ES2398412T3 - Procedimiento de diagnóstico in vitro de cepas de Staphylococcus aureus productoras de PVL - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de diagnóstico in vitro de cepas de Staphylococcus aureus productoras de la leucocidina dePanton-Valentine (PVL) a partir de una muestra biológica obtenida de un individuo propenso a ser colonizado oinfectado por Staphylococcus aureus, realizándose el diagnóstico por detección de la PVL por un inmunoensayode rutina, caracterizado porque dicha muestra biológica se trata previamente para desnaturalizar la PVL.
Description
Procedimiento de diagnóstico in vitro de cepas de Staphylococcus aureus productoras de PVL.
La presente invención se refiere a las infecciones asociadas con la presencia de bacterias que pertenecen al género Staphylococcus y a la especie Staphylococcus aureus productora de leucocidina de Panton-Valentine (conocida por su abreviatura en inglés PVL, por la expresión Panton Valentine Leukocidin). Más particularmente, la presente invención se refiere a un procedimiento para la determinación de cepas de Staphylococcus aureus productoras de PVL por un inmunoensayo de rutina en una muestra biológica que pueda contener cepas de Staphylococcus aureus.
Las infecciones por cepas de Staphylococcus aureus productoras de PVL son las principales responsables de infecciones extrahospitalarias. La bacteria Staphylococcus aureus expresa una gran variedad de factores de virulencia, entre los cuales se encuentra la leucocidina de Panton-Valentine (PVL), que es una citotoxina que favorece las lesiones tisulares1. La PVL es una toxina presente frecuentemente en cepas de Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina y transmisibles extrahospitalariamente (abreviadamente CA-MRSA por la expresión inglesa «Community acquired methicillin-resistant S. aureus») propagándose en el mundo entero2 .
La PVL, así como otras leucocidinas es una proteína perteneciente a la familia de las toxinas sinergohimenotrópicas. Todas las toxinas de esta familia están constituidas por dos componentes polipeptídicos, de acción sinérgica, denominados S y F. La PVL es codificada por dos genes contiguos cotranscritos, lukF-PV y lukS-PV. La PVL es una exotoxina porque es excretada en el medio extracelular después de la lisis o no de la bacteria, a diferencia de las endotoxinas o lipopolisacáridos, que no son liberadas más durante la destrucción de la bacteria Gram-negativa que las secreta.
Las cepas de Staphylococcus aureus productoras de PVL, son bacterias Gram-positivas, asociadas a determinadas infecciones humanas, tales como infecciones cutáneas, subcutáneas de tipo forúnculos, abscesos, celulitis y miositis, infecciones osteoarticulares, así como neumonías necrosantes graves que afectan principalmente a niños y adultos jóvenes con una tasa de mortalidad de aproximadamente el 70%.
La patogénesis no se conoce completamente, pero varias líneas de evidencia sugieren que la PVL desempeña una función importante en la fisiopatología de las infecciones por cepas de Staphylococcus aureus productoras de PVL:
i) la fuerte relación epidemiológica con los aislados de S. aureus que sintetizan la PVL y la presentación clínica de la infección,
ii) la elevada frecuencia de leucopenia, un efecto conocido de la PVL,
iii) las lesiones necróticas del tracto respiratorio, que se asemejan a la necrosis inducida por inyección intradérmica de la PVL en conejos,
iv) la presencia de PVL en el pulmón al que se dirigen las células polimorfonucleares,
v) solo las cepas productoras de PVL o la PVL purificadas inducen una neumonía necrosante en los modelos experimentales7 .
La detección de cepas de S. aureus productoras de PVL se realiza actualmente por ensayos de detección de ácidos nucleicos, y principalmente por detección de los genes lukF-PV y lukS-PV, por PCR3.
Dichos ensayos tienen como inconvenientes ser indirectos porque no permiten afirmar que el gen sea funcional y/o expresado, son caros debido a la necesidad de equipo específico, poco rápidos y difíciles de realizar. Además, en el contexto de la utilización de una PCR, pueden ocurrir problemas de contaminación.
La detección de la PVL ha sido igualmente realizada siempre por inmunodifusión con ayuda de anticuerpos policlonales4, pero esta técnica se abandonó rápidamente en favor de la detección de genes, porque no es fácil y difícilmente estandarizable, de modo que no es una buena herramienta para ser utilizada rutinariamente.
Debido a la gravedad de ciertas infecciones por cepas de Staphylococcus aureus productoras de PVL, es urgente disponer de un ensayo rápido y sencillo de realizar, que supere las desventajas de los ensayos actualmente utilizados para la detección de cepas de S. aureus productoras de PVL.
La solicitud de patente europea EP 597110 A describe que la detección de MRSA puede ser realizada por inmunoensayos de rutina usando anticuerpos monoclonales anti-PVL. Sin embargo, aunque estos ensayos permiten superar los inconvenientes anteriores, la especificidad de la detección no es suficiente.
La publicación científica de Kasai et al., (Kasai S. et al., 2000, Analytical Chemistry, 72 (23):5761-5765) se refiere al diagnóstico in vitro de cepas de Staphylococcus aureus productoras de leucocidina de Panton-Valentine (PVL) y describe un procedimiento para detectar la PVL por un inmunoensayo de rutina sin la etapa preliminar de desnaturalización de la muestra.
Contra toda expectativa, los inventores han demostrado ahora que la especificidad de la detección de las cepas de
S. aureus productoras de PVL por un inmunoensayo de rutina podría mejorarse mediante un tratamiento previo de la muestra biológica para desnaturalizar la PVL, puesto que los expertos en la técnica saben que, como cualquier exotoxina, la PVL es sensible a los agentes físico-químicos, como la temperatura5.
Por lo tanto, la presente invención tiene por objeto un procedimiento para el diagnóstico in vitro de cepas de Staphylococcus aureus productoras de leucocidina de Panton-Valentine (PVL) a partir de una muestra biológica obtenida de un individuo propenso a ser colonizado o infectado por Staphylococcus aureus, realizándose el diagnóstico mediante la detección de la PVL por un inmunoensayo de rutina, caracterizado porque dicha muestra biológica se trata previamente con el fin de desnaturalizar la PVL.
