ES2978162T3 - Método para producir un agente de detección de endotoxinas que comprende el factor C recombinante de Limulus y su uso - Google Patents
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Abstract
Se proporcionan: todas las proteínas recombinantes de longitud completa que están implicadas en el mecanismo de coagulación de Limulus polyphemus; moléculas de ADNc que codifican las proteínas recombinantes de longitud completa; y usos de las proteínas recombinantes de longitud completa. Proteína recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 o 4, una proteína recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12, una proteína recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20 o 22, y variantes de las mismas; moléculas de ADNc que codifican las proteínas recombinantes y las variantes de las mismas; y usos de las proteínas recombinantes y las variantes de las mismas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Método para producir un agente de detección de endotoxinas que comprende el factor C recombinante deLimulusy su uso
La presente invención se refiere a determinados agentes detectores de endotoxinas, así como a los métodos correspondientes para detectar una endotoxina usando dichos agentes.
Los cangrejos herradura se dice que son "fósiles vivientes" y sólo existen dos géneros y cuatro especies en la Tierra. Como géneros, sólo "el géneroLimulus"vive únicamente en la costa este del continente norteamericano y "el géneroTachypleus"vive únicamente en la zona marítima del sureste de Asia.
Una distribución en la que un grupo de organismos está distribuido por separado en regiones alejadas entre sí se denomina "distribución discontinua", y los organismos que están separados en dos regiones de la Tierra, como los cangrejos herradura, son muy raros.
Los organismos pertenecientes al géneroLimulusestán asignados a una sola especie:Limulus polyphemus,y los organismos pertenecientes al géneroTachypleusestán asignados a solo tres especies:Tachypleus tridentatus, Tachypleus gigasyTachypleus rotundicauda(también llamadoCarcinoscorpius rotundicauda).
Se sabe que cuando un extracto de los amebocitos (lisado de amebocitos) presentes en la sangre de este organismo entra en contacto con una endotoxina, el extracto se coagula. Debido a esta propiedad, el lisado de amebocitos se ha utilizado ampliamente para el control de calidad de las preparaciones farmacéuticas o similares como reactivo para detectar una endotoxina con alta sensibilidad.
Este reactivo se llama "reactivo de lisado". Además, la propiedad de coagulación en presencia de una endotoxina se encontró por primera vez enLimulus polyphemusy, por lo tanto, este reactivo a veces se denomina "reactivo deLimulus"o "reactivo LAL (lisado de amebocitos deLimulus)".Incluso un reactivo que utiliza un lisado de amebocitos obtenido del géneroTachypleusse denomina habitualmente "reactivo deLimulus"o "reactivo LAL".
En la actualidad, el reactivo de lisado (reactivo deLimuluso reactivo LAL) utilizado por los fabricantes farmacéuticos en Japón, EE. UU. y Europa procede deLimulus polyphemuscomo materia prima. El número de capturas deLimulus polyphemusestá estrictamente limitado debido a que preocupa su extinción, aunque algunos informes también dicen que la población sigue disminuyendo.
Para proteger los cangrejos herradura, se ha pensado que el reactivo se prepare produciendo artificialmente proteínas del lisado de amebocitos mediante una técnica recombinante (PTL 1 a PTL 8). Entonces, mediante la utilización de proteínas recombinantes, se lanzaron al mercado productos como PyroGene (marca registrada) (Lonza), EndoZyme (marca registrada) (Hyglos) y PyroSmart (marca registrada) (Seikagaku Corporation).
Sin embargo, todos ellos utilizan proteínas recombinantes procedentes de un organismo del géneroTachypleus,y no ha habido ningún informe sobre un reactivo que utilice las proteínas recombinantes obtenidas deLimulus polyphemusque se ha utilizado ampliamente como reactivo de lisado.
La razón de esto es que las proteínas implicadas en el mecanismo de aparición de la coagulación por una endotoxina y sus genes enLimulus polyphemusno se han identificado por completo desde el punto de vista estructural y funcional.
En el géneroTachypleus,por ejemplo, con respecto al factor C, que es una de las proteínas implicadas en el mecanismo de coagulación, se describió en 1991 una secuencia génica completa y una secuencia completa de aminoácidos obtenida deTachypleus tridentatus(NPL 1), y en 1995 se describió una secuencia génica completa y una secuencia completa de aminoácidos obtenidas deTachypleus rotundicauda (Carcinoscorpius rotundicauda)(NPL 2).
Sin embargo, enLimulus polyphemusno se ha logrado la identificación completa de estas proteínas y genes ni desde el punto de vista estructural ni del funcional a pesar de que han pasado 20 años o más desde que se publicaron los resultados sobre el géneroTachypleusdescrito anteriormente. Esto se debe a que la determinación exacta de las estructuras de secuencia completa y la elucidación de la expresión y función de estas proteínas y genes no se pudieron lograr mediante las técnicas generales debido a diversas diferencias en biomoléculas, diversidades, etc., debido a las diferencias en los géneros o especies de los cangrejos herradura.
De hecho, como parte del proyecto de genomas de invertebrados utilizando un secuenciador de última generación, se ha llevado a cabo un análisis exhaustivo de genes deLimulus polyphemus(http://genome.wustl.edu/genomes/detail/limulus-polyphemus/), aunque aún no se han dilucidado las secuencias completas de todas las proteínas y genes implicados en el mecanismo de coagulación deLimulus polyphemus.Este hecho también respalda lo difícil que es la determinación exacta de las estructuras de secuencia completa de estas proteínas y genes enLimulus polyphemus.
En este contexto, Tokunaga et al. (Tokunaga, F. et al.;J. Biochem.,109; págs. 150-157; 1991) describieron el aislamiento del factor C deLimulus polyphemusy su caracterización como un zimógeno intracelular que se activa mediante la quimotripsina a. Además, la patente europea EP 2 930 241 A1 describe la expresión de un factor C recombinante del cangrejo herradura en las células de mamíferos.
Bibliografía de patentes
PTL 1: Patente de los EE. UU. n.° 5,712,144
PTL 2: Patente de los EE. UU. n.° 5,716,834
PTL 3: Patente de los EE. UU. n.° 5,858,706
PTL 4: Patente de los EE. UU. n.° 5,985,590
PTL 5: Patente de los EE. UU. n.° 6,645,724
PTL 6: Solicitud de patente internacional WO 2008/004674
PTL 7: Patente japonesa JP-T-2014-510898
PTL 8: Solicitud de patente internacional WO 2014/092079
Bibliografía que no son patentes
NPL 1: Muta T et al.,Journal of Biological Chemistry,266, 6554-6561 (1991)
NPL 2: Ding JL et al.,Molecular Marine Biology and Biotechnology,4(1), 90-103 (1995)
Un objeto de la presente invención es dar a conocer todas las proteínas recombinantes completas implicadas en el mecanismo de coagulación deLimulus polyphemus,los ADNc que las codifican y sus aplicaciones.
Los presentes inventores lograron obtener los ADNc completos que codifican todos los factores proteicos implicados en el mecanismo de coagulación deLimulus polyphemus,algo que nadie había logrado durante mucho tiempo, y la expresión de todas las proteínas recombinantes de los mismos, y descubrieron además que estas se pueden utilizar en diversas aplicaciones, y así completar la presente invención.
Es decir, la presente invención está caracterizada en las reivindicaciones adjuntas.
En las figuras se muestra:
La figura 1 es una fotografía de la electroforesis de un producto de PCR en un procedimiento para obtener un ADNc de una proteína que tiene actividad de factor C deLimulus polyphemus.
La figura 2 es una fotografía de la electroforesis de un producto de PCR en un procedimiento para obtener un ADNc de una proteína que tiene actividad de factor C deLimulus polyphemus.
La figura 3 es una figura en la que se muestra la actividad de escisión de un sustrato sintético al entrar en contacto cada proteína recombinante sola o varias mezclas de proteínas recombinantes con una endotoxina.
La figura 4 es una figura que muestra una curva de calibración de una endotoxina usando una mezcla de tres tipos de proteínas recombinantes.
<1> Primera proteína recombinante y método para producirla
(1) Primera proteína recombinante
Una primera proteína recombinante es una proteína recombinante que tiene actividad de factor C.
La primera proteína recombinante es específicamente una proteína recombinante que es alguna de las siguientes:
(I) una proteína recombinante que contiene una secuencia de aminoácidos de la proteína deLimulus polyphemusque tiene actividad de factor C; y
(II) una proteína recombinante que es una variante de la anterior (I) y tiene actividad de factor C.
Los ejemplos de secuencia de aminoácidos de la proteína deLimulus polyphemusque tiene actividad de factor C incluyen las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID n.os 2 o 4. Además, los ejemplos de una secuencia de bases que codifica dicha secuencia de aminoácidos incluyen las secuencias de bases representadas por las SEQ ID n.os 1 o 3.
La primera proteína recombinante puede ser más específicamente una proteína recombinante que es alguna de las siguientes:
(A) una proteína recombinante que contiene la secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID n.os 2 o 4;
(B) una proteína recombinante que contiene una secuencia de aminoácidos que tiene un 95 % o más de identidad con la secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID n.os 2 o 4, y que tiene actividad de factor C;
(C) una proteína recombinante que está codificada por un ADN que contiene una secuencia de bases que tiene un 95 % o más de identidad con las secuencias de bases representadas por las SEQ ID n.os 1 o 3, y que tiene actividad de factor C; y
(D) una proteína recombinante que está codificada por un ADN que se hibrida con un ADN compuesto por una secuencia complementaria a las secuencias de bases representadas por las SEQ ID n.os 1 o 3 en condiciones rigurosas, y que tiene actividad de factor C.
Obsérvese que la expresión "que contiene una secuencia de aminoácidos" o "que contiene una secuencia de bases" también incluye un caso de "estar compuesto por la secuencia de aminoácidos" o un caso de "estar compuesto por la secuencia de bases".
Esta proteína se obtuvo por primera vez en el mundo mediante el método descrito en los ejemplos de esta descripción, y se dilucidaron por primera vez la estructura de la secuencia completa y su función. La función de la proteína es la función de convertirse en una forma activa en presencia de una endotoxina y convertir una proteína que tiene actividad de factor B, tal como la segunda proteína mencionada a continuación, en una forma activa (denominada "actividad de factor C" en esta solicitud de patente). La primera proteína recombinante puede ser una proteína que presenta actividad de factor C en combinación con al menos la segunda proteína, tal como una segunda proteína recombinante.
Si se puede confirmar si tiene actividad de factor C detectando el progreso de una reacción en cascada en presencia de una endotoxina cuando se combina una proteína recombinante deseada con una proteína (que no está en una forma activa, en lo sucesivo denominada "forma inactiva") que tiene actividad de factor B, tal como la segunda proteína (forma inactiva), una proteína (forma inactiva) que tiene actividad enzimática procoagulante, tal como una tercera proteína (forma inactiva), y un sustrato para la detección.
La "reacción en cascada" se refiere a una serie de reacciones en las que una proteína (forma inactiva) que tiene actividad de factor C es activada por una endotoxina, una proteína (forma inactiva) que tiene actividad de factor B es activada por la proteína (forma activa) que tiene actividad de factor C, y una proteína (forma inactiva) que tiene actividad enzimática procoagulante es activada por la proteína (forma activa) que tiene actividad de factor B. El progreso de la reacción en cascada se puede detectar mediante la escisión de un sustrato para la detección.
