cada grupo de sujetos a cada aceite p<0,05 fue considerado significativo.

RESULTADOS

Consumo de aceites fritos y lipemia postprandial

Los niveles de TGL postprandiales en plasma se incrementaron tras el consumo de los cuatro aceites (p <0,05), pero no se encontró ninguna diferencia entre los aceites (datos no mostrados).

Por otro lado, no se observaron cambios significativos en los niveles de CT, C-HDL y C-LDL.

Determinación de fenoles en los aceites

Se determinó el contenido de compuestos fenólicos, antes y después de 20 ciclos de calentamiento a 180 °C, en los aceites que los contenían, a saber: VOO (presente de forma natural) y SOP (con compuestos fenólicos añadidos), En ambos casos los ciclos de calentamiento redujeron la cantidad de algunos de los fenoles, pero la mayoría de ellos (tirosol, apigenina, luteolina, ácido vainilínico, ácido p-cumárico, oleuropeína y oleuropeína aglicona dialdehído) todavía estaban presentes tras el calentamiento.

Ingestión aguda de los diferentes aceites de fritura y expresión de NF-kB y de IKB-a

Con el fin de examinar si la ingestión aguda en forma de desayuno de cuatro aceites diferentes de fritura con distinto perfil lipídico y contenido de compuestos antioxidantes podría influir en la respuesta inflamatoria de las células mononucleares, los extractos nucleares de PBMCs recogidos a las 12 horas de ayuno y 4 horas después de ingerir el desayuno fueron analizados por EMSA. Los resultados mostraron que la ingesta del desayuno que contenía VOO (p = 0,029) y el desayuno con SOP (p = 0,009) disminuyó la activación de NF-kB posprandial (FIGURA 1A), aumentando la expresión de su inhibidor (FIGURA 1B), frente al resultado encontrado con los aceites carentes en compuestos fenólicos.

Cambios en suero de los niveles de LPS en respuesta a la ingesta de los diferentes aceites fritos

Se ha estudiado si la ingesta de cuatro diferentes aceites fritos afecta la absorción de LPS endógena. Se observó una disminución significativa del nivel sérico postprandial de LPS, 2 h después de la ingesta de ambos VOO (p = 0,043) y SOP (p = 0,032) en comparación con el tiempo basal. Por el contrario, no hubo cambios significativos después del consumo de los desayunos basados en SFO y SOD (FIGURA 2).

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Claims

REIVINDICACIONES

1- El uso de los compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen en una concentración de al menos 300 ppm, en la elaboración de una composición para la prevención o el tratamiento de la arteriosclerosis en humanos.

2- El uso según la reivindicación anterior, donde los compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen se encuentran en una concentración de al menos 350 pp.

3- El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1–2, donde los compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen se encuentran en una concentración de al menos 400 ppm.

4- El uso de los compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen según cualquiera de las reivindicaciones 1–3, donde los compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen se obtienen del alperujo.

5- El uso de los compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen según cualquiera de las reivindicaciones 1–4, donde el humano presenta un índice de masa corporal (IMC) mayor o igual a 24 kg/m2.

6- El uso de los compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen según cualquiera de las reivindicaciones 1–5, donde la composición es una composición farmacéutica o un medicamento.

7- El uso de los compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen según la reivindicación 6, donde la composición farmacéutica además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

8- El uso de los compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen según cualquiera de las reivindicaciones 6–7, donde la composición además comprende otro principio activo.

9- El uso de los compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen cualquiera de las reivindicaciones 1–5, donde la composición es una composición alimentaria.

10-El uso de los compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen según la reivindicación 9, donde la composición alimentaria incluye un suplemento nutricional.

11-Una composición alimentaria según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 9–10, que comprende compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen y una matriz alimentaria.

12-Una composición alimentaria según la reivindicación anterior, donde la matriz alimentaria se selecciona de la lista que comprende: leche, yogurt, queso, leche fermentada, leche de soja, cereales precocinados, galletas, pan, bollos, mantequilla, margarina, salchichas, aceites de freír, aceites vegetales, condimentos, zumos de frutas, siropes, helados, productos congelado, gomas de mascar y alimentos intermedios.

13-Una composición alimentaria según la reivindicación 12, donde la matriz alimentaria es un aceite vegetal o una mezcla de aceites vegetales.

14-Una composición alimentaria según la reivindicación 13, donde el aceite vegetal es aceite de girasol.

15-Una composición alimentaria según la reivindicación 14, donde la mezcla de aceites vegetales comprende: aceite de girasol alto oleico y aceite de colza.

16-Uso de la composición alimentaria según cualquiera de las reivindicaciones 11–15, para prevenir la generación de un ambiente proaterogénico en el endotelio.