Por la expresión cepas de Staphylococcus aureus productoras de PVL, se entiende todas las cepas de Staphylococcus aureus capaces de producir la PVL, a saber, tanto las cepas sensibles a la meticilina (abreviadamente MSSA por la expresión inglesa methicillin sensible-Staphylococcus aureus) como las resistentes a la meticilina (MRSA por la expresión inglesa methicillin resistant-Staphylococcus aureus).
Por individuos propensos a ser colonizados por Staphylococcus aureus, se entiende los individuos con riesgo de poder ser portadores sanos de esta bacteria, tales como el personal de hospitales. Por individuo propenso a ser infectado por Staphylococcus aureus, se entiende los pacientes que muestran síntomas de infección por Staphylococcus aureus.
Por infección por Staphylococcus aureus, se entiende cualquier infección provocada por la presencia de esta bacteria en un organismo, aunque estas infecciones sean por las cepas de Staphylococcus aureus productoras de PVL o por cepas de Staphylococcus aureus que no tengan dicha capacidad. Como ejemplo de tales infecciones, se pueden citar infecciones supurativas de la piel y de los tejidos blandos, infecciones de las vías respiratorias, infecciones del sistema nervioso central, infecciones de las vías urinarias, infecciones endovasculares y de las válvulas del corazón e infecciones musculares y óseas. Tales infecciones y sus síntomas asociados son ampliamente conocidos por los expertos en la técnica y se describen por ejemplo en el texto Précis de Bacteriologie Clinique5.
Por muestra biológica obtenida de un individuo propenso a ser colonizado o infectado por Staphylococcus aureus, se entiende cualquier muestra susceptible de contener estas bacterias o bien la PVL excretada, tal como pus, exudado respiratorio, exudado nasal, orina o hemocultivo.
La muestra biológica utilizada en el procedimiento de la invención puede ser la muestra sin modificar o puede ser un cultivo bacteriano procedente de esta muestra. El cultivo puede ser realizado en un medio sólido, tal como una placa de Petri o en un caldo, entendiéndose que el caldo de cultivo puede ser inoculado por dicha muestra o por colonias de Staphylococcus aureus aisladas previamente de dicha muestra biológica mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica, tales como por siembra en placas de Petri. El inmunoensayo se utilizará entonces o bien directamente sobre el medio sólido o bien en el caldo de cultivo. En general, el cultivo de las bacterias de interés o de dicha muestra dura alrededor de 24 horas. Cabe señalar que, cualquiera que sea el cultivo, el medio de cultivo comprende un agente que favorezca la producción de PVL, como el medio CCY (medio de hidrolizado de caseína y extracto de levadura), con o sin el uso de moléculas que permitan una mayor producción de PVL, tales como oxacilina y bacitracina en dosis sub-inhibidoras.
Por inmunoensayo, se entiende cualquier inmunoensayo que utilice una pareja de unión capaz de unirse específicamente a la PVL, ya sea la fracción LukF de la PVL, la fracción LukS de la PVL, o bien ambas fracciones simultáneamente.
Por inmunoensayo de rutina se entiende cualquier inmunoensayo ampliamente utilizado en el laboratorio rutinariamente. Como ejemplo de los inmunoensayos de rutina se pueden citar ensayos sándwich de tipo ELISA o inmunocromatográficos (también llamados de flujo lateral) y los ensayos de aglutinación de partículas, por ejemplo, partículas de poliestireno. Todos estos ensayos son ampliamente conocidos por los expertos en la técnica. El ensayo de tipo sándwich se puede realizar en una o varias etapas, es decir, sin una etapa de lavado, o con una o varias etapas de lavado.
Como ejemplos de parejas de unión específica de PVL se pueden citar anticuerpos, fracciones de anticuerpos, receptores, mimótopos y cualquier otra molécula capaz de unirse a la PVL.
Los anticuerpos parejas de unión, son por ejemplo, anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales.
Los anticuerpos policlonales pueden obtenerse mediante inmunización de un animal con la PVL, una fracción de la PVL o un péptido de la PVL, seguido por la recuperación del suero de dicho animal. Los anticuerpos pueden utilizarse purificados o no en el procedimiento de la invención. La purificación de los anticuerpos policlonales se puede realizar, por ejemplo, por recogida del suero de dicho animal y separación de los anticuerpos de los otros constituyentes del suero, principalmente por cromatografía de afinidad en una columna a la que se fija un antígeno específicamente reconocido por los anticuerpos, principalmente la PVL.
Los anticuerpos monoclonales se pueden obtener por la técnica de hibridomas, cuyo principio general se describe a continuación.
En una primera etapa se inmuniza un animal, generalmente un ratón (o células cultivadas en el marco de inmunizaciones in vitro) con la PVL, una fracción de la PVL o un péptido de la PVL, cuyos linfocitos B son entonces capaces de producir anticuerpos contra dicho antígeno. Estos linfocitos productores de anticuerpos se fusionan a continuación con células mielomatosas "inmortales" (de múridos en el ejemplo) para dar lugar a hibridomas. A partir de la mezcla heterogénea de las células así obtenidas, se efectúa entonces una selección de células capaces de producir un anticuerpo específico y de multiplicarse indefinidamente. Cada hibridoma se multiplica en forma de un clon, conduciendo cada uno a la producción de un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente la PVL. Los anticuerpos pueden purificarse o no en el procedimiento de la invención. Los anticuerpos monoclonales se pueden purificar principalmente por la técnica de cromatografía de afinidad descrita anteriormente.
Los anticuerpos monoclonales también pueden ser anticuerpos recombinantes obtenidos por ingeniería genética, utilizando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica.
Por fragmentos de anticuerpo útiles para los fines de la invención, se entienden fragmentos de tipo F(ab')2, Fab, Fab', scFv de un anticuerpo natural, que han conservado la capacidad de unirse específicamente a la PVL.
