ES2397707T3

ES2397707T3 - Vacunas contra la gripe canina

Info

Publication number: ES2397707T3
Application number: ES06789953T
Authority: ES
Inventors: Jules Maarten Minke; Kemal Karaca; Jiansheng Yao
Original assignee: Merial Ltd; Merial LLC
Current assignee: Merial Ltd; Merial LLC
Priority date: 2005-08-25
Filing date: 2006-08-23
Publication date: 2013-03-08
Anticipated expiration: 2026-08-23
Also published as: US7425336B2; EP1942933A2; PL1942933T3; US20070048821A1; PT1942933E; EP1942933B1; WO2007024947A3; SI1942933T1; WO2007024947A2; JP2009506050A; CA2620074A1; CA2620074C; DK1942933T3; CY1113540T1

Abstract

Uso de una formulación que comprende un vector de expresión avipox que comprende unpolinucleótido que codifica un antígeno de la gripe equina y un portador, excipiente o vehículo farmacéutica oveterinariamente aceptable en una cantidad eficaz para estimular una respuesta inmunoprotectora, en la fabricaciónde un medicamento para estimular una respuesta inmunoprotectora contra la gripe en un can; en el que el vector de expresión avipox es un vector de expresión avipox atenuado, en el que el vector de expresiónavipox es un vector del virus de la viruela del canario y en el que el vector del virus de la viruela del canario esALVAC; y en el que el antígeno de la gripe equina es una hemaglutinina en la que la hemaglutinina es H3.

Description

Vacunas contra la gripe canina.

INCORPORACIÓN POR REFERENCIA

[0001] Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de los Estados Unidos con Nº de Serie 11/264.622 presentada el 1 de noviembre de 2005, que reivindica la prioridad de la Solicitud de los Estados Unidos con Nº de Serie 11/211.983 presentada el 25 de agosto de 2005.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0002] La presente descripción abarca las vacunas contra la gripe, en particular las vacunas contra la gripe canina. La vacuna puede ser una vacuna de poxvirus recombinante o una vacuna inactivada.

ANTECEDENTE DE LA INVENCIÓN

[0003] Las enfermedades respiratorias que se asemejan a la gripe han infectado miles de perros en los Estados Unidos. Brotes recurrentes de enfermedad respiratoria grave caracterizada por tos y fiebre se han producido en galgos en las casetas de perros de los canódromos. Los hallazgos patológicos han incluido hemorragias pulmonares y pleurales graves, de manera precisa, traqueítis subaguda erosiva a hiperplásica, bronquitis y bronquiolitis y bronconeumonía. En 2004, se sacrificaron ocho galgos en Jacksonville, Florida debido a un virus de la gripe equina que saltó la barrera interespecies de caballos a perros.

[0004] El virus de la gripe equina es una enfermedad de los caballos, y el virus está en el mismo grupo que produce la gripe en las personas. La enfermedad está presente en las poblaciones de caballos en toda Europa, Norteamérica y partes de Asia, en la que los caballos desarrollan de forma típica fiebre y una tos áspera seca. En las etapas iniciales de la enfermedad, los caballos son reacios a comer o beber durante algunos días, pero normalmente se recuperan en dos a tres semanas.

[0005] Subtipos H3N8 del virus de la gripe equina se aislaron previamente de los pulmones de dos perros de Florida y un perro de Texas que habían muerto debido a la infección. Los análisis de las secuencias genéticas y las comparaciones filogenéticas determinaron que los tres aislados caninos estaban estrechamente relacionados, y habían evolucionado a partir de cepas contemporáneas de la gripe equina H3N8. La inmunohistoquímica demostró que el antígeno de la gripe estaba presente en las células epiteliales de las glándulas bronquiales, células epiteliales bronquiales y bronquiolares y en macrófagos alveolares. Se demostró la seroconversión al virus de la gripe canina mediante ensayos de inhibición y microneutralización de la hemaglutinación.

[0006] Los análisis moleculares y antigénicos de tres virus de la gripe aislados de brotes de enfermedad respiratoria grave en galgos de competición desveló que estaban estrechamente relacionados con el virus H3N8 de la gripe equina (véase, por ejemplo., Crawford y col., Science. 2005 Oct. 21; 310 (5747): 482 – 5. Epub 26 de septiembre de 2005). El análisis filogenético indicó que los genomas del virus de la gripe canina forman un grupo monofilético consistente con una única transferencia de virus interespecies. Los cambios moleculares en la hemaglutinina sugirieron la evolución adaptativa en el nuevo hospedador. El papel etiológico de este virus en la enfermedad respiratoria estaba apoyado por la asociación temporal del aumento de los títulos de anticuerpo con la enfermedad y por los estudios de inoculación experimentales. La expansión geográfica de la infección y su persistencia durante algunos años indican la eficiente transmisión del virus de la gripe canina entre los galgos. Las evidencias de infección en perros mascotas sugieren que esta infección puede también llegar a ser enzoótica en esta población.

[0007] En 2005, se notificó que una forma mutada de la gripe aviar (virus H3N8) había matado galgos en Massachusetts.

[0008] ("The detectives", Cornell Veterinary Magazine, 2004, p. 10 – 13, URL: http: //www.vet.cornell.edu/news/cvmagazine/Fall04/detectives.pdf)

[0009] De acuerdo con esto, existe una necesidad de una vacuna eficaz contra la gripe en canes. La citación

o la identificación de cualquier documento en esta solicitud no es un reconocimiento de que dicho documento está disponible como técnica anterior a la presente invención.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0010] La presente invención proporciona el uso de una formulación que comprende un vector de expresión avipox que comprende un polinucleótido que codifica un antígeno de la gripe equina y un portador, excipiente o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable en una cantidad eficaz para estimular una respuesta inmunoprotectora, en la fabricación de un medicamento para estimular una respuesta inmunoprotectora contra la gripe en un can; en el que el vector de expresión avipox es un vector de expresión avipox atenuado, en el que el vector de expresión avipox es un vector del virus de la viruela del canario y en el que el vector del virus de la viruela del canario es ALVAC, y en el que el antígeno de la gripe equina es una hemaglutinina en la que la hemaglutinina es H3.

[0011] En otro aspecto, la presente invención proporciona una formulación que comprende un vector de expresión avipox que comprende un polinucleótido que codifica un antígeno de la gripe equina y portador, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable en una cantidad eficaz para estimular una respuesta inmunoprotectora, para el uso en la estimulación de una respuesta inmunoprotectora contra la gripe en canes;

en el que el vector de expresión avipox es un vector de expresión avipox atenuado, en el que el vector de expresión avipox es un vector del virus de la viruela del canario y en el que el vector del virus de la viruela del canario es ALVAC; y

en el que el antígeno de la gripe es una hemaglutinina en la que la que la hemaglutinina es H3.

[0012] En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de una formulación que comprende una vacuna contra la gripe inactivada y un vehículo farmacéuticamente aceptable en una cantidad eficaz para estimular una respuesta inmunoprotectora en un can, en la fabricación de un medicamento para estimular una respuesta inmunoprotectora contra el virus de la gripe en un can; en la que dicha vacuna de la gripe inactivada es un virus de la gripe equina inactivado de serotipo H3; en el que la vacuna de la gripe inactivada es un aislado de la gripe equina inactivado y en el que el aislado de la gripe equina se escoge entre el grupo que consiste en un aislado de la gripe equina de Ohio, un aislado de la gripe equina de Kentucky, un aislado de la gripe equina de Newmarket o sus mezclas.

[0013] La presente invención proporciona, en otro aspecto, una formulación que comprende una vacuna de la gripe inactivada y un vehículo farmacéuticamente aceptable en una cantidad eficaz para estimular una respuesta inmunoprotectora en un can, para uso en la estimulación de una respuesta inmunoprotectora contra la gripe en un can; en la que dicha vacuna de la gripe inactivada es un virus de la gripe equina inactivado de serotipo H3, en el que la vacuna de la gripe inactivada es un aislado de la gripe equina inactivado y en el que el aislado de la gripe equina se escoge entre el grupo que consiste en un aislado de la gripe equina de Ohio, un aislado de la gripe equina de Kentucky, un aislado de la gripe equina de Newmarket o sus mezclas.

[0014] La presente descripción abarca vacunas de la gripe canina, que pueden ser una vacuna de la gripe canina recombinante o una vacuna de la gripe canina inactivada.

[0015] En una realización en la que la vacuna contra la gripe canina es una vacuna recombinante, de forma ventajosa, el vector es un vector de expresión avipox que puede comprender un polinucleótido que codifica un antígeno, epítopo o inmunógeno de la gripe. El antígeno, epítopo o inmunógeno de la gripe puede ser una hemaglutinina, proteína de matriz, neuraminidasa, proteína no estructural, nucleoproteína, polimerasa o cualquiera de sus fragmentos.

[0016] En una realización ventajosa, el antígeno, el epítopo o el inmunógeno de la gripe canina se deriva de un can infectado con gripe. Por ejemplo, pero sin limitación, el virus de la gripe se puede aislar del lavado bronquioalveolar y/o de los tejidos de pulmón de un perro afectado. Se puede llevar a cabo el aislamiento y la caracterización de la secuencia de nucleótidos de la gripe que infecta al perro mediante experimentación rutinaria por una persona normalmente experta en la técnica.

[0017] El antígeno, el epítopo o el inmunógeno de la gripe canina se puede aislar de una gripe equina. La gripe equina puede ser una gripe equina de Ohio, gripe equina de Kentucky o una gripe equina de Newmarket.

[0018] El vector de expresión avipox puede ser un vector de expresión avipox atenuado. En una realización, el vector de expresión avipox puede ser un vector del virus de la viruela del canario, de forma ventajosa ALVAC. El antígeno, el epítopo o el inmunógeno de la gripe puede ser una hemaglutinina, tal como H3. El vector del virus de la viruela del canario puede ser CP 2242, CP1529 o CP1533.

[0019] La presente descripción abarca también una vacuna de la gripe inactivada. La vacuna de la gripe inactivada puede ser una gripe canina inactivada. En otra realización, la vacuna de la gripe inactivada puede ser una gripe equina, de forma ventajosa una gripe equina de Ohio, una gripe equina de Kentucky o una gripe equina de Newmarket. La vacuna puede estar inactivada con formalina o beta-propiolactona.

[0020] La descripción se refiere también a un procedimiento para estimular una respuesta inmune contra la gripe en un can, que puede comprender administrar una formulación que comprenda una cualquiera de la vacuna de la gripe recombinante o la vacuna inactivada anteriores y un portador, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable en una cantidad eficaz para estimular una respuesta inmune. En una realización ventajosa, se puede añadir un adyuvante. El adyuvante puede ser hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, un carbómero o una emulsión de aceite en agua y opcionalmente puede comprender CpG. De forma ventajosa, la administración puede ser subcutánea o intramuscular.

[0021] La descripción se refiere además a un procedimiento para inducir una respuesta inmune contra la gripe en un can, que puede comprender administrar una formulación que comprende una cualquiera de la vacuna de la gripe recombinante o la vacuna inactivada anteriores y un portador, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmune. En una realización ventajosa, se puede añadir un adyuvante. El adyuvante puede ser hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, un carbómero o una emulsión de aceite en agua, y opcionalmente puede comprender CpG. De forma ventajosa, la administración puede ser subcutánea o intramuscular.

[0022] La descripción abarca además un kit para llevar a cabo un procedimiento para estimular o inducir una respuesta inmune que puede comprender una cualquiera de las vacunas de la gripe recombinantes o las vacunas inactivadas e instrucciones para llevar a cabo el procedimiento.

[0023] Estas y otras realizaciones se dan a conocer o son obvias a partir de y quedan abarcadas por, la siguiente Descripción detallada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0024] La siguiente descripción detallada, proporcionada por medio de ejemplos, pero que no se pretende que limite la invención exclusivamente a las realizaciones específicas descritas, se puede entender mejor con los dibujos que la acompañan, en los que:

La FIG. 1 ilustra la secuencia de la inserción en PJT004 (SEQ ID NO: 1);

La FIG. 2 ilustra la secuencia de la inserción en PJT005 (SEQ ID NO: 2);

La FIG. 3 ilustra una comparación de la secuencia de aminoácidos de la cepa HA del EIV Ohio 03 con la de la cepa H3HA de Newmarket (SEQ ID NOS: 3 y 4);

La FIG. 4A ilustra una construcción de un plásmido donante ALVAC para la generación de una cepa H3 HA de EIV optimizada para el codón que e4xpresa ALVAC recombinante (Ohio 3);

La FIG. 4B ilustra el pALVAC C5 de la cepa H3 HA de EIV sintética para H6p, pJY1571.1;

La FIG. 5B ilustra una secuencia de nucleótidos de los grupos e inserciones con traducción;

La FIG. 6 ilustra un análisis de transferencia Western de vCP2242. Se utilizó una dilución 1/1.000 del anticuerpo combinado dirigido contra EIV para el análisis. Banda 1: 5 μl del marcador de proteínas Fermentas Prestain, banda

2. 15 μl del aglomerado celular de ALVAC, banda 3. 15 μl del aglomerado celular de vCP2242, banda 4: 15 μl del aglomerado celular de vCP2242, banda 5: 15 μl del aglomerado celular vCP1533, banda 6: separación, banda 7. 40 μl de sobrenadante de ALVAC, banda 8. 40 μl de sobrenadante de vCP2242, banda 9: 40 μl de sobrenadante de vCP2242, banda 10: 40 μl de sobrenadante de vCP1533.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0025] La presente invención está basada, en parte, en los estudios de los solicitantes, que demuestran que una cepa HA de la gripe equina que expresa la viruela del canario recombinante es inmunogénica en perros.

[0026] La presente descripción abarca cualquier antígeno, epítopo o inmunógeno de la gripe que estimula una respuesta inmunógena en un animal, de forma ventajosa un vertebrado, de forma más ventajosa un perro. El antígeno, el epítopo o el inmunógeno de la gripe puede ser cualquier antígeno, epítopo o inmunógeno de la gripe, tal como, pero sin limitarse a, una proteína, péptido o uno de sus fragmentos, que provoca, induce o estimula una respuesta en un animal, de forma ventajosa un vertebrado, de forma más ventajosa un perro.

[0027] En una realización ventajosa, el antígeno, epítopo o inmunógeno de la gripe canina se deriva de un can infectado con la gripe. Por ejemplo, pero sin limitación, el virus de la gripe se puede aislar a partir del lavado bronquioalveolar y/o de tejidos pulmonares de un perro afectado. El aislamiento y la caracterización de la secuencia de nucleótidos de la gripe que infecta el perro se puede llevar a cabo mediante experimentación rutinaria por una persona normalmente experta en la técnica.

[0028] En otra realización ventajosa, el antígeno, el epítopo o el inmunógeno de la gripe canina se pueden derivar de un equino infectado con gripe o de una cepa de gripe equina. De forma ventajosa, la cepa de gripe equina es una gripe equina de Ohio, una cepa de gripe equina de Kentucky o una cepa de gripe equina de Newmarket. El antígeno, el epítopo o el inmunógeno de la gripe canina se pueden determinar por una persona normalmente experta en la técnica a partir de las secuencias de nucleótidos de los Ejemplos 4 y 5. De forma ventajosa, el antígeno, el epítopo o el inmunógeno de la gripe canina es una hemaglutinina (HA) (por ejemplo, precursor de HA, H1, H2, proteína, proteína de matriz (por ejemplo, proteína de matriz M1 o M2), neuraminidasa, proteína no estructural (NS) (por ejemplo, NS1 o NS2), nucleoproteína (NP) y polimerasa (por ejemplo, polimerasa PA, polimerasa 1 de PB1 o polimerasa 2 de PB2).

