ES2398018T3 - Quinasa termoestable unida covalentemente para la validación de un proceso de descontaminación - Google Patents

Abstract

Método de validación de un proceso de tratamiento para reducir la cantidad o actividad de un contaminante enuna muestra, que comprende las etapas de: (a) obtener una muestra que contiene o es sospechosa de contener un contaminante; (b) someter la muestra a un proceso de tratamiento en presencia de una cantidad definida de un indicador deproceso biológico que comprende una quinasa termoestable unida covalentemente a un componente biológico; (c) medir la actividad residual de quinasa y opcionalmente calcular la reducción en la actividad de quinasa; y (d) comparar dicha actividad residual de quinasa con una actividad de quinasa predeterminada, o comparar dichareducción en la actividad de quinasa con una reducción predeterminada en la actividad de quinasa, donde laactividad predeterminada de quinasa o la reducción predeterminada en la actividad de quinasa corresponde a unareducción confirmada en la cantidad o actividad del contaminante bajo las mismas condiciones.

Description

Quinasa termoestable unida covalentemente para la validación de un proceso de descontaminación.

[0001] La presente invención se refiere al campo de indicadores biológicos, y en particular a indicadores biológicos para la validación de procesos de tratamiento diseñados para reducir la cantidad o actividad de un contaminante en una muestra. La presente invención se refiere además a métodos de preparación de estos indicadores y a los usos de los mismos.

[0002] Se conocen una amplia variedad de indicadores biológicos para validar procesos de limpieza ydescontaminación. Éstos varían desde indicadores relativamente básicos, tales como los que utilizan una “valoración visual” simple para valorar si un proceso ha sido eficaz, hasta indicadores más sofisticados que dependen de quinasas termoestables como enzimas informadoras (WO2005/093085). Estos indicadores basados en quinasas han sido un desarrollo importante en el campo de indicadores biológicos, proporcionando un medio rápido y sensible de validación de procesos.

[0003] El documento WO2005/093085 describe en detalle la producción y la utilización de los indicadores basados en quinasas referidos anteriormente. En resumen, se prepara un indicador habitual mediante la adsorción de una quinasa termoestable sobre un soporte sólido, tal como una tira indicadora o tira reactiva. A continuación, el indicador se incluye con una muestra (que contiene un contaminante) a tratar, y el indicador más la muestra se someten a un proceso de tratamiento. A continuación, la reducción en la actividad de la quinasa indicadora por el tratamiento se correlaciona con la reducción en la cantidad o la actividad del contaminante. Cuando se determina un nivel de actividad que es conocido por correlacionarse con una reducción aceptable en el contaminante, a continuación el tratamiento se considera como validado.

[0004] Se ha encontrado que el rendimiento de estos indicadores basados en quinasas se puede mejorar significativamente mediante la reticulación covalente de la quinasa termoestable con un componente biológico, donde el componente biológico es un mimético/sustituto del contaminante. Esto permite que el indicador refleje de manera más precisa la reacción del contaminante al proceso de tratamiento, que, a su vez, conduce a precisión/sensibilidad mejorada del indicador y, de este modo, menos “falsas” validaciones de procesos.

[0005] De manera ventajosa, el componente biológico puede ser parte de una matriz o mezcla biológica, tal como muestra contaminada de análisis disponible comercialmente (suelo de Browne, suelo de Edimburgo, etc.), sangre, tejido neurológico, alimentos, material de animal sacrificado, suero, óvulos, moco, o una muestra contaminada de análisis producida para cumplir con los requisitos específicos del usuario. De este modo, la reducción en la cantidad/actividad de la quinasa es función de las diversas propiedades de la matriz, lo cual mejora adicionalmente la precisión/sensibilidad del indicador.

[0006] Un indicador de este tipo también es capaz de monitorizar la eliminación/desactivación de un componente específico de la matriz o mezcla. De manera ventajosa, se puede diseñar un indicador de manera que la quinasa termoestable esté unida al componente de la matriz más “difícil” de eliminar/desactivar (por ejemplo, en una matriz de sangre, la fibrina es mucho más difícil de eliminar que la hemoglobina). Esto proporciona una validación extremadamente rigurosa del proceso de tratamiento.

[0007] Los indicadores descritos anteriormente también presentan la ventaja de proporcionar validaciones de procesos rápidas de una etapa. Esto contrasta con ciertos indicadores de validación conocidos que requieren múltiples etapas para la validación y, por tanto, requieren una mayor inversión de tiempo y esfuerzo. A modo de ejemplo, el documento WO00/65344 describe la utilización de un prión de levadura como indicador biológico para un proceso de descontaminación de priones. Al final del proceso, en una etapa adicional, el operador debe analizar la destrucción del prión de levadura a efectos de validar el proceso, En cambio, los indicadores descritos anteriormente se diseñan para tener una quinasa indicadora unida directamente a un componente biológico que mimetiza el contaminante relevante (por ejemplo, prión), de manea que la destrucción de este componente está íntimamente unido a la pérdida de actividad quinasa. Por tanto, estos indicadores son capaces de proporcionar una indicación rápida en una única etapa de la eficacia de proceso.

[0008] Por lo tanto, la presente invención se refiere al problema de proporcionar un indicador biológico de base quinasa alternativo/mejorado.

Indicador de procesos biológicos

[0009] En un primer aspecto de la invención, se proporciona un indicador de proceso biológico para validar un proceso de tratamiento en el que se reduce la cantidad o actividad de un contaminante en una muestra, en el que el indicador comprende una quinasa termoestable unida covalentemente a un componente biológico, con la condición de que el componente biológico no sea un anticuerpo.

[0010] En una realización, el componente biológico es un mimético o sustituto del contaminante y, por tanto, reacciona al proceso de tratamiento sustancialmente de la misma manera que el contaminante. En otra realización, el componente biológico puede ser el mismo, pero físicamente diferente, que el contaminante en la muestra que se va someter al proceso de tratamiento, por ejemplo, si el contaminante es una proteína, entonces el componente biológico es también una proteína; si el contaminante es una proteína de la sangre, el componente biológico es también una proteína de la sangre; si el contaminante es una molécula de ADN, entonces el componente biológico es también una molécula de ADN; si el contaminante es una molécula de ARN, entonces el componente biológico es también una molécula de ARN, etc, para cada uno de los contaminantes y componentes biológicos descritos en esta memoria. En una realización adicional, el componente biológico puede ser diferente del contaminante.

[0011] Entre los componentes biológicos que se pueden utilizar en los indicadores de la invención se incluyen proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos y lípidos.

[0012] En una realización, el componente biológico comprende una proteína seleccionada del grupo que consiste en una proteína de la sangre, una proteína bacteriana, una proteína viral, una proteína fúngica, y una proteína autoagregante y una proteína formadora de amiloides.

[0013] En una realización adicional, la proteína de la sangre se selecciona del grupo que consiste en proteínas de la coagulación de la sangre (por ejemplo, fibrinógeno, péptidos de fibrina, fibrina, sustratos de transglutaminasa, trombina), proteínas de suero (por ejemplo, albúmina y globulina), proteínas de plaquetas, glicoproteínas de células sanguíneas y hemoglobina.

[0014] En otra realización, la proteína bacteriana se selecciona del grupo que consiste en una proteína fimbrial bacteriana (por ejemplo, CgsA de E.coli y AgfA de Salmonella), una proteína de toxina bacteriana (por ejemplo, toxinas de Bacillus anthracis, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium botulium), una proteína de la superficie celular bacteriana (por ejemplo, peptidoglicano, lipoproteínas), y una proteína de espora bacteriana (por ejemplo, de bacterias Gram positivas y que tienen una secuencia similar o estructura global con las proteínas que forman los apéndices de los lazos en Clostridum taeniosporum, proteínas chaplina, proteínas rodlina).

[0015] En otra realización, la proteína viral se selecciona del grupo que consiste en una proteína de la cubierta viral, una proteína de la cápside viral y una proteína del núcleo viral. De manera adecuada, las proteínas virales son de un virus bacteriófago (por ejemplo, las proteínas MS2 y PP7), virus norwalk (por ejemplo, proteína de la cápside), rotavirus (por ejemplo, proteínas VP2, VP6 y VP7), coronavirus (por ejemplo, proteínas SARS S, E y M), virus de la lengua azul (por ejemplo, proteína VP2), virus del papiloma humano (por ejemplo, proteína estructural principal viral, L1), hepatitis B (por ejemplo, proteína de la cubierta pequeña HBsAg), virus de la Hepatitis C (por ejemplo, proteínas del núcleo E1 y E2), virus de la gripe (por ejemplo, proteínas de neuraminidasa y hemaglutinina y de matriz), virus de la polio (por ejemplo, proteínas de la cápside VP0, 1 y 3), VIH (por ejemplo, proteína de la cubierta Pr55gag) y virus del dengue B (por ejemplo, cubierta (e) y pre-membrana/ membrana (prM/M).

[0016] En otra realización, la proteína fúngica se selecciona del grupo que consiste en proteínas de hidrofobinas (por ejemplo, SC3 de Schizophyllum commune, RodA/B de Aspergillus fumigates, y proteínas equivalentes de levadura), proteínas de espora fúngica, proteínas hifales, micotoxinas, y priones fúngicos (por ejemplo Sup35, Het S, URE 2, Rnq1, New 1).

[0017] En otra realización, la proteína autoagregante se selecciona del grupo que consiste en priones (por ejemplo, PrPSc y PrPc, Sup35, Het S, Ure 2, Rnq1, New 1), proteínas miméticas de priones, fibrilas amiloides, adhesinas de la superficie celular de bacterias formadoras de flóculos y filamentosas en lodo activado, proteína beta amiloide, proteína tau, proteína de unión a poliadenina, glicoproteína B del virus del herpes simplex, proteína C de surfactante de pulmón, proteína CsgA de E.coli, proteína AgfA de especies de Salmonella, proteínas fimbriales bacterianas, apolipoproteínas (por ejemplo, apolipoproteína A1), hidrofobinas de especies fúngicas (por ejemplo, SC3 de Schizophyllum commune, RodA/B de Aspergillus fumigates), chaplinas (por ejemplo, Chps A-H de Streptomyces spp), rodlinas (por ejemplo, Rd1A y Rd1B de streptomyces spp), proteínas de cubierta de espora gram positivas (por ejemplo P29a, P29b, GP85 y un análogo de SpoVM), y proteínas de tipo cemento de percebe (por ejemplo, la proteína de 19kDa de Balanus albicostatus, y la proteína de 20kDa de Megabalanus rosa, y la nueva proteína de tipo cemento dependiente de calcita de Balanus albicostatus).

[0018] En otra realización, el ácido nucleico se selecciona de una molécula de ADN y una molécula de ARN. En una realización adicional, el ácido nucleico se selecciona entre ADN de cadena sencilla (ssDNA), ARN de cadena sencilla (ssRNA), ADN de doble cadena (dsDNA) o ARN de doble cadena (dsRNA). En una realización, el ácido nucleico deriva de tejido neurológico.

[0019] En otra realización, el carbohidrato se selecciona del grupo que consiste en exopolisacárido, lipopolisacárido (EPS/LPS, a veces conocido como endotoxina) (por ejemplo de especies de Legionella, E.coli, especies de Staphylococcus, especies de Streptococcus, especies de Pseudomonas, especies de Acinetobactorte, especies de Campylobactor, y especies de Bacillus), peptidoglicano, componentes de la pared celular de plantas, hongos y levadura (por ejemplo, quitina, lignina, glucano), preparaciones de mucina, glicolípidos (especialmente glicolípidos derivados de cerebro), glicoproteínas (por ejemplo, glicoproteínas de la superficie celular, Eap1 p), extractos de esporas (por ejemplo de Bacillus spp, Clostridal spp y otros formadores de esporas), polisacáridos de cápsulas de levadura, y secreciones de invertebrados (por ejemplo de geles de moluscos).

[0020] En otra realización, el lípido se selecciona del grupo que consiste en glicolípidos (por ejemplo, glicolípidos derivados del cerebro), gangliósidos (por ejemplo, gangliósidos de células neuronales, tales como GT1b, GT1a y gangliósidos de origen celular más general, tal como GM1), y aceites vegetales y lípidos.

[0021] En una realización adicional, el componente biológico es parte de una matriz biológica. En una realización, el indicador está unido covalentemente a la matriz biológica. La matriz biológica puede ser un mimético de la muestra que se trata. En una realización, la matriz biológica comprende uno o más componentes seleccionados del grupo que consiste en proteínas, lípidos, ácidos nucleicos y carbohidratos, o fragmentos o derivados de los mismos. En otra realización, la matriz biológica puede comprender una mezcla de proteínas. En una realización adicional, la matriz biológica puede comprender uno o más componentes seleccionados del grupo que consiste en sangre, suero, albúmina, moco, óvulo, tejido neurológico, alimentos, material de animal sacrificado y muestra contaminada de análisis disponible comercialmente. En otra realización de la invención, la matriz biológica comprende uno o más componentes seleccionados del grupo que consiste en fibrinógeno, trombina, factor VIII, CaCl2, y opcionalmente, albúmina y/o hemoglobina.

[0022] En una realización se la invención, la quinasa termoestable está unida covalentemente al componente biológico. En otra realización, la quinasa termoestable está reticulada genéticamente o químicamente al componente biológico. En una realización adicional, el componente biológico está unido a la quinasa termoestable en forma de una proteína de fusión.

[0023] Los indicadores de la invención se pueden utilizar para validar los procesos de tratamiento diseñados para eliminar/desactivar un contaminante seleccionado del grupo que consiste en una proteína, un lípido, un carbohidrato y un ácido nucleico.

[0024] El indicador de procesos biológicos de la invención puede comprender además un agente para estabilizar la quinasa, tal como iones metálicos, alcoholes de azúcar o agentes formadores de gel.

[0025] El indicador de la invención (incluyendo cualquier matriz biológica) también se puede “fijar” mediante tratamiento con etanol al 70% o isopropanol. Para conseguir esto, este indicador/matriz se incuba en isopropanol al 70% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Esto mimetiza uno de los procesos hallados habitualmente que pueden incrementar la resistencia de materiales contaminantes en instrumentos quirúrgicos y, por tanto, proporciona el indicador con un modo eficaz de monitorizar la eliminación de dichos materiales.

[0026] El indicador de procesos biológicos de la invención se puede inmovilizar en o sobre un soporte sólido. En una realización, el indicador de procesos biológicos se inmoviliza en el soporte sólido o se inmoviliza sobre el soporte sólido mediante reticulación o adsorción química. El indicador puede estar unido al soporte sólido a través de la quinasa termoestable o a través del componente biológico.

[0027] En una realización, el soporte sólido es una tira indicadora, una tira reactiva o una microesfera y, opcionalmente, comprende además medios para unir el soporte sólido a una superficie (tal como una proyección, hueco o apertura para la unión del soporte sólido a una superficie mediante un tornillo, tuerca y perno o abrazadera). En una realización adicional, el soporte sólido es una matriz y el indicador se dispersa en la matriz.

[0028] En una realización de la invención, la enzima utilizada para formar el indicador de procesos biológicos no es una liquenasa, una xilanasa, una xilosidasa, una formiltransferasa, una Taq polimerasa, una alfa amilasa o una betaglucosidasa.

[0029] En otra realización de la invención, se proporciona una muestra contaminada de análisis que comprende un indicador tal como se describe anteriormente.

Preparación del indicador biológico

[0030] El indicador biológico de la invención se puede preparar mediante la unión covalente de una quinasa termoestable a un componente biológico apropiado. Se puede utilizar cualquier método adecuado de unión covalente conocido. En una realización, la quinasa termoestable se reticula genéticamente o químicamente al componente biológico y, en una realización, el indicador se prepara como una proteína de fusión.

[0031] La reticulación química se puede conseguir utilizando una gama de reactivos homobifuncionales y heterobifuncionales utilizados habitualmente para reticular proteínas para la generación de conjugados de enzimas u otros fines relacionados. Por ejemplo, en un indicador que comprende fibrina como componente biológico, la fibrina y la quinasa termoestable se puede derivar con la adición de SPDP (Perbio) a grupos amina primarios. La quinasa termoestable se puede reducir a continuación para generar un grupo tiol reactivo y, a continuación, éste se mezcla con la fibrina para producir uniones covalentes de fibrina-quinasa termoestable.

[0032] Las quinasas también se pueden reticular químicamente a carbohidratos, lípidos u otros glicoconjugados utilizando agentes heterobifuncionales siguiendo el tratamiento del carbohidrato diana con meta-peryodato. La reticulación se puede conseguir utilizando una variedad de químicas tal como se indica en el ejemplo 23.

[0033] Alternativamente, el indicador se puede preparar como una proteína de fusión. Esto se consigue mediante la fusión de un gen sintético que codifica una quinasa termoestable apropiada (por ejemplo, el gen que codifica AK de Sulfolobus acidocaldarius o Thermatoga neopolitana) a un gen que codifica un componente biológico apropiado. Los protocolos detallados para la preparación de los indicadores de proteínas de fusión se proporcionan en los ejemplos (véase, por ejemplo, los ejemplos 10 y 13).

Enzimas quinasa para utilizar en el indicador biológico

[0034] Las enzimas quinasa utilizadas en los indicadores de la invención son capaces de generar una señal que es detectable sobre un rango extremadamente amplio. En general, la quinasa se detecta utilizando un sustrato que comprende ADP que se convierte en ATP, utilizado para generar luz, por ejemplo, utilizando luciferina/luciferasa, detectada utilizando un luminómetro. El amplio rango hace que el indicador sea particularmente adecuado para la validación, ya que la quinasa permanece detectable incluso después de muchas reducciones logarítmicas en la cantidad/actividad. Para la esterilidad, la mayoría de institutos nacionales consideran necesaria una reducción 6 veces logarítmicas en la cantidad o la actividad de un contaminante antes de que la esterilidad pueda ser validada. Las quinasas utilizadas en los indicadores de la invención ofrecen el potencial de reducir la validación en la cantidad

o actividad de contaminantes más allá de 6 veces logarítmicas a 8 veces logarítmicas y más.

[0035] Se puede utilizar cualquier enzima quinasa adecuada como quinasa informadora en la presente invención. En una realización, la quinasa informadora es una adenilato quinasa, acetato quinasa o piruvato quinasa o una combinación de las mismas.

[0036] Las quinasas informadoras utilizadas en la invención pueden tener una variedad de estructuras terciarias reconocidas, por ejemplo, la quinasa pueden ser una quinasa trimérica o monomérica. Estas estructuras terciarias se pueden asociar con una mejor estabilidad de la quinasa en condiciones, tales como, por ejemplo, temperatura, pH, desnaturalizantes químicos o proteasas.

[0037] En una realización, la quinasa informadora es una quinasa microbiana derivada de un organismo seleccionado del grupo que consiste en Pyrococcus furiousus, P.abyssi, P.horikoshii, P.woesii, Sulfolobus solfataricus, S.acidocaldarius, S.shibatae, Rhodothermus marinus, Thermococcus litoralis, Thermatoga maritima, Thermatoga neapolitana y Methanococcus spp. En otra realización, la quinasa es una quinasa de Sulfolobus sp. o una quinasa de Thermotoga sp. En otra realización, la quinasa es una quinasa de A. acidocaldarius, quinasa de A. fulgidus, quinasa de A. pernix, quinasa de A. pyrophilus, quinasa de B. caldotenax BT1, quinasa de PS3 de especie Bacillus, quinasa de B. stearothermophilus 11057, quinasa de B. stearothermophilus 12001, quinasa de B. thermocatenulatus, quinasa de C. stercocorarium, quinasa de Methanococcus spp., quinasa de M. ruber, quinasa de

P. abyssi, quinasa de P. furiosus, quinasa de P. horikoshii, quinasa de P. woesii, quinasa de R. marinus, quinasa de

S. acidocaldarius, quinasa de S. shibatae, quinasa de S. solfataricus, quinasa de T. ethanolicus, quinasa de T.

thermosulfurogenes, quinasa de T. celere, quinasa de T. litoralis, quinasa de T. aquaticus YT1, quinasa de T. caldophilus GK24, quinasa de T. thermophilus HB8, quinasa de T. maritima o una quinasa de T. neapolitana. En una realización adicional, la quinasa es una quinasa de T. litoralis, quinasa de T. maritima, o una quinasa de T. neapolitana.

[0038] En una realización, la quinasa informadora es termoestable. Además de ser resistentes a temperaturas elevadas, también se halla que las quinasas termoestables son resistentes a otros procesos bioquímicos y físicos que normalmente dañan o destruyen proteínas o las hace desactivas, tales como la exposición a ciertos agentes químicos, por ejemplo, caótropos, daños por radicales libres, detergentes, extremos de pH, exposición a proteasas, reticulación de proteínas, encapsulación con membranas o polímeros no permeables o semipermeables, o inmovilización irreversible sobre superficies. (Véase, por ejemplo: Daniel RM, Cowan DA, Morgan HW, Curran MP, "A correlation between protein thermostability and resistance to proteolysis", Biochem J. 1982 207:641-4; Rees DC, Robertson AD, "Some thermodynamic implications for the thermostability of proteins", Protein Sci. 2001 10:1187-94; Burdette DS, Tchernajencko V V, Zeikus JG."Effect of thermal and chemical denaturants on Thermoanaerobacter ethanolicus secondary-alcohol dehydrogenase stability and activity", Enzyme Microb Technol. 2000 27:11-18; Scandurra R, Consalvi V, Chiaraluce R, Politi L, Engel PC., "Protein thermostability in extremophiles", Biochimie. 1998 Nov;80(11):933-41; y Liao HH., "Thermostable mutants of kanamycin nucleotidyltransferase are also more stable to proteinase K, urea, detergents, and water-miscible organic solvents", Enzyme Microb Technol. 1993 Apr; 15(4):286-92, todos ellos incorporados en la presente por referencia en su totalidad).

[0039] Ejemplos de quinasas adecuadas para utilizar en la invención se indican en las SEQ ID NOs 1-32 siguientes. En una realización, las quinasas utilizadas en la invención tienen por lo menos un 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ó 100% de identidad con las SEQ ID Nos: 1-32.

[0040] Otros ejemplos de quinasas informadoras adecuadas se pueden encontrar en WO00/46357 y WO2005/093085, que se incorporan en la presente por referencia en su totalidad.

[0041] En una realización de la invención, se detecta la actividad de quinasa utilizando un sistema de detección bioluminiscente de ATP. Un método de ensayo de luciferina-luciferasa estándar puede detectar como mínimo10-15 moles de ATP. Mediante el acoplamiento de una amplificación enzimática a los métodos de detección bioluminiscentes es posible detectar como mínimo 10-20 moles de quinasa.

Estabilización del indicador biológico

[0042] En la técnica son conocidos un conjunto de aditivos y cambios en la formulación que incrementan la estabilidad de una enzima, por ejemplo una quinasa, a la desactivación por calor.

[0043] La adición de agentes de estabilización, tales como sorbitol, hasta una concentración de 4 M, u otros polioles, tales como etilenglicol, glicerol o manitol, a una concentración de hasta 2 M puede mejorar la termoestabilidad de la enzima. Otros aditivos, tales como xilano, trehalosa, gelatina, también pueden proporcionar efectos de estabilización adicionales, ya sea individualmente o en combinación. La adición de una gama de iones metálicos divalentes, de manera más destacada Ca2+, Mg2+ o Mn2+ también puede mejorar la estabilidad de la enzima.

[0044] La modificación química de las enzimas también se puede utilizar para mejorar su estabilidad térmica. La alquilación reductora de los grupos amino expuestos en la superficie mediante ácido glioxílico (por ejemplo, Melik-Nubarov (1987) Biotech letts 9:725-730), la adición de carbohidratos a la superficie de proteínas (por ejemplo Klibanov (1979) Anal. Biochem. 93:1-25) y la amidación (por ejemplo, Klibanov (1983) Adv. Appl. Microbiol. 29:1-28) pueden incrementar la estabilidad de la enzima. Métodos adicionales que incluyen la utilización de agentes de reticulación químicos y la utilización de varios soportes poliméricos para la inmovilización de enzimas también son métodos relevantes para incrementar la termoestabilidad de enzimas (revisado en Gupta (1991) Biotech. Appl. Biochem. 14:1-11).

[0045] Modificaciones similares también son relevantes para la estabilización del indicador frente a otros procesos de esterilización, tales como peróxido de hidrógeno u ozono. En particular, los procesos en los que está limitado el acceso del esterilizador en fase gaseosa a la enzima, por ejemplo, mediante la encapsulación en un polímero o formulación adecuados con un aditivo para reducir la penetración del gas, proporcionarán métodos útiles para incrementar la estabilidad del enzima, si es necesario.

[0046] Muchos de los tratamientos que son eficaces en el incremento de la estabilidad térmica de enzimas también son relevantes en la estabilización contra tratamientos con proteasas, por ejemplo para el desarrollo de un indicador para la desactivación eficaz de agentes TSE mediante un tratamiento con proteasas. En general, es probable que una proteína que muestra niveles elevados de termoestabilidad también muestre un grado elevado de estabilidad para procesos degradativos, tales como la desnaturalización o tratamiento con proteasas (Véase, por ejemplo: Daniel RM, Cowan DA, Morgan HW, Curran MP, "A correlation between protein thermostability and resistance to proteolysis", Biochem J. 1982 207:641-4; Rees DC, Robertson AD, "Some thermodynamic implications for the thermostability of proteins", Protein Sci. 2001 10:1187-94; Burdette DS, Tchernajencko V V, Zeikus JG."Effect of thermal and Chemicals denaturants on Thermoanaerobacter ethanolicus secondary-alcohol dehydrogenase stability and activity", Enzyme Microb Technol. 2000 27:11-18; Scandurra R, Consalvi V, Chiaraluce R, Politi L, Engel PC., "Protein thermostability in extremophiles", Biochimie. 1998 Nov;80(11):933-41; y Liao HH., "Thermostable mutants of kanamycin nucleotidyltransferase are also more stable to proteinase K, urea, detergents, and water-miscible organic solvents", Enzyme Microb Technol. 1993 Apr;15(4):286-92). Por lo tanto, las quinasas termoestables muestran en general un grado más elevado de estabilidad a las acciones de los tratamientos con proteasas diseñados para desactivar los agentes TSE que lo que podrían quinasas mesofílicas equivalentes. Dependiendo del tipo de proceso utilizado, también se puede seleccionar una quinasa para favorecer otras características del proceso. De este modo, para un tratamiento con proteasas a pH alcalino, el protocolo tiende a la utilización de una quinasa termoestable de un organismo moderadamente alcalofílico, tal como P.furiosus, mientras que un tratamiento con proteasas a pH ácido podría utilizar una quinasa de un acidófilo, tal como S.acidocaldarius o S.solfotaricus.

[0047] Si se requiere para mejorar la estabilidad del indicador de quinasa en el tratamiento con proteasas existen un conjunto de otras opciones. Un conjunto de éstas son las mismas que las descritas anteriormente para la estabilización de la enzima contra el tratamiento térmico. Por ejemplo, las formulaciones que contienen sorbitol, manitol u otros polímeros complejos reducen los niveles de desactivación de la enzima en la superficie del indicador. Además, los tratamientos que reducen específicamente la velocidad en que un sustrato de proteasa se degrada son particularmente relevantes para esta aplicación. Por ejemplo, la formulación de la quinasa en una solución que contiene hasta alrededor de 10 mg/ml (un exceso de 10 veces en comparación con la concentración preferida del indicador) de una proteína portadora adecuada, tal como caseína o albúmina, que actúa como sustrato alternativo para la proteasa, reducirá específicamente la velocidad de digestión del indicador de quinasa. De manera similar, la adición de aminoácidos libres, tales como glicina, tirosina, triptófano o dipéptidos a la formulación proporcionaría un medio de inhibición del nivel de sustrato de la enzima y reduciría la desactivación local del indicador de quinasa.

[0048] Las quinasas termoestables producidas mediante la expresión recombinante en bacterias también se pueden utilizar en la presente invención. Se ha observado que la modificación genética de enzimas proporciona aumentos significativos en la estabilidad térmica y por analogía dichas mutaciones también aumentarán probablemente de manera significativa la estabilidad de las enzimas indicadoras en otros procesos, tales como el tratamiento con proteasas o la “esterilización” en fase gaseosa. La comparación de la termoestabilidad de las enzimas quinasas obtenida con la estructura tridimensional definida de las AK (arqueas) triméricas (Vonrhein et al (1998) J. Mol. Biol. 282:167-179 y Criswell et al (2003) J. Mol. Biol.330:1087-1099) ha identificado aminoácidos que influyen en la estabilidad de la enzima.

[0049] Las variantes de quinasas modificadas genéticamente que muestran una termoestabilidad mejorada también se utilizan en la presente invención y se pueden generar de varias maneras. Esencialmente éstas implican la mutagénesis dirigida de sitio específico de aminoácidos que se cree que forman parte de la región de empaquetamiento del núcleo central de la molécula trimérica y métodos de “evolución dirigida” aleatoria donde la molécula completa se somete a rondas posteriores de mutagénesis y la selección/cribado de moléculas con propiedades mejoradas. Las enzimas modificadas específicas se establecen en las SEQ ID NOs: 17-19 (varias variantes están comprendidas por cada referencia). Estas modificaciones descritas se basan en una estrategia de híbridos que utiliza una estrategia basada en consenso para definir regiones que probablemente influyen en la termoestabilidad de las enzimas en base a las diferencias observadas entre moléculas estructuralmente relacionadas. Esto va seguido de cambios definidos para incorporar los aminoácidos que se correlacionan con la mejor estabilidad o una sustitución aleatoria para incorporar cada aminoácido disponible en las posiciones definidas como esenciales para la termoestabilidad.

[0050] La estabilidad/resistencia de los indicadores que se unen a componentes biológicos que son parte de una matriz se puede mejorar mediante el incremento de la concentración del componente biológico en la matriz, o mediante el incremento del grado de reticulación. A modo de ejemplo, uno de los indicadores de la invención emplea un indicador de péptido quinasa reactiva a fibrina para realizar una reticulación en una matriz biológica que contiene fibrina, por ejemplo, una película de fibrina. Mediante la alteración de la película de fibrina, por ejemplo, mediante el incremento de la concentración de fibrina, o mediante el incremento de su grado de reticulación, es posible incrementar de manera significativa la resistencia del indicador a procesos específicos.

[0051] La resistencia de indicadores que contienen componentes biológicos, tales como Sup35, se puede incrementar mediante la inducción de la fibrilación de los indicadores. Esto proporciona una molécula con una mayor estabilidad física y puede ser relevante para monitorizar la desactivación de agentes, tales como proteínas priones, que se cree que son de naturaleza multimérica.

[0052] En una realización, el indicador se formula en un portador seleccionado del grupo que consiste en sacarosa (por ejemplo hasta un 15 p/v), mucina (por ejemplo, hasta un 0,5% p/v), y albúmina (por ejemplo, hasta 1 mg/ml).

Soportes sólidos

[0053] El indicador biológico de la invención puede estar unido a un conjunto de soportes sólidos. Los soportes pueden ser con o sin modificaciones químicas y pueden comprender uno o más indicadores en un conjunto de formulaciones, dependiendo, por ejemplo, de las necesidades del proceso a validar. En una forma, el soporte es una superficie de plástico, madera, cerámica, vidrio, tela, acero u otra superficie metálica o polimérica sobre la que se seca/reticula el indicador como medio de inmovilización. El soporte puede ser una tira indicadora o reactiva de policarbonato, poliestireno o polipropileno, opcionalmente con una superficie aplanada, sobre la que se aplica el indicador. Un tipo adicional de soporte con una superficie porosa para la unión del indicador es también particularmente útil como indicador para procesos gaseosos. Las microesferas de plástico, madera, metálicas o cerámicas también pueden proporcionar un formato valioso para el soporte sólido, de nuevo con relevancia específica para monitorizar los procesos gaseosos. Dichos soportes presentan ventajas para ciertas aplicaciones, ya que proporciona un área superficial significativamente incrementada para la unión del indicador. En una realización adicional, el soporte sólido es una matriz y el indicador se dispersa en la matriz. En otra realización, la matriz es una matriz biológica compleja.

Inmovilización del indicador biológico sobre el soporte sólido

[0054] Los indicadores de la invención se pueden unir sobre el soporte sólido mediante cualquiera de una amplia variedad de métodos conocidos en la técnica.

[0055] En una realización de la invención, el indicador se une sobre el soporte sólido a través de métodos estándar de adsorción de proteínas descritos a continuación.

[0056] La unión del indicador sobre el soporte sólido se puede conseguir mediante métodos utilizados habitualmente para unir proteína a las superficies, por ejemplo, la incubación de proteína en tampón de bicarbonato de sodio 0,1 M a pH de aproximadamente 9,6 a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora. Alternativamente, la proteína se une covalentemente a la superficie utilizando una amplia gama de químicas de acoplamiento conocidas para los expertos en la materia. Por ejemplo, se une covalentemente una proteína de fusión de adenilato quinasa (por ejemplo a Sup35) derivada con SPDP (Pierce chemicals; utilizando las instrucciones del fabricante), reducida con DTT para proporcionar grupos sulfhidrilo libres para la reticulación, a un soporte de poliestireno con una superficie de maleimida. Las superficies de plástico con dichas superficies de unión a sulfhidrilo están descritas en la literatura. Una ventaja añadida de este método de acoplamiento es que, si es necesario, la enzima se puede separar del soporte, por ejemplo, mediante reducción con DTT o MESNA, para permitir que se lleve a cabo el ensayo por separado a cualquier soporte de indicador. Los indicadores descritos en esta solicitud tienen la propiedad de que su actividad se mantiene tras la derivación y la reticulación a dichos soportes.

[0057] Alternativamente, se utiliza una superficie reactiva a amina en un soporte de poliestireno o policarbonato, con un agente de reticulación bifuncional, tal como glutaraldehído monomérico, para proporcionar una reticulación no separable directa del indicador de quinasa a través de grupos amina libres en la proteína. El tratamiento con UV también se puede utilizar para unir directamente el indicador a un soporte adecuado. Las superficies de acero se pueden tratar de forma similar a las superficies de plástico para mediar la unión covalente del indicador.

[0058] Están disponibles una amplia variedad de reactivos reticulantes en compañías, tales como Pierce chemical company (Perbio). Se diseñan reactivos que son reactivos a grupos sulfhidrilo, amino, hidroxilo y carboxilo para acoplar proteínas, pero se pueden utilizar igualmente para reticular proteínas a soportes reactivos de forma natural o soportes sólidos recubiertos, tales como plásticos, otros polímeros, vidrio y metales. Las químicas reactivas también están disponibles para reticular las enzimas a carbohidratos. Por ejemplo, se pueden utilizar los reactivos BMPH ((N[ácido ß-maleimidopropiónico]hidrazida•TFA), KMUH ((N-[ácido k-maleimidoundecanoico]hidrazida), y MPBH (clorhidrato de hidrazida de ácido 4-(4-N-maleimidofenil)butírico) para reticular el indicador que contiene un sulfhidrilo libre en forma de un residuo de cisteína o una proteína derivada químicamente reducida para generar un grupo reactivo sulfhidrilo a carbohidratos. Esto puede ser particularmente importante para un soporte sólido que es un carbohidrato complejo (por ejemplo, papel, membranas de base celulosa, geles o resinas) o puede estar recubierto o tratado con una solución de carbohidrato para generar una superficie reactiva de forma adecuada.

[0059] Para cada tipo de soporte, el indicador se puede formular en una solución que aumenta la unión y/o estabiliza la proteína unida. Dichas formulaciones incluyen soluciones que contienen hasta un 10% (p/v) de sacarosa, sorbitol, manitol, celulosa o polietilenglicol (PEG). Además, el indicador se puede formular como parte de un gel que se aplica a la superficie o canal de un soporte adecuado. Algunos ejemplos incluyen matrices de alginato, agar o poliacrilamida.

[0060] El indicador también puede comprender un agente para estabilizar el indicador y se seleccionan agentes de estabilización adecuados entre iones metálicos, azúcares, alcoholes de azúcares y agentes formadores de geles.

[0061] Para facilitar la utilización del indicador, el indicador puede comprender además medios para unir el soporte sólido a una superficie, tal como una proyección, hueco o apertura para la unión del soporte a una superficie mediante un tornillo, tuerca y perno o abrazadera.

Kits que comprenden el indicador biológico

[0062] En un segundo aspecto de la invención, se proporciona un kit para utilizar en la validación de un proceso de tratamiento en que se reduce la cantidad o actividad de un contaminante en una muestra, que comprende:

(i)

un indicador de proceso biológico según el primer aspecto de la invención, y

(ii)

un sustrato para la quinasa termoestable.

[0063] Para llevar a cabo la medición de la cantidad/actividad de quinasa, el kit puede incluir medios para detectar ATP, por ejemplo, luciferina/luciferasa y opcionalmente un luminómetro. En una realización, el sustrato para la quinasa termoestable es ADP.

[0064] A partir de análisis previos con contaminantes conocidos, se pueden preparar datos que correlacionan la reducción en la cantidad o actividad del contaminante con actividad quinasa, y por tanto, el kit también puede incluir una o más tablas de búsqueda que correlacionan la actividad quinasa con la reducción en la cantidad o actividad de una lista d contaminantes especificados. En una realización, el kit es para monitorizar la desactivación de TSE. En una realización adicional, el kit se utiliza para monitorizar la desactivación de norovirus.

Utilización del indicador biológico

[0065] En un tercer aspecto, la presente invención proporciona la utilización de una quinasa termoestable unida covalentemente a un componente biológico como un indicador de procesos biológicos para validar un proceso de tratamiento para reducir la cantidad o actividad de un contaminante en una muestra.

[0066] En una realización, el indicador de procesos biológicos se formula según el primer aspecto de la invención.

[0067] En una utilización particular de la invención, un indicador según el primer aspecto de la invención es el informador en un método de indicación de la posible presencia de un contaminante (por ejemplo, un agente infeccioso) después de un proceso de limpieza o desactivación. En primer lugar, se expone una muestra que contiene el indicador a un procedimiento de limpieza/desactivación (por ejemplo, uno o más de una temperatura, pH

o concentración de proteasa seleccionados). La siguiente etapa es eliminar cualquier actividad enzimática contaminante mediante tratamiento térmico, por ejemplo, desde 60 a 80°C durante por lo menos 10 minutos (es decir, bajo condiciones que no afectan de manera significativa a la quinasa termoestable). A continuación, el indicador reacciona a una temperatura entre 30°C y 70°C con un sustrato (por ejemplo ADP) para permitir la generación de ATP. La formación de ATP se puede medir mediante detección bioluminiscente utilizando luciferina/luciferasa y un luminómetro adecuado a 20-30°C durante 10 minutos a 1 hora. La lectura de salida de luz del luminómetro proporciona una lectura de la actividad residual de quinasa, es decir, la actividad de la quinasa después de la exposición al tratamiento de limpieza/desactivación. En base a los datos que se han derivado previamente de experimentos separados, el método se completa mediante la correlación de la actividad residual de quinasa con la posible presencia de un contaminante en la muestra tratada.

[0068] En una realización, se puede eliminar la actividad enzimática contaminante o ATP en una muestra mediante una etapa de tratamiento inicial (por ejemplo, una temperatura, pH o concentración de proteasa seleccionados), antes de la adición del indicador.

[0069] A continuación, se describe la utilización del indicador de la invención para monitorizar/validar una variedad de procesos.

[0070] En una realización, el indicador se utiliza para validar el rendimiento de una preparación de lavado biológico en un ciclo de lavado. Aunque la validación de un ciclo de lavado sería potencialmente útil en un entorno doméstico, su uso más ventajoso sería en un entorno de preparación sanitaria, farmacéutica o alimenticia, por ejemplo, para validar la descontaminación de ropa de cama, vestidos u otros objetos asociados con pacientes sufren o están expuestos a agentes infecciosos (por ejemplo, un brote de Staphylococcus aureus (MRSA) o virus Norwalk/del tipo Norwalk resistentes de meticilina). En este contexto, el indicador de la invención tiene la ventaja de que es relevante para el material biológico, tal como sangre u otros fluidos biológicos.

[0071] Para la validación de un ciclo de lavado, el indicador puede estar reticulado sobre una vara flexible, una tira de ropa u otro material adecuado para la inclusión en el ciclo. El indicador se pone en el equipo de lavado con el resto de la carga. En una realización, el indicador se puede fijar en un soporte adecuado en el interior del equipo de lavado para facilitar su recuperación.

[0072] A continuación, se realiza el ciclo de lavado y se extrae el indicador y se evalúa antes de cualquier manipulación o procesado adicional de la carga, utilizando un “lector” que se ha calibrado para indicar un nivel aceptable de actividad residual de quinasa en el indicador – derivando el nivel aceptable de la calibración y la valoración previas del rendimiento de lavado adecuado en el proceso. Dicha valoración podría incluir los niveles globales de suciedad y el recuento viable de microorganismos valorado utilizando organismos modelos adecuados conocidos por los expertos en la materia. En base a la lectura calibrada, la carga se pasa para el procesamiento posterior o se repite el ciclo de lavado.

[0073] En una segunda realización, el indicador se utiliza para validar procesos para la desactivación de virus. La detección de aislados virales vivos en el medio ambiente es problemática, particularmente cuando están asociados con una situación de emergencia donde la velocidad y la precisión pueden ser críticas. La presente invención proporciona la posibilidad de desarrollar sistemas indicadores que permiten la monitorización de procedimientos de descontaminación esencialmente a tiempo real. Esto sería particularmente valioso para la descontaminación de superficies en instalaciones sanitarias y relacionadas después de un brote (por ejemplo de virus de tipo Norwalk) o una liberación deliberada de un agente viral (tal como la viruela).

[0074] El indicador para validar un proceso d desactivación viral puede tener una variedad de formas diferentes, por ejemplo, una vara o una tira reactiva para monitorizar un área pulverizada o sumergida con virucida, o un indicador suspendido para la monitorización de un proceso de contaminación en fase gaseosa. Alternativamente, el indicador se puede pulverizar sobre una superficie antes de la contaminación y posteriormente se pueden evaluar los niveles de actividad residual de quinasa mediante la recogida de muestras con hisopo de la superficie.

[0075] En una realización adicional de la invención, el indicador se utiliza para validar la degradación de proteasas de toxinas proteicas bacterianas, toxinas vegetales, tales como ricina, y otras proteínas, péptidos o análogos de péptidos tóxicos.

[0076] Las proteasas muestran un potencial significativo para la degradación de una amplia gama de toxinas proteicas que son potenciales agentes de amenaza de guerra bacteriológica/bioterror que incluyen la toxina botulínica, toxinas de ántrax y ricina. También presentan potencial para desactivar una amplia gama de otros agentes proteicos o peptídicos potencialmente tóxicos o dañinos para permitir la descontaminación de superficies/instalaciones o la eliminación segura de materiales. En este contexto, el indicador de la invención, junto con la superficie/material a descontaminar, se someten al procedimiento de descontaminación con proteasas. Al final del procedimiento, la actividad residual de quinasa del indicador se evalúa según el método de la invención. A continuación, se correlaciona el nivel de actividad residual de quinasa con los índices de desactivación para la toxina

o grupo de toxinas proteicas particulares. Suponiendo que el nivel de actividad es igual o inferior al valor del índice definido, entonces el material se puede desechar de manera segura o la superficie/instalación se puede volver a utilizar.

[0077] En una realización, se construye un margen de seguridad adecuado en la calibración de los índices de desactivación para permitir cualquier variabilidad del rendimiento del proceso. La estabilidad adicional de las enzimas utilizadas en esta invención permite hacerlo con una mayor certeza y un mayor rango dinámico que el rango amplio de otros indicadores enzimáticos, que incluyen los de organismos “termoestables”, tales como Bacillus stearothermophilus, tal como se muestra por los datos que muestran la estabilidad térmica relativa de AK de organismos termófilos (figura 1, ejemplo 2).

[0078] El indicador también se puede utilizar para validar procedimientos de descontaminación con proteasas para limpiar aparatos de producción farmacéutica. Una amplia variedad de productos farmacéuticos utilizan materiales de humanos o animales que podrían estar contaminados con una amplia variedad de agentes, que incluyen agentes priones (TSE) y virus (por ejemplo, virus del oeste del Nilo, hepatitis, VIH). Los riesgos se pueden exacerbar cuando el origen del material es de origen animal (por ejemplo, suero de ternera fetal, inmunoglobulinas de caballo) y cuando una etapa intermedia del procesado puede implicar el riesgo de incrementar la concentración de patógenos no identificados en una muestra concreta. La posibilidad de utilizar una proteasa para limpiar instalaciones y aparatos de fabricación (por ejemplo, columnas de cromatografía, recipientes, conductos) entre los lotes de fabricación presenta el potencial de reducir o eliminar dichos riesgos, incluso cuando el contaminante no se ha identificado de forma oficial. Esto es particularmente cierto para agentes priones, por ejemplo, aparatos de fraccionamiento de sangre donde existe un riesgo significativo de acumulación y de implicación de un riesgo de infección en el producto final.

[0079] Para validar este tipo de procedimiento, el indicador de la invención se formula de manera ideal como una tira reactiva a sumergir en la solución de tratamiento con proteasas o como un cartucho a unir en línea con el aparato a limpiar. Mediante la evaluación de los niveles de actividad residual de quinasa en el dispositivo indicador después del tratamiento y la correlación de éstos con los niveles aceptables de limpieza, se puede desarrollar un seguimiento del rendimiento rápido y fiable.