El procedimiento de la invención se realiza preferentemente con las siguientes características, tomadas por separado o en combinación:
- -
- el inmunoensayo de rutina es un método de tipo sándwich,
- -
- emplea parejas(s) de unión específica(s) de LukS-PV o LukF-PV,
- -
- emplea fragmentos de anticuerpos y, principalmente, el fragmento F(ab')2.
En el marco de un ensayo de tipo sándwich que utiliza dos parejas de unión específica a la PVL se pueden usar, por ejemplo, dos anticuerpos monoclonales, dos anticuerpos policlonales o sus fragmentos, o un anticuerpo monoclonal y un anticuerpo policlonal o sus fragmentos. En el marco de un ensayo de aglutinación de partículas, se utiliza sólo una pareja de unión específica a la PVL, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal, en forma de fragmento o no.
Según un modo de realización particular, el inmunoensayo utiliza al menos un anticuerpo monoclonal anti-PVL.
En el marco de un ensayo de aglutinación de partículas, la pareja de unión específica a la PVL se utiliza para la captura. En el marco de un ensayo de tipo sándwich, se utiliza para la captura y para la detección.
Cuando la pareja de unión se utiliza como reactivo de detección, está marcada para poner de manifiesto la unión PVL/pareja de unión.
Por marcaje de las parejas de unión, se entiende la fijación de un marcador capaz de generar directa o indirectamente una señal detectable. Una lista no exhaustiva de estos marcadores consiste en:
- •
- enzimas que producen una señal detectable, por ejemplo, por colorimetría, fluorescencia, luminiscencia, como peroxidasa de rábano silvestre, fosfatasa alcalina, a-galactosidasa, glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa,
- •
- cromóforos, tales como compuestos fluorescentes, luminiscentes y colorantes
- •
- moléculas radiactivas como 32P, 35S o 125I, y
- •
- moléculas fluorescentes, tales como alexa o ficocianinas.
También se pueden usar sistemas de detección indirectos, como por ejemplo, ligandos capaces de reaccionar con un anti-ligando. Las parejas ligando/anti-ligando son bien conocidas por los expertos en la técnica, que es el caso por ejemplo, de las siguientes parejas: biotina/estreptavidina, hapteno/anticuerpo, antígeno/anticuerpo, péptido/anticuerpo, azúcar/lectina, polinucleótido/polinucleótido complementario. En este caso, es el ligando el que lleva la pareja de unión. El anti-ligando puede ser detectado directamente por los marcadores descritos en el párrafo anterior o ser detectado el mismo por un ligando/anti-ligando.
Estos sistemas de detección indirectos pueden conducir, bajo ciertas condiciones, a una amplificación de la señal. Esta técnica de amplificación de la señal es bien conocida por los expertos en la técnica, y se puede hacer referencia al artículo de J. Histochem. Cytochem6. 45:481-491, 1997.
Dependiendo del tipo de marcaje utilizado, el experto en la técnica añadirá los reactivos que permitan la visualización del marcaje.
En el caso de los métodos denominados de competición, la PVL se marca como se ha descrito anteriormente para la pareja de unión.
La pareja de unión específica de la PVL, si se utiliza para la captura, es entonces inmovilizada directa o indirectamente en una fase sólida mediante procedimientos conocidos por los expertos en la técnica.
El tratamiento previo de la muestra utilizada en el procedimiento de la invención puede ser cualquier tratamiento de desnaturalización de proteínas ampliamente conocido por los expertos en la técnica. Este tratamiento se puede realizar por ejemplo, por modificación del pH, por utilización de agentes desnaturalizantes químicos, tales como urea, dodecilsulfato de sodio (SDS), iones de guanidinio o por calentamiento de la muestra en la que se encuentra la proteína que se ha de desnaturalizar.
Según un modo de realización, el tratamiento previo de dicha muestra consiste en calentar a una temperatura comprendida entre 60 y 100ºC, durante un período de al menos 10 minutos. Preferiblemente, el calentamiento se realiza a una temperatura comprendida entre 80 y 100ºC, incluso preferiblemente entre 90 y 100ºC.
Por supuesto el tratamiento previo de la muestra se aplicará a la muestra propiamente dicha cuando el inmunoensayo de rutina se lleve a cabo en dicha muestra, o se aplicará al cultivo cuando el inmunoensayo se realice en dicho cultivo.
El procedimiento de la invención también puede comprender una etapa suplementaria de verificación de la presencia de Staphylococcus aureus en dicha muestra biológica, pudiendo realizarse esta etapa de forma previa o simultánea. Los procedimientos de detección de estas bacterias son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, el uso de medios que contienen una agente cromógeno específico de esta bacteria, tal como se describe por ejemplo en la solicitud de patente WO 02079486 presentada por una de las firmas solicitante.
De manera similar, el procedimiento de la invención puede comprender una etapa suplementaria que consiste en determinar si las cepas de Staphylococcus aureus presentes en dicha muestra biológica son bacterias resistentes a la meticilina (MRSA) o sensibles a la meticilina (MSSA), lo que constituye un modo de realización particular de la invención.
Esta etapa de determinación de la sensibilidad a la meticilina (MRSA o MSSA) puede ser realizada por procedimientos ampliamente conocidos por los expertos en la técnica, tales como inmunoensayos que utilizan, por ejemplo, una pareja de unión específica para la proteína PBP2', que es una proteína expresada solamente por las MRSA, ensayos de detección del ácido nucleico o ensayos microbiológicos, por ejemplo, que utilizan un medio que contiene un antibiótico, tal como oxacilina o una cefalosporina, por ejemplo cefoxitina .