Entre las primeras proteínas recombinantes, la más preferida es la proteína recombinante (I) mencionada anteriormente, tal como la proteína recombinante (A) mencionada anteriormente, pero la proteína recombinante puede ser una variante de la misma siempre que tenga actividad de factor C.
La variante puede ser, por ejemplo, una proteína recombinante que contiene una secuencia de aminoácidos que incluye una sustitución, una deleción, una inserción y/o una adición de uno o varios aminoácidos en uno o varios sitios de una secuencia de aminoácidos (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID n.os 2 o 4) de la primera proteína recombinante como se describió anteriormente, y que tiene actividad de factor C. El término "uno o varios" puede ser, por ejemplo, de 1 a 20, de 1 a 10, de 1 a 5 o de 1 a 3. La sustitución, eliminación, inserción y/o adición de uno o varios aminoácidos es una mutación conservativa que mantiene la función de la proteína normal. Una mutación conservativa representativa es una sustitución conservativa. La sustitución conservativa es, por ejemplo, una mutación en la que se produce una sustitución mutua entre Phe, Trp y Tyr cuando el sitio de sustitución es un aminoácido aromático, entre Leu, Ile y Val cuando el sitio de sustitución es un aminoácido hidrófobo, entre Gln y Asn cuando el sitio de sustitución es un aminoácido polar, entre Lys, Arg e His cuando el sitio de sustitución es un aminoácido básico, entre Asp y Glu cuando el sitio de sustitución es un aminoácido ácido, y entre Ser y Thr cuando el sitio de sustitución es un aminoácido que tiene un grupo hidroxilo. Los ejemplos específicos de la sustitución considerada como una sustitución conservativa incluyen una sustitución de Ala por Ser o Thr, una sustitución de Arg por Gln, His o Lys, una sustitución de Asn por Glu, Gln, Lys, His o Asp, una sustitución de Asp por Asn, Glu o Gln, una sustitución de Cys por Ser o Ala, una sustitución de Gln por Asn, Glu, Lys, His, Asp o Arg, una sustitución de Glu por Gly, Asn, Gln, Lys o Asp, una sustitución de Gly por Pro, una sustitución de His por Asn, Lys, Gln, Arg o Tyr, una sustitución de Ile por Leu, Met, Val o Phe, una sustitución de Leu por Ile, Met, Val, o Phe, una sustitución de Lys por Asn, Glu, Gln, His o Arg, una sustitución de Met por Ile, Leu, Val o Phe, una sustitución de Phe por Trp, Tyr, Met, Ile o Leu, una sustitución de Ser por Thr o Ala, una sustitución de Thr por Ser o Ala, una sustitución de Trp por Phe o Tyr, una sustitución de Tyr por His, Phe o Trp, y una sustitución de Val por Met, Ile o Leu .
Además, la variante puede ser, por ejemplo, una proteína recombinante que contiene una secuencia de aminoácidos que tiene un 80 % o más, un 90 % o más, un 95 % o más, un 96 % o más, un 97 % o más, un 98 % o más, o un 99 % o más de identidad con una secuencia de aminoácidos (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID n.os 2 o 4) de la primera proteína recombinante como se describió anteriormente, y que tiene actividad de factor C.
Además, la variante puede ser, por ejemplo, una proteína recombinante que está codificada por un ADN que contiene una secuencia de bases que tiene un 80 % o más, un 90 % o más, un 95 % o más, un 96 % o más, un 97 % o más, un 98 % o más, o un 99 % o más de identidad con una secuencia de bases (por ejemplo, la secuencia de bases representada por las SEQ ID n.os 1 o 3) que codifica la secuencia de aminoácidos de la primera proteína recombinante como se describió anteriormente, y que tiene actividad de factor C.
Además, la variante puede ser, por ejemplo, una proteína recombinante que está codificada por un ADN que se hibrida en condiciones rigurosas con un ADN compuesto por una secuencia complementaria a una secuencia de bases (por ejemplo, la secuencia de bases representada por las SEQ ID n.os 1 o 3) que codifica la secuencia de aminoácidos de la primera proteína recombinante como se describió anteriormente, y que tiene actividad de factor C. El término "condiciones rigurosas" se refiere a las condiciones en las que se forma el llamado híbrido específico y no se forma ningún híbrido inespecífico mediante una operación de hibridación general descrita enMolecularCloning: A Laboratory Manual2.a ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory editado por T. Maniatis et al., o similares. El término "condiciones rigurosas" se refiere específicamente a las condiciones en las que la concentración de sal de sodio es de 15 a 750 mM, preferiblemente de 50 a 750 mM, más preferiblemente de 300 a 750 mM, la temperatura es de 25 a 70 °C, preferiblemente de 50 a 70 °C, más preferiblemente de 55 a 65 °C, y la concentración de formamida es del 0 al 50 %, preferiblemente del 20 al 50 %, más preferiblemente del 35 al 45 %. Además, en el caso de las condiciones rigurosas, las condiciones de lavado para un filtro después de la hibridación son tales que la concentración de sal de sodio es generalmente de 15 a 600 mM, preferiblemente de 50 a 600 mM, más preferiblemente de 300 a 600 mM, y la temperatura es de 50 a 70 °C, preferiblemente de 55 a 70 °C, más preferiblemente de 60 a 65 °C.
A modo de variante, se prefieren específicamente las proteínas recombinantes (B) a (D) mencionadas anteriormente. El término "95 % o más" en (B) y (C) anteriores es preferiblemente el 96 % o más, más preferiblemente el 97 % o más, más preferiblemente el 98 % o más, y más preferiblemente el 99 % o más.
Además, a la primera proteína recombinante, se le puede añadir un péptido arbitrario tal como una etiqueta de His o una etiqueta V, o similares, siempre que tenga actividad de factor C.
Además, el término "proteína recombinante" en esta solicitud se refiere a una proteína obtenida introduciendo artificialmente un gen que codifica una proteína en una célula hospedadora que no sea de cangrejo herradura y que expresa la proteína. Por lo tanto, la proteína obtenida de un cangrejo herradura natural en sí no corresponde a la "proteína recombinante" en este documento de solicitud.
(2) Método para producir la primera proteína recombinante
La secuencia de aminoácidos completa de la primera proteína recombinante se ha descrito por primera vez en la presente memoria y, por lo tanto, la primera proteína recombinante puede producirse mediante una técnica de ingeniería genética usando, por ejemplo, un ADN que codifica esta secuencia. Un método para producir la primera proteína recombinante mediante una técnica de ingeniería genética no está particularmente limitado y, por ejemplo, se puede adoptar un método general para producir una proteína mediante una técnica de ingeniería genética. La primera proteína recombinante se puede producir, por ejemplo, utilizando un sistema de expresión heterólogo o un sistema de síntesis de proteínas libre de células.
Por ejemplo, la primera proteína recombinante se puede producir introduciendo artificialmente el primer ADNc mencionado a continuación en una célula hospedadora que no sea de cangrejo herradura y que la proteína se exprese a partir de este ADNc. También se describe en la presente memoria un método para producir la primera proteína recombinante.
Cuando se introduce artificialmente un ADN en una célula hospedadora, se puede utilizar una construcción de ADN (tal como un vector) en la que el ADN se ha integrado artificialmente. Como tal construcción de ADN artificial, puede ejemplificarse, por ejemplo, una construcción de ADN en la que se ha integrado el primer ADNc. Una construcción de ADN artificial de este tipo se describirá más adelante.
La célula hospedadora que no es del cangrejo herradura no está particularmente limitada siempre que pueda expresar funcionalmente la proteína del primer ADNc. Los ejemplos de células hospedadoras que no son del cangrejo herradura incluyen células de mamíferos y células de insectos. Los ejemplos de mamíferos incluyen roedores y primates. Los ejemplos de roedores incluyen hámster chino, hámster, ratón, rata y cobaya. Los ejemplos de células de hámster chino incluyen una línea celular derivada de ovario de hámster chino (CHO). Los ejemplos de CHO incluyen CHO DG44, CHO S y CHO K1. Los primates no están particularmente limitados; sin embargo, sus ejemplos incluyen humanos, monos y chimpancés. Los ejemplos de células humanas incluyen una línea celular derivada de células de riñón embrionario humano (HEK). Los ejemplos de HEK incluyen HEK 293.
La frase "expresada funcionalmente" se refiere a que la primera proteína recombinante expresada muestra actividad de factor C. Se puede confirmar si una proteína muestra actividad de factor C mediante el método descrito en el ejemplo que se menciona a continuación. Además, se puede confirmar si la proteína expresada contiene una secuencia de aminoácidos deseada de cualquiera de las estructuras (A) a (D) mencionadas anteriormente o similares analizando la secuencia de aminoácidos de la proteína expresada y comparándola con la secuencia de aminoácidos deseada.
Una técnica para introducir artificialmente el primer ADNc en una célula hospedadora tampoco está particularmente limitada siempre que el ADNc quede retenido para su expresión en la célula hospedadora. Al hacer crecer la célula hospedadora en la que se ha introducido artificialmente el primer ADNc, se puede expresar la primera proteína recombinante.
El crecimiento de la célula hospedadora transformada se puede llevar a cabo, por ejemplo, cultivando la célula. Las condiciones de cultivo en este momento tampoco están particularmente limitadas siempre que la célula pueda crecer o proliferar, y las condiciones generalmente utilizadas para cultivar la célula pueden usarse modificándose apropiadamente según sea necesario. Por ejemplo, cuando la célula hospedadora es una célula de mamífero, se puede utilizar un medio de cultivo que se suela utilizar para cultivar la célula de mamífero. Como tal medio de cultivo, se puede utilizar, por ejemplo, medio RPMI-1640 (Sigma Aldrich Co. LLC.), medio DMEM (Sigma Aldrich Co. LLC.), medio de expresión ExpiCHO™ (Thermo Fisher Scientific) o similar. El cultivo se puede llevar a cabo, por ejemplo,<mediante cultivo estático, cultivo en suspensión o similar a entre 36 °C y 38 °C mientras se suministra CO>2<del 5 % al>8 %. Se puede utilizar un kit específico para la expresión de proteínas.
La primera proteína recombinante expresada se recoge como una fracción de solución que la contiene y se puede utilizar en diversas aplicaciones que se describen a continuación.
La fracción de solución que contiene la primera proteína recombinante es una solución de cultivo o un sobrenadante de cultivo. La primera proteína recombinante se puede usar purificándola hasta el grado deseado o se puede usar tal cual sin purificación.
La purificación se puede llevar a cabo mediante un método conocido utilizado para purificar una proteína. Los ejemplos de dicho método incluyen precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba y cromatografía en hidroxiapatita.
Tal como se describe en la presente memoria, por primera vez ha sido posible expresar artificial y funcionalmente la primera proteína recombinante. La primera proteína recombinante así producida se puede utilizar, por ejemplo, para la aplicación que se describe a continuación.