[0080] En otra realización de la invención, el indicador se utiliza para validar la desactivación en fase gas de contaminantes, tales como TSE.

[0081] El potencial del ozono u otros esterilizantes en fase gas para desactivar dichos contaminantes ha sido sugerido por una amplia gama de publicaciones y artículos, aunque, por ahora, ningún método se ha mostrado explícitamente eficaz. Para ayudar en el desarrollo e introducción de esta tecnología en fase gas en la sanidad, será necesario un medio de validación del rendimiento de la tecnología. Como se ha observado que los agentes, tales como TSE, son mucho más resistentes a esta forma de desactivación que los agentes virales o bacterianos convencionales, los métodos disponibles actualmente para validar la desactivación en fase gas no son probablemente adecuados. La presente invención se refiere a este problema.

[0082] Para este tipo de validación, el indicador se une sobre un soporte sólido mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, la adsorción general y la reticulación química mediante enlaces amida, peptídicos, carbonílicos o cisteína. Por ejemplo, para la esterilización con ozono, se puede utilizar un soporte de cloruro de polivinilo (PVC) rígido, vidrio, acero, poliamida o polipropileno, con el indicador acoplado al soporte mediante cualquiera de los métodos descritos previamente. A continuación, el indicador se incluye en el lote de materiales/instrumentos a esterilizar, se expone al ozono, y se valora frente a un índice de desactivación calibrado de manera adecuada diseñado para evaluar la desactivación correspondiente del agente en cuestión. La desactivación satisfactoria permite el procesado posterior o la utilización del material/instrumentos.

[0083] El indicador opcionalmente puede estar unido a la cara interna de un tubo o espacio interno equivalente, de manera que se limita la penetración del gas. Esto proporciona un seguimiento que es adecuado para valorar la penetración del gas en espacios equivalentes en instrumentos con canales o a través de cargas de material empaquetado. Alternativamente, el indicador se puede unir a materiales porosos, tales como microesferas poliestireno, o se puede inmovilizar en un gel o resina.

[0084] En una realización adicional de la invención, el indicador se utiliza para validar sistemas de esterilización química líquida (por ejemplo, Endoclens), tal como se utiliza para procesar endoscopios y equipo relacionado.

[0085] Habitualmente se utiliza una amplia gama de endoscopios en medicina y son una parte importante del diagnóstico y el tratamiento médico. Estos instrumentos son extremadamente sensibles y han supuesto un problema muy significativo para el lavado y desinfección rutinarias. Tradicionalmente, y aún existente en la práctica actual, los endoscopios se limpian a mano antes de descontaminarse utilizando un método de baja temperatura. Se ha desarrollado una gama de desinfectantes químicos y aparatos de reprocesado automatizados para tratar las partes específicas de piezas sensibles a la descontaminación de equipos, tales como endoscopios, en los que no es posible el autoclave tradicional. Estos métodos han ayudado a reducir los niveles de contaminación en la dificultad de limpiar instrumentos, que se ha asociado con la transmisión yatrogénica de una amplia gama de patógenos virales y bacterianos. El método actual de validación de dichos procesos es el seguimiento de la velocidad de flujo y la temperatura de la solución de lavado. El indicador de la invención proporciona un medio de validación adicional que proporciona una lectura de la eficacia real de limpieza en los canales del endoscopio.

[0086] Para este tipo de validación, el indicador se une a la superficie interna de un tubo diseñado para tener un diámetro interno global similar al del tubo del endoscopio. Este aparato indicador se conecta en serie al endoscopio en el aparato de reprocesado automático. A continuación, el endoscopio se procesa de la manera normal. Al final del proceso, preferentemente antes de extraer el endoscopio del aparato, se separa el indicador y se valor el nivel de actividad quinasa restante. El nivel de actividad se puede correlacionar con los umbrales definidos anteriormente para al rendimiento aceptable del proceso y, en base a esta valoración, el endoscopio se puede transferir para una limpieza o descontaminación adicional o prepararse para su uso. Si el nivel de rendimiento no es adecuado, entonces el instrumento se puede reprocesar (utilizando las mismas condiciones o más rigurosas) con un nuevo indicador unido tal como se ha indicado previamente. El aparato indicador también es adecuado para validar la limpieza manual del endoscopio y/o cualquier otro instrumento con un canal.

[0087] En una realización adicional de la invención, el indicador se utiliza para el seguimiento del rendimiento de la limpieza de rutina en equipos de lavado-desinfección, tales como los utilizados en hospitales.

[0088] En otra realización de la invención, el indicador se utiliza para monitorizar los tratamientos con glutaraldehído u orto-ftaldehído (OPA). El glutaraldehído y formaldehído se han utilizado ampliamente como esterilizantes durante muchos años. Los desinfectantes químicos trabajan multiplicando las proteínas reticulantes de una manera no específica para destruir su función. El ortoftaldehído (OPA) ha aparecido recientemente como un nuevo desinfectante en esta familia y se está utilizando ampliamente ya que evita parte de los problemas de toxicidad asociados con el glutaraldehído. El indicador de la invención es adecuado para el seguimiento de toda esta clase de desinfectantes químicos, ya que las quinasas son sensibles al reticulado no específico de este tipo. El indicador puede estar unido covalentemente a una superficie adecuada y exponerse a un esterilizante químico junto con los otros productos a esterilizar. La eficacia del proceso se evalúa midiendo la actividad residual de la enzima del indicador. Esta actividad se compara con los valores umbrales definidos que indican el rendimiento correcto del proceso.

[0089] La utilización de diferentes tipos de quinasa puede proporcionar una sensibilidad o susceptibilidad al proceso según sea necesario para diferentes aplicaciones. Las adenilato quinasas termoestables descritas en esta memoria se pueden clasificar ampliamente en dos grupos basados en su arquitectura molecular. De este modo, las enzimas de la especie Sulfolobus son ejemplos de enzimas que presentan una estructura trimérica con un núcleo central hidrofóbico que es el determinante principal en el mantenimiento de su actividad a altas temperaturas. El segundo grupo de enzimas son monoméricas, ejemplificadas por las adenilato quinasas de la especie Thermatoga, pero tienen una cadena polipeptídica ligeramente más larga con un dominio “tapa” adicional que afecta al sitio activo. Estos tipos diferentes de enzimas termoestables mostrarán una sensibilidad diferencial a este tipo de esterilizante químico debido a la flexibilidad variable de sus cadenas peptídicas durante la acción de la enzima. Para cualquier tipo de esterilizante y/o concentración un cribado empírico identificará enzimas con susceptibilidades adecuadas para monitorizar y validar estos tipos de agentes químicos.

[0090] En una realización adicional de la invención, el indicador se utiliza como un seguimiento de lectura ultrarápida para óxido de etileno, peróxido de hidrógeno u otros procesos en fase gas.

[0091] Actualmente una amplia gama de esterilizantes en fase gas son utilizados por un conjunto de fabricantes para la desinfección rutinaria de agentes bacterianos y virales. Los métodos actuales explotan las propiedades oxidativas de los gases para destruir las uniones peptídicas. Por tanto, las quinasas de la presente invención, con sus propiedades fisicoquímicas robustas, son ideales para proporcionar una lectura muy rápida de la desactivación. El indicador en este ejemplo es similar a los descritos previamente, por ejemplo, en relación con la desactivación con ozono de agentes, tales como TSE.

[0092] Un punto particularmente desafiante para los procesos de esterilización y descontaminación es la capacidad de validar la esterilidad de grandes cantidades líquidos voluminosos, como puede ser necesario en la fabricación de varias medicinas u otros productos farmacéuticos. Mientras que los métodos actuales monitorizan los parámetros de temperatura, tiempo y/o presión de un proceso particular (dependiendo de su exacta naturaleza), existen poco métodos disponibles, si los hay, para validar la esterilización real en el líquido voluminoso. Esto es difícil incluso en volúmenes de alrededor de 1 litro, pero es casi imposible a volúmenes más grandes.

[0093] La presente invención proporciona un conjunto de posibles soluciones para tratar este problema. En su forma más simple, el indicador se puede añadir al líquido a esterilizar en una concentración adecuada para medir niveles definidos de desactivación de quinasa el final del proceso y equipararlos a los niveles de esterilización. Aunque esto no sería deseable en ciertos tipos de procesos, la naturaleza inerte de la quinasa y la omnipresencia de actividades enzimáticas equivalentes en todos los organismos, puede hacerlo aceptable. La aceptabilidad se puede mejorar por el hecho de que muchas enzimas termoestables están altamente condensadas y, de este modo, tienen una inmunogenidad muy baja después de la inoculación en animales.

[0094] Cuando dichas adiciones directas no son aceptables, el indicador se puede añadir al líquido voluminoso en una bolsa de diálisis, recipiente poroso o se puede inmovilizar a un soporte adecuado, de manera que no se libera ninguna parte del indicador en el líquido voluminoso, sino que las condiciones esterilizantes trabajan en el indicador de la misma manera que para toda la muestra. Para los expertos en la materia son conocidas una amplia variedad de maneras posibles de contener o inmovilizar proteínas para permitir la difusión general de la muestra líquida, pero limitando el movimiento de la muestra indicadora. Los posibles ejemplos incluyen, pero sin limitación, membranas de diálisis, tubos Visking, membranas porosas, resinas de unión a proteínas, geles rígidos o soportes sólidos tal como se han descrito para los otros indicadores dados a conocer. El indicador se puede unir a la superficie mediante cualquiera de los métodos descritos anteriormente, o simplemente recubrirse en una membrana adecuada sin unión, de manera que el indicador se puede extraer simplemente de líquido voluminoso al completar el proceso.

Método de validación de un proceso de tratamiento

[0095] En un cuarto aspecto, la invención proporciona un método de validación de un proceso de tratamiento para reducir la cantidad o actividad de un contaminante en una muestra, que comprende las etapas de:

(a)

obtener una muestra que contiene o es sospechosa de contener un contaminante;

(b)

someter la muestra a un proceso de tratamiento en presencia de una cantidad definida de una quinasa termoestable unida covalentemente a un componente biológico;

(c)

medir la actividad residual de quinasa y opcionalmente calcular la reducción en la actividad de quinasa; y

(d)

comparar dicha actividad residual de quinasa con una actividad de quinasa predeterminada, o comparar dicha reducción en la actividad de quinasa con una reducción predeterminada en la actividad de quinasa, donde la actividad predeterminada de quinasa o la reducción predeterminada en la actividad de quinasa corresponde a una reducción confirmada en la cantidad o actividad del contaminante bajo las mismas condiciones.

[0096] Es posible que la muestra en la etapa (a) no pueda contener ningún contaminante. El punto de la validación es que, después de llevar a cabo el tratamiento, se confirme que cualquier agente que podría haber estado presente se haya eliminado/desactivado hasta un grado aceptable. En general, sin embargo, se sabe que la muestra contiene, o es sospechosa de contener el contaminante.

[0097] En una realización, la quinasa termoestable en la etapa (b) del método se formula como un indicador según el primer aspecto de la invención.

[0098] En otra realización, la actividad residual de quinasa en la etapa (c) se mide añadiendo un sustrato que comprende ADP a la quinasa residual y midiendo la formación de ATP. La formación de ATP se puede medir mediante detección bioluminiscente utilizando luciferina/luciferasa y un luminómetro adecuado.

[0099] Habitualmente, un operador mide la actividad de quinasa antes de tratar la muestra y después de tratar la muestra. También es posible que la quinasa contaminante, normalmente mesofílica, pueda entrar en la muestra antes de analizar la actividad de quinasa. De este modo, en una realización de la invención, el ensayo incluye la etapa de desactivar la quinasa mesofílica, tal como mediante el tratamiento de la muestra a 70 grados C durante por lo menso 30 minutos, o a 80 grados C durante por lo menso 10 minutos, antes de medir la actividad residual de quinasa.

[0100] En una realización, la quinasa, antes del tratamiento, tiene una actividad de por lo menos 10.000.000 Unidades Relativas de Luz (RLU) por mg de quinasa, o por lo menos 8.000.000 RLU por mg de quinasa, o por lo menos 5.000.000 RLU por mg de quinasa, o por lo menos 3.000.000 por mg de quinasa, o por lo menos 1.000.000 RLU por mg de quinasa, o por lo menos 500.000 RLU por mg de quinasa, cuando se mide en presencia de luciferina/luciferasa mediante un luminómetro.

[0101] En otra realización de la invención, la actividad predeterminada de quinasa es inferior a 10.000 RLU por mg de quinasa, o inferior a 1000 RLU por mg de quinasa, o inferior a 500 RLU por mg de quinasa, o inferior a 250 RLU por mg de quinasa, o inferior a 100 RLU por mg de quinasa, o inferior a 10 RLU por mg de quinasa, o inferior a 1 RLU por mg de quinasa, o es 0 RLU por mg de quinasa.

[0102] En una realización adicional de la invención, la reducción predeterminada en la actividad de quinasa es igual

o superior a una reducción de una vez logarítmica, o una reducción de dos veces logarítmicas, o una reducción de tres veces logarítmicas, o una reducción de cuatro veces logarítmicas, o una reducción de cinco veces logarítmicas,

o una reducción de seis veces logarítmicas, o una reducción de siete veces logarítmicas, o una reducción de ocho veces logarítmicas o una reducción de nueve veces logarítmicas en la actividad de quinasa.

[0103] En otra realización, la reducción predeterminada en la actividad de quinasa corresponde a una reducción de tres veces logarítmicas, o una reducción de seis veces logarítmicas, o una reducción de siete veces logarítmicas, o una reducción de ocho veces logarítmicas, o una reducción de nueve veces logarítmicas, en la cantidad o concentración de la quinasa. En realizaciones adicionales, la reducción predeterminada en la actividad de quinasa corresponde a una reducción en RLU de por lo menos 800.000, o por lo menos 900.000, o por lo menos 950.000, o por lo menos 990.000, o por lo menos 999.000, o por lo menos 999.900, o por lo menos 999.990, o por lo menos

999.999 RLU.

[0104] En otra realización de la invención, la reducción confirmada en la cantidad o actividad del contaminante en la muestra es de por lo menos 3 veces logarítmicas, por lo menos 6 veces logarítmicas, preferiblemente por lo menos 7 veces logarítmicas, más preferiblemente por lo menos 8 veces logarítmicas, lo más preferiblemente por lo menos 9 veces logarítmicas.

[0105] En otra realización de la invención, se continúa el tratamiento hasta que la actividad residual de quinasa o la reducción en la actividad de quinasa corresponde a una reducción confirmada en la cantidad o actividad del contaminante de por lo menos 3 veces logarítmicas, por lo menos 6 veces logarítmicas, o por lo menos 7 veces logarítmicas, o por lo menos 8 veces logarítmicas o por lo menos 9 veces logarítmicas.

[0106] En una realización de la invención, el método comprende además la etapa de registrar los datos obtenidos en la etapa (c) en un portador de datos adecuado.

Método de correlación

[0107] En un quinto aspecto, la invención proporciona un método de correlación de la reducción en la cantidad o actividad de un contaminante en una muestra con la actividad de quinasa de un indicador de procesos biológicos descrito en relación con el primer aspecto de la invención. Este método comprende:

(i)

preparar una muestra que contiene una cantidad definida del contaminante y una muestra que contiene una cantidad definida del indicador según el primer aspecto de la invención, o preparar una única muestra que contiene una cantidad definida del contaminante y una cantidad definida del indicador según el primer aspecto de la invención;

(ii)

someter la muestra o muestras a un tratamiento;

(iii) medir la actividad residual del indicador quinasa y opcionalmente calcular la reducción en la actividad de quinasa;

(iv)

medir la cantidad o actividad residual del contaminante y opcionalmente calcular la reducción en la cantidad o actividad del contaminante;

(v)

repetir las etapas (i) a (v), donde se cambia por lo menos uno de los parámetros del tratamiento.

[0108] En una realización, el parámetro del tratamiento comprende uno o más de tiempo, temperatura, pH, presión, concentración de proteasa y concentración de esterilizante o detergente.

[0109] En una realización particular, el tratamiento comprende calendar la muestra o muestras a 50-140°C, o 80100°C, o 134-138°C; el parámetro de tratamiento es el tiempo; y se repiten las etapas (i) a (iv) mediante el sometimiento de la muestra o muestras a dicho tratamiento durante periodos de 1, 5, 10, 20, 40 y 60 minutos.

[0110] En una realización adicional, el tratamiento comprende exponer la muestra o muestras a un pH de 9-14 o pH 12 o superior, o aproximadamente pH 12; el parámetro de tratamiento es el tiempo; y se repiten las etapas (i) a (iv) mediante el sometimiento de la muestra o muestras a dicho tratamiento durante periodos de 1, 5, 10, 20, 40 y 60 minutos.

[0111] En otra realización, el tratamiento comprende exponer la muestra o muestras a una proteasa a una concentración de 0,5-2 mg/ml, o aproximadamente 1 mg/ml, o aproximadamente 2 mg/ml; el parámetro de tratamiento es el tiempo; y se repiten las etapas (i) a (iv) mediante el sometimiento de la muestra o muestras a dicho tratamiento durante periodos de 1, 5, 10, 20, 40 y 60 minutos. El método anterior permite la preparación de datos de calibración para la utilización futura del indicador para la validación de un tratamiento en muestras que contienen, o son sospechosas de contener contaminante. La calibración de un conjunto de procesos de tratamiento se describe en WO2005/093085.

Sección de definiciones

[0112] El término “contaminante” comprende agentes infecciosos y no infecciosos derivados de una fuente biológica. Ejemplos de contaminantes incluyen bacterias, virus, hongos, priones, toxinas, alérgenos, esporas, cualquiera de los agentes indicados anteriormente como componentes biológicos y fragmentos y derivados de cualquiera de los anteriores. En el contexto de la invención, un contaminante también puede referirse a un agente biológico contaminante.

[0113] El término "reticulado" se refiere a la unión de dos entidades a través de uno o más enlaces covalentes. La reticulación puede ser química o genética. La reticulación genética comprende indicadores preparados como proteínas de fusión.

[0114] El término "muestra" comprende cualquier producto, instrumento, superficie, fluido o material. Ejemplos incluyen, pero sin limitación, muestras clínicas (tales como sangre completa, suero, muestras orales, tales como saliva, pus, muestras vaginales, muestras de heces, vómitos), muestras ambientales (tales como muestras de agua, tierra, aire). Instrumentos quirúrgicos y médicos, placas de microtitulación, tiras reactivas, dispositivos de flujo lateral, vestimenta de hospital, ropa de cama, líquidos voluminosos, material de animal sacrificado, productos farmacéuticos, banquetas de trabajo, paredes y suelos, matrices biológicas

[0115] El término "tratamiento" o "proceso de tratamiento" comprende cualquier proceso que se diseña para reducir la cantidad o actividad de un contaminante en una muestra. Los tratamientos adecuados incluyen uno o más de: un pH seleccionado (por ejemplo, por debajo de pH 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7, o por encima de pH 7, 8, 9, 10 ó 11, o aproximadamente pH 12), temperatura seleccionad (por ejemplo, por lo menos 40C, 50C, 60C, 70C, 80C, 90C, 100C, 110C, 120C, 130C, 140C, 150C, ó 160C, o entre 50-120C) o presión seleccionada (por ejemplo, por lo menos 50 kPa, 70 kPa, 100 kPa, 150 kPa, 200 kPa, ó 250 kPa), exponer la muestra a una proteasa u otra enzima lítica, exponer la muestra a un detergente, un esterilizante químico, radiación, radicales libres, o un esterilizante en fase gas. En una realización, el tratamiento se diseña para reducir la actividad infecciosa (también conocida como infectividad) de un contaminante biológico infeccioso, tal como TSE. El término "tratamiento" o "proceso de tratamiento" también comprende procesos de limpieza y desactivación, tales como autoclave a temperatura elevada con vapor de agua húmedo o seco, esterilización con ozono, esterilización con H2O2, enfoscar u otro método diseñado para eliminar o desactivar el contaminante. En otra realización de la invención, tanto el indicador como el contaminante se exponen directamente al proceso de tratamiento, es decir, no existe un sellado o barrera entre el indicador /contaminante y el proceso de tratamiento. Por lo tanto, el indicador y el contaminante están ambos en contacto con el proceso de tratamiento y están sujetos a las mismas condiciones de tratamiento.

[0116] El término "componente biológico" comprende cualquier molécula biológica que puede estar unida covalentemente a una enzima quinasa. El componente biológico se puede seleccionar entre una proteína, un ácido nucleico, un lípido o un carbohidrato. El componente biológico es de manera adecuada un mimético o sustituto del contaminante en la muestra a tratar y, por lo tanto, reacciona al proceso de tratamiento sustancialmente la misma manera que el contaminante. En una realización, el componente biológico puede ser el mismo, pero físicamente distinto, que el contaminante en la muestra que se somete al proceso de tratamiento, por ejemplo si el contaminante es una proteína, entonces el componente biológico es también una proteína; si el contaminante es una proteína de la sangre, el componente biológico es también una proteína de la sangre; si el contaminante es una molécula de ADN, entonces el componente biológico es también una molécula de ADN; si el contaminante es una molécula de ARN, entonces el componente biológico es también una molécula de ARN, etc. para cada uno de los contaminantes y componentes biológicos descritos en esta memoria. En otra realización, el componente biológico es diferente del contaminante. En una realización de la invención, el componente biológico no es un péptido, proteína o polipéptido. En una realización adicional de la invención, el componente biológico no es un oligonucleótido (por ejemplo, una sonda de oligonucleótido específica para HPV16). En otra realización adicional de la invención, el componente biológico no es lectina, factor de crecimiento, aptámero ADN/ARN, bacteriófago, o un agente de unión específico para un analito.

[0117] El término "proteína" comprende cualquier molécula que contiene proteína o péptido. Los términos "proteína", "péptido", y "polipéptido" se utilizan indistintamente en la presente memoria.

[0118] El término "proteína de sangre" comprende cualquier proteína que esté presente en la sangre. Ejemplos específicos incluyen proteínas de coagulación de la sangre (por ejemplo, fibrinógeno, péptidos de fibrina, fibrina, sustratos de transglutaminasa, trombina), proteínas del suero (por ejemplo, albúmina y globulina), plaquetas, glicoproteínas de células sanguíneas y hemoglobina.

[0119] El término "proteína bacteriana" comprende cualquier proteína que deriva de una bacteria. Los ejemplos específicos incluyen proteína fimbrial bacteriana (por ejemplo, CgsA de E.coli y AgfA de Salmonella), una toxina proteica bacteriana (por ejemplo, toxinas de Bacillus anthracis, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium botulinum), una proteína de la superficie celular bacteriana (por ejemplo, adhesinas de la superficie celular de bacterias formadoras de flóculos y bacterias filamentosas en lodo activado, peptidoglicano, lipoproteínas), y una proteína de espora bacteriana (por ejemplo, de bacterias Gram positivas y que tiene una secuencia similar o estructura global con las proteínas que forman los apéndices de los lazos en Clostridum taeniosporum, proteínas chaplina A-H y proteínas rodlina Rd1A y Rd1B de Streptomyces spp.).

[0120] El término "proteína viral" comprende cualquier proteína que deriva de un virus. Ejemplos específicos incluyen una proteína de cubierta viral, una proteína de envoltura viral, una proteína de cápside viral y una proteína de núcleo viral. En una realización, las proteínas virales son de un virus bacteriófago (por ejemplo, las proteínas de cubierta MS2 y PP7), virus norwalk (por ejemplo, proteína de cápside), rotavirus (por ejemplo, proteínas VP2, VP6 y VP7), coronavirus (por ejemplo, proteínas S, E y M de SARS), lengua azul (por ejemplo, proteína VP2), virus del papiloma humano (por ejemplo, proteína estructural principal viral, L1), hepatitis B (por ejemplo, proteína de envoltura pequeña HBsAg), Hepatitis C (por ejemplo, proteínas E1 y E2 del núcleo), gripe (por ejemplo neuraminidasa y hemoglutinina y proteínas de matriz), poliovirus (por ejemplo, proteínas de la cápside VP0, 1 y 3), VIH (por ejemplo, proteínas de la envoltura, Pr55gag) y dengue B (por ejemplo, envoltura (e) y premembrana/membrana (prM/M).

[0121] El término "proteína fúngica" comprende cualquier proteína que deriva de un hongo. Ejemplos específicos incluyen proteínas de hidrofobina (por ejemplo SC3 de Schizophyllum commune, RodA/B de Aspergillus fumigates, y proteínas equivalentes de levadura), proteínas de esporas fúngicas, proteínas hifales, micotoxinas, y priones fúngicos (por ejemplo Sup35, Het S, Ure 2, Rnq1, New 1).

[0122] El término "proteína autoagregante" comprende cualquier proteína que es capaz de autoagregarse o autoensamblarse en fibrilas amiloides o biopelículas reactivas en la superficie. Los ejemplos específicos incluyen priones (por ejemplo PrPSc y PrPc, Het S, Ure 2, Rnq1, New 1), proteínas miméticas de priones, fibrilas amiloides, adhesinas de la superficie celular de bacterias formadoras de flóculos y bacterias filamentosas en lodo activado, proteína beta amiloide, proteína tau, proteína de unión a poliadenina, proteína C surfactante de pulmón, proteína CsgA de E.coli, proteína AgfA de especie Salmonella, proteínas fimbriales bacterianas, apolipoproteínas (por ejemplo, apolipoproteína A1), hidrofobinas de especies fúngicas (por ejemplo SC3 de Schizophyllum commune, RodA/B de Aspergillus fumigates), chaplinas (por ejemplo, Chps A-H de Streptomyces spp), rodlinas (por ejemplo Rd1A y Rd1B de streptomyces spp), proteínas de cubierta de esporas gram positivas (por ejemplo P29a, P29b, GP85 y un análogo de SpoVM), y proteínas de tipo cemento de percebe (por ejemplo, la proteína de 19kDa de Balanus albicostatus, y la proteína de 20kDa de Megabalanus rosa, y la nueva proteína de tipo cemento dependiente de calcita de Balanus albicostatus).

[0123] El término "ácido nucleico" comprende polímeros de nucleótidos de cualquier longitud o composición. Ejemplos específicos incluyen una molécula de ADN y una molécula de ARN. En una realización, el ácido nucleico se selecciona entre ADN de cadena sencilla (ssDNA), ARN de cadena sencilla (ssRNA), ADN de doble cadena (dsDNA) o ARN de doble cadena (dsRNA). En otra realización, dichas moléculas derivan de tejido neurológico.

[0124] El término "carbohidrato" comprende cualquier molécula que contiene carbohidrato. Ejemplos específicos incluyen exopolisacárido, lipopolisacárido (EPS/LPS, a veces conocidos como endotoxina) (por ejemplo de Legionella, E.coli, especie Staphylococcus, especie Streptococcus, especie Pseudomonas, especie Acinetobactor, especie Campylobactor, y especie Bacillus,) peptidoglicano, componentes de la pared celular de plantas, hongos y levadura (por ejemplo, quitina, lignina, glucano), preparaciones de mucina, glicolípidos (especialmente, glicolípidos derivados del cerebro), glicoproteínas (por ejemplo, glicoproteínas de la superficie celular, Eap1p), extractos de esporas (por ejemplo de Bacillus spp, Clostridal spp y otros formadores de esporas), polisacáridos de cápsulas de levadura, y secreciones de invertebrados (por ejemplo de geles de moluscos).

[0125] El término "lípido" comprende cualquier molécula que contiene lípidos. Ejemplos específicos incluyen glicolípidos (por ejemplo, glicolípidos derivados del cerebro), gangliósidos (por ejemplo, GT1b, GT1a y GM1), y aceites vegetales y lípidos.

[0126] Un "sustrato de transglutaminasa" es cualquier molécula que es un sustrato para una enzima transglutaminasa. Las transglutaminasas son una familia de enzimas (EC 2.3.2.13) que catalizan la formación de un enlace covalente entre un grupo amina libre (por ejemplo, lisina unida a proteína o péptido) y el grupo gammacarboxamida de glutamina unida a proteína o péptido. Ejemplos de dichas enzimas incluyen el Factor VIII, la transglutaminasa de queratinocito y la transglutaminasa tisular. La fibrina, que actúa mediante el Factor VIII, es un ejemplo de sustrato de transglutaminasa.

[0127] Una "matriz o mezcla biológica" puede comprender uno o más componentes seleccionados del grupo que consiste en proteínas, lípidos, ácidos nucleicos y carbohidratos. En una realización, puede ser una mezcla de proteínas, o puede comprender uno o más entre sangre, suero, moco, óvulo, tejido neurológico, comida o material de animal sacrificado. La matriz o mezcla biológica también puede ser una muestra contaminada de análisis disponible comercialmente, tal como suelo de Browne o suelo de Edimburgo. En una realización, la matriz/mezcla biológica tiene una composición similar a la matriz/mezcla en que está presente el contaminante. En el contexto de la invención, una matriz biológica, también puede referirse como muestra contaminada de análisis.

[0128] Un componente biológico que es un “mimético” o “sustituto” del contaminante es un componente que reaccionará al proceso de tratamiento de una manera muy similar (o sustancialmente la misma) que el contaminante. De manera similar, una matriz biológica que es “mimética” o “sustituta” de la muestra es una matriz que tiene una composición similar a la muestra y que reaccionará al proceso de tratamiento sustancialmente de la misma manera.

[0129] El término "anticuerpo" comprende inmunoglobulinas de longitud completa, y todos los fragmentos y derivados de las mismas, por ejemplo, una cadena pesada, una cadena ligera, un dominio constante, un dominio variable, una región Fab, una región Fc, etc. de una inmunoglobulina.

[0130] El término "fibrina" comprende todos los péptidos derivados de fibrina. Éstos incluyen los péptidos de fibrina de longitud completa y todos los fragmentos y derivados de la misma. Comprende todos los péptidos que tienen reactividad de fibrina, por ejemplo, péptidos que actúan por el Factor VII para formar un coágulo. El término fibrina o péptido de fibrina se puede utilizar indistintamente con el término "sustrato de transglutaminasa" a lo largo de esta memoria.

[0131] El término "salida de luz" significa la luz que se emite mediante la reacción de ATP con el reactivo luminiscente. Esta salida de luz se puede detectar utilizando tecnología completamente convencional, tal como un luminómetro estándar (por ejemplo, un luminómetro de 96 pocillos Berthold Orion o un luminómetro de soporte manual).

[0132] El término "quinasa informadora" se refiere a una enzima quinasa que no está presente de forma inherente en la muestra a analizar, es decir, la quinasa es exógena a la muestra. La quinasa informadora se añade a la muestra como un reactivo separado, por ejemplo, como una quinasa aislada. En una realización, las quinasas informadoras son termoestables.

[0133] El término "quinasa termoestable" se refiere a una quinasa que mantiene la actividad después de la exposición al calor, es decir, que no se ve relativamente afectada por las temperaturas elevadas. En una realización de la invención, las quinasas termoestables mantienen por lo menos un 70% de la actividad (u 80% de actividad, 90% de actividad, o 100% de actividad) después de la exposición a una temperatura entre 50 - 120 C. En otra realización, las quinasas termoestables mantienen por lo menos un 70% de la actividad (u 80% de actividad, 90% de actividad, 95% de actividad o 100% de actividad) después de la exposición a 40C durante 30 minutos, o después de la exposición a 50C durante 30 minutos, o después de la exposición a 60C durante 30 minutos, o después de la exposición a 70C durante 30 minutos, o después de la exposición a 80C durante 30 minutos, o después de la exposición a 90C durante 10 minutos, o después de la exposición a 120C durante 3 minutos. Las quinasas termoestables también pueden ser más resistentes que las quinasas no termoestables hasta un rango de otros procesos bioquímicos y físicos que normalmente dañan o destruyen proteínas o las desactivan, tal como la exposición a ciertos agentes químicos, por ejemplo, caótropos, daño por radicales libres, detergentes, extremos de pH, exposición a proteasas, reticulación de proteínas, encapsulación en membranas o polímeros no permeables o semipermeables, o inmovilización irreversible sobre superficies. En una realización particular, las quinasas termoestables pueden mantener por lo menos un 70% de la actividad (u 80% de actividad, 90% de actividad, 95% de actividad o 100% de actividad) después de la exposición a uno o más de los procesos bioquímicos y físicos descritos anteriormente. En todos los casos, esta “actividad mantenida” se puede confirmar fácilmente utilizando tests convencionales. Brevemente, la quinasa se incuba con ADP bajo las condiciones de tratamiento determinadas durante una cantidad de tiempo determinada y a continuación se analiza la actividad residual mediante la detección de la generación de ATP utilizando luciferina/luciferasa y un luminómetro. A partir de esto, se puede determinar el % de actividad de quinasa mantenida después del tratamiento.

[0134] Los términos "quinasa" y "actividad quinasa" se utilizan indistintamente a lo largo de esta memoria.

5 [0135] El término "reactivo bioluminescente" se refiere a cualquier sustancia o mezcla de sustancias capaces de reaccionar con ATP para generar luz, por ejemplo, una mezcla de luciferina y luciferasa.

[0136] El término "RLU" significa Unidad Relativa de Luz. Las Unidades Relativas de Luz son una medición relativa, no absoluta. Los valores dados en la memoria se refieren a mediciones tomadas utilizando un luminómetro de 10 microplacas de 96 pocillos Berthold Orion con un sistema inyector que utiliza un método “flash” de medición de luz durante 2 segundos inmediatamente después de la adición de los reactivos luciferasa/luciferina (fotomultiplicador de especificación técnica que mide la luz emitida a una longitud de onda de 300-650nm). Para tratar este punto, los fabricantes han generado datos para “factores” de RLU, que permiten normalizar los datos generados por un luminómetro determinado hasta un patrón calibrado. De este modo, se pueden realizar comparaciones entre

15 diferentes instrumentos. El factor de RLU para el luminómetro de microplacas de 06 pocillos Berthold es 1. Por consiguiente, los valores de RLU proporcionados en la memoria se pueden considerar como valores de RLU estandarizados/normalizados.

[0137] En términos de valores absolutos, un valor de RLU se puede relacionar con la concentración de ATP 20 requerida para proporcionar dicho valor con los reactivos descritos en el método. Como conversión aproximada, y dada la relación lineal entre los valores de RLU y la concentración de ATP, se pueden utilizar los siguientes valores:

RLU

Concentración aproximada de ATP/�M

12.000.000

1000

1.200.000

100

120.000

10

12.000

1

1.200

0,1

120

0,01

[0138] Todas las referencias citadas en esta solicitud se incorporan en la presente por referencia en su totalidad.

25 [0139] A continuación, se describe la presente invención en realizaciones específica en los siguientes ejemplos y con referencia a los dibujos que se acompañan en los que:

La figura 1 muestra la actividad de enzimas adenilato quinasa (AK) después del tratamiento a 70°C (A), 80°C (B) y 30 90°C (C);

la figura 2 muestra la estabilidad térmica de una gama de enzimas AK expresadas recombinantemente en E.coli. Se clonaron y se expresaron los genes que codificaban las enzimas AK tal como se describe en el ejemplo 3. Todos los genes se expresaron a partir del vector pET28a a excepción del clon I de S.acidocaldarius que se expresó a partir de

35 pET3a tal como se describe previamente. Los niveles de expresión fueron similares para cada clon, pero una parte de la enzima de Pyrococcus furiosus (P.fu) estaba en la fracción insoluble y es probable que esto haya reducido la cantidad de esta enzima a analizar. La estabilidad térmica de las enzimas recombinantes se midió después de la incubación a 80°C durante 30 minutos en un lisado de E.coli crudo a diluciones en serie de 10 veces a partir de proteína celular total 1 mg/ml (de manera que la columna 12 es equivalente a proteína total 1 fg/ml). Las enzimas de

40 Thermotoga maritima y Archaeoglobus fulgidus mostraron una estabilidad significativamente mayor que las otras enzimas analizadas, aunque las enzimas restantes (Sulfolobus solfataricus (S.so P2), Aeropyrum pernix y P.fu) mostraron una actividad similar a la enzima de S.acidocaldarius utilizada como base de los ensayos previos (datos marcados como S.ac I);

45 la figura 3 muestra el análisis electroforético en gel (SDS-PAGE) de la expresión y purificación de fusiones de péptidos tAK-fibrina. Carril 1, marcadores Seeblue; Carril 2, homogenato celular completo; Carril 3, residuo celular insoluble (P1); Carril 4, sobrenadante (S1); Carril 5, S1 – residuo celular insoluble tratado con calor (P2); Carril 6, S1

– fracción soluble tratado con calor (S2); Carriles 7-12, fracciones de tAK-fibrina purificadas eluidas secuencialmente a partir de cromatografía de afinidad Cibacron Blue;

50 la figura 4 muestra el análisis por Espectrometría de Masas de las fusiones de péptidos tAK (Sac)-Fibrina purificadas y tAK (Sac) de tipo natural. Se aplicaron Sac (A) y Sac-Fibrina (B) purificados a un chip recubierto de silicio (NP), se dejó secar y se aplicó la matriz (ácido sinípico) para análisis de espectroscopía de masas SELDI. El peso molecular se muestra en el eje de abcisas y la señal relativa en el eje de ordenadas. La adición del péptido de fibrina da lugar a un incremento en el peso molecular de Sac de 21170 Da (A) a 22188 Da (B) sin aparente degradación de dicho péptido. Las respectivas especies dímero y trímero de Sac también se pueden observar a 42324 Da y 63448 Da para Sac, y 44357 Da y 66494 Da para Sacfibrina;

la figura 5 muestra un análisis electroforético en gel (SDS-PAGE) de Sup35-tAK (Sac) solubilizado y replegado de preparados de cuerpos de inclusión aclarados. Carril 1, marcador SeeBlue Plus 2; Carril 2; Sup t35AK, replegado a partir de cuerpos de inclusión solubilizados (preparados en presencia del agente reductor, DTT) en Tris-HCl 20 mM pH 8,5; Carril 3, como el Carril 2, pero utilizando cuerpos de inclusión solubilizados preparados en ausencia de DTT; Carril 4, como el Carril 3, fracción insoluble; Carril 5, como el Carril 2, pero tratado con calor a 75°C durante 10 min, fracción soluble; Carril 6, como el Carril 3, tratado con calor a 75°C durante 10 min, fracción soluble; Carril 7, como el Carril 6, fracción insoluble; Carril 8, como el Carril 7, residuo celular lavado; Carril 9, como el Carril 2 concentrado en tubo de diálisis cubierto en PEG 10000; Carril 10, como el Carril 1. RV308 de E. coli que expresaba Sup35-tAK se cultivó a 30°C en matraces de agitación hasta una DO final a 600 nm de 14. Las pasta celular centrifugada se resuspendió en Tris-HCl 20 mM , pH 7,5, EDTA 10 mM, Triton X-100 al 1% en 0,05 x volumen de cultivo. Las células se lisaron mediante sonicación. Se aislaron los cuerpos de inclusión del lisado celular crudo mediante centrifugación y se lavaron tres veces con Tris-HCl 20 mM , pH 7,5, EDTA 10 mM, Triton X-100 al 1%. El peso final en húmedo del residuo celular lavado fue de 5 g/L de cultivo. Los cuerpos de inclusión se resuspendieron a 15 mg/ml en CAPS 50 mM, pH 11 con N-lauroilsarcosina al 0,3% y +/- DTT 1 mM, se incubaron durante 1,75 horas a 20°C y se aclararon mediante centrifugación a 12.000 rpm en una centrífuga Sorval, rotor SS34 durante 10 minutos. A continuación, el sobrenadante que contenía la proteína solubilizada se dializó con 5 cambios de tampón (los primeros dos con DTT y el resto sin) antes de su utilización. La Sup35-tAK replegada se pudo preparar en formas soluble o insoluble mediante la solubilización de los cuerpos de inclusión en presencia o ausencia de DTT tal como se muestra en los Carriles 2 y 4, respectivamente. La Sup35-tAK soluble replegada demostró estabilidad contra el tratamiento térmico anterior;

la figura 6 muestra un análisis por microscopía electrónica de la formación de fibrilas de tAK-Sup35 (Sac). Los cuerpos de inclusión purificados se solubilizaron y replegaron tal como se ha descrito anteriormente (figura 5). La formación de fibrilas se indujo mediante la incubación a 4°C durante 24h - 72h a una concentración de proteínas de 2 mg/ml. Las muestras se analizaron mediante técnicas de microscopía electrónica de transmisión (TEM) estándar utilizando acetato de uranilo como tinción negativa. Mediante las imágenes se pueden observar múltiples especies poliméricas (flechas). No se observaron especies de fibrilas a concentraciones de proteínas por debajo de 2 mg/ml;

la figura 7 muestra la reticulación de tAK a mucina porcina purificada utilizando SPDP. Carril 1, marcadores de peso molecular; Carril 2, tAK conjugada a mucina; Carril 3, conjugado tAK-mucina reducido utilizando DTT. Después de la derivación con SPDP de tAK y mucina tal como se ha descrito previamente, se forman especies de conjugados de peso molecular elevado <200 kDa. No está presente tAK no conjugado en el Carril 2, demostrando una reticulación muy eficaz entre las dos especies de proteínas. La reducción del conjugado rompe los enlaces de reticulación dando lugar a la aparición de tAK libre tal como se indica en el Carril 3;

la figura 8 muestra el procesado de indicadores de tAK y mucina en un equipo de lavado-desinfección. La tAK en mucina se preparó mediante la adición de tAK no modificada a mucina porcina y dejando que la tAK se secara en la superficie del indicador. El conjugado de tAK-mucina se preparó tal como se ha descrito previamente utilizando SPDP para reticular la tAK a mucina. Los indicadores se procesaron en un equipo de lavado-desinfección validado utilizando 3E-zyme como detergente;

la figura 9 muestra el análisis por SDS-PAGE de la unión covalente de la proteína de fusión tAK-fibrina con fibrinógeno para formar una película de tAK-fibrina. Carril 1, marcadores SeeBlue2; Carril 2, control activado sin trombina de la reacción en la proporción 1:1000 de tAK-fibrina con respecto a fibrinógeno; Carril 3, como el Carril 2 – proporción de 1:500 tAK-fibrina: fibrinógeno; Carril 4, como el Carril 2, proporción de 1:250 tAK-fibrina:fibrinógeno; Carril 5, como el Carril 2, activado con trombina; Carril 6, como el Carril 3 activado con trombina; Carril 7, como el Carril 4 activado con trombina. Las reacciones se incubaron a 37°C durante 1 hora en presencia o ausencia de 5 U de trombina, según sea necesario. La incorporación covalente óptima se consiguió a una proporción de tAKfibrina:fibrinógeno de 1:1000 (Carril 5) con especies de peso molecular más elevado (<198 kDa) formadas tal como se indica, con una disminución concomitante de especies de tAK-fibrina no conjugadas (22,1 kDa).