La invención se comprenderá mejor con ayuda de los siguientes ejemplos que se dan a modo de ilustración y no de limitación, así como con ayuda de las Figuras 1 a 3 adjuntas, en las que:
- -
- La Figura 1 es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo ELISA (Densidad óptica (DO) de cada cepa) para la detección de la PVL en muestras biológicas que contienen cepas de Staphylococcus aureus productoras de PVL (PVL+) o no productoras de PVL (PVL-),
- -
- La Figura 2 es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo ELISA (Densidad óptica (DO) de cada cepa) para la detección de la PVL en muestras biológicas que contienen cepas de Staphylococcus aureus productoras de PVL (PVL+) o no productoras de PVL (PVL-), habiendo sido tratada previamente dicha muestra por calentamiento para desnaturalizar la PVL, y
- -
- La Figura 3 es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo ELISA (Densidad óptica (DO) de cada cepa) para la detección de PVL en muestras biológicas que contienen cepas de Staphylococcus aureus productoras de PVL (LY990084, A92007, LUG855) o no productoras de PVL (LY990333, LY991321, RN6911), habiendo sido tratada previamente dicha muestra por calentamiento (tratamiento 1), por un agente químico desnaturalizante (tratamiento 2), por un agente desnaturalizante y por calentamiento (tratamiento 3), correspondiendo el estado 0 a ningún tratamiento previo de la muestra.
Ejemplo 1: Preparación de anticuerpos anti-PVL
1. Producción de PVL recombinante
Se produjeron las proteínas LukS His-Tag y LukF His-Tag de secuencias respectivas SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 usando el vector pIVEX de 2,4d (Roche) transformado en una cepa de Escherichia coli BL21 star(DE3) pLys (Invitrogen) durante un cultivo de 2 litros a 37ºC con agitación, inducción durante 3 horas a 37ºC por IPTG (isopropilbeta-D-tiogalactopiranósido, Eurobio) 1 mM y después un cultivo durante 5 horas más. El cultivo se repartió en 6 tubos diferentes.
Cada sedimento celular se recuperó por centrifugación a 4000 g durante 20 minutos y eliminación del líquido sobrenadante. La purificación de las proteínas recombinantes se realizó usando el kit "The QIAexpressionist" según las recomendaciones del proveedor (Qiagen). El sedimento se lisó con 20 ml de una solución de lisis no desnaturalizante (Qiagen) a 4ºC, y después se conservó durante una noche a -80ºC. Después de descongelación, la lisis fue seguida por tratamiento con 1 mg/ml de lisozima (Eurobio) durante 1 hora a 4ºC antes de un tratamiento con ultrasonidos en un aparato Vibracell (Bioblock) a 100 vatios, 2 minutos en ciclos de 6 segundos.
La solución se centrifugó a 10.000 g durante 30 minutos a 4ºC. El líquido sobrenadante se puso en contacto con 5 ml de agarosa-NiNTA (Qiagen) durante 3 horas a 4ºC con agitación circular suave. La agarosa se introdujo luego en una columna de 20 ml (Biorad). La columna se lavó con 200 ml de tampón de lavado "Wash buffer" (Qiagen) y después se eluyó con imidazol 250 mM como tampón de elución. Esta purificación se completó con una purificación en columna de intercambio iónico monoSP (Amersham).
Las proteínas recombinantes se concentraron en un aparato Centricon (Vivaspin), se dializaron contra un tampón MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico) 50 mM y se eluyó con un gradiente de NaCl (0 a 1 M). Las proteínas se dializaron luego contra agua estéril libre de pirógenos.
2. Producción de anticuerpos monoclonales
Se obtuvieron los anticuerpos monoclonales siguientes:
-anti-LukF: 10D1A10, 16A10A3, 6H10E5 y
-anti-LukS: 2H2H12, 3D9D12, 7C1F9, 7F8D7, 18A4E10
como sigue:
Anticuerpos monoclonales anti-LucF: 10D1A10, 16A10A3, 6H10E5.
Se inmunizaron ratones según el protocolo siguiente: en el día 0 inyección intraperitoneal de 10 μg de proteína recombinante LukF en presencia de adyuvante completo de Freund. Los días 14 y 28, nueva inyección intraperitoneal de la misma cantidad de proteína recombinante LukF en presencia de adyuvante incompleto de Freund. Cuatro días antes de la fusión se les puso una inyección intravenosa de 50 μg de antígeno LukF diluido en solución salina fisiológica.
Se cribaron 1600 líquidos sobrenadantes por la técnica ELISA indirecto. Las placas fueron "revestidas" con 100 μl de antígeno (proteína recombinante LukF) a 1 μg/ml en tampón PBS, pH 7,2. Las placas "revestidas" se incubaron durante una noche a la temperatura de 18-22ºC. Las placas se saturaron con 200 1l de PBS-1% de leche y se incubaron durante 1 hora a 37º+/-2ºC. Se añadieron 100 μl de líquidos sobrenadantes o líquido ascítico diluidos en tampón PBS-Tween 20 al 0,05% y las placas se incubaron durante 1 hora a 37º+/-2ºC. Se añadieron 100 μl de anticuerpo policlonal de cabra anti-Ig (H+L) de ratón conjugado con fosfatasa alcalina (Jackson Immunoresearch ref.: 115-055-062), diluido 1/2000 en tampón PBS-BSA al 1% y las placas se incubaron a continuación durante 1 hora a 37º+/-2ºC. 100 1l de PNPP (Biomérieux, ref.: 60002990) con una concentración de 2 mg/ml en DEA-HCl (Biomérieux ref.: 60002989), pH = 9,8. Las placas se incubaron durante 30 minutos a 37º+/-2ºC. La reacción se bloqueó mediante la adición de 100 μl de NaOH 1N. Se realizaron tres lavados entre cada etapa con 300 1l de tampón PBS-Tween 20 al 0,05%. Se realizó un lavado adicional en agua destilada antes de añadir el PNPP.
72 líquidos sobrenadantes dieron positivos en ELISA indirecto con una DO > 0,6. Después de los ensayos de especificidad se produjeron los tres anticuerpos antes citados.
Anticuerpos monoclonales anti-LucS: 2H2H12, 3D9D12, 7C1F9, 7F8D7, 18A4E10.
Se inmunizaron ratones según el protocolo siguiente: en el día 0 inyección intraperitoneal de 10 μg de proteína recombinante LukS en presencia de adyuvante completo de Freund. Los días 14 y 28 nueva inyección intraperitoneal la misma cantidad de proteína recombinante LukS en presencia de adyuvante incompleto de Freund. Cuatro días antes de la fusión, se les puso una inyección intravenosa de 50 μg de proteína recombinante LukS diluida en solución salina fisiológica.