<2> Segunda proteína recombinante y método de producción para la misma
La segunda proteína recombinante es una proteína recombinante que tiene actividad de factor B.
La segunda proteína recombinante es específicamente una proteína recombinante que es alguna de las siguientes:
(I) una proteína recombinante que contiene una secuencia de aminoácidos de la proteína deLimulus polyphemusque tiene actividad de factor B; y
(II) una proteína recombinante que es una variante de la anterior (I) y tiene actividad de factor B.
Los ejemplos de la secuencia de aminoácidos de la proteína deLimulus polyphemusque tiene actividad de factor B incluyen las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID n.os 6, 8, 10 o 12. Además, los ejemplos de una secuencia de bases que codifica dicha secuencia de aminoácidos incluye las secuencias de bases representadas por las SEQ ID n os 5, 7, 9 u 11.
La segunda proteína recombinante puede ser más específicamente una proteína recombinante que es alguna de las siguientes:
(A) una proteína recombinante que contiene la secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID n.os 6, 8, 10 o 12;
(B) una proteína recombinante que contiene una secuencia de aminoácidos que tiene un 95 % o más de identidad con la secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID n.os 6, 8, 10 o 12, y que tiene actividad de factor B;
(C) una proteína recombinante que está codificada por un ADN que contiene una secuencia de bases que tiene un 95 % o más de identidad con la secuencia de bases representada por las SEQ ID n.os 5, 7, 9 u 11, y que tiene actividad de factor B; y
(D) una proteína recombinante que está codificada por un ADN que se hibrida con un ADN compuesto por una secuencia complementaria a la secuencia de bases representada por las SEQ ID n.os 5, 7, 9 u 11 en condiciones rigurosas, y tiene actividad de factor B.
La función de esta proteína es la función de convertirse en una forma activa mediante una proteína (forma activa) que tiene actividad de factor C, tal como la primera proteína que se ha convertido en una forma activa y que convierte una proteína que tiene actividad enzimática procoagulante como la tercera proteína que se menciona a continuación en una forma activa (denominada "actividad de factor B" en este documento de solicitud). La segunda proteína recombinante puede ser una proteína que muestra actividad de factor B en combinación con al menos la primera proteína, tal como la primera proteína recombinante, y la tercera proteína, tal como una tercera proteína recombinante.
Se puede confirmar si se tiene actividad de factor B detectando el progreso de una reacción en cascada cuando se combina una proteína recombinante deseada con una proteína (forma activa) que tiene actividad de factor C, tal como la primera proteína (forma activa), una proteína (forma inactiva) que tiene actividad enzimática procoagulante, tal como la tercera proteína (forma inactiva), y un sustrato para la detección. En este sistema, puede existir además una endotoxina para convertir una proteína (forma inactiva) que tiene actividad de factor C en una forma activa.
Para la otra explicación, se puede aplicar la explicación del punto <1> anterior. Es decir, por ejemplo, "SEQ ID n.° 1 o 3", "SEQ ID n.° 2 o 4", "primera proteína (recombinante)", "primer ADNc" y "factor C" en el punto <1> anterior puede sustituirse por "SEQ ID n.os 5, 7, 9 u 11", "SEQ ID n.os 6, 8, 10 o 12", "segunda proteína (recombinante)", "segundo ADNc" y "factor B", respectivamente, y así sucesivamente.
<3> Tercera proteína recombinante y método de producción para la misma
La tercera proteína recombinante es una proteína recombinante que tiene actividad enzimática procoagulante.
La tercera proteína recombinante es específicamente una proteína recombinante que es alguna de las siguientes:
(I) una proteína recombinante que contiene una secuencia de aminoácidos de la proteína deLimulus polyphemusque tiene actividad enzimática procoagulante; y
(II) una proteína recombinante que es una variante de la anterior (I) y tiene actividad enzimática procoagulante.
Los ejemplos de la secuencia de aminoácidos de la proteína deLimulus polyphemusque tiene actividad enzimática procoagulante incluyen las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID n.os 14, 16, 18, 20 o 22. Además, los ejemplos de una secuencia de bases que codifica dicha secuencia de aminoácidos incluyen las secuencias de bases representadas por las SEQ ID n.os 13, 15, 17, 19 o 21.
La tercera proteína recombinante puede ser más específicamente una proteína recombinante que es alguna de las siguientes:
(A) una proteína recombinante que contiene la secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID n.os 14, 16, 18, 20 o 22;
(B) una proteína recombinante que contiene una secuencia de aminoácidos que tiene un 95 % o más de identidad con la secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID n.os 14, 16, 18, 20 o 22, y que tiene actividad enzimática procoagulante;
(C) una proteína recombinante que está codificada por un ADN que contiene una secuencia de bases que tiene un 95 % o más de identidad con la secuencia de bases representada por las SEQ ID n.os 13, 15, 17, 19 o 21, y que tiene actividad enzimática procoagulante; y
(D) una proteína recombinante que está codificada por un ADN que se hibrida con un ADN compuesto por una secuencia complementaria a la secuencia de bases representada por las SEQ ID n.os 13, 15, 17, 19 o 21 en condiciones rigurosas, y que tiene actividad enzimática procoagulante.
La función de esta proteína es la función de convertirse en una forma activa mediante una proteína (forma activa) que tiene actividad de factor B, tal como la segunda proteína que se convierte en una forma activa y escinde el sustrato mencionado a continuación (una proteína o un péptido) (denominada "actividad enzimática procoagulante " en este documento de solicitud). La tercera proteína recombinante puede ser una proteína que muestra actividad enzimática procoagulante en combinación con al menos la segunda proteína, tal como la segunda proteína recombinante.
Se puede confirmar si una proteína tiene actividad enzimática procoagulante detectando el progreso de una reacción en cascada cuando se combina una proteína recombinante deseada con una proteína (forma activa) que tiene actividad de factor B, tal como la segunda proteína (forma activa) y un sustrato para la detección. En este sistema, puede existir además una proteína (forma activa) que tiene actividad de factor C para convertir una proteína (forma inactiva) que tiene actividad de factor B en una forma activa. Además, en este sistema, puede existir además una endotoxina para convertir una proteína (forma inactiva) que tiene actividad de factor C en una forma activa.
Para la otra explicación, se puede aplicar la explicación del punto <1> anterior. Es decir, por ejemplo, "SEQ ID n.os 1 o 3", "SEQ ID n.os 2 o 4", "primera proteína (recombinante)", "primer ADNc" y "factor C" en el punto <1> anterior pueden sustituirse por "SEQ ID n.os 13, 15, 17, 19 o 21", "SEQ<i>D n.os 14, 16, 18, 20 o 22", "tercera proteína (recombinante)", "tercer ADNc" y "enzima procoagulante", respectivamente, y así sucesivamente.
<4> Uso de la primera proteína recombinante
La primera proteína recombinante puede usarse para activar una proteína que tenga actividad de factor B, tal como la segunda proteína. En otras palabras, en la presente memoria se describe un método para activar una proteína que tiene actividad de factor B que incluye una etapa de poner en contacto la primera proteína recombinante con la proteína que tiene actividad de factor B.
Los ejemplos de proteínas que tienen actividad de factor B incluyen la segunda proteína.
La segunda proteína es específicamente una proteína que es alguna de las siguientes:
(I) una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos de la proteína deLimulus polyphemusque tiene actividad de factor B; y
(II) una proteína que es una variante de la anterior (I) y tiene actividad de factor B.
La segunda proteína puede ser más específicamente una proteína que es alguna de las siguientes:
(A) una proteína que contiene la secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID n.os 6, 8, 10 o 12; (B) una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 95 % o más con la secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID n.os 6, 8, 10 o 12, y que tiene actividad de factor B; (C) una proteína que está codificada por un ADN que contiene una secuencia de bases que tiene una identidad del 95 % o más con la secuencia de bases representada por las SEQ ID n.os 5, 7, 9 u 11, y que tiene actividad de factor B; y
(D) una proteína que está codificada por un ADN que se hibrida con un ADN compuesto por una secuencia complementaria a la secuencia de bases representada por las SEQ ID n.os 5, 7, 9 u 11 en condiciones rigurosas, y que tiene actividad de factor B.
Además, los ejemplos de proteínas que tienen actividad de factor B también incluyen las siguientes proteínas:
(III) una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos de una proteína de un cangrejo herradura que no esLimulus polyphemusque tiene actividad de factor B; y
(IV) una proteína que es una variante de la anterior (III) y tiene actividad de factor B.
A la explicación de la proteína que tiene actividad de factor B, se le puede aplicar la explicación del punto <2> anterior. Tal como se describe en la presente memoria, se ha dado a conocer por primera vez que la proteína (A) de la primera proteína recombinante tiene actividad de factor C. La proteína (A) que tiene tal función y su variante se aplican para la activación de la proteína que tiene actividad de factor B.
La proteína que tiene actividad de factor B utilizada en el presente documento puede ser una proteína obtenida a partir de una sustancia natural o una proteína producida artificialmente (por ejemplo, la segunda proteína recombinante) siempre que tenga la estructura y función mencionadas anteriormente. Tal como se describe en la presente memoria, por primera vez ha sido posible expresar artificial y funcionalmente la segunda proteína recombinante y también ha sido posible producir de forma estable la segunda proteína con una calidad constante sin obtenerla delLimulus polyphemusnativo. Por lo tanto, la proteína que tiene actividad de factor B es preferiblemente la segunda proteína recombinante.
La activación de la proteína que tiene actividad de factor B usando la primera proteína recombinante se puede llevar a cabo poniendo en contacto entre sí una molécula de la primera proteína recombinante (forma activa) y una molécula de la proteína (forma inactiva) que tiene actividad de factor B. Secundariamente, para convertir la primera proteína recombinante en una forma activa, la primera proteína recombinante (forma inactiva) y la proteína (forma inactiva) que tiene actividad de factor B pueden ponerse en contacto entre sí en presencia de una endotoxina.
Las condiciones durante este contacto no están particularmente limitadas siempre que las condiciones permitan que la primera proteína recombinante (forma activa) presente la actividad de factor C para poder activar la proteína que tiene actividad de factor B (cuando la operación se lleva a cabo en presencia de una endotoxina, las condiciones permiten además que la endotoxina pueda activar la primera proteína recombinante). Por ejemplo, se pueden adoptar unas condiciones de reacción para un reactivo de lisado conocido.
Puede confirmarse si la proteína que tiene actividad de factor B se ha activado mediante el método descrito en el ejemplo mencionado a continuación.
<5> Uso de la segunda proteína recombinante
La segunda proteína recombinante se puede utilizar para activar una proteína que tenga actividad enzimática procoagulante, tal como la tercera proteína. En otras palabras, en la presente memoria se describe un método para activar una proteína que tiene actividad enzimática procoagulante que incluye una etapa de poner en contacto la segunda proteína recombinante con la proteína que tiene actividad enzimática procoagulante.
Los ejemplos de proteínas que tienen actividad enzimática procoagulante incluyen la tercera proteína.
La tercera proteína es específicamente una proteína que es alguna de las siguientes:
(I) una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos de la proteína deLimulus polyphemusque tiene actividad enzimática procoagulante; y
(II) una proteína que es una variante de la anterior (I) y tiene actividad enzimática procoagulante.