SEQ ID Nos

[0140]

SEQ ID 1 Secuencia proteica de Adenilato quinasa de Sulfolobus solfataricus SEQ ID 2 Secuencia proteica de Adenilato quinasa de Sulfolobus acidocaldarius SEQ ID 3 Secuencia proteica de Adenilato quinasa de Sulfolobus tokodaii SEQ ID 4 Secuencia proteica de Adenilato quinasa de Pyrococcus furiosus SEQ ID 5 Secuencia proteica de Adenilato quinasa de Pyrococcus horikoshii SEQ ID 6 Secuencia proteica de Adenilato quinasa de Pyrococcus abyssi SEQ ID 7 Secuencia proteica de Adenilato quinasa de Methanococcus thermolithotrophicus SEQ ID 8 Secuencia proteica de Adenilato quinasa de Methanococcus voltae SEQ ID 9 Secuencia proteica de Adenilato quinasa de Methanococcus jannaschii SEQ ID 10 Secuencia proteica de Adenilato quinasa de Methanopyrus kandleri SEQ ID 11 Secuencia proteica de Adenilato quinasa de Methanotorris igneus SEQ ID 12 Secuencia proteica de Adenilato quinasa de Pyrobaculum aerophilum SEQ ID 13 Secuencia proteica de Adenilato quinasa de Thermotoga maritima SEQ ID 14 Secuencia proteica de Adenilato quinasa de Aeropyrum pernix SEQ ID 15 Secuencia proteica de Adenilato quinasa de Archaeoglobus fulgidus SEQ ID 16 Secuencia proteica de Adenilato quinasa de Pyrococcus abyssi (adenilato quinasa monomérica (AdkE)) SEQ ID 17 Secuencia proteica de Adenilato quinasa de Pyrococcus furiosus modificada genéticamente para proporcionar una mayor estabilidad SEQ ID 18 Secuencia proteica de Adenilato quinasa de Pyrococcus horikoshii modificada genéticamente para proporcionar una mayor estabilidad SEQ ID 19 Secuencia proteica de Adenilato quinasa de Sulfolobus acidocaldarius modificada genéticamente para proporcionar una mayor estabilidad SEQ ID 20 Secuencia proteica de Acetato quinasa de Thermatoga maritima SEQ ID 21 Secuencia proteica de Piruvato quinasa de Pyrococcus horikoshii SEQ ID 22 Secuencia proteica de Piruvato quinasa de Sulfolobus solfataricus SEQ ID 23 Secuencia proteica de Piruvato quinasa de Thermotoga maritima SEQ ID 24 Secuencia proteica de Piruvato quinasa de Pyrococcus furiosus SEQ ID 25 Secuencia proteica de Acetato quinasa de Methanosarcina thermophila SEQ ID 26 Secuencia de ADN que codifica la Adenilato quinasa de Sulfolobus acidocaldarius SEQ ID 27 Secuencia de ADN que codifica la Adenilato quinasa de Sulfolobus acidocaldarius, en la que el uso de codones se ha optimizado para la expresión del gen en E.coli. SEQ ID 28 Secuencia de ADN que codifica la Adenilato quinasa de Thermotoga maritima SEQ ID 29 Secuencia de ADN que codifica la Adenilato quinasa de Thermotoga maritima, en la que el uso de codones se ha optimizado para la expresión del gen en E.coli. SEQ ID 30 Secuencia de ADN que codifica la Adenilato quinasa de Archaeoglobus fulgidus, en la que el uso de codones se ha optimizado para la expresión del gen en E.coli. SEQ ID 31 Secuencia proteica de Adenilato quinasa de Sulfolobus acidocaldarius, en la que el uso de codones se ha optimizado para la expresión del gen en E.coli. (SEQ ID 27). SEQ ID 32 Secuencia proteica de Adenilato quinasa de Thermotoga maritima, en la que el uso de codones se ha optimizado para la expresión del gen en E.coli (SEQ ID 29). SEQ ID 33 Secuencia proteica de sustrato de transglutaminasa. SEQ ID 34 Secuencia proteica de Adenilato quinasa termoestable de Sulfolobus acidcaldarius fusionada en el extremo N-terminal con una secuencia del sustrato de transglutaminasa (Factor XIII) SEQ ID 35 Secuencia proteica de Adenilato quinasa termoestable de Sulfolobus acidcaldarius fusionada en el extremo C-terminal con una secuencia del sustrato de transglutaminasa (Factor XIII) SEQ ID 36 Secuencia proteica de Adenilato quinasa termoestable de Sulfolobus acidcaldarius fusionada en el extremo N-terminal con una secuencia del sustrato de transglutaminasa (Factor XIII) SEQ ID 37 Secuencia de ADN de secuencia de sustrato de transglutaminasa (Factor XIII) fusionada al extremo 5’ de la Adenilato quinasa de Thermotoga maritima. SEQ ID 38 Secuencia proteica de Adenilato quinasa de Thermotoga maritima fusionada al extremo N terminal con una secuencia de sustrato de transglutaminasa (Factor XIII). SEQ ID 39 Secuencia de ADN de secuencia de sustrato de transglutaminasa (Factor XIII) fusionada al extremo 3’ de Adenilato Quinasa de Thermotoga maritima. SEQ ID 40 Secuencia proteica de Adenilato quinasa de Thermotoga maritime fusionada al extremo C terminal con una secuencia de sustrato de transglutaminasa (Factor XIII). SEQ ID 41 Secuencia de ADN de secuencia de sustrato de transglutaminasa (Factor XIII) fusionada a los extremos 5’ y 3’ de Adenilato quinasa de Thermotoga maritima. SEQ ID 42 Secuencia proteica de Adenilato quinasa de Thermotoga maritime fusionada en el extremo N-terminal y C-terminal con una secuencia de sustrato de transglutaminasa (Factor XIII). SEQ ID 43 Secuencia de ADN del constructo del gen de Sup35 completo de Saccharomyces cerevisiae SEQ ID 44 Secuencia proteica de Sup35 completo de Saccharomyces cerevisiae SEQ ID 45 Secuencia de ADN de codones predispuestos de sup35N (dominio N-terminal) para la expresión óptima en E. coli SEQ ID 46 Secuencia proteica de sup35N (dominio N-terminal) SEQ ID 47 Secuencia de ADN de Adenilato quinasa con codones predispuestos en E.coli de Sulfolobus acidcaldarius fusionada al extremo N-terminal con el dominio N-terminal de Sup35 de Saccharomyces cerevisiae SEQ ID 48 Secuencia proteica de Adenilato quinasa de Sulfolobus acidcaldarius fusionada en el extremo N-terminal con el dominio N-terminal de Sup35 de Saccharomyces cerevisiae SEQ ID 49 Secuencia de ADN de de Adenilato quinasa con codones predispuestos en E.coli de Sulfolobus acidcaldarius fusionada al extremo C-terminal con el dominio N-terminal de Sup35 de Saccharomyces cerevisiae SEQ ID 50 Secuencia proteica de Adenilato quinasa de Sulfolobus acidcaldarius fusionada en el extremo C-terminal con el dominio N-terminal de Sup35 de Saccharomyces cerevisiae SEQ ID 51 Secuencia de ADN de Sup35N fusionada en el extremo 5’ de Adenilato quinasa de Thermotoga maritima. SEQ ID 52 Secuencia proteica de Adenilato quinasa de Thermotoga maritima fusionada en el extremo N-terminal con Sup35N. SEQ ID 53 Secuencia de ADN de Sup35N fusionada en el extremo 3’ de Adenilato quinasa de Thermotoga maritima. SEQ ID 54 Secuencia proteica de Adenilato quinasa de Thermotoga maritima fusionada en el extremo C-terminal con Sup35N SEQ ID 55 Secuencia de ADN que codifica un péptido Sup35 corto capaz de agregarse para formar fibrilas de amiloide; para utilizar como un péptido de fusión con genes de tAK. SEQ ID 56 Péptido amiloide derivado de Sup35 SEQ ID 57 Secuencia de ADN que codifica una proteína de la cápside de Norovirus (58kDa) SEQ ID 58 Secuencia proteica de la proteína de la cápside de Norovirus (58kDa) SEQ ID 59 Secuencia de ADN para un gen sintético que codifica una proteína de la cápside de Norovirus (58kDa) optimizada para la expresión en E.coli SEQ ID 60 Secuencia de ADN para un gen sintético que codifica una proteína de la cápside de Norovirus (58kDa) optimizada para la expresión en E.coli fusionada en el extremo 5’ de un gen que codifica la tAK de Thermotoga maritima.

SEQ ID 61 Secuencia proteica de una proteína de la cápside de Norovirus (58kDa) fusionada en el extremo Nterminal de la Adenilato Quinasa de Thermotoga maritima. SEQ ID 62 Secuencia proteica de una proteína de cubierta de bacteriófago MS2 SEQ ID 63 Secuencia proteica de un monómero de proteína de cubierta de bacteriófago PP7 SEQ ID 64 Secuencia proteica de un dímero de proteína de cubierta de bacteriófago PP7 SEQ ID 65 Secuencia proteica de CsgA de E.coli SEQ ID 66 Secuencia proteica de AgfA de Salmonella SEQ ID 67 Secuencia proteica de Adenilato quinasa de Thermotoga maritima fusionada al extremo N-terminal de CsgA de E.coli SEQ ID 68 Secuencia proteica de la proteína hidrofobina 3 de la especie Fusarium SEQ ID 69 Secuencia proteica de la proteína hidrofobina 5 de la especie Fusarium SEQ ID 70 Secuencia proteica de la proteína de tipo cemento de Balanus albicostatus (19K) SEQ ID 71 Secuencia proteica de la proteína de tipo cemento de Megabalanus rosa (20k) SEQ ID 72 Secuencia proteica de fusión de la proteína de percebe de Balanus albicostatus con la tAK de Thermotoga maritima; fusión N-terminal SEQ ID 73 Secuencia proteica de fusión de la proteína de percebe de Balanus albicostatus con la tAK de Thermotoga maritima; fusión C-terminal SEQ ID 74 Secuencia proteica de adsorbente específico de calcita de Balanus albicostatus SEQ ID 75 Secuencia proteica de un péptido derivado de una proteína de cemento de percebe SEQ ID 76 Secuencia proteica de un péptido derivado de una proteína de cemento de percebe SEQ ID 77 Secuencia proteica de un péptido derivado de una proteína de cemento de percebe

Ejemplo 1

Purificación de enzimas adenilato quinasas nativas

[0141] Se produjo biomasa de veinticuatro microorganismos termófilos e hipertermófilos diversos (Tabla 1).

[0142] Se representaron ocho miembros de las arqueas junto con dieciséis bacterias aeróbicas y anaeróbicas diversas. Se purificaron las AK de cada uno de estos organismos mediante cromatografía de afinidad utilizando absorción y desorción selectiva de Cibacron Blue 3A (Azul Sefarosa). Todas las enzimas se caracterizaron adicionalmente y se purificaron mediante filtración en gel (Superdex G200). Esto permitió la identificación de la

fracción de AK principal y la estimación de la masa molecular.

Tabla 1: Lista de organismos termófilos cultivados para producir biomasa para el aislamiento de AK

5

termoestables

Organismo

Dominio Crecimiento Topt pHopt

1

Aeropyrum pernix Arquea Aerobio 95°C 7,0

2

Alicyclobacillus Bacteria Aerobio 65°C 3,5

acidocaldarius

3 4

Aquifex pyrophilus Bacillus caldotenax BT1 Bacteria Bacteria Microaerophi leeberophile Aerobio 85°C 65°C 6,5 7,0

5 6

especie Bacillus PS3 Bacillus Bacteria Bacteria Aerobio Aerobio 65°C 65°C 7,0 7,0

stearothermophilus

11057

7

Bacillus Bacteria Aerobio 65°C 7,0

stearothermophilus

12001

8

Bacillus Bacteria Aerobio 65°C 7,0

thermocatenulatus

9

Clostridium Bacteria Anaerobio 55°C 7,0

stercocorarium

10

Meiothermus ruber Bacteria Aerobio 60°C 6,5

111213

Pyrococcus furiosus Pyrococcus horikoshii Pyrococcus woesei Arquea Arquea Arquea Anaerobio Anaerobio Anaerobio 95°C 95°C 95°C 7,5 7,0 7,0

14

Rhodothermus marinus Bacteria Aerobio 70°C 6,5

15

Sulfolobus Arquea Aerobio 75°C 2,5

acidocaldarius 98-3

16

Sulfolobus shibatae B21 Arquea Aerobio 75°C 2,5

17

Sulfolobus solfataricus Arquea Aerobio 75°C 2,5

P2

18

Thermoanaerobacter Bacteria Anaerobio 65°C 6,0

ethanolicus

19

Thermoanaerobacter Bacteria Anaerobio 65°C 6,5

thermosulfurogenes

20

Thermobrachium celere Bacteria Anaerobio 60°C 7,0

2122

Thermococcus litoralis Thermus aquaticus YT1 Arquea Bacteria Anaerobio Aerobio 85°C 70°C 6,5 8,0

23

Thermus caldophilus Bacteria Aerobio 70°C 8,0

GK24

24

Thermus thermophilus Bacteria Aerobio 70°C 8,0

HB8

Ejemplo 2 Análisis de la termoestabilidad de adenilato quinasas nativas

[0143] Se evaluó la termoestabilidad a 70, 80 y 90°C de adenilato quinasas aisladas de biomasa de organismos termófilos y los resultados se muestran en la figura 1.

15 [0144] Las adenilato quinasas se aislaron de la biomasa mediante cromatografía de afinidad utilizando absorción y desorción selectiva de Cibacron Blue 3A (Azul Sefarosa). Las muestras eluidas de las columnas se diluyeron 1:10000 y a continuación se añadieron 10 ml de cada una a un pocillo de microtitulación. Se añadieron 2,5 l de apirasa a cada pocillo para destruir el ATP presente del tampón de elución, y se incubaron a 37°C durante 30

20 minutos. La apirasa se desactivó mediante tratamiento térmico a 65°C durante 20 minutos.

[0145] Se añadió sustrato ADP y se incubó a 70°C (panel A), 80°C (panel B) o 90°C (panel C) durante 30 minutos y se enfrió hasta 25°C antes de la adición de 10 l de reactivo D-luciferin-luciferasa. El ATP producido se midió como RLU en un luminómetro de placa.

Ejemplo 3

Expresión y purificación de adenilato quinasas recombinantes.

[0146] Se protegieron los clones que expresaban AK termoestables representativas y se produjeron AK termoestables recombinantes de la arquea termoacidofílica Sulfolobus acidocaldarius y la bacteria termofílica, Bacillus stearothermophilus. Los plásmidos se transformaron en E.coli y se observó que los extractos celulares contenían bandas de proteínas en electroforesis correspondientes a las masas moleculares esperadas de las AK. La actividad de AK termoestable se midió después de la incubación a la temperatura apropiada (80°C para la AK de Sulfolobus acidocaldarius y 60°C para la AK de Bacillus stearothermophilus).

[0147] Se establecieron métodos de purificación para ambas AK termoestables e incluían un tratamiento térmico inicial de incubación durante 20 minutos a 80°C, para desactivar y agregar proteínas derivadas de E.coli, seguido de cromatografía de afinidad y filtración en gel. La cromatografía de afinidad implicaba la adsorción de la enzima a Azul Sefarosa, seguido de una elución específica con una concentración baja de cofactores de AK (AMP+ATP e iones magnesio). El ATP y AMP (Sigma) en el tampón de elución se degradaron mediante incubación con apirasa mesófila que se desactiva fácilmente mediante el tratamiento posterior con calor. La cromatografía de filtración en gel se escaló para utilizar una columna Superdex de grado preparativo que permite la preparación de cantidades grandes de ambas enzimas.

[0148] Los cebadores se diseñaron para la amplificación mediante PCR de los genes de AK de los organismos termófilos identificados durante la selección de enzimas nativas candidatas.

[0149] Los microorganismos termoestables se desarrollaron usando condiciones de crecimiento definidas individualmente y se aisló y utilizó el ADN genómico como molde para la amplificación mediante PCR de los genes de adenilato quinasa de cada organismo. Los genes de adenilato quinasa amplificados por PCR de los organismos termófilos, Thermotoga maritima, Aeropyrum pernix, Sulfolobus acidocaldarius y Sulfolobus solfataricus se subclonaron en el vector pET28a y se transformaron en una cepa de E. coli potenciada en codones que expresaba ARNt raros (Zdanovsky et al., 2000). Esta cepa de E. coli es adecuada para aumentar los niveles de expresión de los genes ricos en AT.

[0150] El éxito de la transformación se evaluó mediante un estudio de miniexpresión y los resultados se analizaron mediante SDS-PAGE de los sobrenadantes de cultivo antes y después de la inducción con IPTG. El SDS-PAGE también se usó para analizar los sobrenadantes tras la inclusión de una etapa de tratamiento con calor, que consistía en calentar la muestra a 80ºC durante 20 minutos antes de desarrollar el gel de SDS-PAGE para eliminar las proteínas lábiles al calor presentes en la muestra.

Secuencias:

[0151]

SEQ ID No.1 - Adenilato quinasa de Sulfolobus solfataricus

MKIGIVTGIP GVGKTTVLSF ADKILTEKGI SHKIVNYGDY MLNTALKEGY VKSRDEIRKL QIEKQRELQA LAARRIVEDL SLLGDEGIGL IDTHAVIRTP AGYLPGLPRH VIEVLSPKVI FLLEADPKII LERQKRDSSR ARTDYSDTAV INEVIQFARY SAMASAVLVG ASVKVWNQE GDPSIAASEI INSLM

SEQ ID No. 2 - Adenilato quinasa de Sulfolobus acidocaldarius

MKIGIVTGIP GVGKSTVLAK VKEILDNQGI NNKIINYGDF MLATALKLGY AKDRDEMRKL SVEKQKKLQI DAAKGIAEEA RAGGEGYLFI DTHAVIRTPS GYLPGLPSYV ITEINPSVIF LLEADPKIIL SRQKRDTTRN RNDYSDESVI LETINFARYA ATASAVLAGS TVKVIVNVEG DPSIAANEII RSMK

SEQ ID No. 3 - Adenilato quinasa de Sulfolobus tokodaii MPFWIITGI PGVGKSTITK LALQRTRAKF KLINFGDLMF EEALKLKLVK HRDEMRKLPL EVQRELQMNA AKKIAEMAKN YPILLDTHAT IKTPHGYLLG LPYEVIKILN PNFIVIIEAT PSEILGRRLR DLKRDRDVET EEQIQRHQDL NRAAAITYAM HSNALIKIIE NHEDKGLEEA VNELVKILDL AVKEYA

MSKMKIGIVT GIPGVGKTTV LSKVKEILEE KKINNKIVNY GDYMLMTAMK LGYVNNRDEM LQIEAARGIA NEAKEGGDGL LFIDTHAVIR TPSGYLPGLP KYVIEEINPR VIFLLEADPKSRSRSDYSDE RIISETINFA RYAAMASAVL VGATVKIVIN VEGDPAVAAN EIINSML

RKLPVEKQKQ VILDRQKRDT

SEQ ID No. 4 - Adenilato quinasa de Pyrococcus furiosus

MPFWIITGI PGVGKSTITR LALQRTKAKF RLINFGDLMF EEAVKAGLVK HRDEMRKLPL AKKITEMAKE HPILVDTHAT IKTPHGYMLG LPYEWKTLN PNFIVIIEAT PSEILGRRLR EEQIQRHQDL NRAAAIAYAM HSNALIKIIE NHEDKGLEEA VNELVKILDL AVNEYA

KIQRELQMKA DLKRDRDVET

SEQ ID No. 5 - Adenilato quinasa de Pyrococcus horikoshii

SEQ ID No. 6 - Adenilato quinasa de Pyrococcus abyssi

MSFVVIITGI PGVGKSTITR LALQRTKAKF KLINFGDLMF EEAVKAGLVN HRDEMRKLPL EIQRDLQMKV AKKISEMARQ QPILLDTHAT IKTPHGYLLG LPYEVIKTLN PNFIVIIEAT PSEILGRRLR DLKRDRDVET EEQIQRHQDL NRAAAIAYAM HSNALIKIIE NHEDKGLEEA VNELVEILDL AVKEYA

SEQ ID No. 7 - Adenilato quinasa de Methanococcus thermolithotrophicus

MKNKLVVVTG VPGVGGTTIT QKAMEKLSEE GINYKMVNFG TVMFEVAQEE NLVEDRDQMR KLDPDTQKRI QKLAGRKIAE MVKESPVVVD THSTIKTPKG YLPGLPVWVL NELNPDIIIV VETSGDEILI RRLNDETRNR DLETTAGIEE HQIMNRAAAM TYGVLTGATV KIIQNKNNLL DYAVEELISV LR

SEQ ID No. 8 - Adenilato quinasa de Methanococcus voltae

MKNKVVVVTG VPGVGSTTSS QLAMDNLRKE GVNYKMVSFG SVMFEVAKEE NLVSDRDQMR KMDPETQKRI QKMAGRKIAE MAKESPVAVD THSTVSTPKG YLPGLPSWVL NELNPDLIIV VETTGDEILM RRMSDETRVR DLDTASTIEQ HQFMNRCAAM SYGVLTGATV KIVQNRNGLL DQAVEELTNV LR

SEQ ID No. 9 - Adenilato quinasa de Methanococcus jannaschii

MMMMKNKVVV IVGVPGVGST TVTNKAIEEL KKEGIEYKIV NFGTVMFEIA KEEGLVEHRD QLRKLPPEEQ KRIQKLAGKK IAEMAKEFNI VVDTHSTIKT PKGYLPGLPA WVLEELNPDI IVLVEAENDE ILMRRLKDET RQRDFESTED IGEHIFMNRC AAMTYAVLTG ATVKIIKNRD FLLDKAVQEL IEVLK

SEQ ID No. 10 - Adenilato quinasa de Methanopyrus kandleri

MGYVIVATGV PGVGATTVTT EAVKELEGYE HVNYGDVMLE IAKEEGLVEH RDEIRKLPAE KQREIQRLAA RRIAKMAEEK EGIIVDTHCT IKTPAGYLPG LPIWVLEELQ PDVIVLIEAD PDEIMMRRVK DSEERQRDYD RAHEIEEHQK MNRMAAMAYA ALTGATVKII ENHDDRLEEA VREFVETVRS L

SEQ ID No. 11 - Adenilato quinasa de Methanotorris igneus

MKNKVVVVTG VPGVGGTTLT QKTIEKLKEE GIEYKMVNFG TVMFEVAKEE GLVEDRDQMR KLDPDTQKRI QKLAGRKIAE MAKESNVIVD THSTVKTPKG YLAGLPIWVL EELNPDIIVI VETSSDEILM RRLGDATRNR DIELTSDIDE HQFMNRCAAM AYGVLTGATV KIIKNRDGLL DKAVEELISV LK

SEQ ID No. 12 - Adenilato quinasa de Pyrobaculum aerophilum

MKIVIVALPG SGKTTILNFV KQKLPDVKIV NYGDVMLEIA KKRFGIQHRD EMRKKIPVDE YRKVQEEAAE YIASLTGDVI IDTHASIKIG GGYYPGLPDR IISKLKPDVI LLLEYDPKVI LERRKKDPDR FRDLESEEEI EMHQQANRYY AFAAANAGES TVHVLNFRGK PESRPFEHAE VAAEYIVNLI LRTRQKS

SEQ ID No. 13 - Adenilato quinasa de Thermotoga maritima MMAYLVFLGP PGAGKGTYAK RIQEKTGIPH ISTGDIFRDI VKKENDELGK KIKEIMEKGE LVPDELVNEV VKRRLSEKDC EKGFILDGYP RTVAQAEFLD SFLESQNKQL TAAVLFDVPE DVVVQRLTSR RICPKCGRIY NMISLPPKED ELCDDCKVKL VQRDDDKEET VRHRYKVYLE KTQPVIDYYG KKGILKRVDG TIGIDNVVAE VLKIIGWSDK

SEQ ID No. 14- Adenilato quinasa de Aeropyrum pernix

MKVRHPFKW VVTGVPGVGK TTVIKELQGL AEKEGVKLHI VNFGSFMLDT AVKLGLVEDR DKIRTLPLRR QLELQREAAK RIVAEASKAL GGDGVLIIDT HALVKTVAGY WPGLPKHVLD ELKPDMIAVV EASPEEVAAR QARDTTRYRV DIGGVEGVKR LMENARAASI ASAIQYASTV AIVENREGEA AKAAEELLRL IKNL

SEQ ID No. 15- Adenilato quinasa de Archaeoglobus fulgidus

MNLIFLGPPG AGKGTQAKRV SEKYGIPQIS TGDMLREAVA KGTELGKKAK EYMDKGELVP DEVVIGIVKE RLQQPDCEKG FILDGFPRTL AQAEALDEML KELNKKIDAV INVVVPEEEV VKRITYRRTC RNCGAVYHLI YAPPKEDNKC DKCGGELYQR DDKEETVRE RYRVYKQNTE PLIDYYRKKG ILYDVDGTKD IEGVWKEIEA ILEKIKS

SEQ ID No. 16- Adenilato quinasa monomérica (AdkE) de Pyrococcus abyssi

MNILIFGPPG SGKSTQARRI TERYGLTYIA SGDIIRAEIK ARTPLGIEME RYLSRGDLIP DTIVNTLIIS KLRRVRENFI MDGYPRTPEQ VITLENYLYD HGIKLDVAID IYITKEESVR RISGRRICSK CGAVYHVEFN PPKVPGKCDI CGGELIQRPD DRPEIVEKRY DIYSKNMEPI IKFYQKQGIY VRIDGHGSID EVWERIRPLL DYIYNQENRR

Ejemplo 4

Análisis de la termoestabilidad de las adenilato quinasas recombinantes

[0152] La estabilidad térmica de las enzimas AKt recombinantes se evaluó en lisados celulares de E. coli sin procesar.

[0153] Las células se desarrollaron esencialmente como se describe en el Ejemplo 3 y se lisaron por sonicación. La actividad AK del extracto sin procesar se determinó tanto antes como después del tratamiento con calor a 80ºC durante 30 minutos, seguido de una dilución en serie 1:10.

[0154] Los resultados (véase la Figura 2) muestran que una amplia variedad de enzimas recombinantes son adecuadas para el uso en el método de la invención. En una realización, las AK son las de T. maritima, A. fulgidus y

S. solfataricus. Es probable que estas enzimas proporcionen un intervalo dinámico mayor para el ensayo bioluminiscente, si es necesario, para proporcionar aún más sensibilidad.

Ejemplo 5

Modificación genética de las adenilato quinasas para mejorar la estabilidad

[0155] Se construyeron mutantes dirigidos de sitio en el gen AK de P. furiosus, P. horikoshii y S. acidocaldarius como se muestra en los Ejemplos 6-8 y en las SEQ ID Nº 17-19 respectivamente, usando métodos estándar conocidos por los expertos en la materia.

[0156] Además de los cambios específicos identificados en cada gen, las regiones subrayadas en la secuencia de S. acidocaldarius forman la región de empaquetamiento del núcleo de la estructura trimérica de la adenilato quinasa de arqueas. Por tanto, es probable que las sustituciones de aminoácidos que alteran el empaquetamiento de esta región tengan un efecto mayor en la disminución de la estabilidad térmica y física de la enzima. Por el contrario, las sustituciones de aminoácidos que mejoran el empaquetamiento del núcleo, especialmente residuos hidrófobos con cadenas laterales grandes, pueden estabilizar la enzima ante los procesos térmicos u de otro tipo. Por tanto, además de las mutaciones específicas ya descritas, se utilizaron diversas estrategias “selectivas” con la mezcla de genes localizados de secuencias génicas relacionadas en estas regiones (esencialmente como se describe en Stemmer (1994) Nature 370:389-391 y Crameri et al. (1996) Nature Biotech. 14:315-319) y mutagénesis aleatoria basada en PCR usando oligonucleótidos degenerados o mezclas de nucleótidos modificados (por ejemplo, Vartanian et al. (1996) Nucleic Acid Res. 24:2627-2633). Algunas de estas modificaciones muestran una estabilidad alterada cuando se evalúan mediante expresión recombinante en E. coli y un ensayo rápido de la actividad adenilato quinasa en células lisadas a alta temperatura.

Ejemplo 6

Adenilato quinasas de Pyrococcus furiosus modificada genéticamente para proporcionar una estabilidad mejorada (SEQ ID NO. 17).

[0157] MPFVVIITGI PGVGKSTITR LALQRTKAKF RLINFGDLMF EEAVKAGLVK HRDEMRKLPL (K A E) IQRELQMKA AKKI (T A A) EMAKE HPILVDTHAT IKTPHGY (M A L) LG LPYEVVKTLN PNFIVIIEAT PSEILGRRLR DLKRDRDVET EEQIQRHQDL NRAAAIAYAM HSNALIKIIE NHEDKGLEEA VNELVKILDL AVNEYA

[0158] Las mutaciones en uno o más o todos los sitios indicados modifican la termoestabilidad de la enzima. Además de los tres cambios definidos destacados, la modificación de la alanina en la posición 157 por otro residuo hidrófobo pequeño (tal como I o L) o un residuo hidrófobo más grande (tal como F) aumenta la termoestabilidad de la proteína recombinante. Por tanto, hay 35 variantes posibles a través de la combinación de modificaciones en estos sitios. La modificación del aminoácido 157 por un residuo polar, tal como la T (como se observa en la posición equivalente en la AdKA de P. horihoshii), S, Y, D, E, K, R da lugar a una disminución de la estabilidad.

Ejemplo 7

Adenilato quinasas de Pyrococcus horikoshii modificadas genéticamente para proporcionar una estabilidad mejorada (SEQ ID NO. 18).

[0159] La modificación de alguno o ambos residuos mostrados en negrita y subrayados incrementa la estabilidad térmica de la enzima (son posibles 3 variantes).

[0160] MPFVVIITGI PGVGKSTITK LALQRTRAKF KLINFGDLMF EEALKLGLVK HRDEMRKLPL EVQRELQMNA AKKIAEMAKN YPILLDTHAT IKTPHGYLLG LPYEVIKILN PNFIVIIEAT PSEILGRRLR DLKRDRDVET EEQIQRHQDL NRAAAIAYAM HSNALIKIIE NHEDKGLEEA VNELVKILDL AVKEYA

Ejemplo 8

Adenilato quinasa de Sulfolobus acidocaldarius modificada genéticamente para proporcionar una estabilidad mejorada (SEQ ID NO. 19).

[0161] La modificación de los residuos subrayados mostrados puede incrementar la estabilidad térmica de la enzima.

[0162] MKIGIVTGIP GVGKSTVLAK VKEILDNQGI NNKIINYGDF MLATALKLGY AKDRDEMRKL SVEKQKKLQI DAAKGIAEEA RAGGEGYLFI DTHAVIRTPS GY (A A M) PGLPSYV ITEINPSVIF LLEADPKIIL SRQKRDTTRN RNDYSDESVI LETINFARYA ATASAVLAGS TVKVIVNVEG DPSIAANEII RSMK

Ejemplo 9

Expresión de acetato y piruvato quinasas

[0163] Después de los métodos del ejemplo 3, se expresaron las acetato y piruvato quinasas:

SEQ ID No. 20 - Acetato quinasa de Thermatoga maritima

MRVLVINSGS SSIKYQLIEM EGEKVLCKGI AERIGIEGSR LVHRVGDEKH VIERELPDHE EALKLILNTL VDEKLGVIKD LKEIDAVGHR VVHGGERFKE SVLVDEEVLK AIEEVSPLAP LHNPANLMGI KAAMKLLPGV PNVAVFDTAF HQTIPQKAYL YAIPYEYYEK YKIRRYGFHG TSHRYVSKRA AEILGKKLEE LKIITCHIGN GASVAAVKYG KCVDTSMGFT PLEGLVMGTR SGDLDPAIPF FIMEKEGISP QEMYDILNKK SGVYGLSKGF SSDMRDIEEA ALKGDEWCKL VLEIYDYRIA KYIGAYAAAM NGVDAIVFTA GVGENSPITR EDVCSYLEFL GVKLDKQKNE ETIRGKEGII STPDSRVKVL VVPTNEELMI ARDTKEIVEK IGR

SEQ ID No. 21 - Piruvato quinasa de Pyrococcus horikoshii MRRMKLPSHK TKIVATIGPA TNSKKMIKKL IEAGMNVARI NFSHGTFEEH AKIIEMVREQ SQKLDRRVAI LADLPGLKIR VGEIKGGYVE LERGEKVTLT TKDIEGDETT IPVEYKDFPK LVSKGDVIYL SDGYIVLRVE DVKENEVEAV VISGGKLFSR KGINIPKAYL PVEAITPRDI EIMKFAIEHG VDAIGLSFVG NVYDVLKAKS FLERNGAGDT FVIAKIERPD AVRNFNEILN AADGIMIARG DLGVEMPIEQ LPILQKRLIR KANMEGKPVI TATQMLVSMT MEKVPTRAEV TDVANAILDG TDAVMLSEET AVGKFPIEAV EMMARIAKVT EEYRESFGIT

RMREFLEGTK RGTIKEAITR SIIDAICTIG IKFILTPTKT GRTARLISRF KPKQWILAFS FSYGVYPFCM EEGFNENDIV RLIKGLGLVG SDDIVLMTEG KPIEKTVGTN SIKIFQIA

TREKVCNNLM

SEQ ID No. 22 - Piruvato quinasa de Sulfolobus solfataricus

MRKTKIVATL

GPSSEEKVKE LAEYVDVFRI NFAHGDETSH RKYFDLIRTY APESSIIVDL PGPKLRLGEL

KEPIEVKKGD KIVFSQKDGI PVDDELFYSA VKENSDILIA DGTIRVRVKS KAKDRVEGTV IEGGILLSRK GINIPNVNLK SGITDNDLKL LKRALDLGAD YIGLSFVISE NDVKKVKEFV GDEAWVIAKI EKSEALKNLT NIVNESDGIM VARGDLGVET GLENLPLIQR RIVRTSRVFG KPVILATQVL TSMINSPIPT RAEIIDISNS IMQGVDSIML SDETAIGNYP VESVRTLHNI ISNVEKSVKH RPIGPLNSES DAIALAAVNA SKVSKADVIV VYSRSGNSIL RVSRLRPERN IIGVSPDPRL AKKFKLCYGV IPISINKKMQ SIDEIIDVSA KLMQEKIKDL KFKKIVIVGG DPKQEAGKTN FVIVKTLEQQ KK

SEQ ID No. 23 - Piruvato quinasa de Thermotoga maritima

MRSTKIVCTV GPRTDSYEMI EKMIDLGVNV FRINTSHGDW NEQEQKILKI KDLREKKKKP VAILIDLAGP KIRTGYLEKE FVELKEGQIF TLTTKEILGN EHIVSVNLSS LPKDVKKGDT ILLSDGEIVL EVIETTDTEV KTVVKVGGKI THRRGVNVPT ADLSVESITD RDREFIKLGT LHDVEFFALS FVRKPEDVLK AKEEIRKHGK EIPVISKIET KKALERLEEI IKVSDGIMVA RGDLGVEIPI EEVPIVQKEI IKLSKYYSKP VIVATQILES MIENPFPTRA EVTDIANAIF DGADALLLTA ETAVGKHPLE AIKVLSKVAK EAEKKLEFFR TIEYDTSDIS EAISHACWQL SESLNAKLII TPTISGSTAV RVSKYNVSQP IVALTPEEKT YYRLSLVRKV IPVLAEKCSQ ELEFIEKGLK KVEEMGLAEK GDLWLTSGV PGKVGTTNTI RVLKVD

SEQ ID No. 24 - Piruvato quinasa de Pyrococcus furiosus

MRRVKLPSHK TKIVATIGPA TNSRKMIKQL IKAGMNVARI NFSHGSFEEH ARVIEIIREE AQKLDRRVAI LADLPGLKIR VGEIKGGYVE LKRGEKVILT TKDVEGDETT IPVDYKGFPN LVSKGDIIYL NDGYIVLKVE NVRENEVEAV VLSGGKLFSR KGVNIPKAYL PVEAITPKDF EIMKFAIEHG VDAIGLSFVG SVYDVLKAKS FLEKNNAEDV FVIAKIERPD AVRNFDEILN AADGIMIARG DLGVEMPIEQ LPILQKKLIR KANMEGKPVI TATQMLVSMT TEKVPTRAEV TDVANAILDG TDAVMLSEET AIGKFPIETV EMMGKIAKVT EEYRESFGLS RIREFMEIKK GTIKEAITRS IIDAICTIDI KFILTPTRTG RTARLISRFK PKQWILAFST NERVCNNLMF SYGVYPFCLE EGFDENDIVR LIKGLGLVES DDMVLMTEGK PIEKTVGTNS IKIFQIA

SEQ ID No. 25 - Acetato quinasa de Methanosarcina thermophila

MKVLVINAGS SSLKYQLIDM TNESALAVGL CERIGIDNSI ITQKKFDGKK LEKLTDLPTH KDALEEVVKA LTDDEFGVIK DMGEINAVGH RVVHGGEKFT TSALYDEGVE KAIKDCFELA PLHNPPNMMG ISACAEIMPG TPMVIVFDTA FHQTMPPYAY MYALPYDLYE KHGVRKYGFH GTSHKYVAER AALMLGKPAE ETKIITCHLG NGSSITAVEG GKSVETSMGF TPLEGLAMGT RCGSIDPAIV PFLMEKEGLT TREIDTLMNK KSGVLGVSGL SNDFRDLDEA ASKGNRKAEL ALEIFAYKVK KFIGEYSAVL NGADAWFTA GIGENSASIR KRILTGLDGI GIKIDDEKNK IRGQEIDIST PDAKVRVFVI PTNEELAIAR ETKEIVETEV KLRSSIPV

Ejemplo 10

Preparación de un dispositivo indicador basado en fibrina

Preparación de fusiones de tAK para la reticulación a fibrina

[0164] Se añade una secuencia de sustrato de transglutaminasa (MNQEQVSPLGG - SEQ ID No: 33) en el extremo N-terminal, el extremo C-terminal o ambos extremos N y C terminal de la Adenilato quinasa termoestable de S. acidocaldarius codificada por un clon de gen de codones optimizados. (La secuencia de sustrato de transglutaminasa se refiere indistintamente en estos ejemplos como fibrina, péptido de fibrina o el sustrato de transglutaminasa). Esta construcción se transfiere como un fragmento Ndel - Sall en el vector de expresión interno (pMTL 1015; tal como se describe en WO 2005/123764). La construcción de expresión se confirma mediante secuenciación de ADN y se transfiere en los huéspedes de expresión BL21 o RV308 para la expresión posterior.

[0165] De manera similar, el gen de tAK resintetizado de Thermatoga maritima (SEQ ID 29) se fusiona a la secuencia de transglutaminasa en las tres orientaciones identificadas anteriormente. La clonación y preparación del sistema de expresión es también como se ha descrito anteriormente. Las construcciones de fusión también se pueden expresar en otras combinaciones de vector de expresión-huésped con la adición de etiquetas de afinidad para la posterior purificación. Son particularmente útiles en este contexto vectores de expresión que añaden etiquetas de 6 histidinas en el extremo N o C terminal de las proteínas de fusión, modificaciones que ayudan en la purificación y detección, pero no interfieren con las propiedades intrínsecas de las proteínas de fusión. Los vectores para este tipo de modificación incluyen vectores de la serie pET (Novagen / Merck) y vectores de la serie pQE (Qiagen).

[0166] Para generar material para los dispositivos indicadores, se desarrollan cepas de expresión inicialmente en fermentadores de 8 litros esencialmente bajo condiciones de cultivo estáticas. Brevemente, las cepas se preparan como lotes de semillas y posteriormente se diluyen en los 8 litros de medio de crecimiento (caldo modificado de manera importante que contenía glucosa adicional). Los cultivos se desarrollan bajo condiciones de fermentación estándar hasta que los cultivos alcanzan una densidad óptima (DO a 600 nm) que demuestra que están entrando en condiciones estacionarias (habitualmente alrededor de DO = 5). A continuación, los fermentadores se mantienen bajo condiciones mínimamente aireadas durante hasta 12 horas antes de recoger el material mediante centrifugación continua.

Purificación de fusiones de tAK

[0167] A continuación, el material recogido se purifica según el siguiente protocolo.

Tampón A: 20 mM Tris-HCl 900 mM NaCl, pH 7.5 Tampón de lavado: 20 mM Tris-HCl 200 mM NaCl, pH 7,5 Tampón B: 20 mM Tris-HCl 200 mM NaCl, pH 7,5 10 mM ATP 10 mM AMP 10 mM MgCl2 Tampón de MgAc: 15 mM MgAc (1 M Fluka BioChemika), pH 6.8

1.

Pesar la pasta celular congelada (10 g) y resuspender en 3 veces (30 ml) el volumen del Tampón A, pH 7,5.

2.

Sonicar en hielo (~12.000khz) utilizando 25 ciclos de 30 segundos conectado/30 segundos desconectado. Tomar 1 ml de muestra.

3.

Se centrifuga la solución celular sonicada a 6.000rpm durante 30 min a 4 grados centígrados. El sobrenadante se vierte cuidadosamente y se toma 1 ml de muestra.

4.

El sobrenadante se trata con calor a 80 grados centígrados en un baño de agua durante 20 min. Se toma una muestra de 1 ml. (Esta etapa es una etapa opcional dependiendo de la estabilidad térmica de las proteínas de fusión).

5.

La solución tratada con calor se centrifuga a 6000 rpm durante 30 min a 4 grados centígrados. Se vierte el sobrenadante y se toma 1 ml de muestra.

6.

Filtrar la muestra con un filtro de baja unión de 0,2 m antes de cargar en la columna,

7.

Equilibrar la columna de flujo rápido de azul sefarosa con 5 volúmenes de columna (CV) de tampón A.

8.

Cargar la muestra. Lavar la columna con tampón de lavado a 0,2 ml/min durante la noche.

9.

Eluir la proteína con tampón B al 100% a una velocidad de flujo de 1 ml/min. Recoger el producto en fracciones de 2,5 ml.

10.

Una vez se han eluido todas las proteínas, lavar la columna con tampón B al 100% a 5 ml/min durante 5 CV.

11.

Reequilibrar la columna con 5 CV de tampón A.

12.

Enjuagar la columna con 5 CV de etanol al 120% para el almacenamiento a 4°C.

[0168] Opcionalmente, se aplican métodos adicionales de purificación de proteínas para producir un producto de pureza más elevada. La cromatografía de intercambio iónico en resinas de flujo rápido de SP-sefarosa o de flujo rápido de Q-Sefarosa es particularmente eficaz.

[0169] A continuación, las muestras se analizan utilizando un formato de ensayo estándar para identificar fracciones que contienen una actividad máxima de adenilato quinasa. Ésta se confirmó mediante un análisis SDS-PAGE utilizando técnicas estándar (véase la figura 3). Brevemente, el ensayo se lleva a cabo utilizando el siguiente protocolo:

1.

Diluir la fusión de tAK purificada 1:1000 y 1:10,000 en tampón de MgAc. Añadir 100 l por pocillo.

2.

Tratar con Apirasa (50 l/pocillo a 2,5 unidades por ml de concentración de solución madre; Apirasa de Grado VI Sigma de patata) e incubar durante 30 min a 30°C, con agitación, para extraer el ATP.

3.

Incubar la placa a 70°C durante 10 min para desnaturalizar la Apirasa.

4.

Añadir 50 l/pocillo de ADP (275 M ADP en tampón de MgAc) y sellar. Incubar a 70°C durante 20 min.

5.

Extraer la placa y dejar enfriar hasta temperatura ambiente durante 20 min, calentar el reactivo de Luciferasa/Luciferina (L/L) hasta temperatura ambiente durante 20 min.

6.

Añadir 200 l de ATP estándar a 1 ó 2 pocillos vacíos por placa.

7.

Colocar inyectores en el luminómetro y prepararlos con reactivo L/L (reactivo ATP, Biotherma). Inyectar 30 l de reactivo L/L/pocillo.

8.

Leer la luz generada inmediatamente utilizando el luminómetro.

[0170] A continuación, las fracciones con actividad máxima de quinasa se dializan ampliamente frente a solución salina tamponada con fosfato (PBS pH 7,4) y se almacenan hasta que es necesario. La confirmación de la presencia de la secuencia de sustrato de transglutaminasa añadida (es decir, el péptido de fibrina) en la tAK purificada se confirma mediante análisis de espectroscopía de masas SELDI (véase la figura 4).

[0171] Opcionalmente, se puede preparar una fusión entre la tAK y la molécula de fibrinógeno de longitud completa para proporcionar medios adicionales para incorporar la actividad enzimática en la película de fibrina.

Deposición de fusiones de tAK sobre un soporte sólido

[0172] La fusión tAK-fibrina se diluye hasta alrededor de 200 g/ml en PBS o tampón bicarbonato (pH 9,6) y se aplica a un soporte sólido de acero inoxidable de grado 316L, plástico, vidrio o tejido. La proteína se deja adherir a la superficie hasta 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4°C.

[0173] Opcionalmente, en esta etapa se añaden moléculas portadoras adicionales, por ejemplo, sacarosa a concentraciones de hasta el 1% p/v, albúmina hasta 1 mg/ml, mucina de cerdo hasta 0,5% p/v. La adición de dichos portadores puede ser particularmente importante para ciertos tipos de indicador, pero la presencia del portador no debe interferir con la posterior interacción y reticulación a la película de fibrina aplicada en la siguiente etapa.

Recubrimiento de muestra contaminada que contiene fibrina y reticulación a la fusión de fibrina-tAK

[0174] A continuación, se recubre muestra contaminada de muestra (matriz biológica) con la preparación de fusión de tAK-fibrina adherida sobre la superficie tal como se describe anteriormente.

[0175] Se añade una solución que contiene fibrinógeno para realizar la reticulación del indicador a la muestra contaminada de análisis que contiene fibrina.

[0176] Se mezcla de nuevo una solución que contenía de hasta 3 mg/ml de fibrinógeno (que contenía el Factor XIII), CaCl2 2,5 mM y trombina (hasta 5 unidades NIH por ml) y se añade a la superficie recubierta del soporte sólido. La reacción se deja proceder a temperatura ambiente hasta 30 minutos, dependiendo del nivel de reticulación requerido. Opcionalmente, en esta etapa se añaden albúmina (hasta 80 mg/ml) y hemoglobina (hasta 80 mg/ml) para proporcionar una estimulación más dura y más realista para la limpieza de una muestra contaminada de tipo sanguíneo. Después de la reticulación, se extrae el líquido residual y se dejar secar el dispositivo del indicador.

[0177] La figura 9 muestra un análisis SDS-PAGE de la unión covalente de una proteína de fusión tAK-fibrina con fibrinógeno para formar una película de tAK-fibrina.

[0178] Opcionalmente, se añade la fusión de tAK-péptido de fibrina a la solución de muestra contaminada de análisis que contiene fibrina (matriz biológica) antes de su adición a la superficie de soporte sólido. La reticulación del péptido de fibrina a la matriz se puede incrementar mediante la adición de más Factor XIII y/o la extensión de la duración de la reacción. La reticulación también se puede aumentar mediante la utilización de la proteína de fusión de tAK con péptidos de fibrina añadidos en ambos extremos de la molécula.

[0179] Opcionalmente, se podría añadir directamente una fusión de fibrinógeno-tAK a esta solución para proporcionar una reticulación adicional del indicador.

Reticulación química covalente de tAK a fibrina o fibrinógeno.