Se cribaron 1800 líquidos sobrenadantes por la técnica ELISA indirecto. Las placas fueron "revestidas" con 100 ml de proteína recombinante LukS a 1 μg/ml en tampón PBS, pH 7,2. Las placas "revestidas" se incubaron durante una noche a la temperatura de 18-22ºC. Las placas se saturaron con 200 1l de PBS-1% de leche y se incubaron durante 1 hora a 37º+/-2ºC. Se añadieron 100 ml de líquidos sobrenadantes o líquido ascítico diluidos en tampón PBS-Tween 20 al 0,05% y las placas se incubaron durante 1 hora a 37º+/-2ºC. Se añadieron 100 1l de anticuerpo policlonal de cabra anti-Ig (H+L) de ratón conjugado con fosfatasa alcalina (Jackson Immunoresearch ref.: 115-055062), diluido 1/2000 en tampón PBS-BSA al 1% y las placas se incubaron a continuación durante 1 hora a 37º+/-2ºC. Se añadieron 100 1l de PNPP (Biomérieux, ref.: 60002990) a la concentración de 2 mg/ml en DEA-HCl (Biomérieux, ref.: 60002989), pH = 9,8. Las placas se incubaron durante 30 minutos a 37º+/-2ºC. La reacción se bloqueó mediante la adición de 100 μl de NaOH 1N. Se realizaron tres lavados entre cada etapa con 300 1l de tampón PBS-Tween 20 al 0,05%. Se realizó un lavado adicional con agua destilada antes de añadir el PNPP.
51 líquidos sobrenadantes dieron positivos en ELISA indirecto con una DO > 0,6. Después de los ensayos de especificidad se produjeron los cinco anticuerpos antes citados.
3. Producción de anticuerpos policlonales
Se obtuvieron los anticuerpos policlonales anti-LukS nº 173/89 y 176/89 del modo siguiente:
En el día 0, conejos (New Zealand White) recibieron una inyección intradérmica de 200 μg de péptido sintético de LukS-PV de la secuencia CSGHDPNLFVGYKPYSQN (SEQ ID NO: 3) acoplado por su N terminal con KLH (hemocianina de lapa bocallave) (Agro-Bio). Los días 14, 28, 42 y 81, los conejos recibieron una nueva inyección subcutánea de la misma cantidad de péptido sintético acoplado a KLH. Se tomó suero de los animales los días 0, 49 y 89. Los sueros de los conejos tomados en el día 89 se purificaron por cromatografía de afinidad respecto a dicho péptido sintético. Para esto, dicho péptido se introdujo en una columna de 1 ml de Hi-Trap-Sepharose según las recomendaciones del fabricante (Amersham-Pharmacia). El suero se diluyó a la mitad en tampón PBS, pH 7,4, y luego se inyectó a razón de 1 ml/minuto en la columna. Después de lavado con PBS, pH 7,4, seguido por elución con mezcla de glicina 50 mM/HCl, pH 3, las fracciones eluídas se neutralizaron inmediatamente y se dializaron contra PBS 0,15 M, pH 7,4.
Se obtuvieron los anticuerpos policlonales anti-LukF como sigue:
En el día 0, conejos (New Zealand White) recibieron una inyección intradérmica de 200 μg de péptido sintético de LukF-PV de la secuencia CNFNWIGNNYKDENRATHTS (SEQ ID NO: 4) acoplado por su N-terminal con KLH (hemocianina de lapa bocallave) (Agro-Bio). Los días 14, 28, 42 y 81, los conejos recibieron una nueva inyección subcutánea de la misma cantidad del péptido sintético acoplado a KLH. Se tomó suero de los animales los días 0, 49 y 89. Los sueros de conejos tomados el día 89 se purificaron por cromatografía de afinidad respecto a dicho péptido sintético. Para esto, dicho péptido se acopló a una columna de 1 ml de Hi-Trap-Sepharose según las recomendaciones del fabricante (Amersham-Pharmacia). El suero se diluyó a la mitad en tampón PBS, pH 7,4, y luego se inyectó a razón de 1 ml/minuto en la columna. Después de lavado con PBS, pH 7,4, seguido por elución con mezcla de glicina 50 mM/HCl, pH 3, las fracciones eluídas se neutralizaron inmediatamente y se dializaron contra PBS 0,15 M, pH 7,4.
4. Producción y acoplamiento de fragmentos de anticuerpos
Se llevó a cabo la digestión de los anticuerpos policlonales anti-LukS 173/89 y 176/89 con pepsina fijada sobre agarosa durante 1 hora 30 minutos, a pH 3,5 a 37ºC para eliminar su fragmento Fc y obtener así los fragmentos F(ab')2.
Se marcaron estos fragmentos con peroxidasa como sigue: los fragmentos F(ab')2 se dializaron contra tampón de carbonato, pH 9,6, y se acoplaron a peroxidasa (Roche) previamente oxidada por NaIO4, 2 horas a 18-25ºC con una relación de 1 mol de F(ab')2 por 2 moles de peroxidasa. El acoplamiento se bloqueó luego por NaBH4 durante 1 hora a 2-8ºC y luego el producto se dializó contra el tampón PBS con conservantes.
A continuación se marcaron con biotina como sigue: los fragmentos F(ab')2 se dializaron contra el tampón de carbonato, pH 8,3, y se acoplaron a biotina-NHS (Roche) durante 1 hora a 18-25ºC con una relación de 1 mol de F (ab')2 por 10 moles de biotina. El acoplamiento se bloqueó por lisina, 20 minutos a 18-25ºC, y el producto se dializó contra PBS + azida.