[0029] Los ejemplos de cepas de la gripe equina de Kentucky que se pueden utilizar en los procedimientos de la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, cepas A/eq/Kentucky/98 de la gripe equina (véase, por ejemplo, Crouch y col., Vaccine., 2 de diciembre de 2004; 23 (3): 418 – 25), A/Equi 2 (Kentucky 81) (véase, por ejemplo, Short y col., J Vet Pharmacol Ther., diciembre 1986; 9 (4): 426 – 32, Homer y Ledgard, N Z Vet J., diciembre de 1988; 36 (4): 205 – 6), A/equine/Kentucky/1/81 (Eq/Ky) (véase, por ejemplo, Breathnach y col., Vet Immunol Immunopathol., abril de 2004 ; 98 (3 – 4): 127 – 36), A/Equine/Kentucky/1/81 (H3N8) (véase, por ejemplo, Olsen y col., Vaccine., julio de 1997; 15 (10): 1149 – 56, Morley y col. Vet Microbiol., junio de 1995; 45 (1): 81 – 92, Ozaki y col., Vet Microbiol., 20 de septiembre de 2001 ; 82 (2): 111 – 9, Sugiura y col., J Virol Methods. Octubre de 2001; 98 (1): 1 – 8, véase, por ejemplo, Sugiura y col., J Virol Methods. octubre de 2001; 98 (1): 1 – 8, Goto y col., J Vet Med Sci. febrero de 1993; 55 (1): 33 – 7, Goto y col., J Vet Med Sci., febrero de1993; 55 (1): 33 – 7), A/Equine/Kentucky/1/91 (H3N8) (véase, por ejemplo, Youngner y col., Am J Vet Res., agosto de 2001; 62 (8): 1290 – 4), A/Equine/Kentucky/1277/90 (Eq/Kentucky) (véase, por ejemplo, Webster & Thomas, Vaccine. 1993; 11 (10): 987 – 93), A/Equine/Kentucky/2/91 (H3N8) (véase, por ejemplo, Donofrio y col., J Vet Diagn Invest., enero de 1994; 6 (1): 39 – 43), A/Equine/Kentucky/79 (H3N8) (véase, por ejemplo, Donofrio y col., J Vet Diagn Invest., enero de 1994; 6 (1): 39 – 43), A/equine/Kentucky/81 (véase, por ejemplo, Sugiura y col., J Virol Methods., octubre de 2001; 98 (1): 1

–: 8), A/equine/Kentucky/91 (H3N8) (véase, por ejemplo, Gross y col., Equine Vet J., noviembre de 1998; 30 (6): 489

–: 97), A/equine-2/Kentucky/95 (H3N8) (véase, por ejemplo, Heldens y col., Vet J., marzo de 2004; 167 (2): 150 – 7) y A/equine-2/Kentucky/98 (véase, por ejemplo, Chambers y col., Equine Vet J., noviembre de 2001; 33 (7): 630 – 6).

[0030] Los ejemplos de cepas de gripe equina de Newmarket que se pueden utilizar en los procedimientos de la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, las cepas de la gripe equina A/eq/Newmarket/1/77 (véase, por ejemplo, Lindstrom y col, Arch Virol. 1998; 143 (8): 1895 – 98, A/eq/Newmarket/5/03 (véase, por ejemplo, Edlund Toulemonde y col., Vet Reo., 19 de marzo de 2005; 156 (12): 367 – 71), A/Equi 2 (H3N8), Newmarket 1/93 (véase, por ejemplo, Mohler y col., Biotechnol Bioeng., 5 de abril de 2005; 90 (1): 46 – 58, Nayak y col., J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci., 8 de julio de 2005), A/equi-2/Newmarket-1/93 (véase, por ejemplo, Heldens y col., J Immunol Methods. 1 de junio de 2002; 264 (1 – 2): 11 – 7), A/equine/Newmarket/2/93 (véase, por ejemplo, Wattrang y col., Viral Immunol. 2003; 16 (1): 57 – 67), A/equine/Newmarket/79 (H3N8) (véase, por ejemplo, Duhaut y Dimmock, Virology., 30 de septiembre de 2000; 275 (2): 278 – 85, Noble y Dimmock, J Gen Virol. diciembre de 1994 ; 75 (Pt 12): 3485 – 91, Duhaut y Dimmock, Virology., 1 de septiembre de 1998; 248 (2): 241 – 53, Hannant y Mumford, Vet Immunol Immunopathol., julio de 1989; 21 (3 – 4): 327 – 37, Hannant y col., Vet Microbiol., abril de 1989; 19 (4): 293 – 303, Hannant y col., Vet Rec., 6 de febrero de 1988; 122 (6): 125 – 8, Richards y col., Vet Immunol Immunopathol., junio de 1992; 33 (1 – 2): 129 – 43, Heldens y col., Vet J., marzo de 2004; 167 (2): 150 – 7), A/equine/Newmarket/1/77 (H7N7) (véase, por ejemplo, Goto y col., J Vet Med Sci., febrero de 1993; 55 (1): 33 – 7, Sugiura y col., J Virol Methods. octubre de 2001; 98 (1): 1 – 8, Sugiura y col., J Virol Methods. octubre de 2001; 98 (1): 1 – 8) y A/equine-2/Newmarket-2/93 (véase, por ejemplo, Heldens y col., Vet J., marzo de 2004 ; 167 (2): 150 – 7).

[0031] La presente descripción abarca también otros virus de la gripe equina, tales como, pero sin limitarse al virus de la gripe equina A/eq/Miami/63 (H3N8) (véase, por ejemplo van Maanen y col., Vet Microbiol., 10 de junio de 2003; 93 (4): 291 – 306), A/equi1 (cepa Praga) (véase, por ejemplo Homer y Ledgard, N Z Vet J., diciembre de 1988 ; 36 (4): 205 – 6, Short y co., J Vet Pharmacol Ther., diciembre de 1986; 9 (4): 426 – 32), A/Equi 2 (Miami) (véase, por ejemplo Short y col., J Vet Pharmacol Ther., diciembre de1986; 9 (4): 426 – 32), A/equi-1/Prague/56 (Pr/56) (véase, por ejemplo Heldens y col., J Immunol Methods., 1 de junio de 2002; 264 (1 – 2): 11 – 7), A/equi-2/Suffolk/89 (Suf/89) (véase, por ejemplo Heldens y col., J Immunol Methods., 1 de junio de 2002; 264 (1 – 2): 11 – 7), A/Equine 2/Sussex/89 (H3N8) (véase, por ejemplo Mumford y col., Vet Rec. 12 de febrero de 1994; 134 (7): 158 – 62), A/equine/Sussex/89 (véase, por ejemplo Wattrang y col., Viral Immunol. 2003; 16 (1): 57 – 67), A/equine2/Saskatoon/90 (véase, por ejemplo Chambers y col., Equine Vet J., noviembre de 2001; 33 (7): 630 – 6), A/Equine/Prague/1/56 (H7N7) (véase, por ejemplo Donofrio y col., J Vet Diagn Invest., enero de 1994 Jan; 6 (1): 39

– 43, Morley y col. Vet Microbiol., junio de 1995; 45 (1): 81 – 92), A/equine/Miami/1/63 (H3N8) (véase, por ejemplo Morley y col. Vet Microbiol., junio de 1995 ; 45 (1): 81 – 92, Ozaki y col., Vet Microbiol., 20 de septiembre de 2001; 82 (2): 111 – 9, Thomson y col, Vet Rec., 28 de mayo de 1977; 100 (22): 465 – 8, Mumford y col., Epidemiol Infect., junio de 1988; 100 (3): 501 – 10, Donofrio y col., J Vet Diagn Invest., junio de 1994; 6 (1): 39 – 43, Mumford y col., J Hyg (Lond)., junio de 1983; 90 (3): 385 – 95), A/Aichi/2/68 (H3N2) (véase, por ejemplo Ozaki y col., Vet Microbiol., 20 de septiembre de 2001; 82 (2): 111 – 9), A/equine/Tokyo/2/71 (H3N8) (véase, por ejemplo Goto y col., J Vet Med Sci. 1993 Feb; 55 (1): 33 – 7), A/eq/LaPlata/1/88 (véase, por ejemplo Lindstrom y col., Arch Virol. 1998; 143 (8): 1585 – 98), A/Equine/Jilin/1/89 (Eq/Jilin) (véase, por ejemplo Webster y Thomas, Vaccine. 1993; 11 (10): 987 – 93), A/Equine/Alaska/1/91 (H3N8) (véase, por ejemplo Webster y Thomas, Vaccine. 1993; 11 (10): 987 – 93), A/equine/Saskatoon/1/91 (H3N8) (véase, por ejemplo Morley y col. Vet Microbiol., junio de 1995; 45 (1): 81 – 92), A/equine/Rome/5/91 (H3N8) (véase, por ejemplo Sugiura y col., J Virol Methods., octubre de 2001; 98 (1): 1 – 8), A/equine/La Plata/1/93 (H3N8) (véase, por ejemplo Ozaki y col., Vet Microbiol., 20 de septiembre de 2001; 82 (2): 111 – 9), A/equine/La Plata/1/93 (LP/93) (véase, por ejemplo Sugiura y col., J Virol Methods., octubre de 2001; 98 (1): 1 – 8), A/eq/Holland/1/95 (H3N8) (véase, por ejemplo van Maanen y col., Vet Microbiol., 10 de junio de 2003; 93 (4): 291 – 306) y A/eq/Holland/2/95 (H3N8) (véase, por ejemplo van Maanen y col., Vet Microbiol., 10 de junio de 2003; 93 (4): 291 – 306).

[0032] En otra realización ventajosa, el antígeno, el epítopo o el inmunógeno de la gripe canina se pueden derivar de un equino infectado con gripe o una cepa de gripe canina derivada de un aislado reciente.

[0033] El antígeno, epítopo o inmunógeno de la gripe se pueden aislar también de cualquier cepa de gripe tal como, pero sin limitarse al virus de la gripe aviar H5N1 A/Hong Kong/156/97 (A/HK/156/97) (véase, por ejemplo Leneva y col, Antimicrob Agents Chemother., abril de 2001 ; 45 (4): 1216 – 24), el virus de la gripe aviar H7N1 (véase, por ejemplo Foni y col, New Microbiol., enero de 2005; 28 (1): 31 – 5), el virus de la gripe aviar H9N2 (véase, por ejemplo Leneva y col, Antimicrob Agents Chemother., abril de 2001; 45 (4): 1216 – 24), el virus de la gripe aviar A/Chicken/HK/G9/97 (H9N2) (véase, por ejemplo Leneva y col, Antimicrob Agents Chemother., abril de 2001; 45 (4): 1216 – 24), el virus de la gripe aviar A/Quail/HK/G1/97 (H9N2) (véase, por ejemplo Leneva y col, Antimicrob Agents Chemother., abril de 2001; 45 (4): 1216 – 24), el virus de la gripe aviar A/Teal/HK/W312/97 (H6N1) (véase, por ejemplo Leneva y col, Antimicrob Agents Chemother., abril de 2001; 45 (4): 1216 – 24), el virus A de la gripe pandémica animal (véase, por ejemplo Audsley y Tannock, Expert Opin Biol Ther., mayo de 2004; 4 (5): 709 – 17), la cepa donante maestra sensible a la temperatura (ts) y adaptada al frío (ca), A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) (véase, por ejemplo Youil y col, Virus Res. 15 de junio de 2004 Jun; 102 (2): 165 – 76), el virus de la gripe equina (A/Equi 2 (H3N8), Newmarket 1/93) (véase, por ejemplo Mohler y col, Biotechnol Bioeng., 5 de abril de 2005; 90 (1): 46 – 58; Nayak y col, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2005 Jul 8), el virus de la gripe 2 equina, A/Equine/Kentucky/1/91 (H3N8) (véase, por ejemplo Youngner y col, Am J Vet Res., agosto de 2001; 62 (8): 1290 – 4), aislados del virus A (H3N2) de la gripe humana (véase, por ejemplo Abed y col, J Infect Dis., 15 de octubre de 2002; 186 (8): 1074 – 80), el virus de la gripe humana A/Memphis/1/71 (H3N2) (véase, por ejemplo Suzuki y col, Biochem J. 1996 Sep 1; 318 (Pt 2): 389 – 93), el virus A/Nanchang/933/95 (H3N2) del virus de la gripe humana (véase, por ejemplo Scholtissek y col, J Virol. 2002 Feb; 76 (4): 1781 – 6), el virus A/PR/8/34 (H1N1) del virus de la gripe humana (véase, por ejemplo Scholtissek y col, J Virol. 2002 Feb; 76 (4): 1781 – 6), el virus A/Singapore/57 (H2N2) del virus de la gripe humana (véase, por ejemplo Scholtissek y col, J Virol., febrero de 2002; 76 (4): 1781 – 6), el virus de la gripe A (véase, por ejemplo Chare y col, J Gen Virol., octubre de 2003; 84 (Pt 10): 2691 – 703), el virus A PR/8/34 (PR8) (subtipo H1N1) (véase, por ejemplo Mantani y col, Planta Med., abril de 2001; 67 (3): 240 – 3), el virus de la gripe A/Aichi/2/68 (H3N2) (véase, por ejemplo Miyamoto y col, Antiviral Res., agosto de 1998; 39 (2): 89

–: 100), el virus adaptado al frío A/Ann Arbor/6/60 del virus de la gripe (véase, por ejemplo Treanor y col, J Virol. 1994 Dec; 68 (12): 7684 – 8), el virus de la gripe A/Beijing 32/92 (H3N2) (véase, por ejemplo Zakay-Rones y col, J Altern Complement Med. Invierno de 1995; 1 (4): 361 – 9), el virus de la gripe A/Charlottesville/31/95 (H1N1) (véase, por ejemplo Gubareva y col, J Gen Virol., noviembre de 2002; 83 (Pt 11): 2683 – 92), el virus A/Kawasaki/86 (H1N1) del virus de la gripe (véase, por ejemplo Staschke y col, Virology., 1 de septiembre de 1998; 248 (2): 264 – 74), el virus de la gripe A/Korea/82 (H3N2) (véase, por ejemplo Treanor y col, J Virol., diciembre 1994; 68 (12): 7684 – 8), el virus de la gripe A/Leningrad/134/57 (véase, por ejemplo Egorov y col, J Virol., agosto de 1998; 72 (8): 6437 – 41), el virus de la gripe A/NWS/33 (H1N1) (véase, por ejemplo Sidwell y col, Antiviral Res., febrero de 1998; 37 (2): 107 – 20), el virus de la gripe A/PR/8/34 (H1N1) (véase, por ejemplo Miyamoto y col, Antiviral Res., agosto de 1998; 39 (2): 89 – 100), el virus de la gripe A/PR8/34 (véase, por ejemplo Nunes-Correia y col, Biochemistry., 19 de enero de 1999; 38 (3): 1095 – 101, Tree y col, Vaccine., 14 de mayo de 2001; 19 (25 – 26): 3444-50), el virus de la gripe A/Puerto Rico (PR)/8/34 (véase, por ejemplo Egorov y col, J Virol. 1998 Aug; 72 (8): A/Puerto Rico (PR)/8/34 (véase, por ejemplo Egorov y col, J Virol., agosto de 1998; 72 (8): 6437 – 41), el virus de la gripe A/Puerto Rico/8-Mount Sinai (véase, por ejemplo Mazanec y col, J Virol., febrero de 1995; 69 (2): 1339 – 43), el virus de la gripe A/Shangdong 9/93 (H3N2) (véase, por ejemplo Zakay-Rones y col, J Altern Complement Med. Invierno de 1995 ; 1 (4): 361 – 9, Sidwell y col, Antiviral Res., febrero de 1998; 37 (2): 107 – 20), el virus de la gripe A/Shingapol/1/57 (H2N2) (véase, por ejemplo Miyamoto y col, Antiviral Res., agosto de 1998; 39 (2): 89 – 100), el virus de la gripe A/Singapore 6/86 (H1N1) (véase, por ejemplo Zakay-Rones y col, J Altern Complement Med. 1995 invierno; 1 (4): 361 – 9), el virus de la gripe A/Singapore/1/57 (H2N2) (véase, por ejemplo Bantia y col, Antimicrob Agents Chemother., abril de 1998; 42 (4): 801