[0180] La preparación de tAK-fibrina como una proteína de fusión ya se ha descrito anteriormente. Sin embargo, la tAK-fibrina también se puede preparar mediante la unión química de tAK a fibrina, péptidos de fibrina o fibrinógeno mediante una amplia gama de métodos familiares para los expertos en el campo. Por ejemplo, las preparaciones de proteína purificada para fibrinógeno o fibrina se obtienen de fuentes comerciales (por ejemplo Sigma). La tAK de S.acidocaldarius se prepara tal como se ha descrito anteriormente. La tAK se deriva utilizando el reactivo que reacciona con amida SPDP (SPDP (N-Succinimidil 3-(2-piridilditio)-propionato; compañía química Pierce) según las instrucciones del fabricante. La fibrina o fibrinógeno también se deriva utilizando el mismo protocolo. La tAK derivatizada se reduce mediante la reacción con mercaptoetanol para producir un grupo sulfhidrilo reactivo. A continuación, éste se mezcla con la fibrina derivatizada con SPDP provocando la formación de enlaces covalentes entre las dos moléculas. Las concentraciones de los ayudantes de reacción deben determinarse empíricamente siguiendo las directrices en las instrucciones del fabricante para SPDP.

[0181] La tAK-fibrina o fibrinógeno unidos químicamente se puede utilizar indistintamente o adicionalmente a la proteína de fusión a lo largo de la descripción anterior de éste y los ejemplos posteriores.

Ejemplo 11

Utilizaciones de indicadores de fibrina-tAK

Utilización en un equipo de lavado y desinfección

[0182] Se prepara un indicador tal como se describe en el ejemplo 10. El soporte sólido es una tira de acero inoxidable rectangular de 55 mm x 5 mm x 0,75 mm, que puede estar recubierto en una o ambas superficies. Se colocan una o varias tiras indicadoras en la cámara del equipo de lavado y desinfección. De manera óptima, éstas se pueden colocar en sitios que pueden ser más difíciles de limpiar, proporcionando el grado más elevado de certeza de que el proceso de lavado ha sido eficaz. Alternativamente, se pueden colocar para monitorizar la función de múltiples brazos pulverizadores (es decir, donde éstos pueden ser independientes entre sí). Las tiras indicadoras se agarran a las estanterías u otra subestructura de la cámara del equipo de lavado y desinfección para asegurar que no se muevan durante el tratamiento de lavado. La orientación de los dispositivos sustitutos se puede modificar para proporcionar información adicional sobre la eficacia del proceso de lavado, por ejemplo, mediante su colocación de manera que la superficie recubierta está en los ángulos rectos a la dirección de la pulverización con agua.

[0183] Se añade la carga del instrumento y se realiza el ciclo de desarrollo estándar del proceso. Al final del desarrollo del proceso, se extraen los dispositivos de la cámara y se valora la presencia de fusión a tAK residual, tal como se indica en el ejemplo 12, antes de la extracción de los instrumentos y cualquier etapa de procesado. Opcionalmente, se pueden extraer los dispositivos durante el proceso de lavado mediante la interrupción del proceso en puntos definidos cuidadosamente o mediante la utilización de una máquina que proporciona un método de extracción del indicador durante el desarrollo del proceso.

Utilización en el procedimiento de análisis con endoscopios

[0184] El dispositivo indicador para monitorizar un sistema de reprocesado con endoscopio es esencialmente similar al indicado anteriormente. Se coloca en una cámara tubular una superficie de indicador de tamaño similar, representativa de cualquiera de los componentes de acero inoxidable en el endoscopio, el conducto de PTFE u otros materiales relevantes. La cámara está unida, a través de ajustes adecuados con tornillos, opresión o acople tipo bayoneta a cualquiera de los extremos delanteros del endoscopio o el extremo que hace contacto con los tejidos del paciente. Se coloca en la unidad de reprocesado del endoscopio y los extremos del conducto del endoscopio y el dispositivo indicador se acoplan a los puertos en la unidad. El proceso se desarrolla como está estipulado y el dispositivo indicador se extraer al final del desarrollo del proceso de análisis, antes de seguir con el procesado o el retorno del endoscopio para su uso.

Ejemplo 12

Medios de evaluación del rendimiento de limpieza

[0185] El dispositivo indicador se extrae al final del proceso de análisis. El indicador se inserta en un tubo con reactivo de control de higiene o luminómetro y se procesa según las instrucciones del fabricante, con el dispositivo indicador sustituyendo la muestra. El control de higiene de soporte manual proporciona una lectura en unidades relativas de luz (RLU) que es directamente proporcional a la concentración de ATP generada por la enzima tAKunida al componente biológico. Ésta, a su vez, es directamente proporcional a la concentración de enzima sobre el intervalo de concentraciones utilizado habitualmente para el indicador. Los dispositivos indicadores se calibran, de manera que un valor RLU por debajo de un valor umbral predeterminado es indicativo de por lo menos una reducción logarítmica de tres veces (o potencialmente superior dependiendo del criterio de aceptación) en la concentración de la fusión de tAK que permanece unida a la superficie del indicador. La liberación en lotes de los instrumentos procesados se basa en la reducción en el valor de RLU generado por la fusión de tAK residual en el dispositivo indicador. Se puede identificar por operarios profesionales para devolver todos los lotes de instrumentos por encima del valor umbral o mediante la calibración del control de higiene para proporcionar una lectura simple de pase o fallo en base al valor de RLU.

[0186] El proceso práctico para permitir el procesado posterior de los lotes de instrumentos quirúrgicos u otros productos procesados es el siguiente:

1.

Insertar los dispositivos indicadores en posiciones preestablecidas en la cámara del dispositivo de lavado desinfectador. Sujetar en el lugar.

2.

Añadir la carga de instrumentos según el procedimiento operativo estándar. Cerrar la puerta y pulsar el botón de inicio.

3.

Durante el desarrollo del proceso, registrar cualquier parámetro del proceso necesario por el procedimiento operativo estándar.

4.

Al final del desarrollo del proceso, registrar el tiempo y cualquier parámetro del proceso necesario por el procedimiento operativo estándar.

5.

Conectar el control de higiene de soporte manual (SystemSURE Plus ™; Hygiena) y permitir la calibración.

6.

Extraer los dispositivos indicadores de la cámara e insertarlos en el tubo con reactivo (UltraSnap; Hygiena).

7.

Inclinar el depósito de reactivo de lado a lado para expulsar todo el reactivo de la base del tubo de muestra (según las instrucciones del fabricante).

8.

Agitar el tubo durante 5 segundos.

9.

Insertar el tubo en el control de higiene y registrar la señal inmediatamente.

10.

Registrar el valor de RLU o la lectura de Pase/Fallo en la hija del desarrollo del proceso.

11.

Repetir las etapas 6-10 para cualquier dispositivo indicador adicional

12.

Si se observa cualquier fallo, reprocesar los instrumentos empezando en la etapa 1.

13.

Al final de cada día, descargar los resultados a un terminal adecuado acumulador de datos o informático a través del puerto unido.

14.

De manera semanal y mensual comprobar la tasa de Pase/Fallo y registrar cualquier tendencia de fallos en el proceso (día de la semana, momento del día, posición en la cámara, operador).

[0187] Este es un ejemplo de un protocolo adecuado, pero serían adecuados un conjunto de tubos de reactivo o instrumentos diferentes (tales como los preparados por BioTrace, Charm u otras compañías) para permitir dichos protocolos de liberación de instrumentos.

Ejemplo 13

Preparación de la fusión tAK-Sup35

[0188] Se generan clones que contenían el dominio N-terminal de Sup35 de Saccharomyces cerevisae fusionado al extremo N o C-terminal, o a ambos extremos, de adenilato quinasas de S.acidocaldarius o T.maritima mediante técnicas de manipulación de ADN estándar. Todos los clones se transfieren como fragmentos NdeI – Sall en el vector de expresión pMTL1015 y sus secuencias verificadas. Las construcciones de expresión se utilizan para transformar las cepas de expresión BL21 o RV308 y el material desarrollado en condiciones de fermentación a gran escala, pero con una aireación mínima.

[0189] La expresión y purificación de una fusión de tAK-Sup35 son esencialmente las mismas que para las fusiones de péptido de fibrina descritas en el ejemplo 10, a excepción de que la utilización de la etapa de desnaturalización térmica (etapa 4) no es parte del protocolo de purificación. Brevemente, la pasta celular del fermentador se resuspende en el tampón A, y se lisa mediante sonicación. Se extrae residuo celular (no se utiliza tratamiento térmico estandarizado para estos tipos de fusiones) y el sobrenadante se utiliza para la purificación en columna tal como se indica en el ejemplo 10.

[0190] Bajo ciertas condiciones de crecimiento, las proteínas de fusión pueden ser insolubles, siendo evidentes como cuerpos de inclusión en las células. En este caso, los residuos celulares se preparan y se lisan de la misma manera, pero la fracción insoluble resultante, que contiene los cuerpos de inclusión, se recogen mediante centrifugación. Este material se lava en un tampón (por ejemplo, PBS), que contenía Triton X100 (hasta concentraciones del 5%). Después de cada lavado, el residuo celular que contenía las proteínas de fusión se separa mediante centrifugación. Después de 5 lavados, los cuerpos de inclusión se resolubilizan en PBS que contiene urea 8M y se agitan suavemente durante 30 minutos. Se extrae cualquier material insoluble residual mediante centrifugación. El material solubilizado con urea se dializa frente hasta 5 x 10 volúmenes de PBS para eliminar la urea y dejar que se replieguen las proteínas de fusión. Opcionalmente, la urea se puede eliminar más rápidamente mediante pulverización de la preparación solubilizada con urea a través de una aguja de calibre fino en 100 volúmenes de PBS o tampón A agitados rápidamente tal como se utilizan para purificación. El material se deja reposar a temperatura ambiente con agitación hasta 30 minutos antes del procesado siguiente. La figura 5 muestra un análisis electroforético en gel (SDS-PAGE) de Sup35-tAK (Sac) solubilizado y replegado a partir de preparaciones de cuerpos de inclusión aclaradas.

[0191] La purificación posterior de las fusiones se lleva a cabo esencialmente tal como se describe en el ejemplo 10. El sobrenadante de las células lisadas o los cuerpos de inclusión solubilizados o replegados se carga sobre una columna de flujo rápido de Azul Sefarosa preequilibrada. Después de un lavado amplio en tampón A y posteriormente en tampón de lavado, la proteína se eluye utilizando tampón B. Las fracciones máximas se determinan mediante análisis SDS-PAGE y ensayo de enzimas. A continuación, las fracciones se agrupan y se dializan en PBS.

Conversión de tAK-Sup35 a una forma amiloide

[0192] Las fusiones Sup35-tAK cuando se ensamblan en fibrilas son más representativas de proteínas amiloides, tales como priones, que son moléculas clave contra las que se evalúa la eficacia de los procesos de descontaminación.

[0193] La forma amiloide de las fusiones Sup35-tAK se genera mediante el replegamiento de la proteína soluble purificada o mediante la modificación de las condiciones utilizadas para la diálisis de las preparaciones de cuerpos de inclusión resolubilizados con urea. En el primer caso, se induce un cambio conformacional mediante la exposición de las proteínas de fusión a condiciones alrededor de pH 14 (por ejemplo, mediante dialización en una solución tamponada adecuadamente a pH 7,4 que contiene opcionalmente hasta 1M de NaCl). En el segundo caso, las proteínas de fusión resolubilizadas en urea 8M/PBS se dializan durante 6-12 horas a temperatura ambiente frente a urea 2 M, NaCl 300 mM, en PBS (pH 7,4). Alternativamente, la fibrilación se puede inducir mediante diálisis frente a Tris 20 mM pH 8,0, EDTA 10 mM bajo condiciones de incubación similares. Se utiliza microscopía electrónica para confirmar la presencia de fibrilas (véase la figura 6).

[0194] Opcionalmente, las proteínas de fusión se pueden incorporar en fibrilas que contienen Sup35 normal. Esto se consigue mediante la mezcla de las fusiones con Sup35 no fusionada expresada de la misma manera, en proporciones entre 1:1 y 1:10 de fusión:Sup35.

Deposición de fusiones tAK-Sup35 sobre el soporte sólido.

[0195] La deposición de las fibrilas sobre un soporte sólido se realiza mediante una adsorción simple de proteínas en un tampón adecuado (por ejemplo PBS pH 7,4 tampón bicarbonato pH 9,6) en presencia de niveles elevados de NaCl. La utilización de superficies cargadas o precubiertas (por ejemplo, plásticos cubiertos con Poli-L-lisina) es útil en la disposición de superficies que se pueden unir más eficientemente a las proteínas de fusión.

[0196] Opcionalmente, las fibrilas se pueden depositar en un portador adecuado, tales como sacarosa (hasta el 1%), mucina de cerdo (hasta el 0,05%) o albúmina (hasta 1 mg/ml).

Recubrimiento de muestra contaminada de análisis

[0197] A continuación, se recubre una muestra contaminada de análisis (matriz biológica) son la preparación de amiloide adherida sobre la superficie tal como se describe anteriormente.

[0198] Entre las matrices biológicas adecuadas en las que se inserta el indicador amiloide se incluyen, por ejemplo, mucina al 0,5%, con o sin albúmina, una muestra contaminada de análisis comercial (tal como la fabricada por Browne) o cualquiera de las muestras contaminadas de análisis identificadas en los documentos de guía publicados por los comités estándar internacionales (por ejemplo, suelo de Edimburgo detallado en HTM 01/01 (UK).)

Ensamblaje de fibrilas de amiloides en la muestra contaminada de análisis

[0199] Dada la capacidad de los amiloides de autoensamblarse en matrices complejas, es posible mezclar la fusión amiloide-tAK con componentes de la muestra contaminada antes de la formación de fibrilas y el posterior depósito sobre las superficies. Esto proporciona opciones adicionales para indicadores en los que las fibrilas de amiloide se pueden mezclar e intercalar con otros componentes de la muestra contaminada proporcionando un tipo diferente de matriz que puede ser más dura de eliminar de las superficies.

Ejemplo 14

Utilizaciones del indicador de tAK-Sup35

Utilización del indicador de tAK-Sup35 para evaluar la eliminación de priones de superficies en un proceso de lavado

[0200] Se prepara un indicador tal como se describe en el ejemplo 13 como fibrilas y seca sobre una superficie de acero en presencia de mucina al 0,5%. El indicador se coloca en la cámara de un equipo de lavado y desinfección en puntos predeterminados. Se añade la carga de instrumentos. El proceso empieza según las instrucciones del fabricante y se completan los registros del proceso. Al final del proceso, y antes de sacar cualquier instrumento de la máquina, el dispositivo indicador se extrae y se evalúa tal como se describe en el ejemplo 12.

Utilización de indicador de tAK-Sup35 para evaluar la desactivación de priones en un proceso basado en proteasa

[0201] Se preparan indicadores tal como se describe en el ejemplo 13 como fibrilas con una proporción elevada de Sup35 libre:Sup35-tAK (superior a 5:1) y se depositan sobre tiras de soporte sólido en presencia de suelo de Edimburgo. Los dispositivos indicadores se insertan en un baño de prerremojo que contiene Prionzyme™ recién preparado (Genencor International) para la desactivación de priones (a 60°C, pH 12). Las tiras indicadoras se sujetan al lateral del baño, de manera que los extremos de los indicadores están en el interior del líquido. Los instrumentos se añaden según sea necesario y se procesan durante 30 minutos. Los dispositivos indicadores se extraen del baño al final del proceso, antes de la extracción de los instrumentos y se evalúan según se describe en el ejemplo 12.

Utilización del indicador de tAK-Sup35 para un proceso oxidativo dirigido a la destrucción de priones.

[0202] Se prepara un indicador tal como se describe en el ejemplo 13 como fibrilas utilizando sólo Sup35-tAK y se deposita sobre una superficie de acero inoxidable (opcionalmente en presencia de sacarosa al 0,1% p/v). El indicador se une a la parte interior de la tapa de un recipiente Genesis™ en que se preparan los instrumentos para el procesado y se cierra la tapa. El recipiente se inserta en la cámara de carga de un procesador adecuado para la estimulación oxidativa (por ejemplo, el esterilizador de ozono de 125L; TSO3 o una tecnología de peróxido de hidrógeno en fase vapor, tal como la descrita en los artículos publicados por Fichet et al 2004; Lancet) y el proceso se desarrolla según las instrucciones del fabricante. Al final del proceso, se saca el recipiente Genesis de la cámara y se extraen los dispositivos indicadores y se procesan tal como se describe en el ejemplo 12.

Ejemplo 15

Preparación de una muestra de contaminación neurológica con componente acoplados a tAK

Identificación de componentes esenciales para una muestra de contaminación neurológica de análisis

[0203] En estudios experimentales se pueden determinar componentes diana críticas hallados en procesos neuroquirúrgicos que permanecen unidos a las superficies de los instrumentos quirúrgicos. Los instrumentos quirúrgicos de las salas neuroquirúrgicas se pueden tratar en proceso de limpieza rutinarios. La proteína residual u otras moléculas biológicas se pueden solubilizar de la superficie del instrumento utilizando una hidrólisis ácida parcial, limpiadores alcalinos fuertes o con la utilización de enzimas líticas adecuadas (por ejemplo proteasas, nucleasas, lipasas). A continuación, las moléculas principales se pueden determinar utilizando técnicas de espectrometría de masas, tales como la ionización por desorción láser aumentada en superficie (SELDI) equivalentes.

[0204] El mismo análisis se puede conseguir mediante la contaminación artificial de instrumentos quirúrgicos con material neurológico humano o muestras equivalentes de especies animales (por ejemplo, homogenatos de cerebro de roedor).

[0205] Una muestra de contaminación neurológica de análisis representativa requerirá un conjunto de componentes que incluyen, entre otros, proteínas derivadas de nervios (por ejemplo, neurofilamentos), lípidos o glicolípidos representativos de entornos neuronales (por ejemplo, gangliósidos ricos en siálico) y carbohidratos. Si la muestra contaminante de análisis se diseña para tratar cuestiones particulares referentes a enfermedades específicas, tales como enfermedades causadas por la agregación de proteínas (por ejemplo, la enfermedad de priones, enfermedad de Alzheimer), entonces estos componentes, o sustitutos de los mismos, también serán adiciones valiosas a la muestra de contaminación de análisis.

Reticulación de fusiones de tAK a proteína o glicolípido

[0206] También se puede producir una fusión de tAK recombinante a proteínas de neurofilamentos o subdominios de las mismas mediante la utilización de los métodos esencialmente descritos en los ejemplos 10 y 13.

[0207] Además, la reticulación se puede conseguir sin la necesidad de generar clones de expresión recombinante. Esto puede ser particularmente útil cuando las proteínas altamente glicosiladas o glicolípidos están unidos a la tAK. En este caso, la proteína o glicolípido se purifica a partir de una fuente adecuada o se genera mediante la expresión de una construcción génica adecuada en una línea celular eucariota (por ejemplo, célula de mamífero, sistema de expresión de baculovirus). La purificación puede ser a través de una variedad de métodos de purificación de proteínas conocidos o mediante la solubilización en detergentes de lípidos de membrana. A continuación, el material purificado se retícula a tAK purificada utilizando uno entre una amplia variedad de químicas de acoplamiento (por ejemplo, SPDP (Pierce chemicals) utilizado para unir proteínas a través de aminas primarias en proteínas; tratamiento con meta-peryodato utilizado para abrir los grupos carbohidrato que permiten la reticulación a glicolípidos). Más métodos adecuados para realizar la reticulación de la tAK con moléculas que contiene carbohidratos o lípidos se describen en detalle en el ejemplo 23.

[0208] De particular utilidad en esta aplicación es el acoplamiento covalente de la tAK a componentes biológicos, tales como gangliósidos, incluyendo aquellos específicos para células neuronales (por ejemplo GT1b, GT1a) y aquellos de origen celular general (por ejemplo GM1). Los gangliósidos se purifican mediante métodos estándar que implican la solubilización en detergentes, la separación en fases y la centrifugación diferencial. Alternativamente, el indicador se puede formular utilizando gangliósidos purificados disponibles comercialmente.

Conjugación de tAK a componentes de ácido nucleico de muestra de contaminación neurológica de análisis

[0209] La tAK se reticula a un ácido nucleico adecuado, purificado, generado sintéticamente o amplificado a partir de un molde utilizando PCR o técnicas similares. La reticulación se puede conseguir mediante la incorporación de un marcador de biotina sobre el ácido nucleico, por ejemplo, durante la síntesis, y utilizando una tAK reticulada a estreptavidina.

Deposición de componentes de componentes de muestra de contaminación de análisis sobre soporte sólido

[0210] La deposición de uno o más indicadores de tAK sobre un soporte sólido se puede conseguir tal como se describe en los ejemplos 10 y 13. Brevemente, los complejos de tAK se preparan en tampón PBS o tampón bicarbonato (pH 9,6) y se deja secar en una superficie de policarbonato durante 30 minutos a temperatura ambiente. Opcionalmente, se puede añadir sacarosa hasta concentraciones de 1% p/v. Las condiciones de unión se diseñan para favorecer la unión a través del componente biológico en lugar de la tAK, por ejemplo, mediante el bloqueo de grupos activos restantes en la superficie de la tAK utilizando un agente de modificación de la superficie adecuado o mediante la incorporación de niveles elevados de NaCl.

[0211] Opcionalmente, la muestra de contaminación neurológica depositada se puede fijar mediante el tratamiento con etanol o isopropanol al 0%. Para conseguir esto, el indicador se incuba en isopropanol al 70% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Esto mimetiza uno de los procesos hallados habitualmente que pueden incrementar la resistencia de materiales contaminantes en instrumentos quirúrgicos y, por tanto, proporciona al indicador una manera eficaz de monitorizar la eliminación de dichos materiales.

Ejemplo 16

Preparación de fusiones de proteína de cápside de norovirus (58kDa) – tAK

[0212] Se genera un gen que codifica una proteína de cápside de 58 kDa de norovirus como una construcción sintética. Este clon se clona en el extremo 5’ del gen que codifica la Adenilato quinasa termoestable de Thermotoga maritima para generar una única proteína de fusión. Después de la verificación de la secuencia, este clon se transfiere en un vector pMTL para la expresión en E.coli o en un sistema de expresión de baculovirus (por ejemplo, sistema de expresión BacPAK; Clontech) para la expresión en líneas celulares de insectos, tales como células SF9.

Expresión y purificación

[0213] La expresión de las fusiones de proteína de cápside-quinasa termoestable en E.coli se lleva a cabo esencialmente tal como se describe en los ejemplos previos. Las proteínas se purifican utilizando un protocolo similar en Flujo rápido de Azul Sefarosa sin etapa de desnaturalización térmica aplicada durante el protocolo de lisis celular. Las proteínas purificadas se analizan mediante análisis de SDS-PAGE y mediante ensayo enzimático tal como se describe en los ejemplos previos. El ensamblaje de las proteínas de fusión en partículas de tipo viral (VLP) es inducido mediante la alteración del pH y la concentración de sal.

[0214] La expresión en baculovirus y posterior purificación se lleva a cabo esencialmente tal como se describe en Jiang et al., (1992) "Expression, self-assembly and antigenicity of the norwalk virus capsid protein", Journal of Virology, 66, páginas 6527-6352.

Deposición en soportes sólidos

[0215] Las VLP-tAKs purificadas se depositan sobre un soporte sólido adecuado para validar la limpieza y desinfección de superficies utilizadas en la preparación de alimentos o después de brotes de norovirus en el entorno hospitalario.

[0216] Para validar la descontaminación de superficies para la preparación de alimentos, se preparan VLP-tAK en un tampón PBS que contiene un extracto de comida cruda que comprende albúmina de huevo y sacarosa. Esta matriz se recubre sobre una tira de polivinilo que mide 5 cm x 5 cm y se deja secar durante 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4°C.

[0217] Para evaluar la descontaminación de una instalación sanitaria potencialmente contaminada después de un brote de norovirus, se producen indicadores de VLP-quinasa termoestable en una preparación diseñada paramimetizar la contaminación relacionada con la sanidad. Ésta incluía varias proteínas relacionadas con la sangre descritas anteriormente, o uno de los contaminantes de chata estándar incluidos en los patrones de descontaminación nacional e internacional. Los indicadores particularmente eficaces se establecen utilizando soportes sólidos de tejido representativos de, por ejemplo, cortinas o batas de hospital.

Utilización de fusiones de VLP de norovirus-tAK para la validación de procesos de eliminación de virus

[0218] Las fusiones de VLP de norovirus-tAK son particularmente ventajosas para validar la capacidad de procesos de eliminar norovirus de muestras de agua o alimentos. Mantienen las propiedades de tamaño, carga e hidrofobicidad del virus parental y, por tanto, mimetizarán su comportamiento en procesos de eliminación. Esto es particularmente útil en este caso ya que no existe un método de cultivo para norovirus y, por tanto, actualmente no es posible medir la purificación de virus vivos de otro modo que no sea RT-PCR, un método que potencialmente consume tiempo.

[0219] Por ejemplo, las fusiones de VLP de norovirus-tAK se ponen en una fuente de agua y se filtran a través de un proceso diseñado para eliminar partículas virales. Se introducen suficientes virus para medir el nivel requerido de purificación viral. Se mide la cantidad de VLP después de la filtración y se evalúa frente a los criterios de pase/fallo predeterminados.

Ejemplo 17

Generación de fusiones de proteína de cubierta de bacteriófago MS2-tAK

[0220] La generación de proteínas de cubierta de MS2 y su ensamblaje espontáneo en partículas de tipo viral se ha descrito en un conjunto de estudios, por ejemplo, en Peabody (2003), "A viral platform for chemical modification and multivalent display", Journal of Nanobiotechnology, vol 1, página 5.

[0221] La secuencia proteica de la proteína de cubierta de MS2 capaz de generar VLP cuando se expresa en E.coli se proporciona a continuación (SEQ ID 62):

MASNFTQFVL VDNGGTGDVT VAPSNFANGV AEWISSNSRS QAYKVTCSVR QSSAQNRKYT IKVEVPKVAT QTVGGVELPV AAWRSYLNME LTIPIFATNS DCELIVKAMQ GLLKDGNPIP SAIAANSGIY

[0222] Las construcciones de proteínas de cubierta de MS2 se generan con la tAK de Thermatoga maritima, fusionada en el extremo N o C terminal de la proteína expresada. Dependiendo de la localización de la fusión, esto da lugar a la incorporación de la tAK en el lumen de la VLP o expuesta en la superficie. Las dos localizaciones presentan propiedades útiles para su aplicación como indicadores. Opcionalmente, la proteína de cubierta de MS2 se puede modificar mediante la inclusión de un residuo de cisteína en la posición 15 en la secuencia nativa (sustitución de treonina15 a cisteína). Las fusiones de VLP-tAK se purifican utilizando una combinación de los métodos descritos para las fusiones de tAK anteriores (Ejemplos 10 y 13) con etapas adicionales de intercambio iónico, si son necesarias. Las VLP intactas que incorporan la tAK también se pueden purificar en base a la exclusión por tamaño utilizando una columna de Sefarosa CL-4B.

[0223] Alternativamente, la tAK purificada se puede reticular a VLP de MS2 utilizando reactivos de reticulación química. Brevemente, la tAK de S.acidocaldarius se derivatiza con SPDP y se reduce para producir un grupo sulfhidrilo reactivo. A continuación, se mezcla con las VLP de MS2 que contienen la variante T15C de la proteína. Esto produce enlaces disulfuro covalentes entre los dos miembros. Estos tipos de moléculas unidas covalentemente se pueden utilizar indistintamente con las fusiones genéticas del resto de estos ejemplos.

Deposición de fusiones de proteína de cubierta de MS2 - tAK en soportes sólidos

[0224] Las VLP de MS2 que contienen tAK purificadas se depositan en superficies de una manera similar a las fusiones descritas en los ejemplos previos utilizando técnicas estándar de adsorción de proteínas. Opcionalmente, se pueden utilizar superficies muy cargadas o hidrófobas para proporcionar una indicación de la eliminación viral de superficies específicas en regímenes de procesos.

[0225] La fusión de VLP-tAK se puede depositar sola o puede estar contenida en una matriz de muestra de contaminación adecuada diseñada para representar la contaminación hallada durante el proceso de tratamiento a validar. Por ejemplo, se puede utilizar la contaminación de una chata para la evaluación o validación de la eliminación de materia fecal de chatas, lavabos o durante episodios de diarrea.

Utilización de fusiones MS2-tAK para validar un régimen de limpieza

[0226] El indicador de MS2-VLP se coloca en una superficie cerámica tal como se ha descrito anteriormente. El indicador cerámico se expone a la misma química de limpieza que las superficies del baño a limpiar, por ejemplo, a hipoclorito sódico diluido en una dilución de aproximadamente 2,5% (v:v), y bajo las mismas condiciones (30 minutos a temperatura ambiente). Al final del proceso, el indicador cerámico se inserta en un tubo para el control de higiene y la MS2-tAK residual se mide utilizando el método del ejemplo 12. Si está limpio por debajo de un umbral predeterminado, entonces se estima que el régimen de limpieza ha sido satisfactorio. En caso contrario, se requiere repetir la limpieza para minimizar cualquier riesgo de transmisión de enfermedades.

Utilización de fusiones de MS2-tAK para validar un proceso de eliminación viral

[0227] Dado que las VLP MS2-tAK mimetizan el tamaño, la carga de superficie y la hidrofobicidad del virus parental y son capaces de representar una amplia variedad de virus relacionados (por ejemplo virus de la polio), estos indicadores son extremadamente útiles para validar los procesos de eliminación viral a nivel de laboratorio o campo. La rapidez del ensayo de tAK proporciona ventajas significativas sobre los métodos tradicionales basados en cultivos.

[0228] Por ejemplo, se puede validar un sistema de tratamiento de aguas in situ utilizando las VLP MS2-tAK. Se colocan VLP MS2-tAK suficientes en el agua de entrada en la planta de tratamiento para proporcionar una estimación logarítmica de la purificación suficiente para la eficacia del proceso, según se determina mediante regulaciones nacionales o locales. Por ejemplo, se colocan 109 VLP-tAK por litro en el agua de entrada. El proceso se realiza y se analizan muestras de aproximadamente 1 ml del agua después del proceso en un sistema de tubo para el control de higiene adecuado (por ejemplo Aqua-trace™, Biotrace UK). Un valor que indica menos de 1 VLPtAK por ml de agua sería suficiente para demostrar una purificación de virus 6 veces logarítmica mediante el proceso empleado. Esto se podría realizar a los dos minutos después de completar el proceso en lugar de las 16-24 horas que se necesitarían para un método estándar basado en cultivos en E.coli.

[0229] Dichos métodos son relevantes para validar una amplia gama de procesos de desactivación viral utilizados ampliamente en las industrias de la sanidad, alimentación, agua o farmacéutica. En la amplia mayoría de los casos, se puede sustituir la utilización del bacteriófago MS2 parental, utilizado ampliamente para validar procesos de eliminación viral, proporcionando una determinación mucho más rápida y sensible de la eliminación. Por ejemplo, la purificación del agua a través de microfiltros cerámicos (que sustituyen el bacteriófago parental en Wegmann et al., 2007, "Modification of ceramic microfilters with colloidal zirconia to promote the adsorption of viruses from water"), el tratamiento del agua con cloro gas (Clevenger et al., 2007, "Comparison of the desactivation of Bacillus subtilis

5 spores and MS2 bacteriophage by MIOX, ClorTec and hypochlorite", J Applied Microbiology, 103, p2285-2290), la validación de la eficacia virucida del lavado de manos (Jones et al., 1991, "The use of bacteriophage MS2 as a model system to evaluate virucidal hand disinfctants", J Hospital Infection, 17, p279-285). Otros ejemplos serían validar, en el proceso, la eliminación de partículas virales de la sangre fraccionada, extracto celular de origen humano o animal, productos farmacéuticos, preparación de alimentos (por ejemplo, extractos de moluscos).

Ejemplo 18

Preparación de más fusiones quinasa-VLP adecuadas para evaluar y validar la eliminación o destrucción viral

15 [0230] La tabla siguiente enumera una serie de proteínas de fusión de VLP que son valiosas en el desarrollo de indicadores para valorar la eliminación o desactivación de un rango de patógenos virales. Éstos representan patógenos reales en los que la validación de la eliminación puede ser esencial o virus modelo capaces de representar la eliminación de un rango de patógenos relacionados. Los patógenos son del campo médico y

20 veterinario y también comprende un rango de patógenos zoonóticos conocidos o posibles que pueden transmitirse de animales a humanos.

Tabla 2: Componentes biológicos adecuados para la preparación de fusiones quinasa-VLP para evaluar y validar la eliminación o destrucción viral

25 [0231] La secuencia proteica del monómero y dímero de la proteína de cubierta del bacteriófago PP7 (Caldeira y Peabody, 2007, Journal of Nanobiotechnology, 5, pág 10) se proporciona a continuación. Los genes de la quinasa termoestable se pueden fusionar al extremo C-terminal del monómero o el dímero.

Virus

Fragmento recombinante Sistema de expresión Referencia

Bacteriófago, por ejemplo MS2, PP7

Proteína de cubierta de MS2 Proteína de cubierta de PP7 E.coli (vector de expresión pET3d) Peabody et al., 2003, Journal of Nanobiotechnology, 1, pág 5

Norwalk (norovirus)

Cápside Baculovirus Revisado en Grgacic y Anderson, 2006, Methods, 40, pág 60-65

Rotavirus

VP2, VP6 y VP7 Baculovirus Revisado en Grgacic y Anderson, 2006, Methods, 40, pág 60-65

SARS (coronavirus)

S, E y M Baculovirus Revisado en Grgacic y Anderson, 2006, Methods, 40, pág 60-65

Lengua azul

VP2 Baculovirus Roy et al., 1994, Vaccine, 12, pág 805-811

Virus del papiloma humano

Proteína estructural principal viral, L1 Células 293TT Buck et al., 2005, J Virology, 79, pág 2839; Buck et al., 2004, J. Virology, 78, pág 751

Hepatitis B

Proteína de envoltura pequeña (HBsAg) Células de levadura o mamífero Revisado en Grgacic y Anderson, 2006, Methods, 40, pág 60-65

Hepatitis C

Núcleo, E1 y E2 Baculovirus, células de levadura y mamífero Revisado en Grgacic y Anderson, 2006 , Methods, 40, pág 60-65

Gripe; Cepas humana (por ejemplo H5N1) y cepas de gripe aviar.

Hemaglutinina, neuraminidasa y matriz (M1 opcional) Baculovirus, células de mamífero Revisado en Grgacic y Anderson, 2006, Methods, 40, pág 60-65

Poliovirus

Cápside (VP0.1 y 3) Baculovirus Revisado en Grgacic y Anderson, 2006, Methods, 40, pág 60-65

VIH

Pr55gag, envoltura Baculovirus, células levadura y mamífero de Revisado en Grgacic y Anderson, 2006, Methods, 40, pág 60-65

Dengue B

Envoltura (e) y premembrana/ membrana (prM/M) Células de mamífero Purdy and Chang, 2005, Virology , 333, pág 239-250

Monómero de PP7 (SEQ ID 63)

[0232]

Dímero de PP7 (SEQ ID 64)

20 [0233]

Ejemplo 19

35 Expresión de fusiones quinasa – proteína fimbrial bacteriana para utilizar en el desarrollo de indicadores para valorar la eliminación de películas de las superficies.

[0234] Se genera una fusión entre la tAK de Thermotoga maritima y la proteína CsgA de E.coli mediante clonación recombinante estándar que es conocida por los expertos en la materia. La secuencia de la proteína generada se 40 muestra a continuación.

Secuencia de la proteína CsgA de E.coli (SEQ ID 65) Secuencia de Adenilato quinasa de Thermotoga maritima fusionada al extremo N-terminal de la proteína CsgA (SEQ ID 67)

[0236]

[0237] Para la expresión, se transfiere el clon a un vector de expresión adecuado, tal como pET 32a (Novagen) o pMALC2x (New England Biolabs) y la proteína se expresa en una cepa huésped adecuada (por ejemplo BL21) bajo condiciones de crecimiento normales.

[0238] Dependiendo de las condiciones de crecimiento, la fusión de quinasa termoestable-CsgA se puede expresar de manera soluble en el citoplasma de las células o como un cuerpo de inclusión insoluble en la célula. En el primer caso, la purificación se lleva a cabo tal como se describe en los Ejemplos 10 y 13. En el segundo, los cuerpos de inclusión se aíslan mediante centrifugación después de la lisis celular y se lavan extensamente en tampón que contiene Triton X100 al 1%. Los cuerpos de inclusión se solubilizan mediante suspensión en urea 8M o clorhidrato de guanidina 6 M y, a continuación, se repliegan mediante diálisis rápida en tampón con muy poca sal (habitualmente menos de 20 mM de NaCl).

[0239] La generación de capas de autoensamblaje está mediada por la incubación de la proteína de fusión purificada y enzimáticamente activa con una superficie hidrófoba (por ejemplo Teflon) en Tris 10 mM pH 8. Para superficies hidrofílicas, tales como acero inoxidable o vidrio, la fusión se incuba en tampón de acetato de sodio 50 mM pH 4, opcionalmente el presencia de Tween 20 al 0,1 %. Se pueden utilizar temperaturas elevadas de hasta 80oC para aumentar la unión o para asegurar el cubrimiento uniforme de superficies.

[0240] También se pueden utilizar fusiones con las secuencias de proteínas equivalentes de otros organismos Gram positivos o Gram negativos (por ejemplo, AgfA de especie Salmonella).

Secuencia proteica de la proteína AgfA de Salmonella (SEQ ID 66)

[0241]

Ejemplo 20

Más péptidos y proteínas de autoensamblaje para la generación de biopelículas

[0242] También se proporciona la generación de más dispositivos indicadores que contienen fusiones de tAK con péptidos capaces de autoensamblarse en fibrilas, o biopelículas reactivas a superficie. En la tabla siguiente se muestra una lista de compañeros de fusión adecuados.

Tabla 3: Péptidos y proteínas de autoagregación/ensamblaje adecuados para la generación de biopelículas

Proteínas y péptidos autoagregantes

Proteína recombinante Sistema de expresión Referencia

Sup 35

Dominio N-terminal de Sup 35 o péptido Sup35 E.coli, levadura Revisado en Harrison et al., 2007, Rev Physiol Biochem Pharmacol, 159, pág 1-77

Het S, Ure2, Rnq1, New 1

Secuencia nativa o fragmentos de la misma E.coli, levadura Revisado en Harrison et al., 2007, Rev Physiol Biochem Pharmacol, 159, pág. 1-77; Derkatch et al., 2007, Proc Natl Acad Sci US, 101, pág 12934-12939

Beta amiloide (enfermedad de Alzheimer)

A1 1-32 E.coli, levadura; péptido sintético Revisado en Harrison et al., 2007, Rev Physiol Biochem Pharmacol, 159, pág 1-77

Proteínas de cemento de percebe

Por ejemplo, proteína de 19kDa de B. albicostatus; proteína de 20kDa de Megabalanus rosa; nueva proteína dependiente de calcita de B. albicostatus E.coli, levadura o baculovirus Urushida et al., 2007, FEBS J., 274, pág 43364346; Nakano et al., 2007, Biomacromolecules, 8, pág 1830-1835; Kamino, 2001 , Biochem J., 356, pág 503-5077.

Apolipoproteína A1 como por ejemplo de trastornos de apolipoproteínas

Residuos 1-93 de ApoAl E.coli, levadura, células de mamífero Andreola et al., 2003, J Biol Chem, 278, pág 2444

Tau (asociada con la enfermedad de Alzheimer)

Proteínas o péptidos que contienen los residuos 306-311 (VQIVYK) E.coli, levadura o células de mamífero Revisado en Harrison et al., 2007, Rev Physiol Biochem Pharmacol , 159, pág 1-77

Proteína 2 de unión a poliadenina

Péptidos que contienen residuos 2-11 (AAAAAAAAAA) E.coli, levadura o células de mamífero Revisado en Harrison et al., 2007, Rev Physiol Biochem Pharmacol , 159, pág 1-77

Proteína C de surfactante de pulmón

Péptidos que contienen los residuos 9-22 (VVVVVVVLVVVV IV) E.coli, levadura o células de mamífero Revisado en Harrison et al., 2007, Rev Physiol Biochem Pharmacol , 159, pág 1-77

Subunidad CgsA (adhesión a superficies y la formación de biopelículas en E.coli)

Secuencia nativa de CsgA catalizada por la secuencia de CsGB E.coli Gebbink et al., 2005 , Nat Rev Microbiol , 3, pág 333; Hammer et al., 2007, PNAS, 104, pág 12494

AgfA ((adhesión a superficies, interacciones célula-célula y formación de biopelículas en Salmonella spp)

Secuencia nativa E. coli Revisado en Harrison et al., 2007, Rev Physiol Biochem Pharmacol , 159, pág 1-77

Adhesinas de la superficie celular formadora de amiloides formadoras de flóculos y bacterias filamentosas en lodo activado

Varias secuencias nativas E. coli Descrito en Larsen et al., 2008, Appl Env Microbiol. Cita en línea (Appl. Environ. Microbiol. doi:10.1128/AEM.0227 4-07v1)

Glicoproteína B(gB) del

Péptidos que contienen E.coli o células de Cribbs et al., 2000 ,

virus del Herpes simplex

aminoácidos 22-42 mamífero Biochemistry, 39, pág 5988-5994

Hidrofobinas (de varias especies fúngicas, por ejemplo, SC3 de Schizophyllum commune, RodA/B de Aspergillus fumigatus)

Secuencias nativas o péptidos derivados que contienen el dominio de 8 cisteínas del núcleo de la hidrofobina E.coli, levadura o Pichia pastoris Gebbink et al., 2005, Nat Rev Microbiol., 3, p333; Sunde et al., 2007, Micron e-pub

Chaplinas/Rodlinas

Proteínas chaplinas E.coli, levadura o pichia Gebbink et al., 2005 , Nat

(Streptomyces spp)

ChpA,B, C,D,E,F,G,H; proteínas rodlinas RdlA y RdlB y combinaciones de las mismas pastoris Rev Microbiol , 3, pág 333

Proteínas de cubierta de esporas gram positivas (por ejemplo, similar en la secuencia o estructura global con aquelas que forman apéndices de los lazos en Clostridium taeniosporum)

P29a, P29b, GP85, y un análogo de SpoVM E.coli, Clostridia Walker et al., 2007, Mol Micro., 63, pág 629-643

Ejemplo 21

Indicadores para monitorizar la eficacia de la limpieza de lentes de contacto para la eliminación de 5 biopelículas

[0243] Existe una gama de bacterias y virus que plantean un riesgo para los portadores de lentes de contacto en forma de plancton y biopelícula. Se pueden generar ventajosamente dispositivos indicadores para monitorizar la eficacia de métodos de limpieza para la eliminación de dichos organismos.

10 [0244] Las fusiones fimbriales descritas anteriormente pueden proporcionar una indicación de a eliminación de patógenos Gram negativos. Cualquier miembro de la familia de genes de hidrofobinas es una fusión indicadora adecuada para la eliminación de patógenos fúngicos donde estás moléculas muy conservadas son los mediadores principales de unión. Los genes de hidrofobinas, o equivalentes de especies de Fusarium y Candida albicans, son

15 adecuados, ya que estos organismos representan una de las mayores amenazas para la infección ocular conduciendo a la ulceración y lesión a largo plazo.

[0245] Las proteínas de fusión se pueden generar con cualquiera de estas moléculas y se pueden formular en películas adecuadas tal como se describe en los ejemplos anteriores. Estos indicadores se pueden incorporar como

20 parte de la cámara de lavado, en que deben limpiarse las lentes de contacto reutilizables. El proceso se realiza durante el periodo de tiempo apropiado y se extrae la lente. Se extrae el indicador y se valora la presencia de la proteína de fusión activa utilizando un control de higiene de la manera habitual. Si está por debajo de los valores umbrales preestablecidos, la lente de contacto es adecuada para la reutilización. Si está por encima (“fallo”), entonces la lente de contacto debe reprocesarse o destruirse.

Secuencia proteica de la proteína hidrofobina 3 de la especie Fusarium (SEQ ID 68)

[0246]

35 Secuencia proteica de proteína hidrofobina 5 de la especie Fusarium (SEQ ID 69)

[0247] Ejemplo 22

Generación de fusiones de tAK a proteínas de tipo cemento para utilizar en la determinación de la eliminación de biopelículas

[0248] Se fusiona tAK de Thermotoga maritima a la proteína de 19KDa de Balanus albicostatus y se expresa como se ha descrito anteriormente. La purificación se realiza a partir de una fracción soluble o insoluble. El repliegue y la posterior deposición de la película que contiene tAK sobre un soporte sólido se consigue como en el ejemplo 19. El grosor, la velocidad de deposición y la posterior eliminación de la biopelícula se pueden alterar mediante la modificación de la concentración de sales y el pH y mediante la alteración de la concentración de la proteína de fusión.

[0249] Las secuencias proteicas de proteínas de tipo cemento de percebe adecuadas para utilizar en la invención se describen a continuación. La quinasa termoestable puede estar fusionada a cualquiera de los extremos N o C terminal de las proteínas de cemento.