1. Preparación de la muestra biológica.
Las cepas clínicas de Staphylococcus aureus se precultivaron en agar-agar GP (Difco: peptona 10 g/l, extracto de levadura 5 g/l, agar-agar 17 g/l; Sigma: NaCl 5 g/l, glucosa 1 g/l). Después de 18 horas a 37ºC, se comprobó la pureza antes de la siembra de algunas colonias (aproximadamente 107 UFC/ml) en 5 ml de medio CCY (Difco: extracto de levadura 30 g/l, casaminoácidos 20 g/l; Sigma: Na2HPO4. 2H2O 3,11 g/l, KH2PO4 0,41 g/l, ácido pirúvico 23 g/l) en un matraz Erlenmeyer de vidrio de 25 ml. Después de cultivo durante 18 horas a 37ºC con agitación, los líquidos sobrenadantes del cultivo se recogieron después de centrifugación (8000 g, 4ºC, 10 minutos), y luego se conservaron durante un corto tiempo a 4ºC o a -20ºC antes de su utilización.
Cada cepa recibió un código de identificación (A o LY seguido por 6 números) y se denominó "+" si se producía PVL
o "-" si no se producía.
2. Ensayo ELISA
Los pocillos de placas ELISA (Greiner, 100 μl/pocillo) fueron revestidos con anti-LukS 18A4E10 por incubación con una solución de este anticuerpo diluido en PBS (PBS Sigma, pH 7,4; azida de sodio al 0,1%) a 10 μg/ml durante 18 horas a temperatura ambiente (aproximadamente 22ºC). Después de 5 lavados con tampón PBS-Tween 20 (aparato
5 ImmunoWash 1575 Biorad), la placa se saturó con una solución de PBS-Tween (0,05%) - 10% de leche - 0,5% de BSA (Sigma) durante 2 horas a temperatura ambiente (150 μl/pocillo).
Después de 5 lavados con PBS-Tween (0,05%), los líquidos sobrenadantes de cultivo se incubaron durante 75 minutos a 37ºC.
Después de 5 lavados con PBS-Tween (0,05%), la solución de anticuerpos de conejo 176-89, fragmento F(ab')2
10 marcado con peroxidasa, diluido 1/100 en PBS-Tween - 5% de leche, se incubó durante 75 minutos a 37ºC. Después de 5 lavados con PBS-Tween se añadieron 75 μl solución de TMB (sustrato de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina, Sigma) y la placa se incubó durante 30 minutos en la oscuridad. La reacción se detuvo mediante la adición de 75 μl de H2SO4 1N. La lectura de las placas (DO) se realizó a 450 nm con un lector MicroPlaque Reader 680 (Biorad).
3. Resultados
15 Los resultados se presentan en la Figura 1 que es un gráfico que muestra la DO de cada cepa.
Los resultados muestran que, entre las 15 cepas PVL+, 12 cepas se detectan bien y que, entre las 14 cepas PVL-, se observaron 3 resultados positivos falsos.
Estos resultados muestran claramente que se pueden diferenciar las cepas PVL+ de las cepas PVL-, con ayuda de un de inmunoensayo de rutina, pero que dicho ensayo carece de especificidad.
1. Tratamiento de la muestra
Se procedió al tratamiento por calentamiento a 95ºC de muestras biológicas, tales como las preparadas en el Ejemplo 2, durante tiempos que varían de 10 a 30 minutos y se determinó su DO según el protocolo descrito en el
25 Ejemplo 2.
Los resultados de DO se dan en la Tabla 1 a continuación que muestra que se obtiene una desnaturalización de la PVL después de 10 minutos de tratamiento.
Tabla 1
- Nº de las cepas
- PVL Sin calentamiento Calentamiento de 10 minutos Calentamiento de 20 minutos Calentamiento de 30 minutos
- LY990179
- + 0,839 2,126 2,76 >3
- A960420
- + 1,73 2,844 >3 >3
- A990438
- - 1,545 0,852 0,25 0
- A980642
- + 0,458 1,364 2,325 >3
- LY990301
- - 2,123 0,105 0 0
- HT20020275
- + 0,729 2,269 >3 >3
- LY990333
- - 0,615 0,202 0 0
- HT20040540
- + 1,178 >3 >3 >3
30 2. Ensayo ELISA
Se repitió el modo operativo descrito en el Ejemplo 2, punto 2 anterior, excepto que se utilizaron los líquidos sobrenadantes de cultivo de 29 cepas (15 PVL+ y 14 PVL-) previamente tratados a 95ºC durante 1 hora.
3. Resultados
Los resultados se muestran en la Figura 2 que es un gráfico que da la DO de cada cepa.
35 Los resultados muestran que todas las cepas PVL+ se identifican por el procedimiento de la invención con un nivel de DO suficientemente alto como para hacer una distinción con las cepas PVL-. El tratamiento previo permite, por lo tanto, mejorar la especificidad del procedimiento de la invención.
Ejemplo 4: Diagnóstico de cepas de Staphylococcus aureus productoras de PVL después del tratamiento
previo de la muestra biológica por varios tipos de tratamiento de desnaturalización
1. Tratamiento de la muestra
Se utilizaron tres cepas clínicas PVL+ (LY990084, A92007, LUG855) y tres cepas clínicas PVL- (LY990333,
5 LY991321, RN6911), las cuales se sometieron a los tratamientos siguientes:
- -
- ausencia de tratamiento (0),
- -
- desnaturalización por calentamiento a 95ºC durante 1 hora (1),
- -
- desnaturalización por ácido KH2PO4 0,1 M final durante 30 minutos con vórtice, y luego neutralización mediante la adición de NaOH (2),
10 -desnaturalización mixta por ácido KH2PO4 0,1 M final durante 10 minutos con vórtice y, luego ebullición durante 10 minutos a 95ºC, seguido por neutralización con NaOH (3).
2. Ensayo ELISA
Se repitió el modo operativo descrito en el Ejemplo 2, excepto que se utilizaron las cepas tratadas previamente según el punto 1 anterior y una solución de anticuerpos de conejo 176-89, fragmento F(ab')2 marcado con 15 peroxidasa, diluido 1/1000 en tampón PBS-Tween - 5% de leche.
3. Resultados
Los resultados se presentan en la Figura 3 que es un gráfico que muestra la DO de cada cepa.
Los resultados muestran que todas las cepas PVL- tenían valores de la DO comprendidos entre 0,09 y 0,181, independientemente del tratamiento de la muestra.