La tercera proteína puede ser más específicamente una proteína que sea alguna de las siguientes:
(A) una proteína que contiene la secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID n.os 14, 16, 18, 20 o 22;
(B) una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 95 % o más con la secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID n.os 14, 16, 18, 20 o 22, y que tiene actividad enzimática procoagulante;
(C) una proteína que está codificada por un ADN que contiene una secuencia de bases que tiene una identidad del 95 % o más con la secuencia de bases representada por las SEQ ID n.os 13, 15, 17, 19 o 21, y que tiene actividad enzimática procoagulante; y
(D) una proteína que está codificada por un ADN que se hibrida con un ADN compuesto por una secuencia complementaria a la secuencia de bases representada por las SEQ ID n.os 13, 15, 17, 19 o 21 en condiciones rigurosas, y que tiene actividad enzimática procoagulante.
Además, los ejemplos de proteínas que tienen actividad enzimática procoagulante también incluyen las siguientes proteínas:
(III) una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos de una proteína de un cangrejo herradura que no esLimulus polyphemusque tiene actividad enzimática procoagulante; y
(IV) una proteína que es una variante de la anterior (III) y tiene actividad enzimática procoagulante.
A la explicación de la proteína que tiene actividad enzimática procoagulante se le puede aplicar la explicación del punto <3> anterior.
La proteína que tiene actividad enzimática procoagulante utilizada en el presente documento puede ser una proteína obtenida a partir de una sustancia natural o una proteína producida artificialmente (por ejemplo, la tercera proteína recombinante) siempre que tenga la estructura y función mencionadas anteriormente.
La activación de la proteína que tiene actividad enzimática procoagulante usando la segunda proteína recombinante se puede llevar a cabo poniendo en contacto entre sí una molécula de la segunda proteína recombinante (forma activa) y una molécula de la proteína (forma inactiva) que tiene actividad enzimática procoagulante. Secundariamente, para convertir la segunda proteína recombinante en una forma activa, la segunda proteína recombinante (forma inactiva) y la proteína (forma inactiva) que tiene actividad enzimática procoagulante se pueden poner en contacto entre sí en presencia de una proteína (forma activa) que tiene actividad de factor C. Además, para activar esta proteína que tiene actividad de factor C, la proteína (forma inactiva) que tiene actividad de factor C, la segunda proteína recombinante (forma inactiva) y la proteína (forma inactiva) que tiene actividad enzimática procoagulante se pueden poner en contacto con entre sí en presencia de una endotoxina.
Las condiciones durante este contacto no están particularmente limitadas siempre que las condiciones permitan que la segunda proteína recombinante (forma activa) exhiba la actividad de factor B para poder activar la proteína que tiene actividad enzimática procoagulante (cuando la operación se lleva a cabo en la presencia de la proteína (forma activa) que tiene actividad de factor C, las condiciones permiten además que la proteína (forma activa) que tiene actividad de factor C exhiba la actividad de factor C para poder activar la segunda proteína recombinante, y cuando la operación se lleva a cabo en presencia de una endotoxina, las condiciones permiten además que la endotoxina pueda activar la proteína que tiene actividad de factor C). Por ejemplo, se pueden adoptar unas condiciones de reacción para un reactivo de lisado conocido.
Puede confirmarse si la tercera proteína se ha activado mediante el método descrito en el ejemplo mencionado a continuación.
Los ejemplos de proteínas que tienen actividad de factor C incluyen la primera proteína.
La primera proteína es específicamente una proteína que es alguna de las siguientes:
(I) una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos de la proteína deLimulus polyphemusque tiene actividad de factor C; y
(II) una proteína que es una variante de la anterior (I) y tiene actividad de factor C.
La primera proteína puede ser más específicamente una proteína que sea alguna de las siguientes:
(A) una proteína que contiene la secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID n.os 2 o 4;
(B) una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos que tiene un 95 % o más de identidad con la secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID n.os 2 o 4, y que tiene actividad de factor C;
(C) una proteína que está codificada por un ADN que contiene una secuencia de bases que tiene un 95 % o más de identidad con la secuencia de bases representada por las SEQ ID n.os 1 o 3, y que tiene actividad de factor C; y
(D) una proteína que está codificada por un ADN que se hibrida con un ADN compuesto por una secuencia complementaria a la secuencia de bases representada por las SEQ ID n.os 1 o 3 en condiciones rigurosas, y que tiene actividad de factor C.
Además, los ejemplos de proteínas que tienen actividad de factor C también incluyen las siguientes proteínas: (III) una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos de una proteína de un cangrejo herradura que no esLimulus polyphemusque tiene actividad de factor C; y
(IV) una proteína que es una variante de la anterior (III) y tiene actividad de factor C.
A la explicación de la proteína que tiene actividad de factor C, se le puede aplicar la explicación del punto <1 > anterior. La proteína que tiene actividad de factor C utilizada aquí puede ser una proteína obtenida a partir de una sustancia natural o una proteína producida artificialmente (por ejemplo, la primera proteína recombinante) siempre que tenga la estructura y función mencionadas anteriormente.
Para la otra explicación, se le puede aplicar la explicación del punto <4> anterior.
<6> Uso de la tercera proteína recombinante
La tercera proteína recombinante se puede utilizar para escindir un sustrato. En otras palabras, en la presente memoria se describe un método para escindir un sustrato que incluye una etapa de poner en contacto la tercera proteína recombinante con el sustrato.
Este sustrato también se puede utilizar como el "sustrato para detección" mencionado anteriormente y puede ser un sustrato de origen natural o un sustrato sintético. Tal sustrato no está particularmente limitado siempre que sea escindido por la actividad enzimática procoagulante de la proteína (forma activa) que tiene actividad enzimática procoagulante, tal como la tercera proteína (forma activa).
Los ejemplos del sustrato que se escindirá mediante la actividad enzimática procoagulante incluyen una proteína, tal como coagulógeno, y un sustrato sintético representado por una fórmula general: X-Y-Z (en donde X- es un grupo protector unido a Y a través de un enlace covalente, Y es un residuo peptídico, y -Z es una sustancia señalizadora unida a Y mediante un enlace amida).
El grupo protector X no está particularmente limitado y se puede utilizar un grupo protector conocido para un péptido. Los ejemplos de dicho grupo protector incluyen un grupo t-butoxicarbonilo y un grupo benzoílo.
El resto peptídico Y tampoco está particularmente limitado, y los ejemplos del mismo incluyen Leu-Gly-Arg (LGR) e Ile-Glu-Gly-Arg (IEGR) (SEQ ID n.223).
La sustancia señalizadora Z tampoco está particularmente limitada, y los ejemplos de la misma incluyen un tinte que se detecta con luz visible y un fluoróforo. Los ejemplos de dicho tinte incluyen pNA (p-nitroanilina), MCA (ácido 7-metoxicumarín-4-acético), DNP (2,4-dinitroanilina) y un tinte de tipo dansilo.
Entre estos, se prefiere Boc-Leu-Gly-Arg-pNA (t-butoxicarbonil-leucil-glicil-arginil-p-nitroanilina, Boc-LGR-pNA). Puede detectarse si el sustrato ha sido escindido por la actividad enzimática procoagulante, por ejemplo, detectando la "gelación" cuando se utiliza el coagulógeno como sustrato. La gelación se puede detectar detectando una disminución de la fluidez mediante observación visual o similar.
Además, por ejemplo, cuando se usa un sustrato sintético como el descrito anteriormente, la señal Z se libera escindiendo el enlace amida entre Y y Z, y se emite una señal tal como revelado de un color o emisión de fluorescencia, y, por lo tanto, al detectar esta señal se puede detectar si el sustrato ha sido escindido por la actividad enzimática procoagulante. La detección de la señal puede realizarse mediante una técnica acorde con el tipo de señal. Por ejemplo, la señal de pNA puede detectarse por absorbancia (405 nm).
La escisión del sustrato utilizando la tercera proteína recombinante se puede llevar a cabo poniendo en contacto entre sí una molécula de la tercera proteína recombinante (forma activa) y una molécula del sustrato. Secundariamente, para convertir la tercera proteína recombinante en una forma activa, la tercera proteína recombinante (forma inactiva) y el sustrato pueden ponerse en contacto entre sí en presencia de la proteína (forma activa) que tiene actividad de factor B. Además, para convertir esta proteína que tiene actividad de factor B en una forma activa, la proteína (forma inactiva) que tiene actividad de factor B, la tercera proteína recombinante (forma inactiva) y el sustrato se pueden poner en contacto entre sí en presencia de la proteína (forma activa) que tiene actividad de factor C. Además, para convertir esta proteína que tiene actividad de factor C en una forma activa, la proteína (forma inactiva) que tiene actividad de factor C, la proteína (forma inactiva) que tiene actividad de factor B, la tercera proteína recombinante (forma inactiva) y el sustrato pueden ponerse en contacto entre sí en presencia de una endotoxina.
Las condiciones durante este contacto no están particularmente limitadas siempre que las condiciones permitan que la tercera proteína recombinante (forma activa) exhiba la actividad enzimática procoagulante para poder escindir el sustrato (cuando la operación se lleva a cabo en presencia de la proteína (forma activa) que tiene actividad de factor B, las condiciones permiten además que la proteína (forma activa) que tiene actividad de factor B exhiba la actividad de factor B para poder activar la tercera proteína recombinante; cuando la operación se lleva a cabo en presencia de la proteína (forma activa) que tiene actividad de factor C, las condiciones permiten además que la proteína (forma activa) que tiene actividad de factor C exhiba la actividad de factor C para poder activar la segunda proteína; y cuando se lleva a cabo la operación en presencia de una endotoxina, las condiciones permiten además que la endotoxina pueda activar la proteína que tiene actividad de factor C). Por ejemplo, se pueden adoptar unas condiciones de reacción para un reactivo de lisado conocido.
Para la otra explicación, se le puede aplicar la explicación del punto <4> anterior.
<7> Método para detectar endotoxinas
El método para detectar una endotoxina descrito en la presente memoria es un método para detectar una endotoxina en una muestra que incluye una etapa de poner en contacto la primera proteína recombinante con la muestra.
Este método puede incluir además una etapa de poner en contacto la primera proteína recombinante que ha entrado en contacto con la muestra con una proteína que tiene actividad de factor B, tal como la segunda proteína. Esta proteína que tiene actividad de factor B puede ser la segunda proteína recombinante.
Además, este método puede incluir además una etapa en la que la proteína que tiene actividad de factor B que ha entrado en contacto con la "primera proteína recombinante que ha entrado en contacto con la muestra" se pone en contacto con una proteína que tiene actividad enzimática procoagulante, tal como la tercera proteína. Esta proteína que tiene actividad enzimática procoagulante puede ser la tercera proteína recombinante.
La detección de una endotoxina en una muestra se puede llevar a cabo detectando la activación de la primera proteína recombinante que ha entrado en contacto con la muestra. Mediante el método descrito en el ejemplo mencionado a continuación puede confirmarse si se ha activado la primera proteína recombinante. Además, la activación de la primera proteína recombinante también puede detectarse directamente utilizando un sustrato (sustrato para la detección). Es decir, se puede detectar directamente la activación de la primera proteína recombinante utilizando como sustrato para la detección un sustrato que emite una señal al ser escindido por la actividad de factor C de la primera proteína recombinante activada. Por lo tanto, este método puede incluir además una etapa de poner en contacto la "primera proteína recombinante que ha entrado en contacto con la muestra" con el sustrato para la detección.