[0250] Secuencia proteica de proteína de tipo cemento de Balanus albicostatus (19k) (SEQ ID 70)

[0251] Secuencia proteica de proteína de tipo cemento de Megabalanus rosa (20k) (SEQ ID 71)

[0252] Secuencia proteica de fusión de la proteína de percebe de Balanus albicostatus con la tAK de Thermotoga maritima; fusión N-terminal (SEQ ID 72)

[0253] Secuencia proteica de fusión de la proteína de percebe de Balanus albicostatus con la tAK de Thermotoga maritima; fusión C-terminal (SEQ ID 73)

[0254] Secuencia proteica de nuevas proteínas de cemento de percebe para utilizar en la generación de proteínas de fusión de quinasa termoestable. La agregación dependiente de calcita y la adherencia de esta proteína permiten que este tipo de indicador monitorice procesos capaces de eliminar iones minerales de agregados de manera que se desestabiliza y elimina la bioincrustación o biopelículas. La quinasa termoestable se puede fusionar opcionalmente al extremo N-terminal o C-terminal. Secuencia de Mori et al., 2007, Calcite-specific coupling protein in barnacle underwater cement; FEBS Journal, 274, pág 6436-6446. Secuencia proteica de adsorbente específico de calcita de Balanus albicostatus (SEQ ID 74)

[0255] Secuencia peptídica de un péptido derivado de una proteína de cemento de percebe para utilizar en la formación de preparaciones de biopelículas de péptidos que contienen quinasa termoestable. Secuencias derivadas de Nakano et al., 2007, Self assembling peptide inspired by a barnacle underwater adhesive protein; Biomacromolecules, vol 8, pág 1830-1835.

Péptido 1 (SEQ ID 75) SKLPCNDEHPCYRKEGGVVSCDCK

Péptido 2 (SEQ ID 76) SKLPSNDEHPSYRKEGGVVSSDSK

Péptido 3 (SEQ ID 77) KTITCNEDHPCYHSYEEDGVTKSDCDCE

Utilización de la fusión de cemento – tAK para monitorizar la limpieza de dispositivos médicos

[0256] El indicador descrito anteriormente se deposita sobre acero inoxidable de un grado representativo de los instrumentos quirúrgicos utilizando los métodos de deposición descritos en los ejemplos previos. El dispositivo se inserta en una carga de instrumentos estándar y se realiza el proceso habitual. Se extrae el dispositivo al final de proceso y se correlaciona la actividad residual de la fusión de tAK con la eliminación de componentes de contaminación potencialmente infecciosos.

Utilización de la fusión cemento - tAK para monitorizar la eliminación de bioincrustación

[0257] El indicador descrito anteriormente también se puede utilizar para monitorizar la eliminación de bioincrustación en otros contextos. Por ejemplo, el indicador se puede unir a la base de un barco sometido a limpieza para la extracción de percebes y otras biopelículas marinas. El indicador se somete al mismo proceso y se valora al final del procedimiento. Aunque la eliminación visual de material es el medio clave de determinación del rendimiento, la utilización de un método de ensayo más sensible permite una valoración de la eliminación de cantidades microscópicas de contaminación que proporcionaría un mejor cebador para el restablecimiento de la biopelícula marina. Por tanto, en esta aplicación, el indicador proporciona una demostración de eficacia inmediata y una indicación de la longevidad del tratamiento.

Ejemplo 23

Reticulación de tAK a exopolisacárido de E.coli o Staphylococcus aureus

[0258] El exopolisacárido se genera mediante el crecimiento de la cepa bacteriana relevante bajo condiciones de crecimiento estándar en cultivos líquidos, semilíquidos, biopelículas o sólidos familiares para los expertos en la materia. Las bacterias se recogen, normalmente hacia el final de la fase logarítmica de crecimiento, mediante resuspensión (cuando sea necesario) y centrifugación. Las células se lavan en tampones de fuerza osmótica baja (normalmente por debajo de 100 mM de NaCl/NaPO4) habitualmente a pH neutro. El lavado se puede llevar a cabo mediante la mezcla vigorosa durante 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche con agitación suave a 4°C. Opcionalmente, se puede extraer una preparación ácida utilizando un tampón de acetato a pH entre 3 y 5. Se puede conseguir una perturbación celular limitada utilizando sonicación de energía muy baja o mediante la adición de niveles bajos de detergente. Las preparaciones se pueden esterilizar por filtración a través de un filtro de nitrocelulosa o acetato de celulosa de 0,2 m antes del almacenamiento a 4°C o -20°C.

[0259] La reticulación de los polisacáridos a tAK se puede conseguir utilizando un conjunto de químicas de acoplamiento. En el primer ejemplo, se utiliza la tAK de S.acidocaldarius. El acoplamiento utiliza el reactivo heterobifuncional ABH (p-Azidobenzoil hidrazida; Pierce Chemical, número de producto de la compañía 21510). El protocolo es el siguiente.

1.

Preparar una solución de peryodato 20 mM mediante la disolución de 4,3 mg de metaperyodato sódico en 1 ml de

acetato de sodio 0,1 M pH 5,5. Almacenar en hielo en la oscuridad.

2.

Añadir el 1 ml de solución de metaperyodato a 1 ml del exopolisacárido (EPS; u otra glicoproteína, carbohidrato complejo o solución lipídica) a una concentración de por lo menos 1 mg/ml de carbohidrato. Incubar durante 30 minutos a 4°C.

3.

Dializar durante la noche contra solución salina tamponada con fosfato

4.

Preparar ABH mediante la disolución de 1,8 mg en DMSO.

5.

Añadir entre 10 y 100 l de la ABH a la solución de EPS oxidada generada en la etapa 3 e incubar a temperatura ambiente durante 2 horas

6.

Dializar las muestras durante la noche para eliminar el exceso de ABH

7.

Mezclar el EPS derivatizada con ABH con tAK purificada de S.acidolcaldarius preparada tal como se describe previamente. La concentración de la tAK requerida para proporcionar el nivel apropiado de reticulación se puede determinar empíricamente, pero estará normalmente en el intervalo de 1-5 mg/ml. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.

8.

Exponer la mezcla de reacción a luz UV utilizando un aparato de reticulación UV o equivalente.

[0260] En un segundo ejemplo de las químicas disponibles, se utiliza el agente heterobifuncional MPBH clorhidrato de la hidrazida del ácido (4-[4-N-maleimidiofenil]butírico; Pierce Chemical, producto de la compañía 22305)). El breve protocolo es el siguiente:

1.

Se genera tAK (por ejemplo, de S.acidocladarius) con un sulfhidrilo reactivo tal como se describe anteriormente mediante la derivatización con SPDP (Ejemplo 10) y la posterior reducción. Alternativamente, se pueden utilizar tAK con residuos cisteína libres (tales como la tAK de Archaeoglobus fulgidus expresada en una forma recombinante tal como se describe anteriormente) o con residuos de cisteína adicionales introducidos mediante métodos recombinantes estándar. La proteína se prepara a aproximadamente 1-5 mg/ml de fosfato de sodio 0,1M NaCl 0,15 M pH 7,2 o solución salina tamponada con fosfato.

2.

Disolver 3,5 mg MPBH en 1 ml de dimetilformamida o dimetilsulfóxido para producir una solución 10 mM.

3.

Añadir a la proteína de la etapa 1 para conseguir un exceso molar de 5-10 veces de MPBH con respecto a la proteína y reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente (o 4 horas a 4°C).

4.

Dializar contra fosfato de sodio 0,1 M NaCl 0,15M pH 7,2.

5.

Preparar una solución de peryodato 20 mM mediante la disolución de 4,3 mg de metaperyodato sódico en 1 ml de acetato de sodio 0,1 M pH 5,5. Almacenar en hielo en la oscuridad.

6.

Añadir el 1 ml de solución de metaperyodato a 1 ml del exopolisacárido (EPS; u otra glicoproteína, carbohidrato complejo o solución lipídica) a una concentración de por lo menos 1 mg/ml de carbohidrato. Incubar durante 30 minutos a 4°C.

7.

Dializar durante la noche contra fosfato de sodio 0,1 M NaCl 0,15 M pH 7,2.

8.

Mezclar la proteína que contiene sulfhidrilo de la sección 4 con la solución de EPS oxidada de la etapa 7 e incubar durante 2 horas a temperatura ambiente. Opcionalmente, separar los componentes reticulados de los componentes libres que aún permanecen utilizando cromatografía de exclusión por tamaño.

[0261] Los métodos descritos anteriormente son aplicables para generar conjugados de tAK con una amplia gama de carbohidratos complejos, glicoproteínas, glicolípidos y otros polímeros que contienen carbohidratos que incluyen los de origen mamífero, bacteriano, arquea, vegetal o fúngico.

Utilización de indicadores basados en fusiones de exopolisacárido-tAK.

[0262] El indicador de EPS-tAK se prepara en un tampón de recubrimiento adecuado, tal como una solución salina tamponada con fosfato (pH 7-7,4), bicarbonato de sodio (pH 9-9,6) o acetato de sodio (pH 4-5,5), que contiene opcionalmente hasta 500 mM de NaCl a una concentración relativamente elevada, por ejemplo, 0,1-2 mg/ml. La solución se deposita sobre un soporte sólido adecuado, tal como acero quirúrgico, plásticos similares a catéteres y recubrimientos, plásticos utilizados habitualmente en endoscopios. La interacción se deja proceder habitualmente durante 1-2 horas a temperatura ambiente y la superficie recubierta se deja secar a temperatura ambiente durante la noche antes del almacenamiento.

[0263] Opcionalmente, se pueden añadir otros componentes de la matriz biológica durante la fase de recubrimiento

o posterior a la misma.

[0264] El indicador se incluye en el proceso a monitorizar, por ejemplo, en un ciclo de lavado-desinfección. El dispositivo se extrae al final del proceso y se inserta en tubos de control de higiene para proporcionar la lectura de la destrucción y/o eliminación eficaz. El proceso se estima eficaz si el valor obtenido está por debajo de los umbrales predeterminados del control de higiene del luminómetro. Si es satisfactorio, el lote de instrumentos o material procesado al mismo tiempo que el indicador se pueden utilizar o pasar al siguiente procesado. Si se estima como insatisfactorio, el material debe reprocesarse con un nuevo dispositivo indicador.

Ejemplo 24

Más ejemplos de indicadores de carbohidratos complejos y glicoconjugados

[0265] Se pueden incorporar en los dispositivos indicadores de la invención una amplia gama de moléculas que contienen carbohidratos complejos mediante la unión covalente a tAK utilizando métodos, tales como los indicados 10 anteriormente (Ejemplo 23). Algunos ejemplos adicionales de éstos se proporcionan en la siguiente tabla.

Tabla 4: Componentes biológicos que contienen carbohidratos adecuados

Tipo de carbohidrato complejo

Organismos (varias especies y cepas) Tipo de proceso para aplicaciones de indicadores

EPS/LPS (a veces denominado endotoxina)

Legionella, E.coli, especie Staphylococcus, especie Streptococcus, especie Pseudomonas, Acinetobactor, Shigella, Campylobacter, especie Bacillus, Limpieza, descontaminación, esterilización, (ejemplos específicos; Eliminación de biopelículas, eliminación o destrucción de endotoxinas, limpieza de instrumentos quirúrgicos, limpieza y descontaminación de productos médicos)

Lignina

Hongos filamentosos Eliminación y destrucción de biopelículas. Destrucción

Componentes de la pared celular

Streptomyces Esterilización de suelos

Eap1p y glicoproteínas de la superficie celular equivalentes (Li et al., 2007, Eukaryotic cell, 6, pág 931939)

Candida albicans y organismos fúngicos relacionados Eliminación de biopelículas, desocntaminación del control de la infección

Extractos de esporas

Especie Bacillus, especie Clostridial; otros formadores de esporas Esterilización de productos, limpieza y descontaminación de habitación

Preparaciones de mucina

Especies de mamíferos y cultivos celulares recombinantes Descontaminación de instrumentos quirúrgicos, descontaminación de máscaras quirúrgicas, control de brotes de virus respiratorio (por ejemplo, gripe, RSV)

Glicolípidos derivados del cerebro

Especies de mamíferos Evaluación/validación de tecnologías de eliminación de priones, descontaminación de instrumentos neurológicos, muestras, etc.

Secreciones de invertebrados

Geles de moluscos Eliminación de bioincrustación

Hidrocaburos, gomas, resinas, aceites o lípidos de plantas

Varias especies de plantas Eliminación o destrucción de materiales contaminantes en superficies o en productos

Ejemplo 25

Acoplamiento de tAK a moco para validar procesos diseñados para reducir la contaminación por mocos de productos médicos

[0266] El moco se purifica de una línea celular productora de moco, tal como células bronquiales humanas

20 normales, células cultivadas o se recoge de muestras de esputo de pacientes. El lavado en agua o soluciones bajas en sales es suficiente para separar la mucina de la mayoría de otros componentes. Alternativamente, también se puede utilizar la mucina purificada de origen animal, por ejemplo, mucina porcina. La preparación purificada se reticula a tAK utilizando los métodos descritos anteriormente, al componente proteico, a través del acoplamiento con SPDP de las proteínas tal como se muestra en la figura 7, o al componente carbohidrato utilizando los métodos específicos establecidos en el ejemplo 23. La deposición posterior utilización del indicador es tal como se describe

5 en los ejemplos 23 y 24. La figura 8 muestra los resultados de la utilización de un conjugado de tAK-mucina para monitorizar la eliminación de mucina en un dispositivo de lavado-desinfección.

LISTADO DE SECUENCIAS

[0267]

<110> Health Protection Agency Sutton, J. Mark Hesp, J. Richard Ungurs, Michael

<120> Indicador biológico reticulado

<130> P30041WO-MRM

<150> GB 0803068.6

<151> 2008-02-20

<160> 77

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 195

<212> PRT

<213> Sulfolobus solfataricus

<400> 1

Met Lys Ile Gly Ile Val Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Thr Thr 1 5 10 15 Val Leu Ser Phe Ala Asp Lys Ile Leu Thr Glu Lys Gly Ile Ser His

20 25 30 Lys Ile Val Asn Tyr Gly Asp Tyr Met Leu Asn Thr Ala Leu Lys Glu 35 40 45 Gly Tyr Val Lys Ser Arg Asp Glu Ile Arg Lys Leu Gln Ile Glu Lys

50 55 60 Gln Arg Glu Leu Gln Ala Leu Ala Ala Arg Arg Ile Val Glu Asp Leu 65 70 75 80 Ser Leu Leu Gly Asp Glu Gly Ile Gly Leu Ile Asp Thr His Ala Val

85 90 95 Ile Arg Thr Pro Ala Gly Tyr Leu Pro Gly Leu Pro Arg His Val Ile 100 105 110 Glu Val Leu Ser Pro Lys Val Ile Phe Leu Leu Glu Ala Asp Pro Lys 115 120 125 Ile Ile Leu Glu Arg Gln Lys Arg Asp Ser Ser Arg Ala Arg Thr Asp

130 135 140 Tyr Ser Asp Thr Ala Val Ile Asn Glu Val Ile Gln Phe Ala Arg Tyr 145 150 155 160 Ser Ala Met Ala Ser Ala Val Leu Val Gly Ala Ser Val Lys Val Val

165 170 175 Val Asn Gln Glu Gly Asp Pro Ser Ile Ala Ala Ser Glu Ile Ile Asn 180 185 190 Ser Leu Met 195

<210> 2

<211> 194

<212> PRT

<213> Sulfolobus acidocaldarius

<400> 2

Met Lys Ile Gly Ile Val Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Ser Thr

1 5 10 15

Val Leu Ala Lys Val Lys Glu Ile Leu Asp Asn Gln Gly Ile Asn Asn 20 25 30 Lys Ile Ile Asn Tyr Gly Asp Phe Met Leu Ala Thr Ala Leu Lys Leu 35 40 45 Gly Tyr Ala Lys Asp Arg Asp Glu Met Arg Lys Leu Ser Val Glu Lys

50 55 60

Gln Lys Lys Leu Gln Ile Asp Ala Ala Lys Gly Ile Ala Glu Glu Ala

65 70 75 80

Arg Ala Gly Gly Glu Gly Tyr Leu Phe Ile Asp Thr His Ala Val Ile

85 90 95 Arg Thr Pro Ser Gly Tyr Leu Pro Gly Leu Pro Ser Tyr Val Ile Thr 100 105 110 Glu Ile Asn Pro Ser Val Ile Phe Leu Leu Glu Ala Asp Pro Lys Ile 115 120 125 Ile Leu Ser Arg Gln Lys Arg Asp Thr Thr Arg Asn Arg Asn Asp Tyr

130 135 140

Ser Asp Glu Ser Val Ile Leu Glu Thr Ile Asn Phe Ala Arg Tyr Ala

145 150 155 160

Ala Thr Ala Ser Ala Val Leu Ala Gly Ser Thr Val Lys Val Ile Val

165 170 175 Asn Val Glu Gly Asp Pro Ser Ile Ala Ala Asn Glu Ile Ile Arg Ser 180 185 190 Met Lys

<210> 3

<211> 197

<212> PRT

<213> Sulfolobus tokodaii

<400> 3

Met Ser Lys Met Lys Ile Gly Ile Val Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly

1 5 10 15

Lys Thr Thr Val Leu Ser Lys Val Lys Glu Ile Leu Glu Glu Lys Lys 20 25 30 Ile Asn Asn Lys Ile Val Asn Tyr Gly Asp Tyr Met Leu Met Thr Ala 35 40 45 Met Lys Leu Gly Tyr Val Asn Asn Arg Asp Glu Met Arg Lys Leu Pro

50 55 60

Val Glu Lys Gln Lys Gln Leu Gln Ile Glu Ala Ala Arg Gly Ile Ala

65 70 75 80

Asn Glu Ala Lys Glu Gly Gly Asp Gly Leu Leu Phe Ile Asp Thr His

85 90 95 Ala Val Ile Arg Thr Pro Ser Gly Tyr Leu Pro Gly Leu Pro Lys Tyr 100 105 110 Val Ile Glu Glu Ile Asn Pro Arg Val Ile Phe Leu Leu Glu Ala Asp 115 120 125 Pro Lys Val Ile Leu Asp Arg Gln Lys Arg Asp Thr Ser Arg Ser Arg

130 135 140

Ser Asp Tyr Ser Asp Glu Arg Ile Ile Ser Glu Thr Ile Asn Phe Ala

145 150 155 160

Arg Tyr Ala Ala Met Ala Ser Ala Val Leu Val Gly Ala Thr Val Lys

165 170 175 Ile Val Ile Asn Val Glu Gly Asp Pro Ala Val Ala Ala Asn Glu Ile 180 185 190 Ile Asn Ser Met Leu 195

<210> 4

<211> 196

<212> PRT

<213> Pyrococcus furiosus

<400> 4

Met Pro Phe Val Val Ile Ile Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Ser

1 5 10 15

Thr Ile Thr Arg Leu Ala Leu Gln Arg Thr Lys Ala Lys Phe Arg Leu 20 25 30 Ile Asn Phe Gly Asp Leu Met Phe Glu Glu Ala Val Lys Ala Gly Leu 35 40 45 Val Lys His Arg Asp Glu Met Arg Lys Leu Pro Leu Lys Ile Gln Arg

50 55 60

Glu Leu Gln Met Lys Ala Ala Lys Lys Ile Thr Glu Met Ala Lys Glu

65 70 75 80

His Pro Ile Leu Val Asp Thr His Ala Thr Ile Lys Thr Pro His Gly

85 90 95 Tyr Met Leu Gly Leu Pro Tyr Glu Val Val Lys Thr Leu Asn Pro Asn 100 105 110 Phe Ile Val Ile Ile Glu Ala Thr Pro Ser Glu Ile Leu Gly Arg Arg 115 120 125 Leu Arg Asp Leu Lys Arg Asp Arg Asp Val Glu Thr Glu Glu Gln Ile

130 135 140

Gln Arg His Gln Asp Leu Asn Arg Ala Ala Ala Ile Ala Tyr Ala Met

145 150 155 160

His Ser Asn Ala Leu Ile Lys Ile Ile Glu Asn His Glu Asp Lys Gly

165 170 175 Leu Glu Glu Ala Val Asn Glu Leu Val Lys Ile Leu Asp Leu Ala Val 180 185 190 Asn Glu Tyr Ala 195

<210> 5

<211> 196

<212> PRT

<213> Pyrococcus horikoshii

<400> 5

Met Pro Phe Val Val Ile Ile Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Ser

1 5 10 15

Thr Ile Thr Lys Leu Ala Leu Gln Arg Thr Arg Ala Lys Phe Lys Leu 20 25 30 Ile Asn Phe Gly Asp Leu Met Phe Glu Glu Ala Leu Lys Leu Lys Leu 35 40 45 Val Lys His Arg Asp Glu Met Arg Lys Leu Pro Leu Glu Val Gln Arg

50 55 60

Glu Leu Gln Met Asn Ala Ala Lys Lys Ile Ala Glu Met Ala Lys Asn

65 70 75 80

Tyr Pro Ile Leu Leu Asp Thr His Ala Thr Ile Lys Thr Pro His Gly

85 90 95 Tyr Leu Leu Gly Leu Pro Tyr Glu Val Ile Lys Ile Leu Asn Pro Asn 100 105 110 Phe Ile Val Ile Ile Glu Ala Thr Pro Ser Glu Ile Leu Gly Arg Arg 115 120 125 Leu Arg Asp Leu Lys Arg Asp Arg Asp Val Glu Thr Glu Glu Gln Ile

130 135 140

Gln Arg His Gln Asp Leu Asn Arg Ala Ala Ala Ile Thr Tyr Ala Met

145 150 155 160

His Ser Asn Ala Leu Ile Lys Ile Ile Glu Asn His Glu Asp Lys Gly

165 170 175 Leu Glu Glu Ala Val Asn Glu Leu Val Lys Ile Leu Asp Leu Ala Val 180 185 190 Lys Glu Tyr Ala 195

<210> 6

<211> 196

<212> PRT

<213> Pyrococcus abyssi

<400> 6

Met Ser Phe Val Val Ile Ile Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Ser

1 5 10 15

Thr Ile Thr Arg Leu Ala Leu Gln Arg Thr Lys Ala Lys Phe Lys Leu 20 25 30 Ile Asn Phe Gly Asp Leu Met Phe Glu Glu Ala Val Lys Ala Gly Leu 35 40 45 Val Asn His Arg Asp Glu Met Arg Lys Leu Pro Leu Glu Ile Gln Arg

50 55 60

Asp Leu Gln Met Lys Val Ala Lys Lys Ile Ser Glu Met Ala Arg Gln

65 70 75 80

Gln Pro Ile Leu Leu Asp Thr His Ala Thr Ile Lys Thr Pro His Gly

85 90 95 Tyr Leu Leu Gly Leu Pro Tyr Glu Val Ile Lys Thr Leu Asn Pro Asn 100 105 110 Phe Ile Val Ile Ile Glu Ala Thr Pro Ser Glu Ile Leu Gly Arg Arg 115 120 125 Leu Arg Asp Leu Lys Arg Asp Arg Asp Val Glu Thr Glu Glu Gln Ile

130 135 140

Gln Arg His Gln Asp Leu Asn Arg Ala Ala Ala Ile Ala Tyr Ala Met

145 150 155 160

His Ser Asn Ala Leu Ile Lys Ile Ile Glu Asn His Glu Asp Lys Gly

165 170 175 Leu Glu Glu Ala Val Asn Glu Leu Val Glu Ile Leu Asp Leu Ala Val 180 185 190 Lys Glu Tyr Ala 195

<210> 7

<211> 192

<212> PRT

<213> Methanococcus thermolithotrophicus

<400> 7

Met Lys Asn Lys Leu Val Val Val Thr Gly Val Pro Gly Val Gly Gly

1 5 10 15

Thr Thr Ile Thr Gln Lys Ala Met Glu Lys Leu Ser Glu Glu Gly Ile 20 25 30 Asn Tyr Lys Met Val Asn Phe Gly Thr Val Met Phe Glu Val Ala Gln 35 40 45 Glu Glu Asn Leu Val Glu Asp Arg Asp Gln Met Arg Lys Leu Asp Pro

50 55 60

Asp Thr Gln Lys Arg Ile Gln Lys Leu Ala Gly Arg Lys Ile Ala Glu

65 70 75 80

Met Val Lys Glu Ser Pro Val Val Val Asp Thr His Ser Thr Ile Lys

85 90 95 Thr Pro Lys Gly Tyr Leu Pro Gly Leu Pro Val Trp Val Leu Asn Glu 100 105 110 Leu Asn Pro Asp Ile Ile Ile Val Val Glu Thr Ser Gly Asp Glu Ile 115 120 125 Leu Ile Arg Arg Leu Asn Asp Glu Thr Arg Asn Arg Asp Leu Glu Thr

130 135 140

Thr Ala Gly Ile Glu Glu His Gln Ile Met Asn Arg Ala Ala Ala Met

145 150 155 160

Thr Tyr Gly Val Leu Thr Gly Ala Thr Val Lys Ile Ile Gln Asn Lys

165 170 175 Asn Asn Leu Leu Asp Tyr Ala Val Glu Glu Leu Ile Ser Val Leu Arg 180 185 190

<210> 8

<211> 192

<212> PRT

<213> Methanococcus voltae

<400> 8

Met Lys Asn Lys Val Val Val Val Thr Gly Val Pro Gly Val Gly Ser

1 5 10 15

Thr Thr Ser Ser Gln Leu Ala Met Asp Asn Leu Arg Lys Glu Gly Val 20 25 30 Asn Tyr Lys Met Val Ser Phe Gly Ser Val Met Phe Glu Val Ala Lys 35 40 45 Glu Glu Asn Leu Val Ser Asp Arg Asp Gln Met Arg Lys Met Asp Pro

50 55 60

Glu Thr Gln Lys Arg Ile Gln Lys Met Ala Gly Arg Lys Ile Ala Glu

65 70 75 80

Met Ala Lys Glu Ser Pro Val Ala Val Asp Thr His Ser Thr Val Ser

85 90 95 Thr Pro Lys Gly Tyr Leu Pro Gly Leu Pro Ser Trp Val Leu Asn Glu 100 105 110 Leu Asn Pro Asp Leu Ile Ile Val Val Glu Thr Thr Gly Asp Glu Ile 115 120 125 Leu Met Arg Arg Met Ser Asp Glu Thr Arg Val Arg Asp Leu Asp Thr

130 135 140

Ala Ser Thr Ile Glu Gln His Gln Phe Met Asn Arg Cys Ala Ala Met

145 150 155 160

Ser Tyr Gly Val Leu Thr Gly Ala Thr Val Lys Ile Val Gln Asn Arg

165 170 175 Asn Gly Leu Leu Asp Gln Ala Val Glu Glu Leu Thr Asn Val Leu Arg 180 185 190

<210> 9

<211> 195

<212> PRT

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 9

Met Met Met Met Lys Asn Lys Val Val Val Ile Val Gly Val Pro Gly

1 5 10 15

Val Gly Ser Thr Thr Val Thr Asn Lys Ala Ile Glu Glu Leu Lys Lys 20 25 30 Glu Gly Ile Glu Tyr Lys Ile Val Asn Phe Gly Thr Val Met Phe Glu 35 40 45 Ile Ala Lys Glu Glu Gly Leu Val Glu His Arg Asp Gln Leu Arg Lys

50 55 60

Leu Pro Pro Glu Glu Gln Lys Arg Ile Gln Lys Leu Ala Gly Lys Lys

65 70 75 80

Ile Ala Glu Met Ala Lys Glu Phe Asn Ile Val Val Asp Thr His Ser

85 90 95 Thr Ile Lys Thr Pro Lys Gly Tyr Leu Pro Gly Leu Pro Ala Trp Val 100 105 110 Leu Glu Glu Leu Asn Pro Asp Ile Ile Val Leu Val Glu Ala Glu Asn 115 120 125 Asp Glu Ile Leu Met Arg Arg Leu Lys Asp Glu Thr Arg Gln Arg Asp

130 135 140

Phe Glu Ser Thr Glu Asp Ile Gly Glu His Ile Phe Met Asn Arg Cys

145 150 155 160

Ala Ala Met Thr Tyr Ala Val Leu Thr Gly Ala Thr Val Lys Ile Ile

165 170 175 Lys Asn Arg Asp Phe Leu Leu Asp Lys Ala Val Gln Glu Leu Ile Glu 180 185 190 Val Leu Lys 195

<210> 10

<211> 191

<212> PRT

<213> Methanopyrus kandleri

<400> 10

Met Gly Tyr Val Ile Val Ala Thr Gly Val Pro Gly Val Gly Ala Thr

1 5 10 15

Thr Val Thr Thr Glu Ala Val Lys Glu Leu Glu Gly Tyr Glu His Val 20 25 30 Asn Tyr Gly Asp Val Met Leu Glu Ile Ala Lys Glu Glu Gly Leu Val 35 40 45 Glu His Arg Asp Glu Ile Arg Lys Leu Pro Ala Glu Lys Gln Arg Glu

50 55 60

Ile Gln Arg Leu Ala Ala Arg Arg Ile Ala Lys Met Ala Glu Glu Lys

65 70 75 80

Glu Gly Ile Ile Val Asp Thr His Cys Thr Ile Lys Thr Pro Ala Gly

85 90 95 Tyr Leu Pro Gly Leu Pro Ile Trp Val Leu Glu Glu Leu Gln Pro Asp 100 105 110 Val Ile Val Leu Ile Glu Ala Asp Pro Asp Glu Ile Met Met Arg Arg 115 120 125 Val Lys Asp Ser Glu Glu Arg Gln Arg Asp Tyr Asp Arg Ala His Glu

130 135 140

Ile Glu Glu His Gln Lys Met Asn Arg Met Ala Ala Met Ala Tyr Ala

145 150 155 160

Ala Leu Thr Gly Ala Thr Val Lys Ile Ile Glu Asn His Asp Asp Arg

165 170 175 Leu Glu Glu Ala Val Arg Glu Phe Val Glu Thr Val Arg Ser Leu 180 185 190

<210> 11

<211> 192

<212> PRT

<213> Methanotorris igneus

<400> 11

Met Lys Asn Lys Val Val Val Val Thr Gly Val Pro Gly Val Gly Gly

1 5 10 15

Thr Thr Leu Thr Gln Lys Thr Ile Glu Lys Leu Lys Glu Glu Gly Ile 20 25 30 Glu Tyr Lys Met Val Asn Phe Gly Thr Val Met Phe Glu Val Ala Lys 35 40 45 Glu Glu Gly Leu Val Glu Asp Arg Asp Gln Met Arg Lys Leu Asp Pro

50 55 60

Asp Thr Gln Lys Arg Ile Gln Lys Leu Ala Gly Arg Lys Ile Ala Glu

65 70 75 80

Met Ala Lys Glu Ser Asn Val Ile Val Asp Thr His Ser Thr Val Lys

85 90 95 Thr Pro Lys Gly Tyr Leu Ala Gly Leu Pro Ile Trp Val Leu Glu Glu 100 105 110 Leu Asn Pro Asp Ile Ile Val Ile Val Glu Thr Ser Ser Asp Glu Ile 115 120 125 Leu Met Arg Arg Leu Gly Asp Ala Thr Arg Asn Arg Asp Ile Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Asp Ile Asp Glu His Gln Phe Met Asn Arg Cys Ala Ala Met

145 150 155 160

Ala Tyr Gly Val Leu Thr Gly Ala Thr Val Lys Ile Ile Lys Asn Arg

165 170 175 Asp Gly Leu Leu Asp Lys Ala Val Glu Glu Leu Ile Ser Val Leu Lys 180 185 190

<210> 12

<211> 197

<212> PRT

<213> Pyrobaculum aerophilum

<400> 12

Met Lys Ile Val Ile Val Ala Leu Pro Gly Ser Gly Lys Thr Thr Ile

1 5 10 15

Leu Asn Phe Val Lys Gln Lys Leu Pro Asp Val Lys Ile Val Asn Tyr 20 25 30 Gly Asp Val Met Leu Glu Ile Ala Lys Lys Arg Phe Gly Ile Gln His 35 40 45 Arg Asp Glu Met Arg Lys Lys Ile Pro Val Asp Glu Tyr Arg Lys Val

50 55 60

Gln Glu Glu Ala Ala Glu Tyr Ile Ala Ser Leu Thr Gly Asp Val Ile

65 70 75 80

Ile Asp Thr His Ala Ser Ile Lys Ile Gly Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly

85 90 95 Leu Pro Asp Arg Ile Ile Ser Lys Leu Lys Pro Asp Val Ile Leu Leu 100 105 110 Leu Glu Tyr Asp Pro Lys Val Ile Leu Glu Arg Arg Lys Lys Asp Pro 115 120 125 Asp Arg Phe Arg Asp Leu Glu Ser Glu Glu Glu Ile Glu Met His Gln

130 135 140

Gln Ala Asn Arg Tyr Tyr Ala Phe Ala Ala Ala Asn Ala Gly Glu Ser

145 150 155 160

Thr Val His Val Leu Asn Phe Arg Gly Lys Pro Glu Ser Arg Pro Phe

165 170 175 Glu His Ala Glu Val Ala Ala Glu Tyr Ile Val Asn Leu Ile Leu Arg 180 185 190 Thr Arg Gln Lys Ser 195

<210> 13

<211> 220

<212> PRT

<213> Thermotoga maritima

<400> 13

Met Met Ala Tyr Leu Val Phe Leu Gly Pro Pro Gly Ala Gly Lys Gly

1 5 10 15

Thr Tyr Ala Lys Arg Ile Gln Glu Lys Thr Gly Ile Pro His Ile Ser 20 25 30 Thr Gly Asp Ile Phe Arg Asp Ile Val Lys Lys Glu Asn Asp Glu Leu 35 40 45 Gly Lys Lys Ile Lys Glu Ile Met Glu Lys Gly Glu Leu Val Pro Asp

50 55 60

Glu Leu Val Asn Glu Val Val Lys Arg Arg Leu Ser Glu Lys Asp Cys

65 70 75 80

Glu Lys Gly Phe Ile Leu Asp Gly Tyr Pro Arg Thr Val Ala Gln Ala

85 90 95 Glu Phe Leu Asp Ser Phe Leu Glu Ser Gln Asn Lys Gln Leu Thr Ala 100 105 110 Ala Val Leu Phe Asp Val Pro Glu Asp Val Val Val Gln Arg Leu Thr 115 120 125 Ser Arg Arg Ile Cys Pro Lys Cys Gly Arg Ile Tyr Asn Met Ile Ser

130 135 140

Leu Pro Pro Lys Glu Asp Glu Leu Cys Asp Asp Cys Lys Val Lys Leu

145 150 155 160

Val Gln Arg Asp Asp Asp Lys Glu Glu Thr Val Arg His Arg Tyr Lys

165 170 175 Val Tyr Leu Glu Lys Thr Gln Pro Val Ile Asp Tyr Tyr Gly Lys Lys 180 185 190

Gly Ile Leu Lys Arg Val Asp Gly Thr Ile Gly Ile Asp Asn Val Val 195 200 205 Ala Glu Val Leu Lys Ile Ile Gly Trp Ser Asp Lys 210 215 220

<210> 14

<211> 204

<212> PRT

<213> Aeropyrum pernix

<400> 14

Met Lys Val Arg His Pro Phe Lys Val Val Val Val Thr Gly Val Pro

1 5 10 15

Gly Val Gly Lys Thr Thr Val Ile Lys Glu Leu Gln Gly Leu Ala Glu 20 25 30 Lys Glu Gly Val Lys Leu His Ile Val Asn Phe Gly Ser Phe Met Leu 35 40 45 Asp Thr Ala Val Lys Leu Gly Leu Val Glu Asp Arg Asp Lys Ile Arg

50 55 60

Thr Leu Pro Leu Arg Arg Gln Leu Glu Leu Gln Arg Glu Ala Ala Lys

65 70 75 80

Arg Ile Val Ala Glu Ala Ser Lys Ala Leu Gly Gly Asp Gly Val Leu

85 90 95 Ile Ile Asp Thr His Ala Leu Val Lys Thr Val Ala Gly Tyr Trp Pro 100 105 110 Gly Leu Pro Lys His Val Leu Asp Glu Leu Lys Pro Asp Met Ile Ala 115 120 125 Val Val Glu Ala Ser Pro Glu Glu Val Ala Ala Arg Gln Ala Arg Asp

130 135 140

Thr Thr Arg Tyr Arg Val Asp Ile Gly Gly Val Glu Gly Val Lys Arg

145 150 155 160

Leu Met Glu Asn Ala Arg Ala Ala Ser Ile Ala Ser Ala Ile Gln Tyr

165 170 175 Ala Ser Thr Val Ala Ile Val Glu Asn Arg Glu Gly Glu Ala Ala Lys 180 185 190 Ala Ala Glu Glu Leu Leu Arg Leu Ile Lys Asn Leu 195 200

<210> 15

<211> 216

<212> PRT

<213> Archaeoglobus fulgidus

<400> 15

Met Asn Leu Ile Phe Leu Gly Pro Pro Gly Ala Gly Lys Gly Thr Gln

1 5 10 15

Ala Lys Arg Val Ser Glu Lys Tyr Gly Ile Pro Gln Ile Ser Thr Gly 20 25 30 Asp Met Leu Arg Glu Ala Val Ala Lys Gly Thr Glu Leu Gly Lys Lys 35 40 45 Ala Lys Glu Tyr Met Asp Lys Gly Glu Leu Val Pro Asp Glu Val Val

50 55 60

Ile Gly Ile Val Lys Glu Arg Leu Gln Gln Pro Asp Cys Glu Lys Gly

65 70 75 80

Phe Ile Leu Asp Gly Phe Pro Arg Thr Leu Ala Gln Ala Glu Ala Leu

85 90 95 Asp Glu Met Leu Lys Glu Leu Asn Lys Lys Ile Asp Ala Val Ile Asn 100 105 110 Val Val Val Pro Glu Glu Glu Val Val Lys Arg Ile Thr Tyr Arg Arg 115 120 125 Thr Cys Arg Asn Cys Gly Ala Val Tyr His Leu Ile Tyr Ala Pro Pro 130 135 140

Lys Glu Asp Asn Lys Cys Asp Lys Cys Gly Gly Glu Leu Tyr Gln Arg

145 150 155 160

Asp Asp Lys Glu Glu Thr Val Arg Glu Arg Tyr Arg Val Tyr Lys Gln 165 170 175 Asn Thr Glu Pro Leu Ile Asp Tyr Tyr Arg Lys Lys Gly Ile Leu Tyr 180 185 190 Asp Val Asp Gly Thr Lys Asp Ile Glu Gly Val Trp Lys Glu Ile Glu 195 200 205 Ala Ile Leu Glu Lys Ile Lys Ser 210 215

<210> 16

<211> 220

<212> PRT

<213> Pyrococcus abyssi

<400> 16

Met Asn Ile Leu Ile Phe Gly Pro Pro Gly Ser Gly Lys Ser Thr Gln

1 5 10 15

Ala Arg Arg Ile Thr Glu Arg Tyr Gly Leu Thr Tyr Ile Ala Ser Gly 20 25 30 Asp Ile Ile Arg Ala Glu Ile Lys Ala Arg Thr Pro Leu Gly Ile Glu 35 40 45 Met Glu Arg Tyr Leu Ser Arg Gly Asp Leu Ile Pro Asp Thr Ile Val

50 55 60

Asn Thr Leu Ile Ile Ser Lys Leu Arg Arg Val Arg Glu Asn Phe Ile

65 70 75 80

Met Asp Gly Tyr Pro Arg Thr Pro Glu Gln Val Ile Thr Leu Glu Asn

85 90 95 Tyr Leu Tyr Asp His Gly Ile Lys Leu Asp Val Ala Ile Asp Ile Tyr 100 105 110 Ile Thr Lys Glu Glu Ser Val Arg Arg Ile Ser Gly Arg Arg Ile Cys 115 120 125 Ser Lys Cys Gly Ala Val Tyr His Val Glu Phe Asn Pro Pro Lys Val

130 135 140

Pro Gly Lys Cys Asp Ile Cys Gly Gly Glu Leu Ile Gln Arg Pro Asp

145 150 155 160

Asp Arg Pro Glu Ile Val Glu Lys Arg Tyr Asp Ile Tyr Ser Lys Asn

165 170 175 Met Glu Pro Ile Ile Lys Phe Tyr Gln Lys Gln Gly Ile Tyr Val Arg 180 185 190 Ile Asp Gly His Gly Ser Ile Asp Glu Val Trp Glu Arg Ile Arg Pro 195 200 205 Leu Leu Asp Tyr Ile Tyr Asn Gln Glu Asn Arg Arg 210 215 220

<210> 17

<211> 196

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Síntetica

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (61)..(61)

<223> El aminoácido "X" puede ser K o E.

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (75)..(75)

<223> El aminoácido “X” puede ser T o A.

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (98)..(98)

<223> El aminoácido “X” puede ser M o L.

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (157)..(157)

<223> El aminoácido “X” puede ser A, o un residuo hidrófobo pequeño (por ejemplo, I o L) o un residuo hidrófobo grande (por ejemplo, F), que incrementa la estabilidad térmica de la enzima.

<400> 17

Met Pro Phe Val Val Ile Ile Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Ser

1 5 10 15

Thr Ile Thr Arg Leu Ala Leu Gln Arg Thr Lys Ala Lys Phe Arg Leu 20 25 30 Ile Asn Phe Gly Asp Leu Met Phe Glu Glu Ala Val Lys Ala Gly Leu 35 40 45 Val Lys His Arg Asp Glu Met Arg Lys Leu Pro Leu Xaa Ile Gln Arg

50 55 60

Glu Leu Gln Met Lys Ala Ala Lys Lys Ile Xaa Glu Met Ala Lys Glu

65 70 75 80

His Pro Ile Leu Val Asp Thr His Ala Thr Ile Lys Thr Pro His Gly

85 90 95 Tyr Xaa Leu Gly Leu Pro Tyr Glu Val Val Lys Thr Leu Asn Pro Asn 100 105 110 Phe Ile Val Ile Ile Glu Ala Thr Pro Ser Glu Ile Leu Gly Arg Arg 115 120 125 Leu Arg Asp Leu Lys Arg Asp Arg Asp Val Glu Thr Glu Glu Gln Ile

130 135 140

Gln Arg His Gln Asp Leu Asn Arg Ala Ala Ala Ile Xaa Tyr Ala Met

145 150 155 160

His Ser Asn Ala Leu Ile Lys Ile Ile Glu Asn His Glu Asp Lys Gly

165 170 175 Leu Glu Glu Ala Val Asn Glu Leu Val Lys Ile Leu Asp Leu Ala Val 180 185 190 Asn Glu Tyr Ala 195

<210> 18

<211> 196

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Síntética

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (47)..(47)

<223> El aminoácido “X” puede ser G, o puede ser cualquier otro residuo que incrementa la estabilidad térmica de la enzima.

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (157)..(157)

<223> El aminoácido “X” puede ser A, o un residuo hidrófobo pequeño (por ejemplo, I o L) o un residuo hidrófobo

grande (por ejemplo, F), que incrementa la estabilidad térmica de la enzima.

<400> 18

Met Pro Phe Val Val Ile Ile Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Ser

1 5 10 15

Thr Ile Thr Lys Leu Ala Leu Gln Arg Thr Arg Ala Lys Phe Lys Leu 20 25 30 Ile Asn Phe Gly Asp Leu Met Phe Glu Glu Ala Leu Lys Leu Xaa Leu 35 40 45 Val Lys His Arg Asp Glu Met Arg Lys Leu Pro Leu Glu Val Gln Arg

50 55 60

Glu Leu Gln Met Asn Ala Ala Lys Lys Ile Ala Glu Met Ala Lys Asn

65 70 75 80

Tyr Pro Ile Leu Leu Asp Thr His Ala Thr Ile Lys Thr Pro His Gly

85 90 95 Tyr Leu Leu Gly Leu Pro Tyr Glu Val Ile Lys Ile Leu Asn Pro Asn 100 105 110 Phe Ile Val Ile Ile Glu Ala Thr Pro Ser Glu Ile Leu Gly Arg Arg 115 120 125 Leu Arg Asp Leu Lys Arg Asp Arg Asp Val Glu Thr Glu Glu Gln Ile

130 135 140

Gln Arg His Gln Asp Leu Asn Arg Ala Ala Ala Ile Xaa Tyr Ala Met

145 150 155 160

His Ser Asn Ala Leu Ile Lys Ile Ile Glu Asn His Glu Asp Lys Gly

165 170 175 Leu Glu Glu Ala Val Asn Glu Leu Val Lys Ile Leu Asp Leu Ala Val 180 185 190 Lys Glu Tyr Ala 195

<210> 19

<211> 194

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (103)..(103)

<223> El aminoácido “X” puede ser A o M.