–: 7), el virus de la gripe A/Texas 36/91 (H1N1) (véase, por ejemplo Zakay-Rones y col, J Altern Complement Med. Invierno de 1995; 1 (4): 361 – 9), el virus A/Texas/36/91 (H1N1) del virus de la gripe (véase, por ejemplo Gubareva y col, J Infect Dis., 15 de febrero de 2001; 183 (4): 523 – 31, Halperin y col, Vaccine., agosto de 1998; 16 (13): 1331 – 5), el virus de la gripe A/Texas/36/91 (H1N1) (véase, por ejemplo Hayden y col, Antiviral Res. Octubre de 1994; 25 (2): 123 – 31), la infección del virus A/Udorn/72 del virus de la gripe (véase, por ejemplo Shimizu y col, Virology., 15 de febrero de 1999; 254 (2): 213 – 9), el virus de la gripe A/Victoria/3/75 (H3N2) (véase, por ejemplo Sidwell y col, Antiviral Res., febrero de 1998; 37 (2): 107 – 20), el virus de la gripe A/Virginia/88 (H3N2) (véase, por ejemplo Hayden y col, Antiviral Res., octubre de 1994; 25 (2): 123 – 31), el virus de la gripe A/WSN/33 (H1N1) (véase, por ejemplo Lu y col, Arch Virol. 2002; 147 (2): 273 – 84), el virus de la gripe A/WSN/33 (véase, por ejemplo Gujuluva y col, Virology., 1 de noviembre de 1994; 204 (2): 491 – 505), el virus de la gripe B (véase, por ejemplo Chare y col, J Gen Virol., octubre de 2003; 84 (Pt 10): 2691 – 703), el virus de la gripe B/Ann Arbor 1/86 (véase, por ejemplo Zakay-Rones y col, J Altern Complement Med. Invierno de 1995; 1 (4): 361 – 9), el virus de la gripe B/Harbin/7/94 (véase, por ejemplo Halperin y col, Vaccine., agosto de 1998; 16 (13): 1331 – 5, el virus de la gripe B/Hong Kong/5/72 (véase, por ejemplo Sidwell y col, Antiviral Res., febrero de 1998; 37 (2): 107 – 20), el virus de la gripe B/Lee/40 (véase, por ejemplo Miyamoto y col, Antiviral Res., agosto de 1998; 39 (2): 89 – 100), el grupo del virus de la gripe B/Victoria (véase, por ejemplo Nakagawa y col, J Virol Methods., abril de 1999 ; 79 (1): 113 – 20), el virus de la gripe B/Yamagata 16/88 (véase, por ejemplo Zakay-Rones y col, J Altern Complement Med. Invierno de 1995; 1 (4): 361 – 9), el grupo del virus B/Yamagata (véase, por ejemplo Nakagawa y col, J Virol Methods., abril de 1999; 79 (1): 113 – 20); el virus de la gripe B/Yamanashi/166/98 (véase, por ejemplo Hoffmann y col, Proc Natl Acad Sci U S A., 20 de agosto de 2002; 99 (17): 11411 – 6), el virus de la gripe C (véase, por ejemplo Chare y col, J Gen Virol., octubre de 2003; 84 (Pt 10): 2691 – 703), la cepa A/Equi/2/Kildare/89 del virus de la gripe (véase, por ejemplo Quinlivan y col, J Clin Microbiol., febrero de 2004; 42 (2): 759 – 63), el virus de la gripe del tipo B/Panama 45/90 (véase, por ejemplo Zakay-Rones y col, J Altern Complement Med. Invierno de 1995; 1 (4): 361 – 9), las vacunas de la gripe A rusa adaptadas al frío, sensibles a la temperatura (ca/ts) (véase, por ejemplo Palker y col, Virus Res., octubre de 2004; 105 (2): 183 – 94), línea de células Madin Darby derivada de riñón canino (MDCK) (véase, por ejemplo Halperin y col, Vaccine., 15 de enero de 2002; 20 (7 – 8): 1240 – 7), virus de la gripe adaptado a ratón A/Guizhou/54/89 (subtipo H3N2) (véase, por ejemplo Nagai y col, Biol Pharm Bull. Febrero de 1995; 18 (2): 295 – 9), virus de la gripe adaptado a ratón A/PR/8/34 (A/PR8) (véase, por ejemplo Nagai y col, Antiviral Res., enero de 1995; 26 (1): 11 – 25), virus de la gripe adaptado a ratón B/Ibaraki/2/85 (véase, por ejemplo Nagai y col, Biol Pharm Bull., febrero de 1995; 18 (2): 295 – 9), cepas donantes de la vacuna de la gripe rusa atenuada viva A/Leningrad/134/17/57, A/Leningrad/134/47/57 y B/USSR/60/69 (véase, por ejemplo Audsley y Tannock, J Virol Methods., febrero de 2005; 123 (2): 187 – 93), virus H1 y H3 de la gripe porcina (véase, por ejemplo, Gambaryan y col, Virus Res., 1 de julio de 2005), virus A de la gripe porcina (véase, por ejemplo Landolt y col, Am J Vet Res., enero de 2005; 66 (1): 119 – 24), virus de la gripe porcina (SIV) (véase, por ejemplo Clavijo y col, Can J Vet Res., abril de 2002; 66 (2): 117 – 21), virus de la gripe porcina A/Sw/Ger 2/81 (véase, por ejemplo Zakay-Rones y col, J Altern Complement Med. Invierno de 1995; 1 (4): 361 – 9), virus de la gripe porcina A/Sw/Ger 8533/91 (véase, por ejemplo Zakay-Rones y col, J Altern Complement Med. Invierno de 1995; 1 (4): 361 – 9), virus de la gripe del pavo A/Tur/Ger 3/91 (véase, por ejemplo Zakay-Rones y col, J Altern Complement Med. Invierno de 1995; 1 (4): 361 – 9) y virus de la gripe del pavo A/turkey/Minnesota/ 833/80 (H4N2) (véase, por ejemplo, Gubareva y col, J Virol., mayo de

1997; 71 (5): 3385 – 90).

[0034] Tal como se usa la presente memoria descriptiva, el término “antígeno” o “inmunógeno” significa una sustancia que induce una respuesta inmunoespecífica en un animal hospedador. El antígeno puede comprender un organismo compuesto, muerto, atenuado o vivo; una subunidad o porción de un organismo; un vector recombinante que contiene una inserción con propiedades inmunógenas, un elemento o fragmento de ADN capaz de inducir una respuesta inmune tras la presentación a un animal hospedador, una proteína, un polipéptido, un péptido, un epítopo, un hapteno, o cualquiera de sus combinaciones. De forma alternativa, el inmunógeno o el antígeno puede comprender una toxina o antitoxina.

[0035] El término “proteína o péptido inmunógeno” tal como se usa en la presente memoria descriptiva también se refiere e incluye los péptidos y polipéptidos que son inmunológicamente activos en el sentido en que una vez administrados al hospedador, son capaces de evocar una respuesta inmune de tipo humoral y/o celular dirigida contra la proteína. Preferiblemente, el fragmento de proteína es uno que tiene sustancialmente la misma actividad inmunógena que la proteína total. De esta manera, un fragmento de proteína de acuerdo con la descripción comprende o consiste esencialmente o consiste en al menos un epítopo o determinante antigénico. El término epítopo se refiere a un sitio de la proteína capaz de inducir una reacción inmune del tipo humoral (linfocitos B) y/o del tipo celular (linfocitos T).

[0036] El término “proteína o péptido inmunógeno” contempla además deleciones, adiciones y sustituciones de la secuencia, siempre que el polipéptido actúe para producir una respuesta inmunógena tal como se define en la presente memoria descriptiva. A este respecto, las sustituciones particularmente preferidas serán generalmente de naturaleza conservativas, es decir, aquellas sustituciones que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos se dividen generalmente en cuatro familias: (1) aspartato y glutamato ácidos; (2) lisina, arginina, histidina básicos, (3) alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano no polares, y (4) glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina treonina, tirosina, fenilalanina, triptófano, y tirosina polares sin carga que se clasifican algunas veces como aminoácidos aromáticos. Es razonablemente predecible que una sustitución aislada de leucina por isoleucina o valina, o viceversa, un aspartato por glutamato o viceversa, una treonina por una serina o viceversa; o una sustitución conservativa similar de un aminoácido por un aminoácido estructuralmente relacionado, no tendrá mayor efecto sobre la actividad biológica. Las proteínas que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la molécula de referencia, pero que poseen las menores sustituciones de aminoácido que no afecten sustancialmente la inmunogenicidad de la proteína están comprendidas, por tanto, dentro de la definición del polipéptido de referencia.

[0037] El término “epítopo” se refiere al sitio en un antígeno o hapteno al cual responden los linfocitos B y/o los linfocitos T específicos. El término se utiliza también de forma indistinta con “determinante antigénico” o “sitio determinante antigénico”. Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo se pueden identificar en un inmunoensayo sencillo que muestre la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana.

[0038] Una “respuesta inmunológica” a una composición o vacuna es el desarrollo en el hospedador de una respuesta celular y/o inmunomediada a una composición o vacuna de interés. Normalmente, una “respuesta inmunológica” incluye, pero no se limita a uno o más de los siguientes efectos: la producción de anticuerpos, linfocitos B, linfocitos T auxiliares, y/o linfocitos T citotóxicos, dirigida específicamente a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Preferiblemente, el hospedador mostrará una respuesta inmunológica tanto terapéutica como protectora, de tal manera, que la resistencia a la nueva infección aumentará y/o la gravedad clínica de la enfermedad se reducirá. Dicha protección se demostrará mediante cualquiera de una reducción o ausencia de síntomas que normalmente muestra un hospedador infectado, un tiempo de recuperación más rápido y una disminución en el título vírico en el hospedador infectado.

[0039] Los términos proteína o polipéptido “inmunógeno” tal como se usan en la presente memoria descriptiva se refieren también a una secuencia de aminoácidos que estimula una respuesta inmunológica tal como se ha descrito anteriormente. Una proteína o polipéptido “inmunógeno”, tal como se usa en la presente memoria descriptiva, incluye la secuencia de longitud completa de la proteína, sus análogos, o sus fragmentos inmunógenos. Por “fragmento inmunógeno” se entiende un fragmento de una proteína que incluye uno o más epítopos y que estimula de esta manera la respuesta inmunológica descrita anteriormente. Dichos fragmentos se pueden identificar utilizando cualquiera de las numerosas técnicas de cartografía de epítopos bien conocidas en la materia. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, N.J. Se pueden determinar, por ejemplo, los epítopos lineales mediante, por ejemplo, síntesis simultánea de numerosos péptidos sobre soportes sólidos, correspondiendo los péptidos a porciones de la molécula de proteína, y reacción de los péptidos con anticuerpos a la vez que los péptidos se unen además a los soportes. Se conocen dichas técnicas en la materia y se describen en, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Nº 4.708.871; Geysen y col. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998 – 4002; Geysen y col. (1986) Molec. Immunol.

23: 709 – 715. De forma similar, se identifican fácilmente epítopos conformacionales determinando la conformación espacial de los aminoácidos tal como mediante, por ejemplo, cristalografía de rayos x, y resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, más arriba. Los procedimientos especialmente aplicables a las proteínas de T. parva se describen completamente en la Solicitud PCT con Nº de Serie PCT/US2004/022605.

[0040] Los antígenos sintéticos quedan también comprendidos en la definición, por ejemplo, poliepítopos, epítopos flanqueantes, y otros antígenos recombinantes o derivados sintéticamente. Véanse, por ejemplo Bergmann y col. (1993) Eur. J. Immunol. 23: 2777 – 2781; Bergmann y col. (1996) J. Immunol. 157: 3242 – 3249; Suhrbier, A. (1997) Immunol. and Cell Biol. 75: 402 – 408; Gardner y col. (1998) 12ª World AIDS Conference, Ginebra, Suiza, 28 de junio-3 de julio de 1998. Los fragmentos inmunogénicos, para los fines de la presente descripción, incluirán normalmente al menos aproximadamente 3 aminoácidos, preferiblemente al menos 5 aminoácidos, de forma más preferible al menos aproximadamente 10 – 15 aminoácidos, y lo más preferible 25 o más aminoácidos, de la molécula. No existe límite superior crítico para la longitud del fragmento, que comprendería casi la longitud completa de la secuencia de la proteína, o incluso una proteína de fusión que comprende al menos un epítopo de la proteína.

[0041] De acuerdo con esto, la estructura mínima de un polinucleótido que expresa un epítopo es la que comprende o consiste esencialmente en o consiste en nucleótidos que codifican un epítopo o determinante antigénico de una proteína o poliproteína de la gripe. Un polinucleótido que codifica un fragmento de la proteína o poliproteína total, más ventajosamente, comprende o consiste esencialmente en o consiste en un mínimo de 21 nucleótidos, de forma ventajosa al menos 42 nucleótidos, y preferiblemente al menos 57, 87 o 150 nucleótidos consecutivos o contiguos de la secuencia que codifica la proteína o poliproteína total. Se pueden utilizar procedimientos de determinación de epítopos, tales como, generar bibliotecas de péptidos solapantes (Hemmer B. y col., Immunology Today, 1998, 19 (4), 163 – 168), Pepscan (Geysen y col., (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81, 3998 – 4002; Geysen y col., (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82, 178 – 182; Van der Zee R. y col., (1989) Eur. J. Immunol, 19, 43 – 47; Geysen H.M., (1990) Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health, 21, 523 – 533; Multipin.RTM. Peptide Synthesis Kits de Chiron) y algoritmos (De Groot A. y col., (1999) Nature Biotechnology, 17, 533 – 561), y en la Solicitud PCT con Nº de Serie PCT/US2004/022605, en la práctica de la invención, sin experimentación innecesaria. Se pueden consultar también otros documentos enumerados para los procedimientos de determinación de epítopos de un inmunógeno o antígeno y de esta manera, las moléculas de ácidos nucleicos que codifican dichos epítopos.

[0042] Un “polinucleótido” es una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, que contiene desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, y análogos en cualquier combinación. Los polinucleótidos pueden tener estructura tridimensional, y pueden llevar a cabo cualquier función, conocida o desconocida. El término “polinucleótido” incluye moléculas bicatenarias, monocatenarias y de triple hélice. A no ser que se especifique o requiera de otra manera, cualquier realización de la descripción descrita en la presente memoria descriptiva que sea un polinucleótido que abarca la forma bicatenaria y cada una de las dos formas complementarias conocidas o previstas constituye la forma bicatenaria de cualquier ADN, ARN o molécula híbrida.

[0043] Se indican a continuación ejemplos no limitantes de polinucleótidos: un gen o fragmento de gen, exones, intrones, ARNm, ARNt, ARNr, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas y cebadores de ácidos nucleicos. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos, uracilo, otros azúcares y grupos de unión tales como fluororribosa y tiolato, y nucleótidos ramificados. Otros tipos de modificaciones incluidas en esta definición son protecciones terminales, sustitución de uno o más de los nucleótidos que se producen naturalmente con un análogo, e introducción de medios para unir el polinucleótido a las proteínas, iones metálicos, componentes de marcado, otros polinucleótidos o soporte sólido. Se pueden obtener los polinucleótidos mediante síntesis química o derivarse de un microorganismo.

[0044] La memoria descriptiva comprende además una hebra complementaria de un polinucleótido que codifica un antígeno, epítopo o inmunógeno de la gripe. La hebra complementaria puede ser polimérica y tener cualquier longitud, y puede contener desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, y análogos en cualquier combinación.

[0045] Los términos “proteína”, “péptido”, “polipéptido” y “fragmento de polipéptido” se utilizan indistintamente en la presente memoria descriptiva para referirse a polímeros de restos de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados o análogos de aminoácidos, y puede estar interrumpido por restos químicos diferentes de aminoácidos. Los términos abarcan también un polímero de aminoácidos que se ha modificado naturalmente o mediante intervención; por ejemplo la formación de un enlace disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tal como la conjugación con un componente marcado o bioactivo.

[0046] Un polinucleótido o polipéptido “aislado” es aquel que está sustancialmente exento de los materiales con los cuales se asocia en su ambiente natural. Por sustancialmente exento, se entiende al menos un 50 %, de forma ventajosa al menos un 70 %, de forma más ventajosa al menos un 80 %, e incluso de forma más ventajosa, al menos un 90 % exento de estos materiales.

[0047] Se pueden llevar a cabo reacciones de hibridación en condiciones de diferente “restricción”. Se conocen bien las condiciones que aumentan la restricción de una reacción de hibridación. Véase por ejemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición (Sambrook y col. 1989). Los ejemplos de condiciones relevantes incluyen (en orden creciente de restricción): temperaturas de incubación de 25 °C, 37 °C, 50 °C, y 68 °C; concentraciones tampón de 10 x SSC, 6 x SSC, 1 x SSC, 0,1 x SSC (en el que SSC es NaCl 0,15 M y tampón citrato 15 mM9 y su equivalente utilizando otros sistemas tampón, concentraciones de formamida de 0 %, 25 %, 50 %, y 75 %; tiempos de incubación de 5 minutos a 24 horas; 1, 2 o más etapas de lavado; tiempos de incubación en lavado de 1, 2, o 15 minutos; y soluciones de lavado de 6 x SSC, 1 x SSC, 0,1 x SSC, o agua desionizada.

[0048] La memoria descriptiva abarca además los polinucleótidos que codifican variantes y derivados funcionalmente equivalentes de los polipéptidos de la gripe y sus fragmentos funcionalmente equivalentes que pueden aumentar, disminuir o no afectar por tanto significativamente las propiedades de los polipéptidos codificados. Estas variantes, derivados, y fragmentos funcionalmente equivalentes muestran la capacidad de retener la actividad de la gripe. Por ejemplo, cambios en una secuencia de ADN que no cambian la secuencia de aminoácidos codificada, así como aquellos que dan como resultado sustituciones conservativas de los restos de aminoácidos, una o unas pocas deleciones o adiciones de aminoácidos, y la sustitución de restos de aminoácidos por análogos de aminoácidos son aquellos que no afectan significativamente las propiedades del polipéptido codificado. Las sustituciones de aminoácidos conservativas son glicina/alanina; valina/isoleucina/leucina; asparagina/glutamina; ácido aspártico/ácido glutámico; serina/treonina/metionina; lisina/arginina; y fenilalanina/tirosina/triptófano. En una realización, las variantes tienen al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología o identidad con el polinucleótido o polipéptido de la gripe de interés.

[0049] Para los fines de la presente descripción, la identidad u homología de la secuencia se determina comparando las secuencias cuando se alinean con el fin de maximizar el solapamiento e identificar mientras se minimizan los vacíos de la secuencia. Un ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990; 87: 2264 – 2268, modificado como en Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90: 5873 – 5877.