Cuando el método incluye además la etapa de poner en contacto con la proteína que tiene actividad de factor B, la detección se puede llevar a cabo detectando la activación de la proteína que tiene actividad de factor B mediante el método descrito en el punto <4> anterior. Además, la activación de la proteína que tiene actividad de factor B también puede detectarse directamente utilizando un sustrato (sustrato para la detección). Es decir, se puede detectar directamente la activación de la proteína que tiene actividad de factor B utilizando como sustrato para la detección un sustrato que emite una señal al ser escindido por la actividad de factor B de la proteína activada que tiene actividad de factor B. Por lo tanto, este método puede incluir además una etapa de poner en contacto la "proteína que tiene actividad de factor B que ha entrado en contacto con la primera proteína recombinante" con el sustrato para la detección.
Cuando el método incluye además la etapa de poner en contacto con la proteína que tiene actividad enzimática procoagulante, la detección se puede llevar a cabo detectando la activación de la proteína que tiene actividad enzimática procoagulante mediante el método descrito en el punto <5> anterior (la escisión del sustrato mediante el método descrito en el punto <6> anterior). Por lo tanto, este método puede incluir además una etapa en la que la "proteína que tiene actividad enzimática procoagulante que ha entrado en contacto con la proteína que tiene actividad de factor B" se pone en contacto con el sustrato (sustrato para detección). Los ejemplos del sustrato para la detección capaz de detectar la activación de la proteína que tiene actividad enzimática procoagulante incluyen los ejemplificados en el punto <6> anterior.
Estos pasos podrán realizarse de forma secuencial o simultánea. Por ejemplo, cuando estos pasos se llevan a cabo simultáneamente, la muestra, la primera proteína recombinante (forma inactiva), la proteína (forma inactiva) que tiene actividad de factor B, la proteína (forma inactiva) que tiene actividad enzimática procoagulante y el sustrato para la detección pueden ponerse en contacto entre sí simultáneamente en el mismo sistema.
Las condiciones para el contacto de estos son las mismas que las condiciones descritas en los puntos <4> a <6> anteriores. Por ejemplo, el contacto de la primera proteína recombinante con la muestra no está particularmente limitado siempre que las condiciones permitan que la endotoxina en la muestra pueda activar la primera proteína recombinante. Como condiciones para el contacto se pueden adoptar, por ejemplo, las condiciones de reacción para un reactivo de lisado conocido. Por ejemplo, como pH de una solución de reacción se puede adoptar un pH de 5 a 10, preferentemente de 7 a 8,5. Como temperatura de reacción, se puede adoptar una temperatura de 10 °C a 80 °C, preferiblemente de 20 °C a 50 °C, más preferiblemente de 30 °C a 40 °C. Como temperatura de reacción, se ejemplifica, por ejemplo, 37 °C. El tiempo de reacción tampoco está particularmente limitado y puede establecerse apropiadamente según las diversas condiciones. El tiempo de reacción puede ser, por ejemplo, de 5 min a 2 h, preferiblemente de 15 a 90 min, más preferiblemente de 30 a 40 min.
La muestra tampoco está particularmente limitada siempre que sea una muestra que requiera la detección de una endotoxina. Los ejemplos de muestra incluyen agua medicinal, preparaciones farmacéuticas, infusiones, preparaciones de sangre, productos sanitarios, instrumentos médicos, cosméticos, alimentos y bebidas, muestras ambientales, componentes biológicos, proteínas naturales, proteínas recombinantes, ácidos nucleicos y sacáridos. La muestra puede someterse a la detección de una endotoxina mezclando, dispersando o disolviendo la propia muestra o un extracto de la misma o una solución de lavado de la misma en un sistema de reacción.
La detección de una endotoxina puede ser una detección cualitativa o una detección cuantitativa. La detección cuantitativa se puede llevar a cabo, por ejemplo, de la siguiente manera: se utilizan numerosos estándares de referencia que tienen diferentes cantidades (concentraciones) de endotoxina, se asocia de antemano una relación entre la cantidad (concentración) de la endotoxina y el nivel de detección según el tipo de sustrato (por ejemplo, el grado de "gelación" cuando se usa coagulógeno como sustrato, y el grado de una señal cuando se usa un sustrato sintético) usando, por ejemplo, una curva de calibración o una fórmula relacional, y la cantidad (concentración) de la endotoxina se calcula mediante la conversión del nivel de detección cuando se utiliza la muestra real.
<8> Agente detector de endotoxinas
El agente detector de endotoxinas descrito en la presente memoria es un agente detector de endotoxinas que contiene la primera proteína recombinante.
Este agente detector puede contener además una proteína que tenga actividad de factor B, tal como la segunda proteína. Esta proteína que tiene actividad de factor B puede ser la segunda proteína recombinante.
Este agente detector puede contener además una proteína que tenga actividad enzimática procoagulante, tal como la tercera proteína. Esta proteína que tiene actividad enzimática procoagulante puede ser la tercera proteína recombinante.
Estas proteínas se encuentran en forma de estar presentes en una solución de cultivo o en un sobrenadante de cultivo. Estas proteínas pueden usarse purificándose hasta el grado deseado o pueden usarse tal cual sin purificación. Por ejemplo, cuando estas proteínas están contenidas en un sobrenadante de cultivo, el sobrenadante de cultivo puede usarse mientras contenga los componentes del medio de cultivo.
Las cantidades correspondientes de la primera proteína recombinante, la proteína que tiene actividad de factor B y la proteína que tiene actividad enzimática procoagulante en este agente detector se pueden ajustar apropiadamente de acuerdo con la actividad o similar de cada proteína y, por ejemplo, se puede ejemplificar de 15 a 30 pg/ml como la concentración final de cada proteína en la solución de reacción en estado de mezclarse con la muestra.
Este agente detector puede contener además un sustrato (sustrato para la detección).
Este agente detector puede producirse incorporando estos materiales como componentes constituyentes. Este agente detector puede contener además un aditivo, tal como un excipiente, un estabilizante, o un tampón distintos de estos. Además, la forma de este agente detector tampoco está particularmente limitada, y el agente puede formularse en una forma arbitraria, tal como una forma sólida (por ejemplo, una forma liofilizada) o una forma líquida.
En este agente detector, estos materiales pueden colocarse colectivamente en un envase unitario como componentes constituyentes o pueden colocarse en envases distintos.
Además, este agente detector puede contener además una solución tamponante para disolución, un estándar de referencia de endotoxinas, un recipiente para una reacción (por ejemplo, un tubo o una microplaca), o similares. Este agente detector también incluye una forma de kit.
Este agente de detección se puede utilizar, por ejemplo, en el método descrito en el punto <7> anterior.
<9> Primer ADNc y utilización del mismo
(1) Primer ADNc
El primer ADNc es un ADNc que es alguno de los siguientes:
(A) un ADNc que contiene la secuencia de bases representada por las SEQ ID n.os 1 o 3;
(B) un ADNc que contiene una secuencia de bases que tiene un 95 % o más de identidad con la secuencia de bases representada por las SEQ ID n.os 1 o 3, y que codifica una proteína que tiene actividad de factor C;
(C) un ADNc que se hibrida con un ADN compuesto por una secuencia complementaria a la secuencia de bases representada por las SEQ ID n.os 1 o 3 en condiciones rigurosas, y que codifica una proteína que tiene actividad de factor C;
(D) un ADNc que codifica una proteína que contiene la secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID n.os 2 o 4; y
(E) un ADNc que codifica una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos que tiene un 95 % o más de identidad con la secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID n.os 2 o 4, y que tiene actividad de factor C.
Este ADNc se obtuvo por primera vez en el mundo mediante el método descrito en los ejemplos de esta descripción, y se dilucidaron por primera vez la estructura de la secuencia completa del mismo y la función de una proteína codificada por el ADNc. La función es "actividad de factor C".
Entre los primeros ADNc, el más preferido es el ADNc (A) mencionado anteriormente, pero el ADNc puede ser una variante del mismo siempre que una proteína codificada por el ADNc tenga actividad de factor C.
Como variante, se prefieren específicamente los ADNc (B) a (E) mencionados anteriormente. El término "95 % o más" en los anteriores (B), (C) y (E) es preferiblemente el 96 % o más, más preferiblemente el 97 % o más, más preferiblemente el 98 % o más, y más preferiblemente el 99 % o más.
Además, para el significado de las "condiciones rigurosas" y la otra explicación, se puede aplicar la explicación del punto <1> anterior.
Además, el primer ADNc puede ser un ADNc en el que un codón arbitrario está reemplazado por un codón equivalente del mismo. Por ejemplo, en el (D) anterior se incluye un ADNc en el que un codón arbitrario en el ADNc (A) mencionado anteriormente está reemplazado por un codón equivalente del mismo.
La secuencia de bases completa del primer ADNc se describe en la presente memoria y, por lo tanto, utilizando esta información de secuencia, el primer ADNc puede producirse mediante una técnica de síntesis de ADN conocida o una técnica de ingeniería genética. El primer ADNc se obtuvo por primera vez mediante el método descrito en el ejemplo mencionado a continuación; sin embargo, dado que la secuencia de bases se describe en la presente memoria, el primer ADNc también se puede producir mediante un método distinto al método descrito en el ejemplo.
(2) Construcción de ADN que contiene el primer ADNc, transformante y método para producir la primera proteína recombinante usando el mismo
En la presente memoria se describe una construcción de ADN que contiene el primer ADNc. Por consiguiente, se puede ejemplificar una construcción de ADN artificial, por ejemplo, un vector. Como vector, se puede seleccionar apropiadamente un plásmido, un virus u otro vector conocido acorde con el propósito, tal como amplificación, mantenimiento o introducción de un ADN recombinante, preparación de genotecas, clonación, traducción de proteínas (expresión de proteínas), o similares. Con la introducción del primer ADNc en dicho vector o similar, se puede producir la construcción de ADN que contiene el primer ADNc.
Además, en la presente memoria se describe una célula que contiene el primer ADNc. Dicha célula puede ser, por ejemplo, una célula que se transforma con dicha construcción de ADN para expresar la primera proteína recombinante. Además, en la presente memoria se describe un método para producir la primera proteína recombinante que incluye una etapa de cultivo de dicha célula.
Al método para transformar una célula (célula hospedadora) con la construcción de ADN y al método para producir la primera proteína recombinante cultivando la célula, se les puede aplicar la descripción del punto <1> (2) anterior.