<400> 19

Met Lys Ile Gly Ile Val Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Ser Thr

1 5 10 15

Val Leu Ala Lys Val Lys Glu Ile Leu Asp Asn Gln Gly Ile Asn Asn 20 25 30 Lys Ile Ile Asn Tyr Gly Asp Phe Met Leu Ala Thr Ala Leu Lys Leu 35 40 45 Gly Tyr Ala Lys Asp Arg Asp Glu Met Arg Lys Leu Ser Val Glu Lys

50 55 60

Gln Lys Lys Leu Gln Ile Asp Ala Ala Lys Gly Ile Ala Glu Glu Ala

65 70 75 80

Arg Ala Gly Gly Glu Gly Tyr Leu Phe Ile Asp Thr His Ala Val Ile

85 90 95 Arg Thr Pro Ser Gly Tyr Xaa Pro Gly Leu Pro Ser Tyr Val Ile Thr 100 105 110 Glu Ile Asn Pro Ser Val Ile Phe Leu Leu Glu Ala Asp Pro Lys Ile 115 120 125 Ile Leu Ser Arg Gln Lys Arg Asp Thr Thr Arg Asn Arg Asn Asp Tyr 130 135 140 Ser Asp Glu Ser Val Ile Leu Glu Thr Ile Asn Phe Ala Arg Tyr Ala

145 150 155 160 Ala Thr Ala Ser Ala Val Leu Ala Gly Ser Thr Val Lys Val Ile Val 165 170 175 Asn Val Glu Gly Asp Pro Ser Ile Ala Ala Asn Glu Ile Ile Arg Ser 180 185 190 Met Lys

<210> 20

<211> 403

<212> PRT

<213> Thermotoga maritima

<400> 20

Met Arg Val Leu Val Ile Asn Ser Gly Ser Ser Ser Ile Lys Tyr Gln

1 5 10 15

Leu Ile Glu Met Glu Gly Glu Lys Val Leu Cys Lys Gly Ile Ala Glu 20 25 30 Arg Ile Gly Ile Glu Gly Ser Arg Leu Val His Arg Val Gly Asp Glu 35 40 45 Lys His Val Ile Glu Arg Glu Leu Pro Asp His Glu Glu Ala Leu Lys

50 55 60

Leu Ile Leu Asn Thr Leu Val Asp Glu Lys Leu Gly Val Ile Lys Asp

65 70 75 80

Leu Lys Glu Ile Asp Ala Val Gly His Arg Val Val His Gly Gly Glu

85 90 95 Arg Phe Lys Glu Ser Val Leu Val Asp Glu Glu Val Leu Lys Ala Ile 100 105 110 Glu Glu Val Ser Pro Leu Ala Pro Leu His Asn Pro Ala Asn Leu Met 115 120 125 Gly Ile Lys Ala Ala Met Lys Leu Leu Pro Gly Val Pro Asn Val Ala

130 135 140

Val Phe Asp Thr Ala Phe His Gln Thr Ile Pro Gln Lys Ala Tyr Leu

145 150 155 160

Tyr Ala Ile Pro Tyr Glu Tyr Tyr Glu Lys Tyr Lys Ile Arg Arg Tyr

165 170 175 Gly Phe His Gly Thr Ser His Arg Tyr Val Ser Lys Arg Ala Ala Glu 180 185 190 Ile Leu Gly Lys Lys Leu Glu Glu Leu Lys Ile Ile Thr Cys His Ile 195 200 205 Gly Asn Gly Ala Ser Val Ala Ala Val Lys Tyr Gly Lys Cys Val Asp

210 215 220

Thr Ser Met Gly Phe Thr Pro Leu Glu Gly Leu Val Met Gly Thr Arg

225 230 235 240

Ser Gly Asp Leu Asp Pro Ala Ile Pro Phe Phe Ile Met Glu Lys Glu

245 250 255 Gly Ile Ser Pro Gln Glu Met Tyr Asp Ile Leu Asn Lys Lys Ser Gly 260 265 270 Val Tyr Gly Leu Ser Lys Gly Phe Ser Ser Asp Met Arg Asp Ile Glu 275 280 285 Glu Ala Ala Leu Lys Gly Asp Glu Trp Cys Lys Leu Val Leu Glu Ile

290 295 300

Tyr Asp Tyr Arg Ile Ala Lys Tyr Ile Gly Ala Tyr Ala Ala Ala Met

305 310 315 320

Asn Gly Val Asp Ala Ile Val Phe Thr Ala Gly Val Gly Glu Asn Ser

325 330 335 Pro Ile Thr Arg Glu Asp Val Cys Ser Tyr Leu Glu Phe Leu Gly Val 340 345 350 Lys Leu Asp Lys Gln Lys Asn Glu Glu Thr Ile Arg Gly Lys Glu Gly 355 360 365 Ile Ile Ser Thr Pro Asp Ser Arg Val Lys Val Leu Val Val Pro Thr

370 375 380

Asn Glu Glu Leu Met Ile Ala Arg Asp Thr Lys Glu Ile Val Glu Lys

385 390 395 400

Ile Gly Arg

<210> 21

<211> 478

<212> PRT

<213> Pyrococcus horikoshii

<400> 21

Met Arg Arg Met Lys Leu Pro Ser His Lys Thr Lys Ile Val Ala Thr

1 5 10 15

Ile Gly Pro Ala Thr Asn Ser Lys Lys Met Ile Lys Lys Leu Ile Glu 20 25 30 Ala Gly Met Asn Val Ala Arg Ile Asn Phe Ser His Gly Thr Phe Glu 35 40 45 Glu His Ala Lys Ile Ile Glu Met Val Arg Glu Gln Ser Gln Lys Leu

50 55 60

Asp Arg Arg Val Ala Ile Leu Ala Asp Leu Pro Gly Leu Lys Ile Arg

65 70 75 80

Val Gly Glu Ile Lys Gly Gly Tyr Val Glu Leu Glu Arg Gly Glu Lys

85 90 95 Val Thr Leu Thr Thr Lys Asp Ile Glu Gly Asp Glu Thr Thr Ile Pro 100 105 110 Val Glu Tyr Lys Asp Phe Pro Lys Leu Val Ser Lys Gly Asp Val Ile 115 120 125 Tyr Leu Ser Asp Gly Tyr Ile Val Leu Arg Val Glu Asp Val Lys Glu

130 135 140

Asn Glu Val Glu Ala Val Val Ile Ser Gly Gly Lys Leu Phe Ser Arg

145 150 155 160

Lys Gly Ile Asn Ile Pro Lys Ala Tyr Leu Pro Val Glu Ala Ile Thr

165 170 175 Pro Arg Asp Ile Glu Ile Met Lys Phe Ala Ile Glu His Gly Val Asp 180 185 190 Ala Ile Gly Leu Ser Phe Val Gly Asn Val Tyr Asp Val Leu Lys Ala 195 200 205 Lys Ser Phe Leu Glu Arg Asn Gly Ala Gly Asp Thr Phe Val Ile Ala

210 215 220

Lys Ile Glu Arg Pro Asp Ala Val Arg Asn Phe Asn Glu Ile Leu Asn

225 230 235 240

Ala Ala Asp Gly Ile Met Ile Ala Arg Gly Asp Leu Gly Val Glu Met

245 250 255 Pro Ile Glu Gln Leu Pro Ile Leu Gln Lys Arg Leu Ile Arg Lys Ala 260 265 270 Asn Met Glu Gly Lys Pro Val Ile Thr Ala Thr Gln Met Leu Val Ser 275 280 285 Met Thr Met Glu Lys Val Pro Thr Arg Ala Glu Val Thr Asp Val Ala

290 295 300

Asn Ala Ile Leu Asp Gly Thr Asp Ala Val Met Leu Ser Glu Glu Thr

305 310 315 320

Ala Val Gly Lys Phe Pro Ile Glu Ala Val Glu Met Met Ala Arg Ile

325 330 335 Ala Lys Val Thr Glu Glu Tyr Arg Glu Ser Phe Gly Ile Thr Arg Met 340 345 350 Arg Glu Phe Leu Glu Gly Thr Lys Arg Gly Thr Ile Lys Glu Ala Ile 355 360 365 Thr Arg Ser Ile Ile Asp Ala Ile Cys Thr Ile Gly Ile Lys Phe Ile

370 375 380

Leu Thr Pro Thr Lys Thr Gly Arg Thr Ala Arg Leu Ile Ser Arg Phe

385 390 395 400

Lys Pro Lys Gln Trp Ile Leu Ala Phe Ser Thr Arg Glu Lys Val Cys

405 410 415 Asn Asn Leu Met Phe Ser Tyr Gly Val Tyr Pro Phe Cys Met Glu Glu 420 425 430 Gly Phe Asn Glu Asn Asp Ile Val Arg Leu Ile Lys Gly Leu Gly Leu 435 440 445 Val Gly Ser Asp Asp Ile Val Leu Met Thr Glu Gly Lys Pro Ile Glu

450 455 460

Lys Thr Val Gly Thr Asn Ser Ile Lys Ile Phe Gln Ile Ala

465 470 475

<210> 22

<211> 452

<212> PRT

<213> Sulfolobus solfataricus

<400> 22

Met Arg Lys Thr Lys Ile Val Ala Thr Leu Gly Pro Ser Ser Glu Glu

1 5 10 15

Lys Val Lys Glu Leu Ala Glu Tyr Val Asp Val Phe Arg Ile Asn Phe 20 25 30 Ala His Gly Asp Glu Thr Ser His Arg Lys Tyr Phe Asp Leu Ile Arg 35 40 45 Thr Tyr Ala Pro Glu Ser Ser Ile Ile Val Asp Leu Pro Gly Pro Lys

50 55 60

Leu Arg Leu Gly Glu Leu Lys Glu Pro Ile Glu Val Lys Lys Gly Asp

65 70 75 80

Lys Ile Val Phe Ser Gln Lys Asp Gly Ile Pro Val Asp Asp Glu Leu

85 90 95 Phe Tyr Ser Ala Val Lys Glu Asn Ser Asp Ile Leu Ile Ala Asp Gly 100 105 110 Thr Ile Arg Val Arg Val Lys Ser Lys Ala Lys Asp Arg Val Glu Gly 115 120 125 Thr Val Ile Glu Gly Gly Ile Leu Leu Ser Arg Lys Gly Ile Asn Ile

130 135 140

Pro Asn Val Asn Leu Lys Ser Gly Ile Thr Asp Asn Asp Leu Lys Leu

145 150 155 160

Leu Lys Arg Ala Leu Asp Leu Gly Ala Asp Tyr Ile Gly Leu Ser Phe

165 170 175 Val Ile Ser Glu Asn Asp Val Lys Lys Val Lys Glu Phe Val Gly Asp 180 185 190 Glu Ala Trp Val Ile Ala Lys Ile Glu Lys Ser Glu Ala Leu Lys Asn 195 200 205 Leu Thr Asn Ile Val Asn Glu Ser Asp Gly Ile Met Val Ala Arg Gly

210 215 220

Asp Leu Gly Val Glu Thr Gly Leu Glu Asn Leu Pro Leu Ile Gln Arg

225 230 235 240

Arg Ile Val Arg Thr Ser Arg Val Phe Gly Lys Pro Val Ile Leu Ala

245 250 255 Thr Gln Val Leu Thr Ser Met Ile Asn Ser Pro Ile Pro Thr Arg Ala 260 265 270 Glu Ile Ile Asp Ile Ser Asn Ser Ile Met Gln Gly Val Asp Ser Ile 275 280 285 Met Leu Ser Asp Glu Thr Ala Ile Gly Asn Tyr Pro Val Glu Ser Val

290 295 300

Arg Thr Leu His Asn Ile Ile Ser Asn Val Glu Lys Ser Val Lys His

305 310 315 320

Arg Pro Ile Gly Pro Leu Asn Ser Glu Ser Asp Ala Ile Ala Leu Ala

325 330 335 Ala Val Asn Ala Ser Lys Val Ser Lys Ala Asp Val Ile Val Val Tyr 340 345 350 Ser Arg Ser Gly Asn Ser Ile Leu Arg Val Ser Arg Leu Arg Pro Glu 355 360 365 Arg Asn Ile Ile Gly Val Ser Pro Asp Pro Arg Leu Ala Lys Lys Phe

370 375 380

Lys Leu Cys Tyr Gly Val Ile Pro Ile Ser Ile Asn Lys Lys Met Gln

385 390 395 400

Ser Ile Asp Glu Ile Ile Asp Val Ser Ala Lys Leu Met Gln Glu Lys

405 410 415 Ile Lys Asp Leu Lys Phe Lys Lys Ile Val Ile Val Gly Gly Asp Pro 420 425 430 Lys Gln Glu Ala Gly Lys Thr Asn Phe Val Ile Val Lys Thr Leu Glu 435 440 445 Gln Gln Lys Lys 450

<210> 23

<211> 466

<212> PRT

<213> Thermotoga maritima

<400> 23

Met Arg Ser Thr Lys Ile Val Cys Thr Val Gly Pro Arg Thr Asp Ser

1 5 10 15

Tyr Glu Met Ile Glu Lys Met Ile Asp Leu Gly Val Asn Val Phe Arg 20 25 30 Ile Asn Thr Ser His Gly Asp Trp Asn Glu Gln Glu Gln Lys Ile Leu 35 40 45 Lys Ile Lys Asp Leu Arg Glu Lys Lys Lys Lys Pro Val Ala Ile Leu

50 55 60

Ile Asp Leu Ala Gly Pro Lys Ile Arg Thr Gly Tyr Leu Glu Lys Glu

65 70 75 80

Phe Val Glu Leu Lys Glu Gly Gln Ile Phe Thr Leu Thr Thr Lys Glu

85 90 95 Ile Leu Gly Asn Glu His Ile Val Ser Val Asn Leu Ser Ser Leu Pro 100 105 110 Lys Asp Val Lys Lys Gly Asp Thr Ile Leu Leu Ser Asp Gly Glu Ile 115 120 125 Val Leu Glu Val Ile Glu Thr Thr Asp Thr Glu Val Lys Thr Val Val

130 135 140

Lys Val Gly Gly Lys Ile Thr His Arg Arg Gly Val Asn Val Pro Thr

145 150 155 160

Ala Asp Leu Ser Val Glu Ser Ile Thr Asp Arg Asp Arg Glu Phe Ile

165 170 175 Lys Leu Gly Thr Leu His Asp Val Glu Phe Phe Ala Leu Ser Phe Val 180 185 190 Arg Lys Pro Glu Asp Val Leu Lys Ala Lys Glu Glu Ile Arg Lys His 195 200 205 Gly Lys Glu Ile Pro Val Ile Ser Lys Ile Glu Thr Lys Lys Ala Leu

210 215 220

Glu Arg Leu Glu Glu Ile Ile Lys Val Ser Asp Gly Ile Met Val Ala

225 230 235 240

Arg Gly Asp Leu Gly Val Glu Ile Pro Ile Glu Glu Val Pro Ile Val

245 250 255 Gln Lys Glu Ile Ile Lys Leu Ser Lys Tyr Tyr Ser Lys Pro Val Ile 260 265 270 Val Ala Thr Gln Ile Leu Glu Ser Met Ile Glu Asn Pro Phe Pro Thr 275 280 285 Arg Ala Glu Val Thr Asp Ile Ala Asn Ala Ile Phe Asp Gly Ala Asp

290 295 300

Ala Leu Leu Leu Thr Ala Glu Thr Ala Val Gly Lys His Pro Leu Glu

305 310 315 320

Ala Ile Lys Val Leu Ser Lys Val Ala Lys Glu Ala Glu Lys Lys Leu

325 330 335 Glu Phe Phe Arg Thr Ile Glu Tyr Asp Thr Ser Asp Ile Ser Glu Ala 340 345 350 Ile Ser His Ala Cys Trp Gln Leu Ser Glu Ser Leu Asn Ala Lys Leu 355 360 365 Ile Ile Thr Pro Thr Ile Ser Gly Ser Thr Ala Val Arg Val Ser Lys

370 375 380

Tyr Asn Val Ser Gln Pro Ile Val Ala Leu Thr Pro Glu Glu Lys Thr

385 390 395 400

Tyr Tyr Arg Leu Ser Leu Val Arg Lys Val Ile Pro Val Leu Ala Glu

405 410 415 Lys Cys Ser Gln Glu Leu Glu Phe Ile Glu Lys Gly Leu Lys Lys Val 420 425 430 Glu Glu Met Gly Leu Ala Glu Lys Gly Asp Leu Val Val Leu Thr Ser 435 440 445 Gly Val Pro Gly Lys Val Gly Thr Thr Asn Thr Ile Arg Val Leu Lys

450 455 460

Val Asp

<210> 24

<211> 477

<212> PRT

<213> Pyrococcus furiosus

<400> 24

Met Arg Arg Val Lys Leu Pro Ser His Lys Thr Lys Ile Val Ala Thr

1 5 10 15

Ile Gly Pro Ala Thr Asn Ser Arg Lys Met Ile Lys Gln Leu Ile Lys 20 25 30 Ala Gly Met Asn Val Ala Arg Ile Asn Phe Ser His Gly Ser Phe Glu 35 40 45 Glu His Ala Arg Val Ile Glu Ile Ile Arg Glu Glu Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Asp Arg Arg Val Ala Ile Leu Ala Asp Leu Pro Gly Leu Lys Ile Arg

65 70 75 80

Val Gly Glu Ile Lys Gly Gly Tyr Val Glu Leu Lys Arg Gly Glu Lys

85 90 95 Val Ile Leu Thr Thr Lys Asp Val Glu Gly Asp Glu Thr Thr Ile Pro 100 105 110 Val Asp Tyr Lys Gly Phe Pro Asn Leu Val Ser Lys Gly Asp Ile Ile 115 120 125 Tyr Leu Asn Asp Gly Tyr Ile Val Leu Lys Val Glu Asn Val Arg Glu

130 135 140

Asn Glu Val Glu Ala Val Val Leu Ser Gly Gly Lys Leu Phe Ser Arg

145 150 155 160

Lys Gly Val Asn Ile Pro Lys Ala Tyr Leu Pro Val Glu Ala Ile Thr

165 170 175 Pro Lys Asp Phe Glu Ile Met Lys Phe Ala Ile Glu His Gly Val Asp 180 185 190 Ala Ile Gly Leu Ser Phe Val Gly Ser Val Tyr Asp Val Leu Lys Ala 195 200 205 Lys Ser Phe Leu Glu Lys Asn Asn Ala Glu Asp Val Phe Val Ile Ala

210 215 220

Lys Ile Glu Arg Pro Asp Ala Val Arg Asn Phe Asp Glu Ile Leu Asn

225 230 235 240

Ala Ala Asp Gly Ile Met Ile Ala Arg Gly Asp Leu Gly Val Glu Met

245 250 255 Pro Ile Glu Gln Leu Pro Ile Leu Gln Lys Lys Leu Ile Arg Lys Ala 260 265 270 Asn Met Glu Gly Lys Pro Val Ile Thr Ala Thr Gln Met Leu Val Ser 275 280 285 Met Thr Thr Glu Lys Val Pro Thr Arg Ala Glu Val Thr Asp Val Ala

290 295 300

Asn Ala Ile Leu Asp Gly Thr Asp Ala Val Met Leu Ser Glu Glu Thr

305 310 315 320

Ala Ile Gly Lys Phe Pro Ile Glu Thr Val Glu Met Met Gly Lys Ile

325 330 335 Ala Lys Val Thr Glu Glu Tyr Arg Glu Ser Phe Gly Leu Ser Arg Ile 340 345 350 Arg Glu Phe Met Glu Ile Lys Lys Gly Thr Ile Lys Glu Ala Ile Thr 355 360 365 Arg Ser Ile Ile Asp Ala Ile Cys Thr Ile Asp Ile Lys Phe Ile Leu

370 375 380

Thr Pro Thr Arg Thr Gly Arg Thr Ala Arg Leu Ile Ser Arg Phe Lys

385 390 395 400

Pro Lys Gln Trp Ile Leu Ala Phe Ser Thr Asn Glu Arg Val Cys Asn

405 410 415 Asn Leu Met Phe Ser Tyr Gly Val Tyr Pro Phe Cys Leu Glu Glu Gly 420 425 430 Phe Asp Glu Asn Asp Ile Val Arg Leu Ile Lys Gly Leu Gly Leu Val 435 440 445 Glu Ser Asp Asp Met Val Leu Met Thr Glu Gly Lys Pro Ile Glu Lys

450 455 460

Thr Val Gly Thr Asn Ser Ile Lys Ile Phe Gln Ile Ala

465 470 475

<210> 25

<211> 408

<212> PRT

<213> Methanosarcina thermophila

<400> 25

Met Lys Val Leu Val Ile Asn Ala Gly Ser Ser Ser Leu Lys Tyr Gln

1 5 10 15

Leu Ile Asp Met Thr Asn Glu Ser Ala Leu Ala Val Gly Leu Cys Glu 20 25 30 Arg Ile Gly Ile Asp Asn Ser Ile Ile Thr Gln Lys Lys Phe Asp Gly 35 40 45 Lys Lys Leu Glu Lys Leu Thr Asp Leu Pro Thr His Lys Asp Ala Leu

50 55 60

Glu Glu Val Val Lys Ala Leu Thr Asp Asp Glu Phe Gly Val Ile Lys

65 70 75 80

Asp Met Gly Glu Ile Asn Ala Val Gly His Arg Val Val His Gly Gly

85 90 95 Glu Lys Phe Thr Thr Ser Ala Leu Tyr Asp Glu Gly Val Glu Lys Ala 100 105 110 Ile Lys Asp Cys Phe Glu Leu Ala Pro Leu His Asn Pro Pro Asn Met 115 120 125 Met Gly Ile Ser Ala Cys Ala Glu Ile Met Pro Gly Thr Pro Met Val

130 135 140

Ile Val Phe Asp Thr Ala Phe His Gln Thr Met Pro Pro Tyr Ala Tyr

145 150 155 160

Met Tyr Ala Leu Pro Tyr Asp Leu Tyr Glu Lys His Gly Val Arg Lys

165 170 175 Tyr Gly Phe His Gly Thr Ser His Lys Tyr Val Ala Glu Arg Ala Ala 180 185 190 Leu Met Leu Gly Lys Pro Ala Glu Glu Thr Lys Ile Ile Thr Cys His 195 200 205 Leu Gly Asn Gly Ser Ser Ile Thr Ala Val Glu Gly Gly Lys Ser Val

210 215 220

Glu Thr Ser Met Gly Phe Thr Pro Leu Glu Gly Leu Ala Met Gly Thr

225 230 235 240

Arg Cys Gly Ser Ile Asp Pro Ala Ile Val Pro Phe Leu Met Glu Lys

245 250 255 Glu Gly Leu Thr Thr Arg Glu Ile Asp Thr Leu Met Asn Lys Lys Ser 260 265 270 Gly Val Leu Gly Val Ser Gly Leu Ser Asn Asp Phe Arg Asp Leu Asp 275 280 285 Glu Ala Ala Ser Lys Gly Asn Arg Lys Ala Glu Leu Ala Leu Glu Ile

290 295 300

Phe Ala Tyr Lys Val Lys Lys Phe Ile Gly Glu Tyr Ser Ala Val Leu

305 310 315 320

Asn Gly Ala Asp Ala Val Val Phe Thr Ala Gly Ile Gly Glu Asn Ser

325 330 335 Ala Ser Ile Arg Lys Arg Ile Leu Thr Gly Leu Asp Gly Ile Gly Ile 340 345 350 Lys Ile Asp Asp Glu Lys Asn Lys Ile Arg Gly Gln Glu Ile Asp Ile 355 360 365 Ser Thr Pro Asp Ala Lys Val Arg Val Phe Val Ile Pro Thr Asn Glu

370 375 380

Glu Leu Ala Ile Ala Arg Glu Thr Lys Glu Ile Val Glu Thr Glu Val

385 390 395 400

Lys Leu Arg Ser Ser Ile Pro Val 405

<210> 26

<211> 585

<212> ADN

<213> Sulfolobus acidocaldarius

<400> 26

atgaagattg gtattgtaac tggaattcct ggtgtaggga aaagtactgt cttggctaaa 60 gttaaagaga tattggataa tcaaggtata aataacaaga tcataaatta tggagatttt 120 atgttagcaa cagcattaaa attaggctat gctaaagata gagacgaaat gagaaaatta 180 tctgtagaaa agcagaagaa attgcagatt gatgcggcta aaggtatagc tgaagaggca 240 agagcaggtg gagaaggata tctgttcata gatacgcatg ctgtgatacg tacaccctct 300 ggatatttac ctggtttacc gtcatatgta attacagaaa taaatccgtc tgttatcttt 360 ttactggaag ctgatcctaa gataatatta tcaaggcaaa agagagatac aacaaggaat 420 agaaatgatt atagtgacga atcagttata ttagaaacca taaacttcgc tagatatgca 480 gctactgctt ctgcagtatt agccggttct actgttaagg taattgtaaa cgtggaagga 540 gatcctagta tagcagctaa tgagataata aggtctatga agtaa 585

<210> 27

<211> 585

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 27

atgaaaatcg gtatcgttac cggtatcccg ggtgttggta aatctaccgt tctggctaaa 60 gttaaagaaa tcctggacaa ccagggtatc aacaacaaaa tcatcaacta cggtgacttc 120 atgctggcta ccgctctgaa actgggttac gctaaagacc gtgacgaaat gcgtaaactg 180 tctgttgaaa aacagaaaaa actgcagatc gacgctgcta aaggtatcgc tgaagaagct 240 cgtgctggtg gtgaaggtta cctgttcatc gacacccacg ctgttatccg taccccgtct 300 ggttacctgc cgggtctgcc gtcttacgtt atcaccgaaa tcaacccgtc tgttatcttc 360 ctgctggaag ctgacccgaa aatcatcctg tctcgtcaga aacgtgacac cacccgtaac 420 cgtaacgact actctgacga atctgttatc ctggaaacca tcaacttcgc tcgttacgct 480 gctaccgctt ctgctgttct ggctggttct accgttaaag ttatcgttaa cgttgaaggt 540 gacccgtcta tcgctgctaa cgaaatcatc cgttctatga aatag 585

<210> 28

<211> 663

<212> ADN

<213> Thermotoga maritima

<400> 28

atgatggcgt accttgtctt tctaggacct ccaggtgcag gaaaaggaac ctacgcaaag 60 agattgcagg aaataacggg gattcctcat atatccaccg gtgacatttt cagggacatt 120 gtaaaaaaag agaacgacga gcttgggaaa aagataaaag agatcatgga aaggggagaa 180 ctcgttccgg acgaactcgt gaacgaggtt gtgaaaagaa gactctcaga aaaagattgt 240 gaaagaggat tcatactgga cggctatcca agaaccgttg ctcaggcgga attcctcgac 300 ggctttttga aaactcaaaa caaagagctc acggctgctg tactctttga agttcctgag 360 gaagtggtcg ttcagaggct cacggccaga aggatctgcc cgaaatgtgg aagaatttac 420 aatttgattt cgctccctcc aaaagaagac gaactgtgcg atgattgtaa agtgaagctc 480 gttcagagag aagacgacaa agaagaaaca gtgagacaca gatacaaggt ttatctcgaa 540 aagacacagc cagtgattga ttactacgat aaaaagggca ttctcaaacg agtggatggt 600 accataggaa tagacaacgt gatcgctgaa gtgttaaaga taatagggtg gagtgataaa 660 tga 663

<210> 29

<211> 660

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 29

atgatggcct atctggtttt tcttggtcca ccgggggcag gcaaaggtac atatgcgaaa 60 cgtttacagg aaatcaccgg catcccgcac attagcacgg gcgacatttt tcgtgatatt 120 gtcaaaaagg aaaatgacga attaggtaag aaaattaaag aaattatgga gcgcggcgag 180 ttggtgccgg acgaactggt gaatgaagtt gtcaaacgtc ggctgtctga aaaggattgc 240 gaacgtggct ttattttgga cggttacccg cgtacagtag ctcaggcaga gtttctcgac 300 ggcttcctga agactcagaa taaggagtta acggctgcgg tcctgttcga ggtgcctgaa 360 gaggtggtcg ttcagcgtct gaccgcgcgg cgtatctgcc cgaagtgtgg tcgtatttac 420 aacctgattt cacttcctcc aaaagaagat gaactgtgtg atgactgcaa agtaaaactg 480 gtgcaacgcg aagatgataa agaggaaact gtgcgccatc gctacaaagt atatctggaa 540 aaaacccaac cggttatcga ttattatgat aaaaaaggca ttttgaaacg cgttgatggg 600

accatcggca tcgataacgt gattgccgaa gttctcaaaa tcattgggtg gagtgataaa 660

<210> 30

<211> 651

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 30

atgaacctga ttttcctggg tccgcctggg gcaggcaaag gcacccaggc gaaacgtgtg 60 tctgaaaagt acggtatccc gcagattagt accggcgata tgctgcgtga agcggttgct 120 aagggtacgg aactggggaa aaaggcgaaa gaatatatgg acaaagggga acttgttccg 180 gatgaagtag ttattggaat cgtgaaagaa cgcctccagc aaccggattg tgagaagggc 240 tttattctgg acggttttcc gcgtacgtta gcacaagccg aagctctgga cgaaatgtta 300 aaagaattga ataagaaaat tgacgccgta atcaacgtgg tcgtaccgga agaggaagtt 360 gtcaagcgta ttacctatcg tcgcacttgc cgcaattgcg gcgccgtgta ccatctcatt 420 tatgcacctc caaaagagga taataaatgt gataaatgcg gcggtgagct ttatcagcgt 480 gatgacgata aagaagagac agtccgcgag cgttaccgtg tgtataaaca gaacacagag 540 ccattgatcg attattaccg taaaaaggga atcctgtatg atgtggatgg tactaaagac 600 atcgaaggag tttggaaaga aattgaggcg attctggaaa aaattaaaag c 651

<210> 31

<211> 194

<212> PRT

<213> Sulfolobus acidocaldarius

<400> 31

Met Lys Ile Gly Ile Val Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Ser Thr 1 5 10 15 Val Leu Ala Lys Val Lys Glu Ile Leu Asp Asn Gln Gly Ile Asn Asn 20 25 30 Lys Ile Ile Asn Tyr Gly Asp Phe Met Leu Ala Thr Ala Leu Lys Leu 35 40 45 Gly Tyr Ala Lys Asp Arg Asp Glu Met Arg Lys Leu Ser Val Glu Lys 50 55 60 Gln Lys Lys Leu Gln Ile Asp Ala Ala Lys Gly Ile Ala Glu Glu Ala 65 70 75 80 Arg Ala Gly Gly Glu Gly Tyr Leu Phe Ile Asp Thr His Ala Val Ile 85 90 95 Arg Thr Pro Ser Gly Tyr Leu Pro Gly Leu Pro Ser Tyr Val Ile Thr 100 105 110 Glu Ile Asn Pro Ser Val Ile Phe Leu Leu Glu Ala Asp Pro Lys Ile 115 120 125 Ile Leu Ser Arg Gln Lys Arg Asp Thr Thr Arg Asn Arg Asn Asp Tyr 130 135 140 Ser Asp Glu Ser Val Ile Leu Glu Thr Ile Asn Phe Ala Arg Tyr Ala 145 150 155 160 Ala Thr Ala Ser Ala Val Leu Ala Gly Ser Thr Val Lys Val Ile Val 165 170 175 Asn Val Glu Gly Asp Pro Ser Ile Ala Ala Asn Glu Ile Ile Arg Ser 180 185 190 Met Lys

<210> 32

<211> 220

<212> PRT

<213> Thermotoga maritima

<400> 32

Met Met Ala Tyr Leu Val Phe Leu Gly Pro Pro Gly Ala Gly Lys Gly

1 5 10 15

Thr Tyr Ala Lys Arg Leu Gln Glu Ile Thr Gly Ile Pro His Ile Ser 20 25 30 Thr Gly Asp Ile Phe Arg Asp Ile Val Lys Lys Glu Asn Asp Glu Leu 35 40 45 Gly Lys Lys Ile Lys Glu Ile Met Glu Arg Gly Glu Leu Val Pro Asp

50 55 60

Glu Leu Val Asn Glu Val Val Lys Arg Arg Leu Ser Glu Lys Asp Cys

65 70 75 80

Glu Arg Gly Phe Ile Leu Asp Gly Tyr Pro Arg Thr Val Ala Gln Ala

85 90 95 Glu Phe Leu Asp Gly Phe Leu Lys Thr Gln Asn Lys Glu Leu Thr Ala 100 105 110 Ala Val Leu Phe Glu Val Pro Glu Glu Val Val Val Gln Arg Leu Thr 115 120 125 Ala Arg Arg Ile Cys Pro Lys Cys Gly Arg Ile Tyr Asn Leu Ile Ser

130 135 140

Leu Pro Pro Lys Glu Asp Glu Leu Cys Asp Asp Cys Lys Val Lys Leu

145 150 155 160

Val Gln Arg Glu Asp Asp Lys Glu Glu Thr Val Arg His Arg Tyr Lys

165 170 175 Val Tyr Leu Glu Lys Thr Gln Pro Val Ile Asp Tyr Tyr Asp Lys Lys 180 185 190 Gly Ile Leu Lys Arg Val Asp Gly Thr Ile Gly Ile Asp Asn Val Ile 195 200 205 Ala Glu Val Leu Lys Ile Ile Gly Trp Ser Asp Lys 210 215 220

<210> 33

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> sustrato de transglutaminasa

<400> 33

Met Asn Gln Glu Gln Val Ser Pro Leu Gly Gly 1 5 10

<210> 34

<211> 204

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de proteína de adenilato quinasa termoestable de Sulfolobus acidcaldarius fusionada al extremo N-terminal con una secuencia de sustrato de transglutaminasa (Factor XIII)

<400> 34

Met Asn Gln Glu Gln Val Ser Pro Leu Gly Gly Lys Ile Gly Ile Val

1 5 10 15

Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Ser Thr Val Leu Ala Lys Val Lys 20 25 30 Glu Ile Leu Asp Asn Gln Gly Ile Asn Asn Lys Ile Ile Asn Tyr Gly 35 40 45 Asp Phe Met Leu Ala Thr Ala Leu Lys Leu Gly Tyr Ala Lys Asp Arg

50 55 60

Asp Glu Met Arg Lys Leu Ser Val Glu Lys Gln Lys Lys Leu Gln Ile

65 70 75 80

Asp Ala Ala Lys Gly Ile Ala Glu Glu Ala Arg Ala Gly Gly Glu Gly

85 90 95 Tyr Leu Phe Ile Asp Thr His Ala Val Ile Arg Thr Pro Ser Gly Tyr 100 105 110 Leu Pro Gly Leu Pro Ser Tyr Val Ile Thr Glu Ile Asn Pro Ser Val 115 120 125 Ile Phe Leu Leu Glu Ala Asp Pro Lys Ile Ile Leu Ser Arg Gln Lys

130 135 140

Arg Asp Thr Thr Arg Asn Arg Asn Asp Tyr Ser Asp Glu Ser Val Ile

145 150 155 160

Leu Glu Thr Ile Asn Phe Ala Arg Tyr Ala Ala Thr Ala Ser Ala Val

165 170 175 Leu Ala Gly Ser Thr Val Lys Val Ile Val Asn Val Glu Gly Asp Pro 180 185 190 Ser Ile Ala Ala Asn Glu Ile Ile Arg Ser Met Lys 195 200

<210> 35

<211> 204

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de proteína de adenilato quinasa termoestable de Sulfolobus acidcaldarius fusionada al extremo C-terminal con una secuencia de sustrato de transglutaminasa (Factor XIII)

<400> 35

Met Lys Ile Gly Ile Val Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Ser Thr

1 5 10 15

Val Leu Ala Lys Val Lys Glu Ile Leu Asp Asn Gln Gly Ile Asn Asn 20 25 30 Lys Ile Ile Asn Tyr Gly Asp Phe Met Leu Ala Thr Ala Leu Lys Leu 35 40 45 Gly Tyr Ala Lys Asp Arg Asp Glu Met Arg Lys Leu Ser Val Glu Lys

50 55 60

Gln Lys Lys Leu Gln Ile Asp Ala Ala Lys Gly Ile Ala Glu Glu Ala

65 70 75 80

Arg Ala Gly Gly Glu Gly Tyr Leu Phe Ile Asp Thr His Ala Val Ile

85 90 95 Arg Thr Pro Ser Gly Tyr Leu Pro Gly Leu Pro Ser Tyr Val Ile Thr 100 105 110 Glu Ile Asn Pro Ser Val Ile Phe Leu Leu Glu Ala Asp Pro Lys Ile 115 120 125 Ile Leu Ser Arg Gln Lys Arg Asp Thr Thr Arg Asn Arg Asn Asp Tyr

130 135 140

Ser Asp Glu Ser Val Ile Leu Glu Thr Ile Asn Phe Ala Arg Tyr Ala

145 150 155 160

Ala Thr Ala Ser Ala Val Leu Ala Gly Ser Thr Val Lys Val Ile Val

165 170 175 Asn Val Glu Gly Asp Pro Ser Ile Ala Ala Asn Glu Ile Ile Arg Ser 180 185 190 Met Lys Gly Gly Asn Gln Glu Gln Val Ser Pro Leu 195 200

<210> 36

<211> 214

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de proteína de adenilato quinasa termoestable de Sulfolobus acidcaldarius fusionada al extremo N-terminal y C-terminal con una secuencia de sustrato de transglutaminasa (Factor XIII)

<400> 36

Met Asn Gln Glu Gln Val Ser Pro Leu Gly Gly Lys Ile Gly Ile Val 1 5 10 15 Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Ser Thr Val Leu Ala Lys Val Lys 20 25 30 Glu Ile Leu Asp Asn Gln Gly Ile Asn Asn Lys Ile Ile Asn Tyr Gly 35 40 45 Asp Phe Met Leu Ala Thr Ala Leu Lys Leu Gly Tyr Ala Lys Asp Arg 50 55 60 Asp Glu Met Arg Lys Leu Ser Val Glu Lys Gln Lys Lys Leu Gln Ile 65 70 75 80 Asp Ala Ala Lys Gly Ile Ala Glu Glu Ala Arg Ala Gly Gly Glu Gly 85 90 95 Tyr Leu Phe Ile Asp Thr His Ala Val Ile Arg Thr Pro Ser Gly Tyr 100 105 110 Leu Pro Gly Leu Pro Ser Tyr Val Ile Thr Glu Ile Asn Pro Ser Val 115 120 125 Ile Phe Leu Leu Glu Ala Asp Pro Lys Ile Ile Leu Ser Arg Gln Lys 130 135 140 Arg Asp Thr Thr Arg Asn Arg Asn Asp Tyr Ser Asp Glu Ser Val Ile 145 150 155 160 Leu Glu Thr Ile Asn Phe Ala Arg Tyr Ala Ala Thr Ala Ser Ala Val 165 170 175 Leu Ala Gly Ser Thr Val Lys Val Ile Val Asn Val Glu Gly Asp Pro 180 185 190 Ser Ile Ala Ala Asn Glu Ile Ile Arg Ser Met Lys Gly Gly Asn Gln 195 200 205 Glu Gln Val Ser Pro Leu 210

<210> 37

<211> 704

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ADN de secuencia de sustrato de transglutaminasa (Factor XIII) fusionada al extremo 5' de adenilato quinasa de Thermotoga maritima.

<400> 37

atgaatcaag aacaagtcag cccgctgggc ggcatcatcg cctatctggt ttttcttggt 60 ccaccggggg caggcaaagg tacctatgcg aaacgtttac aggaaatcac cggcatcccg 120 cacattagca cgggcgacat ttttcgtgat attgtcaaaa aggaaaatga cgaattaggt 180 aagaaaatta aagaaattat ggagcgcggc gagttggtgc cggacgaact ggtgaatgaa 240 gttgtcaaac gtcggctgtc tgaaaaggat tgcgaacgtg gctttatttt ggacggttac 300 ccgcgtacag tagctcaggc agagtttctc gacggcttcc tgaagactca gaataaggag 360 ttaacggctg cggtcctgtt cgaggtgcct gaagaggtgg tcgttcagcg tctgaccgcg 420 cggcgtatct gcccgaagtg tggtcgtatt tacaacctga tttcacttcc tccaaaagaa 480 gatgaactgt gtgatgactg caaagtaaaa ctggtgcaac gcgaagatga taaagaggaa 540 actgtgcgcc atcgctacaa agtatatctg gaaaaaaccc aaccggttat cgattattat 600 gataaaaaag gcattttgaa acgcgttgat gggaccatcg gcatcgataa cgtgattgcc 660 gaagttctca aaatcattgg gtggagtgat aaataggtcg acgc 704

<210> 38

<211> 231

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de proteína de adenilato quinasa de Thermotoga maritime fusionada al extremo N-terminal con una secuencia de sustrato de transglutaminasa (Factor XIII).

<400> 38

Met Asn Gln Glu Gln Val Ser Pro Leu Gly Gly Ile Ile Ala Tyr Leu

1 5 10 15 Val Phe Leu Gly Pro Pro Gly Ala Gly Lys Gly Thr Tyr Ala Lys Arg 20 25 30 Leu Gln Glu Ile Thr Gly Ile Pro His Ile Ser Thr Gly Asp Ile Phe 35 40 45 Arg Asp Ile Val Lys Lys Glu Asn Asp Glu Leu Gly Lys Lys Ile Lys 50 55 60 Glu Ile Met Glu Arg Gly Glu Leu Val Pro Asp Glu Leu Val Asn Glu 65 70 75 80 Val Val Lys Arg Arg Leu Ser Glu Lys Asp Cys Glu Arg Gly Phe Ile 85 90 95 Leu Asp Gly Tyr Pro Arg Thr Val Ala Gln Ala Glu Phe Leu Asp Gly 100 105 110 Phe Leu Lys Thr Gln Asn Lys Glu Leu Thr Ala Ala Val Leu Phe Glu 115 120 125 Val Pro Glu Glu Val Val Val Gln Arg Leu Thr Ala Arg Arg Ile Cys 130 135 140 Pro Lys Cys Gly Arg Ile Tyr Asn Leu Ile Ser Leu Pro Pro Lys Glu 145 150 155 160 Asp Glu Leu Cys Asp Asp Cys Lys Val Lys Leu Val Gln Arg Glu Asp 165 170 175 Asp Lys Glu Glu Thr Val Arg His Arg Tyr Lys Val Tyr Leu Glu Lys 180 185 190 Thr Gln Pro Val Ile Asp Tyr Tyr Asp Lys Lys Gly Ile Leu Lys Arg 195 200 205 Val Asp Gly Thr Ile Gly Ile Asp Asn Val Ile Ala Glu Val Leu Lys 210 215 220 Ile Ile Gly Trp Ser Asp Lys 225 230

<210> 39

<211> 696

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ADN de secuencia de sustrato de transglutaminasa (Factor XIII) fusionada al extremo 3' de adenilato quinasa de Thermotoga maritima.

<400> 39

atgatggcct atctggtttt tcttggtcca ccgggggcag gcaaaggtac ctatgcgaaa 60 cgtttacagg aaatcaccgg catcccgcac attagcacgg gcgacatttt tcgtgatatt 120 gtcaaaaagg aaaatgacga attaggtaag aaaattaaag aaattatgga gcgcggcgag 180 ttggtgccgg acgaactggt gaatgaagtt gtcaaacgtc ggctgtctga aaaggattgc 240 gaacgtggct ttattttgga cggttacccg cgtacagtag ctcaggcaga gtttctcgac 300 ggcttcctga agactcagaa taaggagtta acggctgcgg tcctgttcga ggtgcctgaa 360 gaggtggtcg ttcagcgtct gaccgcgcgg cgtatctgcc cgaagtgtgg tcgtatttac 420 aacctgattt cacttcctcc aaaagaagat gaactgtgtg atgactgcaa agtaaaactg 480 gtgcaacgcg aagatgataa agaggaaact gtgcgccatc gctacaaagt atatctggaa 540 aaaacccaac cggttatcga ttattatgat aaaaaaggca ttttgaaacg cgttgatggg 600 accatcggca tcgataacgt gattgccgaa gttctcaaaa tcattgggtg gagtgataaa 660 ctgggcggca atcaagaaca agtcagcccg ctgtaa 696

<210> 40

<211> 231

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de proteína de adenilato quinasa de Thermotoga maritime fusionada al extremo C-terminal con una secuencia de sustrato de transglutaminasa (Factor XIII).

<400> 40

Met Met Ala Tyr Leu Val Phe Leu Gly Pro Pro Gly Ala Gly Lys Gly 1 5 10 15

Thr Tyr Ala Lys Arg Leu Gln Glu Ile Thr Gly Ile Pro His Ile Ser 20 25 30 Thr Gly Asp Ile Phe Arg Asp Ile Val Lys Lys Glu Asn Asp Glu Leu 35 40 45 Gly Lys Lys Ile Lys Glu Ile Met Glu Arg Gly Glu Leu Val Pro Asp 50 55 60 Glu Leu Val Asn Glu Val Val Lys Arg Arg Leu Ser Glu Lys Asp Cys 65 70 75 80 Glu Arg Gly Phe Ile Leu Asp Gly Tyr Pro Arg Thr Val Ala Gln Ala 85 90 95 Glu Phe Leu Asp Gly Phe Leu Lys Thr Gln Asn Lys Glu Leu Thr Ala 100 105 110 Ala Val Leu Phe Glu Val Pro Glu Glu Val Val Val Gln Arg Leu Thr 115 120 125 Ala Arg Arg Ile Cys Pro Lys Cys Gly Arg Ile Tyr Asn Leu Ile Ser 130 135 140 Leu Pro Pro Lys Glu Asp Glu Leu Cys Asp Asp Cys Lys Val Lys Leu 145 150 155 160 Val Gln Arg Glu Asp Asp Lys Glu Glu Thr Val Arg His Arg Tyr Lys 165 170 175 Val Tyr Leu Glu Lys Thr Gln Pro Val Ile Asp Tyr Tyr Asp Lys Lys 180 185 190 Gly Ile Leu Lys Arg Val Asp Gly Thr Ile Gly Ile Asp Asn Val Ile 195 200 205 Ala Glu Val Leu Lys Ile Ile Gly Trp Ser Asp Lys Leu Gly Gly Asn 210 215 220 Gln Glu Gln Val Ser Pro Leu 225 230

<210> 41

<211> 729

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ADN de secuencia de sustrato de transglutaminasa (Factor XIII) fusionada a los extremos 5' y 3' de adenilato quinasa de Thermotoga maritima.