[0050] Otro ejemplo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, CABIOS 1988; 4: 11 – 17. Dicho algoritmo se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) que es parte del paquete de software de alineación de la secuencia GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, se puede utilizar una tabla de peso de restos PAM 120, una penalización por longitud de hueco de 12, y una penalización por hueco de 4. Otro algoritmo adicionalmente útil para identificar las regiones de similitud y alineación local de secuencias es el algoritmo FASTA que se describe en Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988; 85: 2444 – 2448.

[0051] Ventajoso para el uso de acuerdo con la presente descripción es el software WU-BLAST (Washington University BLAST) versión 2.0 Los programas ejecutables para el software WU-BLAST versión 2.0 para diversas plataformas UNIX pueden descargarse de ftp : //blast.wustl.edu/blast/executables. Este programa se basa en la versión 1.4 de WU-BLAST, que a la vez se basa en el NCBI-BLAST versión 1.4 de dominio público (Altschul & Gish, 1996, Local alignment statistics, Doolittle ed., Methods in Enzymology 266: 460 – 480; Altschul y col., Journal of Molecular Biology 1990; 215: 403 – 410; Gish y States, 1993; Nature Genetics 3: 266 – 272; Karlin y Altschul, 1993; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873 – 5877.

[0052] En general, la comparación de las secuencias de aminoácidos se lleva a cabo alineando una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de una estructura conocida con la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de estructura desconocida. A continuación se comparan los aminoácidos en las secuencias y los grupos de aminoácidos que son homólogos se agrupan juntos. Este procedimiento detecta regiones conservadas de los polipéptidos y contabiliza las inserciones y las deleciones de aminoácidos. Se puede determinar la homología entre las secuencias de aminoácidos utilizando algoritmos comercialmente disponibles (véase también la descripción de la homología anterior). Además de los ya mencionados en la presente memoria descriptiva, se hace mención también a los programas BLAST, BLAST con huecos, BLASTN, BLASTP, y PSI-BLAST, que proporciona el National Center for Biotechnology Information. Estos programas se utilizan ampliamente en la técnica para este fin y pueden alinear regiones homólogas de dos secuencias de aminoácidos.

[0053] En todos los programas de búsqueda incluidos en la suite, las rutinas de alineación con huecos son integrales con la propia búsqueda en bases de datos. La formación de huecos se puede desconectar si se desea. La penalización por defecto (Q) de un hueco de longitud uno es Q = 9 para las proteínas y BLASTP, y Q = 10 para BLASTN, pero puede cambiarse a cualquier entero. La penalización por defecto por resto para extender un hueco

(R) es R = 2 para las proteínas y BLASTP, y R = 10 para BLASTN, pero puede cambiarse a cualquier número entero. Se puede utilizar cualquier combinación de valores para Q y R para alinear las secuencias con el fin de maximizar el solapamiento y la identidad minimizando a la vez los huecos de la secuencia. La matriz de comparación de aminoácidos por defecto es BLOSUM62, pero se pueden utilizar otras matrices de comparación de aminoácidos tales como PAM.

[0054] Alternativa o adicionalmente, el término “homología” o “identidad”, por ejemplo, con respecto a la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos, puede indicar una medida cuantitativa de la homología entre dos secuencias. El porcentaje de homología de secuencias se puede calcular como

[0055] (Nref - Ndif)*100/Nref, en la que Ndif es el número total de restos no idénticos en las dos secuencias cuando se alinean y en el que Nref es el número de restos en una de las secuencias. Por tanto la secuencia de ADN AGTCAGTC tendrá una identidad de la secuencia del 75 % con la secuencia AATCAATC (Nref = 8; Ndif = 2).

[0056] Alternativa o adicionalmente, “homología” o “identidad” con respecto a las secuencias puede referirse al número de posiciones con nucleótidos o aminoácidos idénticos dividido por el número de nucleótidos o aminoácidos en la parte más corta de las dos secuencias en la que se puede determinar la alineación de las dos secuencias de acuerdo con el algoritmo de Wilbur y Lipman (Wilbur y Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 1983; 80: 726), por ejemplo, utilizando un tamaño de ventana de 20 nucleótidos, una longitud de palabra de 4 nucleótidos, y una penalización por hueco de 4, y un análisis e interpretación asistidos por ordenador de los datos de la secuencia que incluyen que la alineación se puede llevar a cabo convenientemente utilizando programas comercialmente disponibles (por ejemplo, Intelligenetics ™ Suite, Intelligenetics Inc. CA). Cuando se dice que las secuencias de ARN son similares, o tienen un grado de identidad u homología de la secuencia con las secuencias de ADN, se considera la timidina (T) en la secuencia de ADN igual a uracilo (U) en la secuencia de ARN. De esta manera, las secuencias de ARN están comprendidas en el alcance de la descripción y se pueden derivar de las secuencias de ADN, considerándose la timidina (T) en la secuencia de ADN igual a uracilo (U) en las secuencias de ARN.

[0057] Y, sin experimentación innecesaria, el técnico experto puede consultar otros muchos programas o referencias para determinar el porcentaje de homología.

[0058] La memoria descriptiva abarca además los polinucleótidos de la gripe contenidos en una molécula de vector o en un vector de expresión y unidos de manera operable con un elemento promotor y opcionalmente con un potenciador.

[0059] El vector es deforma ventajosa un poxvirus, particularmente un virus vaccinia o un virus avipox, tal como un virus de la viruela aviar y un virus de la viruela del canario. De forma ventajosa, el virus es un virus de la viruela del canario. De forma ventajosa, las cepas de la viruela del canario pueden ser una cepa atenuada. El vector puede expresar al menos un epítopo de las cepas Kentucky, las cepas Newmarket y/o las cepas Ohio. De forma ventajosa, las construcciones del virus de la viruela del canario incluyen, pero no se limitan a, vCP 1529, vCP 1533 y vCP 2242. Los virus apivox recombinantes (véase, por ejemplo las patentes de los estados Unidos Nos 5.505.941 y 5.756.103, tales como un virus de la viruela del canario atenuado, por ejemplo ALVAC, o un virus de la viruela aviar atenuado, por ejemplo TROVAC, son especialmente ventajosos. En una realización ventajosa, la vacuna ALVAC recombinante descrita por Edlund Toulemonde y col., Vet Rec. 2005 Mar 19; 156 (12): 367 – 71 se puede utilizar como una vacuna de la gripe canina. Otros virus que se pueden usar en los procedimientos de la descripción incluyen, pero no se limitan a, virus vaccinia, tales como un virus vaccinia atenuado, por ejemplo NYVAC, adenovirus, tales como adenovirus caninos (CAV), y virus del herpes, tales como virus del herpes caninos (CHV) o un virus del herpes felino (FHV).

[0060] Un “vector” se refiere a un ADN recombinante o ARN plásmido que comprende un polinucleótido heterólogo que se va a liberar en una célula diana, tanto in vitro como in vivo. El polinucleótido heterólogo puede comprender una secuencia de interés para fines de terapia, y puede estar opcionalmente en la forma de un casete de expresión. Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, un vector no necesita ser capaz de replicación en la célula o sujeto diana en último extremo. El término incluye vectores de clonación, se incluyen también vectores víricos.

[0061] El término “recombinante” significa un polinucleótido semisintético, o de origen sintético que no se produce en la naturaleza o que está unido a otro polinucleótido en una disposición que no se encuentra en la naturaleza.

[0062] “Heterólogo” significa derivado de una entidad genéticamente distinta del resto de la entidad con la cual se está comparando. Por ejemplo, un polinucleótido se puede colocar mediante técnicas de ingeniería genética en un plásmido o vector derivado de una fuente diferente, y es un polinucleótido heterólogo. Un promotor retirado de su secuencia de codificación natural y unida de manera operativa a una secuencia de codificación diferente de la secuencia natural es un promotor heterólogo.

[0063] Los polinucleótidos de la descripción pueden comprender secuencias adicionales, tales como secuencias de codificación adicionales en la misma unidad de transcripción, elementos de control tales como promotores, sitios de unión a ribosoma, sitios de poliadenilación, unidades de transcripción adicionales bajo el control del mismo o de un promotor diferente, secuencias que permiten la clonación, expresión, recombinación homóloga, y transformación de una célula hospedadora, y cualquiera de las mencionadas construcciones que puede ser deseable para proporcionar las realizaciones de esta descripción.

[0064] Los elementos para la expresión de un antígeno, epítopo o inmunógeno de la gripe están presentes de forma ventajosa en un vector. De manera mínima, este comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un codón de inicio (ATG), un codón de detención y un promotor, y opcionalmente también una secuencia de poliadenilación para determinados vectores tales como un plásmido y determinados vectores víricos, por ejemplo, otros vectores víricos diferentes de poxvirus. Cuando el polinucleótido codifica un fragmento de poliproteína, por ejemplo, un péptido de la gripe, de forma ventajosa, en el vector, se coloca un ATG en 5’ del marco de lectura y se coloca un codón de detención en 3’. Pueden estar presentes otros elementos para controlar la expresión, tales como secuencias potenciadoras, secuencias de estabilización, tales como intrones y secuencias señal que permitan la secreción de la proteína.

[0065] Los procedimientos para preparar y/o administrar un vector o recombinantes o plásmidos para la expresión de productos génicos de las genes de la descripción tanto in vivo como in vitro pueden ser cualquier procedimiento deseado, por ejemplo, un procedimiento que es mediante o análogo a los procedimientos dados a conocer en, o dados a conocer en los documentos enumerados en las Patentes de los Estados Unidos 4.603.112; 4.769.330; 4.394.448; 4.722.848; 4.745.051; 4.769.331; 4.945.050; 5.494.807; 5.514.375; 5.744.140; 5.744.141; 5.756.103; 5.762.938; 5.766.599; 5.990.091; 5.174.993; 5.505.941; 5.338.683; 5.494.807; 5.591.639; 5.589.466; 5.677.178; 5.591.439; 5.552.143; 5.580.859; 6.130.066; 6.004.777; 6.130.066; 6.497.883; 6.464.984; 6.451.770; 6.391.314; 6.387.376; 6.376.473; 6.368.603; 6.348.196; 6.306.400; 6.228.846; 6.221.362; 6.217.883; 6.207.166; 6.207.165; 6.159.477; 6.153.199; 6.090.393; 6.074.649; 6.045.803; 6.033.670; 6.485.729; 6.103.526; 6.224.882; 6.312.682;

6.348.450 y 6.312.683; la solicitud de patente de los Unidos con Nº de Serie 920,197, presentada el 16 de octubre de 1986; los documentos WO 90/01543; W091/11525; WO 94/16716; WO 96/39491; WO 98/33510; EP 265785; EP 0 370 573; Andreansky y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 11313 – I 13I 8; Ballay y col., EMBO J. 1993; 4: 3861 – 65; Felgaer y col., J. Biol. Chem. 1994; 269: 2550 – 2561; Frolov y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA 1996 93: 11371 – 11377; Graham, Tibtech 1990; 8: 85 – 87; Granhaus y col., Sem. Virol. 1992; 3: 237 – 52; Ju y col., Diabetologia 1998; 41: 736 – 739; Kitson y col, J. Virol. 1991; 65: 3068 – 3075; McClements y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 11414 – 11420; Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 1134I – 11348; Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 11349 – 11353; Pennock y col, Mol. Cell. Biol. 1984; 4: 399 – 406; Richardson (Ed), Methods in Molecular Biology 1995; 39, "Baculovirus Expression Protocols," Humana Press Inc.; Smith y col. (1983) Mol. Cell. Biol. 1983; 3: 2156 – 2165; Robertson y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 11334 – 11340; Robinson y col., Sem. Immunol. 1997; 9: 271; y Roizman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 11307 – 11312. De esta manera, el vector en la descripción puede ser cualquier virus o vector de virus recombinante, tal como un poxvirus (por ejemplo, virus vaccinia, virus apivox, virus de la viruela del canario, virus de la viruela aviar, virus de la viruela del mapache, virus de la viruela porcina, etc.), adenovirus (por ejemplo, adenovirus humanos, adenovirus caninos), virus del herpes (por ejemplo, virus del herpes canino), baculovirus, retrovirus, etc., o el vector puede ser un plásmido. Los documentos enumerados en la presente memoria descriptiva, además de proporcionar ejemplos de vectores útiles en la práctica de la invención, pueden proporcionar también fuentes para péptidos o sus fragmentos no de gripe que se van a expresar por el vector o los vectores en, o incluidos en, las composiciones de la descripción.

[0066] La presente descripción se refiere también a las preparaciones que comprenden vectores, tales como vectores de expresión, por ejemplo, composiciones terapéuticas. Las preparaciones pueden comprender, consisten esencialmente de, o consisten de uno o más vectores, por ejemplo, vectores de expresión, tales como vectores de expresión in vivo, que comprenden, que consisten esencialmente o que consisten en (y que expresan de forma ventajosa) uno o más antígenos, epítopos o inmunógenos de la gripe. De forma ventajosa, el vector contiene y expresa un polinucleótido que incluye, consiste esencialmente en, o consiste en un polinucleótido que codifica para (y que expresa de forma ventajosa) un antígeno, epítopo o inmunógeno de la gripe, en un portador, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable. De esta manera, de acuerdo con una realización de la descripción, el otro vector o vectores en la preparación comprende, consiste esencialmente en o consiste en un polinucleótido que codifica, y en circunstancias adecuadas el vector expresa una o más de diferentes proteínas de un antígeno, epítopo o inmunógeno de la gripe (por ejemplo, hemaglutinina, neuraminidasa, nucleoproteína) o uno de sus fragmentos.

[0067] De acuerdo con otra realización, el vector o vectores en la preparación comprende, o consiste esencialmente en, o consiste en polinucleótido (s) que codifican una o más proteínas o sus fragmentos de un antígeno, epítopo o inmunógeno de la gripe, expresando el vector o vectores el (los) polinucleótido (s). La preparación comprende de forma ventajosa, consiste esencialmente en, o consiste en, al menos dos vectores que comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en, y que expresan también de forma ventajosa, ventajosamente in vivo en condiciones apropiadas o condiciones adecuadas o en una célula hospedadora adecuada, polinucleótidos de diferentes aislados de la gripe canina que codifican las mismas proteínas y/o diferentes proteínas, pero de forma ventajosa las mismas proteínas. Las preparaciones contienen uno o más vectores que contienen, consisten esencialmente en o consisten de polinucleótidos que codifican, y que expresan de forma ventajosa, ventajosamente in vivo, un antígeno, proteína de fusión o uno de sus epítopos de la gripe. La descripción se dirige también a las mezclas de vectores que contienen, consisten esencialmente de, o consisten de la codificación de, y que expresan diferentes antígenos, epítopos o inmunógenos de la gripe, por ejemplo, un antígeno, epítopo o inmunógeno de la gripe de diferentes especies tales como, pero sin limitarse a, seres humanos, cerdos, además de especies de aves que incluyen pollos, patos, y gansos.

[0068] De acuerdo con una realización de la descripción, el vector de expresión es un vector vírico, en particular un vector de expresión in vivo. En una realización ventajosa, el vector de expresión es un vector de adenovirus. De forma ventajosa el adenovirus es un vector Ad5 humano, un adenovirus E1 con deleción y/o un adenovirus E3 con deleción.

[0069] En una realización concreta, el vector vírico es un poxvirus, por ejemplo un virus vaccinia o un virus vaccinia atenuado, (por ejemplo, MVA, una cepa Ankara modificada obtenida después de más de 570 pases de la cepa de la vacuna Ankara en fibroblastos embriónicos de pollo; véase Stickl y Hochstein-Mintzel, Munch. Med. Wschr., 1971, 113, 1149 – 1153; Sutter y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1992, 89, 10847 – 10851; disponible como ATCC VR-1508; o NYVAC, véase la patente de los Estados Unidos Nº 5.494.807, por ejemplo, los Ejemplos 1 a 6 y siguientes de la Patente de los Estados Unidos Nº 5.494.807 que describe la construcción de NYVAC, así como las variaciones de NYVAC con los ORF adicionales eliminados del genoma del virus vaccinia de la cepa Copenhagen, así como la inserción de moléculas de ácidos nucleicos que codifican genes heterólogos, en los sitios de este recombinante y también y también, el uso de promotores emparejados; véase también el documento WO96/40241), un virus avipox o un virus avipox atenuado (por ejemplo, el virus de la viruela del canario, el virus de la viruela aviar, el virus de la viruela de la paloma, el virus de la paloma torcaz, el virus de la viruela de la codorniz, ALVAC o TROVAC; véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos N º 5.505.941, 5.494.807), el virus de la viruela porcina, el virus de la viruela del mapache, el virus de la viruela del camello, o el virus de la mixomatosis.

