ES2539110T3

ES2539110T3 - Evento de maíz MIR604

Info

Publication number: ES2539110T3
Application number: ES05723097.1T
Authority: ES
Inventors: Henry-York Steiner; Eric Chen; Moez Meghji
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 2004-03-25
Filing date: 2005-02-16
Publication date: 2015-06-26
Anticipated expiration: 2025-02-16
Also published as: PT1737290E; CN1933724B; KR101303110B1; AU2005235963A1; US20080167456A1; MXPA06009603A; WO2005103301A2; US8884102B2; RU2006137474A; ES2568896T3; US7361813B2; EP2289311A2; KR101268897B1; EP1737290A2; US8354519B2; CN1933724A; EP1737290A4; US20110111420A1; EP2281447A2; EP1737290B1

Abstract

Un método para caracterizar una planta de raíz, o una parte de la misma, que comprende un inserto heterólogo que comprende un gen cry3A055 de SEC ID NO: 59 flanqueado por secuencias nucleotídicas expuestas en SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 3, y SEC ID NO: 2, y SEC ID NO: 4, respectivamente, o por sus complementos, que comprende digerir el ADN genómico de la planta con la endonucleasa de restricción KpnI y sondar el ADN digerido con una sonda que comprende al menos una molécula de ácido nucleico de longitud suficiente de nucleótidos contiguos homólogos o complementarios a una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, y SEC ID NO: 4, que funciona como una sonda de ADN específica para dicho ADN.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

E05723097

10-06-2015

50% de la secuencia diana se hibrida a una sonda perfectamente emparejada. Típicamente, en condiciones muy restrictivas una sonda se hibridará a su subsecuencia diana, pero no a otras secuencias.

Un ejemplo de condiciones de hibridación muy restrictivas para hibridación de ácidos nucleicos complementarios los cuales tienen más de 100 restos complementarios sobre un filtro en una transferencia Southern o Northern es formamida al 50% con 1 mg de heparina a 42ºC, llevándose a cabo la hibridación durante la noche. Un ejemplo de condiciones de lavado de restricción muy elevada es NaCl 0,15M a 72ºC durante alrededor de 15 minutos. Un ejemplo de condiciones de lavado muy restrictivas es un lavado SSC 0,2x a 65ºC durante 15 minutos (véase, Sambrook, más abajo, para una descripción de disolución amortiguadora SSC).

Las condiciones de hibridación ejemplares para la presente invención incluyen hibridación en SDS al 7%, NaPO4 0,25 M pH 7,2 a 67ºC durante la noche, seguido de dos lavados en SDS al 5%, NaPO4 0,20 M pH 7,2 a 65ºC durante 30 minutos cada lavado, y dos lavados en SDS al 1%, NaPO4 0,20 M pH 7,2 a 65ºC durante 30 minutos cada lavado. Un lavado de restricción media ejemplar para dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 1x SSC a 45ºC durante 15 minutos. Un lavado de restricción baja ejemplar para un dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 4-6x SSC a 40ºC durante 15 minutos.

Para sondas de alrededor de 10 hasta 50 nucleótidos, las condiciones muy restrictivas típicamente implican concentraciones de sal de menos de alrededor de 1,0 M de ion de Na, típicamente una concentración de alrededor de 0,01 a 1,0 M de ion de Na (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3, y la temperatura típicamente es al menos alrededor de 30ºC. Las condiciones muy restrictivas también se pueden lograr con la adición de agentes de desestabilización tales como formamida. En general, una relación de señal a ruido de 2x (o mayor) que aquella observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridación particular indica la detección de una hibridación específica. Los ácidos nucleicos que no se hibridan entre sí en condiciones muy restrictivas son todavía sustancialmente idénticos si las proteínas que codifican son sustancialmente idénticas. Esto ocurre, por ejemplo, cuando una copia de un ácido nucleico se crea usando la degeneración de codón máxima permitida por el código genético.

Los siguientes son conjuntos ejemplares de condiciones de hibridación/lavado que se pueden usar para hibridar secuencias nucleotídicas que son sustancialmente idénticas a secuencias nucleotídicas de referencia como se describen aquí: una secuencia nucleotídica de referencia preferiblemente se hibrida a la secuencia nucleotídica de referencia en dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50ºC con lavado en SSC 2X, SDS al 0,1% a 50ºC, más deseablemente en dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50ºC con lavado en SSC 1X, SDS al 0,1% a 50ºC, todavía más deseablemente en dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50ºC con lavado en SSC 0,5X, SDS al 0,1% a 50ºC, preferiblemente en dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50ºC con lavado en SSC 0,1X, SDS 0.1% a 50ºC, más preferiblemente en dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50ºC con lavado en SSC 0,1X, SDS 0,1% a 65ºC. Las secuencias de la presente invención se pueden detectar usando todas las condiciones anteriores. Con el fin de definir la invención, se usan las condiciones muy restrictivas.

“Transformación” es un proceso para introducir un ácido nucleico heterólogo en una célula u organismo hospedante. En particular, “transformación” significa la integración estable de una molécula de ADN en el genoma de un organismo de interés.

“Transformado/transgénico/recombinante” se refiere a un organismo hospedante tal como una bacteria o una planta en la cual una molécula de ácido nucleico heteróloga se ha introducido. La molécula de ácido nucleico puede ser integrada establemente dentro del genoma del hospedante, o la molécula de ácido nucleico también puede estar presente como una molécula extracromosómica. Tal molécula extracromosómica puede ser autorreplicante. Se entiende que las células, tejidos o plantas transformadas engloban no solamente el producto final de un proceso de transformación, sino también la progenie transgénica de este. Un hospedante “no transformado”, “no transgénico”, o “no recombinante” se refiere a un organismo de tipo silvestre, por ejemplo una bacteria o planta, que no contiene la molécula de ácido nucleico heteróloga. Como se usa aquí, “transgénico” se refiere a una planta, célula vegetal, o multitud de células vegetales estructuradas o no estructuradas que tienen integrado, vía técnicas bien conocidas de manipulación genética e inserción génica, una secuencia de un ácido nucleico que representa un gen de interés dentro del genoma de la planta, y típicamente dentro de un cromosoma de un núcleo celular, mitocondria u otro orgánulo que contiene cromosomas, en una ubicación diferente a, o en un número de copias mayor que, aquel presente normalmente en la planta o célula vegetal nativa. Las plantas transgénicas resultan de la manipulación e inserción de las secuencias de ácido nucleico, en oposición a mutaciones de origen natural, para producir una planta de origen no natural o una planta con un genotipo de origen no natural. Las técnicas para transformación de plantas y células vegetales son bien conocidas en la técnica y pueden comprender por ejemplo electroporación, microinyección, transformación mediada por Agrobacterium, y transformación balística.

Se usa aquí la nomenclatura de bases de ADN y aminoácidos como se expone en 37 C.F.R. § 1.822.

Se describe aquí una línea mejorada genéticamente de maíz que produce la proteína de control de insectos, Cry3A055, y una enzima fosfomanosa isomerasa (PMI) que permite a la planta utilizar manosa como una fuente de carbono. Particularmente, se describe aquí un evento de maíz transgénico designado MIR604 que comprende un genotipo novedoso, así como composiciones y métodos para detectar ácidos nucleicos de este evento en una

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

E05723097

10-06-2015

muestra biológica. Se describen además plantas de maíz que comprenden el genotipo MIR604, semillas transgénicas de las plantas de maíz, y métodos para producir una planta de maíz que comprende el genotipo MIR604 por cruzamiento de un maíz endogámico que comprende el genotipo MIR604 con él mismo u otra línea de maíz. Las plantas de maíz que comprenden el genotipo MIR604 como se describe aquí son útiles para controlar plagas de insectos coleópteros que incluyen Diabrotica virgifera virgifera, el gusano de raíz de maíz del oeste, D. virgifera zeae, el gusano de raíz de maíz mejicano, y D. longicornis barberi, el gusano de raíz de maíz del norte. Las plantas de maíz que comprenden el genotipo MIR604 como se describe aquí también son capaces de utilizar manosa como una fuente de carbono.

En un aspecto, se describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende al menos 10 o más (por ejemplo, 15, 20, 25, ó 50) nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN heteróloga insertada dentro del genoma de planta de maíz del evento de maíz MIR604 y al menos 10 o más (por ejemplo, 15, 20, 25 ó 50) nucleótidos contiguos de un ADN de genoma de planta de maíz que flanquea el punto de inserción de una secuencia de ADN heteróloga insertada dentro del genoma de la planta de maíz del evento de maíz MIR604. También están incluidas las secuencias nucleotídicas que comprenden 10 o más nucleótidos de secuencia de inserto contigua del evento MIR604 y al menos un nucleótido de ADN de flanqueo del evento MIR604 adyacente a la secuencia de inserto. Tales secuencias nucleotídicas son de diagnóstico para evento MIR604. La amplificación de ácido nucleico de ADN genómico del evento MIR604 produce un amplicón que comprende tales secuencias nucleotídicas de diagnóstico.

En otro aspecto, se describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia nucleotídica que comprende al menos una secuencia de unión del evento MIR604 seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, y sus complementos, en la que una secuencia de unión abarca la unión entre un casete de expresión heterólogo insertado dentro del genoma de maíz y el ADN del genoma de maíz que flanquea el sitio de inserción y es de diagnóstico para el evento.

En otro aspecto, se describe un ácido nucleico aislado que liga una molécula de ADN heteróloga al genoma de la planta de maíz en el evento de maíz MIR604, que comprende una secuencia de desde alrededor de 11 hasta alrededor de 20 nucleótidos contiguos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, y sus complementos.

En otro aspecto, se describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, y sus complementos.

En un aspecto, se describe un amplicón que comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, y sus complementos.

En otro aspecto, se describen cebadores de secuencia de flanqueo para detectar el evento MIR604. Tales cebadores de secuencia de flanqueo comprenden una secuencia de ácido nucleico aislada que comprende al menos 10-15 nucleótidos contiguos de nucleótidos 1-801 de SEC ID NO: 3 (designada arbitrariamente aquí como la secuencia de flanqueo 5’), o sus complementos. En un subaspecto, los cebadores de secuencia de flanqueo se seleccionan del grupo que consiste en SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, y sus complementos.

En otro aspecto, se describen cebadores de secuencia de flanqueo que comprenden al menos 10-15 nucleótidos contiguos de los nucleótidos 507-1570 de SEC ID NO: 4 (designada arbitrariamente aquí como la secuencia de flanqueo 3’), o sus complementos. En un aspecto, los cebadores de secuencia de flanqueo se seleccionan del grupo que consiste en SEC ID NO: 39, SEC ID NO: 40, SEC ID NO: 41, SEC ID NO: 42, SEC ID NO: 43, SEC ID NO: 44, SEC ID NO: 45, SEC ID NO: 46, y sus complementos.

En todavía otro aspecto, se describe un par de cebadores polinucleotídicos que comprenden un primer cebador polinucleotídico y un segundo cebador polinucleotídico los cuales funcionan juntos en la presencia de un molde de ADN de evento de maíz MIR604 en una muestra para producir un amplicón de diagnóstico para el evento de maíz MIR604, en el que la primera secuencia de cebador es o es complementaria a un genoma de planta de maíz que flanquea el punto de inserción de una secuencia de ADN heteróloga insertada dentro del genoma de la planta de maíz del evento de maíz MIR604, y la segunda secuencia de cebador polinucleotídico es o es complementaria a la secuencia de ADN heteróloga insertada dentro del genoma de la planta de maíz del evento de maíz MIR604.

En un subaspecto, el primer cebador polinucleotídico comprende al menos 10 nucleótidos contiguos de posición 1801 de SEC ID NO: 3 o sus complementos. En un subaspecto adicional, el primer cebador polinucleotídico comprende la secuencia nucleotídica expuesta en SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, o sus complementos. En otro subaspecto, el primer cebador polinucleotídico comprende al menos 10 nucleótidos contiguos de posición 507-1570 de SEC ID NO: 4 o sus complementos. En otro subaspecto, el primer cebador polinucleotídico comprende la secuencia nucleotídica expuesta en SEC ID NO: 39, SEC ID NO: 40, SEC ID NO: 41, SEC ID NO: 42, SEC ID NO: 43, SEC ID NO: 44, SEC ID NO: 45, SEC ID NO: 46, o sus complementos. En todavía otro subaspecto, el segundo cebador polinucleotídico comprende al menos 10 nucleótidos contiguos de SEC ID NO: 57, SEC ID NO: 58, SEC ID

imagen8

imagen9

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

E05723097

10-06-2015

usando un método de amplificación de ácido nucleico o de hibridación de ácido nucleico. En otro subaspecto, la muestra se selecciona de harina de maíz, jarabe de maíz, aceite de maíz, almidón de maíz y cereales fabricados completamente o en parte para contener productos de maíz.

Aún en otro aspecto, se describe un método para producir una planta de maíz resistente a al menos una infestación de gusanos de raíz de maíz, que comprende: (a) cruzar sexualmente una primera planta de maíz progenitora con una segunda planta de maíz progenitora, en el que dicha primera o segunda planta de maíz progenitora comprende el ADN del evento de maíz MIR604, produciendo de ese modo una pluralidad de plantas de progenie de primera generación; (b) seleccionar una planta de progenie de primera generación que es resistente a al menos la infestación de gusanos de raíz del maíz; (c) autofecundar la planta de progenie de primera generación, produciendo de ese modo una pluralidad de plantas de progenie de segunda generación; y (d) seleccionar de las plantas de progenie de segunda generación, una planta que es al menos resistente a la infestación de gusanos de raíz del maíz; en el que las plantas de progenie de segunda generación comprenden una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2.

En otro aspecto, se describe un método para producir semillas de maíz híbridas, que comprende: (a) sembrar semillas de una primera línea de maíz endogámica que comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, y SEC ID NO: 4, y semillas de una segunda línea endogámica que tiene un genotipo diferente; (b) cultivar las plantas de maíz que resultan de dicha siembra hasta el momento de la floración; (c) emascular dichas flores de plantas de una de las líneas endogámicas de maíz;

(d) cruzar sexualmente entre sí las dos líneas endogámicas diferentes; y (e) cosechar la semilla híbrida producida de ese modo. En un subaspecto, la primera línea de maíz endogámica proporciona los progenitores femeninos. En otro subaspecto, la primera línea de maíz endogámica proporciona los progenitores masculinos. También se describe aquí la semilla híbrida producida por el método divisado, y plantas híbridas que se hacen crecer a partir de la semilla.

Un experto en la técnica reconocerá que el genotipo transgénico como se describe aquí se puede introgresar mediante reproducción en otras líneas de maíz que comprenden diferentes genotipos transgénicos. Por ejemplo, el maíz endogámico que comprende el genotipo transgénico como se describe aquí se puede cruzar con un maíz endogámico que comprende el genotipo transgénico del evento Bt11 resistente a lepidópteros, que se conoce en la técnica, produciendo de esta manera semillas de maíz que comprenden tanto el genotipo transgénico como se describe aquí como el genotipo transgénico Bt11. Los ejemplos de otros eventos transgénicos que pueden cruzarse con un endogámico como se describe aquí incluyen los eventos tolerantes al glifosato GA21 y NK603, el evento MON802 resistente a insectos lepidópteros/tolerante a glifosato, el evento DBT418 resistente a lepidópteros, el evento DAS-06275-8 resistente a lepidópteros, el evento MS3 estéril masculino, el evento B16 tolerante a la fosfinotricina, el evento MON 80100 resistente a insectos lepidópteros, los eventos T14 y T25 tolerantes a fosfinotricina, el evento 176 resistente a insectos lepidópteros, y el evento MON863 resistente a coleópteros, todos los cuales se conocen en la técnica. Se reconocerá además que se pueden realizar otras combinaciones con el genotipo transgénico como se describe aquí.

Un experto en la técnica también reconocerá que la semilla de maíz transgénico que comprende el genotipo transgénico como se describe aquí puede tratarse con diversas sustancias químicas de tratamiento de semillas, incluyendo insecticidas, para aumentar o sinergizar la actividad insecticida de la proteína Cry3A055. Por ejemplo, la semilla de maíz transgénica como se describe aquí puede tratarse con el insecticida comercial Cruiser®. Tal combinación puede usarse para incrementar el espectro de actividad y para incrementar la eficacia de la proteína expresada y la sustancia química.

Reproducción

El genotipo transgénico como se describe aquí puede hacer introgresar en cualquier maíz endogámico o híbrido que usa las técnicas de reproducción reconocidas en la técnica. El objetivo de la reproducción vegetal es combinar en una variedad o híbrido único diversos rasgos deseables. Para cultivos de campo, estos rasgos pueden incluir resistencia a insectos y enfermedades, tolerancia a herbicidas, tolerancia al calor y la sequía, reducción del tiempo para maduración del cultivo, mayor rendimiento, y calidad agronómica mejorada. Con la cosecha mecánica de muchos cultivos, es importante la uniformidad de características de la planta tales como germinación y establecimiento en reposo, velocidad de crecimiento, madurez, y altura de la planta y la mazorca.

Los cultivos de campo se reproducen a través de técnicas que aprovechan el método de polinización de la planta. Una planta se autopoliniza si el polen de una flor se transfiere a la misma u otra flor de la misma planta. Una planta se poliniza cruzadamente si el polen proviene de una flor en una planta diferente.

Las plantas que se han autopolinizado y seleccionado por tipo para muchas generaciones se vuelven homocigotas en casi todos los loci génicos, y producen una población uniforme de progenie de reproducción verdadera. Un cruzamiento entre dos líneas homocigóticas diferentes produce una población uniforme de plantas híbridas que pueden ser heterocigotas para muchos loci génicos. Un cruzamiento de dos plantas, cada una heterocigota en un número de loci génicos, producirá una población de plantas híbridas que difieren genéticamente y no serán uniformes.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

E05723097

10-06-2015

El maíz se puede reproducir mediante técnicas tanto de autopolinización y como de polinización cruzada. El maíz tiene flores masculinas y femeninas separadas en la misma planta, localizadas sobre la panoja y la mazorca, respectivamente. La polinización natural ocurre en el maíz cuando el viento hace volar el polen desde las panojas hasta las sedas que sobresalen de las puntas de las mazorcas.

Un método fiable para controlar la fertilidad masculina en plantas ofrece la oportunidad de reproducción vegetal mejorada. Esto es especialmente cierto para desarrollo de híbridos de maíz, que se basa en algún tipo de sistema de esterilidad masculina. Existen varias opciones para controlar la fertilidad masculina disponibles para los cultivadores, tales como: emasculación (o despanojado) manual o mecánica, esterilidad masculina citoplásmica, esterilidad masculina genética, gametocidas y similares.

La semilla de maíz híbrido típicamente se produce por un sistema de esterilidad masculina que incorpora el despanojado manual o mecánico. Se plantan filas alternas de dos maíces endogámicos en un campo, y se eliminan las panojas que portan el polen de uno de los endogámicos (femenino). Siempre y cuando hay suficiente aislamiento de fuentes de polen de maíz externo, las mazorcas del endogámico despanojado serán fertilizadas solamente desde el otro endogámico (masculino), y la semilla que resulta es por lo tanto híbrida y formará plantas híbridas.

El proceso de despanojado laborioso, y ocasionalmente no fiable, puede ser evitado mediante el uso de uno de muchos métodos para conferir esterilidad masculina genética en la técnica, cada uno con sus propios beneficios e inconvenientes. Estos métodos usan una variedad de enfoques tales como suministrar a la planta un gen que codifica una sustancia citotóxica asociada con un promotor específico de tejido masculino, o un sistema no codificante en el que se identifica un gen crítico para la fertilidad y un no codificante para ese gen se inserta en la planta (véase: Fabinjanski, et al., EPO 89/3010153.8 publicación nº 329.308 y solicitud PCT nº PCT/CA90/00037 publicada como WO 90/08828).

Desarrollo de líneas endogámicas demaíz

El uso de endogámicos estériles masculinos es un y solo un factor en la producción de híbridos de maíz. Las técnicas de reproducción vegetal conocidas en la técnica y usadas en un programa de reproducción de planta de maíz incluyen, pero no se limitan a, selección recurrente, retrocruzamiento, reproducción de linaje, selección mejorada de polimorfismo de longitud de restricción, selección mejorada de marcador genético y transformación. El desarrollo de híbridos de maíz en un programa de reproducción de planta de maíz requiere, en general, el desarrollo de líneas endogámicas homocigotas, el cruzamiento de estas líneas, y la evaluación de los cruces. Los métodos de reproducción de linaje y reproducción por selección recurrente se usan para desarrollar líneas endogámicas de poblaciones de reproducción. Los programas de reproducción de planta de maíz combinan los antecedentes genéticos de dos o más líneas endogámicas u otras diferentes fuentes de germoplasma en conjuntos de reproducción a partir de los cuales se desarrollan nuevas líneas endogámicas por autofecundación y selección de fenotipos deseados. Los nuevos endogámicos se cruzan con otras líneas endogámicas, y los híbridos de estos cruces se evalúan para determinar cuál de ellos tiene potencial comercial. La reproducción vegetal y el desarrollo de híbridos, como se practica en un programa de reproducción de planta de maíz, son procesos caros y consumen tiempo.

La reproducción de linaje comienza con el cruce de dos genotipos, cada uno de los cuales puede tener una o más características deseables que falta en el otro o que complementa al otro. Si los dos progenitores originales no proporcionan todas las características deseadas, se pueden incluir otras fuentes en la población de reproducción. En el método de linaje, las plantas superiores son autofecundadas y seleccionadas en generaciones sucesivas. En las generaciones subsiguientes, la condición heterocigota cede el paso a líneas homogéneas como resultado de la autopolinización y la selección. Típicamente en el método de reproducción de linaje, se practican cinco o más generaciones de autofecundación y selección: F1  F2; F2  F3; F3  F4; F4  F5; etc.

La reproducción por selección recurrente, por ejemplo retrocruzamiento, se puede usar para mejorar una línea endogámica y un híbrido que se obtiene usando aquellos endogámicos. El retrocruzamiento se puede usar para transferir un rasgo deseable específico de un endogámico o fuente a un endogámico que carece de ese rasgo. Esto se puede lograr, por ejemplo, cruzando en primer lugar un endogámico superior (progenitor recurrente) a un endogámico donante (progenitor no recurrente), que porta el o los genes apropiados para el rasgo en cuestión. La progenie de este cruce se aparea luego nuevamente con el progenitor recurrente superior seguido de la selección en la progenie resultante para el rasgo deseado a transferir del progenitor no recurrente. Después de cinco o más generaciones de retrocruzamiento con selección del rasgo deseado, la progenie será homocigota para los loci que controlan la característica que se transfiere, pero será como el progenitor superior para esencialmente todos los otros genes. La última generación de retrocruzamiento es luego autofecundada para dar progenie de reproducción pura para el o los genes que se transfieren. Un híbrido desarrollado de endogámicos que contienen el o los genes transferidos es esencialmente el mismo que un híbrido desarrollado de los mismos endogámicos sin el o los genes transferidos.

Las líneas endogámicas de élite, esto es, líneas endogámicas homocigotas de reproducción pura, también se pueden usar como materiales de partida para poblaciones de reproducción o fuentes a partir de las cuales se desarrollan otras líneas endogámicas. Estas líneas endogámicas derivadas de líneas endogámicas élite pueden

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

E05723097

10-06-2015

desarrollarse usando los métodos de reproducción de linaje y de reproducción por selección recurrente descritos anteriormente. Como un ejemplo, cuando la reproducción de retrocruzamiento se usa para crear estas líneas derivadas en un programa de reproducción de planta de maíz, los endogámicos de élite se pueden usar como una línea parental o material de partida o población de fuente, y puede servir ya sea como el progenitor donante o recurrente.

Desarrollo de Híbridos de Maíz

Un híbrido de maíz de un solo cruce resulta del cruce de dos líneas endogámicas, cada una de las cuales tiene un genotipo que complementa el genotipo de la otra. La progenie híbrida de la primera generación se designa F1. En el desarrollo de híbridos comerciales en un programa de reproducción de planta de maíz, solamente se buscan las plantas de híbrido F1. Los híbridos F1 preferidos son más vigorosos que sus progenitores endogámicos. Este vigor del híbrido, o heterosis, se puede manifestar en muchos rasgos poligénicos, que incluyen crecimiento vegetativo aumentado y rendimiento aumentado.

El desarrollo de un híbrido de maíz en un programa de reproducción de planta de maíz implica tres etapas: (1) la selección de plantas de varios conjuntos de germoplasma para cruces de reproducción inicial; (2) la autofecundación de las plantas seleccionadas a partir de los cruces de reproducción durante varias generaciones para producir una serie de líneas endogámicas, las cuales, aunque diferentes una de otra, se reproducen de verdad y son altamente uniformes; y (3) el cruce de las líneas endogámicas seleccionadas con diferentes líneas endogámicas para producir la progenie híbrida (F1). Durante el proceso de reproducción en maíz, el vigor de las líneas disminuye. El vigor se restaura cuando dos líneas endogámicas diferentes se cruzan para producir la progenie híbrida (F1). Una consecuencia importante de la homocigosidad y homogeneidad de las líneas endogámicas es que el híbrido entre un par definido de endogámicos siempre será el mismo. Una vez que los endogámicos que dan un híbrido superior se han identificado, la semilla híbrida se puede reproducir por un tiempo indefinido en tanto que se mantenga la homogeneidad de los progenitores endogámicos. Una gran parte del vigor del híbrido mostrado por los híbridos F1 se pierde en la siguiente generación (F2). Consecuentemente, la semilla de híbridos no se usa para plantar plantas madre.

La producción de semilla híbrida requiere la eliminación o inactivación del polen producido por el progenitor femenino. La eliminación o inactivación incompleta del polen proporciona el potencial de autopolinización. Esta semilla autopolinizada inadvertidamente puede ser cosechada no intencionadamente y se puede envasar con la semilla híbrida.

Una vez que se siembra la semilla, es posible identificar y seleccionar estas plantas autopolinizadas. Estas plantas autopolinizadas serán equivalentes genéticamente a la línea endogámica femenino usada para producir el híbrido.

Como es fácilmente manifiesto por un experto en la técnica, lo anterior es solamente algunas de las diversas formas mediante las cuales el endogámico descrito aquí se puede obtener por aquellos que buscan introgresar el genotipo transgénico como se describe aquí en otras líneas de maíz. Están disponibles otros medios, y los ejemplos anteriores son solamente ilustrativos.

EJEMPLOS

La invención además estará descrita con referencia a los siguientes ejemplos detallados. Estos ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos solamente, y no están destinados para ser limitantes a menos que se especifique de otra manera. Las técnicas de ADN recombinante y clonación molecular estándar usadas aquí son bien conocidas en la técnica y se describen por Ausubel (ed.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994); J. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d Ed., Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001); y por T. J. Silhavy, M. L. Berman, y L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984).

Ejemplo 1. Transformación y selección del evento MIR604.

El evento MIR604 fue producido por transformación mediada por Agrobacterium de la línea de maíz endogámico (Zea mays) A188. El callo embriogénico tipo I se transformó esencialmente como se describe en Negrotto et al., (Plant Cell Reports 19:798-803, 2000), incorporado en aquí como referencia, usando un fragmento de ADN de plásmido pZM26 (Figura 1). pZM26 contiene una secuencia nucleotídica que comprende casetes de expresión en tándem. El primer casete de expresión se compone de una secuencia de promotor MTL (Patente US 6.018.099) ligada operablemente a una secuencia codificante de cry3A055 ligada además operablemente a una secuencia de poliadenilación y terminación de trascripción del extremo 3’ de nopalina sintetasa. El segundo casete de expresión se compone de un promotor de ubiquitina de maíz (ZmUbInt) (Christensen et al., 1992 PMB 18:675) ligado operablemente a una secuencia codificante de pmi ligada además operablemente a una secuencia de poliadenilación y terminación de trascripción del extremo 3’ de nopalina sintasa.

Los embriones inmaduros se cortaron de mazorcas de 8-12 días y se enjuagaron con medio reciente en preparación para la transformación. Los embriones se mezclaron con la suspensión de células Agrobacterium que albergan el vector de transformación pZM26, se pusieron en torbellino durante 30 segundos, y se dejaron incubar durante unos

10

15

20

25

30

35

E05723097

10-06-2015

5 minutos adicionales. La disolución de Agrobacterium en exceso se aspiró, y los embriones se movieron entonces a placas que contienen un medio de cultivo no selectivo. Los embriones se cocultivaron con el Agrobacterium que queda a 22ºC durante 2-3 días en la oscuridad. Los embriones se transfirieron a medio de cultivo suplementado con ticarcilina (100 mg/ml) y nitrato de plata (1,6 mg/l), y se incubaron en la oscuridad durante 10 días. Los embriones que producen callo embriogénico se transfirieron a medio de cultivo celular que contiene manosa.

Las plántulas regeneradas se evaluaron mediante análisis de PCR de TAQMAN® (véase el Ejemplo 2) en busca de la presencia de ambos genes pmi y cry3A055, así como la ausencia del gen de espectomicina de resistencia antibiótica (Spec). Las plantas positivas para ambos transgenes, y las negativas para el gen spec, se transfirieron al invernadero para la propagación posterior. Los eventos positivos se identificaron y se cribaron usando bioensayos de insectos contra gusano de raíz de maíz. Los eventos insecticidas se caracterizaron para determinar el número de copias mediante análisis de TAQMAN. El MIR604 se seleccionó para el análisis posterior basándose en que tiene una copia única de los transgenes, buena expresión proteica como se identifica mediante ELISA, y buena actividad insecticida contra gusano de raíz de maíz.

El T0 MIR604 se retrocruzó con la línea de maíz endogámica CG00526, creando la población T1. Las plantas T1 se autofecundaron para crear la generación T2, y este proceso se repitió para crear una generación T3. La evaluación de progenie de las plantas T3 se empleó para identificar familias homocigotas (convertidas). El endogámico CG00526 convertido de MIR604 se cruzó con otras líneas endogámicas de élite para crear híbridos usados en estudios posteriores

Ejemplo 2. Detección de MIR604 mediante PCR de TAQMAN

El análisis de TAQMAN se llevó a cabo esencialmente como se describe en Ingham et al. (Biotechniques, 31:132140, 2001) incorporado aquí como referencia. Brevemente, el ADN genómico fue aislado de las hojas de plantas de maíz transgénicas y no transgénicas usando el kit de extracción de ADN genómico Puregene® (Gentra Systems, Minneapolis, MN) esencialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante, excepto que todas las etapas se llevaron a cabo en placas de 96 pocillos de 1,2 ml. El pelete de ADN seco se volvió a suspender en disolución amortiguadora TE (Tris-HCl 10 Mm, pH 8,0, EDTA 1 mM).

Las reacciones de PCR de TAQMAN se llevaron a cabo en placas de 96 pocillos. Para el control del gen de maíz endógeno, se diseñaron cebadores y sondas específicos para el gen de alcohol deshidrogenasa (adh) Zea mays (nº de acceso Genbank AF044295). Se reconocerá por la persona experta que otros genes de maíz se pueden usar como controles endógenos. Las reacciones se multiplexaron para amplificar simultáneamente cry3A055 y adh o pmi y adh. Para cada muestra, se generó una mezcla maestra combinando 20 l de ADN genómico extraído con 35 l de 2x TAQMAN Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) suplementada con cebadores hasta una concentración final de 900 nM cada uno, sondas hasta una concentración final de 100 nM cada una, y agua hasta un volumen final de 70 l. Esta mezcla se distribuyó en tres réplicas de 20 l cada una en placas de amplificación de 96 pocillos y se sellaron con película de sellado por calor ópticamente transparente (Marsh Bio Products). La PCR se ejecutó en el instrumento ABI Prism 7700 usando los siguientes parámetros de amplificación: 2 min. a 50ºC y 10 min. a 95ºC, seguido de 35 ciclos de 15 s a 95ºC y 1 min. a 60ºC.

Los resultados del análisis de TAQMAN demostraron que el evento MIR604 tuvo una copia del gen cry3A055 y una copia del gen pmi.

Ejemplos de combinaciones de secuencia cebadora/sonda apropiadas las cuales que se usaron son:

Nombre del cebador: Secuencia del cebador SEC ID NO:

Cry3A055-directo: 5’-TACGAGAGCTGGGTGAACTTCA-3’ SEC ID NO: 47

Cry3A055-inverso: 5’-CGATCAGGTCCAGCACGG-3’ SEC ID NO: 48

Cry3A055-sonda: 5’-CCGCTACCGCCGCGAGATGA-3’ SEC ID NO: 49

(marcador 5’ = FAM, marcador 3’ = TAMRA)

PMI-directo: 5’-CCGGGTGAATCAGCGTTT-3’ SEC ID NO: 50

PMI-inverso: 5’-GCCGTGGCCTTTGACAGT-3’ SEC ID NO: 51

PMI-sonda: 5’-TGCCGCCAACGAATCACCGG-3’ SEC ID NO: 52

(marcador 5’ = FAM, marcador 3’ = TAMRA)

16

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

E05723097

10-06-2015

Nombre del cebador Secuencia del cebador SEC ID NO:

ZmADH-267 directo: 5’-GAACGTGTGTTGGGTTTGCAT-3’ SEC ID NO: 53

ZmADH-337 inverso: 5’-TCCAGCAATCCTTGCACCTT-3’ SEC ID NO: 54

ZmADH-316 sonda: 5’-TGCAGCCTAACCATGCGCAGGGTA-3’ SEC ID NO: 55

(marcador 5’ = TET, marcador 3’ = TAMRA)

Ejemplo 3. Detección de MIR604 por transferencia Southern

El ADN genómico usado para análisis de southern se aisló del tejido de hoja reunido de diez plantas que representan la generación seis de retrocruzamiento (BC6) de MIR604 usando esencialmente el método de Thomas et al., (Theor. Appl. Genet. 86:173-180, 1993), incorporado aquí como referencia. Todas las plantas usadas para aislar ADN se analizaron individualmente usando PCR de TAQMAN (como se describe en el Ejemplo 2) para confirmar la presencia de una sola copia del gen cry3A055 y el gen pmi. Para los controles segregantes negativos, el ADN se aisló de tejido de hoja reunido de cinco plantas que representan la generación BC4 del evento MIR604. Estas plantas segregantes negativas se analizaron individualmente usando PCR de TAQMAN, y los ensayos fueron negativos para la presencia del gen cry3A055 y el gen pmi, pero fueron, como se esperaba, positivos para el control interno del ensayo, el gen adh de maíz endógeno.

El análisis de Southern se llevó a cabo usando técnicas de biología molecular convencionales. EL ADN genómico (7,5 g) se digirió con enzima de restricción KpnI, que tiene un sitio de reconocimiento único en el inserto de T-ADN de MIR604 de plásmido pZM26 (Figura 1). Este enfoque permite la determinación del número de copias de los elementos, que corresponden a la sonda específica usada para cada Southern, que se ha incorporado en MIR604. Esto da como resultado una banda de hibridación por copia del elemento presente en MIR604. Tras la electroforesis en gel de agarosa y transferencia alcalina a una membrana Nytran®, las hibridaciones se llevaron a cabo usando sondas generadas con PCR de longitud completa específicas del elemento. La sonda usada en las transferencias Southern de cry3A055 y pmi comprende las secuencias nucleotídicas expuestas en SEC ID NO: 58 y SEC ID NO: 61, respectivamente. Las sondas se marcaron con 32P vía cebado aleatorio usando el sistema Rediprime™ II (Amersham Biosciences, nº de catálogo RPN1633).

Se usaron las siguientes condiciones de hibridación muy restrictivas: 1-2 millones de cpm/ml se añaden a PerfectHyb (Sigma) suplementado con 100 g/ml de ADN de timo de ternera (Invitrogen) precalentado a 65ºC. La prehibridización tiene lugar en la misma disolución como anteriormente, a la misma temperatura durante la noche o durante al menos una hora. La hibridación se llevó a cabo a 65ºC durante 3 horas seguido del lavado 2X en 2X SSC, SDS al 0,1% durante 20 minutos a 65ºC y 2X en 0,1X SSC, SDS al 0,1% durante 20 minutos a 65ºC.

En cada Southern se incluyeron tres muestras de control: (1) ADN de un segregante negativo (no transformado) usado para identificar cualesquiera secuencia de Zea mays endógenas que puedan hibridarse de forma cruzada con la sonda específica del elemento; (2) el ADN de un segregante negativo en el cual se introduce una cantidad de pZM26 digerido con KpnI que es igual a un número de copias basado en la longitud de la sonda, para demostrar la sensibilidad del experimento en la detección de una sola copia génica dentro del genoma de Zea mays; y (3) el plásmido pZM26 digerido con KpnI que es igual a un número de copias basado en la longitud de la sonda, como un control positivo para hibridación así como para demostrar la sensibilidad del experimento.

Los datos de hibridación proporcionan pruebas confirmatorias para apoyar el análisis de PCR de TAQMAN de que MIR604 contiene una sola copia de los genes cry3A055 y pmi, y que MIR604 no contiene ninguna de las secuencias de soporte de vector presente en pZM26. Como se espera para ambas sondas cry3A055 y pmi, la digestión de KpnI dio como resultado una única banda de hibridación del tamaño correcto, demostrando que una sola copia de cada gen está presente en el evento MIR604. Adicionalmente, para la sonda de soporte la carencia de hibridación demuestra la ausencia de cualquier secuencia de soporte de vector pZM26 que se incorporan en MIR604 durante el proceso de transformación.

Ejemplo 4. Secuenciación del inserto de T-ADN

La secuencia nucleotídica de todo el inserto de ADN transgénico presente en el evento MIR604 se determinó para demostrar la integridad global del inserto, la vecindad de los elementos funcionales, y para detectar cualesquiera cambio de pares de bases individuales. El inserto de MIR604 se amplificó mediante PCR a partir de ADN derivado de la generación BC5 como dos fragmentos solapantes individuales. Cada fragmento se amplificó usando un cebador polinucleotídico homólogo a secuencias genómicas vegetales que flanquean el inserto de MIR604, y un cebador polinucleotídico homólogo al gen cry3A055. Para generar el fragmento 5’, se combinó un primer cebador polinucleotídico homólogo a la secuencia de flanqueo 5’, 5’S1 (SEC ID NO: 15) con un segundo cebador polinucleotídico homólogo al ADN insertado dentro del gen cry3A055, 5’AS1 (SEC ID NO: 28). Para generar el fragmento 3’, se combinó un primer cebador polinucleotídico homólogo a la secuencia de flanqueo 3’, 9268AS (SEC

imagen10

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

E05723097

10-06-2015

Para caracterizar el intervalo de expresión de las proteínas Cry3A055 (el principio insecticida activo) y fosfomanosa isomerasa (PMI) (el marcador seleccionable) en plantas MIR604, se determinaron las concentraciones de proteína Cry3A055 y PMI mediante ELISA en varios tejidos vegetales y plantas completas en cuatro etapas de crecimiento (verticilo, antesis, madurez de la semilla y senescencia) en dos híbridos (MIR604-B y MIR604-C) y un endogámico (MIR604-A). Los híbridos fueron hemicigotos para los transgenes en el evento MIR604, mientras que el endogámico fue homocigoto para los transgenes.

Plantas completas y plantas individuales (excepto polen) se redujeron a un polvo fino mediante procesamiento usando un molinillo de café, una amasadora, una trituradora Grindomix™ (Brinkmann Instruments; Westbury, NY, USA), mortero con una mano de almirez, o un molino, o una combinación de estos dispositivos. Todo el procesamiento se realizó en presencia de hielo seco o de nitrógeno líquido. Las mezclas se mezclaron bien para asegurar la homogeneidad. La muestra de tejido vegetal completa, o una submuestra representativa, se retuvo para el análisis, permitiendo un tamaño de muestra suficiente para el almacenamiento de archivo de las muestras de tejido vegetal de reserva. Se determinó el porcentaje de peso seco de cada muestra, y las muestras procesadas se almacenaron a aprox. -80ºC hasta liofilización.

Se extrajeron muestras recientes de tejido (excepto polen y ensilaje) y de planta completa. Para cada muestra analizada, se pesó una alícuota de 1,0 g del material reciente en polvo en un tubo de polipropileno de 15 ml, se suspendió en 3 ml de disolución amortiguadora de extracción [CAPS 50 mM, NaCl 0,1 M, EDTA 2 mM, ditiotreitol 1 mM, fluoruro de 4-(l-aminoetil)bencenosulfonilo HCl 1 mM, leupeptina 1 mM, pH 10], y se extrajo usando un homogenizador Autogizer® (Tomtek; Hamden, CT, USA). Después de centrifugar durante 15 min. a 10.000 x g a 4ºC, el sobrenadante se usó para el análisis de Cry3A055 y PMI mediante ELISA. Después del tratamiento con yodoacetamida como se describe por Hill y Straka (1988), la proteína total en los extractos se cuantificó usando el reactivo de ensayo de proteínas BCA™ (Pierce; Rockford, IL, USA).

Se prepararon extractos de polen suspendiendo polen 1:30 (p/v) en disolución amortiguadora de extracción. Después de 30 min. en hielo, las suspensiones de polen se disgregaron mediante tres pasadas a través de una cuba de presión francesa a aprox. 15.000 psi (1.054 kg/cm2), seguido de la centrifugación a 14.000 x g durante 5 min. a 4ºC. Los análisis de Cry3A055 y PMI mediante ELISA se llevaron a cabo en los sobrenadantes como se describe más abajo. La proteína total se cuantificó como se describe anteriormente.

Los extractos de ensilaje se prepararon suspendiendo ensilaje 1:25 (p/v) en disolución amortiguadora de extracción 2X. Después de 30 min. en hielo, las suspensiones de ensilaje se extrajeron usando un homogeneizador Brinkmann Polytron® (Brinkmann; Westbury, NY, USA). Después de centrifugar durante 15 min. a 10.000 x g a 4ºC, el sobrenadante se usó para el análisis de Cry3A055 y PMI mediante ELISA. La proteína total se cuantificó como se describe anteriormente.

Cuantificación de Cry3A055

Los extractos preparados como se describe anteriormente se analizaron cuantitativamente para determinar Cry3A055 mediante ELISA (Tijssen, 1985) usando anticuerpos policlonales de conejo anti-Cry3A055 purificados mediante inmunoafinidad y anticuerpos policlonales de cabra anti-Btt (Cry3A nativa de Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis) purificados mediante inmunoafinidad. El límite inferior de la cuantificación del ELISA de doble sándwich se estimó en base a la concentración más baja de proteína de referencia pura que se encuentra sobre la porción lineal de la curva patrón, el volumen máximo de un extracto de control que se podía analizar sin interferencia de fondo, y el peso correspondiente de la muestra que representó la alícuota.

Se detectaron niveles cuantificables de proteína Cry3A055 en todos los tejidos vegetales derivados de MIR604 analizados, excepto el polen. En la mayoría de los casos, los resultados se presentan como medias de las cinco muestras tisulares repetidas. Para ensilaje, se analizó una muestra; por lo tanto, no se pudo calcular ninguna media. Los niveles de las muestras de control estaban por debajo del límite de cuantificación para todas las etapas y tejidos.

A lo largo de todas las etapas de crecimiento, los niveles medios de Cry3A055 medidos en hojas, raíces y plantas oscilaron desde aprox. 3-23 g/g de peso reciente (4-94 g/g peso seco), aprox. 2-14 g/g de peso reciente (7-62 g/g de peso seco), y alrededor de 0,9-11 g/g de peso reciente (3-28 g/g de peso seco), respectivamente. Los niveles medios de Cry3A055 medidos en pepitas en la madurez de las semillas y senescencia oscilaron desde alrededor de 0,6-1,4 g/g de peso reciente (0,8-2,0 g de peso seco). Los niveles medios de Cry3A055 medidos en tejido sedoso en antesis estuvieron por debajo del límite inferior de cuantificación (LOQ), <0,1 g/g de peso reciente (<1,0 g/g de peso seco). Los niveles medios de Cry3A055 medidos en tejido sedoso en la madurez de semillas oscilaron desde alrededor de 0,6-1,9 g/g de peso reciente (1-3 g/g de peso seco). La proteína Cry3A055 no fue detectable en polen del endogámico MIR604-A o de los híbridos MIR604-B y MIR604-C [límite de detección (LOD) = 0,07 /g de peso reciente, 0,15 /g de peso seco].

Los niveles de Cry3A055 fueron generalmente similares entre híbridos para cada tipo de tejido en cada punto de tiempo. Para la línea endogámica, la expresión de Cry3A055 fue generalmente mayor que en los híbridos en hojas, raíces y plantas completas en las etapas de verticilo y antesis, y en raíces en la madurez de semillas. Los niveles de Cry3A055 medidos en tejidos de ensilaje fueron de media 2.5 g/g de peso reciente (7,3 g/g de peso seco) durante

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

E05723097

10-06-2015

15, 29 y 75 días. En comparación, el nivel de Cry3A055 medido en el material vegetal cortado antes del ensilaje (Día 0 previo al ensilaje) fue alrededor de 8 g/g de peso reciente (20 g/g de peso seco).

Cuantificación de PMI

Los extractos preparados como se describe anteriormente se analizaron cuantitativamente para determinar PMI mediante ELISA (Tijssen, 1985) usando anticuerpos policlonales de conejo purificados mediante Proteína A y anticuerpos policlonales de cabra purificados mediante inmunoafinidad, específicos para PMI. El límite inferior de cuantificación del ELISA de doble sándwich se estimó basándose en la concentración más baja de la proteína de referencia pura que se encuentra sobre la porción lineal de la curva patrón, el volumen máximo de un extracto de control que se pudo analizar sin interferencia de fondo, y el peso correspondiente de la muestra que representó la alícuota.

La proteína PMI se detectó en la mayoría de los tejidos vegetales analizados derivados de MIR604, sin embargo a niveles bajos. En la mayoría de los casos, los resultados se presentan como medias de las cinco muestras tisulares repetidas. Para ensilaje, se analizó una réplica; por lo tanto, no se pudo calcular ninguna media. Los niveles de la muestra de control están por debajo del límite de cuantificación para todas las etapas y tejidos.

A lo largo de todas las etapas de la planta, los niveles medios de PMI medidos en hojas, raíces y plantas completas oscilaron desde indetectable (ND) hasta aprox. 0,4 g/g de peso reciente (ND-2,1 g/g de peso seco), por debajo del LOQ (<0,03 g/g de peso reciente) hasta alrededor de 0,2 /g de peso reciente (<0,1 – 1,0 g/g de peso seco), y por debajo del LOQ (<0,02 g/g de peso reciente) hasta alrededor de 0,3 g/g de peso reciente (<0,04 -2 g/g de peso seco), respectivamente. Los niveles medios de PMI medidos en pepitas en la madurez de semillas y senescencia oscilaron desde debajo del LOQ (<0,06 g/g de peso freso) hasta alrededor de 0,4 g/g de peso reciente (<0,07 – 0,5 g/g de peso seco). Los niveles medios de PMI medidos en tejido sedoso en antesis y madurez de la semilla oscilaron desde debajo del LOQ (<0,1 g/g de peso reciente) hasta alrededor de 0,8 g/g de peso reciente (<0,2 – 6,8 g/g de peso seco). PMI en polen osciló desde alrededor de 1,9 – 2,6 g/g de peso reciente (3,9 – 5,2 g/g de peso seco).

Los niveles de PMI fueron generalmente similares entre los genotipos endogámico e híbrido para cada tipo tisular en cada punto de tiempo. PMI no se pudo detectar en ensilaje en los tres tiempos de muestreo (día 15, 29 y 75), mientras que el nivel medido en el material vegetal cortado antes del ensilaje (Día 0 previo al ensilaje) fue alrededor de 0,3 g/g de peso reciente (0,7 g/g de peso seco).

Niveles de proteína Cry3A055 total estimados por acre y por hectárea

Para la línea endogámica (MIR604-A) y para ambos híbridos (MIR604-B y MIR604-C), las plantas alcanzaron su mayor biomasa en la madurez de las semillas. Las plantas también alcanzaron sus niveles medios de Cry3A055 estimados más elevados en una base por acre (y por hectárea) en la madurez de la semilla, y se estimó que contenían alrededor de 78, 141 y 240 g de Cry3A055/acre (193, 348 y 592 g/hectárea) para MIR604-A, MIR604-B y MIR604-C, respectivamente. A lo largo de la estación de crecimiento y a través de los genotipos, las estimaciones de Cry3A055 en plantas derivadas de MIR604 oscilaron desde niveles medios de alrededor de 8 g de Cry3A055/acre (21 g de Cry3A055/hectárea) en la etapa de senescencia hasta alrededor de 240 g de Cry3A055/acre (592 g Cry3A055/hectárea) en la madurez de la semilla, suponiendo una densidad de siembra de

26.500 plantas por acre (65.500 plantas/hectárea).

Ejemplo 7. Eficacia en Campo de MIR604

Gusano de raíz de maíz del oeste y del norte

Las plantas MIR604 se ensayaron para determinar la eficacia frente al gusano de raíz de maíz occidental y del norte en 12 localizaciones en los Estados Unidos de América. MIR604 se ensayó con y sin la adición del tratamiento insecticida de semillas Cruiser®. Los grupos de control consistieron en semilla tratada con dos tasas diferentes de Cruiser® y un control no tratado. Los tratamientos consistieron en cuatro réplicas de dos filas de 17,5-20 pies (5,36,1 metros) separados 30” (76,2 cm) en el centro diseñado en un bloque completo aleatorizado. Se escogieron al azar diez plantas por tratamiento y se evaluaron en busca de la eficacia usando una escala de 0-3, en la que 0 = ningún daño de alimentación (la puntuación más baja que se puede dar); 1 = un nodo (círculo de raíces), o el equivalente de un nodo completo, comido en aproximadamente dos pulgadas (5 cm) del tallo (línea del suelo en el 7º nodo); 2 = dos nodos completos comidos; 3 = tres o más nodos comidos (puntuación más elevada que se puede dar). El daño entre nodos completos comidos se anotó como el porcentaje del nodo perdido, es decir, 1,50 = 1 ½ nodos comidos, 0,25 = ¼ de un nodo comido.

Los resultados, mostrados en la Tabla 1, demuestran que las raíces de dos líneas fraternas de MIR604, 3-11 y 3-12, sostuvieron un daño de alimentación significativamente menor que las raíces del tratamiento con Cruiser® o las raíces del control no tratado. MIR04-3-11 y MIR6004-3-12 tuvieron puntuaciones de daño de la raíz de 0,44 y 0,42, respectivamente, en comparación con los tratamientos con Cruiser® de 0,25 y 1,25 mgA/semilla, que tuvieron puntuaciones de daño de 1,6 y 0,9, respectivamente, y la línea de control con una puntuación de daño de 2,14. Hubo

10

15

20

E05723097

10-06-2015

una tendencia hacia puntuaciones de daño de la raíz menores en las plantas MIR604, cuyas semillas se trataron con Cruiser®, sugiriendo que Cruiser® aumentó la proteína Cry3A055, o que hubo una posible sinergia entre Cruiser® y Cry3A055. Esto fue particularmente evidente en los tratamientos de semillas de 1,0 y 1,25 mgA/MIR604, con puntuaciones de daño de raíz de 0,33 y 0,29, respectivamente.

Tabla 1. Eficacia de MIR604 con y sin tratamiento de semillas Cruiser®

Línea de maíz: Tratamiento Cruiser® (mgA/Semilla) Puntuación de daño a la raíz (Escala de 0-3 CRW)

MIR604-3-11: 0 0,44

MIR604-3-12: 0 0,42

MIR604: 0,25 0,43

MIR604: 0,50 0,39

MIR604: 1,0 0,33

MIR604: 1,25 0,29

Híbrido de control: 0,25 1,60

Híbrido de control: 1,25 0,99

Híbrido de control: 0 2,14

La eficacia de MIR604 se comparó con patrones insecticidas granulares comerciales aplicados en el surco. El diseño experimental fue como se describe anteriormente. Los resultados en la Tabla 2 demuestran que la eficacia de MIR604 fue comparable a los patrones comerciales a la hora de proteger plantas frente al daño de alimentación del gusano de raíz de maíz.

Tabla 2. Comparación de la eficacia de MIR604 con insecticidas comerciales aplicados en el surco

Tratamiento Puntuación de daño a la raíz (Escala de 0-3 CRW)

MIR604: 0,43

Force® 3G: 0,44

Aztec® 6.7G: 0,32

Lorsban® 15 G: 0,75

Control no tratado: 2,14

Gusano de raíz de maíz mejicano

Las plantas MIR604 se evaluaron para determinar la resistencia al gusano de raíz de maíz mejicano en dos localizaciones en Tejas. El diseño experimental fue esencialmente el mismo como se describe anteriormente.

Los resultados mostrados en la Tabla 3 demuestran que ambos hermanos de MIR604 sostenían menos daño de alimentación que los controles no tratados. Hubo una respuesta positiva para el control de gusano de raíz de maíz mejicano cuando se añadió Cruiser a la semilla de MIR604. Fue evidente una clara respuesta a la tasa. Los resultados en la Tabla 4 demuestran que la eficacia de MIR604 fue comparable a los patrones comerciales a la hora de proteger las plantas frente al daño de alimentación de gusano de raíz de maíz mejicano.

Tabla 3. Eficacia de MIR604 con y sin tratamiento de semillas Cruiser frente a gusano de raíz de maíz mejicano.

Tratamiento: Tasa de Cruiser® (mgA/Semilla) Puntuación de daño a la raíz (Escala de 0-3 CRW)

MIR604-3-11: 0 1,14

0,125: 0,19

0,25: 0,18

21

Claims

imagen1