ES2398465T3

ES2398465T3 - Procedimientos para potenciar la tolerancia a la sequía en plantas y procedimientos de los mismos

Info

Publication number: ES2398465T3
Application number: ES04789188T
Authority: ES
Inventors: Mary Fernandes
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 2003-09-29
Filing date: 2004-09-29
Publication date: 2013-03-19
Anticipated expiration: 2024-09-29
Also published as: BR122016016506B1; EP2371841B1; EP2371841A1; US8735657B2; PL1668141T3; KR20080055940A; NZ546346A; US7786353B2; PL2281895T3; BRPI0414880B1; CA2540348C; BRPI0414880A; KR20060080235A; US20110035835A1; JP2007507229A; AU2004278752A1; JP5323044B2; WO2005033318A2; CN103589749B; SI2281895T1

Abstract

Una planta tolerante a la sequía que tiene insertada en el genoma de sus células un ADN recombinante quecodifica una proteína que comprende un dominio de choque frío y que tiene al menos el 80 % de identidad sobre lalongitud entera de las SEC ID Nº: 1, 2, 63 ó 65, en la que la expresión de dicha proteína confiere tolerancia a lasequía a dicha planta en comparación con una planta no transformada de la misma especie, siendo la sequíasimulada dando a las plantas un 95 % o menos de agua que a una planta de control y determinando diferencias enel vigor, el crecimiento, el tamaño o la longitud de las raíces.

Description

Procedimientos para potenciar la tolerancia a la sequía en plantas y procedimientos de los mismos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la tolerancia a la sequía en plantas. Específicamente, la presente invención se refiere a un procedimiento de aumento de la tolerancia a la sequía de plantas que expresan una proteína(s) de choque frío dentro de las células de dicha planta.

Antecedentes

La producción de semillas y frutos son industrias comerciales de múltiples billones de dólares y fuentes primarias de ingreso para numerosos estados en los Estados Unidos y para muchos países en todo el mundo. Semillas comercialmente valiosas incluyen, por ejemplo, canola, semillas de algodón y semillas de girasol, que son apreciadas para el aceite vegetal que puede prensarse a partir de la semilla. Las semillas de plantas leguminosas tales como guisantes, judías y lentejas también son comercialmente valiosas ya que son ricas en proteínas, consistiendo las sojas, por ejemplo, en 40-45 % de proteína y 18 % de grasas y aceites. Además, el café es un cultivo valioso preparado a partir de semillas secadas y tostadas de plantas de Coffea arabica, mientras que el chocolate se prepara a partir de la semilla o “judía” del cacao. Similarmente, muchos frutos y semillas son comercialmente valiosos, que incluyen, por ejemplo, maíz, arroz, trigo, cebada y otros cereales, frutos secos, legumbres, tomates y frutas cítricas. Por ejemplo, las semillas de maíz se preparan en muchos artículos de comida o artículos usados en la cocina tales como tortillas para tacos, aceite de maíz, tortillas, copos de maíz, harina de maíz y muchos otros. El maíz también se usa como material de partida en muchos procedimientos de producción que incluyen, pero no se limitan a, producción de pienso y etanol.

La producción de semillas y frutos están ambos limitados inherentemente debido al estrés biótico y abiótico. La soja (Glycine max), por ejemplo, es una especie de cultivo que sufre la pérdida de germinación de semilla durante el almacenamiento y no logra germinar cuando las temperaturas de la tierra son frías (Zhang y col., Plant Soil 188: (1997)). Esto también es cierto en maíz y otras plantas de importancia agronómica. La mejora de la tolerancia al estrés abiótico en plantas sería una ventaja agronómica para los productores, permitiendo el crecimiento y/o germinación creciente en frío, sequía, inundación, calor, estrés por UV, aumentos de ozono, lluvia ácida, polución, estrés por sales, metales pesados, tierras mineralizadas y otros estreses abióticos. El estrés biótico, tal como infección fúngica y vírica, también produce grandes pérdidas de cultivos en el mundo.

El cultivo tradicional (cruce de alelos específicos de un genotipo en otro) se ha usado durante siglos para aumentar la tolerancia al estrés biótico, tolerancia al estrés abiótico y rendimiento. El cultivo tradicional está limitado inherentemente al número limitado de alelos presentes en las plantas parentales. Esto limita a su vez la cantidad de variabilidad genética que puede añadirse de este modo. La biología molecular ha permitido que los inventores de la presente invención busquen poco a poco genes que mejorarán la tolerancia al estrés en plantas. Los presentes inventores buscaron determinar cómo otros organismos reaccionan a y toleran condiciones estresantes. Las proteínas de choque frío son parte de un sistema usado por bacterias y otros organismos para sobrevivir a condiciones de frío y estresantes.

El documento WO 90/09447 desvela una proteína de choque frío A de E. coli y contempla el uso de esa proteína para proteger cosechas del daño por heladas.

Los inventores propusieron que la disposición de genes que codifican las proteínas de choque frío, y proteínas relacionadas con ellas, en plantas y que las expresan aumentaría la tolerancia al estrés por frío, sequía, calor, agua, y a otro estrés abiótico de plantas, además de tolerancia al estrés fúngico, vírico y otro estrés biótico de plantas. También creen que usando genes que son homólogos a proteínas de choque frío, o tienen similitud de secuencias, también aumentaría la tolerancia al estrés biótico y abiótico.

La presente invención es útil para agricultores para limitar sus pérdidas debidas al estrés por sequía.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona una planta que expresa una proteína de choque frío (Csp) en las células de la planta. La expresión de esta csp conduce a una mayor tolerancia a la sequía dentro de dicha planta. Por tanto, la invención proporciona

(1): una planta tolerante a la sequía que tiene insertada en el genoma de sus células un ADN recombinante que codifica una proteína que comprende un dominio de choque frío y que tiene al menos el 80 % de identidad sobre la longitud entera de las SEC ID Nº: 1, 2, 63 ó 65, en el que la expresión de dicha proteína confiere la tolerancia a la sequía a dicha planta en comparación con una planta no transformada de la misma especie, siendo la sequía simulada dando a las plantas un 95 % o menos de agua que a una planta de control y determinando diferencias en el vigor, crecimiento, tamaño o longitud de las raíces;

(2): un procedimiento de producir una planta que tiene tolerancia a la sequía potenciada, que comprende insertar

en el genoma de una célula o células de planta un ADN recombinante que codifica una proteína que comprende un dominio de choque frío y que tiene al menos el 80 % de identidad sobre la longitud entera de las SEC ID Nº: 1, 2, 63 ó 65, y seleccionar plantas que presentan la tolerancia a la sequía potenciada como se define en (1) anteriormente; y

(3): el uso de un ADN recombinante que codifica una proteína que comprende un dominio de choque frío y que tiene al menos el 80 % de identidad sobre la longitud entera de las SEC ID Nº: 1, 2, 63 ó 65, para producir una planta que tiene tolerancia a la sequía potenciada como se define en (1) anteriormente.

En una realización, un polinucleótido que codifica una csp es expresado por un promotor operativamente ligado que funciona en plantas, y un terminador que funciona en plantas.

Más especialmente, tal molécula de ADN recombinante comprende, en la dirección 5' a 3', un primer polinucleótido de ADN que comprende un promotor que funciona en plantas, operativamente ligado a un segundo polinucleótido de ADN que codifica una proteína de choque frío, operativamente ligada a un polinucleótido de ADN de terminación de la transcripción de 3' que proporciona un sitio de poliadenilación. El primer polinucleótido de ADN es frecuentemente ventajosamente heterólogo al segundo polinucleótido de ADN. La molécula de ADN recombinante puede tener un intrón insertado entre el primer polinucleótido de ADN y el segundo polinucleótido de ADN. En la molécula de ADN recombinante, el segundo polinucleótido de ADN puede codificar una proteína que comprende el motivo en SEC ID Nº: 3.

En la molécula de ADN recombinante, el promotor está seleccionado del grupo que consiste en promotores inducibles, promotores constitutivos, promotores regulados temporales, promotores regulados por el desarrollo, promotores preferidos por tejido, promotores potenciados por el frío, promotores específicos para frío, promotores potenciados por el estrés, promotores específicos para el estrés, promotores inducibles por la sequía, promotores inducibles por deficiencia de agua y promotores específicos para tejido.

Las células vegetales y las plantas contienen en su genoma moléculas de ADN recombinante como se describe e incluyen los propágulos y la progenie producidas a partir de las mismas. Las plantas incluyen, pero no se limitan a, plantas de cultivo, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Más específicamente, éstas podrían incluir soja, maíz, canola, arroz, algodón, cebada, avena, hierbas de césped, algodón y trigo.

Un procedimiento de la invención comprende las etapas de

a) insertar en el genoma de una célula o células de planta una molécula de ADN recombinante que comprende ADN que codifica una proteína de choque frío, b) obtener una célula o células de planta transformada, c) regenerar plantas a partir de dicha(s) célula(s) de planta transformada; y d) seleccionar plantas que presentan el rasgo potenciado.

En la invención se seleccionan plantas que presentan tolerancia a la sequía potenciada.

La planta de la invención también incluye propágulos que contienen las moléculas de ADN recombinante anteriores, cuando se plantan o se hace que germinen de otro modo, y un campo de plantas germinadas a partir de dichos propágulos, por ejemplo, cuando tales propágulos son semillas.

Un procedimiento de producir una planta tolerante a la sequía transgénica de (2) anterior comprende las etapas de:

(i) introducir en el genoma de una célula de planta una molécula de ADN que codifica una proteína csp como se define anteriormente, en el que dicho polinucleótido de ADN está operativamente ligado a un promotor y operativamente ligado a un polinucleótido de ADN de terminación de la transcripción en 3'; y (ii) seleccionar dicha célula de planta transgénica; y (iii) regenerar dicha célula de planta transgénica en una planta transgénica.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra un mapa de plásmidos de pMON57396. La Figura 2 muestra un mapa de plásmidos de pMON23450. La Figura 3 muestra un mapa de plásmidos de pMON57397. La Figura 4 muestra un mapa de plásmidos de pMON57398. La Figura 5 muestra un mapa de plásmidos de pMON23450. La Figura 6 muestra un mapa de plásmidos de pMON57399. La Figura 7 muestra un mapa de plásmidos de pMON48421. La Figura 8 muestra un mapa de plásmidos de pMON56609. La Figura 9 muestra un mapa de plásmidos de pMON56610. La Figura 10 muestra un mapa de plásmidos de pMON73607. La Figura 11 muestra un mapa de plásmidos de pMON61322. La Figura 12 muestra un mapa de plásmidos de pMON73608. La Figura 13 muestra un mapa de plásmidos de pMON65154. La Figura 14 muestra un mapa de plásmidos de pMON72472. La Figura 15 muestra un mapa de plásmidos de pENTR1.

La Figura 16 muestra el patrón de crecimiento de plantas que expresan el gen indicado, y controles, que muestran que los genes introducidos proporcionan tolerancia al estrés abiótico. La Figura 17 muestra un mapa de plásmidos de pMON42916. La Figura 18 muestra un mapa de plásmidos de pMON73983. La Figura 19 muestra un mapa de plásmidos de pMON73984.

Descripción detallada de realizaciones específicas

La presente invención proporciona una planta con una elevada tolerancia a la sequía. La planta proporcionada tiene elevada tolerancia a la sequía debido a la expresión de proteína de choque frío (csp) en las células de dicha planta. La invención proporciona ejemplos de varias realizaciones y contempla otras realizaciones que se espera funcionen en la invención.

Las siguientes definiciones y procedimientos se proporcionan para definir mejor la presente invención y para orientar a aquellos expertos habituales en la materia en la práctica de la presente invención. A menos que se indique lo contrario, los términos deben entenderse según el uso convencional para aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, definiciones de términos comunes usadas en molecular biología y genética molecular pueden encontrarse en Lewin, Genes VII, Oxford University Press and Cell Press, Nueva York, 2000; Buchanan y col., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, Courier Companies, EE.UU., 2000; Lodish y col., Molecular Cell Biology, W.H. Freeman y Co., Nueva York, 2000. Términos comunes en genética pueden encontrarse en las referencias anteriores, además de Lynch y col., Genetics and Analysis of Quantitative Traits, Sinauer and Associates, Sunderland, MA, 1998; Hartwell y col., Genetics: From Genes to Genomes, McGraw-Hill Companies, Boston, MA, 2000; Hartl y col., Genetics: Analysis of Genes and Genomes, Jones and Bartlett Publishers, Sudbury, MA; Strachan y col., Human Molecular Genetics, John Wiley and Sons, Nueva York, 1999.

Se usa la nomenclatura para bases de ADN como se expone en el artículo 37 del CFR nº 1.822. Se usa la nomenclatura de una y tres letras convencional para residuos de aminoácidos.

Muchos rasgos agronómicos pueden afectar el “rendimiento”. Por ejemplo, éstos podrían incluir, sin limitación, altura de la planta, número de vainas, posición de las vainas en la planta, número de entrenudos, incidencia de la rotura de vainas, tamaño de grano, eficiencia de nodulación y fijación de nitrógeno, eficiencia de la asimilación de nutrientes, resistencia a estrés biótico y abiótico, asimilación de carbono, arquitectura de la planta, resistencia al encamado, porcentaje de germinación de semillas, vigor de las plantas de semillero y rasgos juveniles. Por ejemplo, esto también podría incluir, sin limitación, eficiencia de germinación (incluyendo germinación en condiciones estresadas), velocidad de crecimiento de cualquiera o todas las partes de la planta (incluyendo velocidad de crecimiento en condiciones estresadas), número de mazorcas, número de semillas por mazorca, tamaño de las semillas, composición de la semilla (almidón, aceite, proteína), características del relleno de la semilla. El rendimiento puede medirse de muchas formas, éstas podrían incluir peso de prueba, peso de la semilla, número de semillas por planta, peso de la semilla por planta, número de semillas o peso por unidad de área (es decir, semillas, o peso de semillas, por acre), fanegas por acre, toneladas métricas por acre, toneladas por acre, kilos por hectárea.

“(Secuencia de) ácidos nucleicos” o “(secuencia) de polinucleótidos” se refiere a ADN (ácido desoxirribonucleico) o ARN (ácido ribonucleico) mono o bicatenario de origen genómico o sintético, es decir, un polímero de bases de desoxirribonucleótido o ribonucleótido, respectivamente, leídas del extremo 5' (en la dirección 5') al extremo 3' (en la dirección 3'). El ácido nucleico puede representar la cadena sentido o complementaria (antisentido).

“Nativo” se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que se produce naturalmente (“natural”).

Secuencia “heteróloga” se refiere a una secuencia que se origina a partir de una fuente o especie extraña o, si es de la misma fuente, está modificada de su forma original. Por ejemplo, podría usarse un promotor nativo para producir la transcripción de un gen heterólogo de la misma especie o de una especie diferente.

“Partes” de una planta incluyen todas las partes o trozos de una planta que incluyen, pero no se limitan a, raíces, brotes, hojas, tallos, polen, semillas, flores, estambres, pistilos, óvulos, embriones, pétalos, filamentos, carpelos (incluyendo estigma, ovario y estilo), célula(s) o cualquier trozo de los anteriores.

“Propágulo” incluye todos los productos de meiosis y mitosis que incluyen, pero no se limitan a, semilla y partes de la planta que pueden propagar una nueva planta. Por ejemplo, los propágulos incluye un brote, raíz u otra parte de la planta que puede crecer en una planta entera. Los propágulos también incluye injertos en los que una porción de una planta es injertada en otra porción de una planta diferente (incluso una de una especie diferente) para crear un organismo vivo. Los propágulos también incluye todas las plantas y semillas producidas clonando o poniendo juntos productos meióticos, o permitiendo que los productos meióticos se junten para formar un embrión o huevo fecundado (naturalmente o con intervención humana).

Una secuencia de ácidos nucleicos “aislada” se separa o purifica sustancialmente de otras secuencias de ácidos nucleicos con las que el ácido nucleico está normalmente asociado en la célula del organismo en el que el ácido nucleico se produce naturalmente, es decir, otro ADN cromosómico o extracromosómico. El término engloba ácidos nucleicos que son bioquímicamente purificados de manera que se eliminan sustancialmente ácidos nucleicos contaminantes y otros componentes celulares. El término también engloba ácidos nucleicos recombinantes y ácidos nucleicos químicamente sintetizados.

“Identidad” o “idéntico” como se usa en el presente documento, cuando se refiere a comparaciones entre proteína(s)

o ácido nucleico(s), significa el 98 % o mayor identidad.

Una primera secuencia de ácidos nucleicos o proteínas muestra “identidad sustancial” o “similitud sustancial” con una secuencia de ácidos nucleicos de referencia o proteína si, cuando está óptimamente alineada (con inserciones o deleciones de nucleótidos o aminoácidos apropiadas que ascienden a menos del 20 por ciento de la secuencia de referencia sobre la ventana de comparación) con el otro ácido nucleico (o su cadena complementaria) o proteína, hay al menos aproximadamente el 80 % de equivalencia, preferentemente al menos aproximadamente el 85 % de equivalencia, y lo más preferentemente al menos aproximadamente el 90 % de equivalencia sobre una ventana de comparación de al menos 20 posiciones de nucleótidos o aminoácidos, preferentemente al menos 50 posiciones de nucleótidos o aminoácidos, más preferentemente al menos 100 posiciones de nucleótidos o aminoácidos, y lo más preferentemente sobre la longitud entera del primer ácido nucleico o proteína. El alineamiento óptimo de secuencias para alinear una ventana de comparación puede realizarse por el (los) algoritmo(s) de homología local, preferentemente por implementaciones computerizadas de estos algoritmos (que pueden encontrarse en, por ejemplo, Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI). El ácido nucleico de referencia puede ser una molécula de longitud completa o una parte de una molécula más larga. Alternativamente, dos ácidos nucleicos tienen identidad sustancial si uno se hibrida con el otro bajo condiciones rigurosas. Condiciones de hibridación apropiadas pueden determinarse empíricamente, o pueden estimarse basándose, por ejemplo, en el contenido de G+C relativo de la sonda y el número de desapareamientos entre la sonda y la secuencia diana, si se conoce. Las condiciones de hibridación pueden ajustarse según se desee variando, por ejemplo, la temperatura de hibridación o la concentración de sales (Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Press, 1989).

Una primera secuencia de ácidos nucleicos está “operativamente ligada” con una segunda secuencia de ácidos nucleicos cuando las secuencias están dispuestas de forma que la primera secuencia de ácidos nucleicos afecte la función de la segunda secuencia de ácidos nucleicos. Preferentemente, las dos secuencias son parte de una única molécula de ácido nucleico contigua y más preferentemente son adyacentes. Por ejemplo, un promotor está operativamente ligado a un gen si el promotor regula o media en la transcripción del gen en una célula. Por ejemplo, una región de terminación transcripcional (terminador) está operativamente ligada a un gen cuando dicho terminador conduce a una ARN polimerasa que termina un transcrito que contiene dicho gen en o próximo al terminador. Por ejemplo, un potenciador es frecuentemente no adyacente al promotor sobre el que está presentando su efecto, pero está generalmente en la misma molécula de ácido nucleico.

Un ácido nucleico “recombinante” o ADN, o molécula de ARN, se prepara por una combinación artificial de dos segmentos de secuencia separados de otro modo, por ejemplo, por síntesis química o por la manipulación de segmentos aislados de ácidos nucleicos por técnicas de manipulación genética. Las técnicas para la manipulación de ácidos nucleicos son muy conocidas (véase, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Press, 1989). Los procedimientos para la síntesis química de ácidos nucleicos se tratan, por ejemplo, en Beaucage y Carruthers, Tetra. Letts. 22:1859-1862, 1981, y Matteucci y col., J. Am. Chem. Soc. 103:3185, 1981. La síntesis química de ácidos nucleicos puede realizarse, por ejemplo, en sintetizadores de oligonucleótidos comercialmente automatizados.

La “expresión” de un gen se refiere a la transcripción de un gen para producir el ARNm correspondiente y la traducción de este ARNm para producir el producto génico correspondiente, es decir, un péptido, polipéptido o proteína. La expresión génica está controlada o modulada por elementos reguladores que incluyen elementos reguladores de 5' tales como promotores.

Los términos “construcción de ADN recombinante”, “vector recombinante”, “vector de expresión” o “casete de expresión” se refieren a cualquier agente tal como un plásmido, cósmido, virus, BAC (cromosoma artificial bacteriano), secuencia autónomamente replicante, fago, o secuencia de nucleótidos de ADN o ARN monocatenario

o bicatenario lineal o circular, derivado de cualquier fuente, que puede integrarse genómicamente o replicarse autónomamente, que comprende una molécula de ADN en la que una o más secuencias de ADN se han ligado en un modo funcionalmente operativo.

“Complementario” se refiere a la asociación natural de secuencias de ácidos nucleicos por apareamiento de bases. La complementariedad entre dos moléculas monocatenarias puede ser parcial, si sólo algunos del par de ácidos nucleicos son complementarios; o completa, si todos los pares de bases son complementarios. El grado de complementariedad afecta la eficiencia e intensidad de las reacciones de hibridación y amplificación.

“Homología” se refiere al nivel de similitud entre secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos en términos de identidad o similitud de nucleótidos o de aminoácidos, respectivamente, es decir, similitud o identidad de secuencias. Homología y homólogo también se refieren al concepto de propiedades funcionales similares entre diferentes ácidos nucleicos o proteínas. Homólogos incluyen genes que son ortólogos y parálogos. Los homólogos pueden determinarse usando la secuencia codificante para un gen, desvelado en el presente documento o encontrado en la base de datos apropiada (tal como en NCBI u otras) en una o más de las siguientes formas. Para una secuencia de proteínas, las secuencias deberían compararse usando algoritmos (por ejemplo, véase la sección sobre “identidad” e “identidad sustancial”). Para secuencias de nucleótidos, la secuencia de una molécula de ADN puede compararse con la secuencia de un homólogo conocido o putativo de una manera muy similar. Los homólogos tienen al menos el 80 %, preferentemente el 88 %, más preferentemente el 92 %, lo más preferentemente el 95 %, a través de cualquier región sustancial (25 nucleótidos o aminoácidos, más preferentemente 50 nucleótidos o aminoácidos, más preferentemente 100 nucleótidos o aminoácidos, o lo más preferentemente la longitud entera de la secuencia más corta) de la molécula (molécula de ADN, ARN o de proteína).

Alternativamente, dos secuencias, o moléculas de ADN o ARN que codifican, o pueden codificar, secuencias de aminoácidos, son homólogas, o codifican secuencias homólogas, si las dos secuencias, o el complemento de una o ambas secuencias, se hibridan entre sí bajo condiciones rigurosas y presentan función similar. Por tanto, si fuera a determinarse si dos secuencias de proteínas fueran o no homólogas, una tanto haría los ejercicios de ordenador descritos en el presente documento como crearía secuencias codificantes degeneradas de todas las posibles secuencias de ácidos nucleicos que podrían codificar las proteínas y se determinaría si podrían hibridarse o no bajo condiciones rigurosas. Condiciones de rigurosidad apropiadas que promueven la hibridación de ADN, por ejemplo, 6,0 x cloruro sódico/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 ºC, seguido de un lavado de 2,0 x SSC a 50 ºC, son conocidos para aquellos expertos en la materia o pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Por ejemplo, la concentración de sales en la etapa de lavado puede seleccionarse de una baja rigurosidad de aproximadamente 2,0 x SSC a 50 ºC a la alta rigurosidad de aproximadamente 0,2 x SSC a 50 ºC. Además, la temperatura en la etapa de lavado puede aumentarse de condiciones de baja rigurosidad a temperatura ambiente, aproximadamente 22 ºC, a condiciones de alta rigurosidad a aproximadamente 65 ºC. Puede variarse tanto la temperatura como la sal, o tanto la temperatura como la concentración de sales pueden mantenerse constantes mientras que la otra variable cambia. En una realización preferida, un ácido nucleico que codifica una proteína descrita en la presente invención se hibridará específicamente con una o más de las moléculas de ácidos nucleicos o complementos de las mismas o fragmentos de cualquiera bajo condiciones altamente rigurosas, por ejemplo, a aproximadamente 2,0 x SSC y aproximadamente 65 ºC. La hibridación de la sonda con la molécula de ADN diana puede detectarse por cualquier número de procedimientos conocidos para aquellos expertos en la materia, éstos puede incluir, pero no se limitan a, marcas fluorescentes, marcas radiactivas, marcas basadas en anticuerpos y marcas quimioluminiscentes.

“Proteína(s) de choque frío” (Csp(s) o CSP(s)) son proteínas que tienen más del 80 % de identidad con la proteína CspA de Escherichia coli (SEC ID Nº: 1) o proteína CspB de Bacillus subtilis (SEC ID Nº: 2). Por ejemplo, como se usa en el presente documento, una proteína de choque frío es el 80 % idéntica, preferentemente el 90 % idéntica, más preferentemente el 95 % idéntica a CspA de E. coli o CspB de B. subtilis a través de la longitud entera de CspA de E. coli o CspB de B. subtilis. Están disponibles varias bases de datos que permiten que un experto en la materia determine si una proteína nueva o existente contiene o no un dominio de choque frío o es una proteína de choque frío, de Genbank para bases de datos de proteínas diseñadas para permitir la determinación de relaciones de proteínas, y/o encontrar proteínas relacionadas. En el presente documento se incluyen dentro de la definición todas las proteínas de choque frío conocidas que incluyen, pero no se limitan a, CspA, CspB, CspC, CspD, CspE, CspF, CspG, CspH y CspI (patente de EE.UU. 6.610.533) de Escherichia coli.

El dominio de choque frío conservado se muestra en SEC ID Nº: 3 ([FY]-G-F-I-x(6,7)-[DER]-[LIVM]-F-x-H-x-[STKR]-x-[LIVMFY]) (motivo de Prosite PS00352; Bucher y Bairoch, (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., pp53-61, AAAIPress, Menlo Park, 1994; Hofmann y col., Nucleic Acids Res. 27:215, 1999). Alternativamente, las proteínas de choque frío pueden encontrarse usando la base de datos Sprint (una base de datos de huellas de proteínas relacional) (Attwood y col., Nucleic Acids Res. 28(1):225, 2000; Attwood y col., Nucleic Acids Research, 30(1), en prensa, 2002). Alternativamente, las proteínas de choque frío pueden encontrarse usando una descripción basada en matriz, o Pfam. Pfam es una gran colección de alineamientos de múltiples secuencias y modelos ocultos de Markov que cubren muchos dominios de proteína conocidos (Bateman y col., Nucleic Acids Research 28:263, 2000). En este escrito (noviembre de 2001; edición de Pfam 6) hay 3071 familias. Las proteínas de choque frío están incluidas como PF00313. El árbol de especies que muestra la distribución de proteínas de choque frío como se determina en la base de datos Pfam.

“Proteínas de choque frío” como se usa en el presente documento también incluyen, pero no se limitan a, cualquier proteína que se encuentre en una búsqueda, usando una proteína de choque frío como secuencia de consulta, de una base de datos usando la función “Blink” (Blast Link) que puede encontrarse en el Centro nacional para información biotecnológica. “Blink” es una función de búsqueda rápida usada para encontrar proteínas con secuencias similares. Esta definición de “proteína de choque frío” o “dominio de choque frío” es además de aquellas usadas anteriormente, y no sustituye dicha definición. Las proteínas de choque frío o proteínas que contienen dominios de choque frío incluyen, pero no se limitan a, todas las proteínas actualmente conocidas en bases de datos públicas y privadas, además de aquellas que todavía tienen que ser descubiertas que son suficientemente similares a las proteínas reivindicadas (por ejemplo, CspA de E. coli y CspB de B. subtilis) por ser “éxitos” bajo los parámetros de búsqueda convencionales actualmente usados en Blast Link (como de 1 de noviembre de 2001). A partir de este escrito Blast 2 está siendo ejecutado, y Blast Link (“Blink”) está ejecutando los parámetros por defecto para las búsquedas por blast de proteína-proteína. Los presentes inventores creen a partir de este escrito que los parámetros por defecto usados en Blink son del siguiente modo; una matriz BLOSUM62 está siendo ejecutada, usando la base de datos “nr”, la búsqueda en CD está seleccionada, ya que son estadísticas basadas en la composición, con la complejidad seleccionada como “baja complejidad”, ese espera 10, con un tamaño de palabra de 3, los costes por hueco son; existencia 11 y extensión 1. La lista en la Tabla I muestra los 200 primeros éxitos para CspA de E. coli

5 usando estos parámetros convencionales, pero los presentes inventores no limitan su reivindicación a los 200 primeros éxitos. Un experto en la materia observaría que bajo estos criterios bastante estrictos se encuentran 167 proteínas de origen bacteriano, pero también 28 metazoos y 5 proteínas de plantas.

10 nacional para información biotecnológica. Se muestra el ID de Genbank y el nombre de cada proteína. Nota: debido a la forma en la que se nombran las proteínas, algunas proteínas y secuencias tendrán varias entradas, como proteínas, ADNc, alelos, etc. La ID de Genbank puede considerarse que son identificadores específicos para cada entrada. Las entradas están en el orden aproximado de mayor a menor identidad, en comparación con la secuencia de búsqueda.