20 Para las cepas PVL+, los valores de la DO son más altos que los de las cepas PVL- después del tratamiento. El aumento de la DO obtenido por tratamiento químico, tratamiento térmico y por combinación de los dos es estadísticamente significativo (p = 0,024, p <0,001, p = 0,018, respectivamente), aunque el tratamiento térmico aparece en estas condiciones el más eficiente.
El tratamiento previo permite, por lo tanto, mejorar la especificidad de un inmunoensayo de rutina.
25 Ejemplo 5: Demostración de la detección temprana de bacterias Staphylococcus aureus productoras de PVL por utilización del procedimiento de la invención
1. Preparación de la muestra biológica
Se cultivaron previamente cuatro cepas clínicas de S. aureus (2 cepas PVL+ y 2 cepas PVL-) según el modo operativo descrito en el Ejemplo 2. Las colonias se utilizaron para realizar una siembra rica de 5 ml de medio CCY
30 en un matraz Erlenmeyer de vidrio de 25 ml. El medio de cultivo se recogió inmediatamente después de la inoculación, y luego, sucesivamente, 1h, 2h, 3h y 18h después de incubación a 37ºC con agitación. Después de centrifugación (8000 g, 4ºC, 10 minutos) se recuperaron los líquidos sobrenadantes de cultivo y luego se conservaron durante un corto período de tiempo a 4ºC o a -20ºC antes de su uso. Las muestras se trataron por calentamiento como se ha descrito en el Ejemplo 3.
35 2. Ensayo ELISA
Se repitió el modo operativo descrito en el Ejemplo 2, punto 2 anterior, excepto que se utilizaron los líquidos sobrenadantes de cultivo de cepas previamente tratadas como se ha descrito en el punto 1 anterior.
3. Resultados Los resultados de DO se presentan en la Tabla 2 que muestra que la PVL puede ser detectada muy rápidamente
40 con el procedimiento de la invención (detección clara a las 2 horas del cultivo). Tabla 2
- Tiempo de cultivo
- Nº de las cepas
- T 0 T 1 hora T 2 horas T 3 horas T 18 horas
- A890097
- PVL+ 0,161 1,116 >3 >3 >3
- A920007
- PVL+ 0,083 0,975 2,57 >3 >3
- LY990301
- PVL- 0 0 0 0 0
- LY990333
- PVL- 0 0 0 0 0
Ejemplo 6: Demostración de la detección temprana de la PVL en muestras biológicas por utilización del procedimiento de la invención
1. Preparación de la muestra biológica
5 Las muestras clínicas son aspirados broncopulmonares, líquidos bronco-alveolares y pus de abscesos cutáneos o de supuración profunda de pacientes que presentan infecciones por S. aureus, ya sea por cepas PVL+ o por cepas PVL-. Estas muestras se conservaron a -20ºC antes del análisis por utilización del procedimiento de la invención. Después de descongelación a temperatura ambiente, las muestras se homogeneizaron por agitación con vórtice durante 15 minutos. Después de centrifugación (10 minutos a 4000 rpm a 15ºC), el líquido sobrenadante se transfirió
10 a un tubo Eppendorf, y luego se desnaturalizó durante 1 hora a 95ºC.
Para muestras muy viscosas estas se diluyeron primeramente al doble con tampón PBS, pH 7,4, y luego se agitaron con vórtice durante 15 minutos. Después de centrifugación (10 minutos a 4000 rpm a 15ºC), el líquido sobrenadante se transfirió a un tubo Eppendorf, y luego se desnaturalizó durante 1 hora a 95ºC.
En caso de líquido sobrenadante viscoso, se diluyó al doble con n-heptano (Merck) y se agitó de nuevo con vórtice
15 durante 10 minutos. Después de centrifugación (10 minutos a 4000 rpm a 15ºC), se eliminó completamente la fase superior que correspondía al n-heptano y la fase inferior se transfirió a otro tubo Eppendorf para ser desnaturalizada durante 1 hora a 95ºC.
2. Ensayo ELISA
Se repitió el modo operativo descrito en el Ejemplo 2, punto 2 anterior, excepto que se utilizaron las muestras 20 biológicas tratadas como se ha descrito en el punto 1 anterior.
3. Resultados
Los resultados de la valoración de la PVL se dan en las Tablas 3 y 4 que muestran que la PVL puede ser detectada directamente en muestras biológicas, independientemente de la sensibilidad de la cepa a la meticilina, y que no existen positivos falsos (en ninguna muestra con cepas PVL- se detecta la PVL). Además, el tratamiento previo de la
25 muestra por n-heptano no altera la detección de la PVL.