[0070] De acuerdo con otra realización de la descripción el vector de poxvirus es un vector vírico de la viruela del canario o un virus de la viruela aviar, de forma ventajosa, un virus de la viruela del canario o un virus de la viruela aviar. A este respecto, se ha preparado el virus de la viruela del canario disponible a partir de la ATCC con número de acceso VR-111. Se describen virus de la viruela del canario atenuados en la Patente de los Estados Unidos Nº

5.756.103 (ALVAC) y en el documento WO 01/05934. Están disponibles también numerosas cepas de la vacuna del virus de la viruela aviar, por ejemplo, la cepa DIFTOSEC CT comercializada por MERIAL y la vacuna NOBILIS VARIOLE comercializada por INTERVET; y se hace también referencia a la Patente de los estados Unidos Nº

5.766.599 que pertenece a la cepa TROVAC del virus de la viruela aviar atenuado.

[0071] Para la información sobre el procedimiento para generar sus recombinantes y cómo administrar sus recombinantes, el técnico experto puede referirse a documentos enumerados en la presente memoria descriptiva y al documento WO90/12882, por ejemplo, así como se hace mención al virus vaccinia de las patentes de los Estados Unidos Nos 4.769.330, 4.722.848, 4.603.112, 5.110.587, 5.494.807, y 5.762.938 entre otras; así como se hace mención al virus de la viruela aviar en las Patentes de los Estados Unidos Nos 5.174.993, 5.505.941 y US-5.766.599 entre otras; así como se hace mención al virus de la viruela del canario de la Patente de los Estados Unidos Nº

5.756.103 entre otras, y así como se hace mención al virus de la viruela del mapache del documento WO00/03030 entre otros.

[0072] Cuando el vector de expresión es un virus vaccinia, el sitio o los sitios de inserción del polinucleótido o polinucleótidos que se van a expresar son ventajosamente en el gen o en el sitio de inserción de la timidina cinasa (TK), el gen o el sitio de inserción de la hemaglutinina (HA), la región que codifica el cuerpo de inclusión del tipo A (ATI); véanse también los documentos enumerados en la presente memoria descriptiva, especialmente aquellos que pertenecen al virus vaccinia. En el caso del virus de la viruela del canario, de forma ventajosa el sitio o los sitios de inserción son los ORF C3, C5 y/o C6; véanse también los documentos enumerados en la presente memoria descriptiva, especialmente aquellos que pertenecen al virus de la viruela del canario. En el caso de la viruela aviar, de forma ventajosa, el sitio o los sitios de inserción son los ORF F7 y/o F8; véanse también los documentos enumerados en la presente memoria descriptiva, especialmente aquellos que pertenecen al virus de la viruela aviar. El sitio o los sitios de inserción del virus MVA son, de forma ventajosa, como en diversas publicaciones, que incluyen Carroll M. W. y col., Vaccine, 1997, 15 (4), 387 – 394; Stittelaar K. J. y col., J. Virol., 2000, 74 (9), 4236 – 4243; Sutter G. y col., 1994, Vaccine, 12 (11), 1032 – 1040; y, a este respecto, se señala también que el genoma del MVA completo se describe en Antoine G., Virology, 1998, 244, 365 – 396, lo que permite al técnico experto usar otros sitios de inserción u otros promotores.

[0073] De forma ventajosa, el polinucleótido que se va a expresar se inserta bajo el control de un promotor de poxvirus específico, por ejemplo, el promotor de vaccinia de 7,5 kDa (Cochran y col., J. Virology, 1985, 54, 30 – 35), the vaccinia promoter I3L (Riviere y col., J. Virology, 1992, 66, 3424 – 3434), el promotor HA de vaccinia (Shida, Virology, 1986, 150, 451 – 457), el promotor ATI de la viruela vacuna (Funahashi y col., J. Gen. Virol., 1988, 69, 35 – 47), el promotor H6 de vaccinia (Taylor J. y col., Vaccine, 1988, 6, 504 – 508; Guo P. y col. J. Virol., 1989, 63, 4189 – 4198; Perkus M. y col., J. Virol., 1989, 63, 3829 – 3836), entre otros.

[0074] En una realización particular, el vector vírico es un adenovirus, tal como un adenovirus humano (HAV) o un adenovirus canino (CAV).

[0075] En una realización, el vector vírico es un adenovirus humano, en particular un adenovirus del serotipo 5, que se ha vuelto incompetente para la replicación debido a una deleción en la región E1 del genoma vírico, en particular desde aproximadamente el nucleótido 459 a aproximadamente el nucleótido 3510 por referencia a la secuencia del hAd5 dada a conocer en el Genbank con el número de acceso M73260 y en la publicación a la que se hace referencia J. Chroboczek y col. Virol. 1992, 186, 280 – 285. El adenovirus eliminado se propagó en células 293

o PER que expresaban E1 (F. Graham y cel. Gen. Virol. 1977, 36, 59 – 72), en particular PER.C6 (F. Falloux y col. Human Gene Therapy 1998, 9, 1909 – 1917). El adenovirus humano se puede eliminar en la región E3, en particular entre aproximadamente el nucleótido 28592 a aproximadamente el nucleótido 30470. La deleción en la región E1 se puede llevar a cabo en combinación con una deleción en la región E3 (véanse, por ejemplo, J. Shriver y col. Nature, 2002, 415, 331 – 335, F. Graham y col. Methods in Molecular Biology Vol. .7: Gene Transfer and Expression Protocols Editado por E. Murray, The Human Press Inc., 1991, p 109 – 128; Y. Ilan y col. Proc. Natl. Acad. Sci. 1997, 94, 2587 – 2592; documento US 6.133.028; documento US 6.692.956; S. Tripathy y col. Proc. Natl. Acad. Sci. 1994, 91, 11557 – 11561; B. Tapnell Adv. Drug Deliv. Rev. 1993, 12, 185 – 199; X. Danthinne y col. Gene Therapy 2000, 7, 1707 – 1714; K. Berkner Bio Techniques 1988, 6, 616 – 629; K. Berkner y col. Nucl. Acid Res. 1983, 11, 6003 – 6020; C. Chavier y cel. Virol. 1996, 70, 4805 – 4810). Los sitios de inserción pueden ser los loci E1 y/o E3 (región) eventualmente después de una deleción parcial o completa de las regiones E1 y/o E3. De forma ventajosa, cuando el vector de expresión es un adenovirus, el polinucleótido que se va a expresar se inserta bajo el control de un promotor funcional en células eucariotas, tales como un promotor fuerte, preferiblemente un promotor del gen temprano inmediato de citomegalovirus (promotor CMV-IE), en particular, la región potenciadora / promotora entre aproximadamente el nucleótido -734 al nucleótido +7 en M. Boshart y col. Cell 1985, 4.1, 521 – 530 o la región potenciadora / promotora procedente del vector pCI de Promega Corp. El promotor CMV-IE es de forma ventajosa de origen murino o humano. Se puede usar también el promotor del factor de alargamiento 1Q. Se puede usar también un promotor específico muscular (X. Li y col. Nat. Biotechnol. 1999, 17, 241 – 245). Se describen también promotores fuertes en la presente memoria descriptiva en relación con los vectores plásmidos. En una realización, la secuencia de corte y empalme se puede localizar en la dirección 3’ de la región potenciadora / promotora. Por ejemplo, el intrón 1 aislado procedente del gen CMV-IE (R. Stenberg y cel. Virol. 1984, 49, 190), el intrón aislado procedente del gen de la �-globina de conejo o humana, en particular el intrón 2 procedente del gen de la b-globina, el intrón aislado procedente del vector PCI de Promega Corp., que comprende la secuencia donante del gen de la �globina humana fusionada a la secuencia aceptora de la inmunoglobulina de ratón (desde aproximadamente el nucleótido 890 a aproximadamente el nucleótido 1022 en el Genbank con el número de acceso CVU47120). Se pueden insertar una secuencia poli (A) y una secuencia terminadora en la dirección 3’ del polinucleótido que se va a expresar, por ejemplo, un gen de la hormona de crecimiento bovino, en particular desde aproximadamente el nucleótido 2339 a aproximadamente el nucleótido 2550 en el Genbank con el número de acceso BOVGHRH, un gen de la �-globina de conejo o una señal de poliadenilación del gen tardío de SV40.

[0076] En otra realización, el vector vírico es un adenovirus canino, en particular un CAV-2 (véanse, por ejemplo,

L. Fischer y col. Vaccine, 2002, 20, 3485 – 3497; Patente de los Estados Unidos Nº. 5.529.780; Patente de los Estados Unidos Nº 5.688.920; Solicitud PCT Nº WO95/14102). Para el CAV, los sitios de inserción pueden estar en la región E3 y/o en la región localizada entre la región E4 y la región ITR derecha (véase la Patente de los Estados Unidos Nº 6.090.393; la Patente de los Estados Unidos Nº 6.156.567). en una realización la inserción está bajo el control de un promotor, tal como un promotor del gen temprano inmediato de citomegalovirus (promotor CMV-IB) o un promotor ya descrito para un vector de adenovirus humano. Se puede insertar una secuencia poli (A) y secuencia terminadora en la dirección 3’ del polinucleótido que se va a expresar, por ejemplo, un gen de la hormona de crecimiento bovino o una señal de poliadenilación del gen de la �-globina de conejo.

[0077] En otra realización particular, el vector vírico es un virus del herpes tal como un virus del herpes canino (CHV) o un virus del herpes felino (FHV). Para el CHV, los sitios de inserción pueden ser en particular en el gen de la timidina cinasa, en el ORF3 o en el ORF de UL43 (véase la Patente de los Estados Unidos Nº 6.159.477). En una realización, el polinucleótido que se va a expresar se inserta bajo el control de un promotor funcional en células eucariotas, de forma ventajosa, un promotor CMV-IB (murino o humano). Se puede insertar una secuencia poli (A) y una secuencia terminadora en la dirección 3’ del polinucleótido que se va a expresar, por ejemplo, la hormona del crecimiento bovino o una señal de poliadenilación del gen de la �-globina de conejo.

[0078] De acuerdo con otra realización adicional de la descripción, el vector de expresión es un vector plásmido o un vector plásmido de ADN, en particular un vector de expresión in vivo. En un ejemplo específico no limitante, se puede utilizar el plásmido pVR1020 o 1012 (VICAL Inc.; Luke C. y col., Journal of Infectious Diseases, 1997, 175, 91

– 97; Hartikka J. y col., Human Gene Therapy, 1996, 7, 1205 – 1217, véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos 5.846.946 y 6.451.769) como un vector para la inserción de una secuencia de un polinucleótido. El plásmido pVR1020 se deriva de pYR1012 y contiene la secuencia señal tPA humana. En una realización la señal tPA humana comprende desde el aminoácido M (1) al aminoácido S (23) en el Genbank con el número de acceso HUMTPA 14. En otro ejemplo específico no limitante, el plásmido utilizado como un vector para la inserción de una secuencia de polinucleótido puede contener la secuencia del péptido señal de IGF1 de equino desde el aminoácido M (24) al aminoácido A (48) en el Genbank con el número de acceso U28070. Información adicional sobre los plásmidos de ADN que se puede consultar o emplearse en la práctica se encuentra, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Nos 6.852.705; 6.818.628; 6.586.412; 6.576.243; 6.558.674; 6.464.984; 6.451.770; 6.376.473 y

6.221.362.

[0079] El término plásmido cubre cualquier unidad de transcripción del ADN que comprende un polinucleótido de acuerdo con la descripción y los elementos necesarios para su expresión in vivo en una célula o células del hospedador o diana deseado, y, a este respecto, se señala que un plásmido circular superenrollado o no superenrollado, así como una forma lineal, se pretende que estén comprendidos en el alcance de la descripción

[0080] Cada plásmido comprende o contiene o consiste esencialmente en, además del polinucleótido que codifica un antígeno, epítopo o inmunógeno de la gripe, fusionado opcionalmente con una secuencia variante, análogo o fragmento de un péptido heterólogo, unido de manera operable a un promotor o bajo el control de un promotor o dependiente de un promotor. En general, es ventajoso emplear un promotor fuerte funcional en células eucariotas. El promotor fuerte preferido es el promotor inmediato temprano de citomegalovirus (CMV-IE) de origen humano o de murino, o que tenga opcionalmente otro origen tal como de rata o cobaya. El promotor CMV-IE puede comprender parte del promotor real, que puede estar o no asociada con la parte potenciadora. Se hace referencia a los documentos EP-A-260 148, EP-A-323 597, las patentes de los estados Unidos Nos 5.168.062, 5.385.839, y 4.968.615, así como la Solicitud PCT Nº WO87/03905. El promotor CMV-IE es de forma ventajosa un CMV-IE humano (Bosbart M. y col., Cell., 1985, 41, 521 – 530) o CMV-IE de murino.

[0081] En los términos más generales, el promotor tiene un origen tanto vírico como celular. Un promotor vírico fuerte diferente de CMV-IE que se puede emplear útilmente en la práctica de la recepción es el promotor temprano/tardío del virus SV40 o el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous. Un promotor celular fuerte que se puede emplear en la práctica de la descripción es el promotor de un gen del citoesqueleto, tal como por ejemplo, el promotor de la desmina (Kwissa M. y col., Vaccine, 2000, 18, 2337 – 2344), o los promotores de la actina (Miyazaki

J. y col., Gene, 1989, 79, 269 – 277).

[0082] Se incluyen en la presente descripción los subfragmentos funcionales de estos promotores, es decir, las porciones de estos promotores que mantienen una actividad promotora adecuada, por ejemplo, se pueden usar los promotores CMV-IE truncados de acuerdo con la Solicitud PCT Nº WO98/00166 o la Patente de los Estados Unidos Nº 6.156.567 en la práctica de la descripción. Un promotor para la práctica de la descripción incluye en consecuencia los derivados y subfragmentos del promotor de longitud completa que mantienen una adecuada actividad promotora y funcionan por tanto como un promotor, promoviendo preferiblemente una actividad sustancialmente similar a la del promotor real o de longitud completa a partir del cual se deriva el derivado o subfragmento, por ejemplo, comparable a la actividad de los promotores CMV-IE truncados de la Patente de los Estados Unidos Nº 6.156.567 con la actividad de los promotores CMV-IE de longitud completa. De esta manera, un promotor CMV-IE en la práctica de la descripción puede comprender, o consiste esencialmente en o consiste en la porción promotora del promotor de longitud completa y/o la porción potenciadora del promotor de longitud completa, así como los derivados o subfragmentos.

[0083] Preferiblemente, los plásmidos comprenden o consisten esencialmente de otros elementos de control de la expresión. Es particularmente ventajoso incorporar una (s) secuencia (s) de estabilización, por ejemplo, la (s) secuencia (s) de un (os) intrón (es), preferiblemente, el primer intrón de la hCMV-IE (Solicitud PCT Nº WO89/01036) el intrón II del gen de la �-globina de conejo (van Ooyen y col., Science, 1979, 206, 337 – 344).

[0084] Como en el caso de la señal de poliadenilación (poliA) de los plásmidos y los vectores víricos diferentes de los poxvirus, el uso puede referirse más a la señal poliA del gen de la hormona de crecimiento bovino (bgH) (véase la Patente de los Estados Unidos Nº 5.122.458) o la señal poli (A) del gen de la �-globina de conejo o la señal poli

(A) del virus SV40.

[0085] De acuerdo con otra realización de la descripción los vectores de expresión son vectores de expresión utilizados para la expresión in vitro de las proteínas en un sistema celular adecuado. Las proteínas expresadas se pueden recoger o a partir del sobrenadante del cultivo después, o antes de la secreción (si no existe secreción se produce o se lleva a cabo normalmente una lisis celular), concentrarse opcionalmente mediante procedimientos de concentración tales como la ultrafiltración y/o purificarse a través de medios de purificación, tales como cromatografía iónica de afinidad, procedimientos de cromatografía de tipo filtración en gel o intercambio iónico.

[0086] Una “célula hospedadora” denota una célula procariota o eucariota que se ha alterado genéticamente, o que es capaz de alterarse genéticamente mediante la administración de un polinucleótido exógeno, tal como un plásmido o vector recombinante. Cuando se refiere a células genéticamente alteradas, el término se refiere a la célula originalmente alterada y s la progenie de la misma. Las células hospedadoras ventajosas incluyen, pero no se limitan a, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de carcinoma de colon (Caco-2), células COS7, células MCF-7, células MCF-10ª, líneas Madin-Darby de riñón canino (MDCK), células de pulmón de visón (Mv1Lu), células MRC-5, células U937 y células VERO. Se pueden insertar polinucleótidos que comprenden una secuencia deseada en un vector de clonación o de expresión adecuado, y se puede introducir a la vez el vector en una célula hospedadora adecuada para la replicación y la amplificación. Se pueden introducir polinucleótidos en las células hospedadoras mediante cualquier medio conocido en la técnica. Se pueden introducir los vectores que contienen el polinucleótido de interés en la célula hospedadora mediante cualquiera de numerosos medios adecuados, que incluyen la captación directa, endocitosis, transfección, emparejamiento de f, electroporación, transfección empleando cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato de calcio, DEAE-dextrano, u otras sustancias, bombardeo de microproyectiles; lipofección; e infección (en la que el vector es infeccioso, por ejemplo, un vector retrovírico). La elección de la introducción de vectores o polinucleótidos dependerá a menudo de las características de la célula hospedadora.