Tabla 20. Algunas proteínas de choque frío y proteínas que contienen un dominio de choque frío encontradas por similitud con CspA de E. coli. Esta lista se compiló usando los parámetros de Blast Link convencionales en el Centro

Nº de ID de Genbank: Nombre del gen

576191: Proteína de choque frío principal 7.4 (Cspa (Cs 7.4)) de (Escherichia coli)

349561: Proteína de unión a ADN [Salmonella typhimurium]

3891780: Cadena A, Proteína de choque frío principal de Nm de disolución de Escherichia coli

479003: Proteína de choque frío [Escherichia coli]

1778828: Proteína de choque frío principal CSPA2 [Yersinia enterocolitica]

6073870: Proteína de choque frío principal CSPA1 [Yersinia enterocolitica]

1468921: Proteína de choque frío CspG [Escherichia coli]

2275140: Proteína hipotética [Yersinia pestis]

12514257: Homólogo de proteína de choque frío de Salmonella [Escherichia coli 0157:H7

15981565: Proteína de choque frío principal Cspa1 [Yersinia pestis]

3249024: Proteína de choque frío CspB [Yersinia enterocolitica]

15979692: Proteína de choque frío [Yersinia pestis]

1742550: Proteína similar a choque frío CspB [Escherichia coli]

16419141: Chaperona de ARN, regulador negativo de la transcripción de cspA [Salmonella

10039151: Proteína similar a choque frío cspE [Buchnera sp. APS]

9957540: Proteína de choque frío B [Yersinia enterocolitica]

1778540: Proteína similar a choque frío [Escherichia coli]

471099: CspE (MsmC) [Escherichia coli]

2961317: cspB [Salmonella typhimurium]

16503235: Proteína de choque frío [Salmonella enterica subsp. enterica serovar

9658370: Proteína de la familia del dominio de choque frío [Vibrio cholerae]

460698: CspC (MsmB) [Escherichia coli]

15980582: Proteína de choque frío putativa [Yersinia pestis]

10038996: Proteína similar a choque frío cspC [Buchnera sp. APS]

15979774: Proteína de choque frío [Yersinia pestis]

(continuación) (continuación) (continuación) (continuación) (continuación) (continuación)

Nº de ID de Genbank: Nombre del gen

9657556: Regulador transcripcional de choque frío CspA [Vibrio cholerae]

4454361: Proteína de choque frío, CSPA [Vibrio cholerae]

2970685: Proteína de choque frío C [Salmonella typhimurium]

1402743: Proteína de choque frío principal [Citrobacter freundii]

5869509: CspG [Shewanella violacea]

5869504: CspA [Shewanella violacea]

9968446: Proteína de choque frío [Lactobacillus plantarum]

1405474: Proteína CspC [Bacillus cereus]

3850776: Proteína de choque frío D [Lactococcus lactis]

10176234: Proteína de choque frío [Bacillus halodurans]

1869948: Proteína de choque frío [Lactobacillus plantarum]

729220: PROTEÍNA DE CHOQUE FRÍO CSPC

7379745: Regulador transcripcional putativo [Neisseria meningitidis Z2491]

1620431: csp [Lactobacillus plantarum]

1405472: Proteína CspB [Bacillus cereus]

3892590: Proteína de choque frío E [Lactococcus lactis]

7226073: Proteína de la familia del dominio de choque frío [Neisseria meningitidis MC58]

2493766: PROTEÍNA SIMILAR A CHOQUE FRÍO CSPLA (CSPL)

1001878: Proteína CspA [Listeria monocytogenes]

13623066: Proteína de choque frío putativa [Streptococcus pyogenes M1 GAS]

758663: Proteína de choque frío [Arthrobacter globiformis]

4468119: Proteína de choque frío A; proteína CspA [Bordetella pertussis]

2370256: Proteína de choque frío [Lactococcus lactis]

1405470: Proteína CspA [Bacillus cereus]

2226349: CspC [Staphylococcus aureus]

1405476: Proteína CspD [Bacillus cereus]

1513079: Proteína de aclimatación al frío A [Pseudomonas fragi]

7242722: Proteína de choque frío [Streptomyces coelicolor A3(2)]

2425105: Proteína de choque frío principal [Micrococcus luteus]

2105046: cspA [Mycobacterium tuberculosis H37Rv]

15023696: Proteína de choque frío [Clostridium acetobutylicum]

12720931: MsmB [Pasteurella multocida]

Nº de ID de Genbank: Nombre del gen

8101860: Proteína de choque frío principal CspA [Staphylococcus aureus]

1513081: Proteína de aclimatación al frío B [Pseudomonas fragi]

3097243: Proteína de choque frío pequeña [Mycobacterium leprae]

9587215: Proteína de choque frío CspA [Mycobacterium smegmatis]

9107526: Proteína de choque frío [Xylella fastidiosa 9a5c]

1256629: Proteína de choque frío [Bacillus subtilis]

12054789: Proteína de choque frío (CspLB) [Listeria monocytogenes]

1864167: Homólogo de la proteína de choque frío principal CspB [Listeria monocytogenes]

1421212: Proteína de choque frío principal (Cspb)

297761: Proteína de choque frío (CspB) [Bacillus subtilis]

13625473: Proteína de aclimatación al frío CapB [Pseudomonas sp. 30/3]

9657576: Proteína del dominio de unión a ADN de choque frío [Vibrio cholerae]

11933043: Proteína similar a choque frío [Streptomyces nodosus]

11933034: Proteína similar a choque frío [Streptomyces hygroscopicus]

8248794: Proteína de choque frío [Streptomyces coelicolor A3(2)]

1778825: Proteína de choque frío principal CspA [Pseudomonas aeruginosa]

740006: Proteína de choque frío

2226347: CspB [Staphylococcus aureus]

1616777: Proteína similar a choque frío [Stigmatella aurantiaca]

7210998: Proteína de choque frío [Streptomyces coelicolor A3(2)]

729217: PROTEÍNA DE CHOQUE FRÍO CSPB

1067201: Proteína de choque frío [Streptomyces coelicolor]

7321274: Proteína de choque frío [Streptomyces coelicolor A3(2)]

1402789: Proteína de choque frío [Yersinia enterocolitica]

1513086: Proteína de aclimatación a la temperatura B [Pseudomonas fragi]

16411332: Similar a proteína de choque frío [Listeria monocytogenes]

5732895: F40 [Streptomyces coelicolor A3(2)]

4193390: CspA [Myxococcus xanthus]

4193394: CspC [Myxococcus xanthus]

1405478: Proteína CspE [Bacillus cereus]

1402753: Proteína de choque frío principal [Klebsiella pneumoniae]

2983729: Proteína de choque frío [Aquifex aeolicus]

2815334: Proteína de dominio de choque frío [Streptomyces coelicolor A3(2)]

Nº de ID de Genbank: Nombre del gen

4193398: CspE [Myxococcus xanthus]

4193396: CspD [Myxococcus xanthus]

2894098: Proteína de choque frío [Thermotoga maritima]

15074838: PROTEÍNA REGULADORA DE LA TRANSCRIPCIÓN SIMILAR A CHOQUE FRÍO PUTATIVA

1402731: Proteína de choque frío principal [Aeromonas hydrophila]

46789: Proteína similar a choque frío de 7 kDa [Streptomyces clavuligerus]

9946316: Proteína de choque frío probable [Pseudomonas aeruginosa]

1402769: Proteína de choque frío principal [Proteus vulgaris]

456240: Proteína de choque frío principal (CspB) [Sporosarcina globispora]

19743: nsGRP-2 [Nicotiana sylvestris]

15026046: Proteína de choque frío [Clostridium acetobutylicum]

11493820: Proteína de choque frío C [Yersinia enterocolitica]

4982460: Proteína de choque frío [Thermotoga maritima]

15979415: Proteína similar a choque frío [Yersinia pestis]

16419455: Similar a CspA pero no inducida por choque frío [Salmonella typhimurium]

14523127: Proteína de choque frío putativa [Sinorhizobium meliloti]

9107847: Proteína de aclimatación a la temperatura B [Xylella fastidiosa 9a5c]

3036806: Proteína rica en glicina [Arabidopsis thaliana]

2182333: Y4cH [Rhizobium sp. NGR234]

1402733: Proteína de choque frío principal [Aeromonas salmonicida]

9655615: Proteína similar a choque frío CspD [Vibrio cholerae]

3831556: Proteína de choque frío principal [Enterococcus faecalis]

3821915: Proteína de choque frío principal [Lactococcus lactis subsp. cremoris]

15160284: AGR L 3376p [Agrobacterium tumefaciens]

6458627: Proteína de choque frío, familia CSD [Deinococcus radiodurans]

3821923: Proteína de choque frío principal [Lactobacillus helveticus]

3821911: Proteína de choque frío principal [Lactococcus lactis subsp. lactis]

15157349: AGR C 4003p [Agrobacterium tumefaciens]

15154976: AGR C 161p [Agrobacterium tumefaciens]

3831558: Proteína de choque frío principal [Pediococcus pentosaceus]

456238: Proteína de choque frío [Bacillus subtilis]

117574: PROTEÍNA SIMILAR A CHOQUE FRÍO CSPD (CSP-D)

Nº de ID de Genbank: Nombre del gen

12620649: (D534 [Bradyrhizobium japonicum]

13424521: Proteína de la familia del dominio de choque frío [Caulobacter crescentus]

3776223: CspA [Sinorhizobium meliloti]

15075353: PROTEÍNA REGULADORA DE LA TRANSCRIPCIÓN DE CHOQUE FRÍO PUTATIVA [Sinorhizobium

15075133: PROTEÍNA REGULADORA DE LA TRANSCRIPCIÓN DE CHOQUE FRÍO PROBABLE (Sinorhizobium

3821913: Proteína de choque frío principal [Lactococcus lactis subsp. lactis]

13476765: Proteína de choque frío [Mesorhizobium loti]

3821925: Proteína de choque frío principal [Streptococcus thermophilus]

3821921: Proteína de choque frío principal [Lactobacillus acidophilus]

729222: PROTEÍNA SIMILAR A CHOQUE FRÍO CSPJ

15162334: AGR pA 762p [Agrobacterium tumefaciens]

13475232: Proteína de choque frío [Mesorhizobium loti]

9947082: Proteína de choque frío probable [Pseudomonas aeruginosa]

13424199: Proteína de la familia del dominio de choque frío [Caulobacter crescentus]

9948689: Proteína de choque frío CspD [Pseudomonas aeruginosa]

4193392: CspB. [Myxococcus xanthus]

13488430: Proteína de choque frío [Mesorhizobium loti]

12720739: CspD [Pasteurella multocida]

3831560: Proteína de choque frío principal [Bifidobacterium animalis]

1513084: Proteína de aclimatación a la temperatura A [Pseudomonas fragi]

1169113: PROTEÍNA SIMILAR A CHOQUE FRÍO CSPD

5714745: Proteína de choque frío 7.4 [Rhodococcus sp. 7/1]

1402767: Proteína de choque frío principal [Photobacterium fosforeum]

14523160: Regulador transcripcional de la proteína de choque frío CspA5 probable

15979447: Proteína similar a choque frío [Yersinia pestis]

13488214: Proteína de choque frío [Mesorhizobium loti]

5714743: Proteína de choque frío A [Rhodococcus sp. 5/14)

3861208: PROTEÍNA SIMILAR A CHOQUE FRÍO (cspA) [Rickettsia prowazekii]

81624: Proteína rica en glicina 2 - Arabidopsis thaliana

15156913: AGR C 3315p [Agrobacterium tumefaciens]

15074652: PROTEÍNA REGULADORA DE LA TRANSCRIPCIÓN DE CHOQUE FRÍO PUTATIVA [Sinorhizobium

Nº de ID de Genbank: Nombre del gen

7295442: Producto génico CG 17334 [Drosophila melanogaster]

3850772: Proteína de choque frío A [Lactococcus lactis]

14334920: Proteína de unión a ADN de dedo de cinc rica en glicina putativa [Arabidopsis

3892588: Proteína de choque frío C [Lactococcus lactis]

2708747: Proteína de unión a ADN de dedo de cinc rica en glicina putativa [Arabidopsis

2739396: Proteína de -caja [Drosophila melanogaster]

1402763: Proteína de choque frío principal [Photobacterium mondopomensis]

15620137: Proteína similar a choque frío [Rickettsia conorii]

1402755: Proteína de choque frío principal [Lactobacillus casei]

409419: Factor de caja Y [Aplysia californica]

14039811: Proteína de unión a caja Y [Schistosoma japonicum]

9946868: Proteína de choque frío probable [Pseudomonas aeruginosa]

1483311: Proteína de caja Y [Dugesia japonica]

1477478: Proteína de unión a caja Y [Schistosoma mansoni]

1402759: Proteína de choque frío principal [Listeria innocua]

15159048: AGR L 1288p [Agrobacterium tumefaciens]

2228815: Proteína de choque frío principal CspH [Salmonella typhimurium]

6911694: Proteína de choque frío A [Streptococcus thermophilus]

2970679: Proteína de caja Y [Drosophila silvestris]

14602477: Similar a proteína de dominio de choque frío A [Homo sapiens]

10727970: Producto génico yps [Drosophila melanogaster]

1402757: Proteína de choque frío principal [Listeria grayi]

1402751: Proteína de choque frío principal [Enterococcus faecalis]

1083796: Proteína RYB-A - rata

505133: RYB-a [Rattus norvegicus]

14523481: Regulador transcripcional de la proteína de choque frío CspA6 probable

8100512: Proteína de caja Y ZONAB-B [Canis familiaris]

8100510: Proteína de caja Y ZONAB-A [Canis familiaris]

15306095: Proteína hipotética XP 053028 [Homo sapiens]

10185725: Isoforma corta de la proteína 3 de caja Y [Mus musculus]

10185723: Isoforma larga de la proteína 3 de caja Y [Mus musculus]

7385223: Proteína de unión a ARN MSY4 [Mus musculus]

6166110: PROTEÍNA DE UNIÓN A ADN A (PROTEÍNA DE DOMINIO DE CHOQUE FRÍO A)

Nº de ID de Genbank: Nombre del gen

1402783: Proteína de choque frío principal [Streptococcus pyogenes]

1167838: Proteína de unión a ADN [Homo sapiens]

1160331: Homólogo murino de dbpA [Mus musculus]

1101884: YB2 [Rattus norvegicus]

950340: Proteína de unión a ADN A [Homo sapiens]

532211: Proteína de unión a caja Y [Mus musculus]

87332: Proteína de unión a ADN A - humana (fragmento)

14742409: Proteína hipotética XP 046353 [Homo sapiens]

14270385: Proteína de dominio de choque frío [Takifugu rubripes]

9653686: Proteína 1 de unión al elemento supresor del receptor de TSH; TSEP-1

8249978: Proteína de choque frío B [Streptomyces coelicolor A3(2)]

3695368: zfY1 [Danio rerio]

CspB de Bacillus subtilis (B. subtilis) es una proteína que se acumula en respuesta a choque frío (Willimsky y col. Journal of Bacteriology 174:6326 (1992)). Tiene homología con CspA de E. coli (véase la Tabla I) y contiene un dominio de unión de ácido nucleico monocatenario (Lopez y col., The Journal of Biologic Chemistry 276:15511 (2001)). Usando la misma búsqueda de Blast básica en NCBI (Blink), las siguientes proteínas se designaron “éxitos”.

5 El número de éxitos mostrados aquí está limitado a 200, pero se esperaría que muchas otras proteínas funcionaran en la invención.

10 Nota: debido a la forma en la que se nombran las proteínas, algunas proteínas y secuencias tendrán varias entradas, como proteínas, ADNc, alelos, etc. La ID de Genbank puede considerarse que son identificadores específicos para cada entrada. Las entradas están en el orden aproximado de mayor a menor identidad con la secuencia de búsqueda.

Tabla 21. Algunas proteínas de choque frío y proteínas que contienen dominios de choque frío encontradas buscando con CspB de B. subtilis. Esta lista se compiló usando los parámetros de Blast Link (Blink) convencionales en el Centro nacional para información biotecnológica. Se muestra el ID de Genbank y el nombre de cada proteína.

Nº de ID de GenBank: Nombre del gen

1421212: Proteína de choque frío principal (Cspb)

1405476: Proteína CspD [Bacillus cereus]

729217: PROTEÍNA DE CHOQUE FRÍO CSPB

1256629: Proteína de choque frío [Bacillus subtilis]

740006: Proteína de choque frío

456238: Proteína de choque frío [Bacillus subtilis]

12054789: Proteína de choque frío (CspLB) [Listeria monocytogenes]

1864167: Homólogo de proteína de choque frío principal CspB [Listeria monocytogenes]

1405472: Proteína CspB [Bacillus cereus]

8101860: Proteína de choque frío principal CspA [Staphylococcus aureus]

Nº de ID de GenBank: Nombre del gen

16411332: Similar a proteína de choque frío [Listeria monocytogenes]

10176234: Proteína de choque frío [Bacillus halodurans]

2493766: PROTEÍNA SIMILAR A CHOQUE FRÍO CSPLA (CSPL)

1001878: Proteína CspA [Listeria monocytogenes]

1405470: Proteína CspA [Bacillus cereus]

1405474: Proteína CspC [Bacillus cereus]

729220: PROTEÍNA DE CHOQUE FRÍO CSPC

2226349: CspC [Staphylococcus aureus]

9968446: Proteína de choque frío [Lactobacillus plantarum]

1402739: Proteína de choque frío principal [Bacillus subtilis]

3892590: Proteína de choque frío E [Lactococcus lactis]

2226347: CspB [Staphylococcus aureus]

3850776: Proteína de choque frío D [Lactococcus lactis]

1402741: Proteína de choque frío principal [Bacillus subtilis]

15979774: Proteína de choque frío [Yersinia pestis]

10039151: Proteína similar a choque frío cspE [Buchnera sp. APS]

8248794: Proteína de choque frío [Streptomyces coelicolor A3(2)]

460698: CspC (MsmB) [Escherichia coli]

11933043: Similar a proteína [Streptomyces nodosus]

11933034: Similar a proteína [Streptomyces hygroscopicus]

1620431: csp [Lactobacillus plantarum]

16419141: Chaperona de ARN, regulador negativo de la transcripción de cspA [Salmonella typhimurium LT2]

15979692: Proteína de choque frío [Yersinia pestis]

2894098: Proteína de choque frío [Thermotoga maritima]

1869948: Proteína de choque frío [Lactobacillus plantarum]

2370256: Proteína de choque frío 3 [Lactococcus lactis]

2970685: Proteína de choque frío C [Salmonella typhimurium]

1778540: Proteína similar a choque frío [Escherichia coli]

471099: CspE (MsmC) [Escherichia coli]

10038996: Proteína similar a choque frío cspC [Buchnera sp. APS]

7242722: Proteína de choque frío 2 [Streptomyces coelicolor A3(2)]

Nº de ID de GenBank: Nombre del gen

15026046: Proteína de choque frío [Clostridium acetobutylicum]

15980582: Proteína de choque frío putativa [Yersinia pestis]

9657676: Proteína del dominio de unión a ADN de choque frío [Vibrio cholerae]

349561: Proteína de unión a ADN [Salmonella typhimurium]

4982460: Proteína de choque frío [Thermotoga maritima]

1405478: Proteína CspE [Bacillus cereus]

9946316: Proteína de choque frío probable [Pseudomonas aeruginosa]

5869509: 5869509CspG [Shewanella violacea]

1067201: Proteína de choque frío [Streptomyces coelicolor]

9948689: Proteína de choque frío CspD [Pseudomonas aeruginosa]

3891780: Cadena A, proteína de choque frío principal de estructura de RMN de disolución de Escherichia coli

72232: Proteína de choque frío principal cspA - Escherichia coli

9657556: Regulador transcripcional de choque frío CspA [Vibrio cholerae]

6458627: Proteína de choque frío, familia CSD [Deinococcus radiodurans]

3831556: Proteína de choque frío principal [Enterococcus faecalis]

15023696: Proteína de choque frío [Clostridium acetobutylicum]

2425105: Proteína de choque frío principal [Micrococcus luteus]

14027737: Proteína de choque frío principal [Bacillus cereus]

9587215: Proteína de choque frío CspA [Mycobacterium smegmatis]

4454361: Proteína de choque frío, CSPA [Vibrio cholerae]

479003: Proteína [Escherichia coli]

3097243: Proteína de choque frío [Mycobacterium leprae]

758663: Proteína de choque frío [Arthrobacter globiformis]

2105046: cspA [Mycobacterium tuberculosis H37Rv]

7379745: Regulador transcripcional putativo [Neisseria meningitidis Z2491]

3249024: Proteína de choque CspB [Yersinia enterocolitica]

7210998: Proteína de choque frío [Streptomyces coelicolor A3(2)]

1513081: Proteína de aclimatación al frío B [Pseudomonas fragi]

5869504: CspA [Shewanella violacea]

Nº de ID de GenBank: Nombre del gen

177882: Proteína de choque frío principal CspA [Pseudomonas aeruginosa]

1513086: Proteína de aclimatación a la temperatura B [Pseudomonas fragi]

12514257: Homólogo de proteína de choque frío de Salmonella [Escherichia coli O157:H7 EDL933]

5732895: F40 [Streptomyces coelicolor A3(2)]

3831558: Proteína de choque frío principal [Pediococcus pentosaceus]

1468921: Proteína de choque frío CspG [Escherichia coli]

13625473: Proteína de aclimatación al frío CapB [Pseudomonas sp. 30/3]

1402771: Proteína de choque frío principal [Staphylococcus aureus]

1402761: Proteína de choque frío principal [Lactococcus lactis subsp. cremoris]

15981565: Proteína de choque frío principal Cspa1 [Yersinia pestis]

9107847: Proteína de aclimatación a la temperatura B [Xylella fastidiosa ga5c]

7321274: Proteína de choque frío [Streptomyces coelicolor A3(2)]

2275140: Proteína hipotética [Yersinia pestis]

9947082: Proteína de choque frío probable [Pseudomonas aeruginosa]

2983729: Proteína de choque frío [Aquifex aeolicus]

2961317: cspB [Salmonella typhimurium]

9107526: Proteína de choque frío [Xylella fastidiosa 9a5c]

1513079: Proteína de aclimatación al frío A [Pseudomonas fragi]

4193394: CspC [Myxococcus xanthus]

4193392: CspB [Myxococcus xanthus]

16503235: Proteína de choque frío [Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi]

9957540: Proteína de choque frío B [Yersinia enterocolitica]

3821921: Proteína de choque frío principal [Lactobacillus acidophilus]

1616777: Proteína similar a choque frío [Stigmatella aurantiaca]

1402759: Proteína de choque frío principal [Listeria innocua]

4468119: Proteína de choque frío A; proteína CspA [Bordetella pertussis]

1742550: Proteína similar a choque frío CspB [Escherichia coli]

12720739: CspD [Pasteurella multocida]

3829915: Proteína de choque frío principal [Lactococcus lactis subsp. cremoris]

Nº de ID de GenBank: Nombre del gen

1402765: Proteína de choque frío principal [Pediococcus pentosaceus]

1513084: Proteína de aclimatación a la temperatura A [Pseudomonas fragi]

4193396: CspD [Myxococcus xanthus]

4193398: CspE [Myxococcus xanthus]

3831560: Proteína de choque frío principal [Bifidobacterium animalis]

4193390: CspA [Myxococcus xanthus]

3821923: Proteína de choque frío principal [Lactobacillus helveticus]

12720931: MsmB [Pasteurella multocida]

3850772.: Proteína de choque frío A [Lactococcus lactis]

9655615: Proteína similar a choque frío CspD [Vibrio cholerae]

9946868: Proteína de choque frío probable [Pseudomonas aeruginosa]

1402757: Proteína de choque frío principal [Listeria grayi]

1402735: Proteína de choque frío principal [Bacillus atrophaeus]

1402751: Proteína de choque frío principal [Enterococcus faecalis]

3892588: Proteína 3 de choque frío C [Lactococcus lactis]

1169113: PROTEÍNA SIMILAR A CHOQUE FRÍO CSPD

15979415: Proteína similar a choque frío [Yersinia pestis]

117574: PROTEÍNA SIMILAR A CHOQUE FRÍO CSPD (CSP-D)

15075133: PROTEÍNA REGULADORA DE LA TRANSCRIPCIÓN DE CHOQUE FRÍO PROBABLE [Sinorhizobium meliloti]

16419455: Similar a CspA pero no inducida por choque frío [Salmonella typhimurium LT2]

1149382C: Proteína de choque frío C [Yersinia enterocolitica]

1402783: Proteína de choque frío principal [Streptococcus pyogenes]

3821925: Proteína de choque frío principal [Streptococcus thermophilus]

1402775: Proteína de choque frío principal [Streptococcus dysgalactiae]

8249978: Proteína 3 de choque frío B [Streptomyces coelicolor A3(2)]

15160284: AGR_L_3376p [Agrobacterium tumefaciens]

81624: Proteína rica en glicina 2 - Arabidopsis thaliana

19743: nsGRP-2 [Nicotiana sylvestris]

2916930: cspB [Mycobacterium tuberculosis H37Rv]

13475232: Proteína de choque frío [Mesorhizobium loti]

3861208: PROTEÍNA SIMILAR A CHOQUE FRÍO (cspA) [Rickettsia prowazekii]

2182333: Y4cH [Rhizobium sp. NGR234]

Nº de ID de GenBank: Nombre del gen

13476765: Proteína de choque frío [Mesorhizobium loti]

3776223: CspA [Sinorhizobium meliloti]

1402755: Proteína de choque frío principal [Lactobacillus casei]

15620137: Proteína similar a choque frío [Rickettsia conorii]

15154976: AGR_C_161p [Agrobacterium tumefaciens]

15074838: PROTEÍNA REGULADORA DE LA TRANSCRIPCIÓN SIMILAR A CHOQUE FRÍO PUTATIVA [Sinorhizobium meliloti]

14548150: Proteína de choque frío de unión a ARN [crenarchaeote 4B7 sin cultivar]

2440094: Proteína de choque frío pequeña [Mycobacterium leprae]

14523127: Proteína de choque frío putativa [Sinorhizobium meliloti]

12620649: ID534 [Bradyrhizobium japonicum]

1063684: AtGRP2b [Arabidopsis thaliana]

3036806.: Proteína rica en glicina [Arabidopsis thaliana]

1402731: Proteína de choque frío principal [Aeromonas hydrophila]

214642: p54 [Xenopus laevis]

15075353: PROTEÍNA REGULADORA DE LA TRANSCRIPCIÓN DE CHOQUE FRÍO PUTATIVA [Sinorhizobium meliloti]

1460247: Similar a proteína de dominio de choque frío A [Homo sapiens]

1175535: PROTEÍNA DE UNIÓN A ARN CITOPLÁSMICO P56 (PROTEÍNA 2 DE UNIÓN A CAJA Y)(FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN DE CAJA Y) (MRNP4)

104266: Proteína 2 de unión a caja Y – Rana africana de uñas

15157349: AGR_C_4003p [Agrobacterium tumefaciens]

8100512: Proteína de caja Y ZONAB-B [Canis familiaris]

8100510: Proteína de caja Y ZONAB-A [Canis familiaris]

1483311: Proteína de caja Y [Dugesia japonica]

1402767: Proteína de choque frío principal [Photobacterium fosforeum]

1402733: Proteína de choque frío principal [Aeromonas salmonicida]

15306095: Proteína hipotética XP_053028 [Homo sapiens]

14742409: Proteína hipotética XP_046353 [Homo sapiens]

14270385: Proteína de dominio de choque frío [Takifugu rubripes]

10185725: Isoforma corta de la proteína 3 de caja Y [Mus musculus]

10185723: Isoforma larga de la proteína 3 de caja Y [Mus musculus]

9653686: Proteína 1 de unión al elemento supresor del receptor de TSH; TSEP-1 [Rattus sp.]

Nº de ID de GenBank: Nombre del gen

7385223: Proteína de unión a ARN MSY4 [Mus musculus]

6166110: PROTEÍNA DE UNIÓN A ADN A (PROTEÍNA DE DOMINIO DE CHOQUE FRÍO A)(PROTEÍNA DE UNIÓN A ADN MONOCATENARIO NF-GMB)

3695368: zfY1 [Danio rerio]

2745892: Factor de transcripción de caja Y [Mus musculus]

2073109: Proteína de caja Y 1 [Carassius auratus]

1353778: Proteína de unión a caja Y [Columba livia]

1167838: Proteína de unión a ADN [Homo sapiens]

1160331: Homólogo murino de dbpA [Mus musculus]

1101884: YB2 [Rattus norvegicus]

1083796: Proteína RYB-a - rata

988283: mYB-1b [Mus musculus]

988281: mYB-1a [Mus musculus]

950340: Proteína de unión a ADN A [Homo sapiens]

608518: p50 [Oryctolagus cuniculus]

532211: Proteína de unión a caja Y [Mus musculus]

516701: Similar a dbp B/YB-1 de ratón [Gallus gallus]

505133: RYB-a [Rattus norvegicus]

Proteína 1 de unión a elemento sensible a nucleasa [Homo sapiens]

423015: Proteína 1 de unión a elemento sensible a nucleasa - humano

289797: Proteína YB-1 [Gallus gallus]

203398: Putativa [Rattus norvegicus]

199821: Factor de transcripción de caja Y [Mus musculus]

189299: Proteína de unión a ADN [Homo sapiens]

162983: Factor de transcripción EF1 (A) [Bos taurus]

115848: PROTEÍNA 1 DE UNIÓN A CAJA Y (FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN DE CAJA Y) (YB-1) (SUBUNIDAD A DEL FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN I DE UNIÓN A CCAAT) (CBF-A)(SUBUNIDAD A DEL FACTOR I POTENCIADOR) (EFI-A) (PROTEÍNA DE UNIÓN A ADN B) (DBPB)

112410: Proteína 1 de unión a caja Y - rata

Las CSP son un grupo de proteínas que pueden o no aumentarse en cantidad cuando se reduce la temperatura o se aplica otro estrés. En realidad, en el organismo mejor estudiado con respecto a las proteínas de choque frío, E. coli, algunas proteínas de choque frío se expresan constitutivamente mientras que otras se inducen por frío, aún otras parecen ser específicas para estreses específicos y/o condiciones o estadios de crecimiento. Una revisión de esto es Yamanaka y col., Molecular Microbiology, 27:247 (1998). En esta revisión, Yamanaka y colaboradores detallan cómo se expresan las nuevas proteínas de choque frío en E. coli (CspA a CspI). CspA, CspB y CspG son inducibles por frío. CspD se induce en la fase estacionaria del ciclo celular y durante la inanición. CspC y E participan en la división celular.

CspA es la proteína de choque frío principal de Escherichia coli (E. coli) (SEC ID Nº: 1). CspA también se llama proteína de choque frío principal 7.4. CspA es altamente inducida en respuesta a choque frío (Goldstein y col., Proceedings of the National Academy of Science (USA) 87:283 (1990)). En algunas condiciones de crecimiento más lento, los ribosomas se ralentizan debido a la formación de estructuras secundarias de ARN o ADN, y esto puede actuar de señal para el aumento de la síntesis de CSP en su organismo nativo. Las CSP se unen a ADNmc y ARN bajo condiciones in vitro (Phadtare y col., Molecular Microbiology 33:1004 (1999)). Se cree que las CSP se unen a un ARN en un modo relativamente no específico durante la traducción y previenen la formación de estructuras secundarias y estabilizan el ARN (esta función se denomina algunas veces una chaperona de ARN). Entonces, el ribosoma puede desplazar fácilmente las CSP e iniciar la traducción sobre un molde de ARN lineal. Los inventores creen que esto podría implicar la función de unión del ácido nucleico monocatenario de estas proteínas, y esta función puede proceder de cualquier proteína de choque frío o proteína que contenga un dominio de choque frío, que incluye, por ejemplo, proteínas de choque frío procariotas, genes que contienen caja Y eucariotas, algunas proteínas ricas en glicina (GRP) y otras proteínas que contienen el dominio de choque frío. Estas proteínas incluyen, pero no se limitan a, aquellas mostradas en la Figura 4, Trends in Biochemical Science, 23(8):289 (1998) (documento incluido, incorporado en el presente documento por referencia). Esta figura muestra claramente la relación evolutiva entre estas proteínas. El origen de estas proteínas probablemente precede a la divergencia de bacterias y eucariotas de ahora, y se ha postulado que estas proteínas pueden haber estado presentes en la aparición de la evolución de una única célula hace 3,5 billones de años. Los presentes inventores han seleccionado dos proteínas para transformar en plantas como ejemplos, como se muestra en la figura citada anteriormente. Estas proteínas son más enormemente divergentes entre sí que de muchos de sus homólogos eucariotas. Los presentes inventores esperan que la expresión ectópica de estas proteínas pueda mejorar la tolerancia a la sequía.