Tabla 3
- Muestra
- Tipo de muestra Tratamiento previo de la muestra Cepa* Cantidad de PVL (μg/ml)
- 17
- Lavado bronco alveolar no PVL+ <0,05
- 13
- Aspiración bronquial no PVL- <0,05
- 18
- Minilavado bronco alveolar no PVL- <0,05
- 22
- Aspiración bronquial no PVL- <0,05
- 11
- Aspiración bronquial no PVL- <0,05
- 8
- Aspiración bronquial PBS + n-Heptano PVL- <0,05
- 16
- Aspiración bronquial no PVL- <0,05
- 10
- Aspiración bronquial no PVL- <0,05
- 19
- Escupitajo no PVL- <0,05
- 14
- Aspiración bronquial no PVL- <0,05
- 15
- Aspiración bronquial no PVL- <0,05
- 12
- Aspiración bronquial no PVL- <0,05
- 7
- Aspiración bronquial no PVL- <0,05
- 5
- Aspiración bronquial no PVL- <0,05
- 23
- Líquido articular no PVL- <0,05
- 20
- Líquido peritoneal no PVL- <0,05
- 4
- Líquido de drenaje no PVL+ <0,05
- 2
- Absceso no PVL+ 1
- 3
- Absceso no PVL- <0,05
- 1
- Líquido de drenaje no PVL- <0,05
- 5
- Aspiración bronquial PBS PVL+ 1,2
- 5
- Aspiración bronquial PBS+ n-Heptano PVL+ 1,2
- 6
- Aspiración bronquial PBS+ n-Heptano PVL+ 1,2
*La pertenencia a PVL- o PVL+ se puso de manifiesto por la detección de la presencia por PCR de los genes LukS-PV y LukF-PV que codifican la PVL en el seno de aislados de S. aureus por los métodos descritos por Vadenesch et al2
Tabla 4 Tabla 4 (continuación)
- Muestra
- Cepa* Concentración de LkS PV ( g/ml) Detección del gen mecA**
- Pneumonía
- Lavado broncoalveolar PVL+ 0,99 0
- Lavado broncoalveolar
- PVL+ 1,07 0
- Lavado broncoalveolar
- PVL+ 20,18 0
- Escupitajo
- PVL- 0,00 1
- Escupitajo
- PVL- 0,00 1
- Lavado broncoalveolar
- PVL- 0,00 1
- Escupitajo
- PVL- 0,00 1
- Lavado broncoalveolar
- PVL- 0,00 ND
- Aspirado bronquial
- PVL- 0,00 0
- Aspirado bronquial
- PVL- 0,00 0
- Aspirado bronquial
- PVL- 0,00 0
- Lavado broncoalveolar
- PVL- 0,00 0
- Aspirado bronquial
- PVL- 0,00 1
- Aspirado bronquial
- PVL- 0,00 0
- Aspirado bronquial
- PVL- 0,00 1
- Aspirado bronquial
- PVL- 0,00 0
- Aspirado bronquial
- PVL- 0,00 0
- Escupitajo
- PVL- 0,00 0
- Aspirado bronquial
- PVL- 0,00 0
- Aspirado bronquial
- PVL- 0,00 0
- Aspirado bronquial
- PVL- 0,00 ND
- Aspirado bronquial
- PVL- 0,00 1
- Aspirado bronquial
- PVL- 0,00 0
- Infección de la piel
- Absceso PVL+ >1 0
- Absceso
- PVL+ 0,42 0
- Absceso
- PVL+ >1 1
- Absceso
- PVL+ >1 0
- Absceso
- PVL+ 1,20 0
- Absceso
- PVL+ 1,00 0
- Absceso
- PVL+ 1,30 0
- Absceso
- PVL+ 1,50 1
- Absceso
- PVL+ 1,82 0
- Absceso
- PVL+ >2 0
- Absceso
- PVL+ 0,92 0
- Absceso
- PVL+ >2 0
- Absceso
- PVL+ 0,27 0
- Absceso
- PVL+ >2 0
- Absceso
- PVL+ 1,72 0
- Muestra
- Cepa * Concentración de LkS PV ( g/ml) Detección del gen mecA**
- Infección de la piel
- Absceso PVL+ 1,41 0
- Absceso
- PVL- 0,00 0
- Absceso
- PVL- 0,00 1
- Absceso
- PVL- 0,00 0
- Absceso
- PVL- 0,00 0
- Absceso
- PVL- 0,00 0
- Absceso
- PVL- 0,00 0
- Absceso
- PVL- 0,00 0
- Absceso
- PVL- 0,00 0
- Absceso
- PVL- 0,00 0
- Absceso
- PVL- 0,00 0
- Absceso
- PVL- 0,00 0
- Absceso
- PVL- 0,00 0
- Absceso
- PVL- 0,00 0
- Absceso
- PVL- 0,00 0
- Absceso
- PVL- 0,00 0
- Absceso
- PVL- 0,00 1
- Absceso
- PVL- 0,00 0
- Absceso
- PVL- 0,00 0
- Absceso
- PVL- 0,00 0
- Absceso
- PVL- 0,00 0
- Absceso
- PVL- 0,00 0
- Absceso
- PVL- 0,00 0
- Absceso
- PVL- 0,00 0
- Absceso
- PVL- 0,00 0
- Absceso
- PVL- 0,00 0
- Absceso
- PVL- 0,00 0
- *La pertenencia a PVL- o PVL+ se puso de manifiesto por la detección de la presencia por PCR de los genes LukS-PV y LukF-PV que codifican la PVL en el seno de aislados de S. aureus según los métodos descritos por Vadenesch et al2 . ** La detección del gen mecA que codifica la resistencia a la meticilina en el seno de aislados de S. aureus se realizó
Bibliografía
<110> bioMérieux Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Université Claude Bernard Lyon 1 5 <120> Procedimiento de diagnóstico in vitro de cepas de Staphylococcus aureus productoras de PVL.
<130> PVL STAPH
<160> 4 10
<170> PatentIn versión 3.3
<210> 1
<211> 309 15 <212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 1
<210> 2
<211> 323
<212> PRT
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<400> 3
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus 15
<400> 4
Claims (6)
- REIVINDICACIONES1. Procedimiento de diagnóstico in vitro de cepas de Staphylococcus aureus productoras de la leucocidina de Panton-Valentine (PVL) a partir de una muestra biológica obtenida de un individuo propenso a ser colonizado o infectado por Staphylococcus aureus, realizándose el diagnóstico por detección de la PVL por un inmunoensayo5 de rutina, caracterizado porque dicha muestra biológica se trata previamente para desnaturalizar la PVL.
-
- 2.
- Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el inmunoensayo de rutina es un método de tipo sándwich.
-
- 3.
- Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el inmunoensayo utiliza al menos un anticuerpo monoclonal anti-PVL.
- 10 4. Procedimiento según la reivindicación 2 o 3, caracterizado porque el método de tipo sándwich es un ensayo ELISA.
- 5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el tratamiento previo consiste en un calentamiento a una temperatura comprendida entre 60 y 100ºC, durante un período de al menos 10 minutos.
- 15 6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el tratamiento previo consiste en un calentamiento a una temperatura comprendida entre 60 y 100ºC y una duración comprendida entre 10 y 30 minutos.
- 7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el tratamiento previo consiste en la desnaturalización de la PVL por un ácido.
- 20 8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque el ácido es KH2PO4.
- 9. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque comprende una etapa adicional que consiste en determinar si las Staphylococcus aureus presentes en dicha muestra biológica son bacterias resistentes a la meticilina (MRSA) o sensibles a meticilina (MSSA).
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-
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