[0087] En una realización ventajosa, la descripción proporciona la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una formulación para la administración y la expresión de un antígeno, epítopo o inmunógeno de la gripe en una célula diana. La determinación de la cantidad terapéuticamente eficaz es de experimentación rutinaria para una persona normalmente experta en la técnica. En una realización, la formulación comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido que expresa un antígeno, epítopo o inmunógeno de la gripe o un vehículo, portador o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable. En una realización ventajosa, el vehículo, portador o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable facilita la

5 transfección y/o mejora la preservación del vector o la proteína.

[0088] Un experto en la técnica conoce bien los vehículos o portadores o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables. Por ejemplo, un vehículo o portador o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable puede ser una disolución de NaCl al 0,9 % (por ejemplo, solución salina) o un tampón fosfato. Otros vehículos o portadores o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables que se pueden usar para los procedimientos de esta descripción incluyen, pero no se limitan a, poli- (L-glutamato) o polivinilpirrolidona. El vehículo o portador o los excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables puede ser cualquier compuesto o combinación de compuestos que faciliten la administración del vector (o la proteína expresada a partir del vector in vitro); de forma ventajosa, el vehículo, portador o excipiente puede facilitar la transfección y/o mejorar la

15 preservación del vector (o de la proteína). Se describen en la presente memoria descriptiva las dosis y los volúmenes de dosis en la descripción general y se pueden determinar también por el técnico experto a partir de esta divulgación leída junto con el conocimiento en la técnica, sin ninguna experimentación innecesaria.

[0089] Los lípidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternario que son, de forma ventajosa, pero no exclusiva, adecuados para los plásmidos, son ventajosamente aquellos que tienen la siguiente fórmula:

en la que R1 es un radical alifático de cadena lineal saturado o insaturado que tiene de 12 a 18 átomos de carbono,

25 R2 es otro radical alifático que contiene 2 o 3 átomos de carbono y X es grupo amina o hidroxilo, por ejemplo, el DMRIE. En otra realización, el lípido catiónico puede estar asociado con un lípido neutro, por ejemplo, el DOPE.

[0090] Entre estos lípidos catiónicos, se da preferencia a DMRIE (N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis (tetradeciloxi)-1-propano amonio; documento WO96/34109), asociado ventajosamente con un lípido neutro, de forma ventajosa DOPE (dioleoil-fosfatidil-etanol amina; Behr J. P., 1994, Bioconjugate Chemistry, 5, 382 – 389), para formar DMRIE-DOPE.

[0091] De forma ventajosa, la mezcla del plásmido con el adyuvante se realiza de manera extemporánea y ventajosamente contemporánea con la administración de la preparación o el acortamiento antes de la administración

35 de la preparación, por ejemplo, el acortamiento antes o previo a la administración, se realiza la mezcla de plásmidoadyuvante, de forma ventajosa con el fin de proporcionar suficiente tiempo para la administración de la mezcla para formar un complejo, por ejemplo, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 60 minutos antes de la administración, tal como aproximadamente 30 minutos antes de la administración.

[0092] Cuando está presente DOPE, la relación molar DMRIE: DOPE es de forma ventajosa aproximadamente 95: aproximadamente 5 a aproximadamente 5: aproximadamente 95, de forma más ventajosa de aproximadamente 1: aproximadamente 1, por ejemplo 1: 1.

[0093] La relación en peso de adyuvante-plásmido DMRIE o DMRIE-DOPE puede estar entre aproximadamente

45 50: aproximadamente 1 y aproximadamente 1: aproximadamente 10, tal como aproximadamente 10: aproximadamente 1 y aproximadamente 1: aproximadamente 5, y de forma ventajosa aproximadamente 1: aproximadamente 1 y aproximadamente 1. Aproximadamente 2, por ejemplo, 1.1 y 1.2.

[0094] La descripción proporciona también vacunas de la gripe canina inactivadas. Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, el término “vacuna inactivada” significa una composición de vacuna que contiene un organismo

o patógeno infeccioso que ya no es capaz de replicación o crecimiento. La inactivación se puede llevar a cabo mediante una variedad de procedimientos suficiente para evitar la replicación o el crecimiento del organismo manteniendo a la vez su inmunogenicidad.

[0095] La vacuna inactivada puede ser una forma inactivada de un aislado de un virus de la gripe procedente de un perro afectado. El virus puede aislarse de los alveolos o del pulmón de un perro afectado. En otra realización, la vacuna inactivada puede ser una gripe equina inactivada. En una realización ventajosa, la gripe equina es una gripe equina de Kentucky o de Newmarket. La vacuna inactivada puede ser una versión inactivada de una cualquiera de las cepas de la gripe descritas anteriormente.

[0096] Se puede preparar una vacuna inactivada así como del cultivo de fluido recogido. El virus se puede producir tanto mediante inoculación de huevos con embrión de 10 – 11 días (J. Violay y col. Documento US 6.048.537) como mediante inoculación de un cultivo de células BHK-21 (C. Ross y col. Archiv. Für die gesamte Virusforschung 1970, 30, 82 – 88; T. Tolstova y col. Acta Virol. 1966,10, 315 – 321; Ho. Merten y colad. Exp. Med. Biol. 1996, 397,141 – 151), de un cultivo de células MDCK (J. Tree y col. Vaccine 2001, 19, 3444 – 3450; Y. Ghendon y col. Vaccine 2005, 23, 4678 – 4684; R. Brands y col. Dev. Biol. Stand.1999, 98, 93 – 100; R Youil y cel. Virol. Methods 2004, 120, 23 – 31), de un cultivo de células Vero (O. Kistner y col. Vaccine 1998, 16, 960 – 968; E. Govorkova y cel. Virol. 1996, 70, 5519 – 5524). Se puede clarificar el fluido alantoico del sobrenadante del cultivo celular mediante centrifugación baja y/o filtración. El virus se puede concentrar mediante ultrafiltración y se puede purificar mediante centrifugación zonalsobre gradiente de sacarosa (J. Violay y col.US 6.048.537; O. Kistner y col. Ídem), mediante filtración en gel (D. Nayak y cel. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2005, 823, 75 – 81; S. Tomita y col. Kitasato Arch. Exp. Med. 1971, 44, 185 – 196).

[0097] Se puede conseguir la inactivación tratando lo virus mediante cualquiera de los procedimientos comúnmente empleados para preparar vacunas inactivadas. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a tratamiento con formaldehído (O. Kistner y col. Ídem; A. Grarcia y col. Avian Diseases 1998, 42, 248 – 256), tratamiento con beta propiolactona (B. Bdowsky y col. Vaccine 1991, 9, 398 – 402 y Vaccine 1993, 11, 343 – 348; N. Keverin y col. Arch. Virol 2000, 145, 1059 – 1066), tratamiento con etileneimina (D. Swayne y col. Avian Diseases 2001, 45, 355 – 365), tratamiento con disolventes orgánicos, tratamiento con detergentes, tratamiento con Tweenéter o tratamiento con Triton X-100 (J. Vilay y col. Ídem) para el fluido alantoico. Para la inactivación, la concentración puede ser aproximadamente de 0,01 – 0,2 % en p/v para el formaldehído; aproximadamente 0,03 – 0,2 % en p/v para la betapropiolactona, aproximadamente 0,5 – 20 mM para la etileneimina. Los procedimientos enumerados en la presente memoria descriptiva sirven como ejemplos conocidos en la técnica para inactivar virus. Se administran usualmente las vacunas de virus inactivados con un adyuvante. Se puede administrar la vacuna inactivada al animal mediante cualquiera de una pluralidad de procedimientos que incluyen, pero no se limitan a inoculación intramuscular o subcutánea, pulverización, por vía ocular, nasal, oral, o en el óvulo.

[0098] Las composiciones y vacunas inmunógenas de acuerdo con la descripción pueden comprender o consisten esencialmente en uno o más adyuvantes. Los adyuvantes adecuados para uso en la práctica de la presente invención son (1) polímeros de ácido acrílico o metacrílico, anhídrido maleico, y polímeros derivados de alquenilo, (2) secuencias de inmunoestimulación (ISS), tales como secuencias de oligodesoxirribonucleótidos que tienen una o más unidades CpG no metiladas (Klinman y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1996, 93, 2879 – 2883; documento WO98/16247), (3) una emulsión de aceite en agua, tal como la emulsión SPT descrita en la p 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" publicada por M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, y la emulsión MF59 descrita en la página p 183 del mismo trabajo, (4) lípidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternario, por ejemplo, DDA (5) citocinas, (6) hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio, (7) sapoilina u

(8) otros adyuvantes descritos en cualquier documento enumerado en la presente solicitud, o (9) cualquiera de sus combinaciones o sus mezclas.

[0099] La emulsión de aceite en agua (3) que es especialmente adecuada para los vectores víricos, se puede basar en: aceite de parafina líquida ligero (tipo farmacopea europea), aceite isoprenoide tal como escualeno, aceite de escualeno resultante de la oligomerización de alquenos, por ejemplo, isobuteno o deceno, ésteres de ácidos o alcoholes que tienen un grupo alquilo de cadena lineal, tal como aceites vegetales, oleato de etilo, propilenglicol, di (caprilato/caprato), glicerol tri (caprilato/caprato) y dioleato de propilenglicol, o ésteres de alcoholes o ácidos grasos ramificados, especialmente ésteres de ácido isoesteárico.

[0100] El aceite se usa en combinación con emulsificantes para formar una emulsión. Los emulsificantes pueden ser tensioactivos no iónicos, tales como: ésteres de, por una parte, sorbitán, manitoles (por ejemplo oleato de anhidromanitol), glicerol, poliglicerol o propilenglicol y, por otra parte, ácidos oleico, isoesteárico, ricinoleico o hidroxiesteáricos, etoxilándose opcionalmente dichos ésteres o copolímeros en bloque de polioxipropilenopolioxietileno, tales como Pluronic, por ejemplo, L121.

[0101] Entre los polímeros adyuvantes de tipo (1), se da preferencia a los polímeros de ácido acrílico o metacrílico reticulados, especialmente, reticulados por polialqueniléteres de azúcares o polialcoholes. Estos compuestos se conocen bajo el nombre de carbómeros (Pharmeuropa, vol. 8, nº. 2, junio de 1996). Un experto en la técnica puede referirse también a la patente de los estados Unidos Nº 2.909.462, que proporciona dichos polímeros acrílicos reticulados por un compuesto de polihidroxilo que tiene al menos tres grupos hidroxilo, preferiblemente no más de

5 ocho de dichos grupos, sustituyéndose los átomos de hidrógeno de al menos tres grupos hidroxilos por radicales alifáticos insaturados que tienen al menos dos átomos de carbono. Los radicales preferidos son aquellos que contienen 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo, vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los radicales insaturados pueden contener también otros sustituyentes, tales como metilo. Los productos comercializados con el nombre Carbopol (BF Goodrich, Ohio, EE.UU.) son especialmente adecuados. Están reticulados mediante alil sacarosa o mediante alil pentaeritritol: Entre ellos, se hace referencia a Carbopol 974P, 934P y 971P.

[0102] Como para los copolímeros derivados de anhídrido maleico-alquenilo, se hace preferencia a los EMA (Monsanto), que son copolímeros de etileno-anhídrido maleico de cadena lineal o reticulados y son, por ejemplo,

15 reticulados mediante divinil éter. Se hace referencia a J. Fields y col., Nature 186: 778 – 780, junio 4, 1960.

[0103] Con respecto a la estructura, los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y EMA se forman preferiblemente mediante unidades básicas que tienen la siguiente fórmula:

en la que:

-: R1 y R2, que pueden ser iguales o diferentes, representan H o CH3 25

-: x = 0 o 1, preferiblemente x = 1

-: y = 1 o 2, con x+y = 2

[0104] Para EM A, X = 0 y = 2 y para los carbómeros X = y = 1.

[0105] Estos polímeros son solubles en agua o solución salina fisiológica (20 g/l de NaCl) y el pH se puede ajustar a 7,3 a 7,4, mediante sosa (NaOH), para proporcionar la disolución adyuvante en la que se puede (n) incorporar el (los) vector (es) de expresión. La concentración del polímero en la composición de la vacuna final puede variar entre

35 0,01 y 1,5 % en p/v, de forma ventajosa 0,05 a 1 % en p/v, y preferiblemente 0,1 a 0,4 en p/v.

[0106] La citocina o citocinas (5) pueden estar en forma de proteína en la composición inmunógena o de vacuna, o pueden expresarse simultáneamente en el hospedador con el inmunógeno o inmunógenos o su (s) epítopo (s), o por tanto mediante un vector separado.

[0107] La descripción comprende preparar dicha combinación de composiciones, por ejemplo, mediante la premezcla de los componentes activos, de forma ventajosa junto y con un adyuvante, vehículo, citocina, y/o diluyente.

45 [0108] Las citocinas que se pueden usar en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulador de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF), interferón Q (IFN Q), interferón � (IFN �), interferón y (IFN y), interleucina-1Q (IL-1Q), interleucina-1� (IL-1�), interleucina-2 (IL-2), interleucina-3 (IL-3), interleucina-4 (IL-4), interleucina-5 (IL-5), interleucina-6 (IL-6), interleucina7 (IL-7), interleucina-8 (IL-8), interleucina-9 (IL-9), interleucina-10 (IL-10), interleucina-11 (IL-11), interleucina-12 (IL12), factor Q de necrosis tumoral (TNF Q), factor � de necrosis tumoral (TNF �), y factor � de crecimiento transformante (TGF �). Se entiende que las citocinas se pueden administrar simultánea y/o secuencialmente con la composición inmunógena o de vacuna de la presente descripción. De esta manera, por ejemplo, la vacuna de la presente descripción puede contener también una molécula de ácido nucleico exógeno que expresa in vivo una citocina adecuada, por ejemplo, una citocina emparejada con este hospedador que se va a vacunar o en el que se va a estimular una respuesta inmunológica (por ejemplo, una citocina canina para las preparaciones que se van a administrar a perros.

[0109] De forma ventajosa, las composiciones farmacéuticas y/o terapéuticas y/o las formulaciones de acuerdo con la descripción comprenden o consisten esencialmente en o consisten de una cantidad eficaz para estimular una respuesta terapéutica de uno o más vectores y/o polipéptidos de expresión tal como se describe en el presente documento, y, se puede determinar una cantidad eficaz a partir de esta divulgación, y del conocimiento de la técnica, sin experimentación innecesaria.

[0110] En el caso de composiciones terapéuticas y/o farmacéuticas basadas en un vector plásmido, una dosis puede comprender, consistir esencialmente en o consistir de, en términos generales, aproximadamente en 1 μg a aproximadamente 2000 μg, de forma ventajosa aproximadamente 50 μg a aproximadamente 1000 μg y de forma más ventajosa de aproximadamente 100 μg a aproximadamente 800 μg de plásmido que expresa el antígeno, epítopo o inmunógeno de la gripe. Cuando las composiciones terapéuticas y/o farmacéuticas basadas en el vector plásmido se administran con electroporación, la dosis de plásmido está generalmente entre aproximadamente 0,1 μg y 1 mg, de forma ventajosa entre aproximadamente 1 μg y 100 μg, de forma ventajosa entre aproximadamente 2 μg y 50 μg. Los volúmenes de las dosis pueden estar entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 2 ml, de forma ventajosa entre aproximadamente 0,2 y aproximadamente 1 ml. Las dosis y volúmenes de las dosis son adecuadas para el tratamiento de canes y otras especies diana de mamíferos tales como equinos y felinos.

[0111] La composición terapéutica y/o farmacéutica contiene por dosis de aproximadamente 104 a aproximadamente 1011, de forma ventajosa de aproximadamente 105 a aproximadamente 1010 y de forma más ventajosa de aproximadamente 106 a aproximadamente 109 partículas víricas de adenovirus recombinante que expresa un antígeno, epítopo o inmunógeno de la gripe. En el caso de composiciones terapéuticas y/o farmacéuticas basadas en un poxvirus, una dosis puede estar entre aproximadamente 102 ufp y aproximadamente 109 ufp. La composición farmacéutica contiene por dosis de aproximadamente 105 a 109, de forma ventajosa de aproximadamente 106 a 108 ufp de poxvirus o virus del herpes recombinante que expresa el antígeno, epítopo o inmunógeno de la gripe.

[0112] El volumen de la dosis de las composiciones de las especies diana que son los mamíferos, por ejemplo, el volumen de la dosis de las composiciones para canes, basadas en los vectores víricos, por ejemplo, las composiciones basadas en los vectores víricos no de poxvirus, está generalmente entre aproximadamente 0,5 ml a aproximadamente 1,0 ml.