Otra posible explicación para el aumento de la velocidad de crecimiento de plantas bajo estrés podría ser la provocación de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) proporcionados por la expresión de CSP. En este modelo, una planta desarrollaría una respuesta de PAMP que provocaría una respuesta de la planta algo similar a resistencia sistémica adquirida (SAR) (al igual que SAR funciona para estreses bióticos), ya que la planta se “prepararía” para el estrés antes de su aplicación. Para que funcione este modelo, la planta debe ser una señal de que la CSP está presente, este mecanismo puede haberse proporcionado recientemente mediante un receptor de planta que se une a CSP (Felix y col., Journal of Biological Chemistry 278(8):6201-8 (2003)). Este mecanismo significaría que cualquier gen que se une a un receptor que provoca una respuesta tipo PAMP funcionaría en la invención. La provocación de respuestas tipo PAMP se ha estudiado generalmente para estreses bióticos, y frecuentemente ha sido provocada por administración exógena de agentes. En el presente documento los inventores podrían estar provocando respuesta de PAMP a la CSP producida a partir del transgén de CSP. El transgén se transformó en una célula de planta como parte de una construcción de ADN recombinante, mediante una pistola de partículas o transformación mediada por Agrobacterium. Esto podría estar creando a su vez una respuesta tipo resistencia adquirida sistémica en la planta, aumentando a su vez la resistencia a estrés abiótico. Esta respuesta podría funcionar en tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas que incluyen, pero no se limitan a, maíz, soja, trigo, arroz, Arabidopsis, canola y algodón. Si el procedimiento de PAMP anterior es el modo de acción para las CSP, entonces podría esperarse que la CSP proporcionara protección contra el estrés biótico, además de protección contra el estrés abiótico. Ninguno de estos mecanismos se indica que sea limitante y uno o ambos, u otra infinidad, podrían participar en el fenotipo manifestado.

Se ha afirmado que MF2, una proteína similar a Csp de Bacillus thuringiensis, proporciona alguna protección contra infección vírica en una planta. La patente de Estados Unidos 6.528.480 muestra esta tolerancia a estrés biótico frotando las hojas de una planta con un extracto que contiene la proteína e infectando la planta con un virus. Contemplan, pero no crean, plantas transgénicas en su interior.

“Planta no transformada de la misma especie” indica que incluye todas las plantas de la misma especie como una planta transformada. En una realización, la planta transformada es de la misma especie y cepa que la planta transformada. En otra realización, la planta es tan idéntica como sea posible a la planta transformada.

El “dominio de choque frío” (CSD) es una secuencia de proteínas que es homóloga a las proteínas de choque frío. Para los fines de la presente invención, un dominio de choque frío que contiene proteína es una “proteína de choque frío”. Se observa más del 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o el 98 % de identidad de aminoácidos entre CspA de E. coli o CspB de B. subtilis y los dominios de choque frío de las proteínas que contienen dominios de choque frío (Wistow, Nature 344:823 (1990); Yamanaka y col., Mol. Micro., 27:247, véase específicamente la Figura 1B en la referencia de Yamanaka; Graumann y col. TIBS 23:286).

Como se usa en el presente documento, “levadura” se refiere regularmente a Saccharomyces cerevisiae, pero también podría incluir Schizosacchommyces pombe y otras variedades (del género Pichia, por ejemplo). “Maíz” se refiere a Zea Mays y todas las especies y variedades que puedan cultivarse con él. “Trigo” se refiere a todas las variedades de Triticum aestivum que incluyen, pero no se limitan a, variedades de trigo de verano, invierno y todas las facultativas. “Trigo” incluye cualquier otra especie de trigo que incluye, pero no se limitan a, trigo duro (Triticum durum), espelta (Triticum spelta), emmer (Triticum dicoccum) y trigo silvestre (Triticum monococcum). “Trigo” también incluye cualquier especie que pueda cultivarse con cualquiera de las especies de trigo anteriormente mencionadas y descendencia de dichos cruces (incluyendo tritical, un híbrido de trigo y centeno). “Sojas” se refiere a Glycine max o Glycine soja y cualquier especie o variedad que pueda cultivarse con ellas. “Arroz” se refiere a Oryza sativa y cualquier especie o variedad que pueda cultivarse con él. “Cebada” se refiere a Hordeum vulgare y cualquier especie o variedad que pueda cultivarse con ella. “Avena” se refiere a Avena sativa y cualquier especie o variedad que pueda cultivarse con ella. “Canola” es un nombre acuñado recientemente dado a semilla, aceite y harina producidos por plantas de semilla de colza genéticamente modificadas, colza oleaginosa (Brassica napus L.) y colza de nabo (B. campestris L), en el presente documento canola incluye todas las plantas de semilla de colza y organismos que pueden cultivarse con ellas. E. coli y Escherichia coli como se usan en el presente documento incluyen organismos de la especie Escherichia coli y todas las cepas de este organismo; es decir, K12 de E. coli. E. coli y Escherichia coli como se usan en el presente documento también pueden incluir cualquier organismo que pueda conjugarse con cualquier cepa de E. coli cuando una es una cepa F+ o Hfr y la otra no es. B. subtilis y Bacillus subtilis se refieren a todos los organismos del género Bacillus, especie subtilis. Agrobacterium tumefaciens como se usa en el presente documento incluye todas las cepas y tipos de esta especie. “Hierbas de césped” incluyen todas las especies y cepas de hierba plantadas algún vez, o que podrían plantarse, para producir un césped, que incluye pero no se limitan a; un pasto, un campo para jugar un juego (es decir, fútbol, beisbol), y todas las áreas de un campo de golf (es decir, tee, calle, green, rough, etc.). “Algodón” se refiere a todas las plantas en el género Gossypium y todas plantas que puedan cultivarse con ella.

Una “proteína rica en glicina” se define como una proteína en un eucariota que es, o tiene identidad sustancial con, o es un homólogo de, una proteína que contiene un dominio de choque frío.

“Sequía” o “agua sería limitante para el crecimiento” se definen como un periodo de aridez que, especialmente cuando es prolongado, puede producir lesión a cultivos o prevenir su crecimiento satisfactorio. De nuevo, diferentes plantas de la misma especie, y aquellas de diferentes cepas de la misma especie, pueden tener diferente tolerancia a la sequía, aridez y/o falta de agua. En el laboratorio, la sequía puede simularse dando a las plantas un 95 % o menos de agua que a una planta de control y buscando diferencias en el vigor, crecimiento, tamaño, longitud de las raíces, e infinitas otras medidas fisiológicas y físicas. La sequía también puede simularse en el campo regando algunas plantas, pero no otras, y comparando su velocidad de crecimiento, especialmente cuando el agua está gravemente limitada para el crecimiento de esa planta.

Ciertas de las secuencias de genes desveladas como parte de la invención son de origen bacteriano, por ejemplo, ciertas proteínas de choque frío procariotas. Es conocido para un experto en la materia que los genes bacterianos sin modificar se expresan escasamente algunas veces en células vegetales transgénicas. El uso de codones de plantas se parece mucho al de los seres humanos y otros organismos superiores a organismos unicelulares tales como bacterias. Varios informes han desvelado procedimientos para mejorar la expresión de genes recombinantes en plantas. Estos informes desvelan diversos procedimientos para manipular secuencias codificantes que representan secuencias que se traducen más eficientemente basándose en las tablas de frecuencias de codones de plantas, mejoras en el sesgo de la posición de la tercera base de los codones, usando secuencias recombinantes que evitan sospechar la poliadenilación o dominios ricos en A/T o secuencias consenso de corte y empalme de intrones. Aunque estos procedimientos para la construcción de genes sintéticos son notables, los inventores han contemplado crear genes sintéticos para proteínas de choque frío o proteínas que contienen dominios de choque frío según el procedimiento de Brown y col. (patente de EE.UU. nº 5.689.052, 1997), y/o por los anteriormente citados, además de otros procedimientos. Brevemente, según Brown y col., la frecuencia de codones de mononucleótidos raros y semi-raros en una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína deseada se reduce y se sustituye con codones monocotiledóneos más preferidos. La acumulación potenciada de un polipéptido deseado codificado por una secuencia de polinucleótidos modificada en una planta monocotiledónea es el resultado de aumentar la frecuencia de codones preferidos analizando la secuencia codificante en seis fragmentos de nucleótidos sucesivos y alterar la secuencia basándose en la frecuencia de aparición de los seis-meros en cuanto a la frecuencia de aparición de los 284, 484 y 664 seis-meros más raros en plantas monocotiledóneas. Además, Brown y col. desvelan la expresión potenciada de un gen recombinante aplicando el procedimiento para reducir la frecuencia de codones raros con procedimientos para reducir la aparición de señales de poliadenilación y sitios de corte y empalme de intrones en la secuencia de nucleótidos, eliminando secuencias auto-complementarias en la secuencia de nucleótidos y sustituyendo tales secuencias con nucleótidos no auto-complementarios a la vez que se mantiene un gen estructural que codifica el polipéptido, y reduciendo la frecuencia de aparición de los pares de dinucleótidos 5'CG-3' en la secuencia de nucleótidos. Estas etapas se realizan secuencialmente y tienen un efecto acumulado que produce una secuencia de nucleótidos que contiene un uso preferencial de los codones monocotiledóneos más preferidos para plantas monocotiledóneas para una mayoría de los aminoácidos presentes en el polipéptido deseado. Específicamente se contempla que todas las proteínas mencionadas en el presente documento se preparen en genes sintéticos como se trata anteriormente, o usando procedimientos similares que incluyen, pero no se limitan a, CspA de Escherichia coli y CspB de Bacillus subtilis.

El trabajo descrito en el presente documento ha identificado procedimientos de potenciar la expresión in planta de proteínas de choque frío y proteínas que contienen dominios de choque frío, que pueden conferir resistencia a muchos estreses de las plantas que pueden incluir, pero no se limitan a frío, calor, sequía, sal y otros estreses, o fenotipos relacionados con el estrés (germinación en frío, estrés por supervivencia después de frío y otros estreses abióticos) cuando se expresa ectópicamente después de la incorporación en el genoma nuclear, de plástido o cloroplasto de plantas susceptibles. La patente de EE.UU. 5.500.365 describe un procedimiento para sintetizar genes de plantas para optimizar el nivel de expresión de la proteína que codifica el gen sintetizado. Este procedimiento se refiere a la modificación de las secuencias estructurales de genes del transgén exógeno para hacerlas más “similares a planta” y, por tanto, más probables de traducir y expresar por la planta, monocotiledónea o dicotiledónea. Sin embargo, el procedimiento como se desvela en la patente de EE.UU. 5.689.052 proporciona la expresión potenciada de los transgenes, preferentemente en plantas monocotiledóneas.

En el desarrollo de las construcciones de ácidos nucleicos de la presente invención, los diversos componentes de la construcción o fragmentos de los mismos se insertarán normalmente en un vector de clonación conveniente, por ejemplo, un plásmido que puede replicarse en un huésped bacteriano, por ejemplo, E. coli. Existen numerosos vectores que se han descrito en la bibliografía, muchos de los cuales están comercialmente disponibles. Después de clonarse cada uno, el vector de clonación con el inserto deseado puede aislarse y someterse a manipulación adicional, tal como digestión con restricción, inserción de nuevos fragmentos o nucleótidos, ligación, deleción, mutación, corte, etc., de manera que se confeccionen los componentes de la secuencia deseada. Una vez se ha completado la construcción, entonces puede transferirse a un vector apropiado para la manipulación adicional según el modo de transformación de la célula huésped.

Una molécula de ADN bicatenaria de la presente invención que contiene, por ejemplo, una proteína de choque frío en un casete de expresión puede insertarse en el genoma de una planta por cualquier procedimiento adecuado. Vectores de transformación de plantas adecuados incluyen aquellos derivados de un plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens, además de los desvelados, por ejemplo, por Herrera-Estrella y col. (1983), Bevan (1984), Klee y col. (1985) y la publicación EPO 120.516. Además de los vectores de transformación de plantas derivados de los plásmidos Ti o inductores de raíz (Ri) de Agrobacterium, procedimientos alternativos pueden usarse para insertar las construcciones de ADN de la presente invención en células vegetales. Tales procedimientos pueden implicar, pero no se limitan a, por ejemplo, el uso de liposomas, electroporación, productos químicos que aumentan la captación de ADN libre, liberación de ADN libre mediante bombardeo de microproyectiles y transformación usando virus o polen.

Un vector de expresión de plásmidos adecuado para la introducción de un gen que codifica una proteína de choque frío, o proteína que contiene un dominio de choque frío en monocotiledóneas usando electroporación, podría estar compuesto de lo siguiente: un promotor que funciona en plantas; un intrón que proporciona un sitio de corte y empalme para facilitar la expresión del gen tal como el intrón Hsp70 (documento WO93/19189); y una secuencia de poliadenilación de 3' tal como la secuencia en 3' de nopalina sintasa (NOS 3'). Este casete de expresión puede ensamblarse en replicones de altas copias adecuados para la producción de grandes cantidades de ADN.

Un ejemplo de un vector de casete de plásmidos Ti útil para la transformación de plantas es pMON-17227. Este vector se describe en el documento WO 92/04449 y contiene un gen que codifica una enzima que confiere resistencia a glifosato (denominada CP4), que es un gen marcador de selección excelente para muchas plantas. El gen está fusionado con el péptido de tránsito de cloroplastos (CTP2) de EPSPS de Arabidopsis y se expresa a partir del promotor de FMV como se describe en su interior. Cuando se obtienen números adecuados de células (o protoplastos) que contienen el gen sedoheptulosa-1,7-bisfosfatasa o ADNc, las células (o protoplastos) se regeneran en plantas completas. La elección de la metodología para la etapa de regeneración no es crítica, estando disponibles protocolos adecuados para huéspedes de Leguminosae (alfalfa, soja, trébol, etc.), Umbelliferae (zanahoria, apio, chirivía), Cruciferae (col, rábano, canola/semilla de colza, etc.), Cucurbitaceae (melones y pepinos), Gramineae (trigo, cebada, arroz, maíz), Solanaceae (patata, tabaco, tomate, pimientos), diversos cultivos florales tales como girasol, y árboles que llevan frutos secos tales como almendras, anacardos, nueces y pecanas.

Plantas que pueden prepararse para expresar proteínas de choque frío por la práctica de la presente invención incluyen, pero no se limitan a acacia, alfalfa, eneldo, manzana, albaricoque, alcachofa, rúcula, espárrago, aguacate, banana, cebada, judías, remolacha, zarzamora, arándano, brócoli, coles de Bruselas, col, canola, melón cantalupo, zanahoria, mandioca, coliflor, apio, cereza, cilantro, cítrico, clementinas, café, maíz, algodón, pepino, abeto de Douglas, berenjena, endivia, escarola, eucalipto, hinojo, higos, calabacino, uva, pomelo, rocío de miel, jícama, kiwi, lechuga, puerro, limón, lima, pino de Loblolly, mango, melón, setas, nogal , avena, ocra, cebolla, naranja, una planta ornamental, papaya, perejil, guisante, melocotón, cacahuete, pera, pimienta, persimón, pino, piña, plátano, ciruela, granada, álamo, patata, calabaza, membrillo, pino radiata, achicoria roja, rábano, frambuesa, arroz, centeno, sorgo, pino del sur, soja, espinaca, calabacín amarillo, fresa, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, batata, liquidámbar, tangerina, té, tabaco, tomate, césped, una vid, sandía, trigo, boniatos, calabacín verde, o cualquier otra planta.

“Promotor” se refiere a una secuencia de ADN que se une a ARN polimerasa (y frecuentemente otros factores de transcripción) y promueve la transcripción de una secuencia de ADN en la dirección 3'. Los promotores frecuentemente proporcionan expresión potenciada o reducida en algunos tejidos cuando se compara con otros. La selección de promotores, específicamente la selección de promotores que aumentan la expresión cuando una planta está sometiéndose a estrés abiótico, podría ser particularmente útil en la presente invención.

Se ha observado en la materia que algunas respuestas al estrés tienen efectos similares sobre la planta, y resistencia a una puede proporcionar resistencia a otra. Esto se observa, por ejemplo, entre las respuestas a deshidratación y baja temperatura (Shinozaki y col., Current Opinions in Plant Biology 3(3):217, 2000). Muchos otros documentos muestran las interrelaciones generales entre diferentes estreses abióticos, y podrían indicar que la tolerancia a un estrés podría conducir a mayor tolerancia de varios otros estreses abióticos (Pernas y col., FEBS Lett 467(2-3):206, 2000; Knight, Int Rev Cytol 195:269, 2000; Didierjean y col., Plant 199: 1, 1996; Jeong y col., Mol Cells 12:185, 2001).

Los casetes de expresión y elementos reguladores encontrados en el segmento de ADN fuera de los elementos de expresión de la planta contenidos en los T-ADN son comunes en muchos esqueletos de ADN de plásmido y funcionan como elementos de mantenimiento de plásmidos, éstos incluyen, pero no se limitan a, el gen aad (Spc/Str) para resistencia de espectinomicina/estreptomicina bacteriana, el pBR322 ori (ori322) que proporciona el origen de replicación para el mantenimiento en E. coli, el sitio bom para la transferencia conjugacional en las células de Agrobacterium tumefaciens y un segmento de ADN es el oriV de 0,75 kb que contiene el origen de replicación del plásmido RK2. Además, aquellos plásmidos previstos para la transformación en plantas frecuentemente contienen los elementos necesarios para que las proteínas de integración de ADN endógeno de Agrobacterium funcionen para insertar el elemento. Éstos incluyen límites (límites derecho (RB) e izquierdo (LB)).

Los procedimientos de laboratorio en tecnología de ADN recombinante usados en el presente documento son aquellos muy conocidos y comúnmente empleados en la materia. Técnicas convencionales se usan para la clonación, aislamiento, amplificación y purificación de ADN y ARN. Generalmente, las reacciones enzimáticas que implican ADN ligasa, ADN polimerasa, endonucleasas de restricción y similares se realizan según las especificaciones del fabricante. Estas técnicas y diversas otras técnicas se realizan generalmente según Sambrook y col., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989).

Los siguientes ejemplos están incluidos para demostrar realizaciones de la invención.

Ejemplos ya no cubiertos por el alcance de las reivindicaciones son para fines ilustrativos. Ejemplos

Ejemplo 1.

pMON57396 (Figura 1) es un vector binario para transformación mediada por Agrobacterium y expresión constitutiva de una proteína (SEC ID Nº: 56) similar a CspA de Escherichia coli en Arabidopsis. Para clonar el gen CspA de E. coli, dos cebadores específicos para genes, MF1 y MF2, se diseñaron basándose en la información de secuencias de CspA (Genbank M30139, GI:409136) del Centro nacional para información biotecnológica, que es parte de la Biblioteca nacional de medicina, a su vez parte de los Institutos nacionales de salud (NCBI). La secuencia para MF1 es AGGTAATACACCATGGCCGGTAA (SEC ID Nº: 66), que se hibrida en el sitio de iniciación de la traducción de CspA e introduce un sitio NcoI en el extremo 5', mientras que la secuencia de MF2 es TTAAGCAGAGAATTCAGGCTGGTT (SEC ID Nº: 67), que se hibrida en el último codón de CspA e introduce un sitio EcoRI al final del cebador. Se realizó PCR para aislar CspA de E. coli. Específicamente, células DH5a de E.co/i se lisaron y una pequeña cantidad del lisado se usó como molde para amplificar el gen CspA usando cebadores de MF1 y MF2, Taq polimerasa y dNTP de Roche Molecular Biochemicals (Indianápolis, IN). Las condiciones de ciclado térmico fueron del siguiente modo: 94 ºC, 1 min, seguido de 30 ciclos de 94 ºC, 16 segundos; 55 ºC, 1 min y 72 ºC, 1 min. El ADN de CspA amplificado se purificó por electroforesis en gel, se digirió con NcoI y EcoRI y se ligó a un vector binario pMON23450 (Figura 2) que previamente había sido linealizado por digestión con NcoI y EcoRI. La ligación se realizó usando T4 ligasa y los siguientes procedimientos recomendados por el fabricante (BRL/Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD). La mezcla de ligación se transformó en células de E. coli para la propagación del plásmido (Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Press, 1989). Las células transformadas se sembraron sobre medio selectivo apropiado (Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Press, 1989) y las colonias se puntuaron horas o días después. Se prepararon plásmidos a partir de colonias individuales y se determinó la secuencia de inserto completo.

El plásmido resultante también se confirmó por mapeo por restricción (por ejemplo, véanse Griffiths y col., An Introduction to Genetic Analysis, 6ª edición pp449-451, ISBN 0-7167-2604-1, W.H. Freeman y Co., Nueva York) y secuenciación. Como el sitio de clonación de NcoI -EcoRI elegido en el vector se flanqueó por un promotor e35S del CaMV en la dirección 5' (5') y una marca de epítope (Flag, que codifica el oligopéptido DYKDDDK (SEC ID Nº: 68), SIGMA, St Louis) en la dirección 3' (3'), CspA de E. coli en esta construcción es así marcada en el extremo C por la marca de epítopes Flag y será accionada transcripcionalmente por el promotor e35S del CaMV tras la transformación en Arabidopsis. La anterior clonación produce un plásmido que codifica una proteína similar a SEC ID Nº: 55. El plásmido resultante se llama pMON57396.

Ejemplo 2.

pMON57397 (Figura 2) es un vector binario para transformación mediada por Agrobacterium y expresión constitutiva de una proteína (SEC ID Nº: 57) similar a proteína CspA de Escherichia coli, en Arabidopsis. Para crear pMON57397, el vector binario pMON57396 que contiene el gen CspA de Escherichia coli (véase el ejemplo anterior) marcado en el extremo C por la marca de epítopes Flag se digirió con enzimas de restricción XhoI y SalI para escindir estos sitios en el vector y liberar la marca de epítopes FLAG (la marca FLAG codifica el oligopéptido DYKDDDK, SIGMA, St Louis). Entonces, el plásmido linealizado se purificó y religó. La ligación se realizó usando T4 ligasa y los siguientes procedimientos recomendados por el fabricante (BRL/Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD). La mezcla de ligación se transformó en células de E. coli para la propagación del plásmido (Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Press, 1989). Las células transformadas se sembraron sobre medio selectivo apropiado (Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Press, 1989) y las colonias se puntuaron horas o días después. Se prepararon plásmidos a partir de colonias individuales y se determinó la secuencia de inserto completo. La anterior clonación produce la creación de un plásmido que codifica una proteína similar a SEC ID Nº: 57.

El plásmido resultante también se confirmó por mapeo por restricción para garantizar que los sitios XhoI y SalI estaban ausentes (por ejemplo, véase Griffiths y col., An Introduction to Genetic Analysis, 6ª edición pp449-451, ISBN 0-7167-2604-1, W.H. Freeman y Co., Nueva York) y secuenciación. El gen CspA de E. coli en esta construcción está sin marcar en el extremo C y es accionado transcripcionalmente por el promotor e35S del CaMV.

Ejemplo 3.

pMON57398 (Figura 4) es un vector binario para transformación mediada por Agrobacterium y expresión constitutiva de una proteína (SEC ID Nº: 59) similar a CspB de Bacillus subtilis, en Arabidopsis. Para clonar el gen CspB de B. subtilis, dos cebadores específicos para genes, MF3 y MF4a, se diseñaron basándose en la información de secuencia de CspB (Genbank U58859, gi:1336655) del Centro nacional para información biotecnológica, que es parte de la Biblioteca nacional de medicina, a su vez parte de los Institutos nacionales de salud (NCBI). La secuencia para MF3 es AGGAGGAAATTCCATGGTAGAAG (SEC ID Nº: 69), que se hibrida en el sitio de iniciación de la traducción de CspB e introduce un sitio NcoI en el extremo 5', mientras que la secuencia de MF4a es TCAATTTATGAATTCGCTTCTTTAGT (SEC ID Nº: 70), que se hibrida en el último codón de CspB e introduce un sitio EcoRI al final del cebador. Se realizó PCR para aislar CspB de B. subtilis. Se obtuvieron células de Bacillus subtilis de Carolina Biological Supply (Burlington, NC), las células se lisaron y una pequeña cantidad del lisado se usó como molde para amplificar el gen CspB usando cebadores MF3 y MF4a, Taq polimerasa y dNTP de Roche Molecular Biochemicals. Las condiciones de ciclado térmico fueron del siguiente modo: 94 ºC, 1 min, seguido de 30 ciclos de 94 ºC, 16 segundos; 55 ºC, 1 min y 72 ºC, 1 min. El ADN de CspB amplificado se purificó por electroforesis en gel, se digirió con Ncol y EcoRI y se ligó a un vector binario pMON23450 (Figura 5) que previamente había sido linealizado por digestión con NcoI y EcoRI. La ligación se realizó usando T4 ligasa y los siguientes procedimientos recomendados por el fabricante (BRL/Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD). La mezcla de ligación se transformó en células de E. coli para la propagación del plásmido. Las células transformadas se sembraron sobre medio selectivo apropiado (Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Press, 1989) y las colonias se puntuaron un día después. Se prepararon plásmidos a partir de colonias individuales y se determinó la secuencia de inserto completo.

El plásmido resultante también se confirmó por mapeo por restricción (por ejemplo, véase Griffiths y col., An Introduction to Genetic Analysis, 6ª edición pp449-451, ISBN 0-7167-2604-1, W.H. Freeman y Co., Nueva York) y secuenciación. Como el sitio de clonación de NcoI -EcoRI elegido en el vector se flanqueó por un promotor e35S del CaMV en la dirección 5' (5') y una marca de epítopes (Flag, que codifica el oligopéptido DYKDDDK (SIGMA, St Louis) en la dirección 3' (3'), el gen similar a CspB de B. subtilis en esta construcción es así marcado en el extremo C por la marca de epítopes Flag y será accionado transcripcionalmente por el promotor e35S del CaMV tras la transformación en Arabidopsis. Esta clonación produce un plásmido con la secuencia que codifica una proteína similar a SEC ID Nº: 59 que se inserta en dicho plásmido.

Ejemplo 4.

pMON57399 (Figura 6) es un vector binario para transformación mediada por Agrobacterium y expresión constitutiva de una proteína (SEC ID Nº: 61) similar a CspB de Bacillus subtilis en Arabidopsis. Para crear pMON57399, el vector binario pMON57398 que contiene el gen CspB de Bacillus subtilis (véase el ejemplo anterior) marcado en el extremo C por la marca de epítopes Flag se digirió con enzimas de restricción XhoI y SalI para escindir estos sitios en el vector y liberar la marca de epítopes FLAG (la marca FLAG codifica el oligopéptido DYKDDDK, SIGMA, St Louis). Entonces, el plásmido linealizado se purificó y religó. La ligación se realizó usando T4 ligasa y los siguientes procedimientos recomendados por el fabricante (BRL/Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD). La mezcla de ligación se transformó en células de E. coli para la propagación del plásmido (Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Press, 1989). Las células transformadas se sembraron sobre medio selectivo apropiado (Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Press, 1989) y las colonias se puntuaron horas o días después. Se prepararon plásmidos a partir de colonias individuales y se determinó la secuencia de inserto completo. Esta clonación produce un plásmido con una secuencia que codifica una proteína similar a SEC ID Nº: 61 que se inserta en dicho plásmido.

El plásmido resultante también se confirmó por mapeo por restricción para garantizar que sitios XhoI y SalI estuvieran ausentes (por ejemplo, véase Griffiths y col., An Introduction to Genetic Analysis, 6ª edición pp449-451, ISBN 0-7167-2604-1, W.H. Freeman y Co., Nueva York) y secuenciación. Como el sitio de clonación Ncol-EcoRI elegido en el vector se flanqueó por un promotor e35S del CaMV en el extremo N en la dirección 5' (5'), el gen CspB de B. subtilis en esta construcción está sin marcar en el extremo C y es accionado transcripcionalmente por el promotor e35S del CaMV tras la transformación en Arabidopsis. Dichos plásmidos se transformaron en Agrobacterium tumefaciens.

Ejemplo 5.

Plantas de Arabidopsis pueden transformarse por uno cualquiera de muchos procedimientos disponibles. Por ejemplo, plantas de Arabidopsis pueden transformarse usando el procedimiento de transformación in planta por infiltración a vacío (véase, Bechtold y col., In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. CR Acad. Sci. Paris Sciences de la vie/life sciences 316: 1194-1199 (1993). Este ejemplo ilustra cómo pueden transformarse plantas de Arabidopsis.

Material de planta madre y condiciones de crecimiento

Preparar macetas de 2,5 pulgadas (6,35 cm) con tierra y cubrirlas con un tamiz de malla, asegurándose de que la tierra no esté compactada demasiado apretada y la malla esté en contacto con la superficie de la tierra (esto garantiza que las plantas de semillero en germinación podrán crecer a través de la malla). Sembrar las semillas y cubrir con una cúpula de germinación. Vernalizar las semillas durante 3-4 días. Cultivar las plantas en condiciones de 16 horas de luz / 8 horas de oscuridad a 20-22º C, 70 % de humedad. Regar dos veces semanalmente y fertilizar desde abajo con 1/2 X (mitad de la concentración recomendada por el fabricante) fertilizante Peters 20-20-20 (de Hummert International, Earth City, MO). Añadir micronutrientes (Hummert's Dyna-grain Soluble Trace Elements) (en la concentración completa recomendada por el fabricante) una vez cada dos semanas. Después de aproximadamente 1-2 semanas, quitar la cúpula y clarear las macetas a una o dos plantas por maceta. Sujetar la espiga primaria, cuando se desarrolla, para estimular la formación de más espigas secundarias. En 5-7 días las plantas estarán listas para la infiltración.

Preparación de Agrobacterium (cultivos a pequeña escala y a gran escala):

La cepa ABI de Agrobacterium se cultiva en línea sobre una placa de LB que contiene espectinomicina 100 mg/l, estreptomicina 100 mg/l, cloranfenicol 25 mg/l y kanamicina 50 mg/l (denotado SSCK). Dos días antes de la infiltración, un bucle de Agrobacterium se coloca en un tubo que contiene 10 ml de LB/SSCK y se dispone en un agitador en la oscuridad a 28 ºC para cultivo durante la noche. Al día siguiente, Agrobacterium se diluye 1:50 en 400 ml de YEP/SSCK y se dispone en un agitador a 28 ºC para cultivo durante 16-20 horas. (Nota: los presentes inventores han encontrado que la velocidad de transformación es significativamente mayor cuando se usa LB durante el crecimiento de la primera noche y se usa YEP para el cultivo de crecimiento durante la noche a gran escala).

Infiltración

Recoger las células de Agrobacterium vertiendo en una botella de centrífuga de 500 ml y centrifugando a 3500 rpm durante 20-25 minutos. Escurrir el sobrenadante. Secar el sedimento y luego resuspender en 25 ml de medio de infiltración (sales basales de MS 0,5 %, vitaminas B-5 de Gamborg 1 %, sacarosa 5 %, MES 0,5 g/l, pH 5,7) con bencilaminopurina 0,44 nM (BAP) (10 μl de 1,0 mg/l de disolución madre en DMSO por litro) y 0,02 % de Vac-In-Stuff (Silwet L-77) de Lehle Seeds (Round Rock, TX). Se añaden BAP y Silwet L-77 frescos el día de la infiltración. Añadir 200 μl de Silwet L-77 y 20 μl de BAP (0,5 mg/l de disolución madre). Usando medio de infiltración como blanco, tomar la DO600 de una dilución 1:10 de las suspensiones de Agrobacterium. Calcular el volumen necesario para 400 ml de medio de suspensión/infiltración de Agrobacterium, DO600 = 0,6, para la infiltración a vacío.

(volumen final) * (DO600 final)

Ecuación : = Volumen necesario para DO600 final de 0,6

DO600

Disponer el cultivo resuspendiendo en un recipiente Rubbermaid dentro de un desecador a vacío. Invertir las macetas que contienen las plantas que van a infiltrarse en la disolución de manera que se cubra la planta entera, que incluye la roseta, pero no sumergir demasiada tierra. Empapar las plantas con agua durante al menos 30 min antes de la infiltración (esto evita que la tierra se empape de suspensión de Agrobacterium).

Generar un vacío de ~23-27 pulgadas de Hg durante 10 min. Liberar rápidamente el vacío. Drenar brevemente las maceras, disponerlas sobre sus lados en un bandeja revestida de pañal, cubrir la bandeja con una cúpula para mantener la humedad y devolver a la cámara de crecimiento. Al día siguiente destapar las macetas, ponerlas derechas y quitar el pañal. No regar las plantas durante ~ 5 días. Después de transcurrir los 5 días, dejar que las plantas se rieguen y continúen creciendo bajo las mismas condiciones que antes (las hojas que se infiltraron pueden degenerarse, pero la planta debe sobrevivir hasta que acabe el florecimiento).

Recolección y esterilización de semilla

Poner las plantas en conos, individualmente, usando Lehle Aracons (Lehle Seeds, Round Rock, TX) aproximadamente 2 semanas después de la infiltración. Después de que toda la semilla haya madurado y haya cuajado (~4 semanas después de la infiltración), sacar las plantas del agua para secar las semillas. Aproximadamente 2 semanas después recolectar las semillas cortando las ramas debajo del cono. Limpiar la semilla usando un tamiz para atrapar el material de silicua y ramas y dejar que la semilla pase a través. Disponer la semilla en un sobre o en tubos cónicos de 15 ml.

Transferir la cantidad deseada de semillas a tubos cónicos de 15 ml antes de la esterilización. Aflojar la tapa a los tubos cónicos y disponerlos sobre su lado en un desecador a vacío con un vaso de precipitados que contiene 400 ml de blanqueador Clorox (Clorox Company, Oakland, CA) y 4 ml de ácido clorhídrico (añadir el HCl al Clorox en una campana extractora). Establecer un vacío justamente para sellar el desecador, y cerrar la succión (es decir, de manera que el desecador esté todavía bajo un vacío, pero el vacío no esté todavía siendo directamente establecido) durante ~16 h. Después de la esterilización, liberar el vacío y disponer los tubos que contienen semilla en una campana estéril (mantener las tapas sueltas de forma que todavía pueda liberarse gas).

Sembrar (“rociar”) la semilla sobre placas de selección que contienen sales basales de MS 4,3 g/l, B-5 de Gamborg (500 X) 2,0 g/l, sacarosa 10 g/l, MES 0,5 g/l y 8 g/l de Phytagar (Life Technologies, Inc., Rockville, MD) con carbenicilina en 250 mg/l, cefotaxima 100 mg/l. Los niveles de selección serán tanto kanamicina 60 mg/l, glifosato 60 μM como bialafos 10 mg/l.

Una cantidad muy pequeña de semilla puede sembrarse primero para comprobar la contaminación. Si hay contaminación, volver a esterilizar las semillas durante ~4 horas más y comprobar la contaminación de nuevo. La segunda esterilización no es normalmente necesaria, pero algunas veces la semilla aloja un contaminante fúngico y se necesitan esterilizaciones repetidas (la duración de la esterilización es generalmente más corta de 16 horas debido a velocidades de germinación significativamente disminuidas a partir de las 24 h de duración de la esterilización). Sellar las placas con parafilm y disponer en una sala fría para vernalizar durante ~2-4 días. Después de vernalizar las semillas, disponer en Percival con bombillas blancas frías.

Transferencia a la tierra

Después de 5-10 días a ~26 ºC y un ciclo de luz 16/8, los transformantes serán visibles como plantas verdes. Después de otras 1-2 semanas, las plantas tendrán al menos un conjunto de hojas verdaderas. Transferir las plantas a la tierra, cubrir con una cúpula de germinación y cambiar a una cámara de crecimiento con condiciones de crecimiento de Arabidopsis normales. Mantener cubiertos hasta que el nuevo crecimiento sea evidente (normalmente 5-7 días).

Ejemplo 6.

Con el fin de comparar el crecimiento de plantas de Arabidopsis no transgénicas naturales y transgénicas para CspA

o CspB, se permitió el crecimiento vertical en placas de Petri estériles:

Las semillas naturales o transgénicas se esterilizaron en líquido usando el siguiente procedimiento:

•: incubación de 5 minutos en un 70 % de etanol tras la mezcla con vórtex

•: incubación de 5 minutos en un 30 % de Clorox (6,15 % de hipoclorito de sodio) + • 0,01 % de Triton X-100 tras la mezcla con vórtex

•: 5 lavados con agua estéril consecutivos

Las semillas se sembraron sobre placas de Petri cuadradas de 100 x 15 mm de plástico (Becton Dickinson - Falcon nº 35-1112), conteniendo cada una 40 ml de medio de agar preparado del siguiente modo:

0,5 X medio de Murashige y Skoog con macronutrientes, micronutrientes y vitaminas (Sigma nº M5519), ajustado a pH 5,8 con hidróxido de amonio y que contiene un 1 % de Phytagel (Sigma nº P8169) para soporte sólido.

Diez semillas de Arabidopsis naturales se sembraron a través de la mitad de una placa de Petri, aproximadamente 1 cm desde el borde y uniformemente separadas. Esto se hizo con un Gilson P-200 Pipetman usando puntas estériles. Similarmente, diez semillas de Arabidopsis transgénicas para CspA o CspB se sembraron a través de la otra mitad de la placa de Petri, uniformemente separadas. Las placas se marcaron con un rotulador para indicar qué mitad contuvo las semillas transgénicas.

Las placas de Petri se pusieron a 4 ºC durante 3 días en la oscuridad para estratificar las semillas y luego se sembraron en una estufa de incubación Percival (modelo AR-36L) a 8 ºC durante 6 semanas a luz constante de 24 horas de 120 microeinstein/metro cuadrado. Al final de esta incubación se comparó el tamaño de las rosetas de CspA y CspB con la de las naturales y se encontró que eran más grandes. Esto puede observarse en la Figura 16. Esto puede observarse en la primera, segunda y última placa representada en las que se usó el ensayo anterior en la Figura 16, la tercera fotografía (CspB + Flag, pMON57399) muestra una placa en la que las plantas se hicieron pasar por un ensayo de choque frío similar al descrito más adelante.

Evaluación del vigor de las plantas de semillero a choque frío de semillas de Arabidopsis thaliana transgénicas: ensayo en placa horizontal.

Introducción:

Este es un procedimiento para evaluar la capacidad de semillas de Arabidopsis transgénicas que han germinado a temperaturas normales sobre medio de agar en placas de Petri horizontales para continuar creciendo tras un desplazamiento a enfriamiento. En resumen, semillas de plantas de control y semillas de plantas transgénicas de prueba se esterilizan, estratifican y se siembran en rejillas 6 x 8 sobre cualquier mitad de una placa de Petri. La placa se incuba a temperatura normal en una posición horizontal durante una semana y luego se desplaza a temperatura de enfriamiento durante dos semanas adicionales, manteniendo la posición horizontal de la placa. El área de follaje de las plantas de semillero se registra por fotografía digital y se cuantifica usando software de obtención de imágenes. La relación del área de follaje total de las plantas de semillero de prueba con la de las plantas de semillero de control puede usarse como parámetro cuantitativo para comparar el potencial de tolerancia al frío de diversos genes de interés en líneas de prueba transgénicas.

Materiales: lo siguiente supone el equipo primordial normal, disponible en un laboratorio de biotecnología convencional (autoclave, balanza, campana de flujo laminar, etc.)

-: Semilla de Arabidopsis: los protocolos aquí se han usado con Arabidopsis thaliana cv. Columbia, pero también deben ser adecuados para otras especies de Arabidopsis.

-: Placas de Petri: Falcon nº35-1112 (cuadrado de 100 mm x 15 mm de profundidad)

-: Medio: Sigma M5519 = medio basal de Murashige y Skoog

-: Phytagel (Sigma nº P-8169)

-: Botellas de vidrio de 1 litro en las que esterilizar en autoclave medios de agar y de las que verter en las placas. Los presentes inventores usan botellas de vidrio Corning con las tapas de rosca naranjas.

-: Agitadores magnéticos y barras de agitación magnéticas

-: Pipeteador eléctrico que puede usarse con pipetas de plástico de 50 ml.

-: Pequeña caja de luz fluorescente con lente de aumento de plástico para sembrar semillas.

-: Pipeteador P 1000 Gilson (o equivalente) y puntas estériles

-: Pipeteador P200 Gilson (o equivalente) y puntas estériles

-: 70 % de etanol, estéril

-: 30 % de blanqueador Clorox + 0,1 % de Tween 20

-: Agua desionizada esterilizada por filtración

-: Tubos de microcentrífuga estériles y gradillas de tubos

-: Sala fría a 4 ºC, cámara fría o refrigerador, preferentemente oscuro

-: Cámara de crecimiento de plantas Percival de 22 ºC o equivalente con ~ 150 μE/m2/s de fuente de luz

-: Cámara de crecimiento de plantas Percival de 8 ºC o equivalente con ~ 150 μE/m2/s de fuente de luz

-: Cinta quirúrgica semipermeable 3M Micropore tape (3M nº 1530-1)

-: Marcador negro (Sharpie)

-: Aspirador a vacío con trampa

-: Balanza de vidrio que pesa papel (VWR nº 12578-165)

-: Calculadora

-: Cuaderno

-: Ordenador compatible con IBM

-: Software Image-Pro Plus, versión 4.1.0.0

-: Software Microsoft Excel

Protocolo:

1- Tomar alícuotas de semillas para viales de almacenamiento o sobres para tubos de microcentrífuga estériles 2- Marcar los tubos con Sharpie para conservar la identidad de las semillas 3- Esterilizar la superficie de semillas en tubos por lavado sucesivo con las siguientes disoluciones y esperar los tiempos enumerados más adelante. Obsérvese, invertir los tubos durante los lavados al menos dos veces para garantizar el buen contacto superficial de las disoluciones sobre las semillas. Las semillas caerán al fondo del tubo, produciendo un sedimento blando:

a.: 70 % de etanol, estéril, durante 3 a 5 minutos

b.: 30 % de blanqueador Clorox + 0,1 % de Tween 20, durante 3 a 5 minutos

c.: Agua desionizada esterilizada por filtración, durante 30 segundos

d.: Repetir c. cuatro veces más y en la última vez, dejar ~0,5 ml de agua estéril restante sobre el sedimento de semillas.

1- Disponer los de tubos de microcentrífuga en la oscuridad a 4 ºC durante tres días para estratificar las semillas para germinación más uniforme tras la siembra en placa.

[Alternativamente, las semillas pueden disponerse directamente sobre placas de Petri de medio de agar, sellarse con cinta y la placa de Petri puede ponerse a 4 ºC en la oscuridad durante tres días antes de la incubación en frío a 8 ºC - véase más adelante.]

2- Preparar las placas preparando alícuotas de 1 litro de 0,5 X medio de Murashige y Skoog en las botellas de vidrio, ajustar el pH a 5,8 con hidróxido de amonio, luego añadir 10 gramos de Phytagel. Usar un agitador magnético cuando se ajusta el pH y mezclar en el Phytagel uniformemente, luego esterilizar en autoclave sobre entorno líquido (escape lento) durante 45 minutos. 3- Verter las placas en la campana de flujo laminar usando el pipeteador eléctrico con la pipeta estéril de 50 ml

para administrar 40 ml de medio a cada placa, inmediatamente cubrir la placa con la tapa. 4- Dejar que las placas se enfríen en la campana de flujo laminar durante al menos 2 horas con el extractor apagado y guardar en bolsas de plástico fechadas a 4 ºC. 5- Marca las placas y sembrar las semillas:

1- Tapar con cinta los cuatro bordes de la placa con cinta Micropore semipermeable, marcar con la fecha y poner las placas en un equipo de estufa de incubación Percival a 22 ºC y ciclo de luz del día de 16 horas a ~100 μE/m2·s. Disponer las placas en una posición horizontal de sólo una capa de espesor e incubar durante 7 días. Fotografiar cada placa con una cámara digital y guardar los datos en un disco compacto. 2- Transferir las placas a un equipo de estufa de incubación Percival a 8 ºC y ciclo de luz del día de 24 horas a ~100 μE/m2·s, disponer las placas en una posición horizontal de sólo una capa de espesor e incubar durante hasta 3 semanas adicionales. Fotografiar cada placa con una cámara digital y guardar los datos en un disco compacto. 3- Observar las placas cada 2 a 3 días para ver cómo los germoplasmas de prueba están avanzando en comparación con controles y fotografiar digitalmente en momentos que son representativos del rendimiento general de los germoplasmas. Esto debe durar menos de 2 semanas (3 semanas como máximo) de incubación a 8 ºC. Aquellos germoplasmas que duran más en mostrar una diferencia necesitan sembrarse a una menor densidad de semillas para evitar la aglomeración en el momento en el que se toma la fotografía digital. 4- Medir el área de follaje de la roseta usando fotografía con cámara digital y el software Image-Pro Plus. Calcular el follaje de plantas de semillero promedio para poblaciones de control y de prueba, eliminar semillas del análisis que nunca germinaron. Calcular la relación entre el área de follaje de las plantas de semillero promedio después del desplazamiento de la temperatura para las plantas de semillero de control y las plantas de semillero de prueba, la desviación estándar y el error estándar para conjuntos de plantas de semillero de control y de prueba. Determinar si hay una diferencia estadística entre las plantas de semillero de prueba y las plantas de semillero de control. Registrar los resultados en un cuaderno. 5- Desechar las placas y plantas de semillero en recipientes de desechos apropiados para materiales de plantas transgénicas (cubos de basura grises con bolsas de basura de plástico transparente).

Ejemplo 7.

Productos de PCR de los genes CspA y CspB se ligaron al vector pCR-TOPO 2.1 según el protocolo del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los fragmentos de NcoI/EcoRI de los derivados de pCR-TOPO 2.1 se subclonaron en pMON48421 (Figura 7), linealizados por las mismas enzimas de restricción. Los fragmentos de NotI de los derivados de pMON48421 que engloban el promotor 35S, genes Csp y el terminador e9 se subclonaron en pMON42916 (Figura 17) en el sitio NotI para crear pMON56609 (Figura 8) y pMON56610 (Figura 9) que contienen los genes CspA y CspB, respectivamente. Dichos plásmidos se transformaron en Agrobacterium tumefaciens mediante procedimientos conocidos. Se cree que pMON56609 contiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína similar a SEC ID Nº: 7. Se cree que pMON56610 contiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína similar a SEC ID Nº: 9.

Ejemplo 8.

Preparación de Agrobacterium:

La cepa EHA105 de Agrobacterium se cultiva en línea sobre una placa de LB que contiene kanamicina 50 mg/l e higromicina 50 mg/l (denotada LB/KH). Dos días antes del co-cultivo, un bucle de Agrobacterium se transfiere a un tubo que contiene 10 ml de LB/KH y se incuba en un agitador en la oscuridad a 28 ºC durante 24 horas. Este cultivo se diluye a 1:100 en 20 ml de LB/KH y se incuba en un agitador en la oscuridad a 28 ºC durante la noche. Al día siguiente, 1 ml de dilución 1:2 de este cultivo se toma en una cubeta y se toma la DO600 con LB/KH como blanco. Calcular el volumen necesario para 5 ml de suspensión de Agrobacterium de D.O. 1,0 para el co-cultivo.

(volumen final) * (DO600 final)

Ecuación : = Volumen necesario para DO600 final de 1,0

DO600

Tomar el volumen requerido de cultivo de Agrobacterium en un tubo de centrífuga de 40 ml y centrifugar a 7000 rpm durante 7 minutos. Desechar el sobrenadante y secar el sedimento. Resuspender el sedimento en 5 ml de medio de co-cultivo (MEDIO de CC-sales basales de MS, sacarosa 20 g/l, glucosa 10 g/l, tiamina HCl 0,5 mg/l, L-prolina 115 mg/l, 2,4-D 2 mg/l) con 20 mg/l de acetosiringona.

Transformación de embriones de arroz:

Se recogieron panículas de 309 variedades de arroz Nipponbare y Taipei cultivadas en invernadero. Las panículas se esterilizaron por inmersión en el 50 % de blanqueador comercial durante 10 minutos, seguido de aclarado en agua destilada estéril. Las panículas se sometieron a tratamiento con el 70 % de alcohol durante 3 min. Entonces, las semillas se eliminaron de las panículas y se descascarillaron individualmente y se transfirieron a un tubo Falcon que contenía el 0,1 % de disolución de Tween 20. Entonces, las semillas se trataron con el 70 % de alcohol en la cámara de flujo de aire laminar. Entonces, las semillas se aclararon con agua estéril. Esto fue seguido de un tratamiento con el 50 % de blanqueador durante 45 minutos. Las semillas se aclararon 5 veces en agua destilada estéril. Finalmente, las semillas se someten a un tratamiento con el 0,1 % de cloruro mercúrico durante 5 minutos. Las semillas se lavaron de nuevo 8 veces con agua destilada estéril.

Los embriones se escindieron asépticamente de las semillas estériles en la cámara de flujo laminar y se dispusieron sobre medio de co-cultivo sólido (MEDIO de CC con 2 g/l de Phytagel). Gotas de 50 μl de la suspensión de Agrobacterium se dispusieron sobre una placa de Petri estéril. Se transfirieron 10 embriones a cada gota. La infección se dejó durante 15 minutos. La suspensión de Agrobacterium se eliminó con una punta de pipeta estéril. Los embriones infectados se transfirieron a una placa de MEDIO de CC sólido fresco y se mantuvieron en la oscuridad durante 2 días. El tercer día, los embriones se lavaron con cefotaxima 500 mg/l. Entonces, los embriones se secaron sobre papel de filtro estéril y se dispusieron sobre medio de retraso (sales basales de MS, tiamina HCl 1 mg/l, glutamina 500 mg/l, cloruro de magnesio 750 mg/l, hidrolizado de caseína 100 mg/l, sacarosa 20 mg/l, 2,4-D 2 mg/l, Pichloram 2,2 mg/l, cefotaxima 250 mg/l). Los embriones se mantienen en medio de retraso en la oscuridad durante un periodo de 7 días. Durante este periodo se forman callos. Los callos se transfieren a medio de selección (medio de retraso con 50 mg/l de higromicina) y se guardan en la oscuridad durante 10 días. Los callos se subcultivan a medio de selección fresco después de este periodo de 10 días. Después de otros 10 días, los callos se transfieren a medio de regeneración (sales basales de MS, sacarosa 30 mg/l, cinetina 2 mg/l, NAA 0,2 mg/l, cefotaxima 250 mg/l, higromicina 25 mg/l) y se mantienen en la oscuridad durante 7 días. Entonces, los callos se transfieren a medio de regeneración fresco y se cambian a un fotoperiodo de 16 horas a 30 ºC. Los brotes desarrollados sobre este callo se transfieren a medio de enraizamiento (sales basales de MS a mitad de concentración, sacarosa 15 g/l, cefotaxima 250 mg/l, higromicina 25 mg/l). Los brotes enraizados se transfieren a tubos de ensayo que contienen agua y se disponen en una cámara de niebla para endurecerse.

Las plantas se seleccionaron como positivas. Esto podría hacerse, por ejemplo, usando procedimientos similares a aquellos descritos en los Ejemplos 12-14 y 26-29 que incluyen procedimientos de cultivo descritos para crear la siguiente generación de plantas transgénicas.

Ejemplo 9.

Respuesta al estrés por frío en el estadio de tres hojas - Plantas transgénicas de arroz para CspB y CspA

Preparación del material de planta:

Germinación: Se esterilizaron semillas tratando con 0,01 por ciento de cloruro mercúrico durante 3 minutos y se lavaron minuciosamente durante diez veces en agua MilliQ para eliminar las trazas de cloruro mercúrico. Se dejó que las semillas esterilizadas se empaparan poniéndolas en remojo en agua MilliQ durante 3 horas. Las semillas empapadas germinaron sobre un papel de filtro húmedo esterilizado a 30 ºC de temperatura y al 60 % de HR usando un germinador de semillas (Serwell Instruments Inc.).

Establecimiento de plantas de semillero en el estadio de tres hojas: Las plantas de semillero germinadas de tres días de edad se transfirieron a bandejas (52,5 mm (longitud) x 26 mm (profundidad) x 5,2 mm (diámetro)) en el invernadero que tenía intensidad de luz de 800 micromol.m2/s y 60 % de HR. Las plantas de semillero se cultivaron hasta el estadio de tres hojas (aproximadamente durante 12 días) en bandejas que contenían tierra de marga arenosa roja. Se aplicó disolución de fertilizante a las plantas de semillero una vez a la semana hasta la completitud de los experimentos (N-75 PPM, P-32 PPM, K-32 PPM, Zn-8 PPM, Mo-2 PPM, Cu-0,04 PPM, B-0,4 PPM y Fe-3,00 PPM).

Análisis de plantas R2 de CspB

Protocolo: Plantas de semillero de arroz en el estadio de tres hojas (12 días de edad) se sometieron a un estrés por frío de 10 ºC durante 4 días en presencia de 100 micromol/m2/s de luz y el 70 % de HR (cámara de crecimiento Percival). Después del tratamiento del estrés se dejó que las plantas se recuperaran en el invernadero durante 10 días y en el 10º día el crecimiento se registraron las observaciones para plantas supervivientes y evidencias fotográficas. Cada tratamiento tuvo 10 replicaciones por línea y se aleatorizaron completamente.

Resultados: Entre las ocho líneas diferentes probadas para tolerancia al estrés por frío, seis líneas presentaron significativamente mayor tolerancia al frío en comparación con la natural. Las líneas que incluyen R2-226-6-9-3, R2226-29-1-1, R2-257-20-2-1, R2-238-1-1-3, R2-230-4-4-2 y R2-257-3-1-3 mostraron alta tolerancia al frío presentando alto crecimiento de recuperación y menos porcentaje de reducción en el crecimiento (con respecto a control no estresado) en comparación con la natural (Tabla -1, placa-1). La línea R2-230-4-42 ha rendido extremadamente bien, presentó el 100 por ciento de supervivencia y mantuvo un buen crecimiento durante la recuperación (Tabla 1).

Tabla 1. Observaciones del crecimiento de recuperación del estrés por frío en el estadio de tres hojas de líneas transgénicas R2 de CspB.

Líneas: % Supervivencia al final de la recuperación Altura de la planta (cm) Estresada Sin estresar % Reducción en la altura de la planta con respecto a sin estresar

R2-257-17-1-1: 13 21,5 ± 11 43,44 ± 4,09 50,38

R2-230-34-1-2: 53 20,78 ± 6,3 45,0 ± 3,51 53,82

R2-226-6-9-3: 60 27,5 ± 7 33,74 ± 4,65 18,49

R2-226-29-1-1: 53 27,6 ± 0,7 35,22 ± 4,06 21,63

R2-257-20-2-1: 93 32,39 ± 5,48 44,0 ± 2,95 27,27

R2-238-1-1-3: 80 29,25 ± 8,19 40,72 ± 5,8 25

R2-230-4-4-2: 100 33,95 ± 4,10 45 ± 3,98 24

R2-257-3-1-3: 40 29,80 ± 2,66 42 ± 4,11 28,5

WT- Taipei: 26 23,93 ± 5,61 45,0 ± 3,7 46,6

(Índice: WT = Natural)

Análisis de plantas R3 de CspB

Protocolo: Plantas de semillero en el estadio de tres hojas se expusieron a estrés por frío de 8 grados Celsius

5 durante 1 día en presencia de 1000 micromol/m2/s de luz. Después se dejó que las plantas de semillero se recuperaran a 28 grados Celsius en el invernadero durante 15 días y al final de la recuperación se registró la altura de la planta.

Resultados: Se probaron ocho líneas diferentes para tolerancia al estrés por frío y las ocho líneas mostraron tolerancia mejorada en comparación con plantas naturales (no transgénicas). Estos resultados confirmaron los datos

10 del análisis de R2 que muestran tolerancia mejorada al frío (Tabla 2).

Tabla 2: Observaciones del crecimiento de recuperación del estrés por frío en el estadio de tres hojas de líneas transgénicas R3 de CspB.

Líneas: Altura de la planta estresada (cm) al final de la recuperación Altura de la planta sin estresar (cm) al final de la recuperación Porcentaje de reducción en la altura de la planta con respecto a sin estresar

R3-226-6-9-3: 28,8 ± 2,88 29,34 ± 7,20 1,84

R3-226-29-1-34: 30,18 ± 3,19 32,07 ± 3,79 5,89

R3-230-4-4-2-1: 30,42 ± 2,16 35,09 ± 4,19 13,30

R3-230-34-1-2-1: 32,14 ± 3,41 37,4 ± 5,68 14,01

R3-238-1-1-3-4: 29,54 ± 3,61 32,2 ± 3,56 8,26

R3-257-3-1-3-1: 27,12 ± 3,38 30,86 ± 3,82 12,11

R3-257-15-1-1-2: 23,84 ± 2,85 26,71 ± 1,92 10,74

R3-257-20-2-1-1: 33,8 ± 3,48 38,82 ± 1,97 12,93

WT - Taipei: 23,9 ± 3,74 36,65 ± 4,01 34,78

Análisis de plantas R2 de CspA

Protocolo: Plantas de semillero de arroz en el estadio de tres hojas (12 días de edad) se sometieron a un estrés por 15 frío de 10 ºC durante 3 días en presencia de 1000 micromol/m2/s y el 70 % de HR en una cámara de crecimiento.

Después del tratamiento del estrés se dejó que las plantas se recuperaran en el invernadero durante 15 días y en el 15º día se registraron las observaciones del crecimiento. Cada valor es un promedio de 12 observaciones y el experimento se realizó por el siguiente diseño experimental completamente aleatorizado (DCA).

Resultados: De las siete líneas transgénicas de CspA independientes probadas, 6 líneas mostraron tolerancia

5 mejorada al frío en comparación con la natural. En este experimento, la altura de la planta se redujo a próxima al 50 % en las plantas de control tratadas con frío (WT) en comparación con plantas sin estresar. Mientras tanto, en las plantas transgénicas con el gen CspA la reducción en la altura de la planta tras el tratamiento con frío varió del 4,5 % al 22,50 % entre diferentes líneas independientes (excepto una línea en la que la reducción en el crecimiento fue el 47,09 %). Estos resultados sugieren que CspA mejora la tolerancia al frío de arroz (Tabla 3).

10 Tabla 3: Observaciones del crecimiento de recuperación del estrés por frío en el estadio de tres hojas de líneas de arroz transgénico R2 de CspA.

Líneas: Altura de la planta al final de la recuperación (cm) Estresada Sin estresar Porcentaje de reducción en la altura de la planta con respecto a sin estresar

R2-362-3-1-2: 28,75 ± 3,11 30,08 ± 2,9 4,5

R2-328-2-1-1: 29,5 ± 2,92 35,58 ± 3,12 17,08

R2-362-7-1-2: 15,83 ± 2,92 29,92 ± 1,73 47,09

R2-365-4-5-3: 26,08 ± 3,75 32,08 ± 2,27 18,7

R2-362-6-1-6: 27,17 ± 2,25 32,00 ± 1,76 15,05

R2-362-3-1-10: 29,58 ± 3,50 38,17 ± 2,59 22,50

R2-362-7-1-2: 24,58 ± 3,42 27,25 ± 2,01 9,79

WT-Nipponbare: 20,58 ± 1,73 37,92 ± 8,59 46,05

Análisis de plantas R3 de CspA

Experimento I

Protocolo: Plantas de semillero en el estadio de tres hojas se expusieron a estrés por frío de 10 grados Celsius

15 durante 3 días en presencia de 1000 micromol de luz. Después se dejó que las plantas de semillero se recuperaran a 28 grados Celsius en el invernadero durante 30 días y al final de la recuperación se registraron la altura de la planta y el porcentaje de supervivencia de las plantas de semillero (En este experimento se usaron 8 replicaciones para cada línea transgénica y se usaron 10 replicaciones para natural).

Resultados: Las seis líneas transgénicas sometidas a estrés por frío rindieron mejor bajo estrés por frío que la

20 natural. Estos resultados confirmaron adicionalmente los datos de análisis de R2 demostrando tolerancia al frío mejorada (Tabla 4).

Tabla 4: Observaciones del crecimiento de recuperación del estrés por frío en el estadio de tres hojas de líneas de arroz transgénico R3 de CspA.

Líneas: Altura de la planta estresada (cm) al final de la recuperación Altura de la planta sin estresar (cm) al final de la recuperación Porcentaje de reducción en la altura de la planta con respecto a sin estresar Porcentaje de la supervivencia de plantas de semillero

R3-362-3-1-2-2: 25,5 ± 4,46 32,25 ± 5,03 20,93 100

R3-362-3-1-3-2: 25,62 ± 3,36 34,43 ± 6,24 25,58 66

R3-365-10-1-2-3: 27,35 ± 3,24 33,75 ± 4,58 18,96 100

R3-362-6-1-2-1: 28 ± 2,45 34,45 ± 2,29 18,72 100

R3-362-7-1-2-3: 27,5 ± 24,17 29,94 ± 5,03 8,1 100

R3-362-7-1-3-3: 27,88 ± 4,22 31,92 ± 2,89 12,65 100

WT-Nipponbare: 26,25 ± 3,95 36,34 ± 4,06 27,76 40

Nota: La altura de la planta sólo se registró para plantas supervivientes y sus promedios se facilitan anteriormente.

Experimento II

Protocolo: Plantas de semillero en el estadio de tres hojas se expusieron a estrés por frío de 10 grados Celsius durante 1 día en presencia de 1000 micromol de luz. Después se dejó que las plantas de semillero se recuperaran a 28 grados Celsius en el invernadero durante 30 días y al final de la recuperación se registraron la altura de la planta

5 y el porcentaje de supervivencia de las plantas de semillero.

Resultados: Las cinco líneas transgénicas sometidas a estrés por frío rindieron mejor bajo estrés por frío que la natural. Estos resultados confirmaron adicionalmente los datos de análisis de R2 mostrando tolerancia mejorada al frío (Tabla 5).

Tabla 5: Observaciones del crecimiento de recuperación del estrés por frío en el estadio de tres hojas de líneas de 10 arroz transgénico R3 de CspA.

R3-362-3-1-2-2: 32,76 ± 3,49 32,25 ± 5,03 Cero

R3-362-3-1-3-2: 36,11 ± 2,04 34,43 ± 6,24 Cero

R3-365-10-1-2-3: 35,85 ± 2,94 33,75 ± 4,58 Cero

R3-362-6-1-2-1: 21,54 ± 5,84 34,45 ± 2,29 37,4

R3-362-7-1-2-3: 32,55 ± 2,73 29,94 ± 5,03 Cero

R3-362-7-1-3-3: 32,17 ± 3,27 31,92 ± 2,89 Cero

WT-Nipponbare: 31,92 ± 2,66 36,34 ± 4,06 12,16

Respuesta al estrés por calor en el estadio de tres hojas

Preparación del material de planta:

Germinación: Se esterilizaron semillas tratando con 0,01 por ciento de cloruro mercúrico durante 3 minutos y se lavaron minuciosamente (~diez veces en agua desionizada) para eliminar las trazas de cloruro mercúrico. Se dejó

15 que las semillas esterilizadas se empaparan poniéndolas en remojo en agua MilliQ durante 3 horas. Las semillas empapadas germinaron sobre un papel de filtro húmedo esterilizado a 30 ºC de temperatura y 60 % de HR usando un germinador de semillas (Serwell Instruments Inc.).

Establecimiento de plantas de semillero en el estadio de tres hojas: Las plantas de semillero germinadas de tres días de edad se transfirieron a bandejas (52,5 mm (longitud) x 26 mm (profundidad) x 5,2 mm (diámetro)) en el

20 invernadero que tenía intensidad de luz de 800 micromol./m2/s y 60 % de HR. Las plantas de semillero se cultivaron hasta el estadio de tres hojas (aproximadamente durante 12 días) en bandejas que contenían tierra roja. Se pulverizó disolución de fertilizante a las plantas de semillero una vez a la semana hasta la completitud de los experimentos (N-75 PPM, P-32 PPM, K-32 PPM, Zn-8 PPM, Mo-2 PPM, Cu-0,04 PPM, B-0,4 PPM y Fe-3,00 PPM).

Análisis de plantas R2 de CspA

25 Protocolo: Plantas de semillero de arroz en el estadio de tres hojas (12 días de edad) se sometieron a estrés por calor de 50 ºC durante 3 horas en presencia de 70 % de HR. Después del tratamiento del estrés se dejó que las plantas se recuperaran en el invernadero durante 15 días y en el 15º día se registraron las observaciones del crecimiento. Cada valor es un promedio de 12 observaciones.

Resultados: De las siete líneas transgénicas CspA independientes probadas, 6 líneas mostraron tolerancia al calor

30 mejorada en comparación con la natural. En este experimento, la altura de la planta se redujo más del 50 % en plantas de control tratadas con calor (WT) en comparación con plantas no estresadas. Mientras tanto, en las plantas transgénicas con el gen CspA la reducción en la altura de la planta tras el tratamiento con calor varió del 9,5 % al 35 % entre diferentes líneas independientes. Estos resultados sugieren que CspA mejora la tolerancia al calor del arroz (Tabla 6).

Tabla 6: Observaciones del crecimiento de recuperación del estrés por calor en el estadio de tres hojas de líneas de arroz transgénico R2 de CspA.

R2-362-3-1-2: 26,67 ± 4,97 30,08 ± 2,9 11,33

R2-328-2-1-1: 26,17 ± 3,49 35,58 ± 3,12 26,41

R2-362-7-1-2: 25,17 ± 1,94 29,92 ± 1,73 15,87

R2-365-4-5-3: 20,83 ± 1,17 32,08 ± 2,27 35,06

R2-362-6-1-6: 23,17 ± 1,83 32,00 ± 1,76 27,59

R2-362-3-1-10: 29,33 ± 5,01 38,17 ± 2,59 23,15

R2-362-7-1-2: 24,67 ± 2,8 27,25 ± 2,01 9,4

WT-Nipponbare: 18,5 3,51 37,92 ± 8,59 51,21

Análisis de plantas R3 de CspB

Protocolo: Plantas de semillero en el estadio de tres hojas se expusieron a estrés por alta temperatura de 53 grados 5 Celsius durante 2 horas y después se dejó que las plantas de semillero se recuperaran a 28 grados Celsius en el invernadero durante 15 días y al final de la recuperación se registró la altura de la planta.

Resultados: De las ocho líneas transgénicas probadas, siete líneas rindieron mejor bajo estrés por calor probado en comparación con la natural. Estos resultados sugieren que CspB mejora la tolerancia al calor del arroz (Tabla 7).

Tabla 7: Observaciones del crecimiento de recuperación del estrés por calor en el estadio de tres hojas de líneas de 10 arroz transgénico R3 de CspB.

R3-226-6-9-3: 34,53 ± 2,14 35,54 ± 2,07 2,84

R3-226-29-1-3-4: 32,38 ± 1,47 37,06 ± 2,92 12,62

R3-230-4-4-2-1: 28,78 ± 4,16 35,06 ± 2,07 17,41

R3-230-34-1-2-1: 33,3 ± 3,94 37,6 ± 3,05 11,43

R3-238-1-1-3-4: 33,96 ± 2,06 41,2 ± 3,83 17,57

R3-257-3-1-3-1: 33,76 ± 3,74 35,4 ± 2,07 4,63

R3-257-15-1-1-2: 25,68 ± 4,27 38,2 ± 3,11 32,77

R3-257-20-2-1-1: 34,78 ± 1,7 42,2 ± 2,97 17,5

WT - Taipei: 25,5 ± 2,97 36,65 ± 4,8 30,42

Análisis de plantas R3 de CspA

Experimento I

Protocolo: Plantas de semillero en el estadio de tres hojas se expusieron a estrés por alta temperatura de 53 grados Celsius durante 3 horas y después se dejó que las plantas de semillero se recuperaran a 28 grados Celsius en el 15 invernadero durante 30 días y al final de la recuperación se registró la altura de la planta.

Resultados: Estos resultados confirmaron los datos del análisis de R2 mostrando tolerancia al calor mejorada (Tabla 8).

Tabla 8: Observaciones del crecimiento de recuperación del estrés por calor en el estadio de tres hojas de líneas de arroz transgénico R3 de CspA.

R3-362-3-1-2-2: 31,07 ± 7,01 32,25 ± 5,03 3,6

R3-362-3-1-3-2: 30,28 ± 4,74 34,43 ± 6,24 12,05

R3-365-10-1-2-3: 24,23 ± 7,60 33,75 ± 4,58 28,20

R3-362-6-1-2-1: 26,93 ± 2,97 34,45 ± 2,29 21,82

R3-362-7-1-2-3: 29,52 ± 2,61 29,94 ± 5,03 1,40

R3-362-7-1-3-3: 21,30 ± 6,37 31,9 ± 2,89 33,27

WT-Nipponbare: 22,68 ± 2,96 36,34 ± 4,06 37,58

Experimento II

Protocolo: Plantas de semillero en el estadio de tres hojas se expusieron a estrés por alta temperatura de 50 grados

5 Celsius durante 1 hora en presencia de 1000 micromol de luz y después se dejó que las plantas de semillero se recuperaran a 28 grados Celsius en el invernadero durante 30 días y al final de la recuperación se registró la altura de la planta.

Resultados: Estos resultados confirmaron los datos de los análisis de R2 mostrando tolerancia al calor mejorada (Tabla 9).

10 Tabla 9: Observaciones del crecimiento de recuperación del estrés por calor en el estadio de tres hojas de líneas de arroz transgénico R3 de CspA.

Líneas: Altura de la planta estresada (cm) al final de la recuperación Altura de la planta sin estresar (cm) al final de la recuperación Porcentaje de reducción en altura de la planta con respecto a sin estresar

R3-362-3-1-2-2: 31,57 ± 2,39 32,25 ± 5,03 2,10

R3-362-3-1-3-2: 34,20 ± 3,87 34,43 ± G,24 0,6

R3-365-10-1-2-3: 31,63 ± 4,32 33,75 ± 4,58 6,28

R3-362-6-1-2-1: 19,72 ± 6,76 34,45 ± 2,29 42,75

R3-362-7-1-2-3: 32,18 ± 3,25 29,94 ± 5,03 Cero

R3-362-7-1-3-3: 32,80 ± 1,51 31,92 ± 2,89 Cero

WT-Nipponbare: 28,20 ± 2,79 36,34 ± 4,06 22,39

Respuesta al estrés por agua

Preparación del material de planta:

Germinación: Se esterilizaron semillas tratando con 0,01 por ciento de cloruro mercúrico durante 3 min, después se

15 lavaron minuciosamente durante diez veces en agua MilliQ para eliminar las trazas de cloruro mercúrico. Se dejó que las semillas esterilizadas se empaparan poniéndolas en remojo en agua MilliQ durante 3 horas. Las semillas empapadas germinaron sobre un papel de filtro húmedo esterilizado a 30 ºC de temperatura y 60 % de HR usando un germinador de semillas (Serwell Instruments Inc.).

Análisis de plantas R2 de CspB

20 Protocolo experimental

Las plantas de semillero germinadas (3 días de edad) se transfirieron a dos niveles diferentes de estrés por agua, creados en macetas de PVC que contenían vermiculita, que se mide en términos de capacidad de campo (CC). El 100 % de la CC es una condición saturada (es decir, 100 g de vermiculita requieren 350 ml de agua) (Sharp y col., 1988, Plant Physiol. 87: 50 -57). Se crearon los diferentes niveles de estrés por agua (es decir, 50 % de CC y 25 % de CC) en una maceta de PVC que contenía vermiculita añadiendo la cantidad requerida de agua. El estado del agua en diferentes niveles de estrés se mantuvo constantemente añadiendo cada día la cantidad de agua perdida

5 debido a la evapotranspiración, durante todo el experimento. Se dejó que las plantas de semillero se cultivaran durante 15 días en la condición de estrés por agua en el invernadero en presencia de 800 micromol/m2/s de intensidad de luz y 60 % de HR. En el 15º día se registraron el crecimiento de raíces y brotes y se tomaron fotografías. Cada tratamiento tuvo 10 replicaciones por línea y se aleatorizaron completamente.

El porcentaje de reducción en el crecimiento se calculó adoptando la siguiente fórmula.

Crecimiento de raíz / brote de control absoluto -Crecimiento de raíz / brote del 25% de CC

% de reducción = x100

10 Crecimiento de raíz / brote de control absoluto con respecto al control

Resultados: Cuatro líneas transgénicas de CspB diferentes se analizaron para tolerancia al estrés por agua. Todas las líneas transgénicas de CspB probadas presentaron crecimiento significativamente mayor durante el estrés en comparación con las plantas naturales. Las líneas transgénicas que incluyen R2-257-15-1-1, R2-238-1-1-3, R2-2573-1-6 y R2-226-6-9-3 presentaron menor porcentaje de reducción en el crecimiento de raíces y brotes con respecto a 15 control sin estresar (CC - 100 %). La reducción en el crecimiento de raíces y brotes en estas líneas osciló entre el 11 y el 25 %. Mientras tanto, las plantas naturales presentaron máxima reducción en el crecimiento, que es próximo al 50 %. Estos resultados sugieren que CspA mejora la tolerancia al estrés por agua del arroz (Tabla - 10 y Tabla - 11).

Tabla 10: Comparación del crecimiento de raíces y brotes al final del estrés por agua de líneas transgénicas de CspB y la natural.

Líneas: CC - 100 % CC - 50 % CC - 25 %

Raíz: Brote R:B Raíz Brote R:B Raíz Brote R: B

R2-257-15-1-1: 9,2 ± 2,2 24,3 ± 2 ,37 9 ± 1,27 23,7 ± 1,5 ,37 8,1 ± 1,5 18,5 ± 2,2 ,43

R2-238-1-1-3: 9,65 ± 2,7 26,3 ± 13,8 ,36 8,35 ± 1,56 22,9 ± 1,26 ,36 7,15 ± 1,0 18,1 ± 1,6 ,39

R2-257-3-1-6: 7,35 ± 2,2 26,1 ± 1,31 ,28 6,4 ± 1,15 23,0 ± 1,57 ,27 6,9 ± 1,07 19,5 ± 1,96 ,35

R2-226-6-9-3: 8,95 ± 1,82 25,05 ± 1,6 ,35 7,4 ± 1,2 19,0 ± 2,24 ,38 7,25 ± 1,5 17,4 ± 2,15 ,41

WT - Taipei: 9,2 ± 1,62 24,6 ± 1,58 ,37 7,4 ± 1,66 22,4 ± 0,97 ,33 6,58 ± 0,9 12,8 ± 3,2 ,51

(Índice: WT = natural, R:B = relación raíz con respecto a brote)

Tabla 11: Comparación del porcentaje de reducción en el crecimiento de raíz y brote de líneas transgénicas de CspB y la natural.

Líneas: % de reducción en el crecimiento de raíces % de reducción en el crecimiento de brotes % de reducción en el crecimiento de raíces y brotes

R2-257-15-1-1: 11 23,8 20

R2-238-1-1-3: 25 31 30

R2-257-3-1-6: 6 25,2 21

R2-226-6-9-3: 19 30,5 27,5

WT - Taipei: 28,4 47,9 42,8

Análisis de plantas R2 de CspA

a. Preparación del material de planta:

25 Germinación: Se esterilizaron semillas tratando con 0,01 por ciento de cloruro mercúrico durante 3 minutos y se lavaron minuciosamente durante diez veces en agua MilliQ para eliminar las trazas de cloruro mercúrico. Se dejó que las semillas esterilizadas se empaparan poniéndolas en remojo en agua MilliQ durante 3 horas. Las semillas empapadas germinaron sobre un papel de filtro húmedo esterilizado a 30 ºC de temperatura y 60 % de HR usando un germinador de semillas (Serwell instruments Inc.).

Establecimiento de plantas de semillero en el estadio de tres hojas: Las plantas de semillero germinadas de tres días de edad se transfirieron a bandejas (52,5 mm (longitud) x 26 mm (profundidad) x 5,2 mm (diámetro)) en el invernadero que tenía intensidad de luz de 800 micromol/m2/s y 60 % de HR. Las plantas de semillero se cultivaron

5 hasta el estadio de tres hojas (aproximadamente durante 12 días) en bandejas que contenían tierra de marga arenosa roja. Se pulverizó disolución de fertilizante a las plantas de semillero una vez a la semana hasta la completitud de los experimentos (N- 75 PPM, P-32 PPM, K-32 PPM, Zn-8 PPM, Mo-2 PPM, Cu-0,04 PPM, B-0,4 PPM y Fe-3,00 PPM).

Protocolo: Plantas de semillero de un mes de edad se sometieron a estrés por agua durante tres días en presencia

10 de 800 micromol/m2/s de luz y 60 % de HR en el invernadero. El estrés por agua se impuso reteniendo la irrigación. Al final de los tres días, las plantas empezaron a mostrar el síntoma de marchitamiento. El estrés se alivió irrigando las plantas con agua y 24 horas después se registraron las observaciones en porcentaje de plantas que mostraron síntoma de marchitamiento. Un mínimo de 12 plantas se mantuvo por línea por tratamiento.

Resultados: De las siete líneas transgénicas de CspA independientes probadas, 6 líneas mostraron tolerancia al

15 estrés por agua mejorada en comparación con la natural. El sesenta y seis por ciento de las plantas de control no se recuperaron del marchitamiento después de la irrigación. Mientras tanto, en las plantas transgénicas de CspA, el porcentaje de plantas que mostraron síntomas de marchitamiento después de la irrigación varió del 5 % al 43 % entre diferentes líneas independientes (excepto una línea en la que el porcentaje de plantas que mostraron marchitamiento fue del 85 %). Estos resultados sugieren que CspA mejora la tolerancia al estrés por agua en arroz

20 (Tabla 12).

Tabla 12: Respuesta al estrés por agua de líneas de arroz transgénico R2 de CspA.

Líneas: Porcentaje de plantas que muestran marchitamiento

R2-362-3-1-2: 17

R2-328-2-1-1: 43

R2-362-7-1-2: 85

R2-365-4-5-3: 5

R2-362-6-1-6: Cero

R2-362-3-1-10: 15

R2-362-7-1-2: 8

WT - Nipponbare: 66

Respuesta al estrés por sales

Análisis de plantas R3 de CspB

Protocolo: Plantas de semillero germinadas (48 h de edad) se sometieron a estrés por salinidad transfiriéndolas a

25 macetas de PVC con vermiculita que contenían 200 mM de NaCl y se cultivaron durante 10 días. Después de 10 días de estrés se dejó que las plantas de semillero se recuperaran durante 15 días transfiriéndolas a nuevas bandejas de vermiculita que contenían agua. La observación del crecimiento tal como la altura de la planta se registró al final de la recuperación. Este experimento se realizó en el invernadero siguiendo el diseño completamente aleatorizado (DCA) y se mantuvieron ocho replicaciones por tratamiento.

30 Resultados: Siete líneas transgénicas de CspB y plantas naturales se sometieron a estrés por NaCl 200 mM. Bajo esta condición, cinco líneas transgénicas rindieron mejor en comparación con la natural. Estos resultados sugieren que CspB mejora la tolerancia de plantas de arroz al estrés por sales (Tabla 13).

Tabla 13: Observaciones del crecimiento de recuperación al estrés por sales de líneas de arroz transgénico R2 de CspA.

R3-226-6-9-3: 12,68 ± 2,83 23,48 ± 3,85 45,99

R3-226-29-1-3-4: 19,24 ± 3,46 25,54 ± 3,64 24,66

(continuación)

R3-230-4-4-2-1: 15,39 ± 3,05 25,2 ± 2,14 38,92

R3-230-34-1-2-1: 15,78 ± 3,31 23,26 ± 1,98 32,15

R3-238-1-1-3-4: 13,41 ± 2,73 23,63 ± 4,61 43,25

R3-257-3-1-3-1: 21,07 ± 3,28 28,95 ± 4,37 27,64

R3-257-20-2-1-1: 19,01 ± 3,98 26,35 ± 2,84 27,85

WT - Taipei: 14,71 ± 2,28 27,43 ± 2,75 46,37

Ensayo de estrés por agua de R3

Plantas de semillero germinadas (3 días de edad) de cuatro líneas independientes transgénicas (1, 2, 3, 4) de CspA y natural (Nipponbare – Número 5) se sometieron a estrés por agua transfiriéndolas a una maceta que contenía 5 vermiculita. Se mantuvieron tres niveles de pautas de agua, tienen el 100 % de capacidad de campo (CC-100 = 3,72 ml de agua / g de vermiculita)

25 % de capacidad de campo (CC25 = 0,93 ml de agua / g de vermiculita), 15 % de capacidad de campo (CC15 = 0,558 ml / g de vermiculita). Las plantas de semillero se cultivaron en diferentes pautas de agua durante 30 días en presencia de 800 micromol/m2/s de intensidad de luz y 60 % de HR en el invernadero. El estado de agua en

10 diferentes niveles de estrés se mantuvo constantemente añadiendo cada día la cantidad de agua perdida debido a la vapotranspiración, durante todo el experimento. Al final del 30º día se dejó que las plantas se recuperaran añadiendo agua para llevarlas al nivel de CC100 y se mantuvo durante 15 días. Durante el experimento se registraron observaciones de crecimiento tales como altura de la planta (alt. pl.) al final del estrés (ES) y longitud de raíces (R) y brotes (B) y peso seco al final de la recuperación.

15 Cada tratamiento tuvo 10 replicaciones por línea y se aleatorizaron completamente.

Tabla 14: Longitud de brotes y raíces promedio (cm) al final de la recuperación

Código de línea: Líneas CC100_Raíz CC100_Brote CC25_Raíz CC25_Brote CC15_Raíz CC15_Brote

1: R2-362-3-1-3-4 24,5 ± 1,9 49,1 ± 36 17,0 ± 2,6 34,5 ± 2,4 125 ± 1,4 31,2 ± 1,8

2: R2-362-6-1-2-2 213 ± 1,3 456 ± 1,5 17,5 ± 1,8 31,5 ± 1,5 17,6 ± 2,3 32,0 ± 0,7

3: R2-362-7-1-3-3 24,5 ± 1,3 47,6 ± 3,3 17,8 ± 2,0 33,5 ± 1,7 15,9 ± 1,7 31,9 ± 1,7

4: R2-365-10-1-2-1 24,03 ± 1,5 44,4 ± 2,2 138 ± 1,3 30,24 ± 1,1 13,9 ± 1,3 28,9 ± 0,9

5: WT-Nipponbare 23,84 ± 1,25 44,8 ± 2,0 129 ± 1,8 31,6 ± 1,2 13,9 ± 1,9 31,5 ± 1,2

Tabla 15: Peso seco de brotes y raíces promedio (mg) al final de la recuperación

1: R2-362-3-1-3-4 231 ± 21,8 563,9 ± 60,7 57,6 ± 6,8 189 ± 16,3 44,7 ± 6,3 152,9 ± 22,1

2: R2-362-6-1-22 22,6 ± 14,2 531,8 ± 63 72,1 ± 5,1 179,8 ± 17 53,9 ± 7,9 146,3 ± 21,1

3: R2-362-7-1-3-3 229,5 ± 30,2 533 ± 48,5 66,1 ± 11,9 183 ± 13,9 60,6 ± 5,7 147,4 ± 14,7

4: R2-366-10-1-2-1 219 ± 43,5 567 ± 71,9 56,2 ± 9,3 173,9 ± 27,3 47,3 ± 3,1 133,7 ± 7,7

5: WT-Nipponbare 226 ± 34,5 525 ± 31,3 61,1 ± 4,2 151,1 ± 16,8 45,2 ± 7,5 132,2 ± 11,03

Tabla 16: Longitud de brotes promedio (cm) al final del estrés

Código de línea: Líneas CC100 CC25 CC15

1: R2-362-3-1-3-4 42 ± 4,6 28,4 ± 1,7 27,4 ± 2,1

2: R2-362-6-1-2-2 40,4 ± 2,1 26,1 ± 1,1 25,2 ± 2,2

3: R2-362-7-1-3-3 40,1 ± 2,7 27 ± 2,0 26,3 ± 1,4

4: R2-365-10-1-2-1 38,9 ± 2,3 26,3 ± 1,6 23,3 ± 2,4

5: WT- Nipponbare 39,5 ± 1,05 24,2 ± 2,0 24,7 ± 1,9

Ejemplo 10.

cspA

Construcción de pMON73607 (Figura 10)

5 1. Cortar el vector pMON61322 con NcoI y ApaI para abrir el esqueleto y abandonar el gen Csp A. Aislar el fragmento de esqueleto por purificación en gel.

2. Amplificar por PCR el gen cspA de E. coli del vector pMON56609 (Figura 8). Los cebadores de PCR usados dejaron el sitio NcoI en el extremo 5' del gen y crearon un sitio SwaI y ApaI en el extremo 3'.

3. Ligar el fragmento de PCR y el esqueleto de pMON61322 (Figura 11). Transformar en células DH5a de 10 eficiencia en bibliotecas. Cribar las colonias usando ApaI y NcoI para identificar clones con insertos.

4. Secuenciar el vector para confirmar la fidelidad del gen CspA y otras regiones seleccionadas del plásmido.

cspB

Construcción de pMON73608 (Figura 12)

15 1. Cortar el vector pMON61322 con NcoI y ApaI para abrir el esqueleto y abandonar el gen HVA1. Aislar el fragmento de esqueleto por purificación en gel.

2. Amplificar por PCR el gen cspB de Bacillus subtilis del vector pMON56610. Los cebadores de PCR usados dejaron el sitio NcoI en el extremo 5' del gen y crearon un sitio SwaI y ApaI en el extremo 3'.

3. Ligar el fragmento de PCR y el esqueleto de pMON61322. Transformar en células DH5a de eficiencia en 20 bibliotecas. Cribar las colonias usando ApaI y NcoI para identificar clones con insertos.

4. Secuenciar el vector para confirmar el gen CspB y otras regiones seleccionadas del plásmido.

Ejemplo 11. Transformación de plantas de maíz.

Las plantas de maíz pueden transformarse mediante procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, véanse los Ejemplos 20-25 en el presente documento.

25 Ejemplo 12.

El análisis de plantas transgénicas para el número de copias se hará del siguiente modo.

Se recoge tejido de hoja de una hoja joven, de tan próxima a la base como sea posible, y de un lado de la hoja. Las muestras se colocan en placas de 96 pocillos liofilizadas durante la noche. Los tejidos se homogeneízan disponiendo tres bolas de metal de 3 mm en cada pocillo y agitando usando un Mega Grinder a 1200 rpm durante 2

30 minutos. Se extrae ADN usando tampones convencionales que contienen beta-mercaptoetanol, Tris tamponada a pH 8, EDTA, NaCl y dodecilsulfato de sodio. La extracción se realiza con acetato de potasio seguido de cloroformo y la precipitación se realiza con isopropanol. Tras la centrifugación, lavar con disolución de etanol y secar, el ADN se resuspende en tampón Tris-EDTA antes del posterior análisis.

El ADN se digiere con múltiples endonucleasas de restricción y los fragmentos se separan por electroforesis en gel

35 de agarosa no desnaturalizante. El ADN se desnaturaliza por disolución de NaOH. El gel se neutraliza en tampón Tris que contiene NaCl y se transfiere a filtros de nailon por acción capilar. Los filtros de nailon se hibridan previamente en disolución tamponada que contiene ADN de esperma de salmón antes de la adición de sondas apropiadas, tanto radiactivas como marcadas con DIG. Tras la hibridación, las transferencias se lavan y se detectan por exposición a película de autorradiografía o detección de DIG con conjugados de anticuerpo anti-DIG y sustratos

40 apropiados.

Ejemplo 13.

Los presentes inventores están usando el marco de lectura abierto de longitud completa de cspA y cspB para la expresión en E. coli usando vectores (Novagen, una filial de Merck KgaA, Darmstadt, Alemania) que permite la síntesis y purificación de antígeno marcado con His. El antígeno purificado se usará para generar anticuerpos policlonales usando un proveedor comercial, por ejemplo, Strategic Biosolutions. Se usarán anticuerpos producidos para probar plantas para la expresión de proteínas CSP.

Ejemplo 14.

Avance de líneas de maíz transgénico. Se generan transformantes primarios en germoplasma tal como MAÍZ DE GERMOPLASMA A, MAÍZ DE GERMOPLASMA C y MAÍZ DE GERMOPLASMA D. Los transformantes primarios se autofecundan, además de retrocruzarse, con plantas no transgénicas del mismo genotipo consanguíneo. La semilla de plantas autofecundadas se planta en el campo y se ensaya por ensayo de cigosidad de Taqman para identificar selecciones homocigóticas putativas, selecciones heterocigóticas putativas y selecciones negativas. Las selecciones heterocigóticas putativas se cruzan con múltiples plantas de probadores apropiados, por ejemplo, MAÍZ DEGERMOPLASMA B y MAÍZ DE GERMOPLASMA D. Se recoge la semilla híbrida, se pela a mano y se reúnen por selección. También pueden emplearse otros procedimientos de cultivo, por ejemplo, véase el Ejemplo 29 en el presente documento.

Ejemplo 15.

Plantas de semillero recibirán un tratamiento que limita el agua disponible a un nivel inferior al óptimo de forma que el tratamiento produzca una respuesta fenotípica medible. Por ejemplo, este tratamiento podría tomar la forma de restringir la cantidad de agua durante varios días que conduce a una deficiencia de agua progresiva, o la forma de una deficiencia aguda estresando osmóticamente las plantas de semillero hidropónicamente o con un tratamiento con sales. Se cribarán plantas positivas para transgén para una respuesta fenotípica mejorada al tratamiento. Las respuestas fenotípicas medidas pueden incluir velocidad de crecimiento de brotes o acumulación de peso seco durante el tratamiento o tras un periodo de recuperación después del tratamiento, marchitamiento o recuperación del marchitamiento, y velocidades de crecimiento de raíces y acumulación de peso seco. Aquellos con respuesta mejorada pasarán a un ensayo de eficacia en campo. Los cribados requerirán cultivar varias plantas positivas para transgén y negativas para transgén en macetas pequeñas en un entorno controlado tal como una cámara de crecimiento o invernadero. El número de plantas cribadas está dictado por la varianza asociada a los tratamientos aplicados y fenotipos medidos.

Ejemplo 16.

Plantas cultivadas en campo recibirán un tratamiento que limita el agua disponible a un nivel inferior al óptimo de forma que el tratamiento produzca una respuesta fenotípica medible. Por ejemplo, este tratamiento podría tomar la forma de restringir la cantidad de agua durante varios días que conduce a una deficiencia de agua progresiva tanto durante el desarrollo vegetativo tardío como el reproductivo temprano de las plantas. Se cribarán plantas positivas para transgén para una respuesta fenotípica mejorada al tratamiento con respecto a plantas negativas para transgén. Las respuestas fenotípicas medidas pueden incluir velocidad de crecimiento de brotes durante el tratamiento, marchitamiento de hojas, rendimiento del grano y componentes del rendimiento de mazorcas tales como número de granos y peso de los granos. Aquellos eventos con respuesta mejorada pasarán a un ensayo de rendimiento del primer año. Los cribados se aplicarán a densidades de siembra típicas en dos localizaciones de campo de secano con irrigación controlable. El número de plantas cribadas está dictado por la varianza asociada a los tratamientos aplicados y fenotipos medidos.

Ejemplo 17.

Varios de los genes descritos se clonarán, transformarán en plantas y se fenotiparán de un modo similar al siguiente (Ejemplos 17-30). Por ejemplos, nucleótidos y nucleótidos que codifican SEC ID Nº: 4-53.

Construcción del vector de destino.

Se construyó un vector de expresión de planta de destino GATEWAY™ (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) (pMON65154, Figura 13) usando procedimientos conocidos para aquellos expertos en la materia. Los elementos del vector de expresión se resumen en la Tabla 17. El esqueleto del plásmido pMON65154 que comprende las funciones de replicación bacterianas y un gen de resistencia a ampicilina expresado en E. coli se derivaron del plásmido pSK-. Los elementos de expresión de la planta en pMON64154 están disponibles para aquellos expertos en la materia y para cada elemento se proporcionan referencias en la Tabla 17. Todas las referencias en la Tabla 17 para la localización se refieren a coordenadas de pares de bases para cada elemento sobre el mapa de plásmidos desvelado en la Figura 13. Generalmente, pMON65154 comprende un casete de expresión de marcador de selección que comprende un promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor operablemente ligado a un gen que codifica neomicina fosfotransferasa II (nptII). La región 3' del casete de expresión del marcador de selección comprende la región 3' del gen nopalina sintasa (nos) de Agrobacterium tumefaciens seguido 3' por la región 3' del gen inhibidor II de la proteinasa de patata (pinII). El plásmido pMON65154 comprende además un casete de expresión de planta en el que un gen de interés puede insertarse usando procedimientos de clonación GATEWAY™. El casete de clonación GATEWAY™ está flanqueado en 5' por un promotor, exón e intrón de la actina 1 de arroz y flanqueado en 3' por la región 3' del gen pinII de patata. Usando procedimientos GATEWAY™, el casete de clonación se sustituyó por un gen de interés. El vector pMON65154 y derivados del mismo que comprenden un gen

5 de interés fueron particularmente útiles en procedimientos de transformación de plantas mediante la administración de ADN directo tal como bombardeo de microproyectiles. Un experto en la materia podría construir un vector de expresión con características similares usando procedimientos conocidos en la técnica. Además, un experto en la materia apreciaría que otros promotores y regiones de 3' serían útiles para la expresión de un gen de interés y pueden usarse otros marcadores de selección.

10 Tabla 17.

Elementos del plásmido pMON65154

CASETE: FUNCIÓN ELEMENTO LOCALIZACIÓN REFERENCIA

Gen de planta de la expresión de interés: Promotor Actina 1 de arroz 1796-2638 Wang y col., 1992

Potenciador: Exón 1, , intrón 1 de actina 1 de arroz 2639-3170 Wang y col., 1992

Clonación GATEWAY™: Recombinación AttR1 3188-3312 Manual de instrucciones de la tecnología de clonación GATEWAY™ (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)

Gen de resistencia a cloranfenicol bacteriano: Gen CmR 3421-4080 Manual de instrucciones de la tecnología de clonación GATEWAY™ (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)

Marcadores de selección negativos bacterianos: Genes ccdA, ccdB 4200-4727 Manual de instrucciones de la tecnología de clonación GATEWAY™ (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)

Sitio de recombinación de GATEWAY™: attR2 4768-4892 Manual de instrucciones de la tecnología de clonación GATEWAY™ (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)

Gen de planta del casete de expresión de interés: Región 3' pinII de patata 4907-5846 An y col., 1989

Casete de expresión del gen marcador de selección de planta: Promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor 5895-6218 Patente de EE.UU. nº 5352605

Gen marcador de selección: nptII 6252-7046 Patente de EE.UU. nº 6174724

Región 3': nos 7072-7327 Bevar y col., 1983

Región 3': pinII 7339-8085 An y col., 1989

Mantenimiento en E. coli: Origen de replicación ColE1 858-1267 Oka y col., 1979

Mantenimiento en E. coli: Origen de replicación F1 8273-3673 Ravetch y col., 1977

Mantenimiento en E. coli: Resistencia a ampicilina bla 8909-551 Heffron y col., 1979

Se construyó un vector de plásmido separado (pMON72472, Figura 14) para su uso en procedimientos mediados

por Agrobacterium de la transformación de plantas. El plásmido pRG76 comprende el gen de expresión de la planta

de interés, clonación GATEWAY™ y casetes de expresión de marcadores de selección de planta presentes en

pMON65154. Además, las secuencias límite de T-ADN izquierdas y derechas de Agrobacterium se añadieron al

5 plásmido. La secuencia del límite derecho está localizada 5' con respecto al promotor de actina 1 de arroz y la

secuencia del límite izquierdo está localizada 3' con respecto a la secuencia de 3' de pinII situada 3' con respecto al

gen nptII. Además, el esqueleto de pSK- de pMON65164 fue sustituido por un esqueleto de plásmido para facilitar la

replicación del plásmido en tanto E. coli como Agrobacterium tumefaciens. El esqueleto comprende un origen con

amplio espectro de huéspedes oriV de replicación de ADN funcional en Agrobacterium, la secuencia rop, un origen 10 pBR322 de replicación de ADN funcional en E.coli y un gen de resistencia a espectinomicina/estreptomicina para la

selección para la presencia del plásmido en tanto E. coli como Agrobacterium.

Los elementos presentes en el vector de plásmido pRG81 se describen en la Tabla 18.

Tabla 18. Elementos genéticos del vector de plásmido pRG81 (continuación)

CASETE: FUNCIÓN ELEMENTO LOCALIZACIÓN REFERENCIA

Gen de planta de expresión de interés: Promotor Actina 1 de arroz 5610-6452 Wang y col., 1992

Potenciador: Exón 1, intrón 1 de actina 1 de arroz 6453-6984 Wang y col., 1992

Clonación GATEWAY™: Recombinación AttR1 7002-7126 Manual de instrucciones de la tecnología de clonación GATEWAY™ (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)

Gen de resistencia a cloranfenicol bacteriano: Gen CmR 7235-7894 Manual de instrucciones de la tecnología de clonación GATEWAY™ (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)

Marcadores de selección negativos bacterianos: Genes ccdA, ccdB 8014-8541 Manual de instrucciones de la tecnología de clonación GATEWAY™ (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)

Sitio de recombinación de GATEWAY™: attR2 8582-8706 Manual de instrucciones de la tecnología de clonación GATEWAY™ (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)

Gen de planta del casete de expresión de interés: Región 3' pinII de patata 8721-9660 An y col., 1989

Casete de expresión del gen marcador de selección de planta: Promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor 1-324 Patente de EE.UU. nº 535260S

Gen marcador de selección: nptII 358-1152 Patente de EE.UU. nº 6174724

Región 3': nos 1178-1433 Bevan y col., 1983

Región 3': pinII 1445-2191 An y col., 1989

Transformación mediada por Agrobacterium: Transferencia de ADN Límite izquierdo 2493-2516 Zambryski y col., 1982; acceso de GenBank AJ237588

Mantenimiento de plásmido en E. coli o Agrobacterium: Origen de replicación Ori-V 2755-3147 Honda y col., 1988

CASETE: FUNCIÓN ELEMENTO LOCALIZACIÓN REFERENCIA

Mantenimiento de plásmido en E. coli: Origen replicación de ColE1 3545-4199 Oka y col., 1972

Mantenimiento de plásmido en E. coli o Agrobacterium: Resistencia espectinomicina estreptomicina a / Spc/Str 4242-5030 Fling y col., 1985

Transformación mediada por Agrobacterium: TransferenciaADN de Límite derecho 5514-5538 Zambryski y col., 1982; acceso de GenBank AJ237588

Ejemplo 18.

Se amplificaron secuencias codificantes por PCR antes de la inserción en un vector de expresión de planta de destino GATEWAY™ tal como pMON65154 (Figura 13). Todas las secuencias codificantes estuvieron disponibles 5 como o bien una secuencia de longitud completa clonada o bien como información de secuencia de ADN que permitió la amplificación de la secuencia deseada de una biblioteca de ADNc. Los cebadores para amplificación por PCR se diseñaron en o próximos a los codones de iniciación o de terminación de la secuencia codificante con el fin de eliminar la mayoría de las regiones sin traducir de 5' y 3'. Los productos de PCR fueron seguidos de secuencias de attB1 y attB2 con el fin de permitir la clonación por recombinación en vectores GATEWAY™ (Invitrogen Life

10 Technologies, Carlsbad, CA).

Se usaron dos procedimientos para producir secuencias amplificadas por PCR flanqueadas por attB de interés. Ambos procedimientos se describen en detalle en el Manual de instrucciones de la tecnología de clonación GATEWAY™ (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). En el primer procedimiento se usó un conjunto de un único cebador que comprende attB y secuencias específicas para molde. Las secuencias del cebador son del

15 siguiente modo:

Cebador directo de attB1:

5' GGG CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTN-secuencia específica para molde-3' (SEC ID Nº: 71) Cebador inverso de attB2 5' GGGG CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTN-secuencia específica para molde-3' (SEC ID Nº: 72)

20 Alternativamente se usó PCR con adaptadores de attB para preparar productos de PCR flanqueados por attB. La PCR con adaptadores de attB1 usa dos conjuntos de cebadores, es decir, cebadores específicos para genes y cebadores para instalar las secuencias de attB. Se diseñaron cebadores de la secuencia de ADN deseada que incluyeron 12 pares de bases de las secuencias de attB1 o attB2 en el extremo 5'. Los cebadores que se usaron fueron del siguiente modo:

25 Cebador directo específico para el gen attB1 5' CCTGCAGGACCATG-cebador directo específico para el gen-3' (SEC ID Nº: 73) Cebador inverso específico para el gen attB2 5' CCTGCAGGCTCGAGCTA-cebador inverso específico para el gen-3' (SEC ID Nº: 74)

El segundo conjunto de cebadores fueron cebadores de adaptadores de attB con las siguientes secuencias:

30 Cebador directo de adaptadores de attB1 5' GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCTGCAGGACCATG 3' (SEC ID Nº: 75) Cebador inverso de adaptadores de attB2 5'GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCCTGCAGGCTCGAGCTA 3' (SEC ID Nº: 76)

Las secuencias flanqueadas por attB1 y attB2 se amplificaron por PCR según los procedimientos descritos por 35 Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA). Los productos de PCR flanqueados por attB se purificaron y se recuperaron a partir de un gel como se ha descrito anteriormente.

En algunos casos, las secuencias flanqueadas por attB se recuperaron de PCR, pero no pudieron insertarse en el vector donante usando tecnología GATEWAY™. Los procedimientos de clonación convencionales usando ligasas se usaron para insertar una secuencia de ADN en un vector de entrada (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) 40 cuando fracasó la recombinación GATEWAY™ en el vector donante. La elección del vector de entrada dependió de la compatibilidad de los sitios de endonucleasa de restricción en el vector de entrada y la secuencia de inserto deseada. El vector de entrada se digirió con una endonucleasa de restricción seleccionada para eliminar el gen ccdB, se desfosforiló y se purificó en gel. La endonucleasa de restricción seleccionada dependió del vector de entrada usado y la secuencia de la secuencia de inserto deseada. Por ejemplo, el gen ccdB se eliminó de pENTR11

(Figura 15) usando EcoR1 u otras combinaciones de endonucleasas de restricción tales como EcoRV, y XmaI o NcoI y XhoI. Podrían usarse otras nucleasas de restricción con otros vectores de entrada para su uso en el procedimiento GATEWAY™. Para usar vectores de entrada digeridos con endonucleasa de restricción fue necesario poder producir extremos cohesivos compatibles sobre el producto de PCR deseado. Los extremos cohesivos podrían producirse por varios procedimientos conocidos para aquellos expertos en la materia, tales como digestión con endonucleasas de restricción, ligación a adaptador o adición de sitios de restricción durante PCR.

En algunos casos no fue posible producir extremos cohesivos compatibles sobre un fragmento de PCR y un vector de entrada. Alternativamente, los extremos cohesivos compatibles podrían producirse dirigidos por digestión con enzima de restricción de un clon de ADNc. Sin embargo, fue posible ligar extremos romos de PCR en un vector de entrada. Usando este procedimiento, el vector de entrada se cortó con una endonucleasa de restricción para eliminar el gen ccdB. Un vector de entrada lineal purificado por gel se hizo de extremos romos con T4 ADN polimerasa. Un experto en la materia es consciente de otros procedimientos de preparación de moléculas de ADN de extremos romos tales como el uso de ADN polimerasa de Klenow. El producto de PCR se hizo de extremos romos y preferentemente se desfosforiló por incubación con T4 ADN polimerasa, u otra polimerasa adecuada, T4 polinucleótido cinasa y una enzima fosfatasa. El vector de entrada y el producto de PCR se ligaron en extremos romos usando procedimientos conocidos en la técnica. Los productos de ligación se transformaron en E. coli y los plásmidos de colonias individuales se analizaron para la presencia del ADN de inserto y la orientación deseada con respecto a los sitios attL en el vector de entrada. Se seleccionaron clones con la secuencia de attL1 próxima al extremo amino del marco de lectura abierto.

Preferentemente, el procedimiento de TA de clonar productos de PCR (Marchuk y col., 1991) se usó cuando los productos de PCR flanqueados por attB no pudieron insertarse en un plásmido usando procedimientos GATEWAY™. El procedimiento de TA aprovecha la actividad de transferasa terminal de Taq polimerasa. Se cortó un vector de entrada con una endonucleasa de restricción y los extremos se hicieron romos usando los procedimientos descritos en el presente documento. El vector de entrada lineal de extremos romos se incubó con dTTP y Taq polimerasa produciendo la adición de un único residuo de timidina en el extremo 3' de cada cadena de ADN. Como la Taq polimerasa tiene una fuerte preferencia por dATP, los productos de PCR se producen casi siempre con una única adenosina añadida al extremo 3'. Por tanto, el vector de entrada y el producto de PCR tienen nucleótidos protuberantes en 3' de una única base complementarios. Tras la ligación en condiciones conocidas para aquellos expertos en la materia, los plásmidos se transformaron en E. coli. Los plásmidos se aislaron de colonias individuales y se analizaron para identificar plásmidos con el inserto deseado en la orientación correcta. Alternativamente, los productos de PCR, seguido de sitios attB, se clonaron por TA en un vector de clonación de TA comercial tal como pGEM-T EASY (Promega Corporation, Madison, WI).

Todos los productos de amplificación por PCR se secuenciaron antes de la introducción en una planta. Los insertos de PCR en vectores de expresión de destino producidos por procedimientos GATEWAY™ se secuenciaron para confirmar que la secuencia insertada codificó la secuencia de aminoácidos esperada. Si los vectores de entrada se produjeron usando los procedimientos de ligación, la secuencia insertada se secuenció en el vector de entrada antes de la producción del vector de expresión de destino usando tecnología GATEWAY™. Se aceptaron mutaciones puntuales que no afectaron la secuencia codificante de aminoácidos, es decir, mutaciones silenciosas.

Ejemplo 19. Construcción de vectores de expresión

Se usaron procedimientos de clonación GATEWAY™ (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) para la construcción de vectores de expresión para su uso en la transformación de maíz. Los procedimientos GATEWAY™ se describen completamente en el Manual de instrucciones de la tecnología de clonación GATEWAY™ (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). El uso del sistema GATEWAY™ facilita la clonación de alta resolución de secuencias codificantes en un vector de expresión de planta. Las secuencias de genes flanqueadas por secuencias de attB1 y attB2 se produjeron por PCR como se ha descrito anteriormente. Dependiendo de qué secuencia de recombinación, attB1 y attB2, se dispuso 5' y 3' con respecto a la secuencia codificante, se produjeron vectores de expresión sentido o antisentido. Se construyó un vector de expresión de planta, pMON65154 (Figura 13), en el que cualquier secuencia codificante podría insertarse en una orientación sentido o antisentido, como se describe en el Ejemplo 1 y se usó como un vector de destino en el procedimiento de clonación GATEWAY™.

Se usaron dos procedimientos alternativos para insertar una secuencia codificante amplificada por PCR en un vector de expresión de planta. En el primer procedimiento, un producto de PCR que comprende la secuencia codificante de interés flanqueada por secuencias de attB1 y attB2 en los extremos 5' y 3' se incubó con el vector donante (pDONR201™, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) en presencia de BP CLONASE™. Se produjeron clones de entrada GATEWAY™ a partir de esta reacción y se transformaron en E. coli. El ADN de plásmido se aisló de los clones de entrada. Las secuencias codificantes insertadas podrían secuenciarse a partir de vectores de entrada con el fin de confirmar la fidelidad de la amplificación por PCR. El ADN de plásmido, aislado a partir de las colonias de E. coli del clon de entrada, se incubó con vector de destino linealizado, preferentemente pMON65154, en presencia de LR CLONASE™ para producir vectores de expresión de planta que comprenden la secuencia codificante de interés. El ADN de la reacción de LR CLONASE™ se transformó en E. coli. El ADN de plásmido de los vectores de expresión de destino se aisló y se secuenció con el fin de determinar la correcta orientación y secuencia del vector de expresión de planta.

En el segundo procedimiento de generación de vectores de expresión de planta, un producto de PCR flanqueado por secuencias de attB1 y attB2 se incubó con un vector donante (pDONR201™, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) y BP CLONASE™ como se ha descrito anteriormente. Tras la incubación, una alícuota de la mezcla de reacción se incubó adicionalmente con vector de destino linealizado y LR CLONASE™. El ADN resultante se transformó en E. coli y los vectores de expresión de planta que contenían la secuencia codificante de interés se seleccionaron usando PCR o técnicas de análisis de transferencia Southern conocidas en la técnica. Ambos procedimientos de producción de vectores de expresión de planta que comprenden una secuencia codificante de interés se describieron por Invitrogen Life Technologies (Manual de instrucciones de la tecnología de clonación GATEWAY™).

Alternativamente se produjeron vectores de entrada usando endonucleasas de restricción y ligasas. Los vectores de entrada están disponibles de Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA). Cada vector de entrada, por ejemplo, pENTR1A, pENTR2B, pENTR3C, pENTR4 y pENTR11, tiene rasgos de clonación y expresión únicos. pENTR11 se usó preferentemente en la práctica de la presente invención. Aquellos expertos en la materia reconocerán la utilidad de los otros vectores de entrada. Antes de usar endonucleasas de restricción y ligasas para insertar secuencias deseadas en uno de los vectores de entrada fue necesario digerir por restricción el vector de entrada sobre cada lado del gen ccdB. Se usaron varias combinaciones de endonucleasas de restricción diferentes dependiendo de los sitios de restricción presentes en la secuencia de ADN a insertar en el vector de entrada. Preferentemente, el vector de entrada se desfosforiló y se purificó en gel después de la digestión por restricción. La secuencia de ADN deseada se insertó en el vector de entrada usando procedimientos convencionales de biología molecular conocidos para aquellos expertos en la materia. La clonación de TA (patente de EE.UU. nº 5.827.657) es un procedimiento preferible de clonación de fragmentos de PCR en un vector de entrada.

Los vectores (designados pMON y un número de 5 dígitos) y secuencias codificantes contenidas en su interior que se produjeron usando los procedimientos de clonación GATEWAY™ son, por ejemplo, SEC ID Nº: 4-28. Se espera que algunas de las secuencias codificantes de la presente invención puedan clonarse en vectores de expresión de planta usando los procedimientos descritos en el presente documento.

Ejemplo 20.

Plantas de MAÍZ DE GERMOPLASMA A se cultivaron en el invernadero. Se recogieron mazorcas de plantas cuando los embriones tuvieron 1,5 a 2,0 mm de longitud, normalmente 10 a 15 días después de la polinización, y lo más frecuentemente 11 a 12 días después de la polinización. Las mazorcas se esterilizaron superficialmente pulverizando o poniendo en remojo las mazorcas en 80 % de etanol, seguido de secado al aire. Alternativamente, las mazorcas se esterilizaron superficialmente por inmersión en 50 % de CLOROX™ que contiene 10 % de SDS durante 20 minutos, seguido de tres aclarados con agua estéril.

Se aislaron embriones maduros de granos individuales usando procedimientos conocidos para aquellos expertos en la materia. Los embriones inmaduros se cultivaron en medio 211 (sales N6, 2 % de sacarosa, 1 mg/l de 2,4-D, 0,5 mg/l de niacina, 1,0 mg/l de tiamina-HCl, 0,91 g/l de L-asparagina, 100 mg/l de mioinositol, 0,5 g/l de MES, 100 mg/l de hidrolizado de caseína, 1,6 g/l de MgCl2, 0,69 g/l de L-prolina, 2 g/l de GELGRO™, pH 5,8) que contenía 16,9 mg/l de AgNO3, (designado medio 211V) durante 3-6 días, preferentemente 3-4 días antes del bombardeo de microproyectiles.

Ejemplo 21.

Se conocen procedimientos de transformación mediada por Agrobacterium de células de maíz y otras monocotiledóneas (Hiei y col., 1997; patente de EE.UU. nº 5.591.616; patente de EE.UU. nº 5.981.840; solicitud de patente EP publicada EP 0 672 752). Aunque pueden usarse diversas cepas de Agrobacterium (véanse las referencias anteriores), la cepa ABI es preferentemente usada por los presentes inventores. La cepa ABI de Agrobacterium se deriva de la cepa A208, una cepa de tipo nopalina de C58, de la que se eliminó el plásmido Ti por cultivo a 37 ºC, y que contiene adicionalmente el plásmido Ti modificado pMP90RK (Koncz y Schell, 1986). Preferentemente se usa un sistema de vector binario de Agrobacterium tumefaciens (An y col., 1998) para transformar maíz. Se han descrito vectores de plásmido Ti cointegrantes alternativos (Rogers y col., 1988) y podrían usarse para transformar maíz. Un vector binario que comprende uno o más genes de interés puede introducirse en una cepa de Agrobacterium aplacada usando electroporación (Wen-jun y Forde, 1989) o apareamiento triparental (Ditta y col., 1980). Un vector binario puede contener un gen marcador de selección, un gen de marcador cribable y/o uno o más genes que confieren un rasgo fenotípico deseable sobre la planta transformada. Un vector binario a modo de ejemplo, pMON30113, se muestra en la FIG. 4. Pueden usarse otros vectores binarios y son conocidos para aquellos expertos en la materia.

Antes del co-cultivo de células de maíz, células de Agrobacterium pueden cultivarse a 28 ºC en medio líquido de LB (DIFCO) que comprende antibióticos apropiados para seleccionar el mantenimiento del plásmido Ti modificado y vector binario. Por ejemplo, ABI/pMON30113 puede cultivarse en medio de LB que contiene 50 ug/ml de kanamicina para seleccionar el mantenimiento del plásmido Ti modificado pMP90RK y 100 ug/ml de espectinomicina para seleccionar el mantenimiento del vector binario pMON30113. Será obvio para un experto en la materia usar agentes de selección apropiados para mantener plásmidos en la cepa de Agrobacterium huésped. Antes de la inoculación de células de maíz, células de Agrobacterium se cultivan durante la noche a temperatura ambiente en medio de AB (Chilton y col., 1974) que comprende antibióticos apropiados para el mantenimiento de plásmidos y acetosiringona 200 uM. Inmediatamente antes de la inoculación de células de maíz, Agrobacterium se sedimenta preferentemente por centrifugación, se lava en medio MSVI a ½ de concentración (2,2 g/l de sales de MS de GIBCO (Carlsbad, CA), 2 mg/l de glicina, 0,5 g/l de niacina, 0,5 g/l de L-piridoxina-HCl, 0,1 mg/l de tiamina, 115 g/l de L-prolina, 10 g/l de Dglucosa y 10 g/l de sacarosa, pH 5,4) que contiene acetosiringona 200 uM y se resuspende a 0,1 a 1,0 x 109 células/ml en medio MSPL a ½ de concentración (2,2 g/l de sales de MS de GIBCO (Carlsbad, CA), 2 mg/l de glicina, 0,5 g/l de niacina, 0,5 g/l de L-piridoxina-HCl, 0,1 mg/l de tiamina, 115 g/l de L-prolina, 26 g/l de D-glucosa, 68,5 g/l de sacarosa, pH 5,4) que contiene acetosiringona 200 uM. Un experto en la materia puede sustituir otros medios por MSVI a ½ de concentración o MSPL a ½ de concentración.

Se aíslan embriones de maíz inmaduros como se ha descrito previamente. Los embriones se inoculan con Agrobacterium 0-7 días después de la escisión, preferentemente inmediatamente después de la escisión. Alternativamente, los embriones inmaduros pueden cultivarse durante más de 7 días. Por ejemplo, puede iniciarse callo embriogénico como se ha descrito anteriormente y co-cultivarse con Agrobacterium. Preferentemente, los embriones de maíz inmaduros se escinden, se sumergen en una suspensión de Agrobacterium en medio MSPL a ½ de concentración preparado como se ha descrito anteriormente y se incuba a temperatura ambiente con Agrobacterium durante 5-20 minutos.

Tras la inoculación, los embriones se transfieren a medio de MS de concentración media (Murashige y Skoog, 1962) que contiene 3,0 mg/l de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), 1 % de D-glucosa, 2 % de sacarosa, 0,115 g/l de Lprolina, 0,5 mg/l de tiamina-HCl, acetosiringona 200 uM y nitrato de plata 20 uM o tiosulfato de plata. Los embriones inmaduros se co-cultivan con Agrobacterium durante 1 a 3 días a 23 ºC en la oscuridad. Un experto en la materia puede sustituir el medio descrito por otro medio.

Los embriones co-cultivados se transfieren a medio 15AA (462 mg/l de (NH4)SO4, 400 mg/l de KH2PO4, 186 mg/l de MgSO4-7H2O, 166 mg/l de CaCl2-2H2O, 10 mg/l MnSO4-H2O, 3 mg/l de H3BO3, 2 mg/l de ZnSO4-7H2O, 0,25 mg/l de NaMoO4-2H2O, 0,025 mg/l de CuSO4-5H2O, 0,025 mg/l de CoCl2-6H2O, 0,75 mg/l de KI, 2,83 g/l de KNO3, 0,2 mg/l de niacina, 0,1 mg/l de tiamina-HCl, 0,2 mg/l de piridoxina-HCl, 0,1 mg/l de D-biotina, 0,1 mg/l de cloruro de colina, 0,1 mg/l de pantotenato de calcio, 0,05 mg/l de ácido fólico, 0,05 mg/l de ácido p-aminobenzoico, 0,05 mg/l de riboflavina, 0,015 mg/l de vitamina B12, 0,5 g/l de casaminoácidos, 33,5 mg/l de Na2EDTA, 1,38 g/l de L-prolina, 20 g/l de sacarosa, 10 g/l de D-glucosa), o medio de MS que contiene 1,5 mg/l de 2,4-D, 500 mg/l de carbenicilina, 3 % de sacarosa, 1,38 g/l de L-prolina y nitrato de plata 20 uM o tiosulfato de plata y se cultiva durante 0 a 8 días en la oscuridad a 27 ºC sin selección. El medio de cultivo usado para la selección de transformantes y regeneración de plantas contiene preferentemente 500 mg/l de carbenicilina. Un experto en la materia puede sustituir otros antibióticos que controlan el crecimiento de Agrobacterium. Alternativamente pueden usarse otros medios de cultivo que soportan el cultivo celular. En ausencia de un retraso de la selección (cultivo de día 0), la selección puede iniciarse en 25 mg/l de paromomicina. El medio de selección puede comprender medio 211 (descrito anteriormente)

o una variante del medio 211 en el que sales N6 se sustituyen por sales de MS. Después de dos semanas, los callos embriogénicos se transfieren a medio de cultivo que contiene 100 mg/l de paromomicina y se subcultivan en intervalos de aproximadamente dos semanas. Si la selección se retrasa tras el co-cultivo, los embriones se cultivan inicialmente en medio que contiene 50 mg/l de paromomicina seguido de posterior cultivo de callo embriogénico sobre medio que contiene 100-200 mg/l de paromomicina. Un experto en la materia cultivará tejido a concentraciones de paromomicina que inhiben el crecimiento de células que carecen del gen marcador de selección, pero a concentración a la que el callo transformado proliferará. Alternativamente pueden usarse otros marcadores de selección para identificar células transformadas. Se cree que el cultivo inicial en 25 a 50 mg/l de paromomicina durante aproximadamente dos semanas, seguido de cultivo en 50-200 mg/l de paromomicina, producirá la recuperación de callo transformado. Los transformantes se recuperan 6 a 8 semanas después de la iniciación de la selección. Las plantas se regeneran a partir de callo embriogénico transformado como se ha descrito anteriormente para transformantes recuperados tras el bombardeo de microproyectiles.

Ejemplo 22. Transformación mediada por Agrobacterium de callo de maíz

Este ejemplo describe procedimientos para la transformación de callo de maíz usando Agrobacterium. El procedimiento se ejemplifica usando un gen marcador de selección nptII y agente selectivo para paromomicina. Un experto en la materia conocerá combinaciones de marcador de selección y agente selectivo que podrían usarse alternativamente.

El callo se inició a partir de embriones inmaduros usando procedimientos conocidos para aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, embriones inmaduros de 1,5 mm a 2,0 mm se escindieron de semilla de maíz en desarrollo deun genotipo tal como MAÍZ DE GERMOPLASMA A y se cultivaron con el eje embrionario hacia abajo en medio 211V, normalmente durante 8-21 días después de la escisión. Alternativamente, un cultivo de callos establecidos puede iniciarse y mantenerse mediante procedimientos conocidos para aquellos expertos en la materia.

Se preparó Agrobacterium para inoculación de tejido de planta según los procedimientos descritos en el Ejemplo 21. Cincuenta a 100 trozos de callo se transfirieron a una placa de Petri de 60 mm X 20 mm que contenía aproximadamente 15 ml de suspensión de Agrobacterium a 0,1 a 1,0 x 109 ufc/ml. Un trozo de callo fue normalmente todo el callo producido por embrión inmaduro de hasta 21 días de cultivo o un trozo de callo establecido de 2 mm a 8 mm de diámetro. El callo se incubó durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente con la suspensión de Agrobacterium, seguido de eliminación del líquido por aspiración.

Se añadieron aproximadamente 50 μl de agua destilada estéril a un papel de filtro Whatman nº 1 en una placa de Petri de 60 mm x 20 mm. Después de 1-5 minutos, 15 a 20 trozos de callo se transfirieron a cada papel de filtro y la placa se selló con, por ejemplo, PARAFILM®. El callo y Agrobacterium se co-cultivaron durante aproximadamente 3 días a 23 ºC en la oscuridad.

Los callos se transfirieron del papel de filtro a medio 211 con nitrato de plata 20 μM y 500 mg/l de carbenicilina y se cultivaron en la oscuridad a 27 ºC a 28 ºC durante 2-5 días, preferentemente 3 días. La selección se inició por transferencia del callo a medio 211 que contenía nitrato de plata 20 μM, 500 mg/l de carbenicilina y 25 mg/l de paromomicina. Después de 2 semanas de cultivo en la oscuridad a 27 ºC a 28 ºC, el callo se transfirió a medio 211 con nitrato de plata 20 μM, 500 mg/l de carbenicilina y 50 mg/l de paromomicina (medio 211QRG). El callo se subcultivó después de dos semanas en medio fresco 211 QRG y se cultivó adicionalmente durante dos semanas en la oscuridad a 27 ºC a 28 ºC. Entonces, el callo se transfirió a medio 211 con nitrato de plata 20 μM, 500 mg/l de carbenicilina y 75 mg/l de paromomicina. Después de 2-3 semanas de cultivo en la oscuridad a 27 ºC a 28 ºC se identificó callo resistente a paromomicina. Un experto en la materia reconocería que los tiempos entre subcultivos de callo son aproximados y el procedimiento de selección puede acelerarse transfiriendo tejido a intervalos más frecuentes, por ejemplo, semanalmente en vez de bisemanalmente.

Las plantas se regeneraron a partir de callo transformado, se transfirieron a la tierra y se cultivaron en el invernadero como se describe en el ejemplo. Tras la transformación mediada por Agrobacterium, el medio 217 (véase el Ejemplo 9) contuvo adicionalmente 500 mg/l de carbenicilina y el medio 127T (véase el Ejemplo 9) contuvo adicionalmente 250 mg/l de carbenicilina. Las plantas de maíz transformadas que comprenden los genes de la presente invención que se produjeron usando transformación mediada por Agrobacterium se resumen en la Tabla Y.

Ejemplo 23. Procedimientos de bombardeo de microproyectiles

Aproximadamente cuatro horas antes del bombardeo de microproyectiles, embriones inmaduros se transfirieron a medio 211 SV (medio 211V con la adición de sacarosa al 12 %). Veinticinco embriones inmaduros se colocaron preferentemente en una placa de Petri de 60 x 15 mm, se dispusieron en una rejilla de 5 x 5 con el extremo coleoptilar del escutelo ligeramente presionado en el medio de cultivo a un ángulo de 20 grados. El tejido se mantuvo en la oscuridad antes del bombardeo.

Antes del bombardeo de microproyectiles se preparó una suspensión de partículas de oro sobre la que se precipitó el ADN deseado. Diez miligramos de partículas de oro de 0,6 μm (BioRad) se suspendieron en 50 μl de tampón (NaCl 150 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,0). Se añadieron veinticinco μl de una disolución 2,4 nM del ADN deseado a la suspensión de partículas de oro y se agitaron suavemente con vórtex durante aproximadamente cinco segundos. Se añadieron setenta y cinco μl de espermidina 0,1 M y la disolución se agitó suavemente con vórtex durante aproximadamente 5 segundos. Se añadieron setenta y cinco μl de una disolución al 25 % de polietilenglicol (peso molecular 3000-4000, Colección americana de cultivos tipo) y la disolución se agitó suavemente con vórtex durante cinco segundos. Se añadieron setenta y cinco μl de CaCl2 2,5 M y la disolución se agitó con vórtex durante cinco segundos. Tras la adición de CaCl2, la disolución se incubó a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos. La suspensión se centrifugó posteriormente durante 20 segundos a 12.000 rpm (centrífuga Sorval MC-12V) y se desechó el sobrenadante. El sedimento de partículas de oro/ADN se lavó dos veces con el 100 % de etanol y se resuspendió en 10 ml de 100 % de etanol. La preparación de partículas de oro/ADN se almacenó a -20 ºC durante hasta dos semanas.

Se introdujo ADN en células de maíz usando el dispositivo de administración de genes de aceleración de partículas de descarga eléctrico (patente de EE.UU. nº 5.015.580). La suspensión de partículas de oro/ADN se recubrió sobre hojas Mylar (película de poliéster Mylar de Du Pont tipo SMMC2, aluminio recubierto sobre una cara, encima recubierto con co-polímero de PVDC sobre ambas caras, cortada en cuadrado de 18 mm) por dispersión de 310 a 320 μl de la suspensión de partículas de oro/ADN sobre una hoja. Después de sedimentarse la suspensión de partículas de oro durante uno a tres minutos, el etanol en exceso se eliminó y las hojas se secaron al aire. El bombardeo de microproyectiles de tejido de maíz se realizó como se ha descrito en la patente de EE.UU. nº

5.015.580. El voltaje de C.A. puede variarse en el dispositivo de administración de partículas de descarga eléctrico. Para el bombardeo de microproyectiles de embriones inmaduros previamente cultivados con MAÍZ DE GERMOPLASMA A se usó preferentemente del 35 % al 45 % de voltaje máximo. Tras el bombardeo de microproyectiles el tejido se cultivó en la oscuridad a 27 ºC.

Ejemplo 24. Selección de células transformadas

Se seleccionaron transformantes en medio de cultivo que comprendía paromomicina basándose en la expresión de un gen neomicina fosfotransferasa II (nptII) transgénico. Veinticuatro horas después de la administración de ADN, el tejido se transfirió a medio 211 V que contenía 25 mg/l de paromomicina (medio 211HV). Después de tres semanas de incubación en la oscuridad a 27 ºC, el tejido se transfirió a medio 211 que contenía 50 mg/l de paromomicina (medio 211G). El tejido se transfirió a medio 211 que contenía 75 mg/l de paromomicina (medio 211XX) después de tres semanas. Los transformantes se aislaron tras 9 semanas de selección. La Tabla Y desvela los resultados de experimentos con transformantes usando los procedimientos de bombardeo de microproyectiles desvelados en el presente documento.

Ejemplo 25. Regeneración de plantas transgénicas fértiles

Se produjeron plantas transgénicas fértiles a partir de células de maíz transformadas. El callo transformado se transfirió a medio 217 (sales N6, 1 mg/l de tiamina-HCl, 0,5 mg/l de niacina, 3,52 mg/l de bencilaminopurina, 0,91 mg/l de L-asparagina monohidratada, 100 mg/l de mio-inositol, 0,5 g/l de MES, 1,6 g/l de MgCl2-6H2O, 100 mg/l de hidrolizado de caseína, 0,69 g/l de L-prolina, 20 g/l de sacarosa, 2 g/l de GELGRO™, pH 5,8) durante cinco a siete días en la oscuridad a 27 ºC. Los embriones somáticos maduraron y la generación de brotes empezó en medio 217. El tejido se transfirió a medio 127T (sales de MS, 0,65 mg/l de niacina, 0,125 mg/l de piridoxina-HCl, 0,125 mg/l de tiamina-HCl, 0,125 mg/l de pantotenato de Ca, 150 mg/l de L-asparagina, 100 mg/l de mio-inositol, 10 g/l de glucosa, 20 g/l de L-maltosa, 100 mg/l de paromomicina, 5,5 g de PHYTAGAR™, pH 5,8) para el desarrollo de brotes. El tejido en medio 127T se cultivó en luz a 400-600 lux a 26 ºC. Las plántulas se transfieren a tierra, preferiblemente macetas de 3 pulgadas (7,62 cm), aproximadamente cuatro a 6 semanas después se transfieren a medio 127T cuando las plántulas tienen aproximadamente 3 pulgadas (7,62 cm) de altura y tienen raíces. Las plantas se mantuvieron durante dos semanas en una cámara de crecimiento a 26 ºC, seguido de dos semanas en un banco de niebla en un invernadero antes de trasplantarlas a macetas de 5 galones (18,9 l) para el crecimiento en invernadero.Las plantas se cultivaron en el invernadero hasta madurez y se hicieron polinizaciones recíprocas con MAÍZ DE GERMOPLASMA A consanguíneo. La semilla se recogió de plantas y se usó para posteriores actividades de cultivo.

Ejemplo 26. Aislamiento de ácidos nucleicos de plantas

Se aislaron ácidos nucleicos de tejido de hoja de plantas R0, se recogieron y se congelaron rápidamente en una caja de recogida de 96 pocillos, 0 a 2 semanas después las plántulas se transfirieron a tierra. Se recogieron aproximadamente 100 miligramos de tejido de cada planta y se guardaron a -80 ºC hasta el análisis.

Se aislaron ADN y ARN de una única muestra de tejido usando el kit Qiagen Rneasy 96™ (Qiagen Inc., Valencia, CA) con modificaciones. Se homogeneizaron cien miligramos de tejido congelado en 700 μl de tampón Rneasy™ RTL (Qiagen Inc., Valencia, CA) usando un Bead Beater™ (Biospec Products, Bartlesville, OK). Las muestras se centrifugaron a 3200 rpm durante 15 minutos y todo el sobrenadante se transfirió a los pocillos de una placa de aclaramiento Promega WIZARD™ (Promega Corporation, Madison, WI). Las disoluciones de muestra se clarificaron por filtración a vacío a través de la placa de aclaramiento. El sobrenadante aclarado se usó para extracciones de ácidos nucleicos.

Para extracciones de ADN, 70 μl de la muestra aclarada se transfirieron a una placa de PCR de pocillos en v, se cubrió por lámina adhesiva y se calentó a 95 ºC durante 8 minutos. Las muestras se incubaron a 0 ºC durante cinco minutos, seguido de centrifugación durante 3 minutos para eliminar materiales insolubles. Se acondicionó una caja de filtración en gel Sephadex G-50 (Edge Biosystems, Gaithersburg, MO) durante 2 min a 2000 rpm. Se cargaron cuarenta μl del sobrenadante tratado con calor en cada pocillo y la caja se centrifugó durante dos minutos a 2500 rpm. Se añadieron 20 μl adicionales de tampón TE al efluente de la columna y la placa de muestra se almacenó a 20 ºC hasta el análisis.

Para extracciones de ARN, quinientos microlitros de disolución aclarada se transfirieron a una caja de muestra de 96 pocillos limpia. A cada muestra se añadieron doscientos cincuenta microlitros de 100 % de etanol y la muestra se mezcló minuciosamente. Entonces, los aproximadamente setecientos cincuenta microlitros de disolución se cargaron en los pocillos de una placa de unión Qiagen Rneasy™ en una unidad de filtración Promega WIZARD™. Quinientos microlitros de tampón RW1 (Qiagen Inc., Valencia, CA) se añadieron a cada pocillo y el tampón se eliminó por filtración a vacío. Ochocientos microlitros de ADNasa sin RNAasa (Qiagen Inc., Valencia, CA) se añadieron a cada pocillo, se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos y la disolución de ADNasa se sacó de los pocillos por filtración a vacío. Se añadieron quinientos microlitros adicionales de tampón RW1 (Qiagen Inc., Valencia, CA) a los pocillos y el tampón se eliminó por filtración a vacío. La muestra se lavó adicionalmente por filtración a vacío con 500 μl de tampón RPE 2X (Qiagen, Valencia, CA). La placa de extracción se dispuso sobre una placa de microtitulación y se centrifugó durante tres minutos a 3000 rpm para eliminar cualquier disolución de tampón RPE residual sobre el filtro. Se añadieron ochenta microlitros de agua de calidad para ARN (sin ADNsa) a cada pocillo, seguido de incubación a temperatura ambiente durante dos minutos. La placa de extracción y la placa de microtitulación se centrifugaron durante tres minutos a 3000 rpm y la preparación de ARN se guardó congelada en la placa de recogida a -80 ºC.

Ejemplo 27. Ensayos para el número de copias

El número de copias de transgenes en plantas R0 se determinó usando procedimientos TAQMAN®. Los vectores de destino de GATEWAY™ pMON65154 y pRG76 se construyeron con una secuencia derivada de la región 3' del gen pinII de patata que podría usarse para ensayar el número de copias de inserciones de transgenes. Los cebadores directo e inverso de pinII fueron del siguiente modo:

Cebador directo 5' ccccaccctgcaatgtga 3' (SEC ID Nº: 77) Cebador inverso 5' tgtgcatccttttatttcatacattaattaa 3' (SEC ID Nº: 78)

La secuencia de la sonda TAQMAN® de pinII fue

5' cctagacttgtccatcttctggattggcca 3' (SEC ID Nº: 79)

La sonda se marcó en el extremo 5' con el colorante fluorescente FAM (6-carboxifluoresceína) y el colorante extintor TAMRA (6-carboxi-N,N,N',N'-tetrametilrrodamina) se unió mediante un ligador al extremo 3' de la sonda. La sonda

5 TAQMAN® se obtuvo de Applied Biosystems (Foster City, CA). __ SAT, un gen de maíz de una única copia, se usó como control interno en ensayos del número de copias TAQMAN®. Los cebadores de SAT fueron del siguiente modo

Cebador directo 5' gcctgccgcagaccaa 3' (SEC ID Nº: 80) Cebador inverso 5' atgcagagctcagcttcatc 3' (SEC ID Nº: 81)

La secuencia de la sonda TAQMAN® de SAT fue

5' tccagtacgtgcagtccctcctcc 3' (SEC ID Nº: 82)

10 La sonda se marcó en su extremo 5' con el colorante fluorescente VIC™ (Applied Biosystems, Foster City, CA) y el colorante extintor TAMRA en su extremo 3'.

Se realizó PCR TAQMAN® según las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA). Se usaron cinco a 100 nanogramos de ADN en cada ensayo. La amplificación por PCR y la detección de sondas TAQMAN® se realizaron en 1X TAQMAN® Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) que contenía ADN 15 polimerasa AmpliTaq Gold®, AmpErase® UNG, dNTP con dUTP, referencia 1 pasiva y tampón optimizado. Se usaron ochocientos nM de cada cebador de pinII directo e inverso y sonda TAQMAN® de pinII 150 nM en el ensayo TAQMAN®. Se usaron 200 nM de cada cebador directo e inverso de Sat y sonda TAQMAN® de Sat 150 nM en el ensayo de número de copias TAQMAN®. Se llevó a cabo la PCR TAQMAN® durante 2 minutos a 50 ºC, 10 minutos a 95 ºC, seguido de 40 ciclos de 15 segundos a 95 ºC y un minuto a 60 ºC. La fluorescencia de sondas TAQMAN®

20 en tiempo real se midió usando un sistema de detección de secuencias ABI Prism 7700 o sistema de detección de secuencias ABI7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los valores de CT se calcularon según el manual de instrucciones del kit de RT-PCR TAQMAN® EZ (Applied Biosystems, Foster City, CA). El valor de MM CT se calculó como CT (gen de control interno (Sat)) - CT (transgén) - CT (gen de control interno (Sat) en planta no transgénica). El número de copias se asignó del siguiente modo según los criterios en la Tabla 12.

25 Tabla 19. Criterios para la determinación del número de copias por TAQMAN®

Número de copias: Criterios

1: -0,5<MMCT<0,50

2: 0,5<MMCT<1,50

>2: MMCT>1,50

Las plantas que comprenden genes de la presente invención se analizarán por procedimientos TAQMAN® para el número de copias. Análisis de transferencia Southern para confirmar la determinación del número de copias por TAQMAN® en aproximadamente el 80 % de las plantas que se analizaron por tanto TAQMAN® como hibridación por transferencia Southern.

30 Ejemplo 28. Ensayos para expresión génica

La expresión de un transgén de la presente invención se ensayó por RT-PCR TAQMAN® usando el kit de RT-PCR TAQMAN® EZ de Applied Biosystems (Foster City, CA). La expresión de ARN se ensayó con respecto a la expresión de un patrón transgénico, un evento de maíz transgénico designado DBT418, que comprende un gen cryIAI de B. thuringiensis operativamente ligado a un región sin traducir 3' de pinII. El evento DBT418 expresa el gen 35 cryIAI a un nivel que confiere niveles comerciales de resistencia a insectos lepidópteros tales como el barrenador europeo del maíz y se vendió comercialmente por DEKALB Genetics Corporation con el nombre de marca DEKALBt®. Los vectores de destino de GATEWAY™ pMON65154 y pRG76 se construyeron con una secuencia derivada de la región 3' del gen pinII de patata que podría usarse para ensayar niveles de transcrito de transgén para cualquier secuencia codificante insertada en el vector de destino. Los cebadores de pinII y la sonda

40 previamente descritos se usaron para RT-PCR TAQMAN®. Se usó ARN de unión a proteína de fusión de ubiquitina (UBI) como control interno en todos los ensayos de RT-PCR TAQMAN®. Los cebadores de UBI usados fueron del siguiente modo:

Cebador directo 5' cgtctacaatcagaaggcgtaatc 3' (SEC ID Nº: 83) Cebador inverso 5' ccaacaggtgaatgcttgatagg 3' (SEC ID Nº: 84)

La secuencia de la sonda TAQMAN® de UBI fue

5' catgcgccgctttgcttc 3' (SEC ID Nº: 85)

La sonda TAQMAN® de UBI se marcó en su extremo 5' con el colorante fluorescente VIC™ (Applied Biosystems, Foster City, CA) y el colorante extintor TAMRA en su extremo 3'

5 La transcripción inversa, amplificación por PCR y sondaje por TAQMAN® se realizaron según el procedimiento de una etapa descrito en el kit de RT-PCR TAQMAN® EZ (Applied Biosystems, Foster City, CA). Se usaron cinco a 100 nanogramos de ARN total en cada ensayo. El ARN de control transcrito in vitro del evento DBT418 se incluyó como control sobre cada placa y se ejecutó sobre un intervalo de concentración de 0,01 picogramos a 10 picogramos. ElARN total de la hoja de DBT418 y de MAÍZ DE GERMOPLASMA A consanguíneo no transgénico se ejecutaron como controles positivos y negativos, respectivamente. Se realizó RT-PCR en tampón TAQMAN® EZ (bicina 50 mM, acetato de potasio 115 mM, EDTA 0,01 mM, referencia 1 pasiva 60 mM, 8 % de glicerol, pH 8,2, Applied Biosystems, Foster City, CA) que contenía acetato de manganeso 3 mM, 300 μM de cada dATP, dCTP, dGTP y dUTP, 100 unidades de ADN polimerasa rTth™ (Applied Biosystems, Foster City, CA) y 25 unidades de AmpErasa UNG (Applied Biosystems, Foster City, CA). La RT-PCR se llevó a cabo del siguiente modo: 2 minutos a 50 ºC, 30

15 minutos a 60 ºC, 5 minutos a 95 ºC, seguido de 40 ciclos de 20 segundos a 95 ºC y 1 minuto a 60 ºC. Se usaron 400 nM de cada cebador directo e inverso para la amplificación de la secuencia de pinII y se usó sonda de pinII TAQMAN® 200 nM para la detección. Se amplificó ARN de UBI usando 400 nM de cada cebador directo e inverso y se usó sonda TAQMAN® de UBI 200 nM para la detección. La fluorescencia de TAQMAN® se midió usando un sistema de detección de secuencias ABI Prism 7700 o sistema de detección de secuencias ABI7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA). La expresión de transgenes de la presente invención se cuantificó con respecto a la expresión de transgenes en DBT418 y se informó como una relación de expresión de transgenes con respecto a la expresión de DBT418, es decir, 2-(MMCT) (transgén) / 2-(MMCT) (DBT418).

Ejemplo 29. Cultivo de plantas

Puede usarse retrocruzamiento para mejorar una planta de partida. El retrocruzamiento transfiere un rasgo deseable

25 específico de una fuente a una planta consanguínea u otra planta que carece de ese rasgo. Esto puede llevarse a cabo, por ejemplo, cruzando primero un consanguíneo superior (A) (padre recurrente) con un consanguíneo donante (padre no recurrente) que lleva el (los) gen(es) apropiado(s) para el rasgo en cuestión, por ejemplo, una construcción preparada según la presente invención. La progenie de este cruce se selecciona primero en la progenie resultante para el rasgo deseado a transferir del padre no recurrente, luego la progenie seleccionada se aparea de nuevo con el padre recurrente superior (A). Después de cinco o más generaciones de retrocruce con selección para el rasgo deseado, la progenie es hemicigótica para loci que controlan la característica que se transfiere, pero son similares al padre superior para la mayoría o casi todos los otros genes. La última generación de retrocruce se autofecunda para dar la progenie que se cultiva de forma pura para el (los) gen(es) que se transfiere(n), es decir, uno o más eventos de transformación.

35 Por tanto, a lo largo de una serie de manipulaciones de cultivo, un transgén seleccionado puede moverse de una línea a una línea totalmente diferente sin la necesidad de manipulación recombinante adicional. Los transgenes son valiosos ya que normalmente se comportan genéticamente como cualquier otro gen y pueden manipularse por técnicas de cultivo de un modo idéntico a cualquier otro gen de maíz. Por tanto, pueden producirse plantas consanguíneas que son cultivos reales para uno o más transgenes. Cruzando diferentes plantas consanguíneas puede producirse un gran número de híbridos diferentes con diferentes combinaciones de transgenes. De esta forma pueden producirse plantas que tienen las propiedades agronómicas deseables frecuentemente asociadas a híbridos (“vigor de híbridos”), además de las características deseables conferidas por uno o más transgenes.

Se desea introgredir los genes de la presente invención en híbridos de maíz para la caracterización del fenotipo conferido por cada gen en una planta transformada. El genotipo del huésped en que el transgén se introdujo,

45 preferentemente MAÍZ DE GERMOPLASMA A, es un consanguíneo de élite y, por tanto, sólo es necesario cultivo limitado con el fin de producir híbridos de maíz de alto rendimiento. La planta transformada, regenerada a partir decallo, se cruza con el mismo genotipo, por ejemplo, MAÍZ DE GERMOPLASMA A. La progenie se autopoliniza dos veces y se identifican plantas homocigóticas para el transgén. Las plantas transgénicas homocigóticas se cruzan con un padre de cruce de prueba con el fin de producir híbridos. El padre de cruce de prueba es un consanguíneo que pertenece a un grupo heterótico que es diferente del padre transgénico y para el que se sabe que pueden generarse híbridos de alto rendimiento, por ejemplo, se producen híbridos de cruces de MAÍZ DE GERMOPLASMAA con tanto MAÍZ DE GERMOPLASMA E como MAÍZ DE GERMOPLASMA B.

Ejemplo 30. Procedimientos de evaluación del fenotipo

La expresión de los genes de la presente invención conduce a diversos fenotipos como se desvela en el presente

55 documento en células y plantas transformadas. Se recogen datos fenotípicos durante el procedimiento de transformación en callo, además de durante la regeneración de plantas, además de en plantas y progenie. Se recogen datos fenotípicos en callo transformado que está relacionados con el aspecto morfológico, además del crecimiento del callo, por ejemplo, abundante en brotes, abundante en raíces, almidonado, mucoide, no embriogénico, elevada velocidad de crecimiento, disminución de la velocidad de crecimiento, muerte. Se espera que un experto en la materia pueda reconocer otras características fenotípicas en callo transformado.

También se recogen datos fenotípicos durante el procedimiento de regeneración de plantas, además de en plantas regeneradas transferidas a la tierra. Los datos fenotípicos incluyen características tales como plantas normales, plantas pobladas, hojas estrechas, hojas rayadas, fenotipo nodoso, clorosis, albino, producción de antocianinas, desarrollo en forma de látigo (un fenómeno conocido en la técnica en el que la mayoría de las hojas recientemente emergidas son alargadas y envueltas las unas alrededor de las otras), o panojas, mazorcas o raíces alteradas. Se espera que un experto en la materia pueda reconocer otras características fenotípicas en plantas transformadas.

Se monitoriza una amplia variedad de fenotipos durante el procedimiento de cultivo y prueba de plantas en plantas tanto consanguíneas como híbridas. Por ejemplo, en plantas R0 y R1 (plantas directamente regeneradas a partir del callo y la progenie directa de aquellas plantas) se registran tipo de planta (características morfológicas generales tales como aquellas descritas anteriormente para plántulas) y composición nutricional del grano producido por las plantas. El análisis de la composición nutricional puede incluir composición de aminoácidos, cantidad de proteína, almidón y aceite, pueden medirse todas las características de proteína, almidón y aceite, fibra, ceniza, contenido de mineral. Se espera que un experto en la materia pueda incluir análisis de otros componentes del grano. En plantas R2 y R3 se observan los días hasta la liberación de polen, días hasta la emisión de estigmas y tipo de planta. Además, se realiza el perfilado de metabolitos de plantas R2. Usando procedimientos disponibles para aquellos expertos en la materia, 50 a 100 o más metabolitos pueden analizarse en una planta, estableciéndose así una huella metabólica de la planta. Además, en plantas R3, la velocidad de extensión de las hojas se mide en condiciones de campo. Se ensayará una variedad de fenotipos en híbridos que comprenden un transgén de la presente invención. Por ejemplo, se registrarán rendimiento, humedad, peso de prueba, composición nutricional, contenido de clorofila, temperatura de la hoja, posición, vigor de las plantas de semillero, altura de la planta, número de hojas, macollamiento, raíces de anclaje, capacidad de permanecer verde, encamado del tallo, encamado de las raíces, salud de la planta, esterilidad/prolificidad, quebrado en verde, resistencia a plagas (incluyendo enfermedades, virus e insectos) y perfiles metabólicos. Además, se registrarán las características fenotípicas del grano recolectado de híbridos, que incluyen número de granos por fila en la mazorca, número de filas de granos en la mazorca, aborto de granos, peso del grano, tamaño del grano, densidad de granos y calidad física de los granos. Además, características tales como fotosíntesis, área de la hoja, estructura de la cáscara, velocidad de secado de los granos y longitud internodal pueden medirse en híbridos o consanguíneos. Se espera que el perfilado transcripcional pueda realizarse en plantas transgénicas que expresan genes de la presente invención.

Con el fin de determinar el rendimiento de híbridos en plantas transgénicas que expresan genes de la presente invención, se reconoce que los híbridos deben probarse en múltiples localizaciones en una localización geográfica en la que el maíz se cultiva convencionalmente, por ejemplo, Iowa, Illinois u otras localizaciones en el centro-oeste de los Estados Unidos. Se espera que sea deseable más de un año de prueba de rendimiento con el fin de identificar transgenes que contribuyen a la mejora de un híbrido de maíz. Por tanto, los híbridos transgénicos se evaluarán en un primer año en un número suficiente de localizaciones para identificar al menos una diferencia de rendimiento de aproximadamente el 10 % de un homólogo híbrido no transgénico. Se realiza un segundo año de pruebas de rendimiento en suficientes localizaciones y con suficientes repeticiones para poder identificar una diferencia de rendimiento del 4-5 % entre dos híbridos. Además, en el segundo año de pruebas de rendimiento, los híbridos se evaluarán bajo condiciones de campo normales, además de bajo condiciones de estrés, por ejemplo, en condiciones de estrés por agua o densidad de población. Un experto en la materia sabe cómo diseñar un ensayo de rendimiento de forma que pueda detectarse una diferencia de rendimiento estadísticamente significativa entre dos híbridos a la tasa de precisión deseada.

Ejemplo 31. Esterilización y empapamiento superficial de semillas de maíz.

Para cada lote transgénico, esterilizar superficialmente aproximadamente 50 semillas de maíz poniéndolas en un matraz Erlenmeyer de 500 ml estéril con 50 ml de 30 % de disolución de blanqueador (disolución de hipoclorito de sodio = Clorox o equivalente) que contiene 0,01 % de Triton X-100 y rotar el matraz en un agitador orbital durante 5 minutos. Luego escurrir la disolución de blanqueador y lavar con aproximadamente 100 ml de agua desionizada estéril y escurrir el lavado de agua. Repetir el lavado con agua estéril 4 veces más, dejando el último lavado de agua sobre las semillas. Incubar las semillas en este agua a temperatura ambiente durante 24 h para empapamiento bajo burbujeo de aire (filtro de paso a través de 0,2 μm).

I. Preparación de medio en fitobandejas.

Preparar medio de agua-agar para varias fitobandejas. Los presentes inventores están usando fitobandeja II (o caja de plástico: 60 x 30 x 15 cm) en la posición invertida de manera que el lado de mayor profundidad del recipiente está en el fondo y el lado más pequeño se usa como tapa. Preparar suficiente medio de agua-agar para 100 ml por fitobandeja esterilizando en autoclave el 0,3 % de BactoAgar en agua desionizada durante 45 minutos en el ciclo líquido. Enfriar el medio hasta el punto de que pueda manipularse fácilmente y verter aproximadamente 100 ml por fitobandeja mientras que todavía está fundido.

II. Ensayo de vigor de las plantas de semillero al frío en maíz.

•: Cuando el medio ha solidificado, llevarlo y las semillas estériles a una campana de flujo laminar.

•: Usar fórceps estériles, seleccionar 20 semillas sanas, lo más uniformes, y disponer las semillas en cada fitobandeja usada para el ensayo, separar las semillas uniformemente de manera que cualquier individuo pueda sacarlas fácilmente después.

•: Disponer las semillas de manera que el lado del embrión esté diagonalmente insertado hacia abajo y la semilla esté justo debajo de la superficie del agar. En esta posición, el brote y raíz emergentes podrán estirarse directamente sin estorbar.

•: Incubar las semillas en el medio a 22 ºC durante una semana, o hasta que la mayoría de las semillas tengan radículas extruidas y estén empezando a emerger del agar.

•: Sacar todas, excepto las 10 plantas de semillero más uniformemente cultivadas, en una campana de flujo laminar.

•: Desplazar las fitobandejas a un equipo de cámara de crecimiento de plantas frío a 10 ºC con ciclo de día de 16 horas e incubar allí durante 2 semanas.

•: Desplazar las fitobandejas de nuevo a 22 ºC durante una semana.

•: Sacar las plantas de semillero, medir la longitud de las raíces y la longitud de los brotes para cada planta de semillero y medir el peso fresco en g/3 plantas de semillero, registrar en el cuaderno.

Adaptación para germinación en frío y ensayo de emergencia.

Lo mismo que antes con las siguientes excepciones:

•: Después del último lavado con agua en I., disponer los matraces a 10 ºC durante la etapa de empapamiento durante la noche. También enfriar previamente las fitobandejas con medio solidificado a 10 ºC.

•: Después de sembrar las fitobandejas enfriadas con semillas empaparas en frío, se ponen directamente en la cámara de 10 ºC.

•: Después de aproximadamente 5 días, sacar todas las semillas, excepto las 10 semillas más uniformemente germinadas, aquellas cuyas radículas tienen aproximadamente la misma longitud. Devolver las fitobandejas a la cámara de 10 ºC durante 1-2 semanas. Sacar las plantas de semillero, medir la longitud de las raíces y la longitud de los brotes para cada planta de semillero y medir el peso fresco en g/3 plantas de semillero, registrar en el cuaderno.

•: Desplazar el 2º conjunto de fitobandejas a 22 ºC durante 1 semana.

Sacar las plantas de semillero, medir la longitud de las raíces y la longitud de los brotes para cada planta de semillero, registrar en el cuaderno.

Ejemplo 31. Creación de plásmidos para la transformación de soja.

Ejemplo (para construcciones de CspA y B - pMON73983 y 73984)

pMON73983 (Figura 18) es un vector binario para transformación mediada por Agrobacterium y expresión constitutiva de una proteína (SEC ID Nº: 1) similar a CspA de Bacillus subtilis en soja. Para clonar el gen CspA de B. subtilis, dos cebadores específicos para genes, MSA452 y MSA453, se diseñaron basándose en la información de secuencias de CspA (Genbank nº M30139) del Centro nacional para información biotecnológica, que es parte de la Biblioteca nacional de medicina, a su vez parte de los Institutos nacionales de salud (NCBI). La secuencia para MSA452 es GCGCAGGCCTAGATGTACCATGTCCGGTAAAATGACTGGTATCGTAAAATGG (SEC ID Nº: 86), que se hibrida en el sitio de iniciación de la traducción de CspA e introduce sitios StuI y BglII en el extremo 5', mientras que la secuencia de MSA453 es CGCGAATTCGGATCCTTATTACAGGCTGGTTACGTTACCAGCTGCC (SEC ID Nº: 87), que se hibrida en el último codón de CspA e introduce sitios BamHI y EcoRI al final del cebador. El cebador inverso MSA453 se diseñó para coincidir con el extremo 3' de la secuencia de genes de Genbank. La reacción de PCR se llevó a cabo usando cebadores MSA452 y MSA453, Taq polimerasa de alta fidelidad (BRL) y pMON57397 (Figura 3) como molde. Este molde se diferencia en el extremo 3' del gen CspA del de la secuencia de GeneBank. El ADN de CspB amplificado se purificó por electroforesis en gel y se ligó con el vector pCR-XL-TOPO (Invitrogen). La reacción de ligación se transformó en células Top10 de E. coli (Invitrogen) según el protocolo del fabricante. Se recogieron cuatro colonias transformantes y se preparó ADN de minipreparación usando el kit Qiagen Miniprep. Los insertos se secuenciaron usando cebadores directos e inversos específicos para M13. El clon con la secuencia correcta se llamó pMON73981 y se usó para la posterior subclonación.

Se digirió ADN de pMON73881 con StuI y BamHI para aislar el fragmento de gen CspA. Se digirió ADN de pMON73980 con StuI y BamHI secuencialmente, y luego se purificó por el kit Gene Clean 11. El fragmento de CspB y este vector purificado pMON73980 se ligaron y la reacción de ligación se electrotransformó en linfocitos B de DH10 de E. coli. Los transformantes se seleccionaron sobre medio que contenía espectinomicina. El ADN de minipreparación se preparó a partir de los transformantes y el ADN se comprobó para la presencia del inserto usando cebador directo específico para el promotor 35S del CaMV. El clon que contiene este inserto se llamó pMON73983. Se preparó una preparación de ADN mayor y se llevaron a cabo una serie de digestos confirmatorios, que incluyeron BglII, EcoRI, PstI, EcoRI+BamHI, StuI+XhoI. Éstos confirmaron la clonación correcta.

pMON73984 es un vector binario para transformación mediada por Agrobacterium y expresión constitutiva de una proteína (SEC ID Nº: 2) similar a CspB de Bacillus subtilis en Arabidopsis. Para clonar el gen CspB de B. subtilis, dos cebadores específicos para genes, MSA454 y MSA455, se diseñaron basándose en la información de la secuencia de CspB (Genbank nº X59715) del Centro nacional para información biotecnológica, que es parte de la Biblioteca nacional de medicina, a su vez parte de los Institutos nacionales de salud (NCBI). La secuencia para MSA454 es GCGCAGGCCTAGATGTACCATGTTAGAAGGTAAAGTAAAATGGTTCAACTCTG (SEC ID Nº: 88), que se hibrida en el sitio de iniciación de la traducción de CspB e introduce sitios StuI y BglII en el extremo 5', mientras que la secuencia de MSA455 es CGCGAATTCGGATCCTTATTACGCTTCTTTAGTAACGTTAGCAGCTTGTGG (SEC ID Nº: 89), que se hibrida en el último codón de CspB e introduce sitios BamHI y EcoRl al final del cebador. El cebador inverso MSA455 se diseñó para coincidir con el extremo 3' de la secuencia de genes de Genbank. La reacción de PCR se llevó a cabo usando cebadores MSA454 y MSA455, Taq polimerasa de alta fidelidad (BRL) y pMON57399 como molde. Este molde se diferencia en el extremo 3' del gen CspB del de la secuencia de GeneBank. El ADN de CspB amplificado se purificó por electroforesis en gel y se ligó con el vector pCR-XL-TOPO (Invitrogen). La reacción de ligación se transformó en células Top10 de E. coli (Invitrogen) según el protocolo del fabricante. Se recogieron cuatro colonias transformantes y se preparó ADN de minipreparación usando el kit Qiagen Miniprep. Los insertos se secuenciaron usando cebadores directos e inversos específicos para M13. El clon con la secuencia correcta se llamó pMON73982 y se usó para la posterior subclonación.

Se digirió ADN de pMON73882 con StuI y BamHI para aislar el fragmento de gen CspB. Se digirió ADN de pMON73980 con StuI y BamHI secuencialmente, y luego se purificó por el kit Gene Clean II. El fragmento de CspB y este vector purificado pMON73980 se ligaron y la reacción de ligación se electrotransformó en linfocitos B de DH10 de E. coli. Los transformantes se seleccionaron sobre medio que contenía espectinomicina. El ADN de minipreparación se preparó a partir de los transformantes y el ADN se comprobó para la presencia del inserto usando cebador directo específico para el promotor 35S del CaMV. El clon que contiene este inserto se llamó pMON73984. Se preparó una preparación de ADN mayor y se llevó a cabo una serie de digestos confirmatorios, que incluyeron BglII, EcoRI, PstI, EcoRI+BamHI, StuI+XhoI. Esto confirmó que la clonación era correcta.

Se crearon plantas de soja, mediante transformación, con las construcciones de pMON anteriormente integradas establemente en su genoma.

Ejemplo 32.

Se estudiaron plantas de maíz transformadas con construcciones de ADN de los Ejemplos 10 y 11, anteriores. Invernadero

•: Se realizaron dos experimentos, uno que probaba 10 eventos de cpsA y uno que probaba 10 eventos de cspB para la tolerancia a la sequía.

•: Se probaron 24 plantas de semillero híbridas positivas para transgén y 24 plantas de semillero negativas para transgén de cada evento (todas las semillas derivadas de mazorcas híbridas segregantes).

•: La prueba se realizó sobre bancos en un invernadero.

•: El tratamiento consistió en retener agua y monitorizar el peso de maceta total de cada maceta que contiene una planta. Macetas completamente regadas pesan aproximadamente 1000 gramos cada una y el agua se retuvo hasta que el peso de cada maceta alcanzó 400 gramos, entonces las macetas se mantuvieron a ese peso durante el resto del tratamiento.

•: Durante todo el tratamiento se determinó la altura de la planta midiendo la distancia de la superficie de la tierra en la maceta hasta la punta de la hoja “más alta”. De estas mediciones se determinaron VEH (velocidades de extensión de las hojas) comparando las alturas a intervalos entre mediciones.

•: Las comparaciones de VEH durante la sequía se hicieron entre plantas negativas para transgén y positivas para transgén dentro de un evento.

•: Para tres de diez eventos probados, plantas transgénicas para cspA fueron significativamente (p<0,10) mejoradas para VEH durante el tratamiento.

•: Para tres de diez eventos probados, plantas transgénicas para cspB fueron significativamente (p<0,10) mejoradas para VEH durante el tratamiento.

Eficacia en campo

•: Se realizaron tres experimentos usando semilla híbrida, uno que probaba 16 eventos de cspB (CA); uno que probaba 21 eventos de cspB (KS) y uno que probaba 14 eventos de cspA (HI) para la tolerancia a la sequía durante el estadio vegetativo tardío de crecimiento.

•: Para los ensayos CA y HI, las filas que contienen ~ 34 plantas, segregantes para la presencia del transgén, estuvieron presentes en seis y cuatro replicaciones, respectivamente. Las filas segregantes se derivaron de mazorcas segregantes.

•: Para KS, las filas experimentales contuvieron ~ 34 plantas; como filas transgénicas y no transgénicas, con seis replicaciones.

•: El tratamiento consistió en retener agua durante aproximadamente diez días durante la fase de

crecimiento vegetativa tardía (dando una pequeña cantidad según se necesitara para mantener plantas viables). Entonces, al final del periodo de diez días, las plantas se irrigaron bien hasta la cosecha.

•: Durante todo el tratamiento se midieron varios fenotipos que incluyeron VEH, clorofila (por SPAD-metro), y velocidad de fotosíntesis. Tras el tratamiento, fenotipos adicionales medidos incluyeron: días hasta la

5 liberación de polen y emergencia de estigmas, y componentes de mazorca tales como granos/mazorca, mazorcas con granos, peso del grano y rendimiento.

•: Las comparaciones de fenotipos se hicieron entre plantas positivas y negativas para transgén dentro de un evento y a través de la construcción.

•: En el ensayo CA, cspB como construcción (a través de todos los eventos para rasgos vegetativos y a

10 través de los seis “mejores” eventos para rasgos reproductivos), las plantas positivas para transgén fueron significativamente (p<0,10) mejoradas para VEH, temperatura de las hojas y granos/mazorca durante o tras el tratamiento de sequía.

• En el ensayo CA, eventos individuales fueron significativamente (p<0,10) mejorados para VEH, longitud

de mazorca promedio, masa de granos/mazorca, conductancia estomatal y días hasta la emisión de 15 estigmas durante o tras el tratamiento de sequía.

• En el ensayo KS, cspB como construcción (a través de todos los eventos para rasgos vegetativos y a través de los seis “mejores” eventos para rasgos reproductivos), las plantas positivas para transgén fueron significativamente (p<0,10) mejoradas para VEH, mazorcas que tienen grano/fila, granos/mazorca, granos/planta, peso de la vaina y rendimiento.

20 • En el ensayo KS, eventos individuales fueron significativamente (p<0,10) mejorados para VEH, velocidad fotosintética, conductancia estomatal, mazorcas/fila y granos/planta.

• En el ensayo HI, tres eventos fueron significativamente (p<0,10) mejorados para VEH (el contenido de clorofila fue el único otro fenotipo medido en HI)

Resúmenes de resultados de CA y KS:

25 Resumen de resultados de la eficacia en campo para sitio de cspb - ks

1.: El diseño del campo, uniformidad del sitio y ejecución de la siembra y muestreo estuvieron todos de acuerdo con un experimento de alta calidad que puede generar conjuntos de datos informativos.

2.: El tratamiento limitado con agua se aplicó de un modo que produjera impactos del tratamiento sobre todos los fenotipos medidos, particularmente VEH, clorofila y velocidades fotosintéticas.

30 3. Los impactos del tratamiento sobre los fenotipos vegetativos y reproductivos fueron suficientes para ser estadísticamente reales y para permitir que se observaran mejoras mediadas por transgén a niveles estadísticamente significativos.

4. Uno o más eventos fueron estadísticamente mejorados en plantas que contienen transgén para VEH, clorofila, velocidad fotosintética, conductancia estomatal, temperatura de las hojas, días hasta la liberación

35 de polen, días hasta la emisión de estigmas, intervalo antesis-emisión de estigmas, mazorcas/terreno, granos/mazorca, granos/planta, peso de la vaina y rendimiento estimado.

5. Se observó mejora estadística al nivel de la construcción a p<0,10 en el tratamiento seco para VEH, mazorcas/terreno, granos/mazorca, granos/planta, peso de la vaina y rendimiento estimado, y para VEH en el tratamiento húmedo.

40 Tabla 20.

Evento Tratamiento Fenotipo mejorado Valor de p

Construcción Seco VEH (T1-T0) 0,009 Seco VEH (T2-T0) 0,009 Seco VEH (T2-T1) 0,096 Seco Conductancia estomatal 0,150 Seco Fotosíntesis 0,141 Seco Mazorcas/terreno 0,012 Seco Granos/mazorca 0,062 Seco Granos/planta 0,006 Seco Peso de la vaina 0,009 Seco Rendimiento est. 0,008 Húmedo VEH (T2-T1) 0,025 Húmedo Clorofila (-) 0,062 Húmedo Mazorcas/terreno (-) 0,185 Húmedo Granos/mazorca (-) 0,121 húmedo Granos/planta (-) 0,083 Húmedo Peso de la vaina (-) 0,132 Húmedo Rendimiento est. (-) 0,101

ZM_M38835 Seco VEH (T1-T0) 0,008 Seco Fotosíntesis 0,066 Seco Conductancia estomatal 0,064 Seco Transpiración 0,126

(continuación)

Evento Tratamiento Fenotipo mejorado Valor de p Seco Granos/planta 0,160 Seco Peso de la vaina 0,149 Seco Rendimiento 0,153 Húmedo VEH (T1-T0) 0,099 Húmedo VEH (T2-T1) (-) 0,026

ZM_M38737 Seco Fotosíntesis 0,108

Resumen de resultados de la eficacia en campo para sitio de cspb - cs (cambio de fuente)

1. El diseño del campo, de la uniformidad del sitio y de la ejecución de la siembra y del muestreo estuvieron 5 todos de acuerdo con un experimento de alta calidad que puede generar conjuntos de datos informativos.

2.: El tratamiento limitado con agua se aplicó de un modo que produjera impactos del tratamiento sobre todos los fenotipos medidos, particularmente VEH, clorofila y velocidades fotosintéticas, pero no sobre todos los fenotipos reproductivos.

3.: Los impactos del tratamiento sobre los fenotipos (vegetativos) de interés fueron suficientes para ser

10 estadísticamente reales y para permitir que se observaran mejoras mediadas por transgén a niveles estadísticamente significativos.

4. Uno o más eventos fueron estadísticamente mejorados en plantas que contienen transgén para VEH, clorofila, velocidad fotosintética, conductancia estomatal, temperatura de las hojas, días hasta la liberación de polen, días hasta la emisión de seda, intervalo antesis-emisión de estigmas, granos/mazorca, longitud

15 de mazorca promedio y masa de granos/mazorca.

5. Se observó mejora estadística al nivel de la construcción en el tratamiento en seco para VEH, temperatura de las hojas y días hasta la liberación de polen, y para IAE en el tratamiento húmedo.

Tabla 21.

Evento Tratamiento Fenotipo mejorado Valor de p

Construcción Seco VEH 0,009 Seco Temperatura de las hojas 0,027 Seco Días hasta la liberación de polen 0,192 Seco Granos/mazorca 0,080 Seco Masa de granos/mazorca 0,197 Seco Peso de prueba (lb/fanega) Neg 0,084 Húmedo VEH 0,157 Húmedo Días hasta la liberación de polen 0,098 Húmedo Longitud de mazorcas promedio 0,091 Húmedo Masa de granos/mazorca 0,010 Húmedo Peso de prueba (lb/fanega) Neg 0,188

ZM_M39583 Seco VEH 0,051 Seco Granos/mazorca 0,200 Húmedo Longitud de mazorcas promedio 0,058 Húmedo Masa de granos/mazorca 0,070

ZM_M39872 Seco VEH 0,159 Húmedo Días hasta la emisión de estigmas 0,024 Húmedo IAE 0,064

ZM_M40946 Seco VEH 0,201

ZM_M38238 Seco Días hasta la emisión de estigmas 0,176 Seco Granos/mazorca 0,192 Húmedo VEH 0,151 Húmedo Masa de granos/mazorca 0,034

ZM_M38244 Seco Conductancia estomatal 0,092 Seco Fotosíntesis 0,132 Seco Temperatura de las hojas 0,155

ZM_M38230 Seco Días hasta la emisión de estigmas 0,176

ZM_M38721 Seco Días hasta la emisión de estigmas 0,066 Seco IAE 0,109 Húmedo Días hasta la emisión de estigmas 0,117

ZM_M38714 Húmedo Días hasta la emisión de estigmas 0,010 Húmedo IAE 0,025

ZM_M40939 Seco IAE 0,109

20 Muchos de estos eventos se han probado posteriormente, para mejoras en eficiencia de la germinación en frío y crecimiento de plantas de semillero bajo condiciones frías, y no han demostrado ser eficaces. Por tanto, es poco probable que estos genes accionados por este promotor funcionen en maíz para la mejora de la germinación en frío

o el crecimiento de plantas de semillero bajo condiciones frías, pero diferentes promotores que accionan los mismos 5 genes, o diferentes proteínas de choque frío, pueden funcionar en maíz para mejorar estos fenotipos.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Monsanto Technology

10 <120> Procedimientos para potenciar la tolerancia al estrés abiótico en plantas y composiciones de los mismos

<130> Número de expediente (38-21)51768C

15 <160> 95

<170> PatentIn versión 3.2

<210> 1 20 <211> 70

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<300> 25 <301> Goldstein, y col

<302> Proteína de choque frío principal de Escherichia coli

<303> Proceedings of the National Academy of sciences (USA)

<304> 87

<305> 1 30 <306> 283-287

<307>

<308> M30139

<309>

<313> (1)..(70) 35

<400> 1

40 <210> 2

<211> 67

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

45 <300>

<308> X59715

<309>

<313> (1)..(67)

<400> 2

<210> 3 5 <211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 10 <223> Motivo de Prosite PS00352

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222>: (6)..(6) 15 <223> xaa= 6 a 7 aminoácidos (cualquier aminoácido)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222>: (15)..(15) 20 <223> xaa= cualquier aminoácido

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222>: (17)..(17) 25 <223> xaa= cualquier aminoácido

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222>: (22)..(22) 30 <223> xaa= cualquier aminoácido

<400> 3

<210> 4

<211> 545

<212> ADN

<213> Glycine max 40

<220>

<221> CDS

<222> (61)..(354)

<400> 4

5 <210> 5

<211> 98

<212> PRT

<213> Glycine max

10 <400> 5 <210> 6

<211> 255 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Secuencia artificial con alguna similitud a CspA de E. coli 10

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(252)

15 <400> 6

<210> 7 20 <211> 84

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 25 <223> Construcción sintética

<400> 7 <210> 8

<211> 246 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Con alguna similitud a CspB de B. subtilis 10

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(243)

15 <400> 8

<210> 9 20 <211> 81

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción sintética

<400> 9

<210> 10

<211> 877

<212> ADN

10: <213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS

<222> (528)..(743)

15

<300>

<308> L28429

<309>

<313> (1)..(877)

20

<400> 10

<210> 11

<211> 71

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 11

<210> 12

<211> 1601 5 <212> ADN

<213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS 10 <222> (243)..(452)

<300>

<308> D28496

<309> 15 <313> (1)..(1601)

<400> 12

<210> 13

<211> 69

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 13

<210> 14

<211> 351 5 <212> ADN

<213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS 10 <222> (74)..(298)

<300>

<308> P24245

<309> 15 <313> (1)..(351)

<400> 14

20

<210> 15

<211> 74

<212> PRT

<213> Escherichia coli

25

<400> 15

<210> 16

<211> 301 5 <212> ADN

<213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS 10 <222> (62)..(259)

<300>

<308> P39819

<309> 15 <313> (1)..(301)

<400> 16

20

<210> 17

<211> 66

<212> PRT

<213> Escherichia coli

25

<400> 17

<210> 18

<211> 994 5 <212> ADN

<213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS 10 <222> (560)..(772)

<300>

<308> D63344

<309>

<313> (1)..(994) 15

<400> 18

<210> 19

<211> 70

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 19

<210> 20

<211> 351 5 <212> ADN

<213> Agrobacterium tumefaciens

<220>

<221> CDS 10 <222> (125)..(334)

<300>

<308> AAK90623

<309> 15 <313> (1)..(351)

<400> 20

<210> 21

<211> 69

<212> PRT

<213> Agrobacterium tumefaciens 25

<400> 21 <210> 22

<211> 301 5 <212> ADN

<213> Agrobacterium tumefaciens

<220>

<221> CDS 10 <222> (59)..(262)

<300>

<308> AAK89225

<309> 15 <313> (1)..(301)

<400> 22

<210> 23

<211> 67

<212> PRT

<213> Agrobacterium tumefaciens

<400> 23

<210> 24

<211> 251 5 <212> ADN

<213> Agrobacterium tumefaciens

<220>

<221> CDS 10 <222> (27)..(242)

<300>

<308> AAK87945

<309> 15 <313> (1)..(251)

<400> 24

<210> 25

<211> 71

<212> PRT

<213> Agrobacterium tumefaciens 25

<400> 25 <210> 26

<211> 651 5 <212> ADN

<213> Agrobacterium tumefaciens

<220>

<221> CDS 10 <222> (297)..(605)

<300>

<308> AAK87573

<309> 15 <313> (1) .. (651)

<400> 26

<210> 27

<211> 102

<212> PRT

<213> Agrobacterium tumefaciens

<400> 27

<210> 28

<211> 301 5 <212> ADN

<213> synechocystis PCC6803

<220>

<221> CDS 10 <222> (22)..(273)

<400> 28

<210> 29

<211> 83

<212> PRT

<213> Synechocystis PCC6803

<400> 29

5 <210> 30

<211> 401

<212> ADN

<213> Synechocystis PCC6803

10 <220>

<221> CDS

<222> (91)..(396)

<400> 30 15

<210> 31

<211> 101

<212> PRT

<213> Synechocystis PCC6803

<400> 31

5 <210> 32

<211> 951

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

10 <220>

<221> CDS

<222> (46)..(654)

<400> 32 15

<210> 33

<211> 203

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 33

5

<210> 34

<211> 950

<212> ADN

<213> Gossypium hirsutum

10

<220>

<221> CDS

<222> (58)..(618)

15: <400> 34

<212> PRT

<213> Gossypium hirsutum

<400>: 35 10

<212> ADN

<213> Gossypium hirsutum

<220> 10 <221> CDS

<222> (42)..(377)

<220>

<221> misc_feature 15 <222> (388)..(388)

<223> n = A, G,T o C

<400> 36

<210> 37

<211> 111

<212> PRT

<213> Gossypium hirsutum

<400> 37

<210> 38

<211> 792 5 <212> ADN

<213> Glycine max

<220>

<221> CDS 10 <222> (17)..(556)

<400> 38

<210> 39

<211> 180

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 39

<210> 40

<211> 1245 5 <212> ADN

<213> Zea mays

<220>

<221> CDS 10 <222> (75)..(806)

<400> 40

<210> 41

<211> 244

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 41

<210> 42

<211> 1409 5 <212> ADN

<213> Zea mays

<220>

<221> CDS 10 <222> (27)..(995)

<400> 42

<210> 43

<211> 323

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 43

<210> 44

<211> 215 5 <212> ADN

<213> Bacillus subtilis

<220>

<221> CDS 10 <222> (15)..(215)

<300>

<308> AB001488

<309> 15 <313> (1)..(215)

<400> 44

<210> 45

<211> 66

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 45 <210> 47

<210> 46

<211> 201

<212> ADN

15: <213> Bacillus subtilis

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(201)

20

<300>

<308> L77246

<309>

<313> (1)..(201)

25

<400> 46

<211> - 66

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 47

<210> 48

<211> 198

<212> ADN

15: <213> Bacillus halodurans

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(198)

20

<300>

<308> AP001519

<309>

<313> (1)..(198)

25

<400> 48

<210> 49

<211> 65

<212> PRT

<213> Bacillus halodurans

<400> 49

<210> 50

<211> 204

<212> ADN 15 <213> corynebacterium glutamicum

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(204) 20

<400> 50

<210> 51

<211> 67

<212> PRT

<213> corynebacterium glutamicum

<400> 51

<210> 52

<211> 384

<212> ADN 15 <213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(384) 20

<400> 52

<210> 53

<211> 127

<212> PRT

<213> corynebacterium glutamicum

<400> 53

<210> 54

<211> 249 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Secuencia artificial con alguna similitud a CspA de E. coli 10

<400> 54

15 <210> 55

<211> 82

<212> PRT

<213> Artificial

20 <220>

<223> Similar a spa de E. coli

<400> 55

<210> 56

<211> 225 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Similar a CspA de E. coli 10

<400> 56

15 <210> 57

<211> 74

<212> PRT

<213> Artificial

20 <220>

<223> Proteína similar a CspA de E. coli

<400> 57

<210> 58

<211> 240 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Similar a CspB de B. subtilis 10

<400> 58

15 <210> 59

<211> 79

<212> PRT

<213> Artificial

20 <220>

<223> Similar a CspB de B. subtilis

<400> 59

<210> 60

<211> 216

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Similar a CspB de B. subtilis

<400> 60

<210> 61

<211> 71

<212> PRT 10 <213> Artificial

<220>

<223> Similar a CspB de B. subtilis

15 <400> 61

<210> 62 20 <211> 213

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 25 <223> Similar a CspA de E. coli

<400> 62

<210> 63

<211> 70

<212> PRT

<213> Proteína similar a CspA 35

<400> 63

5 <210> 64

<211> 204

<212> ADN

<213> Artificial

10 <220>

<223> Similar a CspB de B. subtilis

<400> 64

<210> 65

<211> 67

<212> PRT 20 <213> Artificial

<220>

<223> Similar a CspB de B. subtilis

25 <400> 65 <210> 66

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador para PCR

<400> 66 aggtaataca ccatggccgg taa 23

<210> 67

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador para PCR

<400> 67 ttaagcagag aattcaggct ggtt 24

<210> 68

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Marca Flag para el marcado de epítopes

<400> 68

<210> 69

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador de PCR

<400> 69 aggaggaaat tccatggtag aag 23

<210> 70

<211> 26 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador de PCR

<400> 70 tcaatttatg aattcgcttc tttagt: 26

<210> 71 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador de PCR

<220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n=a, c, t o g

<400> 71 gggcactttg tacaagaaag ctgggtn: 27

<210> 72 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador de PCR

<220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n = a, c, t o g

<400> 72 ggggcacttt gtacaagaaa gctgggtn: 28

<210> 73 <211> 14 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador de PCR

<400> 73 cctgcaggac catg: 14

<210> 74 <211> 17 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador de PCR

<400> 74 cctgcaggct cgagcta: 17

<210> 75 <211> 43

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador de PCR

<400> 75 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc ctgcaggacc atg 43

<210> 76

<211> 47

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador de PCR

<400> 76 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc cctgcaggct cgagcta 47

<210> 77

<211> 18

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador de PCR

<400> 77 ccccaccctg caatgtga 18

<210> 78

<211> 31

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador de PCR

<400> 78 tgtgcatcct tttatttcat acattaatta a 31

<210> 79

<211> 30

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador de PCR

<400> 79 cctagacttg tccatcttct ggattggcca 30

<210> 80

<211> 16

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador de PCR

<400> 80 gcctgccgca gaccaa 16

<210> 81

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador de PCR

<400> 81 atgcagagct cagcttcatc 20

<210> 82

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador de PCR

<400> 82 tccagtacgt gcagtccctc ctcc 24

<210> 83

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador de PCR

<400> 83 cgtctacaat cagaaggcgt aatc 24

<210> 84

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador de PCR

<400> 84 ccaacaggtg aatgcttgat agg 23

<210> 85

<211> 18

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador de PCR

<400> 85 catgcgccgc tttgcttc 18

<210> 86

<211> 52

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador de PCR

<400> 86 gcgcaggcct agatgtacca tgtccggtaa aatgactggt atcgtaaaat gg 52

<210> 87

<211> 46

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 5 <223> Cebador de PCR

<400> 87 cgcgaattcg gatccttatt acaggctggt tacgttacca gctgcc 46

10 <210> 88

<211> 53

<212> ADN

<213> Artificial

15 <220>

<223> Cebador de PCR

<400> 88

gcgcaggcct agatgtacca tgttagaagg taaagtaaaa tggttcaact ctg 53 20

<210> 89

<211> 51

<212> ADN

<213> Artificial 25

<220>

<223> Cebador de PCR

<400> 89 30 cgcgaattcg gatccttatt acgcttcttt agtaacgtta gcagcttgtg g 51

<210> 90

<211> 204

<212> ADN 35 <213> Artificial

<220>

<223> Codones sintéticos que optimizan CspB para la expresión en plantas

40 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(204)

<400> 90 45

<210> 91

<211> 67

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción sintética

<400> 91

10 15: <210> 92 <211> 213 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Codones sintéticos que codifican CspA

20: <220> <221> CDS <222> (1)..(213)

<400> 92

<210> 93

<211> 70

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción sintética

<400> 93

<210> 94

<211> 201

<212> ADN 10 <213> Bacillus thuringiensis

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(201) 15

<400> 94

20 <210> 95

<211> 66

<212> PRT

<213> Bacillus thuringiensis

25 <400> 95

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Una planta tolerante a la sequía que tiene insertada en el genoma de sus células un ADN recombinante que codifica una proteína que comprende un dominio de choque frío y que tiene al menos el 80 % de identidad sobre la longitud entera de las SEC ID Nº: 1, 2, 63 ó 65, en la que la expresión de dicha proteína confiere tolerancia a la sequía a dicha planta en comparación con una planta no transformada de la misma especie, siendo la sequía simulada dando a las plantas un 95 % o menos de agua que a una planta de control y determinando diferencias en el vigor, el crecimiento, el tamaño o la longitud de las raíces.
2.

La planta de la reivindicación 1, en la que dicha proteína es una proteína de choque frío bacteriana.
3.

La planta de la reivindicación 1, en la que dicha proteína tiene al menos el 90 % de identidad sobre la longitud entera de las SEC ID Nº: 1, 2, 63 ó 65.
4.

La planta de la reivindicación 3, en la que dicha proteína tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1, 2, 63 ó 65.
5.

La planta según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicha planta es

(i)

una planta de maíz; o

(ii)

una planta de soja; o

(iii) una planta de algodón; o

(iv)

una planta de trigo; o

(v)

una planta de cebada; o

(vi)

una planta de canola.
6.

Un procedimiento de producción de una planta que tiene tolerancia a la sequía potenciada que comprende insertar en el genoma de una célula o células de planta un ADN recombinante que codifica una proteína que comprende un dominio de choque frío y que tiene al menos el 80 % de identidad sobre la longitud entera de las SEC ID Nº: 1, 2, 63 ó 65, y seleccionar plantas que presentan la tolerancia a la sequía potenciada como se define en la reivindicación 1.
7.

Uso de un ADN recombinante que codifica una proteína que comprende un dominio de choque frío y que tiene al menos el 80 % de identidad sobre la longitud entera de las SEC ID Nº: 1, 2, 63 ó 65 para producir una planta que tiene tolerancia a la sequía potenciada como se define en la reivindicación 1.