<400> 41

atgaatcaag aacaagtcag cccgctgggc ggcatcatcg cctatctggt ttttcttggt 60 ccaccggggg caggcaaagg tacctatgcg aaacgtttac aggaaatcac cggcatcccg 120 cacattagca cgggcgacat ttttcgtgat attgtcaaaa aggaaaatga cgaattaggt 180 aagaaaatta aagaaattat ggagcgcggc gagttggtgc cggacgaact ggtgaatgaa 240 gttgtcaaac gtcggctgtc tgaaaaggat tgcgaacgtg gctttatttt ggacggttac 300 ccgcgtacag tagctcaggc agagtttctc gacggcttcc tgaagactca gaataaggag 360 ttaacggctg cggtcctgtt cgaggtgcct gaagaggtgg tcgttcagcg tctgaccgcg 420 cggcgtatct gcccgaagtg tggtcgtatt tacaacctga tttcacttcc tccaaaagaa 480 gatgaactgt gtgatgactg caaagtaaaa ctggtgcaac gcgaagatga taaagaggaa 540 actgtgcgcc atcgctacaa agtatatctg gaaaaaaccc aaccggttat cgattattat 600 gataaaaaag gcattttgaa acgcgttgat gggaccatcg gcatcgataa cgtgattgcc 660 gaagttctca aaatcattgg gtggagtgat aaactgggcg gcaatcaaga acaagtcagc 720 ccgctgtaa 729

<210> 42

<211> 242

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de proteína de adenilato quinasa de Thermotoga maritime fusionada al extremo N-terminal y Cterminal con una secuencia de sustrato de transglutaminasa (Factor XIII).

<400> 42

Met Asn Gln Glu Gln Val Ser Pro Leu Gly Gly Ile Ile Ala Tyr Leu 1 5 10 15

Val Phe Leu Gly Pro Pro Gly Ala Gly Lys Gly Thr Tyr Ala Lys Arg 20 25 30 Leu Gln Glu Ile Thr Gly Ile Pro His Ile Ser Thr Gly Asp Ile Phe 35 40 45 Arg Asp Ile Val Lys Lys Glu Asn Asp Glu Leu Gly Lys Lys Ile Lys 50 55 60 Glu Ile Met Glu Arg Gly Glu Leu Val Pro Asp Glu Leu Val Asn Glu 65 70 75 80 Val Val Lys Arg Arg Leu Ser Glu Lys Asp Cys Glu Arg Gly Phe Ile 85 90 95 Leu Asp Gly Tyr Pro Arg Thr Val Ala Gln Ala Glu Phe Leu Asp Gly 100 105 110 Phe Leu Lys Thr Gln Asn Lys Glu Leu Thr Ala Ala Val Leu Phe Glu 115 120 125 Val Pro Glu Glu Val Val Val Gln Arg Leu Thr Ala Arg Arg Ile Cys 130 135 140 Pro Lys Cys Gly Arg Ile Tyr Asn Leu Ile Ser Leu Pro Pro Lys Glu 145 150 155 160 Asp Glu Leu Cys Asp Asp Cys Lys Val Lys Leu Val Gln Arg Glu Asp 165 170 175 Asp Lys Glu Glu Thr Val Arg His Arg Tyr Lys Val Tyr Leu Glu Lys 180 185 190 Thr Gln Pro Val Ile Asp Tyr Tyr Asp Lys Lys Gly Ile Leu Lys Arg 195 200 205 Val Asp Gly Thr Ile Gly Ile Asp Asn Val Ile Ala Glu Val Leu Lys 210 215 220 Ile Ile Gly Trp Ser Asp Lys Leu Gly Gly Asn Gln Glu Gln Val Ser 225 230 235 240 Pro Leu

<210> 43

<211> 1288

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ADN de constructo génico de Sup35 completo de Saccharomyces cerevisiae

<400> 43

gattcaaacc aaggcaacaa tcagcaaaac taccagcaat acagccagaa cggtaaccaa 60 caacaaggta acaacagata ccaaggttat caagcttaca atgctcaagc ccaacctggg 120 ggtgggtact accaaaatta ccaaggttat tctgggtacc aacaaggtgg ctatcaacag 180 tacaatcccg acgccggtta ccagcaacag tataatcctc aaggaggcta tcaacagtac 240 aatcctcaag gcggttatca gcaccaattc aatccacaag gtggccgtgg aaattacaaa 300 aacttcaact acaataacaa tttgcaagga tatcaagctg gtttccaacc acagtctcaa 360 ggtatgtctt tgaacgactt tcaaaagcaa caaaagcagg ccgctcccaa accaaagaag 420 actttgaagc ttgtctccag ttcctgtatc aagttggcca atgctaccaa gaaggttgac 480 acaaaacctg ccgaatctga taagaaagag gaagagaagt ctgctgaaac caaagaacca 540 actaaagagc caacaaaggt cgaagaacca gttaaaaagg aggagaaacc agtccagact 600 gaagaaaaga cggaggaaaa atcggaactt ccaaaggtag aagaccttaa aatctctgaa 660 tcaacacata ataccaacaa tgccaatgtt accagtgctg atgccttgat caaggaacag 720 gaagaagaag tggatgacga agttgttaac gatatgtttg gtggtaaaga tcacgtttct 780 ttaattttca tgggtcatgt tgatgccggt aaatctacta tgggtggtaa tctactatac 840 ttgactggct ctgtggataa gagaactatt gagaaatatg aaagagaagc caaggatgca 900 ggcagacaag gttggtactt gtcatgggtc atggatacca acaaagaaga aagaaatgat 960 ggtaagacta tcgaagttgg taaggcctac tttgaaactg aaaaaaggcg ttataccata 1020 ttggatgctc ctggtcataa aatgtacgtt tccgagatga tcggtggtgc ttctcaagct 1080 gatgttggtg ttttggtcat ttccgccaga aagggtgagt acgaaaccgg ttttgagaga 1140 ggtggtcaaa ctcgtgaaca cgccctattg gccaagaccc aaggtgttaa taagatggtt 1200 gtcgtcgtaa ataagatgga tgacccaacc gttaactggt ctaaggaacg ttacgaccaa 1260 tgtgtgagta atgtcagcaa tttcttga 1288

<210> 44

<211> 429

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia protecica de Sup35 completa de Saccharomyces cerevisiae

<400> 44

Asp Ser Asn Gln Gly Asn Asn Gln Gln Asn Tyr Gln Gln Tyr Ser Gln

1 5 10 15

Asn Gly Asn Gln Gln Gln Gly Asn Asn Arg Tyr Gln Gly Tyr Gln Ala 20 25 30 Tyr Asn Ala Gln Ala Gln Pro Gly Gly Gly Tyr Tyr Gln Asn Tyr Gln 35 40 45 Gly Tyr Ser Gly Tyr Gln Gln Gly Gly Tyr Gln Gln Tyr Asn Pro Asp

50 55 60

Ala Gly Tyr Gln Gln Gln Tyr Asn Pro Gln Gly Gly Tyr Gln Gln Tyr

65 70 75 80

Asn Pro Gln Gly Gly Tyr Gln His Gln Phe Asn Pro Gln Gly Gly Arg

85 90 95 Gly Asn Tyr Lys Asn Phe Asn Tyr Asn Asn Asn Leu Gln Gly Tyr Gln 100 105 110 Ala Gly Phe Gln Pro Gln Ser Gln Gly Met Ser Leu Asn Asp Phe Gln 115 120 125 Lys Gln Gln Lys Gln Ala Ala Pro Lys Pro Lys Lys Thr Leu Lys Leu

130 135 140

Val Ser Ser Ser Cys Ile Lys Leu Ala Asn Ala Thr Lys Lys Val Asp

145 150 155 160

Thr Lys Pro Ala Glu Ser Asp Lys Lys Glu Glu Glu Lys Ser Ala Glu

165 170 175 Thr Lys Glu Pro Thr Lys Glu Pro Thr Lys Val Glu Glu Pro Val Lys 180 185 190 Lys Glu Glu Lys Pro Val Gln Thr Glu Glu Lys Thr Glu Glu Lys Ser 195 200 205 Glu Leu Pro Lys Val Glu Asp Leu Lys Ile Ser Glu Ser Thr His Asn

210 215 220

Thr Asn Asn Ala Asn Val Thr Ser Ala Asp Ala Leu Ile Lys Glu Gln

225 230 235 240

Glu Glu Glu Val Asp Asp Glu Val Val Asn Asp Met Phe Gly Gly Lys

245 250 255 Asp His Val Ser Leu Ile Phe Met Gly His Val Asp Ala Gly Lys Ser 260 265 270 Thr Met Gly Gly Asn Leu Leu Tyr Leu Thr Gly Ser Val Asp Lys Arg 275 280 285 Thr Ile Glu Lys Tyr Glu Arg Glu Ala Lys Asp Ala Gly Arg Gln Gly

290 295 300

Trp Tyr Leu Ser Trp Val Met Asp Thr Asn Lys Glu Glu Arg Asn Asp

305 310 315 320

Gly Lys Thr Ile Glu Val Gly Lys Ala Tyr Phe Glu Thr Glu Lys Arg

325 330 335 Arg Tyr Thr Ile Leu Asp Ala Pro Gly His Lys Met Tyr Val Ser Glu 340 345 350 Met Ile Gly Gly Ala Ser Gln Ala Asp Val Gly Val Leu Val Ile Ser 355 360 365 Ala Arg Lys Gly Glu Tyr Glu Thr Gly Phe Glu Arg Gly Gly Gln Thr

370 375 380

Arg Glu His Ala Leu Leu Ala Lys Thr Gln Gly Val Asn Lys Met Val

385 390 395 400

Val Val Val Asn Lys Met Asp Asp Pro Thr Val Asn Trp Ser Lys Glu

405 410 415 Arg Tyr Asp Gln Cys Val Ser Asn Val Ser Asn Phe Leu 420 425

<210> 45

<211> 348

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223> Secuencia de ADN de codón de sup35N (dominio N-terminal) dirigido a expresión óptima en E. coli

<400> 45

atggactcta accagggtaa caaccagcag aactaccagc agtactctca gaacggtaac 60 cagcagcagg gtaacaaccg ttaccagggt taccaggctt acaacgctca ggctcagccg 120 ggtggtggtt actaccagaa ctaccagggt tactccggat atcaacaggg tggttaccaa 180 caatataatc cagacgctgg ttaccagcag cagtacaacc cgcagggtgg ttaccagcag 240 tacaacccgc aaggcggata tcaacaccag ttcaatccgc agggtggtcg tggtaactac 300 aaaaacttca actacaacaa caacctgcag ggttaccagg ctggttaa 348

<210> 46

<211> 115

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica de sup35N (dominio N-terminal)

<400> 46

Met Asp Ser Asn Gln Gly Asn Asn Gln Gln Asn Tyr Gln Gln Tyr Ser 1 5 10 15 Gln Asn Gly Asn Gln Gln Gln Gly Asn Asn Arg Tyr Gln Gly Tyr Gln

20 25 30 Ala Tyr Asn Ala Gln Ala Gln Pro Gly Gly Gly Tyr Tyr Gln Asn Tyr 35 40 45 Gln Gly Tyr Ser Gly Tyr Gln Gln Gly Gly Tyr Gln Gln Tyr Asn Pro

50 55 60 Asp Ala Gly Tyr Gln Gln Gln Tyr Asn Pro Gln Gly Gly Tyr Gln Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Pro Gln Gly Gly Tyr Gln His Gln Phe Asn Pro Gln Gly Gly

85 90 95 Arg Gly Asn Tyr Lys Asn Phe Asn Tyr Asn Asn Asn Leu Gln Gly Tyr 100 105 110 Gln Ala Gly 115

<210> 47

<211> 941

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ADN de adenilato quinasa de Sulfolobus acidcaldarius dirigida a codones en E. Coli fusionada al extremo N-terminal con el dominio N-terminal de Sup35 de Saccharomyces cerevisiae

<400> 47

atggactcta accagggtaa caaccagcag aactaccagc agtactctca gaacggtaac 60 cagcagcagg gtaacaaccg ttaccagggt taccaggctt acaacgctca ggctcagccg 120 ggtggtggtt actaccagaa ctaccagggt tactccggtt atcagcaagg tggctaccaa 180 caatataatc cagacgctgg ctatcaacag caatataatc ctcagggtgg ttaccagcag 240 tacaacccgc aaggcggtta tcaacaccag ttcaatccgc agggtggtcg tggtaactac 300 aaaaacttca actacaacaa caacctgcag ggttaccagg ctggaattat gaagatcggc 360 attgtgaccg gcattccggg cgttggcaaa agcaccgttc tggcaaaggt gaaggagatc 420 ctggacaacc agggcattaa taacaaaatt attaattatg gtgattttat gctggcgacc 480 gcgctgaagc tgggctacgc aaaagatcgt gacgaaatgc gcaaactgag cgtggaaaaa 540 cagaagaagc tgcagattga tgcggcgaag ggcattgcgg aagaggcacg cgcgggcggc 600 gaaggctacc tgtttatcga tacccatgcg gtgatccgca ccccgagcgg ttatctgccg 660 ggcctgccgt cttacgtgat tacggaaatc aacccgagcg ttatttttct gctggaggca 720 gatccgaaga ttattctgag ccgccagaag cgcgatacca cccgcaaccg caacgattat 780 agcgacgaaa gcgttatcct ggagaccatc aactttgcgc gctatgcggc aaccgcgagc 840 gcggttctgg caggctctac cgttaaagtg atcgtgaacg tggagggtga tccaagcatc 900 gcggcgaacg aaatcattcg cagcatgaaa taagtcgacg c 941

<210> 48

<211> 310

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica de Adenilato quinasa de Sulfolobus acidcaldarius fusionada al extremo N-terminal con el dominio N-terminal de Sup35 de Saccharomyces cerevisiae

<400> 48

Met Asp Ser Asn Gln Gly Asn Asn Gln Gln Asn Tyr Gln Gln Tyr Ser

1 5 10 15

Gln Asn Gly Asn Gln Gln Gln Gly Asn Asn Arg Tyr Gln Gly Tyr Gln 20 25 30 Ala Tyr Asn Ala Gln Ala Gln Pro Gly Gly Gly Tyr Tyr Gln Asn Tyr 35 40 45 Gln Gly Tyr Ser Gly Tyr Gln Gln Gly Gly Tyr Gln Gln Tyr Asn Pro

50 55 60

Asp Ala Gly Tyr Gln Gln Gln Tyr Asn Pro Gln Gly Gly Tyr Gln Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Pro Gln Gly Gly Tyr Gln His Gln Phe Asn Pro Gln Gly Gly

85 90 95 Arg Gly Asn Tyr Lys Asn Phe Asn Tyr Asn Asn Asn Leu Gln Gly Tyr 100 105 110 Gln Ala Gly Ile Met Lys Ile Gly Ile Val Thr Gly Ile Pro Gly Val 115 120 125 Gly Lys Ser Thr Val Leu Ala Lys Val Lys Glu Ile Leu Asp Asn Gln

130 135 140

Gly Ile Asn Asn Lys Ile Ile Asn Tyr Gly Asp Phe Met Leu Ala Thr

145 150 155 160

Ala Leu Lys Leu Gly Tyr Ala Lys Asp Arg Asp Glu Met Arg Lys Leu

165 170 175 Ser Val Glu Lys Gln Lys Lys Leu Gln Ile Asp Ala Ala Lys Gly Ile 180 185 190 Ala Glu Glu Ala Arg Ala Gly Gly Glu Gly Tyr Leu Phe Ile Asp Thr 195 200 205 His Ala Val Ile Arg Thr Pro Ser Gly Tyr Leu Pro Gly Leu Pro Ser

210 215 220

Tyr Val Ile Thr Glu Ile Asn Pro Ser Val Ile Phe Leu Leu Glu Ala

225 230 235 240

Asp Pro Lys Ile Ile Leu Ser Arg Gln Lys Arg Asp Thr Thr Arg Asn

245 250 255 Arg Asn Asp Tyr Ser Asp Glu Ser Val Ile Leu Glu Thr Ile Asn Phe 260 265 270 Ala Arg Tyr Ala Ala Thr Ala Ser Ala Val Leu Ala Gly Ser Thr Val 275 280 285 Lys Val Ile Val Asn Val Glu Gly Asp Pro Ser Ile Ala Ala Asn Glu

290 295 300

Ile Ile Arg Ser Met Lys

305 310

<210> 49

<211> 947

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ADN de adenilato quinasa de Sulfolobus acidcaldarius dirigida a codones en E. Coli fusionada al extremo C-terminal con el dominio N-terminal de Sup35 de Saccharomyces cerevisiae

<400> 49

atgaagatcg gcattgtgac cggcattccg ggcgttggca aaagcaccgt tctggcaaag 60 gtgaaggaga tcctggacaa ccagggcatt aataacaaaa ttattaatta tggtgatttt 120 atgctggcga ccgcgctgaa gctgggctac gcaaaagatc gtgacgaaat gcgcaaactg 180 agcgtggaaa aacagaagaa gctgcagatt gatgcggcga agggcattgc ggaagaggca 240 cgcgcgggcg gcgaaggcta cctgtttatc gatacccatg cggtgatccg caccccgagc 300 ggttatctgc cgggcctgcc gtcttacgtg attacggaaa tcaacccgag cgttattttt 360 ctgctggagg cagatccgaa gattattctg agccgccaga agcgcgatac cacccgcaac 420 cgcaacgatt atagcgacga aagcgttatc ctggagacca tcaactttgc gcgctatgcg 480 gcaaccgcga gcgcggttct ggcaggctct accgttaaag tgatcgtgaa cgtggagggt 540 gatccaagca tcgcggcgaa cgaaatcatt cgcagcatga aacagtcgag tatggactct 600 aaccagggta acaaccagca gaactaccag cagtactctc agaacggtaa ccagcagcag 660 ggtaacaacc gttaccaggg ttaccaggct tacaacgctc aggctcagcc gggtggtggt 720 tactaccaga actaccaggg ttactccggt tatcagcaag gtggctacca acaatataat 780 ccagacgctg gctatcaaca gcaatataat cctcagggtg gttaccagca gtacaacccg 840 caaggcggtt atcaacacca gttcaatccg cagggtggtc gtggtaacta caaaaacttc 900 aactacaaca acaacctgca gggttaccag gctggttaag tcgacgc 947

<210> 50

<211> 312

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica de Adenilato quinasa de Sulfolobus acidcaldarius fusionada al extremo C-terminal con el dominio N-terminal de Sup35 de Saccharomyces cerevisiae

<400> 50

Met Lys Ile Gly Ile Val Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Ser Thr 1 5 10 15 Val Leu Ala Lys Val Lys Glu Ile Leu Asp Asn Gln Gly Ile Asn Asn

20 25 30 Lys Ile Ile Asn Tyr Gly Asp Phe Met Leu Ala Thr Ala Leu Lys Leu 35 40 45 Gly Tyr Ala Lys Asp Arg Asp Glu Met Arg Lys Leu Ser Val Glu Lys

50 55 60 Gln Lys Lys Leu Gln Ile Asp Ala Ala Lys Gly Ile Ala Glu Glu Ala 65 70 75 80 Arg Ala Gly Gly Glu Gly Tyr Leu Phe Ile Asp Thr His Ala Val Ile

85 90 95 Arg Thr Pro Ser Gly Tyr Leu Pro Gly Leu Pro Ser Tyr Val Ile Thr 100 105 110 Glu Ile Asn Pro Ser Val Ile Phe Leu Leu Glu Ala Asp Pro Lys Ile 115 120 125 Ile Leu Ser Arg Gln Lys Arg Asp Thr Thr Arg Asn Arg Asn Asp Tyr

130 135 140 Ser Asp Glu Ser Val Ile Leu Glu Thr Ile Asn Phe Ala Arg Tyr Ala 145 150 155 160 Ala Thr Ala Ser Ala Val Leu Ala Gly Ser Thr Val Lys Val Ile Val

165 170 175 Asn Val Glu Gly Asp Pro Ser Ile Ala Ala Asn Glu Ile Ile Arg Ser 180 185 190 Met Lys Gln Ser Ser Met Asp Ser Asn Gln Gly Asn Asn Gln Gln Asn 195 200 205 Tyr Gln Gln Tyr Ser Gln Asn Gly Asn Gln Gln Gln Gly Asn Asn Arg

210 215 220 Tyr Gln Gly Tyr Gln Ala Tyr Asn Ala Gln Ala Gln Pro Gly Gly Gly 225 230 235 240 Tyr Tyr Gln Asn Tyr Gln Gly Tyr Ser Gly Tyr Gln Gln Gly Gly Tyr

245 250 255 Gln Gln Tyr Asn Pro Asp Ala Gly Tyr Gln Gln Gln Tyr Asn Pro Gln 260 265 270 Gly Gly Tyr Gln Gln Tyr Asn Pro Gln Gly Gly Tyr Gln His Gln Phe 275 280 285 Asn Pro Gln Gly Gly Arg Gly Asn Tyr Lys Asn Phe Asn Tyr Asn Asn 290 295 300

Asn Leu Gln Gly Tyr Gln Ala Gly 305 310

<210> 51

<211> 1011

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ADN de Sup35N fusionada en el extremo 5' de adenilato quinasa de Thermotoga maritima.

<400> 51

atggactcta accagggtaa caaccagcag aactaccagc agtactctca gaacggtaac 60 cagcagcagg gtaacaaccg ttaccagggt taccaggctt acaacgctca ggctcagccg 120 ggtggtggtt actaccagaa ctaccagggt tactccggtt atcagcaagg tggctaccaa 180 caatataatc cagacgctgg ctatcaacag caatataatc ctcagggtgg ttaccagcag 240 tacaacccgc aaggcggtta tcaacaccag ttcaatccgc agggtggtcg tggtaactac 300 aaaaacttca actacaacaa caacctgcag ggttaccagg ctggaattat gatggcctat 360 ctggtttttc ttggtccacc gggggcaggc aaaggtacct atgcgaaacg tttacaggaa 420 atcaccggca tcccgcacat tagcacgggc gacatttttc gtgatattgt caaaaaggaa 480 aatgacgaat taggtaagaa aattaaagaa attatggagc gcggcgagtt ggtgccggac 540 gaactggtga atgaagttgt caaacgtcgg ctgtctgaaa aggattgcga acgtggcttt 600 attttggacg gttacccgcg tacagtagct caggcagagt ttctcgacgg cttcctgaag 660 actcagaata aggagttaac ggctgcggtc ctgttcgagg tgcctgaaga ggtggtcgtt 720 cagcgtctga ccgcgcggcg tatctgcccg aagtgtggtc gtatttacaa cctgatttca 780 cttcctccaa aagaagatga actgtgtgat gactgcaaag taaaactggt gcaacgcgaa 840 gatgataaag aggaaactgt gcgccatcgc tacaaagtat atctggaaaa aacccaaccg 900 gttatcgatt attatgataa aaaaggcatt ttgaaacgcg ttgatgggac catcggcatc 960 gataacgtga ttgccgaagt tctcaaaatc attgggtgga gtgataaata g 1011

<210> 52

<211> 336

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica de adenilato quinasa de Thermotoga maritime fusionada en el exremo N-terminal con Sup35N.

<400> 52

Met Asp Ser Asn Gln Gly Asn Asn Gln Gln Asn Tyr Gln Gln Tyr Ser 1 5 10 15 Gln Asn Gly Asn Gln Gln Gln Gly Asn Asn Arg Tyr Gln Gly Tyr Gln 20 25 30 Ala Tyr Asn Ala Gln Ala Gln Pro Gly Gly Gly Tyr Tyr Gln Asn Tyr 35 40 45 Gln Gly Tyr Ser Gly Tyr Gln Gln Gly Gly Tyr Gln Gln Tyr Asn Pro 50 55 60 Asp Ala Gly Tyr Gln Gln Gln Tyr Asn Pro Gln Gly Gly Tyr Gln Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Pro Gln Gly Gly Tyr Gln His Gln Phe Asn Pro Gln Gly Gly 85 90 95 Arg Gly Asn Tyr Lys Asn Phe Asn Tyr Asn Asn Asn Leu Gln Gly Tyr 100 105 110 Gln Ala Gly Ile Met Met Ala Tyr Leu Val Phe Leu Gly Pro Pro Gly 115 120 125 Ala Gly Lys Gly Thr Tyr Ala Lys Arg Leu Gln Glu Ile Thr Gly Ile 130 135 140 Pro His Ile Ser Thr Gly Asp Ile Phe Arg Asp Ile Val Lys Lys Glu 145 150 155 160 Asn Asp Glu Leu Gly Lys Lys Ile Lys Glu Ile Met Glu Arg Gly Glu 165 170 175 Leu Val Pro Asp Glu Leu Val Asn Glu Val Val Lys Arg Arg Leu Ser 180 185 190

Glu Lys Asp Cys Glu Arg Gly Phe Ile Leu Asp Gly Tyr Pro Arg Thr 195 200 205

Val Ala Gln Ala Glu Phe Leu Asp Gly Phe Leu Lys Thr Gln Asn Lys 210 215 220

Glu Leu Thr Ala Ala Val Leu Phe Glu Val Pro Glu Glu Val Val Val

225 230 235 240

Gln Arg Leu Thr Ala Arg Arg Ile Cys Pro Lys Cys Gly Arg Ile Tyr

245 250 255 Asn Leu Ile Ser Leu Pro Pro Lys Glu Asp Glu Leu Cys Asp Asp Cys 260 265 270 Lys Val Lys Leu Val Gln Arg Glu Asp Asp Lys Glu Glu Thr Val Arg 275 280 285 His Arg Tyr Lys Val Tyr Leu Glu Lys Thr Gln Pro Val Ile Asp Tyr

290 295 300

Tyr Asp Lys Lys Gly Ile Leu Lys Arg Val Asp Gly Thr Ile Gly Ile

305 310 315 320

Asp Asn Val Ile Ala Glu Val Leu Lys Ile Ile Gly Trp Ser Asp Lys 325 330 335

<210> 53

<211> 1025

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ADN de Sup35N fusionada en el extremo 3' de adenilato quinasa de Thermotoga maritima.

<400> 53

Ala Thr Gly Ala Thr Gly Gly Cys Cys Thr Ala Thr Cys Thr Gly Gly

1 5 10 15

Thr Thr Thr Thr Thr Cys Thr Thr Gly Gly Thr Cys Cys Ala Cys Cys 20 25 30 Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Gly Gly Cys Ala Ala Ala Gly Gly Thr 35 40 45 Ala Cys Cys Thr Ala Thr Gly Cys Gly Ala Ala Ala Cys Gly Thr Thr

50 55 60

Thr Ala Cys Ala Gly Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Cys Cys Gly Gly

65 70 75 80

Cys Ala Thr Cys Cys Cys Gly Cys Ala Cys Ala Thr Thr Ala Gly Cys

85 90 95 Ala Cys Gly Gly Gly Cys Gly Ala Cys Ala Thr Thr Thr Thr Thr Cys 100 105 110 Gly Thr Gly Ala Thr Ala Thr Thr Gly Thr Cys Ala Ala Ala Ala Ala 115 120 125 Gly Gly Ala Ala Ala Ala Thr Gly Ala Cys Gly Ala Ala Thr Thr Ala

130 135 140

Gly Gly Thr Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ala Ala Gly

145 150 155 160

Ala Ala Ala Thr Thr Ala Thr Gly Gly Ala Gly Cys Gly Cys Gly Gly

165 170 175 Cys Gly Ala Gly Thr Thr Gly Gly Thr Gly Cys Cys Gly Gly Ala Cys 180 185 190 Gly Ala Ala Cys Thr Gly Gly Thr Gly Ala Ala Thr Gly Ala Ala Gly 195 200 205 Thr Thr Gly Thr Cys Ala Ala Ala Cys Gly Thr Cys Gly Gly Cys Thr

210 215 220

Gly Thr Cys Thr Gly Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Thr Thr Gly Cys

225 230 235 240

Gly Ala Ala Cys Gly Thr Gly Gly Cys Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr

245 250 255 Thr Gly Gly Ala Cys Gly Gly Thr Thr Ala Cys Cys Cys Gly Cys Gly 260 265 270 Thr Ala Cys Ala Gly Thr Ala Gly Cys Thr Cys Ala Gly Gly Cys Ala 275 280 285 Gly Ala Gly Thr Thr Thr Cys Thr Cys Gly Ala Cys Gly Gly Cys Thr

290 295 300

Thr Cys Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala Cys Thr Cys Ala Gly Ala Ala

305 310 315 320

Thr Ala Ala Gly Gly Ala Gly Thr Thr Ala Ala Cys Gly Gly Cys Thr 325 330 335 Gly Cys Gly Gly Thr Cys Cys Thr Gly Thr Thr Cys Gly Ala Gly Gly 340 345 350 Thr Gly Cys Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala Gly Gly Thr Gly Gly Thr 355 360 365 Cys Gly Thr Thr Cys Ala Gly Cys Gly Thr Cys Thr Gly Ala Cys Cys

370 375 380

Gly Cys Gly Cys Gly Gly Cys Gly Thr Ala Thr Cys Thr Gly Cys Cys

385 390 395 400

Cys Gly Ala Ala Gly Thr Gly Thr Gly Gly Thr Cys Gly Thr Ala Thr

405 410 415 Thr Thr Ala Cys Ala Ala Cys Cys Thr Gly Ala Thr Thr Thr Cys Ala 420 425 430 Cys Thr Thr Cys Cys Thr Cys Cys Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly 435 440 445 Ala Thr Gly Ala Ala Cys Thr Gly Thr Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala

450 455 460

Cys Thr Gly Cys Ala Ala Ala Gly Thr Ala Ala Ala Ala Cys Thr Gly

465 470 475 480

Gly Thr Gly Cys Ala Ala Cys Gly Cys Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly

485 490 495 Ala Thr Ala Ala Ala Gly Ala Gly Gly Ala Ala Ala Cys Thr Gly Thr 500 505 510 Gly Cys Gly Cys Cys Ala Thr Cys Gly Cys Thr Ala Cys Ala Ala Ala 515 520 525 Gly Thr Ala Thr Ala Thr Cys Thr Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala

530 535 540

Cys Cys Cys Ala Ala Cys Cys Gly Gly Thr Thr Ala Thr Cys Gly Ala

545 550 555 560

Thr Thr Ala Thr Thr Ala Thr Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala

565 570 575 Gly Gly Cys Ala Thr Thr Thr Thr Gly Ala Ala Ala Cys Gly Cys Gly 580 585 590 Thr Thr Gly Ala Thr Gly Gly Gly Ala Cys Cys Ala Thr Cys Gly Gly 595 600 605 Cys Ala Thr Cys Gly Ala Thr Ala Ala Cys Gly Thr Gly Ala Thr Thr

610 615 620

Gly Cys Cys Gly Ala Ala Gly Thr Thr Cys Thr Cys Ala Ala Ala Ala

625 630 635 640

Thr Cys Ala Thr Thr Gly Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Thr Gly Ala

645 650 655 Thr Ala Ala Ala Cys Thr Gly Thr Cys Gly Ala Gly Thr Ala Thr Gly 660 665 670 Gly Ala Cys Thr Cys Thr Ala Ala Cys Cys Ala Gly Gly Gly Thr Ala 675 680 685 Ala Cys Ala Ala Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Ala Cys Thr Ala

690 695 700

Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr Ala Cys Thr Cys Thr Cys Ala Gly

705 710 715 720

Ala Ala Cys Gly Gly Thr Ala Ala Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys

725 730 735 Ala Gly Gly Gly Thr Ala Ala Cys Ala Ala Cys Cys Gly Thr Thr Ala 740 745 750 Cys Cys Ala Gly Gly Gly Thr Thr Ala Cys Cys Ala Gly Gly Cys Thr 755 760 765 Thr Ala Cys Ala Ala Cys Gly Cys Thr Cys Ala Gly Gly Cys Thr Cys

770 775 780

Ala Gly Cys Cys Gly Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Thr Ala

785 790 795 800

Cys Thr Ala Cys Cys Ala Gly Ala Ala Cys Thr Ala Cys Cys Ala Gly

805 810 815 Gly Gly Thr Thr Ala Cys Thr Cys Cys Gly Gly Thr Thr Ala Thr Cys 820 825 830 Ala Gly Cys Ala Ala Gly Gly Thr Gly Gly Cys Thr Ala Cys Cys Ala 835 840 845 Ala Cys Ala Ala Thr Ala Thr Ala Ala Thr Cys Cys Ala Gly Ala Cys 850 855 860 Gly Cys Thr Gly Gly Cys Thr Ala Thr Cys Ala Ala Cys Ala Gly Cys

865 870 875 880 Ala Ala Thr Ala Thr Ala Ala Thr Cys Cys Thr Cys Ala Gly Gly Gly 885 890 895 Thr Gly Gly Thr Thr Ala Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr Ala Cys 900 905 910 Ala Ala Cys Cys Cys Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys Gly Gly Thr Thr 915 920 925 Ala Thr Cys Ala Ala Cys Ala Cys Cys Ala Gly Thr Thr Cys Ala Ala

930 935 940

Thr Cys Cys Gly Cys Ala Gly Gly Gly Thr Gly Gly Thr Cys Gly Thr

945 950 955 960

Gly Gly Thr Ala Ala Cys Thr Ala Cys Ala Ala Ala Ala Ala Cys Thr

965 970 975 Thr Cys Ala Ala Cys Thr Ala Cys Ala Ala Cys Ala Ala Cys Ala Ala 980 985 990 Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Gly Gly Thr Thr Ala Cys Cys Ala Gly 995 1000 1005 Gly Cys Thr Gly Gly Thr Thr Ala Ala Gly Thr Cys Gly Ala Cys 1010 1015 1020 Gly Cys 1025

<210> 54

<211> 338

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica de adenilato quinasa de Thermotoga maritime fusionada en el extremo C-terminal con Sup35N

<400> 54

Met Met Ala Tyr Leu Val Phe Leu Gly Pro Pro Gly Ala Gly Lys Gly

1 5 10 15

Thr Tyr Ala Lys Arg Leu Gln Glu Ile Thr Gly Ile Pro His Ile Ser 20 25 30 Thr Gly Asp Ile Phe Arg Asp Ile Val Lys Lys Glu Asn Asp Glu Leu 35 40 45 Gly Lys Lys Ile Lys Glu Ile Met Glu Arg Gly Glu Leu Val Pro Asp

50 55 60

Glu Leu Val Asn Glu Val Val Lys Arg Arg Leu Ser Glu Lys Asp Cys

65 70 75 80

Glu Arg Gly Phe Ile Leu Asp Gly Tyr Pro Arg Thr Val Ala Gln Ala

85 90 95 Glu Phe Leu Asp Gly Phe Leu Lys Thr Gln Asn Lys Glu Leu Thr Ala 100 105 110 Ala Val Leu Phe Glu Val Pro Glu Glu Val Val Val Gln Arg Leu Thr 115 120 125 Ala Arg Arg Ile Cys Pro Lys Cys Gly Arg Ile Tyr Asn Leu Ile Ser

130 135 140

Leu Pro Pro Lys Glu Asp Glu Leu Cys Asp Asp Cys Lys Val Lys Leu

145 150 155 160

Val Gln Arg Glu Asp Asp Lys Glu Glu Thr Val Arg His Arg Tyr Lys

165 170 175 Val Tyr Leu Glu Lys Thr Gln Pro Val Ile Asp Tyr Tyr Asp Lys Lys 180 185 190 Gly Ile Leu Lys Arg Val Asp Gly Thr Ile Gly Ile Asp Asn Val Ile 195 200 205 Ala Glu Val Leu Lys Ile Ile Gly Trp Ser Asp Lys Leu Ser Ser Met

210 215 220

Asp Ser Asn Gln Gly Asn Asn Gln Gln Asn Tyr Gln Gln Tyr Ser Gln

225 230 235 240

Asn Gly Asn Gln Gln Gln Gly Asn Asn Arg Tyr Gln Gly Tyr Gln Ala

245 250 255 Tyr Asn Ala Gln Ala Gln Pro Gly Gly Gly Tyr Tyr Gln Asn Tyr Gln 260 265 270

Gly Tyr Ser Gly Tyr Gln Gln Gly Gly Tyr Gln Gln Tyr Asn Pro Asp 275 280 285 Ala Gly Tyr Gln Gln Gln Tyr Asn Pro Gln Gly Gly Tyr Gln Gln Tyr 290 295 300 Asn Pro Gln Gly Gly Tyr Gln His Gln Phe Asn Pro Gln Gly Gly Arg 305 310 315 320 Gly Asn Tyr Lys Asn Phe Asn Tyr Asn Asn Asn Leu Gln Gly Tyr Gln 325 330 335 Ala Gly

<210> 55

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ADN que codifica un péptido corto de Sup35 capaz de agregarse para formar fibrilas amiloides; para utilizar como péptido de fusión con genes de tAK.

<400> 55

ggtaacaacc agcagaacta c 21

<210> 56

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido amiloide derivado de Sup35

<400> 56

Gly Asn Asn Gln Gln Asn Tyr 1 5

<210> 57

<211> 1593

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ADN que codifica una proteína de la cápside de Norovirus (58kDa)

<400> 57

atgatgatgg cgtctaagga cgctacatca agcgtggatg gcgctagtgg cgctggtcag 60 ttggtaccgg aggttaatgc ttctgaccct cttgcaatgg atcctgtagc aggttcttcg 120 acagcagtcg cgactgctgg acaagttaat cctattgatc cctggataat taataatttt 180 gtgcaagccc cccaaggtga atttactatt tccccaaata atacccccgg tgatgttttg 240 tttgatttga gtttgggtcc ccatcttaat cctttcttgc tccatctatc acaaatgtat 300 aatggttggg ttggtaacat gagagtcagg attatgctag ctggtaatgc ctttactgcg 360 gggaagataa tagtttcctg cataccccct ggttttggtt cacataatct tactatagca 420 caagcaactc tctttccaca tgtgattgct gatgttagga ctctagaccc cattgaggtg 480 cctttggaag atgttaggaa tgttctcttt cataataatg atagaaatca acaaaccatg 540 cgccttgtgt gcatgctgta cacccccctc cgcactggtg gtggtactgg tgattctttt 600 gtagttgcag ggcgagttat gacttgcccc agtcctgatt ttaatttctt gtttttagtc 660 cctcctacgg tggagcagaa aaccaggccc ttcacactcc caaatctgcc attgagttct 720 ctgtctaact cacgtgcccc tctcccaatc agtagtatgg gcatttcccc agacaatgtc 780 cagagtgtgc agttccaaaa tggtcggtgt actctggatg gccgcctggt tggcaccacc 840 ccagtttcat tgtcacatgt tgccaagata agagggacct ccaatggcac tgtaatcaac 900 cttactgaat tggatggcac accctttcac ccttttgagg gccctgcccc cattgggttt 960 ccagacctcg gtggttgtga ttggcatatc aatatgacac agtttggcca ttctagccag 1020 acccagtatg atgtagacac cacccctgac acttttgtcc cccatcttgg ttcaattcag 1080 gcaaatggca ttggcagtgg taattatgtt ggtgttctta gctggatttc ccccccatca 1140 cacccgtctg gctcccaagt tgacctttgg aagatcccca attatgggtc aagtattacg 1200 gaggcaacac atctagcccc ttctgtatac ccccctggtt tcggagaggt attggtcttt 1260 ttcatgtcaa aaatgccagg tcctggtgct tataatttgc cctgtctatt accacaagag 1320 tacatttcac atcttgctag tgaacaagcc cctactgtag gtgaggctgc cctgctccac 1380 tatgttgacc ctgataccgg tcggaatctt ggggaattca aagcataccc tgatggtttc 1440 ctcacttgtg tccccaatgg ggctagctcg ggtccacaac agctgccgat caatggggtc 1500 tttgtctttg tttcatgggt gtccagattt tatcaattaa agcctgtggg aactgccagc 1560 tcggcaagag gtaggcttgg tctgcgccga taa 1593

<210> 58

<211> 530

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica de proteína de la cápside de Norovirus (58kDa)

<400> 58

Met Met Met Ala Ser Lys Asp Ala Thr Ser Ser Val Asp Gly Ala Ser 1 5 10 15 Gly Ala Gly Gln Leu Val Pro Glu Val Asn Ala Ser Asp Pro Leu Ala

20 25 30 Met Asp Pro Val Ala Gly Ser Ser Thr Ala Val Ala Thr Ala Gly Gln 35 40 45 Val Asn Pro Ile Asp Pro Trp Ile Ile Asn Asn Phe Val Gln Ala Pro

50 55 60 Gln Gly Glu Phe Thr Ile Ser Pro Asn Asn Thr Pro Gly Asp Val Leu 65 70 75 80 Phe Asp Leu Ser Leu Gly Pro His Leu Asn Pro Phe Leu Leu His Leu

85 90 95 Ser Gln Met Tyr Asn Gly Trp Val Gly Asn Met Arg Val Arg Ile Met 100 105 110 Leu Ala Gly Asn Ala Phe Thr Ala Gly Lys Ile Ile Val Ser Cys Ile 115 120 125 Pro Pro Gly Phe Gly Ser His Asn Leu Thr Ile Ala Gln Ala Thr Leu

130 135 140 Phe Pro His Val Ile Ala Asp Val Arg Thr Leu Asp Pro Ile Glu Val 145 150 155 160 Pro Leu Glu Asp Val Arg Asn Val Leu Phe His Asn Asn Asp Arg Asn

165 170 175 Gln Gln Thr Met Arg Leu Val Cys Met Leu Tyr Thr Pro Leu Arg Thr 180 185 190 Gly Gly Gly Thr Gly Asp Ser Phe Val Val Ala Gly Arg Val Met Thr 195 200 205 Cys Pro Ser Pro Asp Phe Asn Phe Leu Phe Leu Val Pro Pro Thr Val

210 215 220 Glu Gln Lys Thr Arg Pro Phe Thr Leu Pro Asn Leu Pro Leu Ser Ser 225 230 235 240 Leu Ser Asn Ser Arg Ala Pro Leu Pro Ile Ser Ser Met Gly Ile Ser

245 250 255 Pro Asp Asn Val Gln Ser Val Gln Phe Gln Asn Gly Arg Cys Thr Leu 260 265 270 Asp Gly Arg Leu Val Gly Thr Thr Pro Val Ser Leu Ser His Val Ala 275 280 285 Lys Ile Arg Gly Thr Ser Asn Gly Thr Val Ile Asn Leu Thr Glu Leu

290 295 300 Asp Gly Thr Pro Phe His Pro Phe Glu Gly Pro Ala Pro Ile Gly Phe 305 310 315 320 Pro Asp Leu Gly Gly Cys Asp Trp His Ile Asn Met Thr Gln Phe Gly

325 330 335 His Ser Ser Gln Thr Gln Tyr Asp Val Asp Thr Thr Pro Asp Thr Phe 340 345 350 Val Pro His Leu Gly Ser Ile Gln Ala Asn Gly Ile Gly Ser Gly Asn 355 360 365 Tyr Val Gly Val Leu Ser Trp Ile Ser Pro Pro Ser His Pro Ser Gly

370 375 380 Ser Gln Val Asp Leu Trp Lys Ile Pro Asn Tyr Gly Ser Ser Ile Thr 385 390 395 400 Glu Ala Thr His Leu Ala Pro Ser Val Tyr Pro Pro Gly Phe Gly Glu 405 410 415 Val Leu Val Phe Phe Met Ser Lys Met Pro Gly Pro Gly Ala Tyr Asn 420 425 430 Leu Pro Cys Leu Leu Pro Gln Glu Tyr Ile Ser His Leu Ala Ser Glu 435 440 445 Gln Ala Pro Thr Val Gly Glu Ala Ala Leu Leu His Tyr Val Asp Pro 450 455 460 Asp Thr Gly Arg Asn Leu Gly Glu Phe Lys Ala Tyr Pro Asp Gly Phe 465 470 475 480 Leu Thr Cys Val Pro Asn Gly Ala Ser Ser Gly Pro Gln Gln Leu Pro 485 490 495 Ile Asn Gly Val Phe Val Phe Val Ser Trp Val Ser Arg Phe Tyr Gln 500 505 510 Leu Lys Pro Val Gly Thr Ala Ser Ser Ala Arg Gly Arg Leu Gly Leu 515 520 525 Arg Arg 530

<210> 59

<211> 1593

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ADN para un gen sintético que codifica una proteína de la cápside de Norovirus (58kDa) optimizada para la expresión en E.coli

<400> 59

atgatgatgg cttctaaaga cgctacctct tctgttgacg gtgcttctgg tgctggtcag 60 ctggttccgg aagttaacgc ttctgacccg ctggctatgg acccggttgc tggttcttct 120 accgctgttg ctaccgctgg tcaggttaac ccgatcgacc cgtggatcat caacaacttc 180 gttcaggctc cgcagggtga attcaccatc tctccgaaca acaccccggg tgacgttctg 240 ttcgacctgt ctctgggtcc gcacctgaac ccgttcctgc tgcacctgtc tcagatgtac 300 aacggttggg ttggtaacat gcgtgttcgt atcatgctgg ctggtaacgc tttcaccgct 360 ggtaaaatca tcgtttcttg catcccgccg ggtttcggtt ctcacaacct gaccatcgct 420 caggctaccc tgttcccgca cgttatcgct gacgttcgta ccctggaccc gatcgaagtt 480 ccgctggaag acgttcgtaa cgttctgttc cacaacaacg accgtaacca gcagaccatg 540 cgtctggttt gcatgctgta caccccgctg cgtaccggtg gtggtaccgg tgactctttc 600 gttgttgctg gtcgtgttat gacctgcccg tctccggact tcaacttcct gttcctggtt 660 ccgccgaccg ttgaacagaa aacccgtccg ttcaccctgc cgaacctgcc gctgtcttct 720 ctgtctaact ctcgtgctcc gctgccgatc tcttctatgg gtatctctcc ggacaacgtt 780 cagtctgttc agttccagaa cggtcgttgc accctggacg gtcgtctggt tggtaccacc 840 ccggtttctc tgtctcacgt tgctaaaatc cgtggtacct ctaacggtac cgttatcaac 900 ctgaccgaac tggacggtac cccgttccac ccgttcgaag gtccggctcc gatcggtttc 960 ccggacctgg gtggttgcga ctggcacatc aacatgaccc agttcggtca ctcttctcag 1020 acccagtacg acgttgacac caccccggac accttcgttc cgcacctggg ttctatccag 1080 gctaacggta tcggttctgg taactacgtt ggtgttctgt cttggatctc tccgccgtct 1140 cacccgtctg gttctcaggt tgacctgtgg aaaatcccga actacggttc ttctatcacc 1200 gaagctaccc acctggctcc gtctgtttac ccgccgggtt tcggtgaagt tctggttttc 1260 ttcatgtcta aaatgccggg tccgggtgct tacaacctgc cgtgcctgct gccgcaggaa 1320 tacatctctc acctggcttc tgaacaggct ccgaccgttg gtgaagctgc tctgctgcac 1380 tacgttgacc cggacaccgg tcgtaacctg ggtgaattca aagcttaccc ggacggtttc 1440 ctgacctgcg ttccgaacgg tgcttcttct ggtccgcagc agctgccgat caacggtgtt 1500 ttcgttttcg tttcttgggt ttctcgtttc taccagctga aaccggttgg taccgcttct 1560 tctgctcgtg gtcgtctggg tctgcgtcgt tag 1593

<210> 60

<211> 2250

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia de ADN para un gen sintético que codifica una proteína de la cápside de Norovirus (58kDa) optimizada para la expresión en E.coli fusionada en el extremo 5’ de un gen que codifica la tAK de Thermotoga maritima.