<10> Segundo ADNc
(1) Segundo ADNc
El segundo ADNc es un ADNc que es alguno de los siguientes:
(A) un ADNc que contiene la secuencia de bases representada por las SEQ ID n.os 5, 7, 9 u 11;
(B) un ADNc que contiene una secuencia de bases que tiene un 95 % o más de identidad con la secuencia de bases representada por las SEQ ID n.os 5, 7, 9 u 11, y codifica una proteína que tiene actividad de factor B; (C) un ADNc que se hibrida con un ADN compuesto por una secuencia complementaria a la secuencia de bases representada por las SEQ ID n.os 5, 7, 9 u 11 en condiciones rigurosas, y codifica una proteína que tiene actividad de factor B;
(D) un ADNc que codifica una proteína que contiene la secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID n os 6, 8, 10 o 12; y
(E) un ADNc que codifica una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos que tiene un 95 % o más de identidad con la secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID n.os 6, 8, 10 o 12, y que tiene actividad de factor B.
Para la otra explicación, se puede aplicar la explicación del punto <9> (1) anterior. Es decir, por ejemplo, "factor C" y "primer ADNc" en el punto <9> (1) anterior pueden sustituirse por "factor B" y "segundo ADNc", respectivamente, y así sucesivamente.
(2) Construcción de ADN que contiene el segundo ADNc, transformante y método para producir una segunda proteína recombinante usando el mismo
En la presente memoria se describe una construcción de ADN que contiene el segundo ADNc. Además, en la presente memoria se describe una célula que contiene el segundo ADNc, tal como una célula que está transformada con dicha construcción de ADN para expresar la segunda proteína recombinante. Además, en la presente memoria se describe un método para producir la segunda proteína recombinante que incluye una etapa de cultivo de dicha célula.
Para la otra explicación, se puede aplicar la explicación del punto <9> (2) anterior.
<11> Tercer ADNc
(1) Tercer ADNc
El tercer ADNc es un tercer ADNc que es alguno de los siguientes:
(A) un ADNc que contiene la secuencia de bases representada por las SEQ ID n.os 13, 15, 17, 19 o 21;
(B) un ADNc que contiene una secuencia de bases que tiene una identidad del 95 % o más con la secuencia de bases representada por las SEQ ID n.os 13, 15, 17, 19 o 21, y codifica una proteína que tiene actividad enzimática procoagulante;
(C) un ADNc que se hibrida con un ADN compuesto por una secuencia complementaria a la secuencia de bases representada por las SEQ ID n.os 13, 15, 17, 19 o 21 en condiciones rigurosas, y que codifica una proteína que tiene actividad enzimática procoagulante;
(D) un ADNc que codifica una proteína que contiene la secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID n os 14, 16, 18, 20 o 22; y
(E) un ADNc que codifica una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos que tiene un 95 % o más de identidad con la secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID n.os 14, 16, 18, 20 o 22, y que tiene actividad enzimática procoagulante.
Para la otra explicación, se puede aplicar la explicación del punto <9> (1) anterior. Es decir, por ejemplo, "factor C" y "primer ADNc" en el punto <9> (1) anterior pueden sustituirse por "enzima procoagulante" y "tercer ADNc", respectivamente, y así sucesivamente.
(2) Construcción de ADN que contiene el tercer ADNc, transformante y método para producir la tercera proteína recombinante usando el mismo
En la presente memoria se describe una construcción de ADN que contiene el tercer ADNc. Además, en la presente memoria se describe una célula que contiene el tercer ADNc, tal como una célula que está transformada con dicha construcción de ADN para expresar la tercera proteína recombinante. Además, en la presente memoria se describe un método para producir la tercera proteína recombinante que incluye una etapa de cultivo de dicha célula.
Para la otra explicación, se puede aplicar la explicación del punto <9> (2) anterior.
<12> Método para producir un agente detector de endotoxinas
También se describe en la presente memoria un método para producir un agente detector de endotoxinas que incluye una etapa de expresión artificial de una proteína usando el primer ADNc.
Este método puede incluir además una etapa de expresión artificial de una proteína usando el segundo ADNc. Además, el método puede incluir además una etapa de expresión artificial de una proteína usando el tercer ADNc. Un método para expresar artificialmente una proteína usando dicho ADNc tampoco está particularmente limitado; sin embargo, se puede usar, por ejemplo, el método descrito en los puntos <9> (2), <10> (2) o <11> (2) anteriores. La primera proteína recombinante se expresa mediante expresión artificial usando el primer ADNc según dicho método. De manera similar, la segunda proteína recombinante se expresa mediante expresión artificial usando el segundo ADNc, y la tercera proteína recombinante se expresa mediante expresión artificial usando el tercer ADNc. La proteína expresada está presente en una solución de cultivo o en un sobrenadante de cultivo. Estas proteínas pueden usarse tras purificarlas hasta el grado deseado o pueden usarse tal cual sin purificación. Por ejemplo, cuando estas proteínas están contenidas en un sobrenadante de cultivo, el sobrenadante de cultivo puede usarse mientras contenga los componentes del medio de cultivo.
Para la otra explicación, se puede aplicar la explicación del punto <8> anterior. Por lo tanto, el método para producir un agente detector de endotoxinas descrito en la presente memoria también incluye el método para producir un kit. Secundariamente, una o ambas de la segunda proteína (tal como la segunda proteína recombinante) y la tercera proteína (tal como la tercera proteína recombinante) pueden reemplazarse por sus equivalentes obtenidos de un cangrejo herradura que no esLimulus polyphemus.Lo mismo se aplica también al segundo ADNc y al tercer ADNc. Los ejemplos de cangrejo herradura que no sonLimulus polyphemusincluyen organismos pertenecientes al géneroTachypleus,tales comoTachypleus tridentatus, Tachypleus gigasyTachypleus rotundicauda.
Es decir, se puede usar en lugar de la segunda proteína (tal como la segunda proteína recombinante), el factor B (tal como el factor B recombinante) obtenido de un cangrejo herradura (tal comoTachypleus tridentatus)que no esLimulus polyphemus,en lugar de la tercera proteína (tal como la tercera proteína recombinante), una enzima procoagulante (tal como una enzima procoagulante recombinante) obtenida del mismo organismo, en lugar del segundo ADNc, un gen del factor B (tal como un ADNc) obtenido del mismo organismo, y en lugar del tercer ADNc, un gen de enzima procoagulante (tal como un ADNc) obtenido del mismo organismo, respectivamente.
Todas estas proteínas y genes pueden ser los que contienen una secuencia de aminoácidos o una secuencia de bases que realmente se encuentran en un cangrejo herradura distinto deLimulus polyphemus,o pueden ser sus variantes. Para las variantes, puede aplicarse la explicación de la variante en los puntos <1> a <11> anteriores. Además, estas proteínas y genes pueden obtenerse o no del mismo cangrejo herradura que no esLimulus polyphemus.
Entonces, como resulta evidente también a partir de la descripción mencionada anteriormente, en el método para producir un agente detector de endotoxinas descrito en la presente memoria, un caso en el que cada uno del primer ADNc, el segundo ADNc y el tercer ADNc (con respecto al segundo ADNc y el tercer ADNc, uno o ambos pueden ser reemplazados por un gen procedente de un cangrejo herradura (comoTachypleus tridentatus)distinto deLimulus polyphemus)está introducido artificialmente en una célula hospedadora que no es de un cangrejo herradura, las correspondientes proteínas recombinantes (tres tipos en total) se expresan a partir de estos correspondientes ADNc, y luego, las correspondientes proteínas recombinantes expresadas se incorporan al igual que también se incluyen los componentes constituyentes como se describe en el punto <8> anterior.
Ejemplos
De aquí en adelante, la presente invención se describirá específicamente mediante ejemplos; sin embargo, estos son simplemente ejemplos de la presente invención y el alcance de la presente invención no se limita a los mismos.(1) Síntesis de cebadores
Para intentar la clonación de una proteína que tiene actividad de factor C enLimulus polyphemus,se sintetizaron los siguientes cebadores correspondientes.
<Cebadores utilizados para la clonación de proteínas que tienen actividad de factor C>
SK15-dT20: CTGCAGGAATTCGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT (SEQ ID n.224)
SK15-FC-S: ATCGATAAGCTTGATGATCTGGGCTTGTGTGATGA (SEQ ID n.225)
SK15-As: CTGCAGGAATTCGAT (SEQ ID n.226)
LFC-5race: CTACACCAAGTTCCA (SEQ ID n.227)
LFC-1st-S: GTAAACCATGTGACAAAACTGGAGGC (SEQ ID n.228)
LFC-lst-As: AATAAGGCCTCCATCGATAGAAGTA (SEQ ID n.229)
LFC-EcoRI-kozak-S: GGGGAATTCAAGCTTGCCACCATGGTACTAGCGTCGTTC (SEQ ID n.230)
LFC-Xhol-stop-As: GGGCTCGAGTCAAATGAACTGCCGAATCCACGATA (SEQ ID n.231)
Además, para intentar la clonación tanto de una proteína que tiene actividad de factor B como de una proteína que tiene actividad enzimática procoagulante, se sintetizaron los siguientes cebadores correspondientes.
<Cebadores utilizados para la clonación de proteínas con actividad de factor B y proteínas con actividad enzimática procoagulante>
SK15-FB-S: ATCGATAAGCTTGATCACATGCAAGGAAAAGTTCT (SEQ ID n.232)
SK15-FB-As: CTGCAGGAATTCGATCACTGTTTAAACAAACTGAA (SEQ ID n.233)
SK15-PCE-S: ATCGAT AAGCTT GAT AGACCAGAGGTGGT CTTTCT G (SEQ ID n.234)
SK15-As: CTGCAGGAATTCGAT (SEQ ID n.226)
(2) Preparación de ARN total a partir de las células sanguíneas de Limulus polyphemus
En la preparación del ARN total se utilizaron el mini kit de ARN PureLink (marca registrada) y el kit de ADNasa PureLink (marca registrada) (Thermo Fisher Scientific), y la operación básica se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones adjuntas. Se le añadió una solución de TRIzol a 2,23 g de un conjunto de células sanguíneas deLimulus polyphemusy las células se homogeneizaron. Después de eso, se le añadió cloroformo, seguido de centrifugación, con lo que se obtuvo una capa acuosa. Después de añadir etanol a la capa acuosa obtenida, se dejó pasar la mezcla resultante a través de un cartucho de membrana de sílice incluido en el kit, mediante lo cual un componente de ácido nucleico se unió a la membrana de sílice. A esta membrana de sílice se le añadió la ADNasa I incluida en el kit para degradar el ADN, y después de lavar el cartucho, se le añadió el tampón de elución, mediante el cual se recogió el ARN total (1,3 mg).
(3) Obtención del ADNc (primer ADNc) de la proteína que tiene actividad de factor C de Limulus polyphemus (3-1) Primer paso
La retrotranscripción se llevó a cabo utilizando el ARN total recogido en el (2) anterior como plantilla y SK15-d20 (SEQ ID n.° 24) como cebador, mediante lo cual se obtuvo un ADNc. Este cebador se diseñó para que se uniera selectivamente a la secuencia poli(A) del ARNm y además tiene una secuencia adicional en el exterior del mismo que se puede utilizar en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En esta reacción se utilizó la transcriptasa inversa SuperScript III (Thermo Fisher Scientific) como retrotranscriptasa y las condiciones de reacción se establecieron de acuerdo con las instrucciones adjuntas.