[0113] Con las composiciones inactivadas del virus u organismo o patógeno producido sobre el nuevo cultivo, se pueden administrar al animal aproximadamente 104-109 de la CCDI50 equivalente (título antes de la inactivación), de forma ventajosa aproximadamente 105 – 108 de la CCDI50 equivalente en una única unidad de dosificación. El volumen de una única unidad de dosificación puede estar entre 0,2 ml y 5,0 ml y de forma ventajosa entre 0,5 ml y 2,0 ml y de forma más ventajosa aproximadamente 2,0 ml. Se pueden llevar a cabo una o más administraciones; por ejemplo, con dos inyecciones con un intervalo de 2 – 4 semanas, y de forma ventajosa con un refuerzo aproximadamente 3 semanas después de la primera inyección.

[0114] En una realización ventajosa, un animal, de forma ventajosa un perro, se vacuna con dos dosis de vacuna inactivada con intervalos de aproximadamente 3 a 4 semanas mediante la ruta subcutánea, aunque se contempla también una ruta intramuscular. Se pueden recoger ambas muestras en el día de la primera y/o segunda vacunación y aproximadamente 2 a 4 semanas después de la segunda vacunación para determinar los niveles de anticuerpos específicos contra el virus de la gripe mediante los procedimientos conocidos por un experto en la técnica, por ejemplo, neutralización del virus, inhibición de la hemaglutinación, ELISA o ensayos individuales de hemólisis radial (SRH).

[0115] Se puede ensayar la eficacia de las vacunas inactivadas aproximadamente 2 a 4 semanas después de la segunda inmunización mediante el estímulo de los animales, de forma ventajosa perros, con una cepa virulenta de la gripe, de forma ventajosa la cepa H3N8 de la gripe. Se puede estimular al animal mediante pulverización, intranasalmente, intratraquealmente y/u oralmente. El estímulo vírico puede ser aproximadamente de 105-8 EID50 en un volumen que depende de la ruta de administración. Por ejemplo, si la administración es mediante pulverización, se pulveriza mediante aerosol una suspensión vírica para generar aproximadamente 1 a 100 μm gotículas, si la administración es intranasal, intratraqueal u oral, el volumen del virus del estímulo es aproximadamente de 0,5 ml, 1

– 2 ml y 5 – 10 ml, respectivamente. Se pueden observar los animales a diario durante 14 días después del estímulo para los signos clínicos, por ejemplo, fiebre, tos, descarga ocular y nasal, insuficiencia respiratoria, anorexia y letargia. Además, se pueden someter a eutanasia grupos de animales y evaluarse para los hallazgos patológicos de hemorragia pulmonar y pleural, traqueítis, bronquitis, bronquiolitis, y bronconeumonía. Se pueden recoger hisopos de la tráquea procedentes de todos los animales 1 – 14 días después del estímulo para el aislamiento del virus. Se puede evaluar la presencia o ausencia de antígenos víricos en los tejidos respiratorios mediante inmunohistoquímica, por ejemplo, en los días 3, 7 y 10 después del estímulo. Se pueden recoger muestras de sangre después del estímulo (por ejemplo, en los días 7 y 14 después del estímulo) y se pueden analizar para la presencia de un anticuerpo específico contra el virus H3N8 de la gripe.

[0116] Un experto en la técnica debe entender que la divulgación de la presente memoria descriptiva se proporciona por medio de ejemplos y que la presente invención no está limitada a lo anterior. A partir de la divulgación de la presente memoria descriptiva y del conocimiento proporcionado por la técnica, el técnico experto puede determinar el número de administraciones, la ruta de administración, y las dosis que se van a utilizar para cada protocolo de inyección, sin ninguna experimentación innecesaria.

[0117] La presente descripción contempla al menos una administración a un animal de una cantidad eficaz de la composición terapéutica preparada de acuerdo con la descripción. El animal puede ser macho, hembra, hembra embarazada y recién nacido. Esta administración puede ser mediante diversas rutas que incluyen, pero no se limitan a, inyección intramuscular (IM), intradérmica (ID) o subcutánea o mediante administración intranasal u oral. Se puede administrar también la composición terapéutica de acuerdo con la descripción mediante aparatos sin aguja (como, por ejemplo, un aparato Pigjet, Biojector o Vitajet (Bioject, Oregón, EE.UU.). Otra solución para administrar composiciones de plásmidos es usar la electroporación (véanse, por ejemplo, Tollefsen y col. Vaccine, 2002, 20, 3370 – 3378; S. Tollefsen y col. Scand. J. Immunol., 2003, 57, 229 – 238; S. Babiuk y col., Vaccine, 2002, 20, 3399 – 3408; Solicitud PCT Nº WO99/01158). En otra realización, la composición terapéutica se administra al animal mediante pistola génica o bombardeo de partículas de oro. En una realización ventajosa, el animal es un vertebrado. En una realización más ventajosa, el vertebrado es un perro.

[0118] Una realización de la descripción es un procedimiento para estimular una respuesta inmune contra la gripe en un animal, que comprende administrar una formulación para la administración y la expresión de una vacuna contra la gripe de un poxvirus recombinante o una vacuna contra la gripe inactivada en una cantidad eficaz para estimular una respuesta inmune. Otra cantidad más de la descripción es un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica o protectora contra la gripe en un animal, que comprende administrar al animal una cantidad eficaz de una formulación para la administración y la expresión de un antígeno, epítopo o inmunógeno de la gripe, en la que la formulación comprende una vacuna contra la gripe de un poxvirus recombinante o una vacuna contra la gripe inactivada y un vehículo, portador o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable.

[0119] La descripción se refiere a un procedimiento para promover, inducir o estimular la respuesta inmune de un animal, de forma ventajosa un vertebrado. En una realización, el vertebrado es un perro, pero también puede ser un gato.

[0120] Otra realización de la descripción es un kit para llevar a cabo un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica o protectora contra la gripe en un animal que comprende una vacuna de un poxvirus de la gripe recombinante o una vacuna de la gripe inactivada e instrucciones para llevar a cabo el procedimiento de administración en una cantidad eficaz para estimular una respuesta inmune en el animal.

[0121] La invención se describirá ahora adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLO 1: Vacunación de perros con el virus de la viruela del canario que expresa los genes H3

[0122] Se llevó a cabo un estudio en el que se vacunaron perros en los días 0 y 21 con un virus de la viruela del canario que expresaba los genes H3 de la gripe equina de Kentucky (CP1529) y Newmarket (CP1533). Se describe la construcción de CP1529 y CP1533 en los Ejemplos 1 (locus c5), 4 y 5 de la Publicación de Patente Internacional WO99/44633.

[0123] Se presentan en las FIGS. 1 y 2 las secuencias de nucleótidos de los plásmidos donantes pJT004 y pJT005.

[0124] Se recogió suero y se ensayó frente a los virus de la gripe H3N8 y los otros virus. Tal como se muestra en la Tabla 1, el virus de la viruela del canario que expresaba los genes H3 de la hemaglutinina indujo una sustancial cantidad de anticuerpos que reaccionó específicamente con las cepas H3N8 pero no con H1N1 o H7N7. De forma importante, fueron detectables los anticuerpos en las dos semanas después de la primera inmunización.

[0125] De acuerdo con esto, un virus de la viruela del canario que expresa un gen HA de la gripe es inmunógeno 5 en perros.

Tabla 1: vacunación de perros con el virus de la viruela del canario que expresa los genes H3 de la hemaglutinina

Antígeno: Exudado GRUPO VACUNADO GRUPO CONTROL

N/1/93: D0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

(H3N8)

D14: 0 63,8 69,9 31,4 96,7 n.s. n.s. n.s. n.s. n.s.

D21: 104,1 91,4 121,5 74,6 121,5 n.s. n.s. n.s. n.s. n.s.

D36: 106 96,7 111,7 69,9 123,6 n.s. n.s. n.s. n.s. n.s.

D51: 76,2 55,1 74,6 38,3 69,9 n.s. n.s. n.s. n.s. n.s.

N/2/93: D0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

(H3N8)

D14: 0 25,1 59,4 29,2 60,8 n.s. n.s. n.s. n.s. n.s.

D21: 86,2 71,4 102,2 65,3 406 n.s. n.s. n.s. n.s. n.s.

D36: 82,8 74,6 96,7 62,3 100,4 n.s. n.s. n.s. n.s. n.s.

D51: 52,3 37,1 66,8 26,1 57,9 n.s. n.s. n.s. n.s. n.s.

Pr/56: D0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

(H7N7): D14 D21 0 19,3 0 24,1 0 0 0 0 0 0 n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s.

D36 D51: 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s.

PR8: D0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

(H1N1)

D14: 0 16,7 0 19,3 0 n.s. n.s. n.s. n.s. n.s.

D21: 0 0 0 0 0 n.s. n.s. n.s. n.s. n.s.

D36: 0 0 0 0 0 n.s. n.s. n.s. n.s. n.s.

D51: 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

n.s. = sin muestra

10 EJEMPLO 2: Construcción del plásmido donante pALVAC C5 H6p-EIV H3 HA sintético, pJY1571.1)

[0126] Se derivó el gen HA del virus de la cepa H3N8 Ohio 03 del virus de la gripe equina (EIV) aislado de un caballo en 2003.

15 [0127] El objetivo fue la construcción de un plásmido donante ALVAC para la generación de un codón de expresión recombinante ALVAC optimizado para EIV H3 HA (Ohio 03). El nombre del plásmido fue pALVAC C5 H6p-EIV H3 HA sintético para, pJY1571.1. El esqueleto del plásmido es pALVAC C5 H6p

[0128] La descripción de la construcción del plásmido fue como sigue y se presenta de forma esquemática en la

20 FIG. 4A. El EIV H3 HA sintético (Ohio 03) se aisló de un plásmido pEIV H3N8 HA mediante digestión con EcoRV/XhoI, y se ligó al plásmido donante pALVAC C5 H6p digerido con EcoRV/XhoI para crear PALVAC C5 Hep-EIV H3 HA sintético. En el plásmido resultante existen múltiples sitios de clonación consistentes en XhoI, Xba I, Cla I y Sma I entre el ORF de HA y la secuencia T5AT que sirve como la señal de terminación de la transcripción. Para acercar entre sí el ORF de HA y la secuencia T5AT, aquellos sitios de clonación se eliminaron a continuación

25 posteriormente mediante ligadura del sitio XhoI recargado con el sitio Sma 1. El plásmido resultante pJY1571.1 se secuenció a continuación y se confirmó que contenía la secuencia correcta. En la FIG. 4B se presenta un diagrama del plásmido resultante. En la FIG. 5A se muestra la secuencia de aminoácidos prevista de EIV H3 HA y en la FIG. 5B. se muestra la secuencia de nucleótidos de los grupos y la inserción con la traducción.

30 EJEMPLO 3: Construcción del virus de la viruela del canario vCP2242 recombinante

[0129] El objetivo de este ejemplo fue la generación y la caracterización de ALVAC recombinante que contenía el codón H3N8 de EIV optimizado para HA insertado en los loci C5 de ALV AC (vCP2242). El virus parental fue ALVAC, el plásmido donante fue pJY1571.1, el sitio de inserción fue un locus C5, el promotor fue un promotor H6 y las células para la recombinación in vitro fueron células de fibroblastos embriónicos de pollo (1ºCEF).

5 [0130] La recombinación in vitro (IVR) se llevó a cabo mediante transfección de las células 1ºCEF con 15 μg de plásmido donante pJY1571.1 no linealizado para I. las células transfectadas se infectaron posteriormente con ALVAC como virus de rescate a una MOI de 10. Después de 24 h, las células infectadas transfectadas se recogieron, sonicaron y se utilizaron para el cribado del virus recombinante.

10 [0131] Las placas recombinantes se cribaron basándose en el procedimiento de hibridación con elevación de placa utilizando una sonda específica EIV syn HA de 821 pb etiquetada con peroxidasa de rábano picante (HRP) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de cuatro ciclos secuenciales de purificación en placa, se generó el recombinante designado como vCP2242 y se confirmó mediante hibridación como positivo al 100 % para la inserción de EIV syn HA y negativo al 100 % para el ORF C5.

15 [0132] Se llevaron a cabo el análisis de la expresión y el análisis de la secuencia. Se llevó a cabo el análisis de la expresión mediante transferencia Western. Se infectaron células CEF primarias con una disolución madre de vCP2242 a una MOI de 10 y se incubaron a 37º C durante 26,5 h. A continuación se recogieron las células y el sobrenadante del cultivo, Se separaron las proteínas de la muestra sobre un gel SDS-PAGE al 10 %, se transfirieron

20 a una membrana de nylon Immobilon, y se sondaron con un combinado de anticuerpos monoclonales de ratón dirigidos contra EIV HA (combinado anti Eq/AK/91: 124-1D9-1, 124-3E3-3, 124-4F3-2 y H3N8 A Eq/miami/63 a una dilución 1/1.000). Se utilizó antisuero de cabra conjugado con peroxidasa dirigido contra ratón como anticuerpo secundario y se visualizaron las bandas utilizando reactivos luminol. vCP2242 mostró un perfil de expresión de la proteína con una proteína de 80 kDa expresada en el aglomerado celular, pero no en el medio de cultivo tal como se

25 presenta en la FIG. 6.

[0133] Los resultados del análisis de la secuencia demostraron que las secuencias del EIV syn HA y C5L y C5R de ALVAC fueron correctas.

30 EJEMPLO 4: Secuencias de nucleótidos de la gripe equina de Kentucky

[0134] DEFINICIÓN gen de la proteína no estructural del virus de la gripe A (A/equine/Kentucky/5/02 (H3N8)), cds completa

35 [0135] ACCESO AY855345; SEQ ID NO: 8

40 [0136] DEFINICIÓN gen de la proteína no estructural del virus de la gripe A (A/equine/Kentucky/5/02 (H3N8)), cds completa

ACCESO AY855344; SEQ ID NO: 9

5 [0137] DEFINICIÓN Gen de la neuraminidasa del virus de la gripe A (A/equine/Kentucky/5/02 (H3N8)), cds completa.

ACCESO AY855343; SEQ ID NO: 10

[0138] DEFINICIÓN Gen de la nucleoproteína del virus de la gripe A (A/equine/Kentucky/5/02 (H3N8)), cds completa.

ACCESO AY855342, SEQ ID NO: 11

5 [0139] DEFINICIÓN Precursor de la hemaglutinina del virus de la gripe A (A/equine/Kentucky/5/02 (H3N8)), gen, cds completa.

ACCESO AY855341, SEQ ID NO: 12

[0140] DEFINICIÓN Gen de la polimerasa PA del virus de la gripe A (A/equine/Kentucky/5/02 (H3N8)), cds completa. 5 ACCESO AY855340, SEQ ID NO: 13

[0141] DEFINICIÓN Gen 1 de la polimerasa PB1 del virus de la gripe A (A/equine/Kentucky/5/02 (H3N8)), cds completa. 5 ACCESO AY855339; SEQ ID NO: 14

[0142] DEFINICIÓN Gen 2 de la polimerasa PB2 del virus de la gripe A (A/equine/Kentucky/5/02 (H3N8)), cds completa. 5 ACCESO AY855338; SEQ ID NO: 15

[0143] DEFINICIÓN gen precursor de la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe A (A/equine/Kentucky/1/91 (H3N8)), cds completa. 5 ACCESO L39918, SEQ ID NO: 16

[0144] DEFINICIÓN Gen precursor de la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe A (A/equine/Kentucky/1/92 5 (H3N8)), cds completa.

ACCESO L39917; SEQ ID NO: 17

[0145] DEFINICIÓN Gen precursor de la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe A (A/equine/Kentucky/1/90 (H3N8)). 5 ACCESO L39915; SEQ ID NO: 18

[0146] DEFINICIÓN gen precursor de la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe A (A/equine/Kentucky/1/94 (H3N8)) cds completa. 5 ACCESO L39914; SEQ ID NO: 19

10 [0147] DEFINICIÓN gen de la nucleoproteína (NP) del virus de la gripe A (A/equine/Kentucky/1/81 (H3N8)), cds

completa. ACCESO AY291288; SEQ ID NO: 20

[0148] DEFINICIÓN Precursor del gen de la hemaglutinina del virus de la gripe A (A/Equine/Kentucky/1/92 (H3N8)), cds parcial.

10 ACCESO D30683, SEQ ID NO: 21 [0149] DEFINICIÓN ARNm precursor de la hemaglutinina (HA1) del virus de la gripe A (A/equine/Kentucky/1/97 (H3N8)), cds parcial.

5 ACCESO AF197249, SEQ ID NO: 22

10 [0150] DEFINICIÓN ARNm precursor de la hemaglutinina (HA1) del virus de la gripe A (A/equine/Kentucky/1/96 (H3N8)), cds parcial.