<400> 60

atgatgatgg cttctaaaga cgctacctct tctgttgacg gtgcttctgg tgctggtcag 60 ctggttccgg aagttaacgc ttctgacccg ctggctatgg acccggttgc tggttcttct 120 accgctgttg ctaccgctgg tcaggttaac ccgatcgacc cgtggatcat caacaacttc 180 gttcaggctc cgcagggtga attcaccatc tctccgaaca acaccccggg tgacgttctg 240 ttcgacctgt ctctgggtcc gcacctgaac ccgttcctgc tgcacctgtc tcagatgtac 300 aacggttggg ttggtaacat gcgtgttcgt atcatgctgg ctggtaacgc tttcaccgct 360 ggtaaaatca tcgtttcttg catcccgccg ggtttcggtt ctcacaacct gaccatcgct 420 caggctaccc tgttcccgca cgttatcgct gacgttcgta ccctggaccc gatcgaagtt 480 ccgctggaag acgttcgtaa cgttctgttc cacaacaacg accgtaacca gcagaccatg 540 cgtctggttt gcatgctgta caccccgctg cgtaccggtg gtggtaccgg tgactctttc 600 gttgttgctg gtcgtgttat gacctgcccg tctccggact tcaacttcct gttcctggtt 660 ccgccgaccg ttgaacagaa aacccgtccg ttcaccctgc cgaacctgcc gctgtcttct 720 ctgtctaact ctcgtgctcc gctgccgatc tcttctatgg gtatctctcc ggacaacgtt 780 cagtctgttc agttccagaa cggtcgttgc accctggacg gtcgtctggt tggtaccacc 840 ccggtttctc tgtctcacgt tgctaaaatc cgtggtacct ctaacggtac cgttatcaac 900 ctgaccgaac tggacggtac cccgttccac ccgttcgaag gtccggctcc gatcggtttc 960 ccggacctgg gtggttgcga ctggcacatc aacatgaccc agttcggtca ctcttctcag 1020 acccagtacg acgttgacac caccccggac accttcgttc cgcacctggg ttctatccag 1080 gctaacggta tcggttctgg taactacgtt ggtgttctgt cttggatctc tccgccgtct 1140 cacccgtctg gttctcaggt tgacctgtgg aaaatcccga actacggttc ttctatcacc 1200 gaagctaccc acctggctcc gtctgtttac ccgccgggtt tcggtgaagt tctggttttc 1260 ttcatgtcta aaatgccggg tccgggtgct tacaacctgc cgtgcctgct gccgcaggaa 1320 tacatctctc acctggcttc tgaacaggct ccgaccgttg gtgaagctgc tctgctgcac 1380 tacgttgacc cggacaccgg tcgtaacctg ggtgaattca aagcttaccc ggacggtttc 1440 ctgacctgcg ttccgaacgg tgcttcttct ggtccgcagc agctgccgat caacggtgtt 1500 ttcgttttcg tttcttgggt ttctcgtttc taccagctga aaccggttgg taccgcttct 1560 tctgctcgtg gtcgtctggg tctgcgtcgt atgatggcct atctggtttt tcttggtcca 1620 ccgggggcag gcaaaggtac ctatgcgaaa cgtttacagg aaatcaccgg catcccgcac 1680 attagcacgg gcgacatttt tcgtgatatt gtcaaaaagg aaaatgacga attaggtaag 1740 aaaattaaag aaattatgga gcgcggcgag ttggtgccgg acgaactggt gaatgaagtt 1800 gtcaaacgtc ggctgtctga aaaggattgc gaacgtggct ttattttgga cggttacccg 1860 cgtacagtag ctcaggcaga gtttctcgac ggcttcctga agactcagaa taaggagtta 1920 acggctgcgg tcctgttcga ggtgcctgaa gaggtggtcg ttcagcgtct gaccgcgcgg 1980 cgtatctgcc cgaagtgtgg tcgtatttac aacctgattt cacttcctcc aaaagaagat 2040 gaactgtgtg atgactgcaa agtaaaactg gtgcaacgcg aagatgataa agaggaaact 2100 gtgcgccatc gctacaaagt atatctggaa aaaacccaac cggttatcga ttattatgat 2160 aaaaaaggca ttttgaaacg cgttgatggg accatcggca tcgataacgt gattgccgaa 2220 gttctcaaaa tcattgggtg gagtgataaa 2250

<210> 61

<211> 750

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica de una proteína de la cápside de Norovirus (58kDa) fusionada en el extremo N-terminal de la adenilato quinasa de Thermotoga maritima

<400> 61

Met Met Met Ala Ser Lys Asp Ala Thr Ser Ser Val Asp Gly Ala Ser 1 5 10 15 Gly Ala Gly Gln Leu Val Pro Glu Val Asn Ala Ser Asp Pro Leu Ala 20 25 30 Met Asp Pro Val Ala Gly Ser Ser Thr Ala Val Ala Thr Ala Gly Gln 35 40 45 Val Asn Pro Ile Asp Pro Trp Ile Ile Asn Asn Phe Val Gln Ala Pro 50 55 60 Gln Gly Glu Phe Thr Ile Ser Pro Asn Asn Thr Pro Gly Asp Val Leu

65 70 75 80 Phe Asp Leu Ser Leu Gly Pro His Leu Asn Pro Phe Leu Leu His Leu 85 90 95 Ser Gln Met Tyr Asn Gly Trp Val Gly Asn Met Arg Val Arg Ile Met 100 105 110 Leu Ala Gly Asn Ala Phe Thr Ala Gly Lys Ile Ile Val Ser Cys Ile 115 120 125 Pro Pro Gly Phe Gly Ser His Asn Leu Thr Ile Ala Gln Ala Thr Leu

130 135 140

Phe Pro His Val Ile Ala Asp Val Arg Thr Leu Asp Pro Ile Glu Val

145 150 155 160

Pro Leu Glu Asp Val Arg Asn Val Leu Phe His Asn Asn Asp Arg Asn

165 170 175 Gln Gln Thr Met Arg Leu Val Cys Met Leu Tyr Thr Pro Leu Arg Thr 180 185 190 Gly Gly Gly Thr Gly Asp Ser Phe Val Val Ala Gly Arg Val Met Thr 195 200 205 Cys Pro Ser Pro Asp Phe Asn Phe Leu Phe Leu Val Pro Pro Thr Val

210 215 220

Glu Gln Lys Thr Arg Pro Phe Thr Leu Pro Asn Leu Pro Leu Ser Ser

225 230 235 240

Leu Ser Asn Ser Arg Ala Pro Leu Pro Ile Ser Ser Met Gly Ile Ser

245 250 255 Pro Asp Asn Val Gln Ser Val Gln Phe Gln Asn Gly Arg Cys Thr Leu 260 265 270 Asp Gly Arg Leu Val Gly Thr Thr Pro Val Ser Leu Ser His Val Ala 275 280 285 Lys Ile Arg Gly Thr Ser Asn Gly Thr Val Ile Asn Leu Thr Glu Leu

290 295 300

Asp Gly Thr Pro Phe His Pro Phe Glu Gly Pro Ala Pro Ile Gly Phe

305 310 315 320

Pro Asp Leu Gly Gly Cys Asp Trp His Ile Asn Met Thr Gln Phe Gly

325 330 335 His Ser Ser Gln Thr Gln Tyr Asp Val Asp Thr Thr Pro Asp Thr Phe 340 345 350 Val Pro His Leu Gly Ser Ile Gln Ala Asn Gly Ile Gly Ser Gly Asn 355 360 365 Tyr Val Gly Val Leu Ser Trp Ile Ser Pro Pro Ser His Pro Ser Gly

370 375 380

Ser Gln Val Asp Leu Trp Lys Ile Pro Asn Tyr Gly Ser Ser Ile Thr

385 390 395 400

Glu Ala Thr His Leu Ala Pro Ser Val Tyr Pro Pro Gly Phe Gly Glu

405 410 415 Val Leu Val Phe Phe Met Ser Lys Met Pro Gly Pro Gly Ala Tyr Asn 420 425 430 Leu Pro Cys Leu Leu Pro Gln Glu Tyr Ile Ser His Leu Ala Ser Glu 435 440 445 Gln Ala Pro Thr Val Gly Glu Ala Ala Leu Leu His Tyr Val Asp Pro

450 455 460

Asp Thr Gly Arg Asn Leu Gly Glu Phe Lys Ala Tyr Pro Asp Gly Phe

465 470 475 480

Leu Thr Cys Val Pro Asn Gly Ala Ser Ser Gly Pro Gln Gln Leu Pro

485 490 495 Ile Asn Gly Val Phe Val Phe Val Ser Trp Val Ser Arg Phe Tyr Gln 500 505 510 Leu Lys Pro Val Gly Thr Ala Ser Ser Ala Arg Gly Arg Leu Gly Leu 515 520 525 Arg Arg Met Met Ala Tyr Leu Val Phe Leu Gly Pro Pro Gly Ala Gly

530 535 540

Lys Gly Thr Tyr Ala Lys Arg Leu Gln Glu Ile Thr Gly Ile Pro His

545 550 555 560

Ile Ser Thr Gly Asp Ile Phe Arg Asp Ile Val Lys Lys Glu Asn Asp

565 570 575 Glu Leu Gly Lys Lys Ile Lys Glu Ile Met Glu Arg Gly Glu Leu Val 580 585 590 Pro Asp Glu Leu Val Asn Glu Val Val Lys Arg Arg Leu Ser Glu Lys 595 600 605 Asp Cys Glu Arg Gly Phe Ile Leu Asp Gly Tyr Pro Arg Thr Val Ala 610 615 620

Gln Ala Glu Phe Leu Asp Gly Phe Leu Lys Thr Gln Asn Lys Glu Leu

625 630 635 640

Thr Ala Ala Val Leu Phe Glu Val Pro Glu Glu Val Val Val Gln Arg 645 650 655 Leu Thr Ala Arg Arg Ile Cys Pro Lys Cys Gly Arg Ile Tyr Asn Leu 660 665 670 Ile Ser Leu Pro Pro Lys Glu Asp Glu Leu Cys Asp Asp Cys Lys Val 675 680 685 Lys Leu Val Gln Arg Glu Asp Asp Lys Glu Glu Thr Val Arg His Arg

690 695 700

Tyr Lys Val Tyr Leu Glu Lys Thr Gln Pro Val Ile Asp Tyr Tyr Asp

705 710 715 720

Lys Lys Gly Ile Leu Lys Arg Val Asp Gly Thr Ile Gly Ile Asp Asn

725 730 735 Val Ile Ala Glu Val Leu Lys Ile Ile Gly Trp Ser Asp Lys 740 745 750

<210> 62

<211> 130

<212> PRT

<213> Bacteriófago MS2

<400> 62

Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr

1 5 10 15

Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu

50 55 60

Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val

65 70 75 80

Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe

85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 Ile Tyr 130

<210> 63

<211> 127

<212> PRT

<213> Bacteriófago PP7

<400> 63

Ser Lys Thr Ile Val Leu Ser Val Gly Glu Ala Thr Arg Thr Leu Thr

1 5 10 15

Glu Ile Gln Ser Thr Ala Asp Arg Gln Ile Phe Glu Glu Lys Val Gly 20 25 30 Pro Leu Val Gly Arg Leu Arg Leu Thr Ala Ser Leu Arg Gln Asn Gly 35 40 45 Ala Lys Thr Ala Tyr Arg Val Asn Leu Lys Leu Asp Gln Ala Asp Val

50 55 60

Val Asp Cys Ser Thr Ser Val Cys Gly Glu Leu Pro Lys Val Arg Tyr

65 70 75 80

Thr Gln Val Trp Ser His Asp Val Thr Ile Val Ala Asn Ser Thr Glu

85 90 95 Ala Ser Arg Lys Ser Leu Tyr Asp Leu Thr Lys Ser Leu Val Val Gln 100 105 110 Ala Thr Ser Glu Asp Leu Val Val Asn Leu Val Pro Leu Gly Arg 115 120 125

<210> 64

<211> 245

<212> PRT

<213> Bacteriófago PP7

<400> 64

Met Ser Lys Thr Ile Val Leu Ser Val Gly Glu Ala Thr Arg Thr Leu

1 5 10 15

Thr Glu Ile Gln Ser Thr Ala Asp Arg Gln Ile Phe Glu Glu Lys Val 20 25 30 Gly Pro Leu Val Gly Arg Leu Arg Leu Thr Ala Ser Leu Arg Gln Asn 35 40 45 Gly Ala Lys Thr Ala Tyr Arg Val Asn Leu Lys Leu Asp Gln Ala Asp

50 55 60

Val Val Asp Ser Gly Leu Pro Lys Val Arg Tyr Thr Gln Val Trp Ser

65 70 75 80

His Asp Val Thr Ile Val Ala Asn Ser Thr Glu Ala Ser Arg Lys Ser

85 90 95 Leu Tyr Asp Leu Thr Lys Ser Leu Val Ala Thr Ser Gln Val Glu Asp 100 105 110 Leu Val Val Asn Leu Val Pro Leu Gly Arg Tyr Gly Ser Lys Thr Ile 115 120 125 Val Leu Ser Val Gly Glu Ala Thr Arg Thr Leu Thr Glu Ile Gln Ser

130 135 140

Thr Ala Asp Arg Gln Ile Phe Glu Glu Lys Val Gly Pro Leu Val Gly

145 150 155 160

Arg Leu Arg Leu Thr Ala Ser Leu Arg Gln Asn Gly Ala Lys Thr Ala

165 170 175 Tyr Arg Val Asn Leu Lys Leu Asp Gln Ala Asp Val Val Asp Ser Gly 180 185 190 Leu Pro Lys Val Arg Tyr Thr Gln Val Trp Ser His Asp Val Thr Ile 195 200 205 Val Ala Asn Ser Thr Glu Ala Ser Arg Lys Ser Leu Tyr Asp Leu Thr

210 215 220

Lys Ser Leu Val Ala Thr Ser Gln Val Glu Asp Leu Val Val Asn Leu

225 230 235 240

Val Pro Leu Gly Arg 245

<210> 65

<211> 151

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 65

Met Lys Leu Leu Lys Val Ala Ala Ile Ala Ala Ile Val Phe Ser Gly

1 5 10 15

Ser Ala Leu Ala Gly Val Val Pro Gln Tyr Gly Gly Gly Gly Asn His 20 25 30 Gly Gly Gly Gly Asn Asn Ser Gly Pro Asn Ser Glu Leu Asn Ile Tyr 35 40 45 Gln Tyr Gly Gly Gly Asn Ser Ala Leu Ala Leu Gln Thr Asp Ala Arg

50 55 60

Asn Ser Asp Leu Thr Ile Thr Gln His Gly Gly Gly Asn Gly Ala Asp

65 70 75 80

Val Gly Gln Gly Ser Asp Asp Ser Ser Ile Asp Leu Thr Gln Arg Gly

85 90 95 Phe Gly Asn Ser Ala Thr Leu Asp Gln Trp Asn Gly Lys Asn Ser Glu 100 105 110 Met Thr Val Lys Gln Phe Gly Gly Gly Asn Gly Ala Ala Val Asp Gln 115 120 125 Thr Ala Ser Asn Ser Ser Val Asn Val Thr Gln Val Gly Phe Gly Asn 130 135 140 Asn Ala Thr Ala His Gln Tyr

145 150

<210> 66

<211> 151

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica de la proteína AgfA de Salmonella

<400> 66

Met Lys Leu Leu Lys Val Ala Ala Phe Ala Ala Ile Val Val Ser Gly

1 5 10 15

Ser Ala Leu Ala Gly Val Val Pro Gln Trp Gly Gly Gly Gly Asn His 20 25 30 Asn Gly Gly Gly Asn Ser Ser Gly Pro Asp Ser Thr Leu Ser Ile Tyr 35 40 45 Gln Tyr Gly Ser Ala Asn Ala Ala Leu Ala Leu Gln Ser Asp Ala Arg

50 55 60

Lys Ser Glu Thr Thr Ile Thr Gln Ser Gly Tyr Gly Asn Gly Ala Asp

65 70 75 80

Val Gly Gln Gly Ala Asp Asn Ser Thr Ile Glu Leu Thr Gln Asn Gly

85 90 95 Phe Arg Asn Asn Ala Thr Ile Asp Gln Trp Asn Ala Lys Asn Ser Asp 100 105 110 Ile Thr Val Gly Gln Tyr Gly Gly Asn Asn Ala Ala Leu Val Asn Gln 115 120 125 Thr Ala Ser Asp Ser Ser Val Met Val Arg Gln Val Gly Phe Gly Asn

130 135 140

Asn Ala Thr Ala Asn Gln Tyr

145 150

<210> 67

<211> 353

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica de adenilato quinasa de Thermotoga maritime fusionada en el extremo N-terminal a CsgA de E.coli

<400> 67

Met Met Ala Tyr Leu Val Phe Leu Gly Pro Pro Gly Ala Gly Lys Gly

1 5 10 15

Thr Tyr Ala Lys Arg Ile Gln Glu Lys Thr Gly Ile Pro His Ile Ser 20 25 30 Thr Gly Asp Ile Phe Arg Asp Ile Val Lys Lys Glu Asn Asp Glu Leu 35 40 45 Gly Lys Lys Ile Lys Glu Ile Met Glu Lys Gly Glu Leu Val Pro Asp

50 55 60

Glu Leu Val Asn Glu Val Val Lys Arg Arg Leu Ser Glu Lys Asp Cys

65 70 75 80

Glu Lys Gly Phe Ile Leu Asp Gly Tyr Pro Arg Thr Val Ala Gln Ala

85 90 95 Glu Phe Leu Asp Ser Phe Leu Glu Ser Gln Asn Lys Gln Leu Thr Ala 100 105 110 Ala Val Leu Phe Asp Val Pro Glu Asp Val Val Val Gln Arg Leu Thr 115 120 125 Ser Arg Arg Ile Cys Pro Lys Cys Gly Arg Ile Tyr Asn Met Ile Ser 130 135 140 Leu Pro Pro Lys Glu Asp Glu Leu Cys Asp Asp Cys Lys Val Lys Leu

145 150 155 160 Val Gln Arg Asp Asp Asp Lys Glu Glu Thr Val Arg His Arg Tyr Lys 165 170 175 Val Tyr Leu Glu Lys Thr Gln Pro Val Ile Asp Tyr Tyr Gly Lys Lys 180 185 190 Gly Ile Leu Lys Arg Val Asp Gly Thr Ile Gly Ile Asp Asn Val Val 195 200 205 Ala Glu Val Leu Lys Ile Ile Gly Trp Ser Asp Lys Gly Ser Gly Val

210 215 220

Val Pro Gln Tyr Gly Gly Gly Gly Asn His Gly Gly Gly Gly Asn Asn

225 230 235 240

Ser Gly Pro Asn Ser Glu Leu Asn Ile Tyr Gln Tyr Gly Gly Gly Asn

245 250 255 Ser Ala Leu Ala Leu Gln Thr Asp Ala Arg Asn Ser Asp Leu Thr Ile 260 265 270 Thr Gln His Gly Gly Gly Asn Gly Ala Asp Val Gly Gln Gly Ser Asp 275 280 285 Asp Ser Ser Ile Asp Leu Thr Gln Arg Gly Phe Gly Asn Ser Ala Thr

290 295 300

Leu Asp Gln Trp Asn Gly Lys Asn Ser Glu Met Thr Val Lys Gln Phe

305 310 315 320

Gly Gly Gly Asn Gly Ala Ala Val Asp Gln Thr Ala Ser Asn Ser Ser

325 330 335 Val Asn Val Thr Gln Val Gly Phe Gly Asn Asn Ala Thr Ala His Gln 340 345 350 Tyr

<210> 68

<211> 83

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica de la proteína hidrofobina 3 de la especie Fusarium

<400> 68

Met Gln Phe Ser Thr Leu Thr Thr Val Phe Ala Leu Val Ala Ala Ala

1 5 10 15

Val Ala Ala Pro His Gly Ser Ser Gly Gly Asn Asn Pro Val Cys Ser 20 25 30 Ala Gln Asn Asn Gln Val Cys Cys Asn Gly Leu Leu Ser Cys Ala Val 35 40 45 Gln Val Leu Gly Ser Asn Cys Asn Gly Asn Ala Tyr Cys Cys Asn Thr

50 55 60

Glu Ala Pro Thr Gly Thr Leu Ile Asn Val Ala Leu Leu Asn Cys Val

65 70 75 80

Lys Leu Leu

<210> 69

<211> 98

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica de la proteína hidrofobina 5 de la especie Fusarium

<400> 69

Met Lys Phe Ser Leu Ala Ala Val Ala Leu Leu Gly Ala Val Val Ser

1 5 10 15

Ala Leu Pro Ala Asn Glu Lys Arg Gln Ala Tyr Ile Pro Cys Ser Gly 20 25 30

Leu Tyr Gly Thr Ser Gln Cys Cys Ala Thr Asp Val Leu Gly Val Ala 35 40 45

Asp Leu Asp Cys Gly Asn Pro Pro Ser Ser Pro Thr Asp Ala Asp Asn 50 55 60

Phe Ser Ala Val Cys Ala Glu Ile Gly Gln Arg Ala Arg Cys Cys Val

65 70 75 80

Leu Pro Ile Leu Asp Gln Gly Ile Leu Cys Asn Thr Pro Thr Gly Val 85 90 95

Gln Asp

<210> 70

<211> 173

<212> PRT

<213> Balanus albicostatus

<400> 70

Val Pro Pro Pro Cys Asp Leu Ser Ile Lys Ser Lys Leu Lys Gln Val

1 5 10 15

Gly Ala Thr Ala Gly Asn Ala Ala Val Thr Thr Thr Gly Thr Thr Ser 20 25 30 Gly Ser Gly Val Val Lys Cys Val Val Arg Thr Pro Thr Ser Val Glu 35 40 45 Lys Lys Ala Ala Val Gly Asn Thr Gly Leu Ser Ala Val Ser Ala Ser

50 55 60

Ala Ala Asn Gly Phe Phe Lys Asn Leu Gly Lys Ala Thr Thr Glu Val

65 70 75 80

Lys Thr Thr Lys Asp Gly Thr Lys Val Lys Thr Lys Thr Ala Gly Lys

85 90 95 Gly Lys Thr Gly Gly Thr Ala Thr Thr Ile Gln Ile Ala Asp Ala Asn 100 105 110 Gly Gly Val Ser Glu Lys Ser Leu Lys Leu Asp Leu Leu Thr Asp Gly 115 120 125 Leu Lys Phe Val Lys Val Thr Glu Lys Lys Gln Gly Thr Ala Thr Ser

130 135 140

Ser Ser Gly His Lys Ala Ser Gly Val Gly His Ser Val Phe Lys Val

145 150 155 160

Leu Asn Glu Ala Glu Thr Glu Leu Glu Leu Lys Gly Leu 165 170

<210> 71

<211> 202

<212> PRT

<213> Megabalanus rosa

<400> 71

Met Lys Trp Phe Leu Phe Leu Leu Thr Thr Ala Val Leu Ala Ala Val

1 5 10 15

Val Ser Ala His Glu Glu Asp Gly Val Cys Asn Ser Asn Ala Pro Cys 20 25 30 Tyr His Cys Asp Ala Asn Gly Glu Asn Cys Ser Cys Asn Cys Glu Leu 35 40 45 Phe Asp Cys Glu Ala Lys Lys Pro Asp Gly Ser Tyr Ala His Pro Cys

50 55 60

Arg Arg Cys Asp Ala Asn Asn Ile Cys Lys Cys Ser Cys Thr Ala Ile

65 70 75 80

Pro Cys Asn Glu Asp His Pro Cys His His Cys His Glu Glu Asp Asp

85 90 95 Gly Asp Thr His Cys His Cys Ser Cys Glu His Ser His Asp His His 100 105 110 Asp Asp Asp Thr His Gly Glu Cys Thr Lys Lys Ala Pro Cys Trp Arg 115 120 125 Cys Glu Tyr Asn Ala Asp Leu Lys His Asp Val Cys Gly Cys Glu Cys

130 135 140

Ser Lys Leu Pro Cys Asn Asp Glu His Pro Cys Tyr Arg Lys Glu Gly

145 150 155 160

Gly Val Val Ser Cys Asp Cys Lys Thr Ile Thr Cys Asn Glu Asp His

165 170 175 Pro Cys Tyr His Ser Tyr Glu Glu Asp Gly Val Thr Lys Ser Asp Cys 180 185 190 Asp Cys Glu His Ser Pro Gly Pro Ser Glu 195 200

<210> 72

<211> 576

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica de fusión de proteína de percebe de Balanus albicostatus con la adenilato quinasa de Thermotgoa maritima; fusión N-terminal

<400> 72

Met Arg Val Leu Val Ile Asn Ser Gly Ser Ser Ser Ile Lys Tyr Gln

1 5 10 15

Leu Ile Glu Met Glu Gly Glu Lys Val Leu Cys Lys Gly Ile Ala Glu 20 25 30 Arg Ile Gly Ile Glu Gly Ser Arg Leu Val His Arg Val Gly Asp Glu 35 40 45 Lys His Val Ile Glu Arg Glu Leu Pro Asp His Glu Glu Ala Leu Lys

50 55 60

Leu Ile Leu Asn Thr Leu Val Asp Glu Lys Leu Gly Val Ile Lys Asp

65 70 75 80

Leu Lys Glu Ile Asp Ala Val Gly His Arg Val Val His Gly Gly Glu

85 90 95 Arg Phe Lys Glu Ser Val Leu Val Asp Glu Glu Val Leu Lys Ala Ile 100 105 110 Glu Glu Val Ser Pro Leu Ala Pro Leu His Asn Pro Ala Asn Leu Met 115 120 125 Gly Ile Lys Ala Ala Met Lys Leu Leu Pro Gly Val Pro Asn Val Ala

130 135 140

Val Phe Asp Thr Ala Phe His Gln Thr Ile Pro Gln Lys Ala Tyr Leu

145 150 155 160

Tyr Ala Ile Pro Tyr Glu Tyr Tyr Glu Lys Tyr Lys Ile Arg Arg Tyr

165 170 175 Gly Phe His Gly Thr Ser His Arg Tyr Val Ser Lys Arg Ala Ala Glu 180 185 190 Ile Leu Gly Lys Lys Leu Glu Glu Leu Lys Ile Ile Thr Cys His Ile 195 200 205 Gly Asn Gly Ala Ser Val Ala Ala Val Lys Tyr Gly Lys Cys Val Asp

210 215 220

Thr Ser Met Gly Phe Thr Pro Leu Glu Gly Leu Val Met Gly Thr Arg

225 230 235 240

Ser Gly Asp Leu Asp Pro Ala Ile Pro Phe Phe Ile Met Glu Lys Glu

245 250 255 Gly Ile Ser Pro Gln Glu Met Tyr Asp Ile Leu Asn Lys Lys Ser Gly 260 265 270 Val Tyr Gly Leu Ser Lys Gly Phe Ser Ser Asp Met Arg Asp Ile Glu 275 280 285 Glu Ala Ala Leu Lys Gly Asp Glu Trp Cys Lys Leu Val Leu Glu Ile

290 295 300

Tyr Asp Tyr Arg Ile Ala Lys Tyr Ile Gly Ala Tyr Ala Ala Ala Met

305 310 315 320

Asn Gly Val Asp Ala Ile Val Phe Thr Ala Gly Val Gly Glu Asn Ser

325 330 335 Pro Ile Thr Arg Glu Asp Val Cys Ser Tyr Leu Glu Phe Leu Gly Val 340 345 350 Lys Leu Asp Lys Gln Lys Asn Glu Glu Thr Ile Arg Gly Lys Glu Gly

355 360 365

Ile Ile Ser Thr Pro Asp Ser Arg Val Lys Val Leu Val Val Pro Thr 370 375 380

Asn Glu Glu Leu Met Ile Ala Arg Asp Thr Lys Glu Ile Val Glu Lys

385 390 395 400

Ile Gly Arg Val Pro Pro Pro Cys Asp Leu Ser Ile Lys Ser Lys Leu

405 410 415 Lys Gln Val Gly Ala Thr Ala Gly Asn Ala Ala Val Thr Thr Thr Gly 420 425 430 Thr Thr Ser Gly Ser Gly Val Val Lys Cys Val Val Arg Thr Pro Thr 435 440 445 Ser Val Glu Lys Lys Ala Ala Val Gly Asn Thr Gly Leu Ser Ala Val

450 455 460

Ser Ala Ser Ala Ala Asn Gly Phe Phe Lys Asn Leu Gly Lys Ala Thr

465 470 475 480

Thr Glu Val Lys Thr Thr Lys Asp Gly Thr Lys Val Lys Thr Lys Thr

485 490 495 Ala Gly Lys Gly Lys Thr Gly Gly Thr Ala Thr Thr Ile Gln Ile Ala 500 505 510 Asp Ala Asn Gly Gly Val Ser Glu Lys Ser Leu Lys Leu Asp Leu Leu 515 520 525 Thr Asp Gly Leu Lys Phe Val Lys Val Thr Glu Lys Lys Gln Gly Thr

530 535 540

Ala Thr Ser Ser Ser Gly His Lys Ala Ser Gly Val Gly His Ser Val

545 550 555 560

Phe Lys Val Leu Asn Glu Ala Glu Thr Glu Leu Glu Leu Lys Gly Leu 565 570 575

<210> 73

<211> 575

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica de fusión de proteína de percebe de Balanus albicostatus con la adenilato quinasa de Thermotgoa maritima; fusión C-terminal

<400> 73

Val Pro Pro Pro Cys Asp Leu Ser Ile Lys Ser Lys Leu Lys Gln Val

1 5 10 15

Gly Ala Thr Ala Gly Asn Ala Ala Val Thr Thr Thr Gly Thr Thr Ser 20 25 30 Gly Ser Gly Val Val Lys Cys Val Val Arg Thr Pro Thr Ser Val Glu 35 40 45 Lys Lys Ala Ala Val Gly Asn Thr Gly Leu Ser Ala Val Ser Ala Ser

50 55 60

Ala Ala Asn Gly Phe Phe Lys Asn Leu Gly Lys Ala Thr Thr Glu Val

65 70 75 80

Lys Thr Thr Lys Asp Gly Thr Lys Val Lys Thr Lys Thr Ala Gly Lys

85 90 95 Gly Lys Thr Gly Gly Thr Ala Thr Thr Ile Gln Ile Ala Asp Ala Asn 100 105 110 Gly Gly Val Ser Glu Lys Ser Leu Lys Leu Asp Leu Leu Thr Asp Gly 115 120 125 Leu Lys Phe Val Lys Val Thr Glu Lys Lys Gln Gly Thr Ala Thr Ser

130 135 140

Ser Ser Gly His Lys Ala Ser Gly Val Gly His Ser Val Phe Lys Val

145 150 155 160

Leu Glu Ala Glu Thr Glu Leu Glu Leu Lys Gly Leu Met Arg Val Leu

165 170 175 Val Ile Asn Ser Gly Ser Ser Ser Ile Lys Tyr Gln Leu Ile Glu Met 180 185 190 Glu Gly Glu Lys Val Leu Cys Lys Gly Ile Ala Glu Arg Ile Gly Ile 195 200 205 Glu Gly Ser Arg Leu Val His Arg Val Gly Asp Glu Lys His Val Ile

210 215 220

Glu Arg Glu Leu Pro Asp His Glu Glu Ala Leu Lys Leu Ile Leu Asn

225 230 235 240

Thr Leu Val Asp Glu Lys Leu Gly Val Ile Lys Asp Leu Lys Glu Ile

245 250 255 Asp Ala Val Gly His Arg Val Val His Gly Gly Glu Arg Phe Lys Glu 260 265 270 Ser Val Leu Val Asp Glu Glu Val Leu Lys Ala Ile Glu Glu Val Ser 275 280 285 Pro Leu Ala Pro Leu His Asn Pro Ala Asn Leu Met Gly Ile Lys Ala

290 295 300

Ala Met Lys Leu Leu Pro Gly Val Pro Asn Val Ala Val Phe Asp Thr

305 310 315 320

Ala Phe His Gln Thr Ile Pro Gln Lys Ala Tyr Leu Tyr Ala Ile Pro

325 330 335 Tyr Glu Tyr Tyr Glu Lys Tyr Lys Ile Arg Arg Tyr Gly Phe His Gly 340 345 350 Thr Ser His Arg Tyr Val Ser Lys Arg Ala Ala Glu Ile Leu Gly Lys 355 360 365 Lys Leu Glu Glu Leu Lys Ile Ile Thr Cys His Ile Gly Asn Gly Ala

370 375 380

Ser Val Ala Ala Val Lys Tyr Gly Lys Cys Val Asp Thr Ser Met Gly

385 390 395 400

Phe Thr Pro Leu Glu Gly Leu Val Met Gly Thr Arg Ser Gly Asp Leu

405 410 415 Asp Pro Ala Ile Pro Phe Phe Ile Met Glu Lys Glu Gly Ile Ser Pro 420 425 430 Gln Glu Met Tyr Asp Ile Leu Asn Lys Lys Ser Gly Val Tyr Gly Leu 435 440 445 Ser Lys Gly Phe Ser Ser Asp Met Arg Asp Ile Glu Glu Ala Ala Leu

450 455 460

Lys Gly Asp Glu Trp Cys Lys Leu Val Leu Glu Ile Tyr Asp Tyr Arg

465 470 475 480

Ile Ala Lys Tyr Ile Gly Ala Tyr Ala Ala Ala Met Asn Gly Val Asp

485 490 495 Ala Ile Val Phe Thr Ala Gly Val Gly Glu Asn Ser Pro Ile Thr Arg 500 505 510 Glu Asp Val Cys Ser Tyr Leu Glu Phe Leu Gly Val Lys Leu Asp Lys 515 520 525 Gln Lys Asn Glu Glu Thr Ile Arg Gly Lys Glu Gly Ile Ile Ser Thr

530 535 540

Pro Asp Ser Arg Val Lys Val Leu Val Val Pro Thr Asn Glu Glu Leu

545 550 555 560

Met Ile Ala Arg Asp Thr Lys Glu Ile Val Glu Lys Ile Gly Arg 565 570 575

<210> 74

<211> 125

<212> PRT

<213> Balanus albicostatus

<400> 74

Met Lys Tyr Thr Leu Ala Leu Leu Phe Leu Thr Ala Ile Ile Ala Thr

1 5 10 15

Phe Val Ala Ala His Lys His His Asp His Gly Lys Ser Cys Ser Lys 20 25 30 Ser His Pro Cys Tyr His Cys His Thr Asp Cys Glu Cys Asn His His 35 40 45 His Asp Asp Cys Asn Arg Ser His Arg Cys Trp His Lys Val His Gly

50 55 60

Val Val Ser Gly Asn Cys Asn Cys Asn Leu Leu Thr Pro Cys Asn Gln

65 70 75 80

Lys His Pro Cys Trp Arg Arg His Gly Lys Lys His Gly Leu His Arg

85 90 95 Lys Phe His Gly Asn Ala Cys Asn Cys Asp Arg Leu Val Cys Asn Ala 100 105 110 Lys His Pro Cys Trp His Lys His Cys Asp Cys Phe Cys

115 120 125

<210> 75

<211> 24

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica de un péptido derivado de una proteína de cemento de percebe

<400> 75

Ser Lys Leu Pro Cys Asn Asp Glu His Pro Cys Tyr Arg Lys Glu Gly 1 5 10 15 Gly Val Val Ser Cys Asp Cys Lys

<210> 76

<211> 24

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica de un péptido derivado de una proteína de cemento de percebe

<400> 76

Ser Lys Leu Pro Ser Asn Asp Glu His Pro Ser Tyr Arg Lys Glu Gly 1 5 10 15 Gly Val Val Ser Ser Asp Ser Lys

<210> 77

<211> 28

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica de un péptido derivado de una proteína de cemento de percebe

<400> 77

Lys Thr Ile Thr Cys Asn Glu Asp His Pro Cys Tyr His Ser Tyr Glu 1 5 10 15 Glu Asp Gly Val Thr Lys Ser Asp Cys Asp Cys Glu

20 25

Claims (24)

1. REIVINDICACIONES

   1. Método de validación de un proceso de tratamiento para reducir la cantidad o actividad de un contaminante en una muestra, que comprende las etapas de:

   (a)

   obtener una muestra que contiene o es sospechosa de contener un contaminante;

   (b)

   someter la muestra a un proceso de tratamiento en presencia de una cantidad definida de un indicador de proceso biológico que comprende una quinasa termoestable unida covalentemente a un componente biológico;

   (c)

   medir la actividad residual de quinasa y opcionalmente calcular la reducción en la actividad de quinasa; y

   (d)

   comparar dicha actividad residual de quinasa con una actividad de quinasa predeterminada, o comparar dicha reducción en la actividad de quinasa con una reducción predeterminada en la actividad de quinasa, donde la actividad predeterminada de quinasa o la reducción predeterminada en la actividad de quinasa corresponde a una reducción confirmada en la cantidad o actividad del contaminante bajo las mismas condiciones.

2. 2.

   Método según la reivindicación 1, en el que la reducción predeterminada en la actividad de quinasa es por lo menos una reducción de 3 veces logarítmicas, o por lo menos una reducción de 6 veces logarítmicas, o por lo menos una reducción de 7 veces logarítmicas, o por lo menos una reducción de 8 veces logarítmicas.

3. 3.

   Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la reducción confirmada en la cantidad o actividad del contaminante es por lo menos una reducción de 3 veces logarítmicas, o por lo menos una reducción de 6 veces logarítmicas, o por lo menos una reducción de 7 veces logarítmicas, o por lo menos una reducción de 8 veces logarítmicas.

4. 4.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende medir la actividad de quinasa antes de tratar la muestra y después de tratar la muestra.

5. 5.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende tratar la muestra a 80°C durante por lo menos 10 minutos antes de medir la actividad residual de la quinasa.

6. 6.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la medición de la actividad residual de la quinasa comprende añadir un sustrato que comprende ADP a la quinasa residual y medir la formación de ATP.

7. 7.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende continuar el tratamiento hasta que la actividad residual de quinasa o la reducción en la actividad de quinasa corresponda a una reducción confirmada en la cantidad o actividad del contaminante de por lo menos 3 veces logarítmicas, o por lo menos 6 veces logarítmicas,

   o por lo menos 7 veces logarítmicas, o por lo menos 8 veces logarítmicas.

8. 8.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende además la etapa de registrar los datos obtenidos en la etapa (c) en un portador de datos adecuado.

9. 9.

   Utilización de una quinasa termoestable unida covalentemente a un componente biológico como un indicador de procesos biológicos para validar un proceso de tratamiento para reducir la cantidad o actividad de un contaminante en una muestra.

10. 10.

    Indicador de proceso biológico para validar un proceso de tratamiento en el que se reduce la cantidad o actividad de un contaminante en una muestra, en el que el indicador comprende una quinasa termoestable unida covalentemente a un componente biológico, y en el que el componente biológico no es un anticuerpo, y en el que el componente biológico se selecciona del grupo que consiste en: una proteína de la sangre; una proteína fúngica seleccionada del grupo que consiste en proteínas de hidrofobinas, proteínas de esporas fúngicas, proteínas hifales, micotoxinas y priones fúngicos; una proteína de autoagregación seleccionada del grupo que consiste en priones, proteínas miméticas de priones, fibrilas amiloides, proteína beta amiloide, proteína tau, proteína de unión a poliadenina, proteína C de surfactante de pulmón, hidrofobinas, chaplinas, rodlinas, proteínas de cubiertas de esporas gram positivas, y proteínas de tipo cemento de percebe; una proteína fimbrial bacteriana; una proteína de toxina bacteriana; una proteína de espora bacteriana; un ácido nucleico; un lípido; y un carbohidrato.

11. 11.

    Indicador de proceso biológico según la reivindicación 10, en el que dicha proteína de sangre se selecciona del grupo que consiste en proteínas de coagulación de la sangre, proteínas del suero, proteínas de plaquetas, glicoproteínas de células sanguíneas y hemoglobina, preferiblemente en el que dicha proteína de coagulación de la sangre se selecciona del grupo que consiste en fibrina, fibrinógeno y sustratos de transglutaminasa.

12. 12.

    Indicador de proceso biológico según la reivindicación 10, en el que el ácido nucleico se selecciona entre una molécula de ADN o una molécula de ARN.

13. 13.

    Indicador de proceso biológico según la reivindicación 10, en el que el carbohidrato se selecciona del grupo que consiste en exopolisacárido, lipopolisacárido, peptidoglicano, quitina, glucano, lignina, mucina, glicolípidos, glicoproteínas, extractos de esporas, polisacáridos de cápsulas de levadura, y secreciones de invertebrados.

14. 14.

    Indicador de proceso biológico según la reivindicación 10, en el que el lípido se selecciona del grupo que consiste en glicolípidos y gangliósidos.

15. 15.

    Indicador de proceso biológico según las reivindicaciones 10-13, en el que el indicador es parte de una matriz biológica, preferiblemente en el que la matriz biológica es un mimético de la muestra.

16. 16.

    Indicador de proceso biológico según la reivindicación 15, en el que la matriz biológica comprende uno o más componentes seleccionados del grupo que consiste en sangre, suero, albúmina, moco, óvulo, tejido neurológico, alimento, material de animal sacrificado y una muestra de contaminante de análisis disponible comercialmente.

17. 17.

    Indicador de proceso biológico según las reivindicaciones 10-16, en el que la quinasa termoestable es adenilato quinasa, acetato quinasa o piruvato quinasa.

18. 18.

    Indicador de proceso biológico según las reivindicaciones 10-17, en el que el indicador comprende además un agente para estabilizar la quinasa, preferiblemente el agente estabilizante se selecciona del grupo que consiste en iones metálicos, azúcares, alcoholes de azúcares y agentes formadores de geles.

19. 19.

    Indicador de proceso biológico según las reivindicaciones 10-18, en el que el componente biológico y la quinasa están unidas juntas en forma de una proteína de fusión.

20. 20.

    Indicador de proceso biológico según las reivindicaciones 10-19, en el que el indicador de proceso biológico está inmovilizado en o sobre un soporte sólido, preferiblemente en el que el indicador de proceso biológico está inmovilizado en o sobre el soporte sólido mediante reticulación o adsorción química.

21. 21.

    Indicador de proceso biológico según la reivindicación 20, en el que el soporte sólido es una tira indicadora, una tira reactiva o una microesfera.

22. 22.

    Kit para utilizar en la validación de un proceso de tratamiento en el que se reduce la cantidad o actividad de un contaminante en una muestra, que comprende:

    (a)

    un indicador de proceso biológico según cualquiera de las reivindicaciones 10-21, y

    (b)

    un sustrato para la quinasa termoestable, preferiblemente en el que el sustrato para la quinasa termoestable es ADP.

23. 23.

    Kit según la reivindicación 18, que comprende además luciferina/luciferasa; y/o que comprende además una tabla de búsqueda que correlaciona la actividad de quinasa del indicador con la cantidad o actividad del contaminante.

24. 24.

    Método según la reivindicación 1, en el que el indicador de proceso biológico en la etapa (B) es un indicador de proceso biológico según cualquiera de las reivindicaciones 10-21, o la utilización de un indicador biológico según cualquiera de las reivindicaciones 10-21, para validar un proceso de tratamiento para reducir la cantidad o actividad de un contaminante en una muestra.

    Figura 1 Figura 2 Figura 3 Figura 4 Figura 5 Figura 6 Figura 7 Figura 8 Figura 9