(3-2) Segundo paso
La PCR se llevó a cabo utilizando el ADNc obtenido como plantilla, el SK15-FC-S (SEQ ID n.° 25) como cebador sentido, el SK15-As (SEQ ID n.° 26) como cebador antisentido y la ADN polimerasa Tks Gflex (Takara Bio Inc.) como polimerasa.
Cuando el producto de PCR se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa, casi no se pudo detectar un ADN deseado (LpFC1) y se detectaron amplificaciones inespecíficas del ADN (figura 1 A). Por lo tanto, se intentó el siguiente paso. Secundariamente, en la figura 1A, el carril "1" es un marcador de tamaños y el carril "2" es el producto de PCR. Además, la marca del triángulo indica una parte donde se espera la presencia de LpFC1.
(3-3) Tercer paso
La porción donde se esperaba la presencia de LpFC1 se cortó del gel, y se extrajo y se purificó el ADN. La PCR se llevó a cabo utilizando el ADN obtenido como plantilla, el SK15-FC-S (SEQ ID n.° 25) como cebador sentido, el SK15-As (SEQ ID n.° 26) como cebador antisentido y la ADN polimerasa Tks Gflex (Takara Bio Inc.) como polimerasa. Como resultado de someter el producto de PCR a la electroforesis en gel de agarosa, sorprendentemente, el ADN deseado (LpFC1) se amplificó notablemente (figura 1B). Esta LpFC1 se cortó del gel, y se extrajo y se purificó. De esta manera se logró obtener un fragmento parcial (LpFC1) de un ADN que puede codificar la proteína con actividad de factor C deLimulus polyphemus.Secundariamente, en la figura 1B, el carril "1" es un marcador de tamaños y el carril "2" es el producto de la PCR. Además, la marca del triángulo indica la posición de LpFC1.
(3-4) Cuarto paso
LpFCI se mezcló con pBlueScript II SK (+) tratado con la enzima EcoRV y se introdujo en un vector mediante recombinación usando la premezcla In-Fusion HD Enzyme (Takara Bio Inc.). El producto de la reacción se introdujo en las células competentes deE. coliDH5a y las células se sembraron en una placa de medio LB con ampicilina que contenía X-Gal e IPTG, y la selección de colonias se llevó a cabo mediante el escrutinio de blancas y azules.
Posteriormente, se llevó a cabo la amplificación del ADN mediante PCR con colonias para una colonia candidata. En este momento, se usó el cebador M13-20 como cebador sentido, el cebador inverso M13 se usó como cebador antisentido, y se usó la ADN polimerasa Tks Gflex (Takara Bio Inc.) como polimerasa. Después de que el producto de PCR obtenido se sometiera a electroforesis en gel de agarosa, se usó como plantilla un ADN (LpFC1) obtenido cortando del gel, con extracción y purificación, y la secuencia del mismo se confirmó mediante PCR de la secuencia. Al hacer esto, se identificó la secuencia de ADN de LpFC1.
(3-5) Quinto paso
El extremo 5' del ADN sintético LFC-5race (SEQ ID n.° 27) preparado en función de la información de la secuencia de LpFC1 se fosforiló con la polinucleótido cinasa de T4 (Takara Bio Inc.) en presencia de ATP. Se obtuvo un ADN deseado (LpFC2) por retrotranscripción con el ARN total como plantilla y también utilizando el cebador fosforilado obtenido y la transcriptasa inversa SuperScript III (Thermo Fisher Scientific) como retrotranscriptasa. Al hacer esto, se obtuvo un fragmento parcial (LpFC2) de un ADN que puede codificar una secuencia de aminoácidos que contiene una porción de la proteína deLimulus polyphemusque tiene actividad de factor C.
El LpFC2 se sometió a un tratamiento a alta temperatura (95 °C, 2 min) en presencia de ARNasa A, seguido de la precipitación con etanol. Posteriormente, el material resultante se trató con ARN ligasa de T4 (New England Biolabs) y, como resultado, se obtuvo un ADN concatenado (LpFC3) en el que LpFC2 está unido en serie. Al hacer esto, se obtuvo un fragmento parcial (LpFC3) de un ADN que puede codificar una secuencia de aminoácidos que contiene una porción de la proteína deLimulus polyphemusque tiene actividad de factor C.
La PCR se llevó a cabo usando LpFC3 como plantilla, LFC-1st-S (SEQ ID n.° 28) como cebador sentido, LFC-1st-As (SEQ ID n.° 29) como cebador antisentido, y la ADN polimerasa Tks Gflex (Takara Bio Inc.), mediante lo cual se amplificó un ADN deseado (LpFC4).
Cuando el producto de la PCR se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa, el ADN deseado (LpFC4) casi no se podía detectar, y se detectó una amplificación inespecífica de ADN (figura 2A). Por lo tanto, se intentó el siguiente paso. Secundariamente, en la figura 2A, el carril "1" es un marcador de tamaños y el carril "2" es el producto de PCR. Además, la marca del triángulo indica la posición de LpFC4.
(3-6) Sexto paso
La porción donde se esperaba la presencia de LpFC4 se cortó del gel, y se extrajo y se purificó el ADN. La PCR se llevó a cabo utilizando el ADN obtenido como plantilla, LFC-1 st-S (SEQ ID n.° 28) como cebador sentido, LFC-1 st-As (SEQ ID n.° 29) como cebador antisentido y la ADN polimerasa Tks Gflex (Takara Bio Inc.) como polimerasa.
Como resultado de someter el producto de la PCR a electroforesis en gel de agarosa, sorprendentemente, el ADN deseado (LpFC4) se amplificó notablemente y se detectó a una concentración muy alta (figura 2B). Este LpFC4 se cortó del gel, y se extrajo y se purificó. De esta manera se logró obtener un fragmento parcial (LpFC4) de un ADN que puede codificar una secuencia de aminoácidos que contiene una porción de la proteína con actividad de factor C deLimulus polyphemus.Secundariamente, en la figura 2B, el carril "1" es un marcador de tamaños y el carril "2" es el producto de PCR. Además, la marca del triángulo indica una parte donde se espera la presencia de LpFC4.
La secuencia de LpFC4 se analizó mediante PCR de secuencia utilizando LpFC4 como plantilla. Al hacer esto, se identificó la secuencia de ADN en el extremo 5' de la proteína deseada.
(3-7) Séptimo paso
La PCR se llevó a cabo usando el ADNc obtenido en el apartado (3-1) anterior como plantilla, LFC-EcoRI-kozak-S (SEQ ID n.° 30) como cebador sentido, LFC-XhoI-stop-As (SEQ ID n.° 31) como cebador antisentido, y la ADN polimerasa Tks Gflex (Takara Bio Inc.) como polimerasa.
El producto de la PCR se purificó mediante extracción con fenol-cloroformo y precipitación con etanol, y luego se trató con la enzima EcoRI y la enzima XhoI. Un producto tratado con las enzimas de restricción se sometió a electroforesis en gel de agarosa y se cortó del gel, y se extrajo y se purificó el ADN, con lo que se obtuvo un ADN deseado (LpFC5).
El LpFC5 se mezcló con un vector de expresión pCA7 (Takeda et al., 2005,J virol79: 14346-14354) tratado con la enzima EcoRI y la enzima XhoI, y se llevó a cabo una reacción de ligación usando Ligation Mix (Takara Bio Inc.). El producto de la reacción se introdujo en células competentes deE. coliDH5a y las células se sembraron en una placa de medio LB que contenía ampicilina. A partir de las colonias obtenidas, se llevó a cabo la selección mediante PCR con colonias y la colonia seleccionada se inoculó en un medio LB que contenía ampicilina.
Después del cultivo, la purificación del plásmido se llevó a cabo mediante NucleoSpin (marca registrada) Plasmid Easy Pure (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG). Los dos tipos de clones de plásmidos obtenidos se utilizaron como moldes y la secuencia de bases de cada clon se analizó mediante PCR de secuencias.
Al hacer esto, se logró elucidar por primera vez las secuencias completas (SEQ ID n.° 1 y SEQ ID n.° 3) de los ADNc que codifican una proteína que puede tener actividad de factor C deLimulus polyphemus, y las secuencias completas (SEQ ID n.° 2 y SEQ ID n.° 4) de aminoácidos de la proteína. Las SEQ ID n.os 1 y 3 (SEQ ID n.os 2 y 4) tienen una relación de variante y se considera que se basan en polimorfismos entre individuos. La expresión y el análisis de la actividad de esta proteína se describirán más adelante.
(4) Obtención del ADNc (segundo ADNc) de la proteína que tiene actividad de factor B de Limulus polyphemus
La PCR se llevó a cabo usando el ADNc obtenido en el apartado (3-1) anterior como plantilla, SK15-FB-S (SEQ ID n.° 32) como cebador sentido, SK15-FB-As (SEQ ID n.° 33) como cebador antisentido y la ADN polimerasa Tks Gflex (Takara Bio Inc.) como polimerasa. Los fragmentos amplificados se clonaron según el mismo procedimiento que en el apartado (3-4) anterior, y con respecto a los cuatro tipos de clones obtenidos, se analizaron sus secuencias de bases.
Al hacer esto, se elucidó la secuencia completa (SEQ ID n.° 5, SEQ ID n.° 7, SEQ ID n.° 9 y SEQ ID n.° 11) de los ADNc que codifican una proteína que puede tener actividad de factor B deLimulus polyphemus,y las secuencias completas (SEQ ID n.° 6, SEQ ID n.° 8, SEQ ID n.° 10 y SEQ ID n.° 12) de aminoácidos de la proteína. Las SEQ ID n.os 5, 7, 9 y 11 (SEQ ID n.os 6, 8, 10 y 12) tienen una relación de variante y se considera que se basan en polimorfismos entre individuos. La expresión y el análisis de actividad de esta proteína se describirán más adelante.
(5) Obtención del ADNc (tercer ADNc) de la proteína que tiene actividad enzimática procoagulante de Limulus polyphemus
La PCR se llevó a cabo usando el ADNc obtenido en el apartado (3-1) anterior como plantilla, SK15-PCE-S (SEQ ID n.° 34) como cebador sentido, SK15-As (SEQ ID n.° 26) como cebador antisentido y la ADN polimerasa Tks Gflex (Takara Bio Inc.) como polimerasa. Los fragmentos amplificados se clonaron según el mismo procedimiento que en el apartado (3-4) anterior, y con respecto a los cinco tipos de clones obtenidos, se analizaron sus secuencias de bases.
Al hacer esto, la secuencia completa (SEQ ID n.° 13, SEQ ID n.° 15, SEQ ID n.° 17, SEQ ID n.° 19 y SEQ ID n.° 21) de los ADNc que codifican una proteína que puede tener actividad enzimática procoagulante deLimulus polyphemus,y las secuencias completas (SEQ ID n.° 14, SEQ ID n.° 16, SEQ ID n.° 18, SEQ ID n.° 20 y SEQ ID n.° 22) de aminoácidos de la proteína. Las SEQ ID n.os 13, 15, 17, 19 y 21 (SEQ ID n.os 14, 16, 18, 20 y 22) tienen una relación de variante y se considera que se basan en polimorfismos entre individuos. La expresión y el análisis de la actividad de esta proteína se describirán más adelante.