ACCESO AF197248, SEQ ID NO: 23

[0151] DEFINICIÓN ARNm precursor de la hemaglutinina (HA1) del virus de la gripe A (A/equine/Kentucky/9/95 (H3N8)), cds parcial.

20 ACCESO AF197247, SEQ ID NO: 24

[0152] DEFINICIÓN ARNm precursor de la hemaglutinina (HA1) del virus de la gripe A (A/equine/Kentucky/1/98 5 (H3N8)), cds parcial.

ACCESO AF197241; SEQ ID NO: 25

[0153] DEFINICIÓN ARNm de la hemaglutinina del virus de la gripe A (A/eq/Kentucky/81 (H3N8)), cds completa. ACCESO U58195; SEQ ID NO: 26

[0154] DEFINICIÓN genes de la proteína de membrana M1 y de la proteína de membrana M2 del virus de la gripe 5 A (A/equine/Kentucky/2/86 (H3N8)), cds completa.

ACCESO M63540, SEQ ID NO: 27 [0155] DEFINICIÓN Proteína no estructural del aislado A/equine/Kentucky/76 del virus de la gripe A, cds completa. ACCESO M80971; SEQ ID NO: 28

[0156] DEFINICIÓN Genes de las proteínas de matriz M 1 y M2 (M) del virus de la gripe A (A/eq/Kentucky/92 (H3N8)), cds completa.

10 ACCESO AF001683, SEQ ID NO: 29

15 [0157] DEFINICIÓN Genes de las proteínas de matriz M1 y M2 (M) del virus de la gripe A (A/eq/Kentucky/81 (H3N8)), cds completa.

ACCESO AF001676, SEQ ID NO: 30

[0158] DEFINICIÓN Genes de las proteínas no estructural.es NS1 y NS2 (NS) del virus de la gripe A (A/eq/Kentucky/92 (H3N8)) cds completa. 5 ACCESO AF001671, SEQ ID NO: 31

10 [0159] DEFINICIÓN Genes de las proteínas no estructurales NS1 y NS2 (NS) del virus de la gripe A (A/eq/Kentucky/1/88 (H3N8)), cds completa.

ACCESO AF001664; SEQ ID NO: 32 [0160] DEFINICIÓN ARNm de la nucleoproteína (seg 5) de la gripe A/equine/Kentucky/2/86 (H3N8), cds completa. 5 ACCESO M30751; SEQ ID N O: 33

[0161] DEFINICIÓN Gripe A/Equine/Kentucky/2/86 (H3N8), polimerasa PB2, cds completa. ACCESO M73526 M36049; SEQ ID NO: 34

[0162] DEFINICIÓN ARN (seg. 4) de la hemaglutinina (HA) de la gripe A/equine/Kentucky/1/87 (H3N8), cds 5 completa.

[0163] DEFINICIÓN ARN (seg. 4) de la hemaglutinina (HA) de la gripe A/equine/Kentucky/2/86 (H3N8), cds 5 completa.

EJEMPLO 5: Secuencias de nucleótidos de la gripe equina de Newmarket

5 [0164] DEFINICIÓN Gen NS1 del virus de la gripe A (A/equine 2/Suffolk/89 (H3N8)). ACCESO X80060; SEQ ID NO: 37

[0165] DEFINICIÓN Gen HAI de la subunidad HAY de la hemaglutinina del virus de la gripe A (A/eq/Newmarket/93/ (H3N8)), ARN genómico.

15 ACCESO X85089; SEQ ID NO: 38

[0166] DEFINICIÓN Gen HAI de la subunidad HAY de la hemaglutinina del virus de la gripe A (A/eq/Newmarket/93/ (H3N8)), ARN genómico. 5 ACCESO X85088; SEQ ID NO: 39

10 [0167] DEFINICIÓN Gen HAI de la subunidad HAY de la hemaglutinina del virus de la gripe A (A/eq/Sussex/89/ (H3N8)), ARN genómico.

ACCESO X85090; SEQ ID NO: 40

[0168] DEFINICIÓN Gen HAI de la subunidad HAY de la hemaglutinina del virus de la gripe A (A/eq/Lambourn/92/ (H3N8)), ARN genómico. 5 ACCESO X85087; SEQ ID NO: 41

10 [0169] DEFINICIÓN Gen HAI de la Subunidad HAY de la hemaglutinina del virus de la gripe A (A/eq/E11a/89/ (H3N8)), ARN genómico.

ACCESO X85086; SEQ ID NO: 42

[0170] DEFINICIÓN Gen HAI de la subunidad HAY de la hemaglutinina del virus de la gripe A (A/eq/Arundel/91/ 5 (H3N8)), ARN genómico.

ACCESO X85085; SEQ ID NO: 43

[0171] DEFINICIÓN Gen HA de la hemaglutinina del virus de la gripe A (A/equine/Suffolk/89 (H3N8)). ACCESO X68437; SEQ ID NO: 44

[0172] DEFINICIÓN Gen de la hemaglutinina del virus de la gripe A (A/equine/Newmarket/1/77 (H7N7)). 5 ACCESO X62554; SEQ ID NO: 45

[0173] DEFINICIÓN Gen Ha parcial de la hemaglutinina del virus de la gripe A, ARN genómico, cepa A/equine/Newmarket-Bob Champion/89 (H3N8). 5 ACCESO AJ223193; SEQ ID NO: 46

[0174] DEFINICIÓN Precursor del gen de la hemaglutinina del virus de la gripe A (A/Equine/NewMarket/D64/79 (H3N8)), cds parcial. 5 ACCESO D30677; SEQ ID NO: 47

10 [0175] DEFINICIÓN Genes de las proteínas de matriz M1 y M2 del virus de la gripe A (A/eq/Newmarket/1/77 (H7N7)), cds completa.

ACCESO AF001686; SEQ ID NO: 48

[0176] DEFINICIÓN Genes de las proteínas de matriz M1 y M2 (M) del virus de la gripe A (A/eq/Newmarket/79 (H3N8)), cds completa. 5 ACCESO AF001675; SEQ ID NO: 49

10 [0177] DEFINICIÓN Genes de las proteínas no estructurales NS1 y NS2 (NS) del virus de la gripe A (A/eq/Newmarket/1/77 (H7N7)), cds completa.

ACCESO AF001663; SEQ ID NO: 50 15

[0178] DEFINICIÓN Genes de las proteínas no estructurales NS1 y NS2 (NS) del virus de la gripe A (A/eq/Newmarket/D63/79 (H3N8)), cds completa. 5 ACCESO AF001662; SEQ ID NO: 51

10 EJEMPLO 6: Eficacia de la vacuna de la gripe inactivada en canes

[0179] El principio activo de la vacuna (AI) se produjo tanto a los 9 – 11 días de edad de los huevos con embriones de pollo como en cultivos celulares continuos tales como células MDCK.

15 [0180] Producción, recogida y purificación de huevos. Se preparó la producción del AI de la vacuna en huevos con embriones de pollo mediante inoculación de 0,1 – 0,25 ml de suspensión de virus que contenían 100 – 1000 EID50 (dosis infecciosa del huevo) en la cavidad alantoica. Se recogió el fluido alantoico tras incubación a 33 – 37º C durante 2 – 6 días y se combinó: El combinado del virus se clarificó mediante centrifugación a 1500 – 4000 g durante 5 – 15 minutos y se filtró a través de un filtro de 20 μm (1). Se puede concentrar el virus mediante ultrafiltración

20 utilizando una membrana de 300 KDa con un factor de concentración máxima de 20 (2).

[0181] Además, el virus concentrado se purificó opcionalmente mediante ultracentrifugación zonal en un gradiente de sacarosa seguido por filtración del virus que contenía la fracción a través de una membrana de 0,5 μm. Se puede repetir esta etapa. El virus que contenía la fracción se diluyó en un tampón adecuado tal como un tampón fosfato (3).

25 [0182] La purificación adicional consiste en el tratamiento con Tween/éter a una concentración final del 0,1 % (p/v) y una concentración final del 50 % (p/p), respectivamente. La disolución resultante se centrifugó y se recogió la fase acuosa. Se puede repetir esta etapa. La fase acuosa se trató con nitrógeno para eliminar el éter residual (4).

30 [0183] Producción, recogida y purificación del cultivo celular. Se preparó el principio activo en células (por ejemplo, células MDCK, BHK, PerC6) mediante inoculación a una tasa de MOI de 0,001 1 TCID50. Se recogió el cultivo tras la incubación a 35 – 37º C durante 48 – 96 horas, cuando el efecto citopático (CPE) es aproximadamente del 50 – 90 %. Se sonicó el cultivo y se centrifugó a 1500 – 4000 g durante 5 – 15 minutos (1). El virus se concentró mediante ultrafiltración utilizando una membrana de 300 KD con un factor de concentración máxima de 20 (2).

[0184] El virus se purificó opcionalmente mediante cromatografía de exclusión (Sefarosa 6 de flujo rápido) (3).

[0185] Inactivación. Se inactivó el virus (fracción 1, 2, 3 o 4) mediante la adición de formalina o beta-propiolactona hasta una concentración final de 0,05 % (p/v) o 0,01 % (p/v), respectivamente y se mantuvo la suspensión respectivamente a 5º C durante 16 – 18 horas o a 20º C durante 25 – 36 horas con agitación continua.

[0186] Se confirmó la inactivación del principio activo mediante la inoculación de huevos con embriones de pollo o sobre células MDCK.

[0187] Preparación de la vacuna final. La vacuna consiste en un virus de la gripe inactivado y un adyuvante tal como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, Carbómero o una emulsión de aceite en agua, que puede contener otros componentes inmunoestimuladores tales como CpG (1 – 100 μg/dosis). La vacuna contiene normalmente 15 – 50 μg de hemaglutinina medidos mediante inmunodifusión radial individual (SRD) o > 400 Unidades de hemaglutinación.

[0188] La vacuna se administra tanto mediante ruta subcutánea como intramuscular. Se administran dos dosis con un intervalo de 2 – 5 semanas a crías de 4 semanas de edad. Duración de la inmunidad: 6 – 12 meses después del curso de una vacuna primaria.

[0189] Protocolo de vacunación/estímulo. Se vacunaron perros (menos de 4 semanas de edad) con 2 dosis de vacuna inactivada con un intervalo de 3 – 4 semanas mediante la ruta subcutánea. Se recogieron muestras de sangre en el día de la primera y la segunda vacunación y 2 – 4 semanas después de la segunda vacunación para determinar los niveles de anticuerpos específicos dirigidos contra el virus de la gripe, utilizando los ensayos de neutralización del virus, la inhibición de la hemaglutinación, ELISA o hemólisis radial individual (SRH).

[0190] Dos a 4 semanas después de la 2ª inmunización, se estimuló a los perros con una cepa virulenta de la gripe H3N8 para determinar la eficacia de las vacunas.

[0191] Se estimuló a los perros vacunados y del control mediante la siguiente ruta:

[0192] Mediante pulverización: los animales se colocaron en un recipiente cerrado o se colocó una mascarilla en el hocico de los perros y se administró mediante aerosol la suspensión del virus para generar 1 – 100 μM gotículas: Los animales se mantuvieron en las cámaras de aerosolización durante 30 minutos para permitir la inhalación del aerosol.

[0193] De forma alternativa, se pueden estimular mediante una de las siguientes rutas:

Intranasalmente: 0,5 ml que contenían 105-8 EID50 del virus del estímulo se administraron en forma de gotas a cada una de las fosas nasales con la ayuda de un gotero.

Intratraquealmente: 1 – 2 ml que contenían 105-8EID50 del virus se instilaron directamente en la tráquea.

Oralmente: 5 – 10 ml que contenías 105-8EID50 del virus del estímulo se administraron por vía oral.

[0194] Se observó a los animales diariamente durante 14 días tras el estímulo para los signos clínicos que incluían fiebre, tos, descarga nasal, ocular, insuficiencia respiratoria, anorexia y letargia. Además, grupos de animales se sometieron a eutanasia y se evaluaron para los hallazgos patológicos de hemorragia pulmonar y de la pleura, traqueítis, bronquitis, bronquiolitis, y bronconeumonía.

[0195] Se recogieron hisopos de la tráquea de todos los animales después del estímulo en los días 1 – 14 para el aislamiento del virus.

[0196] Se evaluó la presencia o ausencia de antígenos víricos en los tejidos respiratorios mediante inmunohistoquímica en los días 3, 7 y 10 después del estímulo.

[0197] Se recogieron muestras de sangre en los días 7 y 14 después del estímulo y se analizaron para la presencia de anticuerpos específicos contra el virus H3N8 de la gripe.

[0198] Por medio de referencia, la descripción se describe adicionalmente mediante los siguientes párrafos 5 numerados:

Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso de una formulación que comprende un vector de expresión avipox que comprende un polinucleótido que codifica un antígeno de la gripe equina y un portador, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable en una cantidad eficaz para estimular una respuesta inmunoprotectora, en la fabricación de un medicamento para estimular una respuesta inmunoprotectora contra la gripe en un can;

en el que el vector de expresión avipox es un vector de expresión avipox atenuado, en el que el vector de expresión avipox es un vector del virus de la viruela del canario y en el que el vector del virus de la viruela del canario es ALVAC; y

en el que el antígeno de la gripe equina es una hemaglutinina en la que la hemaglutinina es H3.
2. Una formulación que comprende un vector de expresión avipox que comprende un polinucleótido que codifica un antígeno de la gripe canina y un portador, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable en una cantidad eficaz para estimular una respuesta inmunoprotectora, para uso en la estimulación de una respuesta inmunoprotectora contra la gripe en un can;

en el que el vector de expresión avipox es un vector de expresión avipox atenuado, en el que el vector de expresión es un vector del virus de la viruela del canario y en el que el vector del virus de la viruela del canario es ALVAC; y

en el que el antígeno de la gripe es una hemaglutinina en la que la hemaglutinina es H3.
3.

Uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la formulación de acuerdo con la reivindicación, en el que la formulación comprende además un adyuvante.
4.

Uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 3 o la formulación de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, en el que el antígeno de la gripe es un fragmento de la hemaglutinina.
5.

Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 o 4 o la formulación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que el antígeno de la gripe se aísla de un can infectado con gripe.
6.

Uso de acuerdo con la reivindicación 5 o la formulación de acuerdo con la reivindicación 5 en el que el antígeno de la gripe se aísla de un lavado bronquioalveolar o de tejido pulmonar del can infectado.
7.

Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 o 4 o la formulación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que el antígeno de la gripe se aísla de un aislado del virus de la gripe equina.
8.

Uso de acuerdo con la reivindicación 7 o la formulación de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el virus de la gripe equina se selecciona entre el grupo que consiste en un aislado del virus de la gripe equina de Ohio, un aislado del virus de la gripe equina de Kentucky, un aislado del virus de la gripe equina de Newmarket, o sus mezclas.
9.

Uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 3 o la formulación de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, en el que el vector del virus de la viruela del canario se selecciona entre el grupo que consiste en CP1529 o CP1533.
10.

Uso de una formulación que comprende una vacuna de la gripe inactivada y un vehículo farmacéuticamente aceptable en una cantidad eficaz para estimular una respuesta inmunoprotectora en un can, para la fabricación de un medicamento para estimular una respuesta inmunoprotectora contra la gripe en un can; en el que dicha vacuna de la gripe inactivada es una gripe equina inactivada de serotipo H3; en el que la vacuna de la gripe inactivada es un aislado de la gripe equina inactivada y en el que el aislado de la gripe equina se escoge entre el grupo que consiste en un aislado de la gripe equina de Ohio, un aislado de la gripe equina de Kentucky, un aislado de la gripe equina de Newmarket o sus mezclas.
11.

Una formulación que comprende una vacuna de la gripe inactivada y un vehículo farmacéuticamente aceptable en una cantidad eficaz para estimular una respuesta inmunoprotectora en un can, para uso en la estimulación de una respuesta inmunoprotectora contra la gripe en un can; en el que dicha vacuna de la gripe inactivada es una gripe equina inactivada de serotipo H3; en el que la vacuna de la gripe inactivada es un aislado de

la gripe equina inactivada y en el que el aislado de la gripe equina se escoge entre el grupo que consiste en un aislado de la gripe equina de Ohio, un aislado de la gripe equina de Kentucky, un aislado de la gripe equina de Newmarket o sus mezclas.

5 12. Uso de acuerdo con la reivindicación 10 o la formulación de acuerdo con la reivindicación 11, en el que la formulación comprende además un adyuvante.
13. Uso de acuerdo con la reivindicación 12 o la formulación de acuerdo con la reivindicación 12, en el

que el adyuvante es hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, un carbómero o una emulsión de aceite en agua y 10 que comprende opcionalmente además CpG.
14. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10, 12 o 13 de la formulación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que la vacuna de la gripe inactivada está inactivada con formalina o beta propiolactona.
15. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 o 12 a 14 o la formulación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 en el que el medicamente o la formulación se formula para la administración subcutánea o intramuscular.