FIG. 1-A

FIG. 1-B

ES 2 397 175 1

FIG. 2

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

N.º solicitud: 201131058

ESPAÑA

Fecha de presentación de la solicitud: 22.06.2011

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : A23L1/30 (2006.01)

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categoría

56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas

X

ES 2288123 A1 (FURFURAL ESPAÑOL S A) 16.12.2007, todo el documento. 1-15

A

16

X

WO 0038541 A1 (UNIELVER) 06.07.2000, reivindicaciones. 1-15

A

ES 2283191 A1 (ANTAS PHARMA S A) 16.10.2007, todo el documento. 1-16

A

EP 1221286 A1 (UNILEVER) 10.07.2002, todo el documento. 1-16

A

US 6641850 B1 (STEWART & LYNDA RESNICK TRUST) 01.11.2003, todo el documento. 1-16

Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud

El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº:

Fecha de realización del informe 12.02.2013

Examinador J. Manso Tomico Página 1/4

INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

Nº de solicitud: 201131058

Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) A23L Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de

búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, EMBASE

Informe del Estado de la Técnica Página 2/4

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 201131058

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 12.02.2013

Declaración

Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)

Reivindicaciones Reivindicaciones 1-16 SI NO

Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)

Reivindicaciones Reivindicaciones 16 1-15 SI NO

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).

Base de la Opinión.-

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

Informe del Estado de la Técnica Página 3/4

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 201131058

1. Documentos considerados.-

A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

Documento

Número Publicación o Identificación Fecha Publicación

D01

ES 2288123 A1 (FURFURAL ESPAÑOL S A) 16.12.2007

D02

WO 0038541 A1 (UNIELVER) 06.07.2000

D03

ES 2283191 A1 (ANTAS PHARMA S A) 16.10.2007

D04

EP 1221286 A1 (UNILEVER) 10.07.2002

D05

US 6641850 B1 (STEWART & LYNDA RESNICK TRUST) 01.11.2003
2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración

La presente solicitud divulga el uso de los compuestos fenólicos del aceite de oliva para la elaboración de una composición para la prevención o tratamiento de la arteriosclerosis en humanos. Las reivindicaciones 1-10 hacen referencia al uso de los compuestos fenólicos en concentraciones de 300, 350 y 400 ppm para la elaboración de un compuesto para la prevención o tratamiento de la arteriosclerosis. Las reivindicaciones 11-15 hacen referencia a una composición alimentaria que comprenda dichos compuestos fenólicos. La reivindicación 16 hace referencia al uso de los compuestos fenólicos para prevenir la aparición de un ambiente proaterogénico en el endotelio. D01 divulga una composición alimentaria funcional rica en compuestos fenólicos, obtenida a partir de la combinación de extractos procedentes de especies cítricas y oliváceas y su uso de la composición para la inhibición de la ateroesclerosis en humanos. D02 divulga un procedimiento de enriquecimiento de un producto alimenticio por medio del cual el producto alimenticio obtenido contiene al menos 10 ppm de compuestos fenólicos derivados de la aceituna. Además divulga un aceite vegetal que contiene al menos 300 ppm de polifenoles del aceite de oliva (reivindicación 3). Además se indica que los polifenoles presentes en el alimento funcional controla la tasa de oxidación del colesterol influyendo positivamente en el sistema cardiovascular de la persona. D03 divulga una formulación para aplicaciones farmacéuticas, alimentarias o cosméticas caracterizada porque comprende la biomasa de pulpa de oliva con alto contenido en antioxidantes fenólicos D04 divulga un método para incrementar el contenido de polifenoles en un aceite mediante la mezcla del aceite con un material provenientes de frutas y un alimento conteniendo tal aceite. D05 divulga un método de tratamiento de pacientes con arterioesclerosis que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente aceptable del jugo de la granada, donde la cantidad de polifenoles naturalmente presente en jugo es al menos de 30 a 3000 micromoles. D06 divulga un estudio donde se administraron 2 desayunos basado en aceite de oliva, uno de ellos con alto contenido en compuestos fenólicos (398 ppm) y el otro con bajo contenido (70 ppm) a 20 pacientes con síndrome metabólico. Los resultados obtenidos sugirieron que el consumo de un desayuno con aceite de oliva, rico en compuestos fenólicos, reduce los procesos de proliferación celular en células mononucleares, lo que podría ser un mecanismo de protección del desarrollo de arteriosclerosis. Según se divulga en algunos documentos del estado de la técnica (D01 y D02) ya es conocido el uso de los fenoles del aceite de oliva para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, y en concreto la arterosclerosis. La diferencia entre el objeto de la solicitud y D01, tomado como documento del estado de la técnica más cercano al objeto de la solicitud, sería la concentración de polifenoles presente en la composición. Sin embargo, esa diferencia no parece conllevar ningún efecto técnico sorprendente puesto que en el estado de la técnica es de sobra conocido el empleo de polifenoles del aceite de oliva en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares y, a tenor de los divulgado en la solicitud, no parece tener relación alguna la concentración de los mismos con la efectividad del tratamiento. Así pues, las reivindicaciones 1-15 aún siendo nuevas, según se menciona en el art. 6 de la ley 11/1986, carecerían de actividad inventiva tal y como se menciona en el art. 8 de la ley 11/1986. Finalmente, la reivindicación 16 sí que cumpliría con los requisitos de novedad y actividad inventiva según se menciona en los anteriores artículos de la ley 11/1986.

Informe del Estado de la Técnica Página 4/4