(6) Expresión de la proteína recombinante
El ADNc (SEQ ID n.° 13) obtenido en el apartado (5) anterior se ligó a un vector pCA7 para la expresión de proteínas en células de mamífero, mediante lo cual se obtuvo un plásmido de expresión. El ADNc (SEQ ID n.° 5) obtenido en el apartado (4) anterior se ligó al vector pCA7 para la expresión de proteínas de acuerdo con la bibliografía (Kobayashi et al., 2015,J Biol Chem,290: 19379-19386), mediante lo cual se obtuvo un plásmido de expresión. Con el uso de estos plásmidos de expresión y el plásmido de expresión (en el que se integró el ADNc de la SEQ ID n.° 1) obtenidos en el apartado (3-7) anterior, y el sistema de expresión ExpiCHO™ (Thermo Fisher Scientific), se obtuvieron proteínas recombinantes del mismo como fracciones del sobrenadante de cultivo.
La transfección de los plásmidos de expresión en las células y la recogida de las proteínas recombinantes se llevaron a cabo según las instrucciones adjuntas.
Al hacer esto, se logró por primera vez la expresión y la obtención de la proteína (SEQ ID n.° 2) que puede tener la actividad de factor C deLimulus polyphemus,la proteína (SEQ ID n.° 6) que puede tener la actividad de factor B del mismo, y la proteína (SEQ ID n.° 14) que puede tener la actividad enzimática procoagulante. El análisis de la actividad de estas proteínas se describirá a continuación.
(7) Medición de la actividad
En presencia de una solución tamponante de Tris a 50 mM (pH 8,0) y un sustrato sintético (Boc-LGR-pNA), con respecto a las diversas combinaciones de los tres tipos de proteínas recombinantes obtenidas en el apartado (6) anterior, la activación de los tres tipos de proteínas recombinantes dependientes de una endotoxina se examinó utilizando una endotoxina estándar de referencia de la Farmacopea de los Estados Unidos (USP-RSE, Seikagaku Corporation) (0 UE/ml y 0,05 UE/ml, UE es la unidad de endotoxina) como muestra. Esta reacción se llevó a cabo a 37 °C durante 30 min.
Si en este sistema de ensayo se produce una reacción en cascada, la proteína que tiene actividad de factor C es activada por la endotoxina, la proteína que tiene actividad de factor B es activada por esta proteína activada que tiene actividad de factor C, la proteína que tiene actividad enzimática procoagulante es activada por esta proteína activada que tiene actividad de factor B, y el sustrato sintético Boc-LGR-pNA es escindido por esta proteína activada que tiene actividad enzimática procoagulante, mediante lo cual se libera pNA. La liberación de pNA se detectó midiendo un cambio de absorbancia (A405 nm). Como resultado, cuando se incluyeron los tres tipos de proteínas recombinantes, se observó la escisión del sustrato sintético (figura 3). Secundariamente, en la figura 3, FC denota la proteína expresada a partir del ADNc obtenido en el apartado (3-7) anterior, FB denota la proteína expresada a partir del ADNc obtenido en el apartado (4) anterior, y PCE denota la proteína expresada a partir del ADNc obtenido en el apartado (5) anterior. La concentración final de cada proteína en la solución de reacción (100 pl) en estado de mezcla con la muestra de endotoxina fue la siguiente: FC: 22,8 pg/ml; FB: 20,0 pg/ml; y PCE: 23,5 pg/ml. Cada ensayo se llevó a cabo estableciendo N = 3, y también se mostró la desviación estándar en el dibujo como barra de error.
A partir de esto, se demostró por primera vez que la proteína expresada que puede tener actividad de factor C, la proteína expresada que puede tener actividad de factor B y la proteína expresada que puede tener actividad enzimática procoagulante tienen actividad de factor C, actividad de factor B y actividad enzimática procoagulante, respectivamente, y la reacción en cascada está causada por el contacto con una endotoxina. Además, se demostró por primera vez que utilizando estas proteínas recombinantes se puede detectar una endotoxina.
Además, cuando se examinó la dependencia de la concentración de una endotoxina en esas condiciones y se creó una curva de calibración, mostró una linealidad favorable dentro de un margen de concentración de 0,001 a 0,1 UE/ml (figura 4). El ensayo en cada concentración de endotoxina se llevó a cabo estableciendo N = 3, y también se mostró la desviación estándar en el dibujo como la barra de error.
A partir de los resultados anteriores, se demostró por primera vez que utilizando los tres tipos correspondientes de proteínas recombinantes mencionados anteriormente, también se puede detectar cuantitativamente una endotoxina con alta sensibilidad y alta precisión.
(8) Comparación de la actividad con el factor C recombinante obtenido del género Tachypleus
Se comparó la actividad entre el factor C recombinante obtenido deLimulus polyphemus(denominado en lo sucesivo "LFC") y el factor C recombinante obtenido del géneroTachypleus(denominado en lo sucesivo "TFC").
Se obtuvo el LFC como una fracción del sobrenadante de cultivo al expresar el LFC a partir del ADNc de SEQ ID n.° 1 de la misma manera que en el apartado (6) anterior. El TFC se obtuvo como una fracción del sobrenadante de cultivo al expresar el TFC de un gen del factor C deTachypleus tridentatus(SEQ ID n.° 1 en la solicitud de patente internacional WO 2014/092079) de la misma manera que en el apartado (6) anterior mediante el método descrito en el ejemplo 1. (2) en la misma bibliografía. En este caso, como vector para la expresión de proteínas, se utilizó pCI-neo (Promega) para ambos.
Con respecto a someter LFC y TFC a una prueba, se llevó a cabo una transferencia Western utilizando un anticuerpo<monoclonal específico contra el factor C (>2<C>1<2; Yoshiki Miura et al., J. Biochem. 112: 476-481 (1992)). Como resultado>de aplicar un volumen igual de muestras (3 pl cada una) y medir ópticamente la intensidad de las bandas, la intensidad del LFC fue de 18036 y la intensidad del TFC fue de 24516. Es decir, la cantidad relativa (TFC/LFC) de factor C recombinante en el mismo volumen de las muestras fue 1,4.
Posteriormente, se comparó la actividad de cada factor C recombinante en un sistema de reacción en cascada (un sistema que contiene el factor C, el factor B y una enzima procoagulante). Como factor B y enzima procoagulante se utilizaron las proteínas recombinantes procedentes del géneroTachypleus.Se usaron las proteínas recombinantes obtenidas como fracciones de sobrenadante del cultivo que expresan la primera a partir de un gen del factor B deTachypleus tridentatus(SEQ ID n.° 5 en la solicitud de patente internacional WO 2014/092079) y que expresa la última a partir de un gen de enzima procoagulante del mismo organismo (SEQ ID n.° 7 en la misma referencia bibliográfica) usando el método descrito en la misma referencia bibliográfica (ejemplo 2: preparación del factor B recombinante y de la enzima procoagulante recombinante).
Al utilizar cada muestra (el mismo volumen para cada una) del factor C recombinante (LFC o TFC), y el factor B recombinante (TFB) procedente deTachypleus tridentatusdescrito anteriormente y la enzima procoagulante recombinante (TPCE) procedente del mismo organismo, la actividad se midió mediante el método descrito en el apartado (7) anterior. Las condiciones fueron las mismas, excepto por el uso del factor C recombinante.
Los cambios de absorbancia (mAbs/min) en las correspondientes concentraciones de endotoxina de 0 UE/ml (blanco) y 0,05 UE/ml en los respectivos sistemas de reacción en cascada fueron 0,53 y 14,27 en el sistema de LFC, y 0,51 y 9,15 en el sistema de TFC. Es decir, en este sistema, el LFC mostró una actividad aproximadamente 1,6 veces (aproximadamente 2,2 veces si se considera la diferencia en la cantidad de proteína) mayor que el TFC.
Como se describe en la presente memoria, se pueden dar a conocer todas las proteínas recombinantes completas que intervienen en el mecanismo de coagulación deLimulus polyphemus, los ADNc que las codifican y sus aplicaciones. La presente invención es particularmente útil para detectar una endotoxina.
[Descripción del listado de secuencias]
SEQ ID n.° 1: secuencia de bases del primer ADNc
SEQ ID n.° 2: secuencia de aminoácidos de la primera proteína
SEQ ID n.° 3: secuencia de bases de la variante 1 del primer ADNc
SEQ ID n.° 4: secuencia de aminoácidos de la variante 1 de la primera proteína SEQ ID n.° 5: secuencia de bases del segundo ADNc
SEQ ID n.° 6: secuencia de aminoácidos de la segunda proteína
SEQ ID n.° 7: secuencia de bases de la variante 1 del segundo ADNc
SEQ ID n.° 8: secuencia de aminoácidos de la variante 1 de la segunda proteína SEQ ID n.° 9: secuencia de bases de la variante 2 del segundo ADNc
SEQ ID n.° 10: secuencia de aminoácidos de la variante 2 de la segunda proteína SEQ ID n.° 11: secuencia de bases de la variante 3 del segundo ADNc SEQ ID n.° 12: secuencia de aminoácidos de la variante 3 de la segunda proteína SEQ ID n.° 13: secuencia de bases del tercer ADNc
SEQ ID n.° 14: secuencia de aminoácidos de la tercera proteína
SEQ ID n.° 15: secuencia de bases de la variante 1 del tercer ADNc
SEQ ID n.° 16: secuencia de aminoácidos de la variante 1 de la tercera proteína SEQ ID n.° 17: secuencia de bases de la variante 2 del tercer ADNc
SEQ ID n.° 18: secuencia de aminoácidos de la variante 2 de la tercera proteína SEQ ID n.° 19: secuencia de bases de la variante 3 del tercer ADNc
SEQ ID n.° 20: secuencia de aminoácidos de la variante 3 de la tercera proteína SEQ ID n.° 21: secuencia de bases de la variante 4 del tercer ADNc
SEQ ID n.° 22: secuencia de aminoácidos de la variante 4 de la tercera proteína SEQ ID n.° 23: péptido sustrato sintético IEGR
SEQ ID n.° 24 a 34: cebadores
Claims (2)
1. Un método para producir un agente detector de endotoxinas, que comprende una etapa de expresar artificialmente una proteína usando un ADNc y recoger la proteína recombinante expresada como una fracción de solución que contiene la proteína recombinante expresada,
en donde el ADNc codifica alguna de las siguientes:
(A) una proteína recombinante expresada que contiene la secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID n.os 2 o 4;
(B) una proteína recombinante expresada que contiene una secuencia de aminoácidos que tiene un 95 % o más de identidad con la secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID n.os 2 o 4, y que tiene actividad de factor C; y
(C) una proteína recombinante que está codificada por un ADN que contiene una secuencia de bases que tiene un 95 % o más de identidad con la secuencia de bases representada por las SEQ ID n.os 1 o 3, y que tiene actividad de factor C, y
en donde la fracción de solución que contiene la proteína recombinante expresada es una solución de cultivo o un sobrenadante de cultivo.
2. Un método para detectar una endotoxina en una muestra que requiere la detección de la endotoxina usando el agente detector de endotoxinas producido según el método según la reivindicación 1, que comprende una etapa de poner la proteína recombinante en contacto con la muestra que requiere la detección de endotoxina.
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