BRPI0920622B1

BRPI0920622B1 - vacina contra o vírus da doença equina africana

Info

Publication number: BRPI0920622B1
Application number: BRPI0920622-1A
Authority: BR
Inventors: Jules Maarten Minke; Jean-Christophe Audonnet; Alan John Guthrie; Nigel James MacLachlan; Jiansheng Yao
Original assignee: Merial, Inc.; The Regents Of The University Of California; University Of Pretoria
Priority date: 2008-10-24
Filing date: 2009-10-22
Publication date: 2019-11-12
Also published as: ZA201103031B; US8168200B2; AP2011005954A0; AU2009308331C1; NZ598605A; PT2358742T; EP2358742B1; JP2012506699A; EP2358742A2; EA024111B1; WO2010048394A2; CA2741333A1; BR122019001455B1; US20120114691A1; EA201100674A1; CL2011000922A1; WO2010048394A3; PL2358742T3; US20140120133A1; KR20110092281A

Abstract

vacina contra o vírus da doença equina africana a presente invenção fornece vetores que contêm e expressam in vivo os genes que codificam vp2 e vps do vírus da doença equina africana ou um epítopo dos mesmos, que elicia · uma resposta imune em um cavalo contra o vírus da doença equina africana, composições compreendendo os ditos vetores, métodos de vacinação contra o vírus da doença equina africana, e kits para uso com tais métodos e composições.

Description

CONTRA O VÍRUS DA DOENÇA EQUINA AFRICANA .

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

Este pedido reivindica o benefício do pedido provisório americano N° de Série 61/108,075, depositado no dia 24 de outubro de 2008, e do pedido provisório americano N° de Série 61/163,517, depositado no dia 26 de março de 2009.

Os pedidos anteriores e todos os documentos citados nos mesmos ou durante os seus processamentos (documentos citados nos pedidos) e todos os documentos citados ou referências nos documentos citados nos pedidos, e todos os documentos citados ou referenciados neste documento (documentos citado aqui), e todos os documentos citados ou referenciados nos documentos aqui citados, juntamente com quaisquer instruções, descrições, especificações de produto e folhetos de produtos do fabricante para qualquer um dos produtos mencionados aqui ou em qualquer documento incorporado por referência neste documento, são por meio deste documento incorporados por referência, podendo ser empregados na prática da invenção.

CAMPO DA INVENÇÃO . A presente invenção se refere à vacinação de um indivíduo contra o Vírus da Doença Equina Africana (AHSV).

Em particular, a invenção diz respeito a construção e utilização de vetores recombinantes contendo e expressando, em um hospedeiro, uma ou mais proteínas imunogênicas do Vírus da Doença Equina Africana. A invenção ainda se refere a composições imunológicas ou vacinas que induzem uma resposta imune direcionada ao Vírus da Doença Equina Africana. A invenção ainda se refere a tais composições ou vacinas que conferem imunidade protetora contra infecção pelo Vírus da Doença Equina Africana.

Várias publicações são referenciadas neste pedido. A citação integral a estes documentos é encontrada no final do relatório descritivo, precedendo as reivindicações, e/ou onde o documento é citado. Estes documentos pertencem ao campo da presente invenção e cada um dos documentos citados ou referenciados neste pedido (documentos aqui citados), e cada documento citado ou referenciado nos documentos aqui citados, são por meio deste documento incorporados aqui por referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A Doença Equina Africana (AHS) é uma doença viral transmitida por artrópodes, grave e frequentemente fatal, de cavalos e mulas (African Horse Sickness, The Merck Veterinary Manual). A taxa de mortalidade pode ser tão alta quanto 95% em algumas formas desta doença. Infecções assintomáticas ou brandas podem ocorrer em cavalos, be como em zebras e burros, especialmente em cavalos que foram anteriormente infectados com um sorotipo diferente do vírus. Os animais infectados ou vetores podem conduzir o vírus para regiões livres de AHS. Alguns autores especulam que a mudança climática podería aumentar o risco de propagação de doenças transmitidas por artrópodes, como a Doença Equina Africana, tal como recentemente aconteceu com o vírus da língua azul relacionado (Wilson A e col. , Parasito!. Res. 2008;103:69-77). Culicoides imicola, o principal vetor desta doença, fez incursões no Norte da África e sul da Europa. Vetores artrópodes potenciais também existem em virtualmente todas as regiões do mundo, incluindo grande parte dos Estados Unidos e no restante das Américas.

A Doença Equina Africana resulta de infecção com o vírus da Doença Equina Africana, um membro do genero Orbivirus, na família Reoviridae. Até o momento, 9 sorotipos do Vírus da Doença Equina Africana são conhecidos. O sorotipo 9 do Vírus da Doença Equina Africana é difundido em regiões endêmicas, enquanto que os sorotipos 1 a 8 são encontrados principalmente em áreas geográficas limitadas. O sorotipo 9 foi responsável pela maioria dos surtos de Doença Equina Africana fora da África. O sorotipo causou um surto na Espanha e em Portugal entre 1987 e 1990 (Lubroth J., Equine Pract. 1988;10:26-33).

Pesquisa inicial com o Vírus da Doença Equina Africana resultou no desenvolvimento da vacina do vírus vivo modificado atenuado no cérebro de camundongo para o Vírus da Doença Equina Africana na década de 1930. Essas vacinas foram refinadas e resultaram no desenvolvimento de uma vacina de vírus vivo modificado (MLV) atenuado em cultura de tecido na década de 1960.

Apesar da eficácia desta vacina, ela tem algumas limitações inerentes, incluindo reações vacinais (incluindo morte) em animais individuais, resposta imune variada em animais individuais, dificuldade em imunizar os animais jovens com imunidade materna passiva, possibilidade de reversão à virulência do vírus da vacina e recombinação das cepas da vacina após a vacinação com possível reversão à virulência (du Plessis M. e col. 1998, Onderstepoort Journal of Veterinary Research 65: 321-329). Também existem implicações socioeconômicas com o uso da vacina MLV. A África do Sul tem um protocolo que permite a exportação de cavalos para a União Européia e uma série de outros países. Este protocolo também permite que os cavalos de outros países entrem na África do Sul para competir em vários eventos ou fiquem em haras por um período temporário. O protocolo se baseia em assegurar que os cavalos estejam adequadamente vacinados contra o Vírus da Doença Equina Africana. As autoridades veterinárias estão cientes dos possíveis perigos de usar a vacina MLV. A maioria desses problemas seria extremamente reduzida pelo desenvolvimento de vacinas alternativas do Vírus da Doença Equina Africana.

genoma do Vírus da Doença Equina Africana é composto de dez segmentos de RNA de fita dupla (Oellermann, R.A. e col., 1970; Bremer, C.W. e col., 1976) que codificam pelo menos dez proteínas virais. Os segmentos do genoma são numerados de 1 a 10, na ordem da migração destes em PAGE. Sete das proteínas virais são estruturais e formam a partícula viral de dupla camada. O capsídeo externo é composto por duas proteínas virais principais, VP2 e VP5, que determinam a variabilidade antigênica do vírus da Doença Equina Africana, enquanto que o capsídeo interno é compreendido por duas proteínas virais principais (VP3 e VP7) e três secundárias (VP1, VP4 e VP6) (Lewis SA e Grubman MJ, 1991); Martinez-Torrecuadrada JL e col., 1994); Bremer, CW, e col. 1990; Grubman, M. J. & Lewis, S. A., 1992) . VP3 e VP7 são altamente conservadas entre os nove sorotipos (Oellermann e col., 1970; Bremer e col., 1990). Pelo menos três proteínas não estruturais NS1, NS2 e NS3 foram identificadas (Huismans, H. & Els, H. J. , 1979); van

Staden, V. & Huismans, H., 1991); Mizukoshi, N. e col. , 1992) .

Vírus canaripox recombinantes derivados de virus atenuados foram desenvolvidos como vetores para a expressão 5 de genes virais heterólogos. Várias destas construções de canaripox foram, desde então, licenciadas como vacinas em muitos parses, incluindo África do Sul, a União Européia e os Estados Unidos da América, para uso em cavalos (Minke JM, e col., 2004a e b; Minke JM, e col. , 2007; Siger L, e 10 col. 2006) e outras espécies (Poulet H, e col., 2003).

O fato de que essas vacinas contêm apenas genes do organismo de interesse as torna inerentemente seguras (Minke JM, e col., 2004b). Além disso, o aparecimento de anticorpos neutralizantes detectáveis é rápido, mesmo após 15 uma única dose de vacina (Minke JM e col., 2004b) . A segurança inerente de tais vacinas e a natureza do desenvolvimento de anticorpos neutralizantes tornam tais vacinas particularmente atraentes para uso em epizoóticos (Minke JM e col., 2004a).

Estudos anteriores demonstraram que os cavalos desenvolvem anticorpos neutralizantes para AHS quando são inoculados com VP2 exogenamente expressa e um adjuvants apropriado (Scanlen M, e col., 2002). Estudos em carneiros demonstraram que a resposta de anticorpos neutralizantes ao vírus da lingua azul é reforçada pela inoculação de carneiros com partículas tipo virais em que VP2 e VP5 são co-expressas (Pearson LD, Roy P, 1993) . Uma vacina de vírus canaripox recombinante coexpressando os genes que codificam as proteínas do capsídeo externo VP2 e VP5 do vírus da língua azul mostrou recentemente induzir altos níveis de proteção em carneiros (Boone JD, e col., 2007).

Não tem sido demonstrado que os cavalos desenvolvem anticorpos neutralizantes para o Vírus da Doença Equina Africana quando inoculados com um vetor contendo e coexpressando VP2 e VP5 do AHSV. Assim, pode-se afirmar que a presente invenção atende uma necessidade na técnica, fornecendo um poxvirus recombinante, incluindo composições e produtos do mesmo, particularmente recombinantes e composições à base de ALVAC e produtos do mesmo, especialmente tais recombinantes expressando VPs 2 e 5 de AHSV ou qualquer combinação destas e composições e produtos provenientes destas.

Citação ou identificação de qualquer documento neste pedido não constitui uma admissão de que tal documento esteja disponível como estado da técnica para a presente invenção.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um objeto desta invenção pode ser qualquer um ou todos OS vetores recombinantes ou virus fornecidos, bem como métodos para fazer tais vetores ou virus recombinantes, e o fornecimento de composições e/ou vacinas, bem como métodos para o tratamento e profilaxia de infecção pelo Vírus da Doença Equina Africana.

A invenção fornece um vetor recombinante, tal como um vírus recombinante, por exemplo, um poxvirus recombinante, que compreende e expressa pelo menos uma molécula de ácido nucleico exóqeno, em que pelo menos uma molécula de ácido nucléico exóqeno pode compreender uma molécula de ácido nucléico que codifica um imunógeno ou epítopo de interesse a partir de um Vírus da Doença Equina Africana, especialmente uma proteína viral ou parte da mesma de um Vírus da Doença Equina Africana.

A presente invenção também fornece vetores recombinantes em que a cepa do Vírus da Doença Equina Africana é 1, 2, 4 ou 9.

A invenção também fornece composições imunológicas (ou imunogênicas) ou vacinas compreendendo tal vírus ou o(s) produto(s) de expressão de tal vírus.

A invenção ainda fornece métodos para a indução de uma resposta imunológica (ou imunogênica) ou protetora contra o Vírus da Doença Equina Africana, bem como métodos para prevenir ou tratar o Vírus da Doença Equina Africana ou estado (s) de doença causados pelo vírus da Doença Equina Africana, compreendendo a administração do virus ou de um produto de expressão do vírus, ou uma composição compreendendo o vírus, ou uma composição que compreende um produto de expressão do vírus.

A invenção também compreende produtos de expressão do virus, bem como anticorpos gerados a partir dos produtos de expressão ou da expressão destes in vivo e a utilização de tais produtos e anticorpos, por exemplo, em aplicações de diagnóstico.

A invenção ainda fornece polipeptídeos VP2 e VP5 de AHSV e polinucleotídeos que codificam polipeptídeos VP2 e VP5 de AHSV. A invenção também fornece uma nova cepa de AHS

AHSV4-Jane.

Estas e outras modalidades são descritas, ou são óbvias a partir de e englobadas pela seguinte Descrição Detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A seguinte descrição detalhada, dada a título de exemplo, mas sem intenção de limitar a invenção exclusivamente às modalidades especificas descritas, pode ser melhor compreendida em conjunto com os desenhos associados, em que:

Figura 1 fornece o esquema de construção para pLHD3460.4, o plasmideo doador C3 para a geração de um recombinante ALVAC expressando proteínas AHSV-4-VP2 sintéticas (SEQ ID NO:1) e proteínas AHSV-4-VP5 sintéticas (SEQ ID NO:2).

Figura 2 fornece o mapa e SEQ ID NOs relevantes para pLHD3460.4 (pC3 H6p AHSV-4-VP2/42Kp sintética AHSV-4-VP5 sintética). pLHD3460.4 = SEQ ID NO:6; DNA de AHSV-4 VP2 (pLHD3460.4)-SEQ ID NO:4; DNA de AHSV-4 VP5 (pLHD3460.4)SEQ ID NO:5; Seq. AA prevista para AHSV-4 VP2 PRT (pLHD3460.4)-SEQ ID NO:1; Seq. AA prevista para AHSV-4 VP5 PRT (pLHD3460.4) = SEQ ID NO:2.

Figura 3 fornece um esquema de recombinação in vitro para VCP2377 (ALVAC C3 H6p AHSV-4-VP2 sintético/ AHSV-4-VP5 42Kp sintético).

Figura 4 fornece um gel de enzima de restrição teórico para o DNA genômico criado no vetor NTI.

Figura 5 fornece os resultados de eletroforese em gel de agarose 0,8% da extração de DNA genômico do estoque de P3 a partir de vCP2377.6.1.1, seguido por digestão com BamHI, HindIII e PstI.

Figura 6 fornece a análise de Southern Blot de vCP2377.6.1.1 utilizando uma sonda AHSV-4-VP2.

Figura 7 fornece resultados de Western blot da análise de vCP2377 recombinante indicando a expressão da proteína AHSV-4-VP5.

Figura 8 fornece os resultados de imuno-plaqueamento indicando 100% de homogeneidade da população vCP2377.6.1.1 usando o mAb anti-AHSV VP5 10AE12 passagem 9 de camundongo em uma diluição de 1:100.

Figura 9 fornece um mapa dos iniciadores utilizados para amplificar o fragmento de inserção-C3L de C3R-AHSV e as SEQ ID referências para as sequências vCP2377.6.1.1 recombinantes (SEQ ID NOs:17-21).

Figura 10 mostra o esquema de construção para pCXL2415.1 (SEQ ID NO:22), o plasmídeo doador C3 para a geração de um ALVAC recombinante expressando as proteínas AHSV9-VP2 (SEQ ID NO:20) e AHSV9-VP5 (SEQ ID NO:21).

Figura 11 fornece o mapa e as SEQ ID NOs relevantes (18-21) para pCXL2415.1 (pALVAC 03 AHSV-9 H6 VP2 42K VP5).

Figura 12 fornece o esquema de recombinação in vitro para vCP2383 (ALVAC 03 H6-VP2 AHSV9 VP2 sintética/ AHSV9 VP5 42K sintética).

Figura 13 fornece um gel de enzima de restrição teórico para o DNA genômico criado no Vetor NTI.

Figura 14 fornece os resultados de eletroforese em gel de agarose 0,8% da extração de DNA genômico de vCP2383.3.1.1.1 e vCP2383.9.1.1.1, digeridos com BamH I, Hindlll ou Xbal.

Figura 15 fornece a análise de Southern blot de vCP2383 utilizando uma sonda AHSV-4 VP5.

Figura 16 fornece os resultados de Western blot da análise de vCP2383 recombinante indicando a expressão da proteína AHSV9 VP5.

Figura 17 fornece os resultados de imunoplaqueamento indicando 100% de homogeneidade da população VCP2383.3.1.1.1 usando mAb anti-AHSV VP5 10AE12 passagem 9 de camundongo a uma diluição de 1:100.

Figura 18 fornece um mapa dos iniciadores utilizados para amplificar todo o fragmento C3L-H6 AHSV9 VP2-42K AHSV9 VP5-C3R e as SEQ ID NOs relevantes (27-31) para as sequências vCP2383 recombinantes.

Figura 19 fornece os resultados de imunofluorescência de IFI anti-VP2 e anti-VP5 a partir de células CEF infectadas.

Figura 20A e B mostra os resultados de western blot com CEF infectadas e transfectadas usando anti-VP2 (A) e anti-VP5 (B).

Figura 21 fornece os resultados do teste de neutralização do vírus-soro contra AHSV-4 para 6 cavalos que foram vacinados usando cpAHSV-4 (vCP2377). Os resultados são mostrados para os dias 0, 28 e 42.

Figura 22 mostra o esquema de construção para pJSY2247.2, o plasmídeo doador C3 para a geração de um

ALVAC recombinante expressando as proteínas VP2 e VP5 de AHSV5.

Figura 23 fornece o mapa e as SEQ ID NOs relevantes para as sequências pJSY2247.2 (pALVAC C3 AHSV5 H6 VP2 42K VP5) .

]_q Figura 24 fornece o esquema de recombinação in vitro para VCP2398 (ALVAC C3 H6 AHSV5 VP2 sintética/ AHSV5 VP5 42K-sitética).

Figura 25 fornece um gel de enzima de restrição teórico para o DNA vCP2398 genômico que foi criado no Vetor

NTI.

Figura 26 fornece um resultado de eletroforese em gel de agarose a 0,8% de extração de DNA genômico a partir de vCP2398.2.1.1 e 3.1.1, digerido com BamHI, HindIII ou PstI.

Figura 27 fornece a análise de Southern blot de vCP2398 usando uma sonda AHSV5 VP2 específica.

Figura 28 fornece resultados de Western blot da análise de vCP2398 recombinante indicando a expressão da proteína VP5 de AHSV5.

Figura 29 fornece os resultados de imunoplaqueamento indicando 100% de homogeneidade da população de vCP2383.2.1.1 usando o mAb anti-AHSV VP5 Passagem 10AE12 de camundongo em uma diluição de 1:100.

Figura 30 fornece um mapa dos iniciadores utilizados para amplificar todo o fragmento C3L-H6 AHSV5 VP2-42K AHSV5 VP5-C3R para o vCP2398 recombinante.

Figura 31 fornece 3 painéis com resultados de desafio de AHSV de 8 vacinados com vCP2377 (em parte definidos pela SEQ ID NO:17) e um cavalo controle imunizado com EIV-CP.

Painel A: Limiar do ciclo de qRT-PCR's para os genes que codificam as proteínas NS2 e VP7 de AHSV (média do perfil NS2 e VP7 mostrada) . A presença de AHSV no sangue do cavalo foi determinada por ensaios de qRT-PCR que detectam os genes individuais que codificam as proteínas VP7 e NS2 de AHSV com amostras sendo classificadas como positivas, se a fluorescência excedeu o limiar de 0,1 em um máximo de 40 ciclos.

Painel B: Temperatura corporal, IDEM

Painel C: Contagem de plaquetas de 8 vacinados com vCP2377 e um cavalo controle não vacinado, após o desafio com uma cepa de campo virulento do sorotipo 4 de AHSV.IDEM

Figura 32 fornece um gráfico que resume as SEQ ID NOs presentes na listagem de sequências.

Figura 33 fornece um alinhamento ClustalW de proteínas VP2 de AHSV-4/5/9 (SEQ ID NOs: 1, 44, 30).

Figura 34 fornece um alinhamento ClustalW de proteínas VP5 de AHSV-4/5/9 (SEQ ID NOs: 2, 45, 31).

Figura 35 fornece um alinhamento ClustalW de proteína VP2 de AHSV-4 sintética (SEQ ID NO:1) versus a cepa Jane de AHSV4 isolada em campo (SEQ ID NO:49). A identidade percentual também é indicada.

Figura 36 fornece um alinhamento ClustalW de proteína VP5 de AHSV-4 sintética (SEQ ID NO:2) versus a cepa Jane de AHSV4 isolada em campo (SEQ ID NO:51). A identidade percentual também é indicada.

Figura 37 fornece um alinhamento ClustalW de proteína VP2 de AHSV-4 sintética (SEQ ID N0:l) versus mútiplas proteínas AHSV-4-VP2 depositadas (SEQ ID NOs:59-63). A tabela de porcentagem de identidade é fornecida.

Figura 38 fornece um alinhamento ClustalW de proteína VP5 de AHSV-4 sintética (SEQ ID NO:2) versus múltiplas proteínas AHSV-4-VP5 depositadas (SEQ ID NOs:52-58). Tabela de porcentagem de identidade é fornecida.

Figura 39 fornece um alinhamento ClustalW de AHSV4-VP2 códon-otimizada (SEQ ID No:4) versus AHSV4-VP2 isolada de campo (SEQ ID NO:48). Identidade percentual é fornecida.

Figura 40 fornece um alinhamento ClustalW da AHSV4 VP5 códon-otimizada (SEQ ID NO:05) versus a AHSV4-VP5 isolada de campo (SEQ ID NO:50). Identidade percentual é fornecida.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Observa-se que nesta divulgação e, particularmente, nas reivindicações e/ou parágrafos, termos como compreende, compreendido, compreendendo e similares podem ter o significado atribuído a eles na lei de patente americana; por exemplo, eles podem significar inclui , incluído, incluindo e similares; e os termos como consistindo essencialmente de e consiste essencialmente de têm o significado atribuído a eles na lei de patentes americana, por exemplo, eles permitem elementos não explicitamente citados, mas excluem os elementos que são encontrados no estado da técnica ou que afetam uma característica básica ou nova da invenção.

Salvo disposição em contrário, os termos técnicos são utilizados de acordo com o uso convencional. As definições de termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas em Benjamin Lewin, Genes V. publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew e col. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-63202182-9); e Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and

Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

Os termos singulares um, uma e o incluem referências no plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Da mesma forma, a palavra ou destina-se a incluir e a menos que o contexto indique claramente o contrário. A palavra ou significa qualquer membro de uma lista particular e também inclui qualquer combinação dos membros daquela lista.

As espécies ou indivíduo (hospedeiro) alvo incluem animais e humanos. 0 animal, conforme usado neste documento, pode ser selecionado do grupo consistindo de equinos (por exemplo, cavalos), caninos (por exemplo, cães, lobos, raposas, coiotes, chacais),· felinos (por exemplo, leões, tigres, gatos domésticos, gatos selvagens, outros grandes felinos, e outros felinos incluindo chitas e linces), ovinos (por exemplo, carneiros), bovinos (por exemplo, gado), suínos (por exemplo, porcos), aves (por exemplo, galinhas, patos, gansos, perus, codornas, faisões, papagaios, tentilhões, falcões, corvos, emas, avestruzes e casuares), primatas (por exemplo, prossímios, társios, macacos, gibões, bugios) e peixes. O termo animal também inclui um animal individual em todos os estágios de desenvolvimento, incluindo os estágios embrionários e fetais.

Os termos polipeptídeo e proteína são aqui usados intercambiavelmente para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos consecutivos.

O termo ácido nucléico, nucleotideo e polinucleotídeo se refere ao RNA ou DNA e seus derivados, como os que contêm estruturas modificadas. Deve-se perceber que a invenção fornece polinucleotídeos compreendendo sequências complementares àquelas aqui descritas. Polinucleotídeos de acordo com a invenção podem ser preparados de diferentes formas (por exemplo, por síntese química, por clonagem de genes, etc.) e podem assumir diversas formas (por exemplo, lineares ou ramificadas, de fita simples ou dupla, ou um híbrido das mesmas, iniciadores, sondas, etc.).

O termo gene é amplamente utilizado para se referir a qualquer segmento de polinucleotídeo associado com uma função biológica. Assim, genes ou polinucleotídeos incluem introns e éxons como na seqüência do genoma, ou apenas as sequências codificadoras como em cDNAs, como uma estrutura de leitura aberta (ORF), iniciando a partir do códon de iniciação (códon de metionina) e terminando com um sinal de finalização (códon de parada). Genes e polinucleotídeos podem também incluir as regiões que regulam as suas expressões, como iniciação da transcrição, tradução e finalização promotores da transcrição. Assim, também são incluídos os regiões de ligação do ribossomo (em geral, esses elementos regulatórios ficam aproximadamente entre 60

250 nucleotídeos montante do códon de da seqüência codificadora ou gene; Doree S M e col.; Pandher K e col.; Chung J Y e col.), finalizadores de transcrição (em geral o finalizador está localizado em aproximadamente 50 nucleotídeos à jusante do códon de parada da seqüência codificadora ou gene;

Ward C

Gene ou polinucleotideo também se refere a um fragmento de ácido nucleico que expressa o

RNAm ou RNA funcional, ou codifica uma proteína específica, que inclui sequências regulatórias.

O termo polipeptideo imunogênico ou fragmento imunogênico, como aqui utilizado, refere a um polipeptideo ou um fragmento de um polipeptideo que compreende uma porção aleloespecífica, um epítopo ou outra seqüência, de modo que o polipeptideo ou o fragmento se ligará a uma molécula de MHC e induzirá uma resposta de linfócito T citotóxico (CTL), e/ou uma resposta de célula

B (por exemplo, produção de anticorpos), e/ou resposta de linfócitos T-auxiliadores, e/ou uma resposta de hipersensibilidade tipo tardia (DTH) contra o antigeno do qual o polipeptideo imunogênico ou fragmento imunogênico é derivado. Uma resposta DTH é uma reação imune em que a ativação do macrófago dependente de célula Tea mflamaçao causam lesão tecidual. Uma reação DTH para a injeção subcutânea do antigeno é frequentemente utilizada como um ensaio para imunidade mediada por célula.

Por definição, um epitopo é um determinante antigênico que é imunologicamente ativo no sentido de que, uma vez administrado ao hospedeiro, ele é capaz de evocar uma resposta imune do tipo humoral (células B) e/ou tipo celular (células T). Estes são grupos químicos particulares ou sequências de peptídeos em uma molécula que são antigênicos. Um anticorpo se liga especificamente a um epitopo antigênico particular em um polipeptideo. Exemplos não limitadores específicos de um epitopo incluem uma seqüência de tetra a pentapeptídeo em um polipeptideo, uma sequência de tri a pentaglicosídeo em um polissacarídeo. No animal, mais antigenos vão apresentar alguns ou até mesmo muitos determinantes antigênicos simultaneamente. Tal polipeptideo pode ser também qualificado como um polipeptideo imunogênico e o epitopo pode ser identificado conforme descrito adicionalmente.

O termo purificado, conforme usado aqui, não necessita de pureza absoluta; antes, ele se destina como um termo relativo. Assim, por exemplo, uma preparação de polipeptideo purificada é uma em que o polipeptideo é mais enriquecido do que o polipeptideo em seu ambiente natural. Uma preparação de polipeptideo é substancialmente purificadade de tal forma que o polipeptideo represente diversas modalidades a pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos, 95%, ou pelo menos 98% do conteúdo de polipeptideo total da preparação. 0 mesmo se aplica aos polinucleotideos. Os polipeptideos divulgados aqui podem ser purificados por qualquer um dos meios conhecidos na técnica.

Um polinucleotideo recombinante é aquele que tem uma sequência que não é de ocorrência natural ou tem uma seqüência que é feita por uma combinação artificial de dois outros segmentos separados da seqüência. Esta combinação artificial é frequentemente realizada por síntese química ou, mais comumente, por meio da manipulação artificial dos segmentos isolados de ácidos nucleicos, por exemplo, através de técnicas de engenharia genética. Em uma modalidade, um polinucleotideo recombinante codifica uma proteína de fusão.

Em um aspecto, a presente invenção fornece polipeptídeos do Virus da Doença Equina Africana. Em outro aspecto, a presente invenção fornece um polipeptídeo tendo uma seqüência conforme estabelecida na SEQ ID NO: 1, 2, 20, 21, 30, 31, 35, 36, 44, 45, 49, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62 ou 63, e variante ou fragmento da mesma.

Como usado aqui, o termo proteína do Vírus da Doença Equina Africana ou polipeptídeo do Vírus da Doença Equina

Africana (AHSV VP) pode incluir	VP1,	VP2, VP3,	VP4, NS1,
VP5, VP6, VP7, NS2, NS3	de	AHSV	e	seus	homólogos,
fragmentos e variantes.
Homólogos de proteínas	virais	do	vírus	da Doença

Equina Africana se destinam a estarem dentro do escopo da presente invenção. Como usado aqui, o termo homólogos inclui ortólogos, análogos e parálogos. 0 termo análogos se refere a dois polinucleotídeos ou polipeptídeos que têm função igual ou similar, mas que evoluíram separadamente em organismos não-relacionados. O termo ortólogos se refere a dois polipeptídeos ou polinucleotídeos de diferentes espécies, mas que evoluíram a partir de um gene ancestral comum por especiação. Normalmente, ortólogos codificam polipeptídeos tendo funções iguais ou semelhantes. 0 termo parálogos se refere a dois polipeptídeos ou polinucleotídeos que são relacionados pela duplicação em um genoma. Parálogos geralmente têm funções diferentes, mas essas funções podem ser relacionadas. Análogos, ortólogos e parálogos de um polipeptideo do vírus da Doença Equina Africana tipo selvagem podem diferir do polipeptideo do Vírus da Doença Equina Africana tipo selvagem por modificações pós-traducionais, por diferenças na sequência de aminoácidos, ou por ambos. Em particular, os homólogos da invenção irão geralmente exibir pelo menos 80-85%, 8590%, 90-95% ou 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência, com toda ou parte das sequências de polipeptideo ou polinucleotídeo do vírus da Doença Equina Africana tipo selvagem, e irão apresentar uma função semelhante.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma AHSV VP tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80-s, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência com um polipeptideo tendo uma sequência conforme estabelecida em SEQ ID NO. 1, 2, 20, 21, 30, 31, 35, 36, 44, 45, 49, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61-, 62 ou 63.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece fragmentos e variantes das AHSV VPs acima identificadas (SEQ ID NO: 1, 2, 20, 21, 30, 31, 35, 36, 44, 45, 49, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62 ou 63) que podem ser prontamente preparados por uma pessoa versada na técnica usando técnicas de biologia molecular bem conhecidas.

Variantes são AHSV VPs homólogas, tendo uma següência de aminoácidos de pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95-s, 96-s,

97%,	98%	ou	99% de identidade com a seqüência	de
aminoácidos	conforme estabelecido em SEQ ID NO: 1,	2,	20,
21,	30, 31,	35,	36, 44, 45, 49, 50, 51, 52, 53, 54,	55,	56,
57,	58, 59,	60,	61, 62 ou 63.
	Variantes	incluem variantes alélicas. 0	termo

variante alélica” se refere a um polinucleotídeo ou um polipeptideo contendo polimorfismos que levam a mudanças nas sequências de aminoácidos de uma proteína e que existem em uma população natural (por exemplo, uma espécie ou variedade de vírus). Tais variações alélicas naturais podem tipicamente resultar em 1 a 5% de variância em um polinucleotídeo ou um polipeptideo. Variantes alélicas podem ser identificadas por sequenciamento da seqüência de ácido nucleico de interesse em uma variedade de espécies diferentes, que podem ser prontamente efetuado pelo uso de sondas de hibridação para identificar o mesmo locus genético do gene naquelas espécies. Quaisquer e todas as tais variações de ácido nucleico e polimorfismos ou variações de aminoácidos resultantes que são o resultado da variação alélica natural e que não alteram a atividade funcional do gene de interesse, pretendem estar dentro do escopo da invenção.

Uma variante é qualquer polipeptideo do vírus da Doença Equina Africana, capaz de induzir em animais, tais como equinos, vacinados com este polipeptideo, uma resposta imune de base celular específica caracterizada pela secreção de interferon gama (IFN-gama) mediante estimulação pelo Vírus da Doença Equina Africana. Tal secreção de IFNgama pode ser demonstrada através de metodologia in vitro (isto é, imunoensaio QUANTIKINE® de R&D Systems Inc. (número do catálogo #CAIFOO); Djoba Siawaya JF e col.).

Conforme aqui utilizado, o termo “derivado ou “variante se refere a um polipeptideo, ou um ácido nucleico que codifica um polipeptideo, que tem uma ou mais variações conservadoras de aminoácidos ou outras modificações menores de modo que (1) o polipeptideo correspondente tenha função substancialmente equivalente quando comparado com o polipeptideo tipo selvagem ou (2) um anticorpo suscitado contra o polipeptideo seja imunorreativo com o polipeptideo tipo selvagem. Essas variantes ou derivados incluem polipeptídeos tendo modificações menores das sequências de aminoácidos primárias do polipeptideo do vírus da Doença Equina Africana, que podem resultar em peptídeos que têm atividade substancialmente equivalente em comparação com o polipeptideo correspondente não modificado. Tais modificações podem ser deliberadas, como por mutagênese sitio-direcionada, ou podem ser espontâneas. 0 termo variante contempla ainda eliminações, adições e substituições à seqüência, contanto que o polipeptideo funcione para produzir uma resposta imunológica conforme aqui definido.

Um fragmento imunogênico do polipeptideo do vírus da Doença Equina Africana inclui pelo menos 8, 10, 15 ou 20 aminoácidos consecutivos, pelo menos 21 aminoácidos, pelo menos 23 aminoácidos, pelo menos 25 aminoácidos ou pelo menos 30 aminoácidos de um polipeptideo do vírus da Doença Equina Africana tendo uma sequência conforme estabelecida em SEQ ID NO: 1, 2, 20, 21, 30, 31, 35, 36, 44, 45, 49, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 ou variantes das mesmas. Em outra modalidade, um fragmento de um vírus da Doença Equina Africana inclui um epitopo antigênico específico encontrado em um polipeptideo do vírus da Doença Equina Africana de comprimento total.

Procedimentos para determinar fragmentos de polipeptideo e epitopo, tais como geração de bibliotecas de peptídeos que se sobrepõem, (Hemmer B. e coi.J, Pepscan (Geysen Η. M. e col. , 1984; Geysen Η. M. e col., 1985; Van der Zee R. e col.; Geysen Η. M. ) e algoritmos (De Groot A. e col.; Hoop T. e col.; Parker K. e col.), podem ser usados na prática da invenção, sem experimentação indevida. Geralmente, anticorpos se ligam especificamente a um epitopo antigênico particular. Exemplos específicos não limitantes de epítopos incluem uma sequência de tetra a pentapeptídeo em um polipeptídeo, uma sequência de tri a pentaglicosídeo em um polissacarídeo. Em animais, a maioria dos antígenos apresentará vários ou mesmo muitos determinantes antigênicos simultaneamente. Preferivelmente, onde o epitopo é um fragmento de proteína de uma molécula maior, ele terá substancialmente a mesma atividade imunológica que a proteína total.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um polinucleot í deo que codifica uma VP de AHSV, como um polinucleotídeo que codifica uma VP de AHSV tendo uma seqüência conforme estabelecida em SEQ ID NO: 1, 2, 20, 21, 30, 31, 35, 36, 44, 45, 49, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63. Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo pelo menos 70%, pelo menos 75-s, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com um polipeptídeo tendo uma seqüência conforme estabelecida em

SEQ ID NO: 1, 2, 20, 21, 30, 31, 35, 36, 44, 45, 49, 51, 52, 53, 54, 55/ 56/ 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 ou uma variante conservadora, uma variante alélica, um homólogo ou um fragmento imunogênico compreendendo pelo menos oito ou pelo menos dez aminoácidos consecutivos de um desses polipeptideos, ou uma combinação destes polipeptideos.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um polinucleotideo que tem uma seqüência de nucleotideos conforme estabelecida em SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 17, 18, 19, 22, 27, 28, 29, 32, 33, 34, 41, 42, 43, 48, 50 ou uma variante das mesmas. Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um polinucleotideo que tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência com um polinucleotideo com uma seqüência conforme estabelecida na SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 17, 18, 19, 22, 27, 28, 29, 32, 33, 34, 41, 42, 43, 48, 50 ou uma variante das mesmas.

Estes polinucleotideos podem incluir sequências de DNA, cDNA e RNA que codificam uma VP de AHSV. Entende-se que todos os polinucleotideos codificando um polipeptídeo do vírus da Doença Equina Africana também estão incluídos aqui, contanto que eles codifiquem um polipeptídeo com atividade reconhecida, como a ligação a um anticorpo que reconhece o polipeptideo, a indução de uma resposta imune ao polipeptideo, ou um efeito sobre a sobrevivência da Doença Equina Africana quando administrados a um indivíduo exposto ao vírus da Doença Equina Africana ou que sofre uma diminuição de um sinal ou sintoma de doença Equina Africana.

Os polinucleotídeos da divulgação incluem sequências que são degeneradas, como resultado do código genético, por exemplo, utilização códon otimizada para um hospedeiro específico. Conforme utilizado aqui, otimizado se refere a um polinucleotídeo que é geneticamente modificado para aumentar sua expressão num dada espécie. Para fornecer polinucleotídeos otimizados que codificam polipeptídeos da Doença Equina Africana, a seqüência de DNA do gene da proteína do vírus da Doença Equina Africana pode ser modificada para: 1) compreender códons preferidos por genes altamente expressos em uma determinada espécie, 2) compreender um teor de A+T ou G+C na composição base de nucleotídeo comparado àquele substancialmente encontrado na dita espécie; 3) formar uma sequência de iniciação das ditas espécies; ou 4) eliminar sequências que causam desestabilização, poliadenilação inapropriada, degradação e finalização de RNA, ou que formam grampos de estrutura secundária ou sítios de união de RNA. A expressão aumentada de proteína da Doença Equina Africana nas ditas espécies pode ser alcançada utilizando a frequência de distribuição de uso de códon em eucariotos e procariotos, ou em uma espécie particular. O termo frequência do uso de códon preferido se refere à preferência exibida por uma célula hospedeira específica no uso dos códons de nucleotídeo para especificar um dado aminoácido. Existem 20 aminoácidos naturais, a maior parte deles sendo especificada por mais de um códon. Portanto, todas as sequências nucleotídicas degeneradas estão incluídas na divulgação, contanto que a sequência de aminoácidos do polipeptideo do virus da Doença Equina Africana codificado pela seqüência de nucleotideos seja funcionalmente inalterada.

A identidade de seqüência entre duas sequências de aminoácidos pode ser estabelecida pelas matrizes blast emparelhada e blosum62 do NCBI (National Center for Biotechnology Information), usando os parâmetros padrão (ver, por exemplo, o algoritmo BLAST ou BLASTX disponível no servidor do National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, Md., EUA), bem . como em Altschul e col.; e deste modo, este documento fala do uso do algoritmo ou da matriz BLAST ou BLASTX e BLOSUM62 pelo termo blasts).

A identidade de sequência entre duas sequências de nucleotideos também pode ser determinada usando o programa Align de Myers e Miller (Optimal Alignments in Linear Space, CABIOS 4, 11-17, 1988) e disponível no NCBI, bem como o mesmo ou outros programas disponíveis via Internet nos seus sítios, como o sitio do NCBI.

Alternativamente ou adicionalmente, o termo identidade, por exemplo, com relação a uma sequência de nucleotídeo ou aminoácido, pode indicar uma medida quantitativa da homologia entre duas sequências. A homologia de seqüência percentual pode ser calculada como: (Nref - Naif) *100/N_ref, em que N_dif é o número total de resíduos não-idênticos nas duas sequências quando alinhadas e em que N_ref é o número de resíduos em uma das sequências. Assim, a seqüência de DNA AGTCAGTC terá uma identidade de seqüência de 7 5% com a seqüência AATCAATC (N_ref = 8; N_dif = 2) .

Alternativamente ou adicionalmente, identidade com relação às sequências pode se referir ao número de posições com nucleotideos ou aminoácidos idênticos dividido pelo número de nucleotideos ou aminoácidos na mais curta das duas sequências, em que o alinhamento das duas sequências pode ser determinado de acordo com o algoritmo de Wilbur e Lipman (Wilbur e Lipman), por exemplo, usando um tamanho de janela de 20 nucleotídeos, um comprimento de palavra de 4 nucleotídeos, e uma penalidade de abertura de 4, e análise assistida por computador e interpretação dos dados da seqüência, incluindo alinhamento, podem ser convenientemente realizados utilizando programas comercialmente disponíveis (por exemplo, Intelligenetics™ Suite, Intelligenetics Inc. CA). Quando sequências de RNA são ditas como sendo similares, ou têm um grau de identidade de seqüência ou homologia com sequências de DNA, timidina (T) na seqüência de DNA é considerada igual a uracila (U) na seqüência de RNA. Assim, sequências de RNA estão dentro do escopo da invenção e podem ser derivadas de sequências de DNA, por timidina (T) na seqüência de DNA sendo considerada igual a uracila (U) nas sequências de RNA.

A identidade de sequência ou similaridade de seqüência de duas sequências de aminoácidos, ou a identidade de seqüência entre duas sequências de nucleotideo pode ser determinada usando o pacote de software Vector NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA).

Os documentos a seguir fornecem algoritmos para comparar a identidade relativa ou homologia de sequências e, adicionalmente ou alternativamente, com relação ao precedente, os ensinamentos nessas referências podem ser usados para determinar a homologia ou identidade percentual: Needleman SB e Wunsch CD; Smith TF e Waterman MS; Smith TF, Waterman MS e Sadler JR; Feng DF e Dolittle RF; Higgins DG e Sharp PM; Thompson JD, Higgins DG e Gibson TJ; e, Devereux J, Haeberlie P e Smithies O. E, sem experimentação excessiva, a pessoa versada na técnica pode consultar muitos outros programas ou referências para determinar a homologia percentual.

Os polinucleotídeos do virus da Doença Equina Africana podem incluir um DNA recombinante que é incorporado em um vetor, em um plasmídeo ou vírus de replicação autônoma, ou no DNA genômico de um procarioto ou eucarioto, ou que existe como uma molécula separada (por exemplo, um cDNA) independente de outras sequências.

Vetores recombinantes aqui divulgados podem incluir um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo, uma variante do mesmo ou um fragmento do mesmo. Vetores recombinantes podem incluir plasmídeos e vetores virais e podem ser utilizados para expressão in vitro ou in vivo. Vetores recombinantes podem incluir ainda um peptídeo sinal. Peptídeos sinal são cadeias peptídicas curtas (3 60 aminoácidos de comprimento) que direcionam o transporte pós-traducional de uma proteína (que são sintetizados no citosol) para certas organelas como núcleo, matriz mitocondrial, retículo endoplasmático, cloroplasto, apoplasto e peroxissomo. A seqüência sinal pode ser a seqüência natural da proteína do vírus da Doença Equina Africana ou um peptídeo sinal de uma proteína secretada, por exemplo, o peptídeo sinal da proteína ativadora de plasminogênio tecidual (tPA), particularmente a tPA humana (S. Friezner Degen e col.; R. Rickies e col·.; D. Berg. E col.), ou o peptídeo sinal do fator de crescimento insulina-like 1 (IGF1), particularmente a IGF1 equina (K. Otte e col.), a IGF1 canina (P. Delafontaine e col.), a IGF1 felina (WO03/022886) , a IGF1 bovina (S. Lien e col.), a IGF1 suína (M. Muller e col.), a IGF1 de qalinha (Y. Kajimoto e col.), a IGF1 de peru (Número de Acesso GenBank AF074980) . O peptídeo sinal da IGF1 pode ser natural ou otimizado, o qual pode ser alcançado através da remoção de sítios de união ocultos e/ou através da adaptação do uso de códons. Após a tradução, o polipeptideo não processado pode ser clivado em um sítio de divagem para levar ao polipeptideo maduro. O sítio de divagem pode ser previsto pelo método de Von Heijne (1986).

Um plasmídeo pode incluir uma unidade de transcrição de DNA, por exemplo, uma seqüência de ácido nucléico que lhe permite replicar em uma célula hospedeira, como uma origem de replicação (procariótica ou eucariótica). Um plasmídeo podem também incluir um ou mais genes marcadores selecionáveis e outros elementos genéticos conhecidos na técnica. Formas circulares e lineares de plasmídeos são englobadas na presente divulgação.

Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a uma composição de vacina ou uma composição farmacêutica para induzir uma resposta imunológica ou protetora em um animal hospedeiro inoculado com a composição. A composição inclui um veículo ou diluente ou excipiente e/ou adjuvante, e um vetor recombinante, tal como um vírus recombinante. 0 vírus recombinante pode ser um vírus recombinante modificado; por exemplo, um recombinante de um vírus que tem nele inativadas funções genéticas codificadas por vírus (por exemplo, rompidas ou eliminadas). Um vírus recombinante modificado pode ter nele inativadas funções genéticas não essenciais codificadas por vírus; por exemplo, de modo que o vírus recombinante tenha virulência atenuada e maior segurança. O vírus utilizado na composição de acordo com a presente invenção é vantajosamente um poxvirus, como um vírus vaccinia ou vírus raccoonpox ou de preferência um vírus avipox, por exemplo, um vírus fowlpox ou, mais preferivelmente, um vírus canaripox; e de maneira mais vantajosa, um vírus ALVAC. É vantajoso que o vetor recombinante ou vírus recombinante tenha expressão sem replicação em espécies de mamíferos. Em outro aspecto, a presente invenção se refere a vetores recombinantes compreendendo pelo menos uma molécula de ácido nucléico codificando um ou mais antigeno(s) do Vírus da Doença Equina Africana (AHSV) . Ela ainda se refere às vacinas ou composições imunogênicas compreendendo uma quantidade eficaz para provocar uma resposta imune protetora em um indivíduo, de um vetor avipox recombinante compreendendo pelo menos uma molécula de ácido nucléico codificando um ou mais antígeno(s) do Vírus da Doença Equina Africana (AHSV). Além disso, ela se refere aos métodos correspondentes de vacinação de um indivíduo contra o Vírus da Doença Equina Africana.

Os veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis de uso são convencionais. Remington's Pharmaceutical Sciences, por E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15^a Edição (1975), descreve composições e formulações adequadas para a distribuição farmacêutica dos polipeptídeos, plasmídeos, vetores virais aqui divulgados. Em geral, a natureza do veículo ou excipiente dependerá do modo particular de administração sendo utilizado. Por exemplo, as formulações parenterais geralmente compreendem fluidos injetáveis que incluem fluidos farmaceuticamente e fisiologicamente aceitáveis como água, salina fisiológica, soluções salinas balanceadas, dextrose aquosa, glicerol ou semelhantes,como um veículo. Para composições sólidas (por exemplo, formas de pastilhas liofilizadas, pós, pílulas, comprimidos ou cápsulas), veículos ou excipientes sólidos atóxicos convencionas podem incluir, por exemplo, classes farmacêuticas de manitol, lactose, amido ou estearato de magnésio. Além de veículos ou excipientes biologicamente neutros, composições imunogênicas a serem administradas podem conter quantidades menores de substâncias auxiliares atóxicas, como agentes umidificantes ou emulsificantes, conservantes e agentes de tamponamento de pH e similares, por exemplo, acetato de sódio ou monolaurato de sorbitano.

As composições ou vacinas de acordo a presente invenção podem incluir vetores compreendendo um ou mais polinucleotídeos (s) que codificam uma ou mais VPs de AHSV de acordo com a presente invenção, como descrito acima.

Múltiplas inserções podem ser feitas no mesmo vetor usando diferentes sítios de inserção ou usando o mesmo sítio de inserção. Quando o mesmo sítio de inserção é usado, cada polinucleotídeo inserido, que pode ser qualquer polinucleotideo da presente invenção supracitado, pode ser inserido sob o controle de promotores iguais e/ou diferentes. A inserção pode ser feita cauda-a-cauda, cabeça-a-cabeça, cauda-a—cabeça ou cabeça—a—cauda.

Elementos IRES (Internal Ribosome Entry Site, ver EP 0803573) também podem ser usados para separar e expressar múltiplas inserções operavelmente ligadas aos mesmos e/ou a diferentes promotores.

Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um vetor de expressão compreendendo um ou mais polinucleotídeo (s) acima mencionado(s) . O vetor de expressão pode ser um vetor de expressão in vivo, ou um vetor de expressão in vitro.

Em uma modalidade, o vetor ou vírus recombinante pode incluir uma ou mais moléculas de ácido nucleico heterólogas que codificam um ou mais antígeno(s) do vírus da Doença Equina Africana (AHSV) , imunógenos, incluindo epítopos ou fragmentos dos mesmos. O vetor recombinante ou vírus recombinante modificado podem incluir, por exemplo, dentro do genoma do virus, tal como dentro uma região não essencial do genoma viral, uma seqüência de DNA heteróloga que codifica uma proteína imunogênica, por exemplo, derivadada da(s) proteína(s) viral/virais do vírus da Doença Equina Africana, por exemplo, AHSV VP1, VP2, VP3, VP4, NS1, VP5, VP6, VP7, NS2, NS3 ou qualquer combinação das mesmas, preferencialmente AHHSV VPs 2 e 5 (em que a proteína imunogênica pode ser um epítopo de interesse, por exemplo, um epítopo de interesse a partir de uma proteína expressa por qualquer uma ou mais dentre AHSV VP1, VP2, VP3, VP4, NS1, VP5, VP6, VP7, NS2, NS3, por exemplo, um epitopo de interesse das AHSV VPs 2 e/ou 5) . O vetor ou vírus é vantajosamente um poxvirus, tal como um vírus vaccinia ou preferivelmente um vírus avipox, por exemplo, um vírus fowlpox ou mais preferivelmente um vírus canaripox; e mais vantajosamente, um vírus ALVAC.

Em outra modalidade, a molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica um ou mais antígeno(s) do Vírus da Doença Equina Africana (AHSV), imunógenos, incluindo epítopos ou fragmentos dos mesmos, por exemplo, derivados da(s) proteína(s) viral/virais do Vírus da Doença Equina Africana, por exemplo, AHSV VP1, VP2, VP3, VP4, NS1, VP5, VP6, VP7, NS2, NS3 ou qualquer combinação das mesmas, preferencialmente AHSV VPs 2 e 5 (em que a proteína imunogênica pode ser um epitopo de interesse, por exemplo, um epitopo de interesse a partir de uma proteína expressa por um ou mais dentre AHSV VP1, VP2, VP3, VP4, NS1, VP5, VP6, VP7, NS2 ou NS3, por exemplo, um epitopo de interesse de AHSV VPs 2 e/ou 5) é operacionalmente ligado a uma seqüência promotora e, opcionalmente, a um intensificador. Em uma modalidade vantajosa, a seqüência promotora é selecionada do grupo consistindo de promotor vaccinia Ηβ, promotor vaccinia I3L, promotor poxviral 42K, promotor vaccinia 7.5K e promotor vaccinia Pi. Mais vantajosamente, a seqüência promotora é o promotor vaccinia H6 ou ο promotor poxviral 42K. Mais preferivelmente, VP2 é operacionalmente ligada ao promotor vaccinia H6 e VP5 é operacionalmente ligada ao promotor poxviral 42K.

Em outra modalidade, a molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica um ou mais antígeno(s) do Vírus da Doença Equina Africana (AHSV), imunógenos, incluindo epítopos ou fragmentos dos mesmos, por exemplo, derivados da(s) proteína (s) viral/virais do Vírus da Doença Equina Africana, por exemplo, AHSV VP1, VP2, VP3, VP4, NS1, VP5, VP6, VP7, NS2, NS3, ou qualquer combinação das mesmas, de preferência AHSV VPs 2 e 5 (em que a proteína imunogênica pode ser um epítopo de interesse, por exemplo, um epítopo de interesse de uma proteína expressa por um ou mais de AHSV VP1, VP2, VP3, VP4, NS1, VP5, VP6, VP7, NS2, ou NS3, por exemplo, um epítopo de interesse de AHSV VPs 2 e/ou 5) é inserido em um vetor compreendendo um loci de inserção onde no dito loci compreende C5 e/ou C6 e/ou C3, e em que as sequências flanqueadoras dos loci de inserção C6, C5 e/ou C3 promovem recombinação homóloga dos antígenos do Vírus da Doença Equina Africana com o locus de inserção cognato.

Em outra modalidade, a molécula de ácido nucléico heteróloga que codifica uma ou mais antigeno(s) do Vírus da Doença Equina Africana (AHSV), imunógenos, incluindo epítopos ou fragmentos dos mesmos, por exemplo, derivados da(s) proteína(s) viral/virais do Vírus da Doença Equina Africana, por exemplo, AHSV VP1, VP2, VP3, VP4, NS1, VP5, VP6, VP7, NS2, NS3, ou qualquer combinação destes, preferencialmente AHSV VPs 2 e 5 (em que a proteína imunogênica pode ser um epitopo de interesse, por exemplo, um epitopo de interesse de uma proteína expressa por qualquer um ou mais de AHSV VP1, VP2, VP3, VP4, NS1, VP5, VP6, VP7, NS2 ou NS3, por exemplo, um epitopo de interesse de AHSV VPs 2 e/ou 5) é inserido em um vetor compreendendo um loci de inserção onde no dito loci compreende C5 e/ou C6 e/ou C3, e em que as sequências flanqueandoras dos loci de inserção C6, C5 e/ou C3 promovem recombinação homóloga dos antígenos do Vírus da Doença Equina Africana com o locus de inserção cognato ainda em que as sequências flanqueadoras compreendem as estruturas de leitura abertas C3L e C3R de avipox.

Em outra modalidade, o vetor avipox é vCP2377 ou VCP2383 ou VCP2398.

A prática da presente invenção empregará, salvo indicado em contrário, técnicas convencionais de biologia molecular, microbiologia, bacteriologia, tecnologia de DNA recombinante e imunologia, que estão dentro da habilidade da pessoa versada na técnica. Tais técnicas são explicadas completamente na literatura. Ver, por exemplo, Sambrook, e col. (1989); 1985; (M.J. Gait ed. 1984); (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); (R.K. Freshney ed. 1986); (IRL press, 1986); Perbal, B., (1984); t (D.M. Weir e C.C. Blackwell eds., 1986).

Em um aspecto, a presente invenção fornece um vetor recombinante, por exemplo, um vírus como um poxvirus recombinante contendo nele uma seqüência de DNA do Vírus da Doença Equina Africana, por exemplo, no genoma do vírus (como poxvirus), vantajosamente uma região não essencial do vírus, por exemplo, o genoma poxvirus. O poxvirus pode ser um vírus vaccinia, tal como um vírus NYVAC ou vírus à base de NYVAC; e o poxvirus é vantajosamente um vírus avipox, como um vírus fowlpox, especialmente um vírus fowlpox atenuado, por exemplo, TROVAC, ou um vírus canaripox, de preferência um vírus canaripox atenuado, como ALVAC. Contudo, o vetor na invenção pode ser qualquer vírus ou vetor viral recombinante apropriado, tal como um poxvirus (por exemplo, vírus vaccinia, vírus avipox, vírus canaripox, vírus fowlpox, vírus raccoonpox, vírus swinepox, etc.), adenovirus (por exemplo, adenovirus canino), herpesvirus, baculovirus, retrovirus, etc. (conforme nos documentos aqui incorporados por referência); ou o vetor pode ser um plasmídeo.

vírus recombinante pode ser um vírus recombinante modificado; por exemplo, um recombinante de um vírus que tem inativadas (por exemplo, rompidas ou eliminadas) suas funções genéticas codificadas por vírus. Um vírus recombinante modificado pode ter suas funções genéticas não-essenciais codificadas por vírus inativadas; por exemplo, de modo que o vírus recombinante tenha virulência atenuada e segurança reforçada. O vírus utilizado na composição de acordo com a presente invenção é vantajosamente um poxvirus, tal como um vírus vaccinia ou de preferência um vírus avipox, por exemplo, um vírus fowlpox ou, mais preferivelmente, um vírus canaripox; e mais vantajosamente, um vírus ALVAC. É vantajoso que o vetor recombinante ou vírus recombinante tenha expressão sem replicação em espécies de mamíferos.

Numa modalidade particular, o vetor viral é um poxvirus, por exemplo, um vírus vaccinia ou um vírus vaccinia atenuado, (por exemplo, MVA, uma cepa Ankara modificada obtida após mais de 57 0 passagens da cepa de vacina Ancara em fibroblastos de embriões de galinha; ver Stickl & Hochstein-Mintzel, Munch. Med. Wschr., 1971 , 113,

1149-1153; Sutter e col., Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A, 1992, 89, 10847-10851; disponível como ATCC VR-1508; ou NYVAC, ver a Patente Americana No. 5,494,807, por exemplo, os Exemplos 1 a 6 e seguintes da Patente Americana No. 5,494,807, que discute a construção de NYVAC, bem como variações de NYVAC com ORFs adicionais excluídas do genoma do virus vaccinia da cepa Copenhagen, bem como a inserção de moléculas de ácido nucleico codificadoras heterólogas em sítios deste recombinante, e também o uso de promotores correspondentes; ver também WO96/40241), um vírus avipox ou um vírus avipox atenuado (por exemplo, vírus canaripox, fowlpox, dovepox, pigeonpox, quailpox, ALVAC ou TROVAC; ver, por exemplo, as Patentes Americanas Nos. 5,505,941, 5,494,807), swinepox, raccoonpox, camelpox ou vírus da mixomatose.

Poxvirus recombinantes podem ser construídos em duas etapas conhecidas na técnica e análogas aos métodos para a criação de recombinantes sintéticos de poxvirus, tais como o vírus vaccinia e vírus avipox descritos nas Patentes Americanas Nos. 4,769,330; 4,722,848; 4,603,112; 5,110,587, 5,174,993; 5,494,807; 5,942,235 e 5,505,941, as divulgações das quais sendo aqui incorporadas por referência. Alternativamente, métodos de fabricação e/ou administração de um vetor ou recombinantes ou plasmideo para expressão de produtos gênicos dos genes da invenção, quer in vivo ou in vitro, podem ser qualquer método desejado, por exemplo, um método que é por ou análogo aos métodos divulgado em, ou

divulgados	nos documentos citados	em: Patentes	Americanas
Nos. 6,130	, 066, 5,494,?	307, 5,514,375, 5,744,140,	5,744,141,
5,756,103,	5,762,938,	5,766,599,	5, 990,091,	6,004,777,
6,130,066,	6,497,883,	6,464,984,	6,451,770,	6,391,314,
6,387,376,	6,376,473,	6,368,603,	6,348,196,	6,306,400,
6, 228,846,	6,221,362,	6,217,883,	6,207,166,	6,207,165,
6,159,477,	6,153,199,	6,090,393,	6, 074,649,	6,045,803,
6,033,670,	6,485,729,	6, 103,526,	6,224,882,	6,312,682,
6,312,683,	6,348,450,	4,603,112,	4,769,330,	5,174,993,
5,505,941,	5,338,683,	5,494,807,	4,394,448,	4,722,848,
4,745,051,	4,769,331,	5,591,639,	5,589,466,	4,945,050;
5,677,178;	5,591,439;	5,552,143; 5,	.580,859; WO 94/16716; WO
96/39491;	W091/11525;	WO 98/33510	; WO 90/01543	; EP 0 370
573; EP 265785; (Paoletti 1996);	(Moss 1996);	Richardson
(Ed) (1995); (Smith,	Summers e	col. 1983);	(Pennock,
Shoemaker	e col. 1984	); (Roizman	1996) ; (Andreansky, He e
col. 1996)	; (Robertson	, Ooka e col	. 1996); (Frol	ον, Hoffman

e col. 1996); (Kitson, Burke e col. 1991); (Ballay, Levrero e col. 1985); (Graham 1990); (Prevec, Schneider e col. 1989); (Feigner, Kumar e col. 1994); (Ulmer, Donnelly e col. 1993); (McClements, Armstrong e col. 1996);(Ju, Edelstein e col. 1998); e (Robinson e Torres 1997).

Elementos para a expressão do polinucleotideo ou polinucleotideos estão vantajosamente presentes em um vetor da invenção. De maneira minima, isto compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de um códon de iniciação (ATG), um códon de parada e um promotor, e, opcionalmente, também uma sequência de poliadenilação para certos vetores, tais como plasmídeos e certos vetores virais, por exemplo, vetores virais diferentes do poxvirus. Quando o polinucleotideos codifica um fragmento de proteína, por exemplo, vantajosamente, no vetor, um ATG é colocado no 5' da estrutura de leitura e um códon de parada é colocado no 3' . Outros elementos para controlar a expressão podem estar presentes, como sequências intensificadoras, sequências estabilizadoras e sequências sinal, que permitam a secreção da proteína.

Os pedidos de patente WO 90/11092, WO 93/19183, WO 94/21797 e WO 95/20660 fizeram uso da técnica recémdesenvolvida de vacinas de polinucleotideo. Sabe-se que estas vacinas usam um plasmídeo capaz de expressar, nas células hospedeiras, o antígeno inserido no plasmídeo. Todas as vias de administração foram propostas (intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, transcutânea, intradérmica, mucosa e semelhantes). Vários meios de vacinação também podem ser usados, como o DNA depositado na superfície de partículas de ouro e projetado de modo a penetrar na pele do animal (Tang e col., 1992) e injetores de jato de líquido, que tornam possível transfectar a pele, músculo, tecidos adiposos, bem como os tecidos mamários (Furth e col., 1992). (Ver também as Patentes Americanas Nos. 5,846, 946, 5,620, 896, 5, 643,578, 5,580,589, 5, 589,466, 5,693,622 e 5,703,055; Ulmer, J.B., e col., 1993; Robinson e col., 1997; Luke e col. 1997; Norman e col. 1997; Bourne e col, 1996; e observe que geralmente um plasmídeo para uma vacina ou composição imunológica pode compreender um DNA que codifica um antigeno operacionalmente ligado às sequências regulatórias que controlam a expressão ou expressão e secreção do antigeno a partir de uma célula hospedeira, por exemplo, uma célula de mamífero; por exemplo, de à montante para à jusante, DNA para um promotor, DNA para um peptídeo líder eucariótico para secreção, DNA para o antigeno, e DNA que codifica um finalizador).

De acordo com outra modalidade da invenção, o vetor poxvirus é um vírus canaripox ou um vetor de vírus fowlpox, vantajosamente um vírus canaripox atenuado ou vírus fowlpox. Sob esse aspecto, é feita referência ao canaripox disponível do ATCC sob o número de acesso VR-111. Virus canaripox atenuados são descritos na Patente Americana No. 5,756,103 (ALVAC) e W001/05934. Várias cepas de vacinação do vírus fowlpox também estão disponíveis, por exemplo, a cepa DIFTOSEC CT, comercializada por MERIAL e a vacina NOBILIS VARIOLE, comercializada por INTERVET; e, também é feita referência à Patente Americana No. 5,766,599, que diz respeito à cepa TROVAC de fowlpox atenuado.

Quando o vetor de expressão é um vírus vaccinia, o sítio ou sítios de inserção para o polinucleotideo ou polinucleotideos a serem expressos podem estar no gene da timidina quinase (TK) ou sítio de inserção, no gene da hemaglutinina (HA) ou sítio de inserção, na região que codifica os corpos de inclusão do tipo A (ATI); ver também os documentos aqui citados, especialmente aqueles que dizem respeito ao vírus vaccinia. No caso do canaripox, o sítio ou sítios de inserção podem ser ORF(s) C3, C5 e/ou C6; ver também os documentos aqui citados, especialmente aqueles que dizem respeito ao vírus canaripox. No caso do fowlpox, o sítio ou sítios de inserção podem ser ORFs F7 e/ou F8; ver também os documentos aqui citados, especialmente aqueles que dizem respeito ao vírus fowlpox. O sítio ou sítios de inserção para a área do vírus MVA podem ser como em várias publicações, incluindo Carroll M. W. e col.,

Vaccine, 1997, 15 (4), 387-394; Stittelaar K. J. e col., J. Virol., 2000, 74 (9), 4236-4243; Sutter G. e col., 1994, Vaccine, 12 (11), 1032-1040; e, neste contexto, também é verificado que o genoma de MVA completo é descrito em Antoine G., Virology, 1998, 244, 365-396, que permite que o profissional versado na técnica utilize outros sítios de inserção ou outros promotores.

Em outra modalidade da presente invenção, o polinucleotídeo a ser expresso é inserido sob o controle de um promotor poxvirus específico, por exemplo, o promotor

vaccinia	de 7,5 kDa	(Cochran e col.,	J. Virology,	1985,	54,
30-35),	o promotor	vaccinia I3L	(Riviere	e	col. ,	J.
Virology,	1992, 66,	3424-3434), ο	promotor	vaccinia	HA

(Shida, Virology, 1986, 150, 451-457), o promotor cowpox ATI (Funahashi e col., J. Gen. Virol., 1988, 69, 35-47), o promotor vaccinia H6 (Taylor J. e col., Vaccine, 1988, 6, 504-508; Guo P. e col. J. Virol., 1989, 63, 4189-4198;

Perkus Μ. E col., J. Virol., 1989, 63, 3829-3836), entre outros.

Em outra modalidade, o vetor viral é um adenovirus, como um adenovirus humano (HAV) ou um adenovirus canino (CAV).

A vacina à base de vetor viral recombinante pode ser combinada com fMLP (N-formilmetionil-leucil-fenilalanina; US 6,017,537) e/ou adjuvante CARBOMER (Pharmeuropa Vol.)

Em outra modalidade, o vetor viral pode ser, mas não está limitado, a um adenovirus de humanos, suínos, ovinos, bovinos ou aves. Para o adenovirus humano, em particular um adenovirus de sorotipo 5, tornado incompetente para replicação por uma deleção na região El do genoma viral, em particular de cerca do nucleotídeo 459 a cerca do nucleotídeo 3510 em referência à seqüência do hAd5 divulgada no GenBank sob o número de acesso M73260 e na publicação referenciada J. Chroboczek e col. Virol. 1992, 186, 280-285. 0 adenovirus deletado é propagado em células 293 expressando El (F. Graham e col. J. Gen. Virol. 1977, 36, 59-72) ou células PER, em particular PER.C6 (F. Falloux e col. Human Gene Therapy 1998, 9, 1909-1917). O adenovirus humano pode ser deletado na região E3, em particular de cerca do nucleotídeo 28592 até aproximadamente o nucleotídeo 30470. A deleção na região El pode ser feita em combinação com uma deleção na região E3 (ver, por exemplo, J. Shriver e col. Nature, 2002, 415, 331-335, F. Graham e col. Methods in Molecular Biology Vol. 7: Gene Transfer and Expression Protocols Edited by E. Murray, The Human Press Inc, 1991, p 109-128; Y. Ilan e col. Proc. Natl. Acad. Sci.

1997, 94, 2587-2592; US 6,133,028; US 6,692,956; S.

Tripathy e col. Proc. Natl. Acad. Sci. 1994, 91, 1155711561; B. Tapnell Adv. Drug Deliv. Rev.1993, 12, 185-199; X. Danthinne e col. Gene Therapy 2000, 7, 1707-1714; K.

Berkner Bio Techniques 1988, 6, 616-629; K. Berkner e col. Nucl. Acid Res. 1983, 11, 6003-6020; C. Chavier e col. J.

Virol. 1996, 70, 4805-4810) . Os sítios de inserção podem ser as posições (regiões) El e/ou E3, eventualmente após uma deleção parcial ou completa das regiões El e/ou E3.

Quando o vetor de expressão é um adenovirus, o polinucleotídeo a ser expresso pode ser inserido sob o controle de um promotor funcional em células eucarióticas, como um promotor forte, tal como um promotor do gene precoce imediato do citomegalovírus (promotor CMV-IE), em particular a região intensificadora/ promotora aproximadamente do nucleotídeo -734 até aproximadamente o nucleotídeo +7 em M. Boshart e col. Cell 1985, 41, 521-530 ou a região intensificadora/ promotora do vetor PCI de Promega Corp. O promotor CMV-IE é vantajosamente de origem murina ou humana. O promotor do fator de alongamento la também pode ser usado. Um promotor específico de músculo também pode ser usado (X. Li e col. Nat. Biotechnol. 1999, 17, 241-245). Promotores fortes também são discutidos aqui em relação aos vetores de plasmídeo. Em uma modalidade, uma seqüência de união pode ser localizada à jusante da região intensificadora/ promotora. Por exemplo, o intron 1 isolado do gene CMV-IE (R. Stenberg e col. J. Virol. 1984, 49, 190), o intron isolado do gene da β-globina de coelho ou humano, em particular o intron 2 do gene da β-globina, o intron isolado do gene da imunoglobulina, uma seqüência de união do gene precoce de SV40 ou a seqüência de intron quimérica isolada a partir do vetor pCI de Promega Corp, compreendendo a sequência doadora do gene da β-globina humana fundida à sequência receptora da imunoglobulina de camundongo (aproximadamente do nucleotideo 890 até aproximadamente o nucleotideo 1022 em GenBank sob o número de acesso CVU47120). Uma seqüência poli(A) e uma sequência finalizadora podem ser inseridas à jusante do polinucleotídeo a ser expresso, por exemplo, um gene do hormônio de liberação do hormônio de crescimento bovino, em particular aproximadamente do nucleotideo 2339 até aproximadamente o nucleotideo 2550 no GenBank, sob o número de acesso BOVGHRH (AF242855), um gene da β-globina de coelho ou um sinal de poliadenilação do gene tardio SV40.

Em outra modalidade, o vetor viral é um adenovirus canino, em particular um CAV-2 (ver, por exemplo, L. Fischer e col. Vaccine, 2002, 20, 3485-3497; Patente

Americana No. 5,529,780; Patente Americana No. 5,688,920;

Pedido PCT No. WO95/14102). Para CAV, os sítios de inserção podem estar na região E3 e/ou na região localizada entre a região E4 e a região ITR direita (ver a Patente Americana No. 6,090,393; Patente Americana No. 6,156,567). Em uma modalidade, a inserção está sob o controle de um promotor, tal como um promotor do gene precoce imediato do citomegalovírus (promotor CMV-IE) ou um promotor já descrito para um vetor de adenovirus humano. Uma seqüência poli(A) e uma sequência finalizadora podem ser inseridas à jusante do polinucleotídeo a ser expresso, por exemplo, um gene do hormônio de crescimento bovino ou um sinal de poliadenilação do gene da β-globina de coelho.

Em outra modalidade particular, o vetor viral é um herpesvirus, tal como um herpesvirus equino (EHV1-5), um herpesvirus suíno (PRV), um herpesvirus canino (CHV) ou um herpesvirus felino (FHV). Os sítios de inserção podem estar no gene da timidina quinase, na ORF3 ou na ORF UL43 (para CHV ver a Patente Americana No. 6,159,477). Em uma modalidade, o polinucleotídeo a ser expresso é inserido sob o controle de um promotor funcional em células eucarióticas, vantajosamente um promotor CMV-IE (murino ou humano). Uma seqüência poli(A) e uma sequência finalizadora podem ser inseridas à jusante do polinucleotídeo a ser expresso, por exemplo, o hormônio de crescimento bovino ou o sinal de poliadenilação do gene da β-globina de coelho.

De modo mais geral, a presente invenção engloba vetores de expressão in vivo, incluindo qualquer plasmídeo (EP-A2-1001025; Chaudhuri P.) contendo e expressando in vivo em um hospedeiro o polinucleotídeo ou gene do polipeptideo do vírus da Doença Equina Africana, uma variante do mesmo ou fragmento do mesmo e elementos necessários para a sua expressão in vivo.

Ainda de acordo com outra modalidade da invenção, o vetor de expressão é um vetor de plasmídeo ou um vetor de plasmídeo de DNA, em particular um vetor de expressão in vivo. Em um exemplo específico, não limitante, o plasmídeo pVR1020 ou 1012 (VICAL Inc.; Luke C. e col., Journal of Infectious Diseases, 1997, 175, 91-97; Hartikka J. e col., Human Gene Therapy, 1996, 7, 1205-1217, ver, por exemplo, as Patentes Americanas Nos. 5,846,946 e 6,451,769) pode ser utilizado como um vetor para a inserção de uma seqüência de polinucleotídeo. O plasmídeo pVR1020 é derivado de pVR1012 e contém a seqüência sinal do tPA humano. Em uma modalidade, o sinal do tPA humano compreende do aminoácido M(l) até o aminoácido S (23) no GenBank sob o número de acesso HUMTPA14. Em outro exemplo específico, não limitante, o plasmídeo utilizado como um vetor para a inserção de uma seqüência de polinucleotideo pode conter a sequência de peptídeo sinal de IGF1 equino do aminoácido M(24) ao aminoácido A(48) no GenBank sob o número de acesso U28070. Informações adicionais sobre plasmídeos de DNA que podem ser consultadas ou utilizadas na prática são encontradas, por exemplo, nas Patentes Americanas Nos. 6,852,705, 6,818,628, 6,586,412, 6,576,243, 6,558,674, 6,464,984, 6,451,770, 6,376,473 e 6,221,362.

Como usado aqui, o termo plasmideo pode incluir qualquer unidade de transcrição de DNA compreendendo um polinucleotideo de acordo com a invenção e os elementos necessários para a sua expressão in vivo em uma célula ou células do hospedeiro ou alvo desejado; e, sob este aspecto, é observado que um plasmideo circular superenovelado ou não-superenovelado, bem como uma forma linear, destinam-se a estar dentro do escopo da invenção. Os plasmídeos também podem compreender outros elementos de regulação de transcrição, como, por exemplo, sequências estabilizadoras do tipo intron. Em várias modalidades, os plasmídeos podem incluir o primeiro intron do CMV-IE (WO 89/01036), o intron II do gene da beta-globina de coelho (van Ooyen e col.), a sequência de sinal da proteína codificada pelo ativador de plasminogênio tecidual (tPA; Montgomery e col.), e/ou um sinal de poliadenilação (poliA), em particular o poliA do gene do hormônio de crescimento bovino (bGH) (US 5,122,458) ou o poliA do gene da beta-globina de coelho ou do vírus SV40.

Cada plasmídeo compreende ou contém ou consiste essencialmente de, além do polinucleotideo que codifica um antigeno AHSV, epítopo ou imunógeno, opcionalmente fundido com uma sequência peptídica heteróloga, variante, análoga ou fragmento, operacionalmente ligado a um promotor ou sob o controle de um promotor ou dependente de um promotor. Em geral, é vantajoso utilizar um promotor forte funcional em células eucarióticas. O promotor, forte preferido é o promotor precoce imediato do citomegalovirus (CMV-IE) de origem humana ou murina ou, opcionalmente, tendo outra origem, como rato ou porquinho-da-índia. O promotor CMV-IE pode compreender a parte promotora efetiva, que pode ou não estar associada com a parte intensificadora. Pode ser feita referência ao EP-A-260 148, EP-A-323 597, Patentes Americanas Nos. 5,168,062, 5,385,839 e 4,968,615, bem como ao pedido PCT No. W087/03905. O promotor CMV-IE é vantajosamente um CMV-IE humano (Boshart M. e col., Cell., 1985, 41, 521-530) ou CMV-IE de murino. Um promotor celular forte que pode ser empregado de forma útil na prática da invenção é o promotor de um gene do citoesqueleto, tal como o promotor de desmina (Kwissa M. e col.), ou o promotor de actina (Miyazaki J. e col.). Subfragmentos funcionais desses promotores, isto é, porções desses promotores que mantêm atividade promotora adequada, são incluídos na presente invenção, por exemplo, promotores CMV-IE truncados de acordo com WO 98/00166 ou US 6, 156,567, e podem ser usados na prática da invenção. Um promotor útil na prática da invenção, consequentemente, pode incluir os derivados e/ou subfragmentos de um promotor de comprimento total que mantém a atividade promotora adequada e, portanto, funciona como um promotor, e que pode vantajosamente ter atividade promotora que é substancialmente semelhante àquela do promotor efetivo ou de comprimento total a partir do qual o derivado ou subfragmento é derivado, por exemplo, parecido com a atividade dos promotores CMV-IE truncados de US 6,156,567, em comparação com a atividade dos promotores CMV-IE de comprimento total. Deste modo, um promotor CMV-IE na prática da invenção pode compreender ou consistir essencialmente de, ou consistir da porção promotora do promotor de comprimento total e/ou porção intensificadora do promotor de comprimento total, assim como os derivados e/ou subfragmentos do mesmo.

Em termos mais gerais, o promotor tem tanto origem viral ou celular. Um promotor viral forte diferente do CMVIE que pode ser empregado de maneira útil na prática da invenção é o promotor precoce/tardio do vírus SV40 ou o promotor LTR do vírus do sarcoma de Rous. Um promotor celular forte que pode ser empregado de maneira útil na prática da invenção é o promotor de um gene do citoesqueleto, como, por exemplo, o promotor de desmina (Kwissa M. e col., Vaccine, 2000, 18, 2337-2344), ou o promotor de actina (Miyazaki J. e col., Gene, 1989, 79,

269-277).

Fragmentos subfuncionais desses promotores isto é porções desses promotores que mantêm uma atividade promotora adequada, estão incluídos dentro da presente invenção, por exemplo promotores CMV-IE truncados de acordo com o Pedido PCT

Petição N° W098/00166 ou a Patente

Americana No. 6,156,567 invenção. Um promotor podem ser utilizados na prática da na prática da invenção inclui consequentemente, derivados e subfragmentos de um promotor de comprimento total que mantêm uma atividade promotora adequada e, portanto, funciona como um promotor, de preferência promovendo uma atividade substancialmente semelhante àquela do promotor efetivo ou de comprimento total a partir do qual o derivado ou subfragmento é derivado, por exemplo, parecido com a atividade dos promotores CMV-IE truncados da Patente Americana No. 6,156,567 com a atividade dos promotores CMV-IE de comprimento total. Assim, um promotor CMV-IE na prática da invenção pode compreender ou consistir essencialmente de ou consiste da porção promotora do promotor de comprimento total e/ou da porção intensificadora do promotor de comprimento total, bem como derivados e subfragmentos.

Preferencialmente, os plasmideos compreendem ou consistem essencialmente de outros elementos de controle de expressão. É particularmente vantajoso incorporar seqüência(s) estabilizante(s), por exemplo, seqüência(s) de intron(s), de preferência o primeiro intron do hCMV-IE (Pedido PCT No. WQ89/01036) , o intron II do gene da βglobina de coelho (van Ooyen e col., Science, 1979, 206, 337-344) .

Quanto ao sinal de poliadenilação (poliA) para os plasmideos e vetores virais diferentes dos poxvirus, a utilização pode ser feita mais do sinal poli(A) do gene do hormônio de crescimento bovino (bGH) (ver a Patente Americana No. 5,122,458), ou do sinal poli(A) do gene da β— globina de coelho ou do sinal poli(A) do vírus SV40.

De acordo com outra modalidade da invenção, os vetores de expressão são vetores de expressão utilizados para a expressão in vitro de proteínas em um sistema celular apropriado. As proteínas expressas podem ser colhidas em ou a partir do sobrenadante de cultura após ou não a secreção (se não houver uma secreção uma lise celular tipicamente ocorre ou é feita), opcionalmente concentrada por métodos de concentração, como ultrafiltração e/ou purificada por meios de purificação, como métodos de cromatografia de afinidade, troca iônica ou gel filtração.

Isolamento e purificação de polipeptídeo recombinantemente expresso podem ser efetuados por meios convencionais, incluindo cromatografia preparativa (por exemplo, por exclusão de tamanho, troca iônica, afinidade), precipitação seletiva e ultrafiltração. Exemplos de técnicas do estado da técnica que podem ser usadas, mas não estão limitadas, podem ser encontradas em Protein Purification Applications, Segunda Edição, editado por Simon Roe e disponível em Oxford University Press. Tal polipeptídeo recombinantemente expresso é parte da presente divulgação. Os métodos para a produção de qualquer polipeptídeo de acordo com a presente invenção, conforme descrito acima, também são englobados, em particular a utilização de um vetor de expressão recombinante compreendendo um polinucleotideo de acordo com a divulgação e de uma célula hospedeira.

As vacinas contendo vetores virais recombinantes de acordo com a invenção podem ser liofilizadas, vantajosamente com um estabilizador. A liofilização pode ser feita de acordo com procedimentos de liofilização padrão bem conhecidos. Os estabilizantes farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis podem ser carboidratos (por exemplo, sorbitol, manitol, lactose, sacarose, glicose, dextrana, trealose) , glutamato de sódio (Tsvetkov T e col.; Israeli E e col.), proteínas como peptona, albumina, lactoalbumina ou caseína, agentes contendo proteína, como leite desnatado (Mills C K e col.; Wolff E e col.), e tampões (por exemplo, tampão fosfato, tampão fosfato de metal alcalino) . Um adjuvante pode ser usado para tornar solúveis as preparações liofilizadas.

Qualquer composição ou a vacina de acordo com a invenção pode vantajosamente também conter um ou mais adj uvantes.

As vacinas à base de plasmídeo podem ser formuladas com lipídeos catiônicos, vantajosamente com DMRIE(N-(2hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(tetradecilóxi)-1propanamônio; WO96/34109), ou em associação com um lipídeo neutro, por exemplo DOPE (dioleoilfosfatidiletanolamina; Behr J. P.) para formar DMRIE-DOPE. Em uma modalidade, a mistura é feita extemporaneamente, e antes de sua administração é vantajoso esperar cerca de 10 min a cerca de 60 min, por exemplo, cerca de 30 min, para a complexação apropriada da mistura. Quando DOPE é utilizada, a razão molar de DMR1E/DOPE pode ser de 95/5 a 5/95, e é vantajosamente de 1/1. A razão em peso de plasmideo/DMRIE ou DMRIE-adjuvante DOPE é, por exemplo, de 50/1 a 1/10, de 10/1 a 1/5 ou de 1/1 a 1/2.

Opcionalmente, uma citocina pode ser adicionada à composição, em especial GM-CSF ou citocinas indutoras de Thl (por exemplo, IL12). Estas citocinas podem ser adicionadas à composição como um plasmídeo que codifica a proteína citocina. Em uma modalidade, as citocinas são de origem canina, por exemplo, GM-CSF canina cuja sequência gênica foi depositada no banco de dados GenBank (número de acesso S49738). Esta seqüência pode ser usada para criar o dito plasmídeo de modo similar ao que foi feito em WO 00/77210.

Uma célula hospedeira denota uma célula procariótica ou eucariótica que tenha sido geneticamente alterada, ou que seja capaz de ser geneticamente alterada pela administração de um polinucleotídeo exógeno, tal como um plasmídeo ou vetor recombinante. Ao se referir às células geneticamente alteradas, o termo se refere tanto à célula originalmente alterada quanto à sua descendência. Células hospedeiras vantajosas incluem, mas não estão limitadas a, células de rim de hâmster bebê (BHK), células de carcinoma de cólon (Caco-2), células COS7, células MCF-7, células MCF-10A, linhagens de rim canino Madin-Darby (MDCK), células de pulmão de marta (MvlLu) , células MRC-5, células U937 e células VERO. Polinucleotideos compreendendo uma sequência desejada podem ser inseridos em um vetor de clonagem ou expressão adequado, e o vetor, por sua vez, pode ser introduzido em uma célula hospedeira adequada para replicação e amplificação. Polinucleotideos podem ser introduzidos nas células hospedeiras por qualquer meio conhecido na técnica. Os vetores contendo os polinucleotideos de interesse podem ser introduzidos na célula hospedeira por qualquer dentre uma série de meios adequados, incluindo absorção direta, endocitose, transfecção, pareamento f, eletroporação, transfecção utilizando cloreto de cálcio, cloreto de rubidio, fosfato de cálcio, DEAE-dextrana ou outras substâncias;

bombardeamento por microprojétil; lipofecção; e infecção (onde o vetor é infeccioso, por exemplo, um vetor retroviral). A escolha dos polinucleotideos ou vetores de introdução muitas vezes dependerá de características da célula hospedeira.

As vacinas polinucleotídicas podem usar tanto DNAs abertos quanto DNAs formulados, por exemplo, dentro de lipossomas ou lipídeos catiônicos ou com CpG's.

Ácidos nucleicos que diferem dos ácidos nucleicos do Vírus da Doença Equina Africana nativo devido à degeneração no código genético também estão dentro do escopo da invenção. Por exemplo, vários aminoácidos são designados por mais de um triplete. Códons que especificam o mesmo aminoácido, ou sinônimos (por exemplo, CAU e CAC são sinônimos para histidina) podem resultar em mutações silenciosas que não afetam a seqüência de aminoácidos da proteína. Variações na seqüência do DNA que levam a alterações nas sequências de aminoácidos das referidas proteínas do Vírus da Doença Equina Africana, codificadas pelos vetores recombinantes da presente invenção também são englobadas pela presente invenção. Quaisquer e todas as variações de nucleotídeos e variações de aminoácidos resultantes estão dentro do escopo desta invenção.

Também é possível modificar a estrutura dos ditos polipeptídeos do Virus da Doença Equina Africana, codificados pelos vetores recombinantes da presente invenção para tais finalidades, como melhoria da eficácia terapêutica ou profilática (por exemplo, aumento da imunogenicidade do polipeptídeo). Tais polipeptídeos modificados, quando concebidos para reter pelo menos uma atividade da forma de ocorrência natural da proteína, são considerados equivalentes funcionais dos polipeptídeos do

Virus da Doença Equina Africana, descritos aqui em mais detalhes. Tais polipeptídeos modificados podem ser produzidos, por exemplo, por substituição, eliminação ou adição de aminoácidos.

Por exemplo, é razoável esperar que, por exemplo, uma substituição isolada de uma leucina com uma isoleucina ou valina, um aspartato com um glutamato, uma treonina com uma serina, ou uma substituição similar de um aminoácido com um aminoácido estruturalmente relacionado (isto é, mutações conservadoras) não terá um grande efeito sobre a atividade biológica da molécula resultante. Substituições conservadoras são aqueles que ocorrem dentro de uma família de aminoácidos que são relacionados em suas cadeias laterais. Aminoácidos geneticamente codificados podem ser divididos em quatro famílias: (1) ácidos = aspartato, glutamato; (2) básicos = lisina, arginina, histidina; (3) apoiares = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; e (4) polares descarregados = glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Fenilalanina, triptofano e tirosina são algumas vezes classificados juntamente como aminoácidos aromáticos. De forma semelhante, o repertório de aminoácidos pode ser agrupado em (1) ácidos = aspartato, glutamato, (2) básicos = lisina, arginina, histidina, (3) alifáticos = glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, com serina θ treonina sendo opcionalmente agrupadas separadamente como alifático-hidroxila, (4) aromáticos — fenilalanina, tirosina, triptofano, (5) amidas = asparagina, glutamina; e (6) contendo enxofre = cisteína e metionina. (ver, por exemplo, Biochemistry, 2^a ed. , Ed. por L. Stryer, W.H. Freeman e Co., 1981). Se uma mudança na seqüência de aminoácidos de um polipeptideo resulta em um homólogo funcional, pode ser facilmente determinado através da avaliação da capacidade do polipeptideo variante para produzir uma resposta nas células de forma semelhante à proteína tipo selvagem.

Quanto aos epítopos de interesse, referência é feita a Kendrew, THE ENCYCLOPEDIA OF MOLECULAR BIOLOGY (Blackwell Science Ltd., 1995) e Sambrook, e col. 1982. Um epitopo de interesse é uma região imunologicamente relevante de um imunógeno ou fragmento imunologicamente ativo do mesmo, por exemplo, de um patógeno ou toxina de interesse humano ou veterinário, por exemplo, o Vírus da Doença Equina Africana. Uma pessoa versada na técnica pode determinar um epítopo ou região imunodominante de um peptídeo ou polipeptideo e, por conseguinte, o DNA de codificação, a partir do conhecimento das sequências de aminoácidos e de DNA correspondentes do peptídeo ou polipeptideo, bem como da natureza de aminoácidos particulares (por exemplo, tamanho, carga, etc.) e o dicionário de códons, sem experimentação excessiva.

A seqüência de DNA preferencialmente codifica pelo menos regiões do peptídeo que geram uma resposta de anticorpo ou uma resposta de célula T. Um método para determinar os epitopos de células T e B envolve o mapeamento de epitopos. A proteína de interesse é sintetizada em peptídeos de sobreposição curtos (PEPSCAN). Os peptídeos individuais são a seguir testados quanto a sua capacidade de se ligar a um anticorpo suscitado pela proteína nativa ou para induzir a ativação de células T ou células B. Janis Kuby, (1992).

Outro método para determinar um epítopo de interesse é escolher as regiões da proteína que são hidrofílicas. Resíduos hidrofilicos estão frequentemente na superfície da proteína e são, portanto, frequentemente as regiões da proteína que são acessíveis ao anticorpo. Janis Kuby, (1992). Ainda outro método para escolher um epítopo de interesse que pode gerar uma resposta de célula T é identificar a partir da seqüência de proteína porções de ligação âncora HLA potenciais que são sequências de peptídeos que são conhecidas por serem susceptíveis a se ligarem à molécula de MHC.

O peptideo que é um epitopo putative de interesse, para gerar uma resposta de célula T, deve ser apresentado em um complexo MHC. 0 peptideo de preferência contém porções âncora adequadas para a liqação às moléculas de MHC, e deve se ligar com afinidade alta o suficiente para gerar uma resposta imune.

Algumas diretrizes na determinação se uma proteína é um epitopo de interesse que vai estimular uma resposta de células T incluem: comprimento do peptideo - o peptideo deve ter pelo menos 8 ou 9 aminoácidos de comprimento para se ajustar no complexo MHC classe I e pelo menos 13 a 25 aminoácidos de comprimento para se ajustar em um complexo MHC classe II. Este comprimento é um mínimo para o peptideo se ligar ao complexo MHC. É preferível que os peptídeos sejam maiores do que esses comprimentos porque as células podem cortar os peptídeos expressos. 0 peptideo deve conter uma porção âncora adequada que lhe permitirá ligar às várias moléculas de classe ou classe II com especificidade alta o suficiente para gerar uma resposta imune (Ver Bocchia, M. e col, ; Englehard, VH, (1994)). Isso pode ser feito, sem experimentação excessiva, por meio da comparação da seqüência da proteína de interesse com as estruturas publicadas de peptídeos associadas com as moléculas MHC.

Além disso, a pessoa versada na técnica pode determinar um epitopo de interesse comparando a sequência de proteína com as sequências listadas no banco de dados de proteínas.

Além disso, outro método é simplesmente gerar ou expressar partes de uma proteína de interesse, gerar anticorpos monoclonais para aquelas porções da proteína de interesse, e depois verificar se aqueles anticorpos inibem o crescimento in vitro do patógeno a partir do qual a proteína foi derivada. A pessoa versada na técnica pode usar as outras diretrizes estabelecidas nesta divulgação e na técnica para gerar ou expressar partes de uma proteína de interesse para analisar se os anticorpos correspondentes inibem o crescimento in vitro.

Em modalidades adicionais, a invenção fornece um vetor recombinante que compreende um ou mais ácido(s) nucleico(s) que codificam uma ou mais proteínas do Vírus da Doença Equina Africana, por exemplo, VP2 e/ou VP5, que tenham sido modificadas de sua forma nativa para superar um epitopo não neutralizante imunodominante. Epítopos não neutralizantes imunodominantes atuam como iscas contra epítopos neutralizantes, por exemplo, pelo direcionamento de uma resposta imune distante de um epitopo neutralizante. Epítopos não neutralizantes imunodominantes podem ser encontrados em proteínas imunogênicas de patógenos, como o Vírus da Doença Equina Africana.

A presente invenção engloba vetores recombinantes e vírus recombinantes modificados compreendendo ácidos nucleicos que codificam uma ou mais proteínas do Vírus da Doença Equina Africana que tenham sido modificados a partir de sua forma nativa, por exemplo, por deleção/deleções e/ou inserção/inserções e/ou substituição de resíduo(s) de aminoácido na seqüência nativa.

Quanto à “composição imunogênica, “composição imunológica e “vacina, uma composição imunológica contendo o vetor (ou um produto de expressão do mesmo) provoca uma resposta imunológica - local ou sistêmica. A resposta pode, mas não precisa ser protetora. Uma composição imunogênica contendo o recombinante ou vetor da invenção (ou um produto de expressão do mesmo) também provoca uma resposta imunológica local ou sistêmica, que pode, mas não precisa ser, protetora. Uma composição de vacina provoca uma resposta protetora local ou sistêmica. Assim, os termos composição imunológica e “composição imunogênica incluem uma “composição de vacina (uma vez que os dois primeiros termos podem ser composições protetoras). A invenção compreende composições imunológicas, imunogênicas ou de vacina.

De acordo com a presente invenção, o vetor recombinante, por exemplo, vírus, como poxvirus, expressa produtos gênicos do(s) gene(s) ou molécula (s) de ácido nucleico do Vírus da Doença Equina Africana estrangeiro. Proteínas virais específicas do Vírus da Doença Equina Africana ou moléculas de ácido nucleico específicas que codificam epitopo(s) a partir de proteínas virais específicas do Vírus da Doença Equina Africana é/são inseridas no vetor recombinante, por exemplo, o vírus, tal como vetor poxvirus, e o vetor resultante, por exemplo, vírus recombinante como poxvirus, é usado para infectar um animal ou expressar o(s) produto (s) in vitro para administração ao animal. A expressão no animal de produtos do gene do Vírus da Doença Equina Africana, resulta em uma resposta imune no animal ao Vírus da Doença Equina Africana. Desta forma, o vetor recombinante, por exemplo, vírus, como poxvirus recombinante da presente invenção, pode ser usado em uma composição imunológica ou vacina para fornecer um meio para induzir uma resposta imune.

O procedimento de administração para um vetor recombinante, por exemplo, o vírus recombinante, como o poxvirus recombinante-AHSV ou produto de expressão do mesmo, bem como para as composições da invenção, como composições imunológicas ou de vacina ou composições terapêuticas (por exemplo, composições contendo o vetor recombinante ou vírus recombinante, como poxvirus, ou o produto de expressão dos mesmos) pode ser através de uma via parenteral (intradérmica, subcutânea ou intramuscular) . Tal administração permite uma resposta imune sistêmica, ou respostas humorais ou mediadas por células.

vetor ou virus recombinante-AHSV, por exemplo, poxvirus-AHSV, ou produto de expressão dos mesmos, ou composição contendo tal produto de expressão e/ou vetor ou vírus, pode ser administrado a cavalos de qualquer idade ou sexo; por exemplo, para provocar uma resposta imunológica contra o Vírus da Doença Equina Africana, por exemplo, para assim evitar o Vírus da Doença Equina Africana e/ou outras sequelas patológicas associadas com o Vírus da Doença Equina Africana. Vantajosamente, o vetor ou vírus recombinante-AHSV, por exemplo, poxvirus-AHSV, ou produto de expressão dos mesmos, ou composição contendo tal produto de expressão e/ou vetor ou vírus, é administrado aos cavalos, incluindo um recém-nascido e/ou a uma égua grávida para conferir imunidade ativa durante a gestação e/ou imunidade passiva ao recém-nascido através dos anticorpos maternos. Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona a inoculação de um cavalo do sexo feminino (por exemplo, égua) com uma composição compreendendo um imunógeno do Virus da Doença Equina Africana ou um epitopo de interesse de tal imunógeno, por exemplo, um imunógeno de VP2 e/ou VP5 de AHSV e/ou um epitopo de interesse expresso por qualquer uma ou mais dessas VPs ou combinações de VPs, e/ou com um vetor expressando tal imunógeno ou epitopo de interesse. A inoculação pode ser anterior à reprodução, e/ou antes da cobertura, e/ou durante a gestação (ou prenhez), e/ou antes do período perinatal, e/ou repetidamente ao longo da vida. Vantajosamente, pelo menos uma inoculação é feita antes da cobertura. Também é vantajosamente seguido por uma inoculação a ser realizada durante a gestação, por exemplo, aproximadamente no meio da gestação (cerca de 5 a 6 meses de gestação) e/ou no final da gestação (ou em cerca de 10 a 11 meses de gestação) . Assim, um regime vantajoso é uma inoculação antes da cobertura e uma inoculação de reforço durante a gestação. Posteriormente, pode haver reinoculação antes de cada cobertura e/ou durante a gestação, aproximadamente no meio da gestação (cerca de 5 a 6 meses de gestação) e/ou no final da gestação (ou em cerca de 10 a 11 meses de gestação). De preferência, a reinoculação pode ser somente durante a gestação. Em outra modalidade preferida, potros, como potros de fêmeas vacinadas (por exemplo, inoculadas como aqui discutido), são inoculados nos primeiros meses de vida, por exemplo, inoculação em três e/ou quatro, e/ou quatro e/ou cinco, e cinco e/ou seis e seis meses de vida. Ainda mais vantajoso, tais potros são então reforçados de duas (2) a oito (8) semanas depois (após serem inoculados pela primeira vez). Assim, tanto à prole como ao cavalo do sexo feminino (por exemplo, a égua) podem ser administradas composições da invenção e/ou podem ser objeto do desempenho dos métodos da invenção. As inoculações podem ser em doses como aqui descritas. Com relação à administração de poxvirus ou composições de vírus e imunidade maternal, é feita referência à Patente Americana No. 5,338,683.

Com relação às dosagens, vias de administração, formulações, adjuvantes e usos para os vírus recombinantes e produtos de expressão dos mesmos, as composições da invenção podem ser usadas para administração parenteral ou de mucosa, preferencialmente pelas vias intradérmica, subcutânea ou intramuscular. Quando a administração pela mucosa é usada, é possível a utilização das vias oral, ocular ou nasal. A invenção em ainda mais um aspecto se refere ao produto da expressão do recombinante ou vetor da invenção, por exemplo, vírus, por exemplo, poxvirus recombinante, e utiliza, portanto, como tal para formar composições imunológicas ou de vacina para o tratamento, prevenção, diagnóstico ou testes; e ao DNA dos vírus recombinantes ou da invenção, por exemplo, poxvirus, que é útil na construção de sondas de DNA e iniciadores de PCR.

As composições imunológicas, composições de vacina ou composições terapêuticas do vetor recombinante ou virusAHSV (por exemplo, recombinantes poxvirus-AHSV) da invenção podem ser preparadas de acordo com técnicas padrão bem conhecidas pelas pessoas versadas na técnica farmacêutica ou veterinária. Tais composições podem ser administradas em dosagens e por técnicas bem conhecidas pelas pessoas versadas nas técnicas veterinárias, levando em consideração fatores como idade, sexo, peso e via de administração. As composições podem ser administradas isoladamente, ou podem ser coadministradas ou administradas sequencialmente com composições, por exemplo, com outra composição imunológica, ou vacina recombinante atenuada, inativada, ou composições terapêuticas proporcionando assim composições multivalentes o de coquetel ou de combinação da invenção e métodos utilizando as mesmas. A composição pode conter combinações do componente do Virus da Doença Equina Africana (por exemplo, vetor recombinante, como um plasmídeo ou virus ou poxvirus expressando um imunógeno ou epitopo de interesse do Vírus da Doença Equina Africana e/ou um imunógeno ou epitopo de interesse do Vírus da Doença Equina Africana) e uma ou mais vacinas de patógeno equino não relacionado (por exemplo, epítopo (s) de interesse, imunógeno(s) e/ou vetores recombinantes ou vírus como um vírus recombinante, por exemplo, poxvirus recombinante expressando tal/tais epítopo(s) ou imunógeno(s) ) como um ou mais imunógenos ou epitopos de interesse de um ou mais patógenos bacterianos e/ou virais equinos, por exemplo, um epítopo de interesse ou imunógeno de um ou mais dentre: herpes vírus equino (EHV), vírus influenza equino (EIV), Vírus do Nilo Ocidental (WNV) em cavalos, encefalomielite equina oriental (EEE), encefalomielite equina ocidental (WEE) e encefalomielite equina venezuelana (VEE), tétano, raiva, e febre equina de Potomac + EPM. Novamente, os ingredientes e o modo (sequencial ou coadministração) de administração, bem como as dosagens podem ser determinadas levando em consideração tais fatores como idade, sexo, peso e via de administração. Sob este aspecto, é feita referência à Patente Americana No. 5,843,456, aqui incorporada por referência, e direcionada às composições de raiva e composições de combinação e usos das mesmas.

Exemplos de composições da invenção incluem preparações líquidas para administração por via mucosa, por exemplo, administração oral, nasal, ocular, etc., como suspensões e preparações para administração parenteral, subcutânea, intradérmica, intramuscular (por exemplo, administração injetável), tais como suspensões ou emulsões estéreis. Em tais composições, o poxvirus recombinante ou imunógenos podem ser misturados com um veículo, diluente ou excipiente adequado, como água estéril, salina fisiológica ou semelhante. As composições também podem ser liofilizadas ou congeladas. As composições podem conter substâncias auxiliares, tais como agentes umidificantes ou emulsificantes, agentes tamponantes de pH, adjuvantes, conservantes e semelhantes, dependendo da via de administração e da preparação desejada.

As composições podem conter pelo menos um composto adjuvante escolhido a partir de hidróxido de alumínio, um óleo metabolizável, compreendendo hidrocarbonetos terpênicos e um copolímero em bloco de polioxietilenopolioxipropileno, os polímeros do ácido acrílico ou metacrílico, os copolímeros de anidrido maleico e derivados de alquenila e matriz de complexo imunoestimulante (ISCOM) compreendendo glicosídeos de QUIL A, colesterol, antígeno e/ou fosfolipídeos.

Os compostos adjuvantes preferidos são os polímeros do ácido acrílico ou metacrílico, que são reticulados, especialmente com polialquenil éteres de açúcares ou poliálcoois. Estes compostos são conhecidos pelo termo

CARBOMER (Pharmeuropa vol. 8, No. 2, junho 1996). As pessoas versadas na técnica também podem se referir à Patente Americana No. 2,909,462 (incorporada aqui por referência), que descreve tais polímeros acrílicos reticulados com um composto poliidroxilado tendo pelo menos 3 grupos hidroxila, de preferência não mais do que 8, os átomos de hidrogênio de pelo menos três hidroxilas sendo substituídos por radicais alifáticos insaturados tendo pelo menos 2 átomos de carbono. Os radicais preferidos são aqueles contendo de 2 a 4 átomos de carbono, por exemplo, grupos vinila, alila e outros etilenicamente insaturados. Os radicais insaturados podem eles próprios conter outros substituintes, tal como metila. Os produtos vendidos sob o nome CARBOPOL® (BE Goodrich, Ohio, EUA) são particularmente adequados. Eles são reticulados com alilsacarose ou com alilpentaeritritol. Dentre estes, podem ser mencionados CARBOPOL® 974P, 934P e 971P.

Entre os copolímeros de anidrido maleico e derivados de alquenila, os copolímeros EMA® (Monsanto), que são copolímeros do anidrido maleico e etileno, lineares ou reticulados, por exemplo, reticulados com éter divinílico, são preferidos. Referência pode ser feita a J. Fields e col., 1960, aqui incorporado por referência.

Do ponto de vista de suas estruturas, os polímeros do ácido acrílico ou metacrílico e os copolimeros EMA® são preferivelmente formados de unidades básicas da seguinte fórmula :

F?i (CH₂)_x----C—(CH₂)_y

COOH em que :

Ri e

R₂, que são idênticos ou diferentes, representam H ou CH₃ ou 1, de preferência x = ou 2, com x +

Para os copolimeros

EMA®, y = 2. Para os carbômeros, y = 1.

dissolução desses polímeros água leva uma solução ácida que será neutralizada, de preferência até pH fisiológico, a fim de fornecer a solução adjuvante na qual a própria vacina será incorporada. Os grupos carboxila do polímero se encontram, então, parcialmente na forma COO .

De preferência, uma solução de adjuvante de acordo com a invenção, especialmente de carbômero, é preparada em água destilada, de preferência na presença de cloreto de sódio, a solução obtida estando em pH ácido. Esta solução estoque é diluída adicionando-a à quantidade desejada (para a obtenção da concentração final desejada), ou uma parte substancial da mesma, de água saturada com NaCl, de preferência salina fisiológica (NaCl 9 g/1) de uma só vez, em diversas porções com neutralização concomitante ou subsequente (pH 7,3 a 7,4), de preferência com NaOH. Esta solução em pH fisiológico será utilizada como tal para mistura com a vacina, que pode ser especialmente armazenada na forma liofilizada, líquida ou congelada.

A concentração de polímero na composição final de vacina será de 0,01% a 2% p/v, mais particularmente de 0,06 a 1% p/v, de preferência de 0,1 a 0,6% p/v.

As composições da invenção também podem ser formuladas como emulsões óleo em água ou água em óleo em água, por exemplo, como em V. Ganne e col. (1994).

Textos clássicos, como REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE, 17^a edição, 1985, incorporado por referência neste documento, podem ser consultados para preparar preparações adequadas, sem experimentação excessiva.

Composições em formas para várias vias de administração são previstas pela invenção. E, novamente, a dosagem eficaz e via de administração são determinadas por fatores conhecidos, como idade, sexo, peso e outros procedimentos de varredura que são conhecidos e não necessitam de experimentação excessiva. As doses de cada agente ativo podem ser como nos documentos aqui citados (ou documentos referenciados ou citados nos documentos aqui citados).

Vetores recombinantes podem ser administrados em uma quantidade adequada para a obtenção de expressão in vivo correspondente às dosagens aqui descritas e/ou nos documentos aqui citados. Por exemplo, faixas adequadas para suspensões virais podem ser determinadas empiricamente. O vetor viral ou recombinante na invenção pode ser administrado a um cavalo ou infectado ou transfectado em células em uma quantidade de cerca de pelo menos 10³ UFP; mais preferivelmente de cerca de 10⁴ UFP a cerca de IO¹⁰UFP, por exemplo, de cerca de 10⁵ UFP a cerca de 10⁹ UFP, por exemplo, de cerca de 10⁶ UFP a cerca de 10⁸ UFP por dose, por exemplo, por 2 ml de dose. E, se mais de um produto gênico for expresso por mais de um recombinante, cada recombinante pode ser administrado nestas quantidades; ou cada recombinante pode ser administrado de forma que haja, em combinação, uma soma de recombinantes compreendendo essas quantidades. Nas composições de vetor recombinante empregadas na invenção, as dosagens podem ser conforme descritas nos documentos aqui citados ou como aqui descrito ou como nos documentos referenciados ou citados nos documentos aqui citados. Por exemplo, quantidades adequadas de cada DNA em composições de vetor recombinantes podem ser de 1 gg a 2 mg, de preferência de 50 μς a 1 mg. Os documentos citados aqui (ou documentos citados ou referenciados nos documentos aqui citados) considerando vetores de DNA podem ser consultados pela pessoa versada na técnica para determinar outras dosagens adequadas para composições de vetor de DNA recombinante da invenção, sem experimentação excessiva.

No entanto, a dosagem da(s) composição/composições, concentração de componentes nela e momento de administração das composições que provocam uma resposta imunológica adequada podem ser determinados por métodos como titulação de anticorpos do soro, por exemplo, por ELISA e/ou análise de ensaio de soroneutralização e/ou por avaliação do desafio de vacinação em cavalos. Tais determinações não requerem experimentação excessiva a partir do conhecimento da pessoa versada na técnica, dessa divulgação e dos documentos aqui citados. Ε, o momento para as administrações sequenciais pode ser igualmente determinado com métodos averiguáveis a partir desta divulgação e o conhecimento na técnica, sem experimentação excessiva.

O imunógeno ou epitopo de interesse do Vírus da Doença Equina Africana pode ser obtido a partir de qualquer um dos nove sorotipos do Vírus da Doença Equina Africana ou pode ser obtido a partir da expressão recombinante in vitro do(s) gene(s) do Vírus da Doença Equina Africana ou porções dos mesmos. Métodos para fazer e/ou usar vetores (ou recombinantes) para a expressão e utilização de produtos de expressão e produtos destes (tais como anticorpos) podem ser por ou análogos aos métodos divulgados nos documentos aqui citados e nos documentos referenciados ou citados nos documentos aqui citados.

Dosagens adequadas podem também ser baseadas nos exemplos abaixo.

A invenção em um aspecto particular é direcionada aos poxvirus recombinantes contendo neles uma seqüência de DNA do Vírus da Doença Equina Africana, vantajosamente em uma região não essencial do genoma poxvirus. Os poxvirus recombinantes expressam produtos gênicos do gene do Vírus da Doença Equina Africana estrangeiro. Em particular, os genes VP2 e VP5 que codificam proteínas virais do Vírus da Doença Equina Africana foram isolados, caracterizados e inseridos em recombinantes ALVAC (vetor canaripox).

Uma modalidade da invenção se refere a uma nova cepa de AHSV, a saber, Cepa AHSV4-Jane.

Tendo assim descrito em detalhes as modalidades preferidas da presente invenção, é preciso entender que a invenção definida pelos parágrafos acima não deve ser limitada a detalhes particulares estabelecido na descrição acima, uma vez que muitas variações das mesmas são possíveis sem se afastar do espírito ou do escopo da presente invenção.

A invenção será agora adicionalmente descrita por meio dos seguintes exemplos não limitadores.

EXEMPLOS

Sem elaboração adicional, acredita-se que uma pessoa versada na técnica possa, usando as descrições anteriores, praticar a presente invenção em toda a sua extensão. Os seguintes exemplos detalhados devem ser interpretados como meramente ilustrativos, e não como limitações da divulgação precedente de forma alguma. As pessoas versadas na técnica irão reconhecer prontamente variações apropriadas dos procedimentos tanto para os reagentes e quanto às condições e técnicas reacionais.

A construção das inserções de DNA, plasmídeos e vetores virais recombinantes foi realizada utilizando as técnicas de biologia molecular padrão descritas por J. Sambrook e col. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^aEdição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989). Todos os fragmentos de restrição utilizados para a presente invenção foram

isolados usando

o kit Geneclean (BIO 101 Inc., La Jolla,

Califórnia).

EXEMPLO 1:

Construção dos vetores virais recombinantes

de canaripox.

Genes sintéticos que codificam as proteínas VP2 e VP5 do Vírus da Doença Equina Africana foram utilizados na construção de um vetor do vírus canaripox recombinante. Resumidamente, os segmentos de gene L2 e M5 que codificam,

respectivamente,

VP2 e VP5 dos sorotipos 4, 5 e 9 do Virus

da Doença Equina Africana foram amplificados pela reação em cadeia da poümerase de transcriptase reversa (RT-PCR) e sequenciados utilizando um protocolo previamente descrito

por Bonneau KR,

Mullens B A, (2001) Bonneau KR, e col.

1999).

As sequências dos genes L2/VP2 (SEQ ID NO:48) e M5/VP5

SEQ ID NO:50)

de um isolado de campo virulento de AHSV-4

(doravante designada como a Cepa AHSV4 Jane) foram comparadas com as sequências publicadas dos mesmos genes de outras cepas de AHS sorotipo 4 disponíveis no GenBank, e sequências sintéticas otimizadas foram, a seguir, derivadas usando o software GeneOptimizer® (Geneart GmbH) para a síntese química de um arranjo de oligonucleotídeos, que englobam cada gene individual. Os oligonucleotídeos foram montados usando uma estratégia baseada em PCR para gerar as sequências codificadoras de VP2 e VP5 sintéticas de comprimento total, completas. Os genes sintéticos que codificam VP2 e VP5 foram então subclonados no vetor de vírus canaripox para produzir o AHSV-vírus canaripox recombinante (AHSV-CP), essencialmente como descrito anteriormente para a vacina do vírus do Nilo Ocidental vetorizada do vírus canarypox recombinante (WNV-CP) (Minke JM, e col. 2004a).

Resumidamente, o gene sintético que codifica VP2 de AHSV-4 (SEQ ID NO:4) foi subclonado em um vetor de inserção C3 canaripox (plasmídeo contendo um promotor H6 do vírus vaccinia e os braços flanqueadores do locus C3 de canaripox) para gerar um cassete de expressão contendo o gene VP2 (SEQ ID NO: 4) sob o controle do promotor H6. Subsequentemente, um cassete de expressão contendo o gene VP5 sintético (SEQ ID NO: 5) sob o controle do promotor de 42K de Amsacta moorei de entomopoxvírus foi construído e clonado no plasmídeo doador H6-VP2. O plasmídeo de inserção resultante continha dois cassetes de expressão, o gene VP2 (SEQ ID NO: 4) sob o controle do promotor H6 e o gene VP5 (SEQ ID NO: 5) sob o controle do promotor de 42K, em uma orientação cabeça-cauda.

Para gerar o recombinante de vírus AHSV-CP, o plasmídeo de inserção foi transfectado em células primáias de fibroblasto de embrião de galinha (CEF) que foram subsequentemente infectadas com o virus canaripox. Após 24 horas, as células infectadas-transfectadas foram coletadas, submetidas ao ultrassom e utilizadas para a varredura do vírus recombinante (Piccini A, e col. (1987)). As placas recombinantes foram rastreadas pelo método de hibridização de levantamento de placa in situ (Sambrook e col., 1982) utilizando uma sonda AHSV específica. Após 4 ciclos sequenciais de purificação da placa, o recombinante confirmado pela hibridação como sendo 100% positivo para a inserção do Vírus da Doença Equina Africana foi amplificado e utilizado para preparar estoques de vacina que foram armazenados a -80°C.

EXEMPLO 2: Construção do plasmídeo doador pLHD3460.4 expressando a AHSV-4 VP2 sintética direcionada por promotor H6 e AHSV-4-VP5 sintética direcionada por promotor de 42K

A Figura 1 mostra o esquema de construção para pLHD3460.4 (SEQ ID NO:6), o plasmídeo doador 03 para a geração do recombinante ALVAC expressando as proteínas virais AHSV-4-VP2 e AHSV-4-VP5. Os genes que codificam AHSV-4-VP2 (SEQ ID NO: 4) e AHSV-4-VP5 (SEQ ID NO: 5) são sintéticos com otimização de códon para expressão em células de mamíferos. 0 gene AHSV-4-VP2 sintético (SEQ ID NO: 4) foi colocado sob o controle do promotor pC3H6p de vaccinia e o gene AHSV-4-VP5 (SEQ ID NO:5) sintético foi colocado sob o controle do promotor 42K de vaccinia. Ο plasmídeo também contém um gene que confere resistência à ampicilina.

O plasmídeo contendo o gene AHSV-4-VP2 sintético foi digerido com BamHI e NruI. A inserção AHSV-4-VP2 de 3,2 Kb resultante foi isolada e clonada nos sítios BamHI/NruI de um vetor de transporte preparado a partir de pJY1107.5 (pF8 AIV H7N2 HA) para criar . pLHD3410.9 (pF8 H6p AHSV-4-VP2), que contém o sítio NruI do promotor H6 e o AHSV-4-VP2 de comprimento total, seguido pelo sítio Xhol.

pLHD3410.9 foi digerido novamente com NruI e Xhol, e um fragmento de DNA de 3,2 Kb compreendendo NruI 3' do promotor H6 e o gene AHSV—4—VP2 de comprimento total foi isolado e clonado nos sítios Nrul/Xhol de um plasmídeo doador C3 ALVAC preparado a partir de pJY1738.2 (pC3 H6p CPV-VP2) para criar pLHD3426.1, um plasmídeo doador C3 ALVAC contendo o cassete de expressão H6p-AHSV-4-VP2.

Um cassete de expressão 42Kp-AHSV-4-VP5 flanqueado pelo sítio Spel foi amplificado por PCR usando o plasmídeo contendo AHSV-4-VP5 como modelo e um par de iniciadores 13599.JY (SEQ ID NO:7) e 13600.JY (SEQ ID NO:8). O iniciador 13599.JY (SEQ ID NO:7) compreende o sítio Spel e a seqüência do promotor 42K seguida pela seqüência 5' do

VP5. O iniciador 13600.JY (SEQ ID NO:8) consiste da sequência 3' de VP5 seguido por T5NT e sitio Spel. 0 cassete de expressão amplificado foi então clonado em pCR2.1, um vetor TOPO, para criar pCR2.1 42Kp AHSV-4-VP5, que foi confirmado como contendo a seqüência correta.

O plasmideo pCR2.1 AHSV-4-VP5 foi digerido com Spel, e o cassete expressando 42Kp-VP5 foi então isolado e clonado no sitio Spel do plasmideo pLHD3426.1 para criar um plasmideo doador C3 ALVAC contendo os cassetes de expressão dupla H6p-AHSV-4-VP2/42Kp-VP5 (pLHD3460.4), que foi sequenciado e confirmado como contendo as sequências corretas conforme estabelecido pela SEQ ID NO:6.

Os iniciadores para a amplificação do cassete expressando 42Kp-AHSV-4-VP5 foram os seguintes: 13599.JY (SEQ ID NO:7)

5' TGACTAGTTC7VWXTTGAA7V\TATATAATTACAATATAAAATGGGCAAGTTTACCAGCTTCCTG7\AG

Spel 42Kp

13600.JY (SEQ ID NO:8)

5' TTAACTAGTAGAAAAATCATCAGGCGATCTTCACGCCGTACAG

Spel T5NT

Os pesos moleculares previstos foram de 124,3 kDa para AHSV-4-VP2 (SEQ ID NO:1) e 57 KDa para AHSV-4-VP5 (SEQ ID NO:2). Os pontos isoelétricos foram 6,75 para AHSV-4-VP2 e

5,8 para AHSV-4-VP5. Ambas as proteínas virais foram expressas primariamente no citoplasma.

EXEMPLO 3: Construção do vetor viral recombinante VCP2377 (ALVAC C3 H6p-AHSV-4-VP2 sintético / AHSV-4-VP5 42 Kp sintético)

Para produzir o vetor viral recombinante vCP2377, o plasmídeo doador pLHD3460.4 (SEQ ID NO:6), e o vírus de origem, ALVAC (4,4 x IO¹⁰ UFP/ml), foram recombinados in vitro utilizando células primárias de fibroblasto de embrião de galinha (CEE primárias, ou CEE) . A FIGURA 3 resume este procedimento. A hibridização em placa por sonda AHSV-4-VP5 específica foi utilizada para confirmar o vetor viral recombinante.

A recombinação in vitro (IVR) foi realizada por transfecção de células CEF primárias com o plasmídeo doador NotI-linearizado pLHD3460.4 (15 μρ) , utilizando o reagente de Fugene (Roche, Paio Alto, Califórnia 94304-1353) . As células transfectadas foram subsequentemente infectadas com ALVAC (4,4 x IO¹⁰ UFP/ml) conforme o vírus de resgate em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10. Após 24 horas, as células transfectadas-infectadas foram coletadas, submetidas ao ultrassom e utilizadas para a varredura do vírus recombinante.

As placas recombinantes foram testadas com base no método de hibridização de levantamento em placa (Sambrook e col., 1982) usando uma sonda AHSV-4-VP5 específica que foi marcada com peroxidase de rábano silvestre, de acordo com o protocolo do fabricante (Amersham, Alpharetta, GA 30058, Cat #RPN3001). Após 3 ciclos sequenciais de purificação de placa, o recombinante designado como vCP2377.6.1.1 (seqüência parcial dada pela SEQ ID NO:17) foi gerado e confirmado por hibridação como 100% positivo para a inserção AHSV e 100% negativo para o sítio C3 vazio.

Placas individuais foram selecionadas a partir do ciclo final de purificação da placa, e expandidas para obter os estoques PI (frasco T-25), P2 (frasco T-75) e P3 (garrafa cilíndrica) para amplificar vCP2377.6.1.1. O recombinante foi reconfirmado no nível P2 por hibridação e considerado como sendo 100% positivo para a inserção e 100% negativo para os loci C3 vazios. 0 fluido de cultura celular infectada a partir das garrafas cilíndricas foi coletado e concentrado para produzir o estoque de vírus (3,2 ml de vCP2377.6.1.1 a l,2xlO¹⁰ UFP/ml). Anticorpo monoclonal anti-BTV4-VP2 de camundongo e anti-VP5 AHSV de camundongo 10AE12 Passagem 9 (Martinez-Torrecuadrada, J e col., Virology 257, 449-459, 1999) foram utilizados para

Western blot e Imunoplaqueamento (Figura 7 e Figura 8, respectivamente).

As células utilizadas na recombinação in vitro foram células primárias de fibroblastos de embriões de galinha (CEF primárias) que cresceram em 10% de soro fetal bovino (FBS) (JRH bioscience, Lenexa, KS 66215: γ-irradiado cat#12107, Lote #1LO232), meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Invitrogen/BRL/Gibco, Carlsbad, Califórnia, 92008-7321, Cat# 11960) suplementado com glutamina 4 mM (Invitrogen/BRL/Gibco, Carlsbad, Califórnia, 92008-7321, cat #25030-081) e piruvato de sódio 1 mM (Invitrogen/BRL/Gibco cat #11360-070) na presença de Ix antibióticos/antimicóticos (P/S/A/A, Invitrogen/BRL/Gibco cat# 15240-062). Fugene (Roche, Lote #181444). Os concentrados de virus finais foram ressuspensos em Tris 1 mM, pH 9,0.

EXEMPLO 4: Análise do vetor viral recombinante vCP2377 (ALVAC 03 H6p-AHSV-4-VP2 sintético / AHSV-4-VP5 42Kpsintético)

O estoque P3 foi reconfirmado por hibridação, como 100% positivo para as inserções AHSV-4-VP2 e AHSV-4 VP5, e 100% negativo para os loci C3 vazios. Um mapa de restrição teórico do DNA genômico (Figura 4) foi criado em Vetor NTI (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia) . Para realizar o experimento de vida real, o DNA genômico foi extraído dos concentrados de vírus vCP2377.6.1.1 e digerido com BamHI, HindIII ou PstI, e separado por eletroforese em gel de agarose a 0,8% (Figura 5). Os resultados revelaram a correta inserção da seqüência do gene estrangeiro.

Southern blot: O DNA genômico digerido com BamHI, HindIII ou PstI foi transferido para membrana de náilon e análise de Southern blot foi realizada por sondagem com a sonda AHSV-4-VP2. As bandas de tamanho esperado foram observadas, a saber, 16047pb, 6971pb BamHI, 20660pb HindIII e 13658pb, 4061pb PstI. Os resultados indicaram a correta inserção de AHSV-4-VP2 e AHSV-4-VP5 nos loci C3. (Figura 6) .

Análise de expressão: Células CEF primárias foram infectadas com o estoque P3 de vCP2377.6.1.1 em um MOI de 10 e incubadas a 37°C por 24 h. As células e sobrenadante da cultura foram a seguir coletados. As proteínas da amostra foram separadas em gel SDS-PAGE 10%, transferidas para membrana de náilon IMMOBILON e sondadas separadamente com o anticorpo anti-VP5 de AHSV (vírus da doença equina africana) de camundongo 10AE12 de passagem 9 (MartinezTorrecuadrada, J e col., 1999) em uma diluição de 1:100. Antissoro anti-camundongo de cabra conjugado com peroxidase foi utilizado como anticorpo secundário e as bandas foram visualizadas usando reagentes de detecção Amersham. Com o uso do mAb anti-AHSV VP5 de camundongo, as bandas de proteínas entre 55 a 70 KDa foram detectadas nos péletes celulares de VCP2377.6.1.1, indicando a expressão da proteína AHSV-4-VP5. (Figura 7). A expressão da proteína AHSV-4-VP5 não foi detectada no meio de cultura. A expressão da proteína AHSV-4-VP2 não foi detectada pelo mAb anti-BTV4-VP2 de camundongo (material de propriedade da Merial).

Immunoplaqueamento: A homogeneidade da população vCP2377.6.1.1 foi de 100% como evidenciado por um ensaio de imunoplaqueamento, usando mAb anti-AHSV VP5 de camundongo 10AE12 de passagem 9 (Martinez-Torrecuadrada, J e col., 1999) em uma diluição de 1:100 (Figura 8) . O anticorpo Anti-AHSV VP2 não estava disponível.

Análise de Sequência: Uma análise mais detalhada do DNA genômico estoque P3 foi realizada utilizando amplificação por PCR e análise de seqüência dos braços flanqueadores do locus C3 e as inserções AHSV-4-VP2 e AHSV4-VP5. Os iniciadores 8103.JY (SEQ ID NO:13) / 13616.LH (SEQ ID N0:15) e 13637.LH (SEQ ID NO:16) / 8104.JY (SEQ ID NO:14) foram utilizados para amplificar todo o fragmento C3R-AHSV-4-VP2/VP5-inserções-C3L (Figura 9). A sequência resultante, a saber, SEQ ID NO: 17, indicou que as sequências das inserções AHSV-4-VP2 e AHSV-4-VP5 e as ramificações C3 esquerda e direita ao redor das inserções AHSV em VCP2377.6.1.1 estavam corretas.

Iniciadores para amplificar a sonda AHSV-4-VP2

13625.LH (SEQ ID NO:9) 5' TACGACCACGGCACCGACATCATCT 3'

13632.LH (SEQ ID NO:10) 5' TTTTCAGCTTCTTAAAGGCGTACTC 3' Iniciadores para amplificar a sonda AHSV-4-VP5

13615.LH (SEQ ID NO:11) 5'AAGAAGATGTACAAGCTGGCCGGCA 3' 13620.LH (SEQ ID NO:12) 5' GCCGCTCGTATTCCTGCTTCACGAT 3' Iniciadores para amplificação por PCR das ramificações C3 vCP2377 mais a inserção

8103. JY (SEQ ID NO: 13) 5' GAGGCATCCAACATATAAAGAAGACTAAAG 3'

8104. JY (SEQ ID NO:14) 5' TAGTTAAATACTCATAACTCATATCTG 3'

13616.LH (SEQ ID NO:15) 5' TGCCGGCCAGCTTGTACATCTTCTT 3'

13637.LH (SEQ ID NO:16) 5' CACCACACTGAAGCTGGACAGAAGA 3'

EXEMPLO 5: Construção do plasmídeo doador pCXL2415.1 expressando a AHSV-9-VP2 sintética direcionado por promotor H6 e a AHSV-9-VP5 sintética direcionada por promotor de 42K

O esquema de construção geral para pCXL2415.1 (SEQ ID NO:22) é mostrado na Figura 10. O plasmídeo contendo AHSV9-VP2 sintético (SEQ ID NO:28) foi digerido com NruI/BamHI, e o fragmento de 3188 pb foi isolado e clonado em pJY1107.5 (pF8 H6p-AIV H7N2 HA) NruI/BamHI-linearizado. O plasmídeo resultante, pCXL2275.1 (PF8 H6p-AHSV-9-VP2), contém o sítio

Nrul do promotor H6 e o AHSV-9-VP2 de comprimento total, seguido pelo sítio Xhol. Após a confirmação da seqüência, pCXL2275.1 foi digerido com Nrul/Xhol, e o fragmento AHSV9-VP2 de 3194 pb foi isolado e clonado em pJY1738.2 Nrul/ Xhol-digerido (o plasmideo doador de C3 ALVAC). O plasmideo resultante, pCXL2328.4 (pC3 H6p-AHSV-9-VP2) contém o cassete de expressão H6p-AHSV-9-VP2.

Para produzir um cassete de expressão 42Kp-AHSV-9-VP5, o DNA que codifica o gene VP5 sintética de AHSV-9 foi amplificado por PCR usando os iniciadores 18020CXL (SEQ ID NO:23) e 18021CXL (SEQ ID NO:24). 0 produto de PCR foi subsequentemente clonado usando o vetor TOPO pCR2.1 para criar o plasmideo pCXL2313.2 (pCR2.1 42Kp-VP5). Contudo, foi constatado que pCXL2313.2 não contem a sequência TN5T no final do gene VP5 devido ao design do iniciador 18020CXL. Portanto, um novo conjunto de iniciadores, 18041CXL (SEQ ID NO:46) e 18042CXL (SEQ ID NO:47), foi sintetizado e utilizado para introduzir a seguência T5NT no final do gene VP5 no plasmideo pCXL2313.2. A mutagênese direcionada a sítio foi realizada usando o kit QuickChange da Stratagene, e o plasmideo resultante, pCXL2399.3, foi sequenciado e confirmado como contendo o cassete de expressão correto 42Kp-AHSV-9~VP5 flanqueado pelos sítios Spel.

O plasmídeo pCXL2399.3 foi subsequentemente digerido com Spel, e o fragmento de 1556 pb contendo o cassete de expressão 42Kp-AHSV-9-VP5 foi isolado e clonado no sítio Spel do plasmídeo pCXL2328.4 para criar pCXL2415.1 (SEQ ID NO:22), que é um doador de C3 ALVAC contendo os cassetes de expressão dupla H6p-AHSV-9-VP2/42Kp-AHSV-9-VP5 em uma orientação cabeça-cauda (Figura 11). Os pesos moleculares previstos para AHSV-9-VP2 e AHSV-9-VP5 são 123,5 KDa e 56,8 KDa, respectivamente. Os pontos isoelétricos para VP2 e VP5 são 8,14 e 5,96, respectivamente, e as proteínas expressas principalmente no citoplasma.

EXEMPLO 6: Construção do vetor viral recombinante VCP2383 (ALVAC C3 H6p-AHSV-9-VP2 sintética/42Kp-AHSV-9-VP5 sintética)

O vetor viral recombinante vCP2383 foi produzido de acordo com o esquema de recombinação in vitro (IVR) representado na Figura 12. 0 IVR foi realizado pela transfecção de células primárias de fibroblasto embrionárias de galinha (CEF) com 13,2 pg do plasmídeo doador Sapl-linearizado pCXL2415.1 usando o reagente de transfecção FuGENE® HD (Roche, Cat #04709705001). As células CEF transfectadas foram subsequentemente infectadas com ALVAC (4,4 x 10¹⁰ UFP/ml) como o vírus de resgate em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10. Após 24 horas, as células transfectadas-infectadas foram coletadas, submetidas ao ultrassom e usadas para a varredura de vírus recombinante.

As placas recombinantes foram testadas com base no método de hibridização de levantamento em placa (Sambrook e col., 1982) usando a sonda específica AHSV-9-VP5, que foi marcada com peroxidase do rábano silvestre de acordo com o protocolo do fabricante (Amersham Cat# RPN3001). Após 4 rodadas sequenciais de purificação de placa, os recombinantes designados como vCP2383.3.1.1.1 e VCP2383.9.1.1.1 foram gerados e confirmados por hibridação como 100% positivo para a inserção de AHSV e 100% negativo para os loci C3. Placas únicas foram selecionadas a partir do ciclo final de purificação da placa, e expandidas para obter estoques de PI (frasco T-25), P2 (frasco T-75) e P3 (garrafa cilíndrica 6X) para amplificar vCP2383.3.1.1.1. O fluido de cultura celular infectada a partir das garrafas cilíndricas foi coletado e concentrado para produzir o estoque de vírus (4,5 ml de vCP2383.3.1.1.1 a 2,2xlO¹⁰UFP/ml).

EXEMPLO 7: Análise do vetor viral recombinante VCP2383 (ALVAC C3 H6p- AHSV-9-VP2 sintético/42Kp-AHSV-9-VP5 sintético)

O estoque de P3 foi reconfirmado por hibridização, como 100% positivo para as inserções AHSV-9-VP2 e AHSV-9VP5, e 100% negativo para os loci C3.

Análise Genômica: um gel de enzima de restrição de DNA genômico VCP2383 teórico foi produzido usando o Vetor NTI (Figura 13) . Para realizar o experimento real, o DNA genômico foi extraído de VCP2383.3.1.1.1 e vCP2383.9.1.1.1, digerido com BamHI, HindIII ou Xbal e separado por eletroforese em gel de agarose 0,8%. Os resultados revelaram a correta inserção da seqüência do gene estrangeiro. (Figura 14).

Southern blot: O DNA genômico digerido com BamHI, HindIII ou Xbal foi transferido para uma membrana de náilon e a análise de Southern blot foi realizada por sondagem com a sonda AHSV-9-VP5. Bandas dos tamanhos esperados foram observadas, a saber, 4940 pb BamHI, 20633 pb HindIII e 9559 pb Xbal. Os resultados indicaram a correta inserção de AHSV-9-VP2 e AHSV-9-VP5 nos loci 03 (Figura 15).

Análise de expressão: Células CEF primárias foram infectadas com o estoque P3 de vCP2383.3.1.1.1 em uma MOI de 10 e incubadas a 37°C por 26 horas. As células e o sobrenadante da cultura foram coletados e as proteínas da amostra foram separadas em gel SDS-PAGE 10%, transferidas para membrana de náilon IMMOBILON, e sondadas separadamente

100 com o anticorpo anti-VP5 de AHSV (Vírus da Doença Equina Africana) de camundongo 10AE12 de passagem 9 (MartinezTorrecuadrada, J e col., 1999) em uma diluição de 1:100. Antissoro anti-camundongo de cabra conjugado com peroxidase foi utilizado como anticorpo secundário e as bandas foram visualizadas usando reagentes de detecção Amersham. Com o mAb VP5 anti-AHSV de camundongo, as bandas de proteína entre 55 a 72 KDa foram detectadas nos péletes celulares de vCP2383.3.1.1.1, indicando a expressão da proteína AHSV-9VP5 (Figura 16). A expressão da proteína AHSV9-VP5 não foi detectada no meio de cultura. A expressão de AHSV9-VP2 não foi detectada pelo mAb anti-BTV4-VP2 de camundongo (material de propriedade da Merial).

Imunoplaqueamento: A homogeneidade da população de VCP2383.3.1.1.1 foi de 100% como evidenciado por um ensaio de imunoplaca, usando mAb anti-AHSV VP5 de camundongo 10AE12 passagem 9 (Martinez-Torrecuadrada, J e col., 1999.) em uma diluição de 1:100 (Figura 17).

Análise de Sequência: Uma análise mais detalhada do DNA genômico estoque P3 foi realizada por amplificação por PCR e a análise da seqüência das ramificações flanqueadoras do locus C3 e as inserções AHSV-9-VP2 (SEQ ID NO:28) e AHSV-9-VP5 (SEQ ID NO:29). Os iniciadores 8103.JY (SEQ ID NO:13) e 8104.JY (SEQ ID NO:14) (Figura 18) foram

101 utilizados para amplificar todo o fragmento C3L-H6-AHSV-9VP2-42K-AHSV-9-VP5-C3R. A seqüência resultante, ou seja, SEQ ID NO:27, indicou que as sequências das inserções AHSV9-VP2 (SEQ ID NO:28) e AHSV-9-VP5 (SEQ ID NO:29) e as ramificações esquerda e direita de C3 em torno das inserções AHSV em vCP2383.3.1.1.1 estavam corretas.

Iniciadores para amplificação da sonda AHSV-9-VP5

18020CXL (SEQ ID NO:23) 5':

CTAGACTAGTTTACTATCATTTCACGCCGAACAGCA

18021CXL (SEQ ID NO:24) 5': GCAAGGACCAGAGCGAGCGGATCA

Iniciadores para amplificação da sonda AHSV-9-VP2

13660CXL (SEQ IDNO:25) 5': AGGCCTTCGCCGGCAACAGCCTGCT

13665CXL (SEQ ID NO:26) 5': AGGGCATCGATCAGGAACTCGCTCT Iniciadores para amplificação por PCR das ramificações vCP2383 C3 mais inserção

8103. JY (SEQ ID NO:13) 5':GAGGCATCCAACATATAAAGAAGACTAAAG 3'

8104. JY (SEQ ID NO:14) 5':TAGTTAAATACTCATAACTCATATCTG 3'

EXEMPLO 8: Construção do plasmídeo doador pJSY2247.2

(SEQ ID	NO:32) expressando a	AHSV-5-VP2	sintética
direcionado	por promotor H6 e	AHSV-5-VP5	sintética
direcionado	por promotor 42K
0	esquema de construção	total para	pJSY2247.2

(SEQ ID NO:32) é mostrado na Figura 22. O plasmídeo contendo o gene AHSV-5-VP2 (SEQ ID NO:33) sintético foi

102 digerido com Xhol e Nrul. A inserção AHSV-5-VP2 resultante (SEQ ID NO:33) foi isolada e clonada nos sítios Nrul/Xhol de um plasmídeo doador ALVAC 03 preparado a partir de pJY1738.2 (pC3 H6p CPV-VP2) para criar pJSY2245.1, urn plasmídeo doador ALVAC 03 contendo o cassete de expressão H6p-AHSV-5-VP2.

Um cassete de expressão 42Kp-AHSV-5-VP5 flanqueado pelo sítio Spel foi isolado do plasmídeo contendo AHSV-5VP5 sintético (SEQ ID NO: 34) por digestão de Spel, e foi então clonado no sítio Spel do plasmídeo pJSY2245.1 para criar um plasmídeo doador ALVAC 03 contendo os cassetes de expressão dupla pJSY2247.2 (SEQ ID NO:32; H6p-AHSV-5VP2/42Kp-VP5), que foi sequenciado e confirmado como contendo as sequências corretas. Um diagrama do plasmídeo pJSY2247.2 e SEQ ID NOs correspondentes estão indicados na Figura 23. Os pesos moleculares para AHSV-5-VP2 sintética (SEQ ID NO:35) e AHSV-5-VP5 sintética (SEQ ID NO:36) foram de cerca de 122,9 kDa e de cerca de 57,1 KDa, respectivamente. Os pontos isoelétricos para a AHSV-5-VP2 sintética (SEQ ID NO:35) e AHSV-5-VP5 sintética (SEQ ID NO:36) foram de cerca de 8,4 e 5,77, respectivamente. Ambas as proteínas virais foram encontradas principalmente no citoplasma.

EXEMPLO 9: Construção do vetor viral recombinante

103

VCP2398 (SEQ ID NO:41) (AHSV-5-VP2 sintética de H6-AHSV-5VP5 sintética de 42K)

O vetor viral recombinante vCP2398 (SEQ ID NO:41) foi produzido de acordo com o esquema de recombinação in vitro (IVR) representado na Figura 24. O IVR foi realizado por transfecção das células CEF primárias com 15 μρ de plasmídeo doador pJSY2247.2 Notl-linearizado (SEQ ID NO: 32) usando o reagente FuGENE (Roche, Cat # 04709705001). As células transfectadas foram subsequentemente infectadas com ALVAC (1) (2 x 10¹⁰ UFP/ml HM1355) como o virus de resgate em um MOI de 10. Após 24 horas, as células transfectadasinfectadas foram coletadas, submetidas ao ultrassom e utilizadas para a triagem com virus recombinante.

As placas recombinantes foram selecionadas com base no método de hibridização de elevação de placa (Sambrook e col., 1982) usando a sonda específica AHSV-5-VP2, que foi marcada com peroxidase de rábano silvestre de acordo com o protocolo do fabricante (Amersham Cat # RPN3001). Após 3 ciclos sequenciais de purificação em placa, o recombinante designado como vCP2398.2.1.1 foi gerado e confirmado por hibridação como 100% positivo para a inserção AHSV e 100% negativo para o sitio C3 vazio.

Placas individuais foram selecionadas a partir do ciclo final de purificação de placa, e foram expandidas

104 para obter os estoques Pl (frasco T-25), Ρ2 (frasco Τ-75) e Ρ3 (garrafa cilíndrica) para amplificar vCP2398.2.1.1. O recombinante foi reconfirmado no nível P2 por hibridação e considerado como sendo 100% positivo para a inserção e 100% negativo para o sítio C3 vazio. O fluido de cultura de célula infectada a partir das garrafas cilíndricas foi coletado e concentrado para produzir o estoque viral (2, 6 ml de VCP2398.2.1.1 a 3.3xlO¹⁰ UFP/ml).

EXEMPLO 10: Análise do vetor viral recombinante VCP2398 (SEQ ID NO:41) (H6-AHSV-5-VP2 sintética de H6 AHSV-5-VP5 sintética de 42K)

O estoque P3 foi reconfirmado por hibridização, como 100% positivo para as inserções AHSV-5-VP2 e AHSV VP5-5, e 100% negativo para o sítio C3 vazio.

Análise genômica: Um gel de enzima de restrição teórico para o DNA genômico foi criado em Vetor NTI e é mostrado na Figura 25. 0 DNA genômico foi extraído de VCP2398.2.1.1, digerido com BamHI, HindIII ou PstI, e separado por eletroforese em gel de agarose 0,8%. Os resultados revelaram a correta inserção da seqüência do gene estrangeiro. (Figura 26).

Southern blot: O DNA genômico digerido com BamHI, HindIII ou PstI foi transferido para a membrana de náilon e a análise de Southern blot foi realizada por sondagem com a

105 sonda AHSV-5-VP2. Bandas BamHI de 20975 pb e 11899 pb, HindIII de 4980pb e PstI de 1818 pb especificas foram observadas nos tamanhos esperados. Os resultados indicaram a correta inserção de AHSV-5-VP2 e AHSV-5-VP5 no locus C3 (Figura 27).

Análise de expressão: Células CEF primárias foram infectadas com o estoque P3 de VCP2398.2.1.1 em um MOI de 10 e incubadas a 37°C por 24 horas. As células e o sobrenadante da cultura foram a seguir coletados. As proteínas da amostra foram separadas em gel SDS-PAGE a 10%, transferidas para membrana de náilon Immobilon e sondadas separadamente com o anticorpo anti-VP5 de AHSV (Vírus da Doença Equina Africana) de camundongo 10AE12 passagem 9 (Martinez-Torrecuadrada, J e col. 1999) em uma diluição de 1:100. O antissoro de cabra anti-camundongo conjugado com peroxidase foi utilizado como um anticorpo secundário e as bandas foram visualizadas usando regentes de detecção Amersham. Com o uso de mAb anti-AHSV VP5 de camundongo, as bandas de proteína entre 55 a 72 KDa foram detectadas nos péletes celulares de VCP2398.2.1.1, indicando a expressão da proteína AHSV-5-VP5 (Figura 28). A expressão da proteína AHSV-5-VP5 não foi detectada no meio de cultura.

Imunoplaqueamento: A homogeneidade da população de vCP2398.2.1.1 foi de 100%, conforme evidenciado por um

106 ensaio de imunoplaca, usando o mAb anti-AHSV VP5 de camundongo 10AE12 passagem 9 (Martinez-Torrecuadrada, J e col., 1999) a uma diluição de 1:100 (Figura 29) .

Análise de sequência: Uma análise mais detalhada do DNA genômico estoque P3 foi realizada por amplificação por PCR e a análise da seqüência das ramificações flanqueadoras do locus C3 e das inserções AHSV-5-VP2 e AHSV-5-VP5. 0 iniciadores 8103.JY/8104.JY foram utilizados para amplificar todo o fragmento de inserções-C3L C3R-AHSV-5VP2/VP5. Um mapa de iniciador é mostrado na Figura 30. A seqüência resultante, a saber, SEQ ID NO:41, indicou que as sequências das inserções de AHSV-5-VP2 e AHSV VP5-5 e as ramificações esquerda e direita de C3 ao redor das inserções AHSV em VCP2398.2.1.1 estavam corretas.

Iniciadores para amplificação da sonda AHSV-5-VP2:

098.JY (SEQ ID NO :37) 5' GGATCGAGCGGGACGAGCTGGACG 3' 18103.JY (SEQ ID NO :38) 5'GCCAGCCGTACTGGAACTTGTAGC 3' Iniciadores para amplificação da sonda AHSV-5 VP5: 18115.JY (SEQ ID NO:39) 5 ' TGCTGGACCTGAGCGCCGAGGTGA 3' 18120.JY (SEQ ID NO:40) 5'TCAGGCGATCTTCACGCCGAACAG 3' Iniciadores para amplificação por PCR das ramificações vCP2398 C3 mais inserção:

8103. JY (SEQ ID NO:13) 5' GAGGCATCCAACATATAAAGAAGACTAAAG 3'

8104. JY (SEQ ID NO:14) 5' TAGTTAAATACTCATAACTCATATCTG 3'

107

EXEMPLO 11: Produção de Vacinas Experimentais

Três diferentes vacinas foram produzidas usando um ingrediente ativo produzido na quinta passagem após o estoque de vírus originário principal (MSV+5), após uma cultura de 4 dias do vCP2377 (produzido de acordo com o EXEMPLO 6) em monocamadas confluentes de fibroblastos de embrião de galinha (CEF) e tratamento da colheita. A passagem MSV+5 é representativa (a partir da perspectiva de estabilidade de estrutura genômica/genética) do produto de vacina comercial, e é normalmente utilizada para a produção de lotes comerciais. As três vacinas (produzidas sob condições de BPF) utilizaram CARBOMER como adjuvante (4 mg/ml) e são diferenciadas por suas concentrações de antígeno. O CARBOMER específico utilizado foi CARBOMER®/CARBOPOL® 974P (grau farmacêutico, produzido por Goodrich Chemicals Europe NV, Bélgica). A concentração utilizada foi de 4 mg/ml com 1 dose = 1 ml. CARBOMER® 974P é utilizado de forma intercambiável com CARBOPOL® 974P em todo o presente pedido.

O título infecciõso do ingrediente ativo vCP2377 usado na formulação das vacinas foi de 8,89 LoglO CCID50/ml. As formulações da vacina também continham os seguintes ingredientes: um adjuvante composto de uma solução de 1,5% do carbômero em água para injeção contendo NaCl 0,1%; um

108

diluente que foi	fisiologicamente tamponado em pH 7	, 1 e	uma
solução de NaOH	0,1 N para a	regulação do	pH.
0 ingrediente ativo	armazenado	a	-7 0	°C	foi
descongelado em	banho-maria	(37°C) por	não	mais	que	72

horas antes do uso. Imediatamente após o descongelamento, eles foram armazenados a +5°C. Em um recipiente estéril com sistema de agitação, 80% da solução salina fisiológica tamponada em pH 7,1 para a formulação foi introduzida em temperatura ambiente. Sob agitação, foi adicionado o ingrediente ativo. Após homogeneização, a solução a 1,5% de CARBOMER® 97 4 P foi adicionada lentamente, com regulação do pH (pH 7,1) usando NaOH IN. Durante a formulação, o valor de pH permaneceu preferencialmente entre 6,5 e 7,3 e uma concentração final de CARBOMER de 4 mg/ml. Quando todo o CARBOMER® 974P foi adicionado, a quantidade remanescente de solução salina fisiológica tamponada em pH 7.1 foi adicionada sob agitação para completar o volume final.

Caso necessário, o pH pode ser ajustado para 7,1 ± 0,2 por adição de hidróxido de sódio (IN) ou ácido clorídrico (1N). O volume foi homogeneizado por agitação a uma temperatura não inferior a +2 °C por pelo menos 2 horas. O volume obtido foi armazenado a +5°C (± 3°C) até o preenchimento. A composição das vacinas está resumida na

Tabela 1.

109

TABELA 1

Vacina Lote 87859A010 Formulação alvo: 7,5 Log₁₀ CCID₅₀/ml
Código	Nome	Lote	Volume (ml)
	VCP2377	8C23775E05	40.7
	CARBOMER® 97 4P (solução 1,5%)	8CB011311H50	266.7
1045001007	Salina fisiológica tamponada em pH 7,1	285142	668.6
1045000842	NaOH IN	283938	47.9
Vacina lote 87859A020 Formulação alvo: 7,2 Log₁₀ CCID₅₀/ml
Código	Nome	Lote	Volume (ml)
	VCP2377	8C23775E05	20.4
	CARBOMER® 974P (solução 1,5%)	8CB011311H50	266.7
1045001007	Salina fisiológica tamponada em pH 7,1	285142	689.2
1045000842	NaOH IN	283938	47.7
Vacina lote 87859A030 Formulação alvo: 6,8 Logi₀ CCID₅₀/ml
Código	Nome	Lote	Volume (mL)
	VCP2377	8C23775E05	8.1
	CARBOMER® 974P (solução 1,5%)	8CB011311H50	266.7
1045001007	Salina fisiológica tamponada em pH 7,1	285142	701.3

110

1045000842

NaOH IN

283938

47.9

EXEMPLO 12: Verificação da identidade de 3 lotes de vacina contendo o vetor viral recombinante vCP2377 expressando proteínas de capsídeo AHSV-4-VP2 sintéticas e 5 AHSV-4-VP5 sintéticas

As 3 vacinas contendo VCP2377 com adjuvante ® 974P foram descritas de acordo com o seguinte: lote 87859A011, título alvo de 7,5 loglO DICC50/ml, lote 87859A021, título alvo de 7,2 loglO DICC50/ml, e lote 87859A031, título alvo 10 de 6,8 loglO DICC50/ml. O VCP2377 antes da formulação foi VCP2377-1-CEPI 7007/17/07/07 eo título foi de 8,3 loglO DICC50/ml.

Uma vacina compreendendo dois canaripox recombinantes não-relevantes (EIV) com adjuvante CARBOPOL® 974P foi 15 utilizada como controle negativo (lote - 76435V191, título 7,34 loglO DICC50/ml).

Métodos: A expressão de proteínas virais AHSV-4-VP2 e AHSV-4-VP5 foi verificada por imunofluorescência indireta e Western blot e foi usada para confirmar a identidade das 20 vacinas. Os reagentes incluíram os seguintes: anti-AHSV VP5 10AE12 (INGENASA, 28037 Madrid), soros policlonais de suínos anti-VP2 sorotipo 4 AHSV (GENOVAC), clone anti-cMyc 4A6 (IgGl monoclonal de camundongo, Upstate, cat #05-724),

111

IRDye800 anti-camundongo, IRDye800 anti-porquinho-da-india, Cy3 anti-camundongo e Cy3 anti-porquinho-da-india. Os plasmideos que codificam as proteínas AHSV-4-VP2 (SEQ ID NO: 1) e AHSV-4-VP5 (SEQ ID NO: 2) sintéticas foram utilizadas como controles positivos: pVR1012 (plasmídeo de controle sem inserção); pCG050 (AHSV-4-VP2 sintética (SEQ ID NO: 4) inserida em pVR1012); pCG042 (AHSV-4-VP5 sintética (SEQ ID NO: 5) inserida em pVR1012); e pCG049 (AHSV-4-VP2 sintética (SEQ ID NO: 4) + etiqueta cMyc inserida em pVR1012).

Para a imunofluorescência indireta, células de fibroblasto embrionário de galinha (CEE) transfectadas com plasmídeo/infectadas com vetor viral recombinante foram plaqueadas em placas de 96 poços (25000 células/poço). As células foram fixadas em cerca de 24h após a transfecção, o que equivale a cerca de 72h após a infecção. As células foram a seguir marcadas usando anticorpos primários antiVP2 e anti-VP5, seguido por anticorpos secundários ligados a Cy3. As células marcadas foram observadas por microscopia de fluorescência.

Para o Western Blot, as células CEE transfectadas com plasmídeo/infectadas com vetor viral recombinante foram plaqueadas em placas de 6 cm (1.10e6 células/placa). As células foram coletadas em cerca de 24h após a transfecção,

112 o que equivale a cerca de 72h após a infecção. Após a penetração, as amostras coletadas foram postas em gel de acrilamida Tris-Glicina a 4-20%. Após a migração, os géis foram transferidos em membrana de nitrocelulose, sondados com os anticorpos primários anti-VP2, anti-VP5 e anti-cMyc e, posteriormente, sondados com anticorpos secundários ligados a IRDye800. A leitura foi realizada utilizando um scanner Odyssey-LiCor.

Resultados: De acordo com os resultados de imunofluorescência, ilustrados na Figura 19, a proteína VP5 foi expressa em células CEF infectadas pelos 3 lotes de vCP2377 com adjuvante CARBOPOL, e com VCP2377 antes da formulação (com vCP EIV como controles negativos). A proteína VP2 foi devidamente detectada com uma associação de soros de três porquinhos-da-índia no VCP2377 antes da formulação e após a formulação em 3 lotes de vCP. No entanto, a fluorescência foi menor com a associação de anticorpos policlonais em comparação com os anticorpos anti-VP5 monoclonais, e um pequeno ruído foi mostrado nos controles vCP EIV negativos.

Além disso, os reagentes foram validados utilizando CEF transfectadas por plasmídeos que codificam as proteínas individuais, incluindo o plasmídeo controle sem inserção (pVR1012), a AHSV-4-VP2 sintética (SEQ ID

113

NO: 4) em pVR1012 (pCG050), a AHSV-4-VP5 sintética (SEQ ID NO: 5) em pVR1012 (pCG042) e a AHSV-4-VP2 sintética + histag em pVR1012 (pCG049) . A proteína VP5 só foi mostrada em CEE transfectadas pelo plasmídeo pCG042. A proteína VP2 foi devidamente detectada em CEE transfectadas pelos plasmídeos pCG050 e pCG049. Estes resultados validaram a técnica e os reagentes.

A Figura 20a mostra o western blot realizado em lisados das CEF infectadas e transfectadas, e indica a expressão da proteína VP2 de AHSV sorotipo 4. A proteína VP2 foi detectada em cada um dos 3 lotes de vCP2377 com adjuvante CARBOPOL (identificados como 9A011, 9A021 e 9A031), e no vCP2377 antes de formulação. As CEF transfectadas pelos plasmídeos pCG050 (VP2 em pVR1012) e pCG049 (VP2 + c-myc em pVR1012), utilizadas como controles positivos, também expressaram VP2. O processamento com o anti-c-myc das CEF transfectadas pelo plasmídeo pCG049 foi utilizado como controle positivo da transfecção.

Como previsto, nenhum sinal foi detectado para as CEF infectadas por vCP EIV, ou para CEF transfectadas por pVR1012 e pCG042. Além disso, os anticorpos policlonais anti-VP2 foram específicos para a proteína VP2 do AHSV sorotipo 4. A Figura 20B mostra o western blot realizado em lisados de CEF infectadas e transfectadas, e indica a

114 expressão da proteína VP5 do AHSV sorotipo 4.

A Figura 20A mostra os resultados de western blot de anti-VP5 em CEF infectadas e transfectadas. A proteína VP5 foi detectada em cada um dos 3 lotes de VCP2377 com adjuvante CARBOPOL ® 974P e no vCP2377 antes da formulação. As CEF transfectadas pelos plasmideos pCG042 (VP5 em pVR1012) também expressaram a proteína VP5.

Como previsto, nenhum sinal foi detectado para CEF infectadas por vCP EIV, nem para CEF transfectadas por pVR1012, pCG050 e pCG049, mostrando que o anticorpo antiVP5 é claramente específico para a proteína VP5 de AHSV, conforme descrito na literatura (Martinez-Torrecuadrada e col.; Virology, 257, 449-459, 1999).

IV. Conclusão

Todos os resultados obtidos por imunofluorescência indireta e western blot mostram que as três vacinas VCP2377 com adjuvante CARBOPOL® 974P expressam as proteínas VP2 e VP5 do sorotipo 4 de AHSV.

EXEMPLO 13: Dose Resposta da Vacina em Cavalos

A. Animais Experimentais

Um total de 6 cavalos previamente não vacinados foram utilizados para estudos de imunogenicidade. Os animais foram alimentados e tratados de acordo com procedimentos padrão.

115

B. Imunogenicidade em animais não vacinados

A fim de avaliar a resposta imune dos cavalos à vacina candidata, 6 potros previamente não vacinados foram aleatoriamente pareados em 3 grupos. Cada grupo de 2 cavalos foi vacinado no Dia 0 com 3 doses de uma das três diferentes preparações em lote (Lotes: 87859A011, 87859A021 e 87859Ά031) da vacina candidata (AHSV-CP). Os lotes diferentes variaram com relação aos seus titulos alvo, como mostrado na Figura 21, a saber, 7,3, 6,96 e 6,28 LogioCCID₅o/ml. Em cada grupo, duas das doses foram administradas por via intramuscular (IM) em um lado do pescoço, e uma dose foi administrada IM no outro lado do pescoço. No Dia 28, os cavalos foram imunizados IM no pescoço com uma dose do mesmo lote da vacina administrada no Dia 0. Antes de receber a dose primária da vacina,

amostras de	sangue	foram	coletadas	(Dia	0) , por punção
venosa da	j ugular	em	2	tubos	de	7 mL	de tubos SST
VACUTAINER.	Além disso,	amostras	de	sangue	foram coletadas

de todos os cavalos por punção venosa da jugular em 2 tubos SST VACUTAINER de 7mL no Dia 28 e Dia 42.

C. Análise

As amostras de soro coletadas antes da primeira vacinação, durante o primeiro período de vacinação, no momento da segunda vacinação e durante o período da segunda

116 vacinação foram submetidas a um teste Elisa grupo específico para anticorpos para o Vírus da Doença Equina Africana (Hamblin C, e col. (1990) Epidemiology and

Infection 104: 303-312) e um teste de neutralização de vírus soro específico do sorotipo 4 de AHS (Howell PG, (1962).

Os resultados são mostrados na Figura 21. No Dia 0, todos os cavalos foram negativos, sem títulos detectáveis de anticorpo do soro contra AHSV-4. No Dia 28, quatro semanas após a imunização primária, todos os cavalos que foram imunizados com a vacina do lote com o título mais elevado (LogioCCID₅₀/ml 7,3) desenvolveram títulos neutralizantes. No Dia 28, 1 dos 2 cavalos que foram imunizados com a vacina do lote com o título intermediário (Logi₀CCID₅o/ml 6,96) desenvolveu títulos neutralizantes. Finalmente, no Dia 28, nenhum dos cavalos que foram imunizados com a vacina do lote com o menor título (Logl0CCID50/ml 6,28) desenvolveram títulos neutralizantes. No Dia 42, duas semanas após a administração da dose de reforço, 5 de 6 cavalos tinham bons títulos de anticorpo (Figura 21). Um cavalo (#53761), que foi imunizado com a vacina do lote de menor título (87859A031) foi negativo para os anticorpos para o Vírus da Doença Equina Africana.

117

EXEMPLO 14: Vacinação de cavalos com vírus canaripox recombinantes

Nove cavalos Boerperd de um ano de idade (5 machos, 4 fêmeas) foram obtidos da Província de Northern Cape, África do Sul, uma região isenta de AHS reportado pelo menos pelos últimos 12 meses. Os cavalos foram confirmados como estando livres de anticorpos AHSV-específicos pelo ensaio de imunoabsorção ligado à enzima indireto (ELISA) que detecta anticorpos para a proteína do núcleo VP7, que é comum aos vírus do sorogrupo AHSV (Maree, S. e Paweska, JT., 2005). Os cavalos foram alojados em instalações de isolamento protegidas dos vetores ao longo de todos estes estudos. Dois grupos de quatro cavalos cada (2 machos e 2 fêmeas) foram inoculados intramuscularmente com 10⁷'¹ ou 10⁶'⁴TCID50/dose, respectivamente, de AHSV-CP em aproximadamente 1 ml de diluente contendo um adjuvante CARBOPOL. Por razões éticas, um único cavalo de controle foi usado para confirmar a virulência do inóculo desafio, porque foi anteriormente demonstrado que esta cepa de vírus causa doença grave ou letal em cavalos inoculados (Nurton, J.P., e col, 2001) . O cavalo controle foi vacinado com vírus canaripox recombinante expressando a proteína hemaglutinina do vírus da influenza equina (EI-CP; vacina do vírus da influenza equina PROTEQFLU®, Merial), que foi administrada

118 de acordo com as instruções do fabricante. Todos os cavalos foram revacinados 28 dias depois, com a respectiva construção da vacina. Os animais foram co-alojados independentemente do tipo de vacina. Todos os testes de laboratório foram feitos independentemente do conhecimento do status de vacinação.

A. Métodos

Infecção AHSV de cavalos e coleta de amostras

Todos os 9 cavalos foram desafiados por inoculação intravenosa de 10⁵'⁵ TCID₅₀ de AHSV-4 28 dias após a segunda vacinação. Os cavalos foram avaliados diariamente em relação a manifestações de Doença Equina Africana por 23 dias após a inoculação. O sangue foi coletado em tubos EDTA VACUTAINER™ (Becton Dickinson) antes da infecção desafio e a 2, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 19, 21 e 23 dias após a infecção (DPI) para as contagens completas de sangue (CBC) . As amostras de sangue também foram coletadas diariamente em tubos EDTA VACUTAINER™ (Becton Dickinson) , nos dias 0 até 23 DPI para a reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa quantitativa (qRT-PCR) e isolamento do vírus em células BHK-21. O soro foi coletado em tubos separadores de soro SST (Becton Dickinson) de todos os cavalos imediatamente antes da vacinação e em intervalos de duas semanas a partir disso.

119

Ensaios laboratoriais clínicos

A análise hematológica foi feita usando um contador de células eletrônico (Coulter Electronics Inc.).

Detecção do virus

A presença de AHSV no sangue dos cavalos foi determinada usando ensaios qRT-PCR, que detectam os genes individuais que codificam as proteínas VP7 e NS2 de AHSV (Quan, M. e AJ Guthrie, 2009), com amostras sendo classificadas como positivas se a fluorescência tiver excedido o limiar de 0,1 em um máximo de 4 0 ciclos. O isolamento do vírus do sangue foi feito em células BHK-21, conforme descrito por Quan, M. e col, 2008.

Ensaios sorológicos

Anticorpos neutralizadores sorotipo específicos para AHSV foram detectados pelo ensaio de microneutralização usando AHSV-4 como o vírus desafio, como descrito por Howell, PG e col, 2002. Os títulos de anticorpos foram registrados como a recíproca da maior diluição final do soro que forneceu pelo menos 50% de proteção da monocamada de células BHK-21. Um título >10 foi considerado significativo.

Análise Estatística

Títulos de anticorpos neutralizantes AHSV-4 em 8 semanas após a vacinação primária e 6 semanas após a

120 infecção por AHSV foram comparados entre os grupos de vacina pelo teste de Mann-Whitney U com P <0,05 sendo considerado significativo.

B. Análise

Imunogenicidade de AHSV-CP

Todos os cavalos foram soronegativos tanto por ELISA quanto por ensaios de microneutralização de AHSV-4 antes da vacinação, e todos, com exceção de dois cavalos na TABELA 2 desenvolveram anticorpos neutralizantes para AHSV-4 após a imunização com o vetor recombinante AHSV-CP enquanto o cavalo imunizado com EIV-CP não desenvolveu anticorpos neutralizantes para AHSV-4 (Tabela 2) . Em 8 semanas após a vacinação, os títulos de AHSV-4 foram significativamente maiores (P = 0,021) nos cavalos que receberam dose da vacina mais alta do que os cavalos no grupo de baixa dose, porém esta diferença foi menos evidente (P = 0,057) em 6 semanas após a infecção. Todos os cavalos permaneceram saudáveis e não apresentaram efeitos adversos após a vacinação.

TABELA 2

Títulos de anticorpos neutralizantes para o sorotipo 4 da doença equina africana

121

Tratamento/Cavalo ID	Títulos pósvacinação^a (semanas após vacinação primária)	Títulos pósinfecção^a (semanas após infecção por AHSV)
0	4	8	2	4	6
Vacinados (AHSV-CP-10⁷'Ó
1	<10	<10	28	20	40	20
2	<10	<10	40	40	10	14
3	<10	<10	20	40	28	40
4	<10	<10	40	80	56	80
Vacinados (AHSV-CP-10⁶'⁴)
5	<10	<10	<10	<10	<10	<10
6	<10	<10	<10	10	<10	<10
7	<10	<10	14	40	20	10
8	<10	<10	10	56	56	14
Controle (EIV-CP)
9	<10	<10	<10	10	160	224

^a Expressos como o recíproco da maior diluição que forneceu > 50% de proteção da monocamada de células BHK-21.

C. Proteção dos cavalos imunizados com AHSV-CP

Ά capacidade de AHSV-CP para imunizar os cavalos de forma protetora foi avaliada pela comparação das quantidades de ácido nucléico de AHSV (valores Ct) no sangue de cavalos imunizados com AHSV-CP (vacinados) e EIVCP (controle) após a infecção desafio (Figura 31, Painel

122

A) . Enquanto que o ácido nucleico de AHSV foi detectado a partir de 8 dias após a infecção (DPI) do cavalo controle (EIV-CP), ele nunca foi detectado no sangue dos cavalos vacinados. Da mesma forma, AHSV-4 foi repetidamente isolado do sangue do cavalo controle, porém nunca a partir dos cavalos vacinados (dados não mostrados).

O cavalo controle (EIV-CP) desenvolveu sinais clínicos consistentes com o dikkop ou forma cardíaca da Doença Equina Africana, enquanto que todos os cavalos vacinados permaneceram normais durante todo o estudo. Especificamente, o cavalo controle desenvolveu febre alta e trombocitopenia, que coincidiu com uma carga viral crescente no sangue (Figura 31, Painéis B e C, respectivamente). 0 cavalo controle também desenvolveu edema proeminente da fossa supraorbital em 12 DPI, que persistiu até 21 DPI.

D. Respostas sorológicas de cavalos vacinados com AHSV-CP e controle após a exposição desafio ao AHSV-4

As respostas sorológicas dos cavalos vacinados (AHSVCP) e controle (EIV-CP) foram determinadas após a infecção desafio com AHSV-4 tanto por testes SN (Tabela 2) quanto por ELISA (dados não mostrados). O cavalo controle foi soroconvertido a AHSV por 4 semanas após o desafio, conforme determinado por ensaios SN, enquanto nenhum dos

123 cavalos vacinados fizeram isso. Além disso, todos os cavalos vacinados permaneceram negativos para anticorpos para VP7 por ELISA durante o estudo. A falta de soroconversão dos cavalos vacinados nos ensaios SN e a falha em detectar o anticorpo para VP7 por ELISA sugere que a replicação viral foi ausente ou mínima nos cavalos vacinados. Da mesma forma, o anticorpo neutralizante de AHSV-4 após a infecção desafio no cavalo controle (WNV-CP), que foi soronegativo antes do desafio, foi consideravelmente maior do que os títulos observados nos cavalos vacinados nas semanas 4 e 6 após a infecção.

REFERÊNCIAS CITADAS

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Tendo assim descrito detalhadamente as modalidades preferidas da presente invenção, acredita-se que a invenção definida pelos parágrafos em anexo não deve ser limitada a detalhes particulares especificados na descrição acima, como muitas variações evidentes das mesmas são possíveis, sem se afastar do espírito ou do escopo da presente invenção.

Claims

1. Composição farmacêutica veterinária, caracterizada pelo fato de compreender:

a) um vetor de expressão, que compreende dois polinucleotídeos heterólogos que codificam o Vírus da Doença Equina Africana AHSV VP2, que possui a sequência conforme definida na SEQ ID NO: 4, que codifica um polipeptídeo que possui a sequência conforme definida na SEQ ID NO: 1, e AHSV VP5 que possui a sequência conforme definida na SEQ ID NO: 5, que codifica um polipeptídeo que possui a sequência conforme definida na SEQ ID NO: 2; e

b) um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vetor de expressão é um vetor de expressão in vivo ou in vitro.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o vetor é selecionado do grupo

consistindo de vCP2377 (SEQ ID NO: 17), vCP2383 (SEQ ID NO: 27), vCP2398 (SEQ ID NO: 41), e suas misturas. 4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o veículo, diluente ou

excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável é CARBOPOL.

5. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de compreender dois polinucleotídeos heterólogos que codificam o Vírus da Doença Equina Africana AHSV VP2 que possui a sequência conforme definida na SEQ ID NO: 4, que codifica um polipeptídeo que possui a sequência conforme definida na SEQ

Petição 870190044817, de 13/05/2019, pág. 37/40

2/2

ID NO: 1, e AHSV VP5 que possui a sequência conforme definida na SEQ ID NO: 5, que codifica um polipeptídeo que possui a sequência conforme definida na SEQ ID NO: 2.

6. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o vetor é selecionado do grupo consistindo de vCP2377 (SEQ ID NO: 17), vCP2383 (SEQ ID NO: 27), vCP2398 (SEQ ID NO: 41), e suas misturas.

7. Vetor, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor de expressão in vivo ou um vetor de expres são in vitro. 8. Vetor, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor viral, e em que o vetor vira l é um vírus da varíola aviária, da varíola canária ou da bouba. 9. Vetor, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é

operavelmente ligado a um promotor selecionado do grupo consistindo de promotor de vaccinia H6, o promotor de vaccinia I3L, promotor poxviral 42K, promotor de vaccinia de 7.5K, e promotor de vaccinia Pi.

10. Vetor, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codificando AHSV VP2 é operavelmente ligado ao promotor de vaccinia H6 e o polinucleotídeo que codifica AHSV VP5 é operavelmente ligado ao promotor poxviral 42K.

11. Célula hospedeira procariota, caracterizada pelo fato de ser transformada com o vetor conforme